KR20020047103A - 항-Ｆｃ 수용체 결합제를 포함하는 치료 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명에는 표적 세포의 이펙터 세포-매개의 사멸을 유도하는 다중특이적 분자가 개시되어 있다. 이 분자는, 하나 이상의 표적이 면역 세포 표면 상의 Fc 수용체인 다중의 (2개 이상의) 별개 표적에 결합하기 때문에 "다중특이적"이다. 본 발명의 다중특이적 분자는, Fcγ 수용체 (예, FcγRⅠ) 또는 Fcα 수용체와 같은 Fc 수용체에 결합하는 하나 이상의 부분, 및 종양 세포 또는 병원체 상의 항원과 같은 상이한 표적에 결합하는 하나 이상의 부분으로 이루어진 분자를 포함한다. 본 발명의 다중특이적 분자는, 1개 이상의 항원에 결합된 항원 표출 세포 (APC) 상의 분자 (예를 들어, Fc 수용체)에 결합하는 다중 (즉, 2개 이상의) 부분으로 구성된 항원 "멀티머 복합체"를 포함한다. 이들 멀티머 복합체는 자기항원과 같은 항원을 APC로 표적화시켜, APC에 의한 항원의 인터날리제이션 (내포작용), 가공 및(또는) 표출을 유도하고(하거나) 증진시킨다. 따라서, 이들 분자는 자기항원과 같이 정상적으로는 비-면역원성인 단백질에 대한 생체내 또는 시험관내 면역 반응을 유도하거나 증진시키는데 사용될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 다중특이적 분자의 하나 이상의 부분은 Fc 수용체 또는 표적 세포 상의 수용체 (예, EGF-R 또는 HER2)에 결합하는 인간화 또는 인간 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, ScFv 또는 Fab')을 포함한다.

Description

항-Ｆｃ 수용체 결합제를 포함하는 치료 화합물{Therapeutic Compounds Comprised of Anti-Fc Receptor Binding Agents}
관련 출원
본 출원은 1999년 7월 30일 출원된 미국 출원 제09/364,088호의 부분 계속 출원이다. 상기 미국 출원 제09/364,088호는 1998년 11월 6일 출원된 미국 출원 제09/188,082호의 부분 계속 출원이다. 미국 출원 제09/188,082호는 1996년 6월 7일 출원되어 현재 미국 특허 제5,837,243호로 허여된 미국 출원 제08/661,052호의 부분 계속 출원이다. 상기 미국 특허는 "항-Fc 수용체 항체를 포함하는 치료 화합물"이란 제목으로 1995년 6월 7일 출원된 미국 출원 제08/484,172호의 부분 계속 출원이다. 상기 언급한 출원들, 및 거기에 인용된 모든 참고문헌, 허여된 특허 및 공개된 특허 출원은 이 거명을 통해 본 명세서에 포함된다.
면역글로불린 (Ig)은 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 구성되어 있으며, 각각의 쇄는 NH2-말단의 항원-결합 가변 도메인과 항체의 이펙터 (effector) 기능을 담당하는 COOH-말단의 불변 도메인을 포함한다. Ig 중쇄의 COOH-말단 도메인은 Fc 영역을 형성하며, 이는 Fc 수용체 (FcR)라 알려진 특이적 수용체와의 상호작용을 통해 세포 활성을 촉진하는데 관여한다. 모든 Ig 클래스에 대한 Fc 수용체 또는 그 이소타입 (예를 들어, IgG(FcγR), IgE(FcεR), IgA(FcαR), IgM(FcμR) 및 IgD(FcδR))이 확인되었다. 상이한 이소타입이 지닌 상이한 생물학적 활성은, 부분적으로는 상이한 면역 (작용) 세포 상에서 발현되는 상이한 FcR에 결합하는 능력을 기초로 한다 (Fridman, W.H. (Sept. 1991) The FASEB Jorunal Vol. 5. 2684-2690). FcR에 대해 유도된 쥐의 항체가 만들어졌다 ("Monoclonal Antibodies To Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes"라는 제목의 미국 특허 제4,954,617호 및 "Monoclonal Antibody Specific For IgA Receptor"라는 제목의 국제 특허 출원 공개 제WO 81/05871호 참조).
쥐의 모노클로날 항체는 인간 치료제로서 유용하며, 간염 바이러스나 인간 면역결핍 바이러스와 같은 인간 병원체에 의해 오염되지 않은 채로 제조될 수 있다. 그러나, 일부의 인간 치료에 쥐의 모노클로날 항체를 사용하는 것은 "외래의" 쥐 단백질에 대한 면역 반응이 발생하는 결과를 초래하였다. 이 반응은 인간 항-생쥐 항체 또는 HAMA 반응 (Schroff, R. et al. (1985), Cancer Res., 45, 879-885)이라 명명되었으며, 이는 인간에서 혈청 질병을 유발시켜 개체의 순환계로부터 쥐의 항체를 빠른 속도로 제거하는 것이다. 인간의 면역 반응은 쥐의 면역글로불린의 가변 및 불변 영역 모두에 대한 것으로 밝혀졌다.
재조합 DNA 기술은, 예를 들어 어떤 종의 특정 면역글로불린 영역을 다른 종의 면역글로불린 영역으로 치환함으로써 항체를 변형시키는데 유용할 수 있다. 뉴버거 (Neuberger) 등의 문헌 (특허 협력 조약 특허 출원 제PCT/GB85/00392호)에는 어떤 종의 Ig 분자 중의 상보적 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 다른 종의 상보적 중쇄 및 경쇄 Ig 불변 도메인과 혼합할 수 있는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 쥐의 불변 영역 도메인을 치환하여 인간 치료에 사용될 수 있는 "키메라" 항체를 생성하는데 이용될 수 있다. 뉴버거 등에 의해 기재된 바와 같이 제조된 키메라 항체는 보체 고정 (complement fixation)과 같은 항체 매개의 이펙터 기능을 효율적으로 자극하는 인간 Fc 영역을 갖지만, 여전히 쥐의 ("외래의") 가변 영역에 대한 인간의 면역 반응을 도출해낼 수 있는 가능성을 가지고 있다.
윈터 (Winter)의 문헌 (영국 특허 출원 제GB2188538A호)에는 상보성 결정 영역 (CDR)을 다른 종의 것으로 치환함으로써 항체를 변형시키는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 원하는 결합 특성 (예를 들면, 인간 병원체에 대한 것)이 있는 모노클로날 항체 중 쥐의 가변 영역 도메인의 CDR을 인간의 중쇄 및 경쇄 Ig 가변 영역 도메인으로 치환하는데 이용할 수 있다. 이와 같이 변형된 가변 영역을 인간 Ig의 불변 영역과 혼합하여, 치환된 쥐의 CDR을 제외하고는 전체의 조성이 인간 항체의 것인 항체를 생성할 수 있다. 윈터의 문헌에 기재된 "재구성된" 또는 "인간화" 항체는 쥐의 성분이 훨씬 더 적기 때문에 인간에서 상당히 감소된 면역 반응을 도출해 낸다. 추가로, 순환계에 존재하는 변형된 항체의 반감기는 천연 인간 항체의 반감기와 거의 유사하다. 그러나, 윈터가 진술한 바와 같이, CDR을 바이러스나 세균의 단백질과 같은 항원에 특이적인 다른 항체로부터의 상보적 CDR로 단지 대체하는 것만으로는, 원하는 결합 능력을 보유하는 변형된 항체가 항상 생성될 수는 없다. 사실상, 항체 가변 영역의 골격에 존재하는 일부 아미노산은 CDR을 구성하는 아미노산 잔기들과 상호작용하기 때문에, 항원 결합을 복구하기 위해서는 인간Ig 가변 영역으로의 아미노산 치환이 필요할 것이다.
항-Fc 수용체 부분 및 항-표적 단백질을 포함하는 이중특이적 항체 (예를 들어, 이종항체 (heteroantibody))가 만들어져 있으며, 이는 암 치료 (예를 들어, 유방암 또는 난소암 치료) 또는 병원체 감염의 치료 (예를 들어, HIV 감염 치료)와 같은 치료에 사용된다 ("Bispecific Heteroantibodies With Dual Effector Functions"라는 제목의 국제 특허 출원 공개 제WO 91/05871호 및 "Bispecific Reagents for AIDS Therapy"라는 제목의 국제 특허 출원 공개 제WO 91/00360호 참조). 또한, 항원 및 항원 표출 세포를 인지하는 이중특이적 분자는, 대상체에 투여되어 면역 반응을 자극할 수 있다 ("Targeted Immunostimulation With Bispecific Reagents"라는 제목의 국제 특허 출원 공개 제WO 92/05793호 참조).
<발명의 개요>
본 발명은 면역 세포를 표적으로 하는, 재조합 및 화학적으로 합성된 다중특이적 분자를 제공한다. 이 분자는, 하나 이상의 표적이 면역 세포 (예를 들어, 이펙터 세포 (effector cell)) 및(또는) 항원 표출 세포 (APC)의 표면 상의 분자인 다중의 (2개 이상의) 별개 표적에 결합하기 때문에 "다중특이적"이다. 바람직한 면역 세포 표적에는 Fc 수용체, 특히 FcδRⅠ 및 FcαR이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 분자는, Fc 수용체와 같은 이펙터 세포 상의 분자에 결합하는 하나 이상의 부분, 및 종양 세포 또는 병원체 상의 항원과 같은 상이한 표적에 결합하는 하나 이상의 부분 (예를 들어, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 부분)으로 이루어진 분자를 포함한다. 따라서, 이들 분자는 이펙터 세포 매개의 표적 제거를 유도하는데 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 다중특이적 분자는 인간 또는 인간화 항체 (또는 항체 단편)을 결합 특이적 부위로서 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 분자는, 1개 이상의 항원에 결합된 항원 표출 세포 (APC) 상의 분자 (예를 들어, Fc 수용체)에 결합하는 다중 (즉, 둘 이상) 부분으로 구성된 항원 "멀티머 (multimer) 복합체"를 포함한다. 이들 멀티머 복합체는 자기항원과 같은 항원을 APC로 표적화시켜, APC에 의한 항원의 인터날리제이션 (internalization)(내포작용), 가공 및(또는) 표출을 유도하고(하거나) 증진시킨다. 따라서, 이들 분자는 자기항원과 같이 정상적으로는 비-면역원성인 단백질에 대한 생체내 또는 시험관내 면역 반응을 유도하거나 증진시키는데 사용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 특징은 항-Fc 수용체 부분, 항-표적 단백질, 및 임의로 제3 표적에 대해 유도된 제3 부분을 최소한으로 포함하는 다중특이적 분자를 제공하는 것이다. 제3 부분 (또한, 본원에서 "항-증진 인자" (항-EF) 부분이라고도 불리움)은, 예를 들어 항체 또는 항체 단편, 또는 세포 수용체 리간드일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 다중특이적 분자는 인간 또는 인간화 항체 (또는 항체 단편)을 결합 특이적 부위로서 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명의 특징은 다중특이적 분자의 생성 방법을 제공하는 것이다. 한 실시양태에서, 2개의 특이적 부위가 동일한 벡터 중에서 코딩되고, 예를 들면 이중특이적 분자 또는 융합 단백질로서 숙주 세포에서 발현 및 수집된다.다른 실시양태에서, 각 결합 특이적 부위는 별개로 (예를 들어, 재조합적으로) 생성된 후, 예를 들어 항체의 경우에 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 서로 화학적으로 접합된다.
또다른 측면에서, 본 발명 특징은 하나 이상의 항원에 결합된 2개 이상의 결합 특이적 부위를 포함하는, 본원에서 "항원 멀티머 복합체"라고도 불리우는 다중특이적 분자를 제공하는 것이다. 결합 특이적 부위는, 이 결합 특이적 부위와의 결합시 분자 복합체의 인터날리제이션을 매개할 수 있는, Fc 수용체와 같이 항원 표출 세포의 표면에 존재하는 성분과 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 분자 복합체는 3개 이상의 결합 특이적 부위를 포함하며, 이 결합 특이적 부위들 중 1개 이상이 Fc 수용체 (예를 들어, FcRγI 또는 FcαR)에 특이적이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항원은 복합체가 아닌 형태로 투여되는 경우에 비-면역원성이다.
또한, 본 발명의 특징은 대상체에게 본 발명의 항원 멀티머 복합체를 투여함으로써 상기 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 증진시키는 방법을 제공하는 것이다. 추가로, 본 발명에는 대상체에게 본 발명의 항원 멀티머 복합체를 투여함으로써 상기 대상체를 면역화시키는 방법이 포함된다.
또한, 본 발명의 다중특이적 분자는 이 분자가 표적 세포를 이펙터 세포 매개로 사멸시킬 수 있다는 것에 기초하여 다중 면역치료법에 사용할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 다중특이적 분자는 다양한 종양 세포를 죽이거나 그의 성장을 억제하는데 사용될 수 있다.
도 1은 인간화 FcγRⅠ 항체인 H22의 힌지 영역 부분에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 [A]와, 이것이 변화되어 생성된 말단이 잘린 단일-술프히드릴 버전 [B], 및 더 변화되어 2개의 유일한 클로닝 부위를 갖도록 조작된 것 [C]을 나타낸다. 밑줄이 그어진 뉴클레오티드는 이전 서열로부터 변화된 것을 표시한다. 위에 줄이 그어진 뉴클레오티드는 표시된 제한 부위에 대한 인식 서열이다.
도 2는 중쇄-EGF 융합체의 발현 작제물인 pJG055의 개략도이다.
도 3은 항-Fc 수용체-리간드 이중특이적 분자를 생성하는 개략도이다.
도 4는 인간화 Fcγ 수용체-상피 성장 인자 융합 단백질의 활성을 시험하는데 사용된 유동 세포계수 분석의 개략도이다.
도 5는 다양한 농도의 상피 성장 인자 (EGF) 융합 단백질 (H22-EGF 융합체) 및 완전히 인간화된 이중특이적 (BsAb) H447의, EGF 수용체 (EGFR)를 발현하는 1483 세포에 대한 결합을 표시하는 평균 형광 강도 (MFI)를 나타내는 그래프이다.
도 6은 EGFR에 결합하는 쥐의 항체인 M425의 존재 및 부재하에, 다양한 농도의 EGF 융합 단백질 또는 BsAb H447의 A431 세포에 대한 결합을 나타내는 그래프이다.
도 7은 다양한 농도의 EGF 융합 단백질, BsAb H447 또는 H425 항체의 A431 세포에 대한 결합으로부터 생겨난 항체 의존성 세포독성 (ADCC)을 나타내는 그래프이다.
도 8은 배지만 존재하는 경우, 25％의 인간 혈청 (HS)을 함유하는 배지가 존재하는 경우, 또는 Fcγ 수용체 항체인 M22의 Fab 단편을 함유하는 배지가 존재하는 경우에, EGF 융합 단백질, BsAb H447 또는 H425 항체의 결합으로부터 생겨난 ADCC를 나타내는 막대 그래프이다.
도 9는 다양한 양의 EGF, H22-EGF, H22의 Fab 단편 (H22 Fab) 또는 H425의 F(ab')2단편 (H425 F(ab')2)의 존재하에 배양된 생존 A431 세포의 수를 나타내는 도표이다.
도 10은 H22Fd-HRG 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 11은 특정 PC-3 또는 SKBr-3 종양 세포를, 인터페론-γ-처리된 단핵구, 및 H22-헤레굴린 융합 단백질을 발현하는 골수종 세포의 상층액을 1:3 또는 1:30으로 희석한 것과 함께 배양하여 생겨난 상기 세포들의 종양 세포 사멸 비율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 12는 단핵구의 존재하 및 다양한 농도의 H22-봄베신 융합 단백질 농축액의 존재하에서 PC-3 종양 세포의 용해를 나타내는 도식이다.
도 13은 o-PDM 또는 DTNB 방법에 의해 생성된 BsAb 447의 활성을 시험하는데 사용된 유동 세포계수 분석의 개략도이다.
도 14는 EGFR 및 FcγRⅠ을 발현하는 A431 세포에 대한, o-PDM 및 DTBN로부터 유래된 다양한 농도의 BsAb 447의 MFI를 나타내는 그래프이다.
도 15는 o-PDM 및 DTNB로부터 유래된 BsAb 447의 A431 세포에 대한 결합으로부터 생겨난 항체 의존성 세포독성을 나타내는 그래프이다.
도 16은 삼중특이적 항체의 제작을 도시하는 흐름도이다.
도 17은 2가의 이중특이적 항체를 3가의 삼중특이적 항체로 변환시키는 것을 도시한다. 2가의 이중특이적 접합체를 환원 후 o-PDM-처리 520C9 Fab'과 혼합하여 TsAb를 생성한다.
도 18은 HER2/neu (패널 A) 및 EGFR (패널 B)에 대한 이중기능성 형광-활성화 세포 분리 분석을 도시한다.
도 19는 다양한 농도의 항체 BsAb 또는 TsAb의 표적 세포에 대한 결합을 나타내는 그래프이다. 항체 결합이 증가할수록 평균 형광 강도 (MFI)도 증가한다. 이는 TsAb가 투여량-의존적 방식으로 SKBr-3 세포 상의 HER2/neu 및 가용성 FcγRⅠ 모두에 동시에 결합함을 나타낸다.
도 20은 TsAb가 투여량-의존적 방식으로 A431 세포 상의 EGFR 및 가용성 FcγRⅠ 모두에 동시에 결합함을 나타내는 그래프이다. 이 분석은 도 19에서 사용된 것과 유사하다.
도 21은 TsAb인 M22 x H425 x 520C9와 BsAb인 M22 x 520C9가 SKBR-3 세포의 ADCC를 유도할 수 있으나, BsAb인 M22 x H425는 그렇지 않음을 나타내는 그래프이다. 다양한 농도의 항체를 SKBR-3 세포 및 미리 활성화된 PMN과 함께 인큐베이션시켰다.
도 22는 TsAb인 M22 x H425 x 520C9와 BsAb인 M22 x H425가 A431 세포의 ADCC를 유도할 수 있으나, BsAb인 M22 x 520C9는 그렇지 않음을 나타내는 그래프이다. 이 분석은 도 21의 분석과 유사한 방식으로 수행하였다.
도 23은 전체 혈액 조절 분석에 대한 흐름도 (23a) 및 그 분석 결과 (23b)이다. 이 3가 항체는 단핵구의 표면으로부터 FcγRⅠ를 빠르게 조절한다.
도 24의 패널 A는 야생형 (TT830) 및 돌연변이 (TT833) 파상풍균의 독소 펩티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드의 아미노산 서열을 나태낸다. 패널 B는 H22Fd-TT 융합 단백질의 도식이다.
도 25a, 25b 및 25c는 각각 FcγRⅠ 양성 U937 세포에 대한 MDXH210, Fab22-TT830 및 H22-TT833S의 결합을 보여주는 유동 세포계수 분석 결과를 나타낸다. 대시로 표시된 선은 음성 대조군을 나타내고, 실선은 융합 단백질로 염색된 것을 나타내며, 점선은 쥐의 mAb22 F(ab')2에 의해 차단된 융합 단백질의 결합을 나타낸다.
도 26은 FcγRⅠ 양성 U937 세포에 대해 다양한 농도의 융합 단백질 MDXH210, Fab22-TT830 및 Fab22-TT833S를 인큐베이션시켜 얻은 평균 형광 강도를 나타내는 도표이다.
도 27은 조사(照射)된 단핵구, 및 다양한 농도의 TT830, Fab22-TT830 TT 또는 TT947과 함께 인큐베이션된 T 세포의 증식을 나타내는 그래프로, 융합 단백질 Fab22-TT830은 TT830에 비해 Th 에피토프의 표출을 약 1000배 증가시킨다.
도 28은 T 세포와 항원을 첨가하기 전에 포화량의 mAb22 F(ab')2와 함께 미리 인큐베이션시키거나 시키지 않은 채로, 1000 nM의 TT830 또는 10 nM의 FAb22-TT830 및 단핵구와 함께 인큐베이션된 T 세포의 증식을 보여주는 막대 그래프이다.
도 29는 IgG의 부재 (대조군) 또는 존재하에, 단핵구 및 5 nM의 Fab22-TT830 또는 1000 nM의 TT830과 함께 인큐베이션된 T 세포의 증식을 나타내는 막대 그래프이다.
도 30의 패널 A 및 B는 단핵구 및 다양한 농도의 TT830 또는 Fab22-TT830과 함께 2일 동안 배양된 T 세포의 상층액에서 IFN-γ (패널 A) 및 IL-4 (패널 B)의 농도를 보여주는 그래프이다.
도 31은 단핵구 및 다양한 농도의 TT833S, Fab22-TT833S 또는 TT830과 함께 인큐베이션된 T 세포의 증식을 도시하는 그래프이다.
도 32는 다양한 농도의 TT833S와 함께 밤새 미리 인큐베이션되고, TT830 및 단핵구와 함께 2일 동안 인큐베이션된 T 세포의 증식을 나타내는 그래프이다.
도 33은 다양한 농도의 TT833S 또는 FAb22-TT833S와 함께 밤새 미리 인큐베이션되고, TT830 및 단핵구와 함께 2일 동안 인큐베이션된 T 세포의 증식 억제율을 나타내는 그래프이다.
도 34는, 먼저 TT830과 함께 4 시간 동안 인큐베이션 (예비-펄스)된 후, T 세포를 첨가하기 전에 10 μM의 TT833S 또는 0.1 μM의 Fab22-TT833S와 함께 밤새 인큐베이션 (채이스)된 다음에, 단핵구와 함께 2일 동안 인큐베이션된 T 세포의 증식을 나타내는 막대 그래프이다.
도 35는 단핵구 및 TT830, Fab22-TT830, TT833S 및 Fab22-TT833S와 함께 배양된 T 세포의 상층액에서 인터페론-γ (IFN-γ) 및 IL-4의 농도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 36은 배지만, TT833S와 함께, 또는 Fab22-TT833S와 함께 단핵구로 1일 동안 자극된 후, 단핵구 및 다양한 농도의 TT830으로 2일 동안 재자극된 T 세포의 증식을 나타내는 그래프로, 이는 TT833S 및 Fab22-TT833S가 T 세포의 면역성 결여 (anergy)를 초래하지 않음을 의미한다.
도 37은 FcγRⅠ (H22)에 대한 1개의 결합 특이적 부위 및 발암성 배 (carcinoembryonic) 항원 (CEA)에 대한 1개의 결합 특이적 부위를 갖는 단일쇄 이중특이적 분자를 코딩하는 2개의 발현 작제물 (작제물 321 및 323), 및 FcγRⅠ에 대한 1개의 결합 특이적 부위를 갖는 단일쇄 항체를 코딩하는 1개의 발현 작제물을 나타내는 도식이다. 코딩 영역은 CMV 프로모터 (CMV Pr)의 조절하에 있다. 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (LH)로부터의 가변 영역 이외에, 이들 작제물에 의해 코딩되는 단백질은 c-myc으로부터의 펩티드 (c-myc) 및 헥사-히스티딘 펩티드 (H-6)에 융합되어 있다.
도 38은 발현 작제물 321 (321-A5 및 321-B4)에 의해 코딩되는 단일쇄 이중특이적 분자 H22-항-CEA의 결합 정도, 및 작제물 225 (225-C2)에 의해 코딩되는 단일쇄 H22 항체의 결합 정도를 이중기능성 ELISA로 측정하여 나타낸 막대 그래프이다.
도 39는 단일쇄 인간화 항-FcγRⅠ 항체의 핵산 서열, 및 이 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 40은 FcγRⅠ에 대한 1개의 결합 특이적 부위 및 CEA에 대한 1개의 결합 특이적 부위를 갖는 단일쇄 이중특이적 분자의 핵산 서열, 및 이 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 41은 항원에 연결된 다중 Fab' 단편으로 이루어진 멀티머 복합체의 구성을 나타내는 개략도이다.
도 42a는 정제된 M22 F(ab')2멀티머 (레인 1) 및 화학적으로 연결된 M22 Fab' 멀티머 복합체 (레인 2)를 나타내는 비-환원 SDS-PAGE 겔이다. 도42b는 M22 F(ab')3 +와 함께 인큐베이션시키면 투여량에 의존적인 방식으로 대식세포의 표면 상에서 CD64의 발현이 최대 50％까지 감소함을 나타내는 그래프이다.
도 43a는 한배에서 나온 비-트랜스제닉 자손에 비해, 3회 면역화된 CD64 트랜스제닉 생쥐 모두에서 높은 타이터의 M22-특이적 항체가 생성됨을 보여준다. 도 43b는 FcγRⅠ (CD64) 트랜스제닉 생쥐를 단지 0.25 mg의 멀티머 복합체만으로 면역화시키더라도 검출 가능한 면역 반응이 유도됨을 보여준다.
도 44a 및 44b는 FcγRⅠ (CD64) 트랜스제닉 생쥐와 비-트랜스제닉 생쥐의 면역 반응을 항-520C9 및 항-M22 타이터에 의해 판단하여 나타낸 도식이다. M22 멀티머 복합체에 커플링된 쥐의 항체 520C9의 Fab' 단편으로 생쥐를 면역화시켰다.
도 45a는 항원과 연결된 1개의 M32.2 sFv 영역에 연결된 2개의 H22 sFv 영역을 포함하는, 유전자적으로 연결된 멀티머 복합체 (H22(2x)-32.2-항원 복합체)를 코딩하는 발현 벡터의 맵을 보여준다. 도 45b는 그 결과 생성된 멀티머 복합체의 도면이다.
도 46은 M22 Fab x M22 Fab x M32 및 H22sFv-H22sFv-32.2sFv-gp75 멀티머 복합체가 FcγRⅠ에 효율적으로 결합하여 인터날리제이션을 유도할 수 있는 능력을 보여주는 막대 그래프이다.
도 47a는 항원에 함께 연결된 2개의 H22 sFv 영역을 포함하는, 유전자적으로 연결된 멀티머 복합체 (H22(2x)-항원 멀티머 복합체)를 코딩하는 발현 벡터의 맵을 보여준다. 도 47b는 그 결과 생성된 멀티머 복합체의 도면이다.
도 48은 H22 Fab', H22sFv2-EGF 멀티머 및 H22 Fab2 멀티머를 이용한 결합 경쟁 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. 결과는 이들 멀티머에 접합된 M22-피코에리트린의 결합 억제에 의해 나타난다.
도 49a는 항원과 연결된 3개의 H22 sFv 단편을 포함하는, 유전자적으로 연결된 멀티머 복합체 (H22(3x)-항원 멀티머 복합체)를 코딩하는 발현 벡터의 맵을 보여준다. 도 49b는 그 결과 생성된 멀티머 복합체의 도면이다.
도 50은 H22(3x)-CEA 멀티머 복합체가 FcγRⅠ의 인터날리제이션을 유도할 수 있음을 다른 멀티머 복합체와 비교해서 보여주는 막대 그래프이다.
도 51은 항-CD89 (14A8) HuMAb 융합 분자의 생성을 나타내는 개략도이다. pJZ906 (14Afd-EGF) 및 pJZ907 (14A8 L-쇄)를 전기천공법에 의해 NSO 세포로 동시 형질감염시키고, G418과 하이그로마이신을 함유하는 배지에서 선별하였다. pJZ909 (14A8sFv-EGF)를 유사하게 형질감염시키고, G418을 함유하는 배지에서 선별하였다. 융합 단백질을 발현하는 세포주를 제한 희석 클로닝에 의해 서브클로닝하였다.
도 52a는 A431 세포 상의 EGF-R에 대한 14A8Fab'-EGF 융합 작제물의 결합 (유동 세포계수법으로 측정)을 나타내는 그래프이다. 도 52b는 A431 세포 상의 EGF-R에 대한 14A8sFv-EGF 융합 작제물의 결합을 나타내는 그래프이다. A431 세포를 피코에리트린에 접합된 염소 항-인간 IgG Fab-2로 염색하였다. EGF를 포함하지않는 14A8 (인간 모노클로날 항-FcαR 항체, 14.1이라고도 불리움)의 Fab-2 단편을 대조군으로 사용하였다. 도 52c는 융합 단백질 및 상업적으로 얻을 수 있는 EGF가 A431 세포에 대한 결합에서 EGF-FITC 접합체 (7 nM)와 경쟁함을 보여준다.
도 53a는 14A8Fab'-EGF 융합 작제물의 U937 세포에 대한 결합 (유동 세포계수법으로 측정)을 보여주는 그래프이다. U937 세포에 결합된 융합 단백질을 피코에리트린에 접합된 염소 항-인간 IgG Fab-2로 염색하였다. EGF-R에 특이적인, 인간화 mAb H415의 Fab-2 단편을 대조군으로 사용하였다. 도 53b는 14A8sFv-EGF 융합 작제물의 U937 세포에 대한 결합을 보여준다. 이 실험은, 다양한 농도의 14A8sFv-EGF가 14A8Fab'-EGF (23 nM)의 결합을 억제하는 능력에 대해 평가한 것 이외에, 도 53a에서와 유사한 방식으로 수행하였다. H22sFv-EGF 융합 단백질을 대조군으로 사용하였다. mAb H22는 U937 세포 상의 상이한 Fc 수용체인 CD64 (FcγRⅠ)에 결합한다.
도 54는 투여량에 의존적인, A431 세포의 융합 단백질-매개의 세포독성을 보여주는 그래프이다. 인큐베이션 시간을 16 내지 18시간으로 하고, 이펙터 세포 대 표적 세포의 양 (단핵구 및 PMN)을 100:1로 하여 크롬 방출 분석을 수행하였다. 이펙터 세포에는 신선한 단핵구 (도 54a), PMN (도 54b) 및 전체 혈액 (도 54c)이 포함되었다. 14A8의 Fab-2 단편을 대조군으로 사용하였다.
도 55는 도 54a 내지 54c의 결과를 비교하는 막대 그래프이다.
도 56a는 A431 세포의 14A8Fab'-EGF (1㎍/ml) 융합 단백질-매개의 세포독성이 14A8의 Fab-2 단편에 의해 억제됨을 보여주는 막대 그래프이다. 도 56b는 A431세포의 14A8sFv-EGF (1㎍/ml) 융합 단백질-매개의 세포독성도 14A8의 Fab-2 단편 (40 ㎍/ml)에 의해 억제됨을 보여주는 막대 그래프이다.
도 57은 이중특이적 단일쇄 융합 분자인 931 및 934와, 이들의 모체인 HuMAb를 나타내는 개략도이다. 14.1 및 3Fe의 가변 경쇄 및 중쇄 영역을 사용하여 931 및 934 (EGF와 함께) 작제물을 생성하였다.
도 58은 양성 대조군으로 사용되는, 14.1 및 3F2 (항-HER2)의 Fab' 단편으로 구성되고 화학적으로 접합된 이중특이적 분자를 나타내는 개략도이다.
도 59a는 트랜스펙토마 (transfectoma)의 상층액에서 발현된 융합 단백질 931 및 934의 유동 세포계수 분석으로 측정한 스크리닝 (결합) 분석을 나타내는 막대 그래프이다. 형질감염된 (931 및 934) 상층액 및 형질감염되지 않은 (NSO) 상층액을 종양 세포주인 SKBR-3 또는 A431과 함께 인큐베이션시켰다. 융합 단백질의 결합은 피코에리트린에 접합된 염소 항-인간 IgG Fab-2로 염색하여 검출하였다. 도 59b는 융합 단백질 931 및 934의 ADCC 분석을 보여주는 막대 그래프이다. 인큐베이션 시간을 16 내지 18시간으로 하고, 이펙터 세포 (단핵구, PMN) 대 표적 세포 (SKBR-3, A431)의 양을 100:1로 하여 크롬 방출 분석을 수행하였다. 종양 세포 사멸은 특이적 용해를 매개하는지에 대해 형질감염된 (931 및 934) 상층액 및 형질감염되지 않은 (NSO) 상층액을 사용하여 검출하였다.
도 60a는 단일쇄 융합 단백질 931 및 934의 U937 세포에 대한 결합 (유동 세포계수법으로 측정)을 보여주는 그래프이다. U937 세포에 결합하지 않는 항-EGF-R mAb인 425의 Fab' 단편을 음성 대조군으로 사용하였다. 도 58에 도시된 화학적으로 연결된 이중특이적 분자 (14.1 x 3F2)를 양성 대조군으로 사용하였다. 도 60b는 단일쇄 융합 단백질 931 및 934의 SKBR-3 세포에 대한 결합 (유동 세포계수법으로 측정)을 보여주는 그래프이다. 14.1 Fab-2를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 58에 도시된 화학적으로 연결된 이중특이적 부위 (14.1 x 3F2)를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 61은 단일쇄 융합 단백질 934의 A431 세포에 대한 결합 (유동 세포계수법으로 측정)을 보여주는 그래프이다. 이 실험은 EGF-R을 과다 발현하는 A431 종양 세포를 사용한 것 이외에, 도 60에서와 동일한 방법으로 수행하였다. EGF에 융합된 14.1의 sFv 단편으로 이루어진 융합 단백질을 양성 대조군으로 사용하였으며, 14.1 Fab-2를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 62는 단일쇄 융합 단백질 931에 의한 SKBR3 (도 62a) 및 BT474 (도 62b) 종양 세포의 PMN (이펙터 세포)-매개의 세포 독성을 보여주는 그래프이다. 인큐베이션 시간을 16 내지 18시간으로 하고, 이펙터 세포 대 표적 세포의 양을 100:1로 하여 크롬 방출 분석을 수행하였다. 14.1 Fab-2를 각 실험에서 음성 대조군으로 사용하였다.
도 63은 단일쇄 융합 단백질 931에 의한 SKBR3 (도 63a) 및 BT474 (도 63b) 종양 세포의 단핵구 (이펙터 세포)-매개의 세포 독성을 보여주는 그래프이다. 인큐베이션 시간을 16 내지 18시간으로 하고, 이펙터 세포 대 표적 세포의 양을 100:1로 하여 크롬 방출 분석을 수행하였다. 14.1 Fab-2를 각 실험에서 음성 대조군으로 사용하였다.
도 64는51Cr 방출로 측정한, 인간 항-HER2/neu x 항-CD89 이중특이적 분자 (14.1 x 3.F2)에 의해 매개된 다형핵 세포에 의한 SKBR-3 및 BT-474 종양 세포의 항체 의존성 세포 용해를 도시하는 그래프이다.
도 65는51Cr 방출로 측정한, 인간 항-HER2/neu x 항-CD89 이중특이적 분자 (14.1 x 3.F2)에 의해 매개된 단핵구에 의한 SKBR-3 및 BT-474 종양 세포의 항체 의존성 세포 용해를 도시하는 그래프이다.
도 66은51Cr 방출로 측정한, 인간 항-HER2/neu x 항-CD89 이중특이적 분자 (14.1 x 3.F2)에 의해 매개된 전체 혈액에 의한 BT-474 종양 세포의 항체 의존성 세포 용해를 도시하는 그래프이다.
다중특이적 분자
본 발명은 면역 세포를 표적으로 하는, 재조합 및 화학적으로 합성된 다중특이적 분자에 관한 것이다. 이 분자는, 하나 이상의 표적이 면역 세포의 표면 상의 분자인 다중의 (2개 이상의) 별개 표적에 결합하기 때문에 "다중특이적"이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 분자는 이펙터 세포 상의 분자 (바람직하게는 Fc 수용체)에 결합하는 하나 이상의 부분, 및 종양 세포 또는 병원체 상의 항원과 같은 상이한 표적에 결합하는 하나 이상의 부분 (예를 들어, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 부분)으로 이루어진 분자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 분자는, 1개 이상의 항원에 결합된 항원 표출 세포 (APC) 상의 분자 (예를들어, Fc 수용체)에 결합하는 다중 (즉, 둘 이상) 부분으로 구성된 항원 "멀티머 복합체"를 포함한다. 이들 멀티머 복합체는 APC에 대한 자기항원과 같은 항원을 표적으로 하여, APC에 의한 항원의 인터날리제이션 (내포작용), 가공 및(또는) 표출을 유도하고(하거나) 증진시킨다. 따라서, 이들 분자는 자기항원과 같이 정상적으로는 비-면역원성인 단백질에 대한 생체내 또는 시험관내 면역 반응을 유도하거나 증진시키는데 사용될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 분자는 Fc 수용체, 통상적으로는 FcδR (예를 들어, FcδRⅠ) 또는 FcαR에 결합하는 인간 또는 인간화된 (키메라) 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 또한, 다중특이적 분자는 상이한 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포) 상의 항원에 결합하는 1개 이상의 결합 특이적 부위 (예를 들어, 리간드 및(또는) 다른 인간 항체나 항체 단편)를 포함한다. 그러한 다중특이적 분자는 화학적으로 연결되거나, 또는 융합 단백질로서 유전자적으로 발현될 수 있다. 더욱이, 다중특이적 분자는, 예를 들어 FcδRⅠ 또는 FcαR을 통해 이펙터 세포를 표적으로 하기 때문에, 이들은 이펙터 세포 (예를 들어, PMN, 대식세포 및 단핵구)-매개의 표적 (예를 들어, 종양) 세포 사멸을 유도하거나, 또는 항원에 결합된 경우에 항원 표출 (AP) 이펙터 세포 (예를 들어, 수지상 세포)에 의한 항원 표출을 증진시키는데 이용될 수 있다.
본 발명의 다중특이적 분자를 설명하기 위해 사용되는 "∼에 결합하는 부분"이란 용어는 "∼에 대한 결합 특이적 부위"와 교환 가능하게 사용되는 것이다. 이들 용어는 표적 에피토프에 결합하는 다중특이적 분자의 영역을 지칭한다. 하기에더욱 상세히 기재되는 바와 같이, 이들 부분 또는 결합 특이적 부위에는, 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv) 및 이들의 모방체 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편의 결합을 "모방"하는 펩티드, 화학적 모방체 및 유기 모방체)를 포함하나 이에 한정되지는 않는, 표적 에피토프에 결합할 수 있는 모든 화합물이 포함된다. 구체적인 실시양태에서, 결합 특이적 부위는 H22 (ATCC 기탁번호 CRL11177), M22 (ATCC 기탁번호 HB12147), M32.2 (ATCC 기탁번호 HB9469) 또는 이들의 항원 결합 단편으로부터 선택되며, FcγRⅠ (CD64)에 결합하는 항체를 포함한다. 인간화 항체인 H22 및 그의 쥐 등가물인 M22는 FcγRⅠ의 천연 리간드 (IgG) 결합 부위의 바깥쪽에 결합하는 이점이 있기 때문에, 생체내에 투여시에도 내생성 리간드에 의해 차단되거나 경쟁에서 도태되지 않는다. 다른 구체적인 실시양태에서, 결합 특이적 부위는 FcαR (CD89)에 결합하는 인간 모노클로날 항체 14.1, 또는 HER2에 결합하는 인간 모노클로날 항체 3.F2로부터 선택되는 하나 이상의 항체를 포함한다.
본원에 사용되는 항체의 "항원-결합 부분" (또는 단순히 "항체 부분")이란 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 지닌 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다 (예를 들어, Fc 수용체). 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인F(ab')2단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체 단일 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되기는 하지만, VL과 VH 영역이 짝을 이루어 1가 분자를 형성하도록 이들을 단일 단백질 쇄로 만들어줄 수 있는 합성 링커에 의한 제조합 방법을 이용하여 이들을 결합시킬 수 있다 (단일쇄 Fv (scFv)로 알려짐; 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426] 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 또한, 그러한 단일쇄 항체는 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되는 것이다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 종래의 기술을 이용하여 얻을 수 있고, 단편은 본래 항체와 동일한 방식으로 유용성을 스크리닝할 수 있다.
Ⅰ. 항원 표출 세포 (APC)를 표적으로 하는 항원 멀티머 복합체를 포함하는 다중특이적 분자
본 발명의 항원 멀티머 복합체는 하나 이상의 항원에 연결된 항원 표출 세포 표면 상의 성분 (APC 세포 표면 성분)을 표적으로 하는 다중 부분 또는 결합 특이적 부위를 포함한다. 다중 결합 특이적 부위는 APC 세포 표면 성분의 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프들에 결합하거나, 또는 상이한 APC 세포 표면 성분들에 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 멀티머 복합체는 APC 세포 표면 성분(들)에 대한 3개 이상의 결합 특이적 부위를 포함한다. 표적화를 위한 APC 상의 적합한 성분에는, 결합 특이적 부위와의 결합시 인터날리제이션을 매개하여 상기 결합 특이적 부위에 연결된 항원이 APC에 의해 효율적으로 인터날리제이션되고 표출되게 하는 성분들이 포함된다.
본원에 사용되는 "항원 표출 세포" 또는 "APC"라는 용어는 항원을 인터날리제이션되게 하고 가공하여 항원 결정부가 면역계 (예를 들어, 클래스 Ⅱ-MHC 제한 헬퍼 T 림프구)에 의해 인식될 수 있는 방식으로 MHC-복합체로서 세포의 표면에 표출되게 할 수 있는 면역 세포를 의미한다. 세포가 APC로서 기능할 수 있게 하는 2가지 필수 특성은 내포된 항원을 가공하는 능력 및 클래스 Ⅱ MHC 유전자 산물의 발현이다. 헬퍼 T 세포에 대해 가장 잘 정의된 APC에는 단핵 식세포 (예를 들어, 대식세포), B 림프구, 수지상 세포, 피부의 랑게르한스 세포, 및 인간의 내피 세포가 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 결합 특이적 부위에 의해 표적화된 APC 세포 표면 성분은 Fc 수용체, 통상적으로는 FcγR이다. 따라서, 본 발명의 구체적인 실시양태에서, 멀티머 복합체는 FcγRⅠ 상의 상이한 에피토프를 표적으로 하는 다중 결합 특이적 부위 (예를 들어, 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상)을 포함한다. 별법으로, 멀티머는 FcγRⅠ 상의 동일한 에피토프를 표적으로 하는 다중 결합 특이적 부위를 포함할 수도 있다. 그러나, 다른 적합한 APC 세포 표면 성분도 표적이 될 수 있다. 그러한 성분은, 동물 (예를 들어, 인간 FcγRⅠ에 대한 트랜스제닉 생쥐)을 APC로 면역화시켜, 예를 들어 표준 분석 (예를 들면, 웨스턴 블롯)을 이용하여 이 동물로부터 얻은 혈청에 의해 결합된 세포 표면 성분을 결정함으로써 확인할 수 있다. 이후에, 이들 APC 세포 표면 성분에 결합하는 화합물이 인터날리제이션되게 하는 능력에 대해 상기 성분들을 시험할 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 멀티머 복합체는 인간 IgG 수용체와 같이 Fc 수용체에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv), 예를 들어 FcγRⅠ (CD64), FcγRⅠI (CD32) 및 FcγRⅠII (CD16)을 비롯한 Fc-감마 수용체 (FcγR)를 포함한다. 바람직한 Fcγ 수용체는 친화도가 높은 Fcγ 수용체인 FcγRⅠ이다. 그러나, 인간 IgA 수용체 (예를 들어, FcαRⅠ)와 같은 다른 Fc 수용체도 표적이될 수 있다. Fc 수용체는 APC, 예를 들어, 단핵구 또는 대식세포의 표면 상에 위치한다. 구체적인 실시양태에서, 멀티머 복합체는 수용체의 면역글로불린 (예를 들어, IgG 또는 IgA) 결합 부위와는 구별되는 다른 부위에서 Fc 수용체에 결합한다. 따라서, 멀티머 복합체의 결합은 면역글로불린의 생리적 양에 의해 차단되지 않는다. 바람직한 인간화 항-FcγR 모노클로날 항체는 PCT 출원 WO 94/10332호 및 미국 특허 제4,954,617호에 기재되어 있으며, 이들 문헌의 교시사항은 이 거명을 통해 그 전문이 본 명세서에 포함된다.
본 명세서의 실시예에 기재되는 바와 같이, 본 발명의 항원 멀티머 복합체에 사용하기 적합한 구체적 인간화 및 쥐의 모노클로날 항-FcγRⅠ 항체 및 항체 단편에는, 인간화 항체 H22 (ATCC 기탁번호 CRL11177), 그의 쥐 대응부 M22 (ATCC 기탁번호 HB12147) 및 쥐의 M32.2 (ATCC 기탁번호 HB9469) 뿐만 아니라, 이들 항체의항원 결합 단편이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
APC를 표적으로 하는 본 발명의 멀티머 복합체는 하나 이상의 항원을 더 포함한다. 본원에 사용되는 "항원"이란 용어는 면역 세포에 의해 인식될 (즉, T 세포-매개의 면역 반응과 같은 면역 반응을 도출함) 수 있는 임의의 분자 (예를 들어, 단백질, 펩티드, 탄수화물 등)를 의미한다. 항원에는, 숙주에 정상적으로 존재하면서 정상적인 상태에서는 숙주로부터 면역 반응을 도출하지 않는 (면역계가 이들은 "외래" 물질이 아닌 "자기" 물질로 인식하기 때문임) "자기항원" 또는 "자가항원"이 포함된다. 특정 질병에서는, 항원이 정상적인 상태에서는 숙주에 존재하지 않기 때문에 숙주의 면역계에 의한 면역 반응을 도출시켜야 하지만, 그렇지 않는다. 즉, 이러한 항원들은 숙주의 면역계에 의한 인식을 "회피한다". 그러한 항원에는, 예를 들어 특정 종양 항원 및 병원성 (예를 들어, 바이러스성 및 세균성) 항원이 포함된다. 이런 상황에서는 면역 세포에 의한 항원의 인식을 유도하거나 증진시키는 방식으로 항원을 변형시켜, 항원이나 항원을 생성하는 세포 (생명체)를 숙주에서 제거하는 것이 바람직할 것이다. 즉, 면역 세포에 의해 더이상 "자기항원"으로 인식되지 않도록 항원을 변형시킨다.
본 발명의 항원 멀티머 복합체는 하나 이상의 항원을, 당업계에 공지된 표준 가교결합제 및 접합 프로토콜을 이용하여, 본원에 기재된 바와 같은 APC 상의 성분에 대한 다수의 (2개 이상의) 결합 특이적 부위에 화학적으로 연결시킴으로써 제조할 수 있다. 별법으로, 항원 멀티머 복합체는 또한 본원에 기재된 바와 같이, 단일 융합 단백질로서 재조합적으로 제조될 수 있다.
따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 항원 멀티머 복합체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 통상적으로, 핵산은 발현 벡터 내에서 멀티머 복합체의 발현을 조절하는 프로모터 및 기타 유전자 조절 서열들과 작동가능하게 연결되어 있다. 핵산이 다른 핵산 서열과 기능적인 관계에 놓여 있을 때, 이 핵산은 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에, 이 프로모터 또는 인핸서는 상기 코딩에 작동가능하게 연결된 것이다. 전사 조절 서열에 관하여, 작동가능하게 연결된 것이란 연결된 DNA 서열이 2개의 단백질 코딩 영역이 결합되는 곳에서 리딩 프레임에 맞게 인접해 있음을 의미한다. 스위치 (switch) 서열의 경우, 작동가능하게 연결된 것은 이 서열이 스위치 재조합을 초래할 수 있음을 나타낸다.
본원에 사용되는 "벡터"란 용어는 자신에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"가 있는데, 이는 부가의 DNA 단편이 연결될 수 있는 환상의 이중 가닥 DNA 루프이다. 벡터의 다른 유형으로 바이러스 벡터가 있는데, 여기서 부가의 DNA 단편은 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 어떤 벡터들은 자신이 도입되고자 하는 숙주에서 스스로 복제할 수 있다 (예를 들어, 세균의 복제 개시점을 갖는 세균 벡터 및 에피좀이 있는 포유류 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 에피좀이 없는 포유류 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어, 숙주의 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 자신이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 그러한 벡터를 본원에서는 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")라 명명한다.일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 보통 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, 플라스미드는 가장 흔하게 사용되는 벡터의 형태이기 때문에, "플라스미드"와 "벡터"는 서로 교환 가능하게 사용된다. 그러나, 동등한 기능을 수행하는 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-결합 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 본 발명에 포함되는 것이다.
본원에 사용되는 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")라는 용어는 재조합 발현 벡터가 도입되는 세포를 의미한다. 이러한 용어는 특정 주체의 세포 뿐만 아니라 그 세포의 자손도 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이나 환경의 영향으로 인해 세대가 계속될수록 변이체가 생겨날 수 있기 때문에 사실상 자손들은 모세포와 동일하지는 않지만, 여전히 본원에 사용되는 "숙주 세포"라는 용어의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 항원 멀티머 복합체는 면역 세포 (예를 들어, APC)에 의한 항원의 인터날리제이션, 가공 및 표출을 유도하거나 증진시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 항원 멀티머 복합체를 투여함으로써 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 증진시키는 방법을 추가로 제공한다. 예를 들어, 항원 멀티머 복합체는 자기항원 (면역계에 의해 인식되지 않는 종양 항원 포함)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 투여되거나, 또는 종양 항원이나 병원체의 성분과 같은 항원에 대한 면역 반응을 증진시키기 위해 투여될 수 있다. 이와 같이, 항원 멀티머 복합체는 숙주를 면역화시키기 위한 백신으로서 사용될 수도 있다.
Ⅱ. 이펙터 세포를 표적으로 하는 다중특이적 분자
본 발명의 다중특이적 분자는 이펙터 세포를 표적으로 하는 분자 (예를 들어, 이펙터 세포를 매개로 표적 세포, 병원체, 알레르기원 또는 다른 존재를 제거할 수 있는 분자)를 포함한다. 따라서, 또다른 측면에서 본 발명은, 통상적으로는 Fc 수용체인 이펙터 세포 상의 성분에 결합하는 하나 이상의 부분, 및 종양 세포 또는 병원체의 항원과 같은 다른 표적에 결합하는 하나 이상의 부분 (예를 들어, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 부분)으로 이루어진 다중특이적 분자를 제공한다.
본원에 사용되는 "이펙터 세포"는 면역 세포를 의미한다. 특이적 이펙터 세포는 특이적 Fc 수용체를 발현하여 특이적 면역 기능을 수행한다. 예를 들어, FcγRⅠ 및 FcαR을 발현하는 단핵구, 대식세포, 중성구 및 수지상 세포는, 표적 세포의 특이적 사멸 및 면역계의 다른 성분에 대한 항원 표출 모두에 관여한다. 따라서, FcγRⅠ 및 FcαR는 이들 이펙터 세포 유형 각각에서 발현되기 때문에, FcγRⅠ 및 FcαR은 본 발명에 사용하기 바람직한 촉진 표적이다. 또한, 이펙터 세포에서 특정 FcR의 발현은 싸이토카인과 같은 체액성 인자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, FcγRⅠ은 인터페론 감마 (IFN-γ)에 의해 상향 조절되는 것으로 알려졌다. 이러한 증가된 발현은 표적에 대한 FcγRⅠ 세포의 세포 독성 활성을 증가시킨다.
이펙터 세포를 표적으로 하는 다중특이적 분자는, 이펙터 세포를 표적으로 하는 Fc 수용체와 같은 이펙터 세포의 성분에 결합하는 1개 이상의 결합특이적 부위 또는 부분들을 갖는다. 한 실시양태에서, 결합 특이적 부위는 상기 설명한 바와 같은 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, Fab' 또는 단일쇄 Fv)에 의해 제공된다.구체적인 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 또는 "인간화" 항체 또는 항체 단편이다. 여기서, 인간화 항체는 인간 항체에서 유래했지만 상보적 결정 영역 (CDR)의 일부분 이상이 비-인간 항체로부터 유래한 것이며, 그 부분은 인간 Fc 수용체에 대한 인간화 항체의 특이성을 제공하기 위해 선택된 것이다. 인간화 항체는 비-인간 항체로부터 유래한 CDR을 가지며, 항체 분자의 나머지 분자는 인간 항체로부터 유래한 것이다.
항체는 완전한 것, 즉 중쇄와 경쇄, 또는 Fab 또는 (Fab')2단편과 같은 임의의 단편을 갖는 것일 수 있다. 또한, 항체는 경쇄 또는 중쇄 다이머이거나, 이 거명을 통해 본 명세서에 그 내용이 포함되는 라드너 (Ladner) 등의 미국 특허 제4,946,778호 (1990년 8월 7일 허여됨)에 기재된 Fv 또는 단일쇄 작제물과 같은 임의의 최소 단편일 수 있다. 인간화 항체 또는 단편은 비-인간 CDR을 보유할 수 있는 임의의 인간 항체일 수 있다. 바람직한 인간 항체는 중쇄 가변 영역 (VH)이 공지된 단백질인 NEWM 및 KOL로부터 유래하고 Ig 카파쇄의 가변 영역 (VK)이 REI로부터 유래한 것이다.
인간 항체에 삽입된 비-인간 CDR의 부분은 인간화 항체가 Fc 수용체에 결합하기에 충분하도록 선택된다. 충분한 부분은 CDR의 부분을 인간 항체에 삽입하고, 효소 결합 면역흡수 분석 (ELISA)을 이용하여 생성된 인간화 항체의 결합 능력을 시험하여 선택할 수 있다.
특정 인간 항체의 모든 CDR은 비-인간 CDR의 일부분 이상으로 대체되거나,또는 CDR의 일부만이 비-인간 CDR로 대체될 수 있다. 인간화 항체가 Fc 수용체에 결합하는데 필요한 수의 CDR을 대체할 필요가 있다. 쥐의 모노클로날 항체 (mAb)인 mAb 22로부터 유래한 비-인간 CDR은 국제 특허 출원 공개 제WO 94/10332호에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 것이다. mAb22 항체는 Fc 수용체에 특이적이며, 또한 이 거명을 통해 그 내용이 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제4,954,617호 (1988년 9월 4일 허여됨)에 기재되어 있다. 인간화 mAb22 항체를 생성하는 세포주는 HA022CL1로 지정되어 아메라칸 타입 컬쳐 콜렉션에 1992년 11월 4일 기탁되었으며, 기탁번호 CRL11177을 배정받았다.
항체는, 인간 항체 CDR의 일부분 이상을 비-인간 항체로부터 유래한 CDR로 대체할 수 있는 임의의 방법에 의해 인간화될 수 있다. 윈터 (Winter)는 본 발명의 인간화 항체를 제조하는데 사용할 수 있는 방법을, 1987년 3월 26일 출원된 영국 특허 출원 제GB 2188638A호에 기재하고 있으며, 이 문헌은 이 거명을 통해 그 내용이 본 명세서에 포함되는 것이다. 인간 CDR은 국제 특허 출원 공개 제WO 94/10332호 (제목: Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes)에 기재된 올리고뉴클레오티드 부위-지정 돌연변이 유발법을 이용하여 비-인간 CDR로 대체될 수 있다.
항-Fc 수용체 부분 이외에, 다중특이적 분자는 "항-표적 부분", 즉 병원체 (예를 들어, 바이러스, 세균, 진균), 병원체 감염 세포, 암세포나 종양 세포 (예를 들어, 유방암, 난소암, 전립선암 등), 또는 대상체 (예를 들어, 인간 또는 동물)가원하지 않는 다른 세포, 또는 항원이나 그의 변형된 형태를 인식하여 결합하는 항체, 기능성 항체 단편 또는 리간드를 포함할 수 있다. 또한, 표적 부분은 항원을 포함하거나 항원에 대해 유도될 수 있다. 바람직한 실시양태는, 예를 들면 만성 감염의 경우에 순환계에서 항원을 제거하여 종양을 치료하기 위해 면역계를 자극하는데 사용할 수 있는 항원을 함유한다. 특히 바람직한 실시양태는 항-FcR 항체를 함유하는 다가 분자에 부착된 항원을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 다중특이적 분자는 리간드를 함유한다. 리간드는 분자와 상호작용하는 임의의 리간드일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 리간드는 일부분, 예를 들어 암세포와 같은 표적 세포 상의 표면 단백질에 결합한다. 바람직한 리간드는 수용체, 예를 들어 성장 인자 또는 분화 인자에 대한 리간드를 포함한다. 예를 들어, 다가 분자는 상피 성장 인자, 또는 적어도 수용체 (예를 들어, 상피 성장 인자 수용체)와 상호작용할 수 있는 그의 부분 또는 변이체 형태를 포함한다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서,리간드는 봄베신, 가스트린-방출 펩티드 (GRP), 리토린, 뉴로메딘 B 또는 뉴로메딘 C와 같은 작은 펩티드이다. 이 펩티드의 서열은, 이 거명을 통해 그 내용이 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제5,217,955호에서 알 수 있다. 또한, 리간드는 임의의 이러한 펩티드들의 변이체 형태일 수 있다. 변이체는 수용체에 대한 결합을 증가 또는 감소시키거나, 또는 수용체에 대한 결합에 영향을 미치지 않을 수 있다. 또한, 리간드의 변이는 효능제를 길항제로 변형시켜 리간드가 오히려 세포 증식의 자극을 억제하게 할 수 있다. 리간드의 변이는 1개 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 변형시키는것일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 다가 또는 이중특이적 분자는 항원을 포함한다. 본원에 사용되는 "항원"이란 용어는 임의의 천연 또는 합성 면역원성 물질, 면역원성 물질의 단편 또는 부분, 펩티드성 에피토프, 또는 합텐 (hapten)을 의미한다. 또한, "항원"이란 용어는 비복합화 형태에서는 면역원성이 아니지만, 복합화시 면역원성이 되는 물질도 포함한다. "비복합화"란 용어는 본 발명의 분자 복합체를 형성하기 이전의 물질을 의미한다. "복합화"란 용어는 본 발명의 분자 복합체를 형성하도록 연결된 물질을 의미한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 이중특이적 또는 다중특이적 분자는 세포에 대한 항원을 표적화하여 상기 세포에 의한 인터날리제이션 과정을 증진시킴으로써, 궁극적으로는 면역 반응을 자극하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 결합제는 항원에 특이적으로 결합 (항원의 에피토프에 직접 결합하거나, 또는 항원에 부착된 에피토프에 간접적으로 결합함)함과 동시에 항원의 가공 및 표출을 위해 항원을 인터날리제이션시키는 항원 표출 세포의 표면 수용체에 결합한다. 다른 실시양태에서, 항원은 다중특이적 또는 이중특이적 분자에 연결됨과 동시에 항원 표출 세포의 표면 수용체에 결합한다. 이들 이중특이적 또는 다중특이적 분자의 수용체 결합 성분은 (따라서, 이중특이적 또는 다중특이적 분자 자체도) 항원 표출 세포의 수용체에 결합한다. 어떤 경우에는 분자의 결합이 수용체의 천연 리간드에 의한 실질적인 차단 없이 일어나기도 한다. 그 결과, 수용체에 대한 항원의 표적화는 생리적 양의 리간드에 의해 방해받지 않고, 표적화된 수용체는 리간드에 결합하여 기능할 수 있는 채로 남아있을 것이다.
항원의 한 유형은 알레르기원일 수 있다. "알레르기원"이란 민감한 대상체에서 알레르기 반응 또는 천식 반응을 유도할 수 있는 물질을 의미한다. 알레르기원의 목록은 방대하며, 여기에는 꽃가루, 곤충의 독, 동물의 비듬, 진균의 포자 및 약물 (예를 들어, 페니실린) 등이 포함된다. 천연의 동물 및 식물 알레르기원에는 하기 속의 생물에 특이적인 단백질이 포함된다: 개과 동물 (카니스 파밀리아리스 (Canis familiaris)), 진드기류 (예를 들어, 더마토파고이데스 파리내 (Dermatophagoides farinae)) , 고양이과 동물 (펠리스 도메스티쿠스 (Felis domesticus)), 돼지풀 (암브로시아 아르테미스폴리아 (Ambrosia artemiisfolia)), 호밀풀 (예를 들어, 롤리움 페렌네 (Lolium perenne) 또는 롤리움 멀티플로룸 (Lolium multiflorum)), 삼나무 (크립토메리아 자포닉카 (Cryptomeria japonica)), 알터나리아균 (알터나리아 알터나타 (Alternaria alternata)), 앨더 (Alder), 오리나무 (알누스 굴티노사 (Alnus gultinosa)), 자작나무 (베툴라 베루코사 (Betula verrucosa)), 참나무 (쿼쿠스 알바 (Quercus alba)), 감람나무 (올레아 유로파 (Olea europa)), 쑥 (아르테미시아 불가리스 (Artemisia vulgaris)), 질경이 (예를 들어, 플란타고 란세올라타 (Plantago lanceolata)), 쐐기풀 (예를 들어, 파리에타리아 오피시날리스 (Parietaria officinalis) 또는 파리에타리아 주다이카(Parietaria judaica)), 바퀴벌레 (예를 들어, 블라텔라 저마니카 (Blattella germanica)), 꿀벌 (예를 들어, 아피스 멀티플로룸 (Apis multiflorum)), 측백나무 (예를 들어, 쿠프레수스 셈퍼비렌스 (Cupressussempervirens), 쿠프레수스 아리조니카 (Cupressus arizonica) 및 쿠프레수스 마크로카르파 (Cupressus macrocarpa)), 향나무 (예를 들어, 주니페루스 사비노이데스 (Juniperus sabinoides), 주니페루스 비르기니아나 (Juniperus virginiana), 주니페루스 콤무니스 (Juniperus communis) 및 주니페루스 아쉐이 (Juniperus ashei), 투야 (Thuya) (예를 들어, 투야 오리엔탈리스 (Thuya orientalis)), 편백나무 (예를 들어, 카매시파리스 오브투사 (Chamaecyparis obtusa)), 바퀴벌레 (예를 들어, 페리플라네타 아메리카나 (Periplaneta americana)), 개밀 (예를 들어, 아그로피론 레펜스 (Agropyron repens)) , 호밀 (예를 들어, 세칼레 세레알레 (Secale cereale)), 밀 (예를 들어, 트리티쿰 애스티붐 (Triticum aestivum)), 오리새 (예를 들어, 닥틸리스 글로메라타 (Dactylis glomerata)), 메도우페스큐 (예를 들어, 페스투카 엘라티어 (Festuca elatior)), 포아풀 (예를 들어, 포아 프라텐시스 (Poa pratensis) 또는 포아 콤프레사 (Poa compressa)), 귀리 (예를 들어, 아베나 사티바 (Avena sativa)), 흰털새 (예를 들어, 홀쿠스 라나투스 (Holcus lanatus)), 향기풀 (예를 들어, 안톡산툼 오도라툼 (Anthoxanthum odoratum)), 개나래새 (예를 들어, 아레나테룸 엘라티우스 (Arrhenatherum elatius)), 흰겨이삭 (예를 들어, 아그로스티스 알바 (Agrostis alba)), 큰조아재비 (예를 들어, 플레움 프라텐세 (Phleum pratense)), 흰갈풀 (예를 들어, 팔라리스 아룬디나세아 (Phalaris arundinacea)), 바히아그라스 (예를 들어, 파스팔룸 노타툼 (Paspalum notatum)), 수수 (예를 들어, 소르굼 할레펜시스 (Sorghum halepensis)) 및 헤오리체스 (예를 들어, 브로무스 이네르미스 (Bromus inermis)).
많은 알레르기원은 두드러기쑥, 잔디 또는 나무의 공기 중 꽃가루에서 발견되거나, 또는 진균류, 동물, 집 먼지 또는 음식에서 발견된다. 한 종류로서, 이들은 단백질가수분해성 분해에 대해 비교적 내성이 있다. 바람직한 알레르기원으로는 비만세포 및 호염기성 세포 상의 IgG에 결합하여 제1형 아나필락시스 (anaphylaxis) 과민반응을 유발하는 것들이 있다. 다가 결합제의 특이적 부위 중 하나 이상이 IgG의 리간드 결합 도메인 바깥쪽에 있는 고친화도 Fc 수용체의 에피토프에 대한 것일 경우, 이 이중특이적 결합제는 대상체의 과민성을 감소시킬 수 있다. 이는 알레르기원이 비만세포 또는 호염기성 세포 상의 IgG에 결합하기 전에 이중특이적 결합제가 IgE-결합 알레르기원과 경쟁하여 제1형 과민반응이 일어날 가능성을 감소시킴으로써 수행된다. 또한, FcγR에 알레르기원을 유도한 결과, 알레르기원에 대한 T 세포 내성 상태가 유도되어 IgE-매개의 제1형 반응을 방해할 수 있었다. 내성은 현행 사용되는 것보다 실질적으로 낮은 양의 알레르기원을 사용하여 알레르기원에 대한 결합에 대해 IgE와 경쟁하는 IgG를 유도함으로써 얻을 수도 있다.
어떤 경우에는 항원성이 낮거나 그 자체에는 항원성이 없는 물질 (예를 들어, 합텐)을 담체 분자, 예를 들어 투여를 위한 거대한 면역원성 단백질 (예를 들면, 세균 독소)에 커플링시키는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 경우, 이중특이적 결합제는 상기 물질 그 자체보다는 상기 물질이 결합된 담체의 에피토프에 결합하게 될 수 있다.
본 발명의 다중특이적 또는 이중특이적 분자에 직접적으로 또는 간접적으로연결된 항원은 가용성이거나 입자성일 수 있으며, 이는 B 세포 에피토프, T 세포 에피토프, 또는 상기 두가지 모두를 가질 수 있다. 항원은 그 기원이 세균, 바이러스 또는 기생 생물일 수 있다. 종종, 항원은 병원성 생물체의 표면 구조 성분을 포함하기도 한다. 예를 들어, 항원은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)의 외피 당단백질 또는 간염 바이러스의 표면 항원과 같은 바이러스 표면 구조를 포함할 수 있다. 또한, 항원은 질병의 치료를 위해 면역 반응이 도출될 수 있는 질병 세포, 예를 들어 종양 세포와 결합될 수 있다. 항원은 인간 유방암 및 난소암 세포에서 발현되는 Her-2/new 원시-종양유전자 산물과 같은 종양-특이적 또는 종양-결합 항원을 포함할 수 있다 (Slamon et al. (1989) Science 244:707).
대상체의 세포는 본 발명의 다가 분자에 시험관내 또는 생체내에서 노출될 수 있다. 다가 분자는 항원을 배양 중인 항원 표출 세포에 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 면역능 세포는 대상체의 혈액으로부터 분리 및 정제된다. 이어서, 상기 세포를 항원을 포함하는 다가 분자에 노출시키거나, 또는 세포를 항원에 대한 결합 특이적 부위를 갖는 다가 분자와 함께 항원에 노출시킨다. 표적화 항원 표출 세포는 항원을 가공하여 자신의 표면에 단편을 표출시킨다. 자극 후, 상기 세포는 대상체에게 되돌아 온다.
본 발명의 방법은 항원에 대한 면역 반응을 증진시키거나 강화시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 보조를 받지 않은 면역계가 감염을 극복할 수 없는 경우에, 간염 및 AIDS와 같은 만성 감염의 치료에 유용하다. 또한, 이 방법은 침윤 생물체에 대한 면역 반응의 강화가 필요한 급성 감염 단계의치료에 사용될 수도 있다.
본 발명의 방법은 보호성 또는 치료성 면역 반응을 얻기 위해 필요한 항원의 투여량을 감소시키거나, 또는 숙주가 항원에 대해 최소한으로도 반응하지 않는 경우에 사용될 수 있다. 일반적으로 바람직하기는 하지만, 알레르기의 경우와 같이 항원이 숙주에 독성을 나타낼 때는 유효량을 낮추는 것이 특히 바람직하다. 항원을 포함하거나 리간드 (예를 들어, 항원과 상호작용하는 항체)를 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 이용하는 방법 및 용도는 공개된 PCT 출원 PCT/US91/07283호에 추가로 기재되어 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 다중특이적 분자는 항원 표출 세포에 의해 T 세포에 변형된 항원의 표출시 T 세포 활성화에 대한 항원의 효과가 변화되도록 변형된 항체를 포함한다. 알란 (Allan) 등은 T 세포를 자극 (예를 들어, T 세포 증식을 자극)하는 펩티드 중 1개 이상의 아미노산을 치환하면, T 세포를 자극할 수 없거나 T 세포에서 면역성 결여를 유도하는 항원이 얻어진다는 것을 사실상 증명하였다. 그러한 변형된 펩티드는 변형 펩티드 리간드 (APL; Altered Peptide Ligand)라 명명한다. 따라서, 이와 같은 APL은 FcγRⅠ에 대한 1개 이상의 결합 특이적 부위를 갖는 이중특이적 또는 다중특이적 분자에 연결될 수 있다. 항원 표출 세포에 의한 이들 분자의 식세포 작용 및 T 세포에 대한 표출시, T 세포의 증식은 억제되거나 불활성화될 수 있다. 따라서, (a) 정상적인 상태에서는 T 세포를 자극하지만, 변형시에는 T 세포의 면역성 결여를 유도하는 항원의 하나 이상의 변이체 펩티드, 및 (b) 하나 이상의 항-FcγRⅠ 항체를 포함하는 다중특이적 분자를대상체에게 투여하면, 상기 대상체에서 항원에 대한 내성이 유도될 것이다. 따라서, 그러한 다중특이적 또는 이중특이적 분자는 다양한 항원, 예를 들어 자가항원에 대해 대상체에게 내성을 부여하는데 사용될 수 있다. 따라서, 사용되는 항원에 따라, 본 발명의 방법은 면역 반응을 증진시키는 방법, 즉 T 세포를 자극하는 항원을 사용하는 방법을 제공하며, 또한 T 세포 자극을 억제하거나 T 세포의 면역성 결여를 유도함으로써 면역 반응을 감소시키는 방법도 제공한다.
또한, 본 발명의 다중특이적 다가 분자는 "항-증진 인자 (항-EF) 부분"을 포함할 수도 있다. "항-증진 인자 부분"은 항체 또는 기능성 항체 단편이거나, 또는 항원에 결합하여 항-Fc 수용체 부분 또는 항-표적 부분의 효과를 증진시키는 리간드일 수 있다. "항-증진 인자 부분"은 Fc 수용체 또는 표적일 수도 있다. 어떤 표적 세포 항원에 결합하는 항-표적 부분 및 다른 표적 항원에 결합하는 항-증진 인자 부분을 포함하는 다가 분자는, 표적 세포가 항원 변형 또는 항원성 변이 (예를 들어, 트리파노좀과 같이 특정 기생 생물에 대해 기재된 바와 같음)를 수행하는 경우에 특히 유용하다. 별법으로, 항-증진 인자 부분은 항-표적 또는 항-Fc 수용체 부분이 결합하는 것과는 상이한 실체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-증진 인자 부분은 세포독성 T-세포에 결합할 수 있다 (예를 들면, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1, 또는 표적에 대한 면역 반응을 증진시키는 기타 면역 세포를 통해).
다중특이적 분자의 제조 방법
상기 기재된 다중특이적 분자는 여러가지 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 2가지 모든 특이적 부위가 동일한 벡터 내에서 코딩되고 발현되어, 동일한 숙주 세포에 수집될 수 있다. 이 방법은 다중특이적 분자가 하기 실시예 2에서와 같이 (리간드) x (Fab) 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 또한, 본 발명의 이중특이적 분자는 단일쇄 이중특이적 항체, 1개의 단일쇄 항체 및 리간드를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자, 또는 2개의 리간드를 포함하는 이중특이적 분자일 수 있다. 또한, 다가 분자는 단일쇄 분자이거나, 또는 2개 이상의 단일쇄 분자를 포함할 수 있다. 2가 또는 다가 항체를 제조하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호, 미국 특허 제5,455,030호, 미국 특허 제4,881,175호, 미국 특허 제5,132,405호, 미국 특허 제5,091,513호, 미국 특허 제5,476,786호, 미국 특허 제5,013,653호, 미국 특허 제5,258,498호 및 미국 특허 제5,482,858호에 기재되어 있다.
단일쇄 분자의 그에 대한 특이적 표적으로의 결합은 본원의 실시예에 기재된 이중특이적 ELISA에 의해 확인할 수 있다.
별법으로, 다중특이적 분자의 각 특이적 부위를 별개로 생성하여, 생성된 단백질 또는 펩티드를 서로 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 2개의 인간화 항체는 2개의 중쇄 중 힌지 영역 C-말단의 술프히드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 이전에 홀수의 술프히드릴 잔기, 바람직하게는 1개의 잔기를 함유하도록 변형된다.
본 발명의 이중특이적 분자는 하기 실시예에 기재된 방법 또는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 항-FcR 및 항-표적 부분을 접합시켜 제조할 수 있다. 예를들어, 다양한 커플링제 또는 가교결합제가 공유결합성 접합에 사용될 수 있다. 가교결합제의 예로는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), N-숙신이미딜-3-(2-피리미딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC) (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686] 및 [Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조)가 포함된다. 다른 방법에는 문헌 [Paulus, Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132], [Brennan et al., Science (1985) 229:81-83] 및 [Glennie et al., J. Immunol. (1987) 139:2367-2375]에 기재된 것들이 포함된다. 바람직한 접합제는 SATA 및 술포-SMCC이며, 이들은 모두 피어스 케미칼 컴퍼니 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)에서 입수할 수 있다.
다중특이적 분자 중의 결합 특이적 부위로서 항체를 이용하는 경우, 바람직한 항체로는 인간 모노클로날 항체 및 그의 인간화 항체 (Fab' 및 단일쇄 Fv와 같은 단편 포함)가 포함된다. 인간화 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 하기 실시예에 상세히 기재되어 있다. 온전한 인간 모노클로날 항체를 제조하는 방법도 당업계에 공지되어 있다. 이들 항체는 종래의 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 표준 체세포 혼성화 기술 (Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975))을 비롯한 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다. 원칙적으로는 체세포 혼성화 기술이 바람직하지만, B 림프구의 바이러스성 또는 종양유전자성 형질전환과 같이 모노클로날 항체를 제조하는 다른 기술들도 사용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기에 바람직한 동물 시스템은 쥐 시스템이다. 생쥐에서 하이브리도마를 생성하는 방법은 매우 잘 확립된 절차이다. 융합을 위해 면역화된 비장세포를 단리하는 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 쥐의 골수종 세포) 및 융합 절차도 알려져 있다.
바람직한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 생쥐의 면역계가 아닌 인간 면역계의 일부를 포함하는 트랜스제닉 생쥐를 이용하여 생성된다. 본원에서 "HuMAb"생쥐라 불리우는 이들 트랜스제닉 생쥐는, 내생성 μ 및 κ 좌위 (locus)를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께 정렬되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 소형 유전자 좌위 (gene minilocus)를 함유한다 (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474):856-859). 따라서, 생쥐의 IgM 또는 κ의 발현은 감소하고, 면역화에 대한 반응으로 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진 (transgene)이 클래스 스위칭 (class swiching) 및 체세포 돌연변이화되어 친화도가 높은 인간 IgGκ 모노클로날 항체를 생성한다 (Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌; 및 문헌 [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101], [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93], 및 [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764:536-546] 참조). HuMAb 생쥐의 제조는 하기 Ⅱ 단락과, 이 거명을 통해 그 내용이 본 명세서에 포함되는 문헌 (Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474):856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y Acad Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851)에 상세히 기재되어 있다. 추가로, 이 거명을 통해 그 전문이 본 명세서에 포함되는 론버그 (Lonberg)와 케이 (Kay) 및 젠팜 인터내셔널 (GenPharm International)의 미국 특허 제5,545,806호 및 제5,625,825; 수라니 (Surani) 등의 미국 특허 제5,545,807호; 1998년 6월 11일 공개된 국제 공개 제WO 98/24884호; 1994년 11월 10일 공개된 국제 공개 제WO 94/25585호; 1993년 6월 24일 공개된 국제 공개 제WO 93/1227호; 1992년 12월 23일 공개된 국제 공개 제WO 92/22645호; 1992년 3월 19일 공개된 국제 공개 제WO 92/03918호를 참조할 수 있다. 별법으로, 실시예 2에 기재된 HCO12 트랜스제닉 생쥐는 온전한 인간 모노클로날 항체를 생성하는데 사용할 수 있다.
온전한 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위해, 문헌 [Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474):856-859], [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851] 및 WO 98/24884호에 기재된 바와 같이 정제된 또는 순도가 높은 목적 면역원 제제 및(또는) 목적 면역원을 발현하는 세포로 생쥐를 면역화시킨다. 예를 들어, 정제된 또는 순도가 높은 HER2/neu 항원 제제 (5 내지 20 ㎍)를 복강내 주사하여 HuMAb 생쥐를 면역화시킨다. 정제된 또는 순도가 높은 HER2/neu 항원 제제를 이용하여 면역화시켜도 항체가 생성되지 않은 경우, HER2/neu를 발현하는 세포, 예를 들어 종양 세포주로 생쥐를 면역화시켜 면역 반응을 촉진할 수 있다.
다양한 항체를 사용한 실험이 누적됨에 따라, HuMAb 트랜스제닉 생쥐는 최초에 완전 프로인트 보강제 중의 항원을 복강내 주사 (IP)로 면역시킨 후, 이어서 2주에 1회씩 불완전 프로인트 보강제 중의 항원을 IP로 면역화 (총 6회)시키는 경우에 가장 항체 생성이 잘되는 것으로 밝혀졌다. 안와후방 출혈로 얻은 혈장 샘플로 면역화 프로토콜의 전체 과정을 모니터링할 수 있다. 혈장은 ELISA (하기 기재됨)에 의해 스크리닝될 수 있으며, 목적 면역원에 대한 인간 면역글로불린의 타이터가 충분한 생쥐를 융합에 사용한다. 생쥐에 항체를 정맥내 주사하여 면역화시키고, 3일 후에 생쥐를 죽여 비장을 분리한다. 각 항원에 대해 2 내지 3회의 융합을 수행한다. 각 항원에 대해 6마리의 생쥐가 면역화될 것이다. 예를 들어, HC07 및 HC012 세포주의 총 12마리 HuMAb 생쥐가 면역화될 수 있다.
이어서, 생쥐 비장세포를 단리하여 표준 프로토콜에 따라 PEG로 생쥐 골수종 세포주에 융합시켰다. 결과로 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝한다. 예를 들어, 면역화된 생쥐로부터 얻은 비장성 림프구의 단일 세포 현탁액을 50％ PEG로 1/6 수의 P3X63-Ag8.653 비분비성 생쥐 골수종 세포 (ACTT, CRL1580)에 융합시킨다. 세포를 바닥이 평평한 마이크로타이터 플레이트에약 2×105의 수로 플레이팅 한 후, 20％의 태아 클론 혈청, 18％의 "653" 조절 배지, 5％의 오리겐 (origen)(IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM L~글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 단위/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 젠타마이신 및 1X HAT (시그마 (Sigma); HAT는 융합 24 시간 후에 첨가)를 함유하는 선별 배지에서 2주 동안 배양한다. 2주 후, HAT가 HT로 대체된 배지에서 세포를 배양한다. 이어서, 목적 면역원에 대한 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체의 존재를 확인하기 위해 각각의 웰을 ELISA로 스크리닝한다. 일단 대규모의 하이브리도마 성장이 일어나면, 보통 10 내지 14일 후에 배지를 관찰한다. 하이브리도마를 분비하는 항체를 다시 플레이팅하고, 다시 스크리닝한 후, 여전히 목적 면역원에 대한 인간 IgG 모노클로날 항체가 존재하면 2회 이상의 제한 희석에 의해 이를 서브클로닝한다. 이어서, 특성화를 위해, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 소량의 항체가 조직 배양 배지 중에 생성되도록 한다.
인간 모노클로날 항체의 결합을 특성화하기 위해, 면역화된 생쥐로부터 얻은 혈청을 ELISA와 같은 방법으로 시험할 수 있다. 요컨대, 마이크로타이터 플레이트를 PBS 중 약 0.25 ㎍/ml의 목적 면역원 (정제됨)으로 코팅한 후, PBS 중의 5％ 소 혈청 알부민으로 차단한다. 목적 면역원으로 면역화된 생쥐로부터 얻은 혈장 희석액을 각 웰에 가하여 37℃에서 1 내지 2 시간 동안 인큐베이션시킨다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 후, 알칼리성 포스파타제가 접합된 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약과 함께 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨다. 세척 후, 플레이트를 pNPP 기질 (1 mg/ml)로 발색반응시키고, 405 내지 650의 OD값에서 분석한다. 바람직하게는, 가장 높은 타이터로 발색반응을 나타내는 생쥐를 융합에 사용할 것이다.
또한, 상기 기재된 ELISA 분석은 목적 면역원과 양성 반응을 나타내는 하이브리도마의 스크리닝에 사용될 수도 있다. 높은 친화도로 목적 면역원과 결합하는 하이브리도마는 서브클로닝되어 추가로 특성화될 것이다. 모세포의 반응성을 보유 (ELISA에 의함)하는, 각 하이브리도마에서 얻은 하나의 클론을 선택하여 -140℃에서 보관된 5 내지 10개의 바이알 세포 뱅크를 만들고, 항체의 정제에 사용할 수 있다.
목적 면역원에 대한 인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제용의 2-리터 스피너 (spinner)-플라스크에서 배양한다. 상층액을 여과하여 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (Pharmacia, Piscataway, NJ)로 친화성 크로마토그래피를 수행한다. 용출된 IgG는 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 순도를 검사할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 대체할 수 있고, 농도는 1.43의 소멸 계수를 이용하여 OD280을 측정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하여 -80℃에 보관한다.
선택된 인간 모노클로날 항체가 목적 면역원 상의 단일 에피토프에 결합하는지 확인하기 위해, 상업적으로 시판되는 시약 (Pierce, Rockford, IL)을 이용하여각 항체를 바이오틴으로 표지한다. 표지되지 않은 모노클로날 항체 및 바이오틴으로 표지된 모노클로날 항체를 이용하는 경쟁 연구는, 상기 기재된 바와 같이 목적 면역원으로 코팅된 ELISA 플레이트를 이용하여 수행한다. 바이오틴으로 표지된 mAb의 결합은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로 검출할 수 있다.
정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 이소타입 ELISA를 수행한다. 마이크로타이터 플레이트의 웰을 4℃에서 10 ㎍/ml의 항-인간 Ig로 밤새 코팅한다. 5％ BSA로 차단한 후, 플레이트를 10 ㎍/ml의 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조군과 상온에서 2 시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgGl 또는 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합 프로브와 반응시킨다. 플레이트를 발색반응시키고, 상기와 같이 분석한다.
모노클로날 항체가 목적 면역원을 발현하는 생세포, 예를 들어 종양 세포 수용체에 결합함을 입증하기 위해, 유동 세포계수법을 사용하였다. 요컨대, 목적 면역원을 발현하는 세포주 (표준 성장 조건에서 배양됨)를 0.1％의 트윈 (Tween) 80 및 20％의 생쥐 혈청을 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 모노클로날 항체와 혼합한 후 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨다. 세척 후, 제1 항체 염색에서와 동일한 조건하에서 세포를 플루오레세인 (Fluorescein)으로 표지된 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 샘플은 단일 세포에 모아지는 광 및 측면 산란 특성을 이용하는 FACScan 장치로 분석할 수 있다. 유동 세포계수 분석법 이외에 (또는 이를 대신하여) 형광 현미경을 이용하는 다른 분석법이 사용될 수도 있다. 세포는 정확히 상기 기재된 바와 같이 염색되어, 형광 현미경에 의해 관찰될 수 있다. 이 방법은개개의 세포를 가시화할 수 있게 하지만, 항원의 밀도에 따라 민감성이 감소될 수도 있다.
목적 면역원에 결합하는 인간 IgG를, 웨스턴 블롯팅에 의해 목적 면역원과의 반응성을 추가로 시험할 수 있다. 요컨대, 목적 면역원을 발현하는 세포의 추출물을 제조하여 나트륨 도데실 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행한다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막에 옮기고, 20％의 생쥐 혈청으로 차단하고, 시험될 모노클로날 항체로 조사한다. 인간 IgG의 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 이용하고 BCIP/NBT 기질 정제 (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)로 발색반응시켜 검출할 수 있다.
다중특이적 분자의 치료 용도
FcR이 있는 면역 세포 및 특정 표적 세포에 결합할 수 있는 능력에 기초하여, 특정 다중특이적 분자는 암 (예를 들어, 유방암, 난소암, 폐의 소세포 암종), 병원체 감염 (예를 들어, 바이러스 (예, HIV) 감염, 원생동물 (예, 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondii)) 감염, 진균 감염 (예, 칸디다증)), 자가 면역 (예를 들어, 혈소판감소성 자반증 및 전신성 루프스)을 비롯한 다양한 질병 또는 증상을 치료하거나 예방하기 위해 대상체에게 투여할 수 있다. 또한, 다중특이적 다가 분자는 표적 세포에 의한 감염에 대해 대상체를 백신화시키기 위해 예방 목적으로 투여될 수 있다.
치료에 사용시, 유효량의 적합한 다중특이적 분자는 이 분자가 의도된 치료 효과를 발휘하게 하는 임의의 방식으로 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로로는 경구 및 경피 (예를 들어, 패치를 통해)가 포함된다. 다른 투여 경로의 예로는 주사 (피하, 정맥내, 비경구, 복강내, 경막내)가 포함된다. 주사는 볼루스 형태로 수행되거나 연속 관주의 형태로 수행될 수 있다.
다중특이적 분자는 제약상 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 본원에 사용되는 "제약상 허용되는 담체"라는 어구는 다중특이적 분자와 동시에 투여되어 상기 분자가 의도한 기능을 수행할 수 있게 하는 물질을 포함하는 것이다. 그러한 담체의 예로는 용액, 용매, 분산 매질, 지연제 및 에멀젼 등이 포함된다. 제약 활성 물질을 위한 그런 매질의 이용은 당업계에 잘 공지되어 있다. 상기 분자와 함께 사용하기 적합한 종래의 모든 담체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
다중특이적 분자의 "유효량"이란 용어는 원하는 생물학적 효과를 실현하는데 필요하거나 충분한 양을 의미한다. 예를 들어, 항-표적 부분이 병원성 세포를 인식하는 다중특이적 분자의 유효량은 종양, 암, 또는 세균, 바이러스 또는 진균의 감염을 제거하는데 필요한 양이다. 특정 분야에 적용하기 위한 유효량은, 치료될 질병 또는 증상, 투여될 다중특이적 분자의 종류, 대상체의 크기, 또는 질병 또는 증상의 심각성과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 불필요한 실험없이도 특정 다중특이적 분자의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있을 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 실시예는 본 발명을 제한하기 위해 작성된 것은 아니다. 본 출원 전체에 인용된 모든 참고문헌, 계류중인 특허 출원 및 공개된 특허는 거명을 통해 본 명세서에 참고문헌으로 포함되는 것이다.
<실시예 1> Fc 수용체 및 항-her2/neu 항체에 특이적인 쥐의 또는 인간화 항체를 포함하는 이중특이적 항체의 제조
모노클로날 항체
항-FcγRⅠ 모노클로날 항체 (mAb)인 M22, M32.2 및 197은 하이브리도마 상층액으로부터 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제하였고, 인간 항-HIV-1 IgG1 mAb인 DZ33은 하이브리도마 상층액으로부터 단백질 A 친화 크로마토그래피 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 및 겔 여과에 의해 정제하였다. M32.2는 1987년 7월 1일 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852)에 기탁되어 ATCC 기탁번호 HB9469를 배정받았다.
세포주
쥐의 골수종 NSO (ECACC 85110503)는 비-Ig 합성 세포주로서, 재조합 mAb의 발현을 위해 사용되었다. NSO 세포를 10％ 소 태아 혈청 (FBS, Bibco, Paisley, U.K.)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. SKBR-3 (ATCC, Rockville, MD)은 HER2/neu 원시 종양유전자를 과다 발현하는 인간 유방암 세포주로서, 이스코브 변형 둘벨코 배지 (IMDM; Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco, Grand Island, NY)에서 배양하였다. U937은 FcγRⅠ을 발현하는 단핵구성 세포주로서, ATCC로부터 얻어 10％ FBS (Gibco, Grand Island, NY)가 첨가된 RPM-1640 배지에서 배양하였다.
쥐의 면역글로불린 V 영역 유전자의 클로닝
쥐의 하이브리도마 22로부터의 세포질 RNA를 문헌 [Favaloro, J., R. Treisman and R. Kamen (1982) Transcription maps of polyoma-specific RNA: analysis by two-dimensional S1 gel mapping. Meth. Enzymol. 65:718]에 기재된 바와 같이 제조하였다. Ig V 영역의 cDNA는 RNA를 주형으로, 국제 특허 출원 공개 제WO 94/10332호 (제목: Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes)에 기재된 프라이머 CG1FOR 및 CK2FOR로부터 개시된 역전사를 통해 제조하였다. cDNA 합성은 100 U의 MMLV 역전사효소 (Life Technologies, Paisley, UK)를 이용하는 표준 조건 하에서 수행하였다. VH및 VκcDNA를, 국제 특허 출원 공개 제WO 94/10332호에 기재된 SH2BACK 및 VK7BACK의 cDNA 프라이머를 이용하는 PCR로 증폭하였다 (Orlandi, R., D. H. Gussow, P. T. Jones and G. Winter (1989) (Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833). 증폭된 VH및 VκDNA를 정제하여, M13에 클로닝 한 후, T7 DNA 중합효소 (Pharmacia, Piscataway, NJ)를 이용하는 디데옥시법에 의해 서열분석하였다.
키메라 항체 유전자의 제작
쥐의 V 영역 DNA의 발현 벡터로의 클로닝을 촉진하기 위해, M22 V 영역 유전자의 양쪽 말단에 가까운 인접 부위에 제한 부위를 도입하였다. VH의 경우,VH1BACK 및 VH1FOR (Id.)를 이용하는 PCR에 의해 5'의 PstⅠ 및 3'의 BstEⅡ 부위를 클로닝된 쥐의 VH유전자에 도입하였다. Vκ의 경우, 프라이머 VK1BACK 및 VK1FOR (Id.)를 이용하여 클로닝된 쥐의 Vκ유전자에 5'의 PvuⅡ 및 3'의 BglⅡ 부위를 도입하였다. 어떤 경우에는 이들 프라이머에서 1개 이상의 아미노산을 자연 발생적인 것과 다르게 변화시켰다. 이들 V 영역 유전자 (ChVH 및 ChVK)를, Ig 프로모터, 신호 서열 및 스플라이스 부위를 함유하도록 적합한 제한효소를 절단하여 M13VHPCR1 및 M13VKPCR1 (Id.)에 클로닝하였다. M13으로부터 HindⅢ-BamHⅠ 단편으로서 DNA를 절단하여 IgG1 (Takahashi, N. et al., (1982), Structure of human immunoglobulin gamma genes: implications for evolution of a gene family, Cell, 29:671) 및 인간 카파 불변 영역 게놈 DNA (Hieter, R. A. et al., (1980) Cloned human and mouse kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments, Cell 22:197)를 함유하는 발현벡터 pSVgpt 및 pSVhyg에 클로닝하였다.
인간화 항체 유전자의 제작
NEWM의 인간 VH(Poljak, R. J. et al., Amino acid sequence of the VH region of a human mycloma immunoglobulin, (IgG New), Biochemistry, 16:3412) 및 KOL (Marquat, M. et al., (1980) Crystallographic refinement and atomic models of the intact immunoglobulin molecule Kol and its antigen-binding fragment at 3.OA and 1.9A resolution, J. Mol. Biol. 141:369)을 기초로 2개의인간화 중쇄를 제작하였다. 인간화 경쇄는 인간 벤스-존스 (Bence-Jones) 단백질인 REI (Epp, O. et al, (1974) Crystal and molecular structure of a dimer composed of the vandible portion of the Bence-Jones protein REI, Eur. J. Biochem. 45:513)로부터 유래하여, 일부 프레임워크 영역 (FR)이 변화된 상태로 제작하였다. 변형은, Vκ도메인이 인간 소그룹 Ⅰ에 더 전형적인 것이 되로록 하였으며, 여기에는 Thr39, Leu104, Gln105 및 Thr107을 Lys39, Val104, Glu105 및 Lys107로ㅗ 대체한 것이 포함된다. 또한, Met4를 Leu4로 변화시켜 PvuⅡ 제한 부위가 생기도록 하였다.
CDR에 무관하게 NEWM VH및 REI VκFR을 함유하는 DNA를 M13VHPCR1 및 M13VKPCR1 (Favaloro et al., 상기 문헌) 벡터에 클로닝하였다. KOL VH를 코딩하는 DNA를, KOL FR 아미노산을 코딩하는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 및 무관한 CDR을 이용하여 일련의 PCR에 의해 제작하였다. 이어서, 이 작제물을 M13VHPCR1에 클로닝하였다.
인간의 FR에 대응하는 뉴클레오티드에 인접한 mAb M22 CDR을 코딩하도록 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 합성하였다. NEWM에 기초한 인간화 VH의 경우, 쥐의 FR 아미노산인 Phe27, Ile28 및 Arg71이 항원 결합에 영향을 미칠 가능성이 높았기 때문에 이들을 프라이머에 포함시켰다 (Chothia, C. and A. M. Lesk (1987), Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol., 196:901; Tramontano, A. et al., (1990), Framework residue 71 is amajor determinant of the position and conformation of the second hypervariable region in VH domains of immunoglobulins, J. Mol. Biol., 215:175). 인간화 Vκ의 경우, 친화도에 영향을 미칠 수 있는 잔기로서 쥐의 아미노산인 Phe71을 이와 유사하게 포함시켰다 (Foote, J. and G. Winter, (1992), Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops, J. Mol. Biol. 224:487). KOL VH에는 쥐의 FR 잔기를 포함시키지 않았다. 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 5'을 인산화시키고, M13 ssDNA 주형을 함유하는 반응액 중에서 M13에 클로닝된 인간 V 영역 유전자에 보편적인 M13 정방향 프라이머를 어닐링시켰다. 2.5 U의 T7 DNA 중합효소 (United States Biochemicals, Cleveland, OH) 및 0.5 U의 T4 DNA 리가아제 (Gibco BRL, Grand Island, NY)로 DNA를 확장 및 라이게이션시켰다. M13 역방향 서열분석 프라이머를 이용하여 1 U의 벤트 (Vent) DNA 중합효소 (New England Biolabs, Beverly, MA)로, 확장/라이게이션 혼합물로부터 돌연변이화 가닥을 우선적으로 증폭시킨 후, M13 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성된 DNA를 BamHⅠ 및 HindⅢ로 절단하고, M13 및 DNA 서열 분석에 의해 확인된 삼중 CDR-이식 돌연변이체에 클로닝하였다.
인간화 V 영역을 함유하는 M13 클론의 전체를 서열분석하여 가짜 돌연변이가 없음을 확인하였다. 확인될 클론으로부터의 RF DNA를 HindⅢ 및 BamHⅠ으로 절단하여 pSVgpt 또는 pSVhyg에 클로닝하였으며, 그 결과 인간 IgG1 또는 인간 카파 불변 영역은 키메라 항체 유전자의 제작시 기재된 바와 같이 정확하게 첨가되었다.
재조합 mAb의 발현 및 정제
중쇄 (5 ㎍) 및 경쇄 (10 ㎍) 발현 벡터를 PvuⅠ으로 절단하고, 에탄올 침전시킨 후, 물 50 ㎕에 용해시켰다. NSO 세포 (1 내지 2 ×107)를 원심분리에 의해 수확하고, DMEM 0.5 ml에 재현탁시킨 후, 0.4 cm의 전기천공 큐벳 중에 DNA와 함께 혼합하였다. 얼음 위에서 5분 후, 세포에 170 V, 960 μF (진펄서 (GenPulser), Bio-Rad, Melville, NY)의 단일 펄스를 주고, 얼음에서 추가로 15 분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 DMEM 배지 중에서 24 내지 48 시간 동안 복구시켰다. 배지에 미코페놀산 (0.8 ㎍/ml) 및 크산틴 (250 ㎍/ml)을 가하여 선별 배지로 만들었다. 200 ㎕의 분취액을 96-웰 플레이트에 분배하였다. 추가로 10 내지 12일이 지난 후, ELISA에 의해 측정시 가장 높은 양의 항체를 함유하는 것으로 판명된 웰의 세포를 선택하여 제한 희석법으로 클로닝하였다.
과다 배양된 배양액으로부터 단백질 A 친화 크로마토그래피 (Boehringer Mannheim, Lewes, U.K.)에 의해 항체를 정제하였다. 농도는 A280nm로 측정하였고, ELISA 및 SDS-PAGE로 확인하였다.
항체 결합 측정용 ELISA
마이크로타이터 플레이트의 웰을 pH 9.6의 50 mM 중탄산염 완충액 중에서 염소 항-인간 IgM 항체 (Sera-Lab, Crawley Down, U.K.)로 코팅하였다. 플레이트를 1％의 BSA로 차단시킨 후, 일시적으로 형질감염된 COS 세포 (발현 벡터는 시드 박사 (Dr. Brian Seed, Massachusetts General Hospital, Boston, MA)가 친절하게 제공함)로부터 얻은 인간 FcγRⅠ 및 인간 IgM 중쇄 (sFcγRⅠ-μ)의 세포외 도메인으로 이루어진 가용성 융합 단백질을 가하였다. 재조합 22 또는 대조군 mAb를 λ 경쇄를 함유하는 과량 (2.2 ㎍/웰)의 인간 IgG1 항체 (Sigma, St. Louis, MO)의 존재하에 가하여, 시험 mAb의 Fc 부분을 통한 비특이적 결합을 차단하였다. 결합된 22 mAb를 퍼옥시다제-표지 염소 항-인간 카파쇄 항체 (Sera-Lab, Crawley Down, U.K.) 및 o-페닐렌디아민으로 검출하였다.
항체의 플루오레세인 표지
0.1 M의 Na2CO3를 가하여 mAb 용액의 pH를 9.3으로 조정하였다. 플루오레세인 이소-티오시아네이트 (FITC)(Sigma, St. Louis, MO)를 DMSO에 2 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 40 ㎍의 FITC를 mAb 1 mg에 가하고, 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 플루오로세인으로 표지된 mAb를 G-25 크로마토그래피에 의해 유리 FITC로부터 분리하였다.
혈액 세포의 준비
헤파린 처리된 전체 정맥 혈액으로부터 생성된 담황갈색 층을 만들었다. 전체 혈액을 5％의 덱스트란을 2.5:1 (부피/부피)의 비율로 함유하는 RPMI로 희석하였다. 얼음에서 45 분 동안 적혈구가 침강되게 한 후, 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 원심분리로 펠렛을 만들었다. 남아있는 백혈구를 저장성 용혈로 제거하였다. 나머지 림프구, 단핵구 및 호중성구는 결합 분석에 사용할 때까지 얼음에 놓아 두었다. 일부 실험에서, 호중성구를 피콜 하이팍 (ficoll hypaque) 구배 분리 (Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해 단핵 세포로부터 분리하였다. FcγRⅠ을 상향조절하기 위해, 호중성구 및 단핵 세포를 싸이토카인으로 처리하였다. 단핵 세포의 배양액을 37℃, 5％ CO2로 48 시간 동안 테플론 접시 (teflon dish)에서 배양하여, 2.5％의 정상 인간 혈청형 AB (Sigma, St. Louis, MO) 및 500 IRU/ml의 IFN-γ (R & D Systems, Minneapolis, MN)를 함유하는 RPMI 중에 4×106개의 세포 농도가 되도록 하였다. 호중성구를 50 ng/ml의 G-CSF (알. 레프 (R. Repp, U. of Erlanger, Germany)가 친절하게 제공함) 및 500 IRU/ml의 IFN-γ가 들어있는 AIM V 배지 (Gibco, Grand Island, NY)에서 48 시간 동안 배양 (37℃, 5％ CO2)하였다.
유동 세포계수법
상기 기재된 바와 같이 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 세포 결합 분석을 수행하였다 (Guyre, P. M. et al., Monoclonal antibodies that bind to distinct epitopes on FcγR are able to trigger receptor function. J. Immunol., 143:1650). 요컨대, 2 mg/ml의 BSA 및 0.05％의 NaN3(PBA)를 함유하는 pH 7.4의 PBS 중에서 세포를 세척하고, PBA로 2.0×107개 세포/ml의 농도를 조정하였다. FITC로 표지된 항체 및 접합되지 않은 항체를 PBA 중에서 제조하였다. 세포 (25 ㎕), 항체 (25 ㎕) 및 인간 혈청 (25 ㎕), 또는 인간 IgG (10 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO)(25 ㎕), 또는 PBA (25 ㎕)를 마이크로타이터 플레이트에 가하여 얼음에서 45 내지 60 분 동안 방치하였다. PBA로 3회 세척하여 결합하지 않은 항체를 제거하였다. 세포를 1％의 파라포름알데히드로 고정하였다. 형광이 결합된 세포를 벡톤 디킨슨 팩스캔 (Becton Dickinson FACScan)에서 분석하였다.
BsAb 커플링 절차
문헌 [Glennie, M. J. et al., (1987), Preparation and performance of bispecific F (ab' gamma)2, antibody containing thioether-linked Fab'gamma fragments, J. Immunol., 139:2367]에 기재된 방법을 이용하여 BsAb를 제작하였다. mAb 22 (쥐의 항체 및 인간화 항체) 및 520C9 (항-HER2/neu) 항체에 대한 각각의 하이브리도마 세포를 시험관내에서 배양하여 각각의 항체를 제조하였다. 항체들을 펩신으로 분해하여 F(ab')2를 생성하고, 이후에 30℃에서 30 분 동안 10 mM의 머캅토에탄올아민 (MEA)을 가하여 Fab'으로 환원시켰다. 50 mM 아세트산나트륨, 0.5 mM EDTA (pH 5.3, 4℃)로 평형화된 세파덱스 (Sephadex) G-25 컬럼에 Fab' 단편을 적용시켰다. 메탄올/얼음 욕에서 디메틸 포름아미드 중에 용해된 오르토-페닐렌디말레이미드 (o-PDM, 12 mM)를, M 22 x 520C9의 경우에는 쥐의 22 Fab'에 가하고 (절반 부피) H 22 x 520C9의 경우에는 520C9 Fab'에 가하여, 얼음에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 50 mM 아세트산나트륨, 0.5 mM EDTA (pH 5.3, 4℃)로 평형화된 세파덱스 G-25 컬럼에서 Fab'-말레이미드를 유리 o-PDM으로부터 분리하였다. BsAb를 제조하는 경우, M22 Fab'-말레이미드를 520C9 Fab'에 가하거나, 또는 520C9 Fab'-말레이미드를 H22 Fab'에 1:1의 몰비로 가하였다. 아미콘 (Amicon) 챔버에서 디아플로 (Diaflo) 막을 이용하여 (4℃), 질소하에서 반응물을 출발 부피까지 농축시켰다. 18 시간 후, 1 M Tris-HCl (pH 8.0)을 이용하여 pH를 8.0으로 조정하였다. 이어서, 혼합물을 10 mM MEA로 환원 (30 분, 30℃)시키고, 25 mM 요오도아세트아미드로 알킬화시켰다. PBS로 평형화된 슈퍼덱스 (Superdex) 200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 컬럼에 의해 이중특이적 F(ab')2를 비반응 Fab' 및 다른 생성물로부터 분리하였다.
항체 의존성 세포 독성 (ADCC)
HER2/neu를 과다 발현하는 인간 유방암종 세포인 SKBR-3를 싸이토카인 활성화 호중성구에 의한 용해의 표적으로 사용하였다 (혈액 세포의 준비 참조). 표적을 100 μCi의51Cr로 1 시간 동안 표지한 후, U-바닥 마이크로타이터 플레이트에서 호중성구 및 항체와 혼합하였다. 37℃에서 5 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 상층액을 수집하여 방사성을 분석하였다. 세포 독성은 하기 식에 의해 계산하였다.
％ 용해=(실험 CPM - 표적누출 CPM/계면활성제 용해 CPM - 표적누출 CPM)×100％.
비용해도=항체 존재시의 ％ 용해 - 항체 부재시의 ％ 용해. 분석은 3배수로 수행하였다.
과산화물 유도
FcγRⅠ를 통해 과산화물의 방출을 촉진시키는 H22의 능력을 측정하기 위해 U937 세포를 사용하였다 (Pfefferkorn, L. C. and G. R. Yeaman (1994), Association of IgA-Fc receptors (Fc x R) with FcεRIγ2 subunits in U937cells, J. Immunol. 153:3228; Hallet, H. B. and A. K. Campbell (1983)). U937 세포를 100 U/ml의 INF-γ (Genentech, S. San Francisco, CA)의 존재하에 10％ FBS (Hyclone, Logan, UT)가 포함된 RPMI-1640 배지 (Gibco, Grand Island, NY)에서 5일 동안 배양하여, 분화를 유도하고 FcγRⅠ의 발현을 증가시켰다. 실험 당일, 분화된 세포들을 37℃에서 10％ FBS가 포함된 신선한 RPMI-1640 배지에서 20분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 펠렛으로 만들고, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 11 mM 글루코스 및 100 ㎍/ml BSA (Sigma, St. Louis, MO)가 보충된 PBS 중에 3 ×106개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 과산화물의 방출을 촉진시키기 위해, 0.1 mM 루미놀 (luminol)(Sigma, St. Louis, MO), 0.4 mM 나트륨 바나데이트 (Sigma, St. Louis, MO), 및 mAb인 M22, H22 또는 197 중 하나를 함유하는 100㎕의 반응 용액에 100 ㎕의 세포를 가하고 22℃에서 발광측정기 (luminometer)에 놓아 두었다. 발광측정기에서 반응 용액에 세포를 가한 직후 매 30 내지 40 초마다 과산화물의 자발 생성을 측정하였다. M22, H22 또는 197과 가교결합된 FcγRⅠ에 의해 촉진되는 과산화물을 비교하기 위해, 각 mAb를 10 ㎍/ml의 농도로 사용하였다. mV/초 단위의 과산화물 생성을 20 분 동안 모니터링하였다. MAb M22, M32.2 및 197을 다양한 농도로 가하여, 투여량에 따른 과산화물의 생성을 확인하였다.
결과
쥐의 Ig V 영역 유전자
쥐의 중쇄 및 카파쇄 불변 영역에 특이적인 프라이머를 이용하여 M22 하이브리도마 RNA로부터 Ig V 영역 cDNA를 제조하고, 공지된 신호 서열 및(또는) 성숙 V 영역의 5' 서열에 기초한 일련의 프라이머를 추가로 사용하여 PCR에 의해 이를 증폭하였다. SH2BACK/CG1FOR과 VK7BACK/CK2FOR 프라이머의 조합을 이용하여 VH및 Vκ에 대한 예상된 크기의 PCR 산물을 얻었다. 증폭된 DNA를 적합한 제한 효소로 절단하여 M13에 클로닝한 후, 적어도 24개의 독립 클론으로부터 양쪽 방향의 서열을 결정하였다. 추정 아미노산 서열은 서열 29 및 30에 기재되어 있다. Vκ의 N-말단 잔기 4개는 VKBACK 프라이머에 의해 코딩된 것이다.
VH및 Vκ는 각각 쥐의 중쇄 소그룹 ⅢD 및 카파 소그룹 Ⅰ에 속하는 구성원이다 (Kabat, E. A. et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., U. S. Department of Health and Human Services). L97 잔기 이외에, M22 Vκ의 아미노산 서열은 쥐의 항-IgG mAb A17 (Shlomchik, M. et al., Variable region sequences of murine IgM anti-IgG monoclonal autoantibodies (rheumatoid factors) Ⅱ Comparison of hybridonias derived by lipopolysaccharide stimulation and secondary protein immunization, J. Exp. Med. 165:970)로부터의 서열과 동일하다.
인간화 mAb 및 그의 결합에 대한 초기 특성화
M22 VHFR은 NEWN (57％)(인간 소그룹 Ⅱ) 보다 KOL (인간 소그룹 Ⅲ)에 더 높은 상동성 (79％)을 나타냈다. 이 차이가 결합에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해, 쥐의 잔기인 Phe27, Ile28 및 Arg71을 포함하는 NEWM VH에 기초한 중쇄 또는 쥐의 FR 아미노산이 없는 KOL VH에 기초한 중쇄를 제작하였다. 2가지 모든 인간화 VH의 파트너로 동일한 REI-유래의 인간화 경쇄를 사용하였다.
FcγRⅠ/IgM 중쇄 융합 단백질에 대한 결합을 측정하는 ELISA에 의해 인간화 mAb의 친화도를 처음에 평가하였다. 그 데이타는, KOL VH/REI VκmAb는 키메라 mAb와 동일한 결합을 나타내는 반면, NEWM VH/REI VκmAb는 약 5배 정도 낮은 친화도를 나타내는 것으로 판명되었다. 비특이적 인간 IgG1 mAb의 결합력이 낮다는 것은, 95％가 넘는 인간화 mAb의 결합이 Fc 도메인 보다는 Fv 부분을 통해 이루어짐을 보여주는 것이다.
결합 친화도를 회복하기 위해 NEWM FR에 추가의 변화가 기대되는 한편, 이러한 변화는 원하지않는 면역 반응을 유발할 수 있는 신규 에피토프를 생성할 수도 있다. 따라서, H22로 명명된 KOL VH/REI VκmAb를 선택하여 추가로 결합 특성을 조사하였다.
mAbH22의 기능적 특성화
H22 항체의 특이성 및 이소타입을 확립하기 위해 일련의 결합 실험을 수행하였다. 플루오로세인-접합 M22 또는 H22로 염색된 말초 혈액 백혈구는 세포당 약 104결합 부위로 단핵구에 대한 특이적 결합을 나타냈다. 이와는 반대로, 림프구 또는 비자극 호중성구는 특이적 결합이 거의 또는 전혀 나타나지 않았다 (표 1).
단핵구에 대한 H22의 특이적 결합
항체 단핵구 림프구 PMN
M22 10,000a <1000 <1000
H22 10,500 <1000 <1000
a세포당 항체 부위, 2회의 평균
FcγRⅠ에 대해 H22가 M22와 동일한 부위에서 결합함을 입증하고 H22가 리간드로서 Fc 결합 도메인에 결합함을 입증하기 위해, 2개의 항-FcγRⅠ 쥐의 mAb (M22 및 M32.2) 및 인간 IgG1 mAb로 경쟁 실험을 수행하였다. 접합되지 않은 H22 및 M22는, FcγRⅠ 상의 Fc 결합 부위가 포화된 과량의 IgG의 존재하에 플루오레세인이 접합된 M22 또는 플루오레세인이 접합된 H22에 대해 동등하게 경쟁하였다. 기대했던 바와 같이, M22와는 FcγRⅠ의 다른 부위에 결합하는 항-FcγRⅠ 항체 M32.2 (Guyre, P. M. et al., J. Immunol. 143:1650)도 또한 M22-FITC와 결쟁할 수 없었다. 또한, H22가 H22-FITC를 억제하지만 무관한 인간 IgG1 mAb는 그렇지 않다는 것은, H22의 V 영역을 통한 FcγRⅠ 결합의 특이성을 확인해주는 것이다.
H22 (M22는 아님)는 플루오로세인이 접합된 인간 IgG1에 의한 FcγRⅠ에의 Fc 매개 결합에 대해 경쟁할 수 있었다. 이 실험은 H22의 Fc 부분 (M22의 Fc 부분은 아님)이 FcγRⅠ의 Fc 결합 도메인에 결합함을 입증하는 것이다. 이는 인간 IgG1 항체 (쥐의 IgG1은 아님)의 Fc 부분이 FcγRⅠ에 높은 친화도로 결합할 수 있다는 사실과 일치된다.
M22의 인간화는 주로 그 면역치료 효능을 증가시키는 것이기 때문에, 단핵구 및 싸이토카인-활성화 호중성구에 대한 H22의 결합 활성은 인간 혈청의 존재하에 측정하였다. H22-FITC는 인간 혈청의 존재 및 부재하에 단핵구 상의 FcγRⅠ에 유사한 친화도로 결합하였다. 이와 반대로, 무관한 인간 IgG-FITC의 Fc-매개 결합은 인간 혈청에 의해 완전히 억제되었다. 이와 유사하게, H22-FITC는 인간 혈청의 존재 및 부재하에 IFN-γ 처리된 호중성구에 유사한 친화도로 결합하였다. 이를 종합해 보면, 데이타는 H22가 Fc 결합 도메인과는 구별되는 다른 부위에 그의 V 영역을 통해 결합하고, 또한 FcγRⅠ의 리간드 결합 도메인에 그의 Fc 영역을 통해 결합함을 보여준다. 전자의 결합 활성은 인간 IgG1의 항체 봉쇄를 효과적으로 극복한다.
H22 BsAb의 기능적 활성
면역치료에 대한 항-FcγRⅠ 항체의 으뜸가는 적용은 FcγRⅠ-포함 이펙터 세포를 종양 세포, 바이러스 또는 바이러스-감염 세포에 연결시키는 BsAb의 개발이다. 그러한 BsAb는 M22로 개발되었고, 따라서 M22 항-종양 BsAb (520C9 x M22)의 능력 및 대응하는 H22 BsAb (520C9 x H22)의 세포독성 매개 능력을 비교했다. 이들 BsAb는 항-HER2/neu 항체의 Fab'에 화학적으로 접합된 H22 또는 M22 Fab'로 이루어져 있으며, 따라서 이펙터 세포 촉진 분자 FcγRⅠ 및 종양 항원에 특이적이다.
ADCC 분석에 의해 M22-유래의 BsAb와 H22-유래의 BsAb를 비교하였다. M22- 및 H22-유래의 BsAb는 SKBR-3 세포를 과다 발현하는 HER2/neu의 사멸을 매개하였다. 쥐의 BsAb 및 인간화 BsAb는 항원 포함 표적 세포의 용해를 유사한 수준으로 나타냈다. 또한, 상기 2가지 BsAb는 모두 인간 혈청의 존재하에 ADCC 활성을 보유하였으나, 과량의 M22 F(ab')2는 사멸을 완전히 억제하였다. 이들 결과를 종합해 보면, H22 BsAb-유도 용해는 M22 에피토프를 통해 매개되며, ADCC는 FcγRⅠ에 특이적임을 알 수 있다.
마지막으로, 단핵구-유사 세포주인 U937에 의해 과산화물 생성을 자극하는 H22 및 M22의 능력을 평가하였다. V 영역에 의해 FcγRⅠ에만 결합하는 M22는 매우 낮은 수준의 산소 방출을 유도했는데, 이는 아마도 수용체에 효과적으로 가교결합하지 못해서 그런것 같다. 그러나, Fc 도메인을 통해 리간드로서 결합하고 또한 Fv를 통해 항체로서 결합하여 FcγRⅠ을 가교결합시키는 H22는 실질적으로 더 많은 과산화물의 방출을 유도하였다.
<실시예 2> 기능성 H22-상피 성장 인자 융합 단백질의 생성
재료 및 방법
발현 벡터 및 클로닝
H22의 중쇄 (pSVgpt) 및 경쇄 (pSVhyg)의 게놈 클론에 대한 발현 벡터는 국제 특허 출원 공개 제WO 94/10332호 (제목: Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes)에 기재된 바와 같다. Fab-리간드 융합 작제물의 경우에는 경쇄를 변화시킬 필요가 없었다. 그러나, 중쇄의 경우에는 HC2 및 CH3 도메인이 제거되고 리간드의 코딩 서열로 대체되었다.중쇄 벡터는 2개의 BamHⅠ 부위를 함유하는데, 이중 하나는 VH와 CH1 사이의 인트론에 있고, 다른 하나는 CH3의 바로 하류에 있다. BamHⅠ 제한 부위를 이용하여, 불변 도메인을 코딩하는 DNA를, CH1과 대부분의 힌지를 코딩하는 말단 절단 버전으로 대체하였다. 이를 위해, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 도 1에 도시된 바와 같이 변화된 중쇄 단편의 새로운 C-말단이 되게 조작하였다.
클로닝 제한효소 부위인 XhoⅠ 및 NotⅠ의 하류, 및 VH의 하류에 새로이 PCR 생성된 CH1 단편을 클로닝하기 위해 사용된 BamHⅠ 부위 상류에 있는 번역 종결 코돈으로 이루어진, 도 1c에 도시된 작제물을 사용하여 융합 단백질 작제물을 생성하였다. Fd와 리간드 사이의 가요성을 보유하기 위해 대부분의 힌지 하류에 위치하는 클로닝 부위를 사용하여 EGF 또는 다른 리간드를 코딩하는 DNA를 삽입하였다. 또한, 기존의 작제물에서 유래한 단일 Cys 잔기가 포함되어 있어서 다이머 분자의 형성을 위한 접합이 가능했다.
리간드를 코딩하는 DNA를 PCR에 의해 증폭시켜 N-말단에 XhoⅠ 부위 및 C-말단에 NotⅠ 부위를 갖게 한 후, 상기 기재된 새로이 조작된 H22 중쇄 말단 절단 단편의 동일한 부위에 적당한 리딩 프레임으로 삽입하였다. 상피 성장 인자 (EGF)를 코딩하는 cDNA는 ATCC (#59957)로부터 얻었다. 약 1200 잔기의 전구체 중 성숙 EGF의 아미노산 잔기 53개를 코딩하는 DNA만을, Asn971에서 시작하여 Arg1023으로 끝나도록 클로닝하였다 (Bell, G. I., Fong, N. M., Stempien, M. M., Wormsted, MA., Caput, D., Ku. L., Urdea, M. S., Rall, L. B. & Sanchez-Pescador, R. Human Epidermal Growth Factor Precurser: cDNA Sequence, Expression In Vitroand Gene Organization. Nucl. Acids Res. 14:8427-8446, 1986).
발현
쥐의 골수종 NSO (ECACC 85110503)는 비-Ig 합성 세포주로서, 융합 단백질의 발현을 위해 사용되었다. H22 Fd를 코딩하는 DNA가 프레임에 맞게 EGF에 융합된 (도 2 참조) 최종 발현 벡터인 pSVgpt 작제물을 바이오라드 진 펄서 (BioRad Gene Pulser)를 이용하는 전기천공법에 의해, H22 경쇄를 코딩하는 DNA가 함유된 pSVhyg로 이미 형질감염된 NSO를 형질감염시켰다. 이들 폴리펩티드는 벡터에 존재하는 Ig 프로모터 및 Ig 인핸서에 의해 발현되었으며, 작제물의 N-말단에 위치하는 mAb 22 중쇄 신호 펩티드에 의해 분비되었다. 형질감염 1 또는 2 일 후, 미코페놀산 및 크산틴을 배지에 가하여 DNA가 들어있는 세포를 선별하였다. ELISA에 의해 결합 활성을 입증한 후, 개개의 성장 콜로니를 단리하여 서브클로닝하였다.
정제
H22-EGF 융합 단백질을 발현하는 세포를 서브클로닝하여 증식시켰다. 융합 단백질을 발현하는 클론을 스피너 배양으로 증식 및 배양하고, 상층액을 투명하게 한 후 농축시켰다. 항-인간 카파쇄 친화성 컬럼 (Sterogene, Carlsbad, CA) 상의 친화도 크로마토그래피에 의해 소규모 정제를 수행하였다. 정제된 단백질을 비환원 조건 하에서 5 내지 15 ％의 아크릴아미드 구배 겔에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 도 3은 항-Fc 수용체-리간드 융합 단백질의 생성을 나타내는 개략도이다.
이중특이적 유동 세포계수법
융합 단백질이 FcγRⅠ 및 EGFR에 동시에 결합할 수 있음을 보여주기 위해,유동 세포계수 분석을 개발하였다 (도 4). 이 분석에서, 상이한 농도의 H22-EGF 융합 단백질 부분, 또는 리간드 결합 부위 (E. Merck)에서 EGFR에 결합하는 이중특이적 항체인 BsAb H447 (H22 X H425, 쥐의 모노클로날 항체 M425의 인간화 버전)을, EGF 수용체 (EGFR)(ATCC, Rockville, MD)를 발현하는 세포주인 A431 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, FcγRⅠ의 세포외 도메인 및 인간 IgM의 Fc 부분으로 이루어진 융합 단백질을 함유하는 상층액을 가하였다. 마지막으로, mAb가 결합하는 부위와는 구별되는 다른 부위에서 FcγRⅠ에 결합하는 피코에리트린 (PE)-표지된 mAb (32.2)를 가하였다. 이 세포를 FACScan으로 분석하였다. 별법으로, EGFR에 대한 결합을 과량 (100 ㎍/ml)의 전체 쥐 mAb 425 (E. Merck)에 의해 차단하고, BsAb 또는 융합 단백질의 결합을 PE-표지된 항-인간 IgG에 의해 검출하였다.
ADCC
51Cr 사멸 분석을 이용하여, 융합 단백질에 의해 매개되는 ADCC를 측정하였다. EGFR을 과다발현하는 세포주인 A431을 γ-인터페론 (IFN-γ)에서 배양된 인간 단핵구에 의한 용해의 표적으로 사용하였다. 표적을 100 μCi의51Cr로 1 시간 동안 표지한 후, U-바닥 마이크로타이터 플레이트에서 이펙터 세포 및 항체와 혼합하였다. 37℃에서 5 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 상층액을 수집하여 방사성을 분석하였다. 세포 독성은 하기 식에 의해 계산하였다.
％ 용해=(실험 CPM - 표적누출 CPM/계면활성제 용해 CPM - 표적누출 CPM)×100％.
비용해도=항체 존재시의 ％ 용해 - 항체 부재시의 ％ 용해. 융합 단백질이 ADCC를매개하는 능력을 각각의 BsAb의 능력과 비교하였다. 또한, 이 분석도 25％ 인간 혈청의 존재 하에 수행하여, IgG 또는 인간 혈청에서 발견되는 다른 인자들이 융합 단백질-매개의 ADCC를 억제하지 않음을 입증하였다.
결과
정제
H22 카파쇄를 발현하는 NSO 세포를 H22-EGF 중쇄 작제물로 형질감염시키고, 미코페놀산 및 크산틴에 내성이 있는 클론을 선별하여 이를 증식시킨 후, 항-인간 카파 컬럼 (Sterogene, Carlsbad, CA) 상에서 상층액으로부터 융합 단백질을 친화-정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 정제된 단백질은 분자량 약 50 내지 55 kDa으로 이동하였으며, 이는 융합 단백질이 이황결합된 다이머가 아닌 모노머로 발현되었음을 의미한다. 또한, 약 25 kDa의 분자량 위치에 밴드 하나가 나타났는데, 이는 아마 유리된 경쇄일 것이다.
결합 특이성
융합 단백질이 FcγRⅠ 및 EGFR에 동시에 결합할 수 있음을 보여주기 위해, 이중특이적 FACS 분석을 고안하였다. 도 5는, 하기 실시예 3에 기재된 바와 같이 만들어진 화학적으로 연결된 온전한 인간화 BsAb H447 (H22 (항-FcγRⅠ) x H425) 및 H22-EGF 융합 단백질이 A431 세포 상의 EGFR과 가용성 FcγRⅠ에 대해 투여량-의존적인 방식으로 동시에 결합함을 보여준다.
융합 단백질의 EGFR-특이성은, 리간드 결합 부위에서 EGFR에 결합하는 쥐의 mAb인 M425가 융합 단백질 또는 H22 x H425 결합을 억제하는 능력에 의해 입증되었다. 다양한 농도의 BsAb H447 또는 H22-EGF 융합 단백질을 과량의 M425의 존재 또는 부재하에 A431 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 도 6은 BsAb 및 융합 단백질의 결합이 모두 M425에 의해 억제됨을 보여주고, 이는 융합 단백질의 EGFR에 대한 특이성을 입증해준다.
ADCC
A431을 표적으로 사용하여 융합 단백질이 ADCC를 매개하는 능력을 분석하였다. IFN-γ의 존재하에 24 시간 동안 배양된 인간 단핵구를 이펙터 세포로서 사용하였다. 도 7은 전체 항체, H425, BsAb H447 (H22 x H425) 및 융합 단백질이 투여량에 의존적으로 A431 세포의 용해를 매개함을 입증하는 것이다. 도 8은, 전체 항체에 의해 매개되는 ADCC는 25％의 인간 혈청 (25％ HS)에 의해 억제되는 반면, 융합 단백질에 의해 매개되는 ADCC는 인간 혈청에 의해 억제되지 않음과, 이 실험에서 융합 단백질 매개의 ADCC는 인간 혈청에 의해 증진됨을 입증하는 것이다. 이들 결과는, 생체내에서와 같이 FcγRⅠ-발현 이펙터 세포가 존재하는 경우에도 융합 단백질이 EGFR-과다발현 세포를 사멸시킬 수 있음을 증명함으로써, 이들 분자의 임상적 유용성을 지지한다.
H22-EGF 융합 단백질의 성장 억제성
EGF는 자신에 대한 수용체를 발현하는 정상 세포의 성장을 자극하는 작용을 하지만, 또한 EGF-R을 과다 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 작용도 한다 (Barnes, D. W. (1982) J. Cell Biol. 93:1; MacLeod, C. L. et al. (1986) J. Cell. Physiol. 127:175). EGF 및 H22-EGF 융합 단백질이 A431 세포의 성장을 억제하는 능력을 하기와 같이 조사하였다.
완전 배지 단독, 또는 EGF, H22-EGF, H22의 Fab 단편 또는 H425의 F(ab')2단편을 다양한 농도로 함유하는 배지가 들어있는 6-웰 플레이트에 2×104개의 A431 세포를 가하였다. 7일 후, 생존 세포의 수를 헤모싸이토미터 (Hemocytometer)로 계수하였다. 분석을 2배수로 수행하여 평균±표준편차로 값을 기록하였다.
결과는 도 9에 나타나 있다. 이들 결과는 EGF 및 H22-EGF가 투여량 의존적인 방식으로 세포의 성장을 상당히 억제함을 보여준다. 이와는 반대로, 높은 농도에서만 약간의 억제 활성이 있는 H425의 F(ab')2단편과 H22의 Fab 단편은 성장 억제 활성이 없었다.
따라서, H22-EGF는 FcγRⅠ 및 EGF에 동시에 결합할 수 있으며, 이는 상기 분자가 적절하게 폴딩되었으며 2개의 수용체에 동시에 결합하기 위해 필요한 가요성을 유지하고 있음을 나타낸다. 또한, H22-EGF는 EGF-R을 발현하는 세포주인 A431의 증식을 억제하였으며, 이는 EGF와 유사하게 H22-EGF 융합 단백질도 EGF-R을 통해 신호전달할 수 있음을 나타낸다. 또한, H22-EGF는 FcγRⅠ을 발현하는 이펙터 세포의 존재시 A431의 잠재적 사멸을 매개하였다. 따라서, H22-EGF는 EGF-R을 발현하는 세포에 대해 세포독성 및 세포증식억제성 효과를 모두 매개한다. 종양에 걸린 대상체에게 H22-EGF를 투여하면, 신체의 천연 세포독성 이펙터 세포를 다시 수집하여 잠재적으로는 3가지 상이한 방식 (즉, 세포독성, 성장 억제 및 식세포 작용)으로 종양 세포의 사멸을 매개할 것이다. 또한, 종양 세포의 세포 매개 세포독성 이외에, H22-EGF에 의해 다시 수집된 이펙터 세포는 염증성 싸이토카인의 분비 및(또는) 종양 특이적 T 세포로의 종양 세포의 가공 및 표출에 의해 항-종양 면역성을 더 증가시킬 수 있다.
<실시예 3> H22-헤레굴린 (H22-gp30) 융합 단백질 매개의 종양 세포 사멸
헤레굴린 (heregulin, HRG)은 HER3 및 Her4 분자에 대한 리간드이다. 이들 수용체는, 일부 유방암 세포에서 과다 발현되는 HER2와 헤테로다이머를 형성한다. HER3 및 HER4에 대한 HRG의 친화도는, 이들 분자가 HER2와 헤테로다이머를 형성할 때 현저히 증가한다. 본 실시예는 헤레굴린 및 FcγRⅠ에 대한 결합 특이적 부위를 포함하는 이중특이적 분자가 종양 세포주의 성장을 억제하며, FcγRⅠ-포함 세포독성 이펙터 세포의 존재하에 이들 세포의 융합 단백질 의존성 세포독성을 매개함을 입증하는 것이다.
H22-헤레굴린 융합 단백질은 실시예 2에 기재된 H22-EGF 융합 단백질의 경우와 유사한 방식으로 제작하였다. 요컨대, 인간화 항-FcγRⅠ mAb인 H22의 Fd 단편을 코딩하는 게놈 DNA를, HRG의 β2 형태의 EGF 도메인을 코딩하는 cDNA에 융합시켰다. H22-HRG 융합 단백질의 아미노산 서열 (서열 4)은 도 10에 도시되어 있다. 이 융합 단백질은 미국 특허 제5,367,060호에 나타낸 헤레굴린 β2의 아미노산 171 내지 239를 포함한다. 헤레굴린 β2의 다른 부분 및 다른 헤레굴린 분자 (예를 들어, 미국 특허 제5,367,060호에 기재된 것들)도 사용할 수 있다. 결과로 생성된 H22Fd-HRG 발현 벡터를, H22 카파 경쇄를 코딩하는 DNA가 함유된 벡터로 이미 형질감염된 골수종 세포주에 형질감염시켰다. 결과의 융합 단백질은, 이 단백질이 H22Fab 성분의 힌지 영역에 유리 Cys 잔기를 함유함에도 불구하고 주로 모노머로서 발현되었다. 유동 세포계수법은 이 융합 단백질이 HER2를 과다 발현하는 종양 세포주인 SKBR-3 뿐만 아니라 FcγRⅠ-발현 세포에도 결합할 수 있음을 보여주었다.
H22Fd-HRG 융합 단백질의 생물학적 활성을 시험하기 위해, 이 융합 단백질을 발현하는 골수종 세포로부터 얻은 상층액을 3배 또는 30배 희석하고, HER2, HER3 및 HER4를 발현하는 PC-3 세포 또는 SKBR-3 종양 세포에, 단핵구 대 표적 종양 세포의 비가 100:1이 되도록 하는 IFN-처리 단핵구의 존재하에 희석액을 가하였다. 단핵구를 INF-γ로 처리하고, 표적 세포를 실시예 2에서와 같이51Cr로 표지하였다. 비용해도의 ％를 실시예 2에 기재된 바와 같이 계산하였다. 그 결과는 도 11에 도시되어 있다. 그 결과, 약 45％의 SKBR3 세포 및 약 49％ 이하의 PC-3 세포가 3배 희석된 상층액과 함께 배양시 용해됨을 알아냈다.
이 융합 단백질은 SKBR-3 종양 세포의 성장을 억제하며, FcγRⅠ-포함 세포독성 이펙터 세포의 존재시 이들 세포의 융합 단백질 의존성 세포독성을 매개한다. 따라서, 본 실시예의 결과는 항-FcγRⅠ-헤레굴린 융합 단백질이 생리적 조건하에서 항-종양 세포독성 활성을 매개할 수 있음을 보여주고, 그러한 융합 단백질이 다양한 암의 치료에 있어서 치료상 유용할 것임을 시사한다.
<실시예 4> H22-봄베신 융합 단백질 매개의 종양 세포 사멸
H22-봄베신 (bombesin) 융합 단백질은 상기 H22-EGF 융합 단백질과 유사하게 제작하였다. 그러나, 봄베신은 짧은 펩티드 (14개의 아미노산 잔기)이므로, PCR기술을 이용하여 봄베신을 코딩하는 cDNA를 증폭하지 않고 봄베신의 센스 및 안티센스 가닥을 코딩하는 DNA 올리고머를 혼성화시켜 코딩 영역을 생성하였다. H22 항체 중쇄의 카르복실 말단에 융합된 봄베신 펩티드의 아미노산 서열은 -Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-Gly (서열 5)이며, 이는 봄베신의 아미노산 잔기 2 내지 14에 대응하고 펩티드의 카르복실 말단에 부가의 글리신 잔기를 함유하고 있다. 올리고머의 말단은, 혼성화되지는 않지만 그 대신 N-말단에 XhoⅠ 부위 및 C-말단에 NotⅠ 부위에 대한 점착성 말단을 생성하여 상기 기재된 바와 같이 H22 중쇄 발현 벡터에 클로닝될 수 있게 하는 중복 말단이다.
H22-봄베신 융합 단백질의 종양 세포 사멸에 대한 생물학적 활성은 H22-EGF 및 H22-헤레굴린 융합 단백질에 대해 상기 기재한 바와 같이 조사하였다. 요컨대, 봄베신 수용체를 포함하는 PC-3 종양 세포를51Cr로 표지하고, 단핵구 및 다양한 농도의 H22-융합 단백질과 함께 배양한 후, 융합 단백질 의존성 용해를 상기 기재한 바와 같이 측정하였다. 그 결과, 도 12에 도시된 바와 같이, 표적 세포가 용해됨을 나타냄과 동시에, 표적 세포의 용해 수준이 분석에 가해진 융합 단백질의 양에 비례하여 증가함을 보여준다.
H22를 하나의 결합체로 갖고 CD4 (AIDS 저장소) 또는 gp120 (AIDS 저장소)를 제2 결합체로 갖는 융합 단백질도 생성하였다.
<실시예 5> 변형된 인간화 항체로부터 이중특이적 항체의 생성
단편
재료 및 방법
발현 벡터 및 클로닝
H22의 중쇄 (pSVgpt) 및 경쇄 (pSVhyg)의 게놈 클론에 대한 발현 벡터는 국제 특허 출원 공개 제WO 94/10332호 (제목: Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes)에 기재된 바와 같다. Fab' 작제물의 경우에는 경쇄를 변화시킬 필요가 없었다. 그러나, 중쇄의 경우에는 HC2 및 CH3 도메인이 제거되고 종결 코돈으로 대체되었다. 중쇄 벡터는 2개의 BamHⅠ 부위를 함유하는데, 이중 하나는 VH와 CH1 사이의 인트론에 있고, 다른 하나는 CH3의 바로 하류에 있다. BamHⅠ 제한 부위를 이용하여, 불변 도메인을 코딩하는 DNA를, CH1과 대부분의 힌지를 코딩하는 말단 절단 버전으로 대체하였다. 이를 위해, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 도 1에 도시된 바와 같이 변화된 중쇄 단편의 새로운 C-말단이 되게 조작하였다. 도 1b는 말단이 잘린 단일-술프히드릴 버전의 생성을 위한 변화를 보여준다.
발현
쥐의 골수종 NSO (ECACC 85110503)는 비-Ig 합성 세포주로서, 변형된 H22 항체의 발현을 위해 사용되었다. H22 Fd를 코딩하는 DNA가 융합된 최종 발현 벡터인 pSVgpt 작제물을 바이오라드 진 펄서를 이용하는 전기천공법에 의해, H22 경쇄를 코딩하는 DNA가 함유된 pSVhyg와 함께 동시에 형질감염시켰다. 이들 폴리펩티드는 벡터에 존재하는 Ig 프로모터 및 Ig 인핸서에 의해 발현되었으며, 작제물의 N-말단에 위치하는 mAb 22 중쇄 신호 펩티드에 의해 분비되었다. 형질감염 1 또는 2 일후, 미코페놀산 및 크산틴을 배지에 가하여 DNA가 들어있는 세포를 선별하였다. FcγRⅠ 결합 활성을 입증한 후, 개개의 성장 콜로니를 단리하여 서브클로닝하였다.
정제
H22 항체의 단일 술프히드릴 형태 및 전체 H425 (항-EGFR) 항체는, 각각 형질감염된 NSO세포를 시험관내에서 배양하여 생산하였다. H425는 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의해 정제하였다. H22의 단일 술프히드릴 형태는 Q-세파로스 및 그 후에 SP-세파로스 (Pharmacia, Piscataway, NJ)를 이용하는 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. H22 항체의 단일 술프히드릴 형태의 순도는 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
이중특이적 항체 (BsAb)의 생성
문헌 [Glennie, M. J. et al., (1987), Preparation and performance of bispecific F (ab' gamma)2, antibody containing thioether-linked Fab'gamma fragments, J. Immunol., 139:2367]에 기재된 방법을 이용하여 BsAb를 제작하였다. 제한 펩신 단백질가수분해에 의해 pH 3.5의 0.1 M 시트레이트 완충액에서 H425의 F(ab')2를 생성하고, 이온교환 크로마토그래피에 의해 F(ab')2을 정제하였다. 30℃에서 30 분 동안 20 mM의 머캅토에탄올아민 (MEA)을 가하여 mAb를 환원시켰다. 50 mM 아세트산나트륨, 0.5 mM EDTA (pH 5.3, 4℃)로 평형화된 세파덱스 G-25 컬럼에 Fab' 단편을 적용시켰다. 메탄올/얼음 욕에서 디메틸 포름아미드 중에 용해된 오르토-페닐렌디말레이미드 (o-PDM, 12 mM)를 H22 Fab'에 가하고 (절반 부피), 얼음에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 50 mM 아세트산나트륨, 0.5 mM EDTA (pH 5.3, 4℃)로 평형화된 세파덱스 G-25 컬럼에서 Fab'-말레이미드를 H425 Fab'에 대해 1.2:1의 몰비로 가하였다. 아미콘 챔버에서 디아플로 막을 이용하여 (4℃), 질소하에서 반응물을 출발 부피까지 농축시켰다. 18 시간 후, 1 M Tris-HCl (pH 8.0)을 이용하여 pH를 8.0으로 조정하였다. 이어서, 혼합물을 10 mM MEA로 환원 (30 분, 30℃)시키고, 25 mM 요오도아세트아미드로 알킬화시켰다. PBS로 평형화된 슈퍼덱스 200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 컬럼에 의해 이중특이적 F(ab')2를 비반응 Fab' 및 다른 생성물로부터 분리하였다.
이중특이적 유동 세포계수법
o-PDM 방법에 의해 생성된 BsAb 및 DTNB 방법에 의해 생성된 BsAb가 FcγRⅠ 및 EGFR에 동시에 결합할 수 있음을 보여주기 위해, 유동 세포계수 분석을 개발하였다 (도 13). 이 분석에서, 상이한 농도의 두 BsAb를, EGF 수용체 (EGFR)를 발현하는 세포주인 A431 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, FcγRⅠ의 세포외 도메인 및 인간 IgM의 Fc 부분으로 이루어진 융합 단백질을 함유하는 상층액을 세포와 함께 배양하였다. 마지막으로, 세포를 FITC-표지된 항-인간 IgM-특이적 항체와 함께 배양하였다. 이어서, 이 세포를 FACScan에 의해 분석하였다.
ADCC
51Cr 사멸 분석을 이용하여, BsAb에 의해 매개되는 ADCC를 측정하였다.EGFR을 과다발현하는 세포주인 A431을 γ-인터페론 (IFN-γ)에서 배양된 인간 단핵구에 의한 용해의 표적으로 사용하였다. 표적을 100 μCi의51Cr로 1 시간 동안 표지한 후, U-바닥 마이크로타이터 플레이트에서 이펙터 세포 및 항체와 혼합하였다. 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 상층액을 수집하여 방사성을 분석하였다. 세포 독성은 하기 식에 의해 계산하였다.
％ 용해=(실험 CPM - 표적누출 CPM/계면활성제 용해 CPM - 표적누출 CPM)×100％.
비용해도=항체 존재시의 ％ 용해 - 항체 부재시의 ％ 용해.
결과
정제
NSO 세포를 말단이 잘린 H22 카파쇄 및 무손상 카파쇄 작제물로 형질감염시켰다. 미코페놀산 및 크산틴에 내성이 있는 클론을 선별하여 이를 증식시킨 후, Q-세파로스 및 그 이후의 SP-세파로스 이온교환 크로마토그래피에 의해 상층액으로부터 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 정제된 단백질은 분자량 약 50 kDa으로 이동하였으며, 이는 융합 단백질이 이황결합된 다이머가 아닌 모노머로 발현되었음을 의미한다.
H425 (항-EGFR)의 Fab'에 연결된 단일 술프히드릴 H22로 구성된 BsAb의 제작 및 특성화
BsAb를, H22의 단일 술프히드릴 형태가 인간화 항-EGFR mAb인 H425의 Fab' 단편에 연결되도록 제작하였다. BsAb는 링커로서 o-PDM을 이용하여 문헌[Glennie, M. J. et al., (1987), Preparation and performance of bispecific F (ab' gamma)2, antibody containing thioether-linked Fab'gamma fragments, J. Immunol., 139:2367]에 기재된 방법에 의해 생성하였다. 이 BsAb의 활성을, 펩신 분해 및 전체 H22의 환원으로부터 만들어진 Fab' 단편을 이용하는 DTNB 방법에 의해 생성된 것과 비교하였다. 이들 BsAb가 FcγRⅠ 및 EGFR에 동시에 결합할 수 있음을 입증하기 위해, 이중특이적 FACS 분석을 고안하였다. 도 14는 o-PDM-관여 BsAb와 DTNB 방법에 의해 만들어진 BsAb가 모두 A431 세포 상의 EGFR 및 가용성 FcγRⅠ에 투여량-의존적인 방식으로 동시에 결합함을 보여준다.
두 BsAb가 ADCC를 매개하는 능력은 A431 세포를 표적으로 사용하여 분석하였다. IFN-γ의 존재하에 24 시간 동안 배양된 인간 단핵구를 이펙터 세포로서 사용하였다. 도 15는 두 BsAb가 필적할만하게 A431 세포의 투여량-의존성 용해를 매개함을 보여준다. 이들 결과는 H22의 말단이 잘린 단일 술프히드릴 형태로부터 생성된 BsAb가 FcγRⅠ-발현 이펙터 세포의 존재시 EGFR을 과다 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있음을 입증한다.
<실시예 6> 3가 항체의 제조
재료 및 방법
세포주, 및 항체 M22, 520C9, H425, SKBR3 및 A431
M22 및 520C9는 하이브리도마 상층액으로부터 이온교환 크로마토그래피 (Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해 정제하였고, 520C9는 단백질 A 친화 크로마토그래피 (Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해 더 정제하였다. H425는 하이브리도마상층액으로부터 단백질 A 친화 크로마토그래피 (Pharmacia, Piscataway, NJ)에 의해 정제하였다. M22- 및 520C9-생성 쥐의 하이브리도마는 기존의 문헌 [Guyre et al., (1989) Monoclonal antibodies that bind to distinct epitopes on FcgRI are able to trigger receptor function, J. Immunol. 143:5, 1650-1655] 및 [Frankel et al., (1985) Tissue distribution of breast cancer-associated antigens defined by monoclonal antibodies, J. Biol. Response Modifiers, 4:273-286]에 기재되어 있었다. 쥐의 골수종 NSO (ECACC 85110503)은 비-IgG 합성 세포주로, 인간화 mAb인 H425 (Kettleborough et al., (1991) Humanization of a mouse monoclonal antibody by CDR-grafting: the importance of framework residues on loop conformation, Protein Eng., 4:773)의 발현을 위해 사용되었다. HER2/neu 원시 종양유전자를 과다 발현하는 인간 유방암 세포주인 SKBR-3 (ATCC, Rockville, MD) 및 EGFR (ATCC, Rockville, MD)을 과다 발현하는 인간 편평세포 암종 세포주인 A431 (ATCC, Rockville, MD)을 이스코브 변형 둘벨코 배지 (Gibco, Grand Island, NY)에서 배양하였다.
호중성구 제조
호중성구를 피콜 하이팍 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 구배 분리에 의해 단핵 세포로부터 분리하였다. FcγRⅠ을 상향 조절하기 위해, 호중성구를 싸이토카인으로 처리하였다. 호중성구를 2.5％의 정상 인간 혈청형 AB (Sigma, St. Louis, MO), 50 ng/ml의 G-CSF (알. 레프 (R. Repp, U. of Erlanger, Germany)가 친절하게 제공함) 및 100 IRU/ml의 IFN-γ가 들어있는 AIM V 배지 (Gibco, Grand Island,NY)에서 24 내지 48 시간 동안 배양 (37℃, 5％ CO2)하였다.
접합 방법
문헌 [Glennie, M. J. et al., (1987), Preparation and performance of bispecific F (ab' gamma)2, antibody containing thioether-linked Fab'gamma fragments, J. Immunol., 139:2367]에 기재된 방법을 이용하여 BsAb를 제작하였다. mAb 22, 520C9 (항-HER2/neu, 33) 및 H425 (항-EGFR) 항체에 대한 각각의 하이브리도마 세포를 시험관내에서 배양하여 각각의 항체를 제조하였다. 항체들을 pH 3.5의 0.1 M 시트레이트 완충액에서 제한 펩신 단백질가수분해로 분해하여 F(ab')2를 생성하고, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 F(ab')2단편을 정제하였다. mAb M22 및 H425는 30℃에서 30 분 동안 20 mM의 머캅토에탄올아민 (MEA)을 가하여 Fab'으로 환원시켰다. 50 mM 아세트산나트륨, 0.5 mM EDTA (pH 5.3, 4℃)로 평형화된 세파덱스 G-25 컬럼에 Fab' 단편을 적용시켰다. 메탄올/얼음 욕에서 디메틸 포름아미드 중에 용해된 오르토-페닐렌디말레이미드 (o-PDM, 12 mM)를 쥐의 22 Fab'에 가하고 (절반 부피), 얼음에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 50 mM 아세트산나트륨, 0.5 mM EDTA (pH 5.3, 4℃)로 평형화된 세파덱스 G-25 컬럼에서 Fab'-말레이미드를 유리 o-PDM으로부터 분리하였다. BsAb를 제조하는 경우, M22 Fab'-말레이미드를 H425 Fab'에 1:1의 몰비로 가하였다. 아미콘 챔버에서 디아플로 막을 이용하여 (4℃), 질소하에서 반응물을 출발 부피까지 농축시켰다. 18 시간 후, 1 M Tris-HCl (pH 8.0)을 이용하여 pH를 8.0으로 조정하였다. 이어서, 혼합물을 10mM MEA로 환원 (30 분, 30℃)시키고, 25 mM 요오도아세트아미드로 알킬화시켰다. 인산염 완충 식염수 (PBS)로 평형화된 슈퍼덱스 200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 컬럼에 의해 이중특이적 F(ab')2를 비반응 Fab' 및 다른 생성물로부터 분리하였다. BsAb M22 x 520C9는 H425 대신 520C9를 사용한다는 것을 제외하고는 위와 유사한 방식으로 만들었다.
M22 x H425 x 520C9로 구성된 삼중특이적 항체를 두 단계로 만들었다 (도 16). 제1 단계에서, 최종 환원 및 알킬화를 제외하고 M22 x H425 BsAb를 생성하기 위해 상기 기재한 바와 같이 M22를 H425에 연결시키고, 반응물을 DTNB로 처리하여 남아있는 유리 술프히드릴기를 차단하였다. 2가 BsAb는 슈퍼덱스 200 컬럼 상에서 겔 여과에 의해 정제한 후, F(ab')2(SH)로 환원시키고, o-PDM-처리된 520C9와 1:1의 몰비로 혼합하였다. 결과의 삼중특이적 F(ab)3를 슈퍼덱스 200 컬럼 상에서 정제하였다. TsAb를, TSK 3000 컬럼 (ToJo Haas, Japan)을 이용하여 HPLC 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 상기와 같은 동일한 절차를 이용하여, m22 Fab' x 32.2 Fab' x m22 Fab'을 포함하는 다른 TsAb를 제작하였다.
이중특이적 유동 세포계수법
TsAb는 EGFR과 FcγRⅠ에 동시에 결합하거나, 또는 HER2/neu와 FcγRⅠ에 동시에 결합한다. A431 세포 (EGFR의 발현량이 높은 세포) 또는 SKBR-3 세포 (HER2/neu의 발현량이 높은 세포)를 다양한 농도의 BsAb (M22 x 520C9 또는 M22 x H425) 또는 TsAb (M22 x H425 x 520C9)와 함께 배양하였다. 세포를 세척한 후, 가용성 FcγRⅠ과 함께 인큐베이션시켰다. 22가 결합하는 부위와는 구별되는 다른 부위에서 FcγRⅠ에 결합하는 mAb 32.2-FITC로 가용성 FcγRⅠ를 검출하였다. 이어서, 이 세포를 FACScan에 의해 분석하였다.
ADCC
SKBR-3 세포 또는 A431 세포를 싸이토카인 활성화 호중성구에 의한 용해의 표적으로 사용하였다. 표적을 100 μCi의51Cr로 1 시간 동안 표지한 후, U-바닥 마이크로타이터 플레이트에서 호중성구 및 항체와 혼합하였다. 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 상층액을 수집하여 방사성을 분석하였다. 세포 독성은 하기 식에 의해 계산하였다.
％ 용해=(실험 CPM - 표적누출 CPM/계면활성제 용해 CPM - 표적누출 CPM)×100％.
비용해도=항체 존재시의 ％ 용해 - 항체 부재시의 ％ 용해. 분석은 3배수로 수행하였다.
FcγRⅠ 조절 분석
M22 x 32.2 x M22 BsAb를 전체 혈액 중의 단핵구에 대한 FcγRⅠ의 조절을 위해 사용하였다. 이 분석 절차는 폐쇄 흐름도 (도 23a 참조)에 나타나 있다. 도 23b는 이 BsAb 10 ㎍/ml로 처리하면, 단핵구 상의 FcγRⅠ의 발현이 BsAb 처리 이전의 수준에 비해 약 50％로 감소함을 보여준다.
결과
TsAb의 제작 및 생화학적 특성화
도 16에 도시된 흐름도에 따라 TsAb를 만들었다. 제1 단계에서, M22를 H425에 커플링시키고, DTNB로 처리한 후, 결과의 이중특이적 F(ab')2를 겔 여과에 의해 정제하였다. 제2 단계에서, 이 이중특이적 F(ab')2를 환원시키고, o-PDM-처리 520C9 Fab'와 함께 혼합하여 TsAb인 M22 x H425 x 520C9를 얻었다. 이 TsAb는 도 17에 개략적으로 도시되어 있다. 이 도면에서, Fab'-A는 M22를 나타내고, Fab'-B는 H425를 나타내며, Fab'-C는 520C9를 나타낸다.
결합 (Bs FACS)
TsAb인 M22 x H425 x 520C9가 FcγRⅠ 및 HER2/neu에 동시에 결합할 수 있음을 보여주기 위해, 이중특이적 FACS 분석을 고안하였다. 이 분석은 도 18a에 개략적으로 도시되어 있다. 도 19는, TsAb가 SKBR-3 세포 상의 HER2/neu 및 가용성 FcγRⅠ에 대해 투여량-의존적인 방식으로 동시에 결합함을 보여준다. 이 분석에서 BsAb인 M22 x H425는 넓은 농도 범위에 걸쳐 무시할만한 신호를 생성하였다. TsAb인 M22 x H425 x 520C9가 FcγRⅠ 및 EGFR에 동시에 결합할 수 있음을 보여주기 위해, EGFR-과다 발현 세포주인 A431을 이 경우에 사용하여 유사한 분석을 고안하였다. 이 분석은 도 18b에 개략적으로 도시되어 있다. 도 20은, TsAb 및 BsAb인 M22 x H425 모두가 A431 세포 상의 EGFR 및 가용성 FcγRⅠ에 대해 투여량-의존적인 방식으로 동시에 결합함을 보여준다. 이 분석에서 BsAb인 M22 x 520C9는 넓은 농도 범위에 걸쳐 무시할만한 신호를 생성하였다.
ADCC
SKBR-3 또는 A431을 표적으로 사용하여 TsAb가 ADCC를 매개하는 능력을 분석하였다. IFN-γ 및 G-SF의 존재하에 24 내지 48 시간 동안 배양된 인간 호중성구를 이펙터 세포로서 사용하였다. 도 21은 BsAb인 M22 x 520C9와 TsAb인 M22 x H425 x 520C9가 SKBR-3 세포의 용해를 매개하는 반면, BsAb인 M22 x H425는 그렇지 않음을 입증하는 것이다. 한편, 도 22는 BsAb인 M22 x H425와 TsAb가 SKBR-3 세포의 용해를 매개하는 반면, BsAb인 M22 x 520C9는 그렇지 않음을 입증하는 것이다. 이들 결과는, FcγRⅠ-발현 이펙터 세포가 존재하는 경우에 TsAb가 HER2/neu 및 EGFR-과다 발현 세포를 사멸시킬 수 있음을 입증하는 것이다.
상기 기재된 삼중특이적 항체에는 항-FcγRⅠ mAb의 쥐 버전인 M22가 포함된다. 그러한 삼중특이적 항체는 인간화 항-FcγRⅠ mAb인 H22의 단일-술프히드릴 형태를 이용하여 제작할 수 있다. 유일한 차이점은 단일-술프히드릴 형태가 이 항체의 F(ab')2로서 분비된다는 것이다. 단일-술프히드릴 형태는 배양 상층액으로부터 Q-세파로스 및 그 이후의 SP-세파로스 (Pharmacia, Piscataway, NJ)를 이용하는 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 일단 H22의 단일-술프히드릴기가 정제되면, 이 시약을 이용한 삼중 항체의 생성은 상기 M22의 F(ab')2단편을 이용하는 것과 동일하다.
<실시예 7> H22-항원 융합 단백질을 이용한 증진된 항원 표출
본 실시예는 (a) 항-FcγRⅠ 항체의 불변 영역에 유전자적으로 이식된 항원성 펩티드는, 항원 단독인 경우에 비해 항원의 항원 표출과 T 세포 자극이 훨씬 더효율적이고, (b) 항-FcγRⅠ 항체의 불변 영역에 유전자적으로 이식된 길항성 펩티드는, 길항성 펩티드 단독인 경우에 비해 T 세포 자극에 대한 억제가 훨씬 더 효율적임을 입증한다. 따라서, 그러한 융합 단백질은 생체내에서 펩티드의 항원 표출 세포 (APC)로의 전달이 효과적으로 증가할 것이며, 다양한 치료 방법에 유용할 것이다.
재료 및 방법
시약
AIM V (GIBCO, Grand Island, NY)를 배양용 배지로 사용하였다. 파상풍균 톡소이드 (Tetanus Toxoide; TT)는 ACCURACTE CHEMICAL CO. (Westbury, NY)에서 구입하였다. 생쥐 항-FcγRⅠ mAb 22의 멸균되고 내독소 농도가 낮은 F(ab')2단편 및 이중특이적 Ab인 MDXH210 (항-Her2/neu 종양 Ag mAb 520C9의 Fab'에 화학적으로 연결된 인간화 Ab 22로 이루어짐)은 MEDAREX, INC. (Annandale, NJ)에서 공급하였다. 보편적인 Th 에피토프인 TT, TT830-844 (QYIKANSKFIGITEL (서열 6), 이하 TT830이라 명명함)(Valmori D. et al. (1994) J. Immunol. 152:2921-29), 및 이 에피토프의 돌연변이 형태인 TT833S (QYISANSKFIGITEL (서열 9), 833 위치의 리신이 세린으로 바뀜)를 합성하여, PEPTIDOGENIC CO. (Livermore, CA)에 의해 95％가 넘는 순도로 정제하였다. 다른 보편적인 Th 에피토프인 TT, TT947-967 (FNNFTVSF WLRVPKVSASHLE (서열 12), 이하 TT947이라 명명함)(>80％의 순도)(Valmori D., 상기 문헌)을 본 연구에서 대조군 펩티드로 사용하였다. 상업적으로 시판되는 정맥내 주사용 (IVI) 인간 IgG를 차단 실험에 사용하였다.
세포
FcγRⅠ을 발현하는 단핵구 세포주인 U937을 ATCC로부터 얻었다. CD4+의 펩티드 TT830-특이적 T 세포를 생성하는 방법은, TT-특이적 T 세포주에 대해 기존에 설명한 프로토콜을 변형시켰다 (Gosselin E. J. (1992) J. Immunol. 149:3477-81). 요컨대, 피콜 하이팍을 이용하여 말초 혈액으로부터 단핵 세포를 단리하였다. 150×106개의 단핵 세포를 10 μM의 TT830이 들어있는 AIM V 50 ml 중에서 자극하였다. 5％ CO2인큐베이터에서 37℃로 3일 동안 배양한 후, HEPES-완충 RPMI 1640으로 플라스크를 1회 세척하여 부착되지 않은 세포 (대부분 비특이적인 세포임)를 제거하였다; 특이적 T 세포 콜로니는 부착성 단핵구와 함께 플라스크에 남아있었다. 20 U/ml의 인간 IL-2 (IMMUNEX, Seattle, WA)가 포함된 AIM V 50 ml, 및 수집된 인간 혈청 1 ml (2％, 최종 농도)을 다시 플라스크에 가하였다. 총 배양시간 10 내지 14 시간 후, T 세포를 수확하고 피콜 하이팍을 통해 죽은 세포를 펠렛으로 만들어, CD4+이면서 Ag에 특이적인 살아있는 T 세포가 풍부한 (95 내지 98％) 개체군을 얻었다. T 세포는 도 3에 도시된 바와 같이 TT830 펩티드에 대해 특이적임을 확인하였다. 냉각 응집법 (cold aggregation method)(Mentzer S. J. et al. (1986) Cell. Immunol. 101:132)을 이용하여 다량의 단핵구를 류코포리시스 팩 (leukophoresis pack)으로부터 정제하였고, 그 결과 순도는 80 내지 90％였다. 나중에 사용하기위해 단핵구 및 T 세포를 모두 분취하여 냉동 보관하였고, 이는 해동 후에도 정상적으로 기능하였다.
Ag 표출 분석
증식 분석에서, T 세포 (5×104개), 조사(照射)된 단핵구 (3000 rad, 105/웰) 및 다양한 농도의 펩티드 TT830 융합 단백질 Fab22-TT830을 평면-바닥 96-웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 최종 부피 200 ㎕로 2일 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 10 ㎕ (1 μCu/웰)의3H-티미딘을 각 웰에 가하였다. 밤새 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 수확하고 액체 섬광 계수기에서 계수하였다. T 세포 증식은 3회 측정한 평균 계수값/분 (CPM) ±SD로 표시하였다. 배경 CPM값 (Ag이 없는 T 세포 및 단핵구)을 모든 데이타에서 감하였다. APL를 이용한 실험은 문헌 [Sette et al., De Magistris (1992) Cell 68:625]에 보고된 프로토콜과 유사하게 수행하였다. 요컨대, 억제 분석의 경우에는 조사(照射)된 단핵구를 다양한 농도의 TT833S 또는 Fab22-TT833S로 밤새 처리하였다. 이어서, 20 nM TT830 및 T 세포를 가하였다. 추가로 2 일 동안 인큐베이션시킨 후, 상기 기재된 바와 같이 T 세포 증식을 측정하였다. "예비-펄스" 실험에서, 조사(照射)된 단핵구를 20 nM TT830으로 펄스 처리하고, 4 시간 후에 10 μM TT833S 또는 0.1 μM Fab22-TT833S를 가하였다. 밤새 인큐베이션시킨 후에 T 세포를 가하였다. 추가로 2 일 인큐베이션시킨 후, T 세포를 조사(照射)된 단핵구 및 TT833S 또는 Fab22-TT833S로 1 일 동안 자극하고, 피콜 하이팍 상에서 원심분리하여 T 세포를 회수한 다음, 단핵구 및 다양한 농도의TT830으로 2 일 동안 다시 자극하였다. 이어서,3H-티미딘의 혼입에 의해 T 세포 증식을 측정하고, 3회 측정값의 평균 CPM을 도표로 작성하였다. 어떤 경우, 억제율을 하기 식에 의해 계산하였다:
％ 억제 = (CPM비억제- CPM억제)/CPM비억제× 100. 모든 실험은 3회 이상 반복하였다.
염색 및 유동 세포계수법
염색 절차는 기존에 기재된 방법 (Gosselin E. J. et al. (1990) J. Immunol. 144:1817-22)을 개조하였다. 요컨대, 4℃에서 96-웰 플레이트의 각 웰에 30 ㎕의 RPMI와 1 mg/ml BSA, 및 Fab22-TT830, Fab22-TT833S 또는 BsAb MDXH210 중 어느 하나를 다양한 농도로 함유하도록 가하였다. 4℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 원심분리하여 상층액을 버리고, 4℃에서 세포를 PBS/BSA로 3회 세척하였다. 이어서, 세포를 웰당 40 ㎕의 FITC-표지 F(ab')2염소 항-인간 IgG (JACKSON IMMUNORESEARCH LABORATORIES, INC. West Grove, PA)와 함께 1 시간 동안 인큐베이션시킨 후, PBS/BSA로 3회 세척하고, 1％ 파라포름알데히드 (KODAK, Rochester, NY)를 함유하는 PBS/BSA 중에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 FACScan (BECTON DICKINSON & CO., Mountain View, CA)으로 조사하고, 평균 형광 강도 (MFI)를 측정하였다.
싸이토카인 측정
자극 2 일 후 Ag 표출 분석용 96-웰 플레이트로부터 상층액을 수집하여 사용할 때까지 동결 보관하였다. 이 샘플로부터의 IFN-γ 및 IL-4 양을 특이적 ELISA로 측정하였다. IFN-γ 및 IL-4에 특이적인 ELISA의 Ab 쌍은 PHARMINGEN (San Diego, CA)에서 구입하였다. ELISA 분석은 제조자가 제공하는 프로토콜을 따라 수행하였다.
H22-TT 펩티드 융합 단백질의 생성
융합 단백질 Fab22-TT830 및 Fab22-TT833S를 생성하기 위해, 하기 기재되는 방법에 따라 각 펩티드를 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드를 별도로 조작하여 인간화 항-FcγRⅠ mAb 22 (H22)의 중쇄 힌지 영역에 넣었다.
발현 및 클로닝 벡터
mAb 22의 CDR 영역을 인간 IgG1 프레임워크에 이식하여 mAb 22를 인간화 항체로 만들었다 (상기 내용 및 문헌 [Graziano R. F. et al. (1995) J. Immunol. 155:4996-5002] 참조). H22의 중쇄 게놈 클론에 대한 발현 벡터 (pSVgpt)는 다른 분자, 이 경우에는 TT 펩티드에 대한 코딩 서열이 혼입되도록 변형하였다. CH1, 힌지, 및 새로이 조작된 XhoⅠ과 NotⅠ 클로닝 부위를 함유하는 이 벡터 (도 2 참조)의 BamHⅠ 단편을 pUC19의 BamHⅠ 부위에 삽입하여 벡터 pUC19/H22CH1(X+N)을 생성하였다. 이 벡터를 사용하여, 하기 기재되는 바와 같이 TT 펩티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열을 클로닝하였다.
파상풍균 독소 (TT)를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열은 코딩 영역의 N-말단에 XhoⅠ 부위가 존재하고 C-말단에 NotⅠ 부위가 존재하도록 디자인되어 있었다 (도 24a 참조). 이들 올리고뉴클레오티드를 합성하고, GENOSYSBiotechnologies (The Woodlands, TX)에 의해 정제하였다. 이어서, 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링시켜 클로닝 벡터 pUC19/H22CH1(X+N)에 라이게이션시켰다. TT 펩티드에 대한 코딩 서열이 혼입된 클론은 제한 매핑에 의해 스크리닝하였다. CH1, 힌지, 및 TT830 또는 TT833S를 함유하는 BamHⅠ 단편을 pUC19에서 잘라낸 후, 이미 VH가 포함된 발현 벡터에 삽입하였다. TT 펩티드와 융합된 H22 중쇄의 최종 발현 작제물은 도 24b에 나타나 있다.
H22-TT 융합 단백질의 발현
쥐의 골수종 NSO (ECACC 85110503)는 비-Ig 합성 세포주로서, H22-TT 융합 단백질의 발현을 위해 사용되었다. 우선, H22 경쇄 코딩 서열을 함유하는 pSVhyg 벡터로 NSO 세포를 형질감염시켰다. 이어서, H22 경쇄를 발현하는 NSO 세포를, TT 코딩 서열에 프레임에 맞게 융합된 H22 H-쇄 Fd 서열을 함유하는 발현 벡터 작제물로 형질감염시켰다 (도 24b). 바이오라드 진 펄서 전기천공 장치를 이용하여 200 V 및 960 μF로 형질감염을 수행하였다. 형질감염 1 또는 2 일 후, 미코페놀산 (0.8 ㎍/ml; SIGMA) 및 크산틴 (2.5 ㎍/ml; SIGMA)을 배지에 가하여 발현 벡터가 성공적으로 들어가 있는 형질감염체를 선별하였다. U937 상의 FcγRⅠ에 대한 배양 상층액의 유동 세포계수법에 의해 입증된 결합 활성에 기초하여 개개의 콜로니를 단리하였다. 양성 콜로니를 제한 희석법에 의해 서브클로닝하였다.
Fab22-TT 융합 단백질의 정제
Fab22-TT830 융합 단백질을 발현하는 클론 pW5 및 Fab22-TT833S 융합 단백질을 발현하는 클론 pM4를 롤러 바틀 배양액에서 증식시켰다. 상층액을 투명하게 하여 농축시켰다. 항-H22 친화성 컬럼 상에서 친화 크로마토그래피에 의해 소규모 정제를 수행하였다. 비환원 조건하에서 5 내지 10％ 아크릴아미드 구배 겔의 SDS-PAGE 분석 결과, 90％가 넘는 융합 단백질이 순수했으며, 분자량은 예상대로 50 kDa이었다. 단백질 농도는 IgG Fab'의 소멸 계수가 1.53임을 이용하여 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다.
결과
H22Fd-TT 융합 단백질은 U937 세포에 결합한다
H22 융합 단백질, Fab22-TT830 및 Fab22-TT833S가 FcγRⅠ에 결합하는 능력을 우선 조사하였다. 동일한 FcγRⅠ-결합 성분 (인간화 mAb 22의 Fab')(Valone F. H. et al. (1995) J. Clin. Oncol. 13:2281-92)을 함유하는 상기한 이중특이적 Ab인 MDXH210을 양성 대조군으로 사용하였다. FcγRⅠ을 구성적으로 발현하는 U937 세포에 대한 융합 단백질 및 MDXH210의 결합은, 인간 IgG에 특이적인 FITC-표지된 염소 Ab로 염색하여 유동 세포계수법으로 측정하였다. 도 24a 및 24b에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질인 Fab22-TT830 및 Fab22-TT833S는 MDXH210과 유사하게 투여량-의존적 방식으로 U937 세포에 결합하였다. 융합 단백질의 결합은 쥐의 항-인간 FcγRⅠ mAb 22 F(ab')2에 의해 완전히 차단되었으며, 이는 FcγRⅠ에 대한 융합 단백질의 특이성을 입증해 준다.
H22Fd-TT 융합 단백질은 TT 펩티드의 표출을 100 내지 1000배 증진시킨다
Th 에피토프인 TT830이 H22의 불변 영역에서 발현시 단핵구에 의해 자가이식T 세포에 효과적으로 표출되는지 측정하기 위해, 융합 단백질 Fab22-TT830을 Ag 표출 분석에 사용하였다. 도 26에 나타난 바와 같이, 동일한 수준으로 T 세포가 증식하는데 TT830 펩티드 단독보다 약 1,000배 정도 적은 양의 Fab22-TT830이 필요했다. 또한, 도 26은 Fab22-TT830의 표출이 무손상 TT의 표출에 비해 약 10,000배 정도 더 효율적임을 나타내며, 이는 증진된 Fab22-TT830의 표출이 단지 높은 분자량에 의한 것도 아니고 TT830 펩티드에 반하여 Fab22-TT830의 안정성이 증가되어서도 아님을 시사한다. 다른 항원성 TT 에피토프인 TT947은 T 세포를 자극하지 못했으며, 이는 T 세포가 TT830 펩티드에 특이적임을 확인해 준다. 따라서, 이들 결과는 H22의 불변 영역에서 발현된 Th 에피토프가 효과적이고 특이적으로 표출될 수 있다는 것에 대한 분명한 증거를 제공한다.
단핵구 상에서의 FcγRⅠ의 차단은 H22Fd-TT 융합 단백질에 의한 Ag 표출 증진을 상쇄시킨다
융합 단백질을 사용한 펩티드 표출의 증진이 FcγRⅠ에 의해 매개되는 것인지 직접 측정하기 위해, Fab22-TT830 또는 TT830 펩티드를 가하기 전에 Ag-표출 단핵구를 mAb 22 F(ab')2로 1 시간 동안 처리하여 Ag-표출 단핵구 상의 FcγRⅠ에 대한 Fab22-TT830의 결합을 차단하였다. 융합 단백질에 의한 펩티드 표출은 mAb 22 F(ab')2에 의해 상쇄되는 반면, TT830의 표출은 영향을 받지 않았다 (도 27). FcγRⅠ에 대한 mAb 22 F(ab')2의 결합이 유리 펩티드의 표출을 증진시키지 못한다는 사실은, FcγRⅠ에 대한 mAb 22의 결합만으로는 단핵구의 기능적 상태가 Ag 표출을 증진시키는 방향으로 변하도록 할 수 없음을 시사한다. 따라서, 항-FcγRⅠ Ab 22에 대한 펩티드의 결합은 Ag 표출에 대해 관찰된 증진 효과에 필수적인 것 같으며, 이는 증진된 표출이 FcγRⅠ을 통한 효과적인 Ag 포착의 결과인 것 같다.
H22에 의한 펩티드 표출의 증진은 인간 IgG의 존재에 영향을 받지 않는다
생리적 조건하에서, FcγRⅠ의 리간드-결합 도메인은 이 수용체에 대한 AgAb의 효율적인 표적화를 차단하는 IgG에 의해 포화된다. FcγRⅠ의 기능을 촉진시키기 위해 mAb 22의 유도체를 사용하는 유일한 이점은, Ab 22가 리간드 결합 도메인의 바깥쪽에서 에피토프에 결합한다는 것이다. 따라서, ADCC, 식세포 작용 및 Ag 표출과 같이 mAb 22에 의해 촉진된 기능은 생리적 수준의 IgG에 의해 억제되지 않는다 (Gosselin E. J., 상기 문헌; Guyre P. M. (1989) J. Immunol. 143:1650-55). 이와 유사하게, 융합 단백질 Fab22-TT830을 이용한 TT830 펩티드의 증진된 표출은 IgG에 의해 억제되지 않았으며 (도 28), 이는 H22-기재의 융합 단백질도 생체내에서 펩티드 Ag을 FcγRⅠ로 표적화하는데 효과적임을 시사한다.
H22Fd-TT 융합 단백질에 의해 Ag 표출이 증진되면 IFN-γ 및 IL-4 생성이 증가된다
활성화시 T 세포는 증식을 통해 클론을 확장할 뿐만 아니라 IFN-γ 및 IL-4와 같은 싸이토카인도 생성하여 B 세포 분화 및 단핵구 활성화의 이펙터 기능을 발휘한다 (Paul W. E. and Seder, R. A. (1994) Cell 76:241-251). 따라서, H22 융합 단백질에 의해 Ag 표출이 증진된 후에 IFN-γ 및 IL-4의 생성도 관찰되었다. 도 28a 및 28b에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 및 IL-4 모두의 생성량이 Fab22-TT830에 의해, 특히 부분최적화 Ag 농도에서 증가되었다. 그러나, 본 실험에서는 싸이토카인 생성의 증가 (약 20배)가 T 세포 증식의 증가 (약 600배)에 비해 더 적었다.
따라서, 항-FcγRⅠ mAb H22의 불변 영역에서 발현된 Th 에피토프는 인간 단핵구에 의해 효과적으로 가공되어 표출될 수 있으며, 그 결과 T 세포의 활성화 및 싸이토카인 생성이 증가하게 된다.
APL, TT833S 및 Fab22-TT833S의 표출은 T 세포 증식을 자극하지 못한다
알렌 (Allen)과 그 동료들에 의해 변형 펩티드 리간드 (APL)라 명명된, 천연 T 세포 에피토프에서 아미노산 1개 또는 2개가 변화된 펩티드는 T 세포 활성화에 대한 효능제, 부분 효능제 또는 길항제임이 입증되었다 (Sette et al. (1994) Ann Rev. Immunol. 12:413; Evavold et al. (1993) Immunol. Today 14:602). TCR을 통해 특이적 T 세포가 APL을 인식하게 되면, 어떤 경우에는 부분적인 신호전달을 촉진시키고, 그 결과 (i) 초항원 (superantigen)에 의한 T 세포 자극의 억제 (Evavlold et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:2300), (ii) T 세포의 면역성 결여 (Sloan-Lancaster et al. (1993) Nature 363:156; Sloan-Lancaster et al. (1994) J. Exp. Med. 185:1195), 또는 (iii) Th1/Th2 분화의 조절 (Nicholson et al. (1995) Immunity 3:397; Pfeiffer et al. (1995) J. Exp. Med. 181:1569; 및 Windhagen et al. (1995) Immunity 2:373)을 초래하게 된다. 부분 효능제는 T 세포에 의한 IL-4와 같은 일부 T 세포의 기능을 자극하지만, T 세포 증식과 같은 다른 기능은 자극하지 못하는 것으로 밝혀졌다 (Evabold et al. (1991) Science252:1308). 또한, 부분 효능제는 면역성 결여를 유도할 수도 있다. 특정 APL은 TCR과의 상호작용시 검출가능한 어떤 신호전달도 촉진하지 않지만, TCR 길항제로 작용하여 야생형 펩티드 항원에 반응하여 나타나는 T 세포 증식을 억제할 수 있기 때문에 TCR 길항제 (De Magistris et al. (1992) Cell 68:625; Ruppert et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2671)라 불리운다.
본 실시예는 파상풍균 독소의 T 세포 에피토프 TT830에 대한 길항제인 TT833S 및 Fab22-TT833S가 T 세포 증식을 자극하지 못함을 입증하는 것이다. 도 30에 나타낸 바와 같이, TT833S에 대해서는 100 μM과 Fab22-TT833S에 대해서는 1 μM이라는 높은 투여량에도 불구하고, TT830-특이적 T 세포의 증식은 관찰되지 않았다. 이는 TT830 펩티드의 833 위치에서 리신을 세린으로 교환한 것 때문에 이 T 세포 에피토프의 T 세포 반응성이 제거되었음을 시사한다. 또한, 펩티드 TT830 및 TT833S가 TT830-특이적 T 세포에 동시에 표출될 때, TT830에 반응하여 나타나는 T 세포 증식은 투여량에 의존적인 방식으로 억제되었으며, 이는 TT833S가 TT830-특이적 T 세포에 대한 길항제로 작용할 수 있음을 의미한다 (도 31).
Fab22-TT833S는 T 세포의 활성화를 억제함에 있어서 TT833S보다 100배 이상 효과적이다
본 실시예는 TT830에 반응하여 나타나는 T 세포 증식을 억제하는데 있어서 TT833S와 Fab22-TT833S의 상대적인 효율을 비교하는 것이다. 도 32에 나타낸 바와 같이, Fab22-TT833S는 TT830-자극 T 세포 증식을 억제함에 있어서 TT833S보다 약 100배 정도 더 효과적이었다. 이는 APL인 TT833S가 mAb H22의 불변 영역에서 발현되는 경우에 APC에 의해 올바르고 효과적으로 표출될 수 있음을 시사한다. T 세포 증식에 대한 융합 단백질 Fab22-TT833S의 증가된 길항 효능은, 유리 펩티드에 비해 FcγRⅠ에 의해 매개된 Ag 포착에 더 효율적임을 반영한다.
T 세포 활성화의 억제는 MHC 클래스 Ⅱ 결합에 대한 경쟁이 아니라 T 세포 수용체 결합에 대한 경쟁에 의해 매개된다
APL TT833S 및 융합 단백질 Fab22-TT833S의 길항 효과는 MHC-결합이나 TCR-결합 또는 둘 모두의 수준에서의 경쟁을 통한 것일 수 있다. 관련된 메카니즘을 알아보기 위해, 세테 (Sette)와 그의 동료들이 최초로 기재한 "예비-펄스" 실험 (DeMagistris, M. T. et al. (1992) Cell 68:625-634)을 수행하였다. 본 실험의 세팅은 억제제 (TT833S)와의 경쟁없이 효능제 (TT830)가 MHC 클래스 Ⅱ에 결합할 수 있게 해주므로, 순수한 MHC 차단제가 아닌 TCR 길항제만이 효능제-자극 T 세포 증식을 효과적으로 억제할 수 있을 것이다. Ag-표출 단핵구를 부분최적 (20 nM) TT830으로 4 시간 동안 펄스 처리하여, TT830이 TT833S와의 경쟁없이 MHC 클래스 Ⅱ에 결합하게 하였다. 이어서, APL인 TT833S 또는 Fab22-TT833S를 예비-펄스 처리된 단핵구와 추가의 16 시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응성 T 세포를 가하고, 상기 기재된 바와 같이 T 세포의 증식을 측정하였다. MHC 차단이 최소한의 작용을 하는 그러한 환경하에서도, T 세포 증식은 여전히 억제되었다 (도 33). 따라서, 억제는 MHC 클래스 Ⅱ 결합에 대한 경쟁의 결과가 아니라 T 세포 수용체에 대한 경쟁의 결과인 것 같다.
TT833S 및 Fab22-TT833S의 표출은 T 세포에 의한 IL-4 및 IFN-γ의 생성을자극하지 못한다
어떤 환경하에서는 APL이 T 세포 싸이토카인 생성은 자극하지만 그 증식은 자극하지 않는다 (Evavold B. D. and Allen P. M. (1991) Science 252:1308-1310). TT833S의 표출이 싸이토카인의 생성을 자극하는지 결정하기 위해, Ag 표출 분석에서 얻은 상층액 중의 IL-4 및 IFN-γ 양을 측정하였다. 도 34에 나타낸 바와 같이, TT833S 및 Fab22-TT833S 모두 T 세포에 의한 IFN-γ 및 IL-4의 생성을 효과적으로 자극하지 못했다.
TT833S 및 Fab22-TT833S의 표출은 T 세포의 면역성 결여를 유도하지 않는다
알렌 (Allen)과 그의 동료들은, TCR이 일부 APL-MHC 클래스 Ⅱ 복합체와 상호작용하면 T 세포의 면역성 결여가 유도된다고 보고하였다 (Sloan-Lancaster J. et al. (1993) Nature 363:156-159; Sloan-Lancaster J. et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1195-1205). 알렌 등의 것과 유사한 실험 계획을 이용하여 TT833S의 표출이 T 세포의 면역성 결여를 유발하는지 측정하였다. 도 35에 나타낸 바와 같이, T 세포를 APC 및 TT833S 또는 Fab22-TT833S와 함께 1 일 동안 인큐베이션시킨 후 회수했을 때, 이 T 세포는 이후의 항원 투여 실험에 반응했을 뿐만 아니라 APC와만 인큐베이션된 T 세포에도 반응하였다. 따라서, 펩티드 단독 또는 Fab22-TT833S의 사용을 통해 표출된 길항제는 T 세포의 면역성 결여를 유발하지 않았다. 또한, 펩티드가 없는 배양액, TT833S가 있는 배양액 또는 Fab22-TT833S가 있는 배양액으로부터 동일한 비율의 생존 T 세포 (약 50％)가 회수되었으며, 이는 TT833S의 표출이 또한 T 세포의 사멸을 증가시키지도 않았음을 시사한다.
항-FcγRⅠ mAb 22 기재의 융합 단백질을 이용하여 FcγRⅠ에 대해 항원성 펩티드를 표적화함으로써 면역성이 약 1000배 증가했다는 관찰은, 상기 융합 단백질이 펩티드 기재의 백신으로, 예를 들어 감염성 질환 및 암에 대해 유용할 것임을 암시한다. 특정 APC 표면 분자에 특이적인 인간 mAb의 불변 도메인 내로 펩티드를 조작하는 것은, 펩티드-기재 백신에 대한 항원 효능을 증가시키는 일반적인 접근법이다.
더욱이, APC가 천연 펩티드로 처음 펄스 처리되어 자가면역 반응을 개선시키기 위해 시도하는 경우에 생체내에서 나타날 수 있는 것과 필적할만한 상황이 되었을 때에도 FcγRⅠ-표적화 길항성 펩티드가 TT830-특이적 T 세포의 증식을 억제했다는 관찰은 길항성 펩티드의 표적화된 표출이 T 세포 매개의 자가면역 질환과 같은 질환의 Ag-특이적 치료법으로서 사용될 수 있음을 보여준다. APL-기재의 치료는 류마티스성 관절염 및 다발성 경화증과 같은 T 세포 매개의 자가면역 질환에 대한 항원-특이적 면역치료법을 제공할 것이다. 또한, FcγRⅠ에 대한 1개의 결합 특이적 부위, 및 면역 반응이 과도하게 나타나는 특징이 있는 면역 질환과 관련된 항원의 부분 효능제인 펩티드를 갖는 융합 단백질의 사용은 항원-특이적 면역성 결여를 유도함으로써 그러한 면역 질환의 치료에 유용할 것이다. 따라서 본 발명은, T 세포를 자극하거나, T 세포의 증식 및(또는) 싸이토카인 분비를 차단하거나, 또는 T 세포에서의 면역성 결여를 유도하는 항원의 항원 표출을 증가시키는 방법을 제공함으로써 다양한 면역학적 질환에 대한 치료 방법을 제공한다.
<실시예 8> 기능성 단일쇄 항-FcγRⅠ-항-CEA 이중특이적 분자
본 실시예는 항-발암성 배 (항-CEA) 항체에 융합된 인간화 항-FcγRⅠ 항체를 포함하는 재조합 이중특이적 단일쇄 분자가 FcγRⅠ 및 CEA에 결합할 수 있음을 입증하는 것이다.
도 37은 FcγRⅠ에 대한 1개의 결합 특이적 부위 및 제조된 발암성 배 항원 (CEA)에 대한 1개의 결합 특이적 부위를 갖는 이중특이적 단일쇄 분자를 코딩하는 포유류 발현 작제물 (작제물 321 및 323)을 나타내는 도식이다. 작제물 321에 의해 코딩되는 이중특이적 단일쇄 분자 H22-항-CEA의 아미노산 서열 (서열 16)과 이 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (서열 15)은 도 40에 기재되어 있다. 작제물 323에 의해 코딩되는 이중특이적 단일쇄 분자 H22-항-CEA는, 단지 H22의 VH쇄와 VL쇄가 바뀌어 있다는 것만이 작제물 321에 의해 코딩되는 융합 단백질과 다르다.
FcγRⅠ에 대한 1개의 결합 특이적 부위를 갖는 단일쇄 항체를 코딩하는 포유류 발현 작제물 (작제물 225)도 제조하였다. 작제물 225에 의해 코딩되는 단일쇄 항체 H22의 아미노산 서열 (서열 14)과 이 단일쇄 항체를 코딩하는 핵산 서열 (서열 13)은 도 39에 기재되어 있다.
이들 각 작제물을, CMV 프로모터에 의해 발현이 유도되는 pcDNA3 (Invitrogen)의 HindⅢ 및 XbaⅠ 부위에 클로닝하였다. 또한, 이들 각 작제물은, 세포 배양액으로부터 재조합 단백질을 정제하는데 사용되는 c-myc 및 헥사-히스티딘 펩티드를 코딩하는 핵산 서열도 함유하고 있다. c-myc 태그는 인간 c-myc (Evan et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3610)의 아미노산 410 내지 420에 대응된다. MFE-23이라 명명된 항-CEA 단일쇄 항체는 추가로 문헌 [Casey et al. (1994)J. Immunol. Methods 179:105] 및 [Chester et al. (1994) Lancet 343:455]에 기재되어 있다.
단일쇄 이중특이적 분자 H22-항-CEA 및 단일쇄 H22 항체를 사용하여 하기와 같이 결합 분석을 수행하였다. ELISA 플레이트를 CEA로 코팅하고, 5％ PBA로 차단하였다. 단일쇄 분자를 코딩하는 작제물로 형질감염된 세포의 상층액 (트랜스펙토마)을 이 플레이트에 가하고, 가용성 FcγRⅠ/IgM-μ (형질감염된 COS 세포로부터의 상층액, 상기와 같음)를 가한 후, 이 플레이트를 알칼리성 포스파타제 (AP)가 접합된 염소 항-인간 IgM과 함께 인큐베이션시키고 RNPP로 발색반응시킨 다음에 405 내지 650 nm에서 플레이트를 판독하여 결합을 검출하였다.
그 결과를 도 38에 나타내었다. 그 결과는 작제물 321 및 323에 의해 코딩되는 단일쇄 이중특이적 H22-항-CEA 분자가 FcγRⅠ 및 CEA에 모두 결합함을 의미한다. 한편, 단일쇄 H22 항체 (작제물 225에 의해 코딩됨)는 예상했던대로 FcγRⅠ 및 CEA에 결합하지 않았다.
<실시예 9> 항원 가공 및 표출을 유도 및(또는) 증진시키기 위한 표적화 CD64 (FcγRⅠ)
인간 CD64 (FcγRⅠ)에 대한 정상적인 비-면역원성 항원 (즉, 자기항원)의 유도가 생체내에서 면역학적 무반응성을 극복할 수 있는지를 결정하기 위해, 항원 표출 세포 상의 Fc 수용체에 대해 유도된 F(ab')2항체 단편에 연결된 그러한 항체를 포함하는 여러가지 멀티머 복합체를 하기 기재되는 바와 같이 제조 및 시험하였다. 특히, 인간 CD64에 대한 트랜스제닉 생쥐 뿐만 아니라 한배에서 나온 비-트랜스제닉 자손을 쥐의 항-인간 CD64 mAb인 M22의 F(ab')2단편으로 면역화시켰다. 2주마다 1회 시행되는 면역화를 4회 받은지 7일 후, 생쥐에서 혈액을 채취하였다. ELISA로 분석시, 트랜스제닉 생쥐 6마리 중 3마리가 상당한 항-M22 특이적 항체 타이터를 나타냈다 (한배에서 나온 비-트랜스제닉 자손은 1마리도 나타나지 않음). 이 항혈청은 M22에 특이적이었으며, 다른 쥐 항체와 반응하지 않았다.
M22 Fab'의 멀티머 복합체가 항원을 더 효율적으로 인터날리제이션시켜 항원 표출을 증진시키고 더 강한 항-M22 Id 면역 반응을 나타내는지 결정하기 위해, M22 Fab' 분자의 멀티머를 화학적으로 및 유전자적으로 합성하여 시험하였다. 이들 멀티머는 22 F(ab')2(또는 다른 Fc 수용체 결합제)에 화학적으로 연결된 항원과 부가의 22 Fab' 분자를 포함한다. 최종 멀티머는, 예를 들어 다중의 22 Fab' 암 (예, 2개 이상)과 1개 이상의 항원 분자를 포함하는 여러가지 분자 종으로 이루어진다. 이들 종은 필요에 따라 크기 배제 또는 친화 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 도 41은 화학적으로 연결된 멀티머 표적 항원의 개발을 나타내는 도식이다.
M22의 F(ab')2를 실온에서 20 몰농도의 과량의 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC)와 함께 2 시간 동안 인큐베이션시켜 화학적으로 합성된 멀티머를 제조하였다. G-25 크로마토그래피에 의해, 결과로 생성된 복합체인 F(ab')2-SMCC로부터 유리 SMCC를 제거하였다. 유리 티올 (SH)기가 있는 항원을 1:1의 몰비로 M22 F(ab')2-SMCC에 가하였다. 결과로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션시켰다. 과량의 요오도아세트아미드를 가하여 반응을 중지시키고, 결과로 생성된 접합체를 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다.
M22 F(ab')2 + -항원 멀티머는 면역 반응을 증진/유도한다
도 42a는 정제된 M22 F(ab')2(레인 1) 및 화학적으로 연결된 M22 Fab' 멀티머 (레인 2)를 함유하는 비-환원 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 멀티머는 F(ab')4, F(ab')5, F(ab')6및 고분자량의 분자로 표시되는 여러가지 분자 종으로 이루어져 있다.
멀티머인 M22 F(ab')3 +에 대한 M22 F(ab')2의 인간 CD64 인터날리제이션 매개 능력을 측정하기 위해, 다양한 농도의 M22 F(ab')2또는 M22 F(ab')3 +를 인간 CD64-트랜스제닉 생쥐로부터 단리된 대식세포와 함께 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. M22 에피토프와는 구별되는 인간 CD64의 다른 부위에 결합하는 FITC-표지 항-인간 CD64 mAb M32.2 (ATCC 기탁번호 9469호인 하이브리도마에 의해 생성됨)에 의해 인간 CD64 표면 발현을 검출하였다. 도 42에 나타낸 바와 같이, M22 F(ab')2와의 인큐베이션은 대식세포의 표면으로부터 인간 CD64의 상당한 감소를 초래하지 않았다. 그러나, 37℃에서 F(ab')3 +와의 인큐베이션은 투여량에 의존적인 방식으로 인간CD64의 발현을 최대 50％까지 감소시켰다. 4℃에서 F(ab')3 +와의 인큐베이션은 인간 CD64의 발현을 감소시키지 않았으며, 이는 이 현상이 온도에 의존적임을 입증해 준다.
생체내에서 조절이 일어나는지 알아보기 위해 추가의 실험을 수행하였다. 인간-CD64 트랜스제닉 생쥐를 M22 F(ab')2또는 M22 F(ab')3 +로 주사하고, 1 시간 후에 혈액을 채취하였다. 인간 CD64의 표면 발현은, M22 F(ab')3 +로부터의 순환 단핵구에서는 상당히 감소하였으나, M22 F(ab')2면역화 동물에서는 감소하지 않았다. 표면 인간 CD64의 발현 감소는 F(ab')3 +멀티머와 함께 수용체의 인터날리제이션을 나타낸다는 가설을 세웠다.
다음으로, M22 F(ab')3 +로 3회 면역화시킨 후에 인간 CD64-트랜스제닉 생쥐와 한배에서 나온 비-트랜스제닉 생쥐가 항-M22 유전자형 ("Id") 반응을 생성하는 능력을 연구하였다. 도 43a에 나타낸 데이타는 멀티머로 3회 면역화 (25 ㎍/면역화)된 모든 인간 CD64-트랜스제닉 생쥐 (n=12)에서 높은 타이터의 M22-특이적 항체가 생성되었지만, 유사하게 면역화된 한배 자손 (n=10)에서는 M22-특이적 항체가 전혀 생성되지 않음을 증명한다. M22 F(ab')3 +에 의해 도출된 인간 CD64-트랜스제닉 생쥐에서의 면역 반응은 M22 (Fab')2에 의해 도출된 면역 반응보다 훨씬 양호했다. 멀티머로 면역화된 모든 생쥐는 반응을 나타냈으며, F(ab')2로 면역화시키는 경우에 비해 멀티머로 면역화시키는 경우에 면역화 회수가 더 적게 (3회 대 4회) 필요했다. 이들 결과는 Fab' 멀티머 복합체가 인간 CD64를 통한 항원의 인터날리제이션을 더 잘 유도하고, 그 결과 항원-특이적 면역 반응이 증진됨을 입증한다. 사실상, 도 43b에 나타낸 데이타는, 인간 CD64-트랜스제닉 생쥐를 단지 0.25 ㎍의 멀티머로 면역화시키더라도 대부분의 생쥐에서 검출가능한 면역 반응이 도출됨을 입증한다.
면역 시스템이 종종 많은 종양-관련 항원에 대해 내성을 갖게 되므로, 이들 항원에 대한 강력한 면역 반응를 관찰하는 것은 어렵다. 정상적으로는 비-면역원성인 항원을 인간 CD64로 유도하면 이 항원에 대한 면역 반응이 생겨나는지 결정하기 위해, 모델 항원, 쥐의 모노클로날 항체의 Fab' 단편인 520C9를 M22 멀티머와 커플링시켰다.
인간 CD64 트랜스제닉 또는 한배에서 나온 비-트랜스제닉 자손을 면역화시킨 후, 항-520C9 Id 타이터와 항-M22 Id 타이터를 모두 평가하였다. 도 44a에 나타낸 바와 같이, 면역화된 인간 CD64 트랜스제닉 생쥐 8마리 중 7마리에서 강한 항-520C9 타이터 및 항-M22 타이터가 나타났다. 비-트랜스제닉 생쥐 7마리에서는 520C9 또는 M22에 대한 측정가능한 타이터가 나타나지 않았다. 이들 데이타는, 정상적으로는 비-면역원성인 단백질을 인간 CD64에 커플링시켜 이 단백질이 인간CD64+항원 표출 세포에 의해 인터날리제이션되면, 상기 항원에 대한 강력한 면역 반응이 생성된다는 것을 입증한다. B 세포 림프종 세포 상의 표면 Ig에 의해 발현되는 유전자형에 특이적인 면역성을 나타내는 것은 강력한 종양 세포-특이적 면역성을 초래할 수 있을 것이라고 몇몇 연구 그룹들이 보고하였다. 본 실시예는 특이적 항-520C9 Id 반응이 520C9 유전자형을 인간 CD64에 유도함으로써 용이하게 도출될 수 있음을 입증한다.
주어진 항원, 특히 종양-관련 또는 바이러스성 항원에 대한 면역 반응의 질은 반응의 양만큼이나 중요하다. T 헬퍼 세포는 자신이 분비하는 싸이토카인의 종류, 및 자극시 B 세포에 제공하는 도움의 유형에 따라 Th1 및 Th2로 분류되었다. Th1 세포는 자극시 IL-2 및 IFN-γ를 분비하고, 통상 B 세포가 IgG2a 이소타입의 항체를 분비하도록 자극한다. Th2 세포는 자극시 IL-4 및 IL-5를 분비하고, 통상 B 세포가 IgG1 또는 IgE 이소타입의 항체를 분비하도록 자극한다. 일반적으로, Th1 세포는 면역 반응의 세포성 면역 반응을 자극하는 반면, Th2 세포는 체액성 면역 반응을 자극한다. 인간 CD64-트랜스제닉 생쥐를 M22 멀티머에 커플링된 520C9로 면역화시킨 후, 이소타입-특이적 발색 시약을 사용하여 IgG1 또는 IgG2a 이소타입의 520C9-특이적 항체에 대한 타이터를 다시 조사하였다. 도 42b에 나타낸 데이타는 강력한 IgG1 뿐만 아니라 강력한 IgG2a Id에 특이적인 타이터가 도출되었음을 입증하고, 이는 이 면역화 방법이 Th1 및 Th2 반응을 모두 활성화시킴을 의미한다.
H22sFv-H22sFv-32.2sFv-항원 멀티머는 면역 반응을 유도한다
도 45a는 유전자적으로 연결된 멀티머 표적 항원을 코딩하는 벡터의 맵을 보여준다. 이 벡터는 인간화 항-FcγRⅠ 항체인 H22 (ATCC 기탁번호 CRL 11177호인 하이브리도마에 의해 생성됨)로부터 얻은 2개의 Fv 영역, 및 항체 M32.2로부터 얻은 1개의 sFv 영역이 함께 항원에 연결된 상태의 단백질을 코딩한다. 결과의 융합 단백질인 H22sFv-H22sFv-32.2sFv-항원 (도 45b에 도시)은 FcγRⅠ의 여러 부위에 결합할 수 있고, 따라서 수용체의 응집을 통해 인터날리제이션을 유도할 수 있다.
쥐의 gp75 (Trp-1 흑색종 항원)를 트랜스제닉 생쥐에서의 모델 연구를 위한 항원으로 사용하여 H22sFv-H22sFv-32.2sFv-항원 멀티머를 만들었다. 이 융합 단백질은 FcγRⅠ에 효율적으로 결합하여 수용체의 인터날리제이션을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 도 46에 나타낸 바와 같이, 화학적으로 연결된 M22Fab x M22Fab x M32Fab 및 유전자적으로 연결된 H22sFv-H22sFv-32.2sFv-항원은 각각 FcγRⅠ의 인터날리제이션을 유도하였다. 이 연구는 37℃에서 2 시간 동안 IFN-γ-처리된 U-937 세포에 샘플을 가하여 수행하였다. 이어서, 세포를 4℃에서 인간 IgG1-FITC로 1 시간 동안 염색하여 FcγRⅠ의 발현을 측정하고, FACScan에 의해 샘플을 분석하였다. 조절 비율 (％)은 [1-(샘플의 MFI/대조군의 MFI)]×100％에 의해 계산하였고, 여기서 MFI는 평균 형광 강도를 의미한다.
H22sFv2-항원은 H22Fab2-항원과 거의 동등한 친화도도 FcγRⅠ에 결합한다
도 47a는 항원에 유전자적으로 함께 연결된 2개의 H22 sFv 영역으로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 벡터의 맵을 보여준다. 결과의 융합 단백질인 H22sFv-H22sFv-항원 (도 47b에 도시)은 2개의 FcγRⅠ 분자에 결합할 수 있다. 이 융합단백질은 단지 1개의 H22 sFv로 이루어진 융합 단백질보다 친화도가 더 높아야 한다. 이 멀티머가 2개의 FcγRⅠ 분자에 결합하는 능력은 또한 수용체의 인터날리제이션을 유도할 수 있다.
이 가설 (즉, H22sFv-H22sFv-항원 융합체가 단일 H22sFv-항원보다 더 높은 친화도로 FcγRⅠ에 결합하는지)을 검증하기 위해, 경쟁 실험을 수행하였다. 미리 IFN-γ로 처리하여 FcγRⅠ의 발현이 증가된 U937 세포를 항체 H22 및 피코에리트린 접합체로 염색하였다. 도 48에 나타낸 바와 같이, 접합체는 다양한 농도의 H22 Fab인 H22sFv2-EGF 융합 단백질 또는 H22 Fab2에 의해 억제되었다. 역시 도 48에 나타낸 바와 같이, H22sFv2-EGF는 H22Fab2와 거의 동등한 친화도로 FcγRⅠ에 결합한다. H22 Fab'과 H22 sFv가 FcγRⅠ에 대해 유사한 친화도를 갖는다는 것은 이미 알려져 있다 (Goldstein et al. (1997) J. Immunol).
H22sFv-H22sFv-H22sFv-CEA는 FcγRⅠ의 인터날리제이션을 유도한다
도 49a는 항원에 연결된 3개의 H22 sFv 단편을 포함하는 멀티머 융합 단백질을 코딩하는 벡터의 맵을 보여준다. 융합 단백질 H22sFv-H22sFv-H22sFv-CEA (도 49b에 도시)은 3개의 H22sFv에 연결된 종양 항원 CEA를 포함한다. 이 융합 단백질은 높은 친화도로 FcγRⅠ에 결합 (sFv 분자 3개의 3가 결합 때문임)해야 하며, 3개의 FcγRⅠ 분자를 응집시켜 FcγRⅠ를 인터날리제이션시킬 수 있어야 한다.
유전자적으로 연결된 H22sFv-H22sFv-H22sFv-CEA 융합체가 FcγRⅠ의 인터날리제이션을 유도하는 능력은 상기와 같이 검증하였고, 그 결과를 도 50에 나타냈다. 중요한 것은, H22Fab-CEA는 유사한 농도에서 인터날리제이션을 매개하지 못했다는 것이며, 이는 H22Fab-CEA가 FcγRⅠ에 1가로 결합하기 때문인 것 같다. 본 실시예는 IFN-γ로 처리된 U937 세포에 샘플을 가하고, 37℃에서 1 시간 또는 밤새 인큐베이션시켜 수행하였다. 이어서, 세포를 4℃에서 M32.2-FITC로 1 시간 동안 염색하여 FcγRⅠ의 발현을 측정하고, FACScan에 의해 샘플을 분석하였다.
<실시예 10> CD89 (FcαR) 및 종양 항원 (예, EGF 수용체)에 대한 인간 항체 융합 단백질은 종양 세포의 세포 매개 세포독성을 촉진한다
하기 연구는 EGF 수용체 (EGF-R)를 발현하는 종양 세포의 이펙터 세포 매개 사멸을 유도하는 이중특이적 융합 작제물의 제조 및 특성화에 관한 것이다. 이 작제물은 항-CD89 (항-FcαR) 항체 (ScFv 또는 Fab')에 연결된 EGF를 포함한다. 따라서, 작제물은 종양 세포로 표적화된 CD89 발현 세포의 이펙터 기능을 활성화시킨다.
CD89 (FcαR)은 인체에서 가장 풍부한 Ig인 IgA의 Fc 부분에 결합하는 수용체이다. CD89는 주로 다형핵 백혈구 (PMN), 단핵구, 대식세포, 호중성구 및 호산성구를 비롯한 세포독성 면역 이펙터 세포에서 구성적으로 발현된다. Ag-복합체 및 모노머 IgA1 및 IgA2는 CD89에 결합하며, 이는 수용체가 생체내에서 모노머 IgA로 포화되어 있음을 의미한다. 리간드 결합 부위의 내부 또는 외부의 에피토프에 특이적인 mAb에 의한 수지상 이펙터 세포 상의 가교결합 CD89는 탈과립화를 촉진하고, 과산화물을 방출하며, 염증성 싸이토카인을 분비하고, 내포작용 및 식세포 작용을 자극한다. 따라서, CD89는 세포독성 면역 이펙터 세포 상의 임상적으로 적절한 촉진 수용체일 수 있다.
Ⅰ형 성장 인자 수용체 족의 구성원은 다양한 암의 발생시에 과다 발현되는 것으로 보고된 티로신-키나아제 결합 수용체들이다. 이 족의 한 구성원은 상피 성장 인자 (EGF-R, c-erbB-1 유전자 산물)에 대한 수용체이다. EGF-R은 거의 모든 두부암 및 경부암, 약 1/3의 유방암 및 난소암에서 과다 발현되며, 전립선암, 신장암, 방광암, 폐암, 뇌암, 췌장암 및 위장관계 암에서 과다 발현될 수 있다. 각질형성세포 및 간세포와 같은 일부 정상 세포에서의 수용체 존재에도 불구하고, 종양 세포 상의 EGF-R 과다 발현은 종양에 대한 특이적 치료법을 개발하는데 유용할 수 있다. 개발된 치료법은 EGF-R에 특이적인 mAb, 또는 EGF와 같은 수용체에 대한 리간드 중 하나를 포함할 수 있다. EGF는 EGF-R을 발현하는 다양한 세포형의 세포 분열 및 분화 기능에 대한 조절제이다. EGF는 53개의 아미노산으로 이루어져 있고, 3개의 이황결합을 함유하는 비글리코실화 폴리펩티드이며, 1207개의 아미노산 전구체로부터 단백질 분해에 의해 가공된 것이다.
융합 작제물의 생성
이중특이적 융합 단백질을 생성하기 위해, 이전에 설명된 바와 같은 HuMAb-Mouse (상표명) 기술을 이용하여 완전한 인간 CD89 mAb를 생성하였다. 이 mAb 14A8 (또한 14.1이라고도 불리움)은 이펙터 기능을 촉진하는 능력은 보유하면서 Fc 결합 부위와는 구별되는 다른 부위의 에피토프에 결합한다. 따라서, 항체는 모노머 IgA의 포화에 의해 생겨난 리간드 결합 부위의 잠재적 차단을 극복할 수 있다. 여기서, mAb 14A8의 Fab' 및 sFv 단편을 EGF에 융합시켰다. 간략히 설명하면, 14A8 하이브리도마 세포주를 가용성 CD89로 면역화된 HuMAb 생쥐로부터 얻었다.RT-PCR을 이용하여 상기 세포주에서 얻은 RNA로부터 V-영역을 클로닝하였다. DNA 서열 분석 결과, 항체는 DN1 D-단편 및 JH4 J-단편이 있는 30.0 VH와, JK3 J-단편이 있는 L18 Vk로 이루어져 있음을 밝혀냈다.
HuMAb-Mouse (상표명)으로부터 생성된 완전한 인간 항-CD89 mAb의 다양한 영역을 코딩하는 DNA를 이용하여, 이중특이적 분자 (BSM)로 작용하는 항체 융합 단백질을 작제하여 발현시켰다. 도 51에 나타낸 바와 같이, 이들 분자는, 여전히 이펙터 세포 기능을 수행하지만 Fc 결합 영역과는 다른 에피토프에서 인간 IgA (FcαRⅠ, CD89)의 Fc 부분에 대한 수용체에 결합하는 항체 단편, 및 다양한 종양 세포주에서 과다 발현되는 상피 성장 인자 수용체 (EGF-R)에 결합하는 암 (arm)으로 이루어져 있었다. BSM을 제조하기 위해, mAb 14A8 (항-CD89)의 Fab 또는 sc-Fv 단편을 EGF에 대한 유동성 펩티드 링커인 EGF-R에 대한 리간드를 통해 융합시켰다. RT-PCR 및 DNA 서열분석을 이용하여 mAb 14A8의 다양한 영역을 클로닝 및 특성화하였다.
인간 IgG1 CH1과 EGF에 융합된 힌지 영역의 cDNA를 포함하는 발현 벡터에 14A8 VH DNA를 삽입하여 Fab 융합 작제물을 제조하였다. 인간 CL 영역의 cDNA를 포함하는 발현 벡터에 14A8 VL DNA를 이와 유사하게 삽입하였다. 또한, sc-Fv 융합 단백질을 한 벡터로부터의 단일쇄로서 발현시켰다. 도 51에 도식적으로 나타낸 바와 같이, pJZ906 (14Afd-EGF) 및 pJZ907 (14A8 L-쇄)을 전기천공법에 의해 NSO 세포에 동시 형질감염시키고, G418과 하이그로마이신을 모두 함유하는 배지에서 선별하였다. pJZ909 (14A8sFv-EGF)를 유사하게 형질감염시키고, G418을 함유하는 배지에서 선별하였다. 융합 단백질을 발현하는 세포주를 제한 희석 클로닝에 의해 서브클로닝하였다. 융합 작제물을 정제하기 위해, 융합 단백질을 발현하는 세포주의 상층액을 단백질 L 컬럼에서 구동시키고, 약 2 ㎍의 정제된 단백질을 환원 및 비-환원 조건하에서 4 내지 15％의 트리스-글리신 겔에 로딩하였다.
종양 세포에 결합하는 융합 작제물의 특성화
도 52 (a 및 b) 및 도 53에 나타낸 바와 같이, 이들 BSM의 항체 단편 및 EGF 부분이 각각의 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합함을 유동 세포계수 실험으로 확인하였다. 도 52a는 A431 세포 상의 EGF-R에 결합하는 14A8Fab'-EGF 융합 단백질을 보여준다. 도 52b는 A431 세포에 결합하는 14A8sFv-EGF를 보여준다 (피코에리트린에 접합된 염소 항-인간 IgG Fab-2로 염색). EGF를 함유하지 않는 14A8의 Fab-2 단편을 대조군으로 사용하였다. 도 52c는 14A8 융합 단백질과 상업적으로 얻은 EGF가 EGF-FITC 접합체 (7 nM)와 A431 세포와의 결합에 대해 경쟁함을 보여준다. 도 53a는 14A8Fab'-EGF 융합 단백질이 CD89를 발현하는 U937 세포 (피코이레트린에 접합된 염소 항-인간 IgG Fab-2로 염색)에 결합함을 보여준다. EGF-R에 특이적인 인간화 mAb H415의 Fab-2 단편을 대조군으로 사용하였다. 도 53b는 14A8sFv-EGF 융합 단백질도 또한 CD89를 발현하는 U937 세포에 결합함을 보여준다. 이 실험은 다양한 농도의 14A8sFv-EGF에 대하여 14A8Fab'-EGF 융합체 (23 nM)를 억제하는 능력을 평가한 것 이외에, 도 53a에서와 유사한 방식으로 수행하였다. H22sFv-EGF 융합 단백질을 다시 대조군으로 사용하였다. mAb H22는 U937 세포 상의 상이한 Fc 수용체인 CD64 (FcγRⅠ)에 결합한다.
EGF-R 발현 종양 세포의 이펙터 세포-매개 용해
크롬 방출 (세포 용해) 분석으로, 14A8Fab'-EGF 및 14A8sFv-EGF 융합 작제물이, 정제된 CD89 발현 다형핵 (PMN) 백혈구, 단핵구 또는 전체 혈액 이펙터 세포에 대해 투여량에 의존적인 방식으로 EGF-R 발현 종양 세포의 특이적 용해를 매개함을 확인하였다.
도 54a, 54b 및 54c, 및 도 55에 나타낸 바와 같이, 14A8 융합 단백질은 단핵구 (54a), PMN (54b) 및 전체 혈액 (54c)을 이용하여 A431 세포의 세포독성을 매개하였다. 인큐베이션 시간을 16 내지 18시간으로 하고, 이펙터 세포 대 표적 세포의 양 (단핵구 및 PMN)을 100:1로 하여 크롬 방출 분석을 수행하였다. 14A8의 Fab-2 단편을 대조군으로 사용하였다. 도 56에 나타낸 바와 같이, 14A8Fab'-EGF 융합체 (1 ㎍/ml)(56a) 및 14A8sFv-EGF 융합체 (1 ㎍/ml)가 매개하는 A431 세포의 세포독성은 14A8의 Fab-2 단편 (40 ㎍/ml)에 의해 억제되었다. 이는 융합 단백질들에 의한 세포 용해가 CD89에 대한 결합에 의해 특이적으로 매개됨을 입증한다.
총괄적으로, 앞선 연구들은 EGF를 14A8의 Fab' 또는 sFv 단편에 연결하고 이 작제물을 포유류 세포 배양액에서 발현시킨 후에 단백질 L 크로마토그래피를 이용하여 거의 균일한 상태로 작제물을 정제하는 유전자적 수단에 의해 융합 단백질을 생성하는 것에 대해 기재하고 있다. 융합 단백질의 치료 효능을 증진시킬 수 있는 14A8과 EGF에 있어서, 14A8은 완전히 인간 기원이고 EGF도 인간 기원이기 때문에, 이들 융합 단백질은 인간에서 최소한의 면역성을 나타낸다. 또한, 앞선 연구들은 이들 융합 단백질 14AFab'-EGF와 14A8sFv-EGF가 CD89 및 EGF-R 발현 세포 모두에결합할 수 있음을 입증한다. 중요한 것은, CD89-발현 면역 이펙터 세포의 존재시 이들 융합 단백질이 투여량에 의존적인 방식으로 EGF-R을 과다 발현하는 세포의 사멸을 매개함을 이 연구가 추가로 입증한다는 것이다. 또한, 전체 혈액의 존재시 종양 세포의 용해도 증명되었다.
<실시예 11> CD89 (FcαR) 및 종양 항원 (예, EGF 수용체 및(또는) HER2)에 대한 인간 항체 결합부를 포함하는 이중특이적 및 삼중특이적 분자의 종양 세포에 대한 세포 매개 세포독성 촉진
하기 연구는 EGF 수용체 (EGF-R) 및(또는) HER2/neu (HER2라고도 불리움)를 발현하는 종양세포의 이펙터 세포 매개 사멸을 유도하는 이중특이적 및 삼중특이적 분자의 제조 및 특성화에 관한 것이다. 이중특이적 작제물은, 3.F2라고도 불리우는 인간 모노클로날 항-HER2 항체 (ScFv 또는 Fab')에 연결된, 14.1이라고도 불리우는 인간 모노클로날 항-CD89 (항-FcαR) 항체 (ScFv 또는 Fab')를 포함한다. 삼중특이적 작제물은 EGF에 융합된 이중특이적 항-CD90 (ScFv) x 항-HER2 (ScFv) 작제물을 포함한다. 이들 작제물은 종양 세포로 표적화된 CD89 발현 세포의 이펙터 기능을 활성화시킨다. 또한, 이들 작제물은 완전히 인간 기원이라는 이점을 제공한다.
이중특이적 및 삼중특이적 융합 작제물의 생성
도 57 및 58은 본 발명의 선별된 이중- 및 삼중-특이적 분자와 이들의 모태인 인간 항체 (HuMAb)를 보여준다. 도 57은 단일쇄 (ScFv) 이중특이적 융합 분자인 931과 934를 보여주는데, 여기서 934는 EGF를 포함하지만 931은 그렇지 않는다는 것을 제외하면 이들 둘은 서로 동일하다. 14.1 (항-CD89) 및 3F2 (항-HER2)의 가변 경쇄 및 중쇄 영역을 사용하여 작제물을 생성하였다. 도 58은 화학적으로 접합된 Fab' 항-CD89 x 항-HER2 이중특이적 분자를 보여준다. 이 이중특이적 분자를 생성하기 위한 표준 화학 가교결합 절차를 이용하여, 14.1 및 3F2의 Fab' 단편을 이황결합에 의해 연결시켰다.
단일쇄 이중- 및 삼중-특이적 분자 (931 및 934)는, NSO 세포를 플라스미드 (예를 들어, pJZ934)로 형질감염 (항-CD89 x EGF 융합체에 대해 도 51에 나타낸 바와 같음)시키고 G418을 함유하는 배지에서 선별함으로써 제조하였다. 융합 단백질을 발현하는지의 여부에 대해 세포주를 스크리닝하여 제한 희석 클로닝에 의해 서브클로닝하였다. 최종적으로, 융합 단백질을 발현하는 세포주의 상층액을 단백질 L 컬럼 상에 구동시켜 정제한 후, 정제된 단백질 약 2 ㎍을 비환원 및 환원 조건하에서 4 내지 15％의 트리스-글리신 겔 상에 로딩하였다. 934 작제물은 주로 트리머 종으로서 정제되었는데, 이를 환원 조건하에서 모노머로 분해하였다.
종양 세포에 결합하는 이중- 및 삼중-특이적 분자의 특성화
유동 세포계수법을 사용하여 이중- 및 삼중-특이적 분자의 결합을 특성화하였다. 도 59a는 트랜스펙토마 상층액에서 융합 단백질의 종양 세포에 대한 결합을 보여준다. 형질감염된 세포 (931 및 934)의 상층액과 형질감염되지 않은 세포 (NSO)의 상층액을 SKBR-3 또는 A431 종양 세포주와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 피코에리트린에 접합된 염소 항-인간 IgG Fab-2로 염색하여 융합 단백질의 결합을 검출하였다. 도 59b에 나타낸 바와 같이, 형질감염된 세포 (931 및 934)로부터의 상층액도 세포 용해 (ADCC)를 매개하였다. 이들 연구에서, 인큐베이션 시간을 16 내지 18시간으로 하고, 이펙터 세포 (단핵구, PMN) 대 표적 세포 (SKBR-3, A431)의 양을 100:1로 하여 크롬 방출 분석을 수행하였다. 종양 세포 사멸은 특이적 용해를 매개하는지에 대해 형질감염된 (931 및 934) 상층액 및 형질감염되지 않은 (NSO) 상층액을 사용하여 검출하였다.
도 60a는 정제된 이중- 및 삼중-특이적 분자 (931 및 934)의 U937 세포에 대한 결합 활성 (CD89 수용체를 통함)을 보여준다. U937 세포에 결합하지 않는 항체 425 (항-EGF-R mAb)의 Fab-2 단편을 음성 대조군으로 사용하였다. 화학적으로 커플링된 이중특이적 분자인 항-CD89 (Fab') x 항-HER2 (Fab') (도 58에 도시)을 양성 대조군으로 사용하였다. 도 60b는 SKBR-3 세포에 대한 결합 (HER2 수용체를 통한 결합)을 시험한 것을 제외하고는 도 60a와 동일하다. 항-CD89 항체인 14.1의 Fab-2 단편을 음성 대조군으로 사용하였다. 도 61은 A431 세포에 대한 934 삼중특이적 작제물의 결합을 보여준다. 이 실험은 EGF-R을 과다 발현하는 A431 종양 세포를 사용한 것 이외에 도 60에 나타낸 것과 동일한 방식으로 수행하였다. EGF에 융합된 14.1의 sFv 단편으로 이루어진 융합 단백질을 양성 대조군으로 사용하였고, 항-CD89 항체인 14.1의 Fab-2 단편을 음성 대조군으로 사용하였다.
EGF-R 및 HER2/neu 발현 종양 세포의 이펙터 세포 매개 용해
단일쇄 이중- 및 삼중-특이적 분자 (931 및 934)도 이펙터 세포의 존재하에 EGF-R 및 HER2/neu를 발현하는 종양 세포의 세포 용해 (ADCC)를 매개하는지 여부에 대해 시험하였다. 인큐베이션 시간을 16 내지 18시간으로 하고, 이펙터 세포 (단핵구, PMN) 대 표적 세포 (SKBR-3, A431)의 양을 100:1로 하여 크롬 방출 분석을 수행하였다. 종양 세포 사멸은 특이적 용해를 매개하는지에 대해 형질감염된 (931 및 934) 상층액 및 형질감염되지 않은 (NSO) 상층액을 사용하여 검출하였다. 도 59b에 나타낸 바와 같이, 형질감염된 세포 (931 및 934)로부터의 상층액은 단핵구, PMN 및 전체 혈액의 세포 용해 (ADCC)를 매개하였다. 이들 연구에서, 인큐베이션 시간을 16 내지 18시간으로 하고, 이펙터 세포 (단핵구, PMN) 대 표적 세포 (SKBR-3, A431)의 양을 100:1로 하여 크롬 방출 분석을 수행하였다. 종양 세포 사멸은 특이적 용해를 매개하는지에 대해 형질감염된 (931 및 934) 상층액 및 형질감염되지 않은 (NSO) 상층액을 사용하여 검출하였다.
도 62 및 도 63은 각각 PMN 및 단핵구의 존재하에서 정제된 단일쇄 이중특이적 작제물인 931에 의한 SKBR-3 세포 (도 62a 및 63a) 및 BT474 세포 (도 62b 및 도 63b)의 이펙터 세포-매개 용해를 보여준다. 인큐베이션 시간을 16 내지 18시간으로 하고, 이펙터 세포 대 표적 세포의 양을 100:1로 하여 크롬 방출 분석을 수행하였다. 항-CD89 항체의 Fab-2 단편을 각 실험에서 음성 대조군으로 사용하였다.
또한, 2개의 가교 결합된 Fab' 항체 단편 (931 및 934 작제물에서의 단일쇄 항체와는 반대임)을 포함하는, 화학적으로 결합된 정제된 이중특이적 분자 14.1 x 3.F2 (도 58)을,51Cr로 표지된 SKBR-3 또는 BT-474 인간 종양 세포의 다형핵 (PMN) 세포, 단핵구 및 전체 혈액을 사용하여 ADCC 사멸에 대해 시험하였다. 37℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후, 배양 상층액으로 방출된51Cr의 분석에 의해 종양 세포 사멸량을 측정하였다. 이중특이적 분자의 존재하에서 종양 세포의 용해량으로서 (다형핵 세포만으로의 종양 세포 용해) 비용해도를 계산하였다. 도 64에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14.1 x 3.F2는 투여량에 의존적인 방식으로 HER2/neu를 발현하는 SKBR-3 및 BT-474 종양 세포 모두에서 PMN에 의한 세포 사멸을 매개하였다. 또한 도 65에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14.1 x 3.F2는 투여량에 의존적인 방식으로 HER2/neu를 발현하는 SKBR-3 및 BT-474 종양 세포 모두에서 단핵구에 의한 세포 사멸을 매개하였다. 이 2가지 경우, 14.1 Fab'210 ㎍/ml을 가하면 1 ㎍/ml의 이중특이적 분자 14.1 x 3.F2에 의한 종양 세포의 ADCC를 완전히 차단했는데, 이는 세포 사멸이 이펙터 세포에 대한 CD89의 결합에 의해서만 매개되었음을 입증해준다. 도 66은 이중특이적 분자 14.1 x 3.F2가 투여량에 의존적인 방식으로 HER2/neu를 발현하는 BT-474 종양 세포에서 전체 혈액에 의한 세포 사멸을 매개함을 보여준다.
총괄적으로, 앞선 연구들은 인간 모노클로날 항체 (단일쇄 및 Fab' 단편 포함)를 함유하는 이중- 및 삼중-특이적 분자의 생성에 관해 설명하고 있다. 또한, 이들 실시예는 이중- 및 삼중-특이적 분자가 이펙터 세포의 존재시에 HER2/neu 및 EGF-R을 발현하는 종양 세포의 사멸을 효과적으로 매개함을 입증해준다.
등가물
당업자라면 일상적인 실험만을 이용해서도 본원에 기재된 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 그러한등가물은 하기 청구항에 포함되는 것이다.

Claims (100)

  1. Fcα 수용체에 대한 제1 결합 특이적 부위 및 EGF 수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위를 포함하는 이중특이적 분자.
  2. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 결합 특이적 부위가 유전자적으로 융합된 것인 이중특이적 분자.
  3. 제1항에 있어서, 제1 결합 특이적 부위가 항체 또는 항체 단편인 이중특이적 분자.
  4. 제3항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 인간 항체 또는 항체 단편인 이중특이적 분자.
  5. 제4항에 있어서, 항체가 단일쇄 항체인 이중특이적 분자.
  6. 제4항에 있어서, 항체 단편이 Fab' 항체 단편인 이중특이적 분자.
  7. 제1항에 있어서, 제2 결합 특이적 부위가 EGF를 포함하는 것인 이중특이적 분자.
  8. Fcα 수용체에 결합하는 인간 항체 또는 그의 단편 및 그와 연결된 EGF를 포함하는 이중특이적 분자.
  9. Fcα 수용체에 결합하는 단일쇄 인간 항체 또는 그의 단편 및 그와 연결된 EGF를 포함하는 이중특이적 분자.
  10. Fcα 수용체에 대한 제1 결합 특이적 부위 및 HER2 수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위를 포함하는 이중특이적 분자.
  11. 제10항에 있어서, 제1 및 제2 결합 특이적 부위가 유전자적으로 융합된 것인 이중특이적 분자.
  12. 제10항에 있어서, 제1 결합 특이적 부위가 인간 항체 또는 그의 단편인 이중특이적 분자.
  13. 제12항에 있어서, 항체가 단일쇄 항체인 이중특이적 분자.
  14. 제13항에 있어서, 항체 단편이 Fab' 항체 단편인 이중특이적 분자.
  15. 제10항에 있어서, 제2 항체 또는 항체 단편이 인간 항체 또는 항체 단편인 이중특이적 분자.
  16. 제15항에 있어서, 항체가 단일쇄 항체인 이중특이적 분자.
  17. 제15항에 있어서, 항체 단편이 Fab' 항체 단편인 이중특이적 분자.
  18. Fcα 수용체에 대한 제1 결합 특이적 부위,
    HER2 수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위, 및
    EGF 수용체에 대한 제3 결합 특이적 부위
    를 포함하는 다중특이적 분자.
  19. 제18항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 결합 특이적 부위가 유전자적으로 융합된 것인 다중특이적 분자.
  20. 제18항에 있어서, 제1 결합 특이적 부위가 항체 또는 항체 단편인 다중특이적 분자.
  21. 제20항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 인간 항체 또는 항체 단편인 다중특이적 분자.
  22. 제21항에 있어서, 항체가 단일쇄 항체인 다중특이적 분자.
  23. 제21항에 있어서, 항체 단편이 Fab' 항체 단편인 다중특이적 분자.
  24. 제18항에 있어서, 제2 결합 특이적 부위가 항체 또는 항체 단편인 다중특이적 분자.
  25. 제24항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 인간 항체 또는 항체 단편인 다중특이적 분자.
  26. 제25항에 있어서, 항체가 단일쇄 항체인 다중특이적 분자.
  27. 제25항에 있어서, 항체 단편이 Fab' 항체 단편인 다중특이적 분자.
  28. 제18항에 있어서, 제3 결합 특이적 부위가 EGF를 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  29. Fcα 수용체에 결합하는 인간 항체 또는 그의 단편,
    HER2 수용체에 결합하는 인간 항체 또는 그의 단편, 및
    EGF
    를 포함하는 다중특이적 분자.
  30. 제29항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 결합 특이적 부위가 유전자적으로 융합된 것인 다중특이적 분자.
  31. 제29항에 있어서, 제1 및 제2 결합 특이적 부위가 단일쇄 항체 또는 항체 단편인 다중특이적 분자.
  32. Fcα 수용체에 대한 제1 결합 특이적 부위 및 EGF 수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위를 포함하는 이중특이적 분자와, EGF 수용체를 과다 발현하는 특징이 있는 종양 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 종양 세포의 이펙터 세포 매개의 세포 사멸을 유도하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 이중특이적 분자의 제1 및 제2 결합 특이적 부위가 유전자적으로 융합된 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 이중특이적 분자의 제1 결합 특이적 부위가 인간 항체 또는 항체 단편인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 항체가 단일쇄 항체 또는 Fab' 항체 단편인 방법.
  36. 제32항에 있어서, 이중특이적 분자의 제2 결합 특이적 부위가 EGF를 포함하는 것인 방법.
  37. Fcα 수용체에 결합하는 인간 항체 또는 그의 단편 및 그와 연결된 EGF를 포함하는 이중특이적 분자와, EGF 수용체 또는 HER2 수용체를 과다 발현하는 특징이 있는 종양 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 종양 세포의 이펙터 세포 매개의 세포 사멸을 유도하는 방법.
  38. Fcα 수용체에 대한 제1 결합 특이적 부위 및 HER2 수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위를 포함하는 이중특이적 분자와, HER2 수용체를 과다 발현하는 특징이 있는 종양 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 종양 세포의 이펙터 세포 매개의 세포 사멸을 유도하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 제1 또는 제2 결합 특이적 부위가 인간 항체 또는 그의 단편인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 항체가 단일쇄 항체 또는 Fab' 항체 단편인 방법.
  41. Fcα 수용체에 대한 제1 결합 특이적 부위,
    HER2 수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위, 및
    EGF 수용체에 대한 제3 결합 특이적 부위
    를 포함하는 다중특이적 분자와, EGF 수용체 또는 HER2 수용체를 과다 발현하는 특징이 있는 종양 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 종양 세포의 이펙터 세포 매개의 세포 사멸을 유도하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 다중특이적 분자의 제1, 제2 및 제3 결합 특이적 부위가 유전자적으로 융합된 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 제1 또는 제2 결합 특이적 부위가 인간 항체 또는 항체 단편인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 항체가 단일쇄 항체 또는 항체 단편인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 제3 결합 특이적 부위가 EGF를 포함하는 것인 방법.
  46. Fcα 수용체에 결합하는 인간 항체 또는 그의 단편,
    HER2 수용체에 결합하는 인간 항체 또는 그의 단편, 및
    EGF
    를 포함하는 다중특이적 분자와, EGF 수용체 또는 HER2 수용체를 과다 발현하는 특징이 있는 종양 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 종양 세포의 이펙터 세포 매개의 세포 사멸을 유도하는 방법.
  47. a) 항원 표출 세포의 표면 성분에 대한 2개 이상의 결합 특이적 부위, 및
    b) 상기 결합 특이적 부위에 연결된 하나 이상의 항원
    을 포함하며, 상기 항원 표출 세포의 표면 성분이 결합 특이적 부위와 결합할 때 분자 복합체의 인터날리제이션 (internalization)을 매개하는 것인 분자 복합체.
  48. 제47항에 있어서, 상기 복합체가 3개 이상의 결합 특이적 부위를 포함하는 것인 분자 복합체.
  49. 제47항에 있어서, 1개 이상의 결합 특이적 부위가 항원 표출 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)에 결합하는 것인 분자 복합체.
  50. 제47항에 있어서, 상기 결합 특이적 부위가 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 분자 복합체.
  51. 제50항에 있어서, 상기 항체가 Fc 수용체 (FcR)에 결합하는 것인 분자 복합체.
  52. 제51항에 있어서, 상기 FcR이 Fcγ 수용체인 분자 복합체.
  53. 제52항에 있어서, 상기 Fcγ 수용체가 FcγRⅠ인 분자 복합체.
  54. 제47항에 있어서, 1개 이상의 결합 특이적 부위가 H22 (ATCC 기탁번호 CRL11177), M22 (ATCC 기탁번호 HB12147), M32.2 (ATCC 기탁번호 HB9469) 또는 이들의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 항체를 포함하는 것인 분자 복합체.
  55. 제47항에 있어서, 상기 결합 특이적 부위가 상기 세포 표면 성분의 동일한 에피토프와 결합하는 것인 분자 복합체.
  56. 제47항에 있어서, 상기 결합 특이적 부위가 상기 세포 표면 성분의 상이한 에피토프들과 결합하는 것인 분자 복합체.
  57. 제47항에 있어서, 상기 결합 특이적 부위가 상이한 세포 표면 성분들과 결합하는 것인 분자 복합체.
  58. 제47항에 있어서, 상기 항원이 상기 결합 특이적 부위에 화학적으로 연결된 것인 분자 복합체.
  59. 제47항에 있어서, 상기 항원이 상기 결합 특이적 부위와 재조합적으로 융합된 것인 분자 복합체.
  60. 제47항에 있어서, 상기 항원이 종양 항원인 분자 복합체.
  61. 제59항에 있어서, 상기 종양 항원이 유방암, 육종, 암종 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인 분자 복합체.
  62. 제47항에 있어서, 상기 항원이 자가항원인 분자 복합체.
  63. 제47항에 있어서, 상기 항원이 자기항원인 분자 복합체.
  64. 제47항에 있어서, 상기 항원이 FcγRⅠ에 결합하는 것인 분자 복합체.
  65. 제47항에 있어서, 상기 항원이 H22 (ATCC 기탁번호 CRL11177), M22 (ATCC 기탁번호 HB12147), M32.2 (ATCC 기탁번호 HB9469) 또는 이들의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 항체를 포함하는 것인 분자 복합체.
  66. 제47항에 있어서, 상기 항원이 항체 520C9 (ATCC 기탁번호 HB8696) 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 분자 복합체.
  67. a) 항원 표출 세포의 표면 성분에 대한 2개 이상의 결합 특이적 부위, 및
    b) 상기 결합 특이적 부위에 연결된 하나 이상의 항원
    을 포함하며, 상기 항원 표출 세포의 표면 성분이 결합 특이적 부위와 결합할 때 분자 복합체의 인터날리제이션을 매개하게 되는 성분인 분자 복합체를 대상체에게 투여하여 대상체에서 상기 항원에 대한 면역 반응을 증진시키거나 유도하는 것을 포함하는, 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 증진시키는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 분자 복합체가 3개 이상의 결합 특이적 부위를 포함하는 것인 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 1개 이상의 결합 특이적 부위가 항원 표출 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)에 결합하는 것인 방법.
  70. 제67항에 있어서, 상기 결합 특이적 부위 중 1개 이상이 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 항체가 Fc 수용체 (FcR)에 결합하는 것인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 Fc 수용체가 FcγRⅠ 수용체인 방법.
  73. 제67항에 있어서, 1개 이상의 상기 결합 특이적 부위가 H22 (ATCC 기탁번호 CRL11177), M22 (ATCC 기탁번호 HB12147), M32.2 (ATCC 기탁번호 HB9469) 또는 이들의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 항체를 포함하는 것인 방법.
  74. 제67항에 있어서, 상기 결합 특이적 부위가 상기 세포 표면 성분의 동일한 에피토프에 결합하는 것인 방법.
  75. 제67항에 있어서, 상기 결합 특이적 부위가 상기 세포 표면 성분의 상이한 에피토프들과 결합하는 것인 방법.
  76. 제67항에 있어서, 상기 항원이 상기 결합 특이적 부위에 화학적으로 연결된 것인 방법.
  77. 제67항에 있어서, 상기 항원이 상기 결합 특이적 부위와 재조합적으로 융합된 것인 방법.
  78. 제67항에 있어서, 상기 항원이 종양 항원인 방법.
  79. 제67항에 있어서, 상기 항원이 자가항원인 방법.
  80. 제67항에 있어서, 상기 항원이 자기항원인 방법.
  81. a) 항원 표출 세포의 표면 성분에 대한 2개 이상의 결합 특이적 부위, 및
    b) 상기 결합 특이적 부위에 연결된 하나 이상의 항원
    을 포함하며, 상기 결합 특이적 부위와의 결합시 상기 성분에 의해 인터날리제이션되는 분자 복합체의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 면역화 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 분자 복합체가 3개 이상의 결합 특이적 부위를 포함하는 것인 방법.
  83. 제81항에 있어서, 1개 이상의 결합 특이적 부위가 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 항체가 Fc 수용체 (FcR)에 결합하는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 Fc 수용체가 FcγRⅠ 수용체인 방법.
  86. 제81항에 있어서, 1개 이상의 상기 결합 특이적 부위가 H22 (ATCC 기탁번호 CRL11177), M22 (ATCC 기탁번호 HB12147), M32.2 (ATCC 기탁번호 HB9469) 또는 이들의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 항체를 포함하는 것인 방법.
  87. 제81항에 있어서, 상기 결합 특이적 부위가 상기 세포 표면 성분의 동일한 에피토프에 결합하는 것인 방법.
  88. 제81항에 있어서, 상기 결합 특이적 부위가 상기 세포 표면 성분의 상이한 에피토프들과 결합하는 것인 방법.
  89. 제81항에 있어서, 상기 항원이 상기 결합 특이적 부위와 화학적으로 연결된 것인 방법.
  90. 제81항에 있어서, 상기 항원이 상기 결합 특이적 부위에 재조합적으로 융합된 것인 방법.
  91. 제81항에 있어서, 상기 항원이 종양 항원인 방법.
  92. 제81항에 있어서, 상기 항원이 자가항원인 방법.
  93. 제81항에 있어서, 상기 항원이 자기항원인 방법.
  94. 결합 특이적 부위와의 결합시 항원의 인터날리제이션을 매개하는 성분인 항원 표출 세포의 표면 성분에 대한 2개 이상의 결합 특이적 부위와 연결된 항원을 항원 표출 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 항원 표출 세포에 의한 항원 표출을 유도하거나 증진시키는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 항원이 3개 이상의 결합 특이적 부위에 연결된 것인 방법.
  96. 제94항에 있어서, 상기 결합 특이적 부위가 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fab' 단편 또는 sFv 단편을 포함하는 것인 방법.
  98. 제96항에 있어서, 상기 항체가 Fc 수용체 (FcR)에 결합하는 것인 방법.
  99. 제96항에 있어서, 상기 항원이 종양 항원인 방법.
  100. 제96항에 있어서, 상기 항원이 자기항원인 방법.
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