본 발명에서는 돼지 알파에스 1 카제인 유전자 및 그 프로모터를 제공하고, 이를 이용하여 목적단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 돼지 알파에스 1 카제인 유전자를 제공한다.
본 발명의 돼지 알파에스 1 카제인 유전자는 구체적으로 프로모터, 및 3' UTR(untranslated region) 부위를 포함하는 서열번호 1의 염기서열을 포함한다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 염기서열 중 1번째부터 9300번째까지 염기서열에 해당하는 서열번호 2의 프로모터를 제공하며, 상기 프로모터는 구조유전자의 5'쪽에 위치하여 구조유전자의 발현을 조절한다.
본 발명의 돼지 알파에스 1 카제인 유전자, 또는 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열에 하나 이상의 붕괴(disruption), 결실(deletion), 삽입(insertion), 점(point), 치환(substitution), 논센스(nonsense), 미스센스(misinse), 다형현상(polymorphism), 재배열 돌연변이(mutation)가 일어난 기능적 등가물 중 선택된 하나가 될 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 2의 프로모터 전체 또는 일부를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 바람직하게, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 염기서열을 본 발명의 발현벡터는 포함한다. 상기 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 염기서열은 벡터에 삽입되어 프로모터의 역할을 하며, 상기 서열을 프로모터 서열 또는 돼 지알파에스1 카제인 유전자 프로모터 서열이라 한다. 본 발명에서 사용하는 '돼지 알파 에스 1 카제인 유전자 프로모터'라는 용어는 돼지 알파 에스 1 카제인 유전자로부터 유래한 프로모터를 의미한다.
서열번호 3, 서열번호 4는 서열번호 1의 돼지 알파에스 1 카제인 유전자 전체 게놈 서열 중 각각 3568번째부터 9037번째까지의 염기서열, 4321번째부터 9300번째까지의 염기서열에 해당하며, 공통적으로 엑손 1 영역을 포함한다.
본 발명의 발현 벡터는 필요에 따라 적절한 위치에 조절인자들, 즉 또 다른 프로모터, 인핸서(enhancer), 선택적 표지 유전자(selective marker), 5'-UTR(untranslated region), 3'-UTR, 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 리보솜결합서열, 게놈의 특정 부위로 삽입될 수 있는 염기서열, 인트론, 또는 WPRE(woodchuck hepatitus virus posttranscriptional regulatory element) 등을 추가로 포함함으로써, 형질전환 세포주의 구축을 용이하게 하며, 목적단백질 발현량의 극대화 및 발현의 안정성을 도모할 수 있다.
선택적 표지 유전자는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin-resistant gene) 등을 사용하며, 시판하는 벡터로부터 해당 부분을 절단하여 사용할 수 있다. 네오마이신 저항성 유전자는 세포주 구축시 사용되는 G418(2R,3S,4R,5R,6S)-5-amino-6-[(1R,2S,3S,4R,6S)-4,6-diamino-3-[(2R,3R,4R,5R)-3,5-dihydroxy-5-methyl-4-methylaminooxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-2-(1-hydroxyethyl)oxane-3,4-diol) 시약에 대해 저항성을 나타내는 유전자로, 프로모터 조절하에 단백질을 발현하는 동물세포주 구축시 효율적인 선택적 표지 유전자로 작용할 수 있다.
인슐레이터는 프로모터 부근에 존재하는 조절인자의 영향을 돕고, 위치 비의존적인(position-independent)발현을 도와주는 인자로, 프로모터의 조절하에 단백질을 안정적으로 발현할 수 있게 하며, 시판되는 벡터로부터 해당 부분을 절단하여 사용할 수 있다.
WPRE는 mRNA의 안정화에 기여하여 단백질 합성량을 증대시킬 수 있는 조절인자로, 프로모터의 조절하에 단백질을 대량으로 발현할 수 있게 한다. WPRE 역시 시판되는 벡터로부터 절단한 것일 수 있다.
본 발명의 발현벡터는 또한, 서열번호 5, 또는 서열번호 6 염기서열을 추가로 포함한다. 상기 서열번호 5, 또는 서열번호 6의 염기서열은 벡터의 3'arm을 형성하며, 형질전환 세포주의 구축을 용이하게 하며, 목적단백질 발현량의 극대화 및 발현 안정성을 도모할 수 있다.
서열번호 5, 서열번호 6은 각각 서열번호 1의 돼지 알파에스 1 카제인 유전자 전체 게놈 서열 중 26344번째부터 30599번째까지의 염기서열, 14447번째부터 19401번째까지의 염기서열에 해당한다.
돼지 알파에스 1 카제인 유전자 전체 게놈 서열 중 서열번호 3, 4, 5, 6의 염기서열 위치는 도 1에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 벡터는 바람직하게 서열번호 3의 염기서열, 및 서열번호 5의 염기서열을 포함한다.
구체적으로 본 발명의 벡터는 도 2의 개열지도를 갖는 것으로, pBC1-pig αS1 casein벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행(대전, 대한민국)에 기탁번호 KCTC 11324BP로 기탁하였다. 본 발명의 발현벡터 pBC1-pig αS1 casein벡터는 pBC1 벡터를 기본 골격으로 사용하며, 선택적 표지 유전자로 네오마이신 저항성 유전자가 융합되어 있다.
본 발명의 발현벡터는 프로모터 영역 염기서열의 3' 쪽으로 목적단백질을 암호화하는 염기서열을 추가로 포함함으로써, 목적단백질을 발현할 수 있다.
상기 목적단백질은 산업상 이용가능한 유용단백질로, 일 예로 의약품의 유효성분으로 사용되는 모든 단백질, 즉 EPO(erythropoietin), 알도스테론(aldosterone), 아드레노코티코트로핀(adreno-corticotropin), 혈액응고인자(blood clotting factor), 고나도트로핀(gonado-tropin), 인슐린(insulin), 프로락틴(prolactin), 또는 바소프레신(vasopressin) 등일 수 있으며, 바람직하게는 hEPO(human erythropoietin)이다.
본 발명은 상기 네오마이신 저항성 유전자, 인슐레이터, WPRE 등을 포함하는 발현벡터의 바람직한 예로 도 3의 개열지도를 갖는 벡터를 제공하며, 구체적으로 pBC1-pig αS1 casein+hEPO-WPRE 벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC 11325BP로 기탁하였다.
본 발명의 pBC1-pig αS1 casein+hEPO-WPRE 벡터는 pBC1 벡터를 기본 골격으로 사용하며, 본 발명의 프로모터 영역의 3'쪽에 인간EPO를 암호화하는 유전자, 및 인간EPO 유전자의 3'쪽에 WPRE가 융합되어 있다.
본 발명의 발현벡터는 낙인벡터(knock-in vector)로 제조될 수 있다.
"낙인벡터"는 게놈의 특정 유전자 위치로 목적하는 유전자를 삽입할 수 있는 벡터로, 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나도록 타겟팅하고자 하는 특정 유전자에 상동인 염기서열을 포함한다. 본 발명의 낙인벡터는 목적 단백질을 코딩하는 핵산서열이 게놈상의 알파에스 1 카제인 유전자에 삽입되는 알파에스 1 카제인 타겟팅 벡터이다.
본 발명의 낙인벡터는 바람직하게는 서열번호 4의 염기서열, 및 서열번호 6의 염기서열을 포함한다.
본 발명의 낙인벡터는 필요에 따라 포지티브 및/또는 네거티브 선별유전자를 사용하여 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 선별유전자란 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물내성, 영양요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 유전자들이 사용될 수 있고, 포지티브 선별유전자와 네거티브 선별유전자가 있다.
포지티브 선별유전자란 선택제가 처리된 환경에서 선택유전자를 발현하는 세포만 생존하도록 하여 포지티브 선택을 가능하게 하는 유전자로 네오마이신(Neomycin; Neo) 저항성 유전자, 하이그로마이신(Hygromycin; Hyg) 저항성 유전자 등이 있다.
네거티브 선별유전자는 무작위적 삽입이 일어난 세포를 선별하여 제거하는 네거티브 선택을 가능하게 하는 유전자로 허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase; HSV-tk) 유전자, 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(hypoxanthine phosphoribosyl transferase; Hprt) 유전자, 싸이토신 디아미나제(cytosine deaminase) 유전자, 또는 디프테리아 톡신(Diphtheria toxin) 유전자 등이 있다. 네가티브 선별유전자는 프로모터 영역의 5'말단 쪽 또는 3'arm의 3'말단 쪽에 위치한다.
포지티브 선별유전자 및 네거티브 선별유전자는 별개의 프로모터, 폴리A등을 가질 수 있으며, 사용되는 프로모터는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터, 또는 포스포글리세레이트키나제(phosphoglycerate kinase;PGK) 프로모터 등이 있다.
본 발명의 낙인벡터와 게놈상의 알파에스 1 카제인 유전자가 상동 재조합이 일어나면 벡터상의 목적 단백질을 코딩하는 핵산이 숙주세포의 알파에스 1 카제인 게놈 유전자로 통합(integration)되어, 숙주세포의 알파에스 1 카제인 단백질 대신 발현된다.
본 발명은 포지티브 선별유전자로 네오마이신 저항성 유전자, 및 네거티브 선별유전자로 허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk)를 사용하는 낙인벡터의 바람직한 예로 도 4의 개열지도를 갖는 벡터를 제공하며, 구체적으로 Pig αS1 casein-hEPO knock in 벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC 11326BP로 기탁하였다.
본 발명의 Pig αS1 casein-hEPO knock in 벡터는 Lox A neo벡터를 기본 골격으로 사용하며, 프로모터(도 4의 Pig aS1 casein 5' arm 부분을 의미함)의 3'쪽에 hEPO, hEPO의 3' 쪽에 포지티브 선별유전자로 네오마이신 저항성 유전자, 네오 마이신 저항성 유전자 3' 쪽에 3'arm(도 4의 Pig aS1 casein 3' arm 부분을 의미함), 및 3'arm의 3' 쪽에 허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase; HSV-tk) 유전자(TK)가 융합되어 있다.
본 발명의 벡터제작은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명은 또한 본 발명의 발현 벡터를 도입시켜 형질전환시킨 동물의 체세포를 제공한다.
본 발명의 벡터가 도입되는 동물의 체세포는 돼지 등 유래로, 1차, 2차 또는 영구세포일 수 있다.
상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 도입하는 방법은 핵산을 세포내로 도입하는 방법을 모두 사용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 기술 즉, 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(diethylaminoethyl-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 등을 사용할 수 있다. 이 경우 벡터는 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태 또는 플라스미드를 제거한 선형의 벡터 형태로 도입할 수 있다.
본 발명의 프로모터 유전자는 유선조직에서만 특이적으로 단백질을 발현시킨다. 돼지의 유즙 중 단백질 구성성분은 카제인이 90%를 차지하고 있으며, 카제인은 다시 알파, 베타, 감마 카제인으로 나누어 진다. 그 중 알파 카제인이 70%로 상당부분을 차지하고, 알파카제인은 알파에스 1 카제인 및 카파카제인으로 나뉘며, 알파에스 1 카제인이 그 중 55%를 차지하므로, 돼지 알파 에스 1 카제인 프로모터를 이용한 벡터는 유즙분비하는 동물, 특히 돼지에게서 유선특이적으로 외부에서 유래한 목적 단백질을 발현하도록 할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 발현 벡터를 도입시켜 형질전환시킨 동물의 체세포의 핵을 탈핵된 난자에 핵이식하여 만든 동물 수정란을 제공한다.
"핵이식"은 핵이 제거된 난자에 세포의 핵을 넣어 이식시키는 것을 의미하며, 이런 핵이식된 수정란을 착상시켜서 태어난 개체는 핵공여 세포의 유전적 물질이 핵수여 세포질로 그대로 전달되었기 때문에 유전적으로 완전히 동일한 복제 개체가 된다.
본 발명은 또한 본 발명의 발현 벡터를 주입시킨 동물 수정란을 제공한다.
상기 주입은 구체적으로, 수정직후 전핵단계에 있는 접합체의 웅성전핵 내에 미세조작기술로서 유전자를 주입하는 미세주입법(Microinjection technique), 배아 간세포(embryonic stem cells)에 유전자를 삽입시키고 이를 배반포기의 수정란 내에 이식하는 방법(Stem cell insertion technique), 레트로바이러스 벡터(Retroviral vector)를 이용하여 유전자를 수정란 내에 주입하는 방법(Retroviral insertion technique), 유전자를 수컷의 정소 내에 주입하여 유전자를 정자에 삽입시키고 이를 난자와 수정시키는 방법(Sperm-mediated gene transfer technique) 등에 의할 수 있으며, 바람직한 예는 미세주입법이다.
본 발명은 또한 본 발명의 동물 수정란을 이식시켜 얻은 형질전환동물을 제공한다.
본 발명의 발현벡터로 형질전환될 수 있는 동물은 유즙을 분비하는 모든 동물, 즉 돼지, 생쥐, 소, 양, 또는 염소 등이다.
본 발명의 발현 벡터를 이용한 형질전환동물의 생산 방법은 통상적인 방법에 의한다.
즉, 형질전환하고자 하는 동물 중 쥐 등의 건강한 개체로부터 수정란을 채취하고, 수정란에 본 발명의 발현 벡터를 도입한 후, 정관결찰 생쥐 등을 이용하여 위임신 생쥐 등을 얻고, 이를 대리모로 하여 난관 내에 수정란을 이식한 후, 대리모로부터 얻은 자손 중 형질전환된 개체를 선별하는 과정으로 이루어질 수 있다.
또한, 돼지 등의 건강한 개체로부터 난포란을 채취하고 체외성숙용 배양액세서 배양한다. 아울러 돼지 등의 태아로부터 채취, 배양한 공여체세포로 본 발명의 발현 벡터를 도입한 후 벡터가 도입된 체세포를 선별, 배양한다. 상기 체외성숙된 난자에서 핵을 제거하고, 이 공간에 공여세포를 주입한 다음, 전기 융합을 통해 핵이식이 완료된 난자의 공여세포와 세포질을 융합시킨 후 체외배양한다. 이 복제수정란을 과배란을 유도한 수란돈에 이식한 후, 수란돈으로부터 얻은 자손 중 형질전환된 개체를 선별하는 과정을 거친다.
이후 형질전환된 것으로 확인된 개체로부터 유즙을 수거한 후, 목적단백질을 분리, 정제함으로써 목적단백질을 제조하게 된다(A. Gokana, J.J. Winchenn, A. Ben-Ghanem, A. Ahaded, J.P. Cartron, P. Lambin(1997) Chromatographic separation of recombinant human erythropoietin isoforms, Journal of chromatography, 791, 109-118).
본 발명의 목적단백질 제조방법에서 분리, 정제 방법은 통상적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 여과법 또는 크로마토그래피법 등이 될 수 있다.
이렇게 하여 제조되는 본 발명의 형질전환동물은 유즙 중에 목적단백질을 발현할 수 있다.
따라서, 본 발명의 돼지 알파에스 1 카제인 유전자, 프로모터, 이를 이용한 발현벡터 및 형질전환동물은 목적단백질의 생산분야에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in Molecular Biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc., 1994)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.
돼지 알파에스 1 카제인 유전자 프로모터는 목적 단백질의 유선특이적 발현을 촉진하므로, 본 발명의 프로모터, 및 이를 이용한 발현벡터에 의해 형질전환된 동물은 유즙 중에 목적단백질을 고농도로 분비하도록 하게 되어 의약학적으로 중요한 가치를 갖는 유용단백질의 생산분야에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 돼지 알파
에스
1
카제인
유전자의 분리 및
클로닝
본 발명의 유선 특이적 유전자를 분리하기 위해, promega사의 pig genomic DNA library와 국립축산과학원(경기도 수원시 권선구 축산길 77 오목천동 564 국립축산과학원, 대한민국)에서 제공받은 BAC(bacterial artificial chromosome) clone을 가지고 돼지의 알파 에스 1 카제인 유전자(pig αS1 casein gene)의 염기서열(sequence)을 밝혔다.
1)
pig
genomic
DNA
library
를 이용한 돼지의 알파
에스
1
카제인
염기서열 분석
돼지의 알파 에스 1 카제인 유전자의 염기서열이 밝혀지지 않았기 때문에, 염기서열이 밝혀진 사람, 소, 말과 생쥐의 알파 에스 1 카제인 cDNA 염기서열을 비교하여 종 간에 높은 상동성과 보존된 부분을 참조하여, 돼지 알파 에스 1 카제인 PCR 증폭에 사용될 프라이머 염기서열을 제작하였다. 5'UTR 쪽 Forward primer 5'- TGACAACCATGAAACTTCTCAT-3'(서열번호 8), Reverse primer 5'- GTTCCTGATGCCTGAGAGGA-3'(서열번호 9), 3' UTR 쪽 Forward primer 5'- AACCATTTTATCTGAAGACTTTG-3'(서열번호 10), Reverse primer 5'-TCTCAGTCACTGCACACAATT-3'(서열번호 11)를 이용, 돼지의 genomic DNA 로부터 PCR 증폭(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 5분간 신장반응)한 결과 5'UTR 쪽으로 3.3 kb의 염기서열(서열번호 12)과 3'UTR 쪽으로 303 bp의 염기서열(서열번호 13)로 이루어진 산물을 얻었다. 이를 pGEM-T vector(promega, 미국)에 클로닝(cloning) 후 염기서열 분석(sequencing)을 통해 돼지 알파 에스 1 카제인의 유전자의 일부인 것으로 확인되었으며, 5'UTR쪽 3.3 kb 와 3'UTR쪽 303 bp의 염기서열을 밝혔다.
밝혀낸 3.3 kb의 돼지 알파 에스 1 카제인 유전자의 염기서열로부터 5'UTR 쪽 탐침인자를 만들기 위해 Forward primer 5'-TGACAACCATGAAACTTCTCAT-3'(서열번호 14), Reverse primer 5'-CTAAGACTCTCATACTGAGTG-3'(서열번호 15)를 이용 PCR 증폭(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 30초간 신장반응)으로 551 bp의 산물(서열번호 16)을 얻었다.
돼지 알파 에스 1 카제인의 염기서열을 밝히는데 사용될 탐침인자를 만들기 위해 상기에서 얻은 5'UTR 쪽 551 bp와 3'UTR쪽 303 bp 의 PCR 산물 100ng을 5분간 끓인 후, 얼음에 식혀 변성(denaturation)시켰다. 변성된 DNA를 프라이머, dNTP, [α-32P]dCTP(3000 Ci/nmol, NEN)를 함유하는 반응 완충액에 첨가한 후, 클레노우 효소(Klenow fragment; promega, 미국)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 반응액을 세파덱스 컬럼(Sephadex G-50 column)을 사용하여 정제함으로써, 32P로 표지된 돼지 알파 에스 1 카제인 유전자 탐침인자를 준비하였다.
돼지 알파 에스 1 카제인 유전자를 밝히기 위해, 돼지의 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. 본 실시예에서 돼지의 게놈 라이브러리는 promega사의 pig genomic DNA library를 사용하였다.
라이브러리를 도입할 호스트 박테리아는 다음과 같이 준비하였다.
0.2%의 말토오스(maltose)가 함유된 LB 배지(Scharlau, 스페인) 5㎖에 박테리아 콜로니(XLL blue P2, promega, 미국) 하나를 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 배양액의 1%를 다시 새로운 0.2%의 말토오스 함유 LB 배지 50㎖로 옮겨, 2.5시간 동안 배양하였다. 600㎚에서의 흡광도가 0.5 정도 되었을 때, 배양액을 2500rpm의 속도로 10분간 원심분리하였다. 그 결과 얻은 세포 침전물을 멸균한 10㎖ 황산마그네슘 용액에 현탁시켜, 최종농도가 1 ×1010세포/㎖이 되도록 하고, 실험할 때까지 4℃에 보관하였다.
라이브러리를 적정(titration)하기 위해, 라이브러리를 SM 완충용액{0.1M NaCl, 8mM MgSO4, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.01% 젤라틴}에 여러 농도로 연속 희석(serial dilution)하였다. 고체 LB배지가 담긴 플레이트(plate)를 37℃ 항온반응기(incubator)에서 데우고, 탑 아가(top agar)를 녹여 48℃로 유지되는 수조에 놓아두었다. 여러 농도로 희석된 파지 용액 10㎕ 와 상기에서 준비한 호스트 박테리아 100㎕를 혼합하여, 37℃에서 호스트 박테리아를 감염(infection)시켰다. 탑 아가에 파지로 감염된 호스트 박테리아를 첨가하고 잘 흔들어 준 후, 상기에서 준비해 둔 LB 배지 위에 부었다. 15분 후 플레이트를 거꾸로 뒤집어 37℃ 항온반응기에 서 하룻밤 동안 배양하였다. 밤새 배양한 플레이트의 배지 상에서는 파지가 호스트 박테리아 내에서 라이브러리 DNA를 복제한 후 호스트 박테리아를 용해시킨 흔적인 플라그가 형성되었으며, 이후의 실험 단계를 위해 배지를 4℃에서 1시간 이상 식혔다.
상기 플레이트에 대해, 일련 번호를 기재한 NC 필터(Amersharm Biosciences.; 영국)를 준비하고, 필터의 가운데 부분부터 닿도록 하여 상기에서 준비한 라이브러리 DNA 플레이트 위에 필터를 덮었다. 필터에 바늘을 수직으로 찔러 위치를 표시하고, 1분 후 조심스럽게 필터를 배지로부터 떼어냈다.
각 필터를 변성화 용액(denaturation solution; 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl; sigma, 미국), 중성화 용액(neutralization solution; 1M Tris-HCl (pH7.5), 1.5M NaCl; sigma, 미국) 및 2 ×SSC 용액(0.3M NaCl, 0.03M Sodium citrate, sigma, 미국)에 차례로 1분씩 담근 후, 80℃ 오븐에서 2시간 동안 두어, 전이된 라이브러리 DNA가 필터 상에 완전히 고정(immobilization)되도록 하였다.
고정된 필터를 밀폐용 비닐에 담아 전혼성화 용액{prehybridization solution; 50% formamide 40 ml, 20X SSPE(saline-sodium phosphate-EDTA buffer) 20 ml, 50X Dehardt's solution 8 ml, 100ng/ml salmon sperm DNA 1.2 ml, 10% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 1.2 ml, 증류수 0.6 ml; sigma, 미국}을 넣어 준 후 68℃에서 1시간 동안 살살 흔들어 주면서 전혼성화 반응을 수행하였다. 전혼성화 반응 후, 준비한 탐침인자를 100 ng 첨가하고, 68℃에서 18시간 동안 살살 흔들어 혼성화 반응을 수행하였다. 혼성화 반응 후, 0.1% SDS를 함유하는 2 ×SSC 용액에 필터를 담그고, 65℃에서 10분 동안 흔들면서 세척하는 과정을 2번 반복하였다. 세척 후, 필터를 공기 중에서 건조시키고, 자기방사기록법(autoradiography)을 수행하였다. 자기방사기록과 플레이트를 대조하여, 양성 반응을 보이는 플라그를 선택하고, 선택된 플라그를 SM 완충액(0.1M NaCl, 8mM MgSO4, 50mM Tris-HCl(pH7.5), 0.01% gelatin, sigam, 미국) 500㎕에 넣고 클로로포름(chloroform) 한 방울을 첨가한 후 잘 섞어 4℃에 보관하였다. 상기와 같은 스크리닝 과정을 두번 반복하여, 양성반응을 나타내는 클론들을 최종적으로 얻었다. 최종적으로 얻은 클론을 가지고 탐침인자를 만들 때 사용했던 프라이머{정방향 프라이머(서열번호 14), 역방향 프라이머(서열번호 15)}와 T7, SP6 프라이머(Cosmo, 한국)를 서로 짝을 이뤄 PCR 증폭(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 5분간 신장반응)을 하였다. PCR 증폭 결과 5'UTR 쪽 551 bp 탐침인자로 5' 방향으로 3.7 kb(서열번호 17)와 3'UTR 쪽 303 bp 탐침인자로 5' 방향 2.2 kb(서열번호 18)와 3' 방향 6.3kb(서열번호 19)의 산물을 얻어 pGEM-T 벡터(promega, 미국)에 클로닝 한 후 완전한 염기서열을 얻었다.
염기서열 분석은 솔젠트(solgent, 한국)에 의뢰하여 진행하였다.
2)
Bac
clone
을 이용한 돼지의 알파
에스
1
카제인
염기서열 분석
pig genomic DNA library를 이용한 염기서열 분석 방법에서 탐침인자를 만들기 위해 사용된 프라이머(서열번호 14 ~ 서열번호 15)를 사용하여 PCR 증폭 방 법(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친 후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 30초간 신장반응)으로 확인 되는 4개(155F1, 188A9, 616B6, 874E5)의 클론(clone)을 얻어 계속적인 염기서열 분석 방법을 통해 총 33kb의 완전한 염기서열(서열번호 41)을 밝혔다.
서열번호 |
염기서열 분석용 프라이머 |
20 |
5'-TAACGAATCCAACTAGGAACC-3' |
21 |
5'-TCCTTCTCCAACCCTATATTC-3' |
22 |
5'-TGAGAGGGGAATAGAAAGAAC-3' |
23 |
5'-TATCAATAGGTCTCAGAAGATC-3' |
24 |
5'-TAGACTTCGAGTTTGGAGGG-3' |
25 |
5'-TATAAGGCACAAATGAGCCCTT-3' |
26 |
5'-AAATGCTCAACATCCCTGATTA-3' |
27 |
5'-TATTCCGTGTTCATGGATTGG-3' |
28 |
5'-AAGTATTCTCCACTGCCTTAC-3' |
29 |
5'-TGTGAGTATGGTAGAGAATTT-3' |
30 |
5'-CTATTGTGAATAGAGCTGCAAT-3' |
31 |
5'-GTGTGAGAGTGTGTACCAGTT-3' |
32 |
5'-TGTTCCCTTGTGATATATAGC-3' |
33 |
5'-CTTGTTCCCACAGTTCAAATG-3' |
34 |
5'-TAGATACCTCCACCAAGAGC-3' |
35 |
5'-TTCTCAGGTTTCCTGAGGTG-3' |
36 |
5'-GTGCACATTTACATACTGATAG-3' |
37 |
5'-ATCATCAATGAACTGAACAGGGT-3' |
38 |
5'-TTGAGACCTAAGTCACAGCTA-3' |
39 |
5'-TCCATAATAATTTATGTCAAGGG-3' |
40 |
5'-TAAGGCAAAATGTGCATGAGTG-3' |
3)
버크샤(Berkshire)종의
돼지로부터 알파
에스
1
카제인
염기서열 분석
pig genomic DNA library 분석법과 Bac clone으로부터 얻은 돼지의 알파 에스 1 카제인의 DNA 염기서열을 바탕으로 버크샤 종 돼지의 genomic DNA로부터 알파 에스 1 카제인의 염기서열을 분석하였다. genomic DNA는 첨단양돈연구소(경상남도, 대한민국)에서 분양 받은 돼지 체세포로부터 intron사(한국)의 Genomic DNA Extraction kit(cat. No. 17231)를 사용하여 분리한 것을 사용하였다. 2)에서 분석된 알파 에스 1 카제인33kb의 염기서열을 총 7부분(4.6kb, 5.7kb, 4.9kb, 5.4kb, 5.3kb, 4.7kb, 4.4kb)으로 나눈 프라이머(서열번호 42 ~ 서열번호 55)를 이용하여, PCR 증폭(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 5분간 신장반응) 후 pGEM-T 벡터에 각각을 클로닝 한 후 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석은 솔젠트 (solgent, 한국)에 의뢰 하여 진행하였다.
|
프라이머 |
서열번호 |
정방향 4.6kb |
5'-AGGATTACAAGATTGCTGTTGGA-3' |
42 |
역방향 4.6kb |
5'-AAAATCGTCAACTACCCTGATTA-3' |
43 |
정방향 5.7kb |
5'-AGCTGCAATGAACATGTGGGTG-3' |
44 |
역방향 5.7kb |
5'-CACCCACATGTTCATTGCAGCT-3' |
45 |
정방향 4.9kb |
5'-CACTCAGTATGAGAGTCTTAG-3' |
46 |
역방향 4.9kb |
5'-CTGTTCAGTTCATTGATGATTTC-3' |
47 |
정방향 5.4kb |
5'-TTTGGTTCTGCTGTGCCATAA-3' |
48 |
역방향 5.4kb |
5'-GTAGAGCTTAGAGTTCAACTC-3' |
49 |
정방향 5.3kb |
5'-CACTCAGGATGAGATTCTCTA-3' |
50 |
역방향 5.3kb |
5'-AACTGATTGATGACTACTATGTT-3' |
51 |
정방향 4.7kb |
5'-AGATCTGACACCTTCTAATTAC-3' |
52 |
역방향 4.7kb |
5'-GTGTATTCCTGCACAGCAAC-3' |
53 |
정방향 4.4kb |
5'-GTCAAACTGCCTTCTAGAGTC-3' |
54 |
역방향 4.4kb |
5'-GTAGACTTATGTGAAGCTCTG-3' |
55 |
그 결과 버크샤 종의 돼지 알파 에스 1 카제인 genomic DNA 염기서열(서열번호 1) 및 염기서열 정보를 알아내었다.
서열번호 1의 염기서열은 돼지 알파에스 1 카제인 유전자의 전체 게놈서열이며, 크기는 33248bp이다. 서열번호 1의 염기서열 중 구조 유전자(gene) 부위는 7760번째부터 27875번째까지의 염기서열이며, 시작코돈은 9326번째부터 9328번째까 지 염기서열이고, 종결코돈은 25982번째부터 25983번째까지 염기서열과 26593번째 염기 부분이다. 또한 5'UTR부위는 7760번째부터 7804번째까지의 염기서열, 및 9314번째부터 9325번째까지 염기서열이고, 3'UTR부위는 26594번째부터 26636번째까지 염기서열, 및 27482번째부터 27875번째까지 염기서열, 폴리에이시그널부위는 27855번째부터 27860번째까지 염기서열이다. 엑손부위는 7760번째부터 7804번째까지 염기서열, 9314번째부터 9376번째까지 염기서열, 12653번째부터 12685번째까지 염기서열, 13117번째부터 13137번째까지 염기서열, 13537번째부터 13578번째까지 염기서열, 14049번째부터 14072번째까지 염기서열, 14780번째부터 14803번째까지 염기서열, 16568번째부터 16591번째까지 염기서열, 17617번째부터 17646번째까지 염기서열, 18423번째부터 18446번째까지 염기서열, 18533번째부터 18580번째까지 염기서열, 20563번째부터 20604번째까지 염기서열, 22369번째부터 22386번째까지 염기서열, 22868번째부터 22906번째까지 염기서열, 24004번째부터 24030번째까지 염기서열, 25018번째부터 25041번째까지 염기서열, 25835번째부터 25983번째까지 염기서열, 26593번째부터 26636번째까지 염기서열, 및 27482번째부터 27875번째까지 염기서열 부분이고, 인트론 부위는 7805번째부터 9313번째까지 염기서열, 9377번째부터 12652번째까지 염기서열, 12686번째부터 13116번째까지 염기서열, 13138번째부터 13536번째까지 염기서열, 13579번째부터 14018번째까지 염기서열, 14073번째부터 14779번째까지 염기서열, 14804번째부터 16567번째까지 염기서열, 16592번째부터 17616번째까지 염기서열, 17647번째부터 18422번째까지 염기서열, 18447번째부터 18532번째까지 염기서열, 18581번째부터 20562번째까지 염기서열, 20605번째부 터 22368번째까지 염기서열, 22387번째부터 22867번째까지 염기서열, 22907번째부터 24003번째까지 염기서열, 24031번째부터 25017번째까지 염기서열, 25042번째부터 25834번째까지 염기서열, 25984번째부터 26592번째까지 염기서열, 및 26637번째부터 27481번째까지 염기서열이며, CDS(coding sequence)는 9326번째부터 9376번째까지 염기서열, 12653번째부터 12685번째까지 염기서열, 13117번째부터 13137번째까지 염기서열, 13537번째부터 13578번째까지 염기서열, 14049번째부터 14072번째까지 염기서열, 14780번째부터 14803번째까지 염기서열, 16568번째부터 16591번째까지 염기서열, 17617번째부터 17646번째까지 염기서열, 18423번째부터 18446번째까지 염기서열, 18533번째부터 18580번째까지 염기서열, 20563번째부터 20604번째까지 염기서열, 22369번째부터 22386번째까지 염기서열, 22868번째부터 22906번째까지 염기서열, 24004번째부터 24030번째까지 염기서열, 25018번째부터 25041번째까지 염기서열, 25835번째부터 25983번째까지 염기서열, 및 26593번째 염기서열이다.
또한, 알파 에스 1 카제인 아미노산 염기서열(서열번호 7)를 분석하였다.
상기 탐침인자의 위치와 탐침인자로 찾아낸 염기서열의 위치 구조는 도 1에 도시된 바와 같다.
도 1의 63/12-ATG-48은 돼지 알파 에스 1 카제인 2번째 엑손의 염기서열 63개중 12개의 염기서열 다음 ATG (시작코돈)가 존재하며 이후로 48개의 엑손 2번째 염기서열을 갖는 것을 의미한다. 149/147-TG는 돼지 알파 에스 1 카제인 17번째 엑손의 염기서열 149개중 147개의 염기서열 다음 TGA (종결코돈) 중 TG 가 존재 하 며, 44/A-43은 돼지 알파 에스 1 카제인 18번째 엑손의 염기서열 44개중 종결코돈의 A가 존재하고 이후로 43개의 엑손 염기서열을 갖는 것을 의미한다.
분석한 돼지 알파 에스 1 카제인 염기서열과 정보는 미국 국립생물공학정보센터에 등록 (EU025875)하였다.
<
실시예
2>
pBC1
-
pig
α
S1
casein
클로닝
벡터 구축
pBC1 벡터(인비트로젠, 미국)의 앰피실린(Ampicillin) 저항성을 가진 유전자를 네오마이신(Neomycin) 저항성 유전자로 치환한 벡터[G418 drug에 저항할 수 있는 neo' 유전자는 pEGFP-N1 벡터(Clontech, 미국)로부터 정방향 프라이머 5'-GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCAC-3'(서열번호 81)와 역방향 프라이머인 5'-CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3'(서열번호 82)을 이용하여 1.9 kb PCR 산물(서열번호 83)을 증폭하여 수득하였으며, 이 후 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하였다. T-벡터에 클로닝된 1.9 kb neo 유전자는 NotI과 PvuI 제한효소{New England Biolabs (NEB), 미국}로 절단하여 삽입 부위를 준비하였다. 또한, pBC1 벡터의 amp 유전자 (ampicillin-resistance gene) 부위를 NotI과 PvuI 제한효소로 절단하여 제거한 후 벡터 부위를 준비하였다. 이렇게 준비된 두 삽입조각 및 벡터 부위를 라이게이션을 통해, neo 유전자(neomycin-resistance gene)가 삽입된 pBC1 벡터를 구축하였다.]에 유산양(Goat) 베타카제인 (beta casein) 프로모터 (promoter) 부위와 3'genomic DNA 부위를 각각 돼지 알파 에스 1 카제인 프로모터 염기서열과 3'arm 염기서열로 치환시킨 클로닝 벡터를 구축하였다.
돼지 알파 에스 1 카제인 프로모터 염기서열 5.5kb(서열번호 3)와 3'arm 염기서열 4.3kb(서열번호 5)를 프라이머 염기서열(서열번호 56 ~ 서열번호 59)을 이용한 PCR증폭(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 5분간 신장반응)으로 산물을 얻은 뒤 각각 pGEM-T벡터(Promega, 미국)에 클로닝하였다.
|
프라이머 |
서열번호 |
프로모터 증폭용 정방향 프라이머 |
5'-GGATCCGGCTGTCGTTTTGTTATGATT-3' |
56 |
프로모터 증폭용 역방향 프라이머 |
5'-CTCGAGAACTAAAAGGCACAGGGAACT-3' |
57 |
3'arm 증폭용 정방향 프라이머 |
5'-CTCGAGTTACAATTCAGTGTGGGGAAT-3' |
58 |
3'arm 증폭용 역방향 프라이머 |
5'-GCGGCCGCCAGCTTTATTACAGGCAGAGG-3' |
59 |
돼지의 알파 에스 1 카제인 프로모터 염기서열에 존재하는 BamHI site(GGATCC) 2곳을 하기와 같이 반복적인 point mutation을 통해 BamHI 제한 효소로 잘리지 않게 하였다. point mutation을 위해 2곳 중 먼저 한 곳을 정해 프라이머를 제작하였다. 돼지 알파 에스 1 카제인 5' 프로모터 부위가 포함된 pGEM-T 벡터 DNA를 정제 후 주형으로 사용될 DNA 20 ng 과 한 쌍의 point mutation 프라이머를 사용하여 95℃ 30 초 (1반복), 95℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 8분 30초 (15 반복)의 조건으로 PCR 증폭하였다. 주형으로 사용된(point mutation 이 안된) DNA를 제거하기 위해 MutazymeTM 효소(iNtRON Biotechnology, 대한민국)를 1 ul 첨가 후 37 ℃ 에서 1시간 반응시켰다. 상기 반응물 10 ul를 DH10B competent cell(Invitrogen, 미국) 에 형질전환(Transfomation) 시키고 LB+Ampicillin 고체 배지(sigma, 미국)에 plating 후 37℃에서 20시간 배양시켰다. LB+Ampicillin 고체 배지에서 자란 콜로니를 LB+Ampicillin 액체 배지에 키운 후 DNA를 정제하여 염기서열 분석 방법으로 BamHI site가 point mutation(GGATCC -> GGACCC) 되었는지 확인하였다. 한 곳에 Point mutation된 콜로니의 DNA를 사용하여 남은 한 곳의 BamHI site도 상기와 같은 방법으로 point mutation 시켰다. 여기서 사용된 point mutation 방법은 인트론사의 제품 Site Direct Mutagenesis kit를 사용하였다.
point mutation에 사용된 프라이머 염기서열은 이하의 표와 같다.
|
프라이머 |
서열번호 |
1차 포인트 뮤테이션용 정방향 프라이머 |
5'-TATATACTACATCTTCCGGGTCCAATCATCTGTTGATGG-3' |
60 |
1차 포인트 뮤테이션용 역방향 프라이머 |
5'-CCATCAACAGATGATTGGACCCGGAAGATGTAGTATATA-3' |
61 |
2차 포인트 뮤테이션용 정방향 프라이머 |
5'-AAGACGTGGCTTGGGTCCCACGTTGCTGT-3' |
62 |
2차 포인트 뮤테이션용 역방향 프라이머 |
5'-ACAGCAACGTGGGACCCAAGCCACGTCTT-3' |
63 |
pGEM-T 벡터에 들어 있는 돼지 알파 에스 1 카제인 프로모터를 BamHI과 XhoI으로 잘라 8.5kb의 벡터를 준비하였다. 또한, 3'arm을 포함하는 염기서열 부분을 XhoI과 NotI으로 잘라 4.3kb의 삽입물(insert)(서열번호 5)을 준비하였다. 각각의 조각을 라이게이션(ligation)하여 pGEM-T-pig αS1 casein 5'+3'을 클로닝하였다.
pBC1 벡터를 BamHI과 NotI으로 잘라 10kb의 벡터를 준비하였고 pGEM-T-pig αS1 casein 5'+3'벡터를 BamHI과 NotI으로 잘라 9.8kb의 삽입물을 준비하였다. 각각의 조각을 라이게이션하여 pBC1-pig αS1 casein 클로닝 벡터를 구축하였다.
완성된 pBC1-pig αS1 casein 클로닝 벡터의 구조는 도 2와 같다.
도 2의 P αS1 casein은 엑손 1(E1)을 포함하는 돼지 aS1카제인 프로모터 염기서열(서열번호 2)이다. 엑손 1은 서열번호 1의 염기서열 중 5'-3'방향으로 가장 먼저 배열되는 엑손을 의미한다.
도 2의 αS1-casein 3'genomic DNA는 엑손 18(E18), 엑손 19(E19), 및 인트론 18(IVS 18)을 포함하는 3'arm의 염기서열(서열번호 5)이다. 엑손 18, 엑손 19는 각각 서열번호 1의 염기서열 중 5'-3'방향으로 18번째와 19번째 엑손을 의미하며, 인트론 18은 18번째 인트론을 의미한다.
XhoI 제한효소 자리를 갖게 되므로, 목적단백질의 유전자를 벡터에 삽입할 수 있다.
2Xβ-globin insulator, 및 pBR322는 pBC1벡터로 부터 기원하는 인슐레이터와 벡터구성요소이며, Neomycin은 네오마이신저항성유전자로 pEGFP-N1 벡터(Clontech, 미국)로부터 기원한다.
상기 방법으로 제조된 pBC1-pig aS1 casein 벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행(대전, 대한민국)에 기탁번호 KCTC 11324BP로 기탁하였다.
<
실시예
3>
pBC1
-
pig
aS1
casein
+
hEPO
-
WPRE
벡터 구축
pBC1 벡터(인비트로젠, 미국)의 엠피실린(Ampicillin) 저항성을 가진 유전자를 네오마이신(Neomycin) 저항성 유전자로 치환한 벡터{G418 drug에 저항할 수 있는 neo' 유전자는 pEGFP-N1 벡터(Clontech, 미국)로부터 정방향 프라이머 5'-GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCAC-3'(서열번호 81)와 역방향 프라이머인 5'- CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3'(서열번호 82)을 이용하여 1.9 kb PCR 산물(서열번호 83)을 증폭하여 수득하였으며, 이 후 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하였다. T-벡터에 클로닝된 1.9 kb neo 유전자는 NotI과 PvuI 제한효소(New England Biolabs (NEB), 미국)로 절단하여 삽입 부위를 준비하였다. 또한, pBC1 벡터의 amp 유전자 (ampicillin-resistance gene) 부위를 NotI과 PvuI 제한효소로 절단하여 제거한 후 벡터 부위를 준비하였다. 이렇게 준비된 두 삽입조각 및 벡터 부위를 라이게이션을 통해, neo 유전자(neomycin-resistance gene)가 삽입된 pBC1 벡터를 구축하였다.}에 에리트로포이에틴(hEPO)을 클로닝 하고 벡터에 존재하는 유산양(Goat) 베타카제인 (beta casein) 프로모터 (promoter) 부위와 3' genomic DNA 부위를 돼지 알파 에스 1 카제인 프로모터 염기서열(서열번호 3) 및 3'arm 염기서열(서열번호 5)로 치환시켰다. 또한 mRNA를 안정화하여 단백질 발현을 증대시킨다고 알려진 WPRE(woodchuck hepatitus virus post-transcriptional regulatory element)를 hEPO 3' 쪽에 추가함으로써 hEPO 단백질의 발현을 극대화시키도록 하였다.
hEPO와 WPRE 각각을 PCR 증폭(PT-200, BIO-RAD, 94에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 hEPO는 2분 30초, WPRE는 30초간 신장반응)으로 2.3kb(서열번호 69)와 0.6kb(서열번호 70)의 산물을 얻어 pGEM-T 벡터에 클로닝 후 염기서열을 확인하였다. hEPO가 들어있는 pGEM-T벡터를 EcoRV와 NotI(New England Biolabs (NEB), 미국)으로 자르고, WPRE가 들어있는 pGEM-T 벡터는 EcoRV와 NotI으로 잘라 각각의 조각을 라이게이션 하였다.
hEPO와 WPRE PCR 증폭을 위해 사용한 프라이머 염기서열은 이하의 표와 같다.
|
프라이머 |
서열번호 |
hEPO증폭용 정방향 프라이머 |
5'-GGATCCTGTGGTCACCCGGCGCGC-3' |
64 |
hEPO증폭용 역방향 프라이머 |
5'-GATATCCCATGGGACAGGCTGGCGCT-3' |
65 |
WPRE증폭용 정방향 프라이머 |
5'-GATATCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTC -3' |
66 |
WPRE증폭용 역방향 프라이머 |
5'-GCGGCCGCGAGCCCGAGGCGAAACAG-3' |
67 |
pBC1 벡터를 BamHI과 NotI으로 잘라 유산양의 베타 카제인 프로모터와 3'genomic DAN부분을 각각 잘라내어 벡터를 준비하였고, pGEM-T 벡터에 클로닝된 hEPO+WPRE를 BamHI과 NotI으로 잘라 2.9kb의 삽입물을 준비하였다. 준비된 벡터와 삽입물을 라이게이션하여 pBC1+hEPO-WPRE를 구축하였다. pBC1+hEPO-WPRE에 돼지 알파 에스 1 카제인의 프로모터와 3'arm을 클로닝 하기 위해 PCR 증폭으로 돼지 알파 에스 1 프로모터 염기서열 5.4kb(서열번호 3)과 3'arm 염기서열 4.3kb(서열번호 5)를 각각의 pGEM-T 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하였다.
돼지 알파 에스 1 카제인 프로모터 염기서열과 3'arm 염기서열을 PCR증폭 시키기 위해 사용한 프라이머 염기서열은 하기 표와 같다.
|
프라이머 |
서열번호 |
프로모터 증폭용 정방향 프라이머 |
5'-GGATCCGGCTGTCGTTTTGTTATGATT-3' |
70 |
프로모터 증폭용 역방향 프라이머 |
5'-GGATCCAACTAAAAGGCACAGGGAACT-3' |
71 |
3'arm 증폭용 정방향 프라이머 |
5'-GCGGCCGCTTACAATTCAGTGTGGGGAAT-3' |
72 |
3'arm 증폭용 역방향 프라이머 |
5'-GCGGCCGCCAGCTTTATTACAGGCAGAGG-3' |
73 |
돼지의 알파 에스 1 카제인 프로모터 염기서열에 존재하는 BamHI site(GGATCC) 2곳을 프라이머(서열번호 60 ~ 서열번호 63)를 이용하여 인트론 제품 Site Direct Mutagenesis로 point mutation을 시켰다. pBC1 + hEPO-WPRE벡터를 BamHI으로 자르고 Alkaline Phosphatase(CIP)를 30분간 처리하여 벡터를 준비하고 point mutatation된 돼지 알파 에스 1 카제인 5' 프로모터 DNA가 들어 있는 pGEM-T 벡터를 BamHI으로 잘라 5.5kb의 삽입물(서열번호 3)을 준비하였다. 각각의 조각을 라이게이션 하여 pBC1 pig αS1 casein 5'+hEPO-WPRE벡터를 클로닝하였다. pBC pig αS1 casein 5'+hEPO-WPRE벡터를 NotI으로 잘라 CIP를 30분간 처리하여 벡터를 준비하고 3'arm DNA가 들어 있는 pGEM-T 벡터를 NotI으로 잘라 4.3kb의 삽입물(서열번호 5)을 준비하였다. 각각의 조각을 라이게이션하여 pBC1-pig αS1 casein +hEPO-WPRE 벡터를 구축하였다.
완성된 pBC1-pig αS1 casein+hEPO-WPRE 벡터의 구조는 도 3과 같다.
도 3의 P αS1 casein은 돼지 aS1 카제인 프로모터 염기서열(서열번호 3)을 의미하며, αS1-casein 3'genomic DNA는 3'arm 염기서열(서열번호 6)을 의미한다.
hEPO는 인간EPO유전자이며, WPRE는 woodchuck hepatitus virus post-transcriptional regulatory element 유전자이다.
2Xβ-globin insulator, 및 pBR322는 pBC1벡터로 부터 기원하는 인슐레이터와 벡터구성요소이며, Neomycin은 네오마이신저항성유전자로 pEGFP-N1벡터(Clontech, 미국)로부터 기원한다.
상기 방법으로 제조된 pBC1-pig aS1 casein+hEPO-WPRE 벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행(대전, 대한민국)에 기탁번호 KCTC 11325BP로 기탁하였다.
<
실시예
4> 돼지 알파
에스
1
카제인
유전자를 이용한 낙인벡터(
Knock
-invector)
Pig
α
S1
casein
-
hEPO
knock
-
in
벡터의 구축
1)
pGEM
-T-
hEPO
벡터의
클로닝
TK유전자 선별 방법을 이용하여 특정 부위에 올바른 유전자도입 여부를 확인 할 수 있는 돼지 알파 에스 1 카제인hEPO knock-in 벡터의 구축을 위해, 먼저, 돼지 알파 에스 1 카제인 유전자에 엑손 2번 영역의 시작부터 시작 코돈까지를 포함하고 시작 코돈 이후 부터는 hEPO 유전자의 염기서열이 증폭 될 수 있도록 하는 특이적인 프라이머 2쌍(서열번호 74 ~ 76)을 준비하였다. 상기에서 준비한 돼지 알파 에스 1 카제인 엑손 2번 영역을 포함하는 프라이머를 가지고 인간의 genomic DNA(조아제약, 대한민국 특허 제10-0769291호의 pBC1-hEPO벡터)로부터 일차 PCR증폭(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 30 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 2분 30초간 신장반응)한 후, 여기서 나온 PCR산물을 다시 주형으로 하여 이차 PCR 증폭(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 30 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 2분 30초간 신장반응)을 하였다. 돼지 알파 에스1 카제인 엑손 2번 영역부터 시작 코돈까지의 염기서열을 포함하는 PCR증폭 산물 2.3kb hEPO 유전자(서열번호 68)를 pGEM-T 벡터(Promega, 미국)에 클로닝(pGEM-T-hEPO) 하였다.
hEPO PCR 증폭에 사용된 프라이머 염기서열은 다음의 표와 같다.
|
프라이머 |
서열번호 |
hEPO 증폭용 일차 정방향 프라이머 |
5'-GTGTTGACAACCATGGGGGTGCACGGTGAGTACTC-3' |
74 |
hEPO 증폭용 이차 정방향 프라이머 |
5'-GATATCTTTTCTTATATAGGTGTTGACAACCATGGGGG-3' |
75 |
hEPO 증폭용 역방향 프라이머 |
5'-GAATTCATGGGACAGGCTGGCGCTGA-3' |
76 |
2)
pGEM
-T-
pig
α
S1
casein
5'
arm
,
pGEM
-T-
pig
α
S1
casein
3'
arm
의 구축
돼지 알파 에스 1 카제인 유전자의 프로모터 염기서열(5' arm)과 3' arm 염기서열을 클로닝하기 위해, 서열번호 77 ~ 서열번호 80의 프라이머를 제작하여 돼지 genomic DNA로부터 PCR 증폭으로 산물 5.0kb(서열번호 4)와 4.9kb(서열번호 6)를 얻어 pGEM-T 벡터에 클로닝(pGEM-T-pig αS1 casein 5'arm, pGEM-T-pig αS1 casein 3'arm)하였다.
|
프라이머 |
서열번호 |
프로모터 증폭용 정방향 프라이머 |
5'-GTCGACAGCTGCAATGAACATGTGGGTG-3' |
77 |
프로모터 증폭용 역방향 프라이머 |
5'-GATATCCAAAATAAAAATTTAGGTCTGACAG-3' |
78 |
3'arm 증폭용 정방향 프라이머 |
5'-GCGGCCGCATGGCATATGGAAGTTCCCAGG-3' |
79 |
3'arm 증폭용 역방향 프라이머 |
5'-CCGCGGTGGGAACTTCCATATGCCAT-3' |
80 |
3)
Lox
A
neo
-
hEPO
벡터 구축
Lox A neo 벡터(Gerard Karsenty's, Department of Genetics and Development, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, New York 10032)를 EcoR V, EcoR I 제한 효소(New England Biolabs (NEB), 미국)로 잘라 벡터를 준비하였고 클로닝된 pGEM-T-hEPO 벡터를 EcoR V, EcoR I 제한 효소로 잘라 2.3kb의 삽입물(서열번호 68)을 준비하였다. 각각의 조각을 ligation 하여 Lox A neo-hEPO 벡터를 구축하였다.
4)
Lox
A
neo
-
hEPO
-
poly
A 벡터 구축
Lox A neo-hEPO 벡터 3'쪽으로 RNA 안정화를 위한 poly A 염기 서열을 삽입 하기 위해 Lox A neo-hEPO 벡터를 EcoR I 제한 효소로 자르고 Alkaline phosphatase(New England Biolabs (NEB), 미국)를 30분간 처리하여 벡터를 준비하 였다. 또한, pcDNA3 벡터(Invitrogen, 미국)에서 유래된 BGH(Bovine Growth Hormone) poly A를 EcoR I 제한 효소로 잘라 0.3kb의 삽입물을 준비하였다. 각각의 조각을 ligation 하여 Lox A neo-hEPO-poly A 벡터를 구축하였다.
5)
Lox
A
neo
-
hEPO
-
poly
A-5'
arm
벡터 구축
Lox A neo-hEPO-poly A 벡터 5'쪽으로 돼지 알파 에스 1 카제인 5' arm을 삽입 하기위해 Lox A neo-hEPO-poly A 벡터를 Sal I, EcoR V 제한 효소(New England Biolabs (NEB), 미국)로 잘라 벡터를 준비하고, 클로닝된 pGEM-T-pig αS1 5'arm 벡터를 Sal I, EcoR V 제한 효소로 잘라 5.0kb의 삽입물(서열번호 4)을 준비하였다. 각각의 조각을 ligation 하여 Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm 벡터를 구축하였다.
6)
Lox
A
neo
-
hEPO
-
poly
A-5'
arm
-3'
arm
벡터 구축
Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm 벡터 3'쪽으로 3'arm을 삽입하기 위해 Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm 벡터를 Not I 제한효소(New England Biolabs (NEB), 미국)로 자르고 alkaline phosphatase를 30분간 처리하여 벡터를 준비하였다. 클로닝된 pGEM-T-pig αS1 3'arm 벡터를 Not I 제한 효소로 잘라 4.9kb의 삽입물(서열번호 6)을 준비하였다. 각각의 조각을 ligation 하여 Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm-3'arm 벡터를 구축하였다.
7)
Lox
A
neo
-
hEPO
-
poly
A-5'
arm
-3'
arm
-
TK
벡터 구축
Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm-3'arm 벡터 3' 쪽으로 세포 사멸 유전자인 허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk) 유전자를 삽입 하기 위해 Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm-3'arm 벡터를 Sac II제한 효소(New England Biolabs (NEB), 미국)로 자르고 alkaline phosphatase를 30분간 처리하여 벡터를 준비하였다. pBS-TK 벡터(Gerard Karsenty's, Department of Genetics and Development, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, New York 10032)를 Not I 제한 효소로 잘라 2.3kb의 삽입물(허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제 유전자 암호화 부분)을 준비하였다. 각각의 조각을 ligation 하여 Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm-3'arm-TK 벡터(Pig aS1 casein-hEPO knock-in 벡터)를 구축하였다.
완성된 Pig αS1 casein-hEPO knock-in 벡터의 구조는 도 4와 같다.
도 4의 Pig αS1 casein 5' arm은 돼지 αS1 카제인 프로모터(서열번호 4)를 의미하며, Pig αS1 casein 3' arm은 3'arm(서열번호 6)을 의미한다.
hEPO는 인간EPO유전자이며, poly A는 폴리 A 시그널을 코딩하는 유전자이며, Neo cassette는 네오마이신 저항성 유전자로 포지티브 선별 유전자이며, PGK promoter는 포스포글리세레이트키나제(phosphoglycerate kinase;PGK) 프로모터이며, TK는 허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk) 유전자로 네거티브 선별 유전자이며, pBS-TK벡터로부터 기원한다.
상기 방법으로 제조된 Pig aS1 casein-hEPO knock-in벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행(대전, 대한민국)에 기탁번호 KCTC 11326BP로 기탁하였다.
<
실시예
5> 형질전환 세포주 제조 및
hEPO
발현 확인
1) 외래 유전자 도입 (Transfection)
생쥐 유선 세포 (HC11, 국립축산과학원, 대한민국), 생쥐 근육 세포 (C2C12, ATCC, 미국), 인간 간세포 (HepG2, ATCC, 미국), 인간 신장 세포 (Caki, ATCC, 미국), 인간 혈액 세포 (U937, ATCC, 미국), 랫트 뇌 세포 (C6, ATCC, 미국) 등을 아래와 같은 배양 조건으로 배양기에서 배양하였다.
HC11 - RPMI 1640 (Gibco, 미국), 10% Fetal Bovine Serum(FBS, HyClone, 미국), 1 % penicillin streptomycin (HyClone, 미국), insulin (sigma, 미국)5 ug/ml, 39℃, CO2 5%
C2C12, HepG2 - DMEM (Gibco, 미국), 10 % FBS, 1 % penicillin streptomycin, 37℃, CO2 5%
Caki - McCoy's 5A (Gibco, 미국), 10 % FBS, 1% penicillin streptomycin, 37℃, CO2 5%
U937 - RPMI 1640 (Gibco, 미국), 10 % FBS, 1 % penicillin streptomycin, 37℃, CO2 5%
80~90 % 정도 자란 세포주를 trypsin (HyClone) 을 이용하여 세포배양접시에서 떼어낸 후 1500 rpm에서 5분간 원심 분리 후 상층액을 제거하였다. Hemocytometer(Reichert, 미국)를 이용하여 세포수를 계수한 후 60 mm 세포배양 접 시에 5 x 105 cells/dish로 세포를 16 시간~20 시간 배양기에서 배양하였다. 외래 유전자 도입은 lipofectamine (invitrogen, 미국)을 사용하였으며 60 mm 세포배양 접시당 실시예 2 와 3에서 제조한 벡터 4 ug을 도입함으로써, 외래유전자를 도입하였다. HC 11 세포주는 외래 유전자 도입 4 시간 후 insulin (sigma, 미국) 5 ug/ml, prolactin (sigma, 미국) 5 ug/ml, hydrocortisone (sigma, 미국) 5 ug/ml을 첨가하였다.
2) 역전사 (Reverse Transcription, RT)
외래유전자 도입 후 24 시간 후에 easy-BLUE total RNA Extraction Solution(iNtRON Biotechnology, 대한민국)을 이용하여 RNA를 정제 하였다. 정제된 RNA 4 ug 과 역전사 효소인 superscript III reverse transcriptase (invitrogen, 미국)을 가지고 역전사 (reverse transcription)를 수행하였다. 이때 외래유전자로 넣어준 DNA의 오염을 막기 위해 DNase I (invitrogen)을 처리하였다. 역전사는 10 pM oligo dT 1 ul와 10 mM dNTPs 1 ul를 넣은 후 65℃에서 5분간 반응 후 얼음 안에서 1분간 반응하였다. 다음으로 5X buffer 4 ul 와 0.1 M DTT 1 ul, reverse transcriptase 1 ul 를 넣은 후 50℃에서 60분 반응 후 70℃에서 15분간 반응 시켜 cDNA를 합성하였다.
3) 실시간 PCR (Real Time - PCR)
민감도가 우수한 실시간 PCR 방법을 이용하여 각 세포주에 도입 시킨 EPO 발현을 확인하였다. 실시간 PCR은 역전사 효소를 이용하여 만든 cDNA를 주형으로 SYBR Green qPCR kit (FINNZYMES, 핀란드)와 DNA engine Opticon 2 (BIO-RAD, 미국)를 이용하여 실시간 PCR (94℃에서 5분간 변성 과정을 거친 후, 다음의 50 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 60초간 신장반응 후 형광 값 측정)을 하였다. 형광 값 보정을 위하여 벡터내의 Neo 유전자와 세포내의 beta actin 유전자를 기준으로 하였다. 결과 분석은 GeneExMacro 3.0 (BIO-RAD) 프로그램을 사용하였다. PCR에 사용한 프라이머(서열번호 84 ~ 91)는 하기 표와 같다.
|
프라이머 |
서열번호 |
EPO 증폭용 정방향 |
5'-CAAGGAGGCCGAGAATATCA-3' |
84 |
EPO 증폭용 역방향 |
5'-AAGTGTCAGCAGTGATTGTTCG-3' |
85 |
Neo 증폭용 정방향 |
5'-GCTACCCGTGATATTGCTGAA-3' |
86 |
Neo 증폭용 역방향 |
5'-CAACACCGTGCGTTTTATTCT-3' |
87 |
인간 beta actin 증폭용 정방향 |
5'-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3' |
88 |
인간 beta actin 증폭용 역방향 |
5'-TTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG-3' |
89 |
생쥐 beta actin 증폭용 정방향 |
5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3' |
90 |
생쥐 beta actin 증폭용 역방향 |
5'-TTTGATGTCACGCACGATTTTCC-3' |
91 |
실시간 PCR 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 pBC1-pig αS1 casein 벡터와 pBC1-pig αS1 casein+hEPO-WPRE 벡터를 도입 시킨 유선세포 및 유선세포 이외의 조직세포에서의 hEPO 발현결과를 나타내며, 같은 세포주에 대조군으로 pBC1 벡터 (invitrogen) 와 pBC1-hEPO-WPRE (조아제약, 대한민국 특허 제 10-0769291 호) 벡터를 도입시켰다. x 축은 각각의 세포주를 나타내고, y 축은 pBC1-pig αS1 casein 벡터와 pBC1 벡터의 결과 값을 1로 하였을 경우 각 세포주에서 발현되는 hEPO의 상대적 비율을 나타낸다. 도 5에서 pPAC는 실시예 2의 pBC1-pig αS1 casein 벡터를 의미하고 pPAC-hEPO는 실시예 3의 pBC1-pig αS1 casein+hEPO-WPRE를 의미한다. pBC1은 염소 프로모터를 갖고 유선특이적으로 발현하도록 만들어 판매되는 invitrogen 사의 벡터이고, pBC1-hEPO는 pBC1-hEPO-WPRE를 의미한다.
도 5에서 보는 바와 같이 hEPO는 생쥐 유선세포 HC11 세포에서 가장 많이 발현하였고 인간 간세포 HepG2와 생쥐 근육세포 C2C12 세포에서는 약하게 발현 하였으며 다른 조직의 세포에서는 발현되지 않음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 벡터로 형질전환된 유선세포에서 목적하는 단백질을 생산할 수 있음을 알 수 있다.
<
실시예
6> 미세주입법에 의한 동물수정란과 그를 이용한 형질전환동물 구축 및
EPO
제조
1) 유전자의 정제
실시예 3에서 제조한 벡터를 Sal 1 (NEB, R0138)을 이용하여 선형으로 만든 후 Qiagen사의 QIAquick Gel Extraction kit(Q-28706)를 이용하여 정제하여 주입용 버퍼(10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH 7.4)에 용리시켜 최종 농도를 2ng/ul로 5ul씩 분주하여 -20℃에 보관하였다.
2)
과배란
암컷 쥐로부터 수정란의 회수
8주령의 C57BL/6 암컷 쥐(오리엔트 바이오, 대한민국)를 5 IU의 pregnant mare serum gonadotropin (PMSG; Intervet, Netherlands)의 주사 후 46시간 뒤에 5 IU의 human chorionic gonadotropin (hCG, Intervet)을 주사하여 과배란을 유도하 였다. 12시간마다 빛 조절(7 a.m. to 7 p.m.)이 되며, PMSG는 11 a.m에 hCG는 9 a.m에 복강투여 방법으로 주입되었다. hCG 주입 후 같은 종의 수컷 쥐와 교미를 시켜 다음날 암컷 쥐의 질입구(vaginal plugs)를 확인하여 정상적으로 교미가 진행되었음을 확인한 후 난관을 적출하였다. 난자-난구세포 복합체를 분리시키기 위해 적출된 난관을 0.1% hyaluronidase (Sigma, H3884)가 포함된 M2 (Sigma, M7167) 배양액으로 옮긴 후 팽대부 부분을 찢었다. 잠시 후 난구세포가 분리된 수정란만을 회수하여 깨끗한 M2 배양액에 씻어서 M16 (Sigma, M7292) 배양액으로 옮겨 미세주입 실험 전까지 37℃, 5% CO 2 인큐베이터에서 배양하였다.
3) 유전자의 미세주입
챔버 슬라이드(Nunclon, Denmark)에 M2 배양액을 소량 떨어뜨린 후 증발을 막기 위해 오일로 덮어 미세주입용 디쉬를 준비한 후 회수된 수정란을 올려놓았다. 수정란의 미세주입은 수정란의 미세조작을 위한 장비인 OLYMPUS 1X71 TH4-200 inverted microscope (Narishige, Tokyo, Japan)에서 수행하였다. Microloader (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 femtojet automatic injector (Eppendorf)에 연결된 femtotip injection pipette (Eppendorf)에 미리 준비된 1)의 정제 유전자를 로딩한다. holding pipette으로 난자를 잡고 수정란의 전핵에 현미경의 초점을 맞춘 후 femtotip injection pipette을 이용하여 난자의 투명대를 뚫고 전핵까지 들어간 후 femtojet automatic injector를 이용하여 상기 유전자를 전핵에 주입하여 전핵의 팽창을 확인하면 난자로부터 injection pipette을 빼내였 다. 미세주입 후 살아남은 난자는 M16 배양액으로 옮겨 37℃, 5% CO 2 인큐베이터에 넣어두었다.
4) 수정란 이식
미세주입 실험 하루 전날 6주령의 BDF-1 암컷 쥐(오리엔트 바이오, 대한민국)를 같은 종의 거세된 수컷과 교미를 시켜 가임신을 유도하였다. 실험전 암컷 쥐의 질입구(vaginal plugs)를 확인하여 정상적으로 교미가 진행되어 가임신이 유도된 암컷쥐에 avertin (Sigma)을 복강 주입하여 마취시킨 후 쥐 등의 옆구리와 흉각 사이의 중간부분을 절개하여 난소 지방을 당겨 난소 및 난관을 꺼냈다. 난소 지방을 수술용 집게로 고정시키고 난소와 난관 사이를 둘러싸고 있는 포낭을 찢어 난관 입구를 확인 한 후 미리 준비된 이식용 파이펫을 난관 입구에 삽입하여 난자를 이식하였다. 수정란 이식은 양쪽의 난관 모두에 수행되었다. 이식 후 확인을 위한 마커 버블 4개와 15개의 미세주입 수정란 및 최종 마커 버블 한 개로 이루어진 이식용 파이펫을 이용하였다.
5) 유전자 도입 확인
수정란 이식 3주 후 새끼가 태어나면 새끼의 꼬리를 잘라 Dneasy Blood&Tissue kit (Qiagen, Q-69506)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 돼지 알파 에스 1 카제인 유전자가 도입된 형질전환 쥐의 확인을 위하여 추출된 DNA에서 EPO-WPRE 유전자 부위와 WPRE-3‘arm 유전자 부위를 증폭 시키는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭실험(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 55℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 30초간 신장반응)을 실시하여 돼지 알파 에스 1 카제인 유전자의 도입을 확인하였다.
EPO-WPRE PCR 증폭에 사용된 프라이머 염기서열은 다음의 표와 같다.
|
프라이머 |
서열번호 |
EPO-WPRE 증폭용 정방향 프라이머 |
5'-AACTCTTCCGAGTCTACTCCA-3' |
92 |
EPO-WPRE 증폭용 역방향 프라이머 |
5'-CTCCTCATAAAGAGACAGCAAC-3' |
93 |
WPRE-3'arm 증폭용 정방향 프라이머 |
5'-TTCCTGTTAATCAACCTCTGG-3' |
94 |
WPRE-3'arm 증폭용 역방향 프라이머 |
5'-TACCAAAGGCCATAATTGTGG-3' |
95 |
그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 실시예 3의 발현벡터 pBC1-pig alpha S1 casein+hEPO-WPRE 벡터로 형질전환된 생쥐를 선별하기 위한 PCR 결과를 나타낸다. 도 6의 EPO-WPRE는 EPO-WPRE 유전자 부위에 대한 결과이고, WPRE-3'arm는 EPO-alpha S1 3'arm 유전자 부위에 대한 결과이다. M은 크기마커(size marker), V는 pBC1-pig-alpha S1 casein-EPO-WPRE 벡터, N은 음성대조를 위한 정상 마우스 genomic DNA, 숫자는 각각의 개체를 의미한다.
그 결과로부터 유전자 도입 여부를 확인하여 형질전환된 쥐를 선발하였다.
6)형질전환 실험동물의 번식 및 유전자 전이 확인
돼지 알파 에스 1 카제인 유전자 도입이 확인된 형질전환 쥐 중 암컷은 성성숙 시기인 6주령이 지난 후 정상 수컷과 교배하여 새끼를 생산한 후, 새끼에 대하여 상기 5)와 동일한 방법으로 외래 유전자의 도입을 확인하였다.
도 7은 실시예 3의 발현벡터 pBC1-pig alpha S1 casein+hEPO-WPRE 벡터로 형질전환된 생쥐를 선별하기 위한 PCR 결과를 나타낸다. 도 7의 EPO-WPRE는 EPO-WPRE 유전자 부위에 대한 결과이고, WPRE-alpha S1은 EPO-alpha S1 3'arm 유전자 부위에 대한 결과이다. M은 크기마커(size marker), V는 pBC1-pig-alpha S1 casein-EPO-WPRE 벡터, N은 음성대조를 위한 정상 마우스 genomic DNA, 1-1 ~ 1-6은 형질전환 쥐의 새끼를 의미한다.
7) 형질전환 어미쥐의 유즙에서
EPO
의
존재여부
및 함량확인
어미쥐를 수유 7일 후 새끼쥐를 격리시키고, 2시간후 옥시토신 10 IU를 복강 주사함과 동시에 유선을 맛사지 하면서 유즙을 채취하였다. 유즙을 이용하여 Western blot assay를 수행하였다. 12% SDS-PAGE한 젤을 PVDF막(millipore, 미국)에 transfer 한 후 5% Skim milk blocking solution에서 항온처리 하였다. 막에 항-인간 EPO 항체(1:1,000, hEPO anti-rabbit antibody, R&D systems Cat. No. AB-286-NA, Lot No. HX01, 미국)를 제조사의 프로토콜에 따라 첨가하여 1시간 동안 상온에서 항온처리 하였다. 30분 동안 TBST buffer(tris buffered saline buffer, 0.01% tween-20)로 막을 씻어준 다음 퍼옥시다제로 레이블 된 항 토끼 항체(1: 3,000, peroxidase labeled anti-rabbit antibody, GE healthcare, Cat. No. NA9340V, Lot No. 348424, 영국)를 첨가하고 1시간 동안 상온에서 항온처리한 후 TBST buffer로 세정한 후 필름에 노출하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8은 형질전환된 어미쥐의 유즙을 이용하여 웨스텃블럿 어세이한 결과를 나타낸다. 도 8의 1~4는 EPO 스탠다드(calbiochem, 미국), 5 ~ 6은 시료를 나타낸다.
그 결과 유즙에서 32 KDa 분자량을 가진 단백질이 발현됨을 확인하였다.
또한, 어미쥐의 유즙내 hEPO의 농도를 확인하기 위하여 ELISA kit(Stem Cell Technology)를 이용하여 사용설명서에 따라 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하였다. 그 결과 유즙내 hEPO가 50,000-200,000 IU/ml이 발현됨을 확인하였다.