CN1431911A - 转基因产生的核心蛋白聚糖 - Google Patents

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Abstract

本发明提供转基因产生的核心蛋白聚糖，和制备及应用转基因产生的核心蛋白聚糖的方法。

Description

转基因产生的核心蛋白聚糖
本申请要求2000年5月5日提交的临时申请60/201,932的权益，该中请的内容被完整地并入。
发明背景
越来越多的重组蛋白正被开发用于治疗、诊断、农业、兽医、营养和其它用途；然而，其中的许多蛋白质使用常规方法以功能性形式大量产生可能是困难的或是昂贵的。
常规方法常涉及将负责产生特定蛋白质的基因插入宿主细胞如细菌、酵母或哺乳动物细胞中。在培养基中培养这些细胞并从细胞或培养基中回收目的蛋白质。传统的细菌或酵母系统有时并不能产生功能形式的复杂蛋白质。尽管某些哺乳动物细胞可以复制复杂蛋白质，但它们常难于培养或培养花费昂贵，并且仅产生相对低量的蛋白质。此外，由于非分泌蛋白质常常不被分泌至培养基中，故相对难以从原核或哺乳动物细胞中被纯化出来。
核心蛋白聚糖，又称作PG-II或PG-40，是成纤维细胞产生的小蛋白聚糖。其核心蛋白具有约40,000道尔顿的分子量。已对该核心进行过测序(Krusius和Ruoslahti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7683(1986)；并入本文作为参考)，并已知它仅带有一条硫酸软骨素/硫酸皮肤素型糖胺聚糖链(E.Ruoslahti，Ann.Rev.Cell Biol.，4；229-255(1988)，特此并入作为参考)。大多数核心蛋白聚糖的核心蛋白的特征在于存在约24个氨基酸的富含亮氨酸的重复(LRR)。
蛋白聚糖是带有一条或多条糖胺聚糖链的蛋白质。已知的蛋白聚糖具有多种多样的功能，并存在于多种细胞位置。许多蛋白聚糖是细胞外基质的成分，它们在其中参与基质的组装并使细胞能够附着基质。
核心蛋白聚糖被用于预防TGF-β诱导的细胞增殖和细胞外基质的产生。因此，核心蛋白聚糖对于减少或预防由TGF-β所调节的活性引起的病理情况(如癌症、血管球性肾炎)和以过量基质为特征的病理情况是有用的。例如，在癌症中，可以使用核心蛋白聚糖破坏TGFβ-1对癌细胞的生长刺激活性。还可以使用核心蛋白聚糖减少或抑制伤口收缩(该过程涉及细胞外基质中的蛋白质)。
发明概述
一般地，本发明涉及转基因产生的核心蛋白聚糖(优选人核心蛋白聚糖)制品。
该转基因产生的核心蛋白聚糖是在转基因生物，即转基因植物或动物中产生的。优选的转基因动物包括：哺乳动物、鸟类、爬行类动物和两栖动物。适宜的哺乳动物包括：反刍动物、有蹄动物、饲养的哺乳动物、和产奶动物。尤其优选的动物包括：山羊、绵羊、骆驼、奶牛、猪、马、公牛、兔和美洲驼。适宜的鸟包括：鸡、鹅和火鸡。当将转基因蛋白分泌至转基因动物的奶中时，该动物应能够每年产生至少1、更优选至少10、或100升奶。
在优选实施方案中，与天然非转基因源中存在的或分离自其中的核心蛋白聚糖、或从细胞培养物中分离的重组产生的核心蛋白聚糖的糖基化相比，本发明转基因产生的核心蛋白聚糖制品(优选在转基因生物中制备的该核心蛋白聚糖制品)的糖基化不足80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％(就制品中糖基化分子的数量，或就制品中糖对分子量的总贡献而言)。优选地，所述转基因产生的核心蛋白聚糖缺少糖胺聚糖(GAG)链。在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖制品是这样一种制品，在该制品中不足50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％的核心蛋白聚糖分子具有GAG链。在另一优选实施方案中，该制品中具有GAG链的核心蛋白聚糖分子与没有GAG链的核心蛋白聚糖分子的比例为约1∶2、1∶3、2∶3、1∶4、3∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9。
在优选实施方案中，该转基因制品，优选转基因生物中制备的该转基因制品，包括糖基化和非糖基化形式，且部分或全部的糖基化形式被通过例如标准蛋白质分离方法从例如体液(如奶)中被除去。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖是在转基因哺乳动物如反刍动物(如山羊)的乳腺中制造的。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖被分泌至转基因动物如反刍动物(如山羊)的奶中。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖是在乳腺特异性启动子，如奶特异性启动子，如乳清(milk serum)蛋白或酪蛋白启动子的控制下产生的。所述奶特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。
在优选实施方案中，本发明核心蛋白聚糖是在膀胱或卵特异性启动子的控制下产生的，并且被分泌至尿或卵中。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖制品在平均分子量、活性、清除时间、或对蛋白水解的耐受性方面与非转基因形式的核心蛋白聚糖是不同的。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖制品在糖基化方面不同于细胞培养物中重组产生的核心蛋白聚糖中发现的或从中分离的核心蛋白聚糖。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖是由转基因生物表达的，并且该转基因产生的核心蛋白聚糖制品在糖基化方面不同于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、培养的哺乳动物细胞(如CHO、COS或HeLa细胞)中存在的或自其中分离的核心蛋白聚糖。例如，它与插入了编码或指导核心蛋白聚糖表达的核酸的培养哺乳动物细胞产生的蛋白质不同。
在优选实施方案中，本发明核心蛋白聚糖制品的电泳迁移率(例如通过SDS-PAGE确定)不同于天然存在的人核心蛋白聚糖的电泳迁移率；该制品的电泳迁移率不同于哺乳动物细胞(如CHO、COS或HeLa细胞)、原核细胞(如细菌)、酵母或昆虫细胞中重组产生的人核心蛋白聚糖的电泳迁移率。
在优选实施方案中，本发明核心蛋白聚糖与天然存在的人核心蛋白聚糖相差至少一个氨基酸残基；该核心蛋白聚糖与哺乳动物细胞(如CHO、COS或HeLa细胞)、原核细胞(如细菌)、酵母或昆虫细胞中重组产生的人核心蛋白聚糖相差至少一个氨基酸残基。
在优选实施方案中，该核心蛋白聚糖的氨基酸序列是哺乳动物或灵长类动物，优选人的核心蛋白聚糖的氨基酸序列。
在优选实施方案中，该制品包括至少1、10或100毫克核心蛋白聚糖。在优选实施方案中，该制品包括至少1、10或100克核心蛋白聚糖。
在优选实施方案中，该制品包括至少1、10、100或500毫克/毫升的核心蛋白聚糖。
另一方面，本发明涉及分离的核酸分子，该核酸分子包括可操作地与组织特异性启动子(如导致蛋白质分泌至转基因哺乳动物奶中的乳腺特异性启动子序列)连接的核心蛋白聚糖的蛋白编码序列。
在优选实施方案中，所述启动子是奶特异性启动子，如乳清(milkserum)蛋白或酪蛋白启动子。奶特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。
在优选实施方案中，所述启动子是膀胱或卵特异性启动子，且核心蛋白聚糖被分泌至尿或卵中。
在优选实施方案中，该核心蛋白聚糖的氨基酸序列是哺乳动物或灵长类动物、优选人的核心蛋白聚糖的氨基酸序列。
另一方面，本发明涉及制备转基因核心蛋白聚糖或转基因核心蛋白聚糖制品的方法。该方法包括：
提供转基因生物，即转基因动物或植物，该转基因生物包含指导核心蛋白聚糖，优选人核心蛋白聚糖表达的转基因；
允许该转基因得以表达；和从所述生物或从所述生物产生的产物(如奶、种子、毛发、血液、卵或尿)中回收转基因产生的核心蛋白聚糖或转基因产生的核心蛋白聚糖制品。
在优选实施方案中，该方法还包括：
将指导核心蛋白聚糖表达的核酸插入细胞中并使细胞发展成转基因生物。
优选的转基因动物包括：哺乳动物、鸟类、爬行类动物和两栖动物。适宜的哺乳动物包括：反刍动物、有蹄动物、饲养的哺乳动物、和产奶动物。尤其优选的动物包括：山羊、绵羊、骆驼、奶牛、猪、马、兔和小鼠。适宜的鸟类包括：鸡、鹅和火鸡。当将转基因蛋白分泌至转基因动物的奶中时，该动物应能够每年产生至少1、更优选至少10、或100升奶。
在优选实施方案中，与天然非转基因源中存在的或从中纯化的核心蛋白聚糖、或从细胞培养物中重组产生的核心蛋白聚糖分离的核心蛋白聚糖的糖基化相比，本发明转基因产生的核心蛋白聚糖制品(优选转基因生物中产生的)的糖基化不足80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％(就制品中糖基化分子的数量，或就制品中糖对分子量的总贡献而言)。优选地，转基因产生的核心蛋白聚糖缺少糖胺聚糖(GAG)链。在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖制品，即在转基因生物中制备的核心蛋白聚糖制品是这样一种制品，在该制品中不足50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％的核心蛋白聚糖分子具有GAG链。在另一优选实施方案中，该制品(即转基因生物中制备的该制品)中具有GAG链的核心蛋白聚糖分子与没有GAG链的核心蛋白聚糖分子的比例是约1∶2、1∶3、2∶3、1∶4、3∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9。
在优选实施方案中，所述转基因制品，优选转基因生物中产生的该转基因制品，包括糖基化和非糖基化形式，且部分或全部的糖基化形式被通过例如标准蛋白质分离方法从体液(如奶)中除去。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖是在转基因哺乳动物如反刍动物(如山羊)的乳腺中制造的。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖被分泌至转基因哺乳动物如反刍动物(如山羊)的奶中。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖是在乳腺特异性启动子，如奶特异性启动子，如乳清(milk serum)蛋白或酪蛋白启动子的控制下产生的。所述奶特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白或乳清蛋白启动子。
在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖在膀胱或卵特异性启动子的控制下产生，并且分泌至尿或卵中。
在优选实施方案中，转基因产生的核心蛋白聚糖制品在平均分子量、活性、清除时间、或对蛋白水解的耐受性方面与非转基因形式是不同的。
在优选实施方案中，转基因产生的核心蛋白聚糖制品在糖基化方面不同于细胞培养物中重组产生的核心蛋白聚糖中存在的或从中分离的核心蛋白聚糖。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖由转基因生物表达，并且该转基因产生的核心蛋白聚糖制品的糖基化不同于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、培养的哺乳动物细胞(如CHO、COS或HeLa细胞)中存在的或自其中分离的核心蛋白聚糖的糖基化。例如，它与插入了编码或指导核心蛋白聚糖表达的核酸的培养哺乳动物细胞产生的蛋白质不同。
在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖制品的电泳迁移率(例如通过SDS-PAGE确定)不同于天然存在的人核心蛋白聚糖的电泳迁移率；该制品的电泳迁移率不同于在哺乳动物细胞(如CHO、COS或HeLa细胞)、原核细胞(如细菌)、酵母或昆虫细胞中重组产生的人核心蛋白聚糖的电泳迁移率。
在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖与天然存在的人核心蛋白聚糖相差至少一个氨基酸残基；所述核心蛋白聚糖与哺乳动物细胞(如CHO、COS或HeLa细胞)、原核细胞(如细菌)、酵母或昆虫细胞中重组产生的人核心蛋白聚糖相差至少一个氨基酸残基。
在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖的氨基酸序列是哺乳动物或灵长类动物，优选人的核心蛋白聚糖的氨基酸序列。
在优选实施方案中，该制品包括至少1、10或100毫克核心蛋白聚糖。在优选实施方案中，该制品包括至少1、10或100克核心蛋白聚糖。
在优选实施方案中，该制品包括至少1、10、100或500毫克/毫升的核心蛋白聚糖。
另一方面，本发明涉及提供在转基因哺乳动物的奶中包括外源性核心蛋白聚糖的转基因制品的方法，该方法包括：
获取生殖系中导入了核心蛋白聚糖蛋白编码序列的转基因哺乳动物的奶，其中所述编码序列可操作地与导致该蛋白编码序列在乳腺上皮细胞中表达的启动子序列连接，由此使得该核心蛋白聚糖分泌至该哺乳动物的奶中以提供所述制品。
适宜的哺乳动物动物包括：反刍动物、有蹄动物、饲养的哺乳动物和产奶动物。尤其优选的哺乳动物包括：山羊、绵羊、骆驼、奶牛、猪、马、公牛和美洲驼。该转基因哺乳动物应能够每年产生至少1、更优选至少10、或100升奶。
在优选实施方案中，与天然非转基因源中存在的或从中分离的核心蛋白聚糖、或从细胞培养物中重组产生的核心蛋白聚糖分离的核心蛋白聚糖的糖基化相比，该转基因产生的核心蛋白聚糖制品(优选转基因生物中产生的核心蛋白聚糖制品)的糖基化不足80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％(就制品中糖基化分子的数量，或就制品中糖对分子量的总贡献而言)。优选地，该转基因产生的核心蛋白聚糖缺少糖胺聚糖(GAG)链。在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖制品，即转基因生物中产生的核心蛋白聚糖是这样一种制品，在该制品中不足50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％的核心蛋白聚糖分子具有GAG链。在另一优选实施方案中，该制品(即转基因生物中产生的该制品)中具有GAG链的核心蛋白聚糖分子与没有GAG链的核心蛋白聚糖分子的比例是约1∶2、1∶3、2∶3、1∶4、3∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9。
在优选实施方案中，所述转基因制品，优选转基因哺乳动物中产生的该转基因制品，包括糖基化和非糖基化形式，且部分或全部的糖基化形式被通过例如标准蛋白质分离方法从体液(如奶)中除去。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖是在转基因哺乳动物如反刍动物(如山羊)的乳腺中制造的。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖被分泌至转基因哺乳动物如反刍动物(如山羊)的奶中。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖是在乳腺特异性启动子，如奶特异性启动子，如乳清(milk serum)蛋白或酪蛋白启动子的控制下产生的。所述奶特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白或乳清蛋白启动子。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖制品在平均分子量、活性、清除时间、或对蛋白水解的耐受性方面与非转基因形式是不同的。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖制品在糖基化方面不同于细胞培养物中重组产生的核心蛋白聚糖中存在的或从中分离的核心蛋白聚糖。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖由转基因生物表达，并且该转基因产生的核心蛋白聚糖制品的糖基化不同于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、培养的哺乳动物细胞(如CHO、COS或HeLa细胞)中存在的或自其中分离的核心蛋白聚糖的糖基化。例如，它与插入了编码或指导核心蛋白聚糖表达的核酸的培养哺乳动物细胞产生的蛋白质不同。
在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖制品的电泳迁移率(例如通过SDS-PAGE确定)不同于天然存在的人核心蛋白聚糖的电泳迁移率；该制品的电泳迁移率不同于哺乳动物细胞(如CHO、COS或HeLa细胞)、原核细胞(如细菌)、酵母或昆虫细胞中重组产生的人核心蛋白聚糖的电泳迁移率。
在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖与天然存在的人核心蛋白聚糖相差至少一个氨基酸残基；所述核心蛋白聚糖与哺乳动物细胞(如CHO、COS或HeLa细胞)、原核细胞(如细菌)、酵母或昆虫细胞中重组产生的人核心蛋白聚糖相差至少一个氨基酸残基。
在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖的氨基酸序列是哺乳动物或灵长类动物，优选人的核心蛋白聚糖的氨基酸序列。
在优选实施方案中，所述奶包括至少1、10、100、500、1,000或2,000毫克/毫升的核心蛋白聚糖。
另一方面，本发明涉及表达转基因核心蛋白聚糖，优选人核心蛋白聚糖并且可从中获得转基因核心蛋白聚糖制品的转基因生物。
该转基因生物是转基因植物或动物。优选的转基因动物包括：哺乳动物、鸟类、爬行类动物和两栖动物。适宜的哺乳动物包括：反刍动物、有蹄动物、饲养的哺乳动物和产奶动物。尤其优选的动物包括：山羊、绵羊、骆驼、奶牛、猪、马、兔和小鼠。适宜的鸟类包括：鸡、鹅和火鸡。当将转基因蛋白分泌至转基因动物的奶中时，该动物应能够每年产生至少1、更优选至少10或100升奶。
在优选实施方案中，与天然非转基因源中存在的或从中分离的核心蛋白聚糖、或从细胞培养物中重组产生的核心蛋白聚糖分离的核心蛋白聚糖的糖基化相比，该转基因产生的核心蛋白聚糖制品(优选转基因生物中产生的核心蛋白聚糖制品)的糖基化不足80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、2.5％或1％(就制品中糖基化的分子的数量而言，或就制品中糖对分子量的总贡献而言)。优选地，转基因产生的核心蛋白聚糖缺少糖胺聚糖(GAG)链。在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖制品，即在转基因生物中产生的核心蛋白聚糖制品是这样一种制品，在该制品中不足50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％的核心蛋白聚糖分子具有GAG链。在另一优选实施方案中，该制品(即转基因生物中产生的该制品)中具有GAG链的核心蛋白聚糖分子与没有GAG链的核心蛋白聚糖分子的比例是约1∶2、1∶3、2∶3、1∶4、3∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9。
在优选实施方案中，该转基因制品，优选转基因生物中产生的该转基因制品，包括糖基化和非糖基化形式，且部分或全部的糖基化形式被通过例如标准蛋白质分离方法从体液(如奶)中除去。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖是在转基因哺乳动物如反刍动物(如山羊)的乳腺中制造的。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖被分泌至转基因哺乳动物如反刍动物(如山羊)的奶中。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖是在乳腺特异性启动子，如奶特异性启动子，如乳清(milk serum)蛋白或酪蛋白启动子的控制下产生的。所述奶特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白或乳清蛋白启动子。
在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖在膀胱或卵特异性启动子的控制下产生，并且分泌至尿或卵中。
在优选实施方案中，转基因产生的核心蛋白聚糖制品在平均分子量、活性、清除时间、或对蛋白水解的耐受性方面与非转基因形式是不同的。
在优选实施方案中，转基因产生的核心蛋白聚糖制品在糖基化方面不同于细胞培养物中重组产生的核心蛋白聚糖中发现的或从中分离的核心蛋白聚糖。
在优选实施方案中，该转基因产生的核心蛋白聚糖由转基因生物表达，并且该转基因产生的核心蛋白聚糖制品的糖基化不同于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、培养的哺乳动物细胞(如CHO、COS或HeLa细胞)中存在的或自其中分离的核心蛋白聚糖的糖基化。例如，它与插入了编码或指导核心蛋白聚糖表达的核酸的培养哺乳动物细胞产生的蛋白质不同。
在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖制品的电泳迁移率(例如通过SDS-PAGE确定)不同于天然存在的人核心蛋白聚糖的电泳迁移率；该制品的电泳迁移率不同于哺乳动物细胞(如CHO、COS或HeLa细胞)、原核细胞(如细菌)、酵母或昆虫细胞中重组产生的人核心蛋白聚糖的电泳迁移率。
在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖与天然存在的人核心蛋白聚糖相差至少一个氨基酸残基；所述核心蛋白聚糖与哺乳动物细胞(如CHO、COS或HeLa细胞)、原核细胞(如细菌)、酵母或昆虫细胞中重组产生的人核心蛋白聚糖相差至少一个氨基酸残基。
在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖的氨基酸序列是哺乳动物或灵长类动物，优选人的核心蛋白聚糖的氨基酸序列。
在优选实施方案中，该制品包括至少1、10或100毫克核心蛋白聚糖。在优选实施方案中，该制品包括至少1、10或100克核心蛋白聚糖。
在优选实施方案中，该制品包括至少1、10、100或500毫克/毫升的核心蛋白聚糖。
另一方面，本发明涉及包括治疗有效量的转基因核心蛋白聚糖、或转基因核心蛋白聚糖制品和可药用载体的药物组合物。
该转基因核心蛋白聚糖或核心蛋白聚糖制品可以通过如本文描述的任何方法或生物制备。
该转基因核心蛋白聚糖或核心蛋白聚糖制品可以是例如本文描述的任何转基因核心蛋白聚糖或核心蛋白聚糖制品。
另一方面，本发明涉及包括转基因产生的核心蛋白聚糖制品，优选人核心蛋白聚糖，和至少一种除核心蛋白聚糖之外的其它成分如营养成分的制剂。
在优选实施方案中，该制剂是固体或液体。
在优选实施方案中，该制剂还包括液体载体。
在优选实施方案中，所述营养成分是：蛋白质，如奶蛋白；维生素，维生素A、维生素B、维生素D；糖；矿物质，如钙、磷、铁。
该转基因核心蛋白聚糖或核心蛋白聚糖制品可以通过例如本文描述的任何方法或生物制备。
该转基因核心蛋白聚糖或核心蛋白聚糖制品可以是例如本文所述的任何转基因核心蛋白聚糖或核心蛋白聚糖制品。
另一方面，本发明涉及包括转基因产生的核心蛋白聚糖或核心蛋白聚糖制品，优选人核心蛋白聚糖，和至少一种除核心蛋白聚糖之外的营养成分的营养食品。
所述转基因核心蛋白聚糖或核心蛋白聚糖可以通过例如本文描述的任何方法或生物制备。
所述转基因核心蛋白聚糖或核心蛋白聚糖制品可以是例如本文所述的任何转基因核心蛋白聚糖或核心蛋白聚糖制品。
另一方面，本发明涉及向需要核心蛋白聚糖的对象提供核心蛋白聚糖的方法。该方法包括：向对象施用转基因产生的核心蛋白聚糖或转基因核心蛋白聚糖制品。
在优选实施方案中，所述对象是∶需要核心蛋白聚糖的人如患者。例如，本发明涉及通过在伤口施用转基因核心蛋白聚糖预防或减少结疤的方法。皮肤结疤是各种皮肤损伤后导致纤维组织包括胶原、纤连蛋白和蛋白聚糖过度聚集的一个过程。纤维基质聚集是由血小板和炎性细胞在伤口处释放的生长因子诱导的。据信诱导纤维疤痕组织堆积的主要生长因子是转化生长因子β(TGF-β)。核心蛋白聚糖结合TGF-β并中和TGF-β的各种生物学功能，包括细胞外基质的诱导。由于缺少该细胞外纤维基质的弹性性质，由严重皮肤损伤造成的疤痕组织常损害基本的组织功能，并会导致难看的疤痕。
在本发明方法中使用转基因核心蛋白聚糖的优点在于它是正常的人蛋白质并据信参与了天然TGF-β的调节途径。因此，可以使用转基因核心蛋白聚糖来预防或减少由烧伤、其它侵入性(invasive)皮肤损伤、和美容或整容手术导致的皮肤疤痕。
已经发现，与未使用核心蛋白聚糖处理的对照伤口相比，使用核心蛋白聚糖处理的伤口基本上不表现出可见疤痕。TGF-β诱导的疤痕形成过程被证明是成年人和妊娠末三月的人类胚胎所独有的，但其在妊娠头6个月的胚胎中基本上不存在。胚胎损伤处缺少疤痕与伤口床中不存在TGF-β有关。相反，成人组织的伤口床中沉积有大量的TGF-β，而且完全愈合的伤口被代替为发红、发皱的疤痕，在这些疤痕中含有大量的纤维胶原基质。核心蛋白聚糖处理的伤口在组织学方面是正常的并类似妊娠头6个月的胎儿伤口。
另一方面，本发明涉及可用于上述方法中的含有转基因核心蛋白聚糖和可药用载体的药物组合物。可药用载体包括例如透明质酸和补加了5％葡聚糖或人血清白蛋白(如果必要的话)的含水溶液如碳酸氢盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Ringer氏溶液，以及生理盐水。该药物组合物还可以包括本领域技术人员已知的其它促进伤口愈合的药剂。这些药剂可以包括例如生物学活性化学物质和多肽，包括PCT WO90/06767(1990年6月28日公布，并入本文作为参考)描述的与可生物降解聚合物连接的含有RGD的多肽。这些多肽可以通过本领域已知的任何方式，包括例如共价或离子结合方式，与聚合物结合。
另一方面，本发明涉及用于减少或抑制对象的伤口收缩的方法，包括给对象施用包含转基因核心蛋白聚糖的药物组合物。本发明提供例如减少或抑制伤口收缩的方法，包括施用包含转基因核心蛋白聚糖的药物组合物。
另一方面，本发明涉及治疗对象的癌症，如乳腺癌的方法，包括给对象施用治疗有效量的转基因核心蛋白聚糖。
该转基因核心蛋白聚糖或核心蛋白聚糖制品可以通过例如本文描述的任何方法或生物来制备。
该转基因核心蛋白聚糖或核心蛋白聚糖制品可以是例如本文所述的任何转基因核心蛋白聚糖或蛋白聚糖制品。
在本文描述的所有组合物和方法中，转基因核心蛋白聚糖制品或制剂可以不含糖胺聚糖(GAG)链，从而导致很均一的核心蛋白聚糖制品。另一优选实施方案中，该转基因制品或制剂是其中不足50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％的核心蛋白聚糖分子具有GAG链的制品或制剂。在另一优选实施方案中，该转基因核心蛋白聚糖制品或制剂中具有GAG链的核心蛋白聚糖分子与无GAG链的核心蛋白聚糖分子的比例为约1∶2、1∶3、2∶3、1∶4、3∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9。
一些转基因蛋白的表达会对转基因动物或其子代的代谢或健康造成有害的影响。
因此，另一方面，本发明涉及在转基因动物中产生转基因蛋白的方法(其中所述转基因蛋白是对转基因动物的代谢产生影响的蛋白)，包括：
在例如转基因动物的奶中表达转基因蛋白；和
对转基因动物进行处理以抑制转基因蛋白对转基因动物的影响。
例如，可以给动物施用可抑制转基因核心蛋白聚糖对动物产生的影响的物质，例如抑制转基因核心蛋白聚糖活性的物质，或可以使动物转基因表达该物质。在优选实施方案中，该物质是多肽。例如，该物质可以是酶或受体，或其片段，或可与转基因核心蛋白聚糖相互作用或结合的其它分子。它可以通过竞争性或非竞争性地抑制转基因核心蛋白聚糖的活性、通过改变核心蛋白聚糖的分布或运输来起作用。
如果转基因蛋白存在于转基因动物的特定位置，如组织、体液或器官中时，则可以在该位置施用或表达所述物质。例如，当转基因蛋白表达在转基因动物的奶中时，可以将该物质施用于转基因动物的奶中，或使之在奶中表达。
在转基因表达所述物质的情况下，所述转基因核心蛋白聚糖和所述物质可以从相同类型的启动子表达，如它们可以均从乳腺特异性启动子，如奶特异性启动子表达。所述转基因核心蛋白聚糖和物质可以从导致两者等同表达的启动子表达，或可以从具有不同强度的不同启动子表达。这可以导致一个比另一个有较高或较低的表达。在某些情况下，可能期望在例如摩尔或重量基础上所述物质的表达超过所述转基因核心蛋白聚糖的表达。在其它情况下，相反的状况将使所述物质的产生得以优化。所述物质可以在非表达核心蛋白聚糖的位置表达。例如，可以将所述物质施用在或使之表达在不期望转基因核心蛋白聚糖出现的位置，例如转基因蛋白可能会渗漏进入的位置，如血液。在优选实施方案中，转基因核心蛋白聚糖在转基因动物的奶中表达，而所述物质被施用在转基因动物的血中，或在血中表达。
在优选实施方案中，给转基因动物施用或使之表达结合转基因核心蛋白聚糖的抗体。该抗体可以是例如单链抗体或intrabody。在优选实施方案中，转基因核心蛋白聚糖表达在奶中，而所述抗体表达在血液中。
可以向转基因动物施用所述物质，或使所述物质作为第二转基因蛋白在转基因动物中表达。然而，在制备转基因动物，如大的转基因动物如转基因山羊之前，应测试所述物质的效力。这可以通过向动物如山羊施用(如注射)核心蛋白聚糖及所述物质，和监测核心蛋白聚糖对转基因动物的代谢或健康的影响来完成。如果观察到所述物质有适当的效果，然后即可制备转基因动物。为了评价候选物质是否可用于构建双转基因动物，即对于核心蛋白聚糖和所述物质而言为转基因的动物，可能期望构建表达转基因核心蛋白聚糖的转基因动物，并向该动物施用该物质。
宿主的健康也可以通过组织特异性表达，如在乳腺中表达，优选在奶中表达来优化。
可以对转基因核心蛋白聚糖的结构进行修饰，以便例如增强治疗或预防效力、或稳定性(例如离体保质期和体内对蛋白水解的耐受性)，或优化动物的健康。设计以保留天然核心蛋白聚糖的至少一种活性的此类修饰的核心蛋白聚糖被认为是本文更为详细描述的核心蛋白聚糖的功能性等同物。这些修饰的肽可以通过例如氨基酸替代、缺失或添加来制备。
在优选实施方案中，可以将转基因核心蛋白聚糖表达为与另一多肽融合的转基因融合蛋白。可以通过表达为融合蛋白来优化动物的健康、蛋白的分离或回收，或改变蛋白质的离体保质期。
在优选实施方案中，核心蛋白聚糖作为与第二多肽序列的融合蛋白表达，该融合使核心蛋白聚糖对转基因动物的代谢或健康的不良影响达到最小。所述第二多肽可以是通过例如干扰核心蛋白聚糖部分和第二分子如受体，如核心蛋白聚糖受体的相互作用来改变融合蛋白中核心蛋白聚糖的活性的多肽。所述第二蛋白可以是改变融合蛋白的组织分布的蛋白质。例如，可以通过所述第二多肽与核心蛋白聚糖部分的融合防止融合物在转基因动物中从表达位置如乳腺组织或奶迁移或转运至另一位置，例如循环系统或血液。
在优选实施方案中，在表达或分离融合蛋白后使所述第二蛋白切离核心蛋白聚糖部分。
转基因核心蛋白聚糖可以与优化转基因核心蛋白聚糖的分离或回收的第二多肽作为融合蛋白表达。例如，所述第二多肽可以通过如下方式优化分离：通过例如使溶解度增加或减少，赋予融合蛋白期望的溶解性质；通过例如提供亲和部分，提供简化纯化过程的部分。
如本文所用，如果两个蛋白在一个或多个如下参数上不同，则它们的糖基化不同：
(1)与蛋白连接的糖残基的总分子量；
(2)与蛋白连接的糖残基的总数；
(3)所连糖残基的亚单位组成；
(4)所连糖中存在的分支点的数目；
(5)分支点在所连接的糖中的位置；
(6)蛋白上与糖连接的位点数；
(7)蛋白上与糖连接的位置；
(8)0连接的糖基化位点的数目；和
(9)N连接的糖基化位点的数目。
如果具有所选特征(如一个或多个以上刚引述的特征)的转基因核心蛋白聚糖分子的比例与第二制品中具有此特征的分子的比例不同，则两个制品彼此不同。例如，两个制品均可以含有糖基化的核心蛋白聚糖和无GAG链的核心蛋白聚糖。
正如本文所用，制品是指由一种或多种转基因动物产生的大量分子。它可以包括具有不同糖基化的分子，或可以就此方面而言是均一的。本文中，术语“转基因产生的核心蛋白聚糖的基本均一制品”是指其中的核心蛋白聚糖分子有不足10％、5％、2％、或1％的具有GAG链的核心蛋白聚糖制品。
本文中，对于转基因产生的多肽，纯化的、基本纯的多肽制品、或分离的多肽是指该多肽已和在转基因动物中或转基因动物产生的体液(如奶)或其它物质(如卵)中与其一起存在的至少一种别的蛋白、脂或核酸分离开。该多肽优选与用于纯化它的物质，如抗体或凝胶基质如聚丙烯酰胺分开。该多肽优选构成所述纯化制品的至少10、20、50、70、80或95％干重。优选地，该制品含有：可以允许进行蛋白测序的足量多肽；至少1、10或100μg多肽；至少1、10或100mg的多肽。
基本上纯的核酸是指该核酸具有以下之一或两个性质：在该核酸来源的生物的天然基因组中与其紧邻的一个或两个序列(即一个在5’端，另一个在3’端)，如编码序列不再与其紧接在一起；或该核酸基本上不含有存在于其来源生物中的核酸序列。该术语包括例如整合在载体例如自主复制质粒或病毒中、或整合在原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为单独的分子(例如PCR或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)独立于其它DNA序列存在的重组DNA。基本上纯的DNA还包括作为编码其它核心蛋白聚糖序列的杂合基因的一部分的重组DNA。
术语肽、蛋白质和多肽在本文中可互换使用。
同源性或序列一致性在本文中是指两个多肽分子或两个核酸分子之间的序列相似性。当第一序列的一个位置上与第二序列的相应位置上占据的氨基酸残基或核苷酸相同时，则这两个分子在该位置同源(即，本文中氨基酸或核酸“同源性”等价于氨基酸或核酸“一致性”)。两个序列之间的同源性百分数是这两个序列共有的一致位置的数目的函数(即，％同源性＝一致性位置的数目/位置总数×100)。
例如，当两个序列的10个位置中有6个匹配或同源，则这两个序列有60％同源性或具有60％序列一致性。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC有50％同源性或序列一致性。一般地，比较在两个序列对齐得到最大同源性或序列一致性的情况下进行。
两个序列之间的序列的比较和同源性百分数的确定可以使用数学算法来完成。用于比较序列的数学算法的优选非限制性实例是按Karlin和Altschul(1993)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-77)修改的Karlin和Altschul(1990)算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-68)。该算法被并入Altschul等(1990)(J.Mol.Biol.215：403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)中。BLAST核苷酸查询可以使用NBLAST程序、分数100、字长12进行以获得与本发明ITALY核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质查询可以使用XBLAST程序、分数50、字长3进行以获得与本发明ITALY蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了比较目的而进行的带缺口比对，可以使用Alschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的缺口BLAST来实现。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一优选非限制性实例是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。该算法被并入作为GCG序列比对软件包一部分的ALIGN程序(2.0版本)中。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以用PAM120权重残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。
本文中，术语转基因是指这样的核酸序列(编码如一个或多个核心蛋白聚糖多肽)，其对于导入的转基因动物或细胞而言部分或完全异源，即是外来的，或其对于导入的转基因动物或细胞的内源性基因而言是同源的但其插入动物基因组的方式或设计将其插入动物基因组的方式使得它插入的细胞的基因组发生改变(例如，它在不同于天然基因位置的地方插入，或它的插入导致敲除)。转基因可以包括一个或多个转录调节序列和对于编码核心蛋白聚糖的所选核酸在例如乳腺中的最佳表达和分泌可能是必需的任何其它核酸，如内含子(所有这些均可操作地与所选核心蛋白聚糖核酸连接)，并可以包括增强子序列。核心蛋白聚糖序列可以操作性地与组织特异性启动子如导致蛋白质分泌至转基因哺乳动物的奶中的乳腺特异性启动子序列、尿特异性启动子、或卵特异性启动子连接。
本文中，术语转基因细胞”是指含有转基因的细胞。
转基因生物在本文中是指转基因动物或植物。
本文中，“转基因动物”是指其中一个或多个，优选基本上所有的动物细胞都含有通过人为干预(如通过本领域已知的转基因技术)导入的异源核酸的非人动物。该转基因可以借助有意的遗传操作，如显微注射或使用重组病毒进行的感染，直接地或通过导入细胞前体间接地被导入细胞中。
哺乳动物在本文中定义为除人之外具有乳腺并产奶的所有动物。
本文中，“产奶动物”是指产奶的动物。在优选实施方案中，产奶动物产生大量的奶并具有长的泌乳期，如奶牛或山羊。
本文中，术语“植物”是指整株植物、植物的部分、植物细胞或植物细胞群。可以用于本发明方法中的植物类型一般广至适于转化技术操作的高等植物类型，包括单子叶和双子叶植物。它包括多种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体和单倍体。
术语“可药用组合物”是指这样的组合物，其包含与一种或多种可药用载体配制在一起的治疗有效量的转基因核心蛋白聚糖。
本文中，术语“制剂”是指包括转基因核心蛋白聚糖的固体如粉末或液体形式的组合物。制剂可以提供治疗或营养益处。在优选实施方案中，制剂可以包括至少一种非核心蛋白聚糖的营养成分。这些制剂可以含有防腐剂以预防微生物生长。
在本文中，术语“营养食品”是指包括转基因核心蛋白聚糖的食物或食物的部分。营养食品可以提供医学或健康益处，包括预防、治疗或消除疾病。该转基因蛋白常常以至少1mg/kg的浓度存在于营养食品中。营养食品可以包括转基因动物的奶。
本文中，术语“核心蛋白聚糖”是指具有核心蛋白聚糖的至少一种生物学活性的蛋白聚糖或其片段或类似物。如果一个多肽具有如下一个性质则其具有核心蛋白聚糖生物学活性：1)与细胞外基质成分如纤连蛋白(例如纤连蛋白的细胞结合域和/或肝素结合域)、胶原(例如胶原I、II、VI、XIV型)相互作用，如结合；2)调节(如抑制)原纤维生成；3)与血小板反应蛋白相互作用，如结合；3)与表皮生长因子受体相互作用，如结合；4)调节如激活表皮生长因子受体；5)调节如促进或抑制信号传导途径，如促进诱导激酶抑制剂如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的途径；6)与生长因子如TGF-β相互作用，如结合；7)调节如抑制细胞增殖；8)调节如抑制细胞迁移；9)调节细胞粘着；和10)调节基质的装配和组织。优选地，人核心蛋白聚糖是指具有Krusius等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：7683描述的氨基酸序列的核心蛋白聚糖，或其变体。天然的人核心蛋白聚糖具有一个GAG链，位于丝氨酸残基位置，如Krusius等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：7683描述的氨基酸序列的第4位丝氨酸残基位置。此外，天然的人核心蛋白聚糖还可以包括两个至三个天冬酰胺(asparginine)结合的寡糖。见如Glossl(1984)J.Biol.Chem259：14144-14150。
本文中，词“对象”旨在包括人和非人动物。在优选实施方案中，对象是需要核心蛋白聚糖的人，如患者；例如患有与异常TGF-β活性有关的疾病，如癌症、糖尿病性肾病、或侵入性皮肤损伤(如烧伤)的人，或进行了美容或重建手术、或患有结缔组织疾病、与骨丧失或异常骨生长有关的疾病(如成骨不全、骨关节炎)的人。本发明中，术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、反刍动物、鸟类、两栖动物、爬行动物。应用转基因技术在转基因动物奶中商业生产重组蛋白较蛋白生产的传统方法具有显著优势。这些优点包括所需的资本支出总量减少、在产品的发育生命周期的早期不需要资金来修建设施、而且对于复杂蛋白每单位的直接生产成本较低。至关重要的是存在这种可能性，即对于某些复杂蛋白，转基因生产可能是唯一在技术和经济上可行的商业生产方法。
本文中，术语“伤口收缩”是指伤口愈合过程中的一个步骤，其中伤口的边缘被试图拉在一起以闭合伤口(见例如Grinnell，J.CellBiol.124：401-404(1994))。本文中，术语“伤口愈合”具有最广的含义，是指从伤口产生直到与伤口愈合有关的生理特征完全出现的这一整个过程。例如，伤口收缩是伤口愈合过程的一部分。因此，减少或抑制伤口收缩的组合物会增加伤口的愈合。应意识到，伤口愈合并不一定导致损伤组织达到受伤前相同的组织水平。
人类产生糖基化的核心蛋白聚糖和缺少一条或多条GAG链的核心蛋白聚糖。缺少GAG链的核心蛋白聚糖具有生物学活性。转基因生物如动物是无GAG链的核心蛋白聚糖的优选来源，这种核心蛋白聚糖可以导致更为均一的核心蛋白聚糖制品。
从如下详述和权利要求，本发明的其它特征和优点将是明显的。
发明详述
转基因哺乳动物
在这里和如下“实施例”部分中描述了制备非人转基因动物的详细方法。
该方法可以包括将DNA结构导入哺乳动物的生殖系中以制备转基因哺乳动物。例如，可以将一个或几个拷贝的结构通过标准转基因技术整合在哺乳动物胚胎的基因组中。
尽管优选牛和山羊，但也可以使用其它非人哺乳动物。优选的非人哺乳动物是反刍动物，如奶牛、绵羊、骆驼或山羊。优选的非人哺乳动物的其它实例包括马、猪、兔、小鼠和大鼠。对于核转移技术，用作细胞，如遗传改造细胞的来源的哺乳动物将根据预期获得的转基因哺乳动物的不同而不同。例如，应使用牛的基因组来进行牛卵母细胞的核转移。
多种转基因动物的制备方法是本领域已知的。制备转基因山羊的方法是本领域已知的。例如，可以通过显微注射(见例如Ebert等(1994)Bio/Technology 12：699)或核转移技术(见例如PCT公开号WO98/30683)将转基因导入山羊的生殖系。制备转基因猪的方法可以参见White和Yannoutsos，Current Topics in Complement Research：64thForum in Immunology，第88-94页；美国专利5,523,226；美国专利5,573,933；PCT申请WO93/25071；和PCT申请WO95/04744。制备转基因大鼠的方法可以参见Bader和Ganten，Clinical andExperimental Pharmacology and Physiology，增刊3：S81-S87，1996。制备转基因奶牛的方法可以参见美国专利5,741,957、PCT申请WO98/30683，和Transgenic Animal Technology，A Handbook，1994，Carl A.Pinkert编，Academic Press，Inc。制备转基因绵羊的方法可以参见PCT公开WO97/07669，和Transgenic Animal Technology，A Handbook，1994，Carl A.Pinket编，Academic Press，Inc。
转染的细胞系
用于通过核转移制备转基因哺乳动物的遗传改造细胞可以来源于其中已导入了目的核酸如编码蛋白质的核酸的细胞系。
可以通过常规转化或转染技术将构建体导入细胞中。本文中，术语“转染”和“转化”包括用于将转基因序列导入宿主细胞中的各种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、或电穿孔。此外，还可以使用生物学载体，如病毒载体，见如下描述。转化或转染宿主细胞的适宜方法可以见Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manuel，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)和其它适当的实验室手册。
两种有用的方法是电穿孔和脂转染。以下就每一种描述了简要的实例。
可以使用如下操作方法通过电穿孔将DNA构建体稳定地导入供体细胞系如胚胎细胞(如胚胎体细胞系)中：将细胞以约4×106细胞/ml重新悬浮在PBS中，向0.5ml细胞悬液中加入50μg线性化的DNA，并将悬液加入电极间隙0.4cm的小杯(Biorad)中，使用Biorad Gene脉冲电穿孔仪以330伏25mA脉冲、1000microFarad和无穷大电阻进行电穿孔。如果DNA构建体含有用于筛选的新霉素抗性基因，则与350μg/ml G418(GibcoBRL)孵育15天后选择新霉素抗性克隆。
可以使用如下操作方法通过脂转染将DNA构建体稳定地导入供体细胞系中：将约2×105个细胞接种在3.5cm直径的孔中并用2μg线性化的DNA和LipfectAMINETM(GibcoBRL)进行转染。转染后48小时，将细胞按1∶1000和1∶5000分开，如果DNA构建体含有用于筛选的新霉素抗性基因，则加入G418至0.35mg/ml终浓度。分离新霉素抗性克隆并扩增用于冷冻保存和核转移。
蛋白质的组织特异性表达
通常期望使蛋白质如异源蛋白质表达在转基因动物的特异组织或体液如奶、血液或尿中。然后可以从表达此异源蛋白的组织或体液中回收该蛋白。例如，常期望使异源蛋白表达在奶中。在奶特异性启动子控制下产生异源蛋白的方法描述如下。此外，以下还描述了其它组织特异性启动子以及其它调节元件，如信号序列和增加非分泌蛋白的分泌的序列。
奶特异性启动子
有用的转录启动子是优先在乳腺上皮细胞中激活的那些启动子，包括控制编码奶蛋白质如酪蛋白、β-乳球蛋白(Clark等(1989)Bio/Technology 7：487-492)、乳清酸性蛋白(Gordon等(1987)Bio/Technology 5：1183-1187)和乳清蛋白(Soulier等(1992)FEBSLetts.297：13)的基因的启动子。酪蛋白启动子可以来源于任何哺乳动物物种的α、β、γ或κ酪蛋白基因；优选的启动子来源于山羊β酪蛋白基因(DiTullio(1992)Bio/Technology 10：74-77)。奶特异性启动子或在乳腺组织中被特异激活的启动子可以来源于cDNA或基因组序列。优选地，它们来源于基因组。
以上所列乳腺特异基因在至少一种，常常是几种生物中的DNA序列信息是现成的。见如Richards等，J.Biol.Chem.256，526-532(1981)(大鼠α-乳清蛋白)；Campbell等，Nucleic Acids Res.12，8685-8697(1984)(大鼠WAP)；Jones等，J.Biol.Chem.260，7042-7050(1985)(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee和Rosen，J.Biol.Chem.258，10794-10804(1985)(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，Biochem.J.242，735-742(1987)(人α-乳清蛋白)；Stewart，Nucleic Acids Res.12，389(1984)(牛αsl和κ酪蛋白cDNA)；Gorodetsky等，Gene66，87-96(1988)(牛β-酪蛋白)；Alexander等，Eur.J.Biochem.178，395-401(1988)(牛κ酪蛋白)；Brignon等，FEBS Lett.188，48-55(1977)(牛αS2酪蛋白)；Jamieson等，Gene61，85-90(1987)，Ivanov等，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369，425-429(1988)，Alexander等，Nucleic Acids Res.17，6739(1989)(牛β乳球蛋白)；Vilotte等，Biochimie 69，609-620(1987)(牛α乳清蛋白)。关于各种奶蛋白基因的结构和功能的综述见Mercier和Vilotte，J.Dairy Sci.76，3079-3098(1993)(为了所有的目的完整地并入作为参考)。如果其它的侧翼序列对于优化异源蛋白的表达有用，则可以使用现有序列作为探针克隆这些序列。不同生物的乳腺特异性调节序列可以通过使用已知的同源核苷酸序列、或同源蛋白的抗体作为探针筛选这些生物的文库获得。
信号序列
有用的信号序列是奶特异性信号序列或导致真核或原核蛋白分泌的其它信号序列。优选地，该信号序列选自奶特异性信号序列，即它来自编码向奶中分泌的产物的基因。最优选地，奶特异性信号序列与构建体中所用的奶特异性启动子相关，见下述。信号序列的大小不是关键的。所要求的仅是序列具有足够大小以便期望的重组蛋白能够被分泌至如乳腺组织中。例如，可以使用来自酪蛋白如α、β、γ或κ酪蛋白、β乳球蛋白、乳清酸性蛋白和乳清蛋白的编码基因的信号序列。优选的信号序列是山羊β酪蛋白信号序列。
也可以使用来自其它分泌蛋白，如肾细胞、胰腺细胞或肝细胞分泌的蛋白的信号序列。优选地，信号序列导致蛋白质分泌至如尿或血中。
其它组织特异性启动子
可以使用在特定组织中提供表达的其它组织特异性启动子。组织特异性启动子是指该启动子在特定组织中比在其它组织中有更强的表达。组织特异性启动子常常基本上仅在该特异组织中表达。例如，如果使改变的蛋白质正常地在肝中表达，则可以使用肝特异性启动子。在使用抑制型tRNA改变血清白蛋白时就是这样。在此情况下，可以将编码抑制型tRNA的转基因序列置于肝特异性启动子的控制之下。
可以使用的组织特异性启动子包括：神经特异性启动子，如nestin、Wnt-、Pax-1、Engrailed-1、Engrailed-2、Sonic hedgehog；肝特异性启动子，如白蛋白、α-1抗胰蛋白酶；肌肉特异性启动子，如肌细胞生成素、肌动蛋白、MyoD、肌球蛋白；卵母细胞特异性启动子，如ZP1、ZP2、ZP3；睾丸特异性启动子，如鱼精蛋白、fertilin、联会复合体蛋白-1；血液特异性启动子，如球蛋白、GATA-1、胆色素原脱氨基酶；肺特异性启动子，如表面活性剂蛋白C(surfactantprotein C)；皮肤或毛发特异性启动子，如角蛋白、弹性蛋白；内皮细胞特异性启动子，如Tie-1、Tie-2；和骨特异性启动子如BMP。
此外，可以使用普通启动子在几种组织中进行表达。普通启动子的实例包括β-肌动蛋白、ROSA-21、PGK、FOS、e-myc、Jun-A和Jun-B。
间隔序列(insulator sequence)
用于制备转基因动物的DNA构建体可以包括至少一个间隔序列。术语“间隔子(insulator)”、“间隔序列”和“间隔元件”在本文中可互换使用。间隔元件是隔离位于其作用范围内的基因的转录的控制元件，但它并不干扰(无论是正向还是负向地)基因的表达。优选地，将间隔序列插在待转录的DNA序列的任一侧。例如，可以将间隔子置于启动子5’端约200bp至约1kb，和目的基因的3’末端距离启动子至少约1kb至5kb的位置。间隔序列距离启动子和目的基因3’末端的距离可以由本领域技术人员依据构建体中所用目的基因、启动子和增强子的相对大小来确定。此外，可以将一个以上的间隔序列置于启动子的5’端或转基因的3’末端。例如可以将两个或更多个间隔序列置于启动子的5’端。位于转基因3’端的间隔子或多个间隔子可以位于目的基因的3’末端，或位于3’调节序列如3’非翻译区(UTR)或3’侧翼序列的3’末端。
优选的间隔子是包括鸡β-珠蛋白座位5’末端并相应于鸡的5’组成型超敏位点(描述在PCT公开文本94/23046中，其内容特此并入作为参考)的DNA区段。
DNA构建体
可以将编码异源蛋白的盒组装成构建体，其中包括启动子如组织特异性启动子(如乳腺上皮细胞特异的启动子，如酪蛋白启动子，如山羊β酪蛋白启动子)、奶特异性信号序列如酪蛋白信号序列(如β-酪蛋白信号序列)和编码异源蛋白质的DNA。
该构建体还可以在编码非分泌蛋白的DNA序列的下游包括3’非翻译区。该区域可以稳定此表达系统的RNA转录本，由此增加表达系统产生的目的蛋白的产量。可在用于本发明的构建体中使用的3’非翻译区有提供polyA信号的序列。这些序列可以来源于如SV40小T抗原、酪蛋白的3’非翻译区，或本领域熟知的其它3’非翻译序列。在一方面，该3’非翻译区来源于奶特异性蛋白质。该3’非翻译区的长度不是关键的但其对polyA转录本的稳定作用似乎对于稳定表达序列的RNA是重要的。
任选地，该构建体可以在启动子和编码信号序列的DNA序列之间包括5’非翻译区。该非翻译区可以与启动子来自相同的控制区，或可以来自不同基因，如它们可以来源于其它合成、半合成或天然来源。同样，它们的特定长度也不是关键的，然而，它们似乎对于提高表达水平是有用的。
该构建体还可以包括优先在乳腺上皮细胞中表达的基因的约10％、20％、30％或更多的N端编码区。例如，该N端编码区可以与所用的启动子相对应，如山羊β-酪蛋白的N端编码区。
可以使用本领域已知的方法制备该构建体。可以将该构建体制备成一个较大质粒的一部分。这种制备使得可以按有效的方式克隆和筛选正确的结构。可以将该构建体置于质粒的方便限制性位点之间，以便它们可以容易地与剩余的质粒序列分开用于整合至期望的哺乳动物中。
药物组合物
可以将本发明的转基因产生的多肽或制品掺入药物组合物中用于缓解、抑制、治疗或预防疾病或病症，如癌症或侵入性皮肤损伤(如烧伤)。该组合物应含有治疗或预防量的转基因产生的核心蛋白聚糖，其包含在可药用载体中或在转基因动物的奶中。
药物载体可以是任何适于将多肽递送给患者的相容、非毒性物质。无菌水、醇、脂、蜡和惰性固体均可用作载体。该药物组合物中还可以加入可药用佐剂、缓冲剂、分散剂等。转基因产生的肽或其它活性剂在药物组合物中的浓度可以有大范围的变化，即从少于约0.1％重量，通常为至少约1％重量，至20％重量或更多。
对于口服给药，活性成分可以以固体剂型如胶囊、片剂和粉末给药，或以液体剂型如酏剂、糖浆和悬浮液给药。可以将活性成分与无活性成分及粉末化载体如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石粉、碳酸镁等等一起包封在明胶囊中。可以加入以提供期望的颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散性或其它已知期望特征的其它无活性成分的实例有氧化铁红、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛、可食用的白色油墨等。可以使用类似的稀释剂制备压缩片剂。片剂和胶囊均可以制备成缓释产品以维持数小时的持续药物释放。压缩片剂可以是糖包衣或薄膜包衣片以掩盖令人不快的味道和使药片避开空气，或可以是肠溶包衣片以便选择性地在胃肠道内崩解。用于口服给药的液体剂型可以含有着色剂和调味剂以便增加患者对它的接受。
对于鼻腔给药，可以将多肽配制成气雾剂。术语“气雾剂”包括任何以气体为载体的悬浮相的本发明化合物，它能够被吸入支气管或鼻通道中。具体地，气雾剂包括气体为载体的悬浮物小滴形式的本发明化合物，可以将其制备在计量给药的吸入器或喷雾器中或弥雾器中。气雾剂还包括悬浮在空气或其它载体气体中的本发明化合物的干粉组合物，例如可以通过从吸入装置向外喷洒来递送的干粉组合物。见Ganderton和Jones，Drug Delivery to the Respiratory Tract，Ellis Horwood (1987)；Gonda (1990) Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 6；273-313；和Raeburn等(1992)J.Pharmacol.Toxicol.Methods 27：143-159。
本发明的药物组合物可以静脉内或口服给药。在一些情况下也可以皮内或肌内给药。对于治疗应用，给患有疾病或紊乱(如癌症或侵入性皮肤损伤)的患者施用足以抑制、防止或减轻疾病的量的该药物组合物。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效量或剂量”。
制剂
制剂包括转基因产生的核心蛋白聚糖。在优选实施方案中，该制剂包括转基因核心蛋白聚糖和至少一种非核心蛋白聚糖的营养成分。营养成分可以是：蛋白质如奶蛋白质；维生素如维生素A、维生素B、维生素D；糖；矿物质如钙、磷、铁。该制剂可以是固体或液体形式。在优选实施方案中，该制剂还包括液体载体，如稀释剂如水。
在优选实施方案中，这些制剂适于通过口服、局部或静脉内或肌内途径给予对象。制剂对于治疗和/或营养应用是有用的。
营养食品
可以将转基因核心蛋白聚糖包括在营养食品中。优选地，该食物是从转基因哺乳动物得到的奶或奶产品，或从转基因植物得到的植物部分，所述转基因哺乳动物和转基因植物均表达本发明的转基因蛋白。其它营养食品的实例包括但不限于含有本发明转基因蛋白的甜点、雪糕、布丁和果冻，以及汤和饮料。此外，本发明的分离的转基因蛋白质可以以粉末或片剂的形式，与或不与其它添加剂、载体、填充剂和稀释剂一起提供。营养食品描述在Scott Hegenhart，Food ProductDesign，1993年12月。
转基因植物
转基因生物可以是将转基因DNA插入了核或质体基因组中的转基因植物。植物转化是本领域已知的。一般参见Methods in Enzymology，第153卷(“Recombinant DNA Part D”)1987，Wu和Crossman编，Academic Press和欧洲专利申请EP 693554。
可以利用微量吸管通过显微注射机械地将外来核酸直接转移至植物细胞中。可以通过使用聚乙二醇与遗传物质形成沉淀复合物然后由细胞摄取该复合物的方式将外来核酸转移至植物细胞中(Paszkowski等(1984)EMBO J.3：2712-22)。
可以通过电穿孔(Fromm等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：5824)将外来核酸导入植物细胞。在此技术中，在含有相关遗传结构的质粒或核酸存在的情况下电穿孔植物的原生质体。高场强的电脉冲可逆地使生物膜通透从而允许导入质粒。经电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁、分裂并形成植物愈伤组织。可以使用表型标记筛选带有转化基因的转化植物细胞。
花椰菜花叶病毒(CaMV)也可以作为载体用于将外来核酸导入植物细胞(Hohn等(1982)“Molecular Biology of Plant Tumors”，Academic Press，纽约，第549-560页；Howell，美国专利4,407,956)。将CaMV病毒DNA基因组插入亲本细菌质粒中，构建可以在细菌中增殖的重组DNA分子。克隆后，再次克隆重组质粒并进一步通过将期望的DNA序列插入接头的独特限制性位点中修饰该质粒。然后从亲本细菌质粒中切除该重组质粒的修饰病毒部分，并将其用于接种植物细胞或植物。
将外来核酸导入植物细胞中的另一方法是使用在小珠或颗粒的基质内或在表面上带有核酸的小颗粒进行的高速轰击穿透(Klein等(1987)Nature 327：70-73)。尽管典型地仅需要导入一次新的核酸片段，但该方法尤其适用于多次导入。
将核酸导入植物细胞的优选方法是用核酸转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染植物细胞、外植体、分生组织或种子。转化的植物细胞可以在本领域已知的适宜条件下培养以形成茎、根并进一步发育成植株。核酸可以通过例如根癌农杆菌的Ti质粒导入适宜的植物细胞中。在根癌农杆菌进行感染时Ti质粒被运送到植物细胞，并稳定地整合到植物基因组中(Horsch等，(1984)“功能性外来基因在植物中的遗传”，Science 233：496-498；Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803)。
Ti质粒含有两个对于转化细胞的产生必需的区域。一个命名为转移DNA(T DNA)，其诱导肿瘤的形成。另一个称作致病区，是将T DNA导入植物中所必需的。转移至植物基因组中的转移DNA区域可以因外来核酸序列的插入而增大但不影响其转移能力。通过除去致瘤基因以便它们不再产生干扰作用，然后可以将此修饰的Ti质粒用作载体将本发明的基因结构转移至适宜的植物细胞中。
目前至少有三种不同的使用农杆菌转化植物细胞的方法：(1)将农杆菌与培养的分离原生质体一起共培养；(2)用农杆菌转化细胞或组织；或(3)用农杆菌转化种子、茎尖或分生组织。第一种方法需要建立允许培养原生质体和从培养的原生质体再生植物的培养系统。第二种方法需要植物细胞或组织可以被农杆菌转化并且转化的细胞或组织可以被诱导再生成全株植物。第三种方法需要进行微繁。
在二元系统中，为了具有感染性，需要两个质粒：含有T-DNA的质粒和vir质粒。大量含有T-DNA的质粒均可以使用，唯一的要求是这两个质粒能够独立地进行筛选。
转化植物细胞或植物后，可以通过适宜的表型标记选择经Ti质粒转化以致整合了期望DNA片段的那些植物细胞或植物。这些表型标记包括，但不限于，抗生素抗性、除草剂抗性或外观。其它表型标记是本领域已知的并可以用于本发明。
可以对能从中分离出原生质体并能培养产生整个再生植株的植物进行转化，以便回收含有转移的外来基因的全株。一些适宜的植物包括例如草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Lihum)、老鹤草属(Geranium)、木薯(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotianan)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、Ciohorium、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Hererocallis、Nemesia、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、(Salpiglossis)、香瓜属(Cucumis)、(Browaalia)、大豆属(Glycine)、黑麦草属(Lolium)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、高梁属(Sorghum)和曼陀罗属(Datura)。
许多植物都可以从培养的细胞或组织再生。术语“再生”在本文中是指从植物细胞、植物细胞群、植物部分或植物块(如从原生质体、愈伤组织、或组织部分)长成全株植株(Methods in Enzymology第153卷(“Recombinant DNA Part D”)1987，Wu和Grossman编，AcademicPress；和Methods in Enzymology，第118卷；和Klee等(1987)Annual Review of Plant Physiology，38：467-486)。
从培养的原生质体再生植物描述在Evans等，“原生质体分离和培养”，Handbook of Plant Cell Cultures 1：124-176(MacMillanPublishing Co.纽约1983)；M.R.Dayey，“植物原生质体培养和再生的最新发展”，原生质体(Protoplasts)(1983)-Lecture Proceedings，第12-29页(Birkhauser，Basal 1983)；P.J.Dale，“谷物和其它难培养的作物的原生质体培养和植物再生”，原生质体(1983)-LectureProceedings，第31-41页(Birkhauser，Basal 1983)；和H.Binding，“植物再生”，Plant Protoplasts，第21-73页(CRC Press，BocaRaton 1985)。
从原生质体再生对于不同的植物物种是不同的，但一般首先产生含有外源序列拷贝的转化原生质体的悬浮物。在某些物种中，然后可以从原生物质体悬浮物诱导胚胎形成，直至与天然胚胎一样的成熟和萌芽阶段。培养基可以含有多种氨基酸和激素，如生长素和细胞分裂素。在培养基中加入谷氨酸和脯氨酸也可能是有利的，尤其是对于玉米和紫花苜蓿这样的物种。茎和根正常情况下同时发育。有效的再生取决于培养基、基因型和培养历史。如果可以控制这三个变量，则完全可复制和重复再生过程。
在营养繁殖的作物中，可以通过采取插条或通过培养技术繁殖成熟的转基因植物以产生大量一致的植物用于试验，如测试生产特征。选择期望的转基因植物，由此得到新的品种，然后可以通过营养繁殖用于商业出售。在种子繁殖作物中，使成熟的转基因植物自交以产生纯合的近交植物。该近交植物产生含有新引入的外来基因的种子以致可以检测该基因的活性水平。可以培养这些种子以得到具有所选表型的植物。根据本发明的近交植物可以用于开发新的杂种植物。在该方法中使选择的近交系和另一近交系杂交以产生杂种植物。
从再生植物得到的部分，如花、种子、叶、枝条、果实等均包括在本发明内，只要这些部分包含由此转化的细胞即可。再生植物的后代和变种、及突变体只要包含引入的DNA序列，也包括在本发明范围内。再生植物的后代和变种、及突变体也包括在本发明范围内。
然而，赋予引入的核酸片段具有抗降解性质、有助于基因组整合或为容易地筛选转化细胞或植物提供方法的任何其它连接的载体序列均是有利的，它们将极大地降低筛选可用转基因植物或植物细胞的困难。
转基因植物或植物细胞的筛选典型地基于肉眼观察分析，如观察颜色的改变(例如白花、不同的色素产生、和花上具有一致的色彩图案或不规则的图案)，但也可以涉及有关酶活性的生化分析或产物定量。使转基因植物或植物细胞长成具有目的植物部分的植物，并检测基因活性，如通过外观(对于类黄酮基因)或生物化学分析(Northern印迹；Western印迹；酶学分析和类黄酮化合物分析，包括光谱法，见Harborne等(编)(1975)The Flavonoids，第1和2卷[Acad.Press])进行检测。选择适宜的植物并进一步进行评价。制备遗传改造植物的方法还描述在美国专利5,283,184、美国专利5,482,852和欧洲专利中请EP693554中。
从奶中纯化
转基因蛋白质可以在奶中以相对高的浓度大量产生，从而连续高水平地产出正常加工的肽，而该肽可以容易地从可再生来源收获得到。有几种本领域已知的不同方法可用于从奶中分离蛋白质。
奶蛋白常常通过多种方法的组合进行分离。首先通过例如撇去油脂、离心、沉淀(H.E.Swaisgood，Developments in Dairy Chemistry，I：Chemistry of Milk Protein，Applied Science Publishers，NY，1982)、酸沉淀(美国专利4,644,056)或使用凝乳酶或胰凝乳蛋白酶进行酶促凝结(Swaisgood，同上)，将原奶分级分离以去除脂肪。接着，可以将主要的奶蛋白分级分离为清澈溶液或大块沉淀物，从中可以容易地纯化出目的特定蛋白质。
法国专利2487642描述了从脱脂奶或乳清通过膜超过滤及排阻层析或离子交换层析分离奶蛋白。首先通过用凝乳酶或乳酸进行凝结除去酪蛋白得到乳清。美国专利4,485,040描述了通过两个连续的超过滤步骤从乳清中将富含α-乳球蛋白的产物分离在滞留物中。美国专利4,644,056提供了通过如下方式从奶或初乳中纯化免疫球蛋白的方法，所述方式是在pH4.0-5.5进行酸沉淀、随后首先在0.1-1.2微米孔径的膜上交叉流过滤以澄清产物库，然后在分离界限5-80kd的膜上交叉流过滤以进行浓缩。
类似地，美国专利4,897,465教导了通过在改变的pH下各金属氧化物膜上连续超过滤从血清、卵黄或乳清中浓缩和富集蛋白质如免疫球蛋白的方法。首先在低于所选蛋白质等电点(pI)的pH下进行过滤以从蛋白滞留物中除去大块杂质，接着在高于所选蛋白pI的pH下过滤以滞留杂质并使所选蛋白通过进入透过液。欧洲专利467482B1教导了不同的过滤浓缩方法，其中将脱脂奶的pH降低至3-4(低于奶蛋白的pI)，以溶解酪蛋白和乳清蛋白。然后通过三个连续的超过滤或渗滤循环浓缩蛋白质以形成含有15％至20％固体的滞留物，其中所述固体的90％是蛋白质。或者，英国专利申请2179947公开了通过超过滤浓缩样品，随后在近中性的pH下进行弱阳离子交换层析从乳清分离乳铁蛋白(lactoferrin)。没有报道纯度的测量。PCT公开号WO95/22258中公开了通过加入浓缩盐将奶调节至高离子强度，随后进行阳离子交换层析从奶中回收蛋白质如乳铁蛋白。
在所有这些方法中，均首先对奶或其部分进行处理以除去脂肪、脂类、和其它会淤塞滤膜或层析介质的颗粒物。由此产生的最初分级分离物可以由酪蛋白、乳清或总的奶蛋白组成，然后可以从中分离出目的蛋白质。
PCT专利公开号WO94/19935公开了通过用正电荷试剂如精氨酸、咪唑或Bis-Tris增加总奶蛋白的溶解度从全奶中分离生物活性蛋白的方法。该处理后形成澄清溶液，从中可以通过例如膜过滤分离蛋白质，否则膜将会被沉淀的蛋白质淤塞。
USSN 08/648,235公开了从全奶或奶分级分离物中通过切向流过滤分离生物活性形式的可溶性奶成分如肽的方法。与前述分离方法不同，此方法消除了首先分级分离全奶以去除脂肪和酪蛋白微胶粒的需要，由此简化了方法并避免了回收率和生物活性的损失。该方法可以和其它纯化步骤一起使用以进一步除去杂质和纯化目的成分。
核心蛋白聚糖的序列
本文中，术语“核心蛋白聚糖”是指具有核心蛋白聚糖的至少一种生物学活性的蛋白聚糖或其片段或类似物。如果一个多肽具有一个如下性质则它具有核心蛋白聚糖生物学活性：1)与细胞外基质成分如纤连蛋白(例如纤连蛋白的细胞结合域和/或肝素结合域)、胶原(例如胶原I、II、VI、XIV型)相互作用，如结合；2)调节如抑制原纤维生成；3)与血小板反应蛋白相互作用，如结合；3)与表皮生长因子受体相互作用，如结合；4)调节如激活表皮生长因子受体；5)调节如促进或抑制信号传导途径，如促进诱导激酶抑制剂如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的途径；6)与生长因子如TGF-β相互作用，如结合；7)调节如抑制细胞增殖；8)调节如抑制细胞迁移；9)调节细胞粘着；和10)调节基质装配和组织。
编码核心蛋白聚糖的序列是已知的。优选地，人核心蛋白聚糖是指具有Krusius等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：7683描述的氨基酸序列的核心蛋白聚糖，或其变体。天然的人核心蛋白聚糖具有一条GAG链，位于丝氨酸残基位置，如Krusius等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：7683描述的氨基酸序列的第4位丝氨酸残基位置。此外，天然的人核心蛋白聚糖还可以包括两个至三个天冬酰胺(asparginine)结合的寡糖。见如Glossl(1984)J.Biol.Chem259：14144-14150。
核心蛋白聚糖的片段和类似物
转基因产生的核心蛋白聚糖可以具有天然蛋白质的氨基酸序列或它可以是天然蛋白质的片段或类似物。
在一个优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖多肽与天然核心蛋白聚糖在氨基酸序列上相差多达，但不超过1、2、3、5或10个残基。在其它实施方案中，所述核心蛋白聚糖多肽与天然核心蛋白聚糖在氨基酸序列上相差多达，但不超过1、2、3、5或10％的残基。在优选实施方案中，这些差异的存在使得该核心蛋白聚糖表现出核心蛋白聚糖的生物学活性。在其它优选实施方案中，这些差异的存在使得该核心蛋白聚糖多肽不具有核心蛋白聚糖的生物学活性。在优选实施方案中，一个或多个、或全部的差异是保守性氨基酸改变。在其它优选实施方案中，一个或多个、或全部的差异不是保守性氨基酸改变。
在优选实施方案中，所述核心蛋白聚糖多肽是全长核心蛋白聚糖多肽的片段，如天然核心蛋白聚糖多肽的片段。
在优选实施方案中，该片段长至少5、10、20、50、100或150个氨基酸；该片段的长度等于或小于200、150、100、50个氨基酸残疾；该片段具有天然核心蛋白聚糖的生物学活性；该片段是天然核心蛋白聚糖生物学活性的激动剂或拮抗剂；该片段可以抑制，如竞争性或非竞争性地抑制核心蛋白聚糖与受体或酶的结合。
在优选实施方案中，该片段与天然核心蛋白聚糖的相应氨基酸序列有至少60、更优选至少70、80、90、95、99、100％的序列一致性。
在优选实施方案中，该片段是脊椎动物，如哺乳动物，如灵长类动物，如人核心蛋白聚糖多肽的片段。
在一个优选实施方案中，该片段的氨基酸序列与天然核心蛋白聚糖的相应残基相差多达，但不超过1、2、3、5或10个残基。在其它优选实施方案中，该片段的氨基酸序列与天然核心蛋白聚糖的相应残基相差多达，但不超过1、2、3、5或10％的残基。在优选实施方案中，这些差异的存在使得该片断表现出核心蛋白聚糖的生物学活性。在其它优选实施方案中，这些差异的存在使得该片断不具有核心蛋白聚糖的生物学活性。在优选实施方案中，一个或多个、或全部的差异是保守性氨基酸改变。在其它优选实施方案中，一个或多个、或全部的差异不是保守性氨基酸改变。
本发明多肽包括因存在多个基因、可选择的转录事件、可选择的RNA拼接事件、和可选择的翻译和翻译后事件而导致的那些多肽。
片段和类似物的制备
本领域技术人员可以通过制备片段或类似物改变本公开的核心蛋白聚糖结构，并测试该新产生的结构的活性。用于产生和测试片段和类似物的现有技术方法的实例讨论如下。这些或其它方法均可以用于制备并筛选核心蛋白聚糖多肽的片段和类似物。在优选实施方案中，所修饰的核心蛋白聚糖结构是人的核心蛋白聚糖。
片段的产生
可以利用几种方法制备蛋白质片段，例如重组、蛋白水解消化、或化学合成。多肽的内部或末端片段可以通过从编码该多肽的核酸的一端(对于末端片段)或两端(对于内部片段)除去一个或多个核苷酸来制备。通过表达诱变的DNA可以产生肽片段。用“末端啃食(end-nibbling)”内切核酸酶消化可以产生编码一组片段的DNA。编码蛋白质片段的DNA还可以通过随机剪切、限制性消化或上述方法的组合产生。
也可以使用本领域已知技术如常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学，通过化学途径合成片段。例如，可以按意愿将本发明肽分成具有期望长度的不相重叠片段，或分成具有期望长度的重叠片段。
类似物的制备：通过随机方法制备改变的DNA和肽序列
蛋白质的氨基酸序列变体可以通过随机诱变编码蛋白质或蛋白质的特定域或区的DNA来制备。有用的方法包括PCR诱变和饱和诱变。也可以通过合成一组简并寡核苷酸序列制备随机氨基酸序列变体文库。(在变体文库中筛选蛋白质的方法见本文的其它地方。)
PCR诱变
在PCR诱变中，使用忠实性降低的Taq聚合酶向克隆的DNA片段中引入随机突变(Leung等，1989，Technique 1：11-15)。这是引入随机突变的一种极为有力且相对快速的方法。使用聚合酶链式反应(PCR)在降低DNA合成忠实性的条件下，如使用5的dGTP/dATP比例和向PCR反应物中加入Mn2+，通过Taq DNA聚合酶扩增待诱变的DNA区域。将扩增的DNA片段库插入适宜的克隆载体中以提供随机突变文库。
饱和诱变
饱和诱变使得可以快速地向克隆的DNA片段中引入大量的单碱基替代(Mayers等，1985，Science 229：242)。该技术涉及通过例如体外化学药品处理或辐射单链DNA，和合成互补DNA链来制备突变体。可以通过调节处理程度来调节突变频率，并可以获得基本上所有可能的碱基替代。由于该方法不涉及遗传筛选突变片段，因此可以获得中性替代以及引起功能改变的那些替代。点突变的分布并不偏向于保守序列元件。
简并寡核苷酸
还可以从一组简并寡核苷酸序列产生同系物文库。可以在自动DNA合成仪上化学合成简并序列，然后将合成的基因连接至适宜的表达载体中。简并寡核苷酸的合成是本领域已知的(见例如，Narang，SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等(1981)Recombinant DNA，Proc3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，编AG Walton，Amsterdam：Elsevier第273-289页；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等(1984)Science 198：1056；Ike等(1983)NucleicAcids Res.11：477)。该技术已用于定向进化其它蛋白质(见例如Scott等(1990)Science 249：386-390；Roberts等(1992)PNAS89：2429-2433；Devlin等(1990)Science 249：404-406；Cwirla等(1990)PNAS 87：6378-6382；以及美国专利5,223,409、5,198,346和5,096,815。)
类似物的制备：通过定向诱变制备改变的DNA和肽序列
可以使用非随机的或定向的诱变技术在特定区域中提供特定序列或突变。这些技术可用以产生变体，其包括如蛋白质已知氨基酸序列中残基的缺失、插入或替代。可以通过如下方法单独地或连续地修饰突变位点，所述方法为例如：(1)首先用保守氨基酸，然后根据要达到的结果选择较为极端的氨基酸进行替代，(2)缺失靶残基，或(3)将相同或不同类型的残基插在该确定位置的邻近，或选项1-3的组合。
丙氨酸扫描诱变
丙氨酸扫描诱变是鉴定能在期望蛋白质中作为进行诱变的优选位置或域的某些残基或区域的有用方法，(Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085，1989)。在丙氨酸扫描中，确定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并由中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或苯丙氨酸)进行替代。氨基酸替代可以影响氨基酸与细胞内或外的周围水性环境的相互作用。然后通过在替代位置或向此位置导入额外的或其它的变异，精确确定出表现出功能对替代敏感的那些域。因此，尽管要预先确定导入氨基酸变体的位置，但不需预先确定突变本身的性质。例如，为了优化指定位置处突变的表现，可以在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，然后筛选具有最佳期望活性组合的表达的期望蛋白质亚基变体。
寡核苷酸介导的诱变
寡核苷酸介导的诱变是制备DNA的替代、缺失和插入变体的一种有用方法，见例如Adelman等(DNA 2：183，1983)。简单地说，通过编码突变的寡核苷酸与DNA模板杂交来改变目的DNA，其中所述模板是含有目的蛋白质的未改变的或天然的DNA序列的单链形式质粒或噬菌体。杂交后，使用DNA聚合酶合成模板的另一条完整互补链，该链由此将并入该寡核苷酸引物，并将在目的蛋白质的DNA中编码选定的改变。一般地，使用长至少25个核苷酸的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸将在编码突变的核苷酸的每一侧有12至15个核苷酸与模板完全互补。这保证该核苷酸可以正确地与单链DNA模板分子杂交。使用本领域已知的技术可以容易地合成这些寡核苷酸，参见Crea等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75；5765[1978])。
盒式诱变
制备变体的另一个方法是盒式诱变，该方法基于Well等(Gene，34；315[1985])描述的技术进行。起始物是包括待突变的蛋白质亚基DNA的质粒(或其它载体)。确定蛋白亚基DNA中待突变的密码子。在该确定的突变位点每一侧必需有单一的限制性内切核酸位点。如果没有这样的限制性位点存在，则可以使用上述寡核苷酸介导的诱变方法在目的蛋白亚基DNA的适宜位置引入突变以产生这些位点。在向质粒中引入限制性位点后，在这些位点切割质粒以使之线性化。使用标准程序合成编码两个限制性位点之间的DNA序列但包含期望突变的双链寡核苷酸。这两条链先使用标准技术单独合成然后杂交在一起。此双链寡核苷酸被称作盒。此盒被设计具有与线性化质粒的两个末端相容的3’和5’末端，以便它可以直接与质粒连接。该质粒现含有突变的目的蛋白亚基DNA序列。
组合诱变
还可以使用组合诱变(combinatorial mutagenesis)制备突变体。例如，将一组同系物或其它相关蛋白质的氨基酸序列进行比对，优选以促进最大可能的同源性。可以选择在比对序列的指定位置出现的所有氨基酸构建一组简并组合序列。通过核酸水平上的组合诱变产生此多样的变体文库，该文库由一个多样的基因文库编码。例如，可以通过酶学方法将合成的寡核苷酸的混合物与基因序列连接，以便该组潜在的简并序列能够作为单独的肽表达，或者作为含有该组简并序列的较大融合蛋白组表达。
用于筛选肽片段或同系物文库的初次高通量方法
本领域已知多种技术可以用于筛选产生的突变基因产物。筛选大基因文库的技术常包括将基因文库克隆在可复制的表达载体中，用所获载体文库转化适宜的细胞，然后在如下条件下表达基因，在所述条件下目的活性(例如在此情况下，核心蛋白聚糖与核心蛋白聚糖互相作用多肽如核心蛋白聚糖受体的相互作用如结合，或候选多肽与核心蛋白聚糖多肽的相互作用如结合)的检测有利于相对容易地分离出编码检测其产物的基因的载体。以下描述的所有技术均适宜高通量分析筛选大量的构建(如通过随机诱变技术)序列。
双杂交系统
双杂交分析如上述系统(和本文所述的其它筛选方法一样)可以用于鉴定与核心蛋白聚糖相互作用物结合的核心蛋白聚糖肽片段或类似物。这些可以包括激动剂、超激动剂、和拮抗剂。
展示文库
在筛选分析的一个方法中，将候选肽展示在细胞或病毒颗粒表面上，然后在“淘选分析”中检测特定细胞或病毒颗粒通过展示产物与适宜受体蛋白结合的能力。例如，可以将基因文库克隆在细菌细胞的表面膜蛋白的基因中，并通过淘选检测所获融合蛋白(Ladner等，WO88/06630；Fuchs等(1990)Bio/Technology 9：1370-1371；和Goward等(1992)TIBS 18：136-140)。以类似方式，可以使用可检测的标记配体以评价潜在的功能肽同系物。可以使用荧光标记配体如受体，以检测保留配体结合活性的同系物。使用荧光标记配体使得可以在荧光显微镜下肉眼观察细胞并对其进行分离，或在细胞形态学允许的情况下通过荧光激活细胞分拣器分离细胞。
可以将基因文库以融合蛋白形式表达在病毒颗粒表面。例如，在丝状噬菌体系统中，可以将外来肽序列表达在感染性噬茵体的表面，由此赋予了两个显著优点。第一，由于可以以大大超过每毫升1013个噬菌体的浓度将这些噬茵体应用于亲和基质，故一次可以筛选大量噬菌体。其次，由于每个感染性噬菌体均在其表面展示有基因产物，因此如果以低产量从亲和基质回收了特定噬菌体，则可以通过另一轮感染扩增该噬菌体。几乎一致的大肠杆菌丝状噬菌体M13、fd和f1是最常用于噬菌体展示文库的组。噬菌体gIII或gVIII衣壳蛋白均可以用于产生融合蛋白，而不破坏病毒颗粒的最终包装。外来表位可以在pIII的NH2端表达，然后可以从缺少该表位的大量噬茵体中回收带有此表位的噬菌体(Ladner等，PCT公开号WO 90/02909；Garrard等，PCT公开号WO 92/09690；Marks等(1992)J.Biol.Chem.267：16007-16101；Griffiths等(1993)EMBO J 12：725-734；Clackson等(1991)Nature352：624-628；和Barbas等(1992)PNAS 89：4457-4461)。
一种常见方法使用大肠杆菌的麦芽糖受体(外膜蛋白，LamB)作为肽融合伙伴(Charbit等(1986)EMBO 5，3029-3037)。将寡核苷酸插入编码LamB基因的质粒中以产生融合在该蛋白的其中一个细胞外环中的肽。这些肽可以和配体如抗体结合，并可以在将细胞施用给动物后引起免疫应答。其它细胞表面蛋白，如OmpA(Schorr等(1991)Vaccines91，第387-392页)、PhoE(Agterberg等(1990)Gene 88，37-45)、和PAL(Fuchs等(1991)Bio/Tech 9，1369-1372)，以及大的细菌表面结构均已被作为载体用于肽展示。可以将肽和菌毛蛋白(聚合以形成菌毛——细菌之间交换遗传信息的管——的蛋白质)(Thiry等(1989)Appl.Environ.Microbiol.55，984-993)相融合。由于其在与其它细胞的相互作用中的作用，菌毛为肽向细胞外环境的呈递提供了有力的支持。用于肽展示的另一个大的表面结构是细菌动力器官，鞭毛。将肽和鞭毛蛋白亚基融合可在宿主细胞上提供具有许多肽拷贝的密集阵列(Kuwajima等(1988)Bio/Tech.6，1080-1083)。其它细菌物种的表面蛋白也已被用作肽融合伙伴。实例包括葡萄球菌属(Staphylococcus)的蛋白A和萘瑟氏球菌(Neisseria)的外膜蛋白酶IgA(Hansson等(1992)J.Bacteriol.174.4239-4245和Klauser等(1990)EMBO J.9，1991-1999)。
在上述丝状噬菌体系统和Lamb系统中，肽和其编码DNA通过将该DNA包含在其表面上带有该肽的颗粒(细胞或噬茵体)中发生物理联系。捕获该肽就捕获了该颗粒和其中的DNA。另一可替代方案使用与DNA结合的蛋白质LacI以在肽和DNA之间形成联系(Cull等(1992)PNASUSA 89：1865-1869)。该系统使用含有在3’末端带有寡核苷酸克隆位点的LacI基因的质粒。在阿拉伯糖控制性地诱导时，产生LacI-肽融合蛋白。该融合物保留了LacI结合称作LacO操作基因(LacO)的短DNA序列的天然能力。通过在表达质粒上放置两个拷贝的LacO，LacI-肽融合物可以紧密地与编码它的质粒结合。由于每个细胞中质粒仅含有一个寡核苷酸序列，并且每个细胞仅表达一个肽序列，所以该肽与指导其合成的DNA序列之间具有特异和稳定的关系。温和裂解文库细胞，使肽-DNA复合物暴露于具有固定化受体的基质以回收含有活性肽的复合物。然后将结合的质粒DNA重新导入细胞中以便扩增和DNA测序以确定肽配体的身份。作为该方法实际应用的一个例证，一个大的十二肽随机文库被制备出来，并在针对阿片样肽强啡肽B产生的单克隆抗体上进行选择。回收了大量的肽，所有的肽通过相应于强啡肽B的一个六残基部分的共有序列相关联。(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89-1869)。
此方案有时称作质粒上的肽(peptides-on-plasmids)，它和噬菌体展示方法有两个重要的方面不同。首先，这些肽结合在融合蛋白的C端，导致文库成员展示为具有游离羧基端的肽。但丝状噬菌体衣壳蛋白pIII和pVIII均通过它们的C端锚定在噬菌体上，而客体肽(guest peptide)被置于向外延伸的N端域中。在一些设计中，噬菌体展示肽恰好出现在融合蛋白的氨基端(Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6378-6382)。第二个不同之处在于影响文库中实际存在的肽群体的生物偏依性。LacI融合分子被限制在宿主细胞的细胞质中。噬茵体衣壳融合蛋白在翻译过程中短暂地暴露在细胞质中，但很快通过内膜分泌进入周质间隙，并通过其C端疏水域锚定在膜中，而含有肽的N端突出在外周质中等待组装成噬菌体颗粒。LacI和噬茵体文库中的肽由于暴露于不同的蛋白水解活性而会显著不同。噬菌体衣壳蛋白在整合于噬菌体中之前需要跨内膜运输和接受信号肽酶的加工。某些肽对这些过程有不利的影响，因此在文库中将得不到充分代表(Gallop等(1994)J.Med.Chem.37(9)：1233-1251)。此特定偏依性的因素在LacI展示系统中并不存在。
重组随机文库中存在的小肽的数量是巨大的。常规制备的文库具有107-109个独立文库。大到具有1011个重组体的文库也已构建出来，但该大小达到了克隆文库的实际极限。对文库大小的限制发生在用含有随机化区段的DNA转化宿主细菌细胞这一步。为了绕开此限制，近来开发了一种基于将新生肽展示在多核糖体复合物上的体外系统。该展示文库方法能够产生比目前现有噬菌体/噬菌粒或质粒文库大3至6个数量级的文库。而且，该文库的构建、肽的表达和筛选均以完全无细胞的形式进行。
在此方法的一个应用中(Gallop等(1994)J.Med.Chem.37(9)：1233-1251)，构建编码1012个十二肽的DNA分子文库，并在大肠杆菌S30体外转录/翻译偶联系统中表达该文库。选择条件以使核糖体停留在mRNA之上，致使相当大比例的RNA积聚在多核糖体中并产生含有仍与其编码RNA连接的新生肽的复合物。这些多核糖体足够稳固，以致可以按与筛选较为常规的重组肽展示文库相类似的方法在固定化受体上对其进行亲和纯化。从结合的复合物中回收RNA，并将其转化成cDNA，并通过PCR扩增以产生用于下一轮合成和筛选的模板。该多核糖体展示方法可以和噬菌体展示系统偶联。在几轮筛选后，将从富集的多核糖体库得到的cDNA克隆在噬茵粒载体中。该载体既作为肽表达载体展示与衣壳蛋白融合的肽，也作为DNA测序载体用于鉴定肽。通过在噬菌体上表达该来源于多核糖体的肽，既可以以此形式继续亲和筛选程序，又可以在噬菌体ELISA中分析各克隆上的肽的结合活性，或在完全噬菌体ELISA中分析结合特异性(Barret等(1992)Anal.Biochem.204，357-364)。为了鉴定活性肽的序列，可以对此噬菌粒宿主产生的DNA进行测序。
二次筛选
上述高通量分析之后可以进行二次筛选以便确定其它的生物学活性，例如以允许本领域技术人员区分激动剂与拮抗剂。所用二次筛选的类型将取决于需要进行测试的目的活性。例如，可以开发一种分析方法，在该方法中可以利用对目的蛋白质和其相应配体之间的相互作用造成抑制的能力从上述一种初次筛选所分离的肽片段群中鉴定出拮抗剂。
因此，用于产生片段和类似物并测试它们的活性的方法是本领域已知的。一旦鉴定出目的核心序列，即可由本领域技术人员常规地进行操作以获得类似物和片段。
本发明进一步通过如下实施例进行举例说明，这些实施例不应以任何方式理解为构成限制。本申请全文中引用的所有引用文献(包括参考文献、颁布的专利、公开的专利申请、和共同待决专利申请)的内容均特此明确地并入作为参考。
实施例核心蛋白聚糖结构的构建
用BspHl部分消化含有1.7kb人核心蛋白聚糖cDNA的pGEMDec，并将退火的寡核苷酸BSPHXH01和BSPHXH02(分别是，CATGCTCGAGCCGCCAC(SEQ ID NO：1)和CATGGTGGCGGCTC GAG(SEQ IDNO：2))连接在人核心蛋白聚糖翻译起始位点紧上游的BspHI位点处。这产生最佳的Kozak核糖体结合序列以及一个XhoI克隆位点。然后对该质粒进行诱变以在人核心蛋白聚糖翻译终止密码子下游2bp处引入一个XhoI位点。然后分离含有完整的人核心蛋白聚糖编码序列的1.1kb XhoI片段，并与XhoI切开的山羊β酪蛋白表达载体BC451连接，产生BC543人核心蛋白聚糖乳腺表达盒。对该质粒进行完全测序以验证方向和可能的突变。
制备注射片段
通过用NotI完全消化从质粒主链中分离出山羊β酪蛋白-人核心蛋白聚糖表达盒，并使用“Wizard”方法进行制备以便用于显微注射。用NotI进行完全消化以从载体主链中分离质粒DNA(100μg)。然后使用l×TAE作为电泳缓冲液(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook，J.1983，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，Cold  Spring Harbor，纽约，Cold Spring HarborLaboratory)在琼脂糖凝胶上电泳消化产物。在UV光(长波长)下观察含有相应于表达盒的DNA片段的凝胶区域。切下含有目的DNA的条带，转移至透析袋中，并通过在1×TAE中电洗脱以分离该DNA。
电洗脱后，将DNA片段浓缩，并根据提供的操作程序使用“WizardDNA纯化系统”(Promega，Cat#A7280)且将其洗脱在125ml显微注射缓冲液(10mM Tris pH 7.5，EDTA 0.2mM)中进行纯化。通过比较性琼脂糖凝胶电泳评价片段浓度。该显微注射片段原液的推导浓度是150ng/ml。仅在原核注射之前将此原液稀释在显微注射缓冲液中，以便终浓度为1.5ng/ml。
显微注射
使CD1雌性小鼠超排卵，并从输卵管中取出受精卵。然后将稀释在显微注射缓冲液中的DNA显微注射至雄原核中。经显微注射的胚胎或在CZB培养基中培养过夜，或被立即转移至假孕受体CD1雌性小鼠的输卵管中。向每个雌性受体转移20至30个二细胞胚胎或40至50个一细胞胚胎，并使之继续发育至足月。
鉴定建立者动物(founder animal)
从尾部组织通过用异丙醇沉淀分离基因组DNA，然后通过聚合酶链式反应(PCR)分析鸡β珠蛋白间隔DNA序列的存在。对于PCR反应，将大约250ng基因组DNA稀释在含有2.5单位Taq聚合酶的50μl PCR缓冲液(20mM Tris pH 8.3，50mM KCl和1.5mM MgCl2，100μM脱氧核苷三磷酸、和各600nM浓度的引物)中，并使用如下温度程序进行反应：
1个循环        94℃       60秒
5个循环        94℃       30秒
               58℃       45秒
               74℃       45秒
30个循环       94℃       30秒
               55℃       30秒
               74℃       30秒
引物对：
GBC332：TGTGCTCCTCTCCATGCTGG(SEQ ID NO：3)
GBC386：TGGTCTGGGGTGACACATGT(SEQ ID NO：4)
对小鼠进行挤奶：
使雌性小鼠自然产仔，并一般在产后7和9天进行挤奶。在挤奶前将小鼠与其幼仔分开大约一小时。这一小时的保持期后，使用25号针头腹膜注射5 i.U.催产素的无菌磷酸缓冲盐水以诱导小鼠泌乳。注射激素后为一至5分钟等待催产素生效的时期。
使用一种抽吸收集系统来挤奶，该系统由一个15ml锥形管组成，该管用中间插有两个18号针头的橡皮塞密封，一个针头的插座形端被插入与人吸乳器连接的橡皮管中。将小鼠放置在笼顶，仅栓住其尾部，并在其它方面不对其进行限制或约束。将另一个针头的插座形端放置在小鼠乳头之上(一次一个)，以便将奶收集在放置于15ml锥形管中的单个eppendorf管中。每收集一个样品后都更换eppendorf管。持续进行挤奶直到获得至少150μl奶为止。收集后，将小鼠放回其幼崽处。
蛋白分析：
按Harlow和Lane，1988，抗体实验室手册(Antibodies，ALaboratory Manual)(Cold Spring Harbor，纽约：Cold SpringHarbor Laboratory)中的描述，使用人核心蛋白聚糖特异性兔多克隆抗体(Chemicon，Cat# AB1909)进行Western印迹分析。
结果
转基因小鼠：
总共显微注射了805个胚胎。624个(77.5％)胚胎在显微注射后存活，将537个胚胎转移至20只假孕受体小鼠中。总共出生142只建立者小鼠(转移胚胎的26.4％)并通过PCR使用特异针对所述间隔序列的引物对其进行了分析。
总共鉴定到15只转基因建立者(10.5％，显微注射胚胎的1.86％)，选择其中的6只进行交配。对于这些品系，人核心蛋白聚糖在奶中表达的情况总结在表1中。
表1：通过Western印迹确定的带有BC543转基因的转基因小鼠的人核心蛋白聚糖表达。N/A，未获得。
    建立者(性别) PCR阳性子代(仅分析了雌性) 通过western印迹分析确定的奶中的人核心蛋白聚糖水平(mg/ml)
    14(F)      0.25
    22(F) 227 0.1
    36(F)      1-1.5
    62(F) 215 2-4
    73(M) 152      N/A5-10
    102(F) 269            0.51-1.5
奶中表达的核心蛋白聚糖的糖基化：
核心蛋白聚糖在带有BC543结构的转基因小鼠的奶中以高水平表达。6个株系中4个以超过1mg/ml的水平表达。在以低水平表达的两个株系中，一个明显是嵌合性的(株系14)，因为没有观察到转基因向后代的转移。转基因表达的核心蛋白聚糖的一个令人吃惊的方面是，它在SDS-PAGE上迁移成位于大约45kd至53kd之间的相对紧密的一组条带，而哺乳动物细胞培养物来源的核心蛋白聚糖迁移成从大约60延伸到120kd的弥散物。转基因表达的核心蛋白聚糖的这种迁移模式与不含糖胺聚糖链的分子相符。
人核心蛋白聚糖在转基因动物奶中以高水平(＞1mg/ml)表达。该转基因表达的人核心蛋白聚糖不含糖胺聚糖侧链。该转基因表达的人核心蛋白聚糖的这种令人意外的性质是非常有用的，因为糖胺聚糖侧链是非常不均一的，其会妨碍达到治疗性重组蛋白的必要均一生产特征。而且，糖胺聚糖链似乎并不是人核心蛋白聚糖的活性所必需的，这正如其在治疗中的使用情况。
转基因山羊的产生和表征
通过转移已显微注射了构建体(如含有与山羊β-酪蛋白基因调节元件可操作地连接的人核心蛋白聚糖基因的BC355载体)的受精山羊卵，制备建立者(F0)转基因山羊。可以使用此部分之后的方法学来制备转基因山羊。
山羊物种和品种：
可使用瑞士山羊，如阿尔卑斯、萨能和吐根堡山羊品种制备转基因山羊。
以下所列部分简单地描述了制备转基因山羊所需的步骤。这些步骤包括使雌山羊超排卵，并与具有生育能力的雄性交配，然后收集受精卵。一旦收集到受精卵后，向一细胞受精胚胎的原核中显微注射DNA结构。将来自一个供体雌性动物的所有胚胎集合在一起，并在可能的情况下将它们转移至单个受体雌性动物体内。
山羊的超排卵：
在第0天通过在耳部皮下植入6mg诺孕美特(Syncromate-B，CEVA Laboratories，Overland Park，KS)使各供体的动情期时间同步化。在头7至9天后给予前列腺素以关闭内源性孕酮的合成。在植入物插入之后第13天开始，3天(每天2次)肌内注射促卵泡激素(FSH-Schering Corp.，Kenilworth，NJ)，总共18mg。在第14天除去植入物。在除去植入物后24小时，在2天内让供体动物与具有生育能力的雄性动物交配几次(Selgrath等，Theriogenology，1990，第1195-1205页)。
胚胎收集：
在配种后第2天(或除去植入物后72小时)进行胚胎收集手术。手术前36小时让超排雌山羊与食物和水隔绝。静脉内给予雌山羊0.8mg/kg安定(Valium)，之后立即静脉内给予5.0mg/kg氯胺酮(Keteset)。手术期间通过气管内管子在2L/分钟氧气中给予三氟溴氯乙烷(2.5％)。沿中线剖腹切开，从中取出生殖道。对黄体(Corporallutea)，直径大于6mm的未破裂卵泡，和卵囊进行计数以评价超排卵结果并预测通过冲洗输卵管应收集到的胚胎数量。将一个套管置于输卵管口处，并用一条3.0 Prolene的临时绷带将其固定在适当位置。将一个20号针头放入子宫内，距离子宫输卵管接合部大约0.5cm。使10至20ml无菌磷酸缓冲盐水(PBS)冲洗流过装有套管的输卵管，然后将其收集在培养皿中。从相反一面重复此过程，然后将生殖道放回腹腔。闭合前，将10-20ml无菌甘油盐水溶液倒入腹腔中以预防粘连。用2.0 Polydioxanone或Supramid进行简单间断缝合以闭合白线，并用无菌创缘夹合拢皮肤。
在立体显微镜上从PBS输卵管冲洗物中收集受精山羊卵，然后在含10％胎牛血清(FBS)(购自Sigma)的Ham氏F12培养基(Sigma，St.Louis，MO)中洗涤。在原核可见的情况下，立即对胚胎进行显微注射。如果原核不可见，则将胚胎置于含有10％FBS的Ham氏F12中，在37℃含5％CO2空气的潮湿气室中短期培养，直到原核可见为止(Selgrath等，Theriogenology，1990，第1195-1205页)。
显微注射程序：
在凹玻片上将一细胞山羊胚胎置于培养基微滴中，覆盖于油下。将具有两个可见原核的受精卵固定在Zeiss垂直显微镜上安装的火焰抛光微量移液管上，该显微镜具有一个使用Normarski光学器件的固定式载物台。在注射缓冲液(Tris-EDTA)中使用细玻璃微针(Selgrath等，Theriogenology，1990，第1195-1205)将目的DNA结构，如含有可操作地与山羊β酪蛋白基因调节元件连接的人核心蛋白聚糖基因的BC355载体，显微注射至原核内。
胚胎发育：
显微注射后，将存活胚胎放入含有10％FBS的Ham氏F12培养基中，然后在含5％CO2空气的潮湿气室中37℃孵育直到受体动物已预备接受胚胎移植为止(Selgrath等，Theriogenology，1990，第1195-1205页)。
制备受体：
通过6mg诺孕美特耳部植入物(Syncromate-B)诱导受体动物的动情期同步。在放入植入物后第13天，给动物单次非超排卵注射(400I.U.)妊娠马血清促性腺激素(PMSG)(购自Sigma)。使受体雌性动物与切除输精管的雄性动物交配以确保动情期同步化(Selgrath等，Theriogenology，1990，第1195-1205页)。
胚胎转移：
将来自一个雌性供体的所有胚胎集合在一起并如果可能将其转移至单个受体中。手术过程与用于上述胚胎收集的手术过程相同，只是并未给输卵管加上套管，使用玻璃微量移液管经输卵管伞将放在最小体积的含有10％FBS的Ham氏F12中的胚胎转移至输卵管腔中。卵巢上具有6个至8个以上排卵点的动物被认为不适合作为受体。与用于供体动物的方法一样进行切开闭合及术后护理(见例如Selgrath等，Theriogenology，1990，第1195-1205页)。
对妊娠和分娩进行监测
在进入动情期第一天后45天通过超声波扫描术确定妊娠。在第110天再进行超声检测以确证妊娠并评价胚胎的应激性。在第130天用破伤风类毒素和梭茵C&D接种妊娠雌性受体山羊。IM(肌内)给予硒和维生素E(Bo-Se)，并皮下给予双氢除虫菌素。在第145天将这些雌山羊转移至干净的羊圈中，并在第约147天诱导分娩前使其适应该环境。在第147天用40mg PGF2a(Lutalyse，Upjohn Company，Kalamazoo Michigan)诱导分娩。IM注射两次，一次注射20mg，4小时后再注射20mg。在第147天第一次注射Lutalyse后昼夜定期观察这些雌山羊。自第二天的早上开始，增加观察次数至每30分钟一次。在第一次注射后30至40小时之间发生分娩。雌山羊分娩后，对其进行挤奶以收集初乳，并证实胎盘的通过。
验证F0动物的转基因性质：
为了筛选转基因F0动物，从两个不同细胞系分离基因组DNA以避免漏掉任何嵌合转基因。嵌合动物定义为不是每个细胞中都具有至少一个拷贝的转基因的雌山羊。因此，从两日龄F0动物采取耳组织样品(中胚层)和血液样品用于分离基因组DNA(Lacy等，A LaboratoryManual，1986，152：第180-183页)。使用特异针对人核心蛋白聚糖基因的引物通过聚合酶链式反应(Gould等，Proc.Natl.Acad.Sci.1989.86：第1934-1938页)并使用随机引发的人核心蛋白聚糖cDNA探针(Feinberg和Vogelstein，Anal.Bioc.，1983，132：第6-13页)通过Southern印迹分析(Thomas，Proc Natl.Acad.Sci.1980.77：5201-5205)分析这些DNA样品。估计测试灵敏度为能在10％体细胞中检测到1个拷贝的转基因。
生产畜群的产生和筛选
可以使用上述程序制备转基因建立者(F0)山羊，以及其它转基因山羊。例如，可以对转基因F0建立者山羊进行培育，如果是雌性建立者则用于产奶，或者如果是雄性建立者则用于制备转基因雌性子代。可以将该转基因雄性建立者与非转基因雌山羊配种，以产生转基因雌性后代。
转基因和相关特征的传递
通过PCR和Southern印迹在耳组织和血液中分析目的转基因在此山羊系中的传递。例如，雄性建立者和三个转基因子代的Southern印迹分析显示两代之间没有出现重排或在拷贝数方面改变。这些Southern印迹使用人核心蛋白聚糖cDNA探针进行探测。在Betascope603上分析这些印迹并通过该转基因与山羊β酪蛋白内源性基因的比较确定拷贝数。
表达水平的评价
转基因蛋白在转基因动物奶中的表达水平使用酶学测定方法或Western印迹来确定。
本文所引用的所有专利和其它参考文献特此并入作为参考。
其它实施方案在如下权利要求的范围内。

Claims (24)

1.转基因产生的核心蛋白聚糖制品。
2.权利要求1的制品，其中所述核心蛋白聚糖是人核心蛋白聚糖。
3.权利要求1的制品，其中所述核心蛋白聚糖是在转基因动物中产生的。
4.权利要求1的制品，其中所述核心蛋白聚糖是在转基因哺乳动物中产生的。
5.权利要求1的制品，其中所述核心蛋白聚糖是在转基因产奶动物中产生的。
6.权利要求1的制品，其中所述核心蛋白聚糖是在转基因山羊中产生的。
7.权利要求1的制品，其中所述转基因产生的核心蛋白聚糖缺少GAG链。
8.权利要求1的制品，其中所述转基因产生的核心蛋白聚糖是在转基因哺乳动物的乳腺中产生的。
9.转基因产生的核心蛋白聚糖制品，其中该制品中不足30％的核心蛋白聚糖分子具有GAG链。
10.制备转基因核心蛋白聚糖制品的方法，包括：
提供转基因生物，该生物包括指导核心蛋白聚糖表达的转基因；
允许该转基因得以表达；和
从该生物或从该生物产生的产物中回收转基因产生的核心蛋白聚糖制品。
11.权利要求10的方法，其中所述核心蛋白聚糖是人核心蛋白聚糖。
12.权利要求10的方法，其中所述核心蛋白聚糖是在转基因动物中产生的。
13.权利要求10的方法，其中所述核心蛋白聚糖是在转基因哺乳动物中产生的。
14.权利要求10的方法，其中所述核心蛋白聚糖是在转基因产奶动物中产生的。
15.权利要求10的方法，其中所述核心蛋白聚糖是在转基因山羊中产生的。
16.权利要求12的方法，所述转基因产生的核心蛋白聚糖缺少GAG链。
17.权利要求10的方法，其中所述转基因产生的核心蛋白聚糖是在转基因哺乳动物的乳腺中产生的。
18.用于提供在转基因哺乳动物的奶中包括异源核心蛋白聚糖的转基因制品的方法，包括：
从其生殖系中导入了核心蛋白聚糖蛋白编码序列的转基因哺乳动物获得奶，其中所述编码序列可操作地与导致该蛋白编码序列在乳腺上皮细胞中表达的启动子序列连接，籍此将该核心蛋白聚糖分泌至哺乳动物的奶中以提供该制品。
19.转基因生物，其表达转基因核心蛋白聚糖，并且从其中可以获得转基因核心蛋白聚糖制品。
20.包含治疗有效量的转基因核心蛋白聚糖或转基因核心蛋白聚糖制品及可药用载体的药物组合物。
21.制剂，其包括转基因产生的人核心蛋白聚糖和至少一种其它的营养成分。
22.向需要核心蛋白聚糖的对象提供核心蛋白聚糖的方法，包括给所述对象施用转基因产生的核心蛋白聚糖或转基因核心蛋白聚糖制品。
23.权利要求22的方法，其中所述对象患有癌症。
24.权利要求22的方法，其中所述对象患有侵入性皮肤损伤。
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