KR20160101196A - 암의 치료 및 예방을 위한 clptm1l 표적화 - Google Patents

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KR20160101196A
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마이클 에이. 제임스
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더 메디컬 컬리지 오브 위스콘신, 인크.
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Abstract

인간 CLPTM1L 폴리펩티드에 대한 특이성을 갖는 치료제, 예를 들어, 하나 이상의 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 치료제, 상기 치료제를 포함하는 조성물, 및 암, 전암성 병변 또는 CLPTM1L 단백질 기능이상(예를 들어, 병원성 생성, 변형, 또는 기능)과 관련된 다른 질병 상태를 치료하거나 예방하기 위해 상기 조성물을 이용하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

암의 치료 및 예방을 위한 CLPTM1L 표적화{TARGETING CLPTM1L FOR TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER}
관련 출원의 전후 참조
본 출원은 2014년 1월 14일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/927,330호의 이익을 청구하며, 상기 출원은 이의 전체내용이 기재된 것처럼 참조로서 본원에 포함된다.
미 연방 후원 연구에 관한 설명
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여되는 수여 번호 U19 CA128147 하에 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 CLPTM1L 폴리펩티드를 표적화하기 위한 화합물 및 조성물 및 암 또는 CLPTM1L 단백질 기능이상과 관련된 다른 질환(예를 들어, 병원성 생성, 변형, 또는 기능)을 치료하거나 예방하기 위해 상기 화합물 및 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 CLPTM1L 표적화 모이어티를 포함하는 치료제 및 CLPTM1L 단백질 기능이상과 관련된 질병 또는 질환, 예를 들어, 비소세포폐암을 치료하거나 예방하기 위해 대상체에 상기 치료제를 투여하는 방법에 관한 것이다. 치료제, 약학적 조성물, 및 방법이 본원에 제공된다.
배경
암은 종양유전자 및 종양 억제인자 유전자의 돌연변이로 시작되는 질병이다. 이들 중요한 유전자의 돌연변이는 암세포가 발달하고, 궁극적으로 인체에서 발견되는 다양한 제공된 유형의 세포의 병원성 복제(과잉 세포 증식을 초래하는 정상 조절성 제어의 손실)를 발생시키는 것을 가능케 한다. 종양 형성, 종양 생존, 및 암 전이는 비부착 성장 및 세포외 기질로부터 종양 세포의 분리와 관련된 프로그램화된 세포 사멸 메커니즘인 제노톡신-유도 아폽토시스 및 아노이키스(anoikis)로부터의 보호를 필요로 한다. 종양 세포는 주위 조직을 침범하고 전이를 발생시키기 위해 아폽토시스 및 아노이키스로부터의 보호를 필요로 한다.
암을 치료하거나 예방하기 위한 방법, 특히 종양 성장을 늦추거나 억제하고, 전이를 방지하는 방법이 당 분야에 필요하다.
발명의 개요
첫번째 양태에서, 본 발명은 항체, 펩티드, 앱타머(aptamer), 또는 이들의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 화합물을 제공한다. CLPTM1L-표적화 작용제는 CLPTM1L 폴리펩티드의 적어도 일부에 특이적인 모노클로날 항체일 수 있다. CLPTM1L 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 일부를 가질 수 있다. 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:4-25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 특이적일 수 있다. 모노클로날 항체는 6-1, 6-2, 10-1, 10-2, 및 10-3로 구성된 군으로부터 선택된 모노클로날 항-CLPTM1L 클론일 수 있다. 모노클로날 항체는 표 2에 기재된 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 CLPTM1L 폴리펩티드에 특이적일 수 있다. 일부 경우에, CLPTM1L-표적화 작용제는 SEQ ID NO:4-25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 약제로서 사용하기 위해 본원에 제공된 화합물 또는 조성물에 따른 작용제가 본원에 제공된다. 약제의 제조에서의 상기 작용제의 용도가 추가로 제공된다.
추가 양태에서, 본 발명의 약학적 조성물 및 인간 대상체로의 투여를 위한 설명서를 포함하는 제조 물품이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 종양을 치료하거나 예방하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 통상적으로 치료적 유효량의 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 이에 의해 상기 종양은 대상체에서 치료되거나 예방된다. 일부 경우에, CLPTM1L-표적화 작용제는 항체, 펩티드, 및 앱타머, 또는 이들의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. CLPTM1L-표적화 작용제는 CLPTM1L 폴리펩티드의 적어도 일부에 특이적인 모노클로날 항체일 수 있다. CLPTM1L 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 일부를 가질 수 있다. 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:4-25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 특이적일 수 있다. 모노클로날 항체는 표 2에 기재된 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 CLPTM1L 폴리펩티드에 특이적일 수 있다. CLPTM1L-표적화 작용제는 SEQ ID NO:4-25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드일 수 있다.
일부 경우에, 종양은 아교모세포종, 육종, 암종, 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 고형 종양이다. 일부 경우에, 종양은 폐암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 방광암, 신장암, 난소암, 결장암, 결장직장암, 유방암, 자궁경부암, 뇌암, 식도암, 및 위암, 또는 이들의 신생물전 병변으로 구성된 군으로부터 선택된 암 또는 신생물전 병변과 관련된다. 종양은 폐암 또는 이의 신생물전 병변과 관련될 수 있다. 종양은 화학요법제에 대한 내성을 나타낼 수 있다. 화학요법제는 시스플라틴 및 젬시타빈으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 화합물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여된다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 CLPTM1L을 인코딩하는 핵산 서열의 과발현 또는 부적절한 발현과 관련된 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 통상적으로 질병 또는 질환의 위험이 있거나, 질병 또는 질환을 갖는 것으로 진단되었거나, 질병 또는 질환의 증상을 나타내는 대상체의 세포, 조직, 또는 기관에 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 상기 질병 또는 질환은 암, 종양(예를 들어, 고형 종양) 또는 신생물전 병변일 수 있다. 종양, 암, 또는 신생물전 병변은 폐암, 췌장암, 아교모세포종, 전립선암, 피부암, 방광암, 신장암, 난소암, 결장암, 결장직장암, 유방암, 자궁경부암, 뇌암, 식도암, 위암, 림프종, 만성 백혈병, 및 급성 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 종양은 화학요법제에 대해 내성을 나타낼 수 있다. 화학요법제는 시스플라틴 및 젬시타빈으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. CLPTM1L-표적화 작용제는 항체, 펩티드, 및 앱타머, 또는 이들의 단편으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. CLPTM1L-표적화 작용제는 CLPTM1L 폴리펩티드의 적어도 일부에 특이적인 모노클로날 항체일 수 있다. CLPTM1L 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 일부를 가질 수 있다. 일부 경우에, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:4-25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 특이적이다. 모노클로날 항체는 표 2에 기재된 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 CLPTM1L 폴리펩티드에 특이적일 수 있다. CLPTM1L-표적화 작용제는 SEQ ID NO:4-25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드일 수 있다. 화합물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 특징, 양태, 및 장점은 후속되는 설명으로부터 더 잘 이해될 수 있을 것이다. 설명에서, 본 발명의 일부를 형성하고, 본 발명의 구체예에 대한 예시로서 제시되고, 이를 제한하지는 않는 수반하는 도면이 참조된다. 바람직한 구체예의 설명은 모든 변형, 동등물 및 대안을 포함시키기 위해 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명의 범위를 해석하기 위해 본원에 열거된 청구항이 참조되어야 한다.
도면의 간단한 설명
본 발명은 하기 상세한 설명을 고려하는 경우 더 잘 이해될 것이며, 상기 기재된 것이 아닌 특징, 양태 및 장점이 명백해질 것이다. 상세한 설명이 하기 도면에 대해 참조된다:
도 1은 더 큰 세포외 영역 내의 작은 무질서한 영역(아미노산 잔기 142-162)에 의해 분리된 2개의 별개의 구형 도메인의 존재를 입증하는 구조 데이터를 제공한다.
도 2는 (A) 형질막 내의 CLPTM1L의 인간 서열의 배향, 2개의 세포외 구형 도메인(ECR1 및 ECR2), 간극 무질서 영역, 막횡단 영역, 및 확인된 당화 세포 표면 펩티드(청색) 및 예측 부위인 N-당화 부위(녹색)를 포함하는 CLPTM1L 예측 구조의 개요를 제공한다. 각각의 ECR을 표적화하는 CLPTM1L 펩티드에 대해 발생된 모노클로날 항체가 괄호 내에 표시된다. 프로터(Protter) 적용을 이용하여 이미지가 생성되었다(Omasits et al., Bioinformatics 30(6):884-6 (2014)). (B) 예측 구조를 변경시키는 세포외 영역 1 및 일부 막횡단 도메인이 결여된 CLPTM1L의 스플라이싱 변이체. 이러한 아이소형의 발현 패턴은 공지되어 있지 않다.
도 3은 인간 CLPTM1L 단백질에 특이적인 모노클로날 항체를 발생시키기 위한 에피토프의 선택을 도시한다. 모노클로날 항체 설계를 위한 집중 영역은 예측 세포외 도메인의 정돈된 영역을 포함하였다. 당화 부위는 배제되었다.
도 4는 CLPTM1L 국소화를 입증한다. (A) CLPTM1L, 막횡단 수용체 EGFR 및 핵 단백질 사이클린 D1에 대한 세포 표면 및 전체 세포 단백질 용해질의 웨스턴 블로팅.모노클로날 항체 6-1, 10-2, 및 10-3가 웨스턴 블로팅에 사용되었다. (B) 세포 핵을 염색시키기 위한 DAPI 염료 및 인간 CLPTM1L의 예측 세포외 N-말단에 대한 폴리클로날 항체 후 CLPTM1L을 검출하기 위한 이차 FITC 컨쥬게이션된 항체를 이용한 비-투과화 A549 폐 종양 세포의 면역형광 염색. 비특이적 항체가 대조군으로 사용되었다. 염색은 단백질의 중단된 형질막 국소화를 나타낸다. (C) 모노클로날 항체를 이용한 H838 세포에서의 CLPTM1L에 대한 웨스턴 블로팅. (D) 모노클로날 CLPTM1L 항체 6-1(1000X) 및 10-2(400X)를 이용한 비-투과화 A549 세포의 면역형광 염색. 모노클로날 항체 6-1 및 10-2가 면역형광에 사용되었다.
도 5는 CLPTM1L 발현이 정상 췌장 도관 상피에 비해 췌장 종양 조직에서 증가되고, 더 높은 발현이 불량한 생존과 관련된다는 것을 입증하는 그래프 및 이미지를 제공한다. (A) 31명의 환자에서의 정상 도관 상피 조직에 비한 췌장 종양에서의 CLPTM1L에 특이적인 항체를 이용한 염색의 면역조직화학 스코어링. (B) CLPTM1L 발현의 삼분위수로 층화된 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선. (C) 종양의 대표 염색.
도 6은 종양 세포에서의 CLPTM1L 표적화가 Bcl-xL 및 Akt 생존 신호전달을 조절하고, 시스플라틴을 이용한 사멸에 세포를 민감화시키는 것을 입증한다. (A) 폴리클로날 항-CLP 항체(1:1000 = 1 ㎍/mL)를 이용한 A549 세포 처리는 항-아폽토티스 분자 Bcl-xL 및 전체 Akt의 축적을 감소시켰다. (B) 항-CLPTM1L은 24시간 동안 시스플라틴 처리시 사멸에 대한 민감성을 유의하게 증가시켰다(p<0.05). (C) 모노클로날 항-CLP(10-2)를 이용한 처리는 젬시타빈(72시간 동안 500 μM)에 의한 사멸에 대한 췌장 샘암종 세포의 민감성을 증가시켰다. (D) 모노클로날 항-CLP(10-2)를 이용한 췌장 샘암종 세포의 처리는 인산화된 Akt의 축적을 감소시켰다.
도 7은 항-CLP 항체(Ab)를 이용한 처리가 시험관 내에서 인간 폐 종양 및 기관지 상피 세포의 비부착 성장을 억제하는 것을 입증하는 이미지 및 그래프를 제공한다. 0.8% 하부 아가 층에 비한 0.4% 상부 아가에서의 콜로니 형성에 의해 측정되는 바와 같은 인간 폐 종양 세포의 비부착 성장은 용매 대조군 처리된 세포에 비해 항-CLPTM1L 처리에 의해 55%-65%까지 억제되었다(p<0.05). 처리는 플레이팅 하루 후 및 다시 1주일 후에 투여되었다. EGF 처리는 Beas2B 인간 기관지 상피 세포에서 비부착 성장을 유도하였고, 이는 항-CLP Ab를 이용한 처리시 76%까지 억제되었다.
도 8은 항-CLPTM1L 항체에 의한 췌장 종양 세포의 콜로니 성장 억제를 입증한다. (A) Panc-1 췌장 종양 세포는 DMEM/F12 w/10% FBS 중에서 웰 당 1000개 세포로 삼중으로 6-웰 플레이트에 플레이팅되었다. 플레이팅 후, 지정된 항체가 5 ㎍/mL로 배양 배지에 첨가되었다. (B) 웰 당 콜로니가 메탄올 중에서의 고정 및 0.5% 크리스탈 바이올렛을 이용한 염색 후에 배양 5일 후에 카운트되었다. **p=0.005.
도 9는 확립된 인간 폐 종양의 성장의 억제를 위한 이종이식 모델을 제공한다. (A) A549 종양 세포가 피하 주입되고, 0, 5, 및 12일에서 종양 확립 후에 대조군 복수, 폴리클로날 항-CLPTM1L, 또는 모노클로날 항-CLPTM1L 클론으로 처리된 무흉선 누드 마우스에서의 평균 종양 부피. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. (B) 17일에서의 개별적 종양의 종양 부피. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.005.
도 10은 모노클로날 항-CLPTM1L 항체의 시험관 내 항-종양 효과의 특징을 요약한다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별적 간행물, 특허, 및 특허 출원이 특별히 및 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 지정되는 것과 같이 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명은 CLPTM1L이 비소세포폐암(NSCLC)에서 일반적으로 과발현되고, 유전독성 아폽토시스로부터 폐 종양 세포를 보호한다는 본 발명자의 발견을 적어도 부분적으로 기초로 한다. 특히, CLPTM1L의 고갈은 다수의 모델에서 생체 내에서 종양형성을 확실하고 유의하게 억제하였다. 구순열 및 구개 막횡단 단백질-유사 단백질 1(CLPTM1L)으로 달리 공지된 시스플라틴 내성 관련 단백질-9(CRR9)는 다수의 전장 유전체 연관(GWA) 연구에 의해 규정된 바와 같이 염색체 5p15.33에 위치된다. CLPTM1L 유전자는 폐암에서 초기의 카피수에서 종종 획득되고, 유전자형에 의해 폐암 감수성과 연관되는 염색체 5 상의 유전자좌 내에 놓여 있다. 예를 들어, CLPMT1L 유전자 근처 및 내의 유전적 변형은 폐암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 방광암, 신경아교종, 전립선암, 기저세포 암종, 및 흑색종과 관련된다. 작용 메커니즘은 충분히 설명되어야 할 것으로 남아 있지만, CLPTM1L이 Bcl-xL 생존 단백질 축적과 연관된 것으로 생각된다. 확실히, 본 발명자는 CLPTM1L이 유전독소-유도 아폽토시스로부터 화학요법적으로 치료된 종양 세포를 보호하고, CLPTM1L이 비 부착 증식 및 Ras-유도 폐 종양형성에 필요한 것을 이전에 입증하였다.
본 발명자는 CLPTM1L이 형질막으로 국소화되고, 세포외인 것으로 예측되는 CLPTM1L 단백질의 N-말단 영역을 표적화하는 폴리클로날 항체가 CLPTM1L의 RNA 간섭-매개 고갈에 의해 유도된 것과 동등한 표현형, 특히, Bcl-xL 및 Akt 억제, 화학요법 민감성증진(chemosensitization), 및 고정 의존성을 유도하는 것을 추가로 발견하였다. 따라서, 본 발명은 고형 종양 및 암의 예방 또는 치료 및 종양 세포의 화학요법 민감성증진을 위해 인간 CLPTM1L을 표적화하기 위한 면역글로불린, 조성물, 및 상기 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "고형 종양"은 낭종 또는 액체 영역을 일반적으로 함유하지 않는 조직의 이상 종괴를 나타낸다. 비암성 종양은 "양성"으로 기재되는 한편, 암성 종양은 "악성"으로 기재된다. 결합조직 세포(예를 들어, 골 연골, 지방)으로부터 형성된 육종, 상피 조직 세포(예를 들어, 유방, 결장, 췌장)으로부터 형성된 암종, 및 림프 조직 세포(예를 들어, 림프절, 비장, 가슴샘)으로부터 형성된 림프종과 같이 고형 종양의 다양한 유형이 이들을 형성하는 특정 세포에 대해 명명된다. 고형 종양의 모든 유형의 치료는 본 발명의 범위 내이다.
인간 CLPTM1L 유전자(SEQ ID NO:1; Genbank ID AAH25305.1)는 538개의 아미노산 폴리펩티드(SEQ ID NO:2; UniProt ID: Q96KA5.1)를 인코딩한다. 인간 CLPTM1L의 유전자 생성물은 일차 mRNA(Genbank ID BC016399.1; SEQ ID NO:3) 및 2개의 추가의 예측된 전사물 스플라이스 변이체(Ensembl transcript IDs: ENST00000320927 및 ENST00000507807)를 포함한다. 이들 예측된 스플라이스 변이체는 각각 502개 및 369개의 아미노산의 단백질을 인코딩한다. 스플라이스 변이체 예측 방법은 useast.ensembl.org/info/docs/genebuild/genome_annotation.html의 월드 와이드 웹 상에서 이용 가능하다.
본 발명의 조성물
한 양태에서, 본 발명은 CLPTM1L 폴리펩티드의 적어도 일부에 대한 특이성을 갖는 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 다양한 임상적 적용을 위한 치료제 및 약학적 조성물로서 유용하다. 특히, 하나 이상의 CLPTM1L 에피토프에 대한 특이성을 갖는(즉, 하나 이상의 CLPTM1L 에피토프로 표적화된) 항체, 항체 단편, 면역컨쥬게이트, 이특이적 항체, 삼특이적 항체, 및 키메라 항원 수용체를 포함하는 하나 이상의 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 치료 조성물이 본원에 제공된다. 하나 이상의 CLPTM1L-표적화 펩티드를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 본원에서 사용되는 CLPTM1L-표적화 작용제는 CLPTM1L 폴리펩티드 또는 CLPTM1L 폴리펩티드 또는 이의 단편의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하고/하거나 CLPTM1L 폴리펩티드 또는 이의 단편의 하나 이상의 에피토프에서의 결합에 대해 경쟁하는 분자 또는 복합체이다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 단수의 "폴리펩티드" 뿐만 아니라 복수의 "폴리펩티드"를 포함하는 것으로 의도되며, 아미드 결합(펩티드 결합으로도 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)으로 구성된 분자를 나타낸다. 용어 "폴리펩티드"는 2개의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 나타내고, 특정 길이의 생성물을 나타내지는 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 나타내기 위해 사용되는 임의의 다른 용어가 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 이들 용어 중 임의의 용어 대신, 또는 이들 용어 중 임의의 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해성 분해, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는 폴리펩티드의 발현후 변형의 생성물을 나타내고자 한 것이다. 폴리펩티드는 자연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있으나, 지정된 핵산 서열로부터 반드시 번역되지는 않는다. 이는 화학적 합성을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체" 및 "항체들"은 "면역글로불린" 및 "면역글로불린들"과 동의어이며, 상기 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "항체" 및 "항체들"은 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체(mAb)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 전체 면역글로불린을 포함한다. 용어 항체는 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 광범위한 부류의 폴리펩티드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε ν)과 함께 이들 중의 일부 서브클래스(예를 들어, γ1-γ4)로 분류되는 것을 인지할 것이다. 항체의 "부류"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로 결정하는 것은 상기 사슬의 특성이다. 면역글로불린 서브클래스(아이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5 등은 잘 특성규명되어 있고, 기능적 특수화를 부여하는 것으로 공지되어 있다.
본 발명에 적절한 항체는 또한 항체 단편 또는 이의 변형된 생성물을 포함하나, 단, 이들은 본 발명에서 적합하게 사용될 수 있어야 한다. 적절한 항체 단편은 면역글로불린의 적어도 하나의 가변 도메인, 예를 들어, 단일 가변 도메인 Fv(Skerra & Pluckthun, Science 240:1038-41 (1988)), scFv(Bird et al., Science 242:423-26 (1988); Huston et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-83 (1988)), Fab, (Fab')2 또는 다른 단백질 분해성 단편을 포함한다. 용어 "항체" 및 "항체들"은 키메라 항체; 인간 및 인간화 항체; 재조합 및 공학 처리된 항체, 컨쥬게이션된 항체, 및 이들의 단편을 추가로 포함한다. 인간화 항체는 인간이 아닌 포유동물로부터의 항체(예를 들어, 마우스 항체)의 상보성 결정 영역(CDR)이 인간 항체의 CDR로 전달된 항체이다. 키메라 및 인간화 항체는 표준 프로토콜, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332호에 개시된 프로토콜에 따라 제조될 수 있다. 다른 항체 포맷은, 예를 들어, 문헌["Antibody Engineering," McCafferty et al. (Eds.) (IRL Press 1996)]에 기재되어 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 방사성 물질, 및 약물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 분자에 일부 방식으로 컨쥬게이션되거나 결합된 CLPTM1L-표적화 면역글로불린이 본 발명에 또한 포함된다. 상기 컨쥬게이션된 항체는 CLPTM1L-표적화 면역글로불린을 화학적으로 변형시킴으로써 획득될 수 있다. 컨쥬게이션된 항체를 획득하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있고 이용 가능하다.
본 발명의 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 바람직하게는, CLPTM1L-표적화 면역글로불린은 모노클로날 면역글로불린이다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생성시키는 방법은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,824,780호에 일반적으로 기재되어 있다. 통상적으로, 본 발명의 항체는 하기에 추가로 기재되는 바와 같은 당 분야에서 이용 가능한 벡터 및 방법을 이용하여 재조합적으로 생성된다. 인간 항체는 또한 시험관 내 활성화 B 세포에 의해 생성될 수 있다(미국 특허 번호 5,567,610호 및 5,229,275호 참조). 인간 항체는 또한 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에서 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 점라인 돌연변이 마우스에서의 항체 중쇄 연결 영역(JH) 유전자의 동형접합 결실이 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 발생시키는 것으로 기재되었다. 인간 점라인 면역글로불린 유전자 어레이의 상기 점라인 돌연변이 마우스로의 전달은 항원 공격시 인간 항체의 생성을 발생시킨다. 예를 들어, 문헌[Jakobovits et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno ., 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,806호, 5,569,825호, 5,591,669호; 미국 특허 번호 5,545,807호; 및 WO 97/17852호를 참조하라. 상기 동물은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 인간 항체를 생성시키도록 유전공학 처리될 수 있다.
본원에 기재된 항체의 공급원은 본 발명에서 특별히 제한되지 않지만, 상기 항체는 바람직하게는 포유동물로부터 유래되고, 더욱 바람직하게는 인간으로부터 유래된다. 본 발명에 적절한 모노클로날 항체는 표준 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 표준 하이브리도마 방법은 생성되는 모노클로날 항체가 CLPTM1L 폴리펩티드에 특이적이고, 관련 단백질 사이에서 교차-반응성을 나타내지 않는 것을 보장하기 위해 차별적 결합 검정을 이용한다. 대안적으로, 본 발명에 적절한 모노클로날 항체는 항체 공학 처리 방법, 예를 들어, 파지 디스플레이를 이용하여 제조될 수 있다. 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 매우 특이적인 항체를 획득하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 여러 파지 항체 라이브러리가, 예를 들어, MorphoSys(Martinsried, Germany), Cambridge Antibody Technology(Cambridge UK) 및 Dyax(Cambridge Mass.)로부터 상업적으로 이용 가능하다. 적합한 파지 디스플레이 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,300,064호 및 5,969,108호, 및 문헌["Antibody Engineering," McCafferty et al. (Eds.) (IRL Press 1996))]에 기재되어 있다. 항체 중쇄 및 경쇄 유전자가 파지 항체로부터 회수된 후, 임의의 적합한 포맷의 항체, 예를 들어, 전체 항체, Fab 단편, scFv 등이 본 발명에 따라 사용하기 위해 제조될 수 있다.
본원에 개시된 항체는 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물 기원일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 뮤린, 당나귀, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 라마, 말, 또는 닭 항체이다.
본 발명에 적절한 폴리클로날 항체는 전통적인 동물-기반 방법을 이용하여 또한 제조될 수 있다. 예를 들어, 적절한 동물이 폴리펩티드 면역원(예를 들어, CLPTM1L의 펩티드)을 이용하여 면역화될 수 있다. 면역화된 동물에서의 폴리펩티드 항체 역가는 표준 기술, 예를 들어, 고정된 폴리펩티드를 이용한 효소 결합 면역흡착법(ELISA)을 이용하여 시간 경과에 걸쳐 모니터될 수 있다. 항원에 특이적인 항체는 포유동물(예를 들어, 혈액)으로부터 분리될 수 있고, 예를 들어, IgG 분획을 획득하기 위해 단백질 A 크로마토그래피를 포함하는 당 분야에서 실시되는 것에 공지된 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다. 일부 경우에, 면역화 후 적절한 시간에(예를 들어, 항체 역가가 가장 높은 경우), 항체-생성 세포는 동물로부터 획득될 수 있고, 모노클로날 항체를 제조하기 위해 이용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프" 또는 "항원 결정인자"는 면역글로불린 또는 항체가 특별히 결합하는 항원(예를 들어, CLPTM1L) 상의 부위를 나타낸다. 일반적으로, 에피토프는 독특한 공간적 입체형태의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 연속적 또는 비-연속적 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조하라. 본원에서 사용되는 용어 "특정 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합하는" 및 "특이적으로 결합하는"은 항원-결합 도메인을 통한 에피토프로의 항체 결합을 나타내며, 상기 결합은 항원-결합 도메인과 에피토프 사이에 일부 상보성을 수반한다. 일반적으로, 항체는 약 10-7 M 미만, 예를 들어, 약 10-8 M, 10-9 M, 또는 10-10 M 미만, 또는 그보다 낮은 친화성(일반적으로, 해리 상수 KD에 의해 표현됨)으로 특이적 또는 선택적으로 결합한다. 본원에서 사용되는 용어 "친화성"은 분자(예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 표적 또는 항원) 사이의 비-공유적 상호작용의 총 합계의 강도를 나타낸다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용되는 "결합 친화성"은 결합쌍의 일원 사이(예를 들어, 펩티드와 이의 표적 사이, 또는 항체와 이의 항원 사이)의 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 나타낸다. 용어 "KD" 및 "Kd"는 동의어이며, 특정 분자 X-결합 파트너 Y 상호작용의 해리 평형 상수를 나타낸다. 항체의 친화성은 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다. 항체 친화성을 결정하기 위한 다른 편리한 기술, 예를 들어, 문헌[Scatchard et al. (Ann. N.Y . Acad . Sci . USA 51:660 (1949))]에 기재된 것이 당 분야에 공지되어 있다. 항원, 세포 또는 이의 조직에 대한 항체의 결합 특성은 일반적으로, 예를 들어, 면역형광-기반 검정, 예를 들어, 면역조직화학(IHC), 및/또는 형광-활성화 세포 분류(FACS)를 포함하는 면역검출 방법을 이용하여 결정되고 평가될 수 있다.
예시적 구체예에서, 본 발명의 항체는 약 10-7 M 미만, 예를 들어, 약 10-8 M, 10-9 M, 또는 10-10 M 미만, 또는 그보다 낮은 값의 해리 평형 상수(KD)로 CLPTM1L에 결합한다.
표 1은 CLPTM1L-표적화 모노클로날 항체를 생성시키는데 유용한 에피토프의 아미노산 서열을 제시한다. "시작" 및 "종료" 위치는 SEQ ID NO:2로 기재된 인간 CLPTM1L(UniProt ID: Q96AK5-1)의 아미노산 서열에 비하여 넘버링된다.
표 1. 모노클로날 항체 생성을 위한 펩티드 및 에피토프
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실시예 섹션에 매우 상세히 기재된 바와 같이, 표 1의 음영진 박스에 제시된 에피토프가 다음과 같은 기준을 이용하여 모노클로날 항체 생성을 위해 먼저 선택되었다: (a) CLPTM1L의 예측 표면-노출 구형 도메인(예를 들어, 위치 32-284의 잔기) 내에 존재하는 에피토프; (b) 예측 당화 부위(예를 들어, 위치 91, 101, 및 229의 잔기)를 피하는 에피토프; (c) 예측 무질서 영역(예를 들어, 위치 141-162)을 피하는 에피토프; 및 (d) 친수성, 폴딩 잠재성, 및 항원 제시를 기초로 하여 높은 스코어의 아미노산 서열을 갖는 에피토프.
모노클로날 항체는 조직 배양으로 성장할 수 있는 골수종 세포와 항체-생성 B 세포를 융합시킴으로써 하이브리드 세포주를 생성시키는 과정인 하이브리도마 기술에 의해 획득될 수 있다. 생성된 하이브리도마 세포주는 단일 특이성의 모노클로날 항체를 생성시킨다.
예시적 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 화학적 또는 구조적으로 변형되거나, 컨쥬게이션되거나, 키메라화되거나, 인간화되거나, 달리 공학 처리된 항체인 CLPTM1L-특이적 면역글로불린(예를 들어, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체)을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 면역컨쥬게이트로서 변형된 CLPTM1L-특이적 항체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "면역컨쥬게이트"는 (1) 높은 특이성으로 항원(예를 들어, 암 세포 항원)에 결합하는 항체, (2) 효과기 분자, 및 (3) 링커를 포함하는 치료제를 나타낸다. 효과기 분자는 치료제, 프로드러그, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 개질제, 약학적 작용제, 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 효과기 분자는 항암 세포 활성을 갖는다. 예를 들어, 문헌[Smaglo et al., Nat. Rev. Clin . Oncol. 11(11):637-48 (2014)]을 참조하라.
적절한 링커는 티오에스테르 결합, 이황화 결합, 하이드라존 결합, 또는 펩티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 링커는 효과기가 통과 동안 항체로부터 분리되지 않고, 표적화된 암세포 또는 종양 기질로 효과기를 확실하게 방출시키는 것을 보장하도록 작동한다. 예를 들어, 개관을 위해, 문헌[Smaglo et al., Nature Reviews Clin . Oncol . 11:637-48 (2014)]을 참조하라. 임의의 특정 메커니즘 또는 작동 방식으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 면역컨쥬게이트는 특히 효과적인 항암제인 것으로 생각되는데, 이는 이들이 치료제(예를 들어, 화학요법제)의 효능 있는 항암 효과 뿐만 아니라 암세포 항원-특이적 모노클로날 항체의 매우 특이적인 암 표적화 특성을 갖기 때문이다. 예시적 구체예에서, 본 발명의 면역컨쥬게이트는 약리학적 작용제, 방사성동위원소, 및 독소로부터 선택된 치료제; CLPTM1L-특이적 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 모이어티; 및 링커를 포함한다.
일부 경우에, 본 발명의 CLPTM1L-특이적 면역글로불린은 이특이적 모노클로날 항체(BsMAb, BsAb)이다. 본원에서 사용되는 용어 "이특이적 모노클로날 항체", "BsMAb" 및 "BsAb"는 상호교환적으로 사용되며, 2개의 상이한 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 포함하는 공학 처리된 면역글로불린을 나타낸다. 따라서, 이특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적 이특이적 항체는 단일 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 상기 항체는 제1 항원 결합 부위와 제2 항원에 대한 결합 부위를 조합시킬 수 있다. 예를 들어, BsMAb는 암세포를 표적화하고 사멸시키기 위해 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 포식세포, 자연살세포, 호산구, 호염기구, 비만 세포) 및 암세포 항원(예를 들어, CLPTM1L)에 동시에 결합하도록 공학 처리될 수 있다.
본 발명의 이특이적 항체는 인간 또는 인간화 Fc 단편, 예를 들어, 인간 IgG Fc 단편을 추가로 포함할 수 있다. CLPTM1L-특이적 면역글로불린은 임의의 적절한 방법에 따라 인간화되거나, Fc 변형에 적용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 일반적으로 비-인간인 공급원으로부터 인간 항체로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 인간 항체를 나타낸다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 "유입" 가변 도메인으로부터 통상적으로 취해지는 "유입" 잔기로 종종 언급된다. 인간화는 전통적으로 인간 항체의 해당 서열을 유입 과가변 영역 서열로 치환시킴으로써 윈터(Winter) 및 동료의 방법에 따라 수행된다(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)). 따라서, 상기 "인간화" 항체는 실질적으로 덜 온전한 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 해당 서열로 치환된 키메라 항체(미국 특허 번호 4,816,567호)이다. 이특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이특이적 항체)로 제조될 수 있다. WO96/16673호에는 이특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체가 기재되어 있고, 미국 특허 번호 5,837,234호에는 이특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체가 개시되어 있다. 이특이적 항-ErbB2/Fcα 항체는 WO98/02463호에 제시되어 있다. 미국 특허 번호 5,821,337호에는 이특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체가 교시되어 있다. 전장 이특이적 항체의 전통적인 생성은 2개의 사슬이 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 한다(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)).
본원에서 사용되는 용어 "Fc" 단편은 이황화 결합에 의해 함께 고정된 2개의 중쇄(H)의 카르복시-말단 부분을 나타낸다. 항체의 효과기 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되며, 상기 영역은 또한 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해 인지되는 부분이다. Fc 영역은 효과기 영역으로의 결합을 개선시키거나 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Vincent and Zurini, Biotechnol. J. 7(12):1444-50 (2012)]을 참조하라. Fc 공학 처리의 다른 예는 면역글로불린 G(IgG)의 반감기를 변형시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 재이용(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 증가된 생체 내 반감기를 갖는 항체 단편이 미국 특허 번호 5,869,046호에 기재되어 있다. 또한, FcRn을 통한 IgG의 재이용을 향상시켜 추가 표적 분자로의 결합을 가능케 하기 위해 공학 처리된 pH-의존성 항원 결합이 적용될 수 있다. 개관을 위해, 문헌[Kaneko and Niwa, Biodrugs 25(1):1-11 (2011)]을 참조하라. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다.
임의의 특정 메커니즘 또는 작용 방식으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이특이적 모노클로날 항체가 증가된 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 나타내는 것으로 생각된다(Chames et al., mAbs 1:6, 539-547 (2009)). 따라서, 본 발명의 CLPTM1L-표적화 이특이적 모노클로날 항체의 유효 용량은 통상적인 모노클로날 CLPTM1L-특이적 항체의 유효 용량보다 적을 수 있다. 일부 경우에, 상기 이특이적 항체의 유효 용량은 통상적인 모노클로날 항체의 유효 용량보다 한 자릿수 이상 작다. 예를 들어, CLPTM1L-표적화 이특이적 모노클로날 항체의 유효 용량은 약 0.01 mg·m-2·d-1 (하루 당 체표면적 제곱미터 당 밀리그램)일 수 있다.
이특이적 항체는 또한 세포독성 작용제를 암세포에 국소화시키기 위해 이용될 수 있다. 이들 항체는 암/종양-결합 아암(arm) 및 세포독성 작용제(예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트, 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 갖는다.
이특이적 항체는 또한 2 초과의 결합가를 갖는 항체를 포함한다. 예를 들어, 이특이적 항체는 항체-매개 세포독성(표적 암세포 상의 종양-관련 항원과의 상호작용을 통함) 및 T-세포 매개 세포독성(세포독성 T 림프구의 인지를 통함) 뿐만 아니라 항-종양 면역학적 기억(Fc 영역과 부속 세포, 예를 들어, 대식세포 상의 마커의 상호작용을 통함)을 유도할 수 있는 본원에서 사용되는 항체인 삼기능성 하이브리드 항체를 포함한다. 문헌[Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)]을 참조하라. 예를 들어, CD16, CD19, 및 CD22에 대한 이특이적 및 삼특이적 항체는 B-세포 백혈병에 대해 자연살세포 활성을 활성화시키는 것으로 밝혀졌다(Gleason et al., Mol . Cancer. Ther. 11(12):2674-84 (2012)).
삼특이적 항체(삼기능성 하이브리드 항체로도 공지됨)는 각각이 대식세포 및 NK 세포의 효과적인 보충을 통해 추가 종양 사멸 능력 및 부속 세포, 예를 들어, 대식세포와의 직접 접촉을 통해 T 세포의 효과적인 공동-자극을 제공하는 상이한 항원 결합 특성을 갖는 모(parental) 마우스 IgG2a 및 래트 IgG2b 모노클로날 항체로부터 유래되는 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 종양 세포, T 세포, 및 부속 세포를 포함하는 3-세포 복합체를 형성시킴으로써, 삼기능성 하이브리드 항체는 효과적인 종양 세포 파괴에 필요한 협력된 신호전달 사건을 유도한다. 상기 중에서, 협력된 신호전달 사건은 포식작용 및 퍼포린-매개 괴사와 같은 파괴 과정을 조절하는 면역 효과기 메커니즘이다. 예를 들어, 융모막 배아 항원(CEA) 및 T-세포 공동-수용체 CD3 및 CD28을 표적화하는 삼특이적 항체는 CEA 양성 종양을 사멸시키기 위해 T 림프구를 보충하는 것으로 밝혀졌다(Wang et al., J Biochem. 135(4):555-65 (2004)).
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)를 향상시키기 위해 효과기 기능과 관련하여 변형된다. 이는 항체의 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)은 Fc 영역 내에 도입됨으로써 상기 영역에서 사슬간 이황화 결합 형성을 가능케 할 수 있다. 따라서, 생성된 동종이합체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 ADCC를 가질 수 있다. 문헌[Caron et al., J. Exp Med . 176:1191-1195 (1992)]을 참조하라. 향상된 항-감염 활성을 갖는 동종이합체 항체가 또한 문헌[Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이종이기능성 가교제를 이용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 가짐으로써 향상된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있는 항체가 공학 처리될 수 있다. 문헌[Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조하라.
다른 경우에, 본 발명의 CLPTM1L-특이적 항체는 키메라 항원 수용체 T 세포에서 구현된다. 본원에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체 T 세포"는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 유전공학 처리된 항체-T 세포 키메라를 나타낸다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 키메라 항원 수용체 T 세포는 CLPTM1L-특이적 항체의 항원 특이성 및 세포 면역의 다기능성 및 효능을 갖는 치료제이다. 키메라 항원 수용체 T 세포 치료를 위한 기술은 당 분야에 공지되어 있고 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌[Kenderian et al., Cancer Res. 74(22):6383-9 (2014)]을 참조하라.
예시적 구체예에서, 본원에 제공된 CLPTM1L-특이적 면역글로불린은, 예를 들어, 친화성 개선 또는 친화성 성숙에 의해 표적 항원에 대한 변경된 결합 특성 또는 증가된 친화성을 갖도록 변형된다. 본원에서 사용되는 용어 "친화성-성숙된 항체"는 치환을 갖지 않는 모(시작) 항체에 비해 항원에 대한 항체의 개선된 친화성을 발생시키는 가변 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 또는 이의 단편을 나타낸다. 항체 친화성 향상 기술은 당 분야에 공지되어 있고 이용 가능하다. 예를 들어, 무작위 돌연변이유발(Groves et al., J. Immunol . Methods, 313:129-39, 2006) 및 부위-특이적 돌연변이유발 방법(Barbas et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 91:3809-13, 1994)이 공지되어 있다. 일부 경우에, 이들 돌연변이유발 방법은 이후의 스크린을 위한 변이체의 라이브러리를 발생시키기 위해, 예를 들어, 시험관 내 디스플레이-기반 기술, 예를 들어, 파지 또는 리보솜 디스플레이와 조합된다(Almagro and Strohl, Antibody Engineering: Humanization, Affinity Maturation and Selection Methods. 307-327. In: Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic. Ed. Zhiqiang An. John Wiley & Sons, Inc. 2009). 바람직하게는, 본원에 기재된 바와 같은 친화성 개선 또는 친화성 성숙에 의해 획득된 변형된 항체는 시작 항체에 비해 표적 항원에 대한 2배, 5배, 10배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 10000배 또는 그 초과의 개선된 활성을 나타낼 것이다. 예를 들어, 문헌[Kaneko and Zurini]에는 치료 항체 최적화가 개관되어 있다.
일부 경우에, 본 발명의 면역글로불린은 하나 이상의 돌연변이를 갖는 CLPTM1L 폴리펩티드를 특이적으로 표적화한다. 표적화될 수 있는 CLPTM1L 폴리펩티드의 프레임쉬프트 및 미스센스 돌연변이는 표 2에 기재된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 아미노산 잔기 위치는 SEQ ID NO:2로 기재된 인간 CLPTM1L의 아미노산 서열에 비해 넘버링된다. 코딩 서열 돌연변이에 대한 뉴클레오티드 위치는 SEQ ID NO:1로 기재된 인간 CLPTM1L의 뉴클레오티드 서열에 비해 넘버링된다. 자율신경절, 유방, 중추신경계, 자궁내막, 신장, 대장, 간, 폐, 난소, 전립선, 피부, 위, 및 상기도의 종양에서 체세포 CLPTM1L 돌연변이가 발견되었다. 공지된 CLPTM1L 돌연변이 각각은 희귀하며(시험된 종양의 <3%), 이들 돌연변이의 기능성 효과는 공지되어 있지 않다.
표 2. 인간 종양에서의 공지된 프레임쉬프트 및 미스센스 돌연변이.
Figure pct00002
Figure pct00003
또 다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 CLPTM1L-특이적 면역글로불린에 컨쥬게이션된 나노입자를 제공한다. 일반적으로, 항체-컨쥬게이션된 나노입자는 높은 친화성으로 생물학적 장벽(예를 들어, 혈액뇌장벽(BBB))을 가로질러 표적에 결합할 수 있고, 따라서 분자 및 세포 표적화에 유리하다. 따라서, 본원에 제공된 항체-컨쥬게이션된 나노입자는 다양한 생의학적 적용, 예를 들어, 생체 내 진단, 임상 치료, 표적화된 약물 전달, 유전자 요법, 세포 표지/추적, 및 분자 영상화에 유용하다. 일부 경우에, 본 발명의 나노입자는 지질-기반 비히클(예를 들어, 리포솜, 고형 지질 나노입자, 마이셀); 중합체 담체, 예를 들어, 하이드로겔, 폴리머솜(polymersome), 덴드리머, 및 나노섬유; 금속 나노입자(예를 들어, 금, 은, 티타늄); 탄소 구조(예를 들어, 나노튜브, 나노혼(nanohorn), 나노다이아몬드(ND), 그래핌(grapheme)); 또는 무기 입자(예를 들어, 실리카)이다. 예를 들어, 문헌[Chow and Ho, Sci Transl Med 5:216rv4 (2013); Montenegro et al., Adv . Drug Delivery Rev. 65:677-688 (2013)]을 참조하라.
추가 양태에서, 본 발명은 CLPTM1L 폴리펩티드를 표적화하는 면역글로불린 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에서 사용되는 구 "약학적으로 허용되는"은 확실한 의학적 판단의 범위 내에서 합리적인 이익/위험 비와 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증이 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 작용제, 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 나타낸다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 CLPTM1L 아미노산 서열의 일부로 구성된 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 SEQ ID NO:4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25(표 1 참조)의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 제공한다. 본 발명의 추가의 CLPTM1L 펩티드는 상기 정의된 에피토프 특성에 따라 선택된 펩티드를 포함한다. 펩티드는 SEQ ID NO. 2의 8-22개의 아미노산 길이 부분일 수 있다. 일부 경우에, CLPTM1L 펩티드는 치료제로서 구현될 수 있다. 예를 들어, CLPTM1L 펩티드는 펩티드 백신, 리간드 차단 펩티드, 또는 경쟁 억제 펩티드로 구현될 수 있다. 상기 작용제는 폐암을 치료하거나 예방하기 위한 유용한 치료제인 것으로 예상된다. 펩티드 백신은 예방적 접근법에 특히 적용 가능하다. CLPTM1L 에피토프, CLPTM1L 면역글로불린, 또는 임의의 다른 CLPTM1L-표적화 치료제가 폐암, 자궁경부암, 골수모구 백혈병, 췌장암, 방광암, 신경아교종, 전립선암, 기저 세포 암종, 및 흑색종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 암 유형의 치료 또는 예방에 유용할 것임이 추가로 예상된다.
일부 경우에, 본 발명의 조성물은 CLPTM1L 표적 분자에 대한 특이성을 갖는 앱타머이다. 본원에서 사용되는 용어 "앱타머"는 앱타머를 특정 입체형태로 제한하는 독특한 구조적 특징으로 인해 특정 표적 분자(예를 들어, 단백질, 인지질, 철 채널, 핵산, 전체 세포)에 대한 높은 친화성 및 특이성을 갖는 구조화된 올리고뉴클레오티드-기반 또는 펩티드-기반 분자를 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 앱타머, 예를 들어, 리보핵산(RNA) 및 단일-가닥 데옥시리보핵산(ssDNA) 앱타머. 펩티드 앱타머는 단백질 스캐폴드에 대해 양 말단에 부착된 짧은 펩티드 영역을 포함하는 조합 단백질 분자이다. CLPTM1L 표적 분자에 대한 높은 친화성 및 특이성을 갖는 치료 앱타머를 설계하고 확인하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Rohloff et al., Molecular Therapy Nucleic Acids 3:e201 (2014); Zhu et al., Theranostics 4(9):931-944 (2014); Ellington and Szostak, Nature 346:818-822 (1990)]을 참조하라.
본원에 제공된 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 또는 담체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 공지된 바와 같은 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장성 작용제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 젤, 결합제, 부형제, 붕괴제, 윤활제, 감미제, 착향제, 염료, 이들의 유사 물질 및 조합물을 나타낸다(예를 들어, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립되지 않는 경우를 제외하고는, 치료 또는 약학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
선택된 투여 경로와 상관 없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 치료제 및/또는 본 발명의 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용되는 투여 형태로 제형화될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 하나 이상의 CLPTM1L-표적화 작용제, 화학요법제, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 화학요법제는 백금-기반 작용제, 예를 들어, 시스플라틴(cisplatin), 젬시타빈(gemcitabine), 및 카르보플라틴(carboplatin); 질소 머스터드 알킬화 작용제; 니트로소우레아 알킬화 작용제, 예를 들어, 카르무스틴(carmustine)(BCNU) 및 다른 알킬화 작용제; 항대사물질, 예를 들어, 메토트렉세이드; 퓨린 유사체 항대사물질; 피리미딘 유사체 항대사물질, 예를 들어, 플루오로우라실(5-FU) 및 젬시타빈; 호르몬성 항신생물제, 예를 들어, 고세렐린(goserelin), 류프롤리드(leuprolide), 및 타목시펜(tamoxifen); 자연 항신생물제, 예를 들어, 탁산(taxane)(예를 들어, 도세탁셀(docetaxel) 및 파클리탁셀(paclitaxel)), 알데스루킨(aldesleukin), 인터루킨-2, 에토포시드(etoposide)(VP-16), 인터페론.알파., 및 트레티노인(tretinoin)(ATRA); 항생 자연 항신생물제, 예를 들어, 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 및 미토마이신(mitomycin); 및 빈카 알칼로이드 자연 항신생물제, 예를 들어, 빈블라스틴(vinblastine) 및 빈크리스틴(vincristine)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 구체예에서, 본원에 제공된 본 발명의 조성물은 상기 확인된 것이 아닌 치료 약물 또는 프로드러그, 예를 들어, 화학요법제, 스캐빈저 화합물, 항생제, 항바이러스 작용제, 항진균제, 항염증제, 혈관수축제 및 항응고제, 암 백신 적용에 유용한 항원 또는 상응하는 프로드러그를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 다른 생물학적 활성 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물을 이용하는 방법
한 양태에서, 본 발명은 CLPTM1L을 억제함으로써 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 CLPTM1L을 표적화하고 이에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 또는 면역글로불린을 포함하는 조성물을 질병 또는 질환을 치료하거나 예방할 필요가 있는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 CLPTM1L 단백질 기능이상(예를 들어, 병원성 생성, 변형, 또는 기능) 또는 CLPTM1L과 유전적 관련성이 존재하는 질병 또는 질환(예를 들어, CLPTM1L 유전자좌 카피수의 증가와 관련된 질병 또는 질환 또는 상기 질병 또는 장애에 대한 민감성이 있는 유전자형)을 갖거나, 이들을 갖는 것으로 의심되거나, 이들에 민감한 개체를 나타낸다. "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 또는 치료가 요망되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 축우, 소 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는", "치료하다" 및 "치료"는 질병, 질환, 또는 장애와 싸우기 위한 목적의 환자의 취급 및 관리를 나타낸다. 상기 용어는 방지, 즉, 예방적 치료 및 완화 치료 둘 모두를 포함한다. 일부 경우에, 용어 "치료된"은 질병 또는 질환의 진행에 대한 임의의 이로운 효과를 나타낸다. 이로운 효과는 용어가 적용되는 질병 또는 질환 또는 상기 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 소견을 역전시키거나, 경감시키거나, 이들의 진행을 억제하거나, 이들을 예방하거나, 이들의 가능성을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 질병 또는 질환이 종양, 암, 또는 암-관련 질환인 경우, 치료는 암과 싸우기 위한 목적의 환자의 취급 및 관리를 나타낼 수 있고, 암 또는 암-관련 질환의 임의의 양태(예를 들어, 전이, 종양 성장)를 역전시키거나, 경감시키거나, 이들의 진행을 억제하거나, 이들을 예방하거나, 이들의 크기를 감소시키거나, 이들의 가능성을 감소시키거나, 이들의 중증도를 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 환자의 건강 및 웰빙에 대한 치료적으로 이로운 효과는 (1) 암의 치료; (2) 암의 진행의 늦춤; (3) 종양 퇴행 야기; 또는 (4) 암의 하나 이상의 증상의 경감을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "예방하는" 및 "예방하다"는 특정 질병 또는 질환의 완전한 예방 뿐만 아니라 상기 용어가 적용되는 질병 또는 질환의 부분적 또는 실질적인 약화, 이들 위험의 감소, 또는 이들의 발생 또는 재발의 지연을 나타낸다.
일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 본원에 제공된 조성물을 투여함으로써 대상체의 종양 암을 치료하거나 예방하는 것에 관한 것이다. 예시적 구체예에서, 상기 방법은 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체로 투여하여 대상체에서 고형 종양을 치료하거나 예방한다. 본원에서 사용되는 용어 "암"은 고형 종양 및 혈행성 종양(예를 들어, 백혈병)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 용어 암은 피부, 조직, 기관, 뼈, 연골, 혈액, 및 혈관의 질병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 용어는 일차 및 전이성 암 둘 모두를 추가로 포함한다. 따라서, 일부 경우에, 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 암을 치료하거나 예방하는 방법은 종양 또는 종양 세포의 성장을 억제하거나, 지연시키거나, 예방하는 방법을 포함한다. 이를 필요로 하는 대상체는, 예를 들어, 종양, 예를 들어, 전암성 종양, 암(예를 들어, 비소세포폐암)으로 진단된 적이 있는 대상체, 또는 치료된 적이 있는 대상체, 예를 들어, 이전 치료에 난치성이었던 대상체를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본 발명에 적절한 고형 종양은 고형 종양이 치료에 반응하지 않는 것을 의미하는 "난치성" 또는 "내성" 고형 종양인 것으로 고려된다. 종양은 치료 시작시에 내성일 수 있거나, 이는 치료 동안에 내성이 발생할 수 있다. 본원에 기재된 CLPTM1L-표적화 작용제의 치료 및/또는 예방적 투여에 민감한 임의 및 모든 종양은, 물론, 본 발명의 범위 내인 한편, 본원에 제공된 조성물 및 방법이 난치성 종양의 치료에서 특히 유용할 것이 예상된다.
본원에 제공된 방법은 CLPTM1L 단백질 기능이상(예를 들어, 병원성 생성, 변형, 또는 기능)과 관련된 질병 또는 질환 또는 CLPTM1L과 유전적 관련성이 존재하는 임의의 질병 또는 질환(예를 들어, CLPTM1L 유전자좌 카피수의 증가와 관련된 질병 또는 질환 또는 상기 질병 또는 장애에 대한 민감성이 있는 유전자형)의 임의의 유형을 치료하거나 예방하기에 적절하다. 예시적 구체예에서, 본원에 제공된 방법은 암, 종양(예를 들어, 고형 종양), 또는 신생물전 병변(예를 들어, 전암성 병변)의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 본원에 제공된 바와 같은 치료 또는 예방 방법에 적절한 암의 예는 폐암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 방광암, 신장암, 난소암, 결장암, 결장직장암, 유방암, 자궁경부암, 뇌암, 식도암, 및 위암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 고형 종양은 폐, 췌장, 전립선, 유방, 신장의 암 및 신생물전 병변, 및 다른 육종, 암종, 및 아교모세포종과 관련될 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 치료 또는 예방 방법에 적절한 다른 질병 또는 질환은 림프종, 만성 백혈병, 및 급성 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하기 위해 실시될 수 있으며, 상기 질병 또는 질환은 화학요법 약물 내성을 나타낸다. 예를 들어, 대상체는 화학요법제, 예를 들어, 시스플라틴 또는 젬시타빈에 대한 내성을 나타내는 질병 또는 질환, 예를 들어, 암을 갖는 것으로 진단되거나 확인될 수 있다. CLPTM1L은 시스플라틴 내성 난소 종양 세포주에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 또한, CLPTM1L은 유전자독성 조건하에서 항-아폽토시스성인 것으로 보인다. 치료가 시스플라틴을 투여하는 것을 수반하는 암의 예는 폐암, 결장직장암, 비소세포폐암(NSCLC), 세기관지폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 및 항문 부위 암, 복부암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 자궁관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상샘암, 부갑상샘암, 부신암, 연조직 육종, 전립선암, 방광암, 신장암, 콩팥 세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담도암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, CNS 신생물, 척추축 암, 뇌간교종, 다형성아교모세포종, 별아교세포종, 신경집종, 뇌실막종, 수모세포종, 수막종, 편평세포 암종 및 뇌하수체 샘종 종양 또는 종양 전이를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 K-Ras, H-Ras, N-Ras, RASSFI, PI3KCA, PTEN, EGFR, FGFR1, PDGFRA, BRAF, AKL, ROS1, BCL-x, BIM, BAD, BAX, AKT, 및 mTOR 중 적어도 하나의 적어도 일부의 돌연변이, 전위, 증폭, 또는 결실과 관련된 암을 치료하거나 예방하기 위해 실시될 수 있다. 예시적 구체예에서, 본원에 제공된 방법은 상기 유전자 중 적어도 하나가 CLPTM1L에 의해 조절되는 것으로 의심되거나 CLPTM1L에 의해 조절되는 것으로 입증된 암을 치료하거나 예방하기 위해 실시될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 방사선 요법에 이전에 적용되었거나 현재 적용되는 암을 치료하거나 예방하기 위해 실시될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "방사선 요법"은 이온화 방사선을 이용한 고형 종양 및 암의 치료의 임의의 방식을 나타내며, 외부 빔 방사선요법, 정위 방사선요법, 가상 치료, 3차원 입체조형 방사선요법, 강도-조절 방사선요법, 이온화 입자 요법, 및 방사성동위원소 요법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 경우에, 본원에 제공된 방법은 화학요법제, 예를 들어, 알킬화제, 가교제, 항-대사물, 항생제, 국소이성화효소 억제제, 또는 유사분열 억제제를 이용한 화학요법에 이전에 적용되었거나 이에 현재 적용되는 암을 치료하거나 예방하기 위해 실시될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "화학요법제"는 종양 또는 암으로 고통받는 환자에 치료적 유효량으로 투여되는 경우 환자의 건강 및 웰빙에 대해 치료적으로 이로운 효과를 갖는 임의의 물질을 나타낸다. 환자의 건강 및 웰빙에 대한 치료적으로 이로운 효과는 (1) 암의 치료; (2) 암의 진행의 늦춤; (3) 종양 퇴행 야기; 또는 (4) 암의 하나 이상의 증상의 경감을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용되는 화학요법제는 또한 고형 종양으로 괴로워하거나, 하나 이상의 치료적 치료 요법의 결과로서 암이 실질적으로 없어진 환자에 예방적 양으로 투여되는 경우 환자의 건강 및 웰빙에 이로운 효과를 갖는 임의의 물질을 포함한다.
상기 방법은 또한 상기 치료제의 사용이 예견되는 경우 암을 치료하거나 예방하기 위해 실시될 수 있다. 예를 들어, CLPTM1L 표적화가 암세포를 DNA 손상-유도 아폽토시스에 민감화시키는 본원에 제공된 방법은 암을 치료하거나 예방하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "민감화시키다" 및 "민감화된"은 세포가 작용제, 치료, 환경, 자극, 또는 조건에 더욱 반응성이 된 것을 나타낸다. 예를 들어, "민감화된" 세포는 상기 반응의 정도에서의 증가 또는 임의의 유형의 반응에서의 증가를 나타낼 수 있다. 예시적 구체예에서, 암세포는 본원에 제공된 방법에 따라 CLPTM1L을 표적화시킴으로써 DNA 손상에 민감화되는 경우에 증가된 아폽토시스를 나타낸다.
일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 하나 이상의 화학요법제, 예를 들어, 알킬화제, 가교제, 항-대사물, 항생제, 국소이성화효소 억제제, 또는 유사분열 억제제에 대해 난치성인 것으로 의심되거나 난치성인 것으로 입증된 암을 치료하거나 예방하기 위해 실시될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린을 이용하여 CLPTM1L을 표적화시키는 것이 암세포를 가교제 및 국소이성화효소 억제제를 이용한 세포독성 치료에 민감화시키는 본원에 제공된 방법은 암을 치료하거나 예방하는데 적절할 수 있다.
예시적 구체예에서, 본원에 제공된 바와 같은 암을 치료하거나 예방하는 방법은 암을 치료하거나 예방할 필요가 있는 대상체에 2개 이상의 CLPTM1L-특이적 면역글로불린을 투여하는 것을 포함한다. 2개 이상의 CLPTM1L-특이적 면역글로불린은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 2개 이상의 CLPTM1L-특이적 면역글로불린을 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 면역글로불린은 CLPTM1L-발현 종양 세포의 화학요법제(예를 들어, 시스플라틴, 젬시타빈)에 대한 민감성을 증가시키는 능력 및/또는 CLPTM1L-발현 종양 세포에 대한 세포독성에 대한 향상된 능력에 대해 선택된다. 조합물은 다양한 폴리펩티드 또는 동일 폴리펩티드 상의 다양한 에피토프에 대한 특이성을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 상기 조합 요법은 종양 반응을 개선시키고, 단일 작용제에 대한 종양 세포의 내성을 역전시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌[Weiner et al., Nature Rev. Immunol. 10:317-327 (2010)]을 참조하라.
또 다른 양태에서, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 면역컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 면역컨쥬게이트는 효과적인 세포독성 및 항암 치료제이다.
추가 양태에서, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 활성화된 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 상기 활성화된 T 세포 치료 방법은 일반적으로 T 세포의 생체 외 활성화 및 확장을 포함한다. 예를 들어, 개관을 위해, 문헌[Slaney et al., Cancer Res. 74:7168-7174 (2014)]을 참조하라. 일부 경우에, T 세포는 대상체로부터 획득된 후, 생체 외에서 정제되고, 확장되고, 활성화된다. 활성화는 암세포-특이적 또는 종양 특이적 항원(예를 들어, 본원에 제공된 모노클로날 항체)의 존재하에서 정제되고 확장된 T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 생성된 활성화된 T 세포는 대상체로 다시 제공된다. 상기 방식으로 활성화된 T 세포는 향상된 면역자극 능력을 갖는다. 예시적 구체예에서, 본원에 제공된 방법에 따른 치료를 필요로 하는 대상체로부터 획득된 T 세포는 하나 이상의 CLPTM1L-특이적 모노클로날 항체(예를 들어, mAb 6-1, 10-2, 및 10-3)의 존재하에서 배양된다.
본원에 제공된 바와 같은 암을 치료하거나 예방하는 방법은 임의의 적절한 시간에서 실시될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 바와 같은 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물은, 예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 암 또는 신생물전 병변(예를 들어, 전암성 병변)의 진단 후에 대상체에 투여된다. 다른 경우에, 본원에 제공된 바와 같은 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물은 대상체로부터의 생물학적 샘플에서의 CLPTM1L의 카피수 증가 또는 발현의 확인 후에 대상체에 투여되며, 상기 발현의 수준은 암 위험을 구성하는 것으로 경험적으로 결정된 역치 초과이다.
상기 역치의 결정은 정상 조직에서의 CLPTM1L 발현과 암의 발병을 연관시키는 현재 및 이후의 데이터의 분석을 포함한다. 폐 조직과 관련하여, 암 위험을 구성하는 것으로 경험적으로 결정된 역치는 주위 조직으로부터 수득된 건강한 샘플에서의 평균 발현에 비한 하나 이상의 시험 폐 조직 샘플에 대한 적어도 2배 더 큰 평균 발현일 수 있다. 일부 경우에, CLPTM1L의 발현이 샘플링되는 조직 주위의 조직에 비해 시험 샘플(예를 들어, 암세포를 포함하는 것으로 의심되는 조직)에서 더 높은 것으로 결정되는 경우에 치료가 지정될 수 있다. 다른 경우에, CLPTM1L의 증가된 양이 종양 세포 표면에 존재하는 것으로 결정되는 경우에 치료가 지정될 수 있다. CLPTM1L의 상기 증가된 수준은, 예를 들어, 순환 종양 세포 또는 고형 종양에서 흐름세포측정법에 의해 검출될 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물은 암의 발달에 대한 하나 이상의 지표 또는 위험 요인의 확인시 또는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서의 암과 관련된 유전자형의 확인 후에 대상체에 투여될 수 있다. 종양 형성을 예방하거나 늦추기 위해, 본원에 제공된 바와 같은 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물이 암 또는 신생물전 병변 전에 또는 부재하에서 대상체에 투여된다. 이러한 경우에, 조성물은 예방제로서 투여된다.
본원에 제공된 방법에 따른 치료 또는 예방은 대상체가 수술, 방사선, 및/또는 화학요법에 의해 치료되기 전, 치료되는 동안, 또는 치료된 후에 발생할 수 있다. 일부 경우에, 화학요법 또는 방사선요법 전의 본원에 제공된 방법에 따른 치료는 통상적인 요법의 결과를 개선시킬 수 있다. 예시적 구체예에서, 본원에 제공된 바와 같은 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물은 하나 이상의 다른 치료제 또는 예방 수단, 예를 들어, 방사선요법, 화학요법, 또는 수술과 동시에 대상체에 투여된다.
본원에 제공된 바와 같은 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물은 의도된 목적을 달성하거나, 당업자에 의해 적절한 것으로 간주되는 임의의 방법에 의해 대상체에 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 의약으로서 투여될 수 있고, 경구 또는 비경구 투여를 통해 전신적 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "투여"는 경구 및 비경구 투여를 포함한다. 경구 투여는, 예를 들어, 경구 작용제의 투여를 포함한다. 상기 경구 작용제는, 예를 들어, 과립, 분말, 정제, 캡슐, 용액, 에멀젼, 및 현탁액을 포함한다. 비경구 투여는, 예를 들어, 주사액의 투여를 포함한다. 상기 주사액은, 예를 들어, 피하 주사액, 근내 주사액, 및 복막내 주사액을 포함한다. 일부 경우에, 정맥내 주사액, 예를 들어, 점적 주입, 근내 주사액, 복막내 주사액, 피하 주사액, 좌약, 관장제, 경구 장용 정제 등이 선택될 수 있다.
적절한 투여 방식은 종양의 신체 위치 또는 대상체의 신체 내의 종양을 기초로 하여 결정될 수 있다. 예시적 구체예에서, 본원에 제공된 바와 같은 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물은 폐암 또는 전암성 병변이 진단된 대상체에 투여되며, 조성물은 경구 또는 정맥내 투여된다. 대안적으로, CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물은 의도된 치료 영역으로 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물은 수술 동안 국소 주사에 의해 투여될 수 있다.
조성물은 각각의 별개의 투여 단위가, 일부 경우에, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여되는 경우에 요망되는 치료 효과를 유도하는 것으로 계산된 소정량의 활성 성분 또는 화합물을 함유하는 투여 단위 형태로 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다.
치료적 유효 용량은 증상의 개선, 예를 들어, 상기 질환의 치료, 치유, 예방 또는 개선에 충분한 화합물의 양을 나타낸다. 예시적 구체예에서, 치료적 유효량 또는 유효 용량은 자유 항체가 혈액 내에 존재하도록 하는 양이다. 투여량 결정을 위해, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 화합물의 독성 및 치료 효능을 평가하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, LD50(즉, 집단의 50%에 치사 용량) 및 ED50(즉, 집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)이 결정될 수 있다. 이들 계산으로부터, 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위가 공식화될 수 있다. 투여량 범위는 투여 방식과 같은 요인에 따라 다양할 수 있다. 본원에 제공된 약학적 조성물의 치료적 유효량은 대상체의 체중 kg 당 약 0.001 내지 100 mg의 항체(예를 들어, 약 0.01 내지 100 mg/kg 체중; 약 0.1 내지 40 mg/kg 체중; 약 1 내지 20 mg/kg 체중)의 범위일 수 있다.
일부 경우에, 모노클로날 항체에 대한 적절한 용량은 0.005 mg/kg으로부터 최대 용인 용량까지일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 바와 같은 약학적 조성물의 적절한 용량은 조성물이 투여될 대상체의 체표면적에 따라 결정될 수 있고, 대상체의 키 및 체중을 이용하여 계산될 수 있다. 이러한 경우에, 용량은 m2 당 조성물의 특정 양(예를 들어, mg/m2)으로 제공될 수 있다. 일부 경우에, 적절한 용량은 약 10 mg/m2 내지 약 40 mg/m2의 모노클로날 항체일 수 있다. 대상체의 체중의 킬로그램(kg) 당 밀리그램(mg)으로 전환되는 경우, 15 mg/m2의 용량은 약 0.4 mg/kg과 동일하다. 문헌[Freireich et al., Cancer Chemotherapy Rep. 50(4):219-244 (1966)]을 참조하라. 투여량 계산에 대한 추가 정보는 의약품 평가 연구 센터, 생물 의약품 평가 연구 센터(2002), 건강한 성인 지원자에서의 치료를 위한 임상 시험에서의 안전한 시작 용량 평가(Estimating the safe starting dose in clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers), 미국 식품의약국(Rockville, Maryland, USA)에서 발견될 수 있다.
본원에 제공된 바와 같은 모노클로날 항체를 포함하는 약학적 조성물의 질량은 항체 및 적용 가능한 경우 전달 작용제 또는 약학적으로 허용되는 담체의 질량을 나타낼 수 있음이 이해될 것이다. 일부 경우에, 본원에 제공된 조성물에 대해 적절한 투여량 및 투여량 범위는 약동학 데이터(즉, 약물 대사 및 청소)를 이용하여 결정될 수 있다. 본원에서 사용되는 "약동학"은 약물 또는 약학적 조성물이 신체로부터 흡수되고, 분포되고, 대사되고, 배출되는 과정을 나타낸다.
임상의, 의사, 및 다른 건강 관리 전문가는 의사 또는 다른 건강 전문가에 의해 본원에 제공된 방법에 따라 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여할 수 있다. 일부 경우에, 조성물의 단일 투여가 충분할 수 있다. 다른 경우에, 조성물의 1회 초과의 투여가 다양한 간격(예를 들어, 1주일에 1회, 1주일에 2회, 매일, 매월)으로 또는 임의의 다른 적절한 치료 요법에 따라 수행된다. 치료 기간은 단일 용량 또는 본원에 제공된 조성물의 투여가 대상체에 의해 용인되는 한 주기적인 다수의 용량일 수 있다.
본원에 제공된 방법에 따른 치료에 대한 대상체의 반응을 결정하거나, 검출하거나, 모니터하기 위해 임의의 적절한 방법이 실시될 수 있다. 본원에서 사용되는 "치료에 대한 대상체의 반응 결정"은 본원에 제공된 조성물의 투여 또는 본원에 제공된 방법에 따른 치료에 반응한 대상체에서의 치료의 결과의 평가를 나타낸다. 예를 들어, 대상체의 상태는 CLPTM1L에 표적화된 RNAi-유도 작제물을 포함하는 조성물에 반응한 대상체의 반응의 지표로서 질병 진행에서의 임의의 변화(예를 들어, 종양 크기에서의 변화)를 검출하고/하거나 모니터하기 위해 적절한 시간 간격(예를 들어, 규칙적 또는 불규칙적 시점)으로 지속적으로 모니터되거나 평가될 수 있다. 일부 경우에, 종양은, 예를 들어, 종양 크기 또는 종양 성장 속도(예를 들어, 종양 팽창 또는 수축, 억제되거나 가속화된 종양 성장 속도)에서의 임의의 변화를 검출하거나 모니터하기 위해 측정될 수 있다. 예를 들어, 전산화단층촬영법(CT), 자기 공명 영상화(MRI) 스캐닝, 및 x-선(예를 들어, 흉부 x-선)과 같은 검출 방법이 이용될 수 있다. 일부 경우에, 종양 퇴행을 검출하고 측정하거나, 병변의 진행을 검출하기 위해 초음파 시험이 이용될 수 있다. 다른 경우에, 종양 또는 신생물전 병변의 평가는, 예를 들어, 생검 샘플의 세포학 또는 조직학을 수반할 수 있다. 고형 종양에 대해, 본원에 제공된 바와 같은 치료에 대한 대상체의 반응의 평가는 RECIST("고형 종양에서의 반응 평가 기준")를 평가하는 것을 포함할 수 있다. RECIST 기준은 대상체의 질병 또는 질환을 치료하기 위해 이용되는 요법에 대한 대상체의 반응을 평가하기 위해 이용될 수 있다. 개관을 위해, 문헌[Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92:205-16, 2000]을 참조하라.
일부 경우에, 본원에 기재된 치료 또는 예방 방법의 효능을 검출하거나 모니터하기 위해 생체마커(예를 들어, mRNA, 단백질)가 이용될 수 있다. 예시적 구체예에서, 생체마커의 이용은 a) 본원에 제공된 조성물을 투여하고; b) 다양한 시점(투여 전, 동안 및/또는 후)에서 대상체로부터 채취된 하나 이상의 생물학적 샘플 내의 본 발명에 따른 생체마커의 수준을 결정하고; c) 특정 치료 단계 동안 획득된 생물학적 샘플에 대해 이루어진 결정을 비교하고, 이들을 대조군 또는 치료의 상이한 단계에서 획득된 대상체의 샘플에 대해 결정된 수준과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 뼈 및 혈액 종양에 대해, 생체마커를 이용하여 평가하는 것은 하나 이상의 종양 마커에 대한 발현 수준을 검출하거나 모니터하고, 예를 들어, 평균 혈소판 부피, 혈소판 수, 백혈구 수, 및 헤모글로빈 수준을 포함하는 혈액학적 지표를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법에 따라 CLPTM1L-특이적 작용제를 포함하는 조성물의 투여 후의 양성 결과의 다른 지표 또는 "효능 마커"는 (1) 종양 또는 표적 조직에서의 감소된 CLPTM1L 전사물 및/또는 단백질 수준 및 (2) 종양 또는 표적 조직에서의 감소된 인산화된 Akt 또는 Bcl-xL 단백질 수준을 포함할 수 있다. 이들 효능 마커는 생검, 흡인물, 또는 세척 후, 예시적 구체예에서, 특정 항체를 이용한 적절한 진단 시험, 예를 들어, PCR, 웨스턴 블로팅, 면역조직화학에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기재된 결과 기준 또는 평가 방법 중 임의의 것에 대한 양성 결과는 대상체의 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하기 위한 방법의 효능을 나타낸다.
본원에 제공된 방법에 따른 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물의 투여에 대한 양성 반응의 지표는, 예를 들어, 처리전 수준 또는 미처리 샘플에 비한 종양 또는 표적 조직에서의 CLPTM1L 전사물 및/또는 CLPTM1L 단백질 수준에서의 유의한 감소(예를 들어, 대조군 샘플에서의 발현의 약 60%-80%로 감소된 발현)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 조성물의 투여에 대한 양성 반응의 지표는 처리전 수준 또는 미처리된 샘플에 비한 종양 또는 표적 조직에서의 인산화된 Akt 및/또는 Bcl-xL 단백질의 유의하게 감소된 수준 또는 처리전 수준 또는 미처리된 샘플에 비한 종양 또는 표적 조직에서의 아폽토시스의 유의한 증가일 수 있다. RECIST 기준에 따르면, 치료에 대한 부분적 반응은 가장 긴 합계 직경을 기준선으로 참조로 하여 표적 병변의 가장 긴 직경의 합계에서의 적어도 30%까지의 감소로 나타날 수 있고, 치료에 대한 완전한 또는 실질적으로 완전한 반응은 치료 전 대상체에 대해 획득된 측정(즉, 기준선 측정) 또는 질병 진행에 있어서 대조군 또는 비교 감소에 비한 모든 표적 병변의 완전한 또는 거의 완전한 소실로 나타날 수 있다. 일부 경우에, 치료에 대한 반응은 본원에 기재된 조성물이 투여되지 않은 하나 이상의 대상체에 비해 평가된다. 본원에 제공된 방법에 따른 치료에 대한 대상체의 반응을 평가하기 위한 다른 파라미터는 전이 성장에서의 비교 감소를 검출하고; 고형 종양에 대한 RECIST 기준에서의 임의의 개선을 검출하고; 단기 또는 장기 생존을 기록하고; 무질병 생존을 기록하고; 종양 마커의 증가되거나 감소된 발현을 검출하고; 혈액 및 골 암에 대한 혈액학적 변화를 검출하고; 방사선요법 및/또는 화학요법에 대한 양성 또는 음성 반응을 검출하거나 모니터하고; 치료된 질병 또는 질환의 재발에서의 증가 또는 감소를 검출하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법에 따라 치료된 대상체는 치료가 시작된 이후로 가장 작은 합계의 가장 긴 직경을 참조로 하여 부분적 반응에 적격인 충분한 수축 또는 진행성 질병에 적격인 충분한 증가가 없는 안정적 질병의 징후를 나타낼 수 있다(Therasse et al., 상기).
특정 요법에 대한 대상체의 반응의 결정은 종양학에서 사용되고, 당업자에 의해 공지된 임의의 평가 기준을 이용하여 결정될 수 있다. 질병의 진행을 기재하기에 유용한 평가 파라미터는 본원에서 사용되는 바와 같은 연구 중인 기간 동안 질병 재발을 겪지 않은 완전 완화 상태의 대상체의 비율을 기재하는 무질병 진행; 본 발명에서 사용되는 바와 같은 완전한 또는 부분적 반응이 관찰된 치료된 대상체의 비를 기재하는 목표 반응; 본 발명에서 사용되는 바와 같은 완전한 반응, 부분적 반응, 약간의 반응 또는 안정적 질병이 6개월 이상 동안 관찰된 치료된 사람의 비에 관한 종양 조절; 본원에서 사용되는 바와 같은 치료 시작으로부터 암 성장의 첫번째 측정때까지의 시간으로 정의되는 무진행 생존을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 대상체의 반응은 진행까지의 시간 및 생존으로부터 선택된 파라미터에 의해 결정된다. 예시적 구체예에서, 본원에 제공된 치료 또는 예방 방법에 대한 대상체의 반응은 통계적으로 유의해야 한다. 반응이 통계적으로 유의한지의 여부의 결정은 통계적 평가 도구, 예를 들어, 신뢰 구간, p 값의 결정, 스튜던츠 t-검정(Student's t-test), 만-휘트니(Mann-Whitney) 검정 등을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직한 신뢰 구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%이다. 바람직하게는, p 값은 0.2, 0.1, 또는 0.05이다.
대상체가 치료되는 동안, 24시간의 기간 동안 소정의 시간에서 관련 지표 중 하나 이상을 측정함으로써 대상체의 건강이 모니터될 수 있다. 투여 및 제형의 보충, 양, 시간을 포함하는 모든 치료 양태는 상기 모니터링 결과를 기초로 하여 최적화될 수 있다. 동일 파라미터를 측정함으로써 개선의 정도를 결정하기 위해 환자는 주기적으로 재평가될 수 있다. 예를 들어, 첫번째 상기 재평가는 요법 개시 후 적절한 기간의 종료시(예를 들어, 약 2주, 약 4주, 약 8주 또는 그 초과)에 발생할 수 있고, 이후의 재평가는 그 이후의 적절한 간격(예를 들어, 요법 동안 4 내지 8주 마다 및 이후 3, 6, 9 또는 그 초과의 개월 마다)으로 발생할 수 있다.
관사는 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)의 상기 관사의 문법적 대상을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, "항체"는 하나의 항체 또는 하나 초과의 항체를 의미한다. 이와 같이, 용어 관사, "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명은 다양한 변형 및 대안적 형태가 가능하나, 이의 특정 구체예는 도면에서 예로서 제시되며, 본원에서 상세히 기재된다. 그러나, 특정 구체예의 본원의 기재는 본 발명을 개시된 특정 형태로 제한하고자 하는 것이 아니라, 반대로, 첨부된 청구항에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 사상 및 범위 내에 해당하는 모든 변형, 동등물 및 대안을 포함하고자 하는 것이 이해되어야 한다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 고려하여 더욱 충분히 이해될 것이다.
실시예
실시예 1 - CLPTM1L의 구조적 분석
본 발명자는 질량분광법에 의해 확인된 6개의 막횡단 도메인, 세포외 구형 도메인(ECR1 및 ECR2), 무질서 영역, 및 N-당화 세포-표면 펩티드를 포함하는 CLPTM1L의 기본 구조 모델을 생성시켰다(도 2a). ECR1 및 엑손 1, 2, 및 9가 결여된 CLPTM1L의 추정의 대안적으로 스플라이싱된 아이소형이 있다(도 2b). 당화된(N-결합된) 아미노산 잔기가 인간 CLPTM1L 단백질 서열의 위치 91, 101, 및 229에서 예측된다(SEQ ID NO:2). 당화의 질량분광법 증거가 인간 CLPTM1L의 아미노산 잔기 91(제시되지 않음) 및 잔기 229에 대해 보고되었다(Chen et al., J Proteome Res. 2009;8:651-61). 형질막 단백질에 대해, 이는 당화된 영역의 세포외 배향을 강하게 나타낸다. 이러한 세포외 영역은 더 큰 세포외 영역 내에 작은 무질서 영역(아미노산 잔기 142-162)에 의해 분리된 2개의 별개의 구형 도메인을 포함하는 것이 예측된다(도 1).
CLPTM1L의 본 발명의 분석은 형질막 국소화 및 세포 표면 노출의 가능성을 암시하였으나, CLPTM1L의 세포하 국소화는 잘 연구되지 않았고, 형질막 국소화는 이전에 보고된 적이 없다. 한 연구는 CLPTM1L이 미토콘드리아로 국소화될 수 있음을 암시하였다. 문헌[Ni et al., PLoS One 7:e52598, 2012]을 참조하라. 종양 세포의 표면에서의 CLPTM1L 노출에 대한 잠저성은 외인성 작용제를 상기 단백질을 표적화시키는 능력과 유의한 관련성을 갖는다.
모노클로날 항체는 정의를 내릴 수 있고, 불변하고, 재현성 있고, 조작될 수 있으므로, 본 발명자는 인간 CLPTM1L 단백질을 표적화하는 모노클로날 항체의 패널의 생성으로 축소시켰다. 모노클로날 항체를 생성시키는 것에 대한 펩티드 에피토프의 설계는 여러 요인을 고려하였다. 본 발명자는 당화 부위(91, 101, 229)를 피하고, 무질서 영역(141-162)을 피하고, 친수성, 폴딩 잠재성, 및 항원 제시를 기초로 하여 높게 스코어링된 아미노산 잔기를 우선시켜 CLPTM1L의 세포 표면 노출된 구형 도메인(잔기 32-284) 내에 존재하도록 에피토프를 설계하였다. 각각이 11개의 아미노산 길이인 8개의 에피토프를 모노클로날 항체 생성을 위해 선택하였다(도 3; 표 1의 음영진 박스를 또한 참조). 폴리클로날 항체는 8-22개의 아미노산의 펩티드에 대해 발생될 수 있는 한편, 특정 모노크로날 항체 생성을 위해 9-11개의 아미노산의 에피토프가 통상적으로 선택된다. 유사한 파라미터를 기초로 하여 선택된 다른 잠재적 에피토프가 표 1의 음영지지 않은 박스 내에 제시된다.
종양 세포의 표면에서의 CLPTM1L의 국소화를 확인하기 위해, 본 발명자는 비오티닐화 및 스트렙타비딘 수지를 이용한 추출에 의해 A549 인간 폐 종양 세포로부터 세포-표면 단백질을 분리시켰다. 전체 세포 및 세포-표면 용해질의 웨스턴 분석은 세포 표면에서의 CLPTM1L의 우세함을 입증하였다(도 4a). 세포-표면 국소화된 대조군으로 사용되는 EGFR은 전체 세포 용해질 신호에 비해 CLPTM1L보다 적은 강도로 세포-표면에서 검출되었다. 핵 단백질 대조군으로 사용된 사이클린 D1은 세포 표면에서 검출되지 않았다. CLPTM1L에 대한 투과화되지 않은 A549 세포의 면역형광 염색은 반점의 세포-표면 염색 패턴을 나타내었다(도 4b).
CLPTM1L의 세포외 구형 도메인을 표적으로 하는 모노클로날 항체의 본 발명의 패널을 CLPTM1L의 검출 및 표면 CLPTM1L의 면역형광 표지화에 대해 시험하였다. 모든 항체는 웨스턴 블롯에 의해 62-킬로달톤의 CLPTM1L 단백질을 강하게 검출하였다(도 4c; 일부 데이터는 제시되지 않음). 모든 항체는 투과화되지 않은 A549 세포에 대한 면역형광에 사용된 경우 세포-표면 염색 패턴을 발생시켰고, ECR2를 표적으로 하는 항체는 더욱 명백한 반점의 염색을 나타내었다(도 4d; 일부 데이터는 제시되지 않음).
실시예 2 - CLPTM1L 모노클로날 항체의 시험관 내 분석
CLPTM1L 발현이 애쥬번트 요법으로 치료된 K-Ras 유래 췌장암과 관련되었는지의 여부를 결정하기 위해, 본 발명자는 매치된 생존 데이터를 이용하여 31명의 환자에 대한 이용 가능한 췌장 마이크로어레이를 이용하였다. CLPTM1L 면역조직화학(IHC)에 적용된 종양의 염색 강도가 3명의 병리학자에 의해 스코어링되었고, 스코어의 평균을 내었다. 염색은 정상 도관 상피에서 균일하게 음성이었던 반면, 종양 세포의 94%(29/31)에서는 양성이었다(r=0.78, p<5x10-10)(도 5a). 종양을 음성(0), 약함(+1), 중간(+2) 또는 강함(+3)으로 스코어링하였다. 독립된 스코어를 평균을 내었다. 종양은 1.46의 평균 스코어를 가진 반면, 정상 도관 상피의 스코어는 0이었다(p<0.05). 1.15 이하의 평균 스코어로 정의된 바와 같은 CLPTM1L의 낮은 수준을 발현하는 종양은 증가된 생존과 관련된 반면, 더 높은 발현을 갖는 환자는 더 짧은 생존 시간을 가졌다. 종양 조직에서 낮은 CLPTM1L 발현을 나타내는 환자는 24개월의 중간 생존을 갖는 반면, 종양 조직에서 중간 및 높은 CLPTM1L 발현을 갖는 환자는 각각 11 및 14개월의 중간 생존을 가졌다(도 5b). CLPTM1L 항체로 염색된 대표적 조직이 도 5c에 제시되어 있다.
본 발명자는 종양 세포에서의 CLPTM1L 표적화가 Bcl-xL 및 Akt 생존 신호전달을 조절하고, 시스플라틴을 이용한 사멸에 세포를 민감화시키는 것을 이전에 입증하였다. 인간 CLPTM1L의 아미노산 잔기 18-307에 대해 발생된 폴리클로날 항체를 0, 1, 및 5 ㎍/mL의 농도로 A549 인간 폐 종양 세포에 적용시켰다. 폴리클로날 항체 처리를 이용한 48시간 동안의 배양 후, 웨스턴 블로팅을 Bcl-xL, 전체 Akt1, 및 포스포-Akt1에 대해 수행하였다. 항-CLPTM1L 처리를 이용한 Bcl-xL 및 Akt1 둘 모두의 축적에서의 용량 의존적 감소가 관찰되었다(도 6a). 시스플라틴에 대한 민감성에서의 폴리클로날 항체를 이용한 처리의 효과를 결정하기 위해, 세포를 24시간 동안 0.01 내지 1 ㎍/mL의 항-CLPTM1L의 희석액으로 처리하였다. 이후, 세포를 48시간 동안 0, 10, 및 20 μM 농도의 시스플라틴에 노출시켰다. 항-CLPTM1L을 이용한 처리는 시스플라틴 처리 후의 세포 생활력에서의 감소를 발생시켰고, 이는 항체의 용량에 의존적이었다(도 6b). 이들 결과는 항체를 이용한 시스플라틴 사멸에 대한 민감화를 입증한다.
모노클로날 항-CLP(10-2)를 이용한 처리는 젬시타빈에 의한 사멸(72시간 동안 500 μM)에 대한 췌장 샘암종 세포의 민감성을 증가시켰고(도 6c), 또한 인산화된 Akt의 축적을 감소시켰다(도 6d).
또한, 본 발명의 모노클로날 항체의 패널을 이용한 A549 및 H838 인간 폐 종양 세포의 처리는 다양한 효능으로 Bcl-xL 및 Akt 인산화의 고갈을 발생시켰다. 웨스턴 분석은 에피토프 6 및 10을 표적으로 하는 항체를 이용한 처리가 Bcl-xL 및 포스포-Akt1 축적에서의 용량 의존적 감소를 발생시킨 것을 나타내었다. 마찬가지로, 시스플라틴 사멸에 대한 민감화는 항-CLPTM1L 모노클로날 항체를 이용한 종양 세포의 처리에 의해 달성되었다. 에피토프 10에 대해 발생된 모노클로날 항체는 A549 세포의 비부착 성장을 효과적으로 억제하였다. CLPTM1L의 세포외 도메인에 대해 발생된 모든 모노클로날 항체 중에서, 에피토프 10에 대해 발생된 것만 H838 세포의 비부착 종양 구형 성장을 억제하는데 효과적이었다. 각각의 항체 클론에 대한 상기 결과의 요약이 도 10에 제공된다.
도 8에 제시된 바와 같이, 본 발명자는 또한 모노클로날 항-CLPTM1L 항체를 이용한 처리가 췌장 종양 세포의 콜로니 성장을 억제한 것을 발견하였다. Panc1 췌장 샘암종 세포를 낮은 밀도로 플레이팅하고, 항-CLPTM1L 6-1, 10-2, 또는 대조군 마우스 IgG로 처리하였다(도 8a-b). 성장 5일 후에 생성된 콜로니의 수는 항-CLPTM1L 처리에 의해 47%까지 억제되었다.
실시예 3 - 인간 폐 종양 이종이식 모델에 대한 CLPTM1L 모노클로날 항체의 효과
ECR1(SEQ ID NO:6) 내의 에피토프 6 및 ECR2(SEQ ID NO:10) 내의 에피토프 10에 대해 발생된 모노클로날 항체를 확립된 인간 폐 종양 이종이식의 성장의 억제에 대해 이종이식 모델에서 평가하였다. A549 세포 이종이식을 확립시키고, 마우스를 동등한 평균 종양 크기 및 분산의 그룹으로 나누었다. 분리 후 0, 5 및 12일에 마우스에 1 ㎕/g(2-3 mg/kg의 항체와 동등한 것으로 판단됨)의 지정된 모노클로날 항체 클론 또는 대조군 복수를 복막내 처리하였다. 한 그룹에는 1 mg/kg의 폴리클로날 항체를 유사하게 처리하였다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 클론 6-1은 처리 후 17일에 걸쳐 종양 성장을 적당하게 그러나 유의하게 억제하였다(도 9). 에피토프 10에 대해 생성된 항체(10-2 및 10-3)는 종양 성장에 대해 더욱 확실하고 더욱 유의한 억제 효과를 가졌다. 모노클로날 클론 10-2는 88%까지 종양 성장을 억제하였다(p<0.005).
상기 기재된 실시예 및 데이터 세트는 항-CLPTM1L 면역글로불린이 생체 내 및 시험관 내에서 항-종양 작용제임을 입증한다. 또한, 이들은 CLPTM1L의 세포외 도메인을 표적화하는데 있어서 효능이 있는 것으로 예상된 특정 에피토프를 기재한다.
SEQUENCE LISTING <110> Medical College of Wisconsin James, Michael <120> TARGETING CLPTM1L FOR TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER <130> 650053.00316 <150> 61/927,330 <151> 2014-01-14 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27311 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcggggccgg cgaatcccgc ggcgccaggt gggagcgggg ccggagcatg cggggcggcc 60 ggcggtctgc ggcgcgcggc gcattcgttc ccccgcggcg gtggcggtgg cgcgcggcgg 120 ctctccagtg agcggcggag cccggagcgg cgggctgggc gccgggcggg cggggctcgc 180 ggctgagagg cgggcgggcc gggggcgccg ggcgcggggc cgccatgtgg agcggccgca 240 gctccttcac cagcttggtg gtgggcgtgt tcgtggtcta cgtggtgcac acctgctggg 300 tcatgtacgg catcgtctac acccgcccgt gctccggcga cgccaactgc atccagccct 360 acctggcgcg gcggcccaag ctgcaggtga gcgtccgcgg ggccgggggc cgggcgggtt 420 ggggtggggg cctctcctcc aggccccaga cgtcgccttc ccgtcccagt tcggagctgt 480 ggccgcgcga gtcgagatgg aacctttcct ggttccccag cggccaggtc ttccgccctc 540 cagctggccg tgggatttga gtgcgtcctg ccagggcctg gccgagctga ctctcgacgc 600 cccctccttt ccagctgagc 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ctgcgtatgc tcggccgttg 24480 ctccgtctca gcggcgtggc tgctgctgaa cggaatgacg gctttcaccg caccctgcgc 24540 ctgtttatcc atttgaggga aaagataatt tgcaggtggt ggtttttcct gtcttgccta 24600 aacttgggtt ccagttgccc atgatatgtc ctggcaagaa actgttccag ctctgtctcc 24660 tcactgtgct ttagaaatgc tcgtttctat gtgaattatt gatgagccac tgaaagcaaa 24720 tgtctctcct taagcgattt atttacctat tcacagtcat tgctattgag cagaacagag 24780 accgtagcat ggctaatcca tacttggcgc tagcctcgaa gtgtccagcc agcagtgtgg 24840 acctgcaggg cacaatgtca ctggggagct cactcacctc agcattggcc gcacccctta 24900 aaccagccac cagggcctct gaagactgca ttgcgtggac ctctcagctt ggccttcagg 24960 ttgaaggctg acggctgagg aaaaggcttt gtggaatttt ctaaaggcag aggttcaggc 25020 cccaccccgg gcctcggaat tttccaaatg cagaggctca ggccccaccc tgggcctccc 25080 gcttccctcc agggctgaca tctgccctct cagtcagcaa aacctccctc cagctctgct 25140 gtgccagggt aggagccagg gatctggggc tcccctcggg agggttgcat ctggaccact 25200 gcaagcactg ccctcacctc cagtgccggc cccagggcct tgtccagggg tcgaaggagt 25260 gtgtgtcacc cccaagacct gctgccaagt gtctcagagc ctcctggctg tgtcctttct 25320 ctggccctca aggtcccttt tcccatctcc ctcccccgac caggaggcca cctcacacac 25380 cacggctgtg acacttccct gtgcccttcc ctcagggcct ggggccatcc tactagtgca 25440 ggagagggat cctcttcccc caggccgtcc tggcgggtcc tgcctaggtc cggggtgccg 25500 gcccttgggg agcgcagtgc tcccgtcccc gccctgtctc cacactcaac ctcgccaggt 25560 gttcagagcc tctgtcccag ccagcatgag gctggcatgg ttctgcctgg tttaactctt 25620 tgttcgggtg cagttggcac atccacacag tggctcatgg ccgcccttgc ccagctctcc 25680 aggcctggcc gccggctgcc cccccccacc ctgttgctgt ctcgtgcagc ccctgcacgg 25740 gagctccagc ttgtgtcagc gggaagggct atttcaccat aagcaacact cacactcaca 25800 cggggcttgg ttcctgtccc ccgttcacca ttctcagatc ccccagctgg ccgcctgccc 25860 cctgcagagc ctgaggttgt ccaagccacg gagccccgga cgctgctgcg cctggtgtgg 25920 ttgtctcaac tgtgagccct tcaagtggct cccaagtcct cgcaggtggc ccggggcgtg 25980 cctgaaactg tgctgtactc aggctctgtg ttaatggctc cagacctgca aacggtgttt 26040 ggccaggatc acagggccct tggtgggcag caggtctgtt tttaagctga aaccctgtac 26100 ttctgttcgc ggccgtgtag agctgcccct tatgccacag cttcctcatc catacgtagg 26160 ggtgatgttg gcaaggcctc cggggcgctc aggatcaaag gcggcggcag tgtcctgcca 26220 agtgttcaca gctgatgaga cgtggtccct gaacacagcg gttcctgttc tgatcactcg 26280 agtctccgtg atgccaccgt tcccagaagg cagcccgtgc agcctccggg tccccccttc 26340 agccatggca gcccgtgcag cctccgggtc gtcccttcgg ccaagcttcc ctttccttga 26400 gagcagcacg ctggcctggc catgcagaac aaaacacaac tcagaaatcc ctcctcagcc 26460 ctcggcagta aaacttctga ggattcgact ttttagttaa tttgctcact gtggcagctc 26520 actggaaaat aaatcgagga tgccaagtcc tcctcttaga aaaatagccc ctgcagtggg 26580 gtttgctgat gtgctcattt gtgtcattgc aggctttatc ctgtggataa acgcagagtg 26640 aacgagtttg gggagtccta cgaggagaag gccacgcggg cgccccacac ggactgaagg 26700 ccgcccgggc tgccgccagc caagtgcaac ttgaattgtc aatgagtatt tttggaagca 26760 tttggaggaa ttcctagaca ttgcgttttc tgtgttgcca aaatcccttc ggacatttct 26820 cagacatctc ccaagttccc atcacgtcag atttggagct ggtagcgctt acgatgcccc 26880 cacgtgtgaa catctgtctt ggtcacagag ctgggtgctg ccggtcacct tgagctgtgg 26940 tggctcccgg cacacgagtg tccggggttc ggccatgtcc tcacgcgggc aggggtggga 27000 gccctcacag gcaagggggc tgttggattt ccatttcagg tggttttcta agtgctcctt 27060 atgtgaattt caaacacgta tggaattcat tccgcatgga ctctgggatc aaaggctctt 27120 tcctcttttg tttgagagtt ggttgtttta aagcttaatg tatgtttcta ttttaaaata 27180 aatttttctg gctgtggcat ttttcttgac ctggtataat gaaagtattt cggatatttg 27240 agtttaaccc ttttccagaa agtaatacat gatatggatt tatttatgca ttaaaagagc 27300 aaatttaaag a 27311 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Arg Pro Lys Leu Gln Leu Ser Val Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Asn Asn Ile Asp Leu Val Leu Asn Val Glu Asp 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Asp Phe Asp Val Glu Ser Lys Phe Glu Arg Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 His Ala Gly Val Leu Pro Trp His Asp Gly Lys Gln 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Gly Ser Ser Leu Pro Ala Asp Val His Arg Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 His Arg Tyr Met Lys Met Ile Gln Leu Gly Lys Thr 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Thr Glu Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Asp Lys Val 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gln Gln Phe Gly Phe Ser Glu Lys Asp Ala Asp Glu 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Thr Arg Pro Cys Ser Gly Asp Ala Asn Cys 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Arg Arg Pro Lys Leu Gln Leu Ser Val Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Glu Asn Asn Ile Asp Leu Val Leu Asn Val Glu 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Phe Asp Val Glu Ser Lys Phe Glu Arg Thr 1 5 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 His Ala Gly Val Leu Pro Trp His Asp Gly Lys Gln 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Thr Thr Tyr Met Val Pro Lys Pro Glu Glu 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ile Asn Leu Leu Thr Gly Glu Ser Asp Thr 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Ser Asp Thr Gln Gln Ile Glu Ala Glu 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Lys Lys Pro Thr Ser Ala Leu Asp Glu Pro Val 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Asp Gly Ser Ser Leu Pro Ala Asp Val His 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 His Arg Tyr Met Lys Met Ile Gln Leu Gly Lys Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Asp Lys Val 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Gln Asp Ala Val Tyr Ser Leu Gln Gln Phe 1 5 10 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gly Phe Ser Glu Lys Asp Ala Asp Glu 1 5

Claims (35)

  1. 항체, 펩티드, 및 앱타머, 또는 이들의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 CLPTM1L 표적화 작용제.
  2. 제 1항에 있어서, CLPTM1L-표적화 작용제가 CLPTM1L 폴리펩티드의 적어도 일부에 특이적인 모노클로날 항체인 작용제.
  3. 제 2항에 있어서, CLPTM1L 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 일부를 갖는 작용제.
  4. 제 2항에 있어서, 모노클로날 항체가 SEQ ID NO:4-25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 특이적인 작용제.
  5. 제 2항에 있어서, 모노클로날 항체가 6-1, 6-2, 10-1, 10-2, 및 10-3으로 구성된 군으로부터 선택된 모노클로날 항-CLPTM1L 클론인 작용제.
  6. 제 2항에 있어서, 모노클로날 항체가 표 2에 기재된 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 CLPTM1L 폴리펩티드에 특이적인 작용제.
  7. 제 1항에 있어서, CLPTM1L-표적화 작용제가 SEQ ID NO:4-25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 작용제.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로 사용하기 위한 작용제.
  10. 약제의 제조에서의 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 작용제의 용도.
  11. (a) 제 8항의 약학적 조성물, 및 (b) 인간 대상체에서 고형 종양을 치료하기 위한 설명서를 제공하는 삽입물을 포함하는, 제조 물품.
  12. 치료적 유효량의 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 화합물을 종양을 치료하거나 예방할 필요가 있는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 종양을 치료하거나 예방하기 위한 방법으로서, 상기 투여에 의해 종양이 대상체에서 치료되거나 예방되는, 방법.
  13. 제 12항에 있어서, CLPTM1L-표적화 작용제가 항체, 펩티드, 및 앱타머, 또는 이들의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, CLPTM1L-표적화 작용제가 CLPTM1L 폴리펩티드의 적어도 일부에 특이적인 모노클로날 항체인 방법.
  15. 제 14항에 있어서, CLPTM1L 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 일부를 갖는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 모노클로날 항체가 SEQ ID NO:4-25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 특이적인 방법.
  17. 제 12항에 있어서, CLPTM1L 표적화 모이어티가 SEQ ID NO:4-25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 방법.
  18. 제 12항에 있어서, 종양이 아교모세포종, 육종, 암종, 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 고형 종양인 방법.
  19. 제 12항에 있어서, 종양이 폐암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 방광암, 신장암, 난소암, 결장암, 결장직장암, 유방암, 자궁경부암, 뇌암, 식도암, 및 위암, 또는 이들의 전암성 병변으로 구성된 군으로부터 선택된 암 또는 신생물전 병변과 관련된 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 종양이 폐암 또는 이의 전암성 병변과 관련된 방법.
  21. 제 12항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  22. 제 12항에 있어서, 종양이 화학요법제에 대해 내성을 나타내는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 화학요법제가 시스플라틴 및 젬시타빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 제 12항에 있어서, 화합물이 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여되는 방법.
  25. CLPTM1L 단백질 기능이상과 관련된 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 질병 또는 질환의 위험이 있거나, 상기 질병 또는 질환을 갖는 것으로 진단되었거나, 상기 질병 또는 질환의 증상을 나타내는 대상체의 세포, 조직, 또는 기관으로 CLPTM1L-표적화 작용제를 포함하는 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, CLPTM1L 단백질 기능이상이 병원성 단백질 생성, 병원성 단백질 변형, 또는 병원성 단백질 기능 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  27. 제 25항에 있어서, 질병 또는 질환이 종양, 암, 또는 신생물전 병변인 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 종양이 아교모세포종, 육종, 암종, 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 고형 종양인 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 종양이 화학요법제에 대해 내성을 나타내는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 화학요법제가 시스플라틴 및 젬시타빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  31. 제 25항에 있어서, CLPTM1L-표적화 작용제가 항체, 펩티드, 및 앱타머, 또는 이들의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  32. 제 25항에 있어서, CLPTM1L-표적화 작용제가 CLPTM1L 폴리펩티드의 적어도 일부에 특이적인 모노클로날 항체인 방법.
  33. 제 32에 있어서, 모노클로날 항체가 표 2에 기재된 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 CLPTM1L 폴리펩티드에 특이적인 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 모노클로날 항체가 SEQ ID NO:4-25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 특이적인 방법.
  35. 제 25항에 있어서, 화합물이 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여되는 방법.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201512733D0 (en) * 2015-07-20 2015-08-26 Genagon Therapeutics Ab Therapeutic agents for treating conditions associated with elevated GDF15
GB201700567D0 (en) 2017-01-12 2017-03-01 Genagon Therapeutics Ab Therapeutic agents
GB201700553D0 (en) * 2017-01-12 2017-03-01 Genagon Therapeutics Ab Therapeutic agents
WO2020086328A1 (en) * 2018-10-25 2020-04-30 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Targeting clptm1l for treatment and prevention of cancer

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5487879A (en) 1994-07-15 1996-01-30 Martin Marietta Magnesia Specialities Inc. Stabilized, pressure-hydrated magnesium hydroxide slurry from burnt magnesite and process for its production
AU4289496A (en) 1994-12-02 1996-06-19 Chiron Corporation Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
JP2000210089A (ja) 1998-11-20 2000-08-02 Asahi Breweries Ltd アポト―シスを誘導する遺伝子
US6824780B1 (en) 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
GB0014185D0 (en) * 2000-06-09 2000-08-02 Novartis Res Found Compound and method
CA2443713A1 (en) 2001-04-06 2002-12-05 Incyte Genomics, Inc. Proteins associated with cell growth, differentiation, and death

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