CN1379782A - 亚单位最优化融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种融合蛋白的制备方法,所述的融合蛋白含有第一种成分,它与第二种成分融合,其中将所述的第一种和第二种成分进行选择以便将该融合蛋白装配成具有可使第二种成分的多聚化形式的活性最优化的亚单位数目的复合体。

Description

亚单位最优化融合蛋白
                      相关申请
本申请要求在先提交的临时申请60/101,083(1998年9月18日提交)的利益，将该文献引入本文作为参考。
                      发明领域
本发明涉及一种含有第一种成分和第二种成分的融合蛋白，其中所述融合蛋白的第二种成分装配成一种多聚体且将另一种成分进行选择或修饰，使得它促进所述第二种成分装配成预选或最优化数量的亚单位。
                      发明背景
融合蛋白可以合并不同蛋白质的有用特性。例如，一种融合蛋白可以将抗体分子的靶向特性与毒素的细胞毒性作用合并。
                      发明概括
一般来说，本发明涉及一种融合蛋白的制备方法，其中所述的融合蛋白含有第一种成分，例如靶向部分、例如免疫球蛋白亚单位(例如免疫球蛋白重链或轻链或其中之一的片段)，它与例如酶、例如毒素(例如酶或毒素的亚单位)这样的第二种成分融合。将所述的第一种成分和第二种成分进行选择，使得所述融合蛋白装配成一种具有大量亚单位的复合体，该复合体可使所述第二种成分的多聚化形式的活性最优化。在优选的实施方案中，所述的第一种成分或所述的融合蛋白装配成具有与存在于所述第二种成分的活性形式、例如天然形式中的数量相同量的亚单位的形式。在优选的实施方案中，所述的第一种成分或所述的融合蛋白装配成具有少于存在于所述第二种成分的活性形式、例如天然形式中的亚单位数量的形式。
在优选的实施方案中，所述的融合蛋白装配成一种复合体，例如二聚化复合体、三聚化复合体、四聚化复合体或四聚化以上的多聚化复合体。优选所述的融合蛋白装配成二聚体或四聚体。
在优选的实施方案中，所述的融合蛋白装配成一种具有酶活性的复合体。
在一个优选的实施方案中，所述的第一种成分是一种单体。例如它通常是单体形式的或例如已经通过使调节亚单位多聚体形成或维持的位点发生突变而修饰的一个种类。在某些优选的实施方案中，所述的单体形式是有用的，因为它可以防止由所述的第二种成分形成多聚体。
在另一个优选的实施方案中，所述的第一种成分是一种二聚体(dimmer)形式、例如异二聚体或同二聚体的形式。例如，它为通常是二聚化形式的或例如已经通过使调节亚单位多聚体形成或维持的位点发生突变而成为二聚体的一个种类。在某些优选的实施方案中，所述的二聚化形式是有用的，因为它可以防止由所述的第二种成分形成多聚体。
在优选的实施方案中，所述的融合蛋白具有下列通式：R1-L-R2；R2-L-R1；R2-R1；或R1-R2，其中R1是第一种成分，例如免疫球蛋白亚单位；L是一种肽接头；且R2是第二种成分，例如酶亚单位。优选R1和R2共价连接、例如它们通过一种肽接头直接融合或连接。
在优选的实施方案中，例如通过取代或缺失部分氨基酸序列来修饰所述融合蛋白中的第一种成分或第二种成分或修饰它们两者。
在一个特别优选的实施方案中，所述的融合蛋白包括属于Ig超家族成员、优选Ig亚单位的第一种成分，已经将其进行了修饰以便抑制例如四聚化形式这样的多聚化形式的形成。优选这种可以是改变、插入或缺失一个或多个氨基酸残基的修饰产生一种亚单位，这种亚单位不会形成多聚体或形成它通常可以形成的低级多聚体、例如它形成二聚体而非四聚体。
优选修饰可介导形成或维持多聚化结构的区且由此使其完全或部分失活。例如，将部分免疫球蛋白亚单位、例如重链、例如铰链区进行修饰，例如使其缺失。在那些修饰、例如除去免疫球蛋白的铰链区的实施方案中，所修饰的免疫球蛋白是单价的。
在优选的实施方案中，对第一种成分的修饰抑制了将第一种成分或融合蛋白装配成多聚体，例如导致产生单体或例如产生二聚体，而其中原本可以形成更高级多聚体。
在优选的实施方案中，所述的第一种成分是一种靶向剂，例如具有对靶物、例如抗体、配体或酶具有高度亲和性的多肽。
在优选的实施方案中，所述的第一种成分是免疫球蛋白或其片段、例如其抗原结合片段。优选的免疫球蛋白是单克隆抗体，例如人、鼠(例如小鼠)单克隆抗体或重组单克隆抗体。优选所述的单克隆抗体是人抗体。在其它实施方案中，所述的单克隆抗体是重组抗体，例如：嵌合或人源化抗体(例如它带有来源于非人抗体(例如鼠)的可变区或至少是互补性决定区(CDR)，剩余部分来源于人)；或转基因生产的人抗体(例如由包括B细胞的杂交瘤产生的抗体，所述的B细胞获自转基因的非人动物，例如转基因小鼠，它具有包括与无限增殖化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组)。
在优选的实施方案，所述的第一种成分是一种全长抗体(例如IgG1或IgG4抗体)或仅包括抗原结合部分(例如Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段)。
在优选的实施方案中，所述的第一种成分是免疫球蛋白亚单位，它选自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgA亚组(sub.sec)、IgD或IgE的亚单位组成的组。优选所述的免疫球蛋白亚单位是IgG同种型、例如IgG3。
在优选的实施方案中，所述的第一种成分是单体、例如单链抗体；或形成二聚体、例如免疫球蛋白重链和轻链的二聚体。
在优选的实施方案中，所述的第一种成分是单价抗体(例如它包括一对重链和轻链或其抗原结合部分)。在其它实施方案中，所述的第一种成分是二价抗体(例如它包括两对重链和轻链或其抗原结合部分)。
在优选的实施方案中，所述的第一种成分包括免疫球蛋白重链或其片段、例如其抗原结合片段。优选所述的免疫球蛋白重链或其片段(例如其抗原结合片段)与酶连接，例如通过肽接头与酶连接或直接与酶融合。优选所述的免疫球蛋白重链-酶融合蛋白能够装配成功能性复合体，例如具有酶活性的二聚化复合体、三聚化复合体、四聚化复合体或多聚化复合体。最优选的形式是二聚体。
在优选的实施方案中，所述的第一种成分包括免疫球蛋白重链或其片段(例如其抗原结合片段)和轻链或其片段(例如其抗原结合片段)。优选所述的免疫球蛋白重链与酶连接，例如通过肽接头与酶连接或直接与酶融合。优选融合的免疫球蛋白重链-酶融合蛋白与轻链一起例如装配成功能性复合体，例如具有酶活性的二聚化复合体、三聚化复合体、四聚化复合体或多聚化复合体。最优选的形式是二聚体。
在优选的实施方案中，所述的第一种成分是与例如癌细胞这样的靶细胞上的细胞表面抗原发生相互作用(例如与之结合)的免疫球蛋白。例如，所述的免疫球蛋白与肿瘤细胞抗原结合，例如癌胚抗原(CEA)、TAG72、her-2/neu、表皮生长因子受体、转铁蛋白受体等等。
在优选的实施方案中，所述的第一种成分定位于例如癌细胞这样的靶细胞附近、例如增加靶细胞附近的融合蛋白的浓度。
在优选的实施方案中，所述的第二种成分是酶的亚单位，例如带有一个或多个亚单位(例如催化亚单位)的酶。优选该酶包括一个、优选两个、更优选三个、最优选四个亚单位。优选的酶是β-葡糖醛酸糖苷酶，例如人β-葡糖醛酸糖苷酶。该酶可以是同多聚体或杂多聚体。如果该酶是杂多聚体，那么需要两种(或多种)融合蛋白形成活性产物。
在优选的实施方案中，所述的第二种成分能够将例如前体药物这样的前药转化成毒性药物。
在优选的实施方案中，所述的第一种成分是免疫球蛋白G(IgG)重链和轻链且所述的第二种成分是人β-葡糖醛酸糖苷酶融合蛋白。
在优选的实施方案中，所述第一种成分的轻链具有附图1B中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)；所述第一种成分的轻链的氨基酸序列与来自附图1B的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)具有至少60％、70％、75％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、99％的序列同一性或同源性。
在优选的实施方案中，所述第一种成分的轻链具有由附图1B(SEQID NO：1)或附图2(SEQ ID NO：37)中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；所述第一种成分的轻链具有由与来自附图1B(SEQ ID NOs：2、3或4)或附图2(SEQ ID NO：37)中所示的核苷酸序列具有至少60％、70％、75％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、99％的序列同一性或同源性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；所述第一种成分的轻链具有由能够在严格条件下与附图1B中所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，所述第一种成分的重链具有如附图4B(SEQID NO：6、7、8、9、10和/或11)或附图5(SEQ ID NOs：13、14、15和/或16)中所示的氨基酸序列；所述第一种成分的重链具有与来自附图4B(SEQ ID NO：6、7、8、9、10和/或11)或附图5(SEQ ID NOs：13、14、15和/或16)的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、99％的序列同一性或同源性的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，所述第一种成分的重链具有由如附图4B(SEQ ID NO：5)或附图5(SEQ ID NO：12)中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；所述第一种成分的重链具有由一种核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述的核苷酸序列与来自附图4B(SEQ ID NO：5)或附图5(SEQID NO：12)中所示的核苷酸序列具有至少60％、70％、75％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、99％的序列同一性或同源性；所述第一种成分的重链具有由能够在严格条件下与附图4B或5中所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述的融合蛋白包括肽接头，且该肽接头具有下列一个或多个特征：a)它使得第一种成分和第二种成分彼此相对旋转；b)它耐受蛋白酶的消化；c)它不与所述的第一种成分或所述的第二种成分发生相互作用；d)它使所述的融合蛋白形成保持酶活性的复合体(例如二聚化复合体、三聚化复合体、四聚化复合体或多聚化复合体)；和e)它促进所述融合蛋白折叠和/或装配成活性复合体。
在一个优选的实施方案中：所述的融合蛋白包括肽接头，且该肽接头具有5-60个氨基酸的长度、更优选具有10-30个氨基酸长度；该肽接头的长度为20个氨基酸；该肽接头的长度为17个氨基酸；该肽接头中的每个氨基酸选自Gly、Ser、Ash、Thr和Ala组成的组；该肽接头包括Gly-Ser元件。
在一个优选的实施方案中，所述的融合蛋白包括肽接头，且该肽接头包括具有通式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y的序列，其中y是1、2、3、4、5、6、7或8。优选所述的肽接头包括具有通式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3的序列。优选所述的肽接头包括具有通式((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro)的序列。
在优选的实施方案中，以重组方式生产所述的融合蛋白，例如在宿主细胞(例如培养的细胞)中或转基因动物体内、例如在转基因哺乳动物(例如山羊、母牛或啮齿动物(例如小鼠)体内生产所述的融合蛋白。
在优选的实施方案中，在转基因哺乳动物(例如山羊、母牛或啮齿动物(例如小鼠)体内生产所述的融合蛋白。因此，该方法包括下列步骤：
提供一种转基因动物，它包括为本文所述的融合蛋白提供表达的转基因；使该转基因得到表达；且优选从所述转基因动物的奶中回收融合蛋白。
就以转基因方式生产所述融合蛋白的实施方案而言，所述的融合蛋白可以进一步包括：
指导所述融合蛋白分泌的信号序列，例如来自分泌蛋白的信号(例如来自分泌入乳的蛋白质的信号或免疫球蛋分泌信号)；和
(可选的)编码分泌蛋白、例如分泌入乳的蛋白或免疫球蛋白的氨基末端编码区充足部分的序列，所述的部分足以促进所述融合蛋白在例如转基因哺乳动物乳中的分泌。
在优选的实施方案中，所述的融合蛋白在转基因哺乳动物、例如反刍动物、例如山羊或母牛的乳腺中生成。
在优选的实施方案中，所述的融合蛋白分泌入转基因哺乳动物、例如反刍动物、例如产奶动物、例如山羊或母牛的奶中。
在优选的实施方案中，所述融合蛋白分泌入转基因哺乳动物的奶，其浓度至少约为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml或5mg/ml以上。
在优选的实施方案中，在乳腺特异性启动子、例如乳特异性启动子、例如乳清蛋白或酪蛋白启动子的控制下制备所述的融合蛋白。乳特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。优选所述的启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在优选的实施方案中，编码所述融合蛋白的转基因是一种核酸构建体，它包括：
(a)可选的，绝缘子序列；
(b)启动子，例如乳腺上皮特异性启动子、例如乳蛋白启动子；
(c)编码可以指导融合蛋白分泌的信号序列的核苷酸序列，所述的信号序列例如是来自乳特异性蛋白或免疫球蛋白的信号；
(d)可选的，核苷酸序列，它编码分泌蛋白、例如分泌入乳的蛋白质或免疫球蛋白的氨基末端编码区的充足部分，该部分足以使所述融合蛋白在例如转基因哺乳动物的乳中分泌；
(e)编码融合蛋白的一种或多种核苷酸序列，所述的融合蛋白例如本文所述的免疫球蛋白-酶融合蛋白；和
(f)(可选的)来自哺乳动物基因、例如乳腺上皮特异性基因(例如乳蛋白基因)的3’非翻译区。
在优选的实施方案中，所述转基因的元件a(如果存在)、b、c、d(如果存在)和f来自相同的基因；所述转基因的元件a(如果存在)、b、c、d(如果存在)和f来自两种或多种基因。例如，信号序列、启动子序列和3’非翻译序列可以来自乳腺上皮特异性基因，例如乳清蛋白或酪蛋白基因(例如β酪蛋白基因)。优选信号序列、启动子序列和3’非翻译序列来自山羊β酪蛋白基因。
在优选的实施方案中，所述转基因的启动子是乳腺上皮特异性启动子，例如乳清蛋白或酪蛋白启动子(例如β酪蛋白启动子)。乳特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。优选所述的启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在优选的实施方案中，由所述转基因编码的信号序列是使蛋白质的表达定向于细胞外部或使其进入细胞膜的氨基末端序列。例如，所述的信号序列可以获自免疫球蛋白。优选所述的信号序列来自分泌入乳、例如转基因动物的乳中的蛋白质。
在优选的实施方案中，编码融合蛋白的一种或多种核苷酸序列包括下列核苷酸序列中的一种或多种：编码可操作地与第二种成分、例如酶连接的第一种成分、例如免疫球蛋白重链(或其抗原结合部分)的核苷酸序列；(可选的)编码免疫球蛋白轻链(或其抗原结合部分)的核苷酸序列；或二者兼之。在一个实施方案中，所述编码重链融合体和轻链的核苷酸序列可操作地与一种单一构建体、例如一种单一粘粒连接。在另一个实施方案中，将编码重链融合体和轻链的核苷酸序列以独立的构建体的形式导入转基因动物。优选在连接时，所述核苷酸序列按照下列次序排列：5’-N1-3’连接5’-N2-3’；或5’-N2-3’连接5’-N1-3’，其中N1是例如可操作地与第二种成分、例如酶连接的的第一种成分、例如免疫球蛋白重链(或其抗原结合部分)；且N2是免疫球蛋白轻链(或其抗原结合部分)。所述核苷酸序列可以呈彼此相对的任意方向，例如正向/正向；反向/反向；正向/反向；或反向/正向。
在优选的实施方案中，所述转基因的3’非翻译区包括聚腺苷酸化位点且获自哺乳动物基因、例如乳腺上皮特异性基因、例如乳清蛋白基因或酪蛋白基因。这种3’非翻译区可以获自酪蛋白基因(例如β酪蛋白基因)、β乳球蛋白基因、乳清酸性蛋白基因或乳清蛋白基因。优选该3’非翻译区来自山羊β酪蛋白基因。
在优选的实施方案中，所述的转基因、例如本文所述的转基因整合入转基因动物的生殖细胞和/或体细胞。
在另一个方面中，本发明涉及一种在转基因哺乳动物的奶中提供以转基因方式生产的融合蛋白、例如本文所述的融合蛋白的方法。该方法包括下列步骤：从转基因哺乳动物中获得奶，它包括编码融合蛋白的转基因，例如已经导入转基因动物生殖系的转基因、例如本文所述的核酸构建体，它们导致在乳腺上皮细胞中表达融合蛋白的蛋白质-编码序列，由此在所述哺乳动物的奶中分泌所述融合蛋白。
在优选的实施方案中，所述的转基因哺乳动物选自绵羊、小鼠、猪、母牛和山羊组成的组。优选的转基因哺乳动物是山羊。
在优选的实施方案中，所述融合蛋白分泌入转基因哺乳动物的奶中，其浓度至少约为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml或5mg/ml以上。
在优选的实施方案中，编码所述免疫球蛋白-酶融合蛋白的转基因是一种核酸构建体，它包括：
(a)可选的，绝缘子序列；
(b)启动子，例如乳腺上皮特异性启动子、例如乳蛋白启动子；
(c)编码可以指导融合蛋白分泌的信号序列的核苷酸序列，所述的信号序列例如是来自乳特异性蛋白或免疫球蛋白的信号；
(d)可选的，核苷酸序列，它编码分泌蛋白、例如分泌入乳的蛋白质或免疫球蛋白的氨基末端编码区的充足部分，该部分足以使所述非分泌蛋白在例如转基因动物的乳中分泌；
(e)编码融合蛋白的一种或多种核苷酸序列，所述的融合蛋白例如本文所述的融合蛋白；和
(f)可选的，来自哺乳动物基因、例如乳腺上皮特异性基因(例如乳蛋白基因)的3’非翻译区。
在优选的实施方案中，所述转基因的元件a(如果存在)、b、c、d(如果存在)和f来自相同的基因；所述转基因的元件a(如果存在)、b、c、d(如果存在)和f来自两种或多种基因。例如，信号序列、启动子序列和3’非翻译序列可以来自哺乳动物基因、例如乳腺上皮特异性基因，例如乳清蛋白或酪蛋白基因(例如β酪蛋白基因)。优选信号序列、启动子序列和3’非翻译序列来自山羊β酪蛋白基因。
在优选的实施方案中，所述转基因的启动子是乳腺上皮特异性启动子，例如乳清蛋白或酪蛋白启动子(例如β酪蛋白启动子)。乳特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。优选所述的启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在优选的实施方案中，由所述转基因编码的信号序列是使蛋白质的表达定向于细胞外部或使其进入细胞膜的氨基末端序列。优选所述的信号序列来自分泌入乳、例如转基因动物的乳中的蛋白质。
在优选的实施方案中，编码融合蛋白的一种或多种核苷酸序列包括下列核苷酸序列中的一种或多种：编码与酶融合的免疫球蛋白重链(或其抗原结合部分)的核苷酸序列；编码免疫球蛋白轻链(或其抗原结合部分)的核苷酸序列；或二者兼之。在一个优选的实施方案中，所述编码重链融合体和轻链的核苷酸序列在一种单一构建体、例如一种单一粘粒中可操作地连接。在另一个实施方案中，将编码重链融合体和轻链的核苷酸序列以独立的构建体的形式导入转基因动物。优选在连接时，所述核苷酸序列按照下列次序排列：5’-N1-3’连接5’-N2-3’；或5’-N2-3’连接5’-N1-3’，其中N1是与酶连接的免疫球蛋白重链(或其抗原结合部分)；且N2是免疫球蛋白轻链(或其抗原结合部分)。所述核苷酸序列可以呈彼此相对的任意方向，例如正向/正向；反向/反向；正向/反向；或反向/正向。
在优选的实施方案中，所述转基因的3’非翻译区包括聚腺苷酸化位点且获自哺乳动物基因、例如乳腺上皮特异性基因(例如乳清蛋白基因或酪蛋白基因)。这种3’非翻译区可以获自酪蛋白基因(例如β酪蛋白基因)、β乳球蛋白基因、乳清酸性蛋白基因或乳清蛋白基因。优选该3’非翻译区来自山羊β酪蛋白基因。
在优选的实施方案中，所述的转基因、例如本文所述的转基因整合入转基因动物的生殖细胞和/或体细胞。
在另一个方面中，本发明涉及一种转基因、例如一种核酸构建体、优选一种分离的核酸构建体，它包括：
(a)可选的，绝缘子序列；
(b)启动子，例如乳腺上皮特异性启动子、例如乳蛋白启动子；
(c)编码可以指导融合蛋白分泌的信号序列的核苷酸序列，所述的信号序列例如是来自乳特异性蛋白或免疫球蛋白的信号；
(d)可选的，核苷酸序列，它编码分泌蛋白、例如分泌入乳的蛋白质或免疫球蛋白的氨基末端编码区的充足部分，该部分足以使所述融合蛋白在例如转基因哺乳动物的乳中分泌；
(e)编码融合蛋白的一种或多种核苷酸序列，所述的融合蛋白例如本文所述的融合蛋白；和
(f)可选的，来自哺乳动物基因、例如乳腺上皮特异性基因(例如一种乳蛋白基因)的3’非翻译区。
在优选的实施方案中，所述转基因的元件a(如果存在)、b、c、d(如果存在)和f来自相同的基因；所述转基因的元件a(如果存在)、b、c、d(如果存在)和f来自两种或多种基因。例如，信号序列、启动子序列和3’非翻译序列可以来自哺乳动物基因、例如乳腺上皮特异性基因，例如乳清蛋白或酪蛋白基因(例如β酪蛋白基因)。优选信号序列、启动子序列和3’非翻译序列来自山羊β酪蛋白基因。
在优选的实施方案中，所述转基因的启动子是乳腺上皮特异性启动子，例如乳清蛋白或酪蛋白启动子(例如β酪蛋白启动子)。乳特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。优选所述的启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在优选的实施方案中，由所述转基因编码的信号序列是使蛋白质的表达定向于细胞外部或使其进入细胞膜的氨基末端序列。优选所述的信号序列来自乳特异性蛋白或免疫球蛋白。优选所述的信号序列指导编码的融合蛋白分泌入转基因动物、例如转基因哺乳动物的乳中。
在优选的实施方案中，编码融合蛋白的一种或多种核苷酸序列包括下列核苷酸序列中的一种或多种：编码与酶融合的免疫球蛋白重链(或其抗原结合部分)的核苷酸序列；编码免疫球蛋白轻链(或其抗原结合部分)的核苷酸序列；或二者兼之。在一个实施方案中，所述编码重链融合体和轻链的核苷酸序列一种单一构建体、例如一种单一粘粒中可操作地连接。在另一个实施方案中，将编码重链融合体和轻链的核苷酸序列以独立的构建体的形式导入转基因动物。优选在连接时，所述核苷酸序列按照下列次序排列：5’-N1-3’连接5’-N2-3’；或5’-N2-3’连接5’-N1-3’，其中N1是与酶连接的免疫球蛋白重链(或其抗原结合部分)；且N2是免疫球蛋白轻链(或其抗原结合部分)。所述核苷酸序列可以呈彼此相对的任意方向，例如正向/正向；反向/反向；正向/反向；或反向/正向。
在优选的实施方案中，所述转基因的3’非翻译区包括聚腺苷酸化位点且获自哺乳动物基因、例如乳腺上皮特异性基因(例如乳清蛋白基因或酪蛋白基因)。这种3’非翻译区可以获自酪蛋白基因(例如β酪蛋白基因)、β乳球蛋白基因、乳清酸性蛋白基因或乳清蛋白基因。优选该3’非翻译区来自山羊β酪蛋白基因。
在另一个方面中，本发明涉及一种编码融合蛋白、例如本文所述的融合蛋白的核酸分子。
在优选的实施方案中，核酸具有附图1B(SEQ ID NO：1)、附图2(SEQID NO：37)、附图4B(SEQ ID NO：5)或附图5(SEQ ID NO：12)中所示的核苷酸序列；所述核酸的核苷酸序列与附图1B(SEQ ID NO：1)、附图2(SEQID NO：37)、附图4B(SEQ ID NO：5)或附图5(SEQ ID NO：12)中所示的核苷酸序列具有至少60％、70％、75％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、99％的序列同一性或同源性；该核酸具有能够在严格条件下与附图1B、附图2、附图4B或附图5所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述的核酸具有编码如附图1A(SEQ IDNOs：2、3、4)、附图4B(SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11)或附图5(SEQID NO：13、14、15、16)中所示氨基酸序列的核苷酸序列；所述核酸具有编码下列氨基酸序列的核苷酸序列，所述的氨基酸序列与来自附图1A(SEQ ID NOs：2、3、4)、附图4B(SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11)或附图5(SEQ ID NO：13、14、15、16)的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、99％的序列同一性或同源性。
在另一个方面中，本发明涉及一种宿主细胞、例如一种分离的宿主细胞(例如培养的细胞)，它包括本发明的核酸(例如核酸或转基因、例如本文所述的核酸构建体)。
在另一个方面中，本发明涉及本文所述的融合蛋白或其纯化的制品。
在另一个方面中，本发明涉及含有治疗有效量的融合蛋白、例如本文所述的融合蛋白和药物上可接受的载体的药物或营养(nutraceutical)组合物。
在一个优选的实施方案中，所述的组合物包括奶。
在另一个方面中，本发明涉及一种包括编码融合蛋白的转基因、例如编码本文所述融合蛋白的转基因的转基因动物。
优选的转基因动物包括：哺乳动物；鸟类动物；爬行动物；有袋类动物；和两栖动物。合适的哺乳动物包括：反刍动物；有蹄类动物；养驯的哺乳动物；和产奶的哺乳动物。特别优选的动物包括：小鼠、山羊、绵羊、骆驼、兔、母牛、猪、马、牛和美洲驼。合适的鸟类包括小鸡、鹅和火鸡。如果转基因蛋白分泌入转基因动物的奶，那么该动物每年应能够产至少1升、且更优选至少10升或100升的奶。优选所述的转基因动物是反刍动物，例如山羊、母牛或绵羊。最优选的转基因动物是山羊。
在优选的实施方案中，所述的转基因哺乳动物具有包含可编码融合蛋白的转基因、例如编码本文所述融合蛋白的转基因的生殖细胞和体细胞。
在优选的实施方案中，在转基因动物体内表达的融合蛋白处于乳腺特异性启动子、例如乳特异性启动子、例如乳清蛋白或酪蛋白启动子的控制下。乳特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。优选所述的启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在优选的实施方案中，所述的转基因动物是哺乳动物且所述的融合蛋白分泌入所述转基因动物的奶中，其浓度至少约为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml或5mg/ml以上。
在另一个方面中，本发明涉及一种含有融合蛋白转基因的转基因生物体的生产方法。该方法包括下列步骤：在生物体细胞中提供或形成一种融合蛋白、例如编码本文所述的融合蛋白的转基因并使所述细胞或其后代产生转基因生物体。
在一个优选的实施方案中，所述的转基因生物体是一种转基因植物或动物。优选的转基因动物包括：哺乳动物；鸟类动物；爬行动物；有袋类动物；和两栖动物。合适的哺乳动物包括：反刍动物；有蹄类动物；养驯的哺乳动物；和产奶动物。特别优选的动物包括：小鼠、山羊、绵羊、骆驼、家兔、母牛、猪、马、牛和美洲驼。合适的鸟类包括小鸡、鹅和火鸡。如果转基因蛋白分泌入转基因动物的奶中，那么该动物每年应能够产至少1升、且更优选至少10升或100升的奶。
在优选的实施方案中，所述的融合蛋白处于乳腺特异性启动子、例如乳特异性启动子、例如乳清蛋白或酪蛋白启动子的控制下。乳特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。优选所述的启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在优选的实施方案中，所述的生物体是哺乳动物且所述的融合蛋白分泌入所述转基因动物的奶中，其浓度至少约为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml或5mg/ml以上。
在另一个方面中，本发明涉及一种选择性杀伤在其表面上表达靶抗原的异常或病态细胞的方法，所述的细胞例如表达细胞表面抗原的癌细胞；该方法包括下列步骤：
使所述异常或病态细胞与有效量的融合蛋白、例如本文所述的融合蛋白接触，其中所述融合蛋白的第一种成分或第二种成分可识别所述的靶抗原，从而可以选择性杀伤所述细胞。
可以将本发明主题的方法用于培养中的细胞、例如体外或离体(ex vivo)的细胞(例如包含癌细胞的培养物)。例如可以在培养基中体外培养细胞，并可以通过向培养基中添加本发明的融合蛋白来完成接触步骤。另一方面，可以对存在于受试者体内的细胞(例如癌细胞)实施该方法，例如作为体内(例如治疗或预防)方案的一部分进行。
在另一个方面中，本发明涉及一种选择性杀伤在其表面上表达靶抗原的异常或病态细胞的方法，所述的细胞例如表达细胞表面抗原的癌细胞；该方法包括下列步骤：
将编码融合蛋白、例如本文所述的融合蛋白的核酸导入所述异常或病态细胞，其中所述融合蛋白的第一种成分或第二种成分可识别所述的靶抗原，从而可以选择性杀伤所述细胞。
可以将本发明主题的方法用于培养中的细胞、例如体外或离体的细胞(例如包含癌细胞的培养物)。例如可以在培养基中体外培养细胞，并可以将本发明的核酸导入培养基。另一方面，可以对存在于受试者体内的细胞(例如癌细胞)实施该方法，例如作为体内(例如治疗或预防)基因疗法方案的一部分进行。
在另一个方面中，本发明提供了一种受试者体内疾病的治疗方法，所述的疾病的特征在于在细胞表面上表达靶抗原的细胞、例如表达靶抗原的癌细胞的生长或活性异常。该方法包括对受试者给予有效量的融合蛋白或编码融合蛋白(例如本文所述的融合蛋白)的核酸的步骤，其中所述融合蛋白的第一种成分或第二种成分可识别所述的靶抗原。
在一个优选的实施方案中，所述疾病的特征在于例如癌细胞、免疫细胞这样的细胞生长或活性异常。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于检测体外或体内样品中靶抗原的存在情况、例如用于诊断疾病的方法。该方法包括下列步骤：(i)在使标记的融合蛋白、例如本文所述的融合蛋白发生相互作用的条件下接触样品或对照样品；和(ii)检测复合体的形成。所述融合蛋白抗体与靶抗原之间复合体的形成与对照样品相比具有统计学显著性的改变，这一结果表示在所述样品中存在靶抗原。
在优选的实施方案中，所述的第二种成分是酶、例如辣根过氧化物酶。
本发明涉及融合蛋白，其中将所述融合体的第一种成分形成多聚体的能力进行选择以便使所述第二种成分的例如活性或溶解性这样的特性最优化。
术语肽、蛋白质和多肽在本文中可以互换使用。
本文所用的多肽的纯化制品、基本上纯的制品或分离的多肽指的是已经与至少一种其它蛋白质、脂类或核酸相分离的多肽，这种多肽与所述其它蛋白质、脂类或核酸一起出现在表达它的细胞或生物体中，例如与转基因动物或转基因动物所产的流体、例如奶或其它物质、例如卵中的蛋白质、脂类或核酸相分离的多肽。优选这种多肽分离自用于纯化它的物质、例如抗体或凝胶基质、例如聚丙烯酰胺。优选这种多肽至少构成所述纯化制品干重的10％、20％、50％、70％、80％或95％。优选所述制品含有：足以进行蛋白质测序的多肽；至少1μg、10μg或100μg的所述多肽；至少1mg、10mg或100mg的所述多肽。
基本上纯的核酸是属于下列核酸中的一种或两种的核酸：与在该核酸所来源的生物体天然基因组中紧密毗邻(即一个在5’末端，一个在3’末端)的序列之一或二者(如编码序列)并不紧密毗邻；或基本上不含在所述核酸所来源的生物体中出现的核酸序列的核酸。该术语例如包括导入载体、例如导入自主复制质粒或病毒或导入原核生物或真核生物的基因组DNA或作为独立于其它DNA序列存在的独立分子(例如通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)的重组DNA。基本上纯的DNA还包括作为编码其它融合蛋白序列的杂种基因的部分的重组DNA。
本文所用的同源性或序列同一性指的是两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。如果第一种序列中的一个位置具有与第二种序列中相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸，那么所述分子在该位置上是同源的(即如本文所用，氨基酸或核酸″同源性″与氨基酸或核酸″同一性″具有相同意义)。两种序列之间的同源性百分比是由所述序列共有的相同位置数的函数(即同源性％＝相同位置的#/总位置的#×100)。
例如，如果两种序列的10个位置中有6个相匹配或同源，那么这两种序列有60％同源或具有60％的序列同一性。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50％的同源性或序列同一性。一般来说，在对两种序列进行序列对比以获得最大同源性或序列同一性时进行比较。
可以使用数学算法在两种序列之间进行序列比较和同源性百分比的测定。用于进行序列比较的数学算法的优选的非限制性实例是Karlin和Altschul在(1990)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：2264-68中所述、由Karlin和Altschul在(1993)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：5873-77中修改的算法。将这类算法引入Altschul等在(1990)《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)215：403-10中所述的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)。可以使用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，得分＝100，字符长度＝12，从而获得与本发明的ITALY核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序进行BLAST蛋白质检索，得分＝50，字符长度＝3，从而获得与本发明的ITALY蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口序列排列，可以如Altschul等在(1997)《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)25(17)：3389-3402中所述使用缺口BLAST。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http：//WWW.ncbi.nlm.nih.gov.。用于进行序列比较的数学算法的另一种优选的非限制性实例是Myers和Miller在CABIOS(1989)中所述的算法。将这类算法引入属于GCG序列对比软件包部分的ALIGN程序(2.0版)。当使用ALIGN程序进行氨基酸序列比较时，可以使用PAM120重量残基表，其中缺口长度罚分为12且缺口罚分为4。
本文所用的术语转基因指的是导入转基因生物体基因组的核酸序列(例如编码一种或多种融合蛋白多肽类)。转基因可以包括一种或多种转录调节序列和诸如内含子这样对编码所述融合蛋白的核酸的最佳表达和分泌而言可能是必不可少的其它核酸。转基因可以包括增强子序列。融合蛋白序列可以可操作地与组织特异性启动子、例如导致所述蛋白在转基因哺乳动物的乳中分泌的乳腺特异性启动子序列、尿特异性启动子或卵特异性启动子相连接。
本文所用的术语″转基因细胞″指的是一种含有转基因的细胞。
本文所用的转基因生物体指的是转基因动物或植物。
本文所用的″转基因动物″是一种非人的动物，其中该动物中的一种或多种细胞、优选基本上所有的细胞含有通过人为干涉、诸如通过本领域中公知的转基因技术导入的转基因。可以通过导入细胞前体、通过谨慎的遗传操作、诸如通过显微注射或通过使用重组病毒感染，将这种转基因直接或间接导入细胞。
本文将哺乳动物定义为不包括人的具有乳腺并可产奶的所有动物。
本文所用的″产奶动物″指的是非人的大于啮齿动物的产奶动物。在优选的实施方案中，所述的产奶动物可产大量的奶并具有较长的分泌乳汁期，例如母牛或山羊。
本文所用的措辞″受试者″包括人和非人动物。本发明中的术语″非人的动物″包括：脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人的灵长类、反刍动物、鸟类、两栖动物、爬行动物和啮齿动物，例如小鼠和大鼠。该术语还包括兔。
本文所用的″转基因植物″是一种植物、优选多细胞的植物或高等植物，其中所述植物中的一种或多种细胞且优选基本上所有的细胞含有通过人为干涉、诸如通过本领域中公知的转基因技术导入的转基因。
本文所用的术语″植物″指的是完整的植物、植物部位、植物细胞或植物细胞群。可以用于本发明方法的植物的种类一般扩展至可使用转化技术的高等植物种类，包括单子叶植物和双子叶植物。它包括各种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体和单倍体。
本文所用的术语″免疫球蛋白″和″抗体″指的是包括通过二硫键相互间连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白。每条重链均由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。该重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链均由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。该轻链恒定区由一个结构域CL组成。可以将所述的VH和VL区进一步再划分成称作互补决定区(CDR)的高变区，其中分散有更为保守的称作构架区(FR)的区域。每条VH和VL均由按照下列顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述的重链和轻链可变区含有与抗原发生相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子、包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和传统补体系统的第一种成分(Clq)的结合。
本文所用的术语抗体的″抗原结合部分″(或简单地″抗体部分″)指的是抗体的保持与抗原(例如靶抗原)特异性结合的能力的一种或多种片段。已经证实可以使用全长抗体的片段实现抗体的抗原结合功能。术语抗体的″抗原结合部分″中包括的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即包括通过铰链区上二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)《自然》(Nature)341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH通过独立的基因编码，但是可以使用重组方法经合成接头连接它们，这种合成接头能够使它们形成一种单蛋白链，其中VL和VH区配对成单价分子(称作单链Fv(scFv)；例如，参见Bird等(1988)《科学》(Science)242：423-426；和Huston等(1988)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85：5879-5883)。这类单链抗体也包括在术语抗体的″抗原结合部分″范围内。使用本领域技术人员公知的常规技术获得这些抗体片段，并按照与完整抗体相同的方式对这些抗体进行用途筛选。
本文所用的术语″单克隆抗体″指的是单分子组成的抗体分子。单克隆抗体组成显示出单一结合特异性和对特定表位的亲和性。因此，术语″人单克隆抗体″指的是显示出单一结合特异性、具有来源于人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。在一个实施方案中，所述的人单克隆抗体由包括获自转基因的非人动物、例如转基因小鼠的B细胞的杂交瘤产生，所述的转基因动物具有包括与无限增殖化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
本文所用的术语″重组人抗体″用以包括通过重组方式制备、表达、生成或分离的所有人抗体，诸如分离自属于对人免疫球蛋白基因进行转基因的动物(例如小鼠)的抗体；使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体；分离自重组、组合人抗体文库的抗体；或通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列在内的任意其它方式制备、表达、生成或分离的抗体。这类重组人抗体具有来源于人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，使这类重组人抗体进行体外诱变(或当使用针对人Ig序列进行了转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，由此重组抗体VH和VL区的氨基酸序列是虽然来源于人生殖系VH和VL序列并与之相关，但可能天然并不存在于体内人抗体生殖系所有组成成分的序列。
核酸在处于与另一种核酸序列发生功能相关性的情况下时是″可操作地连接的″。例如，启动子或增强子可操作地与编码序列连接，条件是它可影响所述序列的转录。就转录调节序列而言，可操作地连接指的是所连接的DNA序列是邻接的，且如果有必要将两种蛋白质编码区相连接，则是邻近并处于阅读框架中。
本文所用的术语″载体″或″构建体″用以指能够转运所连接的另一种核酸的核酸分子。一类载体是″质粒″，它指的是可以连入其它DNA片段的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中其它DNA片段可以连入该病毒的基因组。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。可以将其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时整合入宿主细胞基因组且由此使它们与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这类载体在本文中称作″重组表达载体″(或简单地″表达载体″)。一般来说，在重组DNA技术中应用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，由于质粒是最常用形式的载体，因此″质粒″和″载体″可以互换使用。然而，本发明包括这类其它形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随载体)。
本文所用的术语″重组宿主细胞″(或简单地″宿主细胞″)用以指已经导入了重组表达载体的细胞。应理解这类术语不仅指的是特定的受试者细胞，而且指这类细胞的子代。因为某些改变可以因突变或环境影响而在后续世代中出现，所以这类子代实际上可能与亲代细胞相同，但它们仍然包括在本文所用的术语″宿主细胞″的范围内。
从下列详细描述和权利要求中显然可以得出本发明的其它特征和优点。
详细描述
首先描述附图。
附图1A是含有人源化抗癌胚抗原抗体431轻链(LC)基因组序列的构建体的图解式图。还指出了信号肽序列以及轻链可变区(Vk)和Ck区的位置。也指出了限制酶位点的位置。
附图1B描绘了人源化抗癌胚抗原抗体431轻链的核苷酸和氨基酸序列。指出了限制酶位点的位置。
附图2描绘了含有人源化抗癌胚抗原抗体431轻链的编码序列的SalI插入片段的核苷酸序列。
附图3是包括含有人源化抗癌胚抗原抗体431轻链的编码序列的SalI插入片段的构建体(Bc458)的图解式图。还指出了沉默子、5’β-酪蛋白非翻译区、轻链编码区和3’β-酪蛋白非翻译区的位置。
附图4A是含有与β-葡糖醛酸糖苷酶序列连接的人源化抗癌胚抗原抗体431重链(HC)基因组序列的构建体的图解式图。还指出了信号肽(S)和重链可变区(Vh)和CH1的位置。也指出了限制酶位点的位置。
附图4B描绘了人源化抗癌胚抗原抗体431重链的核苷酸和氨基酸序列。指出了限制酶位点的位置。
附图5描绘了人源化抗癌胚抗原抗体431突变体重链的核苷酸和氨基酸序列。所述的突变体重链缺乏铰链区。指出了限制酶位点的位置。
附图6是含有与β-葡糖醛酸糖苷酶序列连接的人源化抗癌胚抗原抗体431突变体重链的构建体(Bc454)的图解式图。还指出了沉默子、5’β-酪蛋白非翻译区、重链突变体/β-葡糖醛酸糖苷酶融合体编码区和3’β-酪蛋白非翻译区的位置。也指出了限制酶位点的位置。
附图7是构建重链突变体的概述。
附图8是对β-葡糖醛酸糖苷酶进行突变的放大的视图。
本发明至少部分提供了转基因生产的融合蛋白，其中所述融合蛋白中的一种成分装配成多聚体，且对另一种成分进行选择或修饰以便促进装配成最优化数量的亚单位。在一个实施方案中，所述的融合蛋白包括与毒素(例如酶的亚单位)融合的免疫球蛋白亚单位(例如免疫球蛋白重链或轻链)。本文所述的免疫球蛋白-酶融合蛋白用于将细胞毒性剂(例如所述酶)靶向至例如肿瘤细胞这样的不需要的细胞。例如，可以将下面实施例中所述的融合蛋白(即与例如葡糖醛酸糖苷酶这样的酶融合的抗癌胚抗原抗体)用于靶向至肿瘤细胞。在使所述免疫球蛋白-酶融合体定位于肿瘤部位足够的时间后，给予无毒性的前体药物。通过定位于肿瘤部位的靶向酶的作用将这种前体药物转化成具有高度细胞毒性的药物，从而可能达到药物的治疗水平而对患者没有不可接受的毒性。
免疫球蛋白的生产
可以通过各种技术生产针对细胞上例如细胞表面蛋白(例如受体)这样的靶抗原的单克隆抗体，所述的技术包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein在《自然》(Nature)256：495(1975)中所述的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交方法通常是优选的，但是一般也可以使用用于生产单克隆抗体的其它技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化技术。
用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。在小鼠体内产生杂交瘤是一种得到充分确立的方法。免疫接种方案和用于分离融合用免疫脾细胞的技术在本领域中是公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是公知的。
可以使用携带完全人免疫系统而非小鼠系统的转基因小鼠生产针对人蛋白的人单克隆抗体(mAbs)。将来自这些免疫接种了有意义抗原的转基因小鼠的脾细胞用于生产分泌对来自人蛋白的表位具有特异性亲和性的人mAb的杂交瘤(例如，参见Wood等，国际申请号WO91/00906；Kucherlapati等，PCT公开号WO91/10741；Lonberg等人，国际申请号WO92/03918；Kay等人，国际申请号92/03917；Lonberg，N.等，1994《自然》(Nature)368：856-859；Green，L.L.等，1994《自然遗传学》(Nature Genet.)7：13-21；Morrison，S.L.等，1994《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：6851-6855；Bruggenman等，1993，《免疫学年鉴》(Year Immunol.)7：33-40；Tuaillon等，1993，PNAS90：3720-3724；Bruggeman等，1991，《欧洲免疫学杂志》(Eur J Immunol)21：1323-1326)。
还可以通过重组DNA技术领域的技术人员公知的其它方法生产单克隆抗体。已经开发出了另一种称作″组合抗体展示″法的方法以鉴定并分离具有特定抗原特异性的抗体片段，并可以将这种方法用于生产单克隆抗体(就组合抗体展示法的说明而言，例如参见Sastry等，1989PNAS 86：5728；Huse等，1989《科学》(Science)246：1275；和Orlandi等，1989 PNAS 86：3833)。在用如上所述的免疫原对动物进行免疫接种后，克隆所得B-细胞收集物的抗体的所有组成成分。用于通过使用寡聚体引物混合物和PCR获得免疫球蛋白分子多样群体可变区的DNA序列的方法一般是公知的。例如，可以将相当于5’前导(信号肽)序列和/或构架1(FR1)序列的混合寡核苷酸引物以及相当于保守的3’恒定区引物的引物用于对来自大量鼠抗体的重链和轻链可变区进行PCR扩增(Larrick等，1991，《生物技术》(Biotechniques)11：152-156)。还可以将相似的策略用于扩增来自人抗体的人重链和轻链可变区(Larrick等，1991，《方法：与酶学方法的比较》(Method：Companionto Methods in Enzymology)2：106-110)。
在一个解释性实施方案中，使用标准方案从B淋巴细胞例如外周血细胞、骨髓或脾制备物中分离RNA(例如美国专利号US4,683,202；Orlandi，等，PNAS(1989)86：3833-3837；Sastry等，PNAS(1989)86：5728-5732；和Huse等(1989)《科学》(Science)246：1275-1281.)。使用对重链和每条K和X轻链恒定区具有特异性的引物以及用于信号序列的引物来合成cDNA第一链。使用可变区PCR引物以单独或组合的方式扩增重链和轻链的可变区，并将其连入合适的载体，以便进一步在生产展示包装物中进行操作。可用于扩增方案的寡核苷酸引物可以是独有的，或者简并的，或者在简并位置处掺入肌苷。还可以将限制性内切核酸酶识别序列掺入所述引物中，以便将扩增的片段以预定读框的形式克隆入载体中进行表达。
可以用展示包装的群体、优选来源于丝状噬菌体的展示包装的群体表达克隆自免疫接种衍生抗体的所有组成成分的V-基因文库，以便形成抗体展示文库。理想的情况是，这种展示包装包括一种系统，该系统可以对极大的杂化抗体展示文库取样、在每次亲合分离循环后快速分拣并从纯化的展示包装中便利地分离所述抗体。除用于生产噬菌体展示文库的商购试剂盒(例如Pharmacia的重组噬菌体抗体系统(Recombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)之外，特别适用于生产杂化抗体展示文库的方法和试剂的实例也可以在下列文献中找到：例如Ladner等的美国专利号US5,223,409；Kang等，国际公开号WO92/18619；Dower等，国际公开号WO91/17271；Winter等，国际公开号WO92/20791；Markland等，国际公开号WO92/15679；Breitling等，国际公开号WO93/01288；McCafferty等，国际公开号WO92/01047；Garrard等，国际公开号WO92/09690；Ladner等，国际公开号WO90/02809；Fuchs等(1991)《生物技术》(Bio/Technology)9：1370-1372；Hay等(1992)《人抗体杂交瘤》(HumAntibodHybridomas)3：81-85；Huse等(1989)《科学》(Science)246：1275-1281；Griffths等(1993)《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBOJ)12：725-734；Hawkins等(1992)《分子生物学杂志》(J Mol Biol)226：889-896；Clackson等(1991)《自然》(Nature)352：624-628；Gram等(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等(1991)《生物技术》(Bio/Technology)9：1373-1377；Hoogenboom等(1991)《核酸研究》(Nuc Acid Res)19：4133-4137；和Barbas等(1991)PNAS88：7978-7982。
在某些实施方案中，可以在通过柔性接头连接的相同多肽上表达重链和轻链的V区结构域，以便形成单链Fv片段，且随后将scFV基因克隆入所需的表达载体或噬菌体基因组。正如McCafferty等在《自然》(Nature)(1990)348：552-554中一般性描述的，可以将通过柔性(Gly4-Ser)3接头连接的抗体的完整VH和VL结构域用于产生可使得展示包装基于抗原亲和性进行分离的单链抗体。随后可以将对所述抗原具有免疫反应性的分离的scFV抗体配制成用于本发明主题方法的药物制剂。
一旦在展示包装(例如丝状噬菌体)表面进行了展示，则用靶抗原或其肽片段筛选抗体文库，以便鉴定和分离可表达对所述靶抗原具有特异性的抗体的包装。可以从展示包装中(例如从噬菌体基因组中)回收编码筛选的抗体的核酸，并通过标准重组DNA技术将其亚克隆入其它表达载体。
可以按照本领域中公知的方法、例如包括筛选文库的方法(Ladner，R.C.等，美国专利US5,233,409；Ladner，R.C.，等，美国专利US5,403,484)，制备对表面蛋白具有高度亲和性的特异性抗体分子。此外，可以在筛选过程中使用这些文库，以便获得属于抗体结构决定簇模拟物的结合决定簇。
特别地，特定抗体分子的Fv结合表面与其靶配体按照蛋白-蛋白相互作用的原理发生相互作用，由此VH和VL(它们中的后者可以是κ或λ链型)的序列数据是本领域技术人员所公知的蛋白质工程技术的基础。包括结合决定子的蛋白质表面的具体组成可以获自抗体序列信息，该步骤通过使用由NMR研究或结晶数据获得的其它抗体的预定三维结构的建模过程来进行。例如，参见Bajorath，J.和S.Sheriff，1996，《蛋白质：结构、功能和遗传学》(Proteins：Struct.，Funct.，and Genet.)24(2)，152-157；Webster，D.M.和A.R.Rees，1995，“抗体结合位点的分子模拟”(″Molecular modeling ofantibody-combining sites″)-S.Paul，编辑，《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biol.)51：“抗体工程方案”(AntibodyEngineering Protocols)，Humana Press，Totowa，NJ，pp17-49；和Johnson，G.，Wu，T.T.和E.A.Kabat，1995，“Seqhunt：用于筛选比对核苷酸和氨基酸序列的程序”(″Seqhunt：A program to screen alignednucleotide and amino acid sequences″)-《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biol.)51，在所引的文献中的1-15页。
在一个实施方案中，通过一种展示包装群体来表达杂化肽文库，以便形成肽展示文库。理想的情况是，该展示文库包括一种系统，该系统可以对极大的杂化肽展示文库取样、在每次亲合分离循环后快速分拣并从纯化的展示包装中便利地分离编码肽的基因。肽展示文库例如可以位于原核生物体和病毒中，它们可以被快速扩增、相对易于操纵且可以生成大量克隆。优选的展示包装例如包括植物性细菌细胞、细菌孢子，且最优选细菌病毒(尤其是DNA病毒)。然而，本发明还关注包括酵母及其孢子在内的真核细胞作为有潜力的展示包装的用途。噬菌体展示文库如上所述。
其它技术包括亲和色谱法，其中使用合适的″受体″、例如靶抗原，随后通过常规技术(例如质谱法和NMR)鉴定分离的结合剂或配体。优选所述的可溶性受体与可被检测以指示配体结合的标记(例如荧光团、显色酶、放射性同位素或发光化合物)缀合。另一方面，可以选择性释放固定化化合物且允许它们通过膜扩散而与受体发生相互作用。
还可以用″标记″合成化合物的组合文库，以便指示所述文库中每种成分的身份(例如，参见W.C.Still等，国际申请WO94/08051)。一般来说，这种方法的特征在于使用惰性的而便于可检测的标记，它们结合在固体支持物上或与所述化合物连接。当检测活性化合物时，通过鉴定独有的附带标记来确定化合物的身份。这种标记方法可合成化合物的较大文库，就该文库中全部组的所有化合物而言，可以鉴定极低浓度的所述化合物。
术语修饰的抗体还用来包括已经通过例如缺失、添加或取代所述抗体的部分而修饰的抗体，诸如单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。例如，可以通过缺失铰链区来修饰抗体，由此产生单克隆抗体。任意的修饰均属于本发明的范围，条件是所述抗体带有至少一种特异性的抗原结合区。
可以通过本领域中公知的重组DNA技术生产嵌合小鼠-人单克隆抗体(即嵌合抗体)。例如，用限制酶消化编码鼠(或其它种类)单克隆抗体的Fc恒定区的基因，以便除去编码鼠Fc的区，并取代成编码人Fc恒定区的基因的等同部分。(参见Robinson等，国际专利公开号PCT/US86/02269；Akira等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，国际申请WO86/01533；Cabilly等，美国专利号US4,816,567；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等(1988Science 240：1041-1043)；Liu等(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu等，1987，《免疫学杂志》(J.Immunol.)139：3521-3526；Sun等(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等，1987，《癌症研究》(Canc.Res.)47：999-1005；Wood等(1985)《自然》(Nature)314：446-449；和Shaw等，1988，《国家癌症研究所杂志》(J.NatlCancer Inst.)80：1553-1559)。
可以进一步用来自人Fv可变区的等同序列取代并不直接涉及抗原结合的Fv可变区序列，使嵌合抗体人源化。Morrison，S.L.在1985《科学》(Science)229：1202-1207和Oi等在1986《生物技术》(BioTechniques)4：214中提供了对人源化嵌合抗体的一般性综述。那些方法包括分离、操作和表达可编码来自重链或轻链中至少一种的免疫球蛋白Fv可变区的全部或部分的核酸序列。这类核酸的来源对本领域技术人员而言是众所周知的，且例如可以获自一种产生抗-GPIIbIIIa抗体的杂交瘤7E3。然后可以将编码嵌合抗体或其片段的重组DNA克隆入合适的表达载体。另一方面，可以通过CDR取代来生产合适的人源化抗体，参见：美国专利US5,225,539；Jones等1986《自然》(Nature)321：552-525；Verhoeyan等1988《科学》(Science)239：1534；和Beidler等1988《免疫学杂志》(J Immunol.)141：4053-4060。
可以用至少部分非人的CDR来取代特定人抗体的全部CDR，或可以用非人的CDR仅取代特定人抗体的某些CDR。唯一必须的是取代人源化抗体与Fc受体结合所需数量的CDRs。
可以通过任意方法使抗体人源化，所述的方法能够用来源于非人抗体的CDR取代人抗体CDR的至少一部分。Winter描述了一种可以用于制备本发明人源化抗体的方法(英国专利申请GB2188638A，1987年3月26日提交)，特别将该文献的内容引入作为参考。可以使用寡核苷酸定点诱变用非人的CDRs取代人CDRs。
本发明范围内还包括嵌合抗体和人源化抗体，其中已经取代、缺失或添加了特定的氨基酸。特别地，优选的人源化抗体在构架区内具有氨基酸取代，由此可以改善与抗原的结合。例如，在带有小鼠CDRs的人源化抗体中，可以用位于小鼠抗体相应位置上的氨基酸取代位于人构架区中的氨基酸。已知在某些情况中，这类取代可以改善人源化抗体与抗原的结合。已经添加、缺失或取代了氨基酸的抗体在本文中称作已修饰抗体或已改变的抗体。
靶抗原
在优选的实施方案中，本发明融合蛋白中的第一种成分是靶向剂，例如对例如抗体、配体或酶这样的靶物具有高度亲和性的多肽。因此，可以将本发明的融合蛋白用于使该融合蛋白中的第二种成分选择性地定向于(例如定位于)不需要细胞的附近。
例如，所述的第一种成分可以是与靶抗原发生相互作用(例如与靶抗原结合)的免疫球蛋白。在某些实施方案中，所述靶抗原存在于细胞、例如异常细胞、诸如增殖过度细胞(例如癌细胞)的表面上。例示的靶抗原包括癌胚抗原(CEA)、TAG-72、her-2/neu、表皮生长因子受体、转铁蛋白受体等。
本文所用的″靶细胞″应指可以由本发明融合蛋白靶向的受试者(例如人或动物)体内任意不需要的细胞。例示的靶细胞包括肿瘤细胞，诸如癌或腺癌衍生的细胞(例如结肠、乳腺、前列腺、卵巢和子宫内膜癌细胞)(Thor，A.等(1997)《癌症研究》(Cancer Res)46：3118；SoissonA.P.等(1989)《美国妇产科学杂志》(Am.J.Obstet.Gynecol.)：1258-63)。术语″癌″是本领域中公知的，指的是上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。典型的癌包括从宫颈、肺、前列腺、乳腺、头颈、结肠和卵巢的组织中形成的那些癌。该术语还包括癌肉瘤，例如包括由癌组织和肉瘤组织构成的恶性肿瘤。″腺癌″指的是来源于腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺结构的癌。术语″肉瘤″是本领域中公知的，指的是间充质衍生的恶性肿瘤。
融合蛋白的生产
所述融合蛋白的第一种成分和第二种成分可以彼此连接，优选通过接头序列彼此连接。所述的接头序列应隔开所述融合蛋白的第一种成分和第二种成分足够的距离，以确保每种成分适当折叠成其二级和三级结构。优选的接头序列(1)应采取柔性扩展的构象、(2)不应显示出具有发展成可以与功能性第一种成分和第二种成分发生相互作用的有序二级结构的倾向，且(3)应具有可促进与功能性蛋白结构域的相互作用的最低程度的疏水或带电特性。柔性蛋白区中典型的表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser。预计含有Gly、Asn和Ser的氨基酸序列变换可满足接头序列的上述标准。还可以将诸如Thr和Ala这样的其它近中性氨基酸用于所述的接头序列。
可以将长度为20个氨基酸的接头序列用于适当隔开功能性蛋白结构域，不过也可以使用较长或较短的接头序列。隔开第一种成分和第二种成分的接头序列可以为5-500个氨基酸长度，或更优选5-100个氨基酸长度。优选所述的接头序列约为5-30个氨基酸长度。在优选的实施方案中，所述的接头序列约为5-约20个氨基酸，且有利的是约为10-约20个氨基酸。可用作第一种成分和第二种成分的接头的氨基酸序列包括但不限于：(SerGly4)y，其中y大于或等于8；或者Gly4SerGly5Ser。优选的接头序列具有式(SerGly4)4。另一种优选的接头具有序列((Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)3-Ser-Pro)。
第一种成分和第二种成分可以直接融合而不需要接头序列。当融合的蛋白质具有非必需的可以用于隔开功能性结构域和防止空间干扰的N-或C-末端氨基酸区时，接头序列不是必须的。在优选的实施方案中，可以使第一种成分的C-末端与第二种成分的N-末端直接融合，反之也可。
重组生产
可以使用应用编码所述融合蛋白的核酸分子的标准重组DNA技术制备本发明的融合蛋白。可以通过标准DNA合成方法合成编码融合蛋白的核苷酸序列。
可以将编码融合蛋白的核酸导入宿主细胞、例如原代或无限增殖化细胞系的细胞。可以将重组细胞用于生产所述的融合蛋白。例如，可以通过同源重组将编码融合蛋白的核酸导入宿主细胞。在大部分情况中，可以将编码所述融合蛋白的核酸掺入重组表达载体。
可以使编码融合蛋白的核苷酸序列可操作地与基于待用于表达的宿主细胞选择的一种或多种调节序列连接。术语″可操作地连接″指的是编码所述融合蛋白化合物的序列以允许表达所述融合蛋白的方式与所述调节序列连接。术语″调节序列″指的是启动子、增强子和其它表达调控元件(例如聚腺苷酸化信号)。这类调节序列例如描述在下列文献中：Goeddel；《基因表达技术：酶学方法》(Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology)185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)，将该文献的内容引入本文作为参考。调节序列包括那些指导核苷酸序列在许多类型宿主细胞中的组成型表达的调节序列、那些指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的调节序列(例如组织特异性调节序列)和那些以可调节方式指导表达的调节序列(例如仅在有诱导剂存在的情况下)。本领域技术人员可以理解所述表达载体的设计可能取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需融合蛋白的表达水平等这样的因素。可以将融合蛋白表达载体导入宿主细胞而由此产生由核酸编码的融合蛋白。
可以为原核细胞或真核细胞中融合蛋白的表达设计重组表达载体。例如，可以在诸如大肠杆菌这样的细菌细胞、昆虫细胞(例如在杆状病毒表达载体系统中)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达融合蛋白。一些合适的宿主细胞进一步描述在下列文献中：Goeddel；《基因表达技术：酶学方法》(Gene Expression Technology：Methods inEnzymology)185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)。用于在啤酒糖酵母中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari等，(1987)《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)《细胞》(Cell)30：933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)《基因》(Gene)54：113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达融合蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，(1983)《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow，V.A.，和Summers，M.D.，(1989)《病毒学》(Virology)170：31-39)。
哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B.，(1987)《自然》(Nature)329：840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)，《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)6：187-195)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的调控功能通常由病毒调节元件提供。例如，通常使用的启动子来源于多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。
除上述调节控制序列外，所述的重组表达载体还可以含有其它核苷酸序列。例如，所述的重组表达载体可以编码选择标记基因以便鉴定已经导入了所述载体的宿主细胞。此外，为了有利于从宿主细胞、尤其是哺乳动物宿主细胞中分泌所述融合蛋白，所述的重组表达载体可以编码可操作地与编码所述融合蛋白氨基末端的序列连接的信号序列，使得在表达时，合成的融合蛋白尤其氨基末端融合了信号序列。这种信号序列指导所述融合蛋白进入细胞的分泌途径且然后使其裂解，从而从宿主细胞中释放成熟的融合蛋白(即不含所述信号序列的所述融合蛋白)。利用信号序列促进从哺乳动物宿主细胞中分泌蛋白质或肽类在本领域中是公知的。
可以通过常规的转化或转染技术将载体DNA导入原核细胞或真核细胞。本文所用的术语″转化″和″转染″指的是用于将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞的各种本领域的已知技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖-介导的转染法、脂转染法、电穿孔法、显微注射法和病毒介导的转染法。用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可以在Sambrook等《分子克隆实验指南》第2版(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratorypress(1989))和其它实验室指南中找到。
通常仅有小部分哺乳动物将外源DNA整合入其基因组。为了鉴定并筛选这些整合体，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与编码所述融合蛋白的基因一起导入宿主细胞。优选的选择标记包括那些赋予对诸如G418、潮霉素和氨甲蝶呤这样的药物的抗性的选择标记。可以将编码选择标记的核酸与编码所述融合蛋白的核酸在同一载体上导入宿主细胞中，或将其在单独的载体上导入。通过药物筛选可以鉴定用导入的核酸稳定转染的细胞(例如已经掺入了所述选择标记基因的细胞会存活，而其它细胞则死亡)。
可以在体外，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶，转录并翻译重组表达载体。
转基因哺乳动物
用于生产非人的转基因动物的方法如本文所述。可以将DNA构建体导入哺乳动物的生殖系以便产生转基因哺乳动物。例如，可以通过标准转基因技术将所述构建体的一个或几个拷贝导入哺乳动物胚胎的基因组。
通常比较理想的是在转基因哺乳动物的奶中表达转基因蛋白。优选可产大量奶并具有较长的分泌乳汁期的哺乳动物。优选的哺乳动物是：反刍动物，例如母牛、绵羊、骆驼或山羊，例如来源于瑞士的山羊，例如Alpine、Saanen和Toggenburg种山羊。其它优选的动物包括牛、兔和猪。
在一个典型的实施方案中，通过将转基因导入非人动物的生殖系来生产转基因的非人动物。可以在不同的发育阶段将转基因导入胚胎靶细胞。根据所述胚胎靶细胞发育阶段的不同而使用不同的方法。如果可能，应对所用的任何动物的具体品系进行选择以便获得一般良好的健康、良好的胚胎产量、胚胎中良好的原核可见性和良好的繁殖适度。
可以通过诸如显微注射、电穿孔或脂转染这样本领域中公知的各种方式中的任意一种将所述融合蛋白转基因导入所述胚胎。例如，可以通过将所述构建体显微注射入受精的哺乳动物卵的原核而将融合蛋白转基因导入哺乳动物，以使所述构建体的一个或多个拷贝在发育中的哺乳动物细胞中得到保留。在将所述的转基因构建体导入受精卵后，可以在体外将该卵孵育不同的时间，或再植入替代宿主或实施这两个步骤。一种常用的方法是根据种类的不同在体外将胚胎孵育约1-7天，然后将其重新植入替代宿主。
可以通过对组织的部分进行DNA印迹分析来对以转基因方式操作的胚胎的子代测试所述构建体的存在。可以将含有稳定整合入基因组的外源性克隆构建体的一个或多个拷贝的胚胎用于建立携带以转基因方式添加的构建体的永久性转基因哺乳动物品系。
可以在出生后检测以转基因方式改变的哺乳动物的幼崽，以便确定是否所述构建体掺入了所述后代的基因组。该步骤可以通过将相当于编码所述融合蛋白的DNA序列或其片段的探针杂交到来自子代的染色体物质上来进行。将发现在其基因组中含有至少一个所述构建体拷贝的哺乳动物子代生长至成熟。这些子代的雌性种类会在其奶中或与奶一起产生所需的蛋白质。可以将这种转基因哺乳动物繁殖，以产生可用于在其奶中生产所需蛋白质的其它转基因子代。
可以使用本领域中公知的试验技术、例如蛋白质印迹或酶试验对转基因雌性动物的蛋白质分泌入奶的情况进行测试。
其它转基因动物
可以由多种转基因动物表达融合蛋白。用于生产转基因猪的方案可以在下列文献中找到：White和Yannoutsos，“补体研究中的最新主题：第64届免疫学讨论会”(Current Topics in Complement Research：64th Forumin Immunology)，88-94页；美国专利号US5,523,226；美国专利号US5,573,933；PCT申请WO93/25071；和PCT申请WO95/04744。用于生产转基因小鼠的方案可以在美国专利号US5,530,177中找到。用于生产转基因大鼠的方案可以在Bader和Ganten的《临床和实验药理学和生理学》(Clinical and Experimental Pharmacology andPhysiology)增刊3：S81-S87,1996中找到。用于生产转基因母牛的方案可以在《转基因动物技术手册》(Transgenic Animal Technology，AHandbook)1994年版，Carl A.Pinkert，Academic Press，Inc.中找到。用于生产转基因绵羊的方案可以在《转基因动物技术手册》(Transgenic Animal Technology，A Handbook)1994年版，Carl A.Pinkert，Academic Press，Inc.中找到。用于生产转基因兔的方案可以在Hammer等的《自然》(Nature)31：680-683，1985和Taylor和Fan的《生物科学前沿》(Frontiers in Bioscience)2：d298-308，1997中找到。
转基因动物奶中转基因蛋白质的生产
乳特异性启动子
有用的转录启动子是那些优先在乳腺上皮细胞中激活的启动子，包括控制编码诸如酪蛋白、β乳球蛋白(Clark等(1989)《生物/技术》(Bio/Technology)7：487-492)、乳清酸性蛋白(Gorton等(1987)《生物/技术》(Bio/Technology)5：1183-1187)和乳清蛋白(Soulier等，(1992)《FEBS通讯》(FEBS Letts.)297：13)这样的乳蛋白的基因的启动子。可以将任何哺乳动物种类的α、β、γ或κ酪蛋白基因启动子用于提供哺乳动物的表达；优选的启动子是山羊β酪蛋白基因启动子(DiTullio，(1992)《生物技术》(Bio/Technology)10：74-77)。乳特异性蛋白启动子或特异地在乳腺组织中激活的启动子可以分离自cDNA或基因组序列。优选它们是基因组来源。
可以获得至少一种、常常是数种生物体中上述所列乳腺特异性基因的DNA序列信息。例如，参见Richards等，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)256，526-532(1981)(大鼠α-乳清蛋白)；Campbell等，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)12，8685-8697(1984)(大鼠WAP)；Jones等，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)260，7042-7050(1985)(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee&Rosen，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)258，10794-10804(1983)(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，《生物化学杂志》(Biochem.J.)242，735-742(1987)(人α-乳清蛋白)；Stewart，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)12，389(1984)(牛αsl和κ酪蛋白cDNAs)；Gorodetsky等，《基因》(Gene)66，87-96(1988)(牛β酪蛋白)；Alexander等，《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)178，395-401(1988)(牛κ酪蛋白)；Brignon等，《FEBS通讯》(FEBS Lett.)188，48-55(1977)(牛αS2酪蛋白)；Jamieson等，《基因》(Gene)61，85-90(1987)，Ivanov等，《生物学与化学》(Biol.Chem.)Hoppe-Seyler369，425-429(1988)，Alexander等，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)17，6739(1989)(牛β乳球蛋白)；Vilotte等，《生物化学》(Biochimie)69，609-620(1987)(牛α-乳清蛋白)。不同乳蛋白基因的结构和功能由Mercier&Vilotte在《乳品科学杂志》(J.Dairy Sci.)76，3079-3098(1993)中综述(为了全部目的而将这些文献的全部内容引入作为参考)。如果其它侧翼序列可用于优化表达，那么可以使用存在的序列作为探针来克隆这类序列。可以通过使用已知的关联核苷酸序列或针对关联蛋白的抗体作为探针，筛选这类生物体的文库，来获得来自不同生物体的乳腺特异性调节序列。
信号序列
有用的信号序列是乳特异性信号序列或导致原核或真核蛋白分泌的其它信号序列。优选所述的信号序列选自乳特异性信号序列，即它来自编码分泌入乳的产物的基因。最优选所述的乳特异性信号序列与用于本发明表达系统的乳特异性启动子相关。信号序列的大小对本发明而言并不关键。所要求的只是所述序列应具有足以使所需重组蛋白例如在乳腺组织中分泌的大小。例如，来自编码例如α、β、γ或κ酪蛋白、β乳球蛋白、乳清酸性蛋白和乳清蛋白这样的酪蛋白的基因的信号序列可用于本发明。优选的信号序列是山羊β-酪蛋白信号序列。
还可以使用来自其它分泌蛋白，例如免疫球蛋白，或由肝细胞、肾细胞或胰腺细胞分泌的蛋白质的信号序列。
绝缘子序列
本发明的DNA构建体进一步包括至少一种绝缘子序列。术语″绝缘子″、″绝缘子序列″和″绝缘子元件″在本文中可以互换使用。绝缘子元件是可将置于其作用范围内的基因转录绝缘而不会负面或正面影响基因表达的调控元件。优选将绝缘子序列插在所转录的DNA序列的任一侧上。例如，所述的绝缘子可以定位于距启动子5’约200bp-约1kb，距启动子5’约1kb-5kb，目的基因3’末端。绝缘子序列距所述启动子和目的基因3’末端的距离可以由本领域技术人员根据目的基因的相对大小、构建体中所用启动子和增强子的不同来测定。此外，可以有一个以上绝缘子序列位于启动子的5’或位于转基因的3’末端。例如，可以有两个或多个绝缘子序列位于启动子的5’。转基因3’末端的绝缘子可以位于目的基因的3’末端，或3’调节序列、例如3’非翻译区(UTR)或3’侧翼序列的3’末端。
优选的绝缘子是一种包括鸡β-珠蛋白基因座的5’末端且相当于如PCT公开号94/23046中所述的鸡5’组成型超敏位点的DNA区段，将所述文献的内容引入本文作为参考。
DNA构建体
可以由包括对乳腺上皮细胞具有特异性的启动子和编码融合蛋白的DNA的构建体表达融合蛋白，所述的启动子例如酪蛋白启动子、例如山羊β酪蛋白启动子、乳特异性信号序列、例如酪蛋白信号序列、例如β-酪蛋白信号序列。
构建体还可以包括编码非分泌蛋白质的DNA序列3’非翻译区的下游。这类区可以使表达系统中的RNA转录物保持稳定，由此增加来自所述表达系统的所需蛋白质的产量。可用于本发明构建体的3’非翻译区包括提供聚腺苷酸信号的序列。这类序列例如可以来源于SV40小t抗原、酪蛋白3’非翻译区或其它本领域中众所周知的3’非翻译序列。优选所述的3’非翻译区来源于乳特异性蛋白。该3’非翻译区的长度并不关键，而其聚腺苷酸转录物的稳定作用看起来在使表达序列中的RNA保持稳定方面是重要的。
构建体可以包括启动子与编码信号序列的DNA序列之间的5’非翻译区。这类非翻译区可以来自启动子所来源的相同调控区，或来自不同基因，例如，它们可以来源于其它合成、半合成或天然来源。同样，其具体长度并不关键，然而，看起来它们可用于改善表达水平。
构建体还可以包括约10％、20％、30％或30％以上优选在乳腺上皮细胞中表达的基因的N-末端编码区。例如，该N-末端编码区可以相当于所用的启动子、例如山羊β-酪蛋白N-末端编码区。
现有技术的方法可以包括制备一种构建体，并在将该构建体置于转基因动物体内前测试其在培养细胞中产生产物的能力。令人意外的是，本发明者已经发现，这类方案在确定是否例如可以在转基因动物的奶中分泌通常并不分泌的蛋白质方面可能并不具有预计的价值。因此，可能比较理想的是直接在转基因动物、例如转基因小鼠体内测试构建体，因为某些不能在CHO细胞中分泌的构建体却能分泌入转基因动物的乳中。
从奶中纯化
转基因融合蛋白可以以相对高的浓度和较大的体积在奶中产生，从而连续高水平输出易于从可再生来源中收获的正常加工的肽。本领域中存在几种用于从奶中分离蛋白质的不同方法。
通常通过组合方法分离乳蛋白。例如，首先通过撇去、离心、沉淀(H.E.Swaisgood，《乳品化学进展》(Developments in DairyChemistry)，I：“乳蛋白化学”(Chemistry of Milk Protein)，AppliedScience Publishers，NY，1982)、酸沉淀(美国专利号US4,644,056)或使用凝乳酶或胰凝乳蛋白酶的酶凝固(Swaisgood，文献同上)将原料乳分级分离以除去脂肪。下一步可以将主要的乳蛋白分级分离成澄清溶液或大量沉淀物，从其中易于纯化出感兴趣的特定蛋白质。
USSN08/648,235中公开了一种用于通过切向流过滤由全乳或乳级分以生物活性形式分离诸如肽这样的可溶性乳成分的方法。不同于现有的分离方法，这种方法不需要首先将全乳分级分离以除去脂肪和酪蛋白胶团，由此简化了工艺且避免了回收率和生物活性的损耗。可以将这种方法与其它纯化步骤联合使用，以便进一步除去污染物并纯化感兴趣的成分。
转基因动物卵中转基因蛋白的生产
融合蛋白可以在转基因动物的组织、分泌物或其它产物、例如卵中产生。例如，可以使用本领域中公知的方法，在转基因动物、优选转基因火鸡、鸭、鹅、鸵鸟、几内亚鸟(guinea fowl)、孔雀、partridge、pheasant、鸽子且更优选转基因鸡的卵中产生融合蛋白(Sang等，《生物技术趋向》(Trends Biotechnology)，12：415-20，1994)。可以修饰诸如卵黄-蛋白基因和清蛋白-蛋白基因这样的编码在卵中特异性表达的蛋白质的基因，以便指导融合蛋白的表达。
卵特异性启动子
有用的转录启动子是那些优先在卵中活化的启动子，包括调控编码例如卵清蛋白、溶菌酶和抗生物素蛋白这样的卵蛋白的基因的启动子。优选来自鸡卵清蛋白、溶菌酶或抗生物素蛋白基因的启动子。卵特异性蛋白启动子或特异地在卵组织中活化的启动子可以来自cDNA或基因组序列。优选所述的卵特异性启动子来源于基因组。
卵特异性基因的DNA序列在本领域中是公知的(例如，参见Burley等，《鸟类的卵》(″The Avian Egg″)，John Wiley和Sons，472页，1989，将该文献的内容引入本文作为参考)。如果其它侧翼序列可用于优化表达，那么可以使用现有的序列作为探针来克隆这类序列。可以通过使用公知的关联核苷酸序列或针对关联蛋白的抗体作为探针筛选这种生物体文库，来获得来自不同生物体的卵特异性调节序列。
转基因植物
可以在转基因生物体、例如转基因植物、例如DNA转基因插入到核或质体基因组的转基因植物中表达融合蛋白。植物的转化为本领域所公知。通常参见：《酶学方法》(Methods in Enzymology)第153卷(“重组DNA部分D”(″Recombinant DNA Part D″))1987，Wu和Grossman编辑，Academic Press；和欧洲专利申请EP693554。
可以通过几种方法将外源核酸导入植物细胞或原生质体。例如，可以通过使用微量吸管进行显微注射而以机械方式将核酸直接转入植物细胞。还可以通过使用与由细胞吸收的遗传物质形成沉淀复合物的聚乙二醇将外源核酸转入植物细胞(Paszkowski等(1984)《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)3：2712-22)。可以通过电穿孔将外源核酸导入植物细胞(Fromm等(1985)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82：5824)。在这项技术中，在有含有相关遗传构建体的质粒或核酸存在的情况下对植物原生质体实施电穿孔。高场强的电脉冲以可逆方式透化生物膜，从而可导入质粒。电穿孔植物的原生质体重新形成细胞壁、分裂并形成了植物愈伤组织。可以使用表型标记完成被转化基因转化了的植物细胞的筛选。
可以将花椰菜花叶病毒(CaMV)用作将外源核酸导入植物细胞的载体(Hohn等(1982)《植物肿瘤的分子生物学》(″Molecular Biology ofPlant Tumors″)，Academic Press，New York，549-560页；Howell，美国专利号US4,407,956)。将CaMV病毒DNA基因组插入亲代细菌质粒，生成可在细菌中增殖的重组DNA分子。可以通过导入所需的DNA序列来进一步修饰重组质粒。然后从亲代细菌质粒中切下所述重组质粒的经修饰病毒部分，并用于接种植物细胞或植物。
可以将通过小粒子进行高速弹击渗入的技术用于将外源核酸导入植物细胞。将核酸分布在小珠或粒子的基质内或表面上(Klein等(1987)《自然》(Nature)327：70-73)。尽管一般仅需要一次导入新核酸片段，但是本方法还可提供多次导入。
可以通过用根癌农杆菌感染植物细胞、外植体、分生组织或种子而将核酸导入植物细胞，所述的根癌农杆菌用所述核酸进行了转化。在合适的条件下，使转化的植物细胞生长成苗、根并进一步发育成植物。例如，可以通过根癌农杆菌的Ti质粒将该核酸导入植物细胞。所述的Ti质粒在用根癌农杆菌感染时透入植物细胞且稳定地整合入植物基因组(Horsch等(1984)：“植物中功能性外源基因的遗传”(″Inheritance of Functional Foreign Genes in Plants″)，《科学》(Science)233：496-498；Fraley等(1983)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80：4803)。
可以转化可以分离出原生质体并培养成完整再生植物的植物，使得可以回收含有转化的外源基因的完整植物。某些合适的植物例如包括来自草莓属、百脉根属、苜蓿属、驴食豆属、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、柑桔属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、鼠耳芥属、芸苔属、萝卜属、白芥鼠、颠茄属、辣椒属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、碧冬茄属、毛地黄属、Majorana、Ciohorium、向日葵属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、Hererocallis、龙面花属、天竺葵属、稷属、狼尾草属、毛茛属、千里光属、Salpiglossis、香瓜属、Browaalia、大豆属、黑麦草属、玉蜀黍属、小麦属、蜀黍属和曼陀罗属的品种。
从培养的原生质体中再生植物的技术描述在下列文献中：Evans等，“原生质体的分离和培养”-《植物细胞培养手册》(Handbook of PlantCell Cultures)1：124-176(MacMillan Publishing Co.New York1983)；M.R.Davey，“植物原生质体的培养和再生中的最新进展”-《原生质体(1983)-演讲记录汇编》(Protoplasts(1983)-LectureProceedings)，12-29页，(Birkhauser，Basal 1983)；P.J.Dale，“谷类植物和其它抗性农作物的原生质体培养和植物再生”-《原生质体(1983)-演讲记录汇编》(Protoplasts(1983)-LectureProceedings)，31-41页，(Birkhauser，Basel 1983)；和H.Binding，“植物的再生”-《植物原生质体》(Plant Protoplasts)21-73页，(CRCPress，Boca Raton 1985)。
从原生质体再生随植物的品种与品种之间的不同而改变，但通常是首先产生含有外源序列拷贝的转化原生质体的混悬液。在某些品种中，随后可以由该原生质体混悬液诱导胚形成至作为天然胚的成熟和发芽阶段。培养基可以含有不同的氨基酸和激素，诸如生长素和细胞分裂素。另外有利的是向所述培养基中添加谷氨酸和脯氨酸，尤其是对诸如玉米和苜蓿这样的品种而言更是如此。苗和根通常同时发育。有效的再生将取决于培养基、基因型和培养史。如果控制这三种可变因素，那么再生过程是完全可再生的和可重复的。
在营养繁殖的作物中，可以通过获得插条或通过组织培养技术使成熟的转基因植物繁殖成多种相同植物用于试验，诸如测试产量特征。进行对所需转基因植物的筛选，由此获得新的品种，并对其进行营养繁殖以用于商业销售。在种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可以自交成纯合的近交植物。这种近交植物产生含有新近导入的外源基因活性水平的基因的种子。可以使这些种子生长成具有所选择的表型的植物。可以将本发明的近交体用于开发新的杂种。在该方法中，选择的近交系与另一种近交系杂交成所述杂种。
本发明包括诸如花、种子、叶、枝条、果实等这样获自转基因植物的部位，条件是这些部位包括已经如此转化的细胞。本发明范围内还包括再生植物的子代和变体以及突变株，条件是这些部分包括导入的DNA序列。本发明范围内还包括再生植物的子代和变体以及突变株。
对转基因植物或植物细胞的筛选可以基于一种视觉试验，诸如观察色泽的改变(例如白色的花、可变的色素产生和花上均匀的色泽图案或不规则的图案)，还可以包括对酶活性或产物定量进行生化试验。转基因植物或植物细胞可以生长成具有目的植物部分的植物，且诸如通过下列方法监测基因活性：视觉外观(就黄酮类化合物基因而言)或生化试验(RNA印迹)；蛋白质印迹；酶试验和黄酮类化合物试验、包括光谱法，参见Harborne等(编辑)，(1975)《黄酮类化合物》(TheFlavonoids)，第1卷和第2卷[Acad.Press]。选择合适的植物并进一步评价。用于生产遗传工程植物的方法描述在美国专利号US5,283,184、美国专利号US5,482,852和欧洲专利申请EP693554中，将所有这些文献引入本文作为参考。
通过下列实施例来进一步解释本发明的实施方案，这些实施例不应起限定作用。特别将本申请全文中引用的全部引用参考文献的内容(包括文献参考书、授权的专利、公开的专利申请和未审的专利申请)引入本文作为参考。
实施例1和2描述了两种构建体的生产：轻链构建体和重链/β-葡糖醛酸糖苷酶融合构建体。从Behringwerke AG.接受了两种质粒，一种含有抗体重链/人β-葡糖醛酸糖苷酶融合蛋白的克隆，而另一种含有κ轻链序列。
实施例1：轻链(LC)构建体的构建
本实施例描述了使用来自针对癌胚抗原(431)的人源化单克隆抗体的轻链核苷酸序列生产轻链核酸构建体的过程，其亚克隆入乳腺特异性表达载体(Bc163)和商品哺乳动物表达载体(pcDNA3)。
简单地说，将含有所述轻链序列的HindIII-EcoRI片段亚克隆入pGEM3z以便有利于进一步操作。进行两种突变：
a)在编码区的开始处生成SalI、XhoI和Kozak共有序列；和
b)在紧邻终止密码子之后生成SalI位点。
原始构建体含有约1300个未知序列的碱基。为了除去未知的序列，将缺口异源双链法用于在紧邻终止密码子之后生成SalI位点。将恰在所述终止密码子前且接近EcoRI位点的SacI位点用于产生缺口，将其用Klenow片段、脱氧核苷酸、T4 DNA连接酶和下列寡核苷酸补平：
Figure A0081442200471
然后对缺口区(通过所述终止密码子和新的SalI位点)测序以证实序列未发生改变。
在下述随后的步骤中除去的未知序列中发现了第二个NcoI位点。为了除去该位点，按常规的实验步骤，将含有新SalI位点的构建体用EcoRI消化、用Klenow片段和脱氧核苷酸补平末端并与商购自NewEngland Biolabs的SalI接头连接。然后用SalI消化含有两个SalI位点的构建体并重新连接，从而除去含有第二个NcoI位点的未知序列。
然后将SalI位点和Kozak共有序列插在起始甲硫氨酸密码子之前紧邻处(而不单纯改变HindIII位点)，这是因为在可能用作替代起始位点的正确起始密码子前存在几个ATG序列。尽管这些ATG序列看起来并不会成为组织培养中的难题，但是最令人满意的途径是除去该区。通过切下HindIII NcoI位点并用含有SalI和XhoI以及Kozak共有序列的HindIII-NcoI衔接子取代它，由此除去这些ATG序列。另外通过测序来证实取代的区。
序列改变如下：
原始5’引发区具有核苷酸序列(ATG序列以大写字母表示；
相当于起始甲硫氨酸的ATG以粗体表示)：
aagctt ATG aat ATG caaatcctgctc ATG aat ATG caaatcctctga
atctac ATG gtaaatatataggtttgtctataccacaaacagaaaaac ATG agat
cacagttctctctacagttactgagcacacaggacctcacc ATG
(SEQ ID NO：22)用下列取代序列取代原始序列：
Figure A0081442200481
然后将含有完整轻链编码区的SalI片段亚克隆入一种乳腺特异性表达载体Bc163和一种商品哺乳动物表达载体pcDNA3的XhoI位点。通过限制酶分析和/或测序确定方向。附图1A是轻链构建体(431A)的图解式图。核苷酸和氨基酸序列如附图1B中所示。附图2描绘了含有人源化抗癌胚抗原抗体431轻链的编码序列的SalI插入片段的核苷酸序列。附图3中图解表示包括含有人源化抗癌胚抗原抗体431的轻链编码序列的SalI插入片段的构建体(Bc458)。还指出了沉默子、5’β-酪蛋白非翻译区、轻链编码区和3’β-酪蛋白非翻译区的位置。
实施例2：重链/β-葡糖醛酸糖苷酶融合构建体的构建
本实施例描述了使用来自针对癌胚抗原(431)的人源化单克隆抗体的重链核苷酸序列生产重链/β-葡糖醛酸糖苷酶融合构建体的过程，其亚克隆入乳腺特异性表达载体(Bc163)和商品哺乳动物表达载体(pcDNA3)中。
将含有重链/β-葡糖醛酸糖苷酶融合体序列的HindIII-XbaI片段亚克隆入pGEM3z以便有利于进一步操作。对所述的重链/β-葡糖醛酸糖苷酶融合构建体的编码区进行三种突变：
a)在所述编码区的开始处生成SalI、XhoI和Kozak共有序列；
b)改变内部SalI位点处的序列、同时保留正确的氨基酸序列；和
c)在终止密码子之后紧邻处生成SalI位点。
用于所述轻链的信号序列也用于所述重链。此外，除去HindIII与NcoI位点之间的区，并用用于所述轻链的相同组寡核苷酸取代而在起始甲硫氨酸密码子之前紧邻处生成SalI位点和Kozak共有序列。(参见上文)。
为将所述片段亚克隆入β酪蛋白表达载体，必须改变内部SalI位点。
3’侧翼序列含有两个聚腺苷酸化信号位点和位于翻译终止密码子与XbaI位点之间的一列16个腺嘌呤残基。为了除去这些序列，在所述终止密码子之后紧邻处插入SalI位点。
Figure A0081442200492
将缺口异源双链法用于产生上述改变。原计划是使DNA在NotI与XbaI位点之间产生缺口，并改变内部SalI位点，同时添加3’SalI位点。经证实难以完成该过程，所以首先添加3’SalI位点，并在两个BglII位点之间产生新的缺口以改变内部SalI位点。然后对缺口区的整体进行测序以便证实该序列没有发生改变。唯一发现的不同出现在第四个内含子，距离起始ATG 1673个碱基。正如上文印刷的序列中所示，在突变和原始的质粒中均发现是胞嘧啶而非腺嘌呤。然后将含有重链--葡糖醛酸糖苷酶融合蛋白的完整编码区的SalI片段亚克隆入乳腺特异性表达载体Bc163和一种商品哺乳动物表达载体pcDNA3的XhoI位点。通过限制酶分析和/或测序确定方向。附图4A是轻链构建体(431A)的图解式图。核苷酸和氨基酸序列如附图4B中所示。
实施例3：连接的构建体的生产
本实施例描述了一种构建体的生产，它包括轻链和重链/β-葡糖醛酸糖苷酶融合体及其相应的上游和下游β酪蛋白序列，它们一起连接到一个粘粒中。
为了消除在共注射到小鼠或其它种类之后仅整合诸如抗体这样的两链蛋白质中的仅一条链的可能性，将两条链及其自身相应的上游和下游β酪蛋白一起连接到一个粘粒中。
为了获得这一结果，通过将下列寡核苷酸插入BarnHI位点来修饰supercosl(Stratagene)：
Figure A0081442200501
这些修饰生成带有唯一的SalI和XhoI位点的新supercos质粒，将其命名为supercos334；其中EcoRI位点位于这些位点的侧翼，而BamHI位点受到破坏。
将来自Bc174或Bc175、分别在β酪蛋白5’和3’侧翼区内含有修饰的轻链和重链/β-葡糖醛酸糖苷酶编码区的SalI片段插入supercos 334的XhoI位点。分离并制备三种克隆。通过限制酶分析确定方向。
       克隆#      名称       插入片段       方向
       1          LC14         LC           反向
       2          LC13         LC           正向
       11         HC9          HC           反向
然后将来自Bc174和Bc175(上述使用的)的互补SalI片段连入上述构建的SalI位点。(将重链片段连入LC13和LC14，而将轻链片段连入HC9)。由此获得的连接物大至足以在体外包装成λ噬菌体颗粒(Amersham试剂盒N.334)并用于感染大肠杆菌XL1 Blue。产生三种形式并分离和制备这些克隆中的每一种：
      克隆#       名称       插入片段       方向
      1           Bc180        HC/LC      反向/反向
      9           Bc181        HC/LC      正向/正向
      20          Bc182        LC/HC      反向/反向
尽管通过两种不同途径制备，但是Bc181和Bc182在从载体中切下时基本上是相同的插入片段。当以正向观察时，它们均含有重链/β-葡糖醛酸糖苷酶SalI盒、该盒后面连接了轻链SalI盒。每个SalI盒含有5’β酪蛋白启动子区、抗体编码区和3’β酪蛋白侧翼序列。
实际上，制备了两种类型：轻链弹夹、后面是重链弹夹；或重链弹夹、后面是轻链弹夹。
实施例4：轻链和重链/b-葡糖醛酸糖苷酶构建体的鉴定
应用使用Opti-MEM(Gibco-BRL)的Lipofectamine的标准方案，在使用上述转染入Cos7细胞的pcDNA3构建体的组织培养物中测试操作的DNA片段。在48小时后取出条件培养基(DMEM+10％FBS)并上10-20％SDS-PAGE凝胶以用于蛋白质印迹。
按照标准步骤进行蛋白质印迹。简单地说，就重链/β-葡糖醛酸糖苷酶而言，在还原条件下按一式三份对样品进行电泳并电印迹在硝酸纤维素上。然后将该硝酸纤维素切成三部分，并与下列三种单克隆抗体中的每一种一起保温过夜：Mab2149/80、Mab2156/94和Mab2156/215。用于检测的二抗来自Cappel(目录号55570)，即亲合纯化的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG。使用来自Amersham的ECL试剂盒进行检测。Mab2149/80是在蛋白质印迹上显示信号的唯一抗体。
就轻链而言，再次在还原条件下对样品进行电泳，并电印迹在硝酸纤维素上。然后将该硝酸纤维素与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人κ链抗体(Cappel no.55233)一起保温过夜。使用来自Amersham的ECL试剂盒进行检测。
实施例5：转基因动物的生产
通过用SalI切割β酪蛋白构建体Bc174(轻链)和Bc175(重链)以释放细菌序列来制备显微注射片段。对片段进行凝胶纯化、然后进行缓冲液交换并使用Promega提供的Wizard系统进行浓缩。
使用含有山羊β酪蛋白上游和编码序列的表达载体在小鼠模型系统中测试原始核苷酸序列的显微注射。制备两种独立的构建体并共注入小鼠胚胎，从中鉴定出建立者(founder)系并进行进一步测试。另外将原始DNA序列与用于产生较高百分比的高产动物品系的″绝缘子″序列一起共注射。例如，在无绝缘子的情况下，在三个品系中一般有一个是相对高产者。若有绝缘子，在许多情况中，产生的几乎所有品系都是高表达品系。
如下进行两组注射：
就第一组注射而言，注射了1249个胚胎，其中有838个存活，将737个胚胎转入假孕雌性动物。从这些雌性动物体内出生了80个活幼仔，其中8个属于转基因动物，7个携带两种链。
就第二组注射而言，注射了508个胚胎，其中有435个存活，将426个胚胎转入假孕雌性动物。从这些雌性动物体内出生了44个活幼仔，其中2个属于转基因动物，它们均携带两种链。
在3天内注射Bc181。在该组中，注射了840个胚胎，其中有641个存活，将618个胚胎转入假孕雌性动物。从这些雌性动物体内出生了39个活幼仔，其中5个属于转基因动物，其中3个携带两种链。由于侧翼β酪蛋白序列重复，所以似乎在某些情况中发生了重组，导致缺失了一条链或另一条链。
在4天内将Bc181与沉默子片段一起共注射。在这种情况中，注射了1495个山羊胚胎，其中有1183个存活，将1073个胚胎转入假孕雌性山羊。从这些雌性山羊体内出生了111个活幼仔，它们中的10个属于转基因动物，6个携带两种链。这些幼仔中的两个携带沉默子片段和两种抗体链。
实施例5：重链/β-葡糖醛酸糖苷酶融合蛋白突变体的生产
在增加活性分子表达的尝试中，实施对重链融合蛋白的两种突变。第一种突变是除去构建体的铰链区。第二种突变除去β-葡糖醛酸糖苷酶编码序列起始处的铰合部和接头序列(ala-ala-ala-ala-val)(SEQID NO：31)，从而使CH2部分与β葡糖醛酸糖苷酶融合。
为了获得这一结果，再次使用缺口异源双链诱变。用(XbaI)使构建体Behring HC5(在pGem3Z中含有所述融合蛋白，其两端均被修饰并除去了内部SalI位点)线性化。用BstE2和Not1切割第二个等分部分。当共沸且冷却时，每种链中的一些退火而形成含有单链缺口的异源双链，在这种情况下缺口是位于BstE2与NotI位点之间。然后产生两种新的构建体，对缺口部分测序以确保不存在偶然产生的其它突变。
GTC#403：使用寡核苷酸″Behr铰合部-替代物″(下面用粗体表示)除去铰链区和位于其前后紧邻处的部分内含子。ccaaactctctactcACTCAGCTCA CGCATCCACCtccatcccagatccccgt(SEQ ID NO：32)
           内含子             内含子
GTC#406：使用寡核苷酸″Behr铰合部/ 接头″(下面用粗体表示)除去铰链区和ala-ala-ala-ala-val接头，从而使CH2和β-葡糖醛酸糖苷酶编码区融合。agcaacaccaaggtgGACAAGAGAGTT CAGGGCGGGATGctgtacccccaggag
      CH2编码序列            β-葡糖醛酸糖苷酶(SEQ ID NO：33)
然后可以使用SalI切下突变的融合蛋白编码序列并亚克隆入合适的表达载体。
使用由沉默子(或绝缘子)片段、其后是山羊β酪蛋白启动子、插入片段DNA和山羊β酪蛋白3’非翻译区组成的载体获得了编码蛋白质的高水平表达。已经将突变体重链和轻链亚克隆入这类载体Bc450，它位于可释放完整注射片段的SalI位点的侧翼。
Bc454：带有重链突变体403(无铰合部)的Bc450
Bc456：带有重链突变体406(无铰合部/接头)的Bc450
Bc458：带有轻链的Bc450
附图5描绘了缺乏铰链区的人源化抗癌胚抗原抗体431的突变体重链的核苷酸和氨基酸序列。
附图6是含有与β-葡糖醛酸糖苷酶序列连接的人源化抗癌胚抗原抗体431的突变体重链的构建体(Bc454)示意图。标出了沉默子、5’β-酪蛋白非翻译区、重链突变体/β-葡糖醛酸糖苷酶融合体编码区和3’β-酪蛋白非翻译区的位置。
实施例6：转基因动物的鉴定
上述实施例描述了在乳表达系统中测试原始融合蛋白和两种重链突变体。测试不含绝缘子及与单独的绝缘子片段一起共注射的原始融合蛋白。另一方面，测试含有整合入所述构建体的绝缘子的重链突变体。
最初通过将样品的信号与蛋白质印迹上标准品的信号进行比较来估计奶中产生的融合蛋白的浓度。然后进行实验测定出活性而非基于蛋白质印迹测浓度。活性测定值更为准确。
除第一组构建体Bc174+Bc175外，通过蛋白质印迹估计的蛋白质浓度是粗略的估计值。一般来说，表达良好的品系看起来在1-2mg/ml的范围。
将表达数据概括如下，其中附上了每个构建体的更为具体的数据组。
构建体 DNA 绝缘子 Western(HC)ug/ml估计值 最大活性ug/ml
 Bc174/Bc175 原始 无 ～800  20
 Bc181 原始，连接 无 1000-2000  Na
 Bc181+绝缘子 原始，连接 共注射片段 ～1000  100
 Bc456/Bc458 无绞合部/接头 有 1000-2000  8
 Bc454/Bc458 无绞合部 有 1000-2000  800
本文所示的结果基本上表明：尽管可以在乳中制备出高浓度的蛋白质，但是大部分这种蛋白质无活性。这种失活可能是由于折叠问题或四聚体装配中的问题所导致的。除去铰合部和接头也产生了具有低活性的蛋白质。相反，在单独除去铰合部时获得了显著量的酶活性。
已经在小鼠的乳中产生了约8mg的这种蛋白质。目前正在体内研究中(″人CEA阳性结肠癌转移模型″)测试这种分离的蛋白质。
产生的有关小鼠的数据和进行的分析的概要列在表格中。
A.Bc174/175建立者(founder)
不含绝缘子的原始DNA
品性 2pdGen. 性别 PCRLC  HC 拷贝数LC    HC Westernug/mlHC 活性ug/ml*
 2  F + + 10 10 --- 0.14
 4  F + + 1 1 --- ＜0.1
 10  F + + 10 10 ～800 18
 142  F + + ～800
 22  F + + 10 10 --- ＜0.1
 154  F + + ～800
 23  F + + 50 50 ～400  4
 200  F + + 0.0
 40  M + + 100 100 --- ＜0.1
 62  F + + + + --- ＜0.1
 81  M + --- --- --- n.a.
 85  F + + 25  25 --- .3
 116  M + + 5  5
 216  F + + ～800
 221  F + + ～800
n.a.＝未分析(只携带一种链的品系)
B.Bc181建立者
不含绝缘子的原始DNA；Bc174和Bc175注射片段的融合体
PCR 拷贝数 Westernug/ml(估计值) 活性ug/ml*
品系 F1 性别 LC  HC LC HC HC
 6  M + + 12 12
 49  F 0.0
 50  F 0.0
 52  F ＞1000 39
 60  F ＞1000 41
 25  F + + 15 15 0.0
 29  F --- + n.a. n.a. 0.0
 33  M --- + n.a. n.a. n.a.
 36  F + + 100 100 0.0
n.a.＝未分析C.Bc181+绝缘子建立者与绝缘子共注射的原始DNA(Bc174和Bc175注射片段的融合体)
    PCR     拷贝数 Westernug/ml(估计值) 活性ug/ml*
品系 2pdgen. 性别 LC  HC Sil LC  HC  sil HC
 9  M --- + n.a. 0  1 --- n.a.
13  M + --- n.a. 2  0 --- n.a.
15  F + --- n.a. 3  0 --- n.a.
33  F + + n.a. 3  3 --- ～800
40  M --- + n.a. 0  2 --- n.a.
58  M + + n.a. 2  10 ---
 2-139  F + + --- ～800 43
 2-140  F + + --- ～800 31
66  F + + n.a. 1  1 +
78  F + + n.a. 1  1 --- 0.0
81  M + + n.a. 1  1 --- 未通过
90  M + + n.a. 20  20 +
 2-123  F + + + ～1000 ～100
 2-124  F + + + ～1000 60
 2-126  F + + --- 低 15
n.a.＝未分析D.Bc456+Bc458建立者除去铰合部和接头的突变：
第一代 第二代 性别 Western HC 活性  ug/ml.
 6  F 无 0
 8  F 0
 13  F 无 0
 18  F 0
 24  F 无 0
 57  F 好 2
 65  F 好 8
 66  F 低 0
 138  M
 175  F
 152  F 无 0
E.Bc454+Bc458仅除去铰合部的突变
第一代 第二代 第三代 性别 Western HC 活性ug/ml.
 162死亡 c-section   F ---
 4   F 高   66
 180   F 好   177
 11   F   133
 12   F   185
 182   M ---
 15   F 好   83
 187   M 未传递基因
 193   M ---
 27   F 高   838
  57   F   829
  58   F   742
  59   F   944
  60   F   574
  61   F   752
  62   F   534
 201   F 好   416
 215   F   (死亡)
 219   M  ---
  F
 220   M  ---
  F
实施例7：转基因山羊的制作和特征记述
下面概括的部分简要描述了生产转基因山羊的主要步骤。山羊的种类和品种：
优选来源于瑞士的山羊、例如Alpine、Saanen和Toggenburg的品种来生产转基因山羊。山羊的超排卵：
在第0天耳部皮下植入6mg诺甲醋孕酮(Syncromate-B，CEVALaboratories，Inc.，Overland Park，KS)使供体的动情期同步化。在第一个7-9天后给予前列腺素以便终止内源性孕酮的合成。从插入植入物后的第13天开始，3天内经肌内给予总计18mg的促卵泡激素(FSH-Schering Corp.，Kenilworth，NJ)，每日注射2次。在第14天除去植入物。在取出植入物后24小时，在2天时间内使供体动物与育性雄性动物交配几次(Selgrath等，《动物生殖学》(Theriogenology)，1990.1195-1205页)。
胚胎的采集：
在繁殖后第2天(或取出植入物后72小时)进行采集胚胎的手术。在手术前36小时使超排卵的母山羊禁食物和水。对母山羊静脉内给予0.8mg/kg地西泮(Valium)，随后立即经静脉内给予5.0mg/kg氯胺酮(Keteset)。在手术过程中通过气管内的软管以2L/分钟给予混有氧气的氟烷(2.5％)。通过中线剖腹术切口将生殖道从腹内取出。统计黄体、未破裂的直径大于6mm的滤泡和卵囊以便评价超排卵的结果并预测应通过冲洗输卵管采集的胚胎的数量。将套管置于输卵管口上并通过用3.0 Prolene单独临时结扎而固定就位。将20号针头置于子宫中距输卵管连接处约0.5cm。用10-20ml的无菌磷酸缓冲盐水(PBS)经插套管的输卵管冲洗并收集在培养皿上。对生殖道的另一侧重复该步骤，然后将生殖道放回腹部。在缝合前，将10-20ml的无菌盐水甘油溶液倾入腹腔以防止粘连。用2.0 Polydioxanone或Supramid的简单间断缝合线缝合白线并用无菌创伤用钳封闭皮肤。
在立体显微镜上从PBS输卵管冲洗液中收集受精的山羊卵，然后将其用含有商购自Sigma的10％胎牛血清(FBS)的Ham’s F12培养基(Sigma，St.Louis，MO)洗涤。在可观察到原核的情况中，立即对所述胚胎进行显微注射。如果不能观察到原核，那么可以将胚胎置于含有10％FBS的Ham’s F12中以便在37℃下，含有5％CO2的空气的加湿气室中进行短期培养，直至原核可见为止(Selgrath等，《动物生殖学》(Theriogenology)，1990.1195-1205页)。显微注射步骤：
将单细胞山羊胚胎置于玻璃凹玻片上处于油下的培养基微滴中。将带有两个可见原核的受精卵固定在火焰抛光的微量吸管上，该微量吸管位于带有使用Normarski光学技术的固定载物台的Zeiss直立式显微镜上。使用精细玻璃显微操作针给原核显微注射溶于注射缓冲液(Tris-EDTA)的目的DNA构建体，例如含有与山羊β-酪蛋白基因调节元件可操作连接的融合蛋白基因的BC355载体(Selgrath等，《动物生殖学》(Theriogenology)，1990.1195-1205页)。胚胎发育：
在显微注射后，将存活的胚胎置于含有1O％FBS的Ham’s F12培养基中，然后在37℃下含有5％CO2的空气的加湿气室内孵育至准备将受体动物进行胚胎转移为止(Selgrath等，《动物生殖学》(Theriogenology)，1990.1195-1205页)。受体的制备：
通过6mg耳部诺甲醋孕酮植入物(Syncromate-B)诱发受体动物的动情期同步化。在插入植入物后的第13天对动物单一给予非超排卵(400 I.U.)的获自Sigma的孕马血清促性腺激素(PMSG)注射液。使受体雌性动物与切除输精管的雄性动物交配以确保动情期同步(Selgrath等，《动物生殖学》(Theriogenology)，1990.1195-1205页)。胚胎转移：
将来自一只供体雌性动物的全部胚胎合在一起，如果可能则转入单一受体。手术过程与对上述采集胚胎概括的过程相同，但不给输卵管插套管，且通过使用玻璃微量吸管经伞部于最小体积的含有10％FBS的Ham’s F12中将胚胎转入输卵管腔。认为卵巢上带有超过6-8个排卵点的动物不适合作为受体。切口封闭和手术后的护理与供体动物相同(例如，参见Selgrath等，《动物生殖学》(Theriogenology)，1990.1195-1205页)。妊娠和分娩的监测：
在持续动情期的第1天后的45天时通过超声波检查法确定是否怀孕。在第110天时进行第二次超声检查以证实妊娠并评价胎儿状况。在第130天时给妊娠的受体母山羊接种破伤风类毒素和梭状芽胞杆菌属C & D。经肌内给予硒和维生素E(Bo-Se)并经皮下给予双氢除虫菌素(Ivermectin)。在第145天时将母山羊移至干净的厩中并在大约第147天诱导分娩前使之适应这种环境。在第147天时用40mg的PGF2a(Lutalyse，Upjohn Company，Kalamazoo Michigan)诱导分娩。经肌内将这种注射给予两次剂量，一次为20mg剂量，随后在4小时后给予20mg剂量。在第147天第一次注射Lutalyse后的白天和晚上对母山羊定期观察。从第二天早晨开始增加到每隔30分钟观察一次。分娩发生在第一次注射后30-40小时之间。在分娩后给母山羊挤乳以便收集初乳并证实胎盘的排出。F0动物的转基因性质的验证：
为了筛选转基因的F0动物，从两种不同的细胞系中分离基因组DNA以避免丢失任何嵌合型转基因动物。将嵌合型动物定义为并不是每个细胞中均带有至少一拷贝的转基因的任意山羊。因此，自两日龄F0动物取耳部组织样品(中胚层)和血样以用于分离基因组DNA(Lacy等，《实验指南》(A Laboratory Manual)，1986，Cold Springs Harbor，NY；以及Herrmann和Frischauf，《酶学方法》(Methods Enzymology)，1987.152：180-183页)。通过使用对所述融合蛋白基因具有特异性的引物的聚合酶链反应(Gould等，《国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci，)1989.86：1934-1938页)以及使用随机引发的第一种成分或第二种成分cDNA探针(Feinberg和Vogelstein，《生化年鉴》(Anal.Bioc.)，1983.132：6-13页)的DNA印迹分析(Thomas，《国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci，)1980.77：5201-5205)来分析DNA样品。估计试验灵敏度是在10％体细胞中检测到一拷贝的转基因。生产种群的产生和筛选
可以将上述步骤用于生产转基因建立者(F0)山羊以及其它转基因山羊。例如，如果是雌性动物，那么繁殖转基因F0建立者山羊进行产奶；或如果是雄性动物建立者，那么繁殖其以产生转基因雌性后代。可以将这种转基因建立者雄性动物与非转基因的雌性动物杂交而产生转基因雌性后代。转基因的传递和相关的特征
通过PCR和DNA印迹分析来分析山羊品系耳部组织和血液中目的转基因的传递情况。例如，对建立者雄性动物和三只转基因后代的DNA印迹分析表明在各代之间没有发生重排或拷贝数的改变。使用免疫球蛋白-酶融合蛋白cDNA探针来探测DNA印迹。在Betascope 603上分析印迹并通过将所述转基因与山羊β酪蛋白内源性基因进行比较来确定拷贝数。表达水平的评价
使用酶试验或蛋白质印迹来测定转基因动物乳中转基因蛋白的表达水平。
其它实施方案也在下面权利要求的范围内。

Claims (19)

1.一种含有第一种成分与第二种成分相融合的融合蛋白的制备方法，该方法包括：
选择第一种和第二种成分，以便将所述的融合蛋白装配成一种具有可使第二种成分的多聚化形式的活性最优化的亚单位数目的复合体。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的第一种成分或融合蛋白装配成一种具有与第二种成分的活性形式中相同数目的亚单位的形式。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的第一种成分包括Ig亚单位。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的第二种成分不是Ig亚单位。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的第一种成分已经在调节亚单位多聚体的形成或维持的位置上被修饰。
6.权利要求1所述的方法，其中所述的第一种成分形成二聚体。
7.权利要求1所述的方法，其中所述的第一种成分包括Ig亚单位，已经将其进行修饰以便抑制多聚化形式的形成。
8.权利要求7所述的方法，其中所述的修饰是改变、插入或缺失一个或多个氨基酸残基，产生不形成多聚体或形成比它通常将形成的多聚体更低级的形式的亚单位。
9.权利要求7所述的方法，其中将免疫球蛋白的铰链区进行了修饰。
10.权利要求7所述的方法，其中所述的修饰产生了二聚化Ig结构。
11.权利要求10所述的方法，其中所述的二聚体包括重链融合体和轻链融合体。
12.权利要求1所述的方法，其中所述的第二种成分包括β-葡糖醛酸糖苷酶。
13.权利要求1所述的方法，其中所述的第一种成分是免疫球蛋白(Ig)的重链或轻链，第二种成分是人β-葡糖醛酸糖苷酶融合蛋白。
14.权利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白在转基因动物体内产生。
15.一种以转基因方式生产的权利要求1的融合蛋白的制备方法，该方法包括：从包含融合蛋白编码转基因的转基因哺乳动物体内获得奶，该转基因引起融合蛋白的蛋白质-编码序列在乳腺上皮细胞中表达；由此在哺乳动物的奶中分泌所述融合蛋白。
16.一种核酸构建体，它包括：
(a)可选的，绝缘子序列；
(b)启动子，例如乳腺上皮特异性启动子、例如乳蛋白启动子；
(c)编码可以指导融合蛋白分泌的信号序列的核苷酸序列，所述的信号序列例如来自乳特异性蛋白或免疫球蛋白的信号序列；
(d)可选的，编码分泌蛋白、例如分泌入乳的蛋白质或免疫球蛋白的氨基末端编码区充足部分的核苷酸序列，该部分足以使所述融合蛋白在例如转基因哺乳动物的乳中分泌；
(e)编码融合蛋白、例如本文所述的融合蛋白的一个或多个核苷酸序列；和
(f)可选的，来自乳腺上皮特异性基因、例如一种乳蛋白基因的3’非翻译区。
17.一种核酸构建体，它包括编码权利要求1的融合蛋白的核酸分子。
18.一种权利要求1中所述的融合蛋白。
19.一种包括编码权利要求1的融合蛋白的转基因的转基因动物。
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