CN1230198A

CN1230198A - 包含抗－FCa受体抗体的治疗性多特异化合物

Info

Publication number: CN1230198A
Application number: CN97197841A
Authority: CN
Inventors: Y·M·德奥; R·格拉兹尔诺; T·克勒
Original assignee: Medarex LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1996-07-11
Filing date: 1997-07-10
Publication date: 1999-09-29
Also published as: JP3519415B2; US6193966B1; AU705643B2; ATE318845T1; AU3723397A; CA2259371A1; WO1998002463A1; DE69735367D1; IL128003A0; EP0914346A1; US6303755B1; JP2000505091A; IL128003A; US5922845A; EP0914346B1; PL331091A1; RU2201766C2; US20010014328A1; HUP9903951A2; HUP9903951A3

Abstract

含有至少一个结合效应细胞上Fcα受体的结合决定簇的多特异混合物。另一个结合决定簇结合到靶细胞的一个或多个抗原,例如,Neu/Her－2原癌基因产物或癌细胞上的表皮生长因子受体,或感染细胞上的念珠菌抗原。实施例是双特异和三重特异抗体。所述多特异混合物的治疗性应用用于癌症和病原体感染治疗。

Description

包含抗-FCα受体抗体的治疗性多特异化合物

发明背景

免疫球蛋白的Fc部分的受体在引发许多单核细胞，巨噬细胞和多核细胞的保护性功能中是重要的。这些细胞上的IgG受体(Fcγ或FcγR)已被广泛研究，并已构建了定靶于这些受体的双特异分子。(参见例如欧洲专利号0255149题目“人类单核巨噬细胞上的免疫球蛋白G的Fc受体的单克隆抗体”。申请者所共有)另外，对已在乳腺和卵巢癌中发现的FcγR和HER-2/neu抗原的特异的双特异分子(BsAb)的临床试验表明，这些分子是安全而有效的(Valone.Frank H等，1995，临床肿瘤杂志13(9):2281-2292)。

IgA受体Fcα受体(FcαR或CD89)也能引发效应细胞功能。在淋巴细胞或具有FcαR的细胞株，配体结合于FcαR引发细胞吞噬和受体介导的细胞毒作用。Fcα受体可以和IgG受体共同作用于效应细胞以增强吞噬靶细胞。IgM(Shen.l等1989，免疫学杂志.143:4117)和IgG(Monteiro.R.C.等，1992免疫学杂志，148:1764)的单克隆抗体类已建立为针对FcαR。

人体内IgA较丰富(Kerr.M.A.1990.生化杂志271:285-296)。一类IgA Fc受体，FcαRⅠ或CD89，单体IgA已被分离和鉴定(Alberchtsen.M.等.1988免疫学.64:201；MonterioR，等，1990实验医学杂志，171:597)。FcαRⅠ在细胞毒免疫效应细胞包括单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，酸性粒细胞中持续表达(Morton,H.C.等1996)。已有报道FcαRⅠ在一亚类淋巴细胞(Moton.H.C.等，1996Critical Reviews Immunology 16:423)，和肾小球系膜细胞(Gomez-Guerrero.C.等1996免疫学杂志.156:4369-4376).有表达。在单核细胞和PMN上的表达可被TNF-α(Gesl.A.等，1994Scad.J.Immunol.39:151-156；Hostoffer.R.W.等，1994.感染疾病杂志170:82-87),IL-1,GM-CSF,LPS或佛波酯(Shen L.等，免疫学杂志.152:4080-4086；Schiller.C.A等，1994，免疫学杂志.81:598-604)增强，其中IFN-γ和TGF-β1降低FcαRⅠ表达(Reterink.T.J.F.，等，1996，临床实验免疫学，103:161-166)。人类FcαRⅠ的α链是大量糖化，一型跨膜分子，属于还包括IgG和IgE的Ig超基因家族。位于19号染色体上的一个基因编码几个FcαRⅠα链的不同剪切异构体(55-110kDa；Morton H.C.等，1996 CriticalReviews Immunology 16:423)。髓细胞FcαRⅠ显示和在FcαRⅠ信号传导中起作用的FcRγ链有关联(Moton.H.C.,1995.生化杂志，270:29781；pfefferkorn.L.C.等1995.免疫学杂志，153:3228-3226；Saito.K.等，1995,J.Allergy Clin.Immunol.96:1152)。

FcαRⅠ结合抗原-复合物和单体IgA1和IgA2(Mazangera,R.L等，1990生化杂志272:159-165)，与来自体内用单体IgA饱和的受体一致，用和IgG和IgE分别使FcγR和FcεR1饱和的同样方法。髓效应细胞上的交联FcαRⅠ，通过多聚IgA,IgA免疫复合体，或配体结合区内或外决定簇特异的mAb，刺激脱颗粒，过氧化物释放，炎症细胞因子释放，内吞或吞噬(Patty.C.A.Herbelin.A.Lihuen.J.F.Bach.和R.C.Monteriro.1995免疫学.86:1-5；Stewart.W.W.,R.L.MazYegera,L.Shen，和M.A.Kerr.1994淋巴细胞生物学杂志，56:481-487；Stewart,W.W.，和M.A.Kerr.1990.免疫学，71:328-334；Shen,L.1992.淋巴细胞生物学杂志.51:373-378)。这些通过FcαRⅠ引发的生理反应对粘膜表面第一线的体液防御是重要的(Morton.H.C.,M.van Egmond，和J.G.J.van de Winkel.1996Critical Reviews in Immunology.16:423)。

这样FcαRⅠ是细胞毒免疫效应细胞上的一临床可靠的扳机受体且其活性可被用来发展新的免疫治疗法。由于几乎所有的基于单克隆抗体(mAb)的治疗都是从不结合FcαRⅠ的IgG类mAbs发展来的，FcαRⅠ的细胞毒潜力还未被仔细研究。

发明概述

本发明涉及具有免疫球蛋白A(IgA)受体的结合决定簇的多特异治疗分子。IgA是粘膜表面的体液中的超优势抗体类型，且IgA受体(Fcα受体，FcαR或FcαR1)被发现存在于白细胞上包括巨噬细胞，单核细胞，嗜中性细胞，嗜酸性细胞和淋巴细胞。本发明的双特异和多特异分子可用作治疗试剂以利用这些血细胞的胞饮和吞噬能力，增强这些细胞对肿瘤细胞，感染微生物的细胞，感染病原体的细胞的攻击能力。

一方面，本发明包括双特异结合分子，含有结合Fcα受体的第一结合决定簇和结合一个或更多靶抗原的第二结合决定簇。优选的，第一决定簇结合FcαR上的位点和内源性IgA结合结合位点不同，因此本发明分子的结合不被或基本不被IgA阻断。在一优选实施方案中，被本发明中双特异分子的第二决定簇结合的靶抗原是癌细胞抗原。在更优选的实施方案中癌细胞抗原是乳腺，卵巢，睾丸，肺，结肠，直肠，胰腺，肝，中枢神经系统，头和颈部，肾，骨，血液和淋巴系统癌细胞抗原。在另一优选实施方案中，靶抗原是病原体或病原体感染细胞中的感染性疾病抗原。在另一实施方案中，本发明利用结合并调节IgA受体的组合物治疗自身免疫疾病，引起受体的调节使IgA进一步结合于受体减少。在一不同的实施方案中，本发明提供结合但不调节IgA受体的组合物，这样受试者的效应细胞被装配上双特异和多特异分子并可结合病原体或癌上的抗原。

本发明的双特异分子的优选实施方案包括含有以下结合决定簇的分子：人类EGF-样受体家族的受体，癌胚抗原，胃泌素释放多肽受体抗原，和粘蛋白抗原，它们过表达于一些肿瘤细胞。

本发明的双特异分子包括保括于抗体的部分结合决定簇的分子，且本发明的分子包括那些工程化的包括至少一个抗体或抗体片段的分子。本发明的双特异结合分子优选含有来自IgG抗体或IgG片段的结合决定簇，包括一个Fab,Fab’,F(ab’)₂,Fv，和单链Fv，包括Fab,Fab’,F(ab’)₂,Fv，和单链Fv的结合决定簇可从IgA抗体或另一同种型的抗体获得。本发明的一种优选双特异结合分子包括至少为抗体A77的功能片段的第一结合决定簇和结合癌细胞抗原，病原体抗原，或感染细胞抗原的第二结合决定簇。本发明的其它优选双特异分子包括至少为抗体A3,A59或A62，其IgA受体亲和力和A77类似且不被受试者IgA封闭，的功能片段的第一结合决定簇。本发明包括编码A77抗体VH和VK区的核酸序列和这些区的预言的氨基酸序列，且这些序列可用作治疗性多特异分子的结合决定簇的人源化。优选的本发明分子的第二结合决定簇为至少抗体520C9，抗体H425或抗体CC9的一功能片段。优选方案含有一个FcαR的结合决定簇和针对例如乳腺，卵巢，和肺癌中发现的HER/neu抗原的一个结合决定簇。

本发明包含多种产生双特异分子的方法，包括结合决定簇的化学偶联，和遗传重组方法。本发明包含由含有由此而编码遗传学偶联的结合决定簇基因的核酸序列编码的重组双特异分子。进一步，本发明的双特异结合分子通过两个含有各自编码结合决定簇的核酸序列的产生抗体的细胞株融合产生，如杂交瘤细胞株，以获得产生本发明双特异分子的后代细胞株。

除外双特异结合分子，本发明还包括多特异结合分子，含有至少一个结合Fcα受体的第一结合决定簇和结合靶抗原的第二结合决定簇，和至少一个第三结合决定簇。这些多特异结合分子的第一结合决定簇结合于FcαR不被人类免疫球蛋白A阻断或抑制，于是很少或几乎没有内源性IgA分子的竞争结合。多特异结合分子包括双特异和三特异组分，和具有四个或更多决定簇。三特异结合分子的优选方案具有另外的结合于Fc受体而非Fcα受体的结合决定簇，包括例如CD2,CD3,Fcγ受体，Fcε受体，Fcδ受体和/或Fcμ受体的结合决定簇，这些决定簇针对不同于Fcα的第一结合决定簇。FcR受体的另外结合决定簇最优选实施方案是Fcγ受体决定簇。对含有Fcγ受体决定簇的本发明多特异结合分子，结合于FcγR不被人类IgG限制，由于该分子在不同于IgG结合于Fcγ的抗原位点结合于Fcγ。通过整合至少每个FcαR和FcγR结合决定簇于单一分子，分子的治疗能力被增强以增强白细胞和肿瘤细胞或病原体微生物细胞或病原体感染细胞的亲和力和动力。

具有Fcα决定簇的多特异结合分子另一优选实施方案具有结合于第二靶抗原或癌细胞，病原体或病原体感染细胞上的第二靶表位的结合决定簇。产生这些分子的优选方法是结合决定簇的化学偶联，尽管本发明也包括重组，或通过具有编码结合决定簇的核酸序列的两个或两个以上的细胞株融合产生的多特异结合分子。优选至少一个结合决定簇是一个抗体或抗体片段，且为改善后续的人类治疗中结果成功，结合决定簇是人源化抗体，它被工程化以最小化分子产生的外源表位数目。

本发明的多特异结合分子的优选实施方案含有一个或多个靶癌细胞抗原的结合决定簇，优选来自乳腺，卵巢，睾丸，肺，结肠，直肠，胰腺，肝，中枢神经系统，头和颈部，肾，骨，血液和淋巴系统的癌细胞抗原。本发明多特异结合分子的不同优选实施方案包括，如靶抗原，来自病原体或病原体感染细胞的感染性抗原。在一实施方案中，靶抗原是感染性疾病抗原和感染细胞表达的抗原，例如细菌，真菌，原生动物，和病毒感染的抗原。在更优选方案中，靶抗原来自病原体真菌，包括来自病原体性酵母的抗原。在最优选实施方案中，靶抗原来自一种念珠菌，例如，白色念珠菌。

癌细胞抗原中适合的的靶是优选的人类EGF样受体家族的成员，更优选癌细胞抗原是EGF受体，最优选癌细胞抗原是HER-2/neu,HER-3,HER-4，或含有至少一个HER亚单位的异多体受体。另外的优选癌细胞抗原包括癌胚抗原，胃泌素释放多肽受体抗原，和TAG72。

最优选多特异结合分子包括至少至少为抗体A77的功能片段的第一结合决定簇和结合癌细胞抗原，病原体微生物抗原，或病原体感染细胞的第二结合决定簇。在A77衍生的具有癌抗原结合决定簇的多特异结合分子的优选实施方案中，优选第二结合决定簇至少是抗体520C9或CC49一个功能片段。Fcα受体的第一结合决定簇优选结合白细胞上的受体。该分子结合的白细胞类型优选是巨噬细胞，单核细胞，嗜中性细胞，嗜酸性细胞和淋巴细胞。

本发明的另一方面包括多特异结合分子，其中分子包括来自病原体或病原体感染细胞或癌细胞抗原的至少一个抗原。此具体方案的分子可用于直接给免疫系统中抗原存在的细胞提供这些抗原作为疫苗以使受者针对感染性疾病或癌免疫。这些抗原可取自已知的细菌，病毒，真菌和原生动物的抗原蛋白序列，以及取自这些病原体感染的细胞或癌细胞以免疫受者。

本发明的多特异结合分子包括来自抗体或抗体片段分子的结合决定簇，优选IgG或IgG片段。抗体片段优选Fab,Fab’,F(ab’)₂,F(ab’)₃,Fv，或单链Fv作为构建多特异结合分子的结合决定簇来源。抗体片段可从IgG类同种型抗原获得，例如从产生单克隆IgG抗体的杂交瘤或来自多克隆IgG制剂。在一优选实施例方案中，多克隆IgG制剂从用来自病原体微生物，更优选病原体真菌的抗原免疫的动物获得。

多特异结合分子的另一个特点是，其中第一结合决定簇结合FcαR，且第二结合决定簇结合靶细胞抗原，包括一个第三结合决定簇，其结合于与第二结合决定簇位于同一靶细胞上的不同的抗原。进一步实施方案中包括一个第三结合决定簇，其结合于与第二结合决定簇位于同一靶抗原上的不同的表位。这些决定簇提供了多特异结合分子对靶的两倍的结合能力，以关连于免疫效应细胞产生胞饮和吞噬。

本发明还提供了消除受试者不想要细胞的方法，给予受试者包含于药用载体中的治疗有效量的多特异结合分子，包括至少一个结合于FcαR的第一结合决定簇和结合于不想要细胞上的抗原的第二抗原决定簇。对人类受试者，抗体来源的结合决定簇可被人源化。进一步，通过从受试者治疗过程中获得生物样品来监视治疗处理。消除受试者中不想要细胞的方法的另一实施方案涉及另外用增强FcαR活性或数目的试剂处理受试者，例如，给受试者用细胞因子治疗。优选的和本发明治疗组合物同时给药的细胞因子包括至少G-CSF,GM-CSF,IFN-γ，和TNF之一，涉及本发明分子治疗方法和不止一种的其它的治疗试剂是可预想的。

在另一实施方案中，受试者的效应细胞可针对一种抗原被装备，通过给予受试者可药用载体中的治疗有效量的多特异结合分子，它包括至少一个结合于FcαR的第一结合决定簇和结合于抗原的第二抗原决定簇。装备有多特异分子的效应细胞不调节或下调其表面的Fcα受体，且能结合于靶抗原。对人类受试者，抗体来源的结合决定簇可被人源化。进一步，通过从受试者治疗过程中获得生物样品来监视治疗处理。

本发明的另一优选实施方案是去除受试者中不想要细胞的方法，包括从所述受试者获得一定量血细胞或血液标本，用可药用的载体中的本发明治疗有效量的多特异结合分子来自体内处理来自体内的血液或血细胞，所述结合分子包括结合于FcαR的第一结合决定簇和结合于一个或多个靶抗原的第二抗原决定簇，并将所述处理的血液或血细胞给予受试者。优选地，分离血样的细胞并在培养中扩增，更优选地所述血液样品细胞用增强Fcα受体活性和数目的试剂处理。对人类受试者，抗体来源的结合决定簇可被人源化。进一步，通过从受试者治疗过程中获得生物样品来监视治疗处理。

一方面，本发明提供了治疗有感染性疾病受试者的一种方法，包括给病人施用治疗有效量可药用载体中的多特异结合分子，其中第一结合决定簇结合于Fcα受体，第二抗原决定簇结合于病原体或病原体感染细胞来源的靶抗原，增强免疫系统的能力以消除感染。

在另一方案中，本发明提供了使受试者免疫于一种癌抗原或病原体或病原体感染细胞上抗原的方法，包括以可药用载体中的含有一个或多个病原体感染微生物抗原，或感染细胞抗原，或癌细胞的多特异结合分子组合物给药。感染生物体优选实施方案是病原体性真菌，包括病原体性酵母，更优选实施方案是一种念珠菌。对人类受试者，抗体来源的结合决定簇可被人源化。进一步，通过从受试者治疗过程中获得生物样品来监视治疗处理。

本发明也提供鉴定调节细胞表面Fcα受体试剂的方法，涉及使含有Fcα受体的细胞样品接触试剂。分辨调节细胞表面Fcα受体试剂的方法，包括使含有Fcα受体的细胞样品接触试剂并用试剂测定样品中Fcα的活性，及在对照样品中用调节Fcα受体的抗体如抗体A77，及在另一对照样品中用未接触所述试剂或抗体的细胞；接着比较样品中Fcα受体活性，这样接触试剂的细胞样品具有比接触试剂的对照细胞统计学显著少的Fcα受体活性，或同具有抗体样品细胞一样的统计学显著低Fcα受体活性，表明该试剂调节细胞表面Fcα受体。

在另一实施方案中，本发明提供方法通过用A77重链和轻链可变区序列决定簇获得A77抗-Fcα受体结合位点的三维模型以设计一种调节Fcα受体用于治疗自身免疫疾病的试剂。此方法涉及比较A77可变区的氨基酸残基序列和已知三维结构的抗体的重链和轻链可变区，决定非同源氨基酸残基在V_H和V_K位点结合区主肽链内的位置，如测定A77抗Fcα受体结合位点的大小，形状，和带电性，通过A77结合位点模拟的计算机模型筛选分子文库一获得合适大小，形状，和带电性的分子，并筛选这些具有合适大小，形状和带电性的候选物作为Fcα受体潜在调节剂的活性，这样就设计了调节Fcα受体的试剂。

附图简述

图1是A77X520C9双特异分子制剂凝胶过滤HPLC洗脱图，其中9.86分钟的峰(～150KD)代表F(ab’)₃异复合体包括一个A77F(ab’)和两个520C9F(ab)，且10.43分钟的峰代表F(ab’)₂异复合体包括一个A77和520C9的F(ab’)；凝胶过滤HPLC用TSK-3000柱进行。

图2是显示A77X520C9结合范围的图，一个抗FcαRⅩ抗-HER2/neu双特异抗体(BsAb)，作为μg/ml嗜中性细胞(PMN，开放方框)和单核细胞(闭合方框)的浓度函数，其中平均荧光强度用FACcan分析即结合测定。

图3是细胞量分析显示A77X520C9，一个抗FcαRⅩ抗-HER2/neuBsAb(10μg/ml终浓度)对肝素化全血中的效应细胞的结合范围，在0℃孵育一小时后；加入藻红蛋白-抗鼠IgG，红细胞被裂解，样品用FCAScan分析；数据显示其基本上结合于单核细胞(中组)和嗜中性细胞(底组)，而非淋巴细胞(上组)。

图4是显示A77X520C9，一个抗FcαRⅩ抗-HER2/neu BsAb(菱形)，以及另一BsAb,MDX210，也具有HER2/neu决定簇(开放方框)，对靶SKBR-3乳腺癌细胞的结合，作为μg/ml浓度的BsAb的函数，其中平均荧光强度用FACcan分析即结合测定。

图5是显示A77X520C9进一步制剂，抗FcαRⅩ抗-HER2/neu BsAb结合于靶SKBR-3乳腺癌细胞的图，作为μg/ml浓度的BsAb的函数；SKBR-3与不同浓度的A77X520C9(圆圈)，A77F(ab’)₂(三角)，或520C9F(ab’)₂(方框)在冰上孵育；洗细胞，用缀合异硫氰酸荧光素(FITC)抗鼠IgG染色，用FACsan分析。

图6是显示A77XH425BsAb结合于过表达EGF-R的A431靶细胞的图，其中平均荧光强度用FACcan分析即结合测定；细胞与不同浓度的A77X520C9(圆圈)，A77F(ab’)₂(三角)，或H425F(ab’)₂(方框)孵育，细胞和抗体如所述在冰上孵育，清洗，用缀合FITC抗鼠IgG染色，用FACsan分析。

图7是显示通过嗜中性效应细胞裂解SKBR-3乳腺癌细胞的A77X520C9BsAb介导抗体用来细胞毒作用，在效应细胞比靶细胞200比1的比例，作为μg/ml浓度的BsAb的函数，用两种不同的BsAb制剂。

图8显示通过全血效应细胞裂解SKBR-3乳腺癌细胞的A77X520C9BsAb介导抗体依赖细胞毒作用，采用彼此独立的一式二份BsAb制剂，作为BsAb μg/ml浓度的函数。

图9是条图，显示抗FcαRA77F(ab’)抑制A77X520C9BsAb介导的单核细胞杀乳腺癌细胞，与加入抗FcγR M22F(ab’)的无抑制比较。

图10显示A77X520C9BsAb介导的通过全血中纯化得来的PMN效应细胞裂解靶细胞SKBR-3细胞毒作用；与PMNs细胞及BsAb另一制剂此处为“BSM”(圆圈)结合前SKBR-3靶细胞用100μCi⁵¹Cr标记1小时；此靶细胞混合物，50μg/ml A77F(ab’)₂(方框)存在下PMNs和BsAb；及M22F(ab’)₂(三角)存在下的混合物，各自在“U”型底滴板中；细胞和抗体混合物在37℃孵育16小时，收集上清并分析放射性，细胞毒性有下公式计算：％裂解=(实验CPM-靶渗漏CPM/去垢剂裂解CPM-靶渗漏CPM)×100％。BsAb依赖裂解=％BsAb裂解-％无BsAb裂解，效应剂∶靶为200∶1；误差条代表从三个实验获得的平均值+/-标准差。

图11显示A77X520C9BsAb介导的通过Leukopaks中纯化得来的单核效应细胞裂解靶细胞SKBR-3细胞毒作用；效应剂∶靶为100∶1；其它条件和符号与图10描述的一样。

图12显示A77X520C9BsAb介导的通过全血效应细胞裂解靶细胞SKBR-3细胞毒作用；其它条件和符号与图10描述的一样。

图13显示过表达EGF-R靶细胞A431的细胞毒作用，该作用由A77XH425 BsAb(此处称为“BSM”；圆圈)介导且PMN效应细胞是纯化自全血；在50μg/ml A77F(ab’)₂(方框)或M22F(ab’)₂(三角)存在下孵育细胞和BsAb；细胞用100μCi⁵¹Cr标记1小时如图10描述测定细胞毒作用。

图14显示A77XH425 BsAb介导的从全血中通过Leukopaks纯化得来的单核效应细胞裂解靶细胞A431(E∶T为100∶1)；其它条件和符号与图13描述的一样。

图15显示A77XH425 BsAb介导的全血效应细胞裂解靶细胞A431；其它条件和符号与图13描述的一样。

图16显示抗-TAG72xA77 BsAb介导的来自含有TAG72癌细胞的嗜中性细胞的抗体依赖的细胞毒作用，BsAb抗体浓度为μg/ml起作用。

图17显示BsAb组合物A77XTT对破伤风毒素(TT)特异T细胞生长的刺激，通过分光光度计测量细胞乳酸脱氢酶来测定，通过BsAb此抗原递呈单核细胞，与未复合的TT相比，作为各抗原浓度μg/ml的函数。

图18显示A77X520C9 BsAb介导SKBR-3乳腺癌靶细胞的吞噬作用范围，作为μg/ml浓度的函数，比例为15嗜中性细胞每靶细胞(圆圈)，或3单核细胞(方框)每靶细胞。

图19是流式细胞计分析BsAb衍生的单核细胞衍生巨噬细胞(MDM)对SKBR-3细胞的吞噬作用；SKBR-3靶细胞用嗜脂红荧光剂染色，PKH26，并在A77X520C9 BsAb(或对照抗体)存在或不存在条件下和MDM于37℃孵育24小时；MDM和非吞噬肿瘤细胞用胰酶回收，用FITC标记的CD14染色，样品用FACSan用两种颜色荧光分析。吞噬百分比用双阳性靶细胞(MDM吞噬)除靶细胞总数得到。

图20显示A77X520C9 BsAb的SKBR-3细胞的吞噬作用，通过比较A77和520C9(三角)的未偶联F(ab；)₂片段其中SKBR-3细胞的特异吞噬作用由A77X520C9 BsAb(圆圈)引起。BsAb介导的吞噬作用被加入10μg/mlA77F(ab’)₂(方框)抑制。BsAb依赖的吞噬作用计算为：％有BsAb的吞噬作用-％无BsAb的吞噬作用。

图21显示流式细胞计显示嗜中性细胞介导的对真菌病原体，白色念珠菌，的吞噬作用，在A77X抗-念珠菌(A77Xα-念珠菌)BsAb存在时，组A和B分别是嗜中性细胞混有白色念珠菌光镜图，组C和D是FACSan分析，分别在BsAb不存在(组A和C)和存在(组B和D)时。

图22显示BsAb介导的，作为μg/ml浓度函数的，G-CSF(上组)，或G-CSF和IFN-γ(底组)处理的嗜中性细胞对SKBR-3乳腺癌靶细胞杀细胞作用范围。

图23显示BsAb介导的，作为μg/ml浓度函数的，效应细胞对SKBR-3乳腺癌靶细胞杀细胞作用范围。其中效应细胞是IFN-γ处理的单核细胞(上右组)，TNF处理的单核细胞(底组)或未处理的单核细胞(上左组)。

图24是条图显示与无IgA对照孵育相比，预先和人类IgA孵育的效应细胞不影响和A77mAB结合。

图25是条图显示与对照mAb520C9(10μg/ml)相比A77mAb在浓度范围从0.001到10μg/ml孵育时，Fcα受体的调节，显示作为A77浓度函数，细胞表面受体数目变化的程度。

图26是条图显示BsAb结合于单核细胞或PMN效应细胞不引起FcαR调节；用流式细胞计检测A77X520C9,A77F(ab’)₂或A77mAb结合PMN或单核细胞后FcαR的调节，用不同浓度抗体直接加入全血并37℃过夜在含5％CO₂的培养基中孵育。裂解红细胞，PMN和单核细胞表面FcαR表达水平通过和huIgA-PE探针在4℃孵育测定。调节计算为：[1-(样品MFI/无抗体MFI/BSM对照)]×100％。

图27显示编码A77-FcαR抗体基因的轻链可变区V_K的DNA序列(序列号5)，及预测氨基酸序列(序列号6)。

图28显示编码A77-FcαR抗体基因的重链可变区V_H的DNA序列(序列号7)，及预测氨基酸序列(序列号8)。

发明详述Ⅰ定义

此处使用术语的定义应具有以下的意思。抗体(或其片段)在本发明用作引起相关白细胞对肿瘤细胞，不想要感染性疾病试剂或感染细胞胞饮及吞噬作用的多特异试剂的组分。适用于本发明方法的抗体是本领域可得到的(例如从American Type Culture Collection,Rockvill,MD或商业的，例如从Becton-Dickinson或Immunotech)或用制备抗体的标准技术制备。此处所用词“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活化决定簇，即含有特异结合(免疫作用)某抗原的抗原结合位点的分子。结构上，最简单的天然发生的抗体(例如IgG)包括四条肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链，都通过二硫键共价连接。大量不同抗体的结合特异性被发现存在于H和L链的可变(V)决定簇；分子的结构区在此基本是稳定的(C)。

结构上，天然存在的抗体(例如IgG，分子量150KDa)含有四条多肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链(分子量25KDa)，四条链通过二硫键共价连接。含有大量不同抗体的每一分子的抗原结合特异性被发现存在于H和L链的可变(V)决定簇；分子的结构区在此基本是稳定的(C)。IgA(Mr 160kDa)是分泌物中主要的抗体(唾液，泪液，mild，鼻粘液，胃肠道及呼吸系统分泌物)。IgA可以单体，二聚体或更高的多聚形式存在(J.Kendrew编著，分子生物学百科全书，1994,Blackwell Science,Oxford)。IgM的另一同种型为B细胞上膜结合的单体(Mr 190kDa)，及循环分泌形式的五聚体(Mr约950kDa)，后者与结合形式由于不同的剪切在重链的N-末端不同。五聚体的重链通过二硫键连于J链分子。少数抗体同种型包括细胞表面表达的IgD(Mr175kDa)及IgE。IgE(总Mr 190kDa)包括0.0003％血清球蛋白，它在医学上作为急性超敏性主要的媒介是很重要的，其在过敏性受试者如哮喘可显著提高。

包含抗体的蛋白的结合位点，即抗体的抗原结合功能区通过分析天然存在的抗体片段来定位。因此，抗原结合片段亦用术语“抗体”命名。包含在术语抗体内的结合片段示例包括：由V_L,V_H,C_L,C_H1区的Fab片段；由V_H,C_H1区的Fd片段；包括抗体单链V_L,V_H，区的Fv片段；包括V_H区的dAb片段(Ward等1989自然341:544-546)；分离的互补性决定区(CDR)；及F(ab’)2片段，包含两个在铰链区以二硫键连接的Fab’片段的二价片段。这些抗体片段用本领域技术熟练人员熟知的传统技术获得，并以与完整抗体相同的方式筛选这些片段的用途。术语抗体进一步还包括具有至少一个来自抗体分子的抗原结合决定簇的双特异及嵌合分子。而且，尽管Fv片段的H和L链由独立的基因编码，可利用重组方法得到的合成的接头使它们能够成为一条蛋白链(即单链抗体，sAb；Bird等1988科学242:423-426；及Huston等1988 PNAS 85:5879-5883)。这样的单链抗体也包括在术语“抗体”中，可在设计和制备多特异结合分子中用作结合决定簇。抗体片段在调控针对细胞表面抗体的受体数目，及通过筛选调控受体的此类试剂获得此活性类似试剂中有用。

通过多次皮下或腹膜内注射免疫原(抗原)和适合的佐剂免疫动物通常是哺乳动物，获得多克隆抗体。作为示例，动物用蛋白，多肽或衍生物通过伍用1μg-1mg增强的载体制剂，如弗氏完全佐剂，或缀合试剂如，明矾并皮内多点注射组合物可引起免疫反应的蛋白典型免疫。动物用至少一次低剂量的完全弗氏佐剂中(或其它合适佐剂)的1/5-1/10原始量免疫原通过多点皮下注射加强。接着，动物抽血测定特异抗体的滴度，再次加强动物并检测直至抗体滴度不再升高(即平台)。

这样的抗体分子群被称作“多克隆”，是因为该群包括一大组抗体，每一个对免疫原中发现的许多不同表位之一特异，每一个以其对此表位的特异亲和力为特征。表位是最小的抗原性决定簇。对于蛋白包括6-8个残基长的肽(Berzofsky.G和L.Berkower，(1993)Pzaul.W.编著基础免疫学Raven Press纽约，246页)。抗体对抗原的亲和力范围从低，如10^-6M，到高，例如10^-11M。从哺乳动物收集的多克隆抗体组分通过熟知的技术分离，例如通过用选择性结合免疫球蛋白分子如蛋白A亲和基质层析来获得IgG组分。为增加抗体的纯度和特异性，特异抗体可进一步通过用固相固定免疫原免疫亲和层析。抗体和固相固定免疫原接触一段时间足以使免疫原和抗体分子相互免疫作用，形成固相固定免疫复合物。结合抗体用标准技术从固相洗脱，如通过用降低pH的缓冲液或增加离子强度，检测洗脱级分，合并含有特异抗体的级份。

此处所用术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单个分子组分的抗体分子制剂。单克隆抗体(mAb)组合物具有对特异表位的单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体可用提供由培养的持续生长的细胞产生抗体分子的技术制备。这些包括，但不局限于Kohler和Milstein描述的杂交瘤技术，(1975，自然，256:495-497；参见Brown等，免疫学杂志1981,127:539-46；Brown等，1980，生物化学杂志255:4980-83；Yeh等，1976,PNAS 76:2927-31；及Yeh等，1982，国际肿瘤杂志29:269-75)和最近人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor等1983，免疫学现状4:72),EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和肿瘤治疗Alan R.Liss.Inc.,77-96页)和trioma技术。

人类IgA类肿瘤特异mAb还未得到。同样，血清IgA(高达4.0mg/ml)在生理条件下可能干扰IgA mAbs的活性。另一方案利用双特异抗体分子使肿瘤靶的FcαRⅠ依赖的细胞介导的细胞毒性作用成为可能。同时结合于靶细胞(肿瘤细胞，病原体)的双特异分子(BsAb)和免疫效应细胞上的扳机受体(例如，CD3,CD2,FcγR)已被描述(Michon.J.等1995，血液，86:11245-1130；Bakacs.T.等1995，国际免疫学76:947-955)。BsAbs可从异杂交瘤得到，或通过化学或遗传的连接具有不同特异性的两个抗体的F(ab’)片段或一个Fab’片段和一个配体得到(Graziano.R.F.等1995，双特异抗体M.W.Fanger编著R.G.Landes Company/Austin.TX；Goldstein.J等1997免疫学杂志158:872-879)。利用结合于扳机受体天然配体结合区外侧的扳机受体特异抗体产生的BsAbs能避免血清抗体的干扰，并在饱和浓度的天然配体存在下募集免疫效应细胞(Fanger,M.等，1989，当代免疫学103:92-99)。以用这种设想产生FcγR特异的BsAbs，它介导在单体或聚合IgG存在下肿瘤细胞的抗体依赖的细胞毒性(ADCC)(Michon.J.等1995，血液，86:1124-1130；Bakacs,T.等1995国际免疫学，76:947-955)，并已在临床显示了很理想的结果，Deo,W.M.等1997，现代免疫学，18:127-135。描述了四个FcαRⅠ-特异的mAb，它们被定义为A3,A59,A62及A77，它们结合于FcαRⅠ上IgA配体结合区外(Monteiro,R.C.等1992，免疫学杂志148:1764)。

单克隆抗体可用以下步骤产生。在所有的过程中，用一抗原如蛋白(或其肽)免疫动物来产生多克隆抗体。免疫过程通常通过给有免疫能力的哺乳动物免疫有效量的免疫原，即足以产生免疫应答的量来完成。优选，哺乳动物为啮齿动物，如兔，大鼠或小鼠。然后哺乳动物在所述足以使其产生高亲和力抗体分子的一段时间内持续加强。从每一个分泌期望抗体的免疫哺乳动物上移取抗体产生细胞的悬液。在产生高亲和力抗体的足够长时间后，杀死动物(如小鼠)，从一个或多个淋巴结，脾及外周血获得产生抗体的淋巴细胞。优选脾细胞，并可用本领域技术熟练人员熟知的方法机械分离为生理培养基中的单个细胞。通过融合于鼠骨髓瘤细胞株使抗体产生细胞不死。鼠淋巴细胞和小鼠同源骨髓瘤有高百分比的稳定融合，尽管也可用大鼠，兔和蛙体细胞。期望抗体产生动物的脾细胞在融合剂，如聚乙二醇存在下与骨髓瘤细胞融合，使不死。所有若干适合用作融合伴侣的骨髓瘤细胞株可用标准技术使用，例如，P3-NS1/1-Ag4-1,P3-x-63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞株，可从American Type CultureCollection(ATCC).Rockville.M.d获得。

融合产生的细胞包括期望的杂交瘤，在选择性培养基如设计用于未融合父代骨髓瘤或淋巴细胞或脾细胞的HAT培养基中培养。选择杂交瘤细胞在有限稀释条件下生长以获得分离克隆。筛选每个具有期望特异性和亲和力的抗体产生的克隆杂交瘤上清，例如通过免疫测定技术以测定如用于免疫的目的抗原。用适当的方法从细胞培养物中分离单克隆抗体，如硫酸铵沉淀，离子交换层析和亲和层析(Zola等，单克隆杂交瘤抗体：技术和应用Hurell编著，51-51CRC press,1982)。根据这些方法产生的杂交瘤可用本领域技术熟练人员熟知的技术在来自体内或体内(腹水中)繁殖培养。

非人源抗体用于人类治疗，非人“外源”表位引起病人免疫反应。如果发展充分，可能导致已知的HAMA(针对小鼠抗体的人抗体)这一潜在致命疾病。为消除或最小化HAMA，可期望设计嵌合抗体衍生物，即，非人Fab可变区结合决定簇和人稳定区(Fc)结合的“人源化”抗体分子。这样的抗体特征是具有与上述单克隆或多克隆抗体相同的抗原特异性和亲和力，在用于人类时，引起免疫反应较少，且更可能被病人耐受。

嵌合鼠-人单克隆抗体(即嵌合抗体)可用本领域熟知的重组DNA技术生产。例如，编码鼠或其它种类单克隆抗体分子Fc稳定区的基因用限制性内切酶消化，以去除编码鼠Fc的区域，且编码人类Fc稳定区的相应部分代替。(见Robinson等，国际专利公布PCT/US8602269；Akira等，欧洲专利申请，184.187；Taniguchi.M.欧洲专利申请171.496；Morrison等欧洲专利申请173.494；Neuberger等国际申请WO86/01533；Cabilly等美国专利号4.816.567；Cabilly等，欧洲专利申请125.023；Better等1988科学240:1041-1043)；Liu等1987 PNAS 84:3439-3443；Liu等1987免疫学杂志139:3521-3526；Sun等1987 PNAS 84:214-218；Nishimura等1987肿瘤研究47:999-1005；Wood等(1985)自然314:446-449；和Shaw等1988 J.Natl.Cancer Inst 80:1553-1559)。

嵌合抗体可通过用等价的人Fv可变区序列取代并不直接涉及抗原结合的Fv可变区序列进一步人源化。人源化嵌合抗体的一般综述由Morrison.S.L,1985科学229:1202-1207和Oi等1986，生物技术4:214提供。这些方法包括分离，处理，并表达编码全部或部分来自至少重链或轻链之一的免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列。这些核酸序列的来源为本领域技术熟练人员所熟知，例如，可从7E3，一株抗GPⅡbⅢa抗体产生杂交瘤获得。编码嵌合抗体，或其片段的重组DNA，可被克隆入合适的表达载体。合适的人源化抗体可通过CDR取代产生(美国专利5.225.539；Jone等1986自然321:552-525；Verhoeyan等1988科学239:1534；和Beidler等1988免疫学杂志142:4053-4060)。

直接针对人类蛋白的人mAb抗体可用带有完全人类免疫系统而非小鼠免疫系统的转基因小鼠产生。来自用感兴趣的抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞可用作产生分泌对人类蛋白表位有特异亲和力的人类mAb的杂交瘤(参见Wood等国际申请WO91/00906.Kucherlapati等PCT公布WO91/10741；Lonberg等国际申请WO92/03918；Key等国际申请92/03917；Lonberg.N等1994自然368:856-859；Green.L.L等1994自然遗传7:13-21；Morrison.S.L等1994美国国家科学院院刊81:6851-6855；Bruggeman等1993免疫年鉴7:33-40；Tuaillon等1993PANS90:3720-3724；Breggeman等1991欧洲免疫杂志21:1323-1326)。

单克隆抗体也可通过本领域技术熟练人员熟知的其它重组DNA技术产生。另一方法称为“重组抗体显示”已被建立用于鉴定和分离具有抗原特异性的抗体片段，且可用于生产单克隆抗体(重组抗体展示的描述参见，Sastry等1989,PNAS86:5728；Huse等1989，科学246:1275；和Orlandi等1989,PNAS86:3833)。如上述用免疫原免疫动物后，所得B细胞库的全部抗体被克隆。通过用混合寡聚引物PCR获得不同的免疫球蛋白分子的可变区的DNA序列的方法是已知的。例如，相应于5’引导序列(信号肽)和/或框架1序列(FR1)混合寡核苷酸引物，以及保守的3’稳定区的引物可用于PCR扩增许多鼠抗体的重链和轻链可变区(Larrick等1991，生物技术11:152-156)。类似的方法可用作扩增人类抗体的人类重链和轻链可变区(Larrick等1991，方法：酶学方法2:106-110)。

术语“补体”指一组超过30个不需预先暴露于特殊抗原及存在的血清蛋白(参见Liszewski.M.等1993，基础免疫学第三版W.Paul编著26章“补体系统”917页)。补体系统的功能是修饰感染性因子的膜，通过细胞作用引发炎症反应。补体蛋白通过一系列蛋白酶剪切转变为活性形式。激活的C3b蛋白的产生可通过“经典”补体途径快速而有效的发生，或通过“旁路”途径缓慢且不足地发生。C3由单核细胞和巨噬细胞分泌：因子B和D和备解素复合体剪切C3，提供产物C3a和C3b。这些产物促进浆细胞脱粒，释放炎症分子如组胺，蛋白酶，溶酶，酸性水解酶，髓过氧化物酶。靶细胞膜的调理作用引发裂解和吞噬。

如此处所用术语“细胞因子”指能调节针对“外源”物质或微生物免疫防卫的蛋白激素。细胞因子的一般特性的综述，例如，Addas.A等细胞和分子免疫学第二版，1994,Saunders Philaderlphia。炎症细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)，白细胞介素1β(IL-1β),IL-6，和γ-干扰素(IFN-γ)。宿主产生细胞因子可被微生物产物或外源抗原刺激，例如，脂多糖(LPS)。

细胞因子可由免疫系统的细胞产生，例如，T细胞和嗜碱性细胞，并可作用于附近的其它细胞(旁分泌作用)，或其它产生细胞(自分泌作用)，或可被释放入循环作用于远距离细胞(内分泌)。细胞因子的功能包括：介导自然免疫；调节淋巴细胞激活，生长和分化；调节免疫介导炎症；及刺激淋巴细胞生长和分化。

细胞因子的功能通过结合于靶细胞特异受体开始。例如，作为三聚体起作用的17kDTN F多肽由巨噬细胞和T细胞产生。它结合于位于，例如，嗜中性细胞或内皮细胞上的特异TNF受体以激活炎症反应。这些靶细胞的一个反应是产生IL-1β，这又反过来引起IL-6的产生。TNF和IL-1β作用于乳腺腺细胞引发信号流，最终增加编码Ig蛋白基因的表达。类似的，IFNγ结合于特异细胞受体刺激不同序列表达。这些细胞因子也结合于肝细胞上受体，以激活免疫反应急性期蛋白的表达。

其它细胞因子对免疫系统的效果可以是抗炎的，例如，IL-4,IL-10和IL-13(Goyce.D.等1994欧洲免疫学杂志24:2699-2705；Zurawski.G，等1994，免疫学现状15:19-26)。IL-10通过下调表面TNF受体(TNF-R)表达，增加可溶性TNF-R产生，抑制TNF释放减少TNF的炎症效果。

进一步，人类IL-13蛋白的功能，通过用LPS刺激单核细胞来研究，抑制IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-8,MIP-1α,TNF-α,IL-10,GM-CSF和G-CSF的产生。进一步，IL-1ra(受体拮抗剂)，IL-1R的可溶形式的产生被增强。这些抗炎症特点与IL-4和IL-10的类似。

对“外源”抗原的免疫反应包括“自身”蛋白和生物表达的其它分子对该生物不是抗原性或免疫原性的这一概念。事实上，异源或异源决定簇和同源或同源决定簇的区别通过免疫系统发育过程中某生物免疫系统的成熟来实现。发生了对有自身结合决定簇抗体的免疫细胞的一系列选择，以便当免疫系统成熟后，它不进攻生物体自身的蛋白或其它分子。而在一定的称作“自身免疫疾病”的病理条件下，这种区别不够准确，内源性结构可能遭受免疫系统进攻。自身免疫性疾病及自身免疫症状的恶化状况的示例包括系统红斑狼疮，重症肌无力，多发性硬化及类风湿性关节炎。能结合于Fcα受体上位点的本发明的组合物，凭借其包括该受体上位点的抗体的结合决定簇，也能调节细胞表面这些受体的数目，故而是自身免疫疾病的潜在治疗试剂。进一步，抗体结合决定簇的Fv区的氨基酸残基序列数据是得到蛋白三维模型特征的基础，如大小，电荷，包括结合位点的残基的形状，从而可以设计模拟结合位点的类似物。

本发明的试剂以适于体内药用的生物相容形式给受试者用药，以产生对癌症或感染性疾病的治疗性应答。“适于体内药用的生物相容形式”意指一种蛋白给药的形式，其毒副作用被组合物的治疗效应远远超出。

本文所用术语“受试者”，指需对一种状态敏感，尤其“癌或感染性疾病”下的活的动物或人。受试者是具有能对抗原刺激和生长因子刺激产生反应的淋巴细胞的生物体。优选，受试者为哺乳动物，包括人类及非人类哺乳动物如狗，猫，猪，牛，绵羊，山羊，马，大鼠，和小鼠。更优选的方案中，受试者为人类。术语“受试者”不排除无癌症，感染性疾病的正常人。

本文所用术语“病人”，指临床有一定症状人类受试者。病人可能需要通过本领域的医疗工作人员熟知的临床方法进一步分类(或没有更进一步的疾病征兆，并在各方面正常)。病人的诊断在疾病的发展过程中可能会改变，或同时或在治疗期间，如进一步疾病症状的发展，或疾病的缓解，或再次诊断为完全正常。

术语“感染性疾病”是指由一种或多种细菌，病毒，真菌和原生动物引起的混乱，它们是产生疾病的有机体被统称为“病原体体”。术语“真菌”包括酵母。本发明例举了病原体体，但不局限于革兰氏阳性菌如革兰氏阳性菌如，粪肠球菌，肺炎嗜血菌，单核细胞增生利斯特氏菌，结核分支杆菌，麻风分支杆菌，疮疱丙酸杆菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，中间葡萄球菌，溶血链球菌，肺炎链球菌，革兰氏阴性菌如，脑膜脓毒性黄杆菌，幽门螺杆菌，肺炎嗜血菌，流感嗜血菌，肺炎克雷伯氏菌，淋病奈瑟氏球菌，铜绿假单孢菌，痢疾志贺氏菌，伤寒沙门氏菌，副伤寒沙门氏菌，大肠杆菌血清型0157，衣原体，螺杆菌属，病毒例如，HIV-1,-2,-3,HSV-Ⅰ和-Ⅱ，非甲，非乙，非丙肝炎病毒，痘病毒，狂犬病毒，和新城疫病毒；真菌如，白色念珠菌，热带假丝酵母菌，克鲁斯氏假丝酵母菌，假热带假丝酵母菌，近平滑假丝酵母菌，C.quillermondit，星型假丝酵母菌，烟曲霉，黑曲霉，构巢曲霉，黄色曲霉，土曲霉，伞枝犁头霉，分枝犁头霉，新型隐球酵母，荚膜组织胞浆菌，粗球孢菌，Pneumocystis carinii，无根根霉，米根霉，微小毛霉，和其他真菌，和原虫例如，痢疾内变形虫，大肠变形虫，蓝氏贾第鞭毛虫，艾美虫，弓形虫，Cryptosporidium parvum,C.muris,C.baileyi,C.meleagridis,C.wrairi.和C.nosarum。通过筛选蛋白和来自体内测试肽从这些生物体中获得单一表位是本领域技术熟练人员所熟知的。Ⅱ多特异分子

本发明涉及具有亲合并能结合至少两个不同实体的重组多特异分子的方案。多特异分子可包括含有Fc受体结合决定簇和靶结合决定簇的双特异分子。本发明的优选的双特异分子包括包括至少一份特异结合Fcα受体或靶的结合决定簇的分子；或含有至少一个结合Fcα受体的结合决定簇，一个靶结合决定簇合另外一个或多个识别其他分子的结合决定簇的分子。优选的多特异分子是双特异分子(BsAb)。它具有至少两个不同的结合决定簇，至少其中一个是抗体来源的。

“Fcα受体的结合决定簇”是指一个抗体，功能性抗体片段(例如，Fab片段)或配体如识别并结合效应细胞上的Fcα受体的工程化结合蛋白。本发明优选的抗体在不被内源性免疫球蛋白A结合的位点结合效应细胞(白细胞)上的Fcα受体。最优选，抗Fcα受体V_H和V_L部分结合人类FcαR。描述了优选的人源化抗FcαR单克隆抗体，其中的经验在此处的参考文献中完全结合。含有本发明BsAb或多特异分子的抗体可以是完整的，即，具有重链和轻链或其中任一片段，例如Fab或(Fab’)₂片段。抗体进一步可是重链或轻链二聚体，或其中任何小片段如Fv或Ladner等(美国专利号4.946.778 1990.8.7发布)描述的单链构建物，其内容为参考文献所参照。

此处所用“效应细胞”是指白细胞或淋巴细胞等免疫细胞。特异效应细胞表达特异的Fc受体并进行特异的免疫反应。例如，表达FcαR的单核细胞，巨嗜细胞，嗜中性细胞，嗜酸性细胞嗜碱性细胞，和淋巴细胞涉及特异杀伤靶细胞并呈递抗原给免疫系统其他元件，或结合递呈抗原的细胞。效应细胞上特异FcR的表达可被激素因子如细胞因子调节。例如，FcγRⅠ的表达已被发现被干扰素γ(IFN-γ)上调。这种增强的表达使具有FcγRⅠ细胞对靶细胞的细胞毒性增强。

特异结合Fc受体的重组抗体或抗体片段，优选“人源化”即具有人类抗体衍生的部分，并至少具有衍生自非人类的抗体的互补决定区(CDR)部分。通常选择“人源化”的部分以提供人源化抗体结合人类Fc受体的特异性。人源化抗体具有衍生自非人类抗体的CDR部分和人类来源的抗体分子的“稳定”部分。

选择插入人类抗体的非人类CDR部分足以允许人源化抗体结合Fcα受体。可通过插入CDR部分于人类抗体并用流式细胞计或酶联免疫测定法(ELISA)检测所产生人源化抗体的结合能力以选择足够的部分。

所有特异人类抗体的CDRs可被至少一个非人类的部分取代或只有部分CDRs可被非人类CDRs取代。只需按人源化抗体结合Fc受体所要求的CDRs的数目取代。

抗体可以任何方法人源化，可以至少用非人类抗体衍生的CDR取代人类抗体的CDR部分。Winter描述了可用于制备本发明人源化抗体的方法(英国专利申请GB2188638A 1987.3.26提交)。其内容为参考文献所参照。人类CDRs可如国际申请WO94/10332，题目为人类单核巨嗜细胞上的免疫球蛋白G的Fc受体人源化抗体描述的用寡核苷酸点突变的非人类CDRs取代。

除了一个抗Fcα受体部分，要求保护的多特异分子可包括靶的结合决定簇，即抗体，功能抗体片段或识别并结合病原体(例如，病毒，细菌，真菌，原生动物)，病原体感染细胞，癌或肿瘤细胞(例如乳腺，卵巢，睾丸，肺，结肠，直肠，胰腺，肝，中枢神经系统，头和颈部，肾，骨，血液和淋巴系统)或其他受试者(例如，人类或动物)中的不想要细胞的配体，或抗原或其修饰形式。另外，靶部分可含有或直接针对抗原。优选的实施方案含有可用作引起针对慢性感染，针对肿瘤或癌细胞的特异免疫反应或去除循环系统中抗原的抗原。另一优选实施方案含有连接于含有FcR结合决定簇的多特异分子的抗原，通过引导抗原至递呈抗原的细胞刺激免疫系统。

在本发明的一个实施方案中，多特异分子含有结合决定簇或和分子作用的配体。在一个优选实施方案中，结合决定簇结合蛋白，例如，靶细胞上的蛋白，如癌细胞，或感染性疾病因子细胞或因子本身或感染细胞。优选结合决定簇包括抗体，抗体片段，生长因子或分化因子的受体。例如一个多特异分子可包括上皮生长因子(EGF)，或至少能合受体相互作用的部分或形式，例如上皮生长因子受体EGF-R，或EGF-R的抗体。本发明的特殊优选实施方案包括人类EGF样受体结合决定簇的BsAb，包括EGF-R,HER2/neu,HER3,HER4，等。在另一优选实施方案中，结合决定簇实针对例如，乳腺，结肠，和卵巢上发现的肿瘤抗原TAG72的。

在本发明的另一实施方案中，配体是小肽，如铃蟾肽，胃泌素释放肽(GRP)，雨滨蛙肽，神经调节肽B，神经调节肽C。这些肽的序列可被发现于例如，美国专利号5.217.955，其内容为参考文献所参照。配体可是这些肽的修饰形式。修饰可增加对受体的结合，降低结合，或不改变对受体的结合。对配体的修饰可将激动剂转变为拮抗剂，这样配体抑制而非刺激细胞增殖。配体的修饰可以是添加，删除，取代，或至少一个氨基酸的修饰。

在本发明的另一实施方案中，多特异分子或双特异分子包含抗原。如此处所用，术语“抗原”指任何天然或合成的免疫原性物质，免疫原性物质的片段或部分，肽表位，或半抗原。在本发明的一个方案中，双或多特异分子用于定靶抗原，例如破伤风毒素于细胞以增强这些细胞的内化和呈递过程，并刺激其免疫反应。在一特殊实施方案中，双特异结合试剂特异结合抗原(直接对抗原表位，或间接对连于抗原的表位)并同时，结合可内化并加工和呈递抗原的抗原呈递细胞的表面受体。在另一方案中，抗原连于多或双特异分子并同时结合抗原呈递细胞的表面受体。在优选实施方案中抗原通过遗传或化学方法共价连于多特异分子。双或多特异分子的受体结合元件(因而双或多特异分子本身)在不同于且远离自然发生配体的位点结合抗原呈递细胞的受体。这样，多特异分子的结合不和受体的天然配体竞争即可发生。作为结果，与受体的结合不会为生理水平的配体阻止且定靶受体保持结合本发明分子和配体的能力。

一类抗原可以是变应原，“变应原”是指可以引起敏感受试者变应或哮喘反应的物质。引起相当比例的人群的敏感反应的变应原的数目是很大的，包括花粉，昆虫毒液，动物皮屑，尘螨蛋白，真菌孢子和药物(例如青霉素)。天然动物或植物变应原的例子包括以下物种特异的蛋白：

猫属(家猫)；犬属(家犬)；表皮螨属(如Dermatophagoides farinae)；大蠊属(如美洲鲱蠊)；豚草属(豚草)；毒麦属(如Lolium perenne或多花黑麦草)；柳杉属(日本柳杉)；交链孢霉属(Alterria alternata)；赤杨；赤杨属(欧洲桤木)；桦(新疆白桦)；栎属(白栎)；木樨榄属(欧橄榄)；蒿(艾蒿)；车前属(如长叶车前)；墙草属(如Parietariaoffcinalis 或Parietari judaica)；小蠊属(如德国小蠊)；蜜蜂属(如Apts multiflorum)；柏木属(如地中海柏，绿干柏和大果柏木)；桧属(如Juniperus sabinoides，铅笔柏，欧洲刺柏和Juniperusashihei)；Thuya(如thuya orientalis)；扁柏属(如日本扁柏)；冰草属(如Agropyron repens)；黑麦属(如黑麦)；小麦属(如小麦)；鸭茅属(如鸭茅)；羊茅属(如Festuca elatior)；早熟禾属(如草地早熟禾和Poa compressa)；燕麦属(如燕麦)；绒毛草属(如绒毛草)；黄花茅属(如Anthoxanthum odoratum)；燕麦草属(如燕麦草)；剪股颖属(如小糠草)；梯牧草属(如梯牧草)；Phalaris(如Phalaris arundinacea)；雀稗属(如Paspalum notatum)；高粱属(如Sorghum halepensis)；和雀麦属(如无芒雀麦)。

许多变应原被发现存在于豚草，草，或树木的空气传播花粉，或真菌，动物，屋尘，或食物。作为一类，它们相对耐受蛋白酶消化。优选那些结合浆细胞和嗜碱性细胞上的IgE的变应原，由此引起从炎症和哮喘到Ⅰ型超敏变态反应的综合征。

在另一优选实施方案中，结合决定簇对感染疾病因子或感染细胞上的抗原特异，如上文所定义。结合决定簇可从通过用病原体片段或组分，例如，病原体的细胞壁组分，注射兔或其他合适动物产生的单克隆抗体获得。IgG可从免疫动物的血清中纯化。制备F(ab’)₂并作为靶结合决定簇的来源。例如，可以获得通过用白色念珠菌片段制剂免疫兔制备的多克隆抗体，并用作制备抗-白色念珠菌IgGF(ab’)₂它可通过此处描述的化学方法偶连一FcαRⅠ结合决定簇。

某些情况下，可以期望偶合一些其自身的弱抗原性或无抗原性的物质(如半抗原)于载体分子，如大的免疫原蛋白(例如，细菌毒素)用于给药。此时，双特异结合试剂可结合于物质偶合的载体的表位，而非物质本身的表位。

可以直接，或间接，连于本发明的双或多特异分子的抗原可以是可溶或颗粒；可带有B细胞表位，T细胞表位或两者。抗原可以是细菌，真菌，病毒或寄生虫起源的。经常，抗原含有病原体微生物的表面结构元件，或病原体微生物感染的细胞表面结构。例如，抗原可含有病毒表面结构如人类免疫缺陷病毒(HIV)的外壳糖蛋白或肝炎病毒的表面抗原。另外，抗原可以合疾病细胞相关，如肿瘤细胞，针对它可出生一种免疫反应以治疗此疾病。抗原可包括肿瘤特异或肿瘤相关抗原，如人类乳腺癌合卵巢癌细胞表达的HER2/neu原癌基因产物(Slamon等(1989)科学244:707)。另一重要的含有本发明BsAb靶点的癌抗原是TAG72，它已在90％的结肠癌，85％乳腺肿瘤，95％卵巢肿瘤中发现(Johnson等癌症研究46:850-897；Bodmer.M等，欧洲特殊专利0348442B1；Mezes.P等国际申请WO93/12231)。

受试者的细胞可体内或来自体内暴露于本发明的多特异分子，以定靶抗原于抗原呈递细胞。免疫细胞从受试者血液肿分离病纯化，暴露于含有抗原的多特异分子，或细胞可暴露于合含有抗原结合决定簇的多特异分子在一起的抗原。刺激后，细胞返回受试者。此程序所用细胞可以用细胞因子或其他因子处理，为了，例如上调每细胞的受体数目。进一步，分子的体内或来自体内治疗作用可通过用一个或多个细胞因子或生长因子处理受试者得以增强。

本发明的方法可用于增强或加强对抗原的免疫反应。例如，该方法对处理慢性感染，如肝炎或AIDS，其中独立的免疫系统无法克服感染，是有用的。它也可用于治疗感染的急性期，此时针对入侵微生物的免疫反应需要增强。

该方法可用于减少获得保护性或治疗性免疫反应或宿主对抗原不再反应或反应较小时所需抗原量。尽管普遍期望，当抗原对宿主有毒如变态反应时，有效量的降低可被特别期望。方法和含有一个或多个抗原或含有一个或多个结合决定簇，例如抗体相互作用于抗原，的双或多特异分子在公开PCT申请PCT/US91/07283中进一步描述。Ⅲ制备多特异分子的方法

上述多特异分子可通过若干方法制备。例如，两种特异性可在同一载体中编码并在同一宿主细胞中表达和装配。当多特异分子是mAbxmAb,mAbxFab,FabxF(ab’)₂或配体xFab融合蛋白时此方法特别有用。本发明的双特异分子也可以是单链双特异分子，如单链双特异抗体，含有一个单链抗体和一个结合决定簇的单链双特异分子，或含有两个结合决定簇的双特异分子。多特异分子也可以是单链分子或包含至少两个单链分子。制备双或多价抗体的方法在例如美国专利号5.260.203；美国专利号5.455.030；美国专利号4.881.175；美国专利号5.132.405；美国专利号5.091.513；美国专利号5.476.786；美国专利号5.013.653；美国专利号5.258.498；美国专利号5.482.858中描述。

单链分子结合于其特异靶可通过本领域技术熟练人员熟知的双特异ELISA证实。或者，多特异分子的每一特异性可被分别产生且所得蛋白或多肽彼此化学缀合。例如，两个人源化的抗体或抗体片段通过下面实施例中描述的两条重链C末端绞链区通过巯基键缀合。

本发明BsAbs可通过用以下实施例中描述或本领域熟知的方法缀合抗FcR和抗靶部分制备。例如，不同的偶合或交联试剂可用于共价缀合。交联试剂的例子包括蛋白A，碳二亚胺，N-琥珀酰亚胺-S-乙酰-硫代硫酸酯(SATA),N-琥珀酰-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)，和sulfo-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(磺基SMCC)(参见例如Karpovsky等1984实验医学杂志160:1686；Liu.MA等1985美国国家科学院院刊82:8648)。其他方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt 1985 78.118-132)；Brennan等(科学1985 229:81-83)，和Glennie等(免疫学杂志1987 139:2367-2375)描述的方法。其他交联试剂的例子包括ortho-phylenedimaleimide(o-PDM)，蛋白A，碳二亚胺。在BsAb的优选实施方案中缀合试剂是o-PDM。其他优选缀合试剂是SATA和sulfo-SMCC，可从Pierce Chemical Co.(Rockford.IL)获得。

基于其结合含有FcαR细胞合特异靶细胞的能力，多特异分子的特殊实施方案可对受试者给药以治疗或避免不同疾病或情况的复发，包括：肿瘤(例如乳腺，卵巢，睾丸，肺，结肠，直肠，胰腺，肝，中枢神经系统，头和颈部，肾，骨，血液和淋巴系统)，病原体感染如病毒(如HIV,HTLV和FELV)，原核生物(如鼠弓形虫)，真菌(如白色念珠菌)；和细菌(如金葡菌，溶血性链球菌，结核分支杆菌)。本发明的另一方面提供用于针对疾病或肿瘤的疫苗的分子，通过包含来自病原体微生物，感染细胞，疾病微生物或肿瘤细胞的基因产物的抗原。为这些目的，本发明提供了连接有用的可操作抗原至引导抗原至免疫系统的结合决定簇的多特异分子组合物。此处提供的一个实施例描述了将破伤风毒素定靶于单核细胞上FcαR的分子，导致在比游离破伤风毒素所需较少的剂量下刺激T细胞。

为用于治疗目的，有效量的合适的多特异分子可通过任何允许该分子达到其治疗效果的方式给以受试者。优选给药路线包括口服，经皮(例如通过膏药)，注射(皮下，静脉内，胃肠道外，腹膜内，气管内等)。注射可以是快速浓注的或持续的。

进一步，组织的细胞，例如，血液，可从病人移去，分级分离并若合适培养以增加细胞数，来自体内用药用可接受载体中的多特异多价组合物处理，并返回病人进行治疗。在来自体内培养和扩增时，选择特殊的细胞类型，例如，单核细胞群。进一步，来自体内培养细胞在来自体内培养的不同点处理和扩增，用试剂修饰某一功能FcαR分子。试剂包括但并不局限于，生长因子，细胞因子，淋巴因子如IFN-γ,G-CSF,TNF，和GM-CSF，和白细胞介素如IL-2,IL-10,IL-12。

多特异分子和药用可接受载体结合给药。如此处所用，术语“药用可接受载体”试图包括可和多特异分子共同给药并允许该分子行使其预计功能的物质。这样的载体的例子包括溶液，溶剂，分散介质，延迟剂，乳剂等此类。这些介质对药用活性物质的作用是本领域熟知的，并在下面谈论。任何其他合适的适合于该分子应用的载体也包括在本发明的范围内。进一步，用多特异多价结合分子治疗可和其他类似分子，或传统化疗药物如顺铂，AZT,DDI，阿霉素，四环素，cefachlor，制霉菌素，和acyclovir共同组成治疗方案。

重组文库可被筛选以获得具有预期结合活性的文库成员，并通过已描述的方法(参见，例如Gordon等J.Med.Chem.op.cit.)分辨其活性种类。这包括用合适的“受体”亲合层析来分离受体的配体，接着用合适技术鉴定分离的配体(例如质谱和NMR)。优选，可溶性受体连于一可被检测到指示配体结合的标记物(例如荧光剂，分光光度酶，放射性标记，发光化合物)。或者，固定化合物可被释放并通过膜扩散以作用于受体。

化合物重组文库可连接“标签”合成以编码文库每一成员的不同(参见W.C.Still等国际申请WO94/08051)。一般的说，此方法特点是应用插入稳定可测的标签，连于固相支持物式化合物。当检测到活性化合物时该化合物的不同通过单一伴随标签的识别来确定。此标签方法允许含有在文库所有化合物总处于非常低水平的可识别化合物的大文库的合成。

具有对靶高亲合力的特异结合蛋白可根据本领域已知的方法制得。例如，结合特异DNA序列的蛋白可以设计，且结合不同靶，特别是蛋白靶(Ladner.R.C等美国专利5.233.409；Ladner.R.C等美国专利5.403.484)的蛋白可被设计并用作本发明的FcαR结合决定簇和靶结合决定簇，等。进一步，这些文库的方法可用于筛选以获得模拟抗体结构决定簇。

特别的，特异抗体分子的FV结合表面和其靶配体根据蛋白相互作用的原则相互作用，因此V_H和V_L(后者可以是κ或λ链型)的序列数据是本领域技术熟练人员熟知的蛋白设计技术的基础。含有结合决定簇的蛋白表面的细节可从抗体序列信息获得，通过利用其他抗体用NMR研究获晶体图数据已测定的三维结构的模拟程序获得。例子参见Bajorath.J合S.Sheriff1996蛋白结构功能和遗传24(2)152-157；Webster.D.M和A.R.Rees1995“抗体结合位点分子模型”S.Paul.编分子生物学方法 51，抗体工程原理HumanaPress.Totowa.NJ.17-49；合Johnson.G,Wu.T.T.和E.A.Kabat1995“Sequnt：筛选匹配核酸和蛋白序列的程序”分子生物学方法51,op,cit1-15。

乳腺和卵巢癌是性激素依赖肿瘤。乳腺癌的特点是不正常表达受体，例如人类EGF样受体家族(HER)，例如HER-2,-3，和-4。本发明不局限于这些HER抗原方案。天然HER配体，Heregulin，可插入双特异分子(BsAb)或多特异分子，作为定靶于肿瘤中表达一个或多个HER受体的乳腺癌细胞方法。进一步，heregulin分子是含有，例如HER-2,-3或-4单体结合，异二聚HER受体的结合决定簇。

性激素依赖的肿瘤的另外的例子包括前列腺癌(Smith.P(1995)肿瘤概况23：防止前列腺癌。Imper Cancer Reseaech Fund)和睾丸癌。激素依赖型肿瘤的生长被雄性激素促进(例如，雄激素如睾丸酮合二氢睾丸酮)。去除睾丸(去势)是多年来阻止性腺雄性激素分泌的标准方法，以减慢肿瘤的生长。目前，雄性激素的分泌可通过化学方法抑制通过干扰黄体激素(LH)的产生，它调节雄性激素的合成。类似的考虑可用于其他性激素依赖的肿瘤，如乳腺癌和卵巢癌，这样有这些疾病和有这些疾病人群倾向的人，不必给性激素作为治疗和替代。本发明的多特异分子可含有性激素的结合决定簇，以减少其浓度并抑制肿瘤生长。

在优选实施方案中，本发明的方法包括给药，例如对肿瘤病人，含有至少一个对肿瘤标记和欲治疗肿瘤的肿瘤特异蛋白，例如，脑癌的nestin蛋白，有亲合力的结合决定簇的多特异多价结合分子制剂。nestin蛋白，在正常哺乳动物胚胎发育过程中表达，也在中枢神经系统肿瘤表达(McKay D.G.Ronald美国专利号5.338.839.8/16/94)。它也在皮肤的黑色素瘤和转移(V.A.Florenes,R.Holm,0.Myklebost,U.Lendahl,O.Fodstad肿瘤研究54:354-6,1994)至其他器官上的黑色素瘤中表达并难于检测和处理。用本发明的分子治疗脑肿瘤的优选的位点是直接给入中枢神经系统和间接，通过脊髓注射或细针入脑。对于转移肿瘤，优选给药途径是直接注射入循环系统，或通过此处描述的来自体内血液方法。

本发明的方法扩及其他肿瘤类型，但不局限于此。Wilm’s瘤(A.J.Buckler等美国专利号5.350.840)一种儿童肾肿瘤，由于病人的单拷贝，正常为双拷贝体细胞基因发生突变所致。wilm’s瘤95％的病例可被外科治愈，一个双特异和多特异多价结合蛋白设想适合于作为外科病人的附属治疗方法。其他肿瘤相关蛋白的例子，其中本发明的组合物的物质和方法都合适，包括那些和胃肠道肿瘤相关的(R.Fishel等国际申请WO95/14085,05/26/95)，那些化疗过程中多种药物耐受的(J.M.Croop等美国专利号5.198.344)，和大量本领域技术熟练人员熟知的原癌基因如Rb,ras，和c-myc，本领域技术熟练人员可获得并分析其序列。本发明的组合物是，例如，适合于抑制分泌酶如基质金属蛋白酶，被认为可加强肿瘤转移(Liotta.L.A等1991细胞64:327-336)。在后面的实施方案中，具有一个针对基质金属蛋白酶和的结合决定簇和一个对FcαR的多特异结合分子将有助于从原位活性抑制和清除这些酶。若和标准外科和化疗方案联合使用，可期望组合物减少肿瘤复发并提高长期存活率。Ⅳ．药物组合物

本发明的化合物可被插入适于体内给受试者用药的药物组合物中。优选方案中，药物组合物包括本发明的多特异性分子之一(化合物或试剂)及可药用的载体。本发明的另一方案中，药物组合物可以组合治疗的方法给药，即与其它试剂组合。例如，组合治疗包括本发明的一种组合物及至少一种抗癌试剂，至少一种抗炎药，至少一种细胞因子，至少一种疫苗，或其它传统治疗。作为示例的抗癌药包括顺铂，阿霉素和紫杉醇。作为示例的抗炎药包括异烟阱，利福霉素，和四环素。作为示例的细胞因子包括G-CSF,GM-CSF，白细胞介素和干扰素。

本文所用“可药用载体”包括任何溶剂，分散介质，包衣剂，抗菌和抗真菌试剂，等渗和缓释试剂，及其它生理相容物。优选，载体适于静脉内，肌内，皮下，胃肠外，脊柱或表皮给药(如通过注射或扩散)。根据给药途径，可将活性化合物包被于一材料中，使其免于酸或其它自然条件使其失活，或使其控释。

“可药用盐”保留母体化合物的期望生物活性，不产生任何不期望毒性作用的盐(参见Berge,S.M.等(1977)药学杂志66:1-19)。这些盐的示例包括酸加盐及碱加盐。酸加盐包括由无毒的无机酸，如盐酸，硝酸，亚磷酸，硫酸，氢溴酸，氢碘酸，磷酸等，及无毒的有机酸如脂肪族一元或二元酸，苯取代的烷基酸，羟烷基酸，芳香酸，脂肪族和芳香族磺酸等得到的盐。碱加盐包括从碱土金属，如钠，钾，镁，钙，等及无毒有机胺，如N,N’-二苯基乙二胺，N-甲基葡糖胺，氯普鲁卡因，胆碱，二乙醇胺，乙二胺，普鲁卡因等得到的盐。

本发明的组合物可通过许多本领域已知方法给药。正如本领域技术人员所知，根据期望的结果不同，给药途径和方式不同。可将活性化合物和保护其不迅速释放的载体一同制备，如控释制剂，包括移植片，透皮及微囊给药系统。可用生物可降解的，生物相容的聚合物，如乙酸乙基乙烯酯，聚酸酐，聚甘油酸，胶原，聚原酸酯和聚乙酸。许多制备这样制剂的方法均有专利或为本领域技术熟练人员熟知。参见如持续和控释给药系统，J.R.robinson，编著，Marcel Dekker Inc，纽约，1978。

通过适当的途径将本发明的化合物给药，可能需要另一防止其失活材料将化合物包衣，或将其同时给予。例如，化合物可在一合适载体中给药于受试者，如脂质体或稀释剂。可药用的稀释剂包括盐和水性缓冲液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂及传统的脂质体(Strejan等(1984)神经免疫学，7:27)。可药用载体包括无菌水溶液或分散物，及用于临时无菌的注射用溶液或分散剂制备的无菌粉末。本领域熟知将这些介质和试剂用于药物活性物质。除传统的介质和试剂与活性化合物不相容，考虑将其用于本发明的药物组合物中。其它活性化合物亦可加入组合物中。

治疗用的组合物通常必须为无菌的，并在制备和储存条件下稳定。组合物可制成溶液，微滴乳状剂，脂质体或其它适于高药物浓度的规则结构制剂。载体可为含如，水，醇，聚醇，(如，甘油，丙二醇及液体聚乙二醇等)及其适当混合物的溶剂或分散介质。通过使用包衣剂如卵磷脂，在分散剂时保持所要求的粒度和使用表面活性剂可保持适当的流动性。大多数情况下，优选组合物中包含等渗试剂，如糖，聚醇，如甘露糖醇，山梨糖醇或氯化钠。通过使组合物中包含延缓吸收的试剂，如硬脂酸单酯盐，可延长可注射用组合物的吸收。

无菌的注射试剂可将要求量的活性化合物与一种或多种以上列举的成分按要求加入适当的溶剂中，然后除菌微滤而制得。通常，分散剂通过将活性组分加入含基本分散介质和其它要求的上列成分的无菌载体中制备。在用无菌粉末制备无菌注射剂时，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冷冻干燥)，从而由其事先无菌过滤的溶液产生活性成分和其它辅剂的粉末。

调节给药剂量(dosage regimen)产生最佳期望效应(如治疗应答)。例如，可仅一次快速浓注给药，一段时间内多次给药或根据治疗情况的紧急程度有比例地增减量。对于胃肠道给药，按剂量给药，做成统一剂量形式便于给药是很优越的。本文所用统一剂量形式指为待治疗受试者制备的作为单位剂量的物理学上不连续的单位，每一单位含有预先计算好能产生期望治疗效应量的活性化合物和所需药用载体。本发明所特用的剂量单位均列出，并直接依赖于(a)活性化合物的特性及期望的治疗效应，(b)混合领域所固有的局限性如用于个体的治疗敏感性的化合物。

可药用的抗氧化剂的示例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸，盐酸半胱氨酸，二硫酸钠，连二亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如软脂酸抗坏血酸盐，丁基化羟茴香醚(BHA)，丁基化羟甲苯(BHT)，卵磷脂，培酸丙酯，α-生育酚等；(3)金属螯合剂，如枸掾酸，四乙酸乙二胺(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸，等。

本发明的治疗用组合物包括适于口服，鼻，局部(包括颊，舌下腺)，直肠，阴道和/或胃肠道给药的制剂。制剂可方便地做成剂量形式，由药学领域熟知方法制备。能与载体材料混合以产生一个剂量的活性成分的量决定于将治疗的受试者，及给药形式。能与载体材料混合以产生一个剂量的活性成分的量通常为产生治疗效应的组合物的量。通常，活性成分的量从0.01％-99％，优选0.1％-70％，更优选1％-30％。

透皮贴剂具有向机体控释提供本发明治疗化合物的优越性。这种剂量形式可通过将组合物溶或分散于适当的介质中制备。也可用促吸收剂增强组合物穿透皮肤。穿透速率可由速率控制膜或将组合物分散于聚合物载体或胶中得以控制。通过离子电渗法或其它电助方法透皮释放组合物的装置，包括贴剂，均可用于本发明，包括，如美国专利4,708,716及5,372,579中所描述的装置。

本文所用短语“胃肠道外给药”指肠和局部以外的给药方式，通常通过注射，并包括，但不局限于，静脉内，肌内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下，脊柱内，硬膜外，乳腺骨内注射和扩散。

可用于本发明药物组合物的合适的水性和非水载体的示例包括水，醇，聚醇(如，甘油，丙二醇及液体聚乙二醇等)，及其适当混合物，植物油，如橄榄油及可注射有机酯，如油酸乙酯。可通过使用包衣剂如卵磷脂，在分散剂时保持所要求的粒度和使用表面活性剂来保持适当的流动性。

这些组合物还可含附加剂如防腐剂，加湿剂，乳化剂及分散剂。可通过上述灭菌加入各种抗菌和抗真菌试剂如，paraben，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸等来去除微生物。组合物中亦可包含一些等渗试剂，如糖，氯化钠等。另外，延缓形式的试剂如硬脂酸铝，明蚀的存在可使可注射药物剂型的吸收延长。

本发明的化合物作为药物给予动物或人类时，它们可单独给药或作为含，如，0.01-99.5％(更优选0.1-90％)的活性成分与可药用载体的药物组合物给药。

不考虑选择的给药途径，可用作适当的水化形式和/或本发明组合物的本发明的化合物，可通过本领域技术熟练人员熟知的传统方法制成可药用的制剂形式。

领域内具有普通知识的医生或兽医很容易决定并给出所需药物组合物的有效剂量。例如，医生或兽医可首先给用于药物组合物中的本发明的化合物以低于能产生期望治疗效果所需量的水平，然后逐渐增加剂量直至获得期望效果。通常，本发明组合物合适的每日剂量为产生治疗效应的最低有效量。这一有效剂量取决于上述因素。优选皮内，肌内，腹膜内，或皮下给药，更优选在靶位点附近给药。如果需要，治疗组合物的有效每日剂量可在一天内适当的间隔分2,3,4,5,6或更多次独立给药，或以单位剂量形式。尽管本发明的化合物可能单独给药，优选其作为药物制剂(组合物)给药。

治疗组合物可以本领域熟知的医疗器械给药。例如，在一优选方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射器给药，如美国专利，5,399,163,5,383,851,5,312,335,5,064,413,4,941,880,4,790,824，或4,596,556所述器械。本发明可用的熟知的植入片及组件的示例包括：美国专利4,487,603，它描述了以控速分散药物的可植入的微-扩散泵；美国专利号4,486,194，它描述了通过皮肤给药的一种治疗器械；美国专利号4,447,233，描述了以精确的速度给药的一种扩散泵；美国专利号4,447,224，描述了持续给药的可植入的扩散器械；美国专利号4,439,196，它描述了具有多隔室的渗透给药系统；美国专利号4,475,196，描述了渗透给药系统。这些专利以参考文献插入本文。其它的植入片，给药系统，及组件均为本领域技术熟练人员所熟知。

在某些方案中，本发明的化合物可做成合适的制剂以保证体内适当的分布。例如，许多高亲水性化合物不能穿过血脑屏障(BBB)。为保证本发明的治疗化合物穿过BBB(若期望)，它们可做成，例如，脂质体中的制剂。制备脂质体的方法，参见，美国专利号，4,522,811；5,374,548；及5,399,331。脂质体可包括一种或多种选择性运输入特异细胞或器官的部分，因而增强了靶向给药(参见，如，Ranade(1989)临床药物杂志29:685)。作为示例的定靶部分包括叶酸盐和生物素(参见，美国专利号5,416,016,Low等)；甘露糖(Umezawa等，1988，生物化学生物物理研究快报，153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS快报357:140；M.Owais等(1995)抗微生物试剂化疗39:180)；表面蛋白A受体(Briscoe等，(1995)美国物理学杂志1233:134)，不同的含本发明制剂的种类，及所发明分子的成分；pl20(Schreier等(1994)生物化学杂志，269:9090)；还可参见K.keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS快报346:123；J.J.Killion；I.J.Filder(1994)免疫学方法4:273。本发明的一个方案中，本发明的治疗化合物制成脂质体中的制剂；在更优选的方案中，脂质体中的治疗化合物一次注射至肿瘤或感染邻近位点。组合物必须为能很容易成为注射器样的流体存在。在制备和储存条件下，其必须很稳定，并保存于无微生物如细菌和真菌污染的环境中。

“治疗有效剂量”优选与未治疗受试者相比，至少20％，更优选至少40％，更优选至少约60％，更优选至少约80％抑制肿瘤生长或病原体感染。化合物抑制治疗和感染疾病的能力可在能预测人类肿瘤和感染性疾病效能的动物模型中评价。另外，组合物的这一性质亦可用检测化合物的抑制能力来评价，这种来自体内抑制试验为本领域技术熟练人员熟知。治疗有效量的治疗化合物可减小肿瘤的尺寸，抑制或延缓感染组织或器官的死亡，降低发热，而细胞计数，增加受试者的CD4计数或改善症状。本领域的常规技术能够检测基于受试者大小，受试者症状严重程度，及所选特殊组合物的给药途径等因素的数量。

本发明进一步以以下实施例论述，但不局限于它们。本发明所引所有文献，公开的专利申请，及发表的专利均在此以文献形式表示。

实施例

在材料和方法章节中描述的以下方法用于下述实施例，见下。材料和方法细胞株和单克隆抗体

用于构建此处描述的产生抗FcαR抗体的BsAb组合物的鼠杂交瘤细胞株为A77(Monteiro等1992，免疫学杂志148:1764-1770)，和其它具有和A77相同或相似的特点的抗FcαRⅠ杂交瘤细胞株，如A3,A59和A62((Monteiro等1992)也可用。用于构建抗HER/neu抗体的杂交瘤细胞株是520C9(Frankel.A等1985 J.Biol.ResponseModifiers 4:273-286；可从American Type CultureCollection,ATCC 12301 Parklawn Drive.Rockville.MD 20852；号码HB8696获得)。抗体H425是一种人源化抗EGF-R抗体(Kettlesborough C.等1991 Port.Eng.4:773-783)。CC49(抗TAG72)杂交瘤可从ATCC(号码HB9459)获得。mAb-产生细胞株在Iscove’sModefied Dulbecco’s Medium(IMDM,Gibco/BRL Grand Islang.NY)培养基加10％胎牛血清(FBS)中培养。mAb制剂从各自杂交瘤上清中通过蛋白A亲和层析纯化(Bio-Rad Richmond.CA).

SKBR-3(Beckman等癌症研究54:2456-2461)，一种人类乳腺癌细胞株，和SKOV-3(卵巢肿瘤)，过表达HER2/neu原癌基因，从ATCC获得。EGF-R过表达细胞株A341(皮肤癌)，HN5(头颈肿瘤)和MDA-MA-468(乳腺癌)，从ATCC获得。肿瘤细胞株在Iscove’s ModefiedDulbecco’s Medium(IMDM,Gibco/BRL Grand Islang.NY)培养基加10％胎牛血清(FBS)中培养。表达FcαR的单核细胞样细胞株U937(免疫学杂志136:1641-1647,1986)从ATCC获得并在RPMI-1640加10％FBS(Gibco/BRL Grand Islang.NY)中生长。

白色念珠菌(菌株ATCC 448.585)在Sabouraud MaltoseBroth(Difco,Detroit,MI)中生长。

血细胞制备

白细胞从正常人类志愿者的肝素化的全静脉血或从成分血制备。全血用含5％右旋糖苷的RPMI以2.5∶1的比例稀释(v/v)。红细胞在冰上沉淀45分钟，然后上清中的细胞转移到一新试管中离心沉淀。残余红细胞用高渗裂解去除。剩下的淋巴细胞，单核细胞和嗜中性细胞置于冰上直至结合试验使用。对某些试验，嗜中性细胞通过FicollHypaque(Pharmacia-Upjohn,Piscataway.NJ)梯度和单核细胞分离。单核细胞通过冷凝聚并通过胎牛血清垫子沉降来从单个核细胞中富集。单核细胞培养物新鲜利用或培养于37℃,5％CO₂24-48小时以4×10⁶细胞/ml在teflon培养皿中含2.0％正常人血清型AB(Sigma,St.Louis,MO)和500IRU/mlIFN-γ(R&DSystem,Minneapolis,MN)的MSFM中。嗜中性细胞在含50ng/mlG-CSF(KindlyR.Repp,U.of Erlanger，德国提供)和500IRU/mlIFN-γ的AIMV培养基(Gibco/BRL Grand Islang.NY)中培养24-48小时(37℃,5％CO₂)。

流式细胞法结合

BsAb结合于FcαR和HER/neu通过流式细胞法测定。不同浓度的BsAb稀释于PBS,pH7.4含2mg/mlBSA和0.05％NaN₃(PBA)，和SKBR-3细胞或人类白细胞早0℃孵育一小时。用PBS洗细胞并用1％原甲醇固定，细胞相关荧光在Becton Dickinson(Mountain Veiw.CA)FACScan上分析。

为测定IgA结合是否干扰mAbA77结合，A77和TNF处理细胞在过量人类IgA存在下孵育，并和无IgA孵育对照比较。用上述藻红素标记的羊抗鼠抗体检测A77结合。洗细胞并用1％原甲醇固定，细胞相关荧光在Becton Dickinson FACScan上分析。另外，在A77mAb存在下测定人类IgA结合于U937细胞，和无过量A77mAb对照比较。用FITC标记的抗人类IgA抗体检测IgA结合。

BsAb偶联程序

BsAb制剂用Glennie等的方法构建(免疫学杂志1987 139:2367-2375)。mAbsA77(抗FcαR),520C9(抗HER/neu),CC49(抗TAG72)和H425(抗EGF-R)抗体通过来自体内培养各自的杂交瘤细胞株制得。抗体制剂分别用胰酶消化产生F(ab’)₂制剂，通过加入10mM巯基乙醇胺(MEA)并在30℃孵育30分钟还原为Fab’.Fab’片段用于SephadexG-25(Pharmacia-Upjohn Piscataway .NJ)用 50mMNaAc,0.5mMEDTA,pH5.3(4℃)平衡的柱。溶于二甲基酰胺并在甲醇/冰浴中冷却一半体积的ortho-phenylenedimaleimide(o-PDM,12mM)加入520C9Fab’，混合物在30℃孵育30分钟，Fab’-马来酰亚胺从游离o-PDM中，在50mM NaAc,0.5mMEDTA,pH5.3(4℃)平衡SphadexG-25上分离。

为制备BsAb,520C9 Fab’-马来酰亚胺加入A77Fab’的等摩尔溶液。反应物用Diaflo膜在Amicon(Lexington.MA)容器中在氮条件下浓缩至起始体积，4℃18小时。用1MTris-HCl,pH8.0调节pH值至8.0，混合物用10mMMEA还原(30分钟，30℃)并用25mM碘乙酰胺烷基化。A77XCC49和A77XH425用类似程序产生。双特异F(ab’)反应物制剂用PBS平衡的Superdex200柱(Pharmacia-Upjohn,Piscataway.NJ)从未反应的Fab’和其它材料分离

A77X520C的HPLC分析表明该BsAb含有两个主要种类；75-85％F(ab’)₂异二聚体(100kDa,10.43mins)和15-25％F(ab’)₃异三聚体(150kDa,9.86mins)(图0)。基于分离方法，F(ab’)₃异三聚体预期含有两个520C9F(ab’)和一个A77F(ab’)。对照试验，其中F(ab’)-o-PDM衍生物和未衍生的第二F(ab’)孵育，确定F(ab’)-o-PDM衍生物不和自身交联，由于所有的铰链-SH基团被O-PDM占据且没有游离-SH基团用于交联(数据未显示)。这样BsAb制剂中F(ab’)₂和F(ab’)₃是有两个不同特性的F(ab’)片段异复合体。

抗体依赖细胞的细胞毒作用(ADCC)

有HER2/neu过表达的人类乳腺癌细胞SKBR-3，用作测定用含有HER2/neu结合决定簇的多特异组合物的裂解作用的靶细胞。其它靶细胞用作试验不同抗原结合决定簇分子，例如，A431细胞对EGF-R,KLEB对TAG72，等。用肝素化全血获得效应细胞样品，纯化嗜中性细胞(如前描述)，或按照前述(Guyre.P.M.等1989免疫学杂志193:1650)从获得自Advanced Biotechnologies Inc(Columbia,MD)的Leukopaks制备单核细胞。为制备利用效应细胞，单核细胞在含2％人类血清的Macrophage Serum-Free MediuM(Gibio/BRL)中Teflon容器中培养24-48小时。靶细胞在U底微滴定管盘中和效应细胞及抗体结合前用100μCi⁵¹Cr标记1小时。37℃孵育16-18小时后，收集每孔上清分析放射性。细胞毒作用通过以下公式计算：％裂解=(实验CPM-靶渗漏CPM/除垢裂解CPM-靶渗漏CPM)×100％。进一步特异裂解-％有抗体裂解-％无抗体裂解。试验进行三次。

抗体的荧光素化

通过加入0.1MNa₂CO₃调节mAb溶液的pH值至9.3。异硫氰酸荧光素(FITC,Sigma.St.Louis.MO)以2mg/ml浓度溶于DMSO。每毫克mAb加入40μgFITC并在室温孵育2小时。通过G-25层析从游离FITC中分离荧光素化的mAb。

mAb A77对FcαR的调节

mAb A77调节人类单核细胞表面的FcαR数目的能力通过和不同稀释度的nAb A77在37℃孵育18小时测定(或用nAb520C9作同种型对照)。单核细胞用PBA洗，并在100μg/ml人类血清IgA存在下0℃孵育1小时。细胞进一步用PBA洗，IgA结合于FαR用FITC标记的抗人IgA抗体检测。调节百分比=1-(样品MFI/对照MFI)×100％，其中MFI是平均荧光强度。

BsAb介导的细胞吞噬作用

单核细胞或嗜中性细胞介导的SKBR-3细胞吞噬作用用嗜脂红荧光素染料PKH26标记的SKBR-3靶细胞进行。从含有单核细胞，嗜中性细胞，和淋巴细胞的肝素化全血中纯化得到的暗红色包被细胞和标记靶细胞在BsAb存在下37℃孵育6小时。单核细胞和嗜中性细胞用FITC标记的抗CD-14mAb(AML-2-23)在0℃染色，洗细胞并用FACScan在两色荧光下分析。吞噬百分比表示为带有PKH26染料的效应细胞(单核细胞或嗜中性细胞)的百分比。实施例1 双特异抗体A77X520C9结合效应细胞

为测定病人致死乳腺癌细胞中双特异抗体BsAb A77X520C9的效能，测定了培养基中特异结合乳腺癌细胞的能力。过度表达HER2/neu原癌基因的SKBR-3细胞株用于这些试验。520C9结合决定簇由抗HER-2/neu鼠杂交瘤获得(Frankel,A.等1985，生物应答修饰物4:273-286)。

图2显示了BsAb A77X520C9结合于两种效应细胞，嗜中性细胞(PMNs)和单核细胞中的每一种。图3显示了全血中，A77X520C9 BsAb与表达FcαR1的PMN和单核细胞结合，而不结合FcαR阴性的淋巴细胞。该结合活性不被全血中生理水平的足以饱和体内表达的所有FcαR1的IgA抑制。实施例2 双特异抗体A77X520C9结合靶乳腺癌细胞

BsAb A77X520C9与来自乳腺癌的靶乳腺癌细胞SKBR-3结合(图4)至与前述BsAb MBX210相同的程度(Valone等1995，临床肿瘤学杂志13(9):2281-2292)。当乳腺癌细胞与0.1,1.0,10μg/mlBsAb孵育时，作为结合测定的平均荧光密度被发现随BsAb的浓度增加。结合乳腺癌靶细胞的BsAb A77X520C9部分与对照的BsAb MBX210部分相当或比之大(图4)，与效应细胞的结合(图2)作为每种BsAb浓度的函数类似。

进一步显示BsAb A77X520C9结合于HER2/neu阳性的SKBR-3细胞的数据在图5中。正如所料，仅BsAb和520C9F(ab’)₂结合于靶乳腺癌细胞，而对照的A77F(ab’)₂不结合。图7-12中显示了一系列不同的效应细胞，与几种不同的双特异抗体制剂，和不同BsAd制剂的不同浓度的数据。实施例3 双特异抗体A77XH425结合靶皮肤癌细胞

单克隆抗体H425对来自皮肤癌(A431)和MDA-MB468(乳腺癌)的细胞株中过度表达的EGF受体(EGF-R)特异。具有对EGF-R和FcαRⅠ结合决定簇的双特异分子A77XH425，可以与A77X520C9相同的化学偶联方法制备，通过此处所描述的方法测定其与靶细胞的结合。

与实施例2和图2-5所示A77X520C9与含HER2/neu的靶细胞的结合类似，图6显示了

BsAb A77XH425的EGF-R肿瘤特异性使该分子与过度表达EGF-R的A431肿瘤细胞结合。而且，含FcαR1决定簇的肿瘤结合决定簇H425F(ab’)₂，而非A77F(ab’)₂，与过度表达EGF-R的A431靶细胞结合。实施例4 双特异抗体A77X520C9的结合介导的效应白细胞溶胞含HER2/neu靶细胞

测定了A77X520C9结合乳腺癌细胞的能力后，还测定了因其具有与靶细胞特异白细胞结合的能力而导致的乳腺癌细胞胞解的影响。因此，图7-16显示了本发明的双特异性抗体(BsAb：亦称作双特异分子：BSM)介导的抗体依赖的细胞胞解(ADCC)的细胞毒百分比及胞解百分比。

如图7所示，A77X520C9和嗜中性效应细胞(PMN)介导的SKBR-3细胞毒性在0.1μg/ml时为6％-9％，在1.0μg/ml时增加至20％-30％。图8中显示了全血中效应细胞杀死介导的类似数据。图9中显示了BsAb介导的细胞毒性被FcαR1结合的A77F(ab’)₂抑制，但不被M22F(ab’)₂的Fcγ决定簇所抑制。

以直接给药入循环的多特异多价化学组合物治疗受试者要求这些试剂在全血中发挥作用。在全血中发挥作用的能力，即，介导细胞胞解，在图8中显示，其中发现A77X520C9制剂能通过血液效应细胞介导培养的乳腺癌细胞的胞解。0.1μg/ml时，A77X520C9使肿瘤细胞胞解15％-20％，在1.0μg/ml时乳腺癌细胞的胞解约25％-30％由于全血中含IgA的浓度在2-5mg/ml，这些数据亦表明BsAb的细胞毒性不为IgA所抑制。这些结果表明BsAb可在体内用于治疗。

BsAb介导的表达FcαR1细胞毒性效应细胞对肿瘤细胞的破坏利用新纯化的效应细胞(单核和PMN)及作为效应细胞来源的全血检测。图10显示了1.0μg/ml A77X520C9 BsAb介导纯化PMN(嗜中性细胞)达37％的BsAb依赖的HER2/neu阳性SKBR-3细胞胞解。这一细胞毒性是剂量依赖的，在1.0μg/ml BsAb时饱和。图11显示了当纯化的单核细胞用作效应细胞时，A77X520C9 BsAb介导的达40％的BsAb依赖的SKBR-3细胞胞解。最后，全血作为效应细胞来源时，A77X520C9BsAb介导的达40％同样靶细胞的胞解(图12)。图10-12所显示的数据中，具有FcαR1决定簇的A77F(ab’)₂，抑制该BsAb的ADCC活性，而具有FcγR1决定簇的抗CD64M22F(ab’)₂却不抑制。这些试验中的背景胞解(无BsAb存在时)约10％。

类似的，全血ADCC试验中A77X520C9 BsAb介导另一HER2/neu过度表达肿瘤株，SKOV-3(卵巢癌株)的溶胞。实施例5 双特异抗体A77X5H425的结合介导的效应白细胞溶解含EGF-R的靶细胞

与BsAb对肿瘤抗原HER2/neu的数据类似，对EGF-R有亲和力决定簇的A77X5H425，当纯化PMN作为效应细胞时，介导达52％的BsAb依赖的A431靶肿瘤细胞胞解(图13)，当纯化的单核细胞用作效应细胞时，介导达55％的BsAb依赖的细胞胞解(图14)，全血作为效应细胞来源时(图15)，达43％的胞解。这些试验中，A77F(ab’)₂，抑制细胞毒活性，而M22F(ab’)₂不抑制。背景胞解(无BsAb存在时)约10％。

这些结果表明BsAb A77X520C9既能与效应细胞亦能与含HER2/neu的靶细胞结合，能介导纯化的嗜中性细胞和单核细胞，及全血中这些细胞的胞解作用。全血中的淋巴细胞不结合BsAb。而且，BsAbA77X5H425能结合EGF-R表达过度的靶细胞，在效应细胞存在下，介导这些细胞的胞解。

全血ADCC试验中，观察到了表达与A431(皮肤癌株)相当水平EGF-R的HN5(头和颈癌株)和MDA-MB468(乳腺癌株)的A77X5H425BsAb依赖的细胞胞解(40-50％)。实施例6 双特异抗体抗TAG 72XA77介导含TAG72的肿瘤细胞溶解

上述实施例表明BsAb制剂能介导来源于肿瘤，含肿瘤抗原HER2/neu和EGF-R的细胞株的细胞胞解。为扩展BsAb这方面的应用，通过上文所述偶联方法制备了另一具有TAG72肿瘤标识物结合决定簇的组合物。在多数乳腺，结肠，卵巢和其它癌症中发现有粘蛋白抗原TAG72。有许多特异结合TAG72的抗体，如杂交瘤CC49产生的单克隆抗体(ATCC HB 9459,Mezes,P.等国际申请WO90/04410)。

将CC49连于A77以产生BsAb抗TAG 72X77，来将含TAG72抗原的肿瘤细胞特异地定靶于含FcαR的效应细胞。图16显示了嗜中性细胞介导的BsAb抗TAG 72XA77(由CC49和A77mAb抗体构建)的含TAG72肿瘤细胞的抗体依赖的细胞毒性，与浓度μg/ml相关。图16的结果表明BsAb抗TAG 72X77介导肿瘤细胞的胞解与BsAb A77X520C9对含HER2/neu的细胞胞解，及BsAb A77X5H425对含EGF-R的细胞胞解程度类似。

总之，实施例1-6论述了本发明的双特异分子介导的含三种不同肿瘤抗原的肿瘤细胞的胞解。这些实施例和其它用取自乳腺癌，皮肤癌，胃癌，头和颈癌，及卵巢癌的细胞株进行的研究表明，连接于各种肿瘤抗原结合决定簇上的FcαR靶向的制剂在许多疾病中有广泛的应用。这些观察是很有意义的，因为，已有关于B细胞淋巴瘤相关抗原的FcγR介导PMN的靶抗原ADCC活性局限性的报道(Elasser,D等1996，血液，87.9:3803-3812)。实施例7 BsAb细胞胞解作用需要通过A77结合决定簇接近FcαR

为表明BsAb介导的靶细胞胞解作用归因于A77结合决定簇对FcαR识别，图9-15中在A77F(ab’)₂的存在下对BsAb的细胞胞解作用进行了分析。如果BsAb由于A77来源结合决定簇通过结合FcαR介导细胞胞解功能，那么加入A77F(ab’)₂，而不是有其它不同受体结合决定簇的抗体，将能导致乳腺癌细胞的细胞胞解抑制。

图9-15的结果表明BsAb通过A77来源结合决定簇结合于FcαR介导细胞胞解功能。在图9-12中，A77F(ab’)₂加入A77X520C9，靶细胞，和效应细胞的混合物抑制了细胞胞解，而类似加入不含FcγR的抗体则对细胞胞解水平无影响。图13-15亦用BsAb A77XH425介导的肿瘤细胞胞解显示了此结果；在50μg/ml A77F(ab’)₂存在下观察到了抑制，而在50μg/ml M22F(ab’)₂存在下未观察到。M22F(ab’)₂特异结合另一受体，FcγR1(Valone等1995，临床肿瘤学杂志13:2281-2292)。

这些数据表明BsAb A77X520C9和A77XH425通过依赖于BsAb特异地与FcαR1结合的方式介导肿瘤细胞的胞解。进一步，发现无论何种效应细胞，均抑制A77F(ab’)₂对BsAbd的杀死。实施例8 利用双特异抗体通过抗原递呈刺激T细胞生长

为利用BsAb提供抗原，用以下方法将mAb A77的FcαR1结合决定簇连于破伤风类毒素上。纯化的破伤风类毒素(TT，精密化学和科研公司，Westbury,NY)与硫代-琥珀酰dimidyl,4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(s-SMCC,Pierce,Rockford,IL)在摩尔比20SMCC:1TT下室温反应2小时。通过G-25色谱从TT:SMCC中除去游离的SMCC。mAb,A77的F(ab’)₂片段在5mM巯基乙胺存在下(MEA,Sigma,St.Louis,MO)30℃孵育30分钟，还原成Fab’，游离的MEA从Fab’中通过G-25色谱除去。A77Fab’室温下与SMCC处理过的TT孵育2小时，然后4℃过夜孵育。通过Superdex 200凝胶过滤(Pharmacia-Upjohn,Piscataway,NJ)从未偶联的Fab’中纯化A77-TT缀合物。

为试验抗原递呈后T细胞的增殖，如前述从免疫个体中产生TT特异的T细胞株(Gosselin,E.J.等免疫学杂志179:3477,1992)。单核细胞如前述通过冷聚纯化(Guyre,P.M.等，免疫学杂志143:1650,1989),T细胞(106/ml的50μl)和自身固有的单核细胞(5×10⁵/ml的50μl)加入有不同浓度TT或A77-TT的96孔组织培养板的板中，在CO₂孵育箱中37℃孵育。孵育四天后，每孔中T细胞的相对数量通过用买自Promega(Madison,WI)的试剂盒测定裂解后细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)来估测。加入底物和终止溶液后通过光谱法定量LDH水平。用ELISA平板读器490nm读光密度(分子仪器，PaloAlto,CA)。

图17中每个数据点都是从四重样品中减去背景值(仅单核细胞和T细胞存在于介质中)得到的平均值。A77-TT缀合物在抗原剂量30-100倍低于未偶联TT时诱导等量T细胞增殖。这些数据表明通过偶联于mAb A77将TT抗原定向于FcαR1，明显增加TT特异的T细胞中TT的单核细胞存在。可用其它的过敏抗原获得类似的抗原表达，如尘螨，猫及狗抗原，及获得疫苗抗原表达，如疟疾，鸡眼，肝炎病毒C，和其它非A非B肝炎病毒。实施例9 双特异抗体结合靶细胞并通过效应细胞引起吞噬作用

为论证BsAb对吞噬的介导，进行下述试验来测定BsAb A77X520C9存在下，效应细胞吞没SKER-3乳腺癌细胞或细胞片段的程度。这些研究测试了嗜中性细胞，单核细胞和单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)对SKER-3的吞噬。FcαR1介导的肿瘤细胞的吞噬未描述。

在暴露于白细胞前用亲脂性红色荧光染色剂PKH26标记肿瘤细胞。效应细胞和靶细胞孵育6小时后，从全血中纯化的效应单核细胞和嗜中性细胞以FITC标记的抗CD14mAb染色，通过细胞分类分析。结果显示于图18-20。吞噬百分比以与亲脂性红色染料相联的FITC-染色效应细胞表示。如图18所示，参与吞噬的效应细胞百分比在65％至70％，依赖于被测为单核细胞还是嗜中性细胞。增加双特异抗体浓度至1.0μg/ml以上，不增加参与吞噬的效应细胞。

已知分化成巨噬细胞(MDM)的单核细胞介导肿瘤细胞的吞噬(Ely,P.等1996，血液，87:3813-3821)。为研究A77X520C9 BsAb能否诱导MDM的吞噬，将这些效应细胞在不同浓度BsAb存在下与染料标记的SKBR-3细胞孵育。吞噬的水平通过两色流式细胞法分析测定，其中一个荧光素标记表示为FL1且另一个荧光素标记表示为FL2。图19显示MDM(组1FL1⁺FL2^-)和SKBR-3细胞(组2,FL1^-FL2⁺)由其单一荧光方式(组3)从其二者的混合物中彼此分辨。当A77X520C9 BsAb加入这些靶细胞和效应细胞中时，BsAb介导了肿瘤细胞的几乎完全消失(组5，下右象限)。这可通过用肿瘤特异ELISA测定可从含BsAb的孔中回收的肿瘤细胞的几乎完全缺失证实(数据未显示)。如预期，MDM单独介导一些无BsAb时(板3)SKBR-3细胞的吞噬作用(～45％)。然而，加入0.1μg/ml A77X520C9足以增强吞噬至＞95％(组5)。此BsAb介导的吞噬活性为A77F(ab’)₂几乎完全抑制(组6)。进一步，未偶联的A77F(ab’)₂和520C9F(ab’)₂的混合物不能增强吞噬作用(组4)，显示需要缀合的A77F(ab’)_X520C9F(ab’)BsAb以定靶肿瘤细胞于效应细胞引起效应细胞的激活(MDM)。

图20显示BsAb介导的吞噬活性是剂量依赖的且在0.1μg/mlBsAb时饱和(肿瘤细胞几乎完全丢失)。A77F(ab’)₂几乎完全阻断此BsAb介导的吞噬作用。同样，未偶联的A77F(ab’)₂和520C9F(ab’)₂的混合物对吞噬作用调节无活性。

以上研究描述显示除了促进细胞外裂解，FcαRⅠ-指导的BsAb介导有效的吞噬活性。特别是，当用MDM为效应细胞时，将近100％肿瘤细胞被吞噬。可能BsAb同时介导ADCC和吞噬活性，且完整细胞或裂解细胞的碎片被MDM通过FcαRⅠ吞噬。此二机制以被显示发生于FcγRⅠ介导的同时(Ely.P等1996，血液87:3813-3821)。已显示抗原呈递吞噬细胞(如MDM)吞噬含抗原颗粒后可通过Ⅰ类和Ⅱ类途径呈递抗原(Falo.L.D等1995自然医学1,7:649-656)。这样通过FcαRⅠ的对肿瘤细胞的有效吞噬可导致特别是针对肿瘤相关抗原的体液和细胞免疫功能的活化。

这些FcαRⅠ针对的BsAb细胞毒作用是有治疗意义的，因为FcαRⅠ表达主要局限于此处显示的介导BsAb依赖的细胞毒活性的免疫效应细胞，即PMN，单核细胞和巨噬细胞(Morton H.C.的1996免疫学综述16:423)。由于FcαRⅠ分布基本局限于细胞毒效应细胞且由于其有效的触发活性，含有FcαRⅠ结合决定簇的BsAb可用于细胞介导的免疫治疗。进一步，此处描述的方法可用于利用已存在的高亲和力的肿瘤特异IgG mAbs制备针对FcαRⅠ的BsAb，即，抗FcαRⅠ BsAb的结合决定簇元件可以是IgG分子，由于它们在化学偶联前被转化成F(ab’)₂片段。进一步，为构建重组BsAb,IgG的Fc部分可通过适当的限制性内切酶消化和进一步合适的外切核酸酶消化去除。利用来自IgG分子Fab部分的结合决定簇的能力将避免需要产生新的IgA类肿瘤特异mAbs以利用FcαRⅠ的细胞毒潜力。实施例10：对真菌病原体白色念珠菌的吞噬作用

本发明的双特异和多特异抗体组合物可用于指导含有FcαRⅠ的白细胞针对微生物病原体的抗原，例如，针对细菌，病毒，原生动物，和多细胞寄生虫，和真菌。通过例子，以下研究显示BsAb介导对白色念珠菌的吞噬作用，一种酵母病原体可引起T细胞缺陷免疫障碍病人的有害感染。

针对此病原体的双特异抗体从兔多克隆-抗念珠菌IgG(Biodesign Kennebunk,ME)制得。此多克隆IgG的F(ab’)片段用磺-SMCC处理以在游离氨基加入马来胺。和等摩尔A77F(ab’)进行缀合，产生A77X抗念珠菌BsAb，通过Superdex200(Pharmacia,Piscataway,NJ)上层析从未偶联的片段中纯化，A77X抗念珠菌与组成抗体特异性一致结合效应细胞和白细胞。

在37℃过夜培养的白色念珠菌细胞离心收集，用磷酸缓冲盐(PBS)洗三遍，并通过和FITC(sigma,St.Louis.MO)在0.1mg/ml浓度0.1MNaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液(pH9.6)4℃孵育30分钟荧光标记。用PBS洗三遍的荧光真菌细胞(5×10⁵)和2×10⁵分离的嗜中性细胞在10μg/mlA77X抗念珠菌(A77Xα念珠菌)BsAb存在下在37℃孵育30分钟；对照在无BsAb情况下孵育。通过用PE-缀合CD11b MoAb(BectonDickinson.San Jose.CA)作为嗜中性细胞的阈标记，在流式细胞计上测定细胞的FITC荧光强度定量吞噬作用，且吞噬作用也在cytostin制剂中测定并通过显微镜评价。每个试验重复三遍。

嗜中性细胞对念珠菌的吞噬作用，针对病原体真菌如念珠菌和曲霉菌(Pizzo.P.1984癌54:2649；Schaffner.A等1986临床观察杂志78:511)的最重要的效应细胞群，及本发明双特异抗体对吞噬作用的刺激，在图21显示。在A77X抗念珠菌存在下，37.5％±7.5％嗜中性细胞被发现具有吞噬真菌颗粒；无BsAb存在下4.2％±1.5％嗜中性细胞消化真菌颗粒(三次试验评价)。这样FcαRⅠ BsAb引起嗜中性细胞对真菌病原体吞噬作用的8.9倍刺激，如图示图21组A和组B，及组C和组D中FITC标记真菌细胞对PE标记嗜中性细胞的荧光强度迁移。

FcαRⅠ-针对BsAb可用于对抗一些感染性疾病，由于多数感染性试剂(细菌，病毒，真菌等)在其表面表达单一抗原且若干病原体特异的抗体已被描述。此技术可用于对抗抗生素耐受病原体如甲氧苯青霉素耐受金葡菌，或其它病原体细菌种类，及除了念珠菌的病原体真菌种类。实施例11：用细胞因子和生长因子处理的效应细胞的BsAb介导的细胞裂解

图22显示SKBR-3乳腺癌靶细胞的细胞毒性百分比，作为A77X520C9 BsAb的浓度的函数，通过预先用G-CSF(组A)或G-CSF和IFN-γ一起(组B)处理的嗜中性效应细胞。在细胞毒测定前嗜中性细胞用这些细胞因子在37℃过夜孵育。比较实施例4中描述的数据，其中嗜中性细胞未用细胞因子预先孵育，发现细胞毒性百分比为预先用G-CSF和IFN-γ一起孵育效应细胞所增强，如0.1μg/ml BsAb水平，超过10％的肿瘤细胞被特异裂解相比较实施例1中少于10％，且在1.0μg/ml水平，观察到超过405细胞毒作用相比于图7中无这些因子时约24％到32％。

图23显示用IFN-γ(组B)或TNF(组C)预先处理效应单核细胞的结果，用BsAb A77XH425，它通过EGF-R的结合决定簇结合FcαR的结合决定簇。如上描述，EGF受体已知在乳腺，皮肤，头颈和其它肿瘤相比上过表达，于是A77XH425含有另一多特异组合物治疗乳腺和其它肿瘤的方案。如图23所示，未处理的单核细胞引起A77XH425 BsAb介导的乳腺癌细胞细胞毒作用，在BsAb浓度为0.1μg/ml和1.0μg/ml。特别的，在1.0μg/ml水平BsAbA77X425引起超过60％未处理的单核细胞和TNF处理的单核细胞的细胞裂解作用，且在0.1μg/ml水平超过40％IFN-γ处理的单核细胞的细胞裂解作用。

总之，这些结果显示每种BsAb制剂，A77X520C9和A77XH425，分别结合于乳腺癌细胞和皮肤癌细胞，介导不用外源细胞因子另外处理这些效应细胞时嗜中性细或单核细胞癌细胞的细胞裂解作用。实施例12:A77FcαR结合位点和FcαR对其天然配体的不同

设计针对FcαRⅠ的治疗性BsAb时，若此实体的结合不与内源性分子类型，如天然配体IgA竞争，则作为受试者中的治疗性试剂，获得最佳功能性。这样治疗性BsAb或多特异结合组合物可以给药，并不被阻断或抑制，或不被内源性Iga真正的阻断或抑制。

图24显示A77抗体在200μg/ml IgA存在下结合于效应细胞的完全范围，比较对照无IgA存在时的结合。平均荧光强度不受IgA存在的影响。这些结合显示A77mAb特异结合不同于结合IgA位点的FcαRⅠ的表位(Monteiro等1992免疫学杂志148:1764-1770)。实施例13FcαRⅠ被A77调节，且不被A77X520C9和A77F(ab’)₂调节

对细胞加入A77mAb对FcαRⅠ调节的效果特点通过研究获得，其中细胞表面FcαRⅠ的调节(受体数目降低)作为A77mAb浓度的函数来检测。

如图25所示，单核细胞和不同浓度的A77在37℃孵育18小时引起在10ng/ml的调节，可达对照的55％到60％的高台(无A77时的受体数目)在1.0到10μg/ml。相反，和抗体520C9引起孵育单核细胞，和A77有相同的同种型并特异结合单核细胞上不表达的HER2/neu受体，对单核细胞上FcαR调节无影响。这样A77mAb功能决定簇能引起表面FcαR的内化和调节。进一步，借助于衍生自520C9的结合决定簇，BsAb结合HER/neu的能力和FcαRⅠ结合决定簇无关。此结果显示通过和A77抗体孵育含此受体的细胞可下调FcαR。这样的调节可用于免疫混乱的调节。

这样的结果被肯定并和BsAb A77X520C9的数据形成对照，A77F(ab’)₂同样，和A77相比它们对单核细胞的FcαRⅠ不显示下调，PMN也几乎没有。BsAb或A77结合于单核细胞，或PMN对FcαRⅠ表达的调节通过流式细胞法测定。图26显示1和10μg/ml完全A77mAb在37℃孵育过夜后导致PMN和单核细胞上FcαRⅠ的约40-50％降低。此调节活性不需要结合A77和抗鼠抗体的交联。然而，1和10μg/mlA77X520C9 BsAb或A77F(ab’)₂在相似条件下导致很小或没有FcαRⅠ的调节，表明在FcαRⅠ表达的下调中需要A77的Fc区。

从显示A77mAb而非BsAb或A77(ab’)₂调节的图26的数据，可得出结论BsAb结合单核细胞，且PMN不导致交联，且接着在靶抗原或细胞不存在时下调FcαRⅠ。由此，FcαRⅠ针对的BsAb可用作给病人或受试者的效应细胞“装备”，而不通过受体交联激活，这样避免不期望的全身性副作用。以本发明多特异抗体装备的效应细胞只可通过结合靶抗原FcαRⅠ的交联激活，例如病原体或肿瘤细胞上的抗原。类似的用FcγRⅠ-针对BsAb对单核细胞装备已显示(Valone.F.H等1995临床肿瘤杂志13:2281-2292)，然而，为有效加FcγRⅠ针对BsAb臂，需要用G-GSF或IFN-γ预先处理受试者以体内利用PMN效应细胞群(Repp.R等1991血液78:995；Weber.J.S.等1996 proc.of ASCO15:354.(摘要)。此处描述的FcαRⅠ针对BsAb可在无细胞因子前处理情况下利用效应细胞如单核细胞，PMN和巨噬细胞，并不下调白细胞上的同类的受体。实施例14:A77可变区基因的克隆和测序

A77RNA从A77FcαR特异抗体产生杂交瘤细胞株中制备，用RNAeasy Total kit(Qiagen)可从约4×10⁷A77相比中提取33μg总RNA。RT-PCR用GeneAmp Thermostabler Tth Reverse TranscriptaseRNAPCR kit(Perkin Elmer)在200ng总RNA上进行。IgG V去cDNA用引物CGlFOR获得5’-ggaagcttagacagatgggggtgtcgttttg，序列号：1(编码鼠IgG1重链CH1区的115-122氨基酸和一个HindⅢ位点)和CK2FOR,5’-ggaagcttgaagatggatacagttggtgcagc，序列号：2(编码鼠κ轻链稳定区111-118氨基酸和一个HindⅢ位点)。

VH和VκcDNA用引物通过PCR扩增，5’-gactggatccatggratggagctggrtcwtbhtctt序列号：3(编码一些VH信号肽的氨基酸的-20到-12的位点序列和一个BamHⅠ位点)和VKlBACKBAM,5’-gactggatccgacattcagctgacccagtctcca，序列号：4(编码信号肽-4到-1氨基酸和一些鼠Vκ区的1到4残基和一个BamHⅠ位点)。单字母编码代表核苷酸组合，为本领域技术熟练人员所知，在New Englang Biolabs目录1996-1997 174页给出(32Tozer Rd.Beverly.MA)。

扩增的VH和VκDNA用Wizard PCR Prep kit(Promega)纯化。克隆入pUC19，用双脱氧法测序。DNA测序由National Biosciences.Inc进行。每个VH和Vκ的至少5pUC19克隆测序以获得这些基因的一致序列，显示于图27(序列号5)和图28(序列号6)。推出的氨基酸序列按VH和Vκ分别显示于图27(序列号7)和28(序列号8)。

这些序列用于获得存在人源化A77 FcαR结合决定簇，以产生单链抗体和单链BsAbs，用于用重组方法设计更高亲和力的决定簇，用于模型研究用推理药物设计以发展模仿药物。及用于本发明描述的另外申请。

等价物

本领域技术熟练人员将认识到，或能确定用不超过常规试验，此处描述的本发明实施方案的许多等价物。这样的等价物将包含于以下权利要求书中。

此处所有参考内容的专利和发表物在此引为参考文献。

序列列表：

(1)一般信息：

(ⅰ)申请者：

(A)姓名：MDAREX,INC.

(B)街道：1545 ROUTE 22 EAST,P.O.BOX 992

(C)城市：ANNANDALE

(E)国家：NEW JERSEY

(F)邮政编码：US

(G)电话：08801-0992

(H)传真：

(ⅱ)发明题目：含有抗Fcα受体抗体的治疗性多特异组合物

(ⅳ)联系地址：

(A)收件人：LAHIVE&COCKFIELD,LLP

(B)街道：60 State Street,Suite 510

(C)城市：Boston

(D)州：Massachusetts

(E)国家：US

(F)邮政编码：02109-1875

(ⅴ)计算机可读类型：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：ASCII TEXT

(ⅵ)目前申请资料：

(A)申请号：PCT/US97/

(B)签发日期：10 JULY 1997

(C)分类：

(ⅶ)以前申请资料：

(A)申请号：US 08/678,194

(B)签发日期：11 JULY 1996

(ⅷ)代理人/委托人信息：

(A)姓名：REMILLARD,JANE E.

(B)登记号：38,872

(C)文献/摘要号：MXI-064CPPC

(ⅸ)通讯信息

(A)电话：(617)227-7400

(B)传真：(617)227-5941

(C)TELEX:

(2)SEQ ID NO:1 言息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：31碱基对

(B)类型：核酸

(C)链类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅸ)特征：

(A)名字/关键词：misc_feature

(B)位置：1...31

(D)其它信息：“PCR引物”

(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:1:GGAAGCTTAG ACAGATGGGG GTGTCGTTTT G 31

(2)SEQ ID NO:2信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：32碱基对

(B)类型：核酸

(C)链类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅸ)特征：

(A)名字/关键词：misc_feature

(B)位置：1...32

(D)其它信息：“PCR引物”

(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:2:GGAAGCTTGA AGATGGATAC AGTTGGTGCA GC 32

(2)SEQ ID NO:3信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：36碱基对

(B)类型：核酸

(C)链类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅵ)特征：

(A)名字/关键词：misc_feature

(B)位置：15,26

(D)其它信息：“”

(ⅶ)特征：

(A)名字/关键词：misc_feature

(B)位置：29

(D)其它信息：“W为A或T”

(ⅵ)特征：

(A)名字/关键词：misc_feature

(B)位置：31

(D)其它信息：“B为C或G或T”

(ⅵ)特征：

(A)名字/关键词：misc_feature

(B)位置：32

(D)其它信息：“H为A或C或T”

(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:3:GACTGGATCC ATGGRATGGA GCTGGRTCWT BHTCTT 36

(2)SEQ ID NO:4信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：34碱基对

(B)类型：核酸

(C)链类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅸ)特征：

(A)名字/关键词：misc_feature

(B)位置：1...34

(D)其它信息：“PCR引物”

(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:4:GACTGGATCC GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCA 34

(2)SEQ ID NO:5信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：336碱基对

(B)类型：核酸

(C)链类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅸ)特征：

(A)名字/关键词：CDS

(B)位置：1...336

(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:5:GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA CTC ACT TTG TCG ATT ACC ATT GGA 48Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Ile Thr Ile Gly1 5 10 15CAA CCA GCC TCC ATC TCT TGC AAG TCA AGT CAG AGC CTC TTA GAT AGT 96Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30GAT GGA AAG ACA TAT TTG AAT TGG TTG TTA CAG AGG CCA GGC CAG TCT 144Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45CCA ACG CGC CTA ATC TAT CTG GTG TCT AAA CTG GAC TCT GGA GTC CCT 192Pro Thr Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60GAC AGG TTC ACT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTG AAA ATC 240Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT TTG GGA ATT TAT TAT TGC TGG CAA GGT 288Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95GCA CAT TTT CCT CAG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA 336Ala His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

(2)SEQ ID NO:6信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：112氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：多肽

(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:6:Rsp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Ile Thr Ile Gly1 5 10 15Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45Pro Thr Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95Ala His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

(2)SEQ ID NO:7信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：426碱基对

(B)类型：核酸

(C)链类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅸ)特征：

(A)名字/关键词：CDS

(B)位置：1...426

(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:7:ATG GGA TGG AGC TGG GTC ATT ATC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGA 48Met Gly Trp Ser Trp Val Ile Ile Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15GCC CAC TCT GAG ATC CAG CTG CAG CAG ACT GGA CCT GAG CTG GTG AAG 96Ala His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Thr Gly Pro Glu Leu Val Lys

20 25 30CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAT TCA TTC 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe

35 40 45ACT GAC TAC ATC ATA TTT TGG GTG AAG CAG AGC CAT GGA AAG AGC CTT 192Thr Asp Tyr Ile Ile Phe Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu

50 55 60GAG TGG ACT GGA AAT ATT AAT CCT TAC TAT GGT AGT ACT AGC TAC AAT 240Glu Trp Thr Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn65 70 75 80CTG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC AAA TCT TCC AGC 288Leu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95ACA GCC TAC ATG CAG CTC AAC AGT CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC 336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110TAT TAC TGT GTA AGA GGA GTT TAT TAC TAC GGT AGT AGC TAC GAG GCG 384Tyr Tyr Cys val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Glu Ala

115 120 125TTT CCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 426Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135 140

(2)SEQ ID NO:8信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：142氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：多肽

(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:8:Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe

35 40 45Thr Asp Tyr Ile Ile Phe Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu

50 55 60Glu Trp Thr Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn65 70 75 80Leu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110Tyr Tyr Cys Val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Glu Ala

115 120 125Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135 140

Claims

1．一种双特异结合分子，含有结合Fcα受体的第一结合决定簇和结合一个或多个靶抗原的第二结合决定簇。

2．权利要求1的双特异结合分子，其中Fcα受体的第一结合决定簇的结合不被人类免疫球蛋白A阻断。

3．权利要求1的双特异结合分子，其中靶抗原是癌细胞抗原。

4．权利要求3的双特异结合分子，其中癌细胞抗原是选自含有乳腺，卵巢，睾丸，肺，结肠，直肠，胰腺，肝，中枢神经系统，头和颈部，肾，骨，血液和淋巴系统癌的组。

5．权利要求1的双特异结合分子，其中靶抗原来自病原体或病原体感染细胞的感染性疾病抗原。

6．权利要求3的双特异结合分子，其中癌细胞抗原是人类EGF样受体家族的一个成员。

7．权利要求6的双特异结合分子，其中癌细胞抗原是EGF受体。

8．权利要求6的双特异结合分子，其中癌细胞抗原是HER-2/neu。

9．权利要求6的双特异结合分子，其中癌细胞抗原选自HER-3和HER-4。

10．权利要求6的双特异结合分子，其中癌细胞抗原是含有至少一个HER亚单位的异二聚体受体。

11．权利要求3的双特异结合分子，其中癌细胞抗原是选自含有癌胚抗原，胃泌素释放肽受体抗原，和鼠肿瘤抗原TAG72的组。

12．权利要求1的双特异分子，其中至少一个所述结合决定簇是抗体或抗体片段。

13．权利要求12的双特异结合分子，其中抗体或抗体片段是IgG或IgG片段。

14．权利要求12的双特异结合分子，其中抗体或抗体片段是选自含有Fab,F(ab’),F(ab’)₂,Fv，和单链Fv的组。

15．双特异结合分子包括一个结合FcαR受体的结合决定簇和一个结合选自含有癌细胞抗原和来自病原体抗原的组的结合决定簇。

16．权利要求书15的双特异结合分子，其中结合Fcα受体的决定簇是人源化的。

17．权利要求书16的双特异结合分子，其中人源化的决定簇是从分别显示于图14(序列号5)和图15(序列号7)的编码抗体A77V_κ和V_H区的Fv结合决定簇的核苷酸序列的全部或部分衍生。

18．权利要求书16的双特异结合分子，其中人源化的决定簇是从分别显示于图14(序列号6)和图15(序列号8)的编码抗体A77V_κ和V_H区的Fv结合决定簇的氨基酸残基序列的全部或部分衍生。

19．权利要求书18的双特异结合分子，其中人源化的决定簇和分别显示于图14(序列号6)和图15(序列号8)抗体A77V_κ和V_H区有超过50％同源性。

20．权利要求书15的双特异结合分子，其中第二结合决定簇是选自含有抗体520C9，抗体CC49和其功能片段的组。

21．权利要求书20的双特异结合分子，通过化学连接抗体A77片段和第二结合决定簇产生。

22．权利要求书20的双特异结合分子，在宿主细胞中重组产生。

23．一种多特异结合分子，含有结合Fcα受体的第一结合决定簇和结合一个或多个靶抗原的第二结合决定簇。

24．权利要求23的多特异结合分子，其中Fcα受体的第一结合决定簇的结合不被人类免疫球蛋白A阻断。

25．权利要求23的多特异结合分子，选自含有一个双特异结合分子和一个三特异结合分子的组。

26．权利要求25的多特异结合分子，包括一个特异于非Fcα受体的Fc受体的第三结合决定簇。

27．权利要求26的多特异结合分子，其中第三结合决定簇结合选自Fcγ受体，Fcε受体，Fcδ受体和Fcμ受体的组的Fc受体。

28．权利要求23的多特异结合分子，其中Fcγ受体的结合不被人类IgG抑制。

29．权利要求28的多特异结合分子，其中第二结合决定簇结合于选自含有癌细胞抗原，病原体抗原，和病原体感染细胞上的抗原的组的靶抗原。

30．权利要求28的多特异结合分子，由化学连接所述结合决定簇产生。

31．权利要求23的多特异结合分子，在转染编码所述结合决定簇的核酸的宿主细胞中重组产生。

32．权利要求23的多特异结合分子，其中至少一个所述结合决定簇是抗体或抗体片段。

33．权利要求32的多特异结合分子，其中至少一个所述结合决定簇是人源化抗体或其片段。

34．权利要求29的多特异结合分子，其中癌细胞抗原是选自含有乳腺，卵巢，睾丸，肺，结肠，直肠，胰腺，肝，中枢神经系统，头和颈部，肾，骨，血液和淋巴系统癌的组。

35．权利要求29的多特异结合分子，其中病原体抗原是选自含有细菌，真菌，原生动物，和病毒抗原的组。

36．权利要求29的多特异结合分子，其中癌细胞抗原是人类EGF样受体家族的一个成员。

37．权利要求36的多特异结合分子，其中癌细胞抗原是EGF受体。

38．权利要求36的多特异结合分子，其中癌细胞抗原是HER-2/neu。

39．权利要求36的多特异结合分子，其中癌细胞抗原是HER-3,HER-4，或含有至少一个HER亚单位的异多聚体。

40．权利要求29的多特异结合分子，其中癌细胞抗原是选自含有癌胚抗原，胃泌素释放肽受体抗原，和鼠(mucin)抗原TAG72的组。

41．多特异结合分子，含有一个抗体A77的功能片段和一个结合选自癌细胞上抗原，病原体上抗原和病原体感染细胞上抗原的组的抗原的第二结合决定簇。

42．权利要求41的多特异结合分子，其中针对癌细胞上抗原的第二结合决定簇是选自包括抗体520C9，抗体CC49和其功能片段的组。

43．权利要求41的多特异结合分子，其中A77抗体片段结合白细胞上的IgA受体。

44．权利要求43的多特异结合分子，其中白细胞是选自含有巨噬细胞单核细胞，嗜中性细胞，嗜碱性细胞，嗜酸性细胞，和淋巴细胞。

45．权利要求41的多特异结合分子，其中病原体抗原是选自含有细菌，病毒，真菌和原生动物的组。

46．权利要求32的多特异结合分子，其中抗体或抗体片段是IgG或IgG片段。

47．权利要求32的多特异结合分子，其中抗体或抗体片段是选自包括Fab,F(ab’),F(ab’)₂,Fv，和单链Fv的组。

48．权利要求23的多特异结合分子，含有一个结合靶细胞上抗原的第三结合决定簇，其中所述第二结合决定簇结合同一靶细胞上不同抗原。

49．权利要求23的多特异结合分子，含有一个结合靶抗原上表位的第三结合决定簇，其中所述第二结合决定簇结合同一靶抗原上不同表位。

50．权利要求45的多特异结合分子，其中病原体是真菌。

51．权利要求50的多特异结合分子，其中真菌是念珠菌属的一种。

52．权利要求51的多特异结合分子，其中种类是白色念珠菌。

53．权利要求50的多特异结合分子，其中对Fcα的结合决定簇不被人类免疫球蛋白A所阻断。

54．消除或减少受试者中不想要细胞的方法，包括给予受试者治疗在一药用可接受载体中的有效量的多特异结合分子，含有结合Fcα受体的第一结合决定簇和结合不想要细胞上抗原的第二结合决定簇。

55．权利要求54的方法，其中至少所述决定簇之一是人源化的。

56．权利要求55的方法，进一步包括给予受试者至少一种增强含有Fcα受体细胞上Fcα受体数目或活性的试剂。

57．权利要求56的方法，其中试剂是细胞因子。

58．权利要求57的方法，其中细胞因子是选自含有至少G-GSF,GM-CSF,IFN-γ，和TNF之一的组。

59．处理病原体感染受试者的方法，其中受试者被给予在一药用可接受载体中的治疗有效量的多特异结合分子，所述分子含有结合Fcα受体的第一结合决定簇和结合病原体或病原体感染细胞上靶抗原的第二结合决定簇。

60．处理受试者以消除或减少受试者中不想要细胞的方法，包括从受试者获得血或血细胞样品；来自体内使所述血或血细胞接触在药用可接受载体中的治疗有效量的多特异结合分子，所述结合分子含有结合Fcα受体的第一结合决定簇和结合一个或多个靶抗原的第二结合决定簇；且将所述血或血细胞返回受试者。

61．权利要求60的方法，其中至少所述决定簇之一是人源化的。

62．权利要求61的方法，其中所述血细胞被分离并培养扩增。

63．用于处理受试者体内存在的不想要细胞的权利要求61的方法，其中所述血细胞被用至少一种增强Fcα受体数目或活性的试剂处理。

64．针对病原体或针对肿瘤免疫受试者的方法，其中受试者被给予在一药用可接受载体中的多特异结合分子，所述分子含有结合Fcα受体的第一结合决定簇和结合选自含有癌细胞上抗原，病原体或病原体感染细胞上抗原的组的抗原的第二结合决定簇。

65．针对病原体或针对肿瘤装备(arming)效应细胞的方法，其中受试者给予在一药用可接受载体中的多特异结合分子，所述分子含有结合Fcα受体的第一结合决定簇和结合选自含有癌细胞上抗原，病原体或病原体感染细胞上抗原的组的抗原的第二结合决定簇。

66．调节受试者中Fcα的方法，包括给予受试者在一药用可接受载体中的含有抗体A77或A77功能片段的组合物。

67．识别调节细胞表面Fcα受体的试剂的方法，包括使带有Fcα受体的细胞样品接触试剂；在一存在试剂的样品中，在一存在调节Fcα受体的抗体的对照样品中，在一细胞不接触所述试剂或抗体作为对照的样品中，测定Fcα受体活性；并比较样品中Fcα受体活性，如细胞样品接触所述试剂且有比不接触试剂的对照细胞显著低的Fcα受体活性，或和有抗体的样品细胞一样低的Fcα受体活性的统计学显著性，鉴定了一种可调节细胞表面Fcα受体的试剂。

68．通过用A77重链和轻链可变区决定簇序列获得A77抗Fcα受体结合位点三维模型设计一种调节Fcα受体用于治疗自身免疫疾病的试剂的方法，包括和已知三维结构的抗体的重链和轻链可变区比较A77可变区的氨基酸序列；决定VH和V_κ位点结合区主肽链内非同源氨基酸残基的排列，这样A77抗Fcα受体结合位点的大小，形状和电荷被决定；利用A77结合位点类似物的计算机模型筛选分子文库以获得合适大小，形状和电荷的分子；并筛选这些具有潜在调节Fcα受体活性的合适大小，形状和电荷候选物，这样调节Fcα受体的试剂即被设计。