CN1053446A - 由牛生产重组多肽和转移基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于在转移基因牛类中产生重组多 肽的转移基因，一种这样的转移基因包括至少一个表 达调控顺序，一个分泌性DNA顺序以及编码重组多 肽的重组DNA顺序。本发明还涉及产生基因转移 牛类的方法，该方法包括将上述转移基因引入牛类胚 胎靶细胞，再将该靶细胞移植到受纳母牛体中并对其 后代进行鉴定。本发明还包括可在其转移基因奶中 产生重组多肽的转移基因牛类和所述牛类的奶以及 含有一种或多种重组多肽的食物配方。

Description

本发明涉及由转移基因牛产生重组多肽和生产具有所需表型的转移基因非人哺乳动物的方法。

有关异源基因在低等生物（例如单细胞细菌、酵母和丝状真菌）和高等生物细胞（例如哺乳动物细胞）中的表达已有大量文献，还有许多报导涉及转移基因动物的生产，其中大多数均与生产转移基因小鼠有关。参阅美国专利4，736，866（transgenic  mice  containing  activated  oncogene）;Andres，A.等（1987）Proc.Natl.Acad.Sci，USA  84，1299-1303（HA-RAS  oncogene  under  control  of  whey  acid  protein  promoter）;Schoenberger，C.A.等（1987）Experientia  43，644和（1988）EMBO  J.7.169-175（C-myc  oncogene  under  control  of  whey  acid  protein  promoter）;和Muller，W.J.等（1988）Cell  54，105-115（C-myc  oncogene  under  control  of  the  mouse  mammary  tumor  virus  promoter）.有些实验室还报导了转移基因猪的生产。（Miller，K.F.等（1989），J.Endocrin.，120，481-488（expression  of  human  or  bovine  growth  hormone  gene  in  transgenic  swine）;Vize，P.D.等（1988），J.Cell  Sci.，90，295-300（porcine  growth  hormone  fusion  gene  in  transgenic  pigs）;以及Ebert，K.等（1988），Mol.Endocrin.，2，277-283（MMLV-rat  somatotropin  fusion  gene  in  transgenic  pigs）），转移基因羊（Nancarrow，等（1987），Theriogenology，27，263（transgenic  sheep  containingboving  growth  hormone  gene）Clark，A.J.等（1989）Bio/Technology  7，487-482和Simons，J.（1988）Bio/Technology  6，179-183（human  factor  Ⅸ  α-1  antitrypsin  CONA  in  ovine  species），以及转移基因兔（Hanover，S.V.等（1987），Deutche  Tierarztliche  Wochenschrift，94，476-478（Production  of  transgenic  rabbits  by  injection  of  uteroglobin-promoter-CAT  fusion  gene  into  fertilized  rabbit  oocytes）。还有许多报告涉及转移基因牛的生产（Wagner等（1984），Theriogenology，21，29-44），其中有篇报告报导了微量注射技术方面的若干进展（Lohse，J.K.等（1985），Theriogenology，23，205）。但是在生产转移基因奶牛方面即使获得了成功也是为数不多。明确说明真正能够产生异源蛋白的转移基因奶牛的生产的科学著作目前尚未为人知。尽管在加拿大生产了一头表达人β干扰素的转移基因奶牛（Van  Brunt，J.（1988），Bio/Technology，6，1149-1155），而且曾有一次获得人α-胚胎蛋白在肝脏和血液中不稳定的表达（Church，R.B.（1986），Biotechnology  News  Watch，6（15），4）。有一篇文献报导了看来是将牛乳头状瘤病毒整合到转移基因奶牛中，但并未在其中表达（Rauschlau等（1988），Arch.Tierz.，Berlin，31，3-8）。最近有篇文章总结了有关家畜遗传工程的工作（Pursel，V.G.等（1989），Science，244，1281-1288）。

许多实验室报导了编码乳腺中多种蛋白的DNA的组织特异性表达或转移基因小鼠和羊的乳中各种蛋白的生产。例如Simmons，J.P.等（1987，Nature，328，530-532）报导了将编码含有4Kb  5′顺序、4.9Kbβ-乳球蛋白（BLG）转录单位和7.3Kb  3′侧翼顺序的BLG的16.2Kb基因组片段微量注射到受精的小鼠卵中。根据这些作者的意见，羊BLG能在乳房组织中表达，并约以3.0至23mg/ml的浓度范围在转移基因小鼠的乳中产生BLG。但是，当编码人因子Ⅸ或人α-1抗胰蛋白酶的cDNA插入到BLG基因5′未转译区并微量注射到羊体内时（Simmons，J.P.等，1988，Bio/Technology，6，179-183），因子Ⅸ或α1-抗胰蛋白酶的产生显著减少（25ng/ml因子Ⅸ，10mg/ml  α1-抗胰蛋白酶，参阅Clark，A.J.等，1989，Bio/Technology，7，487-492）。

据报导还有一个类似的方法，将含有整个7.5Kb大鼠β-酪蛋白和3.5Kb  5′和3.0Kb  3′侧翼DNA的14Kb基因组克隆微量注射到受精小鼠的卵母细胞中（Lee等，1988，Nucl.Acids  Res.，16，1027-1041）。但是据报导，在这种情况下，在转移基因小鼠的分泌乳有乳腺中大鼠β-转移基因表达量为0.01-1%的小鼠内源β-酪蛋白基因。

据报导：当编码含有人t-PA内源分泌顺序的人t-PA的cDNA在鼠乳清酸蛋白基因2.6Kb  5′顺序的控制下表达时，在转移基因小鼠乳中产生的人组织血纤维蛋白溶酶原激活因子（t-PA）的量为0.2-约0.4μg/ml。（Gordon，K.等，1987，Bio/Technology，5，1183-1187）。又据报导，后来用相同或相似的构建方法所进行的试验，在不同鼠系的乳中产生的t-PA的量从低于20ng/ml至大约50μg/ml（Pittius，C.W.等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5874-5878）。

1989年10月10日发表的美国专利4873316公开了牛αS1-酪蛋白基因的9Kb  5′顺序的应用，其含有与成熟t-PA顺序相融合的酪蛋白信号肽顺序。据报导，用这种构建方法得到的转移基因小鼠在它们的乳中产生大约0.2-0.5μg/ml的t-PA。

此外，还有许多专利文献都介绍了在转移基因的小鼠和羊的乳中特异性蛋白的产生。例如参阅1988年4月20日公开的欧洲专利公报0264166（hepatitis  B  surface  antigen  and  t-PA  genes  under  control  of  the  whey  acid  promoter  protein  for  mammary  tissue  specific  expression  in  mice）;1988年1月14日公开的PCT公报WO88/00239（tissue  specific  expression  of  a  transgene  encoding  factor  Ⅸunder  control  of  a  whey  protein  promoter  in  sheep）;1988年3月10日公开的PCT公报WO88/01648（transgenic  mouse  having  mammary  secretory  cells  incorporating  a  recombinant  expression  system  comprising  a  bovine  α-lactalbumin  gene  fused  to  interleukin-2）;1988年8月24日公开的欧洲专利公报0279582（tissue-specific  expression  of  chloramphenicol  acetyltransferase  under  control  of  rat  β-casein  promoter  in  transgenic  mice）;以及1988年12月29日公开的PCT公报WO88/10118（transgenic  mice  and  sheep  containing  transgene  encoding  bovine  αS1-casein  promoter  and  signal  sequence  fused  to  t-PA）。

从上述基因转移技术的现状看来，显然需要提供能有效地生产转移基因动物特别是除了转移基因小鼠以外的转移基因动物的方法。

另外，显然还需要提供生产转移基因牛的方法，提供的这类牛能在所述转移基因动物的乳中产生诸如人乳蛋白和人血清清蛋白一类的重组多肽。

因此，本发明的目的之一在于提供检测植入前受精卵母细胞基因转移的方法。

本发明的目的之二在于提供能够生产保持在细胞内外分泌的重组多肽的转移基因牛。

本发明的目的之三在于提供能够在所述转移基因动物的乳中产生诸如人乳蛋白和人血清清蛋白一类的重组多肽的转移基因牛。

本发明的目的之四在于提供由含有这类重组多肽的转移基因牛所产生的牛乳。

本发明的目的之五在于提供补充有来自转移基因牛乳的重组多肽的食品组合物，如含有人乳铁蛋白的婴儿用配制剂。

本发明的目的之六在于提供能在转移基因牛的乳中产生重组多肽的转移基因。

本文所讨论的参考文献仅仅为了提供在本申请的申请日前已公开的内容。但本文所述，不能被认为这些先前公开的内容而使发明者失去依据早期提交的申请而享有优先权。

根据上述目的，本发明包括用于在转移基因牛的乳中产生重组多肽的转移基因。生产这种含有一种或多种重组多肽的转移基因牛乳是合乎需要的，因为对人们食用来说，其所提供的基质只需要略加提纯，甚至不需要提纯。该转移基因包括编码在有意义的牛乳房分泌细胞中起作用的分泌信号顺序的分泌DNA顺序和编码重组多肽的重组DNA顺序。这些顺序通过操作连接形成分泌-重组DNA顺序。至少有一个在牛乳房分泌细胞中起作用的表达调控顺序可以通过操作与分泌-重组DNA顺序相连接。这样构建的转移基因能够在含有转移基因的雌牛乳房分泌细胞中表达分泌-重组DNA顺序。这种表达产生一种由乳房分泌细胞分泌到转移基因牛的乳中的重组多肽。

此外，本发明包括生产这类转移基因牛的方法，该方法包括将上述转移基因引入牛的胚胎靶细胞中，再将由此形成的转移基因胚胎的靶细胞移植到受体牛亲本中，以及识别至少有一头后代雌牛能在其乳中产生重组多肽。

本发明还包括能在所述分泌乳汗的雌牛的乳中产生重组多肽的转移基因牛，由含有这类重组多肽的转移基因牛中得到的牛乳，含有转移基因牛乳的液体或固体的食品配制物，以及补充有一种或多种由这类转移基因牛乳中得到的重组多肽的食品配制剂。

除以上所述之外，本发明还包括转移基因和含有能产生重组多肽的转移基因的转移基因牛。这类转移基因类似于上述分泌乳的转移基因，而且其特征在于具有表达调控顺序。该顺序将编码重组多肽的DNA的表达对准于特定的细胞或组织，例如在转移基因牛肝脏中表达人血清蛋白。当由这种靶细胞或靶组织中分泌重组多肽时，在特定靶细胞或组织中起编码分泌信号顺序作用的分泌DNA顺序通过操作与编码重组多肽的重组DNA顺序相连接，例如将人血清蛋白由牛肝脏分泌到牛循环系统中。

除上所述，本发明包括产生具有所需表型的转移基因非人哺乳动物的方法。该方法包括在将转移基因结合到转移基因非人动物的细胞中时，例如通过用含转移基因的质粒转化适当的细菌，如大肠杆菌MM294，首先对能给予所需表型的转移基因甲基化。然后将甲基化的转移基因切开引入到非人动物的受精卵母细胞，使之整合到基因组中。培养该卵母细胞，复制各个受精卵母细胞的基因组，从而形成预植入胚胎。此后，从各个预植入胚胎中至少移出一个细胞进行处理，释放其中所含DNA。用核酸内切限制酶消化释放出的各个DNA，该内切酶对整合到基因组DNA并进行复制以后的甲基化转移基因能够裂解，但对未甲基化的转移基因不能裂解。这些已经整合了转移基因的预植入胚胎含有一种DNA，其对含转移基因区内的核酸内切限制酶的裂解具有抗性。在DNA的PCR扩增和与转移基因的标记探针杂交后，进行对消化与电泳能检测出的这种抗消化可鉴别是否成功获得转移基因。

本发明还包括产生具有相同基因型的一群转移基因后代的方法。该方法采用上述的特定步骤检测早期发生的转移基因。采用该方法，将甲基化转移基因引入受精卵母细胞，再培养为预植入胚胎。此后，每个预植入胚胎分裂形成第一和第二半胚胎。分析各个第一半胚胎的上述转移基因的产生。确定在第一半胚胎中至少有一个已成功地产生转移基因以后，对含有整合转移基因的未经处理的第二半胚胎进行克隆，形成克隆转移基因胚泡或半胚泡的复感染，其中每个都具有相同的基因型。然后将转移基因胚胎移植到一个或多个受体母体中，以产生一群具有相同基因型的转移基因非人哺乳动物。

结合在说明书中并作为其组成部分的附图用以说明本发明的实施方案，与说明书一起说明本发明的原理。

附图说明：

图1  说明由本文所述人乳cDNA库得到的人乳铁蛋白克隆的DNA和氨基酸顺序，其中核苷酸1557-1791和2050-2119之间的顺序相当于先前已公开的顺序（Rado等，1987，Blood，70，989-993）。

图2  说明人乳铁蛋白的完全DNA和氨基酸顺序，包括5′和3′未转译顺序和完全的人乳铁蛋白信号顺序。

图3是牛αS1-酪蛋白基因5′侧翼区克隆的限制图。

图4是牛αS1-酪蛋白基因3′侧翼区克隆的限制图。

图5A、5B和5C说明pSI  3′5′CAT和pSI  5′CAT的构建。

图6说明pMH-1。

图7A-7F说明含编码人乳铁蛋白顺序的表达载体的构建。

图8说明人血清清蛋白基因组、用于产生转移基因小鼠的含该基因组DNA的片段和鉴定该片段的大小，该片段是采用限制酶BstE-Ⅱ和Nco-Ⅰ或用Nco-Ⅰ和Hindi-Ⅲ消化转移基因小鼠的基因组DNA得到的。

图9说明在编码人乳铁蛋白中构建本发明转移基因的另一个途径。

图10说明含编码蛋白质C的转移基因的质粒pPC的构建。

图11说明用于本发明最佳实施例的杂交拼接信号的DNA顺序。该杂交顺序包括牛αS1-酪蛋白间插顺序的5′部分和IgG间插顺序的相应间插顺序的3′部分。5′和3′部分的连接处表示HindⅢ位点。

本发明所述非人哺乳动物包括能产生具有“所需表型”的“转移基因非人哺乳动物”的所有非人哺乳动物。这样的哺乳动物包括非人脊椎动物，非人灵长类，鼠，牛，犬等。较佳的非人动物包括牛，猪和羊，尤以牛为最佳。

转移基因非人哺乳动物的所需表型包括但不限于以下所述类型：在转移基因非人雌性哺乳动物的乳中产生重组多肽，产生用于研究疾病的动物模型，产生具有较高抗病（例如乳腺病中的乳腺炎）能力的动物，以及在动物的血、尿或其他适合的体液或组织中产生重组多肽。在一些较佳的实施例中，已公开了转移基因牛，其在分泌乳汁的雌性动物的乳中产生重组人乳铁蛋白、人血清清蛋白和人蛋白质C，或在转移基因动物肝脏中产生人血清清蛋白。

本发明的转移基因非人哺乳动物是通过将“转移基因”引入经过选择的动物胚胎靶细胞中产生的。本发明的另一方面，转移基因是一种DNA顺序，当转移基因非人哺乳动物的细胞基因组中含有这种顺序时，就能产生所需要表型。在一些具体的实施例中，转移基因包括编码“重组多肽”的“重组DNA顺序”。在这样情况下，能够表达转移基因，产生重组多肽。

本文所述“重组多肽”（或编码重组多肽的重组DNA顺序）可以是“异源多肽”，也可以是“同源多肽”。异源多肽通常不是由转移基因动物产生的多肽。异源多肽的例子包括人乳蛋白，如乳铁蛋白，溶菌酶，分泌免疫球蛋白，乳清蛋白，胆汁盐刺激的脂肪酶等;人血清蛋白，如清蛋白，免疫球蛋白，因子Ⅷ，因子Ⅸ，蛋白质C等;由原核和真核源得到的工业用酶，如蛋白酶，脂肪酶，壳多糖酶，和木质素酶。重组DNA顺序包括编码重组多肽的基因组顺序和cDNA顺序。

使用编码异源多肽的重组DNA顺序时，可以随机方法将转移基因整合到用于产生转移基因的动物的基因组中。如实施例所公开的，将编码人乳铁蛋白、人血清清蛋白和人蛋白质C的转移基因设计成在αS1-酪蛋白表达调控顺序控制下，与αS1-酪蛋白分泌信号顺序相结合，由转移基因哺乳动物乳腺中产生这些异源多肽并将其分泌到它的乳中。

本文所述同源多肽是一种对特定转移基因动物而言为内源的多肽。牛内源多肽的例子包括牛乳蛋白，如αS1，αS2，β-酪蛋白和k-酪蛋白，β-乳球蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶，胆固醇水解酶;血清蛋白，如血清清蛋白;以及蛋白激素，如生长激素。在使用编码同源多肽的重组DNA顺序时，最好将转移基因随机整合到用于产生转移基因的动物的基因组中。这样的随机整合产生的转移基因动物，不仅含有编码内源多肽的转移基因，而且还含有相应的内源基因组DNA顺序。因此，这类转移基因非人哺乳动物的特征显然在于增加编码内源多肽的基因的拷贝数。此外，转移基因一般都在与内源基因不同的位置上。

当编码同源多肽的DNA在牛中表达时，转移基因动物的特征在于增加内源组织或体液中同源多肽的量，而同源多肽在该组织或体液中于正常情况下是可以发现的，和/或虽然存在于组织和/或体液中，但在正常情况下并不含有同源多肽或产生同源多肽的量很低。

因此，以牛胆固醇水解酶为例，在正常情况下，大约生乳作用的前15-20天时，其存在于初乳中。这种天然内源多肽使牛的体重增加。然而在表达调控顺序控制下，例如在由能使同源多肽的表达超过正常生乳期的牛酪蛋白基因得到的那些顺序控制下，这种蛋白在乳分泌细胞中表达时也是同源多肽。

因此根据本发明，将胆固醇水解酶重组DNA（或cDNA或基因组）置于牛αS1-酪蛋白表达调控顺序的控制下，使牛胆固醇水解酶表达保持在转移基因牛乳中。当使用基因组重组DNA时，设计得使其在结构基因的5′和3′端上具有适当的限制位点（例如ClaⅠ和Sa1Ⅰ），从而能插入到适当的转移基因基因组盒中（例如P-16Kb，CS，在实施例15中介绍）。另外，编码由cDNA衍生的牛胆固醇水解酶的重组DNA通过取代如P16，8HLF3（含有杂交间插顺序）或P16，8HLF4（含有同源αS1-酪蛋白间插顺序）等质粒中的人乳铁蛋白顺序，可以置于牛αS1-酪蛋白表达调控顺序的控制下。当使用这些特定的质粒时，设计的cDNA克隆应使其在重组DNA末端具有适当的ClaⅠ和Sa1Ⅰ限制位点。

还有一个例子，即在正常情况下，牛乳铁蛋白存在于奶牛乳中的量极低，然而在由αS1-酪蛋白基因中得到的其他调控顺序控制下，在转移基因牛乳中乳铁蛋白的量都较高。另一个例子，将含有编码同源牛生长激素的DNA的转移基因结合到牛基因组中，使生长特性优于转移基因动物。在其他一些例子中，同源多肽包括的一种多肽通常保持在特定动物的细胞中，但是又分泌到转移基因动物的乳中或其他胞外区域中，例如循环系统。

各种异源或同源多肽的特征都在于特异氨基酸和核酸顺序。因此，应该理解为这种顺序包括其天然的其他等位顺序和由重组方法产生的变化形式，其中这样的核酸和多肽顺序可通过在这类核酸中的一个或多个核苷酸的取代、插入和/或缺失进行修饰，产生重组多肽中一个或多个氨基酸残基的取代、插入或缺失。

当转移基因的DNA的表达需要产生所需表型（例如产生重组多肽）时，一般说来转移基因包括至少5′，最好还包括3′的“表达调控顺序”，并通过操作将各顺序与如下所述的重组DNA或分泌-重组DNA相连接。这种表达调控顺序除了控制转录外，还有助于DNA稳定和处理，至少达到它们也被转录的程度。

这种表达调控顺序的选择是为了产生重组DNA或分泌-重组DNA的组织特异性或细胞类型特异性的表达。一当组织或细胞类型被选定用于表达，则5′并且也可连同3′的表达调控顺序也一起被选定。一般说来，这种表达调控顺序是由最初在选定的组织或细胞类型所表达的基因中产生的。产生这些表达调控顺序的基因基本上仅在所选择的组织或细胞中表达，然而如果在这样的组织或细胞类型表达转移基因的重组DNA对转移基因动物无害，则在其他组织和/或细胞类型中进行二次表达也可接受。特别理想的表达调控顺序是对被操作的动物来说属于内源的那些顺序。但是，由其他动物产生的表达调控顺序也可使用，例如由人基因产生的那些表达调控顺序。在若干例子中，表达调控顺序和重组DNA顺序（基因组或cDNA）来自相同的动物，例如都来自牛或人。在这种情况下，表达调控顺序和重组DNA顺序相互同源。另一种情况则是表达调控顺序和重组DNA顺序（cDNA或基因组）来自不同的动物，例如表达调控顺序来自牛，而重组DNA顺序来自人。在这种情况下，表达调控顺序和重组DNA顺序相互异源。

以下所述限定了由内源基因产生的表达调控顺序。这些限定也可用于由非内源基因产生的表达调控顺序。

一般说来，5′表达调控顺序包括转译起始顺序上游内源基因的转录部分（5′未转译区域或5′UTR）和其上游那些含功能启动子的侧翼顺序。本文所述“功能启动子”包括那些必需的未转录的DNA顺序，其使RNA聚合酶与内源基因结合，从而启动转录。这类顺序一般包括通常位于大约转录起始位点25-30核苷酸处的TATA顺序或盒。该TATA盒有时也称为近端信号。在许多例子中，启动子还包括位于启动转录所必需的近端信号（TATA盒）上游的一个或多个远端信号。这类启动子顺序一般都在位于转录起始位点上游的前100-200核苷酸内，但也可延长至转录起始位点的500-600核苷酸。这类顺序对本领域专业人员来说很容易理解，或采用常规方法很容易鉴别。这类启动子顺序不管是单独的还是与5′未转译区相结合，在本文中均称为“近端5′表达调控顺序”。

除了这种近端5′表达调控顺序外，最好在转移基因中还包括另一个5′侧翼顺序（本文称为“远端5′表达调控顺序”）。这类远端5′表达调控顺序含有一个或多个增强因子和/或其他顺序，能促进内源基因的表达，其结果能通过操作而促进与远端和近端5′表达调控顺序相连接的重组DNA顺序或分泌-重组DNA顺序的表达。远端5′表达调控顺序的量决定于产生顺序的内源基因。但是一般说来，这类顺序包括大约1Kb的5′侧翼区，以16Kb的为佳，尤以约30Kb的5′侧翼顺序为最佳。使用由任何特定内源基因得到的远端5′表达调控顺序的最佳量很容易确定，即通过改变远端5′表达调控顺序的量，从而获得最大的表达。一般来说，远端5′表达调控顺序不会大到延长至邻近的基因中，也不会包括对转移基因表达量起不利影响的DNA顺序。

此外，最好还包括3′表达调控顺序，以补充组织或细胞特异性表达。这类3′表达调控顺序包含3′近端和3′远端表达调控顺序。3′近端表达调控顺序包括转录但未转译的DNA，其位于重组DNA顺序中转译终止信号的下游（亦称为3′未转译区或3′UTR）。这类顺序一般在多腺苷化顺序处终止（由内源基因或由其他源例如SC40产生），而且是可使RNA稳定的顺序。一般说来，3′URT包括在产生3′调控顺序的基因中转译终止信号下游的大约100-500个核苷酸。远端3′表达调控顺序包括近端3′表达调控顺序下游侧翼DNA顺序。远端顺序中的有些顺序被转录，但并不形成mRNA部分，而其他远端3′表达调控顺序完全未转录。这类远端3′表达调控顺序含有增强因子和/或增强表达的其他顺序。这类顺序必须足够的多腺苷化并含有转录终止顺序。最好这类顺序含有大约2Kb的3′侧翼顺序，含8Kb的更佳，含约15Kb的为最佳。

虽然最好同时使用5′和3′表达调控顺序，但在本发明的一些实施例中，也有不用内源3′调控顺序。在这种情况下，将通常与由重组DNA顺序编码的基因组DNA相结合的3′近端表达调控顺序用于多腺苷化。另外，也可使用编码重组多肽的基因组DNA的远端3′表达调控顺序，其用量最好与内源3′表达调控顺序相同。在这种情况下，应理解为由转移基因编码的重组多肽可以包括基因组DNA，也可以包括由cDNA产生的双股DNA。在与5′表达调控顺序一起使用时，可很容易测定3′表达调控顺序的最佳量，即改变3′侧翼顺序的量，以获得重组多肽的最大表达。一般说来，来自内源基因或异源基因的远端3′调控顺序不会延伸到对转移基因表达量产生不利影响的任何顺序的邻近基因中，并且排除这种顺序。

表达调控顺序的例子示于表Ⅰ。

表  Ⅰ

表达调控顺序  组织特异性  动物种类

16Kb牛αS1-酪蛋白5′-结构基因和

8Kb  3′-结构基因  乳分泌细胞  牛

≈15Kb  5′-清蛋白基因  肝  鼠科动物

≈15Kb  5′-α-肌动蛋白基因  肌肉  鼠科动物

≈15Kb上游鱼精蛋白基因  精子细胞  小鼠

除了3′和5′表达调空顺序和重组DNA（或基因型或得自cDNA）以外，本发明的转移基因最好还包括一个“重组间插顺序”，它阻断转移基因的转录但不转译的5′区域。这类间插顺序可以得自例如牛αS1-酪蛋白、人乳铁蛋白。本发明所用的间插顺序是“同源重组间插顺序”，其中的5′和3′RNA拼接信号是那些通常在外源或异源间插顺序中发现的信号。但是，重组间插顺序还包括“杂交的间插顺序”。这类杂交的间插顺序包括一个来自不同来源间插顺序的5′RNA拼接信号和3′RNA拼接信号。在本发明的某些方面，这类杂交间插顺序包括至少一个“受纳RNA拼接顺序”。本发明所用的受纳RNA拼接信号是一种来自含有全部胚系DNA片段中的内含子的RNA拼接信号顺序（最好是3′RNA拼接顺序），所述DNA片段在细胞分化期间重新排列。这类基因的实例包括免疫球蛋白超基因族，包括免疫球蛋白类和T-细胞抗原受体以及全部胚系的主要组织亲和性复合（MHC）基因。特别优选的受纳拼接顺序是那些得自免疫球蛋白家族的拼接顺序，最好是得自IgG族，更优选的是那些与Ig重链和轻链（最好是重链）的重排的J-C片段相联系的3′拼接顺序。

当重组DNA相当于一个cDNA顺序时，优选使用这类含有受纳RNA拼接信号的杂交间插顺序。如实施例中所述，当来自αS1-酪蛋白的16Kb5′表达调控基因与αS1-酪蛋白-IgG杂交间插顺序结合使用来表达可操纵地连接在αS1-酪蛋白的分泌信号顺序上的人乳铁蛋白（hLF）cDNA时，得到可在转移基因的奶中产生约1330μg/ml的人乳铁蛋白的转移基因小鼠。这一数量的重组多肽大大超过了以前报导过的在转移基因的小鼠奶中产生的各种蛋白的数量，它们通常少于10μg/ml，有一种约为50μg/ml。

但是，这类杂交间插顺序不限于利用cDNA的转移基因。而且，当重组多肽由基因组顺序编码时，杂交的间插顺序也是很有用的。基于以上用cDNA重组DNA得到的结果和对基因组DNA顺序比得自cDNA的顺序表达效率更高的一般期望，可以预期这类杂交间插顺序和基因组重组DNA一起使用时，其表达水平会比仅用基因组顺序时大大提高。

基于以上叙述，似乎优选的基因组将包括大量的5′和3′表达调控顺序。而且，重组DNA最好得自基因组克隆，这类克隆的长度可能会有几百个Kb。基于本发明的克隆和操作DNA的技术，转移基因的构建和微量注射实际上只限于长度不超过50Kb的线性DNA。但是，本发明的转移基因，特别是那些长度大于50Kb的转移基因，可通过将所需转移基因的两个或更多的重叠片段引入胚胎靶细胞而方便地产生，当这样引入时，重叠片段会经历同源重组，这将导致完全重新构建的转移基因整合到靶细胞的基因组中。一般说来，优选那些在重叠区域中具有100%同源性的重叠转移基因片段。但是，如果有足够的同源重组发生，也可允许较低的顺序同源性。如果在同源顺序部分之间存在非同源性，那么非同源性最好不要波及同源顺序部分，而在分离区域。尽管在哺乳动物细胞中有14个碱基对100%同源就足以进行同源重组（Rubnitz，J.and  Subramani，S.（1984）Mol.Cell.Biol.4，2253-2258），但优选长的同源顺序部分，例如每个同源顺序部分500bp，1000bp更好一点，2000bp更好，大于2000bp最好。

如实施例中所述，将人血清清蛋白的三个重叠片段以约等摩尔的比例微量注射到小鼠受精卵的前核中，这些片段成功地重组并整合到小鼠基因组中，这一点通过检测转移基因小鼠血清中的RNA转录本和人血清清蛋白而证实。尽管这样产生的转移基因长度为38Kb，但是对利用更大和/或更多数量的重叠基因转移片段可能形成的转移基因的长度的实际限制还不清楚。具体说，预期用这种方法可形成长度在50-1000Kb之间的转移基因，最好是在50-500Kb之间的转移基因。而且，可期望使用重叠片段的同源重组大量产生更大的转移基因动物，如含有本发明转移基因的转移基因牛类。

当最终目的是要分泌重组多肽时，编码功能性分泌信号肽的“分泌性DNA顺序”也被可操纵地连接接在转移基因中以指导重组多肽从转移基因动物的一种或多钟细胞类型中分泌。分泌性DNA顺序一般得自编码与转移基因动物同样品种动物的分泌蛋白的基因。这类分泌性DAN顺序最好得自编码从定靶于组织特异性表达的细胞类型中分泌出的多肽的DAN顺序，这种多肽例如在乳腺分泌细胞中表达并分泌的奶蛋白。但是，分泌性DNA顺序并不限于这些顺序，也可采用编码转移基因动物种内的其它细胞类型分泌的蛋白的DNA顺序，例如，编码不是从乳腺中分泌的蛋白的同源基因的天然信号顺序。此外，还可使用“异源分泌性DAN顺序”，它编码来自与转移基因动物不同种动物的信号分泌肽，例如人t-PA、人血清清蛋白，人乳铁蛋白和人乳清蛋白。一般说来，分泌性DAN顺序可以定义为：当可操纵地连接到一个重组DNA顺序上时，可编码一个能引起重组多肽分泌的信号肽的任何DNA顺序。

在一种优选方案中，用编码牛类乳腺分泌细胞中功能性分泌信号顺序的分泌性DNA顺序来引起重组多肽从牛乳腺分泌细胞中分泌。分泌性DAN顺序被可操纵地连接到重组DNA顺序上。这类分泌性DNA的实例包括编码牛αS1酪蛋白、鼠乳铁蛋白和人转铁蛋白的信号分泌顺序的DNA顺序。优选的分泌性DNA顺序是编码牛类αS1酪蛋白的分泌顺序的DNA顺序。这类分泌性DNA顺序的应用在实施例中详细叙述。

本文中将分泌性DNA顺序连接到重组DNA顺序上的所谓“可操纵地连接”，意思是将分泌性DNA顺序（包括编码分泌性信号肽顺序的密码子）共价连接到重组DNA顺序上，得到编码5′到3′的分泌信号顺序和重组多肽的分泌性重组DNA顺序。因此，分泌性顺序和重组DNA顺序的读码必须共价结合，以使得在转录和RNA前体加工后形成的mRNA顺序的5′端存在一个开放读码。RNA中的开放读码含有编码分泌信号肽的5′顺序部分和编码重组多肽的3′顺序部分。当这样构建时，分泌性重组DNA顺序一旦表达产生重组多肽，就是可以从表达DNA顺序的靶细胞中分泌的形式。信号肽一般是在分泌产生细胞外形式的重组多肽期间在体内除去。

在本发明的优选方案中，分泌性重组DNA顺序在转移基因牛类的乳腺分泌性细胞中显著地表达。这种组织特异性表达通过将乳腺特异性表达调控DNA顺序可操纵地连接到上述分泌性重组DNA顺序上而得到。这类乳腺特异性调控顺序包括以前提到的在动物乳腺分泌细胞中优先表达的各种牛基因中的调控顺序。这类乳腺特异性基因包括αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、K-酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白。优选的表达调控顺序得自αS1-酪蛋白，详细描述见实例1。

一般说来，本发明的用来将重组多肽分泌到转移基因奶中的转移基因，都能够产生比以前报导的转移基因小鼠和羊高许多的分泌。当重组多肽由相当于或得自cDNA的重组DNA编码时，重组多肽的摩尔浓度优选大于1.0μM，更优选大于10μM，最好大于100μM。当从转移基因奶中存在的重组多肽而言时，重组多肽的量优选大于50μg/ml，更优选大于500μg/ml，最好大于1000μg/ml（1mg/ml）。

当本发明的转移基因编码由得自或相当于基因组DNA的重组DNA顺序（或由这样的基因组顺序构成，如大于约50%，优选大于70%，最好大于90%的编码重组多肽的密码子来自基因组顺序）编码的重组多肽时，牛转移基因奶中的摩尔浓度和蛋白质水平与cDNA的情况一样或更高些。一般说来，转移基因奶中的重组多肽浓度优选大于50μM，更优选大于150μM，最好大于500μM。当从基因转移奶中的蛋白水平的角度来看，优选大于10mg/ml，更优选大于25mg/ml，最好大于50mg/ml。

上述牛转移基因奶中的摩尔浓度和蛋白质水平将由具体的重组多肽而定。在牛转移基因奶中产生重组多肽的一个优点是可以产生较大分子量的多肽，这种多肽在其它体系如原核表达体系中很难大量产生。虽然根据本发明可以在牛转移基因奶中产生任何重组多肽，但一般优选产生分子量大于约10，000道尔顿的重组多肽。但是在转移基因牛奶中也可产生其它分子量大于15，000、大于20，000以及大于60，000道尔顿的重组多肽。例如，分子量为17，000道尔顿的人溶菌酶和分子量为79，000道尔顿的乳铁蛋白，可根据本发明公开的方法在牛类转移基因奶中方便地产生。因此，本发明的重组多肽具有很大的分子量范围。

因此，当生产高分子量的重组多肽时，可对上述重组多肽的优选摩尔浓度进行调节。这种调节通过将摩尔浓度转移成所的产生蛋白量，再调节摩尔浓度使重组多肽水平在下面的优选浓度范围内。

以前大多数涉及转移基因奶中产生多肽的报道都是关于转移基因小鼠的。但是，小鼠通常产生55-80mg蛋白质/ml奶。而一只母牛通常产生30-34mg蛋白质/ml奶。由于重组多肽产生水平过高时，会反过来影响内源奶蛋白的产生和/或影响哺乳动物的分泌腺，所以重组多肽的浓度优选在正常牛奶蛋白浓度的3-50%之间（即每毫升转移基因奶中含1-17mg重组蛋白），更优选在10-20%之间（即3-7mg/ml），最好在10-15%之间（即3-5mg/ml）。这样的优选范围也提供了上述转移基因牛奶中所产生蛋白质水平的优选最大极限。

以上所述的将各种DNA顺序连接起来形成本发明的转移基因，可利用本领域专业人员已知的标准方法或本文描述的方法进行。一旦转移基因或编码转移基因的重叠同源片段被构建，便用于制造转移基因的非人动物。

将转移基因或重叠的转移基因片段引入胚胎靶细胞的方法包括将转移基因微量注射到非人动物的受精的卵母细胞的前核或ES细胞的核中。这种方法对鼠类而言，是本领域专业人员已知的。或者，通过用含有转移基因的还原病毒感染受精卵而将转移基因引入动物中（Jaenisch，R.（1976），Proc.Natl.Acad.Sci.USA，73，1260-1264）。优选的方法是微量注射到受精的卵母细胞中。在这种优选方案中，受精的卵母细胞先利用标准方法进行微量注射，然后在体外培养，直到得到“前植入胚”。这类前植入胚最好含有大约16-150个细胞。胚胎的16-32细胞期一般称作桑椹期。那些含有多于32个细胞的前植入胚通常称作胚泡。它们通常证明64细胞期的囊胚腔发育的特性。将受精的卵母细胞培养成前植入胚的方法包括以下文献中所描述的方法：Gordon  et  al.（1984），Methods  in  Enzymology，101，414;Hogan，et  al.（1986）in  Manipulating  the  Mouse  Embryo，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press，Cold  Spring  Harbor，N.Y.（for  the  mouse  embryo）;and  Hammer，et  al.（1985），Nature，315，680（for  rabbit  and  procine  embryos）Gandolif  et  al.（1987）J.Reprod，Fert.81，23-28;Rexroad  et  al.（1988）J.Anim.Sci.66，947-953（for  ovine  embryos）and  Eyestone，W.H.et  al.（1989），J.Reprod.Fert.，85，715-720;Camous.，et  al.（1984），J.Reprod.Fert.，72，779-785;and  Heyman，Y.，et  al.（1987），Theriogenology，27，5968（for  bovine  embryos）。然后将这类前植入胚利用标准方法转移到适当的母体中，以产生转移基因的或嵌合的动物，由引入转移基因时的发育时期而决定。

由于转移基因参入的频率通常很低，所以非常需要对转移基因在前植入胚中的整合进行检测。在本发明的一个方面中，提供了鉴别发生基因转移的胚的方法，该胚以后可以植入形成转移基因动物。在上述方法中，至少要从前植入胚中除去一个细胞。如果是等分分裂，最好不要使胚经过桑椹胚期（32细胞）。前植入胚的分裂（见Willams  et  al.（1986）Theriogenology  22，521-531），产生两个“半胚”（半桑椹或半胚泡），每个半胚在植入适当的母体后，都能在子宫（in  utero）中继续发育，形成胎儿。尽管优选前移入胚的等分分裂，但应明白所述胚也可以有意识地或无意识地不等分裂成细胞数目不同的两个半胚。所必须的是，其中的一个胚（没有象本文后面所述进行分析）须有足够数目的细胞，以在子宫中发育成完整胎儿。在一个特定的实施方案中，半胚（没有如本文所述进行分析）如果表现出基因转移，则被用于产生转移基因非人动物的克隆群体。

将由前植入体分裂而形成的两个半胚中的一个进行分析，以测定转移基因是否已整合到有机体的基因组中。将两个半胚中的另一个留着用于随后植入受纳母体。一种检测胚胎发育早期基因转移的优选方法，是把这些半胚与有独特性质的限制性内切酶DpnⅠ一起使用。这种酶可识别双链DNA中的顺序GATC，但只有当该顺序内每一条链中的腺嘌呤都在N-6甲基化后才可识别。当使用这一优选方案时，将含有顺序GATC的转移基因在微量注射前进行甲基化，所述甲基化或通过将在适当载体上的转移基因通过一个微生物的DAM菌株如大肠杆菌MM294转移而完成，或通过用雌亲性甲基化酶直接进行甲基化。然后将甲基化的转移基因（最好没有任何外源顺序如质粒载体）微量注射到受精的卵母细胞（每个前核约10至50拷贝，最好50至100拷贝）中。将这样得到的受精卵细胞在体外培养至前植入体阶段。在这早期生长期间和细胞分裂阶段，基因组DAN被复制。因此，这些整合在受精卵母细胞基因组中的甲基化转移基因拷贝在复制后脱甲基化，而未整合的转移基因在复制后仍保持甲基化（Lacks，S.et  al.（1977），J.Mol.Biol.，114，153）。整合的与未整合的转移基因的这种差示甲基化方式使其可用来鉴定受精卵母细胞中的转移基因是否已整合到基因组中。

含有整合的转移基因的前植入体的鉴定，通过分析来自每个半胚的DNA而完成。所述DNA通常通过溶解半胚而得到，在用Ninomig，T.等人所述方法（1989，molecular  Reproduction  and  Development  1，242-248）处理后，分析释放出的DNA。将每个DNA样品用Dpn  I处理。然后，进行聚合物酶链反应（Saiki，et  al.，1985，Science，230，1350-1354）以放大所有的或部分的转移基因。当要放大整个转移基因时，用两个在转移基因两端的分别互补于另一条链的延伸引物进行放大作用。但是，当不是放大整个转移基因时，选择这样的延伸引物，即它放大的基因产物包括转移基因的DpnI位点。如果不发生DpnI断裂，PCR放大作用产生的放大顺序具有预定的长度，而对那些已断裂的转移基因，引物延伸将产生指数倍数的放大作用。一般说来，将Dpn  I/PCR放大的来自半胚的DNA先进行电泳，然后与在互补于两个延伸引物间的转移基因区域的标记探针杂交。这有助于测定放大的DNA顺序的长度（如果有的话），并指明转移基因是否已被整合到产生半胚（现称为转移基因半胚）的前植入胚中。如果已经整合，则将剩下那个未处理的转移基因半胚植入一受体中。在子宫中发育后，利用适当的方法在子宫中或在出生后鉴定具有转移基因赋予的所需表型（由整合的转移基因赋予）的转移基因非人动物。当然，在后面的方法中还会用到其它能切断甲基化DNA顺序但不能切断所识别顺序的未甲基化形式的限制性核酸内切酶。

以上所述利用DpnI的方法，需要在目标转移基因中存在顺序GATC。当这种顺序不存在时，可通过位点直接突变（Kunkel，T.A.（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.，82，488）或盒式突变（Wells，J.A.，et  al.（1985）.Gene，34，315）将它方便地引入，只要这种突变不改变转移基因编码的氨基酸顺序（或引起氨基酸顺序的无意义改变）并且这样产生的任何密码子在目标转移基因动物中有意义即可。

上述用于检测前移入胚中基因转移的方法提供了经济省时的产生转移基因非人动物的方法，因为这些方法明显地减少了产生转移基因动物所需的怀孕数目，也减少了植入胚产生转移基因非人动物的似然性。这些方法对那些得到转移基因频率很低或没有的动物（如牛类）而言，是非常重要的。

在另一种实施方案中，将上述检测前植入胚中基因转移的方法和胚胎克隆结合起来，产生一群克隆的转移基因胚，将这些胚植入受纳母体，产生一群克隆的有同样基因型的转移基因非人动物。在这一点上，应该明白，具有同样“基因型”的转移基因胚和/或转移基因非人动物是指在胚胎和/或转移基因动物群体的个体之间，基因组DNA基本相同。但是，也应明白在有丝分裂间期可能发生各种各样的体细胞突变，这种突变会产生一种或多种在基因型上变异的细胞和/或动物。因此，具有同样基因型的一个群体可能会有个体或亚群体变异。

当一个半胚被鉴定为转移基因半胚后，将它进行克隆。这种胚的克隆可过利用几种不同的方法进行。在一种克隆方法中，将转移基因半胚培养在与将单个卵母细胞培养成前植入体阶段所用的培养基相同或相似的培养基中。然后将这样形成的转移基因胚（最好是转移基因桑椹胚）分裂成两个转移基因半胚，所述半胚可以植入受纳母体形成两个基因转移动物的克隆群体。或者，可以将得到的两个转移基因半胚再培养到前植体阶段，再分裂并再培养到转移基因胚阶段。将这一方法重复进行，直到得到所需数量的具有同样基因型的转移基因胚为止。然后将这些转移基因胚植入受纳母体，产生转移基因非人动物的克隆群体。

在一种优选的克隆方法中，转移基因是根据Prather等人（1988，Biol.Report  37  59-86）和Roble等人（1987，J.Anim.Sci.64，642-664）的技术，通过核转移而克隆的。根据这一方法，将转移基因胚的核移植到去核卵母细胞中，然后将每个卵母细胞培养到胚泡阶段。在这一点上，转移基因胚可以通过核移植再进行另一次克隆或转移到受纳母体中产生具有同样基因型的转移基因后代。

除了前面所述的检测早期基因转移的方法外，还可以用其它方法检测基因转移。这些方法包括在子宫内和产后进行组织分析。子宫内分析可利用几种技术进行。一种技术是在回波指示器指导下进行通过阴道的羊膜腔穿刺（Bowgso  et  al.，1975，Bet.Res.86，124-127;Rumsey  et  al.，1974，J.Anim.Sci.39，386-391）。这一方法包括收集怀孕约35到100天之间的约15-20ml羊水。这些羊水含有约1，000-12，000个细胞/ml，来自发育胚的尿道、皮肤或肺。这些细胞中的大多数是死细胞。但是，这些细胞含有基因组DAN，将这些DNA进行转移基因的PCR分析作为成功基因转移的指征。或者，可通过绒膜穿刺收集胎儿细胞，这一方法也可以通过阴道并在四波指示器指导下进行。在这一方法中，用针穿刺受体动物的固定在阴道壁上的胎盘，具体说是胎盘结构。这种取样方式可在牛类怀孕60天左右时进行。如果需要，可将绒毛膜细胞和母体组织分离、再进行作为成功基因转移指征的PCR分析。

基因转移还可以在出生后检测。在这种情况下，转移基因的整合可利用适当的组织活体解剖而检测，如来自推测的转移基因动物的耳朵或尾巴的活体解剖组织。获取1-2cm的尾巴或5-10平方毫米的耳朵，然后根据Hogan等人的方法（Manipulating  thd  Mouse  Embryo，1986，ColdSpring  Harper  Laboratory）用转移基因探针进行Southern杂交。

在这些实施方案中，重组多肽被表达并分泌到牛类转移基因奶中，这样得到的转移基因奶可直接使用或进一步处理以纯化重组多肽，这部分地决定于转移基因奶中所含有的重组多肽和所述蛋白质的最终用途。因此，当重组多肽被分泌到转移基因牛奶中以增加牛奶的营养价值时，就不需要进一步纯化。这种情况的实例包括一个优选实施方案，其中在牛奶中产生人乳铁蛋白作为控制新生儿肠道感染的补充剂。在另一些情况中，可能需要进行部分纯化以分离一种特别的重组多肽。例如，转移基因牛奶中产生的人乳铁蛋白可通过将牛奶酸化至pH4-5以沉淀酪蛋白而进行部分纯化。溶解部分（乳清）含有部分纯化的人乳铁蛋白。

牛转移基因奶中所含的重组多肽还可用于食品配方。一个具体的有用的食品配方包括含有一种或多种得自转移基因奶的重组多肽的婴儿食品配方。所述重组多肽或有营养价值，或有其它有益的价值。例如，根据本发明制造的含有得自转移基因牛奶的人乳铁蛋白的婴儿食品配方具有抑菌作用，有助于控制新生儿腹泻。同样，在转移基因奶中也可产生有营养价值的重组多肽，如人酪蛋白和人乳清蛋白。表2列出了一般婴儿食品配方的组成。如表2所示，蛋白质含量在1.8-4.5克/100千卡之间，因此，包括重组多肽在内的总蛋白应该至少在表2配方所依据的美国规定的需要量的范围内。当然，包括重组多肽在内的总蛋白量可根据当地具体配方的用途规则而变化。

表2

营养成分 最小值^a最大值^a

蛋白质（gm）^f1.8^b4.5

脂肪

gm  3.3  6.0

每百卡  30.0  34.0

基本脂肪酸（亚油酸）

每百卡  2.7

mg  300.0

维生素

（A）（IU） 250.0（75μg）^c750.0（225μg）^c

D（IU）  40  100.0

K（μg）  4.0

E（IU）  0.7（0.7IU/gm亚油酸）

C（抗坏血酸（mg）  8.0

B₁（硫胺素）（μg） 40.0

B₂（核黄素）（μg） 60.0

B₄（吡哆醇）（μg） 35.0（15μg/gm蛋白）

B₁₂（μg） 0.15

烟酸（μg）  250.0

叶酸（μg）  4.0

泛酸（g）  300.0

生物素（μg） 1.5^d

胆碱（mg） 7.0^d

肌醇（mg） 4.0^d

表2（续）

营养成分  最小值  最大值

矿质

钙（mg） 50.0^e

磷（mg） 25.0^e

镁（mg）  6.0

铁（mg）  0.15

碘（μg）  5.0

锌（mg）  0.5

铜（μg）  60.0

锰（μg）  5.0

钠（mg）  20.0  60.0

钾（mg）  80.0  200.0

氯化物（mg）  55.0  150.0

a.每100千卡

b.蛋白质来源至少在营养上相当于酪蛋白。

c.维生素A等价物。

d.只有在不是基于奶的配方中才需要有这一数量。

e.钙与磷的比例必须大于1.1，小于2.0

f.包括本发明的重组蛋白或重组蛋白和其它蛋白。

除了用于婴儿食品配方外，其他食品配方中也可补充转移基因牛乳中的重组多肽。例如这类重组多肽可用于补充普通的食物配制。

当重组多肽用于药物时，需要与这种应用相符合的纯化方法。这种纯化方法取决于具体需要纯化的重组多肽，而且一般均为本领域专业人员所熟知。所述方法一般包括酪蛋白馏分的部分纯化，然后对含重组多肽的适当部分进行层析，包括亲和层析，离子交换层析，凝胶过滤和HPLC。

在本发明一个具体实施例中，提供了在转移基因牛的乳中产生人乳铁蛋白的转移基因。人乳铁蛋白（HLF）是一种结合2个铁离子的单链糖蛋白，由外分泌腺（Mason  et  al.（1978）J.Clin.Path.31，316-327;Tenovuo  et  al.（1986）Infect.Immun.51，49-53）和多形核中性粒细胞（Mason  et  al.（1969）J.Exp.Med.130，643-658）分泌，这种蛋白由于抑制不同谱菌的生长而起着宿主非特异性保护体系的部分作用。HLF由于在培养基中可得到的铁的螯合具有制菌作用，因这种重要的金属进不到所侵袭的微生物（Bullen  et  al.（1972）Br.Med.J.1，69-75;Griffiths  et  al.（1977）Infect.Immun.15，396-401;Spik  et  al.（1978）Immunology  8，663-671，Stuart  et  al.，（1984）Int.J.Biochem.16，1043-1947）。如果该蛋白被铁离子饱和，则这种作用就会终止。有些研究认为HLF对某些微生物显示直接杀菌作用（Arnold  et  al.（1980）Infect.Immun.28，893-898;Arnold  et  al.（1977）Science  197，263-265;Arnold  et  al.（1981）Infect.Immun.32，655-660;Arnold  et  al.（1982）Infect.Immun.35，792-797;Bortner  et  al.（1986）Infect.Immun.51，373-377）。由于蛋白质的铁离子饱和也会抑制杀菌作用。尽管已经证明HLF能损害革兰氏阴性菌中的外膜和改变外膜的渗透性（Ellison等，1988，Infect.Immun.56，2774-2781），但对HLF的杀菌作用还未作出任何的假定。

乳铁蛋白是人乳中的主要铁结合蛋白（存在的量约1.5-1.7mg/ml），并且在通过小肠吸收铁方面可起一定的作用。存在于乳房乳中的所有铁都与HLF相结合，并且与配制的食物相比较都有很高的效力（Hide，D.W.等，1981，Arch.Dis，Child.，56，172）。据现有的假定，由于HLF结合铁在受体空肠中的摄入量很高，并且给出了在受体罗猴中存在的数据（Cox等，1979，BBA，588，120;Davidson，L.A.等，1985，Fed.Proc.，18，901）。乳铁蛋白受体对成年人小肠粘膜细胞的作用也已被证实（Cox等，1979，Biochem.Biophys.Acta.588，120-128）。在肠内菌丛控制下，还含有游离铁（Mevissen-Verhage等，1985，Eur.J.Clin.Microbiol.，4，14）。与喂牛奶的婴儿相比，加与不加铁，喂奶的婴儿在粪便样品中显著降低了大肠杆菌素和增加了双歧杆菌和核状芽孢杆菌的量。在体外研究中，证明人乳对大肠杆菌具有特殊的抑制作用（Brock等，1983，Infect.and  Immunit.，40，453）。此外，还证明小肠内由于铁结合蛋白（主要是HLF）的量很高，因此人乳对大肠杆菌也具有特殊的抑制作用（Bullen等，1972，British  Med.J.，1，69）。

因此，在转移基因牛的乳中生产人乳铁蛋白提供了人乳铁蛋白的一种来源。这类乳铁蛋白可由用于配制食品的转移基因乳中提纯。另外，也可使用全转移基因乳，可以是液体的，也可以是干燥的形式，尤以经过巴氏杀菌的为佳。此外，人乳铁蛋白潜在的有利作用是将人乳铁蛋白或含有乳铁蛋白的转移基因乳与人溶菌酶结合使用。人溶菌酶可以通过同时引入次级转移基因和HLF转移基因，在转移基因奶牛中同时产生人溶菌酶，从而生产出能在转移基因乳中产生一个以上的重组多肽。另外，也可以将转移基因连续引入牛内。在这种情况下，得到的转移基因牛含有一种转移基因。此后，将从转移基因雌牛中得到的胚胎细胞（例如卵）进行处理;结合进编码第二种多肽的第二种转移基因。最好先使卵受精，然后微量注入所得到的接合子的原核。应该理解的是上述转移基因牛的乳中两种以上重组多肽的结合不限于上述人乳铁蛋白和溶菌酶的结合。因此，本发明可望生产转移基因牛和转移基因乳，其中通过这样的转移基因动物，在转移基因乳中可产生一个以上多肽。

完全的HLF氨基酸顺序已经测定（Metz-Boutigue等，1984，Eur.J.Biochem.1451，659-676）。HLF含有两个区域，各含一个铁结合位点和一个N-连接的糖基化位点。这两个区域相互同源，可说明遗传基因复制和融合。另外，HLF扩大与铁传递蛋白族的其他成员同源（Meta-Boutigue，引文同上;Pentecost等，1987，J.Biol.Chem.262，10134-10139）。氨基酸在铁结合位点内的位置已用X射线结晶学方法测定（Anderson等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84，1769-1773）。嗜中性白细胞HLF的部分cDNA顺序已由Rado等发表（1987，Blood，70，989-993）。由cDNA推导出的氨基酸顺序之间具有98%以上的一致性，并且已经由人乳中的乳铁蛋白的直接分析测定。铁饱和的和无铁形式的人乳铁蛋白已于最近发表（Anderson等，1989，J.Mol.Biol.209，711-734;Anderson等，1990，Nature，784-787）。

本文所述“人乳铁蛋白”包括具有基本上为Metz-Boutigue等（1984，Eur.J.Biochem.，1451-659-676）和附图2所述氨基酸顺序的多肽。但是应该注意的是人乳铁蛋白顺序的早期部分顺序在与已经公开的顺序和本发明得到的顺序之间存在许多差异。特别是存在以下的差异（由图1顺序中编号的氨基酸，括号内为DNA位置）：

氨基酸  位置  Metz-Boutigue顺序

Arg  122（418）  无

Thr  130（442）  Ile

Gln  151（505）  Arg

Ser  184（604）  Leu

Tyr  189（619）  Lys

Ser  372（1169）  TrP

Ala和Met之间  391（1122）  13个氨基酸

Cys  403（1225）  Gly

Gln  512（1588）  Glu

Lys  675（2077）  Arg

因此，人乳铁蛋白也是图1所示顺序限定的，它将本发明得到的顺序差异与已公开的顺序结合在一起。人乳铁蛋白还包括这些顺序或重组人乳铁蛋白变体之间的等位变化，其中一个或多个氨基酸被一个或多个氨基酸残基取代、插入或缺失所修饰。在有些例子中，人乳铁蛋白可在含与其共价连接的全部或部分分泌信号顺序的乳中产生。

本文所述“人乳铁蛋白DNA顺序”是如上所述的编码人乳铁蛋白的DNA顺序。这种人乳铁蛋白DNA顺序可由人乳腺cDNA库得到，或可由人基因组衍生得到。本文中的实施例2介绍了由人乳腺cDNA库衍生的人乳铁蛋白的克隆和核苷酸顺序。该人乳铁蛋白的DNA顺序示于图1和图2，并且基本上与Rado等所述相同（1987，Blood，70，989-993）。在实施例中还介绍了含编码HLF可表达转移基因的质粒的构建。其中一个质粒为cGP1HLF（有时也称16，8HLF3），含有为在牛乳分泌细胞中组织特异性表达而设计的转移基因。

在本发明的第二个实施例中，为在转移基因牛的乳中产生人血清清蛋白提供了转移基因。人血清清蛋白是含有584个氨基酸残基的血清蛋白（Minghetti等，1986，J.Biol.Chem.，261，6747）。这是人血清中丰度最大的蛋白。执行着两个最重要的生理功能。血清清蛋白承担大约80%的血的总克分子渗透压浓度，并在脂肪组织间运输脂肪酸。

人血清清蛋白主要用于通过提高循环系统中的渗透压，使原生质体积膨胀。现在已有将热处理血清衍生的HSA部分注入严重休克和创伤患者，包括进行重手术的大多数患者。作为由血液部分处理中的副产品HSA是由人血浆中衍生的，得到稀少的血蛋白，如因子Ⅷ和Ⅸ。因此，最近发展的通过生物技术产生这类因子的技术，威胁着人血清清蛋白的来源。

本文所述“人血清清蛋白”包括具有基本上为Minghetti（引文同上）和Lawn等（1981，Nucl.Acids.Res.，9，6103）所述氨基酸顺序的多肽及其变体，包括重组人血清清蛋白变体，其中一个或多个氨基酸已通过由一个或多个氨基酸残基的取代，插入或缺失所修饰（Minghetti等，1986，J.Biol.Chem.，261，6747-6757）。在若干例子中，人血清清蛋白可在乳中通过表达含有编码HSA的分泌信号顺序的DNA的转移基因产生。另外，人血清清蛋白可在利用完全异源转移基因的转移基因动物的肝脏细胞中产生，也可由其分泌产生，所述异源转移基因包括编码5′表达调控顺序、人血清清蛋白分泌信号和结构基因以及3′表达调控顺序的人基因组DNA。如实施例中所述，含有该异源顺序的转移基因是通过在转移基因动物内重建HSA基因的重叠转移基因片段在体内的同源重组形成的。由此形成的转移基因动物在其循环系统中产生人血清清蛋白。

本文所述“人血清清蛋白DNA顺序”是编码如上定义的人血清清蛋白的DNA顺序。如Urano等（1986，J.Biol.Chem.，261，3244-3251，1984，Gene，32，255-261）和本文实施例中所述，这种人血清清蛋白DNA顺序可由λHAL-HAI、λHAL-3W和λHAL-H14得到。

人血清清蛋白DNA顺序按本文实施例10所述先后进行克隆和操作，取代在质粒cGP1HLF中（也称作P16，8HLF4）中编码的人乳铁蛋白基因。由该质粒得到的转移基因含有16Kb牛α-S1酪蛋白基因的5′表达调控顺序、人血清清蛋白DNA顺序和大约8Kb的α-S1酪蛋白牛基因的3′-侧翼区。将该转移基因用于微量注射受精过的牛卵母细胞。经早期检测发生转移基因后，将含HSA转移基因的胚泡植入受体雌牛中并迫使接受。

以下实施例用于说明本发明，而不是限制本发明的范围。

实施例1

构建一种特异于牛αS1-酪蛋白顺序的探针

A.分离染色体DNA

胚盘组织得自屠宰物。除去周围连接的组织，将约30克胎盘组织碎片在液氮中迅速冷冻。染色体DNA如下分离：将30克组织用35ml缓冲液1（在冰上）匀浆，所述缓冲液1含有300mM蔗糖、60mM  KCl、15mM  NaCl、60mM  Tris  ·HCl（pH8.2）、0.5M亚精胺、0.15Mm精胺、2mMEDTA、0.5mM  EGTA。加入含有1%NP40的65ml冰冻缓冲液1，混合物在冰上保温5分钟。在3000xg下离心5分钟后，沉淀用含有1%  NP40的缓冲液冲洗。重复所述离心步骤后，将沉淀再悬浮于5ml缓冲液1中。迅速加入5ml  0.5M  EDTA。终体积为15ml。加入0.15ml  10%  SDS溶液。混合后，加入RNAse  A和T1，终浓度分别为0.4mg/ml和6μ/ml。在37℃下保温3小时后，加入蛋白酶K至终浓度0.1mg/ml。将该混合物在37℃下保温15小时。然后用苯酚小心提取混合物。分离水相，加入1/30体积的3M  NaOAc（pH5.2）和1体积的异丙醇。沉淀（DNA）在4℃下用70%乙醇冲洗并缓慢溶解于0.5ml  10mM  Tris-HCl（pH8.0）1mM  EDTA中。

B.放大来自α-S1-酪蛋白基因的5′-侧翼区域的顺序

利用Yu-Lee等人公开的方法（1986，NaCl.Acid.Res.14，1883-1902）在顺序上合成两条DNA-引物。引物1位于相当于主要转录起始位点的681位，具有如下顺序：

5′-TCC ATG GGG GTC ACA AAG AAC TGG AC-3′

（顺序ID  NO.：5）

引物＃2位于相当于主要转录起始位点的+164位，具有如下顺序：

5′-TGA ACG TTG CTA ACA GTA TAT CAT AGG-3′

（顺序ID  NO.：6）

虽然该引物的前8个核苷酸顺序不是由牛基因组编码的，但含有一个HindⅢ限制性位点，这有助于后面的克隆步骤。将这些引物对染色体DNA退火，并在脱氧核糖核酸存在下利用TAQ-聚合物酶进行延伸。三分钟后，将混合物在92℃下变性1分钟，在50℃下退火1.5分钟，再在延伸温度（68℃）下保温2分钟。将这一循环重复30次。最后一次循环后，检查DNA中预期的EcoRⅠ位点是否存在。片段的长度和EcoRⅠ位点的存在都如预期的一样。然后用填平酶（Klenow  enzyme）处理片段以修复悬垂的末端，用激酶处理以在片段末端连上磷酸基团，在65℃保温10分钟以使激酶和填平酶失活，最后用HindⅢ消化。然后将片段在pUC19中亚克隆（Yanisch-Perron等人，1985，Gene，33，103-109），用SmaⅠ和HindⅢ消化。该片段的同一性的证明通过对该亚克隆的一部分进行顺序分析而得到（在再克隆到M13载体中之后）。测出的顺序与公开的顺序一致。然后用这一探针筛选牛基因组文库，得到特异于αS1-酪蛋白基因5′-侧翼区域的克隆。

C.放大来自αS1-酪蛋白基因的3′-侧翼区域的顺序

用上述同样方法，根据Stewart等人（1984，NaCl.Acid.Res.12，3895-3907）公开的顺序，设计两个引物。5′-引物位于在cDNA顺序173位起始的编码顺序的下游。它具有如下顺序：

5′-GAG GGA CTC CAC AGT TAT GG-3′

（顺序ID  NO.：7）

另一个引物位于cDNA顺序的1070位，具有如下顺序：

5′-GCA CAC AAT TAT TTG ATA TG-3′  （顺序ID  NO.：8）

将这些引物对染色体DNA退火，在这两个引物之间的区域如上所述被放大。所得片段约为900bp，比预期的要长。顺序分析表明，这一长度的间插顺序存在于cDNA的核苷酸737和738之间。放大后的片段用填平-聚合酶处理以修复悬垂末端，用激酶处理以在片段末端连上磷酸基因。然后将所述片段连到前面用SmaⅠ切过的pUC19上。

D.筛选牛噬菌体文库中的αS1-酪蛋白侧翼区域

构建在EMBL3中的牛基因组文库得自M.Groenen博士（Agriculrune  University  Wageninger，Netherlands），并用以下方法进行筛选。病毒噬菌体颗粒的效价在大肠杆菌MB406（一个受纳寄主菌株）中测定。为此，在SM缓冲液（50mM  Tris-HCl  pH7.5，100mM  NaCl，10mM  MgSO，0.01%明胶）中进行噬菌体原种的稀释，并与200ml  MB406混合（O.D.-0.9）;在37℃下保温20分钟后，加入3ml琼脂糖（Luria-Bertani介质，0.8%琼脂糖，10mM  MgCl），并铺布于LB板上，在37℃下保温过夜。

将约600，000个噬菌体加到400ml MB406中，铺在平皿上。后面的铺板步骤和上面描述的一样。下一步是将噬菌体转移到硝酸纤维素滤膜上。将平皿在4℃下放置1小时。将硝酸纤维素滤膜（S & S）放在琼脂糖的上面，准确标记位置。揭开后，将滤膜（1）在变性缓冲液（1.5M NaCl，0.5M NaOH）中浸泡30分钟（2）在中性缓冲液（1.5M NaCl，0.5M Tris·HCl pH8.0）中浸泡5分钟。用2×SSPE（360mM NaCl，20mM NaH₂PO、2mM EDTA）冲洗后，将滤膜在真空下80℃烘烤2小时。

滤膜的预杂交在缓冲液中42℃下进行2小时;所述缓冲液含有50%甲酰胺、5×Denhardt溶液（0.1%Ficoll、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、0.1%牛血清清蛋白）、5×SSPE、0.1%SDS和100mg/ml变性的鲑鱼精子DNA。杂交在同样的缓冲液中42℃振荡水浴中进行过夜。将如前所述制备的探针用得自Boehringer  Mannheim的Random  Primed标记药盒进行标记。过夜杂交后，滤膜在室温下用2×SSC、0.1%SDS冲洗三次。

在-70℃下用放大屏幕（Dupont）进行柯达XAR胶片的过夜曝光。将推测的阳性菌落从平皿中挑出，放在SM缓冲液中4℃下过夜。并根据平皿溶菌方法（Maniatis，T.，等人，1982，Mocecular  Cloning：A  Laboratory  Manual，Cold  Spring  Harbor，N.Y.）分离DNA。将5ml  SM缓冲液加到上层琼脂糖中;在轻轻摇动2小时后，除去缓冲液，并在4000rpm下4℃下旋转10分钟。将上清液转移到无菌试管中，加入RNase  A和DNaseⅠ（终浓度均为1mg/ml），在37℃下保温30分钟。加入1体积的20%聚乙二醇和2.5M  NaCl溶液，并在冰上放置1小时。在4℃下4000rpm离心30分钟，以沉淀噬菌体颗粒。将沉淀的颗粒再悬浮于500ml  SM缓冲液中，加入SDS（终浓度0.1%）和EDTA（终浓度5mM），在68℃下保温15分钟。用苯酚和氯仿提取步骤除去蛋白质。噬菌体DNA用1体积异丙醇进行沉淀。将噬菌体DNA用70%乙醇洗涤一次，并溶于50ml  Tris-HCl（pH7.5）、1mM  EDTA缓冲液中。

限制性酶的分析、琼脂糖凝胶电泳、DNA从凝胶中转移到硝酸纤维素薄膜上以及Southern杂交都按照标准方法进行（Maniatis，1982，Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual）。按照上面所述的同样筛选方法，用探针进行杂交。

E.分离含有牛S1-酪蛋白5′-侧翼区域的克隆

用探针鉴定三个推测克隆，方法如上所述。在又一个筛选循环后，分析明显的重组噬菌体。用SalⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ/EcoRⅠ消化克隆的DNA（双重消化），如上述方法用探针进行杂交，结果表明三个克隆中的插入片段相同。所述插入片段由一个18Kb（由S1Ⅰ切开的部分Sau3A片段）组成。在克隆中的转录的取向由上述限制性片段与（1）上述探针1和（2）与杂针1的NcoⅠ-NsiⅠ片段杂交而测定。结果显示出一个转录起始部位上游约16Kb的区域。转录起始部位下游是另一个1.9Kb。对后一区域进行部分筛选，表明牛αS1-酪蛋白基因中存在外显子2和部分内涵子2。对区域-103-+300进一步进行筛选，证实了克隆的同一性。所述限制性片段的溴乙锭式也表明了克隆在EMBL载体中的取向。用下述限制性酶（NcoⅠ、PstⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、BqlⅡ）对克隆进行分析，得到牛S1-酪蛋白基因5′侧翼区域的限制性图谱，示于图3。

F.分离含有牛αS1-酪蛋白3′-侧翼区域的克隆

前面所述的杂交条件，用3′αS1-酪蛋白探针筛选用于分离5′克隆的从原始噬菌体平皿上复制的硝酸纤维滤膜。如上所述制备噬体DNA。用Sa1Ⅰ、EcoRⅠ、和Sa1Ⅰ/EcoRⅠ限制性酶消化以及用3′αS1探针杂交表明八个克隆中的七个克隆的插入片段相同。用限制性酶BsteⅡ和BamHⅠ对那个含有18.5Kb  EcoRⅠ插入片段的克隆进行进一步的分析。该克隆的限制性图谱示于图4。

实施例2

人乳铁蛋白基因的克隆

A.材料

限制性核酶内切酶、T4连接酶、和T7聚核苷酸激酶得自Boehringer-Mannheim、New  England  Biolabs或Bethesda  Research  Laborato-ries。放射性同位素购自Amersham。细菌噬菌体中的人乳腺cDNA文库得自Clontech，Inc.，Palo  Alto，Calif。

B.人乳铁蛋白基因的分离

人乳腺文库利用标准的噬菌斑杂交技术（Naniatis，et  al.，1982，Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual）用三个合成的寡聚体进行筛选。其中的两个寡聚体是相当于Rado等人（见前面）的cDNA顺序的30聚体，在氨基酸的426-445位和682-691位。第三个是一个基于人密码子偏倚的21聚体的“最佳”探针，编码hLF氨基酸顺序中18-24之间的氨基酸残基。它们分别为：

（1） 5′-CTTGCTGTGGCGGTGGTTAGGAGATCAGAC-3′（Seq.ID  NO.：9）

（2）  5′-CTCCTGGAAGCCTGTGAATTCCTCAGGAAG-3′（Seq.ID  NO.：10），and

（3）  5′-ACCAAGTGCTTCCAGTGGCAG-3′（Seq.ID  NO.：11）.

将探针进行放射性标记（Crouse等人，1983，Method  Enzyiol、101，78-79），并用于筛选复制的滤膜。滤膜最后在2×SSC中37℃下洗涤。

C.核苷酸顺序分析

利用低熔琼脂糖分离DNA片段（Crouse等人），并亚克隆到细菌噬菌体M13mp18或M13mp19中（Messing等人，1983，Methods  Enzymol.101，20-78）。利用顺序酶（修饰过的T7  DNA聚合物酶）测定顺序（Tabor等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  84，4767-4771）。所有反应都按照制造商的说明书进行（US  Biochemicals）。该顺序示于图1。用HindⅢ和EcoRⅠ（存在于周围噬菌体中）消化hLF顺序，并亚克隆到pUC19的HindⅢ和EcoRⅠ位点，以形成pUS119  Lacto  4.1。该克隆含有整个hLF成熟形式的编码顺序，但缺少完整的信号顺序。

实施例3

构建牛αS1-酪蛋白CAT载体

为了测定实施例1得到的αS1-酪蛋白片段是否有起动子和表达异源基因所需的其它性质，构建含有可变量的αS1-酪蛋白基因的5′-和3′-侧翼区域的表达载体。用氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）作为这些载体构建体的异源基因。CAT基因对检测异源基因构建体的表达水平非常有用，因为它不能正常地存在于哺乳动物细胞中，并赋予细胞一个容易检测的酶活性，它可以在含有表达基因的细胞或哺乳动物中被定量（见Gorman，C.N.等人，1983，Mol.Cell.Biol.，2，1044-1051）。

A.cDNA顺序

利用聚合酶链反应（PCR）放大作用，将681bp的αS1-酪蛋白启动子+第一个非编码性外显子+第一个间插顺序（IVS）从实施例1的5′-侧翼基因组克隆中分离，作为NcoⅠ-HindⅢ片段（约830bp）。该片段在图5A中鉴定为片段1。所述引物顺序包括：

5′-TCCATGGGGGTCACAAAGAACTGGAC-3′

（Seq.ID  NO.：12）and

5′-TGAAGCTTGCTAACAGTATATCATAGG-3′

（Seq.ID  NO.：13）

它们是从Yu-Lee等人（1986，Nuc.Acid.Res.14，1883-1902）公开的顺序中指定的。

利用PCR放大作用分离得自实施例1的牛3′-侧翼基因组克隆的约1.6Kb（图5A的片段2）的αS1-酪蛋白3′-侧翼顺序。该区域包括前面描述的在αS1-酪蛋白基因3′不转译区的拼接顺序。将片段2亚克隆到pUC19的SmaⅠ位点上。引物顺序组成如下：

5′-GAGGGACTCCACAGTTATGG-3′

（Seq.ID  No.：14）and

5′-GCACACAATTATTTGATATG-3′

（Seq.ID  No.：15）

它们是从Stewart等人（1984，Nucl.Acids.Res.12，3895-3907）公开的顺序中指定的。

合成制备含有疫球蛋白基因3′拼接位点的杂交拼接信号（Bothwell等人，1981，Cell，24，625-637），并与独特的限制性位点侧翼一起插入pUC18中，产生pMH-1。该质粒示于图6。NcoⅠ和HindⅢ位点被指定，这样将片段1和牛5′基因组克隆连接便产生功能性的杂交拼接顺序。

从SV40病毒中得到作为BamHⅠ-DraⅠ片段的多聚腺苷酸化的顺序（图5A中的片段3）（Gorman，C.M.等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.，79，6777-6781）。

将细菌CAT编码顺序亚克隆到pUC19中作为PstⅠ-BamHⅠ片段。

B.构建pS1  3′5′CAT

将αS1-酪蛋白启动子的片段1亚克隆到pMH-1（图6）的NcoⅠ和HindⅢ位点之间，形成pMHS1  5′侧翼。

将作为BamHⅠ-DraⅠ片段的SV40聚腺苷酸化顺序（片段3）亚克隆到pUC19中的3′αS1-酪蛋白侧翼顺序（片段3）的3′位，形成pUC19  3′UTR/SV40。这使得可以除去连续的EcoRⅠ-Sal  Ⅰ片段（含有3′-侧翼顺序和聚（A）顺序），该顺序被亚在克隆到pMH-1中，得到pMHS1  3′UTR（图5B），它用于以后构建含有编码人乳铁蛋白的pMHS13′UTR  hif。

将EcoRⅠ-SalⅠ顺序（片段2和3）亚克隆到pMHS1  5′侧翼的EcoRⅠ-SalⅠ位点，形成pS1  3′5′侧翼。

在用填平酶钝化BamHⅠ位点后，将PstⅠ-BamHⅠ  CAT片段（图5B中的片段4）亚克隆到pS1  3′5′侧翼（图5B）的PstⅠ和SmaⅠ位点之间，形成pS1  3′5′CAT。

C.构建pS1  5′CAT

将CAT片段（图5B中片段4，PstⅠ-BamHⅠ）和SV40聚腺苷酸化片段（图5A中片段3，BamHⅠ-DraⅠ）亚克隆到pMHS1  5′侧翼的PstⅠ和SamⅠ位点之间，形成pS1  5′CAT（图5C）。

D.测定CAT产物

利用磷酸钙共沉淀方法（Gorman，C.M.等人，1983，Science，221  551;Graham，F.L.，等人，1973，Virology，52，456-467），将每个CAT质粒转染到人293S细胞中。在转染44小时后，收集细胞，并测定细胞提取液的CAT活性（Gorman，C.M.，等人，1982，Mol.Cell.Biol.，2，1011;de  Crombrugghe，B.，等人，1973，Natune〔London〕，241，237-251，as  modifided  by  Nordeen，S.K.，等人，1987，DNA，6，173-178）。将由细胞肥大病毒直接早期起动子驱动的表达CAT的对照质粒转染到人293S细胞中，以测定转染效力。

pS1  3′5′CAT在这些细胞中的表达水平约比对照质粒低30-100倍，但明显高于背景知识中。引物延伸分析表明在转录主要在预期的区域内起始。

当pS1  5′CAT被转染到293S细胞中时，也可检测其表达水平。

实施例4

牛αS1-酪蛋白/人乳铁蛋白表达装配质粒cGP1HLF

A.构建DNA顺序

将实施例1的16Kb牛αS1-酪蛋白5′侧翼顺序从牛基因组文库（噬菌体GP1）中分离出，作为SalⅠ-Bg1Ⅱ片段。BglⅡ位点位于αS1-酪蛋白基因的第一个内涵子和第二个外显子的接合处。

在Cylone  Plus  DNA合成仪上（Millgen/BiosearchⅠ）合成制备牛αS1-酪蛋白信号顺序，该顺序含有整个信号顺序加上连在5′端的XhoⅠ和ClaⅠ位点和3′端的NaeⅠ（图7B片段8）。

用EaeⅠ准确切割pUC119  Lacto4.1，在编码成熟hLF第一个氨基酸的密码子处打开质粒。用填平酶填补悬垂的5′端。用AccⅠ和EcoRⅠ进一步消化，得到两个片段：（a）含有成熟hLF前面243bp的EaeⅠ-AccⅠ片段（图7C片段5），和（b）1815bp的邻接的AccⅠ-EcoRⅠ片段，该片段含有除了5个末端密码子外的全部剩余密码顺序。

从EcoRⅠ位点开始制备含有hLF最后5个密码子的合成连接子，并延伸到终止密码子以外的四个碱基。在3′端加上KpnⅠ位点（图7C中片段7）。

从牛基因组文库（图4）中分离8.5Kb的EcoRⅠ3′片段，它含有始于αS1-酪蛋白编码区域下游的顺序和距5′端约350bp的BstEⅡ位点。将这一片段亚克隆到pMH-1的EcoRⅠ位点，形成pMH3′E10（图7A）。在pMH3′E10中，SalⅠ位点与3′-EcoRⅠ位点相邻。

B.构建cGB1  HLF

将hLF3′-连接了亚克隆到pMH3′UTR的EcoRⅠ-KpnⅠ位点上（图7A），产生pMH3′UTR  hLF2连接子（图7A）。

然后将合成的牛αS1-酪蛋白信号顺序（片段8）亚克隆到pMH3′UTR  hLF2连接子的SmaⅠ位点，制成pS1  3′hLF1/2L（图7B）。

将两个hLF编码片段（图7C中的片段5和6）亚克隆到pS1  3′hLF1/2L的NaeⅠ和EcoRⅠ位点，制成pS1  3′UTR  hLF（图7C）。

从pMH  3′E10（图7A）中分离作为BstEⅡ-SalⅠ片段的大αS1-酪蛋白3′UTR片段，并亚克隆到pS1  3′UTR  hLF的同样位点，形成phLF3′10Kb（图7D）。

从以下3-路连接（图7F）制备装配型cGP1HLF：

（a）通过连上两个连接子结合体而修饰来自噬菌体GP1的16Kb  5′-侧翼顺序（实施例1，图3）。将5′端的SalⅠ位点连到NotⅠ-SalⅠ连接子上。3′端的Bg1Ⅱ位点连到Bg1Ⅱ-XhoⅠ连接子上;

（b）从phF  3′10Kb中分离作为XhoⅠ-SalⅠ片段的hLF编码区域，它经过αS1-酪蛋白信号顺序的5′端侧翼和约8.5KbαS1-酪蛋白3′侧翼顺序的3′端侧翼。将5′端的SalⅠ位点连到SalⅠ-NotⅠ连接子上。

（c）用NotⅠ将装配型pWE15（Stratagene，Inc.）线性化。

把得自（a）、（b）和（c）的片段连在一起，并利用市售的λ包装提取液（Strategene，Inc.）转染到细菌中，产生cGP1HLF。

实施例5

牛αS1-酪蛋白/hLF表达质粒

A.构建pS13′5′hLF

将pS1  3′UTRhLF的HindⅢ-SalⅠ片段亚克隆到pMHS1  5′侧翼的同样位点中，形成pSl  3′5′hLF（图7E）。该质粒含有681bp的牛αS1-酪蛋白启动子顺序、αS1-酪蛋白/IgG杂交内涵子、αS1-酪蛋白信号顺序、hLF编码顺序、约1.6Kb的αS1-酪蛋白3′侧翼顺序，和SV40晚期区域多腺苷酸化顺序。

B.pS1  5′hLF

用KpnⅠ和BamHⅠ切割质粒pS13′5′hLF（图7E），切出αS1-酪蛋白1.6Kb3′侧翼顺序。将较大的载体片段纯化，用填平酶钝化末端，自我连接形成pS1  5′hLF。

C.hLF的放射性免疫分析

利用50%的硫酸铵沉淀制备抗人乳铁蛋白单克隆抗体的腹水液的富含免疫球蛋白的部分，所述单克隆抗体不与牛或鼠蛋白发生交叉反应。将Sephrose珠悬浮于磷酸缓冲的盐水中（2mg/ml）（PBS;10mM磷酸钠、0.14M  NaCl、10mM  EDTA、0.1%（W/V）Polylorene和0.02%（W/V）NaH，pH7.4）。将Sepharose悬浮液（0.3ml）在室温下保温5小时，通过在2ml聚苯乙烯试管中head-over-head旋转而进行。然后用盐水洗涤Sepharose珠（5次），并在室温下与50μl（1KBq）Ⅰ-标记的亲和纯化多克隆大鼠抗人乳铁蛋白抗体以及0.5ml  PBS、0.1%（W/V）Tween-20一起保温16小时。用盐水再次洗涤Sepharose（4次，每次1.5ml）后，测定结合的放射活性。结果表示为所加入的标记抗体的结合百分比。测试样品中乳铁蛋白的水平表示成nM，以纯化的人乳铁蛋白作为标准（在PBS、10mM  EDTA、0.1%（W/V）Tween  20中系列稀释）。

在不同时刻进行标准重复试验，表明所述放射性免疫分析是高度可重复性的，各种检测系数的变化在5-10%之间。这种放射性免疫分析可检测出少至0.1ng的人乳铁蛋白。

D.在293S细胞中表达

如上所述用hLF质粒转染293S细胞（用1μg  CMA-CAT质粒共转染，作为转染效力的对照）。在从细胞中除去转染介质并如上所述进行hLF检测44小时后，利用Stryker等人所述的方法（1989，EMBO  J.8，2669）分析RNA。结果概括如下：

1.两种hLF质粒的转染效力相同;

2.hLF在细胞中表达并分泌到介质中。在两种情况下，利用3×10细胞的表达分泌水平约为0.4μg/ml介质。

3.在以结合的Ⅰ-抗乳铁蛋白的量作为所用样品量的函数的剂量反应测试中，所述蛋白质和人奶样品中的hLF行为一样。

4.通过Western杂交  判断出所述蛋白质与人奶样品中的蛋白质大小相同（约80KD）。

5.通过Northern杂交判断出细胞中所产生的hLF  RNA大小正确，并且两质粒的水平相同。

这些数据表明这两种表达质粒都可以表达hLF。利用目前所用的所有标准方法得到的蛋白质都与人奶中存在的hLF相同。异源杂交信号顺序的作用是促进蛋白从细胞分泌到介质中。而且，在这些质粒中所用的酪蛋白调控顺序可以促进异源基因的表达。

实施例6

牛卵母细胞在体外成熟、受精和培养

由屠宰场取得的牛卵巢，将卵泡吸出，获得大量（400-600/天）未成熟的卵母细胞。在未成熟的卵母细胞能够受精前，先在体外培养一段时间。一旦“成熟”，用已成熟的精子使卵母细胞受精或“适应于”体外。然后将编码表达和分泌人乳铁蛋白的转移基因注射到受精过的卵母细胞的原核中。将该体外受精和经微量注射形成的接合子在制备的培养基中培养到晚期桑葚胚或胚泡期（5-6天），或“固定”在输卵管组织内。将胚泡通过非手术方法转移到受体牛中进行受孕平衡或按上所述分析转移基因的整合。

体外成熟（IVM）：在屠宰场屠宰后立即取出卵巢，回收卵母细胞。另外一种方法，可通过外科手术。内窥镜手术或阴道超声手术，从活牛体内取出卵母细胞。不管何种方法，都要从卵巢泡（2-10mm直径）吸出卵母细胞。将卵母细胞洗涤后置于含M199加10%胎牛血清的成熟培养基中，39℃下温育24小时。（参阅Sirard等，1988，Biol.Reprod.39，546-552）。

体外受精（IVF）：将成熟的卵母细胞与新鲜的或解冻的精子受精。采用“游动”分离技术，将首先富集到的具有流动性的一群精子制备用于受精的精子（Parrish等，1986，Theriogenology，25，591-600）。然后将能动的精子加到由改进的Tyrode溶液（Parrish等，1986，引文同上）和诱导精子活力的肝素（Parrish等，1988，Biol.Reprod.38，1171-1180）组成的受精培养基中。活力构成受精必需的最终精子的成熟过程。将精子和卵母细胞一起培养18小时。此体外受精方法的可用性在于（在冰冻精子的情况下）当具体射精的最佳受精条件被确定时，结果可以重复（Parrish等，1986，引文同上）。

体外培养（IVC）：常规的培养体系可以保证鼠、兔或人的卵细胞的发育，但不保证超过8-16个细胞期的牛的胚胎的发育。这个问题通过在预条件培养基培养输卵管组织而被克服。输卵管条件培养基可在体外保证8-16个细胞期至胚泡期的牛胚胎的发育（Eyestone  and  First，1989，J.Reprod.Fert.85，715-720）。

现已证明，牛胚胎对体外培养的不应期。在一定程度上来说，这是由于在体外8-16个细胞期阻滞卵裂的存在。通过在兔（Boland述评，1984，Theriogenology  21，126-137）或羊（Willadeen，1982，in  Mammalian  EggTransfer，E.Adams编，185-210，Eyestone等，1987，Theriogenology18，1-7）的输卵管中培养胚胎，即可使这种阻滞得到缓解。然而改为体内培养也并不理想，其原因在于：（1）它们要求保持大量受体动物;（2）为了转移，它们要求进行外科手术才能进入输卵管，并且要求进行第二次手术（或杀死）才能回收胚胎;（3）回收全部被转移的胚胎量很少;（4）在培养期间要完全排除因观察或处理需要而进入胚胎操作。没有体外培养体系，阻碍了各种操作技术（例如通过原核注射转移基因）的发展，因为牛发育的时间次序和个体发生过程的基本信息的积累受到障碍，而且使胚胎培养到与胚胎非手术转移和低温防腐技术相一致的阶段复杂化（例如胚泡晚期）。

当胚胎与滋养组织一起培养时，牛胚胎不会在体外将它们培养超过8-16个细胞“阻滞”到Camous等（J.Reprod.Fert.72，479-485）所述卵裂为216个细胞。

根据同源或异源输卵管的能力，将共培养方法扩展到输卵管组织，以保证接合子发育为胚泡。因此，将牛胚胎与输卵管组织一起培养，或在以输卵管组织为条件的培养基中，使接合子在体外发育为胚泡（Eyestone  and  First，1989，J.Reprod.Fert.85，715-720;Eyestone  W.H.1989，“Factors  affecting  the  development  of  early  bovine  embryos  in  vivo  and  in  vitro.”Ph.D.Thesis，University  of  Wisconsin）。在排卵和人工授精后，或经体外成熟（IVM）和未成熟卵母细胞的受精（IVF），胚泡就在该体系中产生。按这种方法产生的胚泡在转移到受体动物后，导致受孕和产生成活的小牛。得到的结果如下：

步骤  效率（%）  数量（以100计）

体外成熟  90  90

未成熟卵母细胞的受精  80  72

体外培养  30  22

胚胎转移（受孕百分比）  50  11

为此，从开始起每天收集500个卵母细胞，可望受孕率达55%。

输卵管组织的共培养和条件培养基的制备：

1.屠宰后或经输卵管造口术后取得牛输卵管;

2.用载玻片轻轻刮下完整无损的输卵管，收集输卵管组织;

3.在10ml改进的tyrodeshepes溶液（Parrish等，1988，Biol.Reprod.38，1171-1180）中将组织洗涤5次;

4.将最后洗净的组织碎片悬浮在M119+10%胎牛血清中，组织与培养基的体积比为1∶50;

5.将组织悬浮液用于胚胎共培养;

6.另一种方法是将培养基保存48小时，在将悬浮液离心后，上清液可用作胚胎培养基。如果需要，条件培养基可保存在-70℃下。条件培养基应在对胚胎培养作用很强（不稀释）的情况下使用（Eyestone，1989，引文同上）。

实施例7

将HLF转移基因微量注射到牛原核中

通过用适当的限制性酶消化和在琼脂糖凝胶上分离，从载体上切下含HLF表达单位的DNA片段。该片段经电泳洗脱、苯酚和氯仿提取以及乙醇沉淀（Maniatis等）纯化，然后将其溶于浓度为1-2μg/ml的10mM  Tris和0.1mM  EDTA（pH7.2）中，并在其中透析。微量注射针装满经透析的DNA溶液。

在体外受精前，在2分钟内以最快速度将卵旋动或用常规微量吸管将卵上下吸动数次，从卵中除去丘细胞。原则上按处理鼠原核方法（Hogan，B.等，1986，Manipulating  the  mouse  embryo，Cold  Spring  Harbor  Laboratory）注射牛原核，离心显示出原核。受精后18-24小时注射。时间的改变取决于用作种源的公牛。不同批的精液可在不同时间用肉眼看到原核。

将体外成熟和受精的牛卵母细胞置于1ml  tyrodes-hepes溶液（Parrish，1987）的Eppendorf管中，于14500g下离心8分钟（Wall等，1985，Biol，Reprod.32，645-651）。将胚胎转移到涂上石蜡油并滴上一滴tyrodes-hepes溶液的载玻片上。利用液压系统将卵母细胞固定到放卵器上，（用干涉一相差仪或相差显微镜）可看到两个原核。如果需要，可转动卵母细胞，改变其在放卵器上的位置，以显示原核。将注射针注入与一个原核相同形状的中心点上，把针推过透明区，细胞质被注入到原核中。以DNA溶液的恒定流速或脉冲流速（用开关），将小体积的1-3pl由注射针注射到含有20-100DNA原核中。另一种方法是按所述方法，将2个细胞阶段的胚胎进行旋转和注射两个分裂细胞的核，然后按实施例6所述，将被注射过的胚胎转移到共培养基上，以促进桑葚胚或胚泡阶段发育。

实施例8

用HLF转移基因早期检测转移基因的产生

通过微量注射方法培养卵母细胞，将各个胚胎的各自位点进行卵裂和溶解（King，D.等，1988，Molecular  Production  and  Development，1，57-62）、蛋白水解（Higuchi，R.，1989，“Amplifications（A  forum  for  PCR  Users。”2，1-3）及DPNI消化。如前所述，用两个引物进行PCR（Ninomiy，T.等，1979，Molecular  Reprod.and  Devel.，1，242-248），其中一个引物在αS1中，另一个引物在HLF  cDNA顺序中。例如在PCR中的前一个引物（30）αS1顺序如下：

ATG AAA CTT ATC CTC ACC TGT CTT GTG （顺序ID  NO.：16）

而HLF顺序中的反向引物（30）则为

GGG TTT TCG AGG GTG CCC CCG AGG ATG GAT （顺序ID  NO.：17）;

（图1中的971-1000），产生990bp片段。该片段由于失去腺苷甲基化，在离前面一个引物起点的934bp处含有失活的DPNI位点。

实施例9

在牛乳中产生HLF

根据Donahue方法（Donahue，S.1986，Genetic  Engineering  of  Animals.ed.J.Warren  Evans  et  al.，Plenum），由经微量注射的卵母细胞发育而来的牛桑葚胚进行分裂，桑葚胚的一半保留在培养基中发育成为胚泡，另一半则按实施例8所示进行DNA分析。在得到该分析结果时，保留在培养基中的桑葚胚已发育成为胚泡或作为核源转移到无核接合子中。根据Betteridge方法（Betteridge，K.J.1977，Embryo  transfer  in  farm  animals：a  review  of  technigues  and  applicat-ions），胚泡同时移到牛中。

使用实施例5的RIA，检测分泌乳的转移基因牛仔的乳中的HLF。

实施例10

牛αS1-酪蛋白/hSA表达质粒

含有完全hSA基因的三个重叠噬菌体克隆用于构建hSA表达载体。它们是λHAL-HAI，λHAL-3W和λHAL-H14，并已由Urano等作了介绍（1986，J.Biol.Chem.，261，3244-3251;1984，Gene，32，255-261）。该基因和一些周围区域的顺序已由Minghetti等发表（1986，J.Biol.Chem.，261，6747-6757）。一个含有完全hSA基因的噬菌体构建如下：

用BstEⅡ和AhaⅡ切开克隆HA-1，分离出从1784（在第一个外显子，处于ATG下游）至3181位上的约1400bp片段，合成连接子与5′端的BstEⅡ位点连接，该5′端含有由BstEⅡ切开的前几个氨基酸和ATG及附近少数几个位点周围的顺序。这个片段称为片段＃1。

用AhaⅡ和SacⅠ切开克隆3W，分离出从3181至16322位上的约13.1Kb片段，合成连接子与SacⅠ位点连接，从而能在噬菌体EMBL3中克隆。这个片段称为片段＃2。

将上述两个片段连接并在噬菌体EMBL3中克隆。在鉴定正确的噬菌体以后，分离出从BstEⅡ位点（已引入单一限制性位点）上游至SacⅠ位点的片段，连接SacⅠ至SalⅠ片段（由克隆H-14分离出的16322至约21200位上的片段）。然后将这两个片段连接并克隆到EMBL4中。

在用ClaⅠ（新引入的位于BstEⅡ位点上游）和BamHⅠ（位于噬菌体DNA  Sa1Ⅰ位点下游）切开后，这个新克隆产生含有大约2.5Kb3′-侧翼顺序的完全hSA基因的片段。

为了构建hSA表达载体，用ClaⅠ和BamHⅠ部分消化装配型质粒cGP1HLF，除去信号顺序、hLF编码顺序、3′-UTR和αS1-酪蛋白的多腺苷酸附加区以及酪蛋白基因的小区3′。

按如上所述，与hSA片段连接，生成的装配型质粒称为cGP1HSA。

由此形成的表达载体含有：（1）由αS1-酪蛋白基因衍生的16Kb启动子顺序;（2）存在于GP1中的该基因的第一个外显子和间插顺序;（3）hSA基因的信号顺序，编码含有该基因下游2.5Kb的hSA的完全的基因组基因;（4）由αS1-酪蛋白基因衍生的约8Kb的3′-侧翼顺序。

按类似于在牛乳中产生hLF的方法，将该转移基因用于生产能在乳中产生hSA的转移基因牛。

实施例11

由牛乳中产生的HSA的纯化

由牛乳中产生的异源蛋白基于以下事实而能够进行纯化，即在酪蛋白沉淀以后，大部分蛋白都存在于蛋清中，与用于微生物或细胞体系的生产培养基相比，蛋清较少被污染。

层析技术用于纯化牛乳中的hSA较为理想，这种方法的回收情况良好，清蛋白纯度高，与乙醇馏份相比则清蛋白聚合物的含量低（Curling（1980）in：“Methods  of  Plasma  Protein  Fractionation”，Curling，ed.，Academic  Press  London，UK;Curling  et  al.（1982）J.Parenteral  Sci.Technol.36，59;Berglof  et  al.and  Martinache  et  al.（1982）Joint  Meeting  IHS-ISBT，Budapest）。通过层析纯化，使hSA特殊的传输作用及其在维持血管内的渗透压方面的主要作用也都能很好保持（Steinbruch，1982，Joint  Meeting  ISH-ISBT，Budapest）。

下述步骤用于回收转移基因奶牛的乳中产生的hSA：

1.在pH4.5和/或加入凝乳酶，沉淀出酪蛋白（约为乳蛋白的80%）和基本上全部的乳脂。乳清部分含有清蛋白;

2.在Cibacron  blue  3  GA-Sepharose  CL-6B（Harvey，1980：Methods  of  Plasma  Protein  Fractionation，在所引的书中）上亲合层析清蛋白。此步骤用于除去清蛋白以外的其他蛋白和减少约30倍待处理蛋白的体积。用0.15M  NaCl和20mM水杨酸钠（pH7.5）从该基质上洗脱清蛋白;

3.在Sephadex  G-25上的缓冲液交换：脱盐到0.025M乙酸钠中，pH调至5.2，然后过滤;

4.在DEAE-Sepharose  Cl-6B上进行阴离子交换层析，在pH4.5脱附清蛋白;

5.在CM-Sepharose  CL-6B上进行阳离子交换层析。用0.11M乙酸钠（pH5.5）洗脱清蛋白，通过超滤，清蛋白浓缩为6%（W/V）溶液;

6.在Sephacryl  S-200上凝胶过滤。滗出高分子量蛋白（例如清蛋白聚合物，热原质）部分。通过超滤浓缩主要部分（清蛋白单体），并予以配制。

应该注意的是步骤3-6与Curling等所述关于纯化原生质中的hSA方法基本相同（Curling，1980;Curling等，1982;Berglof等，1982;引文均在书中）。

实施例12

含有经同源重组产生的人血清清蛋白（hSA）转移基因的转移基因小鼠

三个重叠基因组hSA克隆用于产生转移基因小鼠、λHAL-HA1、λHAL-H14和λHAL-3W中的hSA基因，并示于由Urano等报导的图8中（1984，Gene，32，255-261;1986，J.Biol.Chem.，261，3244-3251）。简言之，基因组库是由人成纤维细胞DNA的部分EcoRⅠ消化构建的。为了克隆λHAL-H14和λHAL-3W，该基因组库用³²P标记的人清蛋白基因组克隆通过杂交进行筛选。所述杂交是先在3×SSC和10×Denhardt溶液中进行预杂交后，再于65℃下在1M  NaCl，50mM  Tris-HCl（pH8.0），10mM  EDTA，0.1%SDS，100μg/ml剪下的鲑鱼精子DNA和10×Denhardt溶液中杂交过夜。杂交后，于65℃下在0.2×SSC和0.1%SDS中洗涤过滤物。除了由λHAL-3W5′端得到的0.9Kb  Bg1Ⅱ-EcoRⅠ片段用于筛选人成纤维细胞库之外，λHAL-HAl克隆的分离与此相同。

上述三个hSA噬菌体克隆用于产生三个重叠的直线DAN片段，其组成包括整个HSA基因和侧翼区。5′大片段Ⅰ是由λHAL-HA1分离得到的EcoRⅠ-EcoRⅠ片段;中片段Ⅱ是λHAL-3W的AcyⅠ（＝AhaⅡ）-SacⅠ片段;3′大片段Ⅲ是λHAL-H14的XhoⅠ-SalⅠ片段（图7）。各片段用Klenow  DNA聚合酶和dNTP处理，以填满突出的粘性末端。在有些实验中，再用细菌碱性磷酸酶处理钝端片段，除去各片段中的5′磷酸盐基团。根据已发表的方法（Hogan等，1986，“Manipulating  the  Mouse  Embryo：A  Laboratory  Manual”，Cold  Spring  Harbor  Laboratory），浓缩重叠DNA片段，然后一起注射到受精小鼠卵的雄原核中。当每个卵细胞注入的分子数约25-100时，各片段的比约1∶1∶1。根据Hogan等所述方法（引文同上），将胚胎植入到假怀孕的雌鼠子宫中。

为了测定上述三个重叠片段正确的同源重组和新生转移基因整合到小鼠基因组中，将新生幼鼠中的基因组DNA进行下述特殊消化，然后与hSA  cDNA探针进行Southern杂交：

BstEⅡ：如果发生了正确的重组，则切去超出hSA基因区部分，得到18Kb带：

NcoⅠ：如果发生了正确的重组，则切去超出重叠基因区部分，得到8.0和9.3Kb带;

NcoⅠ+HindⅢ：如果存在完整无损的片段，在若干位置上切去超出重叠区部分;

HincⅢ：如果在这些区域中排列正确，则切去重叠区，可得到若干条带。

在所产28头转移基因动物的最初实验中，有22头动物正确地重组所有3个片段，在这22头动物中，采集了20头动物的血样，并用放射免疫测定法，测定是否存在hSA蛋白。在这20头动物中有15头的hSA表达量为0.5-5μg/ml。没有一头动物不被重组，也没有对转移基因不予表达。经RNA印迹分析，只有两头动物（蛋白含量最高）显示具有一条带。我们对富集的RNA进行了印迹分析，以测定是否存在mRNA（即多腺苷酸+RNA）。用逆转录酶合成cDNA，继而用PCR，我们观察到RNA和蛋白间的良好关系。然而在这个实验中，我们未能测定RNA的大小。

实施例13

编码HLF转移基因的另一种构建方法

这个实施例介绍两种HLF转移基因的构建，其中之一含有约16KbαS1-酪蛋白5′表达调控顺序（pGP1hLF（16Kb），也称p16，8HLF4），另一种含约7.9KbαS1-酪蛋白5′表达调控顺序（pGP1hLF（8Kb），也称p8.8HLF4）。这些构建的全部方法示于图9。

1.8Kb  EcoRⅠ-Bg1Ⅱ片段（图9中的片段C）是由噬菌体克隆GP1分离得到的，这个片段由转录起始位点的-100位至αS1-酪蛋白基因的第二外显子。Bg1Ⅱ位点位于αS1-酪蛋白基因的第一内含子和第二外显子的连接处。含Bg1Ⅱ位点的3′端与合成的Bg1Ⅱ-ClaⅠ连接子连接并亚克隆到质粒pUC19中。生成的质粒称为pEBS。

图9中的片段B是作为EcoRⅠ片段分离得到的，并克隆到pEBS的EcoRⅠ位点。片段B包括αS1-酪蛋白基因中的转录起始位点-7500至-100位的顺序。由此形成的质粒称为pEB3S，含有片段B和C的结合，这是由转录起始位点的-7500至+1400位的8.9Kb  EcoRⅠ-ClaⅠ片段。由pEB3分离得到8.9Kb  EcoRⅠ-ClaⅠ片段，并将其克隆到含有NotⅠ限制位点的EcoRⅠ-ClaⅠ切开的pKUN2（pKUN的衍生物;Gene，1986，46，269-276）中，形成pNE3BS。所述pEB3是由ClaⅠ完全消化并由EcoRⅠ部分消化得到的。

8.5Kb  ClaⅠ-EcoRⅠ片段（图9中的片段A）由转录起始位点的-16000至-7500位，从噬菌体GP1分离得到。然后将其亚克隆到pUC19中形成pSE。用合成的寡核苷酸将单一NotⅠ位点引入ClaⅠ位点，从而使其失效。生成的质粒称为pNE。

由pNE的插入分离得到NotⅠ-EcoRⅠ片段，并与插入pNE3BS的EcoRⅠ-ClaⅠ一起连接到克隆载体pKUN2。生成的质粒pGP1（△2ex）含有16KbαS1-酪蛋白启动子加向着第二个外显子边缘的Bg1Ⅱ位点的基因5′端。

含有转移基因的最终质粒（16，8HLF4）用由克隆pGPⅠ（△2ex）的NotⅠ-ClaⅠ片段和由克隆pHLF3′10Kb的Xho-NotⅠ片段进行组装，该转移基因的结构与本文以上所述相同。

通过用SalⅠ切开并插入含有NotⅠ位点而不是SalⅠ位点的连接子除去该质粒的SalⅠ位点，从而对该质粒略作修改。然后通过切开在加有下列连接子位上的KPnⅠ位点，将SalⅠ位点引入HLF顺序的下游

5′CGTCGACAGTAC-3′（顺序ID  NO.：18）

CATGGCAGCTGT-5′（顺序ID  NO.：19）

实际上HLF顺序的周围有2个单一限制位点（ClaⅠ和SalⅠ）并能由任何具有在5′端上的ClaⅠ位点和3′端上的SalⅠ位点的重组DNA顺序取代。

另一个转移基因的构建与以上所述相同，但其仅含大约8Kb的5′αS1-酪蛋白表达调控顺序。它的构建是利用由pNE3BS得到的NotⅠ-ClaⅠ片段并将其直接融合到由克隆pHLF3′10Kb得到的Xho-NotⅠ片段中。生成的质粒称为pGPIhLF（7Kb）（也称p8，8HLF4）。

对质粒16，8hLF4进行修饰，使其含有如实施例3和5所述杂交拼接信号（αS1-酪蛋白-IgG）。生成的质粒称为16，8hLF3，除了与5′-UTR中的“天然”酪蛋白内含子相比，存在杂交内含子外，其余与16，8hLF4相同。

hLF信号顺序也可用本文所公开的全部cDNA构建，以取代酪蛋白信号顺序。这个构建可按下述方法进行：制备合成的寡聚物含有完全的HLF信号顺序（参阅图2）和5′端上的ClaⅠ限制位点和3′端上的EagⅠ限制位点。这些限制位点还与其他质粒（例如p16，8hLF4）中的酪蛋白信号顺序连接。将含有周围为ClaⅠ和SalⅠ位点的HLF-cDNA的片段克隆到含有ClaⅠ和SalⅠ位点的pGEM7（Stratagene，Inc.）中。生成的质粒用ClaⅠ和EagⅠ消化，并用作供给含有HLF顺序的ClaⅠ-EagⅠ片段的载体。从正克隆中切开含有本身顺序的cDNA，成为ClaⅠ-SalⅠ片段并插入到ClaⅠ-SalⅠ消化的p16，8hLF4中，产生p16，8hLF5。这个含有HLF-cDNA和HLF信号顺序的Cla-Sal片段可被插入任何HLF-cDAN载体。

实施例14

在转移基因小鼠的乳中生产重组人乳铁蛋白

利用本文实施例中所述的若干转移基因产生转移基因小鼠，所用的转移基因列于表3。在任何情况下，5′和3′表达调控顺序均来自牛αS1-酪蛋白基因，5′未转译区中的RNA拼接信号顺序可以与αS1-酪蛋白基因同源，也可以是杂交酪蛋白-IgG间插顺序。在任何情况下，重组DNA均由cDNA克隆衍生。

表3

切开转  5′-表达调  3′-表达调  记录的  超过10μg/

移基因  控顺序的  控顺序的  最大表  ml表达量的

的质粒  长度（Kb）  长度（Kb）  IVS  株数  达量  小鼠（%）

P0.7.8HLF4  0.7  8  同源  5  5μg/ml  0

P8.8HLF4  8  8  同源  6  140μg/ml  67

P16.8HLF4  16  8  同源  4  8μg/ml  0

P16.8HLF3  16  8  杂交  7  1330μg/ml  43

实施例15

基因组重组DNA的转移基因盒的构建

就所述的全部质粒都含有由未转录区（包括间插顺序）的牛α1-酪蛋白衍生的区域。当基因组基因表达已含有允许高度表达的未转译区和间插顺序时，最好使用α1-酪蛋白基因的侧翼区通过操作与将表达的基因的未转译区相连接的表达盒。这种表达盒是P16Kb，CS，其构建如下：质粒PS1  3′5′hLF用作PCR实验中的模板。该质粒含有α1-酪蛋白基因的680bp启动子顺序及其第一个外显子。该质料的其余部分与此实验无关。上游引物位于插入质粒部分的上游（在NotⅠ限制位点的上游）。它的顺序为：5′-CGA CGT TGT AAA ACG ACGG-3′。

下游引物位于外显子1内，其顺序与外显子的前19bp完全一致，并且还含有ClaⅠ和SalⅠ位点17bp的非杂交区。它具有下列顺序：

5′-ATTGTCGACTTATCGATGGGTTGATGATCAAGGTGA-3′

扩增的片段用NotⅠ和SalⅠ消化并与pKUN2连接（参阅实施例13）。因此，生成的质粒（P-680CS）位于-680至+19和加2个限制位点（在所述19bp下游）的近端启动子片段处。

该质粒用NotⅠ（在-680的上游）和NsiⅠ（在-280处）消化，并用作与由P16，8hLF4（实施例13）分离得到的从NotⅠ位点（在-16Kb上游）至NsiⅠ（在-280处）的片段相连接的载体。因此该质粒（P-16Kb，CS）位于从约-16000至+19的启动子片段。它能用于将含有本身UTR和多腺苷酸信号的基因组基因的插入。在作为ClaⅠ-SalⅠ片段的基因组基因插入后，α1-酪蛋白3′-侧翼区能作为SalⅠ-片段被插入。

实施例16

生产蛋白质C的转移基因的构建

蛋白质C的基因组顺序已经发表（Foster等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4673-4677）。但是该顺序不包括由Beckman等发表的整个cDNA顺序所确认的第一个外显子（1985，Nucl.Acids  Res.13，5233-5247）。蛋白质C的第一个外显子位于Foster顺序的-1499至-1448位处。表达和并在牛乳中分泌蛋白质C的转移基因示于图10。该转移基因构建如下：

EMBL-3（Clonotech）中的人基因组库用对蛋白质C具有特异性的顺序进行探测。分离得到含有完全蛋白质C基因的纯化噬菌体DNA制剂。该噬菌体由具有Dam表型的大肠杆菌株（例如菌株GM113）中分离得到，产生未甲基化的克隆DNA，因此所有ClaⅠ限制位点都能被裂解。

分离得到+1333至11483位的ClaⅠ  NheⅠ片段，称之为片段Ⅰ。

PGEM（Stratogene，Inc.）用SphⅠ和SmaⅠ消化。位于其间的区域由相应的质粒pKUN的区域取代（Gene，1986，46，269-276）。生成的质粒称之为pGEM7A，并且在相关区域内具有下列限制图：

合成两个引物，其中引物GP125具有下列顺序：

5′- CAA ATC GATTGA ACT TGC AGT ATC TCC ACG AC - 3′

           Cla Ⅰ

引物GP126具有下列顺序：

5′- GGG ATC GATCAG ATT CTG TCC CCC AT - 3′

          ClaⅠ

引物GP125与外显子0（蛋白质C基因的654至675位）重叠，并将ClaⅠ位点引入5′未转译区。外显子0并不是Foster等所述的外显子。引物GP126与蛋白质C基因中的1344至1315位区重叠。该区域含有ClaⅠ位点。

654至1344位之间的区域是用作模板的人DNA或噬菌体DNA扩增的，这样扩增的材料用ClaⅠ消化，并将其克隆到载体pGEN7a中，形成pPCCC。该载体在dam阴性菌株（例如GM133）中繁殖，并用ClaⅠ（用ClaⅠ在1340位上一次切开的质粒是非常有意义的）部分切开，再用XbaⅠ全部切开。将ClaⅠ  NheⅠ片段（片段1）克隆到该载体中。生成的质粒称之为pPC。它的结构示于图10。由该质粒分离得到蛋白质C转移基因即ClaⅠ-SalⅠ片段，将其连接到P16Kb，CS（参阅实施例15），形成能在牛乳中表达蛋白质C的转移基因，该质粒称之为P16Kb，CS，PC。

在质粒P16Kb，CS，PC中所含转移基因用NotⅠ切开，用于产生如前所述的转移基因，这种转移基因动物能在其乳中产生蛋白质C。

对本发明的最佳实施例已作了介绍，显然本领域的专业人员对所公开的实施例可进行各种修改，但是这种修改均属本发明的范围。

本文所公开的全部参考文献都已结合在本文中作为参考。

Claims (62)

1、一种能在转移基因牛中产生重组多肽的转移基因，包括能在至少一种所述牛的细胞类型中通过操作与编码重组多肽的重组DNA连接的至少一种表达调控DNA顺序，其中所述转移基因能使所述重组DNA顺序在至少所述一种含有该转移基因的牛细胞类型中进行表达，产生所述重组多肽。

2、按权利要求1的转移基因，其中所述表达调控顺序包括由血清清蛋白中得到的5′和3′表达调控顺序，所述细胞类型是肝脏细胞，所述重组多肽是人血清清蛋白，所述转移基因进一步包括在肝脏细胞中通过操作与编码所述人血清清蛋白的重组DNA连接的分泌DNA顺序。

3、一种在转移基因牛的乳中产生重组多肽的转移基因，包括能在所述牛的乳房分泌细胞中起作用的至少一种表达调控DNA顺序、还能在所述牛的乳房分泌细胞中起作用的编码分泌信号顺序的分泌DNA顺序和编码重组多肽的重组DNA顺序，所述分泌DNA顺序能通过操作与所述重组DNA顺序相连接，形成分泌-重组DNA顺序，所述至少一种表达调控顺序能通过操作与所述分泌-重组DNA顺序相连接，其中所述转移基因能使所述分泌-重组DNA顺序在含有所述转移基因的牛的乳房分泌细胞中表达和产生一种重组多肽，当由该乳房分泌细胞分泌时，在所述牛的乳中产生重组多肽。

4、按权利要求1或3的转移基因，进一步包括重组间插顺序。

5、按权利要求4的转移基因，其中所述重组间插顺序是一种杂交间插顺序。

6、按权利要求5的转移基因，其中所述杂交间插顺序含有一种受纳的RNA拼接信号。

7、按权利要求3的转移基因，其中所述重组多肽是一种与牛同源的多肽。

8、按权利要求7的转移基因，其中所述同源多肽选自酪蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶、胆固醇水解酶和血清清蛋白。

9、按权利要求3的转移基因，其中所述重组多肽是一种异源多肽。

10、按权利要求9的转移基因，其中所述异源多肽选自人乳蛋白、人血清蛋白和工业用酶。

11、按权利要求10的转移基因，其中所述异源多肽是人乳蛋白。

12、按权利要求11的转移基因，其中所述人乳蛋白选自分泌免疫球蛋白、溶菌酶、乳铁蛋白、乳球蛋白、α-乳清蛋白和胆汁盐刺激的脂肪酶。

13、按权利要求12的转移基因，其中所述乳蛋白是乳铁蛋白。

14、按权利要求10的转移基因，其中所述异源多肽是人血清蛋白。

15、按权利要求14的转移基因，其中所述人血清蛋白选自清蛋白、免疫球蛋白、因子Ⅷ、因子Ⅸ和蛋白质C。

16、按权利要求15的转移基因，其中所述血清蛋白是清蛋白。

17、按权利要求10的转移基因，其中所述异源多肽选自蛋白酶、脂肪酶、壳多糖酶和木质素酶的工业用酶。

18、按权利要求3的转移基因。其中所述分泌DNA顺序选自编码由人乳铁蛋白、人血清清蛋白得到的分泌信号顺序和由牛αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、k-酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和血清清蛋白得到的分泌信号顺序的DNA顺序。

19、按权利要求18的转移基因，其中所述分泌DNA顺序是编码牛αS1-酪蛋白的信号分泌顺序的DNA顺序。

20、按权利要求3的转移基因，其中所述至少一个表达调控顺序包括5′表达调控DNA顺序，其中所述5′表达调控DNA顺序可通过操作与所述分泌-重组DNA顺序的5′端相连接。

21、按权利要求20的转移基因，其中所述5′表达调控DNA顺序选自由编码αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、k-酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白的牛基因得到的5′表达调控顺序。

22、按权利要求21的转移基因，其中所述5′表达调控DNA顺序是含有牛αS1-酪蛋白启动子的近端5′表达调控顺序。

23、按权利要求22的转移基因，其中所述5′表达调控DNA顺序进一步包括含有由牛αS1-酪蛋白得到的5′侧翼DNA顺序的远端5′表达调控顺序。

24、按权利要求20的转移基因，进一步包括通过操作与所述分泌-重组DNA顺序的3′端连接的3′表达调控顺序。

25、按权利要求24的转移基因，其中所述3′表达调控顺序包括由编码αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、k-酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白的牛基因得到的3′表达调控顺序。

26、按权利要求25的转移基因，其中所述3′表达调控DNA顺序包括由牛αS1-酪蛋白得到的3′近端表达调控顺序。

27、按权利要求26的转移基因，其中所述3′表达调控DNA顺序进一步包括由牛αS1-酪蛋白得到的3′近端表达调控顺序。

28、按权利要求27的转移基因，其中所述远端5′表达调控DNA顺序包括大约30Kb牛αS1-酪蛋白的5′-侧翼区，所述远端3′表达调控DNA顺序包括大15Kb牛αS1-酪蛋白的3′-侧翼区。

29、一种转移基因牛，其能在所述动物的至少一种细胞中产生重组多肽。

30、一种转移基因牛，其能在所述转移基因牛的乳中产生重组多肽。

31、按权利要求30的转移基因牛，其中所述重组多肽是由牛中得到的同源多肽。

32、按权利要求30的转移基因牛，其中所述重组多肽是异源多肽。

33、按权利要求30的转移基因牛，其中所述异源多肽选自人乳蛋白、人血清蛋白和工业用酶。

34、按权利要求33的转移基因牛，其中所述异源多肽是人乳蛋白。

35、按权利要求34的转移基因牛，其中所述人乳蛋白选自分泌免疫球蛋白、溶菌酶、乳铁蛋白、乳球蛋白、α-乳清蛋白和胆汁盐刺激的脂肪酶。

36、按权利要求35的转移基因牛，其中所述乳蛋白是乳铁蛋白。

37、按权利要求33的转移基因牛，其中所述异源多肽是人血清蛋白。

38、按权利要求37的转移基因牛，其中所述人血清蛋白选自清蛋白、免疫球蛋白、因子Ⅷ、因子Ⅸ和蛋白质C。

39、按权利要求38的转移基因牛，其中所述血清蛋白是清蛋白。

40、按权利要求33的转移基因牛，其中所述异源多肽是选自蛋白酶、脂肪酶、壳多糖酶和木质素酶。

41、由含有重组多肽的转移基因牛得到的牛乳。

42、按权利要求41的牛乳，其中所述重组多肽是由牛中得到的同源多肽。

43、按权利要求41的牛乳，其中所述重组多肽是异源多肽。

44、按权利要求43的牛乳，其中所述异源多肽选自人乳蛋白、人血清蛋白和工业用酶。

45、按权利要求44的牛乳，其中所述异源多肽是人乳蛋白。

46、按权利要求45的牛乳，其中所述人乳蛋白选自分泌免疫球蛋白、溶菌酶、乳铁蛋白、乳球蛋白、α-乳清蛋白和胆汁盐刺激的脂肪酶。

47、按权利要求46的牛乳，其中所述乳蛋白是乳铁蛋白。

48、按权利要求43的牛乳，其中所述异源多肽是人血清蛋白。

49、按权利要求48的牛乳，其中所述人血清蛋白选自清蛋白、免疫球蛋白、因子Ⅷ、因子Ⅸ和蛋白质C。

50、按权利要求49的牛乳，其中所述血清蛋白是清蛋白。

51、一种食品配制剂，包括含有重组多肽的转移基因乳。

52、按权利要求51的食品配制剂，其中所述重组多肽是由该转移基因乳至少经过部分纯化的。

53、按权利要求51的食品配制剂，其与适宜于婴儿配方的营养物质一起配制。

54、生产能在转移基因牛的乳中产生重组多肽的转移基因牛的方法，所述方法包括：

将权利要求1的转移基因引入牛的胚胎靶细胞;

将由此形成转移基因胚胎靶细胞或由此得到的胚胎植入受体母体牛中;

鉴别至少有一头雌性后代能在其乳中产生该重组多肽。

55、生产具有所需表型的转移基因非人哺乳动物的方法，该方法包括：

（a）在将转移基因结合到所述转移基因非人动物的细胞中时，对能赋予所述表型的转移基因进行甲基化;

（b）将该甲基化的转移基因引入到所述非人哺乳动物受精卵母细胞中，使该转移基因整合到所述受精卵母细胞的基因组DNA中;

（c）培养所形成的各个卵母细胞和预植入胚胎，从而复制所述各个受精卵母细胞的基因组;

（d）从所述各个预植入的胚胎中至少取出一个细胞并将其溶解，以释放其中所含的DNA;

（e）将所述释放的DNA与能裂解所述甲基化转移基因组不能裂解未甲基化的在整合到所述基因组DNA并进行复制后所形成的转移基因的限制性核酸内切酶接触;

（f）检测该预植入胚胎中的细胞所含转移基因对核酸内切限制酶的裂解的抗性，以说明预植入胚胎是否已经与所述转移基因整合。

56、按权利要求55的方法，其中所述取出至少一个细胞形成预植入各个胚胎的第一和第二半胚胎，将各个第一半胚胎溶解并按步骤（d）至（f）进行分析，所述方法进一步包括：

（g）克隆至少一个第二半胚胎;

（h）形成转移基因胚胎的增殖。

57、按权利要求56的方法，进一步包括将一个以上转移基因胚胎移植到受体母本，产生一组具有相同基因型的至少两个转移基因非人动物。

58、按权利要求55的方法，进一步包括将含有基因组已经整合的转移基因的其余预植入胚胎移植到受体母本中，鉴定至少有一个后代具有所述表型。

59、按权利要求55的方法，其中所述核酸内切限制酶是DPNI，所述转移基因是在转移基因内的顺序GATC的腺嘌呤的N6上被甲基化。

60、按权利要求59的方法，其中所述检测是用延长引物补充GATC顺序上下游的顺序进行聚合酶链反应。

61、按权利要求59的方法，其中所述非人转移基因哺乳动物是牛，所述转移基因编码重组多肽，所需的表型是能在所述牛的乳中产生该重组多肽。

62、按权利要求61的方法，其中所述转移基因是权利要求3所述的转移基因。

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