JP2003522128A - 抗Fc受容体結合薬からなる治療用化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
号の一部継続出願であり、それは1998年11月6日に出願された米国出願第
09/188,082号の一部継続出願であり、それは発行された米国特許第5
,837,243号となっている、1996年6月7日に出願された米国出願第
08/661,052号の一部継続であって、それは1995年6月7に出願さ
れ、「抗Fc受容体抗体からなる治療用化合物」と題された米国出願第08/4
84,172号の一部継続出願である。上記の各出願の全ての内容及びそこに引
用された全ての参照文献、発行された特許及び公開特許出願は、本明細書に言及
により編入される。
は、N(NH2)末端抗原結合可変ドメインと、抗体のエフェクター機能を担う
C(COOH)末端恒常ドメインと、を含む。免疫グロブリンのH鎖のC末端ド
メインは、Fc(結晶断片)領域を形成し且つFc受容体(FcR)として知ら
れる特異的な受容体との相互作用を介して細胞活性を惹起させることに関与する
。全ての免疫グロブリンのクラス、もしくはアイソタイプ、に関するFc受容体
(例えば、免疫グロブリンG(IgG特異的Fc受容体、FcγR)、免疫グロ
ブリンE(IgE特異的Fc受容体、FcεR)、免疫グロブリンA(IgA特
異的Fc受容体、FcαR)、免疫グロブリンM(IgM特異的Fc受容体、F
cμR)および免疫グロブリンD(IgD特異的Fc受容体、FcδR)が特定
されている。種々のアイソタイプの抗体の様々な生物学的活性の一部は、種々の
免疫(エフェクター)細胞表面上で発現した種々のFc受容体に結合するこれら
アイソタイプの能力による(Fridman, W.H.(Sept. 1991) The FASEB Jounal Vol
. 5. 2684-2690)。FcRを標的にするマウス抗体が作製されている(例えば、
「ヒト一核性貪食細胞上の、免疫グロブリンGに関するFc受容体に対するモノ
クローナル抗体」と題された米国特許第4,954,617号および「免疫グロ
ブリンA受容体に関して特異的なモノクローナル抗体」と題された国際特許出願
公報第WO91/5871号を参照されたい)。
免疫不全ウイルスのような病原体によって汚染されることなく作製できる。しか
し、マウスのモノクローナル抗体をヒトの治療に用いると、これら「異物の」マ
ウスのタンパク質に対する免疫反応が生じる場合がある。こうした反応は、ヒト
抗マウス抗体、即ちHAMA反応(Schroff, R. et al. Cancer Res., 45, 879-
885)と呼ばれており、ヒトの血清病を発症させかつ個体の血中からマウス抗体
の急速なクリアランスが生じる一つの状態である。ヒトの免疫反応は、マウスの
免疫グロブリンの可変および恒常領域の双方に対するものであることが分かって
いる。
ロブリン領域を、別の種から得た免疫グロブリン領域で置換することによって、
抗体を変更させることができる。Neuberger等(特許協力条約に基づく特許出願
第PCT/GB85/00392号)が、ある種から得た免疫グロブリン分子の
相補的なH鎖およびL鎖可変ドメインを、別の種から得た免疫グロブリンの相補
的なH鎖およびL鎖恒常ドメインと結合可能にする方法を記載している。こうし
た方法を用いることで、マウスの恒常領域ドメインで置換して、ヒトの治療に使
用可能な「キメラ」抗体を作製してもよい。Neuberger等の記載のように作製さ
れたキメラ抗体は、補体結合のような抗体媒介エフェクター機能を効率的に刺激
するヒトFc領域を有しているが、マウスの(「異物の」)可変領域に対するヒ
トの免疫反応を誘発するポテンシャルを依然として保有する。
R)を、別の種から得た相補性決定領域で置換することによって、抗体を変更す
る方法を記載している。この方法を用いることで、ヒトのH鎖およびL鎖免疫グ
ロブリン可変領域ドメインを、所望の特性(例えば、ヒトの病原体に対するよう
な)を有するモノクローナル抗体のマウス可変領域ドメインから得たCDRに置
換してもよい。このような変更された免疫グロブリン可変領域は、次にヒト免疫
グロブリン恒常領域と結合して、置換されたマウスCDRを除いて、組成が完全
にヒトである抗体を作製することができる。Winterの記載による「再構築された
」つまり「ヒト化された」抗体は、マウスの成分が著しく少ないので、キメラ抗
体に比べて、ヒトにおける免疫反応が著しく抑制されるようになる。さらに、血
中における変更された抗体の半減期は、本来のヒト抗体の半減期にほぼ等しいは
ずである。しかし、Winterが述べているように、ウイルス性もしくは病原性のタ
ンパク質のような抗原に関して特異的な、別の抗体から得た相補的なCDRで、
ヒトのCDRを置き換えるだけでは、所望の結合能を保持する変更された抗体が
必ずしも得られるとは限らない。実際に、抗体可変領域のフレームワークにおけ
るアミノ酸には、これらのCDRを構成するアミノ酸残基と相互作用するものが
あり、抗原結合を再生するにはヒトの免疫グロブリン領域にアミノ酸置換が必要
となる場合が多い。
体)が調製され、例えば、癌(乳癌又は卵巣癌など)又は病原性感染症(ヒト免
疫不全ウイルスなど)処置などの治療に用いられている(例えば、「二重エフェ
クター機能を有する二重特異的異種抗体」と題した国際特許出願公開第WO91
/05871号および「AIDS治療のための二重特異的試薬」と題した国際特
許出願公開第WO91/00360号を参照されたい)。さらに、抗原および抗
原提示細胞を認識する二重特異的分子を被験体に投与して免疫反応を刺激するこ
とができる(例えば、「二重特異的試薬で標的を決められた免疫刺激」と題した
国際特許出願公開第WO92/05793号を参照されたい)。
を提供する。これらの分子が「多重特異的」であるのは、これらが多くの(二つ
又はそれ以上の)別個の標的に結合するからであり、それらの標的の一つに、エ
フェクター細胞及び/又は抗原提示細胞(APC)のような免疫細胞の表面上の
分子がある。好適な免疫細胞標的には、Fc受容体、具体的には、IgD特異的
Fc受容体I型(FcδRI)およびIgA特異的Fc受容体(FcαR)が含
まれる。
Fc受容体のような分子に結合する少なくとも一つの部分と、腫瘍細胞又は病原
体の表面上の抗原のような異なる標的に結合する少なくとも一つの部分(例えば
、二つ、三つ又はそれ以上の部分)とからなる分子を含む。よって、これらの分
子を用いることで、エフェクター細胞を媒介にして標的の脱離を誘導することが
できる。好適な実施例においては、これらの多重特異的分子は、結合特異的部分
として、ヒト抗体又はヒト化抗体(もしくは抗体フラグメント)を包含する。
表面上の、一つ又はそれ以上の抗原と結合したFc受容体のような分子に結合す
る多くの(即ち、二つ又はそれ以上の)部分からなる抗原「マルチマー複合体」
を含む。自己抗原のような、APCに対するこれらのマルチマー複合体標的抗原
は、APCによる抗原のエンドサイトーシス、プロセシング及び/又は提示を誘
導及び/又は増強する。よって、これらの分子を用いて、自己抗原のような通常
は非免疫性のタンパク質に対して、インビビオ又はインビトロの何れでも免疫反
応を誘導又は増強させることができる。
随意に、第三の標的に対して向けられた第三の部分を包含する多重特異的分子を
特徴とする。この第三の部分は、本明細書において「抗増強因子」(抗EF)と
も呼ばれるが、例えば、これらの抗体もしくは抗体フラグメント、又は細胞受容
体リガンドでもよい。好適な一実施例においては、多重特異的分子は、結合特異
的部分として、ヒト又はヒト化抗体(もしくは抗体フラグメント)を包含する。
においては、両方の特異的部分が同じベクターにおいてコード化され、また、例
えば、二重特異的分子又は融合タンパク質として、一つの宿主細胞において発現
かつ結合される。別の一実施例では、それぞれの結合特異的部分は、別々に生成
された(例えば、組換え型で)後、例えば、抗体の場合では、H鎖のC末端ヒン
ジ領域のスルフヒドリル結合を介して相互に化学的に共役される。
又はそれ以上の結合特異的部分を包含する多重特異的分子(本明細書において「
抗原マルチマー複合体」とも呼ぶ)を特徴とする。これらの結合特異的部分は、
抗原提示細胞の表面上の成分(Fc受容体のような)に結合され、このFc受容
体は、これらの結合特異的部分と結合されると分子複合体の内部移行に介在する
能力を有する。好適な一実施例においては、この分子複合体は、三つ又はそれ以
上の結合特異的部分を包含し、かつこれらの結合特異的部分の内の少なくとも一
つが、Fc受容体(例えば、FcδRI又はFcαR)に対して特異的である。
特に好適な一実施例においては、抗原は、非複合体の形態で投与される場合は、
非免疫原性である。
て、被験体における抗原に対する免疫反応を誘導又は増強させる方法を特徴とす
る。さらに本発明は、被験体に本発明の抗原マルチマー複合体を投与することに
よって、被験体を免疫化する方法も含む。
いられ、エフェクター細胞が介在して標的細胞を殺す。一つの具体的な実施例に
おいては、多重特異的分子を用いて腫瘍細胞の変種を殺したり、又はその成長を
阻害したりする。
関する。これらの分子が「特異的」であるのは、それらが多数の(二つ又はそれ
以上の)、別個の標的に結合するからであり、その標的の一つは免疫細胞表面上
の分子である。一実施例においては、本発明の多重特異的分子は、エフェクター
細胞表面上の分子、好ましくはFc受容体に結合する少なくとも一つの部分から
なる分子と、腫瘍細胞又は病原体上の抗原のような種々の標的に結合する少なく
とも一つの部分(例えば、二つ、三つ、四つ又はそれ以上の部分)と、からなる
分子を含む。別の実施例においては、本発明の多重特異的分子は、抗原提示細胞
(APC)表面上の、一つ又はそれ以上の抗原と結合したFc受容体のような分
子に結合する多くの(即ち、二つ又はそれ以上の)部分からなる抗原「マルチマ
ー複合体」を含む。APCに対するこれらのマルチマー複合体標的抗原(自己抗
原のような)は、APCによる抗原のエンドサイトーシス、プロセシング及び/
又は提示を誘導及び/又は増強する。よって、これらの分子を用いて、自己抗原
のような通常は非免疫性のタンパク質に対して、インビボ又はインビトロの何れ
でも免疫反応を誘導又は増強させることができる。
的にはFcδR(例えば、FcδRI)又はFcαRに結合する、ヒト又はヒト
化(キメラ)抗体もしくは抗体フラグメントを含む。これらの多重特異的分子は
さらに、別の標的細胞(例えば、腫瘍細胞)表面上の抗原に結合する、リガンド
及び/又は別のヒト抗体もしくは抗体フラグメントのような一つ又はそれ以上の
結合特異的部分を含む。このような多重特異的分子は、化学的に結合させるか或
いは融合タンパク質として遺伝子的に発現させることができる。さらには、これ
らの分子は、例えば、FcδRI又はFcαRを介してエフェクター細胞を標的
にするので、それらを用いてエフェクター細胞(例えば、多形核好中球(PMN
)、マクロファージ及び単球)を媒介にして標的細胞(例えば、腫瘍細胞)を殺
すのを誘導できるし、或いは抗原に結合されている場合は、それらの分子を用い
て抗原提示(AP)エフェクター細胞(例えば、樹状細胞)による抗原提示を増
強させることもできる。
結合する部分」という用語は、「に関する結合特異的部分」という用語と同義に
用いられる。両者は、標的エピトープに結合する多重特異的分子の領域を指す。
以下にさらに記載する如く、これらの部分もしくは結合特異的部分には、抗体、
抗体フラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv又は単鎖
Fv)及びそれらのミメティック(例えば、ペプチド、抗体もしくは抗体フラグ
メントの結合を「模倣する」化学的及び有機的ミメティック)を含むが、これら
に限定されない、標的エピトープに結合する能力がある任意の化合物が含まれる
。適切な抗体および抗体フラグメントには、マウス、ヒト化(キメラ)、単鎖お
よびヒトのモノクローナル抗体及びそのフラグメントが含まれるが、これらに限
定されない。一実施例においては、これら結合特異的部分には、H22(ATC
C預託番号CRL11177)、M22(ATCC預託番号HB12147)、
M32.2(ATCC預託番号HB9469)から選択した一つ又はそれ以上の
抗体及びその抗原結合フラグメントが含まれており、それらの各々が、FcγR
I(CD64)に結合する。ヒト化抗体H22及びそのマウス同等物M22は、
自然のリガンド(IgG)結合部位の外でFcγRIに結合する利点を提供し、
よってインビボ投与時に内生的リガンドによって妨害又は排除されることがない
。他の実施例においては、これらの結合特異的部分には、FcαR(CD89)
に結合するヒトモノクローナル抗体14.1及びHER2に結合するヒトモノク
ローナル抗体3.F2から選択された一つ又はそれ以上の抗体が含まれる。
いう用語は、 ある抗原(例えば、Fc受容体)に特異的に結合した能力を保持
する抗体の一つ又はそれ以上のフラグメントを指す。ある抗体の抗原結合作用が
、完全長抗体のフラグメントによって実現され得ることが分かっている。抗体の
「抗原結合性部分」という用語で網羅される結合フラグメントの例には、(i)
抗原結合性フラグメント(Fab)、即ち、VL、VH、CHIドメインからな
る1価フラグメント、(ii)F(ab’)2フラグメント、即ち、ヒンジドメ
インにおいてジスルフィド架橋によって結合された二つのFabフラグメントを
包含する2価フラグメント、(iii)VH及びCHIドメインからなるFdフ
ラグメント、(iv)抗体の単一アームのVL及びVHドメインからなるFvフ
ラグメント、(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al., (
1989)Nature 341: 544-546)及び(vi)単離した相補性決定領域(CDR)
が含まれる。さらに、Fvフラグメントの二つのドメイン、即ち、VL及びVH
は、別個の遺伝子によって遺伝コードを指定されるが、これらのドメインは、組
換え法を用いて、VL及びVH領域が対になって1価分子を形成する単一タンパ
ク質鎖としてこれらのドメインを形成させることができる合成リンカーによって
結合し得る(単鎖Fv(scFv)として既知であり、例えば、Bird et al. (1
988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 85:5879-5883を参照されたい)。このような単鎖の抗体が、抗体の「抗原
結合性部分」という用語に網羅されることも思料する。これらの抗体フラグメン
トは、当業者に既知の通常の技法を用いて得られ、また無傷の抗体と同じ態様で
、スクリーニングされて利用される。
特異的分子
以上の抗原に結合した成分(APC細胞表面成分)を標的とする複数の部分又は
結合特異的部分を含む。多重結合特異的部分は、APC細胞表面成分上の同じか
又は異なるエピトープ、又は種々のAPC細胞表面成分と結合することができる
。好適な一実施例においては、マルチマー複合体は、一つ又はそれ以上のAPC
細胞表面成分に関して少なくとも三つのこれら結合特異的部分を含む。APC表
面の標的にするのに適切な成分には、結合特異的部分によって結合されると、結
合特異的部分に結合した抗原が効率よく内部移行され且つAPCによって提示さ
れるように、その内部移行を媒介するものが含まれている。
語は、免疫系(例えば、クラスIIMHC制限ヘルパーTリンパ球)によって認
識され得るような態様で、抗原決定因子が、主要組織適合遺伝子複合体(MHC
)としてこの細胞表面に提示されるように、抗原を内部移行且つプロセシングす
る能力を有する免疫細胞を指す。細胞をAPCとして機能させることができる必
須の二つの特性は、内部移行された抗原を、プロセシングする能力及びクラスI
IMHC遺伝子産生物の発現である。最もよく定義された、ヘルパーT細胞に関
するAPCには、単核貪食細胞(例えば、マクロファージ)、Bリンパ球、樹状
細胞、皮膚のランゲルハンス細胞及び、ヒトにおいては、内皮細胞が含まれる。
は、Fc受容体、典型的にはFcγRである。したがって、本発明の一実施例で
は、マルチマー複合体は、FcγRI上の種々のエピトープを標的にする多重結
合特異的部分(例えば、二つ又はそれ以上の、好ましくは三つ又はそれ以上の)
を含む。あるいは、このマルチマーは、FcγRI上の同一のエピトープを標的
にする多重結合特異的部分を含んでもよい。しかし、他の適切なAPC細胞表面
成分を標的にすることもできる。このような成分の識別は、例えば、ある動物(
例えば、ヒトFcγRIに関して遺伝子導入したマウス)をAPCで免疫化し、
例えば、標準的(ウェスタン法など)アッセイなどを用いて、その動物から採取
した血清が結合した細胞表面成分を測定することによって可能となる。次に、こ
れらのAPC細胞表面成分は、この成分と結合する化合物を内部移行する能力の
有無を実験できる。
体もしくはそのフラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、F
v又は単鎖Fv)を含み、この抗体もしくはそのフラグメントは、ヒトの免疫グ
ロブリンG(IgG)受容体(例えば、FcγRI(CD64)、FcγRII
(CD32)及びFcγRIII(CD16))等のFcガンマ受容体(Fcγ
R)のような、一つのFc受容体に結合する。好適なFcガンマ受容体は、高親
和性Fcガンマ受容体、即ち、FcγRIである。しかし、他のFc受容体、例
えば、ヒトの免疫グロブリンA(IgA)受容体(FcαRI等)等も標的にし
てもよい。Fc受容体は、APC(例えば、単球もしくはマクロファージ)の表
面上に存在している。一実施例においては、マルチマー複合体は、受容体の免疫
グロブリン(例えば、IgG又はIgA)結合部位とは別個の部位においてFc
受容体に結合する。したがって、マルチマー複合体の結合が、生理学的レベルの
免疫グロブリンによっては妨害されることはない。好適なヒト化された抗Fcγ
Rモノクローナル抗体は、国際特許協力条約に基づく特許出願第WO94/10
332号及び米国特許第4,954,617号において記載されており、それら
の教示は、言及により本明細書に全て編入されている。
に適切な、特定のヒト化された及びマウスのモノクローナル抗FcγRI抗体及
び抗体フラグメントは、ヒト化抗体H22(ATCC預託番号CRL11177
)、そのマウス対応物M22(ATCC預託番号HB12147)及びマウスM
32.2(ATCC預託番号HB9469)と、これらの抗体の抗原結合フラグ
メントとを含むが、これらに限定されない。
抗原を含む。ここで用いる「抗原」という用語は、免疫細胞によって認識され得
る(例えば、T細胞を介した免疫反応のように免疫反応を惹起するような)任意
の分子(例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物など)を指す。抗原の中には
、通常は宿主内に存在するが、その宿主からの免疫反応を惹起することがない(
つまり、その免疫系が抗原を「異物」ではなく「自己」と認識するからである)
「自己抗原」(self antigens or autoantigens)が含まれる。疾患の中には、
通常は宿主内に存在せず、よって宿主の免疫系による免疫反応を惹起するはずの
抗原が免疫反応を起こさないものがある。換言すれば、これらの抗原は、宿主の
免疫系による認識を「逃れる」のである。このような抗原には、例えば、ある種
の腫瘍抗原及び病原性の(ウイルス及び細菌性)抗原が含まれる。このような状
態においては、抗原又は抗原を産生する細胞/生体が宿主から排除するべく、免
疫細胞がその抗原を認識するのを誘導又は増強させるようにその抗原を改変する
ことが望ましいであろう。換言すれば、免疫細胞がその抗原をもはや「自己抗原
」として認識しないように、その抗原を変更する。
の標準的な架橋試薬及び共役プロトコルを用いて、APC表面の成分に関する多
数の(二つ又はそれ以上の)結合特異的部分に、一つ又はそれ以上の抗原を化学
的に結合することによって調製できる。あるいは、抗原マルチマー複合体は、同
様にここで記載されるように、単一の融合タンパク質として組換えによって作製
することができる。
コード化する核酸を提供する。一般的には、核酸は、発現ベクター内で、マルチ
マー複合体の発現を制御する促進因子(プロモーター)及び他の遺伝子調節配列
に作用的に結合する。核酸は、それが別の核酸配列と作用的な関係に配置される
と、「作用的に結合」すると言う。例えばプロモーター又はエンハンサーは、そ
れが配列転写に作用する場合、コードする配列に作用的にする。転写調節配列に
関しては、作用的に結合する、とは、結合されるDNA配列が連続しており、且
つ二つのタンパク質をコードする領域を結合する必要のある箇所では、連続かつ
解読枠内にあることを意味する。スイッチ配列に関しては、作用的に結合する、
とは、それらの配列がスイッチ組換えを引き起こすことを意味する。
された別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指すものとする。一つのベク
ターのタイプは、「プラスミド」であり、付加的DNA染色体部分が結合するこ
とができる環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルス
性ベクターであり、付加的DNA染色体部分がウイルスのゲノムに結合できる。
あるベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製ができる(例
えば、細菌性複製起点を有する細菌性ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター)
。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳類ベクター)は、宿主細胞へ導入さ
れると、その宿主細胞のゲノムと一体化することができ、それによってその宿主
ゲノムと共に複製される。更に、あるベクターは、それらが作用的に結合する遺
伝子の発現を支配することができる。本明細書では、このようなベクターを、「
組換え発現ベクター」(もしくは単に「発現ベクター」)と呼ぶ。一般的には、
組換えDNA技術において利用される発現ベクターは、プラスミドの形態である
ことが多い。プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であり、本明
細書においては、「プラスミド」及び「ベクター」を同義で用いることができる
。しかし、本発明は、ウイルス性ベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、
アデノウイルスおよびアデノ関連性ウイルス)のような、同等の作用を果たすこ
のような他の発現ベクターの形態も含めることを思料する。
、組み換え発現ベクターが導入された細胞を指すものとする。このような用語は
、特定の被験体細胞ばかりでなく、このような細胞の子孫をも指すものであるこ
とを理解すべきである。世代が続く内に変異又は環境の影響の何れかによって何
らかの変更が生じることがあるので、このような子孫は、実際には親細胞とは同
一でないことがあり得るが、本明細書において用いられる「宿主細胞」という用
語の範囲内に依然として包含される。
の内部移行、プロセシング及び発現を誘導又は増強させるのに用いることができ
る。したがって、本発明はさらに、被験体に有効量の抗原マルチマー複合体を投
与することによって、抗原に対する免疫反応を誘導又は増強する方法を提供する
。例えば、抗原マルチマー複合体を投与して、自己抗原(免疫系によって認識さ
れない腫瘍抗原を含む)に対する免疫反応を誘導したり、或いは腫瘍抗原もしく
は病原体の成分のような抗原に対する免疫反応を増強する。よって、抗原マルチ
マー複合体は、宿主を免疫化するワクチンとして用いることもできる。
的細胞、病原体、アレルゲン又は他の実体をエフェクター細胞を介して排除する
ように設計された分子を含む。したがって、本発明は、別の態様においては、エ
フェクター表面の成分、典型的にはFc受容体に結合する少なくとも一部分と、
腫瘍細胞又は病原体表面の抗原のような別の標的に結合する少なくとも一部分(
例えば、二つ、三つ、四つ又はそれ以上の部分)と、からなる多重特異的分子を
提供する。
ター細胞は、特異的なFc受容体を発現し、かつ特異的な免疫作用を果たす。例
えば、単球、マクロファージ、好中球及び樹状細胞は、FcγRI及びFcαR
を発現するが、それらは標的細胞を特異的に殺すこと及び免疫系の他の成分に対
して抗原を提示することの双方に関与している。よって、FcγRI及びFcα
Rは、これらのエフェクター細胞タイプのそれぞれの表面上おいて発現するので
、それらの受容体は、本発明において使用するのに好ましいトリガー標的である
。さらに、エフェクター細胞上の特定のFcRの発現は、サイトカインのような
体液性因子によって制御され得る。例えば、FcγRIは、インターフェロンガ
ンマ(IFN−γ)によって上方制御されることが分かっている。このような増
強された発現によって、FcγRI細胞の標的に対する細胞障害活性が増大する
。
ェクター細胞表面の成分に結合する一つ又はそれ以上の結合特異性もしくは部分
を有している。一実施例においては、この結合特異的部分は、本明細書で既に記
載した如く、抗体又は抗体フラグメント(例えば、Fab’又は単鎖Fv)によ
って提供される。一実施例では、この抗体又は抗体フラグメントは、ヒトのもの
であるか又はヒト化されている(即ちヒト抗体由来であるが、非ヒト抗体由来の
相補性決定領域(CDR)の少なくとも一部分を有しており、この部分は、例え
ば、ヒトFc受容体に関する、ヒト化抗体の特異的部分を提供するように選択さ
れている)。ヒト化抗体は、非ヒト抗体由来のCDRを有するが、この抗体分子
の残余の部分はヒトである。
ab’)2フラグメント等、その任意のフラグメントを有していてもよい。この
抗体はさらに、L鎖二量体もしくはH鎖二量体、又はFv又は単鎖構成体のよう
な、その最小限の任意のフラグメントであってもよく、これらのフラグメントは
、Ladner等(1990年8月7日付けで発行された米国特許第4,946,77
8号)において記載されており、その内容は言及により明示的に本明細書に編入
されている。このヒト化抗体又はフラグメントは、非ヒトCDRを保持できる任
意のヒト抗体でよい。好適なヒト抗体は、H鎖可変領域(VH)に関する既知の
タンパク質NEWM及びKOL、及び免疫グロブリンκ鎖可変領域(VK)に関
するタンパク質REIから由来するものである。
できるように十分な部分が選択される。十分な数の部分を選択するには、このC
DRの一部をヒト抗体へ挿入し、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)を用い
て作製されたヒト化抗体の結合能を実験することで可能である。
も、或いはこれらのCDRの幾つかだけを非ヒトCDRと置換してもよい。ただ
必要なことは、Fc受容体にヒト化CDRを結合させるのに必要な数のCDRを
置換することである。マウスモノクローナル抗体(mab)、即ち、mab22
由来の非ヒトCDRは、その内容を言及により本明細書に全て編入する国際特許
出願公開第WO94/10332号において記載されている。このmab22抗
体は、Fc受容体に対して特異的であり、1988年9月4日付けで発行された
米国特許第4,954,617号にさらに詳細に記載されており、その内容も言
及により明示的に編入されている。セルラインを作製するヒト化mab22抗体
は、指定HA002CL1の下に1992年9月4日付けでアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(ATCC)に保管され、預託番号CRL1117
7を有する。
由来の一つのCDRと置換することができる任意の方法によって実行してよい。
Winterが、本発明によるヒト化抗体の調製に使用できる方法を記載しており(1
987年3月26日付け出願の英国特許出願第GB2188638A号)、その
内容は言及により明示的に本明細書に編入する。「免疫グロブリンGに関する、
ヒト単核貪食細胞上のFc受容体に対するヒト化抗体」と題された国際特許出願
公開第WO94/10332号において記載のオリゴヌクレオチド特定部位の変
異誘発を用いて、ヒトCDRを非ヒトCDRと置換してもよい。
)、機能的抗体フラグメント、又は、病原体(例えば、ウイルス、細菌、真菌類
)、病原体感染細胞、癌もしくは腫瘍細胞(例えば、乳房、卵巣、前立腺など)
もしくは被験体(例えば、ヒト又は動物)内の他の有害細胞もしくはそれらの抗
原もしくは改変された形態、を認識かつ結合するリガンドを包含し得る。更に、
標的部分は、抗原を包含したり又はそれを標的にすることができる。好適な実施
例には、免疫系を刺激し、例えば慢性感染症の場合は、リンパ系の抗原を減少さ
せ、また腫瘍を治療するのに使用できる抗原が含有されている。とりわけ好適な
一実施例には、抗FcR抗体を含有する多価分子に付着する抗原が含まれている
。
ガンドは、分子と相互作用するものなら何れのリガンドでもよい。好適な一実施
例においては、このリガンドは、タンパク質に、例えば、癌細胞のような標的細
胞上の表面タンパク質に、結合する。好適なリガンドは、成長もしくは分化因子
のような、受容体に対するリガンドを含む。例えば、多価分子は、上皮成長因子
又は受容体(例えば、上皮成長因子受容体)と相互作用することができる少なく
とも一部分もしくは改変された形態を包含する。別の好適な実施例においては、
リガンドは、ボンベシンのような小ペプチド、胃酸分泌ホルモン(GRP)、リ
トリン(原語:litorin)、ニューロメジンB(原語:neuromedin B)又はニュ
ーロメジンC(原語:neuromedin C)である。これらのペプチドの配列は、例え
ば、ここにその内容が言及によって編入される米国特許第5,217,955号
において見いだすことができる。リガンドは、これら内の任意のペプチドの改変
された形態でもよい。改変することによって、受容体への結合を増大させたり、
結合を減少させたり、或いは受容体への結合に影響を与えないようにすることが
できる。リガンドを改変することで、リガンドが細胞増殖を刺激するのではなく
阻害するように、アゴニストをアンタゴニストへ形質転換させることもできる。
リガンドの改変には、少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、置換又は変更が
あり得る。
。ここで用いられている場合は、「抗原」という用語は、任意の自然の或いは合
成の免疫原性物質、免疫原性物質のフラグメントもしくは部分、ペプチド・エピ
トープ又は付着体(ハプテン)を意味する。「抗原」という用語はまた、複合体
にされていない形態では非免疫原性であるが、複合体にされると免疫原性となる
物質も含む。「複合体にされていない」という用語には、本発明の分子複合体を
形成するように結合されない物質が含まれる。「複合体にされたもの」という用
語には、本発明の分子複合体を形成するように結合される物質が含まれる。
て抗原を向かわせ、これらの細胞の内部移行及び提示プロセスを増強し、最終的
にはその細胞内の免疫反応を刺激する。特定の一実施例においては、二重特異的
結合薬が、抗原と特異的に結合し(直接又は間接の何れかで、即ち、抗原のエピ
トープ又は抗原に付着したエピトープの何れかに)、かつ同時に、プロセシング
及び提示を行うために抗原を内部移行することができる抗原提示細胞の表面受容
体と結合する。別の実施例においては、抗原が、多重特異的又は二重特異的分子
に結合され、かつ同時に抗原提示細胞の表面受容体と結合する。これらの二重又
は多重特異的分子の受容体結合成分(よって二重又は多重特異的分子それ自身)
が、抗原提示細胞の受容体と結合する。場合によっては、分子の結合は、分子が
この受容体に関する本来のリガンドによって実質的に妨害されることなく起こる
ことがある。したがって、受容体に対して抗原を向かわせても、リガンドの生理
学的レベルによって阻止されることなく、また標的された受容体は、リガンドと
結合し且つ作用する能力を温存することになる。
においてアレルギー性又は喘息性反応を惹起させ得る物質を指す。アレルゲンの
リストは膨大であり、花粉、昆虫毒、動物のふけ埃、真菌胞子及び薬物(例えば
、ペニシリン)を含み得る。自然、動物及び植物アレルゲンの例には、以下に掲
げる属に特有なタンパク質を含み、それらには、イヌ科(Canis familiaris)ヤ
ケヒョウヒダニ属(Dermatophagoides)(例えば、Dermatophagoides farinae)
、ネコ属(Felis domesticus)、ブタクサ(Ambrosia artemiisfolia)、ライグ
ラス(例えば、Lolium perenne又は Lolium multiflorumホソムギまたはイタリ
アンライグラス)、スギ(スギCryptomeria japonica)、アルタナリア(Altern
aria alternata)、ハンノキ類、ハンノキ(Alnus gultinosa)、シラカンバ(B
etula verrucosa)、コナラ(Quercus alba)、オリーブ(Olea europa)、ヨモ
ギ(Artemisia vulgaris)、オオバコ(例えば、Plantago lanceolata)、パリ
エタリアParietaria(例えばParietaria officinalis又は Parietaria judaica
)、チャバネゴキブリ属(例えばチャバネゴキブリ)、ミツバチ(例えば、Apis
multiflorum)、Cupressus(例えば、Cupressus sempervirens、Cupressus ari
zonica及びCupressus macrocarpaモントレーイトスギ)、ビャクシン属(例えば
、Juniperus sabinoides、Juniperus virginiana、Juniperus communis及びJuni
perus ashei)クロベ属(例えば、Thuya orientalis)、ヒノキ(例えば、Chama
ecyparis obtusa)、Periplaneta(例えば、Periplaneta americanaワモンゴキ
ブリ)、カモジグサ属(例えば、Agropyron repens)、ライムギ(例えば、 Sec
ale cerealeライムギ)、コムギ属(例えば、Triticum aestivum)、Dactylis(
例えば、Dactylis glomerata)、フェスキュ(例えば、Festuca elatior)、イ
チゴツナギ属(例えば、Poa pratensis 又はPoa compressa)、Avena(例えば、
Avena sativaマカラスムギ)、Holcus(例えば、Holcus lanatus)、Anthoxanth
um(例えば、Anthoxanthum odoratum)、Arrhenatherum(例えば、Arrhenatheru
m elatius)、ヌカボ(例えば、Agrostis alba)、イネ科(例えば、チモシー)
、Phalaris(例えば、Phalaris arundinacea)、スズメノヒエ(例えば、Paspal
um notatumバヒアグラス)、モロコシ属(例えば、Sorghum halepensis)及びブ
ロムグラス(例えば、Bromus inermis)がある。
動物、家の塵埃又は食物に見い出される。一般的に、 それらはタンパクの消化
に対して比較的耐性がある。好適なアレルゲンは、マスト細胞および好塩基性細
胞上のIgEに結合し、それによってタイプIアナフィラキシー過敏性反応を引
き起こすものである。多価作用物質の少なくとも一つの特異的部分が、IgGに
関するリガンド結合ドメインの外側にある高親和性Fc受容体のエピトープに関
する場合は、この二重特異的結合物質は、被験体内の過敏性を抑制することがで
きる。このようなことが達成されるのは、IgE結合アレルゲンがマスト細胞お
よび好塩基性細胞上のIgEに結合する前に、二重特異的結合物質がこのアレル
ゲンと結合をめぐって競合するので、タイプI過敏性反応の可能性を減ずること
になるからである。さらに、アレルゲンがFcγRに向けられた結果、このアレ
ルゲンに対する、IgE媒介型のタイプI反応を阻害するT細胞耐性状態が誘導
され得る。耐性は、現在用いられているアレルゲン用量よりも実質的に少ない用
量を用いて、アレルゲンに結合しようするIgEと競合するIgGを減誘導する
ことによって達成できる。
ような担体分子に、抗原性が弱いか或いは本質的に非抗原性(ハプテンのような
)の物質を結合させるのが望ましかろう。これらの場合においては、二重特異的
結合試薬は、それ自身のエピトープではなく、その結合試薬が結合する担体のエ
ピトープと結合するように作ってもよい。
することができる抗原は、可溶性または微粒子であってもよく、この抗原は、B
細胞エピトープ、T細胞エピトープ又は両者を保持できる。この抗原は、細菌、
ウイルス又は寄生体由来であってもよい。この抗原は、病原性生体の表面構成体
の成分を包含する。例えば、この抗原は、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)のウ
イルス体膜グリコタンパク質のようなウイルス表面構成又は肝炎ウイルスの表面
抗原を包含してもよい。さらに、この抗原は、腫瘍細胞のような、病原細胞と結
合されてもよく、その病原細胞に対する免疫反応を高めて病疾を治療する。この
抗原は、ヒトの乳癌及び卵巣癌細胞上で発現するHer−2/newプロト腫瘍
形成遺伝子(Slamon et al. (1989) Science 244:707)のような、腫瘍特異的又は
腫瘍結合抗原を包含できる。
とができる。多価分子を用いて、培養中の抗原提示細胞に対する抗原を標的にす
ることができる。免疫適格細胞は、患者の血液から分離且つ精製される。次に、
これらの細胞を、抗原を含む多価分子に暴露するか、又は抗原に関する結合特異
的部分を有する多価分子と共に抗原に暴露できる。標的を決められた抗原提示細
胞は、抗原をプロセシングし、且つそれらの表面上のフラグメントを提示する。
刺激の後、これらの細胞を患者に戻すことができる。
とができきる。例えば、この方法は、肝炎又は後天性免疫不全ウイルス症候群(
AIDS)のような、本来の免疫系では感染症に打ち勝つことができない場合に
、慢性的な感染症を治療するのに価値を発揮する。その方法は又、侵入生体に対
する免疫反応を強化する必要がある感染症の急性段階の処置にも用いることがで
きる。
原に対して反応しないか或いは最低限にしか反応しない場合は、必要な抗原の用
量を減ずることができる。一般的には望ましいことであるが、有効用量を減ずる
のは、アレルギーに関する症例の如く、宿主にとって当該抗原が毒性である場合
には特に望ましい。抗原を含有するか、又はリガンド(例えば、抗原と相互作用
する抗体)を含有する二重もしくは多重特異的分子を用いる方法及び利用法は、
公開されたPCT出願第PCT/US91/07283号において更に詳細に記
載されている。
ており、したがってT細胞活性に及ぼすその分子の効果は、抗原提示細胞により
この改変抗原がT細胞に提示されると、改変される。Allan等は、T細胞を刺激
する(例えば、T細胞の増殖を刺激する)ペプチドの一つ又はそれ以上のアミノ
酸を置換することによって、T細胞を刺激することが不能な抗原を、もしくはT
細胞におけるアネルギーを誘導する抗原を得ることができるのを実際に証明した
。このような改変されたペプチドは、改変ペプチドリガンド(APL)と呼ばれ
る。したがって、このようなAPLは、FcγRIに関する少なくとも一つの結
合特異的部分を有する二重特異的もしくは多重特異的分子に結合し得る。抗原提
示細胞が、これらの分子を食作用により取り込んでT細胞へ提示すると、T細胞
の増殖は阻害されるか、もしくはアネルギー状態にすることができる。よって、
(a)通常はT細胞を刺激するが、改変されるとT細胞のアネルギーを誘導する
抗原の少なくとも一つの改変ペプチドと、(b)少なくとも一つの抗FcγRI
抗体と、を包含する多重特異的分子を被験体に投与することによって、抗原に対
する被験体の耐性が誘導されることになる。よって、このような多重特異的もし
くは二重特異的分子を用いて種々の抗原(例えば、自己抗原)に対して被験体を
耐性化することができる。したがって、使用したこれらの抗原によっては、本発
明の方法は、例えば、T細胞を刺激する抗原を用いることで免疫反応を高める方
法を提供し、かつ本発明はまた、T細胞への刺激を阻害するか或いはT細胞のア
ネルギーを誘導するか、その何れかによって免疫反応を抑制する方法も提供する
。
んでもよい。この「抗増強因子部分」は、抗原と結合することによって、抗Fc
受容体部分又は抗標的部分の機能を増強させる、抗体、作用的な抗体フラグメン
ト又はリガンドでもよい。この「抗増強因子部分」は、Fc受容体又は標的と結
合できる。一つの標的細胞抗原に結合する抗標的部分と、異なる標的抗原に結合
する抗増強因子部分と、を包含する多価分子は、標的細胞が、抗原変調もしくは
抗原性変異(例えば、トリパノソーマ類のようなある種の寄生体に関して記載さ
れた如く)を受ける場合において特に有用である。あるいは、この抗増強因子部
分は、抗標的もしくは抗Fc受容体部分が結合する実体とは異なる別の実体と結
合することもできる。例えば、抗増強因子部分は、細胞障害性T細胞(例えば、
CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM−1又は標的
に対して免疫反応の増強をもたらすその他の免疫細胞を介して)と結合すること
ができる。
ば、両方の特異的部分を同一のベクターにおいてコードし、且つ同一の宿主細胞
において発現および組み立ててよい。このような方法は、多重特異的分子が、以
下の例2において記載する(リガンド)x(fab)融合タンパク質である場合
に特に有用である。本発明の二重特異的分子はまた、単鎖二重特異的抗体のよう
な単鎖二重特異的分子、一つの単鎖抗体及び一つのリガンドを含む単鎖二重特異
的分子、或いは二つのリガンドを含む単鎖二重特異的分子でもよい。多価分子は
また、単鎖分子でもよいし、或いは少なくとも二つの単鎖分子を含んでもよい。
二価又は多価抗体を調製する方法は、例えば、米国特許第5,260,203号
、米国特許第5,455,030号、米国特許第4,881,175号、米国特
許第5,132,405号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,
476,786号、米国特許第5,013,653号、米国特許第5,258,
498号及び米国特許第5,482,858号において記載されている。
て記載される二重特異的ELISA(酵素結合免疫吸着検査法)によって確認す
ることができる。
れたタンパク質もしくはペプチドを相互に共役させることができる。例えば、二
つのヒト化抗体は、二つのH鎖のC末端ヒンジ領域のスルフヒドリル(SH)結
合を介して共役させることができる。一実施例においては、共役する前に、この
ヒンジ領域が、奇数(好ましくは一つ)のスルフヒドリル(SH)残基、を含有
するように改変する。
の方法を用いて、抗FcR及び抗標的部分を共役させることによって調製できる
。例えば、種々の結合もしくは架橋薬を共有結合型共役に用いてよい。架橋薬の
例には、プロテインA、カルボジイミド、N−スクシニミジル−S−アセチル−
チオアセテート(N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate)(SATA)、N−スクシ
ニミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオナート(N-succinimidyl-3-(2-
pyridyldithio)propionate)(SPDP)及びスルフォスクシニミジル4−(N−マレ
イミドメチル)シクロハクサン−1−カルボキシレート(sulfosuccinimidyl 4-
(N-maleimidomethyl) cyclohaxane-1-carboxylate)(sulfo-SMCC)が含まれる(例
えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (198
5) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648、を参照されたい)。その他には、Paul
usによって記載されたものが含まれる(Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118
-132); Brennan et al. (Science (1985) 229:81-83), and Glennie et al. (J.
Immunol. (1987) 139: 2367-2375)。好適な共役剤は、 SATA及びsulfo-SMCCで
あり、共にピアスケミカル社(イリノイ州ロックフォード)から入手可能である。
は、ヒトモノクローナル抗体及びそのヒト化抗体(例えば、Fab’及び単鎖F
v等のフラグメント)が含まれる。ヒト化抗体を作製する方法は、当該分野では
既知であり、以下の例において詳細に記載される。完全にヒトのモノクローナル
抗体を作製する方法も当該分野では既知である。これらの抗体は、例えば、Kohl
er 及びMilstein(Nature 256: 495 (1975)の標準的な体細胞雑種形成技術など
の従来のモノクローナル抗体方法論を含めて種々の技術よって作製することがで
きる。原則的には体細胞雑種形成法が好ましいが、モノクローナル抗体を作製す
る他の方法も用いてもよい(例えば、Bリンパ球のウイルス又は腫瘍形成形質変
換)。
イブリドーマの作製は、非常によく確立された方法である。免疫化した、融合の
ための脾細胞を分離する免疫化プロトコルおよび技術は、当該分野では既知であ
る。融合相手(例えば、マウス骨髄腫細胞)及び融合方法も当該分野では既知で
ある。
ヒトの免疫系の部分を担持する遺伝子導入マウスを用いて作製する。これらの遺
伝子導入マウス(ここでは「HuMab」マウスと呼ぶ)は、内生的なμ及びκ
鎖遺伝子座を非活性化させる、標的を決められた変異体と共に、再配列されてい
ないヒトH鎖(μ及びγ)及びκL鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫
グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を含有する(Lonberg, N. et al. (1
994) Nature 368(6474): 856-859)。したがって、当該マウスは、マウスIgM
もしくはκの発現が抑制され、かつ導入されたヒトH及びL鎖遺伝子は、クラス
スイッチ及び体性変異を経て高親和性ヒトIgGκモノクローナルを、免疫化に
対応して作製する(Lonberg, N. et al. (1994), 上述; Lonberg, N. (1994) Han
dbook of Experimental Pharmacology 113:49-101に説明あり; Lonberg, N. and
Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, and Harding, F.
and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546)。HuMabマウ
スの調製は、以下の詳細なセクションII及び以下の参考文献に記載があり、こ
れら全ての内容はその全体が言及により本明細書に編入されている(Taylor, L.
et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (199
3) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Nat
l. Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-
123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994)
J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-
859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101
; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg,
N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding,
F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D.
et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851)。更に参照されたいのは
、Lonberg並びにKay及びGenPharm International社に発行された米国特許第5,
545,806号及び第5,625,825号、Surani等に発行の米国特許第5
,545,807号 、及び1998年6月11日付け国際公開第WO98/2
4884号 、1994年11月10日付け第WO94/25585号、199
3年6月24日付け第WO93/1227号、1992年12月23日付け第W
O92/22645号、1992年3月19日付け第WO92/03918号で
あり、これらの全ての内容の開示は、その全体が言及により本明細書に編入され
ている。或いは、例2において記載のHCO12遺伝子導入マウスを用いて完全
にヒトのモノクローナル抗体を作製することができる。
を発現する所望の免疫原及び/又は細胞を精製し且つ強化したプレパラートによ
って免疫化できる(Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856 859; F
ishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 and WO 98/248
84)。好適には、マウスは最初の注入時に6乃至16週齢である。例えば、HE
R2/neuの精製又は強化プレパラート(5乃至20μg)を用いてHuMa
bマウスを腹腔内免疫化できる。HER2/neuの精製又は強化プレパラート
を用いる免疫化によって抗体が作製されない場合は、例えば腫瘍細胞株などの、
HER2/neuを発現する細胞によって免疫化して免疫反応を促進することも
できる。
最もよく反応するのは、フロインド完全アジュバントにおいて、抗原でまず腹腔
内(IP)免疫化をした後、フロインド完全アジュバントにおいて、抗原で一週
おきにIP免疫化(合計六回まで)を実施する場合である。免疫反応は、免疫化
プロトコルの全過程に亘ってモニターすることができ、且つ血漿試料を眼窩後方
からの採血によって得ることができる。この血漿はELISA(以下に記載の如
く)によってスクリーニングされ、所望の免疫原に対する十分な力価のヒト免疫
グロブリンを有するマウスを融合に用いることができる。マウスは、脾臓を犠牲
にし且つ除去する前三日間、抗原で静脈内に追加刺激してよい。それぞれの抗原
に関して二回から三回の融合を実行する必要が見込まれる。それぞれの抗原に関
して六匹のマウスを免疫化することになろう。例えば、合計12匹のHC07及
びHC12系のマウスを免疫化してもよい。
レングリコール(PEG)でマウス骨髄腫セルラインに融合させることができる
。次に、その結果得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体を作製するために
スクリーニングすることができる。例えば、免疫化したマウスから得た脾臓リン
パ球の単細胞懸濁液を、50%のPEGで、六分の一の数のP3X63−Ag8
.653非分泌マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL1580)まで融合する。
細胞は、平底の微量定量プレート内でおよそ2x105個を平板培養した後、2
0%の胎児クローン血清、18%の「653」調整培地、5%のオリゲン(IG
EN社)、4mMのL−グルタミン、1mMのL~グルタミン、1mMのピルビ
ン酸ナトリウム、5mMのHEPES(N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−
N’−2−エタンスルホン酸)、0.055mMの2−メルカプトエタノール、
50ユニット/mlのペニシリン、50mg/mlのストレプトマイシン、50
mg/mlのゲンタマイシン及び1XHAT(シグマケミカル社、HAT(混合
培養液)は融合のあと24時間後に加えられる)を含有する選択的な媒体中で、
二週間定温放置される。二週間後、細胞は、HATがHTと置換されている媒体
中で培養される。次に、所望の免疫原に対するヒトモノクローナルIgM及びI
gG抗体の有無に関して、個々のウェルは、ELISAによってスクリーニング
する。一旦、全体的にハイブリドーマが成長すると、媒体は通常10乃至14日
間観察する。ハイブリドーマを分泌する抗体を再度平板培養して、再度スクリー
ニングを行い、ヒトIgGモノクローナル抗体に関して依然として陽性なら、限
界希釈して少なくとも二回サブクローニングすることができる。次に、特性の説
明のために、安定したサブクローンは、インビトロ培養して組織培地に少量の抗
体を作製する。
から得た血清が、例えば、ELISA法によって実験される。簡単に説明すると
、微量定量プレートに、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)中での、およそ0.2
5μg/mlの所望の免疫原(精製された)を塗布し、次にPBS中の5%のウ
シの血清アルブミンで遮断する。所望の免疫原で免疫化したマウスから得た血漿
の希釈液を各ウェルに加え、37℃で一、二時間定温放置する。プレートをPB
S−Tweenで洗浄した後、 アルカリホスファターゼに共役したヤギ抗ヒト
IgGのFc特異的多クローン薬と共に、37℃で一時間定温放置する。洗浄後
、プレートはpNPP( 4−リン酸ニトロフェニル、ジナトリウム塩六水和物、
リン酸パラニトロフェニル(4-nitrophenyl phosphate, disodium salt hexahyd
rate; para-nitrophenyl phosphate))基質(1mg/ml)で展開され、40
5乃至650のOD(光学濃度)で分析される。好適には、最高の力価濃度を生
じるマウスを融合に用いる。
する陽性活性を示すハイブリドーマの有無をスクリーニングするために用いるこ
とができる。高結合活性を示して所望の免疫原と結合するハイブリドーマは、サ
ブクローニングされ、さらに特性の説明をする。各ハイブリドーマから一つのク
ローン(親細胞の反応性を保持する(ELISAによる))を選択して、−14
0℃で保管した5乃至10個のバイアル細胞バンク(a 5-10 vial cell bank)
の作製及び抗体精製することができる。
ハイブリドーマを2リットルのスピンナーフラスコ内で成長させてモノクローナ
ル抗体を精製する。プロテインAセファロース(ファーマシア社、ニュージャー
ジー州ピスカタウェー)で親和性クロマトグラフィーを実施する前に、上澄み液
を濾過し濃縮することができる。溶離したIgGは、ゲル電気泳動及び高性能液
体クロマトグラフィーにより検査して純度を確認することができる。緩衝液はP
BSと交換し、濃度は、1.43吸光係数を用いてOD280によって測定でき
る。モノクローナル抗体は、等分割して−80℃で保管できる。
結合するかどうか測定するために、各抗体を市販の試薬(イリノイ州ロックフォ
ード、ピアスケミカル社)を使用してビオチン標識することができる。標識され
ていないモノクローナル抗体及びビオチニレート化されていない抗体を使用する
競合研究を、上述の如く所望の免疫原を塗布したELISAプレートを用いて実
行してもよい。ビオチニレート化されたmAb(モノクローナル抗体)結合をス
トレプアビジンアルカリホスファターゼ(strep-avidin-alkaline phosphatase
)・プローブで検出することができる。
行することができる。4℃で一晩、微量定量プレートのウェルに10μg/ml
の抗ヒトIgを塗布することができる。5%のウシ血清アルブミンで遮断した後
、周囲温度で二時間、これらのプレートを10μg/mlのモノクローナル抗体
又は精製したアイソタイプ対照と反応させる。次に、これらのウェルをヒトIg
G1又はヒトIgMの何れかに特異的なアルカリ性ホスファターゼ共役プローブ
と反応させることができる。上述したように、プレートは展開され且つ分析され
る。
クローナル抗体が結合するのを証明するために、流動細胞光度測定法(フローサ
イトメトリー)を用いることができる。簡単に説明すると、所望の免疫原(標準
的な成長条件下で成長させた)を発現するセルラインは、0.1%のTween
80及び20%のマウス血清を含有するPBS(リン酸緩衝生理食塩水)内で種
々の濃度のモノクローナル抗体と混合し、37℃で一時間定温放置する。洗浄後
、これらの細胞を、第一次抗体染色と同一条件下でフルオレセイン標識された抗
ヒトIgG抗体と反応させる。これらの試料は、光源及び単離細胞上で作動する
側方散乱特性を用いるFACScan装置によって分析することができる。螢光
顕微鏡検査法を用いる別のアッセイをフローサイトメトリー・アッセイ(それに
加えて又はその代わりに)を用いてもよい。細胞は上述と同様に染色し且つ螢光
顕微鏡検査法によって検査される。このような方法によって、個々の細胞を視覚
化できるが、抗原の濃度によって感受性が減少する可能性がある。
の反応性の有無をさらに実験することができる。簡単に説明すると、所望の免疫
原を発現する細胞から細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸塩ナトリウム・ポリア
クリルアミド・ゲル電気泳動にかけることができる。電気泳動の後、分離された
抗原は、ニトロセルロース膜に移し、20%のマウス血清で遮断し、モノクロー
ナル抗体をプローブにして実験される。ヒトIgG結合は、抗ヒトIgGアルカ
リホスファターゼを用いて検出可能であり、BCIP/NBT基質錠剤(シグマ
ケミカル社、ミズーリ州セントルイス)で展開(develop)することができる。
特異的分子を被験体に投与して、以下のような種々の疾患又は状態を処置又は予
防することできる。それらの疾患又は状態には、癌(例えば、乳癌、卵巣癌、肺
臓の小細胞癌)、病原性感染症(例えば、HIVなどのウイルス性)、原虫によ
るもの(トキソプラズマ原虫のような)、真菌類によるもの(カンジダ症のよう
な)、自己免疫状態(例えば、免疫性血小板減少紫斑病及び全身性紅斑性狼瘡)
が含まれる。また、多重特異的多価抗体は予防的に投与して、標的細胞による感
染症に対して被験体を予防接種することもできる。
の意図された治療効果を発揮できれば任意の態様で被験体に投与してもよい。好
適な投与経路には、経口及び経皮(例えば、貼付薬を介して)が含まれる。その
他の投与経路には、注射(皮下、静脈、腸管外、腹腔内、クモ膜下など)がある
。注射には、大量注射又は継続的な点滴があり得る。
用されているように、「薬学的に許容可能な担体」という文言は、多重特異的分
子と同時投与でき且つその分子を見込み通りに働くようにさせる物質を含むこと
を意図している。このような担体の例には、溶液、溶剤、分散媒体、遅延剤、乳
剤などが含まれる。薬学的活性物質に関するこのような媒体の使用は、当該分野
において周知である。これらの分子を用いるのに適切であれば、その他の通常の
担体は何れも本発明の範囲内にある。
を実現するのに必要な又は十分な用量を指す。例えば、有効量の多重特異的分子
(抗標的部分が病原性細胞を認識する)は、腫瘍、癌又は細菌性、ウイルス性も
しくは真菌性感染を排除するのに必要な用量である。具体的な適用に関する有効
量は、治療中の疾患又は状態、投与される具体的な多重特異的分子、被献体の体
格又はこれら疾患もしくは状態の重症度などの要因により様々であり得えよう。
通常の技能を備えた当業者であれば、余計な実験の必要もなく個々の多重特異的
分子の有効量を経験的に決定することができる。
定であると解釈するべきではない。本願を通じて引用される、全ての参照文献、
出願中の特許出願及び公開特許の内容は、言及により本明細書に明示的に編入さ
れる。
抗体を包含する二重特異的抗体の作製
は、イオン交換クロマトグラフィーによってハイブリドーマ上澄から精製し、ま
たDZ33、即ち、ヒト抗HIV−1IgG1mAbは、プロテインA親和性ク
ロマトグラフィー(ファーマシア社、ニュージャージー州ピスカタウエー)及び
ゲル濾過によってハイブリドーマ上澄から精製された。M32.2は、2085
2メリーランド州,ロックビル、パークローンドライブ12301に所在のアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に、1987年7月1
日付けで預託され、ATCC預託番号HB9469と指定されている。
、組換えmAbの発現に用いられた。NSO細胞は、DMEMプラス10%の胎
児ウシ血清(FBS、ギブコ社、英国ペイリー)中で培養された。SKBR−3
は、HER2/neu癌原遺伝子(ATCC,メリーランド州ロックビル)を過
剰発現するヒトの乳癌腫セルラインであり、イスコーブの改変されたダルベッコ
培地(IMDM、ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド)において培養
された。U937は、FcγRIを発現する単球様セルラインであり、ATCC
から入手して、RPM−1640プラス10%のFBS(ギブコ社、ニューヨー
ク州グランドアイランド)中で育成した。
oro, J., R. Treisman and R. Kamen,(1982) ポリオーム特異的RNAの転写マ
ップ:二次元S1ゲルマップによる分析、Meth. Enzymol. 65:718)において記載
のように調製された。IgV領域cDNAは、「ヒト単核貪食細胞上の、免疫グ
ロブリンに関するFc受容体に対するヒト化抗体」と題された国際特許出願公開
第WO94/10332号に記載の如くプライマCG1FOR及びCK2FOR
から開始された逆転写を介してRNAから作製された。cDNA合成を、100
UMMLV逆転写酵素(英国ペイスリー、ライフテクノロジー社)を用いて標準
的な条件下で行った。VH及びVκcDNAは、国際特許出願公開第WO94/
10332号に記載したようにH2BACK及びVK7BACKと共にcDNA
プライマーを用いてPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって増幅された(Orlan
di, R., D.H. Gussow, P.T. Jones and G. Winter (1989) (ポリメラーゼ連鎖反
応による、免疫グロブリン発現可変ドメインのクローニング), Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 86:3833)。増幅されたVH及びVκDNAは精製し、M13にクロ
ーニングし、T7DNAポリメラーゼ(ファーマシア社、ニュージャージー州ピ
スタウェー)を用いてジデオキシ法によって配列された。
制限部位を、両M22V領域遺伝子の末端の極めて近接位に配置した。VHに関
しては、5’PstI部位及び3’BstEII部位が、VH1BACK及びV
H1FOR(Id.)を用いてPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によりクローニ
ングされたマウスVH遺伝子へ導入した。Vκに関しては、5’PvuII部位
及び3’BglII部位を、VK1BACK及びVK1FOR(Id.)を用い
てPCRによりクローニングされたマウスVκへ導入した。幾つかの場合では、
これらのプライマーは、このような自然発生的なアミノ酸から一つ又はそれ以上
のアミノ酸を変化させた。これらのV領域遺伝子(ChVH及びChVK)は、
適正な制限酵素で切断され、Igプロモーター、シグナル配列及びスプライス部
位を含有するM13VHPCR11BACK及びVKPCR1(Id.)にクロ
ーニングされた。DNAは、M13からHindIII−BamHIフラグメン
トとして切除されて、ヒトIgG1(Takahashi, N. et al. (1982)、 ヒト免疫
グロブリンガンマ遺伝子の構成:遺伝子系統群の進化に関する示唆、Cell, 29:6
71)及びヒトカッパ恒常領域ゲノムDNA(Hieter, R.A. et al. (1980)、クロ
ーニングされたヒト及びマウスカッパ免疫グロブリン恒常及びJ領域遺伝子は、
作用的セグメントにおいて相同性を保存する。 Cell 22:197)を含有するpSV
gpt及びpSVhyg発現ベクターへ、クローニングされた。
マイクローマ免疫グロブリン(IgG New), Biochemistry, 16:3412)のVH領域の
アミノ酸配列、及びKOL(Marquat, M. et al., (1980)無傷な免疫グロブリン
分子Kolの 結晶学的な精製及び原子模型及び3.0A及び1.9A分解能そ
の抗原結合フラグメント, J. Mol. Biol. 141:369)、に基づくものであった。
ヒト化L鎖は、幾つかの基質領域(FR)の変更部を有するヒトベンス−ジョー
ンズ・タンパク質REI(Epp, O. et al, (1974)ベンス−ジョーンズ・タンパ
ク質REIのバンディブル部分からなるダイマーの結晶及び分子構造, Eur. J.
Biochem. 45:513)に由来するものであった。改変されてVκドメインが更に典
型的なヒトサブグループIになり、Thr39、Leu104、Gln105及
びThr107が、Lys39、Val104、Glu105及びLys107
に置換されている。更に、Met4をLeu4に変更して、PvuII制限部位
を収容可能とする。
を含有するDNAを、ベクターM13VHPCR1及びM13VKPCR1(Fa
valoro et al. 上述)にクローニングした。KOLVHをコードするDNA、K
OLFRアミノ酸及び無関係のCDRをコードするオリゴデオキシリボヌクレオ
チドを用いて、一連の連続PCR( ポリメラーゼ連鎖反応)によって作成した
。これらの作成物を、次にM13VHPCR1にクローニングした。
チドによってフランクされたmABM22CDRをコードした。NEWMに基づ
くヒト化VHに関しては、プライマーが、マウスFRアミノ酸Phe27、II
e28及びArg71(これらは抗原結合に影響するので)を含んでいた(Chot
hia, C. and A.M. Lesk (1987), 免疫グロブリンの高度可変領域に関するカノニ
カル構造, J. Mol. Biol., 196:901; Tramontano, A. et al., (1990),フレーム
ワーク残基71は、免疫グロブリンのVHドメインにおける第二の高度可変領域
の配置及び配座の主要な決定因子である, J. Mol. Biol., 215:175)。ヒト化V κ に関しては、マウスアミノ酸Phe71が、親和性に作用する能力を有する残
基として同様に含まれている(Foote, J. and G. Winter, (1992), 高度可変ルー
プの配座に作用する抗体フレームワーク残基, J. Mol. Biol. 224:487)。マウ
スFR残基は、KOLVHには一切含まれていなかった。オリゴデオキシリボヌ
クレオチドは、5’−リン酸化され、M13ユニバーサル前方プライマーで、M
13ssDNA鋳型を含むM13に反応でクローニングしたヒトV領域遺伝子に
、アニーリングされた。このDNAは、拡大されて2.5UのT7DNAポリメ
ラーゼ(USバイオケミカル社、オハイオ州クリーブランド)及び0.5UのT
4DNAリガーゼ(BRL、ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド)に
結合された。変異ストランドは、1UのVentDNAポリメラーゼ(ニューイ
ングランドバイオラブ、マサッチューセッツ州ベバリー )を有するM13逆方
配列プライマーを使って拡大/結合混合物から選択的に増幅した後、M13の前
方及び逆方プライマーの両者を用いるPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)により増
幅した。産生物DNAは、BamH1及びHindIIIで切断され、DNA配
列により識別された、M13及び三重CDR移植変異体にクローニングされた。
存在しないことが確認された。確認されたクローンからのRFDNAは、Hin
dIII及びBamHIで消化され、pSVgptもしくはpSVhyg及びヒ
トIgG1もしくはキメラ抗体遺伝子の作成に関して記載したのと全く同様に付
加されたヒトカッパ恒常領域にクローニングされた。
エタノール沈降させて、50μlの水に溶解された。NSO細胞(1−2x10 7 個)が遠心沈澱法により回収され、0.5mlDMEMで再懸濁されて、0.
4cmの電気穿孔キュベット内でDNAと混合された。5分後、氷の上で、これ
らの細胞は、170V、960μFで一回パルスされ(ギーンパルサー社、バイ
オラッド社、ニューヨーク州メルビルGenePulser, Bio-Rad, Melville, NY )、
氷の上で15分間さらに定温放置された。これらの細胞は、24乃至48時間D
MEM中で回復させることができた。媒体は、次にマイコフェノール酸(mycoph
enolic acid)(0.8μg/ml)及びキサンチン(250μg/ml)を加
えることによって選択的になった。200μlのアリコートが、96−ウェル・
プレート内へ分配された。さらに10乃至12日後、これらのウェルから得た、
ELISAによって測定された最高レベルの抗体を含有する細胞が選択されかつ
希釈度を制限することによってクローニングされた。
から精製された(ボーリンジャーマンハイム社、英国リューズ)。濃度は、A2 80nm を測定することにより測定し、かつELISA及びSDS−PAGEに
よって確認した。
抗ヒトIgM抗体(セララブ社英国クローリーダウン)を塗布した。このプレー
トには、1%のBSAで遮断された後、一時的に形質移入したCOS細胞から得
られたヒトFcγRI及びヒトIgMのH鎖(sFcγRI−μ)の細胞外ドメ
インからなる可溶性融合タンパク質を加えた(発現ベクターは、マサチューセッ
ツ州ボストンのマサチューセッツ総合病院のBrian Seed博士のご好意により提供
された)。次に、組換え体22もしくは対照mAbが、被験体mAbがそのFc
部分を介して非特異的に結合するのを遮断するλL鎖を含有するヒトIgG1抗
体(シグマ社、ミズーリー州セントルイス)の過剰(2.2μg/well)な存
在下で加えられた。結合された22mAbは、ペルオキシダーゼ標識されたヤギ
抗ヒトカッパ鎖抗体(セララボ、英国クローリーダウン)及びo−フェニレンジ
アミンで検出された。
れた。フルイソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)(シグマ社、ミズーリ
ー州セントルイス)を、2mg/mlの濃度でDMSOに溶解させた。1ミリグ
ラムのmAb当り40μgのFITCを加えて、室温で二時間定温放置した。フ
ルオレセイン染色されたmAbは、G−25クロマトグラフィーにより遊離FI
TCから分離された。
含有するRPMIで2.5対1(v/v)の比率で希釈された。赤血球は、氷の
上で45分間沈降させた後、上澄中の細胞を新たな試験管に移し替えて遠心分離
法によりペレット化した。残留赤血球を低張溶解により除去した。後に残ったリ
ンパ球、単球、好中球は、結合アッセイで使用するまで氷の上で保管した。幾つ
かの実験に関して、好中球は、フィコール・ハイパーク(ファーマシア社、ニュ
ージャージー州ピスカタウェー)勾配分離法により単核細胞から分離した。Fc
γRIを上方制御するために、好中球及び単核細胞はサイトカインで処理した。
単核細胞の培養組織は、2.5%の通常のAB型ヒト血清(シグマ社、ミズーリ
ー州セントルイス)及び500IRU/mlのIFN−γ(R&Dシュステムズ
社、ミネソタ州ミネアポリス)を含有する1ml当たり4x106個の細胞のR
PMI希釈液において、37℃、5%のCO2で48時間テフロン(R)皿内に
定温放置した。好中球は、50ng/mlのG−CSF(ドイツのエアランガー
大学のR. Repp氏の好意により提供される)及び500IRU/mlのIFN−
γを含有するAIMV培地(ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド)中で
48時間(37℃、5%のCO2)培養した。
施した(Guyre, P.M. et al., 受容体機能を惹起することができるFcγR上の
別々のエピトープに結合するモノクローナル抗体、 J. Immunol., 143:1650)。
簡単に説明すると、2mg/mlのBSA及び0.05%のNaN3(PBA)
を含有する、pH7.4のPBSで、細胞を洗浄し且つそれら細胞をPBAで1
ml当たり2.0x107個の細胞まで調節した。FITC標識され且つ共役さ
れていない抗体が、PBA中に調製された。細胞(25μl)、抗体(25μl
)及びヒト血清(25μl)、又はヒトIgG(10mg/ml、ミズリー州セ
ントルイスのシグマ社)(25μl)、又はPBA(25μl)を微量定量プレ
ートに加えて、45乃至60分間氷上に放置した。結合されていない抗体は、P
BAで三回洗浄してウェルから除去した。これらの細胞を1%のパラホルムアル
デヒドで固定した。フルオレセンス染色された細胞が、ベクトン−ディキンソン
FACScanにおいて分析された。
7),チオエーテル結合の二重特異的F(ab’γ)2抗体の調製及び性能, J. Im
munol., 139:2367)。mAb22(マウスおよびヒト化の両方)及び520C9
(抗HER2/neu)抗体を、それぞれのハイブリドーマ細胞のインビトロ培
養によって作製した。これらの抗体は、別々にペプシンでF(ab’)2へ消化
分解され、さらに10mMのメルカプトエタノールアミン(MEA)を加えて、
30℃、30分間でFab’に分解された。Fab’フラグメントは、50mM
の酢酸ナトリウム、0.5mMのEDTA(pH5.3、4℃)中で平衡させた
セファッデクスG−25カラムにかけた。ジメチルホルムアミドに溶解させ且つ
メタノール/氷の溶液中で冷却したオルトフェニレンジマルイミド(o−PDM
、12mM)を、M22x520C9の場合はマウス22Fab’に、及びH2
2x520C9の場合は520C9Fab’に加えて(半量)、さらに氷上で3
0分間定温放置した。次に、50mMの酢酸ナトリウム、0.5mMのEDTA
(pH5.3、4℃)中で平衡させたセファッデクスG−25カラムにおいて、
遊離o−PDMからこのFab’−マレイミダを分離した。BsAbの調製に関
しては、1対1のモル比で、M22Fab’−マレイミドを520C9Fab’
に加えるか、或いは520C9Fab’−マレイミドをH22Fab’に加えた
。アミコン(商品名)チャンバ内で、デアフロ膜を用いて、窒素存在下において
、これらの反応体を出発量まで濃縮した(全て4℃)。18時間後に、pH8.
0の1MトリスHCLでそのpHを8.0に調節した。次いで、この混合物を1
0mMのMEAで還元し(30℃で30分間)且つ25mMのヨードアセトアミ
ドでアルキル化した。PBSにおいて平衡させたスーパーデックス200(ファ
ーマシア社、ニュージャージー州イスカタウェー)カラムによって生じた、非反
応Fab’及び他の作製物から、二重特異的F(ab’)2を分離した。
カインで活性化された好中球による溶解の標的として用いられた(血液細胞の調
製を参照されたい)。標的は、好中球及び抗体と結合する前に、U字底の微量定
量プレート内で一時間にわたり100μCiの51Crで標識された。37℃で
五時間放置した後、上澄を回収して放射能の有無を分析した。細胞障害性は、次
式によって計算された。即ち、溶解(%)=(実験用CPM−標的漏出CPM/
洗浄剤溶解CPM−標的漏出CPM)x100%である。特異的溶解=抗体含有
溶解(%)−抗体非含有溶解(%)である。アッセイは、三重反復実験で実施し
た。
起するH22の能力を測定した(Pfefferkorn, L.C. and G.R. Yeaman (1994),
U937細胞におけるIgAFc受容体(FcxR)のFcεRIγ2サブユニ
ットとの会合, J. Immunol. 153:3228; Hallet, H.B. and A.K. Campbell (1983
).多形核球白血球における酸素遊離基の産生を刺激する別個の二つの機序, Bioc
hem J. 216:459)。10%のFBS(ハイクローン社、ユタ州ローガン)を含有
するRPMI−1640(ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド)中で
、100U/mlのIFN−γ(ゲネンテック社Genentech, カリフォルニア州
サンフランシスコ)の存在下で、五日間、U937細胞を培養して、FcγRI
の分化及び増強された発現を誘導した。実験日に、これらの分化させた細胞は、
10%のFBSを含有する新鮮なRPMI−1640中において、37℃で20
分間定温放置した。次に、これらの細胞をペレット化し、1mMのCaCl2、
1mMのMgCl2、1mMグルコース及び100μg/mlのBSA(シグマ
社、ミズーリー州セントルイス)を補足したPBS中に、1ml当たり3x10 6 個の細胞の濃度で懸濁させた。スーパーオキシドの放出を惹起するために、0
.1mMのルミノール(シグマ社、ミズーリー州セントルイス)、0.5mM1
00μlのバナジウム酸ナトリウム(シグマ社、ミズーリー州セントルイス)お
よびmAbM22,H22又は197のうち何れかを含有する100μlの反応
溶液に、100μlの細胞を加えて、22℃で、照度計中に配置した。照度計中
で反応溶液に細胞を加えた直後から開始して、スーパーオキシドの自発的な産生
を、30乃至40秒ごとに照度計で測定した。FcγRIをM22、H22又は
197と架橋させることで惹起されたスーパーオキシドを比較するために、各m
Abは同一濃度10μg/mlで使用した。mV/secでのスーパーオキシド
の産生を20分間モニターした。mAbM22、M32.2及び197を種々の
濃度で加えてスーパーオキシド産生の用量反応性を確立した。
ハイブリドーマRNAからIgV領域cDNAを調製し、成熟したV領域の既知
のシグナル及び/又は5’配列の配列に基づいて一連のプライマーを付加的に用
いて、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)により増幅した。VH及びVκに関して
、見込んだ大きさのPCR作製物が、SH2BACK/CG1FOR及びVK7
BACK/CK2FORプライマーの組み合わせを使用して得られた。増幅され
たDNAは適正な制限酵素で消化され、M13にクローニングされて、両方向の
配列は、少なくとも24個の別個のクローンから決定された。導き出したアミノ
酸配列は、配列ID番号29及び30に示されている。Vκの4つのN末端残基
は、VKBACKプライマーによってコードされている。
サブグループIの仲間である(Kabat, E.A. et al., (1991), 免疫グロブリンに
関するタンパク質配列第5版、米国健康福祉省 (Department of Health and Hu
man Services)。L97の残基を除けば、M22Vκのアミノ酸配列は、マウス
抗IgGmAbA17からの配列と同一である(Shlomchik, M. et al., マウス
IgM抗IgGモノクローナル自己抗体の可変領域配列(リウマチ因子)。II
II.バイリポ多糖類刺激及び二次プロテイ免疫化から由来のハイブリドーマの
比較、 bylipopolysaccharide, J. Exp. Med. 165:970)。
KOL(ヒトサブグループIII)に対してより大きな相同性(79%)を示し
た。この違いがどのように結合に影響するのかを見るために、マウス残基Phe
27、Ile28及びArg71を含むNEWMVH又はマウスFRアミノ酸を
含まないKOLVHの何れかに基づいて、H鎖を作成した。両方のヒト化VHが
、同じREI由来のヒト化L鎖と組み合わせられた。
親和性をELISA(酵素結合免疫吸着検査法)によって最初に評価した。この
データによれば、KOLVH/REIVκmAbは、キメラmAbと同じ結合性
を有するが、NEWMVH/REIVκmAbは、低親和性がおよそ5倍低いこ
とが分かった。非特異的ヒトIgG1mAbの結合性が低いことにより、ヒト化
mAbの結合が95%より高い場合FcドメインではなくFv部分を介するもの
であることがわかった。
えられたが、これらは有害な免疫反応を引き起こす可能性がある新規のエピトー
プを創製する恐れがあった。よって、H22と指定されたKOLVH/REIV
κmAbを、その結合特性を更に実験するために選択した。
た。フルオレセインと結合したM22又はH22で染色された末梢血白血球によ
って、細胞一個当たりおよそ104箇所の結合部位を有する単球に対する特異的
結合が証明された。対照的に、リンパ球又は刺激されなかった好中球には殆ども
しくは全く特異的結合が見られなかった(表1)。
はFc結合領域においてリガンドとしても結合することを証明するために、二つ
の抗FcγRIマウスmAb(H22及びM32.2)及びヒトIgG1mAb
に関して競合実験を実施した。非共役H22及びM22は、FcγRIのFc結
合部位を飽和させる過剰なヒトIgGの存在下で、フルオレセイン染色されたM
22又はフルオレセインされた染色されたH22の何れかに関して、同等に競合
した。見込み通り、M22とは異なるFcγRI上の部位に結合する抗FcγR
I抗体M32.2(Guyre, P.M. et al., J. Immunol. 143:1650)も、M22−
FITCと競合することができなかった。さらに、H22によって、したがって
無関連なヒトIgG1mAbによってではなく、H22−FITCが阻害される
ことから、H22のV領域を介したFcγRIの特異性が確認された。
のFc媒介結合をめぐって競合することができたが、M22はそれができなかっ
た。この実験の結果、M22ではなく、H22のFc部分が、FcγRIのFc
結合ドメインに結合することが証明された。これは、マウスIgG1ではなく、
ヒトIgG1のFc部分が高親和性をもってFcγRIと結合することができる
事実と一致している。
カイン活性化された好中球に対するH22の結合活性を、ヒト血清の存在下で測
定した。H22−FITCは、ヒト血清の存在下でも非存在下においても、同様
の親和性をもって単球上のFcγRIと結合した。対照的に、無関連のヒトIg
G−FITCのFc媒介結合は、完全にヒト血清によって阻害された。同様に、
H22−FITCは、ヒト血清の存在下でも非存在下においても、同様の親和性
をもってIFN−γ処理した好中球と結合した。総括すれば、H22は、そのV
領域を介してFc結合ドメインとは別の部位に結合し、且つそのFc領域を介し
てFcγRIのリガンド結合ドメインに結合する、ということがデータによって
証明された。前者の結合活性によって、ヒトIgG1の抗体妨害を効果的に克服
することができる。
又はウイルス感染細胞にFcγRI担持エフェクター細胞を結合させるBsAb
の開発である。こうしたBsAbはM22を用いて開発されたので、M22抗腫
瘍BsAb(520C9xM22)及び対応するH22BsAb(520C9x
H22)を細胞障害性介在能力に関して比較した。これらのBsAbは、抗HE
R2/neu抗体(520C9)のFab’と化学的に共役したH22又はM2
2のFab’からなり、よってエフェクター細胞トリガ分子FcγRI及び腫瘍
抗原に関して特異的であった。
性細胞傷害)アッセイにより実施した。M22及びH22由来のBsAbは、H
ER2/neuSを過剰発現するKBR−3細胞の致死に介在した。マウス及び
ヒトBsAbの両方とも、同様なレベルの抗原担持標的細胞の溶解を示した。さ
らに、両方のBsAbが、ヒト血清の存在下で、ADCC活性を保持したが、過
剰なM22F(ab’)2は、致死を完全に阻害することになった。これらの結
果を合わせると、H22BsAb誘導溶解は、M22エピトープを介して媒介さ
れることと、及びADCCは、FcγRI特異的であることが分かった。
22及びM22の能力を評価した。M22(そのV領域によってのみFcγRI
に結合する)が非常に低レベルの酸素バーストしか誘導しないのは、おそらくそ
れが受容体と効率的に架橋できないからであると考えられる。しかし、H22は
、そのFcドメインを介してリガンドとして、また更にそのFvを介して抗体と
しても結合することによって、FcγRIを架橋することができるが、H22は
スーパーオキシドのより多くの放出を誘導した。
る発現ベクターは、国際特許出願公開第WO94/10332(名称「ヒト単核
貪食細胞上の免疫グロブリンGに関するFc受容体に対するヒト化抗体」)に記
載の如くである。Fabリガンド融合構成体に関して、そのL鎖を変更する必要
があった。しかし、そのH鎖に関しては、CH2及びCH3ドメインを除去し且
つリガンドをコードする配列で置換しなければならなかった。H鎖ベクターは、
二つのBamHI部位を含み、一方はVH及びCH1の間のイントロン中に、他
方はCH3のすぐ下流側に存在する。BamHI制限部位を用いて、恒常ドメイ
ンをコードするDNAをCH1及びヒンジの大部分だけをコードする切断型と置
換した。このようにするために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用して、
図1に示した変更部を有するH鎖フラグメントの新たなC末端を設計した。
下流側であり、VHの下流側の新たなPCR産生CHIフラグメントをクローニ
ングするのに用いた、BamHI部位の上流側にある翻訳末端コドンと、からな
るが、この構成体を融合タンパク質構成体を作製するのに用いた。 クローニン
グ部位は、Fdとリガンドドメインとの間で柔軟性を保持するために殆どヒンジ
の下流側に位置するが、この部位を用いてEGF又は他のリガンドをコードする
DNAを挿入した。同様に、一つのCys残基が、二量体分子を形成するための
共役が可能なように前構成体から保持された。
C末端上にNotI部位を有するようにPCRにより増幅され、次に適正な解読
枠内で上記の新たに作成されたH22H鎖切形フラグメントの同一部位に挿入さ
れた。上皮成長因子(EGF)をコードするcDNAは、ATCC(預託番号5
9957)から入手した。およそ1200の残基先駆物質から成熟したEGFの
53個のアミノ酸残基をコードするDNAだけを、開始はAsn971で、そし
て終止はArg1023でクローニングした。(Bell, G.I., Fong, N.M., Stemp
ien, M.M., Wormsted, MA., Caput, D., Ku. L., Urdea, M.S., Rall, L.B. & S
anchez-Pescador, R. ヒト上皮成長因子前駆物質:cDNA配列、インビトロ発
現及び遺伝子組織、 Nucl. Acids Res. 14: 8427 8446,1986.)
ラインであり、融合タンパク質の発現に用いられた。最終表現ベクター、即ちフ
レーム内でEGF(図2に示す)に融合されたH22FdをコードするDNAを
有するpSVgpt構成体が、バイオラッド・ジーン・パルサーを用いる電気穿
孔法によって、H22L鎖をコードするDNAを含有するpSVhygで、既に
形質移入されたNSOに形質移入された。これらのポリペプチドは、ベクター内
に存在するIgプロモーター及びIgエンハンサーによって発現され、これらの
構成体のN末端上に存在するmAb22H鎖ペプチドによって分泌された。形質
移入後一日又は二日間、マイコフェノール酸及びキサンチンを培地に加えて、D
NAを取り込んだ細胞を選択した。結合活性をELISAによって証明した後、
個々の成長コロニーは分離されサブクローニングされた。
大された。融合タンパク質発現クローンは、撹拌培養で拡大かつ成長させ、その
上澄を清澄且つ濃縮させた。抗ヒトカッパ鎖親和性カラム(ステロジーン社、カ
リフォルニア州カールスバッド)上で親和性クロマトグラフィーによって、小規
模な精製を実施した。精製されたタンパク質は、5乃至15%アクリルアミド勾
配ゲル上で非還元性条件下において、SDS−PAGE(SDS(ドデシル硫酸
ナトリウム)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)によって分析した。図3は、
抗Fc受容体−リガンド融合タンパク質の作製を概略図で示したものである。
合する能力を有することを証明するために、フローサイトメトリー・アッセイが
開発された(図4)。このアッセイにおいては、種々の濃度のH22−EGF融
合タンパク質又は二重特異的抗体、即ちBsAbH447(H22XH425、
リガンド結合部位においてEGFRを結合する(E. Merck)マウスモノクローナ
ル抗体M425のヒト化型)を、EGF受容体(EGFR)を発現するセルライ
ンA431細胞(ATCC、メリーランド州ロックビル)と共に定温放置した。
洗浄後、FcγRIの細胞外ドメイン及びヒトIgMのFc部分からなる融合タ
ンパク質を含有する上澄を加えた。最後に、mAb22によって結合された部位
とは別の部位でFcγRIを結合する、フィコエリトリン(PE)標識mAb(
32.2)を加えた。次に、これらの細胞をファックスキャンによって分析した
。或いは、EGFRとの結合は、過剰の(100μg/ml)全マウスmAb4
25(E. Merck)によって遮断し、bsAbの結合、つまり融合タンパク質が、
PE標識抗ヒトIgGによって検出された。
れた。EGFR(A431)を過剰に発現するセルラインは、γインターフェロ
ン(IFN−γ)において24時間培養されたヒト単球による溶解に関する標的
として用いられた。U字底微量定量プレート内でエフェクター細胞及び抗体を結
合させる前に、標的を100μCiの51Crで一時間標識した。37℃で五時
間放置後、上澄を回収して放射能の有無を分析した。細胞障害性は、次式によっ
て計算された。即ち、溶解(%)=(実験用CPM−標的漏出CPM/洗浄剤溶
解CPM−標的漏出CPM)x100%。特異的溶解=抗体を含む溶解(%)−
抗体を含まない溶解(%)。ADCCを媒介する融合タンパク質の能力が、それ
ぞれのBsAbの能力と比較された。25%のヒト血清の存在下においてもこの
アッセイを実施して、IgG又は他のヒト血清中の要素は融合タンパク質介在A
DCCを阻害しないことを証明した。。
入し、マイコフェノール酸及びキサンチンに対する耐性に関して選択されたクロ
ーンを拡大し、融合タンパク質を抗ヒトカッパカラム(ステロジーン社、カリフ
ォルニア州カールズバッド)の上の上澄から親和精製した。精製されたタンパク
質は、SDS−PAGEによって分析した。精製されたタンパク質は、50乃至
55kDaの見かけ分子量で泳動したが、これは融合タンパク質が、ジスルフィ
ド結合二量体ではなく、単量体として発現されていることを示すものである。さ
らに、25kDaの見かけ分子量で、バンドが認められたが、おそらく遊離L鎖
であろう。
合できることを証明するために二重特異的FACS(細胞自動解析分離装置)ア
ッセイが考案された。図5に示すのは、化学的に結合され、完全にヒト化された
BsAbH447(H22(抗FcγRI)xH425)と、以下の例3に記載
されるように作成されたH22−EGF融合タンパク質とが、A431細胞上の
EGFR及び可溶性のFcγRIと、同時に用量依存の態様で結合した。
と結合するマウスmAb(M425)が、融合タンパク質又はH22xH425
結合を阻害する能力によって証明された。種々の濃度のBsAbH447又はH
22−EGF融合タンパク質の何れかを、過剰なM425の存在か又は非存在下
の何れかで、A431細胞と一緒に定温放置した。図6が示すのは、BsAb及
び融合タンパク質の両者の結合がM425によって阻害されたことであり、EG
FRに関する融合タンパク質の特異性を証明する。
て分析した。IFN−γの存在下で24時間培養したヒト単球がエフェクター細
胞として用いられた。図7は、完全な抗体(H425)、BsAbH447(H
22xH425)及びA431細胞の融合タンパク質媒介用量依存溶解を実証す
るものである。図8は、完全な抗体によって媒介されたADCCが、25%のヒ
ト血清(25%HS)によって阻害され且つ一方で、この実験の場合においては
、融合タンパク質媒介ADCCはヒト血清によって増強されたことを証明する。
この融合タンパク質は、生体内に存在するFcγRI発現エフェクター細胞の存
在下であってさえも、EGFR過剰発現細胞を殺す能力があることを証明するこ
とによって、これらの分子の治療上の有用性がこのような結果によって裏打ちさ
れた。
作用するが、それは同時にEGF−Rを過剰発現する腫瘍細胞の成長を阻害する
ようにも作用する(Barnes, D.W. (1982) J. Cell Biol. 93:1, MacLeod, C.L.
et al. (1986) J. Cell. Physiol. 127:175)。EGF及びH22−EGF融合
タンパク質がA431細胞の成長を阻害できることが以下のごとく検査された。
のFabフラグメント又はH425のF(ab’)2フラグメントの何れかを含
有する培地の場合で、2x104A431細胞を六つのウェルプレートに加えた
。七日後に、生存能力のある細胞を血球計数器を使って勘定した。分析は、二重
反復実験で実施し、平均値+/−標準偏差で報告した。
Fは、用量依存の態様で細胞の成長を顕著に阻害したことである。逆に高濃度に
おいてのみ幾らか阻害活性を有したH45のF(ab’)2フラグメント及びH
22のFabフラグメントには阻害活性が見られなかった。
この分子は、適切にフォールドし、且つ両方の受容体と同時結合するのに必要な
融通性を適正に保持し且つ維持したこと分かる。更に、H22−EGFは、EG
F−R腫瘍を発現するセルライン(A431)の増殖を阻害したことで、EGF
と同様に、H22−EGF融合タンパク質は、EGF−Rを介して信号を送るこ
とができることを示す。H22−EGFはまた、FcγRIを発現するエフェク
ター細胞の存在下で、A431細胞を殺す潜在能を媒介する。よって、H22−
EGFは、EGF−Rを発現する細胞に対する、細胞障害性及び細胞増殖抑制性
の両方の効果を媒介する。腫瘍細胞を有する被験体にH22−EGFを投与する
と、潜在的には三つの異なる態様、即ち、細胞障害、成長阻害及び食菌作用によ
って、体に本来ある細胞障害性エフェクター細胞を動員して腫瘍細胞を殺す媒介
を行うことになろう。さらに、腫瘍細胞の細胞媒介性細胞障害に加えて、H22
−EGFによって動員されたエフェクター細胞は、炎症性のサイトカインの分泌
及び/又は腫瘍特異的T細胞に腫瘍抗原をプロセシングしかつ提示することによ
って、抗腫瘍免疫性をさらに増大させることもできる。
致死の媒介
。これら受容体は両方とも幾つかの乳癌細胞に過剰発現されることがある分子H
ER2と共に異質二量体を形成できる。HER3及びHER4に関するHRGの
親和性は、これらの分子が分子HER2と異質二量体を形成する場合に著しく増
大する。この例によって分かることは、ヘレグリン及びFcγRIに関する結合
特異性を包含する二重特異的分子は、腫瘍セルラインの成長を阻害し、かつFc
γRI担持細胞障害性エフェクター細胞の存在下においてこれらの細胞の融合タ
ンパク質依存型細胞侵害性を媒介するということである。
パク質と同じ方法で構成することができる。簡単に説明すると、ヒト化抗Fcγ
RImAb(H22)のFdフラグメントをコードするゲノムDNAを、HRG
のβ2型のEGFドメインをコードするcDNAに融合させた。H22−HRG
融合タンパク質(配列ID番号4)のアミノ酸配列が図10に示されている。こ
の融合タンパク質は、米国特許第5,367,060号に示されているヘレグリ
ンβ2のアミノ酸171乃至239からなる。ヘレグリンβ2の他の部分も、米
国特許第5,367,060号に開示されたような、他のヘレグリン分子の部分
同様、用いてもよい。得られたH22Fd−HRG発現ベクターを、H22カッ
パL鎖をコードするDNAを含有するベクターで形質移入済みの骨髄腫セルライ
ンに形質移入した。結果として得られた融合タンパク質は、それがH22Fab
成分のヒンジ領域における遊離Cys残基を含んではいるが、モノマーとして概
ね発現された。フローサイトメトリーの結果、この融合タンパク質は、FcγR
発現細胞とばかりでなく、HER2を過剰発現する腫瘍セルライン(SKBR−
3)とも結合できることが分かった。
合タンパク質を発現する骨髄腫細胞の上澄を3倍乃至30倍に希釈して、IFN
処理単球の存在下において、100対1の単球と標的腫瘍細胞との比率で、HE
R2、HER3及びHER4を発現するPC−3細胞もしくはSKBR−3腫瘍
細胞に加えた。これらの単球は、IFN−γで処理し、これらの標的細胞は、例
2の記載の如く51Crで標識した。特異的な溶解のパーセントは、例2と同じ
く計算された。その結果は、図11に示す。この結果が示唆するのは、約45%
のSKBR−3細胞及び約49%までのPC−3細胞は、三倍に希釈した上澄と
一緒にこれらの細胞を定温放置すると溶解されることである。
存在下において、SKBR−3腫瘍細胞の成長を阻害し且つこれらの細胞の融合
タンパク質依存性細胞障害性を媒介する。よって、この例の結果が示すのは、抗
FcγRI−HRG融合タンパク質は、生理学的な条件下において抗腫瘍細胞障
害的活性を媒介できることをであり、且つこのような融合タンパク質は、種々の
癌の処置における治療上の有用性を有することが示されている。
と同様に作製された。しかし、ボンベシンは短いペプチド(14個のアミノ酸残
基)なので、ボンベシンをコードするcDNAをPCR(ポリメラーゼ連鎖反応
)技術を用いて増幅するのではなく、ボンベシンのセンス及びアンチセンス鎖を
コードするDNAオリゴノマーを交雑させてコード領域を創製した。H22抗体
のH鎖のC末端に融合したボンベシンペプチドのアミノ酸配列は次のものである
。
l−Gly−His−Leu−Met−Gly−(配列ID番号5)
71) Experientia 27:166)、ペプチドのC末端における付加的なグリシン残基を
含む。これらのオリゴマーは、その重複端部は交雑はしなかったが、その代わり
にN末端上のXhol部位及びC末端上のNotI部位に関する付着端を創製す
るので、その部位は、上記のH22H鎖発現ベクターにクローン化され得た。
H22−EGFおよびH22−ヘレグリン融合タンパク質に関して記載したよう
な方法で検査した。簡単に説明すると、PC−3腫瘍細胞担持ボンベシン受容体
を51Crで標識し、単球及び種々の濃度のH22融合タンパク質と一緒に定温
放置して、上記記載の如く、融合タンパク質依存性溶解を測定した。図12に示
した結果は、標的細胞が溶解したことと、アッセイに加えた融合タンパク質の量
に比例して、標的細胞溶解のレベルが増加することを示している。
4(エイズレポジトリー)又はgpl20(エイズ・レポジトリー)を有する融
合タンパク質も同様に作製された。
る発現ベクターは、「ヒト単核貪食細胞上の免疫グロブリンに関するFc受容体
に対するヒト化抗体」と題する国際特許出願公開第WO94/10332号おい
て記載されている。Fab’の構成体に関してはL鎖を変更する必要があった。
しかし、H鎖に関しては、CH2およびCH3ドメインは、除去し且つ末端コド
ンに置き換えねばならなかった。H鎖ベクターには二つのBamHI部位が含ま
れており、一つはVH及びCHl間のイントロンの中に、そして他方はCH3の
すぐ下流側に存在する。BamHI制限部位を使用して、恒常ドメインをコード
するDNAは、CH1とヒンジの大部分だけをコードする切断型と置換した。こ
うするために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用して、図1に示した変更
部を有するH鎖フラグメントの新たなC末端を作製した。図1Bに、切断された
単一スルフヒドリル形の作製に関する変更を示す。
ラインであり、改変H22抗体の発現に用いた。最終表現ベクター、即ち、H2
2FdをコードするDNAを持つpSVgpt構成体は、バイオラッド・ジーン
・パルサーを用いる電気穿孔法によって、H22L鎖をコードするDNAを含む
pSVhyg構成体で同時形質移入された。これらのポリペプチドは、ベクター
内に存在するIgプロモーター及びIgエンハンサーによって発現され、これら
の構成体のN末端上に存在するmAb22H鎖シグナルペプチドによって分泌さ
れた。形質移入後一日又は二日間、マイコフェノール酸及びキサンチンを培地に
加えて、DNAを取り込んだ細胞を選択した。FcγRIの結合活性が実証され
た後、個々の成長コロニーは分離されサブクローニングされた。
それぞれの形質移入されたNSO細胞のインビトロ培養によって作製した。H4
25は、プロテインA親和性クロマトグラフィーによって精製した。単一スルフ
ヒドリル形のH22抗体は、Q−セファロースに続いてSP−セファロース(フ
ァーマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェー)を使用してイオン交換クロ
マトグラフィーによって精製された。単一スルフヒドリル形のH22抗体の精製
は、SDS−PAGEによって評価した。
7),チオエーテル結合の二重特異的F(ab’γ)2抗体の調製及び性能, J. Im
munol., 139:2367)。H425のF(ab’)2は、0.1Mのクエン酸塩緩衝
液で、pH3.5において、制限ペプシンタンパク質加水分解によって作製され
、F(ab’)2は、イオン交換クロマトグラフィーによって精製された。 m
Abは、20mMのメルカプトエタノールアミン(MEA)を加えることによっ
て、30℃で30分間還元された。Fab’フラグメントは、50mMの酢酸ナ
トリウム、0.5mMのEDTA(pH5.3、4℃)中で平衡させたセファッ
デクスG−25カラムにかけた。ジメチルホルムアミドに溶解させ且つメタノー
ル/氷の溶液中で冷却したオルトフェニレンジマルイミド(o−PDM、12m
M)をH22Fab’に加えて(半量)、さらに氷上で30分間定温放置した。
次に、50mMの酢酸ナトリウム、0.5mMのEDTA(pH5.3、4℃)
中で平衡させたセファッデクスG−25カラムにおいて、遊離o−PDMからこ
のFab’−マレイミダを分離した。BsAbの調製に関しては、1.2対1の
モル比で、H22Fab’−マレイミドをH45Fab’に加えた。アミコンチ
ャンバ内で、デアフロ膜を用いて、窒素存在下において、これらの反応体を出発
量まで濃縮した(全て4℃)。18時間後に、pH8.0の1MのトリスHCL
でそのpHを8.0に調節した。次いで、この混合物を10mMのMEAで還元
し(30℃で30分間)且つ25mMのヨードアセトアミドでアルキル化した。
PBSにおいて平衡させたスーパーデックス200(ファーマシア社、ニュージ
ャージー州イスカタウェー)カラムによって生じた、非反応Fab’及び他の作
製物から、二重特異的F(ab’)2を分離した。
のばかりでなくo−PDM(オルトフェニレンジマルイミド)法によって作製さ
れたBsAbが、FcγRI及びEGERと同時に結合できることを証明するた
めに、フローサイトメトリーアッセイが開発された(図13)。このアッセイに
おいては、種々の濃度の二つのBsAbが、A431細胞(EGF受容体、つま
りEGFR受容体を発現するセルライン)と一緒に定温放置された。洗浄後、F
cγRIの細胞外ドメイン及びIgMのFc部分からなる融合タンパク質を含有
する上澄がこれらの細胞と一緒に定温放置された。最後に、これらの細胞を、F
ITC標識抗ヒトIgM特異的抗体と一緒に定温放置した。その後、これらの細
胞を、FACSCANによって分析した。
R(A431)を過剰に発現するセルラインは、γインターフェロン(IFN−
γ)において24時間培養されたヒト単球による溶解に関する標的として用いら
れた。平底微量定量プレート内で、エフェクター細胞及び抗体を結合する前に、
標的を100μCiの51Crで一時間標識した。37℃で16時間放置後、上
澄を回収して放射能の有無を分析した。細胞障害性は、次式によって計算した。
即ち、溶解(%)=(実験用CPM−標的漏出CPM/洗浄剤溶解CPM−標的
漏出CPM)x100%。Ab依存性溶解=抗体を含む溶解(%)−抗体を含ま
ない溶解(%)。
された。マイコフェノール酸及びキサンチンに対する耐性に冠して選択されたク
ローンが展開され、このタンパク質は、Q−セファロースに続きSP−セファロ
ースによって上澄から精製された。精製されたタンパク質は、SDS−PAGE
によって分析した。精製されたタンパク質は、50kDaの見かけ分子量で泳動
したが、これは融合タンパク質が、ジスルフィド結合二量体ではなく、単量体と
して発現されていることを示すものである。
らなるBsAbの作製及び特性説明 BsAbは、単一スルフヒドリル形のH22がH425のFab’フラグメン
ト、即ち、ヒト化抗EGFRmAbに結合した所に構成された。BsAbは、o
−PDMをリンカーとして用いてGlennie等の方法によって作製されている(Gle
nnie, M.J. et al., (1987), チオエーテル結合Fab’γフラグメントを含有
する抗体である二重特異的F(ab’γ)2の調製及び性能、 J. Immunol., 13
9:2367)。BsAbの活性が、完全H22のペプシン消化及び還元から作製され
たFab’フラグメントを用いるDTNB法によって作製されたものと比較され
た。これらのBsAbがFcγRI及びEGFRと同時結合できることを証明す
るために、三重特異的FACSアッセイが考案された。図14は、o−PDM結
合BsAb及びDTNB法によって作成されたBsAbの両者が、用量依存の態
様で、A431細胞上のEGFR及び可溶性のFcγRIと同時に結合したこと
を示す。
ることで分析した。IFN−γの存在下において24時間培養されたヒト単球は
、エフェクター細胞として用いた。図15は、A431細胞の二つのBsAb媒
介用量依存性溶解を比較可能な態様で示す。これらの結果によって、切断型、単
一スルフィドリル形のH22は、FcγRI発現エフェクター細胞の存在下にお
いてEGFR過剰発現細胞を殺すことができることが証明された。
1) M22及び520C9は、イオン交換クロマトグラフィー(ファーマシア社、
ニュージャージ州ピスカタウェー)によってハイブリドーマ上澄から精製され、
520C9は更にプロテインA親和性クロマトグラフィー(ファーマシア社、ニ
ュージャージ州ピスカタウェー)によって精製された。H425は、タンパク質
A親和性クロマトグラフィー(ファーマシア社、ニュージャージ州ピスカタウェ
ー)によってハイブリドーマ上澄から精製された。M22及び520C9から作
製したマウスハイブリドーマは、既に記載がなされている(Guyre et al., (198
9) FcgRI上の別個のエピトープに結合するモノクローナル抗体は、受容体
機能を惹起することができる。 J. Immunol. 143:5, 1650-1655; Frankel et al
., (1985) モノクローナル抗体によって定義された乳癌関連抗体の生体内分布、
J. Biol. Response Modifiers, 4:273-286)。マウス骨腫瘍NSO(ECAC
C85110503)は、非Ig合成ラインであり、ヒト化mAb、即ちH42
5の発現に用いられた(Kettleborough et al., (1991)CDR移植によるマウス
モノクローナル抗体のヒト化:ループ立体配座上のフレームワーク残基の重要性
, Protein Eng., 4:773)。SKBR3(ATCC、メリーランド州ロックビル
)、即ち、HER2/neuプロト腫瘍遺伝子を過剰発現するヒト乳癌腫セルラ
イン、及びA431(ATCC、メリーランド州ロックビル)、即ち、EGFR
を過剰発現するヒト有棘細胞癌腫セルラインが、イスコーブの改変ダルベッコ培
地(IMDM、ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド)において培養さ
れた。
スカタウェー)勾配分離法により単核細胞から分離した。FcγRIを上方制御
するために、好中球はサイトカインで処理した。好中球は、2.5%の正常なヒ
トAB型血清(シグマ社、ミズーリー州セントルイス)、50ng/mlのG−
CSF(ドイツのエアランガーErlanger大学のR. Repp氏の好意により提供され
る)及び100IRU/mlのIFN−γを含有するAIMV培地(ギブコ社、
ニューヨーク州グランドアイランド)において24乃至48時間(37℃、5%
CO2)培養した。
1987), チオエーテル結合Fab’γフラグメントを含有する抗体である二重特
異的F(ab’γ)2の調製及び性能、 J. Immunol., 139:2367)。mAbM2
2、520C9(抗HER2/neu、33)及びH425(抗EGFR)抗体
は、それぞれのハイブリドーマ細胞のインビトロ培養で作製された。各抗体のF
(ab’)2は、0.1Mのクエン酸塩緩衝液で、pH3.5において、制限ペ
プシンタンパク質加水分解によって作製され、F(ab’γ)2 は、イオン交
換クロマトグラフィーによって精製された。mAbM22及びH425は、20
mMのメルカプトエタノールアミン(MEA)を加えることによって、30℃で
30分間還元された。Fab’フラグメントは、50mMの酢酸ナトリウム、0
.5mMのEDTA(pH5.3、4℃)中で平衡させたセファッデクスG−2
5カラムにかけた。ジメチルホルムアミドに溶解させ且つメタノール/氷の溶液
中で冷却したオルトフェニレンジマルイミド(o−PDM、12mM)をマウス
22Fab’に加えて(半量)、氷上で30分間定温放置した。次に、50mM
の酢酸ナトリウム、0.5mMのEDTA(pH5.3、4℃)中で平衡させた
セファッデクスG−25において、遊離o−PDMからこのFab’−マレイミ
ダを分離した。BsAbの調製に関しては、1対1のモル比で、M22Fab’
−マレイミドをH425Fab’に加えた。アミコンチャンバ内で、デアフロ膜
(商品名)を用いて、窒素存在下において、これらの反応体を出発量まで濃縮し
た(全て4℃)。18時間後に、pH8.0の1MのトリスHClでそのpHを
8.0に調節した。次いで、この混合物を10mMのMEAで還元し(30℃で
30分間)且つ25mMのヨードアセトアミドでアルキル化した。PBS(食塩
加リン酸緩衝液)において平衡させたスーパーデックス200(ファーマシア社
、ニュージャージー州イスカタウェー)カラムによって生じた、非反応Fab’
及び他の生成物から、二重特異的F(ab’)2を分離した。BsAbM22x
520C9は、H425の代わりに520C9を用いた以外は同様の態様で作製
された。
された(図16)。 最初の段階においては、最終的な還元及びアルキル化では
なく、反応体がDTNBで処理されて残余の遊離スルフィドリル基を遮断した以
外は、上述のように、M22をH425と結合させてM22xH425BsAb
を創製した。二価BsAbは、スーパーデックス200カラム上でゲル濾過する
ことによって精製し、F(ab)’2(SH)に還元して、1対1のモル比でo
−PDM処理した520C9と混合された。こうして得られた三重特異的F(a
b)3は、スーパーデックス200カラムにおいて精製された。このTsAbは
、TSK3000カラム(トージョーハース社、日本)を用いてHPLCサイズ
・エクスクルージョン・クロマトグラフィーによって分析した。上記と同じ方法
で、m22Fab’x32.2Fab’xm22Fab’を含む別のTsAbが
作製された。
及びFcγRIとも同時結合できる。A431細胞(高度EGFR発現細胞)又
はSKBR−3(高度HER2/neu発現細胞)の何れかを、種々の濃度のB
sAB(M22x520C9又はM22xH425)又はTsAb(M22xH
425x520C9)の何れかと一緒に定温放置した。これらの細胞は洗浄後、
可溶性のFcγRIと一緒に定温放置した。可溶性FcγRI結合が、22結合
部位とは別個の部位においてFcγRIと結合するmAb32.2−FITCで
検出された。これらの細胞は、次にFACSCANによって分析された。
又はA431細胞の何れかを用いた。U字底微量定量プレート内で、好中球及び
抗体と結合する前に、標的を100μCiの51Crで一時間標識した。37℃
で16時間放置後、上澄を回収して放射能の有無を分析した。細胞障害性は、次
式によって計算した。即ち、溶解(%)=(実験用CPM−標的漏出CPM/洗
浄剤溶解CPM−標的漏出CPM)x100%。特異的溶解=抗体を含む溶解(
%)−抗体を含まない溶解(%)。アッセイは、三重反復実験で実施した。
いた。アッセイの方法は、拡大フローチャート(図23A参照)に示す。図23
Bは、10μg/mLのこのBsAbで処理することによって、単球上のFcγ
RI発現が、処理前のレベルのおよそ50%に減少したことを示している。
法の第一段階においては、M22が、H425に結合され、DTNBで処理され
て、得られた二重特異的F(ab’)2がゲル濾過によって精製された。第二段
階においては、この二重特異的F(ab’)2 を、還元され且つo−PDM処
理520C9Fab’と混合して、TsAb(M22xH425x520C9)
が得られた。このTsAbが図17に示されている。この図においては、Fab
’−AはM22、Fab’−BはH425、そしてFab’−Cは520C9を
表す。
uと同時に結合できることを証明するために、二重特性FACSアッセイが考案
された。このアッセイは、図18Aにシグナルしか発生しなかった示してある。
図19は、用量依存の態様で、TsAbが、SKBR−3上のHER2/neu
と可溶性FcγRIとの両者に同時に結合したことが示す。BsAb(M22x
H425)は、広範囲の濃度に亘ってこのアッセイにおいてごくわずかなシグナ
ルしか発生しなかった。TsAb(M22xH425x520C9)が、Fcγ
RI及びEGFRと結合できることを証明するために、EGFR過剰発現セルラ
イン(この場合はA431)を用いる同様なアッセイが考案された。このアッセ
イは図18Bに概略的に示す。図20が示すのは、TsAb及びBsAb(M2
2xH425)の両者とも、A431細胞上のEGFR及び可溶性のFcγRI
と用量依存の態様で同時に結合したことである。BsAb(M22x520C9
)は、広範囲の濃度に亘ってこのアッセイにおいてごくわずかなシグナルしか発
生しなかった。
かを標的として用いて分析された。IFN−γ及びG−SF存在下において24
乃至48時間培養したヒト好中球が、エフェクター細胞として用いられた。図2
1によって、BsAb(M22x520C9)及びTsAb(M22xH425
x520C9)は、SKBR−3細胞の溶解を媒介するが、BsAb(M22x
H425)はしなかったことを証明している。他方、図22においては、BsA
b(M22xH425)及びTsAbは、SKBR−3細胞の溶解を媒介したが
、BsAb(M22x520C9)はしなかったことを証明する。この結果証明
されたことは、TsAbは、FcγRIを過剰発現するエフェクター細胞の存在
下においてHER2/neu及びEGFRを過剰発現する細胞の両者を殺すこと
ができたことである。
が含まれていた。このような三重特異的抗体は、単一スルフィドリル形のヒト化
抗FcγRImAb(H22)を用いて作製することができた。唯一の相違は、
単一スルフィドリル形は、この抗体のF(ab’)2フラグメントとして分泌さ
れることであった。この単一スルフィドリル形は、Q−セファロースに続いてS
P−セファローズ(ファーマシア社ニュージャージー州ピスカタウェー)を用い
るイオン交換クロマトグラフィーを利用して、培養上澄から精製することができ
る。単一スルフィドリル形のH22が精製されれば、この試薬を使う三重特異的
抗体は、M22のF(ab’)2フラグメントを用いる上記と同一の方法で創製
されよう。
伝子的に移植された抗原ペプチドは、抗原単独の場合に比べて、抗原による抗原
提示及びT細胞刺激の効率が顕著に増大すること、及び(b)抗FcγRI抗体
の恒常領域上に遺伝子的に移植されたアンタゴニストペプチドは、アンタゴニス
トペプチド単独の場合に比べて、T細胞刺激阻害の効率が顕著に増大することで
ある。よって、このような融合タンパク質は、インビボでの抗原提示細胞へのペ
プチド輸送を効果的に増大させることになり、したがって種々の治療法に有用と
なろう。
用いた。テタヌス・トキソイド(TT)は、アクラクト・ケミカル社(ニューヨ
ーク州ウエストベリー)から購入した。マウス抗FcγRImAb22の無菌で
低い内毒素性F(ab’)2フラグメント及び二重特異的Ab、即ちMDXH2
10(抗HER2/neu腫瘍AgmAb520C9のFab’と化学的に結合
した、ヒト化Ab22のFab’からなる)は、メダレックス社(ニュージャー
ジー州アナンデール)から提供された。TTのユニバーサルThエピトープ、即
ち、TT830−844(QYIKANSKFIGITEL(配列ID番号6)
、以後TT830と呼ぶ)(Valmori D. et al. (1994) J. Immunol. 152:2921-
29)及びこのエピトープの変異形、即ち、TT833S(QYISANSKFI
GITEL)(配列ID番号9)、833位においてセリンに変更されたリジン
)は、ペプチドジェニック社(カリフォルニア州リバーモア)によって合成され
、純度は95%より高く精製された。別のTTユニバーサルThエピトープ、即
ち、TT947−967(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(配列
ID番号12)、以後TT947と呼ぶ。純度は80%より高い)(Valmori D.
同上)は、この研究では制御ペプチドとして用いられた。市販されている静脈
注射(IVI)用ヒトIgGは、遮断実験に用いた。
。CD4+、即ち、ペプチドTT830−特異的T細胞は、TT特異的Tセルラ
インに関する既述のプロトコルから改変された(Gosselin E.J. (1992) J. Immu
nol. 149:3477-81)。簡単に説明すると、単核細胞は、フィコール・ハイパック
を用いて末梢血から分離された。150x106個の単核細胞が、50mlのA
IMV培地において10μMのTT830で刺激された。5%のCO2下のイン
キュベータにおいて、三日間37℃で定温放置後、10mlのHEPES緩衝R
PMI1640でフラスコ1Xを洗浄することによって、非付着物(殆どが非特
異的細胞)を取り除くと、そのフラスコには、付着した単球と共に特異的T細胞
のコロニーが残った。50mlのAIMVプラス20U/mlのヒトIL−2(
イムネックス社、ワシントン州シアトル)、及び1ml(最終濃度2%)のヒト
のプール血清をこのフラスコに加えた。10乃至14日間放置後、T細胞を採取
し、死んだ細胞をフィコール・ハイパックによってペレット化すると、高度に培
養強化された個体群(95乃至98%)の生きたCD4+、即ち、Ag特異的T
細胞が作製された。T細胞が、図3に示すように、TT830ペプチドに関して
特異的であることが確認された。大量の単球を、低温凝集法(Mentzer S.J. et
al. (1986) Cell. Immunol. 101:132)を用いてロイコフォレシス・パックから
精製して、80乃至90%の純度が得られた。単球及びT細胞の両方を将来使用
するために等分割して冷凍したが、解凍すると正常に機能することが分かった。
00rad、105/ウェル)及び種々の濃度のペプチドTT830融合タンパ
ク質Fab22−TT830を一緒に、最終量200μl/ウェルで、平底の9
6ウエル組織培養プレートにおいて二日間定温放置した。 次に、10μl(1
μCi/ウェル)3H− チミジンを各ウエルに加えた。一晩放置した後、プレ
ートを回収して液浸計数装置で数を測定した。T細胞の増殖は、三重反復試験の
平均計数/分(1分間のカウント)±標準偏差で表示した。バックグラウンドC
PM(抗原を含有しないT細胞及び単球)を全データポイントから差し引いた。
APL(改変されたペプチドリガンド)を用いる実験は、Sette等によって報告
されたものと同様のプロトコルに従って実行した(De Magistris (1992) Cell 68
:625)。阻害アッセイに関して簡単に説明すると、放射能照射した単球は、種々
の濃度のTT833S又はFab22−TT833Sで一晩処理した後、20n
MのTT830及びT細胞を加えた。さらに二日間放置した後、T細胞を上記の
ように測定した。「プリパルシング」実験においては、10μMのTT833S
又は0.1μMのFab22−TT833Sを加える前に、放射能照射した単球
を20nMのTT830で4時間に亘りパルスした。一晩定温放置した後、T細
胞を加えた。更に二日間放置後、放射能照射した単球及びTT833Sもしくは
Fab22−TT833Sで、T細胞を一日刺激し、フィコール・ハイパックで
遠心分離した後、回収して、二日間、単球及び種々の濃度のTT830で再度刺
激した。次に、T細胞増殖を3H−チミジンの取り込みによって測定し、三重反
復試験の平均CPM(1分間のカウント)をグラフにした。幾つかのケースにお
いては、阻害パーセンテージを次式によって計算した。即ち、阻害(%)=(C
PM無阻害物質−CPM阻害物質)/CPM無阻害物質X100。全実験は少な
くとも三回反復した。
90年)。簡単に説明すると、30μlのRPMI(培地もしくは培養液)とF
ab−TT830、Fab−TT833Sの何れかを含むタンパク質とを含有す
る1mg/mlのBSA(ウシ血清アルブミン)、或いは、種々の濃度のBsA
bMDXH210を、4℃の96−ウエルプレートの個々のウエルに加えた。4
℃で一時間定温放置した後、プレートを遠心分離し、上澄を除去して、細胞をP
BS(食塩加リン酸緩衝液)/BSAで4℃において三回洗浄した。次に、40
μl/ウェルのFITC標識したF(ab’)2ヤギ抗ヒトIgG(ジャクソン
・イミュノリサーチ・ラボラトリーズ社、ペンシルバニア州ウエストグローブ)
と一緒に定温放置した後、PBS/BSAで三回洗浄し、さらに1%のパラフォ
ルムアルデヒド(コダック社、ニューヨーク州ロチェスター)を含有するPBS
/BSA中に再懸濁させた。次に、細胞をFACScan(ベクトン・ディキン
ソン社、カリフォルニア州マウントビュー)によって検査して、平均蛍光強度(
MFI)を測定した。
、使用するまで冷凍した。これらの試料からのIFN−γ(インターフェロンγ
)及びIL−4(インターロイキン4)のレベルを、特異的ELISAによって
測定した。IFN−γ及びIL−4特異的ELISAに関するAb(抗体)対は
、ファーミンゲン社(カリフォルニア州サンディエゴ)から購入した。ELIS
A(酸素結合免疫吸着検査法)アッセイは、製造業者のプロトコルにしたがって
実施した。
に、以下に記載の方法にしたがって、各ペプチドをコードする合成オリゴヌクレ
オチドをヒト化抗FcγRImAb22(H22)のH鎖ヒンジ領域に別個に作
製した。
によってヒト化された(上記及びGraziano R. F. et al. (1995) J. Immunol. 15
5:4996-5002を参照)。H22のH鎖(pSVgpt)のゲノムクローンに関する
発現ベクターを改変して、他の分子、この場合においてはTTペプチドに関する
コード化配列を取り込むことができた。CH1,ヒンジ、及び、新たに設計した
XhoI及びNotIクローニング部位、を含有するこのベクターのBamHI
フラグメントをpUC19のBamHI部位へ挿入してベクターpUC19/H
22CH1(X+N)を作製した。このベクターを用いて、以下に記載の如く、
TTペプチドコードするオリゴヌクレオチド配列をクローン化した。
ド化領域のN末端上にXhoI部位及びC末端上にNotI部位を有するように
設計された(図24A参照)。これらのオリゴヌクレオチドは、ジェノシス(バ
イオテクノロジー社、テキサス州ウッドランド)によて合成かつ精製された。次
に、合成オリゴヌクレオチドを、クローニングベクターpUC19/H22CH
l(X+N)にアニールし、且つ結合した。 TTペプチドに関するコード化配列を取り込んだクローンは、制限地図によって
スクリーニングされた。次に、CH1、ヒンジ及びTT830もしくはTT83
3Sを含有するBamHIが、pUC19から切断されて、既にVHを含有した
発現ベクターへ挿入された。TTペプチドと融合されたH22H鎖の最終的な発
現構成体が図24Bに示されている。
あり、H22−TT融合タンパク質の発現に用いられた。まず、H22L鎖コー
ド化配列を含有するpSVhygベクターで、NSO細胞を形質移入した。次に
、TTコード化配列にフレーム内融合されたH22H鎖Fd配列を含有する発現
ベクター構成体で、NSO細胞を発現するH22L鎖を形質移入した(図24B
)。バイオラッド・ジーン・パルサー電気穿孔法装置を使って、200V及び9
60μF(ファラド)を用いる形質移入を実施した。形質移入から一日又は二日
後、マイコフェノール酸(0.8μb/ml、シグマ社)及びキサンチン(2.
5μg/ml、シグマ社)を媒体に加えて、首尾よく発現ベクターを内部移行済
みのトランスフェクタントを選択した。個々のコロニーは、フローサイトメトリ
ーによって示したように、培養上澄がU937細胞上のFcγRIと結合する活
性度に基づいて分離された。陽性コロニーは、限界希釈することでサブクローン
化した。
22−TT833S融合タンパク質を発現するクローンpM4とをローラーボト
ル培養で拡大した。上澄は、清澄しかつ濃縮した。親和性クロマトグラフィーに
よって小規模な精製を抗H22親和カラム上で実施した。非還元条件下における
5乃至10%のアクリルアミド勾配ゲルのSDS−PAGE分析によって、これ
らの融合タンパク質の純度は90%より高く、また見込み通り50kDaの分子
量を得た。タンパク質濃度は、IgGFab’の吸光係数=1.53を使用して
280nmでの吸光度で測定した。
、Fab22−TT830及びFab22−TT833Sの能力であった。同一
のFcγRI結合成分(ヒト化mAb22のFab’)を含有する、既述の二重
特異的抗体(Ab)、即ち、MDXH210を陽性対照として使用した。融合タ
ンパク質及びMDXH210と、構成的にFcγRIを発現するU937細胞と
の結合は、FITC標識された、ヒトIgGに関して特異的なヤギ抗体による染
色、及びフローサイトメトリーによって測定された。図24A及び24Bに示し
たように、融合タンパク質(Fab22−TT830及びFab22−TT83
3S)は、MDXH210と同様に用量依存の態様で、U937細胞と結合した
。融合タンパク質の結合は、マウス抗ヒトFcγRImAb22F(ab’)2 によって完全に遮断され、FcγRIに関する融合タンパク質の特異性を証明し
た。
1000倍増強される、という事実 融合タンパク質、即ち、Fab22−TT830を抗原(Ag)提示アッセイ
において使用して、Thエピトープ、即ち、TT830が、H22の恒常領域に
おいて発現された場合、単球によって効果的に自己由来のT細胞に対して提示さ
れ得るかを測定した。図26に示すように、同一レベルのT細胞の増殖を達成す
るのに必要なFab22−TT830は、TT830単独の場合に比べると、お
よそ1000倍少ない量であった。さらに、図26によると、Fab22−TT
830の提示は、無傷のTTを提示する場合に比べると、およそ10,000倍
効率的であったことが分かり、Fab22−TT830の提示が増強されたのは
、単に分子量が大きくなったせいでなく、TT830ペプチドではなく、Fab
22−TT830の安定性が増強されたからもないことを示している。別の抗原
性TTエピトープ、即ち、TT947は、これらのT細胞を刺激することができ
なかったので、これらのT細胞はTT830に関して特異的であることが確認さ
れた。よって、これらの結果は、H22の恒常領域において発現されたThエピ
トープは、効果的かつ特異的に提示され得ることを明確に証明している。
(Ag)提示の増強を排除する、という事実 ペプチド提示が融合タンパク質の使用によって増強されることに、FcγRI
が媒介するのかどうかを直接的に測定するために、Fab22−TT830又は
TT830ペプチドを加える前に、mAb22F(ab’)2で一時間単球を処
理することによって、抗原提示する単球上のFcγRIにFab22−TT83
0が結合するのを遮断した。融合タンパク質による、ペプチド提示の増強は、m
Ab22F(ab’)2によって排除されたが、TT830の提示は影響を受け
なかった(図27)。FcγRIにmAb22F(ab’)2が結合しても、遊
離ペプチドの提示の増強に至らなかったことから、FcγRIにmAb22が結
合するだけでは、抗原提示を増強するようには、単球の機能状態を変更すること
はなかったことが示唆される。よって、抗原提示に対する観察された増強効果を
得るには、抗FcγRIAb22にペプチドが結合する必要があることが分かる
。このことは、このような提示の増強は、おそらくFcγRIによって抗原が効
率的に捕捉された結果であることを示唆する。
によって影響を受けない、という事実 生理学的な条件下では、FcγRIのリガンド結合ドメインは、この受容体に
対してAgAb(抗原抗体)が効率的に標的にするのを妨害するIgGによって
飽和されている。mAb22の誘導体を使ってFcγRI機能を惹起するという
他にない利点は、Ab22がリガンド結合ドメインの外でエピトープに結合する
ことである。したがって、ADCC(抗体依存性細胞障害)のような、mAb2
2によって惹起される機能は、生理学的なレベルのIgGによって阻害されない
(Gosselin E. J.,同上, Guyre P. M. (1989) J. Immunol. 143-1650-55)。同様
に、融合タンパク質Fab22−TT830を使うTT830提示の増強がIg
Gによって阻害されなかった(図28)ことは、H22を基体にした融合タンパ
ク質も、FcγRIに対してペプチドAgをインビボで向かわせる効果的な方法
であることを示唆している。
N−γ(インターフェロンγ)及びIL−4(インターロイキン4)の産生が増
加される。 活性されると、T細胞は、増殖によるクローン拡大を経るばかりでなく、IF
N−γ及びIL−4のようなサイトカインを産生して、B細胞分化及び単球活性
化というそのエフェクター機能を働かせる(Paul W. E. and Seder, R. A. (1994
) Cell 76:241-251)。したがって、H22融合タンパク質によるAg提示の増強
後の、IFN−γ及びIL−4の産生を調べた。図28A及び28Bに示すよう
に、IFN−γ及びIL−4の両方の産生レベルが、特に最適以下のAg濃度に
おいて、Fab22−TT830によって増強された。しかし、これらの実験に
おいては、サイトカイン産生に関する増強(約20倍)は、T細胞増殖に関する
増強(約600倍)よりも少なかった。
ープを、ヒト単球によって効果的にプロセシング且つ提示することができ、T細
胞の活性化及びサイトカインの産生が増強されるようになる。
増殖は刺激されない。 自生のT細胞エピトープから一つ又は二つのアミノ酸が変更されたものを含有
するペプチド(Allenと共同研究者により改変ペプチド・リガンド(APL)と
命名された)は、T細胞の活性化に関して、アゴニストもしくは部分的なアゴニ
ストであり、或いはアンタゴニストでもあることが分かっている(Sette et al.
(1994) Ann. Rev. Immunol. 12:413 and Evavold et al. (1993) Immunol. Toda
y 14:602)。TCR(T細胞受容体)を介する、特異的なT細胞によるAPLの
認識は、場合によっては、部分的なシグナル伝達を惹起して、(i)超抗原によ
る、T細胞刺激の阻害(Evavlold et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 91:2300)、T細胞アネルギー(Sloan-Lancaster et al. (1993) Nature 363
:156 and Sloan-Lancaster et al. (1994) J. Exp. Med. 185:1195)又は(ii
i)Th1/Th2の変調(Nicholson et al. (1995) Immunity 3:397; Pfeif
fer et al. (1995) J. Exp. Med. 181:1569; and Windhagen et al. (1995) Imm
unity 2:373)をもたらすことがある。部分的アゴニストはアネルギーを誘導す
ることもできる。APL(改変ペプチド・リガンド)のなかには、TCR(T細
胞受容体)との相互作用時には何ら検出され得るようなシグナリング事象を惹起
しないが、野生型ペプチド抗原に反応して、TCRアンタゴニストとして機能し
、T細胞の増殖を阻害できるものある。したがって、このようにTCRアンタゴ
ニストと呼ばれている(De Magistris et al. (1992) Cell 68:625 and Ruppert
et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2671)。
のT細胞エピトープTT830に関するアンタゴニスト・ペプチド、及びFab
22−TT833Sが、T細胞の増殖を刺激し得ないことである。図30に示す
如く、TT833Sに関して100μM、及びFab22−TT833Sに関し
て1μMもの高レベルの用量においてさえも、TT830に特異的なT細胞の有
意な増殖は一切観察されなかった。このことが示すのは、TT830ペプチドの
833位におけるリシンからセリンへの変更によって、このT細胞エピトープの
T細胞反応性が除去されたことである。さらに、ペプチドTT830及びTT8
33Sが、同時にTT830に特異的なT細胞に提示されると、TT830に反
応するT細胞増殖が用量依存の態様で、TT833Sによって阻害された。この
ことは、TT833Sが、TT830に特異的なT細胞に関するアンタゴニスト
として機能できることを示す(図31)。
り少なくとも100倍効果的である、という事実 この例によって、TT830に反応したT細胞増殖の阻害における、TT83
3S及びFab22−TT833Sの相対的効率を比較する。図32において示
すように、Fab22−TT833Sは、TT833Sよりも約100倍以上効
果的に、TT830に刺激されたT細胞の増殖を阻害した。このことは、APL
(TT833S)は、mAbH22の恒常領域において発現されると、正確かつ
効果的にAPC(抗原提示細胞)によって提示され得ることを示す。融合タンパ
ク質Fab22−TT833Sが、アンタゴニストとして、T細胞増殖に対して
より効力を増大するのは、遊離ペプチドに比べて、FcγRIの媒介による抗原
の捕捉がより効率的であったことを反映している。
ラスII結合めぐる競合ではなく、T細胞受容体(TCR)結合をめぐる競合で
ある、という事実 APL、即ち、TT833S及び融合タンパク質Fab22−TT833Sの
アンタゴニストとしての効果は、おそらくMHC結合もしくはTCR結合、又は
両方のレベルにおける競合によるものであろう。これに関係する機序を考察する
ために、「プリパルシング」実験を実施したが、これはSette等によって最初に
記載されている(DeMagistris, M.T. et al. (1992) Cell 68:625-634)。この
実験設定によって、アゴニスト(TT830)は、阻害因子(TT833S)か
らの競合の不存在下において、MHCクラスIIに結合することができ、よって
、純粋なMHC遮断薬ではなく、TCRアンタゴニストのみが、アゴニストによ
って刺激されたT細胞増殖を効果的に阻害するものと思われる。抗原(Ag)提
示単球を最適以下の(20nM)TT830で四時間パルスして、TT833S
からの競合の不存在下においてTT830をMHCクラスIIと結合させること
ができた。次に、このAPL、即ち、TT833SもしくはFab22−TT8
33Sを、プリパルシングした単球と一緒に更に16時間定温放置した。応答す
るT細胞を加えて、上記の如くそれらの増殖を測定した。MHCの遮断が最小限
の役割しか果たさない条件下においてさえ、T細胞増殖が依然として阻害された
(図33)。よって、この阻害は、MHCクラスII結合をめぐる競合ではなく
、T細胞受容体をめぐる競合の結果であることが分かる。
(インターロイキン4)及びIFN−γ(ガンマ・インターフェロン)の産生を
刺激しない、という事実 状況によっては、APLは、T細胞サイトカインの産生を刺激できるが、増殖
を刺激することができないことがある。TT833Sの提示によってサイトカイ
ンの産生が刺激されるかどうかを測定するために、Ag提示アッセイから得た上
澄におけるIL−4及びIFN−γのレベルを測定した。図34に示すように、
TT833S及びFab22−TT833Sの両者ともT細胞によるIL−4及
びIFN−γの産生を刺激する効果はなかった。
らない、という事実 Allen及びその同僚研究者等の報告によると、TCRが幾つかのAPL−MH
CクラスII複合体と相互作用するとT細胞のアネルギーをもたらした(Sloan-L
ancaster J. et al. (1993) Nature 363:156-159, Sloan-Lancaster J. et al.
(1994) J. Exp. Med. 180:1195-1205)。彼らのスキームと同様な実験的スキーム
を用いて、同様に、TT833Sの提示がT細胞のアネルギーをもたらし得るか
どうかを測定した。図35に示すように、APC及びTT833SもしくはFa
b22−TT833Sと共に、一日間、二日間又は三日間定温放置した後、T細
胞を回収すると、APCだけで定温放置していたT細胞ばかりでなく、これらの
T細胞もその後の抗原性攻撃に反応した。よって、ペプチドのみ又はFab22
−TT833Sの何れかを用いることによって提示されたアンタゴニストは、T
細胞アネルギーを惹起しなかった。更には、同一パーセントの生きたT細胞(約
50%)がペプチド、即ち、TT833SもしくはFab22−TT833Sを
含有しない培養体から回収されたことによって、同様に、TT833Sの提示も
T細胞致死を増大させなかったことを示唆している。
FcγRIに対して抗原性ペプチドを向かわせることによって約1000倍も増
大する、という観察によって、このような融合タンパク質は、感染性疾患及び癌
などに関するペプチドを基体にしたワクチンに有用となることが示されている。
特定のAPC表面分子に特異的なペプチドを、ヒトmAbの恒常ドメインに設計
することは、ペプチドを基体にしたワクチンに関する抗原性潜在能を増大させる
一般的な方法である。
自己抗原反応を改善しようと試みる際に、インビボで遭遇する可能性のある状況
に匹敵する状況でさえ、FcγRI標的のアンタゴニスト・ペプチドは、TT8
30に特異的なT細胞の増殖を阻害するということが観察されたが、この観察に
よって、標的を決められた、アンタゴニスト的なペプチドの提示が、T細胞媒介
の自己免疫病などの疾患に関するAg特異的治療として利用できることが証明さ
れた。APLを基体にした処理によって、慢性関節リウマチ及び多発性硬化症の
ような、T細胞が介在する自己免疫疾患に免疫療法が提供されよう。さらに、F
cγRIに対して一つの結合特異的部分を有する融合タンパク質、及び過剰免疫
反応を特徴とする免疫疾患に関与する抗原の部分的アゴニストであるペプチドを
用いることは、抗原特異的アネルギーを誘導することによって、このような免疫
疾患を処置するのに有用となろう。よって、本発明は、T細胞の刺激、T細胞増
殖の遮断及び/又はサイトカイン分泌、或いはT細胞におけるアネルギーの誘導
の何れかを行う、抗原の抗原提示を増大させ得る方法を提供することによって、
種々の免疫学的疾患を処置する方法を提供する。
抗体を包含する組換え特異的単鎖分子は、FcγRI及びCEA(胎児性癌抗原
)と結合することができることを示すものである。
性癌抗原(CEA)関する一つの結合特異的部分を有する二重特異的単鎖分子(
構成体321及び323)をコード化する哺乳類の発現構成体の概略図である。
構成体321によってコード化された二重特異的単鎖分子H22−抗CEAのア
ミノ酸配列(配列ID番号16)及びこの融合タンパク質をコード化する核酸(
配列ID番号15)が図40に示してある。構成体323によってコード化され
た二重特異的単鎖分子H22−抗CEA、と構成体321によってコード化され
た融合タンパク質との唯一の違いは、H22のVH及びVL鎖がスイッチされて
いるところである。
乳類の発現構成体(構成体225)も調製した。構成体225によってコード化
された単鎖抗体H22のアミノ酸配列(配列ID番号14)及びこの単鎖抗体を
コード化する核酸の配列(配列ID番号13)が図39に示してある。
II及びXbaI部位にクローン化され、これらの部位から、発現がCMV(サ
イトメガロウイルス)プロモーターから駆動される。これらの構成体はまた、そ
れぞれが、c−mycからのペプチド及びヘキサヒスチジンペプチドをコード化
する核酸配列を含んでおり、これらは、組換えタンパク質を細胞培養から精製す
るのに用いられた。c−mycタグは、ヒトc−mycのアミノ酸410乃至4
20に対応する(Evan et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3610)。MFE−32
と呼ばれる抗CEA単鎖抗体は、Casey et al. (1994) J. Immunol. Methods 17
9:105 及びChester et al. (1994) Lancet 343:455に更に詳しく記載されている
。
おいて使用して、次のようにアッセイを実施した。ELISAプレートにCEA
を塗布し、5%のPBA(多クローン性B細胞活性化物質)で遮断した。これら
の単鎖分子をコード化する構成体(トランスフェクトーマ)で形質移入した細胞
の上澄をプレートに加え、可溶性のFcγRI/IgM−μ(上記のCOS形質
移入細胞からの上澄)を加えて、アルカリホスファターゼ(AP)共役したヤギ
抗ヒトIgMと共にプレートを定温放置し、PNPP(p−ニトロフェニール燐
酸)で展開し、そして405乃至650nmでこのプレートを読み取ることによ
って、結合を検出した。
によってコード化された単鎖二重特異的H22−抗CEA分子は、FcγRIと
CEAの両者と結合することである。他方では、単鎖H22抗体(構成体225
によるコードされる)は、見込み通りにFcγRIとCEAの両者と結合しない
。
導及び/又は増強する、という事実 通常は非免疫原性抗原(例えば、自己抗原)をヒトCD64(FcγRI)に
向けると、インビボで免疫非反応性を克服できるかどうかを測定するために、抗
原提示細胞上のFc受容体に向けられたF(ab’)2抗体フラグメントに結合
するこうした抗原を含む幾つかのマルチマー複合体を調製して次のように実験を
行った。具体的には、ヒトCD64に関して遺伝子導入マウスを、それらの同腹
子ともども、マウス抗ヒトCD64mAb、即ち、M22(ATCC預託番号H
B−12147のハブリドーマによって作製した)のF(ab’)2フラグメン
トで免疫化した。マウスを隔週ごとの免疫化を四回実施後七日目に、これらのマ
ウスから採血した。ELISAによって分析すると、六匹のうち三匹の遺伝子導
入マウスは、顕著な抗M22Id特異的抗体力価を呈したが、六匹の非遺伝子導
入の同腹子の何れも全く呈しなかった。このような抗血清は、M22特異的であ
り、他のマウス抗体とは反応しなかった。
って抗原提示及びより強力な抗M22Id免疫反応を増強させるかどうかを測定
するために、M22Fab’分子のマルチマーを化学的及び遺伝子的の両方で合
成し、実験を行った。これらのマルチマーは、22F(ab’)2 (もしくは
外のFc受容体結合剤)及び付加的な22Fab’分子に化学的に結合され得る
抗体を包含する。最終的なマルチマーは、例えば、多重22Fab’アーム(例
えば、二つ又はそれ以上)と、一つ又はそれ以上の抗原分子とを含む幾つかの分
子種からなる。これらの化学種は、所望であれば、サイズ排除又は親和クロマト
グラフィーによって精製してよい。図41に示すのは、このように化学的に結合
された多重結合標的抗原の形成に関する概略図である。
−マレイミドメチル)シクロヘキサン−(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)
cyclohexane-1-carboxylate)(SMCC)と共に、室温にて二時間定温放置し
て作製した。G−25クロマトグラフィーによって、遊離SMCCを、得られた
複合体、即ち、F(ab’)2−SMCCから除去した。遊離チオール(SH)
基を有する抗原を1対1のモル比でM22F(ab’)2−SMCCに加えた。
得られた混合物を一晩室温で放置した。この反応は過剰のヨードアセトアミドを
加えることによって停止させ、得られた共役体をサイズ・エクスクルージョン・
クロマトグラフィーによって精製した。
う事実 図42aが示すのは、精製M22F(ab’)2(右側)を含有する非還元S
DS−PAGEゲル及び化学的結合M22Fab’マルチマー(左側)である。
このマルチマーは、F(ab’)3,F(ab’)4,F(ab’)5,F(a
b’)6及びより大きな分子量の分子を表す幾つかの分子種からなる。
介するM22F(ab’)2の能力を測定するために、種々の濃度のM22F(
ab’)2又はM22F(ab’)3+の何れかを、ヒトCD64遺伝子導入マ
ウスから分離したマクロファージと共に二時間定温放置した。M22エピトープ
とは別個のヒトCD64上の部位に結合するFITC標識抗ヒトCD64mAb
M32.2(ATCC預託番号9469を有するハブリドーマによって作製)に
よって、ヒトCD64表面発現を検出した。図42Bに示すように、M22F(
ab’)2との定温放置は、このマクロファージの表面からヒトCD64の顕著
な抑制をもたらさなかった。しかし、37℃におけるF(ab’)3+との定温
放置では、用量依存の態様でヒトCD64発現が50%まで抑制されるに至った
。F(ab’)3+と共に4℃で定温放置してもヒトのDC64の発現の現象に
は至らなかったことで、このような現象の温度依存性が証明された。
64遺伝子導入マウスにM22F(ab’)2又はM22F(ab’)3+の何
れかを注射して、一時間後に採血した。M22F(ab’)3+で免疫化した動
物からの血中単球上では、ヒト64の表面発現が抑制されたが、M22F(ab
’)2で免疫化した動物からの血中単球上では抑止されなかった。ヒト64の表
面発現は、F(ab’)3+マルチマーを伴った受容体の内部移行を表す、とい
う仮説を立てた。
M22F(ab’)3+マルチマーで三回免疫化した後、抗M22イディオタイ
プ(「Id」)反応を起こすことができるかどうかである。図43Aで示されて
いるデータによって、このマルチマーで三回免疫化(一回の免疫化当たり25μ
g)した、ヒトCD64遺伝子導入マウス(n=12)の全てにおいて高い力価
のM22特異的抗体の産生をみたが、同様に免疫化した非遺伝子導入の同腹子(
n=10)の何れにもM22特異的抗体は産生されなかったことが示された。M
22F(ab’)3+マルチマーによって惹起されたヒトCD64遺伝子導入体
における免疫反応は、M22F(ab’)2によって惹起された反応よりも著し
く優れていた。マルチマー免疫マウスは全てが反応し、且つこのマルチマーで免
疫化して免疫反応を起こすのに必要な免疫化回数は、F(ab’)2に比べて、
より少ない回数であった(三回対四回)。このような結果が証明するのは、Fa
b’マルチマー複合体によって、ヒトCD64を介する抗原のより優れた内部移
行が導かれ、結果的に抗原特異的な免疫反応を増強させるということである。実
際に、図43Bにおいて示されたデータでは、わずか0.25μgのマルチマー
でヒトCD64遺伝子導入マウスを免疫化しても、殆どのマウスにおいて免疫反
応を依然として検出できることが証明されている。
抗原に効果的な免疫反応を認めるのは難しい。このような通常は非免疫原性であ
る抗原をヒトCD64に向けることによって、この抗原に対する免疫反応を惹起
するかを確かめるために、モデル抗原として、マウスモノクローナル抗体のFa
b’フラグメント、即ち、520C9をM22マルチマーに結合した。
た後、抗520C9Id力価及び抗M22Id力価の両者を査定した。図44a
に示すように、八匹の免疫化ヒトCD64遺伝子導入マウスの内の七匹が、強力
な抗520C9及び抗M22力価を顕現した。七匹の免疫化非遺伝子導入マウス
は何れも、520C9又はM22の何れに対しても測定できるような力価を顕現
することはなかった。これらのデータによって証明されるのは、ヒトCD64+ 抗原提示細胞が、通常は非免疫原性的なタンパク質を内部移行するように、その
タンパク質をヒトCD64に結合させると、この抗原に対する効果的な免疫反応
が誘導されると言うことである。幾つかのグループでは、B細胞リンパ種細胞の
表面Igによって発現されたイジオタイプに関する免疫特異性の発生によって、
潜在的な腫瘍細胞特異的な免疫性をもたらし得ることが分かった。この例は、特
異的な抗520C9Id反応は、520C9イディオタイプをヒトCD64に向
けることによって容易に惹起することができることを証明する。
、反応の量と同様に重要な場合がある。Tヘルパー細胞は、それらが分泌するサ
イトカインの型及び刺激時にそれらがB細胞に対して提供する補助の型によって
、Th1及びTh2に分けられている。Th1細胞は、刺激を受けると、IL−
2及びIFN−γを分泌し、且つ通常はB細胞を刺激してIgG2aアイソタイ
プを分泌させる。Th2細胞は、刺激を受けると、IL−4及びIL−5を分泌
し、且つ通常はB細胞を刺激してIgG1又はIgEアイソタイプを分泌させる
。一般的に言えば、Th1細胞は、免疫反応の細胞アームを刺激し、一方、Th
2細胞は、体液性アームを刺激する。520C9特異的抗体の、即ち、IgG1
又はIgG2aアイソタイプの何れかの力価を、M22マルチマーに結合した5
20C9でヒトCD64遺伝子導入マウスを免疫化しておいてから、アイソタイ
プ特異的な展開試薬を用いて検査した。図44bに示すデータによって証明され
ているのは、IgG2aId特異的な強い力価ばかりでなく、IgG1特異的な
強い力価が惹起されるということであり、この方法による免疫化は、Th1及び
Th2反応の両者を活性化させ得ることを証明する。
導する、という事実 図45aが示すのは、遺伝子的に結合した多重結合の、標的を決められた抗原
をコード化するベクターのマップである。このベクターは、ヒト化抗FcγRI
抗体、即ち、H22(ATCC預託番号CRL11177を有するハブリドーマ
によって作製)からの二つのsFv領域、及び抗体M32.2からの一つのsF
v領域(これらの抗体は全て一つの抗原に一体に結合している)で、タンパク質
をコード化する。この結果作製される融合タンパク質、H22sFv−H22s
Fv−32.2sFv抗原(図45Bに示す)は、多数の部位においてFcγR
Iと結合でき、それによって受容体の凝集を介して内部移行を誘導する。
マウスのモデル研究に関する抗原としてマウスgp75(Trp−1メラノーマ
抗原)を使用することで作成された。分かったことは、この融合タンパク質は、
FcγRIと効率的に結合し、且つ受容体の内部移行を誘導するということであ
った。図46に示すように、化学的に結合したM22FabxM22FabxM
32Fab及び遺伝子的に結合したH22sFv−H22sFv−32.2sF
v抗原は、それぞれFcγRIの内部移行を誘導した。この研究は、IFN−γ
処理したU−937細胞に37℃で二時間試料を加えて実施した。次に、ヒトI
gG1−FITCで4℃で一時間細胞を染色することで、FcγRIの発現を測
定し、試料をFACscanによって分析した。変調のパーセント(%)を次式
によって計算した。[1−(試料のMFI/対照のMFI)]x100%:ここ
でMFIは、平均蛍光強度である。
cγRIに結合する、という事実 図47aに、遺伝子的に一つの抗原に一体に遺伝子的に結合した二つのH22
sFv領域からなる融合タンパク質をコード化するベクターのマップを示す。得
られた融合タンパク質、即ち、H22sFv−H22sFv抗原(図47Bに示
す)は、二つのFcγRI分子に結合することができる。このような融合タンパ
ク質は、一つのH22sFvのみからなるなる融合タンパク質よりもFcγRI
に関する親和性がより大きいはずである。同様に、二つのFcγRI分子と結合
するこのマルチマーの能力は、受容体の内部移行もより強力に誘導する可能性が
ある。
は、単一のH22sFv抗原融合に比べてより大きな親和性をもってFcγRI
に結合するかどうかを)、競合実験を実施した。FcγRIの発現を増強するた
めに事前にIFN−γで処理したU937細胞を、抗体22及びフィコエリトリ
ン共役体で染色した。図48に示すように、種々の濃度のH22Fab、H22
sFv2−EGF融合タンパク質又はH22Fab2によって、この共役体を阻
害した。同様に図48に示すように、H22sFv2−EGFは、H22Fab
2とほぼ同等の親和性をもってFcγRIと結合する。H22Fab’及びH2
2sFvは、FcγRIに関して同様な親和性を有することが分かっていた(Go
ldstein et al. (1997) J. Immunol.)。
行を誘導する、という事実 図49Aは、一つの抗原に結合した三つのH22sFvフラグメントを含有す
るマルチマー融合タンパク質をコード化するベクターのマップである。この融合
タンパク質、即ち、H22sFv−H22sFv−H22sFv−CEA(図4
9bに示す)は、三つのH22sFvと結合する腫瘍抗原CEA(胎児性癌抗原
)を含有する。この融合タンパク質は、高親和性をもってFcγRIと結合し(
三つのsFv分子の三価結合により)、かつ三つのFcγRI分子の凝集によっ
てFcγRIの内部移行を誘導するはずである。
が、FcγRIの内部移行を誘導する能力を、既に説明の如く実験し、その結果
が図50に示してある。重要なことは、H22Fab−CEAは、おそらくそれ
がFcγRIと一価性的に結合したために、同様な濃度では内部移行を媒介しな
かった。IFN−γ処理したU−937細胞に試料を加え、且つ37℃で一時間
又は一晩の何れかで定温放置してこの例を実験した。次に、4℃で一時間M32
.2−FITCで細胞を染色することによってFcγRI発現を測定した。
られたヒト抗体融合タンパク質は、腫瘍細胞の細胞媒介による細胞障害を促進す
る、という事実 次の研究は、EGF(上皮成長因子)受容体(EGF−R)を発現する腫瘍細
胞のエフェクター細胞媒介による致死を誘導する二重特異的融合構成体の作製及
び特徴に関連する。この構成体は、抗CD89(抗FcαR)抗体(ScFvも
しくはFab’)に結合したEGFを含む。よって、これらの構成体は、腫瘍細
胞に向けられたCD89発現細胞のエフェクター機能を活性化させる。
疫グロブリン)のFc部分に結合する受容体である。CD89は、主に、多核白
血球(PMN)、単球、マクロファージ、好中球及び好酸球を含む細胞障害性免
疫エフェクター上において構成的に発現される。Ag複合体及び単量体のIgA
1及びIgA2の両者が、CD89と結合するが、これは、この受容体が単量体
IgAとインビボでは飽和され得ることを示唆する。リガンド結合部位の内側又
は外側で、エピトープに対して特異的なmAbによって、骨髄腫エフェクター細
胞上で架橋するCD89は、脱顆粒、スーパーオキシドの放出、炎症性サイトカ
インの分泌、エンドサイトーシス及び食細胞活動を刺激する。よって、CD89
は、細胞障害性免疫エフェクター細胞上の治療的に関連性のあるトリガー受容体
となる得る。
れたと報告されている、チロシン−キナーゼ結合受容体である。この系統群の一
つのメンバーに、上皮細胞成長因子に関する受容体がある(EGF−R、c−e
rbB−1遺伝子産物)。EGF−Rは、殆ど全ての頭部及び首部、およそ三分
の一の乳癌及び卵巣癌において過剰発現され、前立腺、腎臓、膀胱、肺臓、脳、
膵臓及び胃腸系の癌において過剰発現し得る。ケラチン生成細胞及び肝細胞のよ
うな幾つかの正常な細胞上にこの受容体が存在するが、腫瘍細胞上におけるEG
F−Rの過剰発現は、特定の腫瘍にたいして特異的な治療法を差し向けるのに有
用となり得る。対象となる治療法には、EGF−Rに関して特異的なmAb、即
ち、EGFのような、この受容体に関するリガンドの一つを含むことができる。
EGFは、EGF−Rを発現する種々の細胞のタイプの細胞分割及び分化の変調
成分である。EGFは53アミノ酸、即ち、三つのジスルフィド結合を含有する
非グリコシル化タンパク質であり、1207アミノ酸先駆物質からタンパク質分
解処理される。
、HuMAb−マウス(商標)技術を利用して、完全にヒトCD89mAbを作
製した。このmAb、即ち、14A8(14.1とも呼ぶ)は、エフェクター機
能を惹起する能力を保持しつつFc結合部位とは別個のエピトープに結合する。
よって、この抗体は、単量体IgAを飽和することによって引き起こされる、リ
ガンド結合部位の遮断可能性を克服する。ここでは、mAb14A8のfab’
及びsFvフラグメントをEGFに融合させる。簡単に説明すると、この14A
8ハブリドーマ・セルラインを、可溶性のCD89で免疫化したHuMAbマウ
スから得た。そのv領域は、このセルラインから分離したRNAのRT=PCR
を用いてクローン化した。DNA配列分析で分かったことは、この抗体は、DN
1Dセグメント及びJH4Jセグメントを有する30.3VHと、JK3Jセグ
メントを有するL18Vkとからなることである。
、可変領域をコード化するDNAを使用すると、二重特異的分子(BMS)とし
て機能する抗体融合タンパク質が作製され且つ発現された。図51に示すように
、これらの分子は、Fc結合部位とは別個の一つのエピトープにおける、ヒトI
gA(FcαRI、即ち、CD89)のFc部分に特異的な受容体に結合し且つ
エフェクター機能を依然として惹起する、抗体フラグメントと、種々の腫瘍セル
ライン上で過剰発現する上皮成長因子受容体(EGF−R)に結合する一つのア
ームとから構成されていた。このBSMを作成するために、mAb14A8(抗
CD89)のFab又はsc−Fvフラグメントを、EGFに対するフレキシブ
ルなペプチド・リンカー、即ち、EGF−Rに関するリガンドを介して融合した
。mAb14A8の可変領域を、RT−PCR及びDNA配列を用いてクローン
化且つ特性説明した。
ヒンジ領域を含有する一つの発現ベクターに14A8VHDNAを挿入すること
によって作成した。14A8VLDNAも同様に、ヒトCL領域のcDNAを含
有する発現ベクターに挿入した。sc−Fv融合タンパク質も、単鎖で、一つの
ベクターから発現された。図51に概略的に示すように、PJZ906(14A
fd−EGF)及びpJZ907(14A8L鎖)を、電気穿孔法によって、N
SO細胞内に同時形質移入し、G418及びハイグロマイシンを含有する媒体で
選択した。PJZ909(14A8sFv−EGF)も同様に形質移入して、G
418を含有する媒体で選択した。融合タンパク質を発現するセルラインは、限
界希釈クローニングによってサブクローン化した。これらの融合構成体を精製す
るために、融合タンパク質を発現するセルラインの上澄を、プロテインLカラム
上に流し、還元及び非還元条件下で、約2μgの精製したタンパク質を4乃至1
5%のトリスグリシン・ゲルに加えた。
て、抗体フラグメント及びこれらのBSMにおけるEGF部分は、これらの各々
の細胞表面受容体に特異的に結合することが確証された。図52Aは、A431
細胞上のEGF−Rに結合する14A8fab’−EGF融合タンパク質を示す
。図52Bは、A431細胞(フィコエリトリンに共役したヤギ抗ヒトIgGF
ab−2で染色された)に結合する14A8sFv−EGFを示す。14A8の
fab−2フラグメントは、EGFを含有しないが、対照として用いられた。図
52Cに示すのは、14A8融合タンパク質及び市販のEGFは、EGF−FI
TC共役体(7nM)を含有するA431との結合をめぐって競合することであ
る。図53Aは、14A8fab’−EGF融合タンパク質が、CD89を発現
するU937細胞(フィコエリトリンに共役したヤギ抗ヒトIgGFab−2で
染色された)CD89に結合することを示す。ヒト化mAbH415のfab−
2フラグメント(EGF−Rに関して特異的である)は、対照として用いられた
。図53Bは、14A8sFv−EGF融合タンパク質も同様にCD89を発現
するU937細胞に結合することを示す。種々の濃度の14A8sFv−EGF
が、14A8fab’−EGF融合(23nM)の結合を阻害するかどうかに関
する査定を除いて、この実験を図53Aにおけるものと同様な態様で実施した。
ここでもH22sFv−EGF融合タンパク質を対照として用いた。mAbH2
2は、CD64(RcγRI)、即ち、U937細胞上の異なるFc受容体、に
結合する。
−EGF及び14A8sFv−EGF構成体の両者とも、精製された、CD89
を発現する多形核球(PMN)白血球、単球又は全血エフェクター細胞で、用量
依存の態様において、EGF−Rを発現する腫瘍細胞の特異的な溶解を媒介する
ことである。
54A)、PMN(54B)及び全血(54C)を用いてA431細胞の細胞障
害を媒介したことを示す。クロム遊離アッセイは、定温放置期間16乃至18時
間及び100対1の標的に対するエフェクターの割合(単球、PMNに関して)
を用いて、定温放置で実施した。14A8のfab−2フラグメントは、対照と
して用いた。図56に示すように、A431細胞の14A8fab’−EGF融
合(1μg/ml)及び14a8Sfv−Egf融合(1μg/ml)媒介細胞
障害は、14A8のfab−2フラグメント(40μg/ml)によって阻害さ
れている。このことは、これら融合タンパク質による細胞溶解は、CD89に結
合することによって特異的に媒介されるということを証明する。
にEGFを結合し、哺乳類の細胞培養において構成体を発現させ、且つプロテイ
ンL・クロマトグラフィーを用いて近似均質までこれらの構成体を精製する、遺
伝子的手段による融合タンパク質の作製を説明したものである。このような融合
タンパク質は、14A8は完全にヒトあり、EGFはヒト由来であって、融合タ
ンパク質の治療上の効力を増強することができるので、ヒトにおいて最上限には
免疫原性である。上記研究はまた、これらの融合タンパク質、即ち、14Afa
b’−EGF及び14A8sFvは、CD89及びEGF−Rを発現する細胞と
結合できる。重要なことは、これらの研究は、CD89を発現する免疫エフェク
ター細胞の存在下において、これらの融合タンパク質が、用量依存の態様で、E
GFを過剰に発現する細胞の致死を媒介することを更に証明していることである
。腫瘍細胞の溶解も、全血の存在下において証明された。
はHER2)に向けられたヒト抗体結合部分を含有する二重特異的及び三重特異
的分子は、腫瘍の細胞媒介細胞障害を促進する、という事実 次の研究は、EGF受容体(EGF−R)及び/又はHER2/neu(HE
R2とも呼ぶ)を発現する腫瘍細胞を、フェクター細胞の媒介によって致死させ
るのを誘導する二重特異的及び三重特異的分子の作製及び特性説明に関する。こ
れらの二重特異的構成体は、3.F2と呼ばれる、ヒト・モノクローナル抗HE
R2抗体(ScFvもしくはFab’)に結合した、14.1と呼ばれる、ヒト
・モノクローナル抗CD89(抗FcαR)抗体(ScFvもしくはFab’)
を含む。三重特異的構成体には、EGFに融合した、二重特異的抗CD89(S
cFv)x抗HER2(ScFv)構成体が含まれていた。これらの構成体は、
腫瘍細胞に向けられている、CD89を発現する細胞のエフェクター機能を活性
化させる。これらは完全にヒトであるという利点も提供する。
親ヒト抗体(HuMab)を示す。図57に示すのは、単鎖(ScFv)二重特
異的融合分子(931及び934)であり、これらは、934はEGFを含むが
、931はEGFを含まないということ以外同一のものである。14.1(抗C
D89)及び3F2(抗HER2)の可変L及びH鎖領域は、これらの構成体を
作製するのに用いられる。図58は、化学的に共役したFab’抗CD89x抗
HER2二重特異的分子を示す。14.1及び3F2のfab’フラグメントは
、標準的な化学架橋法を用い、ジスルフィド結合によって結合して、この二重特
異的分子を作製した。
pJZ934)でNSO細胞を形質移入することで作製し(抗CD89xEGF
融合に関して、図51で示したように)、G418を含有する媒体中で選択した
。セルラインを融合タンパク質の発現に関してスクリーニングし、限界希釈クロ
ーニングによてサブクローン化した。最後に、融合タンパク質を発現するセルラ
インの上澄をプロテインL・カラム上に流し、その後非還元及び還元条件下にお
いて、およそ2μgの精製したタンパク質を4乃至15%のトリスグリシンのゲ
ルに加えることによって、を融合タンパク質を精製した。934構成体が、還元
条件下において、主としてモノマーに解離する三量体として精製された。
。図59Aは、トランスフェクトーマ上澄における、融合タンパク質の腫瘍細胞
との結合を示す。形質移入された(931及び934)及び形質移入されなかっ
た(NSO)上澄を、SKBR−3又はA431腫瘍セルラインの何れかと共に
定温放置した。次に、融合タンパク質の結合を、フィコエリトリンに共役された
ヤギ抗ヒトIgGfab−2で染色することで検出した。図59Bに示したよう
に、形質移入された細胞(931及び934)からの上澄も細胞溶解(ADCC
)を媒介した。これれらの研究においては、16乃至1時間の放置期間及び10
0対1の標的(SKBR−3、A431)に対するエフェクター(単球、PMN
)の割合で、クロム遊離アッセイを実施した。腫瘍細胞致死は、特異的な溶解を
媒介するべき、形質移入された(931及び934)及び形質移入されなかった
(NSO)上澄を用いて検出した。
37細胞(CD89受容体を介して)に結合する活性を示す。U937細胞に結
合しない、抗体425(抗EGF−RmAb)のfab−2フラグメントは、陰
性対照として用いた。抗CD89(Fab’)x抗HER2(Fab’)、即ち
、化学的結合した二重特異性分子(図58に示す)は、陽性対照として用いた。
図60Bは、SKBR−3細胞との結合(HER2受容体を介する)実験以外は
、図60Aと同一である。抗CD89抗体(14.1)のfab−2フラグメン
トは、陰性対照として用いた。図61は、A431細胞との934三重特異的構
成体の結合を示す。この実験は、EGF−Rを過剰発現するA431腫瘍細胞を
用いた点以外は、図60に示したものと同一の態様で実施した。EGFに融合し
た14.1のsFvフラグメントからなる融合タンパク質を陽性対照として、ま
た抗CD89抗体のfab−2フラグメント(14.1)を陰性対照として用い
た。
瘍細胞の溶解 単鎖二重及び三重特異的分子(931及び934)に関しても、エフェクター
細胞の存在下において、EGF−R及びHER2/neuを発現する腫瘍細胞の
細胞溶解(ADCC)を媒介できるかを実験した。16乃至18時間の定温放置
期間及び100対1の標的(SKBR−3、A431)に対するエフェクター(
単球、PM)の割合で、クロム遊離アッセイを実施した。腫瘍細胞致死は、特異
的な溶解を媒介するべき、形質移入された(931及び934)及び形質移入さ
れなかった(NSO)上澄を用いて検出した。図59Bに示すように、形質移入
された(931及び934)からの上澄は、単球、PMN及び全血の細胞溶解(
ADCC)を媒介した。これらの研究においては、16乃至18時間の定温放置
期間及び100対1の標的(SKBR−3、A431)に対するエフェクター(
単球、PM)の割合で、クロム遊離アッセイを実施した。腫瘍細胞致死は、特異
的な溶解を媒介するべき、形質移入された(931及び934)及び形質移入さ
れなかった(NSO)上澄を用いて検出した。
MN及び単球の存在下におけるSKBR−3細胞(図62A及び図63A)及び
BT474細胞(図62B及び図63B)のエフェクター細胞媒介溶解をそれぞ
れ示す。16乃至18時間の定温放置期間及び100対1の標的に対するエフェ
クターの割合で、クロム遊離アッセイを実施した。抗CD89抗体(14.1)
のfab−2フラグメントを、各実験において陰性対照として用いた。
体の場合の単鎖抗体とは異なり)を含有する、精製され化学的に共役された二重
特異的分子14.1x3.F2(図58)をテストして、51Cr標識されたS
KBR−3又はBT−474ヒト腫瘍細胞の多形核球(PMN)細胞、単球及び
全血によるADCC致死をテストした。37℃で一晩放置した後、培養上澄中に
遊離された51Crの分析によって、腫瘍細胞致死の量を測定した。特異的溶解
は、二重特異的分子の存在下における腫瘍細胞致死から、多形核球細胞のみでの
腫瘍細胞致死を減じた量として算出した。図64に示すように、二重特異的分子
14.1x3.F2は、用量依存の態様で、HER2/neuを発現するSKB
R−3及びBT−474の両方の腫瘍細胞の、PMNによる細胞致死を媒介した
。更に、図65に示すように、二重特異的分子14.1x3.F2は、用量依存
の態様で、HER2/neuを発現するSKBR−3及びBT−474の両方の
腫瘍細胞の、単球による細胞致死を媒介した。両方の場合において、10μg/
mlの14.1Fab’2を加えることによって、1μg/mlの二重特異的分
子14.1x3.F2による腫瘍細胞のADCCが完全に遮断された。これは、
標的にされた細胞の致死が、エフェクター細胞に結合するCD89によって排他
的に媒介されたことを証明する。図66は、二重特異的分子14.1x3.F2
も、用量依存の態様で、HER2/neuを発現するBT−474腫瘍細胞の、
全血による細胞致死を媒介したことを示す。
フラグメントを含めて)を含有する二重及び三重特異的分子の作製を説明したも
のである。さらに、これらの例によって、これらの二重及び三重特異的分子は、
エフェクター細胞の存在下において、HER2/neu及びEGF−Rを発現す
る腫瘍細胞の致死を効果的に媒介することを証明する。
等物を認識もしくは通常程度の実験法を用いて確認するであろう。このような同
等物は、添付の特許請求の範囲によって網羅されるものと思料する。
ノ酸配列を示し[A]、変更して、切断された単一スルフヒドリル形とし[B]
、更に変更して、二つの固有のクローニング部位を作製したもの[C]、を示す
。下線のヌクレオチドは、以前の配列からの変更を示す。上線のヌクレオチドは
、示した制限部位の認識配列である。
たフローサイトメトリー・アッセイの略図である。
及び完全にヒト化した二重特異性(BsAb)H447のEGF受容体(EFG
R)発現1483細胞への結合を表す平均蛍光強度(MFI)をグラフで示す。
、様々な濃度のEGF融合タンパク質又はBsAbH447細胞のA431細胞
への結合を示すグラフである。
への結合に起因する抗体依存性細胞障害(ADCC)を示すグラフである。
22のfabフラグメントを含む培地の存在下における、EGF融合タンパク質
、BsAbH447、又はH425抗体結合に起因する抗体依存性細胞障害(A
DCC)を示す棒グラフである。
ab)、又はH425のF(ab’)2フラグメント(H425F(ab’)2
)の存在下で培養された生存A431細胞の数を表すグラフである。
、H22−ヘレグリン融合タンパク質を発現する骨髄腫細胞からの上澄みを1:
3又は1:30の希釈と、で培養したことに起因するこれら細胞の致死のパーセ
ントを示す柱状グラフである。
おける、PC−3腫瘍細胞溶解のパーセントを示すグラフである。
されたBsAb477の活性を評価するためのフローサイトメトリーアッセイを
表す略図である。
細胞を発現するEGFR及びFcγRIに関する平均蛍光強度(MFI)を表す
グラフである。
るEGFR及びFcγRIへの結合に起因する抗体依存性細胞障害を示すグラフ
である。
特異性抗体は、還元し且つo−PDM処理した520C9Fab’と混合して、
TsAbを得た。
胞選別アッセイを示す図である。
る。平均蛍光強度(MFI)はAb結合の増加と共に増加する。これは、TsA
bがSKBr−3上の可溶性のHER2/neuとFcγRIの両者に、用量依
存の態様で、同時に結合したことを示す。
態様で同時に結合したことを示すグラフである。このアッセイは図19で用いた
アッセイと類似のものである。
9)が、SKBr−3のADCCを誘導する能力があるが、BsAb(M22x
H425)にはその能力が無かったことを示すグラフである。様々な濃度の抗体
をSKBr−3細胞及び予め活性化したPMNと一緒に定温放置した。
)が、A431のADCCを誘導する能力があるが、BsAb(M22x520
C9)にはその能力が無かったことを示すグラフである。このアッセイは図21
で用いたアッセイと類似の様態で実行した。
球表面からのFcγRIを急速に変調する。
チドを符号化する合成オリゴヌクレオチドのアミノ酸配列を示す。 Bは、H22Fd−TT融合タンパク質を示す。
ーサイトメトリー・アッセイの結果を示す。 (b)は、Fab22−TT830のFcγRI陽性U937細胞への結合を
示すフローサイトメトリー・アッセイの結果を示す。 (c)は、H22−TT833SのFcγRI陽性U937細胞への結合を示
すフローサイトメトリー・アッセイの結果を示す。破線はそれぞれ陰性対照を示
し、実線は融合タンパク質による染色を示し、点線はマウスmAb22F(ab
’)2により阻害された融合タンパク質結合を表す。
10、FAb22−TT830、及びFab22−TT833Sの定温放置に起
因する平均蛍光強度を示すグラフである。
又はTT947と一緒に定温放置したT細胞の増殖を表すグラフであり、TT8
30と比較すると融合タンパク質Fab22−TT830は、Thエピトープの
提示を1000倍向上させることを示す。
予備的に定温放置した場合または定温放置しなかった場合の、1000nMにお
けるTT830又は10nMのFAb22−TT830及び単球と一緒に定温放
置したT細胞の増殖を表す柱状グラフである。
830又は1000nMのTT830と一緒に定温放置されたT細胞の増殖を表
す柱状グラフである。
間培養したT細胞の上澄みにおけるIFN−γの濃度を示すグラフである。 (b)は、単球と様々の濃度のTT830又はFab22−TT830と一緒
に二日間培養したT細胞の上澄みにおけるIL−4の濃度を示すグラフである。
0と共に定温放置したT細胞の増殖を示すグラフである。
0と一緒に一晩定温放置したT細胞の増殖を示すグラフである。
晩定温放置した後、単球とTT830と一緒に二日間定温放置したT細胞増殖の
抑制をパーセントで示すグラフである。
ス)、更に10μMのTT833S又は0.1μMのFab22−TT833S
と一緒に一晩定温放置(チェース)した後に、単球と一緒に二日間定温放置した
T細胞増殖を示す柱状グラフである。
−TT833Sで培養したT細胞の上澄みにおけるインターフェロン−γ(IF
N−γ)及びIL−4の濃度を示す柱状グラフである。
1日間刺激して、その後、単球と様々の濃度のTT830で2日間にわたり再刺
激したT細胞の増殖を示すグラフであり、TT833S及びFab22−TT8
33SはT細胞のアネルギーを引き起こさなかったことを示している。
A)(構成体321及び323)に関する一つの結合特異的部分とを備えた単鎖
二重特異的分子を符号化する二つの発現構成体及び、FcγRIに関する一つの
結合特異的部分を備えた単鎖抗体を符号化する一つの発現構成体を示すグラフで
ある。これら符号化領域はCMVプロモーター(CMV Pr)の制御下にある
。抗体のH鎖(VH)及びL鎖(VL)からの可変領域に加え、これら構成体に
より符号化されるタンパク質は、c−myc(c−myc)からのペプチド及び
ヘキサヒスチジンペプチド(H−6)に融合する。
及び323−C4)により符号化される単鎖二重特異的分子H22−抗CEAと
、構成体225(225−C2)により符号化される単鎖H22抗体との、二重
特異的ELISAにより測定した結合レベルを示す柱状グラフである。
より符号化されるアミノ酸配列を示す。
抗原に関する一つの結合特異的部分とを備えた単鎖二重特異的分子の核酸配列及
び、その核酸により符号化されるアミノ酸配列を示す。
の構造を示す略図である。
的に結合したM22Fab’3マルチマー複合体(右側ライン)を示す非還元S
DS−PAGEゲルを示す。 (b)は、M22F(ab’)3+との定温放置が、マクロファージの表面に
おけるCD64の発現を、投与量に依存して50%まで減らすことを示すグラフ
である。
異的抗体が、三回免疫化されたCD64遺伝子導入マウス全てにおいて見られた
ことを示す。 (b)は、僅か0.25mgのマルチマー複合体でFcγRI(CD64)遺
伝子導入マウスを免疫化しても、検出可能な免疫反応が得られることを示す。
子導入されていないマウスの、抗520C9及び抗M22力価で判断した免疫反
応を示すグラフである。これらマウスは、M22マルチマー複合体に結合したマ
ウス抗体520C9のFab’フラグメントで免疫化した。
M32.2sFv領域に結合した二つのH22sFv領域を含んだ遺伝子的に関
連したマルチマー複合体を符号化する発現ベクターのマップを示す。 (b)は、作製されたマルチマー複合体を示す図である。
.2sFv−gp75マルチマー複合体の、FcγRIに効率的に結合して内部
移行を誘導する能力を示す棒グラフである。
つのH22sFv領域を含んだ遺伝子的に関連したマルチマー複合体を符号化す
る発現ベクターのマップを示す。 (b)は、作製されたマルチマー複合体を示す図である。
ルチマーを用いた結合競合アッセイの結果を示すグラフである。結果は、これら
マルチマーによるM22−フィコエリトリン共役の結合阻害に関して示したもの
である。
22sFvフラグメントを含んだ遺伝子的に関連したマルチマー複合体を符号化
する発現ベクターのマップを示す。 (b)は、作製されたタンパク質を示す図である。
、FcγRI内部移行を誘導する能力を示す棒グラフである。
906(14Adf−EGF)及びpJZ907(14A8L鎖)は電気穿孔法
によってNSO細胞に同時形質移入され、G418及びハイグロマイシンを含ん
だ培地で選択された。PJZ909(14A8sFv−EGF)は、同様に、形
質移入され、G418を含んだ培地で選択された。融合タンパク質を発現する細
胞株は、限界希釈クローニングによりサブクローニングした。
の(フローサイトメトリーで測定した)結合を示すグラフである。 Bは、14A8sFv−EGF融合構成体のA431細胞上のEGF−Rへの
結合を示すグラフである。A431細胞は、フィコエリトリンに共役したヤギの
抗ヒトIgGFab−2で染色した。EGFを含まない14A8のFabフラグ
メント(ヒトモノクローナル抗FcαR抗体、14.1とも称する)を、対照と
して用いた。 Cは、融合タンパク質と市販のEGFが、EGF−FITC共役を備えた43
1細胞への結合で競争することを示す(7nM)。
トメトリーで測定した)結合を示すグラフである。U937細胞へ結合した融合
タンパク質は、フィコエリトリンに共役したヤギの抗ヒトIgGFab−2で染
色した。ヒト化したmAbH415ののFab−2フラグメント(EGF−Rに
対して特異的である)を、対照として用いた。 Bは、14A8sFv−EGF融合構成体の、U937細胞への結合を示す。
この実験はAと類似の様態で実施されたが、相違点は、14A8Fab’−EG
Fの結合を阻害する能力を、14A8sFv−EGFの様々な濃度において評価
したことである。mAbH22は、U937細胞上の異なるFc受容体であるC
D64(FcγRI)に結合する。
る。クロミウム放出アッセイを、16乃至18時間定温放置して、100:1の
エフェクター対標的(単球及びPMNに関して)の比を用いて行った。14A8
のFab2フラグメントを対照として用いた。 A エフェクター細胞には新鮮な単球を含めた。 B エフェクター細胞にはPMNを含めた。 C エフェクター細胞には全血を含めた。
ク質媒介細胞障害は、14A8のfab−2フラグメントにより抑制されること
を示す棒グラフである。 Bは、A431細胞の14a8sfv−efg(1μg/ml)融合タンパク
質媒介細胞障害も、14A8のfab−2フラグメント(40μ/ml)により
抑制されることを示す棒グラフである。
ある。14.1及び3F2の可変L鎖及びH鎖領域を用いて931及び934(
w/EGF)構成体を作製した。
メントからなる、化学的に共役した二重特異的分子の略図である。
上澄において発現した融合タンパク質931及び934のスクリーニング(結合
)アッセイを示す棒グラフである。形質移入された(931及び934)及び形
質移入されなかった(NSO)上澄を、SKBR−3又はA431腫瘍セルライ
ンの何れかと一緒に定温放置した。融合タンパク質の結合を、フィコエリトリン
に共役されたヤギ抗ヒトIgGfab−2で染色することで検出した。 Bは、融合タンパク質931及び934のADCC分析を示す棒グラフである
。16乃至1時間の定温放置期間及び100対1の標的(SKBR−3、A43
1)に対するエフェクター(単球、PMN)の割合で、クロム遊離アッセイを実
施した。腫瘍細胞致死は、特異的な溶解を媒介すべき、形質移入された(931
及び934)及び形質移入されなかった(NSO)上澄を用いて検出した。
・クロマトグラフィーで測定した)を示すグラフである。U937細胞に結合し
ない、425(抗EGF−RmAb)のfab’フラグメントは、陰性対照とし
て用いた。図58に示した化学的結合した二重特異性分子(14.1x3F2)
は、陽性対照として用いた。 Bは、単鎖融合タンパク質931及び934のSKBR−3細胞への(フロー
・クロマトグラフィー分析法で測定した)結合を示すグラフである。14.1f
ab−2を陰性対照として用いた。図58に示した化学的に結合した二重特異的
分子(14.1x3F2)を、再び陽性対照として用いた。
定した)結合を示すグラフである。この実験は、EGF−Rを過剰発現するA4
31腫瘍細胞を用いた点以外は、図60に示したものと同一の態様で実施した。
EGFに融合した14.1のsFvフラグメントからなる融合タンパク質を陽性
対照として、また14.1fab−2フラグメントを陰性対照として用いた。
図62B)腫瘍細胞のPMN(エフェクター細胞)媒介細胞障害を示すグラフで
ある。クロミウム放出アッセイを、16乃至18時間の定温放置及び100:1
のエフェクターに対する標的の比を用いて行った。各実験において、14.1f
ab−2を対照として用いた。
図62B)腫瘍細胞の単球(エフェクター細胞)媒介細胞障害を示すグラフであ
る。クロミウム放出アッセイを、16乃至18時間の定温放置及び100:1の
エフェクターに対する標的の比を用いて行った。各実験において、14.1fa
b−2を対照として用いた。
分子(14.1×3.F2)により媒介された多核細胞によるSKBR−3及び
BT−474腫瘍細胞の抗体依存細胞障害を示すグラフである。
分子(14.1×3.F2)により媒介された単球によるSKBR−3及びBT
−474腫瘍細胞の抗体依存細胞障害を示すグラフである。
分子(14.1×3.F2)により媒介された全血によるBT−474腫瘍細胞
の抗体依存細胞障害を示すグラフである。
Claims (100)
- 【請求項1】 Fcα受容体に関する第1結合特異的部分と、EGF受容体に
関する第2結合特異的部分とを包含した二重特異的分子。 - 【請求項2】 前記第1及び第2結合特異的部分が、遺伝子的に融合されてい
る、請求項1に記載の二重特異的分子。 - 【請求項3】 前記第1結合特異的部分が、抗体または抗体のフラグメントで
ある、請求項1に記載の二重特異的分子。 - 【請求項4】 前記抗体または抗体のフラグメントが、ヒトの抗体または抗体
フラグメントである、請求項3に記載の二重特異的分子。 - 【請求項5】 前記抗体が単鎖抗体である、請求項4に記載の二重特異的分子
。 - 【請求項6】 前記抗体フラグメントがFab’抗体フラグメントである、請
求項4に記載の二重特異的分子。 - 【請求項7】 前記第2特異的分子がEGFを包含する、請求項1に記載の二
重特異的分子。 - 【請求項8】 EGFに結合した、Fcα受容体に結合するヒト抗体またはそ
のフラグメントを包含する二重特異的分子。 - 【請求項9】 EGFに結合した、Fcα受容体に結合する単鎖ヒト抗体また
はそのフラグメントを包含する二重特異的分子。 - 【請求項10】 Fcα受容体に関する第1結合特異的部分と、HER2受容
体に関する第2結合特異的部分とを包含した二重特異的分子。 - 【請求項11】 前記第1及び第2結合特異的部分が、遺伝子的に融合されて
いる、請求項10に記載の二重特異的分子。 - 【請求項12】 前記第1結合特異的部分が、ヒトの抗体または抗体のフラグ
メントである、請求項10に記載の二重特異的分子。 - 【請求項13】 前記抗体が単鎖抗体である、請求項12に記載の二重特異的
分子。 - 【請求項14】 前記抗体フラグメントがFab’抗体フラグメントである、
請求項13に記載の二重特異的分子。 - 【請求項15】 前記第2抗体または抗体フラグメントが、ヒト抗体または抗
体フラグメントである、請求項10に記載の二重特異的分子。 - 【請求項16】 前記抗体が単鎖抗体である、請求項15に記載の二重特異的
分子。 - 【請求項17】 前記抗体フラグメントが、Fab’抗体フラグメントである
、請求項15に記載の二重特異的分子。 - 【請求項18】 多重特異的分子であって、 Fcα受容体に関する第1結合特異的部分と、 HER2受容体に関する第2結合特異的部分と、 EGF受容体に関する第3結合特異的部分と、を包含した多重特異的分子。
- 【請求項19】 前記第1、第2、及び第3結合特異的部分が、遺伝子的に融
合されている、請求項18に記載の多重特異的分子。 - 【請求項20】 前記第1結合特異的部分が、抗体または抗体フラグメントで
ある、請求項18に記載の多重特異的分子。 - 【請求項21】 前記抗体または抗体フラグメントが、ヒトの抗体または抗体
フラグメントである、請求項20に記載の多重特異的分子。 - 【請求項22】 前記抗体が単鎖抗体である、請求項21に記載の多重特異的
分子。 - 【請求項23】 前記抗体フラグメントがFab’抗体フラグメントである、
請求項21に記載の多重特異的分子。 - 【請求項24】 前記第2結合特異的部分が、ヒトの抗体または抗体のフラグ
メントである、請求項18に記載の多重特異的分子。 - 【請求項25】 前記抗体または抗体フラグメントが、ヒト抗体または抗体フ
ラグメントである、請求項24に記載の多重特異的分子。 - 【請求項26】 前記抗体が単鎖抗体である、請求項25に記載の多重特異的
分子。 - 【請求項27】 前記抗体フラグメントがFab’抗体フラグメントである、
請求項25に記載の多重特異的分子。 - 【請求項28】 前記第3結合特異的部分がEGFを包含する、請求項18に
記載の多重特異的分子。 - 【請求項29】 Fcα受容体に結合するヒト抗体またはそのフラグメントと
、 HER2受容体に結合するヒト抗体またはそのフラグメントと、 EGFと、を包含する多重特異的分子。 - 【請求項30】 前記第1、第2、及び第3結合特異的部分が、遺伝子的に融
合されている、請求項29に記載の多重特異的分子。 - 【請求項31】 前記第1及び第2結合特異的部分が、単鎖抗体または抗体フ
ラグメントである、請求項29に記載の多重特異的分子。 - 【請求項32】 EGF受容体の過剰発現を特徴とする腫瘍細胞の、エフェク
ター細胞が媒介する致死を誘導する方法であって、この腫瘍細胞を、Fcα受容
体に関する第1結合特異的部分と、EGF受容体に関する第2結合特異的部分と
を包含した二重特異的分子に、接触させる段階を包含した、方法。 - 【請求項33】 前記二重特異的分子の前記第1及び第2結合特異的部分が、
遺伝子的に融合されている、前記請求項32に記載の方法。 - 【請求項34】 前記二重特異的分子の前記第1結合特異的部分が、ヒト抗体
または抗体フラグメントである、請求項32に記載の方法。 - 【請求項35】 前記抗体が、単鎖抗体またはFab’抗体フラグメントであ
る、請求項34に記載の方法。 - 【請求項36】 前記二重特異的分子の前記第2結合特異的部分が、EGFを
包含する、請求項32に記載の方法。 - 【請求項37】 EGF受容体またはHER2受容体の過剰発現を特徴とする
腫瘍細胞の、エフェクター細胞が媒介する致死を誘導する方法であって、この腫
瘍細胞を、EGFに結合した、Fcα受容体に結合するヒト抗体またはそのフラ
グメントを包含する二重特異的分子に、接触させる段階を包含した、方法。 - 【請求項38】 HER2受容体の過剰発現を特徴とする腫瘍細胞の、エフェ
クター細胞が媒介する致死を誘導する方法であって、この腫瘍細胞を、Fcα受
容体に関する第1結合特異的部分と、HER2受容体に関する第2結合特異的部
分とを包含した二重特異的分子に、接触させる段階を包含した、方法。 - 【請求項39】 前記第1及び第2結合特異的部分が、ヒトの抗体または抗体
フラグメントである、請求項38に記載の方法。 - 【請求項40】 前記抗体が、単鎖抗体またはFab’抗体フラグメントであ
る、請求項39に記載の方法。 - 【請求項41】 EGF受容体またはHER2受容体の過剰発現を特徴とする
腫瘍細胞の、エフェクター細胞が媒介する致死を誘導する方法であって、この腫
瘍細胞を、多重特異的分子に接触させる段階を包含し、この多重特異的分子が、 Fcα受容体に関する第1結合特異的部分と、 HER2受容体に関する第2結合特異的部分と、 EGF受容体に関する第3結合特異的部分と、を含んだ方法。 - 【請求項42】 前記多重特異的分子の前記第1、第2、及び第3結合特異的
部分が、遺伝子的に融合されている、請求項41に記載の方法。 - 【請求項43】 前記第1または第2結合特異的部分が、ヒトの抗体または抗
体フラグメントである、請求項41に記載の方法。 - 【請求項44】 前記抗体が、単鎖抗体または抗体フラグメントである、請求
項43に記載の方法。 - 【請求項45】 前記第3結合特異的部分がEGFを包含する、請求項43に
記載の方法。 - 【請求項46】 EGF受容体またはHER2受容体の過剰発現を特徴とする
腫瘍細胞の、エフェクター細胞が媒介する致死を誘導する方法であって、この腫
瘍細胞を、多重特異的分子に接触させる段階を包含し、この多重特異的分子が、 Fcα受容体に結合するヒト抗体またはそのフラグメントと、 HER2受容体に結合するヒト抗体またはそのフラグメントと、 EGFとを含んだ、方法。 - 【請求項47】 分子複合体であって、 a) 抗原提示細胞の表面上の成分に関する二つまたはそれ以上の結合特異的
部分と、 b) 前記結合特異的部分に結合した少なくとも一つの抗原と、を包含し、 前記成分が、前記結合特異的部分に結合される際に、前記分子複合体の内部移
行を媒介する、分子複合体。 - 【請求項48】 前記複合体が、三つかそれ以上の結合特異的部分を包含した
、請求項47に記載の分子複合体。 - 【請求項49】 少なくとも一つの結合特異的部分が、抗原提示細胞上のFc
受容体(FcR)に結合する、請求項47に記載の分子複合体。 - 【請求項50】 前記結合特異的部分が、抗体またはその抗原結合フラグメン
トを包含する、請求項47に記載の分子複合体。 - 【請求項51】 前記抗体が、Fc受容体(FcR)に結合する、請求項50
に記載の分子複合体。 - 【請求項52】 前記FcRがFcγ受容体である、請求項51に記載の分子
複合体。 - 【請求項53】 前記Fcγ受容体がFcγRIである、請求項52に記載の
分子複合体。 - 【請求項54】 前記結合特異的部分の一つまたはそれ以上が、H22(アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション預託番号CRL11177)、M2
2(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション預託番号HB12147)
、M32.2(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション預託番号HB9
469)、及びその抗原結合フラグメントから選択される抗体を包含する、請求
項47に記載の分子複合体。 - 【請求項55】 前記結合特異的部分が、前記細胞表面成分の同一エピトープ
に結合する、請求項47に記載の分子複合体。 - 【請求項56】 前記結合特異的部分が、前記細胞表面成分の異なるエピトー
プに結合する、請求項47に記載の分子複合体。 - 【請求項57】 前記結合特異的部分が、異なる細胞表面成分に結合する、請
求項47に記載の分子複合体。 - 【請求項58】 前記抗原が、前記結合特異的部分に化学的に結合した、請求
項47に記載の分子複合体。 - 【請求項59】 前記抗原が、前記結合特異的部分に組換えによって融合した
、請求項47に記載の分子複合体。 - 【請求項60】 前記抗原が、腫瘍抗原である、請求項47に記載の分子複合
体。 - 【請求項61】 前記腫瘍抗原が、乳房癌、肉腫、癌腫、および卵巣癌からな
るグループから選択された癌からのものである、請求項59に記載の分子複合体
。 - 【請求項62】 前記抗原が自己抗原(autoantigen)である、請求項47に記
載の分子複合体。 - 【請求項63】 前記抗原が自己抗原(self antigen)である、請求項47に記
載の分子複合体。 - 【請求項64】 前記抗原がFcγRIに結合する、請求項47に記載の分子
複合体。 - 【請求項65】 前記抗原が、H22(アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション預託番号CRL11177)、M22(アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション預託番号HB12147)、M32.2(アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション預託番号HB9469)、及びその抗原結合フラ
グメントから選択される抗体を包含する、請求項47に記載の分子複合体。 - 【請求項66】 前記抗原が、抗原520C9(アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション預託番号HB8696)またはその抗原結合フラグメントを
包含する、請求項47に記載の分子複合体。 - 【請求項67】 被験体に分子複合体を投与して、前記被験体における抗原に
対する免疫反応を増強または誘導させる方法であって、前記分子複合体が、 a) 抗原提示細胞の表面上の成分に関する二つまたはそれ以上の結合特異的
部分と、 b) 前記結合特異的部分に結合した少なくとも一つの抗原と、を包含し、 前記成分が、前記結合特異的部分に結合される際に、前記分子複合体の内部移
行を媒介する、方法。 - 【請求項68】 前記分子複合体が、三つかそれ以上の結合特異的部分を包含
した、請求項67に記載の方法。 - 【請求項69】 前記結合特異的部分の前記の少なくとも一つが、抗原提示細
胞上のFc受容体(FcR)に結合する、請求項67に記載の方法。 - 【請求項70】 前記結合特異的部分の少なくとも一つが、抗体またはその抗
原結合フラグメントを包含する、請求項67に記載の方法。 - 【請求項71】 前記抗体が、Fc受容体(FcR)に結合する、請求項70
に記載の方法。 - 【請求項72】 前記Fc受容体がFcγRI受容体である、請求項70に記
載の方法。 - 【請求項73】 前記結合特異的部分の一つまたはそれ以上が、H22(アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション預託番号CRL11177)、M2
2(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション預託番号HB12147)
、M32.2(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション預託番号HB9
469)、及びその抗原結合フラグメントから選択される抗体を包含する、請求
項に記載の方法。 - 【請求項74】 前記結合特異的部分が、前記細胞表面成分の同一エピトープ
に結合する、請求項67に記載の方法。 - 【請求項75】 前記結合特異的部分が、前記細胞表面成分の異なるエピトー
プに結合する、請求項67に記載の方法。 - 【請求項76】 前記抗原が、前記結合特異的部分に化学的に結合した、請求
項67に記載の方法。 - 【請求項77】 前記抗原が、前記結合特異的部分に組換えによって融合した
、請求項67に記載の方法。 - 【請求項78】 前記抗原が、腫瘍抗原である、請求項67に記載の方法。
- 【請求項79】 前記抗原が自己抗原(autoantigen)である、請求項67に記
載の方法。 - 【請求項80】 前記抗原が自己抗原(self antigen)である、請求項67に記
載の方法。 - 【請求項81】 被験体に有効量の分子複合体を投与することを包含した、前
記被験体を免疫化する方法であって、前記分子複合体が、 a) 抗原提示細胞の表面上の成分に関する二つまたはそれ以上の結合特異的
部分と、 b) 前記結合特異的部分に結合した少なくとも一つの抗原と、を包含し、 前記成分が、前記結合特異的部分に結合される際に、前記分子複合体の内部移
行を媒介する、方法。 - 【請求項82】 前記分子複合体が、三つかそれ以上の結合特異的部分を包
含した、請求項81に記載の方法。 - 【請求項83】 前記結合特異的部分の少なくとも一つが、抗体またはその抗
原結合フラグメントを包含する、請求項81に記載の方法。 - 【請求項84】 前記抗体が、Fc受容体(FcR)に結合する、請求項83
に記載の方法。 - 【請求項85】 前記Fc受容体がFcγRI受容体である、請求項84に記
載の方法。 - 【請求項86】 前記結合特異的部分の一つまたはそれ以上が、H22(アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション預託番号CRL11177)、M2
2(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション預託番号HB12147)
、M32.2(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション預託番号HB9
469)、及びその抗原結合フラグメントから選択される抗体を包含する、請求
項81に記載の方法。 - 【請求項87】 前記結合特異的部分が、前記細胞表面成分の同一エピトープ
に結合する、請求項81に記載の方法。 - 【請求項88】 前記結合特異的部分が、前記細胞表面成分の異なるエピトー
プに結合する、請求項81に記載の方法。 - 【請求項89】 前記抗原が、前記結合特異的部分に化学的に結合した、請求
項81に記載の方法。 - 【請求項90】 前記抗原が、前記結合特異的部分に組換えによって融合した
、請求項81に記載の方法。 - 【請求項91】 前記抗原が、腫瘍抗原である、請求項81に記載の方法。
- 【請求項92】 前記抗原が自己抗原(autoantigen)である、請求項81に記
載の方法。 - 【請求項93】 前記抗原が自己抗原(self antigen)である、請求項81に記
載の方法。 - 【請求項94】 抗原提示細胞による抗原の提示を誘導または向上させる方法
であって、前記抗原を前記抗原提示細胞に接触させる段階を包含し、前記抗原が
、前記抗原提示細胞の表面上の成分に関する二つまたはそれ以上の結合特異的部
分に結合され、前記成分が、前記結合特異的部分により結合される際に、前記抗
原の内部移行を媒介する、方法。 - 【請求項95】 前記抗原が、三つかそれ以上の結合特異的部分に結合した、
請求項94に記載の方法。 - 【請求項96】 記結合特異的部分が、抗体またはその抗原結合フラグメント
を包含する、請求項94に記載の方法。 - 【請求項97】 前記抗体フラグメントが、Fab’フラグメントまたはsF
vフラグメントを包含する、請求項96に記載の方法。 - 【請求項98】 前記抗体が、Fc受容体(FcR)に結合する、請求項96
に記載の方法。 - 【請求項99】 前記抗原が自己抗原(autoantigen)である、請求項96に記
載の方法。 - 【請求項100】 前記抗原が自己抗原(self antigen)である、請求項96に
記載の方法。
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