JP2011526495A - 豚のαS1カゼイン遺伝子、そのプロモーター、及びその用途 - Google Patents
豚のαS1カゼイン遺伝子、そのプロモーター、及びその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011526495A JP2011526495A JP2011516140A JP2011516140A JP2011526495A JP 2011526495 A JP2011526495 A JP 2011526495A JP 2011516140 A JP2011516140 A JP 2011516140A JP 2011516140 A JP2011516140 A JP 2011516140A JP 2011526495 A JP2011526495 A JP 2011526495A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vector
- casein
- animal
- gene
- expression vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108050000244 Alpha-s1 casein Proteins 0.000 title claims abstract description 124
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 135
- 102000009366 Alpha-s1 casein Human genes 0.000 claims abstract description 88
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 48
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims abstract description 23
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims abstract description 23
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 166
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 claims description 35
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 claims description 33
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 15
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 12
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 12
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 12
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 9
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 7
- 239000012212 insulator Substances 0.000 claims description 7
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 6
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000283923 Marmota monax Species 0.000 claims description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 33
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 30
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 29
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 21
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 21
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 18
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 18
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 14
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 14
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 7
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 7
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 6
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 6
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 6
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 6
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 6
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 6
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 4
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 3
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 3
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 3
- 101100333654 Homo sapiens EPO gene Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101000741052 Sus scrofa Alpha-S1-casein Proteins 0.000 description 3
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 3
- 101150047086 arm gene Proteins 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 102100027467 Pro-opiomelanocortin Human genes 0.000 description 2
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 2
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 2
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N Aldosterone Chemical compound C([C@@]1([C@@H](C(=O)CO)CC[C@H]1[C@@H]1CC2)C=O)[C@H](O)[C@@H]1[C@]1(C)C2=CC(=O)CC1 PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N 0.000 description 1
- PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N Aldosterone Natural products C1CC2C3CCC(C(=O)CO)C3(C=O)CC(O)C2C2(C)C1=CC(=O)CC2 PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 229920002491 Diethylaminoethyl-dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100497384 Drosophila melanogaster CASK gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000741054 Mus musculus Alpha-S1-casein Proteins 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031951 Oxytocin-neurophysin 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000021839 RNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960002478 aldosterone Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229940090047 auto-injector Drugs 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- -1 oxy 2- (1-hydroxyethyl) oxane-3,4-diol Chemical compound 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950004616 tribromoethanol Drugs 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000001177 vas deferen Anatomy 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 1
- 235000021249 α-casein Nutrition 0.000 description 1
- 235000021246 κ-casein Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4732—Casein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
- A01K2217/206—Animal model comprising tissue-specific expression system, e.g. tissue specific expression of transgene, of Cre recombinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/108—Swine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
本発明の乳線特異的遺伝子を分離するために、promega社の豚ゲノムDNAライブラリーと国立畜産科学院(京畿道水原市権善区畜産路77五木川洞564国立畜産科学院、大韓民国)から提供を受けたBAC(bacterial artificial chromosome)クローンを持って豚のαS1カゼイン遺伝子(豚αS1カゼイン 遺伝子)の塩基配列(sequence)を明らかにした。
豚のαS1カゼイン遺伝子の塩基配列が明らかでなかったため、塩基配列が明らかであったヒト、牛、ウマ、及びマウスのαS1カゼインcDNA塩基配列を比較して種間の高い相同性と保存された部分を参照して、豚αS1カゼインPCR増幅に使われるプライマー塩基配列を製作した。5’UTR側正方向プライマー 5’−TGACAACCATGAAACTTCTCAT−3’(配列番号8)、逆方向プライマー 5’−GTTCCTGATGC CTGAGAGGA−3’(配列番号9)、3’UTR側正方向プライマー 5’−AACCATTTTATCTGAA GACTTTG−3’(配列番号10)、逆方向プライマー 5’−TCTCAGTCACTGCACACAATT−3’(配列番号11)を用いて、豚のゲノムDNAからPCR増幅(PT−200、BIO−RAD、94℃で5分間変性過程を経た後、次の35サイクルを遂行した:94℃で30秒間変性後、56℃で30秒間プライマー結合し、72℃で5分間伸張反応)した結果、5’UTR側に3.3kbの塩基配列(配列番号12)と3’UTR側に303bpの塩基配列(配列番号13)からなる産物を得た。これをpGEM−Tベクター(promega、米国)にクローニングした(cloning)後、塩基配列分析(sequencing)を通じて豚αS1カゼインの遺伝子の一部であることを確認し、5’UTR側3.3kbと3’UTR側303bpの塩基配列を明らかにした。
物を得てpGEM−Tベクター(promega、米国)にクローニングした後、完全な塩基配列を得た。
豚ゲノムDNAライブラリーを用いた塩基配列分析方法において、プローブを作るために使われたプライマー(配列番号14〜配列番号15)を使用してPCR増幅方法(PT−200、BIO−RAD、94℃で5分間変性過程を経た後、次の35サイクル(cycle)を遂行した:94℃で30秒間変性後、56℃で30秒間プライマー結合、72℃で30秒間伸張反応)により確認される4個(155F1、188A9、616B6、874E5)のクローン(clone)を得て継続的な塩基配列分析方法を通じて総33kbの完全な塩基配列(配列番号41)を明らかにした。
豚ゲノムDNAライブラリー分析法とBacクローンから得た豚のαS1カゼインのDNA塩基配列に基づいてバークシャー種の豚のゲノムDNAからαS1カゼインの塩基配列を分析した。ゲノムDNAは尖端養豚研究所(慶尚南道、大韓民国)から分譲を受けた豚の体細胞からintron社(韓国)のゲノムDNA抽出キット(cat. No. 17231)を使用して分離したものを使用した。2)で分析されたαS1カゼイン33kbの塩基配列を全部で7部分(4.6kb、5.7kb、4.9kb、5.4kb、5.3kb、4.7kb、4.4kb)に分けたプライマー(配列番号42〜配列番号55)を用いて、PCR増幅(PT−200、BIO−RAD、94℃で5分間変性過程を経た後、次の35サイクルを遂行した:94℃で30秒間変性後、56℃で30秒間プライマー結合、72℃で5分間伸張反応)後、pGEM−Tベクターにそれぞれをクローニングした後、塩基配列を分析した。塩基配列分析は、ソルゼント(solgent、韓国)に依頼して行った。
17647番目から18422番目までの塩基配列、18447番目から18532番目までの塩基配列、18581番目から20562番目までの塩基配列、20605番目から22368番目までの塩基配列、22387番目から22867番目までの塩基配列、22907番目から24003番目までの塩基配列、24031番目から25017番目までの塩基配列、25042番目から25834番目までの塩基配列、25984番目から26592番目までの塩基配列、及び26637番目から27481番目までの塩基配列であり、CDS(coding sequence)は9326番目から9376番目までの塩基配列、12653番目から12685番目までの塩基配列、13117番目から13137番目までの塩基配列、13537番目から13578番目までの塩基配列、14049番目から14072番目までの塩基配列、14780番目から14803番目までの塩基配列、16568番目から16591番目までの塩基配列、17617番目から17646番目までの塩基配列、18423番目から18446番目までの塩基配列、18533番目から18580番目までの塩基配列、20563番目から20604番目までの塩基配列、22369番目から22386番目までの塩基配列、22868番目から22906番目までの塩基配列、24004番目から24030番目までの塩基配列、25018番目から25041番目までの塩基配列、25835番目から25983番目までの塩基配列、及び26593番目の塩基配列である。
pBC1ベクター(インビトロジェン、米国)のアンピシリン(Ampicillin)抵抗性を有する遺伝子をネオマイシン(Neomycin)抵抗性遺伝子に置換したベクター[G418 薬剤(drug)に抵抗することができるneo遺伝子は、pEGFP−N1ベクター(Clontech、米国)から正方向プライマー5’−GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCAC−3’(配列番号81)と逆方向プライマーである5’−CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC−3’(配列番号82)を用いて1.9kb PCR産物(配列番号83)を増幅して収得し、その後、pGEM T−easyベクターにクローニングした。T−ベクターにクローニングされた1.9kb neo遺伝子はNotIとPvuI制限酵素{New England Biolabs (NEB)、米国}で切断して挿入部位を用意した。また、pBC1ベクターのamp遺伝子(アンピシリン耐性遺伝子)部位をNotIとPvuI制限酵素で切断して除去した後、ベクター部位を用意した。このように用意した2挿入片及びベクター部位をライゲーションを通じて、neo遺伝子(ネオマイシン耐性遺伝子)が挿入されたpBC1ベクターを構築した。]に乳山羊(Goat)ベータカゼイン(beta casein)プロモーター(promoter)部位と3’ゲノムDNA部位をそれぞれ豚αS1カゼインプロモーター塩基配列と3’arm塩基配列に置換させたクローニングベクターを構築した。
pBC1ベクター(インビトロジェン、米国)のアンピシリン(Ampicillin)抵抗性を有する遺伝子をネオマイシン(Neomycin)抵抗性遺伝子に置換したベクター{G418 薬剤(drug)に抵抗することができるneo’遺伝子はpEGFP−N1ベクター(Clontech、米国)から正方向プライマー5’−GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCAC−3’(配列番号81)と逆方向プライマーである5’−CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC−3’(配列番号82)を用いて1.9kb PCR産物(配列番号83)を増幅して得て、その後、pGEM T−easyベクターにクローニングした。T−ベクターにクローニングされた1.9kb neo遺伝子はNotIとPvuI制限酵素(New England Biolabs(NEB)、米国)で切断して挿入部位を用意した。また、pBC1ベクターのamp遺伝子(アンピシリン耐性遺伝子)部位をNotIとPvuI制限酵素で切断して除去した後、ベクター部位を用意した。このように用意した2挿入片及びベクター部位をライゲーションを通じて、neo遺伝子(ネオマイシン耐性遺伝子)が挿入されたpBC1ベクターを構築した。}にヒトエリスロポエチン(hEPO)をクローニングし、ベクターに存在する乳山羊(Goat)ベータカゼイン(ベータカゼイン)プロモーター(promoter)部位と3’ゲノムDNA部位を豚αS1カゼインプロモーター塩基配列(配列番号3)及び3’arm塩基配列(配列番号5)に置換させた。また、mRNAを安定化してたんぱく質発現を増大させると知られるWPRE(woodchuck hepatitus virus post−transcriptional regulatory element)をhEPOの3’側に追加することで、hEPOたんぱく質の発現を極大化させるようにした。
1)pGEM−T−hEPOベクターのクローニング
TK遺伝子選択方法を用いて特定部位に正しい遺伝子が導入されたか否かを確認することができる豚αS1カゼインhEPOノックインベクターの構築のために、まず、豚αS1カゼイン遺伝子にエクソン2番領域の開始から開始コドンまでを含み、開始コドン以後からはhEPO遺伝子の塩基配列が増幅できるようにする特異的なプライマー2対(配列番号74〜76)を用意した。上記で用意した豚αS1カゼインエクソン2番領域を含むプライマーを用いてヒトのゲノムDNA(ゾア製薬、大韓民国特許第10−0769291号のpBC1−hEPOベクター)から1次PCR増幅(PT−200、BIO−RAD、94℃で5分間変性過程を経た後、次の30サイクルを遂行した:94℃で30秒間変性後、56℃で30秒間プライマー結合、72℃で2分30秒間伸張反応)した後、これから出たPCR産物をまた鋳型にして2次PCR増幅(PT−200、BIO−RAD、94℃で5分間変性過程を経た後、次の30サイクルを遂行した:94℃で30秒間変性後、 56℃で30秒間プライマー結合、72℃で2分30秒間伸張反応)をした。豚αS1カゼインエクソン2番領域から開始コドンまでの塩基配列を含むPCR増幅産物2.3kb hEPO遺伝子(配列番号68)をpGEM−Tベクター(Promega、米国)にクローニング(pGEM−T−hEPO)した。
豚αS1カゼイン遺伝子のプロモーター塩基配列(5’arm)と3’arm塩基配列をクローニングするために、配列番号77〜配列番号80のプライマーを製作して豚ゲノムDNAからPCR増幅により産物5.0kb(配列番号4)と4.9kb(配列番号6)を得てpGEM−Tベクターにクローニング(pGEM−T−豚αS1カゼイン5’arm, pGEM−T−豚αS1カゼイン3’arm)した。
Lox A neoベクター(Gerard Karsenty’s, Department of Genetics and Development, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, New York 10032)をEcoRV、EcoRI制限酵素(New England Biolabs(NEB)、米国)で切ってベクターを用意し、クローニングされたpGEM−T−hEPOベクターをEcoR V、EcoR I制限酵素で切って2.3kbの挿入物(配列番号68)を用意した。それぞれの片をライゲーションしてLox A neo−hEPOベクターを構築した。
Lox A neo−hEPOベクター3’側にRNA安定化のためのポリA(polyA)塩基配列を挿入するためにLox A neo−hEPOベクターをEcoR I制限酵素で切り、アルカリフォスファターゼ(Alkaline phosphatase)(New England Biolabs(NEB)、米国)を30分間処理してベクターを用意した。また、pcDNA3ベクター(Invitrogen、米国)から由来したBGH(ウシ成長ホルモン、Bovine Growth Hormone)ポリAをEcoR I制限酵素で切って0.3kbの挿入物を用意した。それぞれの片をライゲーションしてLox A neo−hEPO−polyAベクターを構築した。
Lox A neo−hEPO−ポリAベクター5’側に豚αS1カゼイン5’armを挿入するためにLox A neo−hEPO−ポリAベクターをSal I、EcoR V制限酵素(New England Biolabs(NEB)、米国)で切ってベクターを用意し、クローニングされたpGEM−T−豚αS1 5’armベクターをSal I、EcoR V制限酵素で切って5.0kbの挿入物(配列番号4)を用意した。それぞれの片をライゲーションしてLox A neo−hEPO−ポリA−5’armベクターを構築した。
Lox A neo−hEPO−ポリA−5’armベクター3’側に3’armを挿入するためにLox A neo−hEPO−ポリA−5’armベクターをNotI制限酵素(New England Biolabs(NEB)、米国)で切り、アルカリフォスファターゼを30分間処理してベクターを用意した。クローニングされたpGEM−T−豚αS1 3’armベクターをNot I制限酵素で切って4.9kbの挿入物(配列番号6)を用意した。それぞれの片をライゲーションしてLox A neo−hEPO−ポリA−5’arm−3’armベクターを構築した。
Lox A neo−hEPO−ポリA−5’arm−3’armベクター3’側に細胞死滅遺伝子である単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ(Herpes simplex virus−thymidine kinase:HSV−tk)遺伝子を挿入するために、Lox A neo−hEPO−ポリA−5’arm−3’arm ベクターをSacII制限酵素(New England Biolabs(NEB)、米国)で切り、アルカリフォスファターゼを30分間処理してベクターを用意した。pBS−TKベクター(Gerard Karsenty’s, Department of Genetics and Development, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, New York 10032)をNot I制限酵素で切って、2.3kbの挿入物(単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ遺伝子暗号化部分)を用意した。それぞれの片をライゲーションしてLox A neo−hEPO−ポリA−5’arm−3’arm−TK ベクター(豚αS1カゼインhEPOノックインベクター)を構築した。
1)外来遺伝子導入(Transfection)
マウス乳線細胞(HC11、国立畜産科学院、大韓民国)、マウス筋肉細胞(C2C12、ATCC、米国)、ヒト幹細胞(HepG2、ATCC、米国)、ヒト腎臓細胞(Caki、ATCC、米国)、ヒト血液細胞(U937、ATCC、米国)、ラット脳細胞(C6、ATCC、米国)などを下記のような培養条件で、インキュベーターで培養した。
C2C12, HepG2− DMEM(Gibco、米国)、10%FBS、1% ペニシリンストレプトマイシン、37℃、CO25%
Caki − McCoy’s 5A(Gibco、米国)、10%FBS、1% ペニシリンストレプトマイシン、37℃、CO25%
U937 − RPMI 1640(Gibco、米国)、10%FBS、1% ペニシリンストレプトマイシン、37℃、CO25%
外来遺伝子導入後、24時間後にeasy−BLUE total RNA Extraction Solution(iNtRON Biotechnology、大韓民国)を用いてRNAを精製した。精製されたRNA 4ugと逆転写酵素であるsuperscript III逆転写酵素(reverse transcriptase)(invitrogen、米国)を用いて逆転写(reverse transcription)を実施した。この際、外来遺伝子に導入したDNAの汚染を防ぐためにDNase I(invitrogen)処理を実施した。逆転写は10pM オリゴdT 1ulと10mM dNTP 1ulを入れた後、65℃で5分間反応後、氷中で1分間反応させた。次に、5X buffer 4ulと0.1M DTT 1ul、逆転写酵素 1ulを入れた後、50℃で60分反応後、70℃で15分間反応させてcDNAを合成した。
高感受性リアルタイムPCRアッセイを用いて各細胞株に導入させたEPO発現を確認した。リアルタイムPCRは逆転写酵素を用いて作ったcDNAを鋳型にしてSYBR Green qPCR kit(FINNZYMES、フィンランド)とDNA engine Opticon 2(BIO−RAD、米国)を用いてリアルタイムPCR(94℃で5分間変性過程を経た後、次の50サイクルを遂行した:94℃で30秒間変性後、56℃で30秒間プライマー結合、72℃で60秒間伸張反応後、蛍光値測定)を行った。蛍光値の補正のためにベクター内のNeo遺伝子と細胞内のベータアクチン遺伝子を基準として用いた。結果分析はGeneExMacro 3.0(BIO−RAD)プログラムを使用した。PCRに使用したプライマー(配列番号84〜91)は、下記の表の通りである。
1)遺伝子の精製
実施例3で製造したベクターをSal 1(NEB, R0138)を用いて線形にした後、Qiagen社のQIAquick Gel Extraction kit(Q−28706)を用いて精製して、注入用バッファー(10mM Tris−HCl、0.1mM EDTA、pH7.4)に溶離させて最終濃度を2ng/ulに5ulずつに分けて−20℃に保管した。
8週齢のC57BL/6雌マウス(オリエントバイオ、大韓民国)に5 IUの妊馬血清性性腺刺激ホルモン(pregnantmare serum gonadotropin)(PMSG:Intervet、Netherlands)の注射後、46時間後に5 IUのヒト性腺刺激ホルモン(human chorionic gonadotropin)(hCG、Intervet)を注射して過排卵を誘導した。12時間毎に光調節(午前7時から午後7時)され、PMSGは午前11時に、hCGは午前9時に腹腔投与方法により注入された。hCG注入後、同一種の雄マウスと交尾させて翌日雌マウスの膣入口(vaginal plugs)を確認して正常に交尾が行われたことを確認した後、卵管を摘出した。卵子−卵球細胞複合体を分離させるために摘出された卵管を0.1%ヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)(Sigma、H3884)が含まれたM2(Sigma、M7167)培養液に移した後、膨大部分を破った。暫くして、卵球細胞が分離された受精卵のみを回収して清潔なM2培養液で洗ってM16(Sigma、M7292)培養液に移して微量注入の実験前まで37℃、5%のCO2インキュベーターで培養した。
チャンバースライド(Nunclon、Denmark)にM2培養液を少量垂らした後、蒸発を防ぐためにオイルで覆って微量注入用の皿を用意した後、回収した受精卵を設置した。受精卵の微量注入は、受精卵の微量操作のための装備であるOLYMPUS 1X71 TH4−200 inverted microscope(Narishige, Tokyo, Japan)で遂行した。Microloader(Eppendorf, Hamburg, Germany)を用いてfemtojet automatic injector (Eppendorf)に連結されたfemtotip注入用ピペット(injection pipette)(Eppendorf)に予め用意した1)の精製遺伝子をローディングした。保持用ピペット(holding pipette)で卵子を取り、受精卵の前核に顕微鏡の焦点を合せた後、femtotip injection pipetteを用いて卵子の透明帯を開けて前核まで入れた後、femtojet automatic injectorを用いて上記遺伝子を前核に注入して前核の膨脹を確認できた場合、卵からinjection pipetteを取り出した。微量注入後、生きている卵はM16培養液に移して37℃、5%のCO2インキュベーターで培養した。
微量注入実験の一日前に6週齢のBDF−1雌マウス(オリエントバイオ、大韓民国)を同一種の去勢された雄と交尾させて擬似妊娠を誘導した。実験前に雌マウスの膣入口(vaginal plugs)を確認して正常に交尾が行われて擬似妊娠が誘導された雌マウスにavertin(Sigma)を腹腔注入して麻酔させた後、マウスの背の横腹と胸脚との間の中間部分を切開して卵巣脂肪を引っ張って卵巣及び卵管を取り出した。卵巣脂肪を手術用鉗子で固定させ、卵巣と卵管との間を囲んでいる包嚢を破いて卵管入口を確認した後、予め用意した移植用ピペットを卵管入口に挿入して卵を移植した。受精卵移植は、両側の卵管に行った。移植後、確認のためのマーカーバブル(marker bubble)4個と15個の微量注入受精卵及び最終マーカーバブル1つからなる移植用ピペットを用いた。
受精卵移植3週後、子が生まれれば、子の尻尾を切ってDneasy Blood&Tissue kit(Qiagen, Q−69506)を用いてゲノムDNAを抽出した。豚αS1カゼイン遺伝子が導入された形質転換マウスの確認のために、抽出されたDNAでEPO−WPRE遺伝子部位とWPRE−3’arm遺伝子部位を増幅させるプライマーを用いてPCR増幅実験(PT−200、BIO−RAD、94℃で5分間変性過程を経た後、次の35サイクルを遂行した:94℃で30秒間変性後、55℃で30秒間プライマー結合、72℃で30秒間伸張反応)を実施して、豚αS1カゼイン遺伝子の導入を確認した。
豚αS1カゼイン遺伝子導入が確認された形質転換マウスのうち、性成熟時期である6週齢が過ぎた後、雌を正常雄と交配して子を生産させた後、子に対して上記5)と同一方法により外来遺伝子の導入を確認した。
親マウスを授乳7日後、子マウスを隔離させ、2時間後、オキシトシン10 IUを腹腔注射すると共に、乳線をマッサージしながら乳汁を採取した。乳汁を用いてウェスタンブロットアッセイ(Western blot assay)を遂行した。12%SDS−PAGEしたゲルをPVDF膜(millipore、米国)に移した後、5%のスキムミルクブロッキング溶液(skim milk blocking solution)で恒温処理した。膜に抗−ヒトEPO抗体(1:1,000、hEPO 抗ウサギ抗体(anti−rabbit antibody)、 R&D systems Cat. No. AB−286−NA, Lot No. HX01、米国)を製造社のプロトコルに従って添加して1時間、常温で恒温処理した。30分間TBSTバッファー(トリス緩衝食塩水(tris buffered saline buffer)、0.01% tween−20)で膜を洗った後、ペルオキシダーゼでラベルされた抗ウサギ抗体(1:3,000、peroxidase labeled anti−rabbit antibody, GE healthcare, Cat. No. NA9340V, Lot No. 348424、英国)を添加し、1時間常温で恒温処理した後、TBSTバッファーで洗浄後、フィルムに露出した。
Claims (25)
- プロモーター及び3’UTR領域を含む配列番号1の塩基配列を有することを特徴とする、豚αS1カゼイン遺伝子。
- 配列番号2の塩基配列を含むことを特徴とする、豚αS1カゼイン遺伝子プロモーター。
- 配列番号2の塩基配列、配列番号3の塩基配列、及び配列番号4の塩基配列のうちから選択される1つ以上の塩基配列を含むことを特徴とする、発現ベクター。
- 前記ベクターは配列番号5または配列番号6のうちから選択される1つ以上の塩基配列をさらに含むことを特徴とする、請求項3に記載の発現ベクター。
- 前記ベクターは、選択的標識遺伝子、インシュレーター、及びWPRE(ウッドチャック・肝炎ウイルス転写後調節因子)のうちから選択される1つ以上が追加されたものであることを特徴とする、請求項3に記載の発現ベクター。
- 前記ベクターは、図2の開裂地図を有するものであることを特徴とする、請求項5に記載の発現ベクター。
- 前記ベクターは、寄託番号KCTC 11324BPとして寄託されたpBC1−豚αS1カゼインであることを特徴とする、請求項6に記載の発現ベクター。
- プロモーター塩基配列の3’側に目的たんぱく質をコードする塩基配列をさらに有することを特徴とする、請求項3乃至5のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 前記目的たんぱく質はヒトEPO(エリスロポエチン)であることを特徴とする、請求項8に記載の発現ベクター。
- 前記ベクターは図3の開裂地図を有するものであることを特徴とする、請求項9に記載の発現ベクター。
- 前記ベクターは寄託番号KCTC 11325BPとして寄託されたpBC1−豚αS1カゼイン+hEPO−WPREであることを特徴とする、請求項10に記載の発現ベクター。
- 前記発現ベクターはノックインベクターであることを特徴とする、請求項4に記載の発現ベクター。
- 前記ノックインベクターは選択的標識遺伝子が追加されたものであることを特徴とする、請求項12に記載の発現ベクター。
- 前記ノックインベクターは図4の開裂地図を有するものであることを特徴とする、請求項13に記載の発現ベクター。
- 前記ノックインベクターは寄託番号KCTC 11326BPとして寄託された豚αS1カゼインhEPOノックインであることを特徴とする、請求項14に記載の発現ベクター。
- 請求項3乃至5のいずれか一項に記載の発現ベクターを導入させて形質転換させたことを特徴とする、動物の体細胞。
- 請求項3乃至5のいずれか一項に記載の発現ベクターが導入されたことを特徴とする、動物受精卵。
- 前記導入が微量注入法によるものであることを特徴とする、請求項17に記載の動物受精卵。
- 請求項17に記載の動物受精卵を移植させて得たことを特徴とする、形質転換動物。
- 前記形質転換動物は、豚、マウス、牛、羊、及びヤギのうちから選択される1つであることを特徴とする、請求項19に記載の形質転換動物。
- 請求項17に記載の動物受精卵を代理母の卵管内に移植した後、代理母から形質転換動物を得て、前記形質転換動物の乳汁から目的たんぱく質を製造することを特徴とする、たんぱく質の製造方法。
- 請求項3乃至5のいずれか一項に記載の発現ベクターを導入させて形質転換させた動物の体細胞の核を脱核された卵子に核移植して作られたことを特徴とする、動物受精卵。
- 請求項22に記載の受精卵を移植させて得たことを特徴とする、形質転換動物。
- 前記形質転換動物は、豚、マウス、牛、羊、及びヤギのうちから選択される1つであることを特徴とする、請求項23に記載の形質転換動物。
- 請求項3乃至5のいずれか一項に記載の発現ベクターを導入させて形質転換された動物の体細胞の核を脱核された卵子に核移植して作った動物受精卵を代理母動物に移植し、前記代理母動物から形質転換動物を得て、前記形質転換動物の乳汁から目的たんぱく質を製造する段階を含むことを特徴とする、たんぱく質の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2008-0062765 | 2008-06-30 | ||
KR20080062765 | 2008-06-30 | ||
PCT/KR2009/003516 WO2010002160A2 (ko) | 2008-06-30 | 2009-06-29 | 돼지의 알파에스 1 카제인 유전자, 그 프로모터 및 그의 용도 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011526495A true JP2011526495A (ja) | 2011-10-13 |
JP5507555B2 JP5507555B2 (ja) | 2014-05-28 |
Family
ID=41466443
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011516140A Active JP5507555B2 (ja) | 2008-06-30 | 2009-06-29 | 豚のαS1カゼイン遺伝子、そのプロモーター、及びその用途 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9738694B2 (ja) |
EP (1) | EP2305814B1 (ja) |
JP (1) | JP5507555B2 (ja) |
KR (1) | KR101033818B1 (ja) |
CN (1) | CN102124109B (ja) |
AU (1) | AU2009266603B2 (ja) |
CA (1) | CA2729625C (ja) |
WO (1) | WO2010002160A2 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8420388B2 (en) | 2008-06-30 | 2013-04-16 | Cho-A Pharm. Co., Ltd. | Gene of porcine beta casein, a promoter of the same and the use thereof |
US9458205B2 (en) | 2011-11-16 | 2016-10-04 | Sangamo Biosciences, Inc. | Modified DNA-binding proteins and uses thereof |
CN102653773B (zh) * | 2012-04-26 | 2015-01-14 | 天津农学院 | 牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1及制备方法 |
KR101938956B1 (ko) | 2016-05-31 | 2019-01-15 | 제주대학교 산학협력단 | 신경세포 특이적으로 발현하는 돼지 Thy1 유전자 프로모터 |
KR101928659B1 (ko) | 2017-06-19 | 2018-12-13 | 서울대학교병원 | Dna 변형 유도 단백질 복합체 및 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 |
CN110257392A (zh) * | 2019-06-28 | 2019-09-20 | 西安医学院 | 转录后水平低氧调控基因、应用及其调控方法 |
CA3191387A1 (en) | 2020-09-30 | 2022-04-07 | Nobell Foods, Inc. | Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same |
US10947552B1 (en) | 2020-09-30 | 2021-03-16 | Alpine Roads, Inc. | Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09298981A (ja) * | 1996-05-16 | 1997-11-25 | Y S New Technol Kenkyusho:Kk | トランスジェニックブタ |
JPH1084981A (ja) * | 1996-07-26 | 1998-04-07 | Y S New Technol Kenkyusho:Kk | 乳腺発現用ベクター |
JP2001197846A (ja) * | 2000-01-18 | 2001-07-24 | Ys New Technology Kenkyusho:Kk | 免疫寛容動物の作製方法 |
JP2003521914A (ja) * | 2000-01-31 | 2003-07-22 | ファーミング インテレクチュアル プロパティー ベー.フェー. | トランスジェニック哺乳動物の乳汁に産生されるc1インヒビター |
JP2006503560A (ja) * | 2002-10-21 | 2006-02-02 | セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア | 非形質転換哺乳動物の乳腺における組換えタンパク質の製造法 |
WO2007131180A2 (en) * | 2006-05-04 | 2007-11-15 | Wayne State University | Restoration of visual responses by in vivo delivery of rhodopsin nucleic acids |
WO2008021136A2 (en) * | 2006-08-09 | 2008-02-21 | Medtronic, Inc. | Methods and sequences to suppress primate huntington gene expression in vivo |
WO2008075911A1 (en) * | 2006-12-20 | 2008-06-26 | Avixgen Inc. | Vector for expressing nc protein of hiv and method for producing nc protein using the same |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0279582A3 (en) | 1987-02-17 | 1989-10-18 | Pharming B.V. | Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion |
US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
EP0688358A4 (en) | 1993-03-12 | 1997-10-01 | Univ Creighton | IMPROVED VECTORS FOR GENTHERAPY |
US5610053A (en) | 1993-04-07 | 1997-03-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | DNA sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells |
US5959171A (en) | 1994-08-17 | 1999-09-28 | Pharming B.V. | Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's |
KR100232640B1 (ko) | 1997-06-03 | 1999-12-01 | 박호군 | 에리트로포이에틴 (epo)을 생산하는 세포주, 그의 제조방법 및 이를 이용한 epo의 제조방법 |
US6136597A (en) | 1997-09-18 | 2000-10-24 | The Salk Institute For Biological Studies | RNA export element |
KR100434729B1 (ko) | 1998-03-18 | 2004-11-03 | 주식회사 엘지생명과학 | 천연 추출물을 첨가하여 중국햄스터 난소 유래세포에서 에리스로포이에틴의 생산 증대방법 |
US6436707B1 (en) | 1998-03-27 | 2002-08-20 | Lexicon Genetics Incorporated | Vectors for gene mutagenesis and gene discovery |
EP1088084B1 (en) | 1998-06-15 | 2006-09-13 | GTC Biotherapeutics, Inc. | Erythropoietin analog-human serum albumin fusion protein |
KR100358754B1 (ko) | 2000-02-14 | 2002-11-07 | 대한민국 | 인간의 조혈촉진제 생산을 위한 형질전환 돼지를 생산하는방법 및 그 형질전환 돼지 |
WO2002077161A2 (en) * | 2001-03-12 | 2002-10-03 | Progenetics Llc | Production of high levels of trangenic factor ix without gene rescue, and its therapeutic uses |
CN1283785C (zh) | 2002-05-20 | 2006-11-08 | 上海杰隆生物工程股份有限公司 | 利用转基因动物乳腺生产人促红细胞生成素的方法 |
DE60318882D1 (de) | 2002-11-04 | 2008-03-13 | Cho A Pharm Co Ltd | Uroplakin-ii-promotor aus schwein und verfahren zur herstellung nützlicher proteine unter verwendung des promotors |
KR100552634B1 (ko) | 2002-11-04 | 2006-02-20 | 조아제약주식회사 | 돼지의 유로플라킨 ⅱ 유전자의 프로모터 및 이를 이용한유용단백질의 생산 방법 |
KR20040101793A (ko) | 2003-05-27 | 2004-12-03 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 사람 에리트로포이에틴을 생산하는 형질전환 복제소 및이의 생산 방법 |
JP2005160359A (ja) * | 2003-12-01 | 2005-06-23 | Rikogaku Shinkokai | Sineの挿入多型を指標とした鯨種判別方法 |
US7667089B2 (en) * | 2004-04-09 | 2010-02-23 | National Chung Hsing University | Transgenic mammal secreting B-domain deleted human FVII in its milk |
EA016039B1 (ru) * | 2005-05-02 | 2012-01-30 | Милеутис Лтд. | Способы ухода за лактирующими животными и фармацевтические композиции, используемые для их осуществления |
KR100769291B1 (ko) | 2006-02-13 | 2007-10-24 | 조아제약주식회사 | 유선 특이적 인간 에리트로포이에틴 발현 벡터, 이를이용한 형질전환 동물 및 이를 이용한 인간에리트로포이에틴의 생산 방법 |
JP2010535496A (ja) | 2007-08-08 | 2010-11-25 | チョ−エー・ファーム・カンパニー・リミテッド | 乳腺特異的ヒトエリトロポエチン発現ベクター、これを用いた形質転換動物及びこれを用いたヒトエリトロポエチンの産生方法 |
US8420388B2 (en) | 2008-06-30 | 2013-04-16 | Cho-A Pharm. Co., Ltd. | Gene of porcine beta casein, a promoter of the same and the use thereof |
-
2009
- 2009-06-29 US US12/737,319 patent/US9738694B2/en active Active
- 2009-06-29 JP JP2011516140A patent/JP5507555B2/ja active Active
- 2009-06-29 EP EP09773696.1A patent/EP2305814B1/en active Active
- 2009-06-29 KR KR1020090058189A patent/KR101033818B1/ko active IP Right Grant
- 2009-06-29 CA CA2729625A patent/CA2729625C/en active Active
- 2009-06-29 AU AU2009266603A patent/AU2009266603B2/en active Active
- 2009-06-29 WO PCT/KR2009/003516 patent/WO2010002160A2/ko active Application Filing
- 2009-06-29 CN CN200980126110XA patent/CN102124109B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09298981A (ja) * | 1996-05-16 | 1997-11-25 | Y S New Technol Kenkyusho:Kk | トランスジェニックブタ |
JPH1084981A (ja) * | 1996-07-26 | 1998-04-07 | Y S New Technol Kenkyusho:Kk | 乳腺発現用ベクター |
JP2001197846A (ja) * | 2000-01-18 | 2001-07-24 | Ys New Technology Kenkyusho:Kk | 免疫寛容動物の作製方法 |
JP2003521914A (ja) * | 2000-01-31 | 2003-07-22 | ファーミング インテレクチュアル プロパティー ベー.フェー. | トランスジェニック哺乳動物の乳汁に産生されるc1インヒビター |
JP2006503560A (ja) * | 2002-10-21 | 2006-02-02 | セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア | 非形質転換哺乳動物の乳腺における組換えタンパク質の製造法 |
WO2007131180A2 (en) * | 2006-05-04 | 2007-11-15 | Wayne State University | Restoration of visual responses by in vivo delivery of rhodopsin nucleic acids |
WO2008021136A2 (en) * | 2006-08-09 | 2008-02-21 | Medtronic, Inc. | Methods and sequences to suppress primate huntington gene expression in vivo |
WO2008075911A1 (en) * | 2006-12-20 | 2008-06-26 | Avixgen Inc. | Vector for expressing nc protein of hiv and method for producing nc protein using the same |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
BIO/TECHNOLOGY, vol. 8, JPN6012065834, May 1990 (1990-05-01), pages 443 - 446, ISSN: 0002410626 * |
DATABASE GENBANK [ONLINE], JPN6012065833, 1 January 2008 (2008-01-01), ISSN: 0002410625 * |
MAMMARY GLAND TRANSGENESIS, vol. pp. 91-106, JPN7012005174, 1998, ISSN: 0002410627 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102124109A (zh) | 2011-07-13 |
JP5507555B2 (ja) | 2014-05-28 |
CA2729625A1 (en) | 2010-01-07 |
US20110239314A1 (en) | 2011-09-29 |
EP2305814A4 (en) | 2011-12-28 |
AU2009266603A1 (en) | 2010-01-07 |
WO2010002160A9 (ko) | 2010-05-06 |
KR101033818B1 (ko) | 2011-05-13 |
CN102124109B (zh) | 2013-10-16 |
CA2729625C (en) | 2016-02-02 |
KR20100003223A (ko) | 2010-01-07 |
EP2305814B1 (en) | 2015-08-05 |
AU2009266603B2 (en) | 2013-01-24 |
EP2305814A2 (en) | 2011-04-06 |
US9738694B2 (en) | 2017-08-22 |
WO2010002160A2 (ko) | 2010-01-07 |
WO2010002160A3 (ko) | 2010-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5507555B2 (ja) | 豚のαS1カゼイン遺伝子、そのプロモーター、及びその用途 | |
US20060253913A1 (en) | Production of hSA-linked butyrylcholinesterases in transgenic mammals | |
JP4087338B2 (ja) | キメラ非ヒト動物 | |
US20040016005A1 (en) | Production of butyrylcholinesterases in transgenic mammals | |
KR101863653B1 (ko) | 락토페린 발현용 넉-인 벡터 및 이를 이용한 넉인 방법 | |
US11647737B2 (en) | Genetically modified rabbit expressing an exogenous protein in milk | |
KR20030060772A (ko) | 형질전환법으로 생성된 데코린 | |
KR101033819B1 (ko) | 돼지의 베타 카제인 유전자, 그 프로모터 및 그의 용도 | |
EP1379677A2 (en) | Production of high levels of trangenic factor ix without gene rescue, and its therapeutic uses | |
KR20040039168A (ko) | 돼지의 유로플라킨 ⅱ 유전자의 프로모터 및 이를 이용한유용단백질의 생산 방법 | |
US20030051257A1 (en) | Transgenic goat producing milk containing human granulocyte-colony stimulating factor | |
US10717991B2 (en) | Transgenic pig which simultaneously expresses HO-1 gene and TNFR1-Fc gene, and comprises knocked-out GGTA1 gene, and use thereof | |
WO2004042062A9 (en) | Porcine uroplakin ii promoter and the production method of useful proteins using said promoter | |
KR100754114B1 (ko) | 상동 재조합을 이용하는 소 베타-카제인 유전자 타겟팅벡터 | |
KR20150047670A (ko) | 돼지의 유청 단백질 유전자 프로모터를 이용한 유선 발현 시스템 | |
KR20170045065A (ko) | 유선 특이적으로 목적 단백질을 발현하는 벡터 | |
WO1996040879A1 (en) | Dna cassettes for expression of lytic peptides in mammalian cells and transgenic organisms containing same | |
JP2005512568A (ja) | 精嚢組織特異的プロモーター及びその利用 | |
KR20010036568A (ko) | 외래 유전자의 정소실질을 이용한 형질전환동물 및 그 생산방법 | |
AU2002305043A1 (en) | Production of high levels of trangenic factor IX without gene rescue, and its therapeutic uses | |
JP2001048803A (ja) | 医 薬 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121218 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130318 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131126 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140127 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140224 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140319 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5507555 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |