CN102653773B - 牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1及制备方法。本发明构建了一个可使目的基因在牛乳腺中特异性表达的载体pBC-αs1，通过在pcDNA3.1中插入pBC1中的绝缘子基因片段来防止其他基因或调控信号对目的基因的影响及异染色质的形成；通过在pcDNA3.1中插入牛α酪蛋白的调控基因片段来使目的基因在牛乳腺中特异性表达；通过构建两个酶切位点来控制目的基因的方向性，本发明实现了表达的高效性，并且通过Cre-LoxP重组酶系统可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞删除抗性标记基因，通过绝缘子防止其它基因或调控信号对目的基因的影响及异染色质的形成。

Description

牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域中的基因工程技术领域，尤其是一种牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1及制备方法。

背景技术

动物乳腺组织特异性高效表达载体是研制乳腺反应器的重要生物元件，外源基因在动物乳腺中的高效表达必须依赖好的表达载体。

酪蛋白是哺乳动物包括母牛，羊和人奶中的主要蛋白质，牛奶中存在着4种酪蛋白，分别为αS1酪蛋白、αS2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白，其中αS1酪蛋白在牛乳蛋白中含量最高，约为13g/L。牛酪蛋白基因座位存在座位控制区域(locus control region，LCR)，因而使得酪蛋白基因可以成为一个完全独立的表达单位。牛αS1-酪蛋白基因是制备乳腺生物反应器常用的表达载体，可以指导外源基因在动物乳腺中高水平表达。要在乳腺中表达外源基因，必需有一个高效的、乳腺特异性表达的启动区，显然，牛αS1酪蛋白基因的启动区是最好的候选启动区。

牛αS1-酪蛋白基因全长17508bp，其中19个外显子占1138bp，大小在24～385bp；18个内含子占16370bp，长度为90～1967bp。53bp的第1外显子为5′非翻译区，信号肽基因以及成熟蛋白质的前2个氨基酸由63bp的第2外显子编码。第18外显子和含有polyA信号的第19外显子为3′非翻译区。除终止密码子UGA是由第17外显子的最后2个碱基UG和第18外显子的第1个碱基A经剪切后拼接而成外，其余三联体密码子均不受剪切影响，因此第3到第16外显子都是三碱基对的倍数。16个编码外显子中有9个均以“GAX”起始，这与cDNA序列分析结果一致。序列中主要的磷酸化位点是由第10外显子的第1个密码子(GAA)与前一外显子拼接后产生。

牛αS1-酪蛋白基因的重要调控元件均位于启动区-400～-10。利用乳蛋白基因启动区进行乳腺特异性表达的转基因试验表明，只要乳蛋白基因启动区包括了-500～+500的区域，一般就能够进行高水平的乳腺特异性表达。从牛αS1酪蛋白基因启动区来看它不具有CAAT盒，TATA盒序列“TTTAAAT”为一弱启动区，但牛αS1酪蛋白基因的表达量却很高，因此推测除了5′端调控机制外，内含子及3′端在表达过程中会起到一定的作用。内含子上的剪接信号也能刺激转录，因为RNA的加工与转录是一个互动的过程，剪接过程能反馈促进RNA聚合酶的活动。内含子除能促进转录外还可影响翻译。将成熟的mRNA直接注射到核中，当它被运送到胞质中时并不能进行翻译，而在注射核酸结合蛋白的抗体或mRNA的3′端非编码区包含1个可剪接的内含子时，上述抑制被解除。有很多试验都表明采用基因组基因表达构件比采用cDNA表达构件提高表达量10～100倍。此外，异源内含子(特别是第1、2内含子)可提高外源基因(特别是以cDNA为表达构件)的表达效率。此外，内含子上的剪接信号也能刺激转录，因为RNA的加工与转录是一个互动的过程，剪接过程能反馈促进RNA聚合酶的活动。内含子除能促进转录外还可影响翻译。

LoxP(locus of X-over P1)序列来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。Loxp位点与Cre重组酶构成Cre-LoxP重组酶系统，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。

绝缘子是一种顺式作用元件。长约数百个核苷酸对，通常位于启动子正调控元件或负调控元件之间的一种调控序列，可防止其他基因或调控信号对目的基因的影响及异染色质的形成。

目前所具有的乳腺特异性表达载体虽然已经不断开发出来，但并不丰富，表达效果各有偏重，通过检索，我们检索到公开号为：CN 1873011A，名称为：高表达水平的转基因动物乳腺特异性载体的构建方法，及申请号为：200810105011.0，名称为：乳腺特异性表达载体及其构建方法，的相关发明专利，但以上发明专利的乳腺特异性表达载体与本发明的乳腺特异性表达载体构成有着本质的不同，其表达效果也不相同。

发明内容

鉴于酪蛋白是哺乳动物包括母牛，羊和人奶中的主要蛋白质，目前所具有的乳腺特异性表达载体虽然已经不断开发出来，但并不丰富，表达效果各有偏重，本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种能使目的基因在牛乳中特异性表达的载体pBC-αs1及其制备方法。

本发明的技术实现方案如下：

一种牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1，在质粒pcDNA3.1结构的Mun I与BamH I两酶切位点之间插入有质粒pBC1的Mun I与BamH I的酶切片段，称此时的载体为pcDNA3.1-In载体；在载体pcDNA3.1-In的BamH I与Pme I两酶切位点之间插入有合成好的牛α酪蛋白的5′端部分调控序列as1-5及牛α酪蛋白的3′端部分调控序列as1-3；载体pcDNA3.1-In的BamH I酶切端连接牛α酪蛋白的5′端部分调控序列as1-5；载体pcDNA3.1-In的Pme I酶切端连接牛α酪蛋白的3′端部分调控序列as1-3，其中as1-5另一末端携带Not I酶切位点，as1-3另一末端携带Xho I酶切位点，Not I和Xho I酶切位点作为目的基因插入位点。

而且、所述牛α酪蛋白的5′端部分调控序列as1-5中包含启动子、外显子1、2以及内含子1、2；所述牛α酪蛋白的3′端部分调控序列as1-3中包含外显子18、19，内含子17、18以及终止子。

而且、所述载体在抗性标记基因两侧含有两个Loxp位点，可与Cre重组酶构成Cre-LoxP重组酶系统，Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除。

一种用于上述牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1的制备方法，其制备步骤如下：

(1)通过Mun I和BamH I两种酶，将pBC1中包含绝缘子的一段长3658bp基因切下；

(2)将步骤(1)的酶切产物回收片段插入Mun I和BamH I两种酶切后的pcDNA3.1载体中，称此时的载体为pcDNA3.1-In载体；

(3)合成包含有启动子、外显子1、2以及内含子1、2的长为4919bp的牛α酪蛋白5′端序列，在合成的基因两端分别加入BamH I及Not I酶切位点，得到αs1-5：

(4)合成包含外显子18、19，内含子17、18以及终止子的长为2339bp的牛α酪蛋白3′端序列，在合成的基因两端分别加入Xho I以及Pme I酶切位点，得到αs1-3；

(5)将合成好的α酪蛋白调控基因αs1-5、αs1-3插入到pcDNA3.1-In载体中，完成乳腺特异性表达载体pBC-αs1的构建。

而且、所述步骤(1)至(5)中任一步都采用胶回收酶切产物。

而且、所述步骤(2)或(5)都采用转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，酶切鉴定pcDNA3.1-In载体或pBC-αs1载体的得到。

本发明的优点及效果：

1、牛酪蛋白基因座位存在座位控制区域(locus control region，LCR)，因而使得酪蛋白基因可以成为一个完全独立的表达单位。牛αS1-酪蛋白是牛乳中含量最高的酪蛋白，是制备乳腺生物反应器常用的表达载体，可以指导外源基因在动物乳腺中高水平表达。

2、要在乳腺中表达外源基因，必需有一个高效的、乳腺特异性表达的启动区，显然，牛αS1酪蛋白基因的启动区是最好的候选启动区。

3、有很多试验都表明采用基因组基因表达构件比采用cDNA表达构件提高表达量10～100倍，此外，异源内含子(特别是第1、2内含子)可提高外源基因(特别是以cDNA为表达构件)的表达效率，本发明的pBC-as1表达载体正是利用了这一特性，实现了表达的高效性。

4、本发明表达载体pBC-as1中的Loxp位点与Cre重组酶构成Cre-LoxP重组酶系统可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除。

5、本发明表达载体pBC-as1中的绝缘子可防止其他基因或调控信号对目的基因的影响及异染色质的形成。

附图说明：

图1为本发明的pBC-as1载体结构示意图；

图2为本发明pBC-as1载体转入目的基因的DNA检测转入鉴定图；

图3为本发明pBC-as1载体转入目的基因的RNA检测表达鉴定图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如图1所示，一种牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1，在pcDNA3.1结构的Mun I与BamH I两酶切位点之间插入有pBC1质粒的绝缘子基因片段，称此时的载体为pcDNA3.1-In载体；在pcDNA3.1-In载体结构的BamH I与Pme I两酶切位点之间插入有合成好的牛α酪蛋白的5′端部分调控序列as1-5及牛α酪蛋白的3′端部分调控序列as1-3；牛α酪蛋白的5′端部分调控序列as1-5一端连接BamH I酶切位点，另一端连接Not I酶切位点；牛α酪蛋白的3′端部分调控序列as1-3一端连接Xho I酶切位点，另一端连接Pme I酶切位点；调控序列as1-5及as1-3通过各酶切位点与pcDNA3.1-In载体相连，由此构成乳腺特异性表达载体pBC-αs1的完整结构。其中Not I和Xho I酶切位点作为目的基因插入位点。

所述牛α酪蛋白的5′端部分调控序列as1-5中包含启动子、外显子1、2以及内含子1、2；所述牛α酪蛋白的3′端部分调控序列as1-3中包含外显子18、19，内含子17、18以及终止子。

在所述3′端与5′端中间设计有两个不同的酶切位点Not I和Xho I，可插入目的基因。

所述载体中保留了pcDNA3.1质粒含有的氨苄青霉素抗性基因以及新霉素抗性基因，有利于目的基因的筛选。

所述载体在抗性标记基因两侧含有两个Loxp位点，可与Cre重组酶构成Cre-LoxP重组酶系统，Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除。

一种牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1的制备方法，其制备过程如下：

1、pBC1载体中绝缘子基因的提取：

(1)、用Mun I和BamH I两种酶对pBC1进行酶切，切下包含有绝缘子的基因片段。

反应体系：20μL反应体系，超纯水12μL、Buffer2μL、pBC1载体5μL、Mun I酶1μL、BamH I酶1μL。

反应条件：37℃1h，80℃5min。

胶回收酶切产物。

2、将含有绝缘子的基因片段插入pcDNA3.1载体中：

(1)、用Mun I和BamH I两种酶将pcDNA3.1切开。

反应体系：20μL反应体系，超纯水12μL、Buffer2μL、pcDNA3.1载体5μL、Mun I酶1μL、BamH I酶1μL。

反应条件：37℃1h，80℃5min。

胶回收酶切产物。

(2)、将2步(1)中的酶切产物与1步(1)中酶切产物相连；

反应体系：20μL反应体系，pcDNA3.1质粒酶切产物5μL、pBC1酶切产物质粒12μL、Buffer 2μL、T4连接酶1μL。

反应条件：

a，首先是20μL反应体系，pcDNA3.1质粒5μL、pBC1质粒12μL、Buffer2μL，65℃3min。

b，然后加入T4连接酶1μL后22℃4h。

c，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，酶切鉴定，得到载体pcDNA3.1-In。

3、牛α酪蛋白调控基因的合成：

(1)合成包含有启动子、外显子1、2以及内含子1、2的长为4919bp的牛α酪蛋白5’端基因序列，在合成的基因两端分别加入了BamH I以及Not I酶切位点，得到αs1-5；

(2)合成包含外显子18、19，内含子17、18以及终止子的长为2339bp的牛α酪蛋白3’端基因序列，在合成的基因两端分别加入Xho I以及Pme I酶切位点，得到αs1-3。

4、乳腺特异性表达载体pBC-αs1的构建：

将合成的α酪蛋白调控基因序列αs1-5和αs1-3插入到pcDNA3.1-In中：

(1)用BamH I及Not I酶对pcDNA3.1-In载体进行酶切；

反应体系：20μL反应体系，超纯水12μL、Buffer2μL、pcDNA3.1-In载体5μL、BamH I酶1μL、Not I酶1μL。

反应条件：37℃1h，80℃5min。

胶回收酶切产物。

(2)将4步(1)中的回收产物与αs1-5调控序列相连；

反应体系：20μL反应体系，pcDNA3.1-In胶回收酶切产物5μL，牛α酪蛋白5’端调控序列5μL，T₄DNA Ligase 1μL，T₄连接酶缓冲液2μL，超纯水7μL。

反应条件：22℃4h。

转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，酶切鉴定，得到载体pBC-αs5’。

(3)用Xho I及Pme I酶对4步(2)中得到的载体pBC-αs5′进行酶切；

反应体系：20μL反应体系，超纯水12μL、Buffer2μL、pBC-αs5′载体5μL、Xho I酶1μL、Pme I酶1μL。

反应条件：37℃1h，80℃5min。

胶回收酶切产物。

(4)将4步骤(3)中的胶回收酶切产物与αs1-3调控序列相连：

反应体系：20μL反应体系，pBC-αs5′胶回收酶切产物5μL，牛α酪蛋白3′端调控序列5μL，T₄DNA Ligase 1μL，T₄连接酶缓冲液2μL，超纯水7μL。

反应条件：22℃4h。

转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，酶切鉴定，得到乳腺特异性表达载体pBC-αs1。

牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1的表达效果检验

我们将fat-1基因(1264bp)克隆到构建好的乳腺特异性表达载体中，然后用转入fat-1基因的表达载体转染牛成纤维细胞和牛乳腺细胞，转染后通过DNA检测目的基因是否转入，通过RNA检测目的基因是否表达。

实验结果如下：

DNA检测目的基因的转入。

Marker：采用的是DL10000。

DNA：(1)marker、(2)水、(3)017牛成纤维细胞的阴性对照、(4)转fat-1基因的017牛成纤维细胞、(5)转fat-1基因的牛乳腺细胞。

如图2所示，我们可以看出，在DNA水平，水、017牛成纤维细胞的阴性对照均无目的基因片段，而转fat-1基因的017牛成纤维细胞和转fat-1基因的牛乳腺细胞中均成功检测到了fat-1基因片段。

RNA检测目的基因的表达。

Marker：采用的是D L10000。

RNA：(1)marker、(2)转fat-1基因的牛乳腺细胞(诱导后)、(3)转fat-1基因的017牛成纤维细胞、(4)017牛成纤维细胞的阴性对照、(5)水。

如图3所示，我们可以看出，在RNA水平，水、017牛成纤维细胞的阴性对照、转fat-1基因的017牛成纤维细胞均无目的基因表达，而转fat-1基因的牛乳腺细胞中均成功检测到了fat-1基因的表达。

综合DNA和RNA检测结果说明，我们构建的牛乳腺特异性表达载体可以成功的将外源基因转入牛细胞中(包括牛乳腺细胞和牛非乳腺细胞)，而目的基因只能在牛乳腺细胞中表达，非乳腺细胞虽然转入了目的基因但是不表达，证明我们成功构建了牛乳腺特异性表达载体并可以在生产中应用。

Claims (5)

1.一种牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1，其特征在于：在质粒pcDNA3.1结构的MunI与BamHI两酶切位点之间插入有质粒pBC1的MunI与BamHI的酶切片段，称此时的载体为pcDNA3.1-In载体；在载体pcDNA3.1-In的BamHI与PmeI两酶切位点之间插入有合成好的牛α酪蛋白的5'端部分调控序列as1-5及牛α酪蛋白的3'端部分调控序列as1-3；载体pcDNA3.1-In的BamHI酶切端连接牛α酪蛋白的5'端部分调控序列as1-5；载体pcDNA3.1-In的PmeI酶切端连接牛α酪蛋白的3'端部分调控序列as1-3，其中as1-5另一末端携带NotI酶切位点，as1-3另一末端携带XhoI酶切位点，NotI和XhoI酶切位点作为目的基因插入位点。

2.根据权利要求1所述的一种牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1，其特征在于：所述牛α酪蛋白的5'端部分调控序列as1-5中包含启动子、外显子1、2以及内含子1、2；所述牛α酪蛋白的3'端部分调控序列as1-3中包含外显子18、19，内含子17、18以及终止子。

3.一种用于权利要求1所述的牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1的制备方法，其特征在于：制备步骤如下：

（1）通过MunⅠ和BamHⅠ两种酶，将pBC1中包含绝缘子的一段长3658bp基因切下；

（2）将步骤（1）的酶切产物回收片段插入MunⅠ和BamHⅠ两种酶切后的pcDNA3.1载体中，称此时的载体为pcDNA3.1-In载体；

（3）合成包含有启动子、外显子1、2以及内含子1、2的长为4919bp的牛α酪蛋白5'端序列，在合成的基因两端分别加入BamHⅠ及NotⅠ酶切位点，得到αs1-5；

（4）合成包含外显子18、19，内含子17、18以及终止子的长为2339bp的牛α酪蛋白3'端序列，在合成的基因两端分别加入XhoⅠ以及PmeⅠ酶切位点，得到αs1-3；

（5）将合成好的α酪蛋白调控基因αs1-5、αs1-3插入到pcDNA3.1-In载体BamHI与PmeI两酶切位点之间，构成牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1。

4.根据权利要求3所述的牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）至（5）中任一步都采用胶回收酶切产物。

5.根据权利要求3所述的牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）或（5）都采用转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，酶切鉴定pcDNA3.1-In载体或pBC-αs1载体。