CN1382157A - 含有抗－fc受体结合剂的治疗化合物 - Google Patents

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Abstract

公开了诱导效应细胞介导的靶细胞杀伤的多特异性分子。该分子是“多特异性的”,因为这些分子与多个(两个或两个以上)不同的靶结合,其中一个靶是免疫细胞表面上的Fc受体。本发明的多特异性分子包括下述的分子,这些分子包含至少一个与Fc受体,例如Fcγ受体(例如,Fc γ RI),结合的部分,以及至少另一个与不同的靶,例如肿瘤细胞或病原体上的抗原,结合的部分。本发明的多特异性分子还包括抗原“多聚体复合物”,它包含多个(即2个或2个以上)与抗原递呈细胞(APC)上的分子,例如Fc受体,结合、并与一个或一个以上抗原连接的部分。这些多聚体复合物将抗原,例如自身抗原,导向APC,以诱导和/或增强APC对该抗原的内在化(胞吞作用)、加工和/或递呈。因此,这些分子可以用于在体内或在体外诱导或增强对正常非免疫原性的蛋白,例如自身抗原,的免疫应答。在特定的实施方案中,至少该多特异性分子的一个部分包含人源化的或人的抗体或抗体片段(例如,ScFv或Fab′),该抗体或抗体片段与Fc受体或靶细胞上的受体(例如EGF－R或HER2)结合。

Description

含有抗-FC受体结合剂的治疗化合物
有关的申请
以下是与本申请有关的专利申请：(1)顺序号为08/484,172，题为“含有抗/Fc受体抗体的治疗化合物”，1995年6月7日提出；(2)美国顺序号为08/661,052，1996年6月7日提出，现已颂发证书的美国专利NO.5,837,243，该专利是(1)的部分继续；(3)美国顺序号为09/188,082，1998年11月6月日提出的美国专利申请，它是(2)的部分继续；(4)美国顺序号为09/364,088，1999年7月30日提出的美国专利申请，它是(3)的部分继续，本申请是(4)的部分继续。前述每项申请的全部内容，及此处列举的所有参考文献、颂布的专利，以及公布的申请专利均在此引入，作为参考。
发明背景
免疫球蛋白(Igs)由二条重链和二条轻链组成，每条链包含对抗体效应物功能起作用的NH2末端抗原结合的可变区，和COOH末端恒定区。Ig重链COOH末端区形成Fc区，并通过与特定的受体，皆知为Fc受体(FcRs)的相互作用，参与触发细胞的活性。所有类别的Ig，或同种型，的Fc受体(例如，IgG(FcγR)、IgE(FcεR)、IgA(FcαR)、IgM(FcμR)、IgD(FcδR))，都已鉴定。不同的同种型抗体的生物活性不同，它部分取决于其与不同FcR的结合能力，这些不同的FcR在不同的免疫(效应)细胞上表达。(Fridman，W.H.(1991年9月)FASEB杂志Vol.5.2684-2690)。直接抗FcRs的鼠抗体已有制备(参见例如，美国专利No.4,954,617，题为人单核吞噬细胞免疫球蛋白G上的Fc受体的单克隆抗体，和国际专利申请公布号WO91/0587，题为对IgA受体特异的单克隆抗体)。
鼠单克隆抗体可用于人的治疗，而且已能生产出无人的病原体，例如肝炎或人免疫缺陷病毒，污染的鼠单克隆抗体。但是，鼠单克隆抗体用于某些人的治疗时，会诱发出对“外源”鼠蛋白的免疫应答。该应答称为人抗鼠抗体，或HAMA应答(Schroff，R.等(1985)，CancerRes.，45，879-885)，而且这种情况会引起血清疾病，并造成鼠抗体从个体的循环中迅速排出。已表明，人体的这种免疫应答可以抗鼠免疫球蛋白的可变区和恒定区。
重组DNA技术已用于抗体的改变中，例如，一个种的特定免疫球蛋白区可被另一个种的免疫球蛋白区所取代。Neuberger等(PCT专利申请号PCT/GB85/00392)描述了某种方法，按此方法，一个种的Ig分子的互补重链和轻链的可变区，可以与另一个种的互补重链和轻链的Ig恒定区相结合。该方法可用来取代鼠的恒定区，产生“嵌合”抗体，该抗体可用于人的治疗。用Neuberger等所述方法生产的嵌合抗体中，含有人的Fc区，它可有效地刺激抗体介导的效应因子功能，例如补体结合功能，但仍然可能在人体内引起抗鼠(外源)可变区的免疫应答。
Winter(英国专利申请号GB2188538A)描述了一种改变抗体的方法，该方法是用来源于另一个种的互补决定区取代该抗体的互补决定区(CDR)。该方法可以用来将鼠单克隆抗体可变区的CDR代入人的重链和轻链的Ig可变区域中，该CDR具有所需的结合性能(例如与人的病源体结合)。然后，这些改变后的Ig可变区与人的Ig恒定区结合而产生抗体，该抗体的组成中，除了代入的鼠CDR以外，其余全部是人的。由于鼠的组分相当少，Winter所述的“重构的”或“人源化的”抗体与“嵌合”抗体相比，大大降低了在人体内引起的免疫应答。而且，改变的抗体在循环中的半衰期应可达到天然的人抗体的水平。但是，如Winter所称，仅用对某种抗原，例如病毒或细菌蛋白特异的另一种抗体的互补CDR，来取代某种抗体的CDR，所产生的改变抗体并不总能保持其所需的结合能力。实际上，在抗体可变区框架中的某些氨基酸与构成CDR的氨基酸残基相互作用，以致于要恢复其与抗原结合的能力，有可能需要取代人的Ig可变区中的氨基酸。
含有抗Fc受体部分和抗靶部分的双特异性分子，(例如异源抗体)，已制成制剂并用于治疗上，例如治疗癌症(例如乳癌或卵巢癌)或病原体感染(如HIV)(参见，例如，国际专利申请公布号W091/00360，题为具有双效应因子功能的双特异性异源抗体；以及国际专利申请公布号WO91/05793，题为治疗爱滋病的双特异性试剂)。此外，识别抗原和抗原呈递细胞的双特异性分子可施予治疗对象，以刺激其免疫应答(参见，例如国际专利申请公布号WO92/05793，题为用双特异试剂导向的免疫刺激)。
发明简述
本发明提供导向免疫细胞的重组和化学合成的多特异性分子。该分子是“多特异性的”，因为这些分子与多个(2个或2个以上)不同的靶结合，其中一个靶是免疫细胞表面上的分子，例如效应细胞和/或抗原递呈细胞(APC)。优选的免疫细胞靶包括Fc受体，特别是FcδRI和FcαR。
在一个实施方案中，本发明的多特异性分子包括至少一个与效应细胞上的分子，例如Fc受体，结合的部分，以及至少一个(例如，2、3、4个或4个以上)与不同的靶，例如在肿瘤细胞或病原体上的抗原，结合的部分。因此，这些分子可以用于诱导效应细胞介导的靶清除。在一个优选的实施方案中，上述多特异性分子包含作为结合特异性的人或人源化的抗体(或抗体片段)。
在另一个实施方案中，本发明的多特异性分子包括抗原“多聚体复合物”，该复合物由多个部份(即2个或2个以上)组成，这些部分与抗原递呈细胞(APC)上的分子，例如Fc受体结合、并与一种或一种以上抗原连接。这些多聚体复合物将抗原，例如自身抗原，导向APC，以通过APC诱导和/或增强对抗原的内在化(胞吞作用)、加工和/或递呈。因此，这些分子可以用于在体内或体外诱导或增强对正常非免疫原性的蛋白，例如自身抗原，的免疫应答。
另一方面，多特异性分子是本发明的特征，该分子最低限度包括抗Fc受体部分、抗靶部分、以及可包括或不包括的直接抗第三种靶的第三部分。该第三部分，此处亦称为“抗增强因子”(抗EF)部分，例如，可以是抗体或抗体片段，或是细胞受体的配体。在优选的实施方案中，该多特异性分子包含作为结合特异性的人或人源化的抗体(或抗体片段)。
另一方面，产生多特异性分子的方法也是本发明的特征。在一个实施方案中，两种特异性都在同一载体中编码，并在宿主细胞中表达和装配成双特异性分子或融合蛋白。在另一实施方案中，先分别产生每种特异性(例如用重组方法)，然后，在抗体的场合，用化学法通过重链C末端的铰链区的巯基结合相互联结在一起。
还有另一方面，本发明的特征是，多特异性分子，此处亦称为“抗原多聚体复合物”，该复合物含有2种或2种以上与至少一种抗原连接的结合特异性。该结合特异性物结合到抗原递呈细胞表面的组分上，例如Fc受体，该受体在与结合特异性结合时，可以介导分子复合物的内在化。在优选的实施方案中，该分子复合物包括3种或3种以上的结合特异性，而且其中至少一种特异性是对Fc受体(例如FcγRI或FcαR)特异的。在特别优选的实施方案中，该抗原在非复合物形式施用时是非免疫原性的。
诱导或增强对目的抗原免疫反应的方法也是本发明的特征，该方法是对治疗对象施予本发明的抗原多聚体复合物。本发明进一步还包括对治疗对象免疫接种的方法，该方法是将本发明的抗原多聚体复合物施予治疗对象。
基于其可引起效应细胞介导的对靶细胞的杀伤，本发明的多特异性分子还可以用于多种免疫治疗中。在特定的实施方案中，该多特异性分子可用来杀死或抑制各种瘤细胞的生长。
附图简述
图1表明人源化的FcγRI抗体，H22铰链区部分的核苷酸和氨基酸序列。将[A]改变，产生截短的单巯基形式的[B]，然后进一步改变，人工改造出2个独特的克隆位点[C]。加下线的核苷酸表明由原先的序列变化而来。加上线的核苷酸为所示限制性位点的识别序列。
图2是重链-EGF融合表达结构pJG055的图示。
图3是产生抗Fc受体配体双特异性分子的图示。
图4是用于测定人源化的Fcγ受体-表皮生长因子融合蛋白活性的流式细胞分析图示。
图5是标绘平均萤光强度(MFI)的图，MFI表明各种浓度的表皮生长因子(EGF)融合蛋白(H22-EGF融合蛋白)和完全人源化的双特异(BsAb)H477与EGF受体(EGFR)表达1483细胞的结合。
图6表明各种浓度的EGF融合蛋白或BsAbH477，在结合EGFR的鼠抗体M425存在和不存在的情况下，与A431细胞结合的结果。
图7是标绘抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的图，该ADCC由各种浓度的EGF融合蛋白、BsAbH477或H425抗体与A431细胞结合所产生。
图8是标绘EGF融合蛋白、BsAb或H425抗体在只有培养基存在下的结合而产生的ADCC的柱状图，培养基含有25％的人血清，或含有受体抗体m22的Fab片段。
图9表明在不同量的EGF、H22-EGF、H22的Fab片段(H22Fab)或H425的F(ab′)2片段(H425F(ab′)2)存在下培养的A431活细胞数。
图10表示H22Fd-HRG融合蛋白的氨基酸序列。
图11是表明PC-3或SKBr-3肿瘤细胞特异杀伤百分率的柱状图，该细胞的杀伤是将这些细胞与干扰素γ处理的单核细胞和表达H22融合蛋白的骨髓瘤细胞上清的1∶3或1∶30的稀释液培养一起而引起的。
图12表明PC-3瘤细胞在单核细胞和不同浓度的H22-铃蟾肽融合蛋白存在下的裂解百分率。
图13是流式细胞分析的图式表示，该分析法用于测定由o-PDM或DTNB法产生的BsAb447活性。
图14标绘了不同浓度来源于o-PDM和DTNB法的BsAb447与EGFR和FcγRIA431细胞结合的MFI。
图15标绘了来源于o-PDM和DTNB法的BsAb447与A431细胞结合所产生的抗体依赖的细胞毒性。
图16是描述三特异抗体构建的流程图。
图17二价的双特异抗体转化为三价的三特异抗体的描述。
图18是HER2/neu(A图)和EGFR(B图)双功能荧光激活细胞分选分析的描述。
图19标绘了不同浓度的抗体BsAb或TsAb与靶细胞结合的结果。平均荧光强度(MFI)随Ab的结合增加而增加。它表明TsAb以剂量依赖的方式，同时与SKBr-3细胞上的HER2/neu和可溶的FcγRI结合。
图表20表明TsAb以剂量依赖的方式，同时与A431细胞上的EGFR和可溶的FcγRI结合。该分析方法类似于图19中所用的方法。
图21表明TsAb、M22×H425×520C9，以及BsAb、M22×520C9能够诱导SKBR-33细胞的ADCC，但是BsAb，M22×H425，不能诱导。不同浓度的抗体与SKBR-33细胞和预激活的PMN一起温育。
图22表明TsAb、M22×H425×520C9，以及BsAb、M22×H425能够诱导A431细胞的ADCC，但是BsAb，M22×520C9，不能诱导。分析按类似于图21的分析方式进行。
图23是全血调节分析流程图(A图)及其分析结果(B图)。这些三价抗体迅速地调节单核细胞表面的FcγRI。
图24的A图表明编码野生型(TT830)和突变型(TT833)破伤风毒性肽的核苷酸的氨基酸序列，B图是H22Fd-TT融合蛋白。
图25的A、B和C图分别代表MDXH210、Fab22-TT830和H22-TT833S与FcγRI阳性U937细胞结合的流式细胞计量分析结果。虚线代表阴性对照，实线表示用融合蛋白染色，以及点线代表用鼠mAb22F(ab′)2封闭的融合蛋白的结合。
图26表明不同量的融合蛋白MDXH210、FAb22-TT830和H22-TT833与FcγRI阳性U937细胞温育所得平均荧光强度。
图27是T细胞与照射的单核细胞以及不同浓度的TT830、Fab22-TT830、TT或TT947温育后增殖的图示，表明了与TT830相比，融合蛋白Fab22-TT830将Th表位的递呈提高了约1000倍。
图28是表示T细胞增殖的直方图，T细胞与1000nM的TT830或10nM的Fab-22TT830，以及单核细胞温育，在加入T细胞和抗原之前用饱和量的mAb22F(ab′)2预温育或不预温育。
图29是表示T细胞增殖的直方图，T细胞与单核细胞和5nM的Fab-22TT830或1000nM的TT830在Ig不存在(对照)或存在下温育。
图30的A图和B图表明T细胞与单核细胞和不同浓度的TT830或Fab22-TT830温育2天后，其上清中IFNγ(A图)和IL4(B图)的浓度。
图31描绘了T细胞与单核细胞以及不同浓度的TT833S、Fab22TT830或TT830温育后的增殖。
图32是T细胞与TT830和单核细胞温育2天后的增殖的图示，单核细胞与不同浓度的TT833S预保温过夜。
图33是T细胞与TT830和单核细胞温育2天的增殖的抑制百分率的图示，单核细胞与不同浓度的TT833 S或Fab22-TT830预温育过夜。
图34是表示T细胞与单核细胞温育2天后的增殖直方图，单核细胞先与TT830温育4小时(预脉冲)，随后与10μM TT833S或0.1μMFab22-TT833S温育过夜(追加)，然后加入T细胞。
图35是表示T细胞与单核细胞以及TT830、Fab22-TT830、TT833S和Fab22-TT833S培养后，上清中干扰素γ(IFNγ)和IL4的浓度的直方图。
图36表示T细胞在只有培养基的条件下用单核细胞、用TT833S、或用Fab22-TT833S刺激一天，然后用单核细胞和不同浓度的TT833S刺激两天的增殖，它表明TT833S和Fab22-TT833S不会导致T细胞无反应性。
图37是两种编码单链双特异分子的表达结构和一种编码单链抗体的表达结构的图示，前者含有一个对FcγRI(H22)的结合特异性，和一个对癌胚性抗原(CEA)的结合特异性(结构321和323)，后者含有一个对FcγRI的结合特异性。上述编码区在CMV启动子(CMVpr)的调控下。除了来自抗体的重链(VH)和轻链的可变区以外，这些结构编码的蛋白与c-myc(c-myc)的肽链，以及六个组氨酸的肽链(H-6)融合。
图38是表明由表达结构321(321-A5和321-B4)和323(323-B2和323-C4)编码的单链双特异分子H22-抗-CEA，和由结构225(225-C2)编码的单链H22抗体的结合水平的直方图，该结合水平用特异的ELISA测定。
图39表示单链人源化的抗FcγRI抗体的核酸序列和该核酸编码的氨基酸序列。
图40表示含有一个对FcγRI的结合特异性，和一个对CEA的结合特异性的单链双特异分子的核酸序列，以及该核酸编码的氨基酸序列。
图41是由多个Fab′片段连接到抗原上而构成的多聚体复合物的图示。
图42(a)所示的是纯化的M22F(ab′)2多聚体(泳道1)和化学法连接的M22 Fab′多聚体复合物(泳道2)的非还原性SDS-PAGE的凝胶。图42(b)表明用M22F(ab′)3+温育造成CD64在巨大吞噬细胞表面的表达以依赖于剂量的方式减少，减少量高达50％。
图43(a)表明，与其非转基因的同窝小鼠相比，所有免疫接种三次的CD64转基因小鼠都产生了高滴度的M22特异抗体。图43(b)表明用少达0.25mg量的多聚体复合物免疫接种的FcγRI(CD64)转基因小鼠仍然产生可检测的免疫应答。
图44(a)和44(b)表明，用抗-520C9和抗M22滴度鉴定的FcγRI(CD64)转基因的和非转基因的小鼠的免疫应答。小鼠用偶联到M22多聚体复合物上的鼠抗体Fab′片段，520C9，免疫接种。
图45(a)是编码基因连接的多聚体复合物的表达载体图谱，该复合物含有两个与一个M32.2sFv区连接的H22sFv区，该MH22sFv区又与抗原连接(H22(2x)-32.2抗原复合物)。图(b)是所产生的多聚体复合物。
图46表明了M22FabxM22FabxM32和H22sFv-H22sFv-32.2sFv-gp75多聚体复合物与FcγRI有效结合，以及诱导内在化的能力。
图47(a)是编码基因连接的多聚体复合物的表达载体图谱，该复合物含有两个共同与抗原连接的H22sFv区(H22(2x)抗原多聚体复合物)。图47(b)是所产生的多聚体复合物。
图48是用H22Fab、H22sFv2-EGF多聚体和H22-Fab2多聚体进行结合竞争试验的结果。该结果用这些多聚体对M22-藻红蛋白结合物的结合抑制来表示。
图49(a)是编码基因连接的多聚体复合物的表达载体图谱，该复合物含有三个与抗原连接的H22sFv片段(H22(3x)-抗原多聚体复合物)。图49(b)是所产生的蛋白。
图50是表明与其他多聚体复合物比较，H22(3x)-CEA多聚体复合物诱导FcγRI内在化的能力的柱状图。
图51是抗CD89(14A8)HuMAb融合分子生产的图示。用电穿孔法将PJZ906(14Afd-EGF)和pJZ907(14A8L-链)共转染到NSO细胞中，并在含有G418和潮霉素的培养基中选择。用类似的方法转染PJZ909(14A8sFv-EGF)并在含G418的培养基中选择。用有限稀释克隆法将表达融合蛋白的细胞系亚克隆。
图52(a)表明了14A8fab′-EGF融合结构与A431细胞上EGFR的结合(用流式细胞计量法测定)。图52(b)表明了14A8sFv-EGF融合结构与A431细胞上EGFR的结合。A431细胞用结合藻红蛋白的羊抗人IgG Fab-2染色。不含EGF的14A8(人单克隆抗FcαR抗体，亦称为14.1)的fab片段用作对照。图52(c)表明融合蛋白与市售的EGF以EGF-FITC结合物(7nM)的形式竞争与A431细胞结合。
图53(a)表明14A8fab′EGF融合结构与U937细胞的结合(用流式细胞计量法测定)。结合U937细胞的融合蛋白用结合藻红蛋白的羊抗人IgG Fab-2染色。对EGF-R特异的人源化mAbH415的fab2片段用作对照。
图53(b)表明14A8sFv-EGF融合结构与U937细胞的结合。除了确定不同的14A8sFv-EGF浓度，以测定其抑制14A8fab′结合的能力(23nM)以外，实验按类似图53(a)的方式进行。H22sFv-EGF融合蛋白作为对照。mAbH22连接到CD64(FcγRI)上，它是U937细胞上不同的Fc受体。
图54表明剂量依赖的融合蛋白介导的A431细胞的细胞毒性。铬释放分析所用的的温育周期为16-18小时，效应物靶比值为100∶1(对单核细胞和PMN)。效应细胞包括新鲜的单核细胞(图54(a))、PMN(图54(b))和全血(图54(c))。14A8的fab片段用作对照。
图55是比较图54(a)-(c)中结果的柱状图。
图56(a)是表明14A8fab′-EGF(1μg/ml)融合蛋白介导的A431细胞的细胞毒性受14A8的fab-2片段抑制的柱状图。
图56(b)是表明14a8sfv-EGF(1μg/ml)融合蛋白介导的A431细胞的细胞毒性也受14A8的fab-2片段抑制(40μg/ml)的柱状图。
图57是双特异单链融合分子，931和934，及其亲本HuMab的图示。14.1和3F2的可变的轻链区和重链区用于产生931和943(w/EGF)结构。
图58是由14.1和3F2(抗HER2)的Fab′片段构成的化学结合双特异分子的图示，该分子用作阳性对照。
图59(a)是对转染上清中所表达的融合蛋白931和934的筛选(结合)分析柱状图，该结果用流式细胞计量法分析测得。转染的(931和934)和未转染的(NSO)上清与SKBR3或A431肿瘤细胞系一起温育。用结合藻红蛋白的羊抗人Igfab-2染色，检测融合蛋白的结合。图59(b)是融合蛋白931和934的ADCC分析的柱状图。铬释放分析中所用的温育周期为16-18小时，效应物靶比值为100∶1。用转染的(931和934)和未转染的(NSO)上清介导特异的裂解，检测肿瘤细胞的杀伤。
图60(a)表明单链融合蛋白931和934与U937细胞的结合(用流式细胞计量法测定)。与U937细胞不结合的抗EGF-GmAb，即425的fab′片段用作阴性对照。图58中所示的化学连接双特异分子(14.1×3F2)用作阳性对照。图60(a)表明单链融合蛋白931和934与SKBR3细胞的结合(用流式细胞计量法测定)，14.1fab-2用作阴性对照。图58中所示的化学连接双特异分子(14.1×3F2)用作阳性对照。
图61表明单链融合蛋白943与A431细胞的结合。除了选用EGF-R高表达的A431肿瘤细胞以外，该实验按图60所示同样的方式进行。由14.1的sFv片段与EGF融合的融合蛋白用作阳性对照，14.1fab-2用作阴性对照。
图62表明通过单链融合蛋白931的PMN(效应细胞)介导的SKBR3(图62(a))和BT474(图62(b))肿瘤细胞的细胞毒性。铬释放分析中所用的温育周期为16-18小时，效应物-靶比值为100∶1。14.1fab-2用作每个实验的阴性对照。
图63表明通过单链融合蛋白931的单核细胞(效应细胞)介导的SKBR3(图62(a))和BT474(图62(b))肿瘤细胞的细胞毒性。铬释放分析中所用的温育周期为16-18小时，效应物-靶比值为100∶1。14.1fab-2用作每个实验的阴性对照。
图64通过51Cr释放测定，描述了人抗HER2/neu x抗CD89双特异分子(14.1×3.F2)介导的多形核细胞对SKBR3和BT474肿瘤分子的抗原依赖的细胞溶解。
图65通过51Cr释放测定，描述了人抗HER2/neu x抗CD89双特异分子(14.1×3.F2)介导的单核细胞对SKBR3和BT474肿瘤分子的抗原依赖的细胞溶解。
图66通过51Cr释放测定，描述了人抗HER2/neu x抗CD89双特异分子(14.1×3.F2)介导的全血对SKBR3和BT474肿瘤分子的抗原依赖的细胞溶解。
发明详述
多特异性分子
本发明介绍导向免疫细胞的重组和化学合成的多特异性分子。该分子是“多特异性的”，因为它们与多个(2个或2个以上)不同的靶结合，其中一个靶是免疫细胞表面上的分子。在一个实施方案中，本发明的多特异性分子包括至少一个与效应物细胞上的分子，例如Fe受体，结合的部分，以及至少一个(例如，2、3、4个或4个以上)与不同的靶，例如在瘤细胞或病原体上的抗原，结合的部分。在另一个实施方案中，本发明的多特异性分子包括抗原“多聚体复合物”，该复合物由多个部份(即2个或2个以上)组成，这些部分与抗原递呈细胞(APC)上的分子，例如Fc受体结合、并与一种或一种以上抗原连接。这些多聚体复合物将抗原，例如自身抗原，导向APC，以诱导和/或增强对抗原的内在化(胞吞作用)、加工和/或递呈。因此，这些分子可以用于在体内或体外诱导或增强对正常非免疫原性的蛋白，例如自身抗原的免疫应答。
在特别优选的实施方案中，本发明的多特异性分子包括与Fc受体，通常是FcδR(例如，FcδRI)或FcαR，结合的人或人源化的(嵌合)抗体或抗体片段。多特异性分子另外包含1种或1种以上的结合特异性，例如配体和/或其他人抗体或抗体片段，它们与不同靶细胞(例如，肿瘤细胞)上的抗原结合。此类多特异性分子可通过化学法连接，或以融合蛋白的方式用基因工程方法表达。而且，由于它们可通过FcδRI或FcαR导向效应细胞，它们可用于诱导效应细胞(例如，PMN、巨噬细胞和单核细胞)介导的靶(例如，肿瘤)细胞的杀伤，或者，如果与抗原连接，则可通过抗原递呈(AP)效应细胞(例如，树枝状细胞)用于增强抗原递呈。
如此处用来描述本发明的多特异性分子那样，术语“结合到…的部分”可与术语“对…的结合特异性”通用。二者都是指多特异性分子中与靶表位结合的区域。如以下所详述的，这些部分或结合特异性包括任何能结合到靶表位上的化合物，包括但不限于抗体、抗体片段(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv，或单链的Fv)及其摸拟物(例如，肽、化学和有机的摸拟物，该摸拟物“摸拟”抗体或抗体片段的结合)。合适的抗体和抗体片段包括，但不限于鼠、人源化的(嵌合的)、单链的，和人的单克隆抗体及其片段。在特定的实施方案中，该结合特异性包括一个或一个以上选自H22(ATCC保藏号CRL11177)、M22(ATCC保藏号HB12147)、M32.2(ATCC保藏号HB9469)的抗体，及其抗原结合片段，每种抗体都与FcγRI(CD64)结合。人源化的抗体H22，及其鼠的等同物，M22具有以下优点，即其与FcγRI结合的位点在天然配基(IgG)的结合位点之外，这样，在其施入体内时，该结合不会被内源配体所阻断或受到竞争抑制。在另一个特定的实施方案中，该结合特异性包括一种或一种以上的抗体，该抗体选自与FcαR(CD89)结合的人单克隆抗体14.1和与HER2结合的人单克隆抗体3.F2。
此处所用的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简单称为“抗体部分”)是指一种或一种以上保留与抗原(例如，Fc受体)特异结合能力的抗体片段。现已证明，抗体的抗原结合功能可由全长的抗体片段来完成。包括在术语抗体的“抗原结合部分”之内的结合片段有以下例子(i)Fab片段，包括VL、VH、CL和CH1区的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，两条Fab片段通过铰链区的二硫键连接而组成的二价片段；(iii)包括VH、CH1区的Fd片段；(iv)包括单臂抗体的VL和VH区的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341：544-546，该片段含有VH区；(vi)分开的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个区，VL和VH，由分开的两个基因所编码，但用重组技术，通过合成的接头可将它们连结起来，该接头可将VL和VH制成单一的蛋白链，在该蛋白链中，VL和VH区配对，形成单价分子(为大众所熟知的单链Fv(scFv)；参见Bird(1988)Science242：423-426；
以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。这种单链抗体也可考虑包括在术语抗体的”抗原结合部分”内。这些抗体片段可用本领域技术人员熟知的常规技术得到，并按完整抗体的同样方式筛选使用。I.含有导向抗原递呈细胞(APC)的抗原多聚体复合物的多特异性分子
本发明的抗原多聚体复合物包括多个部分或结合特异性，该特异性导向抗原递呈细胞表面的组分，并与一种或一种以上的抗原连接。上述的多个结合特异性可结合到同一或不同的APC细胞表面组分的抗原表位上。在优选的实施方案中，该多聚体复合物包括至少3个与APC细胞表面组分结合的结合特异性。APC上用于导向的合适组分包括以下所述的组分，当其与结合特异性结合时，可介导该特异性的内在化，从而使与结合特异性连接的抗原有效地内在化，并通过APC递呈。
此处所用的术语“抗原递呈细胞”或“APC”是指能使抗原内在化并能对其加工的免疫细胞，这样，抗原决定簇以可被免疫系统(例如II类-MHC局限辅助性T淋巴细胞)识别的方式，以MHC-复合体的形式在该细胞的表面递呈。使细胞起APC功能的两种必须的性能是加工胞吞的抗原，和表达II类MHC基因产物的能力。对于辅助性T细胞，最好的APC包括单核吞噬细胞(例如，巨噬细胞)、B淋巴细胞、树枝状细胞、皮肤朗氏细胞，以及人的内皮细胞。
在优选的实施例中，结合特异性所导向的APC细胞表面组分为Fc受体，通常为FcγR。因此，在本发明特定的实施方案中，该多聚体复合物包括多个导向FcγR上不同表位的结合特异性(例如，2个或2个以上，优选3个或3个以上)。另外，该多聚体可以包括多个导向FcγRI上同一表位的结合特异性。但是，其他合适的APC细胞表面组分也可被导向。这类组分可用以下方法鉴定，例如，用APC对某种动物(例如人FcγR转基因鼠)免疫接种，然后从该动物取出血清，用标准分析法(例如Western blot)测定与该血清结合的组分。然后可再测定这些APC细胞表面组分使与其结合的化合物内在化的能力。因此，在一个实施例中，该多聚体复合物包括至少一个与Fc受体结合的抗体或其片段(例如，Fab、Fab、F(ab)2、Fv，或单链的Fv)，该Fc受体例如是人IgG受体，如Fcγ受体(FcγR)，例如是FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、和cγRIII(CD16)。优选的Fcγ受体是高亲和力的Fcγ受体FcγRI。但是，其他Fc受体，例如人IgA受体(例如FcαRI)也可被导向。Fc受体位于APC，例如单核细胞或巨噬细胞的表面。在特定的实施方案中，多聚体复合物与Fc受体结合的位点远离该受体的免疫球蛋白(例如，IgG或IgA)结合位点。因此，多聚体复合物的结合不会受到生理水平上的免疫球蛋白的阻断。优选的人源化抗FcγR单克隆抗体在PCT申请WO94/10332和美国专利NO.4,954,617中已有描述，其中的内容在此全部并入作为参考。
如此处的实施例所述，适用于本发明抗原多聚体复合物的特定人源化和鼠的单克隆抗体和抗体片段包括，但不限于，人源化的抗体H22(ATCC保藏号CRL11177)、鼠源的该抗体，M22(ATCC保藏号12147)，鼠抗体M32.2(ATCC保藏号HB9469)及这些抗体的抗原结合片段。
本发明的导向APC的多聚体复合物进一步还包括一种或一种以上的抗原。此处所用的术语“抗原”是指能够被免疫细胞所识别(即引起免疫应答，例如T细胞介导的免疫应答)的任何分子(例如，蛋白、肽、糖类等)。抗原包括“自身抗原(self antigen)”或“自抗原”(autoantigen)，该抗原正常存在于宿主中，而且在正常情况下不会引起宿主的免疫应答(因为免疫系统识别该抗原为“自身的”，而不是“外源的”)。在某些疾病中，不正常地存在于宿主中的抗原，应该由宿主的免疫系统引起免疫应答，但实际上不是这样。换句话说，这些抗原“逃离了”宿主免疫系统的识别。这类抗原包括，例如，某些肿瘤的抗原和病原体(例如病毒和细菌)的抗原，在这种场合，要求对抗原进行修饰，以诱导或增强免疫细胞对它的识别，从而清除宿主细胞中的该抗原或产生该抗原的细胞/有机体。换句话说，该抗原经修饰后，使免疫细胞不再将其识别为“自身抗原”。
本发明的抗原多聚体复合物的制备可按此处所述，采用标准的交联剂和本领域熟知的接合方法，将一种或一种以上的抗原，通过化学方法，连接到多个(2个或2个以上)APC上组分的结合特异性上。此处还叙述了另一种方法，即通过重组产生单一蛋白的抗原多聚体复合物。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了编码某种抗原多聚体复合物的核酸。通常，该核酸在表达载体内与启动子和控制该多聚体复合物表达的其他基因调控序列操纵连接。当某种核酸与另一种核酸序列处于功能的关系时，则该核酸是“操纵连接”的。例如，如果某启动子或增强子影响了某编码核酸的转录，则该启动子或增强子与该编码核酸是操纵连接的。就转录调控序列而言，操纵连接意味着所连接的DNA序列是邻接的，在需要连结两种蛋白编码区时，是按阅读框的邻接。对于开关序列，操纵连接表明该序列能影响开关重组。
此处所用的术语“载体”是指能载运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，质粒是指环状双链的DNA环，外加的DNA片段可连接到其中。载体的另一种类型是病毒载体，其中外加的DNA片段可连接到病毒的基因组中。某些载体能在其引入的宿主细胞中自主复制(例如有细菌复制原点的细菌载体和附加型的哺乳类动物载体)。其他载体(例如非附加型的哺乳类动物载体)可以通过将其引入宿主细胞而整合到该宿主细胞的基因组中，并与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能指导与其操纵连接的基因的表达。这类载体在此称为重组表达载体(或简称为表达载体)。一般，重组DNA技术中所用的表达载体常常是质粒的形式。在本发明的说明书中，“质粒”和“载体”可以通用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明还包括其他形式的起同等功能的表达载体，例如病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
此处所用的术语“重组宿主细胞”(或简称为宿主细胞)是指其中已导入重组表达载体的细胞。应该懂得这种术语不仅是指特定的对象细胞，而且还指该细胞的子代。因为在连续传代的过程中，由于突变或环境的影响，会发生某些修饰，这种子代实际上可能与其亲本细胞不完全等同，但它仍然包括在此处所用的术语“宿主细胞”的范围内。
本发明的抗原多聚体复合物可通过免疫细胞(例如APC)用于诱导或增强抗原的内在化、加工和递呈。因此，本发明还提供诱导或增强治疗对象抗原的免疫应答的方法，该方法是将有效量的抗原多聚体复合物施予治疗对象。例如，可以施予抗原多聚体复合物，以诱导对自身抗原的免疫应答(包括免疫系统不能识别的肿瘤抗原)，或增强对抗原的免疫，例如肿瘤抗原或病原体的组分。这样，该抗原多聚体复合物也可用作免疫宿主的疫苗。II.导向效应细胞的多特异性分子
本发明的多特异性分子还包括设计成导向效应细胞的分子，以引起效应细胞介导的靶细胞、病原体、等位基因或其他实体的清除。因此，在另一方面，本发明提供了多特异性分子，该分子包括至少一个与效应物细胞上的组分结合的部分，该组分通常是Fc受体，以及至少一个(例如，2、3、4或4个以上)与不同的靶，例如肿瘤细胞或病原体上的抗原结合的部分。
此处所用的“效应细胞”是指某种免疫细胞。特定的效应细胞表达特定的Fc受体，并具有特定的免疫功能。例如，表达FcγRI和FcαR的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞和树枝状细胞参与了靶细胞的特异杀伤，并将抗原递呈到免疫系统的其他组分上。因此，由于RcγRI和FcαR都在这些类别的效应细胞上表达，所以被优选用于本发明中的触发靶。此外，特定的FcR在效应细胞上的表达可由体液因子，例如细胞因子调控。例如，已发现，FcγRI的表达受干扰素γ(IFNγ)的正调控。这种增强的表达增加了FcγRI细胞抗靶的细胞毒性活性。
导向效应细胞的多特异性分子含有一个或一个以上与效应细胞上的组分，例如Fc受体结合的特异性或部分。在一个实施方案中，如前所述，该结合特异性由抗体或抗体片段(例如，Fab  或单链Fv)提供。
在特定的实施例中，该抗体或抗体片段是人或“人源化”的(亦即，来源于人的抗体，但含有至少一部分来源于非-人抗体的互补决定区(CDR)，选用该部分的目的是提供人源化抗体对人Fc受体的特异性)。
上述抗体可以是完整的，即有重链和轻链或它们的任何片段，例如Fab或(Fab)2片段。该抗体还可以是轻链或重链双体，或其任何最小的片段，例如Fv或如按Ladner(美国专利NO.4,946,778，1990年8月7日颂布)所述而的单链结构，该专利的内容明确引入作为参考。上述人源化的抗体或片段可以是能够保留非-人CDR的任何人抗体。对于重链可变区(VH)，优选的人抗体来源于已知蛋白NEWM，对于Ig kappa链可变区(VK)优选的人抗体来源于已知蛋白KOL。
所选择的插入人源化抗体的非-人CDR部分要足以能够使人源化的抗体与Fc受体结合。该部分的选择方法是将此CDR部分插入人抗体中，然后用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定所产生的人源化抗体的结合能力。
特定人抗体的所有CDR都可被至少一部分份非人抗体的CDR所取代，或者某些CDR可被非人抗体所取代。唯一的要求是代入必需量的CDR，使人源化抗体能与Fc受体结合。来源于鼠单克隆抗体(mab)的非人CDR，mab22，在国际专利申请公布号W/O94/10332中已有描述，该专利的内容在此全部引入作为参考。该mab22抗体是对Fc受体特异的，在1988年9月4日颂布的美国专利NO.4,954,617中对此有进一步的描述，该专利的内容亦明确引入作为参考。人源化的mab22抗体产生的细胞系已于1992年11月4日保藏在美国典型培养物保藏中心，名称为HA022CL1，登记号为CRL11177。
抗体可用任何方法人源化，该方法可以用来源于非人抗体的CDR取代至少一个部份人抗体的CDR。Winter描述了可用来制备本发明人源化抗体的方法(英国专利申请GB2188638A，1987年3月26日提出)，该专利已明确引入作为参考。采用寡核苷酸定点突变的方法，可使人的CDR被非人的CDR所取代，该方法如在国际专利申请公布号：WO94/10332中所述，其题为，人单核吞噬细胞上免疫球蛋白G的Fc受体的人源化抗体。
除了抗Fc受体部分以外，多特异性分子可包括“抗靶部分，”即某种抗体、功能性抗体片段或配体，它能识别和结合病原体(例如病毒、细菌、真菌)、病原体感染的细胞、癌或瘤细胞(例如乳房、卵巢、前列腺等)或治疗对象(例如人或动物)体内其他不希望有的细胞或抗原，或它们的经修饰的形式。此外，该靶部分可含有抗原，或可被导向抗原。优选的实施方案中包含可用来刺激免疫系统的抗原，例如慢性感染的情况，以耗竭循环中的抗原，并治疗肿瘤。在特别优选的实施方案中，抗原是连接到含有抗FcR抗体的多价分子上的。
在本发明特定的实施方案中，该多特异性分子含有配体。该配体可以是与某种分子反应的任何配体。在优选的实施方案中，该配体与蛋白，例如在靶细胞，如癌细胞，表面的蛋白结合。优选的配体包括受体配体，例如生长因子或分化因子。举例来说，多价分子可包括表皮生长因子，或至少包括能与受体，如表皮生长因子受体反应的部分或其修饰形式。在本发明另一优选的实施方案中，该配体是小的肽链，例如铃蟾肽、胃泌素释放肽(GRP)、西滨蛙肽、神经调节肽B，或神经调节肽C。上述这些肽的序列可以查到，例如在美国专利No.5,217,955中可查到，该专利的内容在此引入作为参考。上述抗体也可以是这些肽的修饰形式。该修饰可以增强对受体的结合，也可减弱或不影响与受体的结合。配体的修饰可将兴奋剂转变为拮抗剂，这样，配体就可抑制而不是刺激细胞的增殖。该抗体的修饰可以是至少加入、缺失或替代一个氨基酸。
在本发明特定的实施方案中，多价或双特异的分子含有某种抗原。此处所用的术语“抗原”是指任何天然的或合成的免疫原性物质、免疫原性物质的片段或部分、肽的表位，或半抗原。该术语“抗原”还包括在非复合状态时是非免疫原性的，但在复合状态时是免疫原性的物质。术语“非复合的”包括不连接成本发明的分子复合物的物质。术语“复合的”包括连接形成本发明的分子复合物的物质。
在本发明的一个实施方案中，采用了双或多特异的分子，用以将抗原导向细胞，以增强细胞对抗原的内源化和递呈的加工作用，最终刺激其免疫应答。在特定的实施方案中，该双特异结合剂与抗原特异结合(直接与抗原表位结合，或间接与抗原连接的表位结合)，并同时与抗原递呈细胞的表面受体结合，该细胞可使抗原内源化，以便对其进行加工和递呈。在另一实施例中，抗原连接到多或双异特分子上，并同时与抗原递呈细胞的表面受体结合。这些双或多特异分子的受体结合组分(由此，也是双或多特异分子本身)与抗原递呈细胞的受体结合。在某些情况下，该特异分子在其未基本上被该受体的天然配体所封闭的情况下发生结合反应，结果，将抗原导向受体的过程不会受到生理水平上的配体的阻止，而且经导向后的受体仍保留结合该配体的能力和功能。
抗原的一种类型可以是变应原。“变应原”是指能对敏感对象引起变应或哮喘反应的物质。变应原的名单很庞大，可包括花粉、昆虫毒液、动物皮屑、真菌孢子和药物(如青毒素)。天然的、动物的和植物的变应原例子包括对以下各属特异的蛋白：犬属(例如普通犬)；表皮螨属(例如法嗜皮螨)；猫属(例如家猫)；豚草属(例如豚草)；黑麦草属(例如多年生黑麦草或多花黑麦草)；杉属(日本杉)；交链孢属(链格孢)；赤杨；桤木属(欧洲桤木)；桦木属(疣皮桦)；栎属(白栎)；齐墩果属(欧洲齐墩果)；篙属(Vulgaris篙)；车前草属(例如长叶车前)；墙草属(例如药用墙草或judaica墙草)；姬蠊属(例如德国蠊)；蜜蜂属(例如多花蜜蜂)；柏木属(例如地中海柏木、缘干柏木、大果柏木)；刺柏属(例如沙比桧、北美圆柏、欧洲杜松和Juniperus ashei)；崖柏属(例如侧柏)；扁柏属(例如日本扁柏)；大蠊属(例如美洲大蠊)；冰草属(例如偃麦草)；黑麦属(例如黑麦)；小麦属(例如小麦)；鸭茅属(例如鸭茅)；羊茅属(例如高羊茅)；早熟禾属(例如草地早熟禾或压扁早熟禾)；燕麦属(例如燕麦)；绒毛草属(例如绒毛草)；黄花茅属(例如香黄花茅)；燕麦草属(例如燕麦草)；剪股颖属(例如小糠草)；梯牧草属(例如梯木草)；鹃草属(例如鹃草)；雀稗属(例如Paspalumnotatum)；高梁属(例如Sorghum halepensis)；以及雀麦属(例如无芒雀麦)。
许多变应原可发现于空气传播的豚草花粉、青草、或树木、或在真菌、动物、房屋尘土、或食物中。从整个类别来看，这些变应原相对比较耐受蛋白酶的消化。优选的变应原是与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE结合，由此引起I型过敏性超敏反应的变应原。当多价试剂中至少有一个对高亲和力Fc受体的表位的特异性而且该表位在IgG的配体结合区之外时，这种双特异结合剂可降低治疗对象的超敏性。在变应原与肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的IgE结合之前，上述双特异结合剂竞争形成IgE-结合的变应原，由此可降低I型超敏反应的可能性从而达到上述降低治疗对象超敏性的目的。此外，由于将变应原定向到FcΥR上，可能诱导使T细胞处于耐受变应原的状态，这样便可干扰IgE介异的I型反应。上述T细胞的耐受状态可由以下方法达到：用大致低于当前所用量的变应原，诱导与IgE竞争结合变应原的IgG。
在某些情况下，希望将弱抗原的或非抗原的物质按其原样(如半抗原)偶联到载体分子上，例如某种大的免疫原性分子(如细菌毒素)，以便用于给药。
在这些例子中，在制备双特异结合试剂时，是与偶联了上述物质的载体的表位结合，而不是与该物质本身的表位结合。
与本发明的多或双特异分子可直接或间接连接的抗原可以是可溶的，或是颗粒；它可以载有B细胞表位，T细胞表位或二者都有。该抗原可以是细菌、病毒或起源于寄生虫。该抗原常常含有病原体有机体的表面结构的组分。例如，该抗原可含有某种病毒表面结构，例如人免疫缺陷病毒(HIV)或肝炎病毒表面抗原的包膜糖蛋白。此外，该抗原可以与疾病的细胞结合，例如肿瘤细胞，可产生对该细胞的免疫应答而治疗该疾病。该抗原可含有肿瘤特异或肿瘤结合的抗原，例如Her-2/ncu原癌基因产物，该基因在人乳房和卵巢癌细胞中表达(Slamon等(1989)Science 244：707)。
治疗对象的细胞可在体外或体内置于本发明的多价分子中，该多价分子可用于将抗原导向培养物中的抗原递呈细胞。从病人血液中分离出免疫活性细胞，然后将此细胞置于含有抗原的多价分子中，或者可将此细胞与多价分子一起置于抗原中，该多价分子具有对该抗原的结合特异性。靶向的抗原递呈细胞将会加工该抗原，并将其片段在细胞表面上递呈。经刺激后，可将该细胞送回到病人体内。
本发明的方法可用来增强或加强对抗原的免疫应答。例如，该方法对治疗慢性感染，如肝炎和爱滋病，是很有价值的，因为对于肝炎和爱滋病来说，其无助的免疫系统不能克服感染。该方法也可用于治疗感染的急性期，此时增强对侵入有机体的免疫应答可能是必要的。
采用该方法可减少得到保护的或治疗的免疫应答所需的抗原剂量，或该方法可用于宿主对抗原无应答或极少应答的例子中。虽然一般来说，都希望减少有效剂量，但当抗原对宿主有毒时，例如变性原的情况下，减少有效剂量是尤为希望的。含有抗原，或含有配体，例如与抗原反应的抗体，的双或多特异分子的使用方法和用途将进一步在公布的PCT申请PCT/US91/07283中描述。
在本发明的另一实施方案中，多特异分子含有经修饰的抗原，这样，通过抗原递呈细胞将修饰的抗原递呈到T细胞，可调节该抗原对T细胞的激活效应。Allan等实际上已表明，对于刺激T细胞的肽链，例如刺激T细胞的增殖的肽链，替代该肽链中的一个或一个以上的氨基酸可以产生不能刺激T细胞的抗原，或在T细胞中诱导无反应性的抗原。这种修饰的肽链称为改变的肽链配体(APL)。因此，这种APL可连接到含有至少一个FcγRI结合特异性的双或多特异分子上。通过抗原递呈细胞对这些分子的吞噬作用，并递呈到T细胞，可以抑制T细胞的增殖，或使其无反应性。因此，将下述多特异分子施予治疗对象将会诱导该治疗对象对抗原的耐受性，该多特异分子含有(a)至少一种改变肽链的抗原，该抗原能正常地刺激T细胞，但其经修饰后可诱导T细胞的无反应性；以及(b)至少一种抗-FcγRI抗体。由此，这种多或双特异分子可以用来使治疗对象耐受各种抗原，例如自身抗原。因此，依照所用的抗原，本发明的方法提供了增加免疫应答的方法，即采用刺激T细胞的抗原；同时本发明还提供了减少免疫应答的方法，即通过抑制T细胞的刺激，或诱导T细胞的无反应性。
本发明的多特异、多价分子还可包括“抗—增强因子(抗—EF)部分”。该“抗增强因子部分”可以是抗体、功能性抗体片段，或与抗原结合的配体，并由此增强了抗Fc受体部分或抗靶部分的效应。上述“抗增强因子部分”可结合某种Fc受体或某种靶。对于靶细胞经受抗原调整或抗原性变异(例如已描述过的某些寄生虫(如锥虫属)那样)的场合，包含与一种靶细胞抗原结合的抗靶部分，以及与不同靶抗原结合的抗增强因子部分的多价分子尤为有用。另一种情况是，该抗增强因子部分可与某种实体结合，此实体与结合抗靶或抗Fc受体部分的实体不同。例如，该抗增强因子部分可结合细胞毒的T细胞(例如通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAMI或其它引起增加对靶的免疫应答的免疫细胞)。
制备多特异分子的方法
上述的多特异分子可由很多种方法制备。例如，两种特异性可以在同一载体内编码，并在同一宿主细胞中表达和装配。在多特异分子是下面实施例中所述的(配体)×(fab)融合蛋白的场合，上述的方法尤为有用。本发明的双特异分子可以是单链的双特异分子，例如单链双特异抗体、包含一种单链抗体和配体的单链双特异分子，或包含二种配体的单链双特异分子。多价分子也可以是单链分子，或可包含至少二个单链分子。制备双或多价抗体的方法如以下专利中所述：美国专利号5,260,203；美国专利号5,132,405；美国专利号4,881,175；美国专利号5.132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858。
单链分子与其特异靶的结合可通过此处实施例中所述的双特异ELISA证实。
另一种制备多特异分子的方法是分别产生多特异分子的每种特异性,然后将所生成的蛋白或肽链相互结合在一起。例如，两种人源化的抗体可通过其两条重链C末端铰链区的巯基结合。在特别优选的实施例中，先将区修饰，使其含有奇数的巯基残基，优选为一个，然后结合在一起。
本发明的双特异分子可采用以下实施例中所述的方法，或用本领域熟知的方法，将抗FcR和抗靶部分结合在一起而制成。例如，很多偶联剂或交联剂可用于共价结合。交联剂的例子包括蛋白A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸盐(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸盐(SPDP)，以及硫代琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸盐(硫代SMCC)(参见例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.med.160：1686；Liu，MA等(1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)、Brennan等(Science(1985)229：81-83)，以及Glennie等(J.Immunol.(1987)139：2367-2375)所描述的方法。优选的结合剂为SATA和硫代SMCC，二者均可由Pierce ChemicalCo.(RockFcrd，IL)供应。
在采用抗体作为多特异分子的结合特异性时，优选的抗体包括人单克隆抗体和人源化的抗体(包括其片段，例如Fab′和单链Fv)。制备人源化抗体的方法在本领域是熟知的，并在下面的实施例中详述。全人单克隆抗体的制备方法在本领域也是熟知的。这些抗体可用各种技术生产，包括传统的单克隆抗体操作法，例如KoRler和Milsten的标准的体细胞杂交技术，Nature 256：495(1975)。虽然原则上是优选体细胞杂交方法，但其他生产单克隆抗体的技术也可采用，例如病毒或原癌基因的B淋巴结胞转化。
优选的制备杂交瘤的动物系统为鼠系统。在小鼠中生产杂交瘤是很成熟的方法。将免疫接种的脾细胞分离，并用于融合的免疫接种方案和技术在本领域是熟知的。融合的配对物(例如鼠的骨髓瘤细胞)以及融合的方法也是已知的。
在优选的实施例中，人单克隆抗体用携带人免疫系统，而不是鼠系统的转基因小鼠来生产。这些转基因小鼠，此处称为“HuMAb”小鼠，含有人的免疫球蛋白基因的小基因座，它可编码未重排的人重链(μ和γ)和K轻链免疫球蛋白序列，以及含有使内源的μ和K链失活的基因座(Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠表现出鼠IgM或K的表达减少，在免疫应答中，引入的人重链和轻链转基因经受类别转换和体细胞突变，产生高亲和力的人IgGk单克隆(Lonberg，N.等(1994)，Supra；Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113：49-101中的综述；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immun01.Vol.13：65-93，以及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764：536-546)。HuMab小鼠的制备在下面II部分以及下列文献中详细描述：Taylor，L.等(1992)Nucleic AcidsResearch20：6287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等(1993)EMBOJ.12：821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology 113：49-101；Taylor，L.等(1994)International Immunology 6：579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93；Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有上述文献的全部内容在此引入作为参考。进一步参见lonberg和Kay，以及GenpharmInternational的美国专利No.5,545,806和5,625,825；Surani等的美国专利No.5,545,807；国际公布号WO 98/24884,1998年6月11日公布；WO94/25585，1994年11月10日公布；WO 92/03918，1992年3月19日公布；所有这些公开在此全部引入作为参考。另外，实施例2中所述的HCO12转基因小鼠可用于产生全人单克隆抗体。
如Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1986)Nature Biotechnology14：845-851以及WO98/24884中所述，为了生产全人单克隆抗体，用纯化的或富含所要求的免疫原的制剂，和/或表达该所要求的免疫原的细胞对小鼠免疫接种。优选该小鼠的年龄按首次输注日算为6-16周。例如，纯化的或富含HER2/neu抗原的制剂(5-20μg)可用于小鼠腹膜内免疫接种。在用纯化或富含HER2/neu抗原免疫接种后未产生抗体的情况下，也可用表达HER2/neu的细胞，例如肿瘤细胞系，对小鼠免疫接种，以促进其免疫应答。
使用各种抗原的累积经验表明，用以下方法免疫接种，HuMAb转基因小鼠的应答最好，即初始先用包含在福氏完全佐剂中的抗原对小鼠腹膜免疫接种(IP)，随后每隔一周用包含在福氏完全佐剂中的抗原IP免疫接种(直至总数为6次)。该免疫应答可用血浆样品在免疫接种的全过程进行监测，所用血浆样品由眼眶后血获得。用ELISA对血浆进行筛选(如下所述)，具有足够滴度的抗所需免疫原的人免疫球蛋白的小鼠可用作融合体。小鼠可用抗原通过静脉刺激3天，然后将其处死，取出脾脏。每种抗原要求做2-3个融合体。每种抗原免疫接种六只小鼠。例如，共免疫接种12只HC07和HC012株系的HuMAb小鼠。
随后将鼠的脾细胞分离出来，用PEG按照标准方案将其与鼠骨髓瘤细胞融合。然后对所得的杂交瘤进行筛选，用于生产抗原特异的抗体。例如，用50％的PEG，将免疫小鼠脾淋巴细胞的单细胞悬浮物与其1/6数量的不分泌P3×63-Ag8.563的鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。将细胞按约2×105的量涂于平底微滴定板上，随后在选择性培养基上培养二星期，该选择性培养基含有20％的胎克隆血清，18％“653”调节的培养基，5％origen(IGEN)，4mML-谷氨酸，1mML-谷氨酸，1mM丙酮酸钠，5mM HEPES，0.055mM2-巯基乙醇，50μ/ml青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素和1XHAT(Sigma；该HAT在融合24小时后加入)。2星期后，将细胞在用HT代替HAT的培养基中培养。用ELISA对每个孔进行筛选，选出抗所要求的免疫原的人单克隆IgM和IgG抗体。一旦出现杂交瘤大面积生长的状况时，通常在10-14天后检查培养基。替换分泌抗体的杂交瘤，再筛选，如果对抗所要求的免疫原的人IgG单克隆抗体仍为阳性，则可用有限稀释法至少亚克隆二次。然后将稳定的亚克隆在体外培养，以在组织培养基中产生少量的抗体用作鉴定。
为了鉴定人单克隆抗体的结合，可对免疫小鼠的血清进行测定，例如用ELISA。简略来说，用所要求的免疫原(纯化的)覆盖微孔滴定板，该免疫原用PBS配制，约0.25μg/ml，然后用5％溶于PBS的牛血清蛋白封闭上述微孔滴定板。将稀释的小鼠血清加入每个孔内，该小鼠已用所要求的免疫原免疫接种，并在37℃下温育1-2小时。用PBS/Tween洗涤该板，然后用偶联碱性磷酸酶的羊抗人IgGFc特导的多克隆试剂在37℃下温育1小时。洗涤后，该板用pNpp底物(1mg/ml)显色，并在OD405-650分析。优选显示出最高滴度的小鼠用作融合体。
上述ELISA分析也可用于筛选与所要求的免疫原呈阳性反应的杂交瘤。与所要求的免疫原以高的抗体亲抗原性结合的杂交瘤可以亚克隆，并进一步鉴定。从每种保留其亲本细胞反应性的(用ELISA法)杂交瘤中选出一个克隆，用来制备5-10管细胞库，贮存于-140℃，用于抗体纯化。
抗所要求的免疫原的人单克隆抗体可按下法纯化，即将选出的杂交瘤在2升的旋转烧瓶中生长，以纯化单克隆抗体。上清液可经过滤和浓缩后，用蛋白A-Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)亲和层析。洗脱的IgG可用凝胶电泳和高效液相层析检测，以保证其纯度。缓冲液可经交换成为PBS，通过OD280的测定，用1.43的消光系数可确定该单克隆抗体的浓度。该单克隆抗体可分成数份并贮存于-80℃下。
为了确定所选择的人单克隆抗体是否与所要求的免疫原的独特表位结合，可用市售的试剂(Pierce，RockFcrd，IL)将每种抗体生物素化。用ELISA板进行非标记的单克隆抗体和生物素化抗体的竞争性研究，该板如上所述，覆盖了所要求的免疫原。生物素化mAb的结合可以用链霉亲和素-碱性磷酸酶探针检测。
为了确定纯化的抗体的同种型，可进行同种型的ELISA。微滴定板的孔覆盖以10μg/ml的抗人Ig，在4℃下放置过夜。用5％BSA封闭后，使该板与10μg/ml的单克隆抗体或纯化的同种型对照在常温下反应2小时。然后使该孔与人IgG1或人IgM特导的碱性磷酸酶偶联探针反应。再如上所述将板显色并进行分析。
为了证实单克隆抗体与活细胞的结合，该活细胞表达所要求的免疫原，例如肿瘤细胞受体，可以采用流式细胞计量法。简要来说，将表达所要求的免疫原的细胞系(在标准的生长条件下生长)与不同浓度的单克隆抗体混合，并在37℃下温育1小时，该单克隆抗体溶于含有0.1％Tween 80和20％鼠血清的PBS中。经洗涤后，将该细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体反应，反应条件与第一抗体染色的条件相同。样品可用利用光及其侧向散射性质的FACScan仪器分析。除了用流式细胞计量法分析以外另一种方法是用荧光显微镜进行分析。细胞完全按上述方法染色，并用荧光显微镜检查。该方法可看得见单个细胞，但降低了依赖于抗原浓度的灵敏度与所要求的免疫原结合的人IgGs可用Western印迹法进一步测试其与所要求的免疫原的反应性。简要地说，由表达所要求免疫原的细胞制备细胞提取物，然后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜上，用20％鼠血清封闭，然后用被测的单克隆抗体探测。采用抗人IgG碱性磷酸酶，并用BCIP/NBT底物片剂显色，可检测到人IgG的结合。
多特异分子的治疗用途
根据多特异分子与FcR的结合能力，该FcR载有免疫细胞和特定的靶细胞，特定的多特异分子可施予治疗对象，以治疗或预防各种疾病或改善健康状况，其中包括：癌(例如乳癌、卵巢癌、小细胞肺癌)、病原体感染(例如，病毒(如HIV))、原生动物(如鼠弓形体)、真菌(如念珠菌病)、自身免疫性(例如，免疫性血小板减少紫癜和系统性狼疮)。该多特异分子也可通过接种疫苗施入治疗对象体内，以抵抗靶细胞的感染。
对于在治疗方面的应用，可以用任何方式将有效量的合适的多特异分子对治疗对象给药，这方式可使该分子实施其预想的治疗效果。优选的给药方式包括口服和经皮给药(例如通过斑点给药)。其他给药方式的例子包括注射(皮下、静脉、非肠道的、腹膜内、鞘内的等)。该注射可以是分次的，也可以连续输注。
多特异分子可以与药用载体一起同时给药。此处所用的短语(药用载体)是指包括能与多特异分子一起给药，并使该分子实施其预期的功能的物质。这类载体的例子包括溶液、溶剂，分散介质、滞留剂、乳化剂等。这种介质用作药物的活性物质在本领域是众所周知的。任何其他适合于与该分子一起使用的常规用载体都在本发明的范围内。
术语多特异分子的“有效量”是指必需或足以识别所需的生物效应的量。例如，对于有效量的多特异分子，其中抗靶部分识别病原体细胞，该有效量是消除肿瘤、癌或细菌、病毒或真菌感染所必需的量。对任何特定应用，其有效量可以不同，它取决于以下的因素，例如被治疗的疾病或治疗对象的健康状况；用于给药的特定的多特异分子；治疗对象的体重；或疾病的或健康状况严重性。本领域的一种普通技术是从经验上确定特定多特异分子的有效量，而无需过多的试验。
以下的实施例对下面的发明作进一步的阐述，但不会构成更多的限制。本申请所列举的所有参考文献、正在申请中的专利和公布的专利的内容，在此特意引入，作为参考。实施例实施例1包含对Fc受体特异的鼠或人源化抗体和抗-her 2 neu抗体的双特异性抗体的生产
单克隆抗体
抗FcγRI单克隆抗体(mAb)M22、M32.2和197用离子交换层析和DZ33从杂交瘤血清中提纯，人抗HIV-1 IgG1 mAb用蛋白A亲和层析法(Pharmacia，Piscataway，NJ)和凝胶过滤从杂交瘤上清中提纯。M32.2于1987年7月1日保藏在美国典型培养物保藏中心，12301 ParklawnDrive，Rockville，MD 20852，并已被指定ATCC登记号HB9469。
细胞系
鼠杂交瘤NSO(ECACC 85110503)为非Ig合成系，并用于重组mAbs的表达。NSO细胞在DMEM加10％牛胎儿血清(FBS，Gibco，Paisley，U.K)中培养。SKBR-3为HER2/neu原癌基因(ATCC，Rockville，MD)高表达的人乳癌细胞系，并在Iscove改良的Dulbecco的培养基(IMDM，Gibco，Grand Island，NY)中培养。U937为表达FcγRI的单核细胞系，从ATCC获得，并在RPM-1640加10％FBS(Gibco，Grand Island，N Y)中生长。
鼠免疫球蛋白区V基因的克隆
鼠杂交瘤22胞质RNA按Favaloro等所述的方法制备(Favaloro，J.，R.Treisman和R.Kamen(1982)多瘤特异的RNA转录图谱：二向S1凝胶图谱分析。酶学方法65：718)。IgV区的cDNA由RNA通过反转录制备，起始引物为CGlFOR和CK2FOR，制备方法如国际专利申请公布号WO 94/10332中所述，该专利题为人单核吞噬细胞上免疫球蛋白Fc受体的人源化抗体。上述cDNA在标准条件下，用100 U MMLV反转录酶(Life Technologies，Paisley，UK)合成。用PCR扩增该VH和VкcDNA，(Orlandi，R.，D.H.Güssow，P.T.Jones和G.Winter(1989)(用聚合物链反应克隆用于表达的免疫球蛋白可变域)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：3833)，所用的cDNA引物与国际专利申请公布号WO 94/10332中所述的SH2BACK和VK7BACK一致。将扩增所得的DNA纯化，克隆到M13中，并用T7 DNA聚合酶(Pharmacia，Piscataway，NJ)由双脱氧法进行序列分析。
嵌合抗体基因的构建为了便于将鼠的V区DNA克隆到表达载体中，可将限制性位点置于与M22 V区基因末端最靠近之处。对于VH，可用引物VHlBACK和VHlFOR(Id.)通过PCR，在克隆的鼠VH基因的5′端和3′端分别引入PstI位点和BstEII位点。对于Vκ，可用引物VKlBACK和VKlFOR(Id.)通过PCR，将Pvu II位点和Bg lII位点分别引入克隆的鼠Vκ基因的5′端和3′端。在某些例子中，这些引物与天然存在的基因相比，改变了一个或一个以上的氨基酸。用合适的内切酶将这些V区基因(ChVH和ChVK)切下，并克隆到含有Ig启动子、信号肽和剪接位点的M13VHPCR1和M13VKPCR1(Id.)中。从M13中切出HindIII-BamHI DNA片段并克隆到表达载体pSVgpt和pSVhyg中，该表达载体含有人IgGl，(Takahashi，N.等，(1982)，人免疫球蛋白γ基因的结构：基因家族进化的意义，Cell，29：671)，以及人kappa恒定区基因组DNA(Hieter，R.A.等，(1980)克隆的人和鼠kappa免疫球蛋白恒定区和区基因功能区的保守同源性，Cell 22：197)。
人源化抗体基因的构建
按照NEWM(Poljak，R.J等，人杂交瘤免疫球蛋白(IgG New)，Biochemistry，16：3412)，和KOL(Marquat，M.等，(1980)完整免疫球蛋白分子Kol及其抗原结合片段在3.0A和1.9A分辨率的晶体学精修和原子模型，J.Mol.Biol.141：369)的人VHs，构建了二条人源化的重链。人源化的轻链来源于人的Bence-Jones蛋白REI，(Epp，O.等，(1974)由Bence-Jonce蛋白REI可变部分组成的二聚体的晶体和分子结构，Eur.J.Biochem.45：513)，其中某些构架区(FR)有所改变。该修饰使Vκ功能区成为更典型的人亚组I，该修饰包括用39位的赖氨酸、104位的缬氨酸、105位的谷氨酸和107位的赖氨酸取代39位的苏氨酸、104位的亮氨酸、105位的谷氨酰胺和107位的赖氨酸。此外4位的甲硫氨酸改变为4位的亮氨酸，以适应成为PvuII限制性位点的需要。
将含有NEWM VH和REIVκFR的DNA分别连同无关的CDR克隆到载体M13VHPCR1和M13VKPCR1中(Favaloro等，Supra)。用编码KOL FR氨基酸的寡脱氧核糖核苷酸和无关的CDR，通过连续的一系列PCR，构建编码KOL VH的DNA。然后将此构建物克隆到M13VHPCR1中。
合成用于编码mAB M22 CDR的寡脱氧核糖核苷酸，其两侧是与人FR相应的核苷酸。对人源化的NEWM VH，该合成引物包括鼠FR氨基酸的27位苯丙氨酸、28位异亮氨酸和71位精氨酸，因为这些氨基酸可能影响抗原的结合，(Chothia，C.和A.M.Lesk(1987)，免疫球蛋白高变区的规范结构，J.Mol.Biol.，196：901；Tramontano，A.等，(1990)，构架残基71是免疫球蛋白VH功能区中第二高变区的位置和构象的主要决定簇，J.Mol.Biol.，215：175)。对人源化的Vκ，同样包括鼠氨基酸的71位苯氨酸作为能影响亲和性的残基，(Foote，J.和G.Winter，(1992)，影响高变环的构象的抗体构架残基，J.Mol.Biol.224：487)。KOL VH中不包含鼠FR残基。将寡脱氧核糖核苷酸的5′端磷酸化，并在含有M13单链DNA模板的反应中和M13通用正向引物一起与克隆在M13中的人V区基因退火，用2.5U T7 DNA聚合酶(United States Biochemicals，Cleveland，OH)和0.5U T4 DNA连接酶(Gibco BRL，Grand Island，NY)使DNA延伸和连接。该突变的链优选用M13反向测序引物，用1U VentDNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)从延伸/连接混合物中扩增，然后用M13正向和反向引物，通过PCR扩增。用BamH1和HindIII切下产生的DNA，克隆到M13中，并通过DNA序列分析鉴定三种CDR-移植的突变体。对含有人源化V区的M13克隆进行全面的序列分析，以确定无假的突变体存在。用Hind III和BamH I从符合要求的克隆中切下RF DNA，克隆到pSVgpt或pSVhyg中，并确切按照构建嵌合抗体基因方法所述加入人的IgG1或人的kappa恒定区。
重组mAbs的表达和纯化
重链(5μg)和轻链(10μg)表达载体用PvuI消化、乙醇沉淀并溶于50μl水中。离心收集NSO细胞(1-2×107)，重悬于0.5ml DMEM中，并在0.4cm的电穿孔杯中与上述DNA混合。5分钟后，将细胞置于冰上，并对其施加170V，960μF的单脉冲(GenePulser，Bio-Rad，Melville，NY)，然后在冰上再保温15分钟。让细胞在DMEM中恢复24-48小时。在培养基中加入霉酚酸(0.8μg/ml)和黄嘌呤(250μg/ml)，使其成为选择性培养基。将细胞按每份200ul分到96孔板中。再过10-12天后，根据ELISA测定，从上述孔中选出抗体水平最高的细胞，然后用有限稀释法进行克隆。
用蛋白A亲和层析(Boehringer Mannheim，Lewes，U.K.)从生长茂盛的培养物中纯化抗体。测定A280nm，确定其浓度，并用ELISA和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步证实。
用ELISA测定抗体的结合
用溶于50mM、pH9.6碳酸氢盐缓冲液中的羊抗-人IgM抗体(Sera-Lab，Crawley Down，U.K.)覆盖微滴定板的孔，然后用1％BSA将该板封闭，随后加入可溶的融合蛋白，该融合蛋白含有从短暂转染的COS细胞(该表达载体由Dr.Brian Seed惠赠，Massachusetts GeneralHospital，Boston，MA)得到的人Fcγ RI和人IgM重链(sFcγ RI-μ)的胞外区。然后在过量的(2.2μg/孔)人IgG1抗体(Sigma，St.Louis，MO)存在下，加入重组的22或对照mAbs，该人IgG1抗体含有λ轻链，用来通过其Fc部分封闭被测mAbs的非特异结合。随后用过氧化物酶标记的羊抗人kappa链抗体(SeraLab，Crawley Down，U.K.)和对苯二胺检测结合的22mAbs。
抗体的荧光化反应
加入0.1M Na2CO3将mAb溶液的pH调至9.3。异硫氰酸荧光素(FITC)(Sigma，St.Louis，MO)按2mg/ml的浓度溶于DMSO中。FITC按每μg mAb 40μg的量加入，并在室温下保温2小时，然后用G-25层析将荧光化的mAb与游离的FITC分离。
血细胞的制备
由肝素化的全静脉血制备黄色层。全血用含有5％右旋糖酐的RPMI按2.5∶1(v/v)的比例稀释。在冰上使红细胞沉降45分钟，然后将上清细胞转移至新的管中，并离心沉淀。残留的红细胞通过低渗裂解除去。其余的淋巴细胞、单核细胞和嗜中性白细胞置于冰上，备作结合分析之用。对于某些实验，嗜中性白细胞用Ficoll-Hypaque(Pharmacia，Piscataway，NJ)梯度分离与单核细胞分离。为了正调节FcγRI，嗜中性白细胞和单核细胞用细胞因子处理。单核细胞的培养物在37℃、5％CO2下保温48小时，培养物置于特氟隆培养皿内培养，其细胞含量为4×106细胞/ml RPMI，该RPMI含有2.5％AB型正常人血清(Sigma，St.Louis，MO)和500IRU/ml的IFN-γ((R & D Systems，Minneapolis，MN)。嗜中性白细胞在含有50ng/ml的G-CSF(由R.Repp，U.Of Erlanger，Germany惠赠)和500IRU/ml的IFN-γ的AIMV培养基(Gibco，Grand Island，NY)中培养48小时(37℃，5％CO2)。
流式细胞计量
细胞结合分析如前所述用96孔微量滴定板进行，(Guyre，P.M.等，结合在FcγR上不同表位的单克隆抗体能够引发受体功能。J.Jmmunol.，143：1650)。简而言之，将细胞用pH7.4，含有2mg/ml BSA和0.05％NaN3(PBA)的PBS洗涤，并用PBA调至2.0×107个细胞/ml。用PBA制备FITC标记的、未结合的抗体。将细胞(25μl)、抗体(25μl)和人血清(25μl)，或人IgG(10mg/ml，Sigma，St.Louis，MO)(25μl)，或PBA(25μl)加到微孔滴定板上，并在冰上放置45-60分钟。用PBA将细胞洗涤3次，除去孔中的未结合抗体。该细胞用1％的低聚甲醛固定。在Becton Dickinson FACScan上分析细胞结合的荧光。
BsAb偶联步骤
BsAb用Glennie等的方法构建，(Glennie，M.J.等，(1987)，含有硫醚键合Fab′γ片段的双特异性F(ab′γ)2抗体的制备和性能，J.Immunol.，139：2367)。mAbs 22(人和人源化的)和520C9(抗-HER2/neu)抗体用体外培养各自的杂交瘤细胞的方法生产。该抗体分别用胃蛋白酶消化，产生F(ab′)2，随后加入10mM巯基乙醇胺，30℃下处理30分钟后将其还原为Fab′。将此Fab′加到Sephadex G-25柱上(4℃)，该柱已用pH5.3、含0.5mM EDTA的50mM醋酸钠平衡。在M22×520CP的场合，将溶于二甲基甲酰胺，并在甲醇/冰浴中冷却的邻苯二马来酰亚胺(o-PDM，12mM)加(一半体积)到鼠的22 Fab′中；在H22×520C9的场合，将上述同样的O-PDM加到520C9 Fab′中，然后在冰上保温30分钟。然后用在pH5.3，含0.5mM EDTA的50mM醋酸钠中平衡的Sephadex G-25柱将Fab′-马来酰亚胺与游离的o-PDM分离(4℃)。对于BsAb的制备，可将M22 Fab′-马来酰亚胺按摩尔比为1∶1加到520C9Fab′中，或将520C9 Fab′-马来酰亚胺按摩尔比为1∶1加入H22 Fab′中。将反应物在Amicon chamber中用Diaflo膜在氮气氛下浓缩至原始体积(在4℃下)。18小时后，用1M Tris-HCl，pH8.0将pH调至8.0。然后用10mM MEA将混合物还原(30分钟，30℃)，并用25mM碘乙酰胺烷基化。用PBS平衡的Superdex 200(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱将双特异性的F(ab′)2与未反应的Fab′分离。
依赖于抗体的细胞的细胞毒性(ADCC)
HER2/neu高表达的人乳癌细胞SKBR-3用作靶细胞，被细胞因子激活的嗜中性白细胞所裂解(参见血细胞的制备)。靶细胞用100μCi51Cr标记1小时，然后在U形底的微量滴定板中与嗜中性白细胞和抗体结合。在37℃下保温5小时后，收集上清并作放射性分析。细胞毒性按以下公式计算：裂解％＝(实验的CPM-靶泄漏的CPM/洗涤剂裂解的CPM-靶泄漏的CPM)×100％。特异裂解＝有抗体的裂解％-无抗体的裂解％。用三份重复样品进行分析。
过氧化物诱导
U937细胞用于测定H22通过FcγRI引发过氧化物爆发集落的能力，(Pfefferkorn，L.C.和G.R.Yeaman(1994)，IgA-Fc受体(Fc×R)与FcεRIγ2亚单位在U937细胞中的结合，J.Immunol.153：3228；Hallet，H.B.和A.K.Campbell(1983)，多形核白细胞中刺激产生氧自由基的两种不同机制，Biochem J.216：459)。U937细胞在100U/ml的IFN-γ(Genentech，S.San Francisco，CA)存在下，在含10％FBS(Hyclone，Logan，UT)的RPMI-1640(Gibco，Grand Island，NY)中培养5天，以诱导分化并增加FcγRI的表达。实验结束后，将这些分化的细胞在含10％FBS的新鲜RPMI-1640中37℃下温育20分钟。然后将细胞沉淀，并按3×106个细胞/ml的浓度重悬于PBS中，该PBS添加了1mM CaCl2，1mMMgCl2，11mM葡萄糖，和100μg/ml BSA(Sigma，St.Louis，MO)。为了引发过氧化物的释放，将100μl的细胞加入含有0.1mM鲁米诺(Sigma，St.Louis，MO)、0.5mM钒酸钠(Sigma，St.Louis，MO)、以及mAb M22、H22或197的反应溶液中，并将其置于22℃下的发光计中。自细胞加入发光计中的反应溶液后，立即开始每隔30至40秒测量一次自发产生的过氧化物。每种mAb所用的浓度均为10μg/ml，以比较FcγRI与M22、H22或197交联所引发的过氧化物。对以mV/sec表示的过氧化物的产生监测20分钟，MAb M22、M32.2和197以不同的浓度加入，以确定过氧化物产生的剂量效应性。结果
鼠Ig V区基因
由M22杂交瘤RNA，采用对鼠的重链和kappa恒定区特异的引物制备Ig V区的cDNA，并根据已知的成熟V区的信号和/或5′端序列，采用另外一系列引物，通过PCR将上述cDNA扩增。组合使用SH2BACK/CG1FOR和VK7BACK/CK2FOR引物，得到预期大小的VH和VγPCR产物。将扩增的DNA用合适的内切酶消化，克隆到M13中，并从至少24个分别的克隆中确定二种不同方向的序列。推导的氨基酸序列示出在SEQ.ID Nos.29和30中。Vγ的4个N末端残基可由VKBACK引物编码。
M22 VH和Vκ分别是鼠重链亚组IIID和kappa亚组I的成员(Kabat，E.A.等，(1991)，免疫学重要蛋白的序列，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services)。除了在L97的残基以外，M22 Vκ的氨基酸序列与鼠抗IgG mAb A17的氨基酸序列相同(Shlomchik，M.等，鼠IgM抗IgG单克隆自身抗体(类风湿因子)的可变区序列。II由脂多糖刺激与由次生蛋白免疫所得hybridonias的比较，J.Exp.Med.165：970)。
人源化的mAbs及其结合的起始特性
M22 VH FR与KOL(人亚组III)的同源性(79％)大于与NEWM(人亚组II)的同源性(57％)。为了了解该差别对结合可能产生的影响，根据NEWM VH或KOLVH构建了重链，NEWM VH包括鼠的27位苯丙氨酸、28位异亮氨酸和71位精氨酸残基，后者KOL VH不含鼠的FR氨基酸。两种人源化的VH均与同一种来源于REI的人源化轻链配合。
人源化mAb的亲和力先通过ELISA测定其与FcγRI/IgM重链融合蛋白的结合来确定。该数据表明KOL VH/REI VκmAb与嵌合的mAb的结合力相同，而NEWM VH/REI VκmAb表现出比嵌合的mAb低约5倍的亲和力。非特异人IgG1 mAb的低结合力表明，＞95％的人源化mAbs的结合是通过Fv部分实现的，而不是通过Fc区结合。
对NEWM FR作其他的改变预期会恢复其亲和力，但这种改变会产生新的表位，这些新的表位可能会引起不希望有的免疫应答。因此，选择KOL VH/REI VκmAb，命名为H22，进一步检验其结合特性。
mAbH22的功能特性
进行了一系列的结合实验，以确定H22抗体的特异性和同种型。被荧光素结合的M22或H22染色的外周血白细胞证明了与单核细胞的特异结合约为每个细胞104个结合位点。相反，淋巴细胞或未刺激的嗜中性白细胞只有少量或没有特异结合(表1)：表1：H22与单核细胞的特异结合
抗体 单核细胞 淋巴细胞 PMNs
 M22  10,000a ＜1000 ＜1000
 H22  10,500 ＜1000 ＜1000
a每个细胞的抗体位点，2个重复试验的平均值为了证明H22和M22是在同一位点与FcγRI结合，同时还要证明H22也作为配体在Fc结合区结合，用两种抗FcγRI鼠mAb(M22和M32.2)和人IgG1 mAb进行竞争性实验。在过量的人IgG存在下，未结合的H22和M22同等地竞争结合为荧光素化的M22或荧光素化的H22。上述过量的人IgG用来饱和FcγRI上的Fc结合位点。如所预期的一样，抗FcγRI抗体M32.2，它在FcγRI上的结合位点与M22不同(Guyre，P.M.等，J.Immunol.143：1650)，也不能与M22-FITC竞争。此外，H22-FITC受H22的抑制，而不受无关系的人IgG1 mAb所抑制证实了FcγRI通过H22的V区结合的特异性。
H22，但不是M22，通过荧光素化的人IgG1，可以竞争Fc介导的与FcγRI的结合。该实验证明，H22而不是M22的Fc部分，结合到FcγRI的Fc结合区上。该结果与人IgG1抗体，而不是鼠IgG1，的Fc部分以高亲和力与FcγRI结合是一致的。
由于M22的人源化主要是为了增加其用于免疫治疗的潜力，因此，在人血清存在下，测定了H22与单核细胞和细胞因子激活的嗜中性白细胞的结合能力。H22-F1TC在人血清存在或不存在的情况下，以类似的亲和力结合到单核细胞上的FcγRI。与此相比，Fc介导的无关系的人IgG-FITC的结合则完全被人血清所抑制。同样，H22-FITC以类似的亲和力，在人血清存在和不存在的情况下，结合到IFN-γ-处理的嗜中性白细胞上。归纳起来说，以上数据证明，H22与FcγRI结合的途径有两条：通过其V区结合到FcγRI的不同于Fc结合区的位点上；通过其Fc区结合到FcγRI的配体结合区上。前者的结合活性有效地克服了人IgG1的抗体封闭。
H22 BsAb的功能活性
抗FcγRI抗体在免疫治疗上的最早应用是BsAb的建立，BsAb将携带FcγRI的效应细胞连接到肿瘤细胞、病毒、或病毒感染的细胞上。这种BsAb已经用M22建立；因此，对M22抗肿瘤BsAb(520C9×m22)和相应的H22 BsAb(520C9×H22)介导细胞毒性的能力作了比较。这些BsAb含有与抗HER2/neu抗体(520C9)的Fab′化学结合的H22或M22Fab′，因此对效应细胞触发分子FcγRI和肿瘤抗原是特异的。
M22来源的BsAb与H22来源的BsAb的比较通过ADCC分析来进行。M22和H22来源的BsAb介导杀伤HER2/neu高表达的SKBR-3细胞。鼠和人源化的BsAb均呈现类似的裂解携带抗原的靶细胞的水平。此外，两种BsAb在人血清存在下能保留ADCC活性，而过量的M22 F(ab′)2会引起杀伤的完全抑制。将这些结果综合起来考虑，可说明H22 BsAb诱导的裂解是通过M22表位介导的，同时也说明ADCC是FcγRI特异的。
最后，对H22和M22通过类似单核细胞的细胞系U937刺激过氧化物生产的能力进行评价。M22，仅通过其V区与FcγRI结合，诱导低水平的氧爆发集落，可能是由于它不能与受体有效地交联的原因。但是，H22，它可作为配体，通过其Fc区与FcγRI结合，此外，还可作为抗体，通过其Fv区与FcγRI结合而与FcγRI交联，因此诱导更多的过氧化物释放。实施例2：功能性H22表皮生长因子融合蛋白的制备材料和方法
表达载体和克隆
H22重链基因组克隆(pSVgpt)和轻链基因组克隆(pSVhyg)的表达载体如国际专利申请公布号：WO94/10332中所述，其题为，人单核吞噬细胞上免疫球蛋白G Fc受体的人源化抗体。对于Fab-配体融合结构，轻链必须改变。而对于重链来说，必须除去CH2和CH3区，并用编码该配体的序列替代。重链载体含有二个BamHI位点，一个在VH和CH1之间的内含子中，另一个正好在CH3的下游。利用该BamHI限制性位点，编码恒定区的DNA可被截短的，仅编码CH1和大部分铰链区的序列所取代。为此，采用聚合酶链反应(PCR)，用图1所示的改变，构建重链片段新的C末端。
图1[C]所示的结构中，在克隆的限制性位点XhoI和NotI的下游与BamHI的上游之间含有翻译终止密码子，该BamHI位点用来克隆VH下游的由PCR产生的新的CHI片段，而图1[C]所示的该结构用来产生融合蛋白结构。克隆位点用来插入编码EGF和其他配体的DNA，这些克隆位点位于大部分铰链区的下游，以保留Fd和配体区之间的柔韧性。另外，保留原先结构中单个的半胱氨酸残基，以便可通过其结合形成双体分子。
用PCR扩增编码该配体的DNA，并使该编码区的N端含有XhoI位点，而在C端含有NotI位点，然后将其以合适的阅读框在上述新构建的截短的H22重链片段的同样位点插入。编码表面生长因子(EGF)的cDNA由ATCC(#59957)获得。仅编码成熟EGF的53个氨基酸残基的DNA的克隆起始于971位的天冬酰胺，终于1023位的精氨酸，该成熟的EGF取自其约1200个氨基酸残基的前体(Bell，G.I.，Fong，N.M.，Stempien，M.M.，Wormsted，MA.，Caput，D.，Ku.L.，Urdea，M.S.，Rall，L.B.和Sanchez-Pescador，R.人表皮生长因子前体：DNA序列，体外表达和基因组构。Nocl.Acids Res.14：8427-8466，1986)。
表达
鼠骨髓瘤NSO(ECACC85110503)为非Ig合成系，并用于表达融合蛋白。最终的表达载体pSVgpt，由编码H22 Fd的DNA按读码框融合到EGF(如图2所示)上而构建成。该表达载体用BioRad Gene Pulser通过电穿孔法转染到NSO中，该NSO预先用含有编码H22轻链的DNA的pSVhyg转染过。这些多肽通过载体中的Ig启动子和Ig增强子表达，并通过位于该结构N端的mAb 22重链信号肽分泌。转染1或2天后，将霉酚酸和黄嘌呤加入培养基中，以选择吸收了该DNA的细胞。经ELISA证实其结合活性后，分离出单个生长的克隆并再亚克隆。
纯化
将表达H22-EGF融合蛋白的细胞亚克隆并扩充。将表达融合蛋白的克隆扩充并在旋转培养物中生长，然后将上清液澄清并浓缩。小规模的纯化采用亲和层析法在抗人Kappa链亲和柱(Sterogene.Carls bad，CA)中进行。纯化的蛋白用SDS-PAGE在5-15％的丙烯酰胺梯度凝胶上，在非还原的条件下分析。图3为制备抗Fc受体-配体融合蛋白的图示。
双特异的流式细胞计量法
为说明该融合蛋白能够同时与FcγRI和EGFR结合，建立了流式细胞分析法(图4)。在该分析中，不同浓度的H22-EGF融合蛋白，或双特异抗体BsAb H447(H22×H425，鼠单克隆抗体M425的人源化形式，它在配体结合位点与EGFR结合(E.Merck))与A431细胞温育，该细胞为表达EGF受体(EGFR)的细胞系(ATCC，Rockville，MD)。洗涤后，加入含有融合蛋白的上清液，该融合蛋白包括FcγRI的胞外区和人IgM的Fc部分。最后，加入藻红蛋白(PE)标记的mAb(32.2)，mAb(32.2)与FcγRI结合位点和mAb22与FcγRI的结合位点不同。该细胞然后用FACSAN分析。另一种方法是用过量的(100μg/ml)全鼠mAb 425(E.Merck)封闭EGFR的结合，然后用PE标记的抗人IgG检测BsAb或融合蛋白的结合。
ADCC
融合蛋白介导的ADCC用51Cr杀伤分析来测定。EGFR高表达细胞系，A431，用作人单核细胞裂解的靶细胞，该单核细胞在γ-干扰素(IFN-γ)中培养了24小时。靶细胞用100μCi的51Cr标记1小时，然后与效应细胞和抗体在U型底的微量滴定板中混合。在37℃温育5小时后，收集上清液并分析其放射性活度。细胞毒性按以下公式计算：裂解％＝(实验的CPM-靶泄漏的CPM/洗涤剂裂解的CPM-靶泄漏的CPM)×100％。特异裂解＝有抗体的裂解％/无抗体的裂解％。比较了融合蛋白与其各自的BsAb介导ADCC的能力。该分析还在25％人血清存在下进行，以证明人血清中的IgG或其他因子不会抑制融合蛋白介导的ADCC。结果
纯化
用H22-EGF重链结构转染表达H22 Kappa链的NSO细胞，选择抗霉酚酸和黄嘌呤的克隆并将其扩充，取其上清液在抗人Kappa柱(Sterogene，Carlsbad，CA)上经亲和纯化得到融合蛋白。用SDS-PAGE分析该纯化的蛋白，纯化蛋白迁移至表观分子量为50-55kDa的位置，表明该融合蛋白是以单体的形式表达，而不是二硫键结合的双体。此外，在表观分子量为25kDa之处可观察到一条带，有可能是游离的轻链。
结合特异性
设计了双特异FACS分析法，以证明该融合蛋白可同时与FcγRI和EGFR结合。图5表明，化学连接的全人源化BsAb H447(H22(抗FcγRI)×H425)和H22-EGF融合蛋白均以剂量依赖的方式，与A431细胞上的EGFR和可溶的FcγRI同时结合，其中全人源化BsAb H447按下面实施例3所述制备。
融合蛋白对EGFR的特异性可由鼠mAb，M425的能力来证明，该能力是指鼠mAb，M425在配体结合位点与EGFR结合，从而抑制了融合蛋白或H22×H425的结合。将不同浓度的BsAb H447，或H22-EGF融合蛋白，在过量的M425存在或不存在的条件下，与A431细胞温育。图6表明，BsAb以及该融合蛋白与EGFR的结合均被M425所抑制，证明了融合蛋白对EGFR的特异性。
ADCC
用A431细胞作为靶细胞，分析融合蛋白介导ADCC的能力。在IFN-γ存在下培养24小时的人单核细胞用作效应分子。图7证明全抗体、H425、BsAb H447(H22×H425)和融合蛋白介导A431细胞的剂量依赖的裂解。图8证明，尽管全抗体介导的ADCC被25％人血清(25％HS)所抑制，但人血清并不抑制融合蛋白介导的ADCC，而且，在此特定的实施例中，人血清增强了融合蛋白介导的ADCC。由于证明了融合蛋白能杀伤EGFR高表达的细胞，甚至在会存在于体内的表达FcγRI的效应细胞存在下，亦是如此，因此上述的结果有助于这些分子在临床上的应用。
H22-EGF融合蛋白的生长抑制性质
虽然EGF可刺激表达其受体的正常细胞的生长，但EGF也能抑制高表达EGF-R的肿瘤细胞的生长(Barnes，D.W.(1982)J.Cell Biol.93：1，MacLeod，C.L.等(1986)J.Cell.Physiol.127：175)。EGF和H22-EGF融合蛋白抑制A431细胞生长的能力按以下方法检测。
将2×104的A431细胞加入六孔板中的培养基中，该培养基为完全培养基或含不同浓度的EGF、H22-EGF、H22的Fab片段，或H425的F(ab′)2片段的培养基。7天后用血球计数器计数活细胞。该分析用二个重复样品进行，结果用平均值+/-标准偏差表示。
结果如图9所示。这些结果表明EGF和H22-EGF以剂量依赖的方式明显抑制了细胞的生长。相反，H425的F(ab′)2片段仅在高浓度时有一些抑制活性，而H22的Fab片段没有生长抑制活性。
由此，H22-EGF能够同时与FcγRI和EGF结合，说明了该分子已正确地折叠，并保留其同时与两种受体结合所需的柔韧性。此外，H22-EGF抑制表达EGF-R的瘤细胞系，A431，的增殖，说明与EGF类似，H22-EGF融合蛋白能够通过EGF-R给出信号。H22-EGF在表达FcγRI效应细胞存在下，也介导A431细胞的有效杀伤。因此，H22-EGF在表达EGF-R的细胞上介导细胞毒性和细胞静止效应。对有肿瘤的治疗对象施用H22-EGF可征集体内的天然细胞毒性效应细胞，从而通过三种可能的不同的模式-细胞毒性、生长抑制和吞噬作用介导肿瘤细胞的杀伤。而且，除了细胞介导的肿瘤细胞的细胞毒性之外，H22-EGF征集的效应细胞也可通过分泌炎症细胞因子，和/或加工和递呈肿瘤抗原到肿瘤特异的T细胞，从而进一步增大抗肿瘤的免疫力。实施例3：H22-Heregulin(H22-gp30)融合蛋白介导肿瘤细胞的杀伤
Heregulin(HRG)是HER3和HER4的配体。这两种受体均可与HER2形成异源双体，即一种在某些乳腺癌细胞中表达的分子。当HER3和HER4分子与HER2形成异源双体时，HRG对HER3和HER4的亲和力明显增加。该实施例证明，在携带FcγRI的细胞毒性效应细胞存在下，含有heregulin和FcγRI结合特异性的双特异分子可抑制肿瘤细胞的生长，并介导这些肿瘤细胞的融合蛋白依赖的细胞毒性。
H22-heregulin融合蛋白的构建方法与实施例2中所述的H22-EGF融合蛋白相同。简要来说，编码人抗FcγRI mAb，H22的Fd片段的基因组DNA与编码β2形式HRG的EGF区的cDNA融合。H22-HRG融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)如图10所示。此融合蛋白含有heregulin β2的171-239位氨基酸，该氨基酸在专利号为5,367,060的美国专利中示出。heregulin的其他部分，以及其他heregulin分子的部分，例如在专利号为5,367,060的美国专利中公开的部分都可采用。将所产生的H22Fd-HRG表达载体转染到骨髓瘤细胞系中，然后再用含有编码H22 kappa轻链DNA的载体转染。所产生的融合蛋白主要以单体的形式表达，尽管该蛋白在H22 Fab组分的铰链区含有游离的半胱氨酸残基。流式细胞计量分析表明，这种融合蛋白能与HER2高表达的肿瘤细胞系，SKBR-3，以及FcγRI表达细胞结合。
为测试H22Fd-HRG融合蛋白的生物活性，取表达该融合蛋白的骨髓细胞上清，稀释3倍或30倍，在IFN-处理的单核细胞存在下，将其加入PC-3细胞或表达HER2、HER3和HER4的SKBR-3肿瘤细胞中，单核细胞与靶肿瘤细胞比为100∶1。按实施例2中所述，单核细胞用IFN-γ处理，靶细胞用51Cr标记。特异裂解％按实施例2中说明的公式计算。结果在图11中描述。该结果说明，在细胞与稀释3倍的上清温育的情况下，约有45％的SKB R3细胞和高达49％的PC-3细胞裂解。
这种融合蛋白在携带FcγRI的细胞毒性效应细胞存在下，抑制SKBR-3肿瘤细胞的生长，并介导该细胞的融合蛋白依赖的细胞毒性。因此，本实施例的结果表明，抗FcγRI-heregulin融合蛋白在生理条件下，可介导抗肿瘤细胞毒性的活性，并说明这种融合蛋白在治疗各种癌症中将会有治疗的效用。实施例4：H22-铃蟾肽融合蛋白介导的肿瘤细胞杀伤
H22-铃蟾肽融合蛋白的构建方法类似于上述的H22-EGF融合蛋白。但是，因为铃蟾肽是短的肽链(14个氨基酸残基)，因此，将编码铃蟾肽正链和反链的DNA寡聚物杂交，产生该编码区，而不用PCR技术扩增编码铃蟾肽的cDNA。融合到H22抗体重链羧基端的铃蟾肽氨基酸序列如下所示：
-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-Gly(SEQ ID NO：5)该序列相当于铃蟾肽的2-14位氨基酸(Anastasi等(1971)Experientia 27：166)，并在该肽链的羧基端含有另一个甘氨酸残基。该寡聚物含有搭接的末端，该末端不杂交，而是产生粘末端，N末端为XhoI位点，在C末端为NotI位点，这样，该寡聚物就可克隆到上述的H22重链表达载体中。
如上述的H22-EGF和H22-heregulin融合蛋白一样，对H22-铃蟾肽融合蛋白在肿瘤细胞杀伤的生物活性进行研究。简要来说，用51Cr标记携带铃蟾肽受体的PC-3肿瘤细胞，并与单核细胞和不同浓度的H22-融合蛋白一起温育，然后如以上所述，测定融合蛋白依赖的裂解。图12所示的结果表明了靶细胞的裂解，而且靶细胞裂解水平的增加与分析中融合蛋白的加入量成比例。
另外，还生产了含有H22作为一种结合实体，以及CD4(AIDS贮藏处)或gp120(AIDS贮藏处)作为第二结合实体的融合蛋白。实施例5：由修饰的人源化抗体片段生产双特异抗体材料和方法
表达载体和克隆
H22重链基因组克隆的表达载体(pSVgpt)和轻链基因组克隆的表达载体(pSVhyg)如国际专利申请公布号：WO94/10332中所述，其题为，人单核吞噬细胞上免疫球蛋白G Fc受体的人源化抗体。对于Fab′结构，必须改变轻链。而对重链，其CH2和CH3区必须除去，并用终止密码子取代。重链载体含有二个BamHI位点，一个在VH和CH1之间的内含子中，另一个正好在CH3的下游。利用该BamHI限制性位点，编码恒定区的DNA可被截短的、仅编码CH1和大部分铰链区的序列所取代。为此，采用聚合酶链反应(PCR)，用图1所示的改变，构建重链片段新的C末端。图1[B]表示为产生截短的单巯基形式所做的改变。
表达
鼠骨髓瘤NSO(ECACC85110503)为非Ig合成系并用于表达修饰的H22抗体。最终的表达载体，即含有编码H22 Fd的DNA的pSVgpt结构，与含有编码H22轻链DNA的PSVhyg结构一起用BioRad GenePulser通过电穿孔法共转染。这些肽链通过载体中的Ig启动子和Ig增强子表达，并通过位于该结构N端的mAb22重链信号肽分泌。转染1或2天后，将霉酚酸和黄嘌呤加入培养基中，以选择吸收了该DNA的细胞，经证实其具有FcγRI结合活性后，将单个生长的克隆分离出来并亚克隆。
纯化
单巯基形式的H22抗体和全H425(抗EGFR)抗体的生产方法是，体外培养各自转染的NSO细胞。H425用蛋白A亲和层析纯化。单巯基形式的抗体H22用离子交换层析纯化，先用Q-Sepharose，随后用SP-Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)。单巯基形式的H22抗体的纯度用SDS-PAGE确定。
双特异抗体(BsAb)的制备
BsAb用Glennie等的方法构建(Glennie，M.T.等，(1987)，双特异F(ab′γ)2的制备和性质，含有硫醚键连接的Fab′γ片段，J.Jmmunol.，139：2367)。H425的F(ab′γ)2在pH3.5，0.1M的柠檬酸缓冲液中，通过有限胃蛋白酶解产生，并用离子交换层析纯化。在30℃下，将20mM的巯基乙醇胺加入mAbs中，使其还原30分钟。将Fab′片段加入SephadexG-25柱，该柱预先在含0.5mM EDTA，pH5.3的50mM醋酸钠中平衡(40℃)。将溶于二甲基甲酰胺，并在甲醇/冰浴中冷却的邻苯二马来酰亚胺(o-PDM，12mM)加入(一半体积)H22 Fab′中，并在冰上保温30分钟。然后用Sephadex G-25柱将Fab′-马来酰亚胺与游离的o-PDM分离(4℃)，该柱预先在含0.5mM EDTA，pH5.3为50mM醋酸钠中平衡。制备BsAb时，将H22 Fab′-马来酰亚胺按12∶1的摩尔比加入H425 Fab′中。反应物在氮气氛下，用Diaflo膜，在Amicon室中浓缩至起始体积(都在4℃)。18小时后，用1M Tris-HCl，pH8.0将其pH调至8.0。然后用10mMMEA使混合物还原(30分钟，30℃)，并用25mM碘乙酰胺烷基化。用在PBS中平衡的Superdex 200(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱将双特异F(ab′γ)2与未反应的Fab′及其他产物分离。
双特异流式细胞计量分析
为了表明用o-PDM方法以及用DTNB方法产生的BsAb能同时结合FcγRI和EGFR，建立了流式细胞计量分析法(图13)。在此分析中，不同浓度的两种BsAb与A431细胞温育，该A431细胞是表达EGF受体(EGFR)的细胞系。洗涤后，此细胞与含融合蛋白的上清液温育，该融合蛋白含有FcγRI的胞外区和人IgM的Fc部分。最后，该细胞与FITC标记的抗人IgM-特异抗体温育，然后用FACSCAN分析该细胞。
ADCC
用51Cr杀伤分析测定BsAb介导的ADCC。EGFR高表达的细胞系，A431，用作人单核细胞裂解的靶细胞，该人单核细胞在γ干扰素中培养了24小时。靶用100μCi的51Cr标记1小时，然后与效应细胞和抗体在平底的微量滴定板中混合。在37℃温育16小时后，收集上清液并分析其放射性活度。细胞毒性用以下公式计算：裂解％二(实验的CPM-靶渗漏的CPM/洗涤剂裂解的CPM-靶渗漏的CPM)×100％。抗体依赖的裂解％＝有抗体的裂解％-无抗体的裂解％。结果
纯化
用截短的H22重链结构和完整的kappa链结构共转化NSO细胞。选择抗霉酚酸和黄嘌呤的克隆并扩充，先用Q-Sepharose，随后用SP-Sepharose离子交换层析纯化上清液中的蛋白。纯化后的蛋白用SDS-PAGE分析。该纯化的蛋白迁移在表观分子量为50kDa的位置，表明该蛋白是以单体的形式表达，而不是二硫键结合的双体。
由单巯基H22与H425的Fab′(抗EGFR)结合构成的BsAb的结构与特性
由H22的单巯基与H425的Fab′片段，即人源化的抗EGFR mAb，结合，即构建成BsAb。该BsAb用o-PDM作为接头，按照Glennie等的方法制成(Glennie，M.J.等，(1987)，双特异F(ab′γ)2的制备和性质，含硫醚键连接的Fab′γ片段，J.Immunol.，139：2367)。比较了该BsAb与由DTNB法制备的BsAb的活性，后者所用的Fab′片段是由完整的H22经胃蛋白酶消化和还原而得到。为了证明这些BsAb能同时结合FcγRI和EGFR，设计了双特异FACS分析法。图14表明o-PDM连接的BsAb和DTNB法制备的BsAb均以剂量依赖的方式，同时结合A431细胞上的EGFR和可溶的FcγRI。
用A431细胞作为靶细胞分析二种BsAbs介导ADCC的能力。在IFN-γ存在下培养24小时的人单核细胞用作效应细胞。图15证明，二种BsAb以类似的方式介导A431细胞的剂量依赖裂解。这些结果证明，由截短的、单巯基形式的H22所产生的BsAb在表达FcγRI的效应细胞存在下，能杀伤EGFR高表达的细胞。实施例6：三价抗体的生产材料和方法
细胞系和抗体，M22，520C9，H425，SKB3和A431
用离子交换层析(Pharmacia，Piscataway，NJ)从杂交瘤上清中纯化M22和520C9，然后520C9用蛋白A亲和层析(pharmacia，Piscataway，NJ)进一步纯化。H425由杂交瘤上清液用蛋白A亲和层析(pharmacia，Piscataway，NJ)纯化。生产M22和520C9的杂交瘤在先前已有描述(Guyre等，(1989)结合到FcgRI上不同表位的单克隆体能触发受体功能，J.Immunol.143：5，1650-1655；Frankel等，(1985)由单克隆抗体确定的结合乳癌的抗原的组织分布，J.Biol.Response Modifiers，4：273-286)。鼠骨髓瘤NSO(ECACC85110503)是非Ig合成系，并用于表达人源化的mAb，H425(Kettleborough等，(1991)鼠单克隆抗体通过CDR移植的人源化：构架区残基对噜噗构象的重要性，Protein Eng.，4：773)。SKBR-3，(ATCC，Rockville，MD)高表达HER2/neu原癌细胞的人乳癌细胞系，和A431(ATCC，Rockville，MD)，高表达EGFR(ATCC，Rockville，MD)的人鳞状癌细胞系，在Iscov′s Modified Dulbecco′s Medium(IMDM，Giboc Grand Island，NY)中培养。
嗜中性白细胞的制备
嗜中性白细胞用菲可帕克(pharmacia，Piscataway，NJ)梯度分离，从单核细胞中分离。为了正调控FcγRI，嗜中性白细胞用细胞因子进行处理。嗜中性白细胞在AIM V培养基中(Gibco，Grand Isand，NY)培养24-48小时(37℃，5％CO2)，AIM V培养基含有2.5％正常人AB型血清(Sigma，St.Louis，MO)，50ng/ml G-CSF(由R.Repp，惠赠，U.of Eolanger，Germany)和100 IRU/ml IFN-γ。
结合方法
BsAb用Glennie等的方法(Glennie，M.J.等，(1987)，双特异F(ab′γ)2，含硫醚键连接的Fab′γ片段，的制备和性质，J.Immunol.，139：2367)构建。mAbs M22、520C9(抗HER2/neu，33)，和H425(抗EGFR)抗体由体外培养各自的杂交瘤细胞来生产。每种抗体的F(ab′)2通过在pH3.5，0.1M的柠檬酸缓冲液中的限制胃蛋白酶解而产生，该F(ab′γ)2然后通过离子交换层析纯化。在M22和H425中加入20mM的巯基乙醇胺(MEA)，在30℃下处理30分钟，使其还原为Fab′。将该Fab′加到Sephadex G-25柱中，该柱已在含0.5mM EDTA，pH5.3的50mM醋酸钠中平衡(4℃)。将溶于二甲基甲酰胺，并在甲醇/冰浴中冷却的邻-苯二马来酰亚胺(o-PDM，12mM)加入(一半体积)鼠22 Fab′中，并在冰上温育30分钟。然后将此Fab′-马来酰亚胺与游离的o-PDM在Sephadex G-25柱上分离，该柱已在pH5.3，含0.5mM EDTA的50mM醋酸钠中平衡(4℃)。BsAb的制备方法如下，将M22 Fab′-马来酰亚胺按1∶1的摩尔比，加入H425中，反应物在氮气氛下，用Diaflo膜在Amicon室中浓缩至原来的体积(均在4℃下进行)。18小时后，用pH8.0的1M Tris-HCl将其pH调至8.0。该混合物然后用10mM EMA还原(30分钟，30℃)，并用25mM的碘乙酰胺烷基化。用磷酸盐缓冲液(PBS)平衡的Superdex200(pharmacia，Piscataway，NJ)柱将双特异F(ab′)2与未反应的Fab′和其他产物分离。BsAb M22×520C9用类似的方法制备，但是要用520C9，而不是用H425。
由M22×H425×520C9组成的三特异抗体的制备分为2个阶段(图16)。在第一阶段，如以上所述，M22与H425连接，产生M22×H425BsAb，但不进行最后的还原反应和烷基化反应，然后用DTNB处理该反应物，以封闭剩余的游离巯基基团，将此二价的BsAb用Superdex 200柱通过凝胶过滤纯化，还原为F(ab′)2(SH)，并按1∶1的摩尔比与o-PDM处理的520C9混合。所生成的三特异F(ab)3用Superdex 200柱纯化。采用TSK 3000柱(ToJo Haas，Japan)，通过HPLC大小排阻层析对该TsAb进行分析。用上述同样的方法，可构建另一种含有m22 Fab′×32.2 Fab′×m22 Fab′的TsAb。
双特异流式细胞计量法
TsAb可同时结合EGFR和FcγRI，或同时结合HER2/neu和FcγRI。A431细胞(EGFR高表达细胞)或SKBR-3细胞(HER2/neu高表达细胞)与BsAb(M22×520C9或M22×H425)或与TsAb，M22×H425×520C9温育。将细胞洗涤，然后与可溶的FcγRI温育。用mAb32.2-FITC检测可溶FcγRI的结合，mAb32.2-FITC与FcγRI的结合位点与22的结合位点不同。该细胞然后用FACSCAN分析。
ADCC
用SKBR-3细胞或A431细胞作为被细胞因子激活的嗜中性白细胞裂解的靶细胞。靶用100μCi的51Cr标记1小时，然后在U形底的微量滴定板中与嗜中性白细胞和抗体混合。在37℃下温育16小时后，收集上清，并分析其放射性活度。细胞毒性按以下公式计算：裂解％＝(实验的CPM-靶渗漏的CPM/洗涤剂裂解的CPM-靶渗漏的CPM)×100％。特异裂解＝有抗体的裂解％-无抗体的裂解％。用三个重复样品进行分析。
FcγRI调节分析
M22×32.2×M22 BsAb用作调节全血中单核细胞上的FcγRI。该分析步骤如附件的流程图所示(参见图23A)。图23B表明用10μg/ml的上述BsAb处理后，FcγRI在单核细胞上的表达降低至约为BsAb处理前水平的50％。结果
TsAb的构建和生化特性
TsAb按图16所描述的流程图制备。在该方法的第一阶段，M22与H425偶联，用DTNB处理，然后用凝胶过滤纯化所产生的双特异F(ab′)2。在第二阶段，将此双特异F(ab′)2还原，并与o-PDM处理的520C9Fab′混合，产生TsAb，M22×H425×520C9。在图17中，用图式对此TsAb作了描述。在该图中，Fab′-A代表M22，Fab′-B代表H425，以及Fab′-C代表520C9。
结合(BsFACS)
为了证明该TsAb，M22×H425×520C9能同时结合FcγRI和HER2/neu，设计了双特异FACS分析。该分析在图18A中用图式作了描述。图19表明TsAb以剂量依赖的方式同时与SKBR-3细胞上的HER2/neu和可溶的FcγRI结合。在该分析中，BsAb，M22×H425，在宽的浓度范围内产生可忽略的信号。为了证明该TsAb，M22×H425×520C9，可同时结合FcγRI和EGFR，设计了类似的分析方法，在此情况下，采用EGFR高表达的细胞系，A431。在图18B中对该分析用图式作了描述。图20表明TsAb和BsAb，M22×H425，均以剂量依赖的方式，分别同时结合A431细胞上的EGFR和可溶的FcγRI。在该分析中，BsAb，M22×520C9，在宽的浓度范围内产生可忽略的信号。
ADCC
用SKBR-3或A431细胞作为靶细胞，分析上述TsAb介导ADCC的能力。人嗜中性白细胞在IFN-γ存在下培养24-28小时，G-SF用作效应细胞。图21证明，BsAb，M22×520C9，和TsAb，M22×H425×520C9，两者均介导SKBR-3细胞的裂解，而BsAb，M22×H425，不介导。另一方面，图22证明，BsAb，M22×H425，介导SKBR-3细胞的裂解，而BsAb，M22×520C9不介导。这些结果证明，TsAb在表达FcγRI的效应细胞存在下，能杀伤HER2/neu和EGFR高表达的细胞。
上述三特异抗体包含M22，鼠形式的抗-FcγRI mAb。这种三特异抗体可用单巯基形式的人抗FcγRI mAb，H22构建。其唯一的区别是所分泌的单巯基形式是该抗体H22的F(ab′)2的片段。采用离子交换层析法，先用Q-Sepharose，随后用SP-Sepharose(Parmacia，Piscataway，NJ)，从培养物上清液中提纯出单巯基形式。只要H22的单巯基形式纯化后，周此试剂产生三特异抗体的方法即与上述用M22的F(ab′)2片段的相同。
实施例7：用H22-抗原融合蛋白增强的抗原递呈
本实施例证明(a)基因移植到抗FcγRI抗体恒定区上的抗原肽链与单独的抗原相比，在抗原的抗原递呈和T细胞刺激中，前者明显更为有效，以及(b)基因移植到抗-FcγRI恒定区上的拮抗肽与单独的拮抗肽相比，在抑制T细胞的刺激中，前者明显更为有效。因此，这种融合蛋白会有效地增进体内肽链向抗原递呈细胞(APC)的递送，因而在各种治疗方法中将会是有用的。材料和方法
试剂
AIMV(GIBCO，Grand Island，NY)用作培养基。破伤风毒素(TT)购自ACCURACTE CHEMICAL CO.(Westbury，NY)。无菌低内毒素的鼠抗FcγRI mAb 22 F(ab′)2片段，和双特异Ab，MD×H210(由人源化的Ab22的Fab′与抗Her2/neu肿瘤Ag mAb 520C9的Fab′化学连接构成)由MEDAREX，INC供应(Annandale，NY)。TT的通用Th表位，TT830-844(QYIKANSKFIGITEL(SEQIDNO：6)，以下称为TT830)(Valmori D.等(1994)J.Immunol.152：2921-29)，以及该表位的突变形式，TT833S(QYIKANSKFIGITEL(SEQID NO：9)，833位的赖氨酸变为丝氨酸)由PEPTIDOGENIC CO(Livermore，CA)合成并提纯至＞95％。另一种TT的通用表位，TT947-967(FNNFTVSF WLRVPKVSASHLE(SEQ IDNO：12)，以下称为TT947)，(＞80％纯度)(Valmori D.同上)用作本研究中的对照肽链，用于静脉注射(IVI)的市售IgG用于封闭试验中。
细胞
表达FcγRI的单核细胞系，U937，由ATCC获得。产生CD4+，即肽TT830特异的T细胞，的方法是经改进的前述用于TT特异的T细胞系的方法(Gosselin E.J.(1992)J.Immunol.149：3477-81)。简要地说，用Ficoll Hypaque从外周血中分离出单核细胞。用10μM TT830刺激在50ml AIM V培养基中的150×106个单核细胞。在含5％CO2的培养箱中，37℃下温育3天后，用10ml HEPES缓冲的RPMI 1640洗涤一次，以除去非连接的(大部分是非特异的)细胞；特异的T细胞集落连同粘附的单核细胞留在烧瓶内。将50ml添加了20U/ml人IL-2(IMMUNEX，Seattle WA)的AIMV，和1ml(终浓度为2％)收集的人血清加回到烧瓶内。在总培养时间为10-14天后，收集T细胞，并通过Ficol Hypaque沉淀死细胞，产生高度富含活细胞CD4+的群体(95-98％)，即Ag特异的T细胞。如图3所示，该T细胞被证实是对TT830肽链特异的。用冷聚集法(Mentzer S.J.等(1986)Cell.Immunol，101：132)从白细胞电泳包装中纯化大量的单核细胞。该方法可获得纯度为80-90％的产品。将单核细胞和T细胞分成份冷冻备用，而且已表明该冷冻细胞在融化后仍保留其正常的功能。
抗原递呈分析
在增殖分析中，将T细胞(5×104)、照射的单核细胞(3000rad，105/孔)，和不同浓度的肽TT838融合蛋白Fab22-TT830，按最终体积200μl/孔，在平底的96孔组织培养板中，一起保温2天。然后每孔加入10μl(1μCi/孔)3H-胸苷。培养过夜后，收集培养板并在液闪计数器中计数。T细胞增殖表示为3个重复样品的平均计数/min(CPM)±SD。背景CPM(不含抗原的T细胞和单核细胞)从所有数据点中减去。APL实验按类似于Sette等报道的方案进行(De Magistris(1992)Cell 68：625)。简要地说，对于抑制分析，照射的单核细胞用不同浓度的TT 833S或Fab22-TT833S处理过夜，然后加入20nm的TT830和T细胞。再温育2天后，按以上所述测定T细胞的增殖。在“预脉冲”实验中，照射过的单核细胞用20nM的TT830脉冲，4小时后，加入10μM  TT833S或0.1μM  Fab22-TT833S。温育过夜后，再加入T细胞。再温育2天后，T细胞用照射过的单核细胞和TT833S或Fab22-TT833S刺激1天，在Ficoll Hypaque上离心后回收，并用单核细胞和不同浓度的TT830再刺激2天。然后加入3H-胸苷测定T细胞的增殖，用3个重复样品的CPM作图。有时，抑制百分率可用以下公式计算：抑制％＝(CPM无抑制剂-CPM抑制剂)/CPM无抑制剂×100。所有实验至少重复三次。
染色和流式细胞计量法
染色步骤由先前描述的步骤改编(Gosselin E.J.等(1990)J.Immunol.144-1817-22)。简要地说，将30μl的RPMI+1 mg/ml BSA加入4℃下的96孔板的每个孔中，该RPMI中含有不同浓度的蛋白Fab22-TT830、Fab22-TT833S，或BsAb MDXH210中的一种。在4℃下温育1小时后，将该板离心，弃去上清，细胞用PBS/BSA在4℃下洗涤3次。细胞然后与40μl/孔FITC标记的F(ab′)2羊抗人IgG(JACKSONIMMUNORESEARCH LABORATORIES，INC.West Grove，PA)温育1小时，随后用PBS/BSA洗涤3次并重悬于含1％低聚甲醛(KODAK，Rochester，NY)的PBS/BSA中。然后用FACScan(BECTONDICKINSON & CO.，Mountain View，CA)检查细胞，并测定平均荧光强度(MFI)。
细胞因子测定
在抗原递呈分析中，经2天刺激后，收集96孔板中的上清液并冷冻备用。用特异的ELISA测定这些样品中的IFN-γ和IL-4的含量。与IFN-γ配对的抗体以及IL-4特异的ELISA购自PHARMINGEN(CanDiego，CA)。ELISA分析按照生产商提供的方案进行。
H22-TT肽融合蛋白的制备
为了制备融合蛋白Fab22-TT830和Fab22-TT833S，按照以下所述的方法，将编码每种肽链的寡核苷酸通过基因工程技术，分别连接到人抗FcγRI mAb22(H22)重链的铰链区。
表达和克隆的载体
通过将mAb22的CDR区移植到人IgG1的构架，使mAb22人源化(参见以上所述及R.F.等(1995)J.Immunol.155：4996-5002)。对H22重链基因组克隆的表达载体(pSVgpt)进行改造，加入其他分子的编码序列，在本实施例中为TT肽。将该载体含有CH1、链链区以及新改造的XhoI和NotI克隆位点(参见图2)的BamHI片段插入pUC 19的BamHI位点，以产生pUC19/H22CH1(X+N)载体。如以下所述，此载体用来克隆编码TT肽链的寡核苷酸序列。
将编码破伤风毒素(TT)肽链的寡核苷酸序列设计成在该编码区的N末端含有XhoI位点，在C末端含有NotI位点(图24A)。这些寡核苷酸由GENOSYS Biotechnologies(The Woodlands，TX)合成并纯化。然后将此合成的寡核苷酸退火，并连接到克隆载体pUC19/H22CH1(X+N)中。通过限制酶切图谱，筛选已掺入TT肽链编码序列的克隆。然后从pUC19中切出含有CH1、铰链区，和TT830或TT833 S的BamHI片段，并插入已含有VH的表达载体中。H22重链与TT肽链融合的最终表达载体如图24B所示。
H22-TT融合蛋白的表达
鼠骨髓瘤NSO(ECACC 85110503)是非合成的系并用作表达H22-TT融合蛋白。首先，NSO细胞用含有H22轻链编码序列的pSVhyg载体转柒。然后该表达H22轻链的NSO细胞再用含有H22H链Fd序列的载体结构转染，该H22H链Fd序列已按读码框与TT编码序列融合(图24B)。BioRad Gene Pulser电穿孔仪用来进行电穿孔，所用电压为200V，电容为960μFarad。转染后1天或2天，培养基中加入霉酚酸(0.8μg/ml；SIGMA)和黄嘌呤(2.5μg/ml；SIGMA)，以选择已成功吸取表达载体的转染子。按照流式细胞计量分析结果，根据培养上清与U937细胞上的RcγRI的结合能力，分离出单个的克隆。阳性克隆用限制稀释法进行亚克隆。
Fab22-TT融合蛋白的纯化
表达Fab22-TT830融合蛋白的克隆pW5和表达Fab22-TT833S的克隆pM4用旋转瓶培养扩充。将上清液澄清并浓缩。小规模的纯化采用亲和层析在抗H22亲和柱上进行。用5-10％的丙烯酰胺梯度凝胶在非还原的条件下进行SDS-PAGE分析，结果表明，融合蛋白的纯度＞90％，其分子量为50kDa，与预期的一致。蛋白浓度通过测定其在280nm的吸收，并由IgGFab′的消光系数为1.53来确定。结果
与U937细胞结合的H22Fd-TT融合蛋白
首先，检验了H22融合蛋白Fab22-TT830和Fab22-TT833S与FcγRI结合的能力。先前描述过的双特异Ab，MDXH120，用作阳性对照，MDXH210含有同样的FcγRI结合组分(人源化mAb22的Fab′)(Valone F.H.等(1995)J.Clin，Oncol.13：2281-92)。融合蛋白和MDXH210与U937细胞的结合可通过用FITC标记的对人IgG特异的羊抗体染色，并用流式细胞计量法测定，该U937细胞基本上表达FcγRI。如图24A和24B所示，融合蛋白Fab22-TT830和Fab22-TT833S以类似于MDXH210的剂量依赖方式，结合到U937细胞上。融合蛋白的结合被鼠抗-人FcγRI mAb 22 F(ab′)2完全封闭，证明了融合蛋白对FcγRI的特异性。
H22Fd-TT融合蛋白增强TT肽链的递呈100-1000倍
融合蛋白Fab22-TT830用于抗原递呈分析中，以确定Th表位，TT830，在H22的恒定区表达时，是否能够被单核细胞有效地递呈到自身的T细胞。如图26所示，要达到同样水平的T细胞增殖，所需的Fab22-TT830量比单独用TT830肽的量少1000倍。此外，图26表明，Fab22-TT830的递呈的比完整TT的递呈更有效10,000倍，由此可以认为，与TT830肽链相比，Fab22-TT830所增强的递呈不仅是由于其分子量高，也由于Fab22-TT830稳定性的增加。另一种抗原TT表位，TT947，不能刺激T细胞，证实了T细胞对TT830肽链是特异的。因此，这些结果提供了明确的证据，即在H22恒定区表达的Th表位可以被有效且特异地递呈。
封闭单核细胞上的FcγRI消除了H22 Fd-TT融合蛋白增强的抗原递呈作用
为了直接确定通过使用融合蛋白而增强的肽链递呈是否是由FcγRI介导的，用mAb22F(ab′)2处理单核细胞1小时，然后加入Fab22-TT830或TT830肽链，以封闭Fab22-TT830与抗原递呈单核细胞上的FcγRI结合。mAb22F(ab′)2消除了融合蛋白所增强的肽链递呈作用，而对TT830的递呈无影响(图27)。mAb22F(ab′)2与FcγRI结合未引起游离肽链递呈的增强，这一事实暗示了mAb22单独与FcγRI结合不会改变单核细胞的功能状态而使其增强抗原递呈作用，因此，假设递呈作用的增强有可能是由于通过FcγRI有效地捕捉抗原的结果，那么，为了增强抗原呈递的效果，将肽链连接到抗FcγRI Ab22上看来是必要的。
人TgG的存在不影响H22对肽链递呈的增强
在生理条件下，FcγRI的配体结合区被IgG所饱和，IgG阻断了抗原抗体导向该受体。用mAb22的衍生物来触发FcγRI功能有以下的独特优点。即Ab22结合到配体结合区以外的表位上。因此，被mAb22触发的功能，例如ADCC、吞噬作用和抗原递呈不会被生理水平的IgG所抑制(Gosselin E J.，同上，Guyre P.M.(1989)J.Immunol.143-1650-55)。同样，用融合蛋白Fab22-TT830增强的TT830的肽链递呈不受Ig(G)的抑制(图28)，可以假定，基于H22的融合蛋白也是在体内将抗原肽导向FcγRI的有效方式。
IFN-γ和IL-4的产生随着H22Fd-TT融合蛋白增强的抗原递呈作用而增加
由于激活的作用，T细胞不仅通过增殖而克隆扩充，而且还产生细胞因子，例如IFN-γ和IL-4，从而发挥其B细胞分化和单核细胞激活的效应功能(Paul W.E.和Seder，R.A.(1994)Cell 76：241-251)。因此，检验了IFN-γ和IL-4随着H22融合蛋白增强的抗原递呈作用而产生的情况。如图28A和28B所示，Fab22-TT830提高了IFN-γ和IL-4的生产水平，尤其是抗原浓度在最适浓度以下时。但是，在这些实验中，细胞因子产量的增加(约20倍)少于T细胞增殖的增加(约600倍)。
因此，在抗FcγRI mAb H22恒定区表达的Th表位可以被人单核细胞有效地加工和递呈，导致增强T细胞的激活和细胞因子的产生。
APL递呈，TT833S和Fab22-TT833S不能刺激T细胞的增殖
天然T细胞表位中，改变了一个或两个氨基酸的肽链被Allen及其同事们称为改变的肽链受体(APL)，现已表明，APL是T细胞激活的兴奋剂，部分兴奋剂或拮抗剂(Sette等(1994)Ann.Rev.Immunol.12：413和Evavold等(1993)Immunol.Today 14：602)。在某些情况下，APL通过TCR被特异的T细胞识别，触发了部分信号的转导，从而导致(i)T细胞的刺激被超抗原抑制(Evavlold等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.V.S.A.91：2300)，T细胞无反应性(Sloan-Lancaster等(1993)Nature363：156以及Sloan-Lancaster等(1994)J.Exp.Med.185：1195)，或(iii)Th1/Th2分化的调节(Nicholson等(1995)Immunity 3：397；Pfeiffer等(1995)J.Exp.Med.181：1569；以及Windhagen等(1995)Immunity2：373)。已表明，部分兴奋剂刺激T细胞的某些功能，例如T细胞产生IL-4的功能，但不能刺激其他功能，例如T细胞增殖(Evabold等(1991)Science 252：1308)。部分兴奋剂也会诱导无反应性。某些APL与TCR反应不能触发任何可检测到的信号发出，但是能起TCR拮抗剂的功能，而抑制T细胞对野生肽抗原应答的增殖，因而称为TCR拮抗剂(De Magistric等(1992)Cell 68：625以及Ruppert等(1993)Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A 90：2671)。
该实施例证明，肽链TT833S，即破伤风毒素T细胞表位TT830的拮抗剂肽链，和Fab22-TT833S不能刺激T细胞的增殖。如图30所示，即使TT833S和Fab22-TT833S的剂量分别高达100μM和1μM，也未能观察到TT830特异的T细胞的明显增殖。此结果说明，TT830肽链的833位赖氨酸改变为丝氨酸后，消除了该T细胞表位的T细胞反应性。此外，当肽链TT830和TT833S同时递呈到TT830特异的T细胞上时，相应于TT830的T细胞增加被TT833S以剂量依赖的方式所抑制，这表明TT833S可起TT830特异的T细胞的拮抗剂的作用。
Fab22-TT833S抑制T细胞激活至少比TT833S更有效100倍
本实施例比较了TT833S和Fab22-TT833S在抑制T细胞相应于TT830的增殖的相对效率。如图32所示，在抑制TT830刺激的T细胞增殖上，Fab22-TT833S比TT833S更有效100倍。可以认为，APL、TT833S在mAb H22的恒定区上表达时，可被APC有效地弟呈。融合蛋白Fab22-TT833S增加了对T细胞增殖的拮抗效力，这可能是FcγRI介导的捕捉抗原比游离的肽链更为有效的反映。
T细胞激活的抑制是由竞争T细胞受体结合所介导，而不是由竞
争MHC II类抗原结合所介导
APL TT833S和融合蛋白Fab22-TT833S的拮抗效应可能是通过MHC结合水平上的竞争，或TCR结合水平上的竞争，或是两者。为了了解有关的机制，进行了首先由Sette及其同事所描述的“预脉冲”实验(DeMagistris，M.T.等(1992)Cell 68：625-634)。该实验设定使兴奋剂(TT830)在不存在来源于抑制剂(TT833S)的竞争的条件下，与MHC II类抗原结合，这样，只有TCR拮抗剂，而不是纯的MHC封闭剂，能有效地抑制兴奋剂刺激T细胞的增殖。抗原递呈的单核细胞用低于最佳浓度(20mM)的TT830脉冲4小时，使TT830在不存在来自TT833S的竞争的条件下与MHC II类结合。然后将APL、TT833S或Fab22-TT833S与预脉冲的单核细胞再温育16小时。加入相应的T细胞，并按上述方法测定其增殖。即使在MHC的封闭起很小作用的情况下，T细胞的增殖仍然受到抑制(图33)。因此，该抑制看来是竞争与T细胞受体结合的结果，而不是竞争MHC II类结合的结果。
TT833S和Fab22-TT833S的递呈不能刺激T细胞产生IL-4和
IFN-γ
在某些情况下，APL能刺激T细胞产生细胞因子，但不能增殖(Evavold B.D.和Allen P.M.(1991)Science 252：1308-1310)。为了确定是否TT833S的递呈刺激了细胞因子的产生，因此，测定了抗原递呈分析所得上清中IL-4和IFN-γ的含量。如图34所示，TT833S和Fab22-TT833S对刺激T细胞产生IFN-γ和IL-4是无效的。
TT833S和Fab22-TT833S的递呈不会导致T细胞无反应性
Allen及其同事报道TCR与某些APL-MHC II类复合物反应会导致T细胞的无反应性(Sloan-Lancaster J.等(1993)Nature 363：156-159，Sloan-Lancaster J.等(1994)J.Exp.Med.180：1195-1205)。类似于上述Allen等的实验方案用来确定TT833S的递呈是否也能引起T细胞的无反应性。如图3 5所示，T细胞与APC和TT833S或Fab22-TT833S温育1天、2天或4天后，回收T细胞，该细胞对随后的抗原攻击的应答与T细胞单独与APC温育的一样。因此，拮抗剂通过单独用肽链，或用Fab22-TT833S递呈，都不会引起T细胞无反应性。而且，其活T细胞的百分率与无肽链、TT833S或Fab22-TT833S的培养物中回收的T细胞相同(约为50％)，可以认为TT833S的递呈不会增加T细胞的死亡。
用基于抗FcγRI mAb22的融合蛋白将抗原肽链导向FcγRI，其免疫原性可增加约1000倍，所观察到的此现象表明，这类融合蛋白对用于慢性疾病和癌症的基于肽链的疫苗是有用的。通过基因工程技术，将肽链引入对特定APC表面分子特异的人mAb恒定区，这种方法代表了增加基于肽链的疫苗抗原效价的普遍采用途径。
此外，FcγRI导向的拮抗肽链抑制了TT830特异的T细胞的增殖，甚至在APC首先用天然的肽链脉冲时亦是如此，这种状况与在体内想减轻自身免疫应答时所遇到的状况类似。所观察到的这种现象表明拮抗肽链的导向递呈可以用作抗原特异治疗法，用于治疗例如，T细胞介导的自身免疫疾病。基于APL的治疗将会提供抗原特异的免疫疗法，用于治疗T细胞介导的自身免疫疾病，例如风湿性关节炎和多发性硬化。此外，对于以过量免疫应答为特征的某种免疫疾病来说，采用某种融合蛋白，通过诱导与该免疫疾病有关的抗原的抗原特异无反应性，可以治疗这种免疫疾病，上述的融合蛋白包含一个对FcγRI的结合特异性，以及是上述抗原的部分兴奋剂的肽链。由此，通过提供增加抗原的抗原递呈作用的方法，本发明提供了治疗各种免疫疾病的方法，该抗原递呈作用的增加刺激了T细胞，阻止了T细胞的增殖和/或细胞因子的分泌，或诱导了T细胞的无反应性。实施例8：功能性单链抗FcγRI抗CEA双特异分子
本实施例证明重组的双特异单链分子可以结合FcγRI和CEA，该重组的双特异单链分子包含与抗癌胚抗原(抗CEA)抗体融合的人源化抗FcγRI抗体。
图37是编码双特异单链分子的哺乳动物表达结构(结构321和323)的简要图示，该双特异单链分子含有一个结合FcγRI的特异性和一个结合癌胚抗原(CEA)的特异性。由结构321编码的双特异单链分子H22抗CEA的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)，和编码该融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)如图40所示。结构323编码的双特异单链分子H22抗CEA与结构321编码的融合蛋白的不同只是H22的VH和VL链的转换。
还制备了编码含有一个FcγRI结合特异性的单链抗体的哺乳动物表达结构(结构225)。结构225编码的单链抗体H22的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)，以及编码该单链抗体的核苷酸序列(SEQ IDNO：13)如图39所示。
将上述每种结构克隆到pcDNA3的HindIII和XbaI位点(体外基因)，由CMV启动子驱动表达。这些结构的每一种还含有编码c-myc肽链和6个组氨酸的肽链的核苷酸，用于从细胞培养物中纯化重组蛋白。该c-myc尾端相应于人c-myc的410-420位氨基酸(Evan等(1985)Mol.Cell.Biol.5：3610)。上述抗CEA单链抗体，称为MFE-23，在Casey等(1994)J.Immunol.Methods 179：105和Chester等(1994)Lancet 343：455中进一步描述。
该单链双特异分子H22抗CEA和单链H22抗体用于结合分析，按以下方法进行。ELISA板用CEA覆盖，并用5％PBA封闭。用编码该单链分子的结构(转染瘤)转染的细胞上清加入板中，并加入FcγRI/IgM-μ(COS转染的细胞上清，以上所述)，然后将此板与偶联碱性磷酸酶的羊抗人IgM一起温育，用PN PP显色，并测定该板在405-650nm的读数，以检测其结合。
分析结果在图8中表示。该结果说明结构321和323编码的单链双特异H22抗CEA分子与FcγRI和CEA两者结合。另一方面，与预期的一致，单链H22抗体(由结构225编码)与FcγRI和CEA两者均不结合。
实施例9：导向CD64(FcγRI)以诱导和/或增强抗原加工和递呈
为了确定是否将正常非免疫原性的抗原(例如，自交抗原)导向人CD64(FcγRI)可克服体内的免疫无应答性，制备了几种多聚体复合物，并按以下所述进行测试，该复合物含有与F(ab′)2抗体片段连接的上述抗原，而此抗体片段是定向抗原递呈分子上Fc受体的。详细地说，人CD64转基因小鼠及其同窝的非转基因小鼠都用鼠抗人CD64mAbM22(用ATCC保藏号为HB-12147的杂交瘤生产)的F(ab′)2片段免疫接种。在小鼠接受第四次的两周一次的免疫接种后，取其血。根据ELISA分析，6只转基因鼠中的3只小鼠呈现出明显的抗M22 Id特异抗体滴度，但6只非转基因同窝小鼠中都没有呈现此滴度。这些抗血清是M22特异的，且与其他鼠抗体不反应。
为了确定是否M22Fab′的多聚体复合物会诱导更有效的抗原内在化，并由此增强抗原递呈，和产生更强的免疫应答，用化学法和基因工程法合成了M22Fab′的多聚体分子。这些多聚体含有可与22F(ab′)2(或其他Fc受体结合的抗原)和另外的22Fab′分子化学连接的抗原。最终的多聚体包括几种不同种类的分子，含有，例如，多个22Fab′臂(例如，2或2个以上)以及1个或1个以上抗原分子。需要时这些不同种类的分子可通过大小排阻层析，或亲和析层来纯化。图41是产生这种化学连接的多聚体靶抗原的简要图示。
化学合成的多聚体可按以下方法制备，将M22的F(ab′)2与20摩尔过量的琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)在室温下温育2小时。用G25层析除去生成的复合物F(ab′)2-SMCC中的游离SMCC。按1∶1的摩尔比加入含有游离巯基(SH)基团的抗原。所得的混合物在室温下温育过夜。加入过量的碘乙酰胺终止反应，然后用大小排阻层析纯化所得的结合物。
M22F(ab′)2+-抗原多聚体增强/诱导免疫应答
图42A所示的是含有纯化的M22F(ab′)2(泳道1)和化学连接的M22Fab′多聚体(泳道2)的非还原SDS-PAGE凝胶。该多聚体包括几种分子F(ab′)3、F(ab′)4、F(ab′)5、F(ab′)6，和分子量更高的分子。
为了比较M22F(ab′)2和多聚体M22F(ab′)3+介导人CD64内在化的能力，将不同浓度的M22F(ab′)2或M22F(ab′)3+与从人CD64转基因鼠分离出的巨噬细胞温育2小时。用FITC标记的抗人CD64 mAbM32.2(由ATCC贮藏号为9469的杂交瘤生产)检测人CD64的表面表达，该FITC标记的抗人CD64mAbM32.2与人CD64结合，其结合位点与M22表位的不同。如图42B所示，与M22F(ab′)2温育没有明显减少巨噬细胞表面的CD64。但是，与F(ab′)3+在37℃下温育，导致人CD64的表达以剂量依赖的方式减少，减少量达50％。与F(ab′)3+在4℃下温育未引起人CD64表达的减少，证明该现象是温度依赖的。
进一步进行实验，以确定是否在体内存在调节。将M22F(ab′)2或M22F(ab′)3+注射入人CD64转基因小鼠体内，1小时后取血。在M22F(ab′)3+免疫的动物的循环单核细胞上，人CD64的表面表达明显减少，但M22F(ab′)2免疫的没有减少。可以推测，表面人CD64表达的减少表示该受体连同F(ab′)3+多聚体一起的内在化。
随后，研究了人CD64转基因小鼠和未转基因的同窝小鼠用M22F(ab′)3+多聚体免疫三次后，产生抗M22独特型(“Id”)应答的能力。图43A所示的数据证明，所有用多聚体免疫三次(25μg/免疫接种)的人CD64转基因小鼠(n＝12)均产生高滴度的M22特异的抗体。但经同样免疫的未转基因同窝小鼠(n＝10)均无特异抗体产生。人CD64转基因小鼠中，M22F(ab′)3+多聚体诱导出的免疫应答明显好于MF(ab′)2所诱导的。与F(ab′)2相比，所有用多聚体免疫的多聚体免疫小鼠都产生应答，而且产生免疫应答所需要的免疫次数较少(3次对4次)。这些结果证明，Fab′多聚体复合物使抗原通过人CD64更好地内在化，并增强了抗原特异的免疫应答。实际上，图43B所示的数据表明，用少至0.25μg的多聚体免疫接种人CD64转基因小鼠，多数小鼠仍能产生可检测到的免疫应答。
要观察到对许多肿瘤结合的抗原的有效免疫应答是困难的，因为免疫系统往往能耐受这些抗原。为了测定将这种正常非免疫原性的抗原导向人CD64能否引起对抗原的免疫应答，将某种模型抗原，鼠单克隆抗体的Fab′片段520C9偶联到M22多聚体上。
对人CD64转基因小鼠或其未转基因的同窝小鼠免疫接种后，确定其抗520C9 Id的滴度和抗M22Id的滴度。如图44A所示，8只人CD64转基因小鼠中的7只显示出强的抗520C9和抗M22的滴度。7只免疫的未转基因小鼠都未显示出可检测到的对520C9或对M22的滴度。这些数据证明，将正常非免疫原性的蛋白偶联到人CD64上，使其通过人CD64+抗原递呈细胞内在化而产生对该抗原的有效免疫应答。几个研究小组已表明，诱导出来的，对B细胞淋巴细胞上表面Ig表达的独特型特异的免疫力可产生有效的对肿瘤细胞特异的免疫力。该实施例证明，通过将520C9独特型导向人CD64，很容易诱导出特异的抗520C9Id应答。对特定抗原免疫应答的性质，特别是结合肿瘤的抗原或病毒抗原，与其应答的量同样重要。T辅助细胞，根据其分泌的细胞因子类型，以及在刺激时对B细胞提供的辅助类型，可分为Th1和Th2。Th1细胞受到刺激时分泌IL-2和IFN-γ，并通常刺激B细胞分泌IgG2a同种型的抗体。Th2细胞刺激时分泌IL-4和IL-5，并通常刺激B细胞分泌IgG1或IgE同种型的抗体。一般，认为Th1细胞刺激免疫应答的细胞臂，而Th2细胞刺激体液的臂。用偶联520C9的M22多聚体免疫接种人CD64转基因小鼠后，用同种型特异的诱导试剂检验IgG1或IgG2a同种型的520C9特异的抗体的滴度。图44B所示的数据证明，已诱导出强的IgG1以及IgG2a Id特异的滴度，证实了这种通过免疫接种激活Th1和Th2应答的方法的能力。
H22sFv-H22sFv-32.2sFv-抗原多聚体诱导免疫应答
图45(a)所示的是编码基因连接的多聚体靶抗原的载体图谱。该载体编码某种蛋白，该蛋白包括二个来源于人源化的抗FcγRI抗体H22(由ATCC保藏号为CRL 11177的杂交瘤产生)的sFv区，以及一个来源于抗体M32.2的sFv区，这些抗体片段都与抗原连接在一起。所产生的融合蛋白H22sFv-H22sFv-32.2sFv-抗原(如图45(b)所示)，可在多个位点与FcγRI结合，并由此通过受体的聚集而诱导内在化。
用鼠gp75(色氨酸1黑素瘤抗原)作为抗原，制备H22sFv-H22sFv-32.2sFv-抗原多聚体，用于转基因小鼠的模型研究。已发现，该融合蛋白与FcγRI有效地结合，并诱导受体的内在化。如图46所示，化学连接的M22Fab×M22Fab×M32Fab-抗原和基因连接的H22sFv-H22sFv-32.2sFv-抗原都诱导FcγRI的内在化。该研究按下述方法进行，将样品加入经IFN-γ处理的U937细胞中，37℃下温育2小时。样品用人IgG1-F1TC在4℃下染色1小时，然后用FACscan分析样品，测定其FcγRI表达。调节百分数(％)用以下公式计算：〔1-(样品的MFI/对照的MFI)〕×100％，其中MFI为平均荧光强度。
H22sFv2-抗原与FcγRI结合的亲和力与H22Fb2抗原的大约相等
图47(a)所示的是编码某种融合蛋白的载体图谱，该融合蛋白由两个H22sFv区与抗原用基因连接法连接在一起而构成。产生的融合蛋白H22sFv-H22sFv-抗原(如图47(b)所示)可与两个FcγRI分子结合。这种融合蛋白对FcγRI的亲和力应该比仅含有一个H22sFv的融合蛋白更大。这种多聚体结合两FcγRI分子的能力也可能诱导受体更好的内在化。
为了检验上述的假定(即H22sFv-H22-抗原融合蛋白与FcγRI结合的亲和力是否比单个H22sFv-抗原融合蛋白的更大)，进行了竞争实验。U937细胞先用IFN-γ处理，以增强FcγRI的表达，然后用抗体H22和藻红蛋白的偶联物染色。如图48所示，该偶联物被不同浓度的H22Fab、H22sFv2-EGF融合蛋白或H22Fab2所抑制。仍然如图48所示，H22sFv2-EGF与FcγRI结合的亲和力与H22Fab2的大约相等。以前已表明，H22Fab′与H22sFv对FcγRI的亲和力相同(Goldstein等，(1997)J.Immunol.)。
H22sFv-H22sFv-H22sFv-CEA诱导FcγRI的内在化
图49(a)所示的是编码某种多聚体融合蛋白的载体图谱，该融合蛋白含有3个与抗原连接的H22sFv片段。此融合蛋白，H22sFv-H22sFv-H22sFv-CEA(如图49(b)所示)，含有与3个H22sFv连接的肿瘤抗原CEA。该融合蛋白应以高的亲和力结合FcγRI(由于3个sFV分子的三价结合)，而且也应由于3个FcγRI分子的聚集而导至FcγRI的内在化。
基因法连接的H22sFv-H22sFv-CEA融合蛋白诱导FcγRI内在化的能力用先前所述的方法测试，其结果如图50所示。很明显，在同样的浓度下，H22Fab-CEA不介导内在化，可能是由于它与FcγRI单价结合。该实施例的操作方法是将样品加入IFN-γ处理过的U937细胞中，并在37℃下温育1小时或过夜。然后用M32.2-FITC在4℃下将细胞染色1小时，样品用FACscan分析，以测定其FcγRI的表达。实施例10：导向CD89(FcαR)和肿瘤抗原(例如，EGF受体)的人
      抗体融合蛋白促进肿瘤细胞的细胞介导的细胞毒素
以下的研究涉及双特异融合结构的生产和特性，该融合结构诱导表达EGF受体(EGFR)的肿瘤分子的效应细胞介导的杀伤。该结构包括与抗CD89(抗FcαR)抗体(ScFv或Fab′)连接的EGF。因此，该结构激活已导向肿瘤细胞的CD89表达细胞的效应功能。
CD89(FcαR)是一种受体，它结合IgA的Fc部分，IgA是人体最丰富的Ig。CD89基本上主要在细胞毒性免疫分子上表达，这些分子包括多形核白细胞(PMN)、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞和嗜伊红性粒细胞，抗原复合的IgA1和IgA2以及单体的IgA1和IgA2均结合CD89，可假定，该受体在体内可能被单体的IgA所饱和。用对配体结合位点内部或外的表位特异的mAb交联髓样效应细胞上的CD89，可刺激脱粒作用、过氧化物的释放、炎症细胞因子的分泌、胞吞作用和吞噬作用。因此，CD89可能是与临床上有关的细胞毒素免疫效应细胞上的触发受体。
酪氨酸激酶连接的受体是I型生长因子受体家庭的成员，已有报道，这些受体在各种癌症的诱发过程期间是高表达的。该家庭的成员之一是表皮生长因子受体(EGF-R，c-erbB-1基因的产物)。EGF-R在几乎所有的头部和颈部的肿瘤中都是高表达的，约在1/3的乳房和卵巢肿瘤中高表达，以及可在前列腺，肾、膀胱、肺、脑、胰腺和胃肠系统的肿瘤中高表达。尽管该受体存在于某些正常细胞中，例如角质形成细胞和肝细胞，但EGF-R在肿瘤细胞上的高表达对于肿瘤的定向特异治疗是有用的。定向治疗可包括对EGF-R特异的mAb，或该受体的配体之一，如EGF。EGF是各种类型表达EGF-R的细胞的细胞分裂和分化功能的调节剂。EGF是53个氨基酸的非糖基化的多肽，该肽含有3对二硫键，并由1207个氨基酸的前体经蛋白加工而产生。融合结构的制备
双特异融合蛋白的制备方法如下所述。采用此处先前所述的HuMAb-Mouse技术，产生完全人CD89 mAb。将此mAb，14A8(亦称为14.1)，结合到某一表位上，该表位与保留触发效应功能的能力时的Fc结合位点不同。由此，该抗体克服了因饱和的单体IgA引起的配体结合位点可能被封闭的问题。在此是将mAb 14A8的fab′和sFv片段与EGF融合。简要地说，由用可溶CD89免疫接种的HuMAb小鼠获得14A8杂交瘤细胞系。用RT-PCR由该细胞系分离的RNA克隆到V区。DNA序列分析表明，该抗体包括含有DN1D区段和JH4J区段的30.3VH，以及含JK3 J区段的L18 Vk。
采用编码由HuMAb-Mouse产生的全人抗CD89 mAb的可变区的DNA，即可构建并表达具有双特异分子(BMS)功能的抗体融合蛋白。如图51所示，这些分子包括与人IgA(FcαRI，CD89)Fc部分的受体在某表位结合的抗体片段，该表位与Fc结合位点不同，但仍可触发效应细胞功能，还包括与表皮生长因子受体(EGF-R)结合的臂，该表皮生长因子在各种肿瘤细胞系中是高表达的。制备上述BMS的方法是将mAb 14A8(抗CD89)的Fab或sc-Fv片段，通过易弯曲的肽链接头，融合到EGF-R的配体EGF上。用RT-PCR的DNA序列分析克隆mAb 14A8的可变区并分析其特性。
Fab融合结构的制备方法是将14A8VH DNA插入表达载体，该表达载体含有与EGF融合的人IgG1 CH1和铰链区的cDNA。同样，将14A8VL DNA插入含有人CL区cDNA的表达载体。sc-Fv融合蛋白以单链形式由一种载体表达。如图51中的图式所示，用电穿孔法，将PJZ906(14Afd-EGF)和PJZ907(14A8L链)共转染到NSO细胞中，并在含G418和潮霉素的培养基中选择。PJZ909(14A8sFv-EGF)同样地转染，并在含G418的培养基中选择。表达融合蛋白的细胞系用限制稀释克隆法进行亚克隆。该融合蛋白的提纯方法是将表达融合蛋白的细胞系的上清通过蛋白L柱，然后将大约2μg的纯化蛋白在还原和非还原的条件下加到4-15％tris-甘氨酸凝胶中。融合蛋白结合肿瘤细胞的特性
如图52(A和B)以及图53所示，流式细胞计量实验证实，这些BSM中的抗体片段和EGF部分与其各自的细胞表面受体特异结合。图52(A)表明14A8fab′-EGF融合蛋白结合到A431细胞上的EGF-R上。图52(B)表明14A8sFv-EGF与A431细胞(用偶联藻红蛋白的羊抗人IgG Fab-2染色)的结合。不含EGF的14A8的fab-2片段用作对照。图52(C)表明，14A8融合蛋白和市售的EGF以EGF-FITC结合物(7nM)的方式竞争与A431细胞的结合。图53(A)表明14A8fab′-EGF融合蛋白与表达CD89的U937细胞(用偶联藻红蛋白的羊抗人IgG Fab-22染色)的结合。对EGF-R特异的人源化mAb H415的fab-2片段用作对照。图53(B)表明14A8sFv-EGF融合蛋白也与表达CD89的U937细胞结合。除了要确定14A8sFv-EGF的不同浓度，以测定其抑制14A8fab′-EGF融合蛋白结合的能力(23nM)之外，该实验按图53(A)同样的方式进行。H22sFv-EGF融合蛋白再用作对照。mAbH22与U937细胞上的另一Fc受体CD64(FcγRI)结合。效应细胞介导的表达EGF-R的肿瘤细胞裂解
铬释放(细胞裂解)分析证实14A8fab′-EGF和14A8sFv-EGF融合蛋白均以剂量依赖的方式，用纯化的表达CD89的多形核(PMN)白细胞、单核细胞或全血效应细胞，介导对表达EGF-R肿瘤细胞的特异裂解。
如图54(A)、54(B)和54(C)，以及图55所示，14A8融合蛋白用单核细胞(54A)、PMN(54B)，和全血(54C)介导A431细胞的细胞毒性。铬释放分析所用的温育周期为16-18小时，效应物-靶比值(对单核细胞和PMN)为100∶1。14A8的fab-2片段用作对照。如图56所示，14A8fab′-EGF融合蛋白(1μg/ml)(56A)和14A8sFv-EGF融合蛋白(1μg/ml)介导，A431细胞的细胞毒素被14A8的fab-2片段(40μg/ml)所抑制。该结果证明，细胞通过融合蛋白的裂解是由与CD89结合而特异介导的。
总的说来，前面的研究描述了用基因法将14A8的Fab′或sFv片段与EGF连接而产生融合蛋白；在哺乳动物细胞培养物中表达该融合结构；以及用蛋白L层析将该结构纯化至接近均一性。这些融合蛋白在人体内是最小免疫原性的，因为14A8是全人的，EGF是起源于人的，这些融合蛋白可能会增强融合蛋白的治疗功效。前面的研究也证明了这些融合蛋白，14A8fab′-EGF和14A8 sFv-EGF，能够结合表达CD89和EGF-R的细胞。虽然，该研究进一步证明，在表达CD89的免疫效应细胞存在下，这些融合蛋白以剂量依赖的方式介导EGF-R高表达细胞的杀伤。也证明了全血存在下肿瘤细胞的裂解。
实施例11：含有导向CD89(FcαR)和肿瘤抗原(例如，EGF受体和/或HER2)的双特异和三特异分子促进细胞介导的肿瘤细胞的细胞毒性
以下的研究涉及双特导和三特导分子的生产和特性，这些分子诱导效应细胞介导的表达EGF受体(EGF-R)和/或HER2/neu(亦称为HER2)的肿瘤细胞的杀伤，双特异结构包括与人单克隆抗HER2抗体(ScFv或Fab′)，称为3.F2，连接的人单克隆抗CD89(抗FcαR)抗体(ScFv或Fab′)，称为14.1。三特异结构包括与EGF融合的双特异抗CD89(ScFv)X抗HER2(ScFv)结构。这些结构激活已导向肿瘤细胞的CD89表达细胞的效应功能。这些结构也具有全人结构的优点。
双特异和三特异融合结构的制备
图57和58所示的是本发明选择的双和三特异的分子及其亲本人抗体(HμMab)。图57所示的是单链(ScFv)双特异融合分子，931和934，除了934包括EGF，而931不包括以外，其余均相同。14.1(抗CD89)和3F2(抗HER2)的可变轻链区和重链区用于产生该结构。图58所示的是化学结合的Fab′抗CD89×抗HER2双特异结构。14.1和3F2的fab′片段用标准的化学交联方法通过二硫键的连接产生该双特异分子。
单链双和三特异分子(931和934)用下述方法生产。用质粒(例如pJZ934)转染NSO细胞(如图51中所示的抗CD89×EGF融合结构)，并在含G418的培养基中选择。从细胞系中筛选出表达融合蛋白的细胞，然后用有限稀释克隆法亚克隆。最后，将表达融合蛋白的细胞系的上清液通过蛋白L柱，纯化融合蛋白，然后在非还原或还原的条件下，将大约2μg的纯化蛋白样加到4-15％tris-甘氨酸中的胶上。纯化的934结构主要是三聚体，该三聚体在还原条件下解离为单体。双和三特异分子结合肿瘤细胞的特性
流式细胞计量法用于测定双和三特异分子的特性。图59(A)所示的是转染上清液中融合蛋白与肿瘤细胞的结合。转染的(931和934)和未转染的(NSO)上清与SKBR-3或A431肿瘤细胞系温育，然后用藻红蛋白偶联的羊抗人IgGfab-2染色，检测融合蛋白的结合。如图59(B)中所示，转染的细胞(931和934)上清也介导细胞裂解(ADCC)。在这些研究中，铬释放分析所用的保温周期为16-18小时，效应物(单核细胞，PMN)-靶(SKBR-3，A431)比值为100∶1。用转染的(931和934)和未转染的(NSO)上清液介导特异裂解，检测肿瘤细胞的杀伤。
图60(A)所示的是纯化的双和三特异分子(931和934)与U937细胞的结合(通过CD89受体)活性。抗体425(抗EGF-RmAb)的fab-2片段用作阴性对照，该片段与U937细胞不结合。抗CD89(Fab′)×抗HER2(Fab′)化学偶联的双特异分子(如图58所示)用作阳性对照。除了是测定与SKBR-3细胞的结合(通过HER2受体)以外，图60(B)与图60(A)相同。抗CD89抗体的fab-2片段，14.1用作阴性对照。图61所示的是934三特异结构与A431细胞的结合。除了采用EGF-R高表达的A431肿瘤细胞以外，图61所示的实验与图60的相同。含有与EGF融合的sFv片段的融合蛋白用作阳性对照，抗CD89抗体14.1的fab-2片段用作阴性对照。效应细胞介导的表达EGF-R和HER2/neu肿瘤细胞的裂解
测定了单链双和三特异的分子(931和934)在效应细胞存在下，介导表达EGF-R和HER2/neu肿瘤细胞的细胞裂解(ADCC)能力。铬释放分析所用的温育周期为16-18小时，效应物(单核细胞，PMN)-靶(SKBR-3)比值为100∶1。用转染的(931和934)和未转染的(NSO)上清介导特异的裂解，检测肿瘤细胞的杀伤。如图59(B)所示，转染的上清介导单核细胞、PMN和全血的细胞裂解(ADCC)。在这些研究中，铬释放分析所用的温育周期为16-18小时，效应物(单核细胞、PMN)-靶(SKBR-3、A431)比值为100∶1。用转染的(931和934)和未转染的(NSO)上清介导特异的裂解，检测肿瘤细胞的杀伤。
图62和图63所示的是用纯化的单链双特异结构931，分别在PMN和单核细胞存在下的效应细胞介导的SKBR-3细胞的裂解(图62(A)和图63(A))，和BT474细胞的裂解(图62(B)和图63(B))。铬释放分析所用的温育周期为16-18小时，效应物-靶比值为100∶1。抗CD89抗体，14.1，的fab-2片段用作每个实验的阴性对照。
此外，用多形核(PMN)细胞、单核细胞和全血，测试纯化的化学结合双特异分子14.1×3.F2(图58)对51Cr标记的SKBR-3或BT-474人肿瘤细胞的ADCC杀伤，该双特异分子含有二个交联的Fab′抗体片段(与931和934结构的单链抗体相应)。特异裂解的计算方法为：在双特异分子存在下肿瘤细胞的裂解量-单独用多形核细胞的肿瘤细胞裂解量。如图64所示，双特异分子14.1×3.F2通过PMN以剂量依赖的方式介导SKBR-3和表达HER2/neu的BT474肿瘤细胞的杀伤。此外，如图65中所述，双特异分子14.1×3.F2通过单核细胞以剂量依赖的方式介导SKBR-3和表达HER2/neu肿瘤细胞的细胞杀伤。在两种情况下，加入10μg/ml的14.1 Fab′2，其肿瘤细胞的ADCC完全被1μg/ml的双特异分子14.1×3.F2所抑制，证明靶细胞的杀伤就是通过CD89与效应细胞结合而介导的。图66表明双特异分子14.1×3.F2通过全血也以剂量依赖的方式介导表达HER2/neu的BT474肿瘤细胞的细胞杀伤。
总的来说，前面的研究描述了含有人单克隆抗体(包括单链和Fab′片段)的双或三特异分子的制备。此外，这些实施例证明了这些双和三特异分子在效应分子存在下，有效地介导了表达HER2/neu和EGF-R的肿瘤细胞的杀伤。等同的实施方案
本领域的技术人员可以识别出，或仅用常规的实验，即能查明许多与此处所述的本发明特有的实施方案等同的实施方案，可以认为这样的实施方案可包括在以下的权利要求之中。
                序列表<110>米德列斯公司等(Medarex，Inc.et al.)<120>含有抗Fc受体结合剂的治疗化合物<130>MXI-043CP3PC<140>09/523,279<141>2000-03-10<150>09/364,088<151>1999-07-30<160>19<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>24<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(1)..(24)<400>1act cac aca tgc cca ccg tgc cca                                   24Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro1               5<210>2<211>27<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(1)..(18)<400>2act cac aca tgc cca ccg tgaggatcc                                 27Thr His Thr Cys Pro Pro1               5<210>3<211>42<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(1)..(33)<400>3act cac aca tgc tcg agc ctt cac ggc ggc cgc tgaggatcc             42Thr His Thr Cys Ser Ser Leu His Gly Gly Arg1               5                  10<210>4<211>300<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>4Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1               5                  10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Asn
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        100                 105                 110Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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        180                 185                 190Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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         20<210>13<211>913<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(11)..(913)<400>13aagcttcacc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gtg gcc aca    49
       Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr
         1               5                  10gct acc ggt gtc cac tcc gat atc caa ctg gtg gag agc ggt gga ggt   97Ala Thr Gly Val His Ser Asp Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
 15                  20                  25gtt gtg caa cct ggc cgg tcc ctg cgc ctg tcc tgc tcc tcg tct ggc   145Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly30                  35                  40                  45ttc agt ttc agt gac aat tac atg tat tgg gtg aga cag gca cct gga   193Phe Ser Phe Ser Asp Asn Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
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            130                 135                 140ggc ggc tcc gga ggt gga ggc agc gga ggg ggc gga tcc gac atc cag   481Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
        145                 150                 155ctg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc agc gtg ggt gac aga gtg   529Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
    160                 165                 170acc atc acc tgt aag tcc agt caa agt gtt tta tac agt tca aat cag   577Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln
175                 180                 185aag aac tac ttg gcc tgg tac cag cag aag cca ggt aag gct cca aag   625Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys190                 195                 200                 205ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg gaa tct ggt gtg cca agc aga   673Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg
            210                 215                 220ttc agc ggt agc ggt agc ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc agc   721Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser
        225                 230                 235ctc cag cca gag gac atc gcc acc tac tac tgc cat caa tac ctc tcc   769Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser
    240                 245                 250tcg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa tct agc tgc   817Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Cys
255                 260                 265tcg agc gga ggc ggg ggt agc gat atc gcg gcc gca gaa cag aaa ctc   865Set Set Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu270                 275                 280                 285atc tca gaa gag gat ctg aat ggc gcc gca cat cac cat cat cac cat   913Ile Set Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
            290                 295                 300<210>14<211>301<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>14Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1               5                  10                  15Val His Ser Asp Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
         20                  25                  30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Ser Phe
     35                  40                  45Ser Asp Asn Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
 50                  55                  60Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro65                  70                  75                  80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
             85                  90                  95Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val
        100                 105                 110Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Glu Gly Ala Met Asp Tyr
    115                 120                 125Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130                 135                 140Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln145                 150                 155                 160Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
            165                 170                 175Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr
        180                 185                 190Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
    195                 200                 205Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
210                 215                 220Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro225                 230                 235                 240Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Trp Thr
            245                 250                 255Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Cys Ser Ser Gly
        260                 265                 270Gly Gly Gly Ser Asp Ile Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
    275                 280                 285Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
290                 295                 300<210>15<211>1679<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(11)..(1669)<400>15aagcttcacc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gtg gcc aca    49
       Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr
         1               5                  10gct acc ggt gtc cac tcc gat atc caa ctg gtg gag agc ggt gga ggt   97Ala Thr Gly Val His Ser Asp Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
     15              20                  25gtt gtg caa cct ggc cgg tcc ctg cgc ctg tcc tgc tcc tcg tct ggc   145Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly30                  35                  40                  45ttc att ttc agt gac aat tac atg tat tgg gtg aga cag gca cct gga   193Phe Ile Phe Ser Asp Asn Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
             50                  55                  60aaa ggt ctt gag tgg gtt gca acc att agt gat ggt ggt agt tac acc   241Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr
         65                  70                  75tac tat cca gac agt gtg aag gga aga ttt aca ata tcg aga gac aac   289Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
     80                  85                  90agc aag aac aca ttg ttc ctg caa atg gac agc ctg aga ccc gaa gac   337Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp
 95                 100                 105acc ggg gtc tat ttt tgt gca aga ggc tac tat agg tac gag ggg gct   385Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Glu Gly Ala110                 115                 120                 125atg gac tac tgg ggc caa ggg acc ccg gtc acc gtg agc tca gga ggt   433Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
            130                 135                 140ggc ggc tcc gga ggt gga ggc agc gga ggg ggc gga tcc gac atc cag   481Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
        145                 150                 155ctg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc agc gtg ggt gac aga gtg   529Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
    160                 165                 170acc atc acc tgt aag tcc agt caa agt gtt tta tac agt tca aat cag   577Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln
175                 180                 185aag aac tac ttg gcc tgg tac cag cag aag cca ggt aag gct cca aag   625Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys190                 195                 200                 205ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg gaa tct ggt gtg cca agc aga   673Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg
            210                 215                     220ttc agc ggt agc ggt agc ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc agc   721Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser
        225                 230                 235ctc cag cca gag gac atc gcc acc tac tac tgc cat caa tac ctc tcc   769Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser
    240                 245                 250tcg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa tct agc tgc   817Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Cys
255                 260                 265tcg agc gga ggc ggg ggt agc gat atc aaa ctg cag cag tct ggg gca   865Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala270                 275                 280                 285gaa ctt gtg agg tca ggg acc tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct   913Glu Leu Val Arg Ser Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser
            290                 295                 300ggc ttc aac att aaa gac tcc tat atg cac tgg ttg agg cag ggg cct   961Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro
        305                 310                 315gaa cag ggc ctg gag tgg att gga tgg att gat cct gag aat ggt gat   1009Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp
    320                 325                 330act gaa tat gcc ccg aag ttc cag ggc aag gcc act ttt act aca gac   1057Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp
335                 340                 345aca tcc tcc aac aca gcc tac ctg cag ctg agc agc ctg aca tct gag   1105Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu350                 355                 360                 365gac act gcc gtc tat tat tgt aat gag ggg act ccg act ggg ccg tac   1153Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr
            370                 375                 380tac ttt gac tac tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca ggt   1201Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
        385                 390                 395gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tca gaa aat   1249Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn
    400                 405                 410gtg ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cca ggg gag aag   1297Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys
415                 420                 425gtc acc ata acc tgc agt gcc agc tca agt gta agt tac atg cac tgg   1345Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp430                 435                 440                 445ttc cag cag aag cca ggc act tct ccc aaa ctc tgg att tat agc aca   1393Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr
            450                 455                 460tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt gga tct   1441Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
        465                 470                 475ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc cga atg gag gct gaa gat gct   1489Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala
    480                 485                 490gcc act tat tac tgc cag caa cgg agt agt tac cca ctc acg ttc ggt   1537Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly
495                 500                 505gct ggc acc aag ctg gag ctg aaa cgg gcg gca ggc tcg agc gga ggc   1585Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Gly Ser Ser Gly Gly510                 515                 520             525ggg ggt agc gat atc gcg gcc gca gaa cag aaa ctc atc tca gaa gag   1633Gly Gly Ser Asp Ile Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
            530                 535             540gat ctg aat ggc gcc gca cat cac cat cat cac cat tgattctaga        1679Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
        545                 550<210>16<211>553<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>16Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1               5                  10                  15Val His Ser Asp Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
         20                  25                  30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Ile Phe
     35                  40                  45Ser Asp Asn Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
 50                  55                  60Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro65                  70                  75                  80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
             85                  90                  95Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val
        100                 105                 110Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Glu Gly Ala Met Asp Tyr
    115                 120                 125Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130                 135                 140Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln145                 150                 155                 160Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
            165                 170                 175Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr
        180                 185                 190Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
    195                 200                 205Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
210                 215                 220Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro225                 230                 235                 240Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Trp Thr
            245                 250                 255Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Cys Ser Ser Gly
        260                 265                 270Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val
    275                 280                 285Arg Ser Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn
290                 295                 300Ile Lys Asp Ser Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Glu Gln Gly305                 310                 315                 320Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr
            325                 330                 335Ala Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ser
        340                 345                 350Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala
    355                 360                 365Val Tyr Tyr Cys Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp
370                 375                 380Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly385                 390                 395                 400Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Val Leu Thr
            405                 410                 415Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile
        420                 425                 430Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln
    435                 440                 445Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu
450                 455                 460Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser465                 470                 475                 480Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
            485                 490                 495Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr
        500                 505                 510Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
    515                 520                 525Asp Ile Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn
530                 535                 540Gly Ala Ala His His His His His His545                 550

Claims (100)

1.一种双特异性分子，它包含对Fcα受体的第一结合特异性和对EGF受体的第二结合特异性。
2.权利要求1所述的双特异性分子，其中的第一和第二结合特异性是基因融合的。
3.权利要求1所述的双特异性分子，其中的第一结合特异性是抗体或抗体片段。
4.权利要求3所述的双特异性分子，其中的抗体或抗体片段是人抗体或抗体片段。
5.权利要求4所述的双特异性分子，其中的抗体是单链抗体。
6.权利要求4所述的双特异性分子，其中的抗体片段是Fab′抗体片段。
7.权利要求1所述的双特异性分子，其中的第二结合特异性包含EGF。
8.一种双特异性分子，它包含与Fcα受体结合，并与EGF连接的人抗体或其片段。
9.一种双特异性分子，它包含与Fcα受体结合，并与EGF连接的单链人抗体或其片段。
10.一种双特异性分子，它包含对Fcα受体的第一结合特异性和对HER2受体的第二结合特异性。
11.权利要求10所述的双特异性分子，其中的第一和第二特结合异性是基因融合的。
12.权利要求10所述的双特异性分子，其中的第一结合特异性是人抗体或其片段。
13.权利要求12所述的双特异性分子，其中的抗体是单链抗体。
14.权利要求13所述的双特异性分子，其中的抗体片段是Fab′抗体片段。
15.权利要求10所述的双特异性分子，其中的第二抗体或抗体片段是人抗体或抗体片段。
16.权利要求15所述的双特异性分子，其中的抗体是单链抗体。
17.权利要求15所述的双特异性分子，其中的抗体片段是Fab′抗体片段。
18.一种多特异性分子，它包含：
对Fcα受体的第一结合特异性；
对HER2受体的第二结合特异性；以及
对EGF受体的第三结合特异性。
19.权利要求18所述的多特异性分子，其中的第一、第二和第三结合特异性是基因融合的。
20.权利要求18所述的多特异性分子，其中的第一特异性是抗体或抗体片段。
21.权利要求20所述的多特异性分子，其中的抗体或抗体片段是人抗体或抗体片段。
22.权利要求21所述的多特异性分子，其中的抗体是单链抗体。
23.权利要求21所述的多特异性分子，其中的抗体片段是Fab′抗体片段。
24.权利要求18所述的多特异性分子，其中的第二结合特异性是抗体或抗体片段。
25.权利要求24所述的多特异性分子，其中的抗体或抗体片段是人抗体或抗体片段。
26.权利要求25所述的多特异性分子，其中的抗体是单链抗体。
27.权利要求25所述的多特异性分子，其中的抗体片段是Fab′抗体片段。
28.权利要求18所述的多特异性分子，其中的第三结合特异性包含EGF。
29.一种多特异性分子，它包含：
与Fcα受体结合的人抗体或其片段；
与HER2受体结合的人抗体或其片段；以及EGF
30.权利要求29所述的多特异性分子，其中的第一、第二和第三结合特异性是基因融合的。
31.权利要求29所述的多特异性分子，其中的第一和第二结合特异性是单链抗体或抗体片段。
32.一种诱导效应细胞介导的肿瘤细胞的细胞杀伤的方法，该肿瘤细胞以高表达EGF受体为其特征，该方法包括使该肿瘤细胞与含有对Fcα的第一结合特异性和对EGF的第二结合特异性的双特异性分子结合。
33.权利要求32所述的方法，其中双特异分子的第一和第二结合特异性是基因融合的。
34.权利要求32所述的方法，其中双特异分子的第一结合特异性是人抗体或抗体片段。
35.权利要求34所述的方法，其中的抗体是单链抗体或Fab′抗体片段。
36权利要求32所述的方法，其中双特异分子的第二结合特性包含EGF。
37.一种诱导效应细胞介导的肿瘤细胞的细胞杀伤的方法，该肿瘤细胞以高表达EGF受体或HER2受体为其特征，该方法包括使该肿瘤细胞与含有与Fcα受体结合，并与EGF连接的人抗体或其片段的双特异性分子接触。
38.一种诱导效应细胞介导的肿瘤细胞的细胞杀伤的方法，该肿瘤细胞以高表达HER2受体为其特征，该方法包括使该肿瘤细胞与含有对Fcα受体的第一结合特异性和对HER2受体的第二结合特异性的双特异性分子接触。
39.权利要求38所述的方法，其中的第一或第二结合特异性是人抗体或其片段。
40.权利要求39所述的方法，其中的抗体为单链抗体或Fab′抗体片段。
41.一种诱导效应细胞介导的肿瘤细胞的细胞杀伤的方法，该肿瘤细胞以高表达EGF受体或HER2受体为其特征，该方法包括使该肿瘤细胞与多特异性分子接触，该分子包含：
对Fcα受体的第一结合特异性；
对HER2受体的第二结合特异性；以及
对EGF受体的第三结合特异性。
42.权利要求41所述的方法，其中第一、第二和第三结合特异性是基因融合的。
43.权利要求41所述的方法，其中第一或第二结合特异性是人抗体或抗体片段。
44.权利要求43所述的方法，其中的抗体是单链抗体或抗体片段。
45.权利要求43所述的方法，其中的第三结合特异性包含EGF。
46.一种诱导效应细胞介导的肿瘤细胞的细胞杀伤的方法，该肿瘤细胞以高表达EGF受体或HER2受体为其特征，该方法包括使所述的肿瘤细胞与多特异性分子接触，该分子包含：
与Fcα受体结合的人抗体或其片段；
与HER2受体结合的人抗体或其片段；以及EGF。
47.一种分子复合物，它包含：
a)两个或两个以上对抗原递呈细胞表面上组分的结合特异性；以及
b)至少一种与所说的结合特异性连接的抗原，其中所说的组分被该结合特异性结合时，介导该分子复合物的内在化。
48.权利要求47所述的分子复合物，其中所说的复合物包含三个或三个以上结合特异性。
49.权利要求47所述的分子复合物，其中至少结合特异性中的一个与抗原递呈细胞上的Fc受体(FcR)结合。
50.权利要求47所述的分子复合物，其中所说的结合特异性包括抗体或其抗原结合片段。
51.权利要求50所述的分子复合物，其中所说的抗体与Fc受体(FcR)结合。
52.权利要求51所述的分子复合物，其中所说的FcR是Fcγ受体。
53.权利要求52所述的分子复合物，其中所说的Fcγ受体是FcγRI。
54.权利要求47所述的分子复合物，其中所说的结合特异性中的一个或一个以上含有选自H22(ATCC保藏号CRL11177)、M22(ATCC保藏号HB12147)、M32.2(ATCC保藏号HB9469)，以及其抗原结合片段的抗体。
55.权利要求47所述的分子复合物，其中所说的结合特异性与所说的细胞表面组分的同一表位结合。
56.权利要求47所述的分子复合物，其中所说的结合特异性与所说的细胞表面组分的不同表位结合。
57.权利要求47所述的分子复合物，其中所说的结合特异性与不同的细胞表面组分结合。
58.权利要求47所述的分子复合物，其中所说的抗原与所说的结合特异性化学连接。
59.权利要求47所述的分子复合物，其中所说的抗原与所说的结合特异性重组融合。
60.权利要求47所述的分子复合物，其中所说的抗原是肿瘤抗原。
61.权利要求59所述的分子复合物，其中所说的肿瘤抗原来源于选自乳癌、肉瘤、癌和卵巢癌的癌症。
62.权利要求47所述的分子复合物，其中所述的抗原是自抗原。
63.权利要求47所述的分子复合物，其中所述的抗原是自身抗原。
64.权利要求47所述的分子复合物，其中所述的抗原与FcγRI结合。
65.权利要求47所述的分子复合物，其中所述的抗原包含的抗体选自H22(ATCC保藏号CRL11177)、M22(ATCC保藏号HB12147)、M32.2(ATCC保藏号HB9469)，以及其抗原结合片段。
66.权利要求47所述的分子复合物，其中所说的抗原包含抗体520C9(ATCC保藏号HB8696)或其抗原结合片段。
67.一种诱导或增强治疗对象体内的抗原免疫应答的方法，包括对该治疗对象施予分子复合物，以增强或诱导该治疗对象体内对该抗原的免疫应答，其中该分子复合物含有：
二个或二个以上对抗原递呈细胞表面上的组分的结合特异性；以及
至少一种与所说的结合特异性连接的抗原，其中所说的组分被该结合特异性结合时，可介导该分子复合物的内在化。
68.权利要求67所述的方法，其中所说的分子复合物包含三个或三个以上的结合特异性。
69.权利要求67所述的方法，其中所说的结合特异性中，至少一个与抗原递呈细细胞上的Fc受体(FcR)结合。
70.权利要求67所述的方法，其中所说的结合特异性中，至少一个包含抗体或其抗原结合片段。
71.权利要求70所述的方法，其中所说的抗体与Fc受体(FcR)结合。
72.权利要求70所述的方法，其中所说的Fc受体是FcγRI受体。
73.权利要求67所述的方法，其中一个或一个以上所说的结合特异性含有选自H22(ATCC保藏号CRL11177)、M22(ATCC保藏号HB12147)、M32.2(ATCC保藏号HB9469)，以及其抗原结合片段的抗体。
74.权利要求67所述的方法，其中所说的结合特异性与所说的细胞表面组分的同一表位结合。
75.权利要求67所述的方法，其中所说的结合特异性与所说的细胞表面组分的不同表位结合。
76.权利要求67所述的方法，其中所说的抗原与所说的结合特异性化学结合。
77.权利要求67所述的方法，其中所说的抗原与所说的结合特异性重组融合。
78.权利要求67所述的方法，其中所说的抗原是肿瘤抗原。
79.权利要求67所述的方法，其中所说的抗原是自抗原。
80.权利要求67所述的方法，其中所说的抗原是自身抗原。
81.一种免疫接种治疗对象的方法，包括对治疗对象施予有效量的分子复合物，该复合物包含：
a)二个或二个以上对抗原递呈细胞表面上组分的结合特异性；以及
b)至少一种与所说的结合特异性连接的抗原，其中所说的组分被该结合特异性结合时，可介导该分子复合物的内在化。
82.权利要求81所述的方法，其中所说的分子复合物包含三个或三个以上结合特异性。
83.权利要求81所述的方法，其中至少一个所说的结合特异性包含抗体或其抗原结合片段。
84.权利要求83所述的方法，其中所说的抗体与Fc受体(FcR)结合。
85.权利要求84所述的方法，其中所说的Fc受体是FcγRI受体。
86.权利要求81所述的方法，其中一个或一个以上所说的结合特异性包含的抗体选自H22(ATCC保藏号CRL11177)、M22(ATCC保藏号HB12147)、M32.2(ATCC保藏号HB9469)，以及其抗原结合片段。
87.权利要求81所述的方法，其中所说的结合特异性与所说的细胞表面组分的同一表位结合。
88.权利要求81所述的方法，其中所说的结合特异性与所说的细胞表面组分的不同表位结合。
89.权利要求81所述的方法，其中所说的抗原与所说的结合特异性化学连接。
90.权利要求81所述的方法，其中所说的抗原与所说的结合特异性重组融合。
91.权利要求81所述的方法，其中所说的抗原是肿瘤抗原。
92.权利要求81所述的方法，其中所说的抗原是自抗原。
93.权利要求81所述的方法，其中所说的抗原是自身抗原。
94.一种通过抗原递呈细胞诱导或增强抗原递呈的方法，包括使抗原与抗原递呈细胞接触，其中抗原与两个或两个以上抗原递呈细胞表面上组分的结合特异性连接，该抗原递呈细胞被结合特异性结合时，可介导该抗原的内在化。
95.权利要求94所述的方法，其中的抗原与三个或三个以上的结合特异性连接。
96.权利要求94所述的方法，其中所说的结合特异性包含抗体或其抗原结合片段。
97.权利要求96所述的方法，其中所说的抗体片段包含Fab′片段或sFv片段。
98.权利要求96所述的方法，其中所说的抗体与Fc受体(FcR)结合。
99.权利要求96所述的方法，其中所说的抗原是肿瘤抗原。
100.权利要求96所述的方法，其中所说的抗原是自身抗原。
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