ES2958587T3 - Inhibidores de LRRC33 y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

En el presente documento se describen agentes inhibidores de LRRC33 y métodos y usos relacionados de los mismos. Más específicamente, se proporcionan agentes terapéuticos para inhibir los efectos de LRRC33 in vivo. Dichos agentes son útiles para el tratamiento de diversos trastornos que implican células que expresan LRRC33 o complejos que contienen LRRC33 en la superficie de las células. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de LRRC33 y uso de los mismos

APLICACIONES RELACIONADAS

[0001]El objeto de la presente solicitud se refiere a la Solicitud provisional de EE. UU. Núm. 62/503,785 depositada el 9 de mayo de 2017, 62/558,048 depositada el 13 de septiembre de 2017, 62/663,030 depositada el 26 de abril de 2018 y 62/666,182 depositada el 3 de mayo de 2018.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002]Esta invención se refiere en general a agentes inhibidores de LRRC33 y a su uso.

FONDO DE LA INVENCIÓN

[0003]La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGFβ) de factores de crecimiento están implicados en una serie de cascadas de señalización que regulan diversos procesos biológicos que incluyen, entre otros: la modulación/supresión inmunitaria, la inhibición del crecimiento celular, la homeostasis tisular, la remodelación de la matriz extracelular (ECM), la transición endotelial a mesenquimal (EMT), la migración e invasión celular, así como la transición mesenquimal a epitelial.

[0004]En el sistema inmunitario, el ligando TGFβ modula la función de las células reguladoras T y el mantenimiento del crecimiento y la homeostasis de las células precursoras inmunitarias. En las células epiteliales normales, el TGFβ es un potente inhibidor del crecimiento y promotor de la diferenciación celular. Sin embargo, a medida que los tumores se desarrollan y progresan, con frecuencia pierden su respuesta negativa de crecimiento al TGFβ. En este escenario, el TGFβ puede convertirse en un promotor del desarrollo tumoral debido a su capacidad para estimular la angiogénesis, alterar el entorno estromal e inducir inmunosupresión local y sistémica. En relación conlaremodelación de la ECM, la señalización de TGFβ puede aumentar las poblaciones de fibroblastos y la deposición de ECM (por ej.,colágeno). Por estas y otras razones, el TGFβ ha sido una diana terapéutica para diversas indicaciones clínicas. A pesar de los grandes esfuerzos realizados hasta la fecha por varios grupos, el desarrollo clínico de un tratamiento con TGFβ ha sido todo un reto.

[0005]Las observaciones de estudios preclínicos, incluso en ratas y perros, han revelado ciertas toxicidades asociadas con la inhibición de la TGFβin vivo.De hecho, la mayoría de los programas clínicos dirigidos al TGFβ (p. ej., inhibidores biológicos y de moléculas pequeñas) se han interrumpido debido al riesgo de efectos secundarios adversos.

[0006]La familia TGFβ dentro de la superfamilia se compone de tres isoformas de TGFβ, a saber, TGFβ1, TGFβ2 y TGFβ3. Las tres isoformas señalan a través de los mismos receptores para desencadenar una amplia gama de efectos celulares. Aunque los estudios deknock-outgénico de estas isoformas ofrecen algunas pistas, sólo se dispone de información limitada en cuanto a la importancia biológica discreta de cada una de estas isoformas en contextos sanos y patológicos.

[0007]Se cree que una faceta adicional de la regulación del TGFβ se produce a través de sus interacciones con las denominadas "moléculas presentadoras". Estas moléculas parecen expresarse de forma específica para cada tejido y secuestran y "presentan" formas inactivas (por ej.,latentes) de TGFβ en el microambiente extracelular (p. ej., superficie celular o matriz extracelular). Allí, el TGFβ se activa en respuesta a determinados estímulos y se libera del complejo latente en el lugar de acción para ejercer su efecto. De este modo, TGFβ puede regular la señalización local de forma específica para cada contexto.

[0008]En la literatura se han descrito previamente varias moléculas presentadoras de TGFβ. Entre ellas se encuentran la proteína de unión a TGF-p latente 1 ("LTBP1"), la proteína de unión a TGF-p latente 3 ("LTBP3"), la glicoproteína A repeticiones predominantes (o "GARP" también conocida como LRRC32) y la proteína 33 con repetición rica en leucina ("LRRC33"). LTBP1 y LTBP3 son componentes de la matriz extracelular, mientras que GARP es una proteína transmembrana que se expresa en las células T reguladoras FOXP3+ (Treg). Véase, por ejemplo: WO 2014/182676; WO 2017/156500; y WO 2018/081287.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0009]La invención se define en las reivindicaciones. La presente divulgación abarca la identificación de LRRC33 como una nueva diana terapéutica para ciertos trastornos proliferativos, incluidos tumores sólidos y trastornos proliferativos hematológicos, como cánceres de la sangre y trastornos de la médula ósea, así como trastornos fibróticos en los que los macrófagos activados desempeñan un papel.

[0010]La presente divulgación se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que LRRC33 se expresa preferentemente en unsubconjuntode células y tejidos con un sorprendente grado de selectividad. Más concretamente, la expresión de LRRC33 se limita predominantemente a las células de linajes mieloides y linfoides (p. ej., glóbulos blancos). En particular, se ha observado la sobreexpresión de LRRC33 en varios tipos de células tumorales de estos linajes.

[0011]Por lo tanto, el inventor de la presente divulgación razonó que la orientación selectiva de LRRC33 en estas células/tejidos puede proporcionar una oportunidad terapéutica para tratar diversos trastornos que implican células mieloides asociadas a la enfermedad que expresan LRRC33 en la superficie celular. Estas incluyen condiciones, en las que el TGFβ desempeña un papel inmunosupresor, sin afectar ampliamente a la función esencial del TGFβ mediada por las otras moléculas presentadoras, que es importante para la homeostasis tisular normal.

[0012]Anteriormente se informó de la expresión de LRRC33 en monocitos, por ejemplo, macrófagos. Sin embargo, estudios posteriores en macrófagos polarizados han revelado inesperadamente que no todos los llamados macrófagos de tipo M2 "pro-fibróticos" expresan LRRC33. Más bien, entre los macrófagos M2 polarizados, la expresión de la superficie celular de LRRC33 parece estar restringida predominantemente a los subtipos, M2c y de tipo TAM (M2d), que son fenotipos asociados con microambientes pro-fibróticos y cancerosos, respectivamente. Además, dicha expresión parece volverse notablemente uniforme tras la exposición a determinados factores derivados de la enfermedad (p. ej., las citoquinas). Esto presenta una oportunidad para inhibir selectivamente las actividades de LRRC33 o del TGFβ asociado a LRRC33 en trastornos profibróticos y/o proliferativos, sin afectar negativamente a las células normales, por ejemplo, monocitos y plaquetas. En algunas realizaciones, las células diana expresan receptores para dichas citocinas. En algunas realizaciones, las células diana expresan CCR2/CD192, que es un receptor para CCL2/MCP-1. En algunas realizaciones, las células diana expresan CD115, que es un receptor para M-CSF.

[0013]Con este fin, la presente invención proporciona inhibidores de LRRC33 para lograr la focalización selectiva de células que expresan LRRC33.

[0014]Una clase de tales inhibidores inhibe selectivamente la activación del proTGFβ presentado por LRRC33.

[0015]Una segunda clase de tales inhibidores se une selectivamente a LRRC33 expresado en células e induce efectos citotóxicos.

[0016]Una tercera clase de tales inhibidores induce la internalización de LRRC33 de la superficie celular o un complejo que contiene LRRC33 para la eliminación del mismo de la superficie celular. En una modalidad, dicho inhibidor incluye un agente citotóxico tal que al unirse selectivamente al LRRC33 de la superficie celular y la subsiguiente internalización del complejo, causa la destrucción de la célula (es decir,la muerte celular) lo que lleva a la depleción de las células que expresan LRRC33. En otra modalidad, dicho inhibidor es un agente de unión a LRRC33 que hace que la LRRC33 de la superficie celular o un complejo que contenga LRRC33 se elimine de la superficie celular, por ejemplo, mediante internalización, mientras que salva a la célula.

[0017]En cualquiera de los escenarios anteriores, los inhibidores de LRRC33 descritos en el presente documento pretenden i) reducir la disponibilidad de TGFβ o complejo LRRC33-proTGFβ en el entorno de la enfermedad, por ejemplo, tejido fibrótico, microambiente tumoral, etc.; ii) reducir o revertir la inmunosupresión; y/o, iii) promover o potenciar la inmunidad del huésped, por ejemplo, la inmunidad antitumoral.

[0018]En consecuencia, en un aspecto, la presente divulgación proporciona una clase de anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos que inhiben específicamente la activación de TGFβ1 asociada con (p. ej., presentada por) LRRC33, pero no con otras moléculas presentadoras. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al complejo proTGFβ1 inactivo (p. ej., latente) que comprende LRRC33 de forma específica para cada contexto, inhibiendo así la liberación de TGFβ1 libre y activo del complejo latente. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo es permisivo al contexto, en el sentido de que puede unirse e inhibir la activación de TGFβ1 a partir de un complejo proTGFβ1 latente asociado con dos o más moléculas presentadoras diferentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo puede inhibir la liberación de TGFβ1 del complejo latente que comprende LRRC33, GARP, LTBP1 o LTBP3. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo puede inhibir la liberación de TGFβ1 del complejo latente que comprende LRRC33 o GARP. En el documento PCT/US2017/021972 se proporcionan ejemplos no limitantes de tales anticuerpos y fragmentos de los mismos adecuados para llevar a cabo la presente invención, que pueden utilizarse para lograr los efectos descritos en el presente documento.

[0019]En otro aspecto, la divulgación proporciona una clase de anticuerpos citotóxicos o fragmentos de los mismos que se dirigen y abaten o erradican células que expresan LRRC33 mediante función efectora. En algunas realizaciones, dichos anticuerpos se diseñan para proporcionar o modular funciones efectoras (p. ej., ADCC, ADCP y CDC) y/o farmacocinéticas. En algunas realizaciones, dichos anticuerpos inducen ADCC al unirse a células diana que expresan LRRC33, provocando así la lisis celular. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo puede ser un isotipo IgG1 o IgG4. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo totalmente humano o una variante del mismo, o un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo contiene una o más mutaciones para modular la función efectora. Por ejemplo, ciertas mutaciones causan una unión alterada a FcRn, FcyRI, FcYRIIIa, C1q, FcYRIIa, FcYRIlb. Además o alternativamente, ciertas mutaciones pueden alterar la semivida del anticuerpo in vivo; alterar la ADCC y/o la CDC; alterar la fagocitosis macrofágica; y/o alterar el intercambio Fab-brazo. En algunas realizaciones, dichos anticuerpos o fragmentos son anticuerpos sensibles al pH, que se unen fácilmente al antígeno respectivo a un pH neutro y se disocian a un pH ácido. Entre ellos se encuentran los llamados anticuerpos "barredores" y los anticuerpos "recicladores".

[0020]Las células a las que se dirigen (es decir, lascélulas diana) mediante el uso de los anticuerpos o fragmentos expresan LRRC33 que presenta proTGFβ (denominado "complejo LRRC33-proTGFβ") en la superficie celular. En algunas realizaciones, las células diana comprenden LRRC33 de superficie celular. En algunas realizaciones, las células diana comprenden LRRC33-proTGFβ1 de superficie celular. En algunas realizaciones, las células diana son de linaje mieloide. En algunas realizaciones, las células diana son monocitos. En algunas realizaciones, las células diana son macrófagos. En algunas realizaciones, las células diana son células dendríticas. En algunas realizaciones, las células diana son células cancerosas hematológicas. En algunas realizaciones, las células diana son células leucémicas, por ejemplo, células de leucemia linfoblástica aguda (ALL), células de leucemia mieloide aguda (AML), células de leucemia linfocítica crónica (CLL) y células de leucemia mieloide crónica (CML). En algunas realizaciones, las células diana son mieloblastos. En algunas realizaciones, las células AML son células mieloblásticas (M0), células mieloblásticas (M1) sin maduración; células mieloblásticas (M2) con maduración; células promielocticas (M3); células mielomonocíticas (M4); células monocíticas (M5); células eritroleucémicas (M6); y/o células megacariocíticas (M7). En algunas realizaciones, las células diana están en circulación y/o en la médula ósea. En algunas realizaciones, las células diana son macrófagos, por ejemplo, macrófagos activados o similares a M2, como M2c y macrófagos similares a TAM. En algunas realizaciones, la célula diana es un macrófago activado que se diferenció de un monocito al ser reclutado en el lugar de la enfermedad/lesión, como un microambiente tumoral (TME). Dichos macrófagos pueden estar expuestos a diversos factores (p. ej., factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas y componentes de remodelación de la ECM, etc.) presentes en el nicho local, que pueden promover aún más el fenotipo asociado al tumor del macrófago. Los factores/citocinas presentes en los entornos patológicos, como el microentorno tumoral, y que pueden afectar a la polarización/diferenciación de los macrófagos incluyen, entre otros indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), IFNγ, IL-10, IL-6, IL - 11, Oncostatina M (OSM), TGFβ como TGFβ1, CCL2/MCP-1, SDF-1/CXCL12, CXCR4, VEG, PDGF, COX-2, metaloproteinasas (MMP) como MMP2, MMP7, MMP13 y MMP9, calicreínas, IL-4, bFGF, TNFα y M-CSF/CSF-1. Así, en algunas realizaciones, las células diana expresan receptor(es) de superficie celular para uno o más de los factores/citocinas mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, las células diana expresan indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO). En algunas realizaciones, las células diana son neutrófilos; en particular, neutrófilos activados. En algunas realizaciones, las células diana son células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). Las MDSC pueden estar asociadas al cáncer y/o a la infección. Por ejemplo, las MDSC pueden estar presentes en el microambiente tumoral.

[0021]Las células a las que se dirige (células diana) son un subconjunto de macrófagos (pero no todos). En algunas realizaciones, el subconjunto de macrófagos es una población derivada de monocitos.

[0022]Las células a las que se dirigen (células diana) mediante el uso de los anticuerpos o fragmentos de la invención incluyen las células B. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula B reguladora. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula CD19+. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula B que expresa IL-10. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula B reguladora productora de IL-10, capaz de reducir el número de células T reguladoras (Tregs). Los datos sugieren que las células B normales aisladas de individuos sanos no muestran una elevada proteína LRRC33 en la superficie celular medida por FACS, a pesar de los niveles relativamente altos de ARNm observados en estas células a nivel de transcripción. Sin embargo, las células B activadas o asociadas a enfermedades (como el cáncer de células B, por ejemplo, linfoma de células B y leucemia de células B) pueden regular en positivo la expresión de LRRC33, lo que conduce a un aumento de los niveles de LRRC33 en la superficie celular, haciendo que estas células respondan a una terapia de inhibición de LRRC33 descrita en el presente documento. Las células a las que se dirige el uso de los anticuerpos o fragmentos de la invención pueden expresar GARP, que presenta proTGFβ en la superficie celular (un "complejo GARP-proTGFβ"). En algunas realizaciones, las células diana expresan el complejo GARP-proTGFβ1 En algunas realizaciones, las células diana son de linaje linfoide. En algunas realizaciones, las células diana son linfocitos. En algunas realizaciones, las células diana son Tregs, como las Tregs naturales desarrolladas en el timo y las Tregs derivadas de células T ingenuas. En algunas realizaciones, las células diana son CD4+/Foxp3+. En algunas realizaciones, las células diana son CD4+/CD25+/Foxp3+. En algunas realizaciones, las células diana están asociadas al tumor (es decir, infiltradas o residen dentro de los tumores) o se acumulan en la sangre periférica. En algunas realizaciones, las células diana son sensibles a IDO.

[0023]Según la presente divulgación, las células diana preferidas expresan LRRC33 o el complejo LRRC33-proTGFβ en la superficie celular a un nivel mayor que las células que no son diana. De esta manera, la invención pretende inhibir preferentemente las células que expresan altos niveles de LRRC33 de superficie celular o complejo que contiene LRRC33 (p. ej., LRRC33-proTGFβ) sobre las células que expresan niveles más bajos de LRRC33 de superficie celular o complejo que contiene LRRC33. En algunas realizaciones, la expresión de LRRC33 en la superficie celular es al menos igual o comparable y preferiblemente mayor que la expresión de CD133, CD44, CD33, c D13 y/o CD64 en la superficie celular. Es importante destacar que la expresión en la superficie celular de LRRC33 o del complejo que contiene LRRC33 (p. ej., LRRC33-proTGFβ) es más selectiva para ciertas subpoblaciones celulares, por ejemplo, restringida solo o predominantemente a las células asociadas a la enfermedad, en comparación con las dianas terapéuticas perseguidas hasta la fecha. La capacidad de dirigirse a una subpoblación definida de células proporciona mayores beneficios clínicos para lograr tanto la eficacia como la seguridad (toxicidades reducidas derivadas de efectos fuera del objetivo).

[0024]Por lo tanto, los inhibidores de LRRC33 descritos en el presente documento pueden utilizarse en terapia. Los inhibidores de LRRC3 pueden formularse en una composición farmacéutica. Los inhibidores pueden utilizarse en el tratamiento de ciertos trastornos proliferativos, incluidos los trastornos proliferativos hematológicos, como los cánceres de la sangre y los trastornos de la médula ósea, los tumores sólidos y/o la fibrosis. Los inhibidores de LRRC33 pueden inhibir selectivamente LRRC33. Los inhibidores de LRRC33 pueden dirigirse selectivamente a las células que expresan LRRC33. Las células diana pueden seleccionarse entre las descritas anteriormente. En algunas realizaciones, las células diana pueden ser células tumorales del tipo que muestran sobreexpresión de LRRC33 (p. ej., en base a la expresión de ARNm) en relación con el nivel de expresión medio de LRRC33 en una serie de líneas celulares de cáncer (p. ej., como se describe en el presente documento). La sobreexpresión puede ser significativa (q<0,05). La sobreexpresión puede ser de 4 a 16 veces superior al nivel de expresión medio en el rango de líneas celulares de cáncer. Las líneas celulares cancerosas pueden ser las ensayadas como se describe en la Figura 2. Los inhibidores de LRRC33 para uso como se describe en el presente documento pueden dirigirse selectivamente a células que expresan LRRC33 en uno o más trastornos como se describe en el presente documento (p. ej., trastornos proliferativos hematológicos) que se caracterizan por la presencia de células de leucemia mieloide aguda que expresan LRRC33, células de mieloma de células plasmáticas, células de leucemia linfoblástica aguda de células T, células de leucemia mieloide crónica en fase blástica, células de leucemia linfoblástica aguda de células B, células de leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño, células de linfoma de células B, células de linfoma de Burkitt, células de linfoma de células del manto, células de leucemia linfoblástica aguda. Otras células que caracterizan los trastornos a tratar pueden incluir células de linfoma anaplásico de células grandes, células de linfoma difuso de células B grandes y células de linfoma de Hodgkin. Los inhibidores de LRRC33 para su uso según se describe en el presente documento pueden dirigirse selectivamente a células que expresan LRRC33 en uno o más trastornos según se describe en el presente documento (p. ej., trastornos proliferativos, como un tumor sólido) que se caracterizan por la presencia de macrófagos polarizados que expresan LRRC33, incluidas células M2c y de tipo TAM. Los macrófagos pueden tener fenotipos profibróticos y de tipo macrófago asociado a tumor, respectivamente. Los inhibidores de LRRC33 aquí proporcionados pueden agotar las células que expresan LRRC33 in vivo. Los monocitos y neutrófilos humanos muestran poca o ninguna expresión superficial de LRRC33 directamente ex vivo, en contraste con CD33. En algunas realizaciones, los inhibidores de LRRC33 no se dirigen a monocitos y/o neutrófilos. En algunas realizaciones, los inhibidores de LRRC33 no agotan (por ej., no agotan significativamente) los monocitos y/o neutrófilos. Entre los macrófagos M2 polarizados, la expresión de la superficie celular de LRRC33 parece estar restringida predominantemente a los subtipos M2c y de tipo TAM (M2d). M2a, M2b, M2c (p. ej., pro-fibrótico) y M2d (pro-tumoral o de tipo TAM). En algunas realizaciones, los inhibidores de LRRC33 no se dirigen a los macrófagos M2a o M2b (o M1). En algunas realizaciones, los inhibidores de LRRC33 no agotan (por ej.,no agotan significativamente) los macrófagos M2a o M2b (o M1).

[0025]Se describen composiciones farmacéuticas formuladas con uno o más de los anticuerpos (o fragmentos) divulgados en la divulgación. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender o utilizarse junto con un adyuvante. Se contempla que ciertos adyuvantes puedan potenciar las respuestas inmunitarias del sujeto a, por ejemplo, antígenos tumorales, y facilitar la función Teffector, la diferenciación de DC a partir de monocitos, la captación y presentación mejorada de antígenos por APCs, etc. Los adyuvantes adecuados incluyen, entre otros, adyuvantes a base de ácido retinoico y sus derivados, adyuvantes a base de emulsiones de aceite en agua, como MF59 y otros adyuvantes que contienen escualeno, ligandos del receptor tipo Toll (TRL), a -tocoferol (vitamina E) y sus derivados.

[0026]En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender además un excipiente. Los métodos para fabricar tales composiciones farmacéuticas, así como los kits que incluyen las mismas, se incluyen en la invención.

[0027]Según la invención, la inmunosupresión del huésped en el microambiente tumoral puede estar mediada por TGFβ. Más concretamente, el TGFβ, en particular el TGFβ1, puede contribuir a la evasión inmunitaria del huésped creando un entorno inmunosupresor o de exclusión inmunitaria a través de uno o varios de los siguientes mecanismos: i) reclutamiento de monocitos e inducción de fenotipos de macrófagos asociados a tumores (TAM) (señalización de TGFβ dependiente de LRRC33); ii) inducción de Tregs infiltrantes de tumores que suprimen las células efectoras T (señalización de TGFβ dependiente de GARP); y, iii) promoción de la remodelación extracelular que favorece el crecimiento y/o la invasión tumoral (señalización de TGFβ asociada a la matriz o dependiente de LTBP1 /3). Un inhibidor de LRRC33 según la presente divulgación puede utilizarse para revertir la inmunosupresión y crear un entorno inmunopermisivo que permita a las células efectoras acceder a las células diana en el entorno de la enfermedad (p. ej., la EMT). Esto puede lograrse inhibiendo la vía del TGFβ asociada a la enfermedad, y/o agotando las células que expresan LRRC33 en la superficie celular o el complejo que contiene LRRC33 (p. ej., macrófagos activados).

[0028]Así, la presente invención incluye el reconocimiento de que la inhibición selectiva de LRRC33 puede ser útil para el tratamiento de diversos trastornos proliferativos. Adicional o alternativamente, la inhibición de LRRC33 puede ayudar a reducir o revertir la inmunosupresión en el huésped, ya sea directa o indirectamente. En consecuencia, la divulgación proporciona métodos para tratar trastornos proliferativos, tales como un trastorno proliferativo hematológico en un sujeto. En algunas realizaciones, el trastorno proliferativo hematológico está asociado a células mieloides o linfoides. En algunas realizaciones, el trastorno hematológico es una enfermedad sistémica o un trastorno localizado. En algunas realizaciones, el trastorno comprende un tumor sólido.

[0029] En consecuencia, otro aspecto de la divulgación se refiere a métodos para inhibir la progresión del cáncer mediante la intervención de los efectos de TGFβ. En algunas realizaciones, los efectos de TGFβ están mediados por LRRC33. En algunas realizaciones, los efectos del TGFβ están mediados por GARP. En algunas realizaciones, tanto LRRC33 como GARP intervienen en el proceso. En algunas realizaciones, el tratamiento contribuye a superar o reducir la inmunosupresión en el sujeto. Así, los métodos mejoran o potencian la respuesta inmunitaria del organismo para tratar el cáncer.

[0030] Basándose al menos en el hallazgo inesperado de que ciertas células cancerosas hematológicas regulan selectivamente en positivo la expresión de LRRC33, se proporcionan métodos para administrar uno o más de tales inhibidores de LRRC33 a pacientes, en los que los pacientes padecen una enfermedad o afección asociada con la sobreexpresión de LRRC33. En algunas realizaciones, la progresión de la enfermedad o trastorno está mediada en parte por TGFβ1 presentado por LRRC33.

[0031] En algunas realizaciones, el trastorno hematológico es cáncer de la sangre y/o cáncer de la médula ósea. En algunas realizaciones, el trastorno hematológico es un trastorno sistémico, un trastorno localizado (como un tumor sólido) o ambos. En algunas realizaciones, las células inmunitarias que expresan LRRC33 y/o GARP se enriquecen en el lugar del tumor para crear un microambiente local asociado al tumor. En algunas realizaciones, las concentraciones de TGFβ1 son elevadas en el nicho.

[0032] Aspectos de la divulgación se refieren en general a inhibidores de LRRC33 como terapéutica del cáncer. Así, en un aspecto, la divulgación proporciona el uso de un inhibidor de LRRC33 en el tratamiento del cáncer que comprende un tumor sólido. Tales inhibidores de LRRC33 incluyen agentes neutralizantes, como anticuerpos o porciones de los mismos que se unen a LRRC33 en la superficie celular, neutralizando o interfiriendo así con su función biológica. La unión de tales agentes neutralizantes a LRRC33 puede agotar eficazmente las células diana que expresan LRRC33 in vivo. En algunas realizaciones, los agentes neutralizantes de LRRC33 (como anticuerpos monoclonales o porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a LRRC33) pueden utilizarse para tratar el cáncer en un sujeto mediante la depleción de las células que expresan LRRC33. Las células que expresan LRRC33 incluyen, entre otras, macrófagos activados (polarizados), por ejemplo, macrófagos asociados a tumores ("TAM"), neutrófilos activados, porejemplo,neutrófilos asociados a tumores ("TAN"), y/o fibroblastos asociados a cáncer ("CAF"), cuyo fenotipo es similar al miofibroblasto. En algunas realizaciones, los CAF expresan una integrina que comprende una cadena alfa-11 (a11). En algunas realizaciones, los CAF expresan receptores de superficie celular para integrina que comprenden una cadena alfa-11 (a11). En algunas realizaciones, los CAF expresan IL-11 y/o IL-6. En algunas realizaciones, los CAF expresan receptores de IL-11 y/o receptores de IL-6. Se contempla que dichos inhibidores de LRRC33 (p. ej., agentes neutralizantes de LRRC33) pueden tener efectos anticancerígenos in vivo, como reducir la tumorigénesis (p. ej., el crecimiento tumoral), la metástasis, la angiogénesis, la vascularidad, la invasión y/o la inmunosupresión. En algunas realizaciones, la inhibición de LRRC33 puede prevenir o reducir el reclutamiento de células inmunitarias al lugar del tumor (p. ej., el microambiente tumoral). En algunas realizaciones, la inhibición de LRRC33 puede prevenir o reducir la infiltración tumoral de macrófagos.

[0033] En algunas realizaciones, los agentes de unión a LRRC33, como los descritos anteriormente, se unen y neutralizan la función biológica de LRRC33 in vivo sin afectar directamente a las actividades de TGFβ. En otras realizaciones, los agentes de unión a LRRC33 funcionan como inhibidores de TGFβ, por ejemplo, TGFβ1. Estos incluyen agentes de unión a LRRC33 que inhiben la activación de TGFβ, por ejemplo, TGFβ1, tales como anticuerpos monoclonales o porciones de unión a antígenos de los mismos que se unen al complejo proproteico inactivo o latente de TGFβ, impidiendo así la liberación del factor de crecimiento TGFβ maduro a partir del complejo.

[0034] En algunas realizaciones, dicha enfermedad comprende un tumor sólido. En algunas realizaciones, las células inmunitarias que expresan LRRC33, como los macrófagos, están enriquecidas en el tumor. En algunas realizaciones, los macrófagos son de fenotipo M2c y/o de tipo TAM. En algunas realizaciones, estos macrófagos son capaces de reclutar linfocitos T supresores en el microambiente tumoral. En algunas realizaciones, los linfocitos T supresores son Tregs que expresan GARP.

[0035] En algunas realizaciones, el trastorno hematológico comprende la proliferación anormal de células sanguíneas poco diferenciadas en la médula ósea. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno mieloproliferativo. En algunas realizaciones, el trastorno mieloproliferativo es la mielofibrosis.

[0036] En otro aspecto, la divulgación proporciona terapias combinadas que comprenden una composición que comprende un inhibidor de LRRC33 y al menos una terapia adicional. La terapia combinada en algunas realizaciones logra beneficios clínicos suplementarios, en comparación con la monoterapia. En algunas realizaciones, la terapia combinada consigue efectos aditivos o sinérgicos.

[0037]Los sujetos adecuados para ser administrados con una composición farmacéutica padecen uno o más trastornos proliferativos hematológicos. En algunas realizaciones, el sujeto no responde o responde mal a la terapia convencional. La terapia convencional puede comprender una terapéutica adicional según se describe en el presente documento, como un antagonista de PD-1 (o un antagonista de la señalización de PD-1) o un inhibidor de tirosina quinasa (p. ej., un inhibidor de Bcr/Abl). En algunas realizaciones, el sujeto sufre una recidiva tras una remisión del trastorno.

[0038]También se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une a LRRC33 humana expresado en una célula, en la que el anticuerpo comprende opcionalmente un dominio Fc, y en la que el anticuerpo no se une a GARP. El anticuerpo puede ser un anticuerpo inhibidor de LRRC33 como se define en el presente documento. La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo inhibidor de LRRC33 puede ser para uso en métodos terapéuticos, como se describe en el presente documento.

[0039]En un aspecto, se divulga en el presente documento un inhibidor de LRRC33 para su uso en un método de depleción de células que expresan LRRC33 en la superficie celular en un sujeto, comprendiendo el método un paso de administración al sujeto del inhibidor de LRRC33 en una cantidad eficaz para reducir el número de células que expresan LRRC33 en la superficie celular, en el que el sujeto padece una enfermedad asociada con sobreexpresión de LRRC33 y/o activación anormal de macrófagos.

[0040]En una realización, el inhibidor de LRRC33 a) mata las células que expresan LRRC33 en la superficie celular, opcionalmente induciendo efectos citotóxicos; y/o, b) induce la internalización de LRRC33 en la superficie celular, para reducir el número de células que expresan LRRC33 en la superficie celular en el sujeto.

[0041]En otra realización, el sujeto tiene un trastorno proliferativo hematológico (p. ej., leucemia, mielofibrosis y mieloma múltiple), tumor sólido y/o fibrosis. En una realización, el trastorno proliferativo hematológico es una leucemia. En una realización, la leucemia es AML, ALL, CLL o CML. En una realización, el tumor sólido está enriquecido con macrófagos asociados a tumores (TAM). En una realización, la fibrosis comprende un tejido fibrótico enriquecido con macrófagos derivados de monocitos, donde opcionalmente la fibrosis es fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis hepática, fibrosis cardiaca, fibrosis de médula ósea y/o fibrosis cutánea.

[0042]En una realización, las células que expresan LRRC33 de superficie celular son: TAM, TAN, CAF, células leucémicas, células madre hematopoyéticas, células progenitoras mieloides, células progenitoras linfoides, células progenitoras megacariocito-eritroides, megacariocitos, monocitos, células B, células NK, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y/o macrófagos.

[0043]En un aspecto, se divulga aquí un inhibidor de LRRC33 para su uso en un método para revertir un entorno de enfermedad inmunosupresora, con el fin de impulsar/facilitar/promover la inmunidad del cuerpo. En una realización, el entorno de la enfermedad es un EMT o tejido fibrótico.

[0044]En una realización, el inhibidor de LRRC33 induce ADCC. En una realización, el inhibidor de LRRC33 induce la internalización de LRRC33 de la superficie celular.

[0045]En una realización, el inhibidor de LRRC33 comprende además un agente citotóxico.

[0046]En otro aspecto, se divulga en el presente documento un inhibidor de LRRC33 para su uso en un método para tratar una leucemia en un sujeto, en el que la administración del inhibidor de LRRC33 a una dosis eficaz causa menos toxicidades en comparación con una terapia de CD33.

[0047]En otro aspecto, se divulga en el presente documento un inhibidor de LRRC33 para su uso en un método para reforzar la inmunidad del huésped contra el cáncer en un sujeto, en el que el sujeto se trata con una terapia contra el cáncer, en la que opcionalmente, la terapia contra el cáncer es una terapia CAR-T, una terapia inhibidora de puntos de control, una quimioterapia o una radioterapia.

[0048]En una realización, la inmunidad del huésped se refuerza reduciendo la inmunosupresión.

[0049]En una realización, el uso del inhibidor de LRRC33 hace que el cáncer responda mejor a la terapia contra el cáncer.

[0050]En una realización, el sujeto recibe una cantidad reducida de la terapia contra el cáncer en comparación con una monoterapia para lograr el mismo beneficio/eficacia terapéutica o equivalente.

[0051]En una realización, la LRRC33 de superficie celular se asocia con un complejo TGFβ latente, en el que opcionalmente el complejo TGFβ latente es un complejo TGFβ1 latente.

[0052]En otro aspecto, se divulga en el presente documento un método para inhibir selectivamente TGFβ1 expresado en células hematopoyéticas, comprendiendo el método un paso de contactar una pluralidad de células que comprenden células hematopoyéticas que expresan TGFβ1 y células no hematopoyéticas que expresan TGFβ1, con un inhibidor de LRRC33, inhibiendo así TGFβ1 en las células hematopoyéticas que expresan TGFβ1 pero no en las células no hematopoyéticas que expresan TGFβ1, en el que el inhibidor de LRRC33 es un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une a un gran complejo latente de TGFβ1 asociado con LRRC33, inhibiendo así la liberación de TGFβ1 activo del complejo; y, en el que el anticuerpo aislado o fragmento del mismo no se une a un gran complejo latente de TGFβ1 asociado con GARP o un LTBP.

[0053]En una realización, las células hematopoyéticas son células mieloides y/o linfoides. En una realización, las células hematopoyéticas son células de mieloma. En una realización, las células hematopoyéticas son células de linfoma.

[0054]En una realización, el anticuerpo se une a proTGFβ1, LRRC33, o combinación de los mismos, pero no se une a TGFβ1 maduro libre.

[0055]En un aspecto, se divulga en el presente documento un método para tratar un cáncer de la sangre, el método comprende un paso de administrar a un sujeto que sufre de un cáncer de la sangre una cantidad eficaz de un inhibidor de LRRC33 para inhibir el cáncer de la sangre en el sujeto.

[0056]En una realización, el cáncer de la sangre se selecciona del grupo que consiste en leucemia, linfoma y mieloma múltiple. En una realización, la leucemia se selecciona del grupo que consiste en: leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL) y leucemia mieloide crónica (CML).

[0057]En una realización, el inhibidor de LRRC33 es un anticuerpo inhibidor de LRRC33.

[0058]En una realización, el anticuerpo inhibidor es a) un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une a un gran complejo latente de TGFβ1, inhibiendo así la liberación de TGFβ1 activo del complejo; o b) un anticuerpo aislado que se une a LRRC33 expresado en una célula, en el que el anticuerpo comprende un dominio Fc para inducir ADCC de la célula.

[0059]En una realización, el anticuerpo inhibidor es un anticuerpo totalmente humano o un anticuerpo humanizado. En una realización, el anticuerpo inhibidor es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo multimérico. En una realización, el anticuerpo multimérico es un anticuerpo biespecífico.

[0060] En una realización, el sujeto ha recibido un trasplante de médula ósea.

[0061]En una realización, el sujeto es tratado con una terapia adicional para el cáncer de sangre. En una realización, el sujeto no responde o responde mal a la terapia adicional. En una realización, el tratamiento adicional es un antagonista de PD-1 o un inhibidor de tirosina quinasa. En una realización, el inhibidor de tirosina quinasa es un inhibidor de Bcr/Abl.

[0062]En una realización, el inhibidor de LRRC33 se administra como terapia combinada.

[0063]A todos los efectos de la presente divulgación, se cita el contenido pertinente de las solicitudes internacionales de patente PCT/US2013/068613, PCT/US2014/036933, PCT/US2015/059468, PCT/US2016/052014, PCT/US2017/021972.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0064]

La FIG.1 proporciona un resumen del análisis informático que enumera las líneas celulares representativas con un cambio estadísticamente significativo en la expresión de la molécula presentadora de TGFβ.

La FIG.2 muestra un gráfico de barras con la expresión de LRRC33 en líneas celulares cancerosas.

La FIG.3 muestra la expresión de ARNm de LRRC33 en líneas celulares de cáncer.

La FIG.4 proporciona una lista parcial de células cancerosas que muestran una expresión elevada de LRRC33 y una expresión concurrente de TGFβ1.

La FIG.5 muestra un gráfico de la expresión relativa de LRRC33 en la superficie celular de macrófagos polarizados/activados.

La FIG.6 muestra un esquema de los subtipos y fenotipos de macrófagos polarizados (adaptado de O'Neill et al., 2015).

En la FIG.7 se muestran dos paneles que muestran la supresión por Treg de la proliferación de efectores T y los efectos del anticuerpo inhibidor.

La FIG.8 proporciona datos que muestran que las Tregs regulan en positivo la expresión de GARP tras la estimulación.

La FIG.9 muestra el cambio fenotípico mediado por la activación en las Tregs humanas.

La FIG.10 muestra la presencia de niveles significativos de Tregs y macrófagos en los pulmones de ratón del modelo de metástasis 4T1.

Las FIG.11A, FIG.11B y FIG.11C muestran la polarización de macrófagos inducida por un panel de citoquinas: (FIG.11A) Expresión de LRRC33 en cuatro subtipos de macrófagos; (FIG.11B) Datos FACS; (FIG. 11C) número de moléculas superficiales de LRRC33 en la superficie de los macrófagos.

Las FIG.12A y FIG.12B proporcionan datos que muestran que LRRC33 es un marcador específico para macrófagos "TAM" activados por M-CSF, proporcionando una diana altamente selectiva en comparación con los marcadores mieloides amplios que se utilizan actualmente como dianas terapéuticas en inmuno-oncología. Las FIG.13A y FIG.13B proporcionan datos que muestran una expresión selectiva de LRRC33 en la superficie celular, en comparación con una expresión más amplia de CD33. Los monocitos y neutrófilos humanos muestran poca o ninguna expresión superficial de LRRC33 directamente ex vivo en contraste con CD33. Las FIG.14A y FIG.14B proporcionan datos de ARN Bloodspot, mostrando que el ARN LRRC33 se expresa alta y uniformemente en una variedad de tipos de AML y a niveles más bajos en poblaciones de precursores hematopoyéticos.

La FIG.15 proporciona datos de un ensayo de internalización utilizando el anticuerpo SRL1 de LRRC33. Se utilizó un anticuerpo anti-CD33 como control positivo en cada caso.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE ALGUNAS REALIZACIONES

[0065]La presente divulgación proporciona terapéuticos que son útiles para tratar trastornos proliferativos asociados con células/tejidos hematológicos. Estos trastornos incluyen, entre otros, los cánceres de células sanguíneas y tejidos hematopoyéticos (p. ej., la médula ósea), así como de células inmunitarias que regulan la inmunidad antitumoral del paciente. Por lo tanto, la invención incluye composiciones relacionadas, uso de las mismas, métodos de fabricación relacionados, así como métodos de tratamiento. Las composiciones aquí divulgadas tienen ventajosamente la capacidad de modular la actividad de las células inmunitarias en los tumores, proporcionando así, en un aspecto, un método para tratar el cáncer afectando a una población celular que directa o indirectamente afecta al crecimiento del tumor.

Definiciones

[0066]Para facilitar la comprensión de la divulgación, se definen en primer lugar algunos términos. Estas definiciones deben leerse a la luz del resto de la divulgación y tal como las entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica. Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica. A lo largo de la descripción detallada figuran otras definiciones.

[0067]Leucemia mieloide aguda:La leucemia mieloide aguda (AML) es un cáncer de la línea mieloide de las células sanguíneas, caracterizado por el rápido crecimiento de glóbulos blancos anormales que se acumulan en la médula ósea e interfieren en la producción de células sanguíneas normales. La AML es la leucemia aguda más frecuente que afecta a los adultos. Dentro de la AML se identifican múltiples subtipos, así como mutaciones genéticas asociadas a cada categoría.

[0068]Anticuerpo:El término "anticuerpo", tal y como se utiliza aquí, engloba inmunoglobulinas o anticuerpos nativos, fragmentos de los mismos, variantes de los mismos, así como agentes de ingeniería de unión a antígenos. Por lo tanto, dichos anticuerpos pueden ser cualquier isotipo o construcción quimérica. Un anticuerpo de la invención puede comprender una cadena ligera humana, por ejemplo, cadenas ligeras kappa y lambda. Un anticuerpo de la invención puede comprender una cadena pesada, por ejemplo, mu, delta, gamma, alfa y épsilon, que típicamente definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Un anticuerpo puede incluir una región para efectuar la función efectora, como una región Fc que es la principal responsable de la función efectora.

[0069]Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos:La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), también denominada citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, es un mecanismo de defensa inmunitaria mediada por células por el que una célula efectora del sistema inmunitario lisa activamente una célula diana, cuyos antígenos de la superficie de la membrana han sido unidos por anticuerpos específicos. La ADCC requiere una célula efectora, como los linfocitos T asesinos (NK), los macrófagos, los neutrófilos y los eosinófilos. La ADCC forma parte de la respuesta inmunitaria adaptativa debido a su dependencia de una respuesta previa de anticuerpos. El recubrimiento de las células diana con anticuerpos se denomina a veces opsonización.

[0070]Conjugado anticuerpo-fármaco:El término conjugado anticuerpo-fármaco, o ADC, se refiere a anticuerpos o moléculas funcionalmente equivalentes (p. ej., agentes de unión) unidos a uno o más agentes citotóxicos o de destrucción celular. Los ejemplos incluyen un anticuerpo monoclonal para un antígeno asociado al tumor que tiene una expresión restringida o nula en las células normales (sanas), donde el anticuerpo se conjuga con un potente agente citotóxico (generalmente un fármaco de molécula pequeña con una alta toxicidad sistémica) destinado a inducir la muerte de la célula diana tras ser internalizado en la célula tumoral y liberado.

[0071]Fragmentos de anticuerpos:Los fragmentos de anticuerpo o porciones de unión a antígeno incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpo de dominio (dAb), fragmentos de región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos de cadena simple (scFv), fragmentos de anticuerpo de cadena simple, anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpo, anticuerpo lineal; anticuerpo recombinante quelante, un tricuerpo o bibicuerpo, un intracuerpo, un nanocuerpo, un pequeño inmunofármaco modular (SMIP), una proteína de fusión de inmunoglobulina con dominio de unión a antígeno, un anticuerpo camelado, un anticuerpo que contenga VHH, o una variante o un derivado de los mismos, y polipéptidos que contengan al menos una porción de inmunoglobulina suficiente para conferir al polipéptido una unión específica al antígeno, como una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias CDR, siempre que el anticuerpo conserve la actividad biológica deseada.

[0072]Trastorno proliferativo de la médula ósea:Tal como se utiliza aquí, el término "trastorno proliferativo de la médula ósea" incluye afecciones en las que las células de la médula ósea experimentan una división celular anormal. Estos trastornos proliferativos incluyen afecciones cancerosas (malignas) y no cancerosas (benignas) de la médula ósea.

[0073]Fibroblasto asociado al cáncer:Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) también se denominan fibroblastos asociados al carcinoma, y estos términos se utilizan indistintamente en el presente documento. Representan una subpoblación de células heterogéneas que residen en el microentorno tumoral. Fenotípicamente, los CAF pueden ser similares a los miofibroblastos y se reorientan hacia la carcinogénesis, por ejemplo, promueven el proceso de transformación fomentando el crecimiento tumoral, la angiogénesis, la inflamación y/o la metástasis. Los CAF suelen derivar de los fibroblastos normales del estroma circundante, pero también pueden proceder de pericitos, células musculares lisas, fibrocitos, células madre mesenquimales (MSC, a menudo derivadas de la médula ósea), o a través de la transición epitelio-mesénquima (EMT) o la transición endotelio-mesénquima (EndMT).

[0074]TGFp de superficie celular o asociado a células:Tal como se utiliza en el presente documento, se dice que la forma proproteica (por lo tanto latente) TGFβ está asociada a células, en contraposición a asociada a ECM o matriz, cuando es presentada por una molécula presentadora que está localizada en la superficie celular, por ejemplo, moléculas presentadoras asociadas a la membrana celular. Ejemplos de proTGFβ de superficie celular incluyen el proTGFβ presentado por GARP y el proTGFβ presentado por LRRC33.

[0075]Beneficios clínicos:Tal y como se utiliza aquí, el término pretende incluir tanto la eficacia como la seguridad de una terapia. Así pues, el tratamiento terapéutico que logra un beneficio clínico deseable es a la vez eficaz y seguro (p. ej., con toxicidades o acontecimientos adversos tolerables o aceptables).

[0076]Terapia combinada:Como se utiliza aquí, el término se refiere a regímenes de tratamiento para una indicación clínica que comprenden dos o más agentes terapéuticos.

[0077]Citotoxicidad dependiente del complemento:El término citotoxicidad dependiente del complemento, o CDC, se refiere al proceso por el que se activa la cascada del complemento, en el que uno o más complejos de ataque de membrana (MAC) se insertan en una diana (p. ej., un patógeno) que provoca una hinchazón coloide-osmótica letal.

[0078]Leucemia mieloide crónica:La leucemia mieloide crónica (o mielógena o mielocítica) (CML), también conocida como leucemia granulocítica crónica (CGL), es un cáncer de los glóbulos blancos. Es una forma de leucemia caracterizada por el crecimiento aumentado y no regulado de células predominantemente mieloides en la médula ósea y la acumulación de estas células en la sangre. La CML es un trastorno clonal de las células madre de la médula ósea en el que se produce una proliferación de granulocitos maduros (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) y sus precursores. Es un tipo de enfermedad mieloproliferativa asociada a una translocación cromosómica característica denominada cromosoma Filadelfia.

[0079]Depleción:En el contexto de la presente divulgación, "depleción de células que expresan LRRC33 de superficie celular" o similares se refiere a i) matar o destruir dichas células dirigiéndose a LRRC33 de superficie celular o al complejo que lo comprende; y/o, ii) eliminar LRRC33 de superficie celular o el complejo que lo comprende de dichas células (es decir,de la superficie celular), por ejemplo, induciendo la internalización. En cualquiera de los dos modos de acción, un resultado común es la reducción del número de células que expresan LRRC33 en la superficie celular, mientras que en el segundo se puede prescindir de las propias células.

[0080]TGF@ asociado a la ECM:Tal como se utiliza en el presente documento, se dice que la forma proproteica (por tanto latente) TGFβ está asociada a la ECM (o "asociada a la matriz"), en contraposición a asociada a la célula (o localizada en la superficie celular), cuando es presentada por una molécula presentadora que está localizada extracelularmente, por ejemplo, componentes de la ECM. El proTGFβ presentado por LTBP1 o LTBP3 es un ejemplo de TGFβ asociado a la ECM.

[0081]Cantidad efectiva:Una cantidad eficaz (o cantidad terapéuticamente eficaz) es una dosis o régimen de dosificación que logra beneficios clínicos estadísticamente significativos en una población de pacientes. Así, una cantidad eficaz de un inhibidor de LRRC33 consigue una eficacia suficiente con toxicidades tolerables cuando se administra a un sujeto o a una población de pacientes.

[0082]Regiones Fc:Los anticuerpos o fragmentos abarcados por la presente divulgación pueden contener una región/dominio que confiera una función efectora. La región Fc de un anticuerpo media su semivida sérica y sus funciones efectoras, como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP). Los anticuerpos terapéuticos diseñados para contener una región Fc o similar a Fc (p. ej., anticuerpos monoclonales y proteínas de fusión Fc) están incluidos en esta invención.

[0083]Complejo GARP-TGFp1:Tal como se utiliza en el presente documento, el término "complejo GARP-TGFβ1" se refiere a un complejo proteico que comprende una forma proproteica o forma latente de una proteína del factor de crecimiento transformante-p1 (TGFβ1) y una proteína predominante de repeticiones de glicoproteína-A (GARP). En algunas formas de realización, una forma proproteica o forma latente de la proteína TGFβ1 puede denominarse "proteína proTGFβ1/TGFβ1 latente". En algunas formas de realización, un complejo GARP-TGFβ1 comprende GARP unido covalentemente con proTGFβ1/TGFβ1 latentea través deuno o más enlaces disulfuro. En otras formas de realización, un complejo GARP-TGFβ1 comprende GARP unida de forma no covalente con proTGFβ1/TGFβ1 latente. En algunas formas de realización, un complejo GARP-TGFβ1 es un complejo que se produce de forma natural, por ejemplo un complejo GARP-TGFβ1 en una célula.

[0084]Cáncer hematológico:El término "cáncer hematológico" se refiere a un cáncer que comienza en el tejido hematopoyético, como la médula ósea, o en las células del sistema inmunitario. Algunos ejemplos de cáncer hematológico son la leucemia, el linfoma, la mielofibrosis y el mieloma múltiple.

[0085]Trastorno proliferativo hematológico:El término "trastorno proliferativo hematológico", tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a afecciones caracterizadas por una división celular anormal (maligna o benigna) en las células sanguíneas o en los tejidos hematopoyéticos, por ejemplo, las células de la médula ósea.

[0086]Leucemia:La leucemia es un cáncer de los tejidos hematopoyéticos del organismo, incluida la médula ósea y el sistema linfático, y puede ser aguda o crónica. Algunas formas de leucemia son más frecuentes en niños, mientras que otras se dan sobre todo en adultos. La leucemia suele afectar a los glóbulos blancos (p. ej., células mieloides y linfoides). Los cuatro tipos principales de leucemia son: Leucemia mieloide aguda (o mielógena) (AML); Leucemia mieloide crónica (o mielógena) (CML); Leucemia linfocítica aguda (o linfoblástica) (ALL); y. Leucemia linfocítica crónica (CLL).

[0087]Tumor localizado:En el contexto de la presente divulgación, el término "localizado" (como en "tumor localizado") se refiere a anomalías anatómicamente aisladas o aislables, como los tumores malignos sólidos, en contraposición a la enfermedad sistémica. Ciertas leucemias, por ejemplo, pueden tener tanto un componente localizado (por ejemplo, la médula ósea) como un componente sistémico (por ejemplo, células sanguíneas circulantes) de la enfermedad.

[0088]Inhibidor de LRRC33:Como se utiliza en el presente documento, el término "inhibidor de LRRC33" se refiere a un agente que se une a LRRC33 o a un complejo que comprende LRRC33, perturbando o interfiriendo así con su función o disponibilidad. Preferiblemente, dicho agente es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a un epítopo de LRRC33 o complejo que contiene LRRC33 presente en la superficie celular. Los inhibidores de LRRC33 pueden o no ejercer efectos inhibidores modulando la disponibilidad o activación del factor de crecimiento TGFβ.

[0089]Complejo LRRC33-TGFp1:Tal como se utiliza en el presente documento, el término "complejo LRRC33-TGFβ1" se refiere a un complejo entre una forma proproteica o forma latente de la proteína factor de crecimiento transformante-μl (TGFβ1) y una proteína 33 que contiene repetición rica en leucina (LRRC33; también conocida como regulador negativo de especies reactivas de oxígeno o<n>R<r>OS). En algunas formas de realización, un complejo LRRC33-TGFβ1 comprende LRRC33 unido covalentemente con proTGFβ1/TGFβ1 latente a través de uno o más enlaces disulfuro. En otras formas de realización, un complejo LRRC33-TGFβ1 comprende LRRC33 unido de forma no covalente con proTGFβ1/TGFβ1 latente. En algunas formas de realización, un complejo LRRC33-TGFβ1 es un complejo que se produce de forma natural, por ejemplo un complejo LRRC33-TGFβ1 en una célula.

[0090]Macrófago:Los macrófagos son un tipo de glóbulos blancos del sistema inmunitario e incluyen subpoblaciones celulares heterogéneas y fenotípicamente diversas. Algunos macrófagos se diferencian de los monocitos circulantes derivados de la médula ósea, mientras que otros son macrófagos específicos de tejidos que residen en localizaciones anatómicas o tisulares concretas (macrófagos "residentes"). Los macrófagos específicos de tejido incluyen, entre otros: Macrófagos del tejido adiposo; Células de Kupffer (Hígado); Histiocitos sinusales (Ganglios linfáticos); Macrófagos alveolares (o células de polvo, alvéolos pulmonares de los pulmones); Macrófagos tisulares (histiocitos) que dan lugar a células gigantes (Tejido conjuntivo); Células de Langerhans (Piel y mucosas); Microglía (Sistema nervioso central); Células de Hofbauer (placenta); células mesangiales intraglomerulares (riñón); osteoclastos (hueso); células epitelioides (granulomas); macrófagos de la pulpa roja (o células de revestimiento sinusoidal, pulpa roja del bazo); macrófagos peritoneales (cavidad peritoneal); y, LysoMac (placa de Peyer). Los macrófagos, por ejemplo, los monocitos derivados de la médula ósea, pueden activarse por determinados estímulos (como las citoquinas) dando lugar a fenotipos polarizados,por ej.,M1 y M2. Los macrófagos con sesgo M2 se clasifican a su vez en varios subtipos fenotípicamente distintos, como M2a, M2b, M2c (p. ej., pro-fibróticos) y M2d (pro-tumorales o de tipo TAM).

[0091]Microentorno: El término "microambiente", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un nicho local en un sistema biológico asociado con una o varias características particulares de interés, como determinados compartimentos celulares/tejidos o loci de enfermedad, como en "microambiente de enfermedad". Dicha enfermedad o loci de enfermedad puede incluir tejidos fibróticos (p. ej., órganos fibróticos o médula ósea), tumores, miopatías (p. ej.,una cardiomiopatía), etc. En consecuencia, por "microambiente tumoral" se entiende el entorno celular/tejido en el que existe el tumor, incluidos los vasos sanguíneos circundantes, las células inmunitarias, los fibroblastos, las células inflamatorias derivadas de la médula ósea, los linfocitos, las moléculas de señalización y la matriz extracelular (ECM). El tumor y los componentes circundantes del microentorno están estrechamente relacionados e interactúan constantemente. Los tumores pueden influir en el microentorno liberando señales extracelulares, promoviendo la angiogénesis tumoral e induciendo la tolerancia inmunitaria periférica, mientras que los componentes del microentorno, como las células inmunitarias, pueden afectar al crecimiento y la evolución de las células cancerosas.

[0092]Mieloma múltiple:El mieloma múltiple (MM), también conocido como mieloma de células plasmáticas, es un cáncer de células plasmáticas, un tipo de glóbulo blanco normalmente encargado de producir anticuerpos. Al principio, no suele notarse ningún síntoma. Cuando está avanzada, pueden aparecer dolores óseos, hemorragias, infecciones frecuentes y anemia. Las complicaciones pueden incluir la amiloidosis.

[0093]Mielofibrosis:La mielofibrosis, también conocida como osteomielofibrosis, es un trastorno proliferativo de la médula ósea relativamente raro, que pertenece a un grupo de enfermedades denominadas trastornos mieloproliferativos. La mielofibrosis se clasifica en la rama de las neoplasias mieloproliferativas con cromosoma Filadelfia negativo (-). La mielofibrosis se caracteriza por la proliferación de un clon anormal de células madre hematopoyéticas en la médula ósea y otras localizaciones, lo que provoca fibrosis o sustitución de la médula por tejido cicatricial. El término mielofibrosis, a menos que se especifique lo contrario, se refiere a la mielofibrosis primaria (<p>M<f>). También puede denominarse mielofibrosis idiopática crónica (FIMc) (los términos idiopática y primaria significan que en estos casos la enfermedad es de origen desconocido o espontáneo). Esto contrasta con la mielofibrosis secundaria a la policitemia vera o a la trombocitopenia esencial. La mielofibrosis es una forma de metaplasia mieloide, que hace referencia a un cambio en el tipo de célula del tejido hematopoyético de la médula ósea, y a menudo ambos términos se utilizan como sinónimos. Los términos metaplasia mieloide agnogénica y mielofibrosis con metaplasia mieloide (MMM) también se utilizan para referirse a la mielofibrosis primaria.

[0094]Célula supresora derivada de mieloides(MDSC):Las células supresoras derivadas de los mieloides, o MDSC, son un grupo heterogéneo de células inmunitarias de linaje mieloide. Las MDSC tienen propiedades inmunosupresoras y se ha descrito su expansión en situaciones patológicas como las infecciones crónicas y el cáncer, como resultado de una hematopoyesis alterada. Las MDSC tienen propiedades inmunosupresoras. Las pruebas clínicas y experimentales indican que los tejidos cancerosos con una elevada infiltración de MDSC se asocian a un mal pronóstico de los pacientes y a la resistencia a las terapias. Las MDSC incluyen múltiples subtipos. Por ejemplo, un subtipo de MDSCs es una población de células mononucleares inmaduras que son fenotípica y morfológicamente similares a los monocitos (p. ej., a las "monocíticas", de ahí M-MDSCs). Otro subtipo es una población de células polinucleares inmaduras que fenotípica y morfológicamente se parecen a los neutrófilos. La función supresora de las MDSC incluye su capacidad para inhibir la proliferación y activación de las células T. En los individuos sanos, las células mieloides inmaduras que se forman en la médula ósea se diferencian en células dendríticas, macrófagos y neutrófilos. Sin embargo, en condiciones inflamatorias crónicas (infecciones víricas y bacterianas) o cáncer, la diferenciación mieloide se inclina hacia la expansión de las MDSC. Estas MDSC se infiltran en los focos de inflamación y en los tumores, donde detienen las respuestas inmunitarias inhibiendo, por ejemplo, las células T y las células NK. Las MDSC también aceleran la angiogénesis, la progresión tumoral y la metástasis mediante la expresión de citoquinas y factores como el TGF-beta

[0095] La actividad de las MDSC se describió originalmente como supresora de las células T, en particular de las respuestas de las células T CD8+. El espectro de acción de la actividad de las MDSC también abarca las células NK, las células dendríticas y los macrófagos. La actividad supresora de las MDSC viene determinada por su capacidad para inhibir la función efectora de los linfocitos. La inhibición puede deberse a diferentes mecanismos. Se atribuye principalmente a los efectos del metabolismo de la L-arginina. Otro factor importante que influye en la actividad de las MDSC es la opresión de ROS

[0096]Célula T reguladora(Treg):Las Tregs se caracterizan por la expresión de los biomarcadores CD4, FOXP3 y CD25. Las células Treg se denominan a veces células T supresoras y representan una subpoblación de células T que modulan el sistema inmunitario, mantienen la tolerancia a los autoantígenos y previenen las enfermedades autoinmunitarias. Las Tregs son inmunosupresoras y generalmente suprimen o regulan en negativo la inducción y proliferación de células T efectoras. Las Tregs pueden desarrollarse en el timo (las denominadas Tregs "naturales" CD4+ Foxp3+) o diferenciarse a partir de células T CD4+ naive en la periferia, por ejemplo, tras la exposición a TGFβ o ácido retinoico.

[0097]Tumor sólido:El término "tumor sólido" (o "un tumor") hace referencia a trastornos proliferativos que dan lugar a un crecimiento o masa anormal de tejido que no suele contener quistes ni zonas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos (no cancerosos) o malignos (cancerosos). Tumor sólido puede referirse a un tumor primario (el crecimiento original) o a un tumor secundario (resultante de la metástasis de un tumor primario). Un tumor sólido puede comprender: células cancerosas (malignas), estroma circundante, que puede incluir fibroblastos activados (p. ej., de fenotipo miofibroblástico), células inmunitarias infiltradas, como macrófagos y neutrófilos, así como vasos sanguíneos.

[0098]Célula diana:En el presente documento, por célula diana se entiende una célula cuya función se va a alterar farmacológicamente. En el contexto de la presente divulgación, las células diana expresan LRRC33 en la superficie celular. Un inhibidor de LRRC33 según la invención es capaz de agotar o antagonizar LRRC33 expresado en una célula diana. La célula diana puede expresar receptores de superficie celular para citocinas derivadas de la enfermedad, como CCL2/MCP-1 y M-CSF.

[0099]Tratar, tratamiento:El término "tratar" o similar se refiere en sentido amplio a: causar beneficios terapéuticos en un paciente, por ejemplo, mejorando o reforzando la inmunidad del organismo; reduciendo o revirtiendo la inmunodepresión; reduciendo, eliminando (p. ej., agotando) o erradicando las células nocivas (por ej., células asociadas a tumores, como TAM, TAN y CAF) o sustancias del organismo; reducir la carga de la enfermedad (p. ej., la carga tumoral); prevenir la recurrencia o recidiva; y/o mejorar la supervivencia. La "depleción" de las células nocivas no requiere necesariamente la eliminación física de dichas células del paciente afectado; más bien, el agotamiento puede lograrse mediante la neutralización de determinadas actividades o funciones biológicas asociadas a dichas células nocivas. El término incluye tratamientos terapéuticos, tratamientos profilácticos y aplicaciones en las que se reduce el riesgo de que un sujeto desarrolle un trastorno u otro factor de riesgo. El tratamiento no requiere la curación completa de un trastorno y abarca las formas en que se reducen los síntomas o los factores de riesgo subyacentes.

TGFp

[0100]Los factores de crecimiento TGFβ (TGFβ1, TGFβ2 y TGFβ3) son miembros de la superfamilia TGFβ de factores de crecimiento y se expresan ampliamente por la mayoría, si no todos, los tipos celulares y tejidos. Los factores de crecimiento TGFβ intervienen en una serie de procesos biológicos, como la diferenciación y la proliferación celular.

[0101]La importancia biológica de la vía del TGFβ en los seres humanos ha sido validada por enfermedades genéticas. La enfermedad de Camurati-Engelman provoca displasia ósea debido a una mutación autosómica dominante en el gen TGFB1, que conduce a la activación constitutiva de la señalización de TGFβ1 (Janssens, K., et al., J Med Genet, 2006. 43(1): p. 1-11). Los pacientes con síndrome de Loeys/Dietz presentan mutaciones autosómicas dominantes en componentes de la vía de señalización TGFβ, que causan aneurisma aórtico, hipertelorismo y úvula bífida (Van Laer, L., H. Dietz y B. Loeys, Adv Exp Med Biol, 2014. 802: p. 95-105). Dado que la desregulación de la vía del TGFβ se ha implicado en múltiples enfermedades, se han desarrollado y probado en pacientes varios fármacos dirigidos a la vía del TGFβ, pero con un éxito limitado.

[0102]Como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo: WO 2014/074532, WO 2014/182676, y WO 2017/156500), una faceta de la regulación del TGFβ implica sus asociaciones diferenciales con moléculas presentadoras específicas del tejido, mediante las cuales el TGFβ puede ejercer efectos biológicos específicos del contexto dentro de un nicho o microambiente local. Estas proteínas que interactúan con y por lo tanto "presentan" una forma inactiva, latente del complejo TGFβ (p. ej., complejos proTGFβ) incluyen: LTBP1, LTBP3, GARP (también conocido como LRRC32) y l Rr C33. lTb P1 y LTBP3 son proteínas secretadas y componentes de la matriz extracelular. Se identificaron originalmente por su asociación con la forma latente de los factores de crecimiento transformantes. Interactúan con diversas proteínas de la matriz extracelular y pueden desempeñar un papel en la regulación de la biodisponibilidad de TGFβ. Por otro lado, GARP y LRRC33 se expresan en la superficie celular de un pequeño subconjunto de tipos celulares donde "presentan" TGFβ latente como un complejo GARP-proTGFβ o LRRC33-proTGFβ. Así, a través de su asociación con TGFβ (TGFβ1, TGFβ2 o TGFβ3, particularmente TGFβ1), LRRC33 puede contribuir a la biodisponibilidad y señalización de TGFβ en nichos o microambientes seleccionados.

LRRC33

[0103]La proteína 33 que contiene repetición rica en leucina ("LRRC33"; también denominada "regulador negativo de las especies reactivas del oxígeno" o "NRROS") es una proteína transmembrana que está estrechamente relacionada con la GARP y solo recientemente se ha confirmado que funciona como molécula presentadora de TGFβ1 (Wang, R., et al., Mol Biol Cell, 2012. 23(6): 1129-39; y, T.A. Springer, Int. Conferencia BMP, octubre de 2016; WO 2018/081287). Se ha informado de que la expresión de la proteína LRRC33 se limita en gran medida a las células del linaje de los monocitos (p. ej., macrófagos y microglía). En los ratones LRRC33-/- se observó paraparesia ascendente, seguida de tetraplejia y muerte a los cinco meses de edad (Timothy Springer, Int. Conferencia BMP, octubre de 2016). En consonancia con el fenotipo neurodegenerativo observado en los ratones LRRC33-/-, el grupo de Springer descubrió que LRRC33 está altamente expresado en la microglía, que se sabe que desempeña un papel crucial en el crecimiento y guiado axonal en el cerebro.

[0104]Investigaciones posteriores de los inventores de la presente divulgación han revelado que en contextos de enfermedad, varias células cancerosas hematológicas expresan altos niveles de LRRC33. Las líneas celulares representativas con cambios significativos en la expresión de la molécula presentadora de TGFβ incluyen, entre otras: células de leucemia mieloide aguda, células de mieloma de células plasmáticas, células de leucemia linfoblástica aguda de células T, células de leucemia mieloide crónica en fase blástica, células de leucemia linfoblástica aguda de células B, células de leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño, células de linfoma de células B, células de linfoma de Burkitt, células de linfoma de células del manto, células de leucemia linfoblástica aguda, células de linfoma anaplásico de células grandes, células de linfoma difuso de células B grandes y células de linfoma de Hodgkin. La sobreexpresión simultánea de TGFβ1 observada en estas células ha sugerido que las actividades de TGFβ1 presentes en LRRC33 pueden contribuir a la patología.

[0105]Además, la sobreexpresión preferencial de LRRC33 se encuentra en la superficie celular de unsubconjunto,pero no todos, de macrófagos polarizados, a saber, células M2c y de tipo TAM, que son fenotipos profibróticos y similares a macrófagos asociados a tumores, respectivamente. Estas subpoblaciones de macrófagos que expresan LRRC33 pueden interactuar directamente e influir en el reclutamiento y/o diferenciación de varios tipos celulares, como las células T inmunosupresoras (Tregs) y los miofibroblastos o CAFs, en el entorno de la enfermedad, como la EMT y los tejidos fibróticos. De hecho, se sabe que las Tregs, que tras la estimulación expresan TGFβ1 presentado por GARP, se infiltran en múltiples tipos de tumores sólidos, lo que plantea la posibilidad de que los macrófagos que expresan LRRC33 puedan estar implicados en el desencadenamiento o la facilitación de este proceso. Además, los macrófagos expuestos a ciertas citocinas asociadas a la enfermedad, como M-CSHCSF-1, muestran un fuerte aumento del nivel de LRRC33 en la superficie celular, lo que plantea la posibilidad de que, en una EMT in vivo, el CSF-1 derivado del tumor pueda inducir aún más la activación de los macrófagos hacia fenotipos pro-tumorales, lo que llevaría a la progresión de la enfermedad. El conjunto de estas observaciones sugiere que el eje LRRC33-TGFβ1 puede ser un factor común que media en la supresión inmunitaria/exclusión de células efectoras en el microambiente tumoral, lo que conduce a la evasión inmunitaria de las células tumorales y a la progresión de la enfermedad.

Composiciones de anticuerpos inhibidores

[0106]En consecuencia, algunas realizaciones de la presente divulgación incluyen composiciones (p. ej., composiciones farmacéuticas) que comprenden un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, que son útiles para inhibir un subconjunto de la señalización de TGFβ1, a saber, mediada por LRRC33. En cualquiera de las realizaciones, el término "anticuerpo" puede referirse a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno diana, e incluye, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos y biespecíficos. Un anticuerpo intacto comprenderá generalmente al menos dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, pero en algunos casos puede incluir menos cadenas, como los anticuerpos que se producen naturalmente en los camélidos, que pueden comprender sólo cadenas pesadas. Los anticuerpos pueden derivarse únicamente de una única fuente, o pueden ser "quiméricos", es decir, diferentes porciones del anticuerpo pueden derivarse de dos anticuerpos diferentes. Los anticuerpos, o porciones de los mismos que se unen a antígenos, pueden producirse en hibridomas, mediante técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. El término anticuerpos, tal como se utiliza aquí, incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (en ocasiones denominados aquí "miméticos de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpos (en ocasiones denominados aquí "conjugados de anticuerpos"), respectivamente. En algunas formas de realización, el término también engloba pepticuerpos.

[0107]Las unidades estructurales de anticuerpos de origen natural comprenden típicamente un tetrámero. Cada uno de estos tetrámeros se compone típicamente de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par con una cadena "ligera" de longitud completa (en ciertas formas de realización, aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" de longitud completa (en ciertas formas de realización, aproximadamente 50-70 kDa). La porción aminoterminal de cada cadena suele incluir una región variable de entre 100 y 110 aminoácidos o más que suele ser responsable del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena suele definir una región constante que puede ser responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras de los anticuerpos humanos suelen clasificarse en cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas suelen clasificarse en mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo. Un anticuerpo puede ser de cualquier tipo (porej.,IgM, IgD, IgG, IgA, IgY e IgE) y clase (porej.,IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1 e IgA2). En las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, las regiones variable y constante suelen estar unidas por una región "J" de unos 12 o más aminoácidos, y la cadena pesada también incluye una región "D" de unos 10 aminoácidos más (véase,por ej.Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed., Ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras/pesadas suelen formar el sitio de unión al antígeno.

[0108]Las regiones variables exhiben típicamente la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par suelen estar alineadas por las regiones marco, lo que puede permitir la unión a un epítopo específico. De N-terminal a C-terminal, las regiones variables de las cadenas ligera y pesada comprenden típicamente los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio suele ajustarse a las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883. Las Cd R de una cadena ligera también pueden denominarse CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, y las CDR de una cadena pesada también pueden denominarse CDR-H1, CDR-H2y CDR-H3. En algunas formas de realización, un anticuerpo puede comprender un pequeño número de deleciones de aminoácidos del extremo carboxilo de la(s) cadena(s) pesada(s). En algunas formas de realización, un anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene deleciones de 1-5 aminoácidos en el extremo carboxilo de la cadena pesada. En ciertas formas de realización, la delineación definitiva de una CDR y la identificación de los residuos que comprenden el sitio de unión de un anticuerpo se logra resolviendo la estructura del anticuerpo y/o resolviendo la estructura del complejo anticuerpo-ligando. En ciertas formas de realización, esto puede lograrse mediante una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, como la cristalografía de rayos X. En algunas formas de realización, se pueden emplear varios métodos de análisis para identificar o aproximar las regiones CDR. Algunos ejemplos de estos métodos son, entre otros, la definición de Kabat, la definición de Chothia, la definición de AbM y la definición de contacto.

[0109]Un "sitio funcional de unión a antígeno" de una proteína de unión es aquel que puede unirse a una diana, antígeno o ligando. La afinidad de unión al antígeno del sitio de unión al antígeno no es necesariamente tan fuerte como la proteína de unión parental de la que se deriva el sitio de unión al antígeno, pero la capacidad de unión al antígeno debe ser medible utilizando cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar la unión de la proteína de unión a un antígeno. Además, la afinidad de unión a antígeno de cada uno de los sitios de unión a antígeno de una proteína de unión multiespecífica no tiene por qué ser cuantitativamente la misma.

[0110]El término "región variable" o "dominio variable" se refiere a una porción de las cadenas ligera y/o pesada de un anticuerpo, que típicamente incluye aproximadamente los 120 a 130 aminoácidos aminoterminales en la cadena pesada y aproximadamente 100 a 110 aminoácidos aminoterminales en la cadena ligera. En ciertas formas de realización, las regiones variables de diferentes anticuerpos difieren ampliamente en la secuencia de aminoácidos, incluso entre anticuerpos de la misma especie. La región variable de un anticuerpo suele determinar la especificidad de un anticuerpo concreto para su diana.

[0111]Un dominio constante de inmunoglobulina se refiere a un dominio constante de cadena pesada o ligera. Las secuencias de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada y la cadena ligera de la IgG humana son conocidas en la técnica.

[0112]El término "competir" cuando se usa en el contexto de proteínas de unión a antígeno (porej.,un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo) que compiten por el mismo epítopo significa competencia entre proteínas de unión a antígeno según se determina mediante un ensayo en el que la proteína de unión a antígeno que se está probando impide o inhibe (porej.,reduce) la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia a un antígeno común (por ej.,TGFβ1 o un fragmento del mismo). Se pueden utilizar numerosos tipos de ensayos de unión competitiva para determinar si una proteína de unión a antígeno compite con otra, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, enzimoinmunoensayo (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición en sándwich; EIA directo de biotina-avidina en fase sólida; ensayo marcado directo en fase sólida, y ensayo marcado directo en sándwich en fase sólida. Normalmente, cuando una proteína de unión a antígeno competidora está presente en exceso, inhibirá (por ej., reducirá) la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia a un antígeno común en al menos un 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% o 75% o más. En algunos casos, la unión se inhibe al menos en un 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97% o 97% o más.

[0113]El término "antígeno" se refiere a una estructura molecular que proporciona un epítopo, porejemplo,una molécula o una porción de una molécula, o un complejo de moléculas o porciones de moléculas, capaz de ser unido por un agente de unión selectiva, como una proteína de unión a antígeno (incluyendo,por ej.un anticuerpo). Así, un agente de unión selectiva puede unirse específicamente a un antígeno formado por dos o más componentes en un complejo. En algunas formas de realización, el antígeno puede utilizarse en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a dicho antígeno. Un antígeno puede poseer uno o más epítopos capaces de interactuar con diferentes proteínas de unión a antígenos, por ej., anticuerpos. En el contexto de la presente divulgación, por lo tanto, el antígeno comprende LRRC33 o un fragmento del mismo, o un complejo proteico que comprende el mismo. Más específicamente, un inhibidor de LRRC33 para llevar a cabo la invención aquí descrita puede unirse a un epítopo presente en la porción extracelular de LRRC33 de la superficie celular o a un complejo que comprenda el mismo.

[0114]Tal como se utiliza en el presente documento, el término "CDR" se refiere a la región determinante de la complementariedad dentro de las secuencias variables de anticuerpos. Hay tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que se designan CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. El término "conjunto de CDR", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo de tres CDR que se encuentran en una única región variable que puede unirse al antígeno. Los límites exactos de estas CDR se han definido de forma diferente según los distintos sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al. (1987; 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.) no sólo proporciona un sistema de numeración de residuos inequívoco aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también proporciona límites de residuos precisos que definen las tres CDR. Estas CDR pueden denominarse CDR de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; y Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883) descubrieron que ciertas subporciones dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones del esqueleto peptídico casi idénticas, a pesar de tener una gran diversidad a nivel de la secuencia de aminoácidos. Estas subporciones se designaron como L1, L2 y L3 o H1, H2y H3, donde la "L" y la "H" designan las regiones de la cadena ligera y de la cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden denominarse CDR de Chothia, cuyos límites se solapan con las CDR de Kabat. Otros límites que definen CDR que se solapan con las CDR de Kabat han sido descritos por Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139 and MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5): 732-45. Otras definiciones de los límites de las CDR pueden no seguir estrictamente uno de estos sistemas, pero coincidirán con las CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de predicciones o resultados experimentales que demuestren que determinados residuos o grupos de residuos, o incluso CDR enteras, no influyen significativamente en la unión al antígeno. Los métodos utilizados en el presente documento pueden utilizar CDR definidos de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque ciertas formas de realización utilizan CDR definidos por Kabat o Chothia.

[0115]Los términos "cristal" y "cristalizado", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a una proteína de unión (porej.,un anticuerpo), o a una porción de unión a antígeno de la misma, que existe en forma de cristal. Los cristales son una forma del estado sólido de la materia, que se distingue de otras formas como el estado sólido amorfo o el estado cristalino líquido. Los cristales se componen de matrices tridimensionales regulares y repetitivas de átomos, iones, moléculas (por ej.,proteínas como los anticuerpos) o conjuntos moleculares (por ej.,complejos antígeno/anticuerpo). Estas matrices tridimensionales se organizan según relaciones matemáticas específicas bien conocidas en este campo. La unidad fundamental, o bloque de construcción, que se repite en un cristal se denomina unidad asimétrica. La repetición de la unidad asimétrica en una disposición que se ajusta a una simetría cristalográfica determinada y bien definida proporciona la "celda unitaria" del cristal. La repetición de la celda unitaria mediante traslaciones regulares en las tres dimensiones proporciona el cristal. Véase Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 201-16, Oxford University Press, Nueva York, Nueva York, (1999).

[0116]El término "epítopo" incluye cualquier determinante molecular (por ej.,determinante polipeptídico) que pueda unirse específicamente a un agente de unión, inmunoglobulina o receptor de células T. En ciertas formas de realización, los determinantes epitópicos incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo, y, en ciertas formas de realización, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno unida a una proteína de unión. Así pues, un epítopo consiste en los residuos de aminoácidos de una región de un antígeno (o fragmento del mismo) que se sabe que se une al sitio complementario del compañero de unión específico. Un fragmento antigénico puede contener más de un epítopo. En ciertas formas de realización, un anticuerpo es capaz de unirse específicamente a un antígeno cuando reconoce su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Por ejemplo, se dice que los anticuerpos "se enlazan al mismo epítopo" si los anticuerpos compiten entre sí (uno impide la unión o el efecto modulador del otro). Además, las definiciones estructurales de los epítopos (solapamiento, similares, idénticos) son informativas, pero las definiciones funcionales suelen ser más relevantes, ya que engloban parámetros estructurales (unión) y funcionales (modulación, competencia).

[0117]Los mecanismos de las actividades inhibitorias de un anticuerpo particular pueden variar. En algunas realizaciones, el anticuerpo inhibidor actúa induciendo la internalización del complejo antígeno-anticuerpo, facilitando así la eliminación del antígeno diana (p. ej., LRRC33 o un complejo que comprende LRRC33) de la superficie celular.

Inhibidores selectivos del contexto de LRRC33 y GARP

[0118]En consecuencia, la presente divulgación incluye ciertos inhibidores "selectivos de contexto" que pueden bloquear unsubconjunto(pero no toda) la señalización de TGFβ in vivo. Tales inhibidores incluyen inhibidores de LRRC33 e inhibidores de GARP. Sin querer estar limitado por una teoría particular, se contempla que la selectividad (o especificidad) permitida por la presente invención puede rendir una seguridad mejorada (p. ej., toxicidad limitada) en comparación con inhibidores más convencionales de TGFβ que no discriminan contextos funcionales.

[0119]En un aspecto, se proporcionan inhibidores específicos de LRRC33.

[0120]En algunas realizaciones, el aspecto proporciona anticuerpos aislados o porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen a un complejo LRRC33-TGFβ1, que es una forma inactiva, latente del complejo. Dicho anticuerpo (o fragmento) puede inhibir la liberación de una forma activa del factor de crecimiento TGFβ1 del complejo latente, inhibiendo así específicamente la señalización de TGFβ1 asociada a LRRC33. En algunas realizaciones, el anticuerpo inhibidor actúa estabilizando el complejo inactivo. En algunas realizaciones, el anticuerpo inhibidor actúa induciendo la internalización del complejo antígeno-anticuerpo, facilitando así la eliminación del antígeno diana (LRRC33 o complejo que contiene LRR<c>33). En algunas realizaciones, el anticuerpo no se une a la forma libre y madura del factor de crecimiento TGFβ1 que no está asociada con el complejo latente. En algunas realizaciones, el anticuerpo es específico de isoforma en el sentido de que inhibe la activación de TGFβ1 sin afectar a TGFβ2 o TGFβ3. Tales anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos son adecuados para el tratamiento de enfermedades asociadas con la sobreexpresión de TGFβ1 presentado por LRRC33. Por ejemplo, como se discute con más detalle en el presente documento, los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a LRRC33-TGFβ1 e inhiben el paso de activación de TGFβ1 son adecuados para su uso en el tratamiento de trastornos proliferativos hematológicos.

[0121]En algunas realizaciones, los anticuerpos selectivos de contexto o porciones de unión a antígeno de los mismos pueden unirse e inhibir la activación (liberación) de TGFβ1 que se presenta por LRRC33 o GARP, pero no LTBP1/3. Basándose en la homología estructural compartida entre las dos moléculas presentadoras, el diseño cuidadoso de un antígeno que comprenda un complejo proTGFβ1 puede generar anticuerpos inhibidores que reconozcan uno o ambos tipos de complejos proTGFβ1 de interés. Los anticuerpos resultantes son adecuados para su uso en la modulación de respuestas inmunitarias.

[0122]Los antígenos adecuados utilizados para generar tales anticuerpos incluyen un complejo proteico que comprende el complejo proTGFβ1 unido a una molécula de presentación de interés (tal como LRRC33 y GARP). La forma inactiva (p. ej., un precursor) de un complejo proTGFβ comprende típicamente un dímero de polipéptidos proproteína proTGFβ, que se asocia con una única molécula presentadora en una estequiometría de 2 a 1. En algunas realizaciones, el dímero es un homodímero. En algunas realizaciones, el dímero es un heterodímero. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo descrito en el presente documento se une a cada uno de los dímeros. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo descrito en el presente documento se une al dímero o al complejo. En algunas realizaciones, el epítopo reconocido por dicho anticuerpo es un epítopo combinatorio formado por dos o más componentes del complejo, donde los componentes se seleccionan de porciones del dímero proTGFβ y la molécula presentadora (p. ej., LRRC33). En algunas realizaciones, el epítopo reconocido por dicho anticuerpo es un epítopo conformacional que depende de la estructura tridimensional del complejo. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente al complejo pero no a cada uno de los componentes del complejo por separado.

[0123]En la tabla siguiente se proporcionan secuencias de aminoácidos ejemplares de LRRC33 y GARP:

(continuación)

[0124]En la tabla siguiente se proporcionan secuencias de aminoácidos de TGFβ ejemplares:

(continuación)

Ligantes específicos de LRRC33 o del complejo que contiene LRRC33

[0125]En algunas realizaciones, los inhibidores de LRRC33 son ligantes específicos de LRRC33 o del complejo que contiene LRRC33 expresado en la superficie celular. Tales inhibidores tienen por objeto reconocer específicamente las células diana que expresan LRRC33 en la superficie celular, inhibiendo así su disponibilidad para la función. Tales ligantes específicos de LRRC33 o complejo que contiene LRRC33 pueden o no tener la capacidad de inhibir la activación de TGFβ.

[0126]En algunas realizaciones, los inhibidores de LRRC33 son agentes de unión a LRRC33 que se unen específicamente a LRRC33 asociado con TGFβ latente (p. ej., complejo LRRC33-proTGFβ1).

[0127]Para ser eficaz como agente terapéutico, es deseable que la expresión en la superficie celular de una molécula diana (como LRRC33) esté suficientemente restringida o sea selectiva para las células asociadas a la enfermedad con respecto a las células sanas. En este sentido, la LRRC33 es ventajosa frente a otros antígenos de superficie celular que se han explotado comercialmente hasta la fecha, como el CD33, debido a una expresión más restringida a determinadas subpoblaciones celulares. De este modo, se pueden preservar las células sanas, reduciendo potencialmente los efectos secundarios no deseados o las toxicidades. Además, la expresión de la superficie celular debe ser robusta, de modo que el inhibidor (aglutinante LRRC33) pueda engancharse fácil y fiablemente a las células diana para garantizar una opsonización suficiente.

[0128]La densidad de superficie celular de LRRC33 en las células evaluadas hasta ahora muestra niveles de expresión equivalentes a las dianas de terapias disponibles comercialmente que se han explotado con éxito como DCA hasta la fecha (como CD33, EGFR y Her2). Como se demuestra en los Ejemplos del presente documento, los macrófagos humanos derivados de monocitos madurados con M-CSF muestran una expresión robusta y uniforme de LRRC33 en la superficie celular, lo que lo convierte en un objetivo ventajoso para agotar las células asociadas a enfermedades. En particular, los inhibidores de LRRC33 sólo se dirigirán a subpoblaciones de monocitos y/o macrófagos. Incluso dentro de los macrófagos polarizados M2, la expresión de LRRC33 en la superficie celular es regulada selectivamente en positivo en las subpoblaciones M2c ("pro-fibrótica") y M2d ("pro-tumoral" o "de tipo TAM"), sin afectar significativamente a las subpoblaciones M2a y M2b. Esto permite dirigirse preferentemente a las poblaciones celulares asociadas a la enfermedad, en comparación con objetivos más amplios como los marcadores mieloides.

[0129]En algunas realizaciones, dichos inhibidores pueden unirse a LRRC33 de la superficie celular o al complejo que contiene LRRC33, neutralizando así (p. ej., bloqueando) su función.

[0130]En algunas realizaciones, dichos inhibidores pueden unirse al LRRC33 de la superficie celular o al complejo que contiene LRRC33, induciendo así la internalización de la LRRC33 (o del complejo que contiene LRRC33) para eliminarlo o limpiarlo de la superficie celular. La depleción dependiente de la internalización de LRRC33 en la superficie celular puede aprovecharse para la destrucción celular mediada por ADC. Tal como se ejemplifica en los Ejemplos del presente documento, en algunas realizaciones, tras el enganche de LRRC33 de la superficie celular o del complejo que contiene LRRC33 por el inhibidor, al menos el 35% (p. ej., al menos el 40%, 45%, 50%, 60%, 70% y 80%) de la diana de la superficie celular se internaliza en 30 minutos, en 60 minutos, en 90 minutos o en 120 minutos a una temperatura fisiológica, donde preferiblemente una mayoría de la internalización (p. ej., internalización de al menos el 50% de la diana de la superficie celular) se produce en una hora tras el enganche de la diana.

[0131]En algunas realizaciones, dichos inhibidores pueden unirse al LRRC33 de la superficie celular, induciendo así la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) de las células diana. La ADCC es un mecanismo de defensa inmunitaria mediada por células por el que una célula efectora del sistema inmunitario lisa activamente una célula diana, cuyos antígenos de la superficie de la membrana (por ejemplo, LRRC33) han sido unidos por anticuerpos específicos (por ejemplo, anticuerpos anti-LRRC33 o fragmentos de los mismos). La ADCC es independiente del sistema inmunitario del complemento, que también lisaba las dianas pero no requería ninguna otra célula. La ADCC requiere una célula efectora (p. ej., linfocitos T asesinos (NK)) que suelen interactuar con anticuerpos IgG. Sin embargo, los macrófagos, neutrófilos y eosinófilos también pueden mediar en la ADCC.

[0132]En realizaciones preferidas, los aglutinantes específicos son anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos que reconocen un epítopo disponible para la unión en la porción extracelular de LRRC33 o un complejo (p. ej., complejo proteico, tal como LRRC33-proTGFβ) en la superficie celular de las células diana. Tales ligandos específicos de LRRC33 abarcados por la presente invención pueden comprender una región efectora que desencadena citotoxicidad celular (p. ej., ADCC) y otras funciones efectoras. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales (mAbs) pueden dirigirse a células/tejidos asociados a enfermedades (p. ej., tumores, tejidos fibróticos, tejidos lesionados, etc.) mediante el reconocimiento específico de antígenos asociados a enfermedades, como los antígenos asociados a tumores, y el posterior reclutamiento de elementos efectores, como macrófagos, células dendríticas, linfocitos T asesinos (NK), células T y componentes de la vía del complemento. Tales reclutamientos se consiguen mediante interacciones entre el fragmento cristalizable (Fc) de la inmunoglobulina gamma (IgG) y los receptores de las células inmunitarias como los receptores Fcy (FcyRs) y la proteína del complemento C1q del sistema del complemento. Estas interacciones conducen a la activación de las células inmunitarias para mejorar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)/fagocitosis mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCP), la formación del complejo de ataque de membrana y una presentación más eficaz del antígeno a las células dendríticas. Mediante un mecanismo de reciclaje, el receptor Fc neonatal (FcRn) prolonga la semivida de los mAbs en una interacción dependiente del pH con la región Fc.

[0133]En una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo LRRC33 que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°.

1; y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 2.

EVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTYYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNSDTTY

NQKFKG KAKLT AVTSTST AYMELSSLTNEDSAVYYCTNTNWEAM DYWGQGTSVTVSS

(SEQ ID NO: 1)

DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGV

PDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:2)

[0134]En una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo LRRC33 que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 1; y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 2. En una realización, la divulgación proporciona un anticuerpo LRRC33 que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 1; y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 2.

[0135]En una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo LRRC33 que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°.

3; y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 4.

EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMNWVKQSHGKSLEWIGRINPYNGDTFYN

QKFKGKATLTVDKSSSTAHMELLSLTSEDSAVYYCGRGGYDYDFDYWGQGTTLTVSS (SEQ

ID NO:3)

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLQSYGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGV

PDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:4)

[0136]En una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo LRRC33 que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 3; y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ iD N°. 4. En una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo LRRC33 que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 3; y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 4.

[0137]En una realización, el anticuerpo LRRC33 comprende tanto una cadena pesada como una cadena ligera, en la que el anticuerpo tiene una secuencia de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N°. 1/SEQ ID N°: 2 (SRL1) y SEQ ID N°. 3/SEQ ID N°: 4 (SRL2).

[0138]En otra realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo LRRC33 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) como se establece en SEQ ID N°. 1; y que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende CDRs como se establece en SEQ ID N°. 2. Además, la secuencia del dominio variable de la cadena pesada puede ser al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 1 y la secuencia del dominio variable de la cadena ligera puede ser al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 2, como se ha indicado anteriormente.

[0139]En otra realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo LRRC33 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) como se establece en SEQ ID N°. 3; y que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende CDRs como se establece en SEQ ID N°. 4. Además, la secuencia del dominio variable de la cadena pesada puede ser al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 3 y la secuencia del dominio variable de la cadena ligera puede ser al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N°. 4, como se ha indicado anteriormente.

[0140]En una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo LRRC33 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende un conjunto CDR de cadena pesada (CDR1, CDR2 y CDR3) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID N°s: 5, 6 y 7, y un dominio variable de cadena ligera que comprende un conjunto CDR de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDr 3) seleccionado del grupo formado por SEQ ID N°s: 8, 9 y 10.

GYTFTYYW (SEQ ID N°:5)

IYPGNSDT (SEQ ID N°:6)

TNTNWEAMDY (SEQ ID N°:7)

QSLLDSDGKTY (SEQ ID N°:8)

LVS (SEQ ID N°:9)

WQGTHFPT (SEQ ID N°:10)

[0141]En una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo LRRC33 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende un conjunto CDR de cadena pesada (CDR1, CDR2 y CDR3) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID N°s: 11, 12 y 13 y un dominio variable de cadena ligera que comprende un conjunto CDR de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) seleccionado del grupo formado por SEQ iD N°s: 14, 15 y 16.

GYSFTGYF (SEQ ID N°:11)

INPYNGDT (SEQ ID N°:12)

GRGGYDYDFDY (SEQ ID N°:13)

KSLLQSYGITY (SEQ ID N°:14)

QMS (SEQ ID N°:15)

AQNLELPFT (SEQ ID N°:16)

[0142]Los inhibidores de LRRC33 que se unen específicamente a LRRC33 pueden usarse para agotar las células que expresan LRRC33 en la superficie celular, por ejemplo, (inmuno-agotamiento). Dichos inhibidores, utilizados como agentes de depleción inmunitaria, pueden ser útiles para interferir o limitar el reclutamiento de monocitos circulantes al lugar de la enfermedad (p. ej., tumores y tejidos fibróticos o lesionados) y/o agotar subpoblaciones de macrófagos activados en el lugar de la enfermedad (p. ej., tumores y tejidos fibróticos o lesionados).

[0143]Para aplicaciones ADCC, los agentes de unión a LRRC33 (p. ej., anticuerpos anti-LRRC33 o fragmentos de los mismos) pueden diseñarse para incluir características adecuadas. Los FcyR, que consisten en las clases FcyRI (CD64), FcyRlI (CD32) y F<cy>RIII (CD16), son heterogéneos en cuanto a su expresión celular y afinidades de unión a Fc. FcyRI se une a la región Fc con K<d>~10-8 - 10-9 M y se expresa en fagocitos mononucleares, células dendríticas y neutrófilos activados por IFN-<y>. FcyRlI se une a la región Fc con una afinidad relativamente menor (K<d>~10-7 M) y existe en cinco isoformas; entre ellas, las activadoras (FcyRlla, que alberga un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora en neutrófilos) o inhibidoras (FcYRIIb, que alberga un motivo inhibidor basado en tirosina inmunorreceptora predominantemente en linfocitos B) son críticas para la regulación inmunitaria. FcyRIII, expresado en dos isoformas, se une a la región Fc con las afinidades más bajas (K<d>~10-5 M). Entre ellos, FcYRIIIa tiene un alelo de unión Fc moderada (V158) y un alelo de unión baja (F158), y se expresa en células NK, macrófagos y subconjuntos de células T y activa la respuesta ADCC mediada por células NK y T; FcYRIIIb está presente exclusivamente en neutrófilos y carece de capacidad de generación de señales.

[0144]Tales agentes de unión a LRRC33 son útiles para eliminar células diana que expresan LRRC33. Del mismo modo, el mismo enfoque se puede tomar para diseñar inhibidores específicos de GARP que se unen específicamente a las células diana que expresan GARP y median los efectos citotóxicos celulares. Tales agentes de unión pueden utilizarse para reducir el número de células diana que expresan LRRC33 y/o GARP en condiciones de enfermedad en las que es beneficioso reducir la sobreexpresión o proliferación de estas células diana.

[0145]Las composiciones que comprenden los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos abarcados por la invención incluyen conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). De este modo, dicho anticuerpo o fragmento del mismo puede diseñarse para ser unido o acoplado a un fármaco o "carga útil" que se administrará al lugar de interés a través de la interacción anticuerpo-antígeno. Por ejemplo, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo puede incluir una fracción adicional para transportar "una carga útil" de interés. Ejemplos de cargas útiles adecuadas incluyen, pero no se limitan a: terapéuticos/fármacos, toxinas, marcadores y etiquetas de detección/imagen, y cualquier otra molécula funcional de interés. Dicha carga útil puede consistir en entidades químicas, pequeñas moléculas, polipéptidos, ácidos nucleicos, radioisótopos, etc. Por lo tanto, la invención incluye un enfoque para inducir la muerte de células diana independiente de anticuerpos (p. ej., no mediada por ADCC) mediante la inclusión de una fracción (p. ej.,entidades químicas) que funciona como toxina. Las moléculas de los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) pueden unirse o conjugarse a la estructura del anticuerpo mediante enlaces covalentes o no covalentes. En algunas realizaciones, los ADC contienen enlaces escindibles o no escindibles. En algunas realizaciones, las interacciones no covalentes (p. ej., asociación y disociación) pueden depender del pH. Cualquier toxina adecuada puede ser empleada y diseñada en moléculas ADC.

[0146]Las moléculas ADC pueden producirse acoplando el ligante LRRC33 con un agente citotóxico. Típicamente, la fracción de unión (como un anticuerpo anti-LRRC33 o fragmento del mismo) y la fracción citotóxica se conjugan mediante un enlazador. El enlazador puede ser un enlazador escindible o no escindible. En algunas realizaciones, el ADC puede contener uno o más aminoácidos no naturales. Por ejemplo, el enlazador del ADC puede comprender uno o más aminoácidos no naturales.

[0147]Puede emplearse cualquier agente citotóxico adecuado. Para las terapias contra el cáncer, dos categorías de tales agentes incluyen agentes disruptores de microtúbulos y agentes modificadores del ADN. Los primeros incluyen, sin limitación, dolastatina 10 y sus derivados; monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), maytansina y sus derivados. Estos últimos incluyen, sin limitación, los análogos de la duocarmicina y la calicheamicina. Otros agentes utilizados en el desarrollo de ADCs incluyen, sin limitación, pirrolobenzodiazepinas, duocarmicina, centanamicina, irinotecán, camptotecina y doxorrubicina.

[0148]Por consiguiente, algunas realizaciones se refieren a ADC que comprenden un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, conjugado con una toxina, en el que el anticuerpo o la porción de unión a antígeno se une a un epítopo en LRRC33, un epítopo en GARP, o un epítopo común a ambos. Dichos anticuerpos pueden utilizarse para dirigirse preferentemente a los tejidos de la enfermedad y reducir toxicidades no deseadas (p. ej., acontecimientos adversos) en los pacientes.

[0149]En algunas realizaciones, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno es un anticuerpo de "doble función" o fragmento del mismo, que funciona como inhibidor de la activación de TGFβ y además comprende una segunda función, como la eliminación de células diana, por ejemplo, ADCC y efectos dependientes de toxinas. Dicho anticuerpo de doble función se caracteriza porque se une a un complejo proTGFβ latente asociado a una molécula presentadora de interés, inhibiendo así que el TGFβ maduro se libere del complejo latente, lo que da lugar a una reducción local del TGFβ libre disponible en el microentorno de la enfermedad. Las moléculas presentadoras adecuadas pueden seleccionarse en función de los mecanismos de activación de TGFβ que impulsan la patología de una enfermedad o trastorno concreto. Otra consideración adicional debe incluir la evaluación del grado de expresión de la molécula presentadora concreta en los tejidos enfermos y normales del organismo. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención pueden dirigirse específicamente a células anormales o tejidos enfermos, sin afectar negativamente a los homólogos normales o sanos. Ejemplos no limitantes de tales anticuerpos se dirigen a un complejo proTGFβ1 asociado a LRRC33, asociado a GARP, o permisivo para unirse a un complejo proTGFβ1 asociado a LRRC33 o a GARP. En algunas realizaciones, dichos anticuerpos se utilizan para tratar un trastorno proliferativo hematológico, como la leucemia y la mielofibrosis.

[0150]Para contrarrestar la acumulación inmunosupresora de Tregs en pacientes portadores de cáncer, se han realizado esfuerzos para desarrollar una estrategia para agotar las Tregs. Por ejemplo, varios grupos se centraron en el receptor IL-2 como diana, que es expresado por la mayoría de las Tregs, para administrar una toxina conjugada con el ligando IL-2 como portador. Los resultados fueron desiguales, con un éxito limitado. Del mismo modo, se utilizó daclizumab, un anticuerpo anti-CD25, para atacar a las Tregs; sin embargo, este enfoque produjo efectos secundarios no deseados al agotar inadvertidamente las células T que expresan CD-25, lo que demuestra la importancia de la especificidad para atacar a las células cancerosas.

[0151]Dirigirse a la señalización de TGFβ selectiva de GARP con el uso de los anticuerpos descritos en el presente documento puede proporcionar beneficios clínicos en la mejora de la inmunidad antitumoral, al tiempo que permite un perfil de seguridad mejorado debido al nivel de especificidad que proporciona este enfoque.

[0152]Como se describe aquí, uno de los hallazgos sorprendentes es que LRRC33 se sobreexpresa en un conjunto muy selectivo de tipos de células/tejidos. Por ejemplo, sólo un subconjunto de monocitos polarizados, a saber, el subtipo M2c profibrótico y el subtipo de tipo TAM asociado a tumores, muestran niveles elevados de expresión de LRRC33.

LRRC33 para aplicaciones CAR-T

[0153]De la misma manera que LRRC33 (p. ej., LRRC33 o un complejo que contenga LRRC33) es una diana atractiva para ser empleada en un enfoque ADC o ADCC para atacar y destruir células patológicas y/o patogénicas (asociadas a enfermedad) (p. ej., leucemia mieloide como AML y macrófagos asociados a tumor o macrófagos asociados a enfermedad/lesión), también puede ser una diana atractiva para terapias CAR-T. De este modo, las células LRRC33+ (es decir,las células que expresan LRRC33 en la superficie celular), como los blastos de AML, pueden ser un potente objetivo de destrucción con efectos secundarios tóxicos mínimos, ya que las células LRRC33- no se verán afectadas por los CAR-Ts.

[0154]Se contempla que dirigirse a LRRC33 debería proporcionar una alternativa más segura, en comparación con las terapias de AML existentes, debido a una expresión más selectiva que restringe las células diana a subpoblaciones más estrechas. De este modo se preservarían las plaquetas y células mieloides sanas que, de otro modo, se verían afectadas por las terapias existentes, que se dirigen a marcadores de superficie celular de expresión más amplia, como CD33, y que son necesarios para el funcionamiento normal.

[0155]Actualmente hay muchas permutaciones de células CAR-T, pero típicamente consisten en un scFV que reconoce un antígeno específico (en este caso LRRC33 o complejo que contiene LRRC33, como LRRC33-proTGFβ1) fusionado a dominios activadores y coestimuladores intracelulares, como CD28, CD3z y/o 4-1BB/ICOS/OX40 u otro dominio de activación de células T. Éstas se clonan en una célula T CD8 que puede llevar o no otras modificaciones genéticas para convertirla en una célula efectora antitumoral potente y/o de larga vida (ejemplo: 'Armored CAR-Ts' expresan IL-12). De este modo, todas las células CAR-T transfundidas a un paciente reconocerían específicamente a LRRC33 o a un complejo que lo comprenda, se activarían y responderían mediante la elaboración de citocinas y proteínas citotóxicas. En otras realizaciones, se pueden adoptar enfoques similares para diseñar células CAR-NKT y/o CAR-NK en las que un scFV similar fusionado a dominios activadores se clona en células NKT o NK como fuente del mecanismo efector antitumoral. En el caso de las CAR-NK, pueden utilizarse dominios de activación alternativos para aprovechar las vías de activación intrínsecas a estas células, como NKG2D, NKp30 y CD226.

[0156]Las terapias CAR-T en células cancerosas de la sangre, como la AML, y en respuesta a tumores sólidos pueden ser más eficaces si se usan en combinación con una o más terapias o terapias contra el cáncer. Otras terapias contra el cáncer utilizadas junto con CAR-T (y/o CAR-NK, CAR-NKT, etc.) incluyen, entre otros, inhibidores de puntos de control, como anti-PD1 o anti-PDL1, ya que algunos blastos de AML de pacientes muestran PDL1 regulado en positivo como mecanismo de inmunosupresión.

[0157]La focalización CAR-T de LRRC33 puede proporcionar una respuesta más duradera que la focalización de antígeno único, ya que las células cancerosas, como las células leucémicas, en algunos casos desarrollan un entorno inmunosupresor y evasión inmunitaria a través de la producción de TGFβ1. Se ha demostrado que la regulación en negativo de los antígenos diana de superficie por parte de las células leucémicas, por ejemplo T-ALL y NHL, es un mecanismo de escape de la destrucción de las células inmunitarias. La regulación en negativo de la superficie LRRC33-proTGFβ puede revertir o disminuir la inmunosupresión impulsada por TGFβ1, haciendo así que las células de la enfermedad (como las cancerosas) queden expuestas a la vigilancia inmunitaria que facilita la inmunidad del organismo para combatir la enfermedad.

[0158]La población de células CAR-T se contraerá naturalmente una vez que el antígeno desaparezca. Se están investigando muchas estrategias para mejorar la generación de memoria inmunológica a partir de estas células. La muerte natural de las células T CD8 ha demostrado ser un reto para la protección duradera CAR-T si las células cancerosas se instalan en un nicho no estudiado. De este modo, la protección puede no ser duradera. Mientras que la alta expresión de LRRC33 es una característica de las células mieloides patológicas, un pequeño porcentaje (~5%) de los monocitos circulantes tienen expresión detectable de LRRC33. Este bajo nivel de expresión puede ser suficiente para la persistencia del antígeno que retendrá una población circulante de CARTs y una vigilancia constante.

[0159]Una permutación adicional sería LRRC33 como un objetivo para BiTes, oengagersBi-específicos de célula T. Por ejemplo, las BiTes son scFv fusionados, con un extremo específico para un antígeno tumoral (LRRC33) y el otro específico para un antígeno de células T, como CD3. De este modo, una célula T CD8+ se pone en contacto con una célula diana y, mediante el acoplamiento con CD3, la célula T se activa para elaborar una respuesta citolítica.

Métodos de fabricación

[0160]Los anticuerpos útiles y los fragmentos de los mismos incluidos en la presente solicitud pueden generarse de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. Se proporcionan métodos ejemplares en, por ejemplo, las solicitudes internacionales de patente PCT/US2013/068613, PCT/US2014/036933, PCT/US2015/059468, PCT/US2016/052014, PCT/US2017/021972.

[0161]En realizaciones preferidas, dichos anticuerpos pueden formularse en composiciones farmacéuticas que comprenden además al menos un excipiente. En el contexto de la presente divulgación, la fabricación abarcará varios pasos, métodos y procesos llevados a cabo, por ejemplo, para generar antígenos o complejos de antígenos, paso(s) de cribado (p. ej., pasos de selección positiva y selección negativa) para identificar y evaluar agentes candidatos (p. ej., aglutinantes e inhibidores) de ciertos perfiles, proceso de escalado, ingeniería y/o modificaciones de anticuerpos, pasos de purificación, ensayos y formulación o mezcla de componentes en composiciones farmacéuticas que sean adecuadas para su administración a sujetos humanos y no humanos. Dichas composiciones farmacéuticas son estériles.

[0162]Típicamente, para producir o identificar inhibidores específicos de LRRC33, los agentes candidatos son cribados para unión específica y selectiva para LRRC33, por ejemplo, una(s) poción(es) extracelular(es) de LRRC33. Este paso suele denominarse selección positiva. Así, los antígenos o inmunógenos útiles incluyen LRRC33 recombinante o un fragmento extracelular del mismo, un complejo proteico que comprende el mismo (p. ej., LRRC33-proTGFβ), así como antígenos basados en células (células que expresan LRRC33 en la superficie celular, con o sin proTGFβ). Un ejemplo no limitativo de tales métodos se proporciona en los Ejemplos del presente documento.

[0163]En algunas realizaciones, la selección negativa puede incluirse en el método de producción o identificación de inhibidores de LRRC33. La "selección negativa" (también denominada "contra-selección" o "contra-cribado") se refiere generalmente a la eliminación de aglutinantes o candidatos indeseables de una reserva.

[0164]Así, la invención incluye métodos para identificar inhibidores de LRRC33. Los métodos pueden comprender un paso de selección de uno o más ligantes que se unen específicamente a LRRC33 a partir de un conjunto (p. ej., biblioteca). El método puede comprender además un paso para llevar a cabo la selección negativa, o la eliminación de ligantes indeseables que no son específicos o selectivos para LRRC33. Por ejemplo, los aglutinantes indeseables pueden incluir aquellos que reaccionan de forma cruzada con GARP. En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de confirmación de la selectividad para LRRC33. En algunas realizaciones, el paso de confirmación puede incluir la confirmación de la selectividad de especie, como LRRC33 murina y/o LRRC33 humana (preferentemente LRRC33 humana). En algunas realizaciones, el paso de confirmación comprende confirmar la selectividad de especie para LRRC33 humana. Sin embargo, en algunas realizaciones, se prefiere que el inhibidor de LRRC33 sea reactivo cruzado para homólogos humanos y roedores (p. ej., murinos) para facilitar las evaluaciones in vivo y/o la traducibilidad. En algunas realizaciones, el método puede comprender un cribado basado en FACS para confirmar que un ligante candidato/prueba es capaz de unirse al LRRC33 de la superficie celular. En algunas realizaciones, el método puede comprender uno o más ensayos celulares, que incluyen, entre otros, ensayos de internalización y ensayos de destrucción celular (citotóxicos) para evaluar o confirmar la capacidad de un aglutinante candidato para agotar células diana.

Aplicaciones clínicas

[0165]Las indicaciones clínicas para las que las composiciones y los métodos relacionados descritos en el presente documento son útiles como terapéuticos incluyen enfermedades o trastornos caracterizados por la regulación en positivo de la expresión de LRRC33 en la superficie celular. En algunas realizaciones, dicha enfermedad o trastorno implica la activación de macrófagos derivados de monocitos en el lugar de la lesión (p. ej., tejidos fibróticos, miopatías, tumores, etc.).

[0166]En consecuencia, un inhibidor de LRRC33 puede usarse para el tratamiento de varias condiciones proliferativas, tales como cáncer, por ejemplo, cáncer sistémico y cáncer localizado. Entre los ejemplos de cáncer sistémico se incluyen los trastornos proliferativos hematológicos (p. ej., el cáncer que comienza en el tejido hematopoyético, como la médula ósea, las células sanguíneas y/o en las células del sistema inmunitario). Ejemplos de cáncer localizado incluyen cánceres que causan un tumor sólido, por ejemplo, tumores primarios así como tumores secundarios (metástasis). Los tumores sólidos pueden incluir, además de células cancerosas (es decir,malignas), células inmunitarias o leucocitos infiltrados, como macrófagos (p. ej., macrófagos asociados a tumores o TAM) y Treg inmunosupresores, así como neutrófilos activados (p. ej., neutrófilos asociados a tumores o TAN) y fibroblastos asociados a cáncer (CAF).

[0167]Las evidencias en la literatura sugieren que, al igual que los monocitos, los TAN también son reclutados a un sitio tumoral, donde pueden desempeñar un papel en la facilitación de la angiogénesis y otros aspectos de la progresión de la enfermedad. Los<t>A<n>elevados parecen correlacionarse con un mal pronóstico en varios tipos de carcinoma. De forma similar a la polarización de los macrófagos, existen subtipos de TAN supresores y promotores de tumores, y se cree que el TGFβ está implicado en esta conversión. Los TAN activados también pueden reclutar macrófagos, lo que sugiere que puede haber una cascada de acontecimientos mediados por LRRC33lTGFβ1 que pueden impulsar la progresión del cáncer.

[0168]Así, la presente divulgación proporciona métodos para dirigirse a células pro-cáncer que expresan LRRC33, tales como TAM, TAN y CAF, para tratar el cáncer. Según la presente divulgación, se utiliza un inhibidor de LRRC33 en un método para agotar las células que expresan LRRC33 en la superficie celular en un sujeto. Como demuestran los datos presentados en el presente documento (véanse, por ejemplo, las FIGs. 11 y 12), los macrófagos polarizados M2 expuestos a citocinas asociadas a enfermedades (p. ej., derivadas de tumores), como el M-CSF, muestran una expresión robusta de LRRC33 en la superficie celular. La densidad de la superficie celular de LRRC33 en células de AML, por ejemplo, muestra niveles de expresión equivalentes a las dianas de otros tipos de cáncer en la clínica explotados como ADC hasta la fecha. Sin embargo, como se describe más adelante en el Ejemplo 2, por término medio, la densidad de LRRC33 en la superficie celular de los macrófagos tratados con M-CSF (el número de moléculas LRRC33 en la superficie celular por célula) aumenta notablemente de forma selectiva en la subpoblación de macrófagos de tipo TAM. Dicha inducción selectiva de LRRC33 en la superficie celular en el subconjunto altamente restringido de células proporciona una oportunidad para dirigirse selectivamente a la subpoblación de macrófagos asociada a la enfermedad, sin afectar a las subpoblaciones no asociadas a la enfermedad que son necesarias para las funciones biológicas normales. En comparación, otros marcadores conocidos que se han empleado como diana mieloide (p. ej., para la terapia de la AML), como CD33 y CD115, muestran una expresión más uniforme, y por tanto menos selectiva, de la superficie celular en diferentes subtipos de macrófagos, por ejemplo, M1 polarizados y los macrófagos tipo TAM inducidos por M-CSF, lo que indica que dirigirse a estos marcadores de expresión más amplia puede afectar tanto a las células asociadas a la enfermedad (por ej., las TAM) como a las no asociadas a la enfermedad, aumentando así los efectos secundarios potencialmente no deseados. El uso de los inhibidores de LRRC33 aquí descritos puede dirigirse selectivamente a varios tipos celulares asociados con características de la enfermedad, por ejemplo, fenotipo pro-tumoral. Así, las células diana pueden incluir, entre otras: monocitos originados en la médula ósea, macrófagos polarizados/activados en el lugar de la enfermedad, macrófagos diferenciados/específicos de un tejido o residentes, por ejemplo, macrófagos alveolares (en el pulmón), osteoclastos (en la médula ósea), microglía (CNS), histiocitos (en el tejido conectivo) y células de Kupffer (en el hígado), MDSC, así como TAN y CAF activados.

[0169]La expresión de LRRC33 en el tumor puede ser un biomarcador útil para identificar una población de pacientes que responden mal a la terapia con inhibidores de puntos de control. De hecho, se ha informado de que un mayor grado de infiltración mieloide en el tumor se correlaciona con una menor capacidad de respuesta al inhibidor de PD-1. El desarrollo clínico actual con antagonistas de los receptores del M-CSF muestra una respuesta significativa, pero no grandiosa, a la supervivencia/crecimiento tumoral, que probablemente esté mediada por la inhibición del reclutamiento de macrófagos M2. Sin embargo, este enfoque no incluye las MDSC como diana porque estas células no son inhibidas por la inhibición del receptor de M-CSF. Sin embargo, mediante el novedoso enfoque descrito aquí, esdecir, dirigiéndose a LRRC33, se pueden inhibir múltiples tipos celulares que contribuyen a la progresión de la enfermedad, incluyendo TAM, TAN, MDSC y CAF, mejorando así la probabilidad de efectos clínicos.

[0170]En consecuencia, se proporciona en el presente documento el uso de dichas composiciones en el tratamiento de tejidos de enfermedades y trastornos proliferativos hematológicos que albergan células inmunitarias que expresan TGFβ que se infiltran y exasperan la progresión de la enfermedad. Así, la divulgación incluye un método para tratar el trastorno proliferativo hematológico que comprende un paso de administrar a un paciente (in vivo o ex vivo) una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que inhibe LRRC33, GARP, o ambos, en una cantidad suficiente para tratar el trastorno.

[0171]Las composiciones proporcionadas en la presente divulgación pueden utilizarse para mejorar o reforzar la inmunidad del huésped reduciendo o revirtiendo la inmunosupresión. Un enfoque para lograr la reversión de la inmunosupresión es reducir las células T reguladoras inmunosupresoras que están elevadas en ciertas condiciones de enfermedad, como el microambiente tumoral. En algunas realizaciones, la enfermedad también puede estar asociada con la inflamación crónica del tejido afectado y/o fibrosis. En algunas realizaciones, dichos métodos están dirigidos a lograr la eliminación inmunomediada de células tumorales/cáncer en el huésped. En algunas realizaciones, las células tumorales/cáncer son células sistémicas, como células cancerosas de la sangre o células localizadas, como un tumor sólido. En algunas realizaciones, los macrófagos que expresan LRRC33 de fenotipo profibrótico y/o fenotipo asociado a tumores están presentes en un tejido/células de la enfermedad. La sobreexpresión de LRRC33 puede conducir a un aumento de TGFβ en el lugar de la enfermedad. Se contempla la posibilidad de que dirigirse a LRRC33 en estos contextos pueda aportar beneficios clínicos.

[0172]En algunas realizaciones, un número elevado de macrófagos polarizados que expresan LRRC33 puede promover el reclutamiento de Tregs que expresan GARP al nicho de la enfermedad.

[0173]Así, en algunas realizaciones de la invención, la administración de la composición puede influir en la progresión de la enfermedad, por ejemplo, prolongar la remisión o retrasar la recidiva de los tumores malignos. En algunas realizaciones, esto se consigue invirtiendo la tolerancia inmunitaria en el huésped, y/o mediante la erradicación directa de las células cancerosas para superar potencialmente la evasión de la inmunidad del huésped por las células cancerosas mediante, por ejemplo, la edición inmunitaria.

[0174]Cuando las composiciones actúan reduciendo la inmunosupresión en el huésped, el anticuerpo o fragmento del mismo puede suprimir las Tregs, promoviendo así las células T efectoras. En algunas realizaciones, las Tregs responden directamente a las células que expresan IDO, como las células dendríticas y los macrófagos, que pueden estimular la maduración de las células Treg. La estimulación elevada de IDO se correlaciona con un mayor reclutamiento de Tregs inmunosupresoras en el microambiente tumoral, lo que conduce al crecimiento tumoral. Por el contrario, una menor estimulación de IDO se correlaciona con una menor infiltración de Tregs en el tumor, lo que mejora la inmunidad antitumoral mediada por células T. Por lo tanto, los anticuerpos que inhiben específicamente el TGFβ presentado por GARP en estos escenarios pueden inhibir las células supresoras, con lo que se puede mantener la inmunidad antitumoral de las células T efectoras para combatir la enfermedad. Paralelamente, la inhibición de la señalización de TGFβ dependiente de GARP puede bloquear el reclutamiento de Tregs al lugar del microambiente tumoral, lo que resulta en una menor infiltración tumoral por parte de las Tregs. La eliminación de las células supresoras del tumor puede promover la función efectora antitumoral de las células T efectoras. Estas células pueden reclutar y activar directamente a las Treg en los microambientes patológicos correspondientes. Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos específicamente a los macrófagos que expresan LRRC33 pueden ayudar a prevenir los efectos inmunosupresores.

[0175]En algunas realizaciones, las células diana que expresan LRRC33 son células de cáncer de la sangre, por ejemplo, células de leucemia (ver más detalles a continuación). Sorprendentemente, tanto LRRC33 como TGFβ1 parecen estar selectivamente regulados en positivo en muchas células cancerosas mieloides y linfoides. Esta expresión selectiva proporciona un medio para dirigirse directamente a LRRC33 en estas células para inducir la destrucción de células cancerosas mediante, por ejemplo, ADCC.

[0176]En consecuencia, se proporcionan métodos para inducir ADCC en células que expresan LRRC33. El método comprende una etapa de administración de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a LRRC33 y comprende un dominio Fc, que es capaz de inducir ADCC en células diana. Entre los ejemplos de cáncer hematológico (p. ej.,cáncer de la sangre) que pueden tratarse de este modo se incluyen, entre otros, la leucemia, el linfoma y el mieloma múltiple.

[0177]Los sujetos adecuados a los que se les puede administrar una composición farmacéutica según la presente divulgación incluyen aquellos que sufren de uno o más trastornos proliferativos hematológicos y aquellos que tienen un tumor sólido o localizado que comprende infiltración de células mieloides y/o linfoides que expresan LRRC33 y/o GARP en la superficie celular.

[0178]El sujeto a tratar por los métodos aquí descritos puede ser un mamífero, más preferiblemente un humano. Los mamíferos incluyen, entre otros, los animales de granja, los animales de deporte, los animales de compañía, los primates, los caballos, los perros, los gatos, los ratones y las ratas. Un sujeto humano que necesita el tratamiento puede ser un paciente humano que tiene, está en riesgo de tener o se sospecha que tiene una indicación relacionada con TGFβ, como las señaladas anteriormente. Un experto en la técnica comprenderá fácilmente que cuando dichas composiciones farmacéuticas contengan un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo para el tratamiento de una indicación relacionada con el TGFβ, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se diseñará preferentemente para causar una inmunogenicidad no deseada mínima en el sujeto que se va a tratar. Por lo tanto, para un sujeto humano, se prefiere un anticuerpo totalmente humano o humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo. Del mismo modo, en el caso de sujetos de otras especies, dichas construcciones pueden diseñarse para que coincidan estrechamente con la especie concreta, con el fin de evitar respuestas inmunitarias no deseadas a la terapia.

[0179]En algunas realizaciones, el sujeto es tratado con la composición como monoterapia. En algunas realizaciones, el sujeto al que se va a administrar la composición aquí descrita ha recibido otra terapia. En algunas realizaciones, el sujeto recibe una terapia combinada que incluye la composición. En algunas realizaciones, el sujeto ha recibido un trasplante de médula ósea y/o un trasplante de células madre. En algunas realizaciones, el sujeto está en remisión. En algunas realizaciones, el sujeto ha experimentado una recidiva. En algunas realizaciones, el sujeto no responde o se ha vuelto resistente a una terapia estándar.

[0180]En algunas realizaciones, el sujeto se trata con la composición a una dosis de aproximadamente 1-20 mg de mAb/kg por dosis, por ejemplo aproximadamente 1 mg de mAb/kg, 2 mg de mAb/kg, 3 mg de mAb/kg, 4 mg de mAb/kg, 5 mg de mAb/kg, 6 mg de mAb/kg, 7 mg de mAb/kg, 8 mg de mAb/kg, 9 mg de mAb/kg, 10 mg de mAb/kg, 11 mg de mAb/kg, 12 mg de mAb/kg, 13 mg de mAb/kg, 14 mg de mAb/kg, 15 mg de mAb/kg, 16 mg de mAb/kg, 17 mg de mAb/kg, 18 mg de mAb/kg, 19 mg de mAb/kg, o 20 mg de mAb/kg. En una realización, la dosis puede ser de aproximadamente 1-15 mAb/kg, 1-10 mAb/kg, o 1-5 mAb/kg. En realizaciones particulares, el sujeto se trata con la composición a una dosis de aproximadamente 1-20 mg de mAb/kg por dosis, por ejemplo aproximadamente 1 mg de mAb/kg, 2 mg de mAb/kg, 3 mg de mAb/kg, 4 mg de mAb/kg, 5 mg de mAb/kg, 6 mg de mAb/kg, 7 mg de mAb/kg, 8 mg de mAb/kg, 9 mg de mAb/kg, o 10 mg de mAb/kg. En algunas realizaciones, la dosis es de aproximadamente 1 10 mg de mAb/kg. La administración de la composición puede ser por cualquier vía, preferentemente intravenosa o infusión.

[0181]En algunas realizaciones, el sujeto es tratado con la composición una vez por semana. En algunas realizaciones, el sujeto es tratado con la composición cada dos semanas. En algunas realizaciones, el sujeto es tratado con la composición cada 4 semanas. En algunas realizaciones, el sujeto es tratado con la composición una vez al mes.

[0182]En algunas realizaciones, la dosificación ocurre en una fase inicial (p. ej., un período de tiempo cuando el sujeto comienza el tratamiento por primera vez), seguido por una fase de mantenimiento. En una realización, la frecuencia de dosificación es la misma en la fase inicial y en la fase de mantenimiento. En una realización, la frecuencia de dosificación es diferente en la fase inicial en comparación con la fase de mantenimiento. Por ejemplo, en una realización, la dosificación en la fase inicial es el día 1 y el día 4, seguida de una dosificación semanal o mensual en la fase de mantenimiento. En una realización, la dosificación en la fase inicial es el día 1 y el día 7, seguida de una dosificación semanal o mensual en la fase de mantenimiento. En una realización, la dosificación en la fase inicial se realiza los días 1, 4 y 7, seguida de una dosificación semanal o mensual en la fase de mantenimiento. En una realización, la dosificación en la fase inicial se realiza los días 1, 3, 5 y 7, seguida de una dosificación semanal o mensual en la fase de mantenimiento. En una realización, la dosificación en la fase inicial es del día 1 al día 7, seguida de una dosificación semanal o mensual en la fase de mantenimiento.

[0183]Dichos trastornos incluyen, entre otros, los siguientes.

Tumor sólido

[0184]Las composiciones y los métodos relacionados son útiles para tratar a un sujeto con un tumor sólido. Así, la divulgación incluye una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de LRRC33 para su uso en el tratamiento de tumor sólido en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición al sujeto. En algunas realizaciones, el inhibidor de LRRC33 se une a un complejo proTGFβ inhibiendo así la liberación del factor de crecimiento TGFβ activo del complejo. En realizaciones preferidas, el proTGFβ es proTGFβ1.

Leucemia

[0185]En algunas realizaciones, el trastorno proliferativo hematológico que puede tratarse de acuerdo con la presente invención es la leucemia.

[0186]La leucemia es un cáncer de los tejidos hematopoyéticos del organismo, incluida la médula ósea y el sistema linfático, y puede ser aguda o crónica. La leucemia suele afectar a los glóbulos blancos (p. ej., células mieloides y linfoides). Los cuatro tipos principales de leucemia son: Leucemia mieloide aguda (o mielógena) (AML); Leucemia mieloide crónica (o mielógena) (CML); Leucemia linfocítica aguda (o linfoblástica) (ALL); y. Leucemia linfocítica crónica (CLL).

AML

[0187]En algunas realizaciones preferidas, el trastorno proliferativo hematológico que puede tratarse de acuerdo con la presente invención es la leucemia mieloide aguda (AML). La AML es el tipo más común de leucemia que afecta a los adultos, y puede desarrollarse a partir de células madre mieloides o de blastos mieloides. La Organización Mundial de la Salud clasifica la AML en varios tipos.

[0188]La leucemia mieloide aguda con anomalías genéticas recurrentes incluye:

• AML con translocaciones entre los cromosomas 8 y 21 - [t(8;21)(q22;q22);] RUNX1/RUNX1T1; (ICD-O 9896/3);

• AML con inversiones en el cromosoma 16 - [inv(16)(p13.1q22)] o translocaciones internas en el mismo -[t(16;16)(p13.1 ;q22);] CBFB/MYH11; (ICD-O 9871/3);

• Leucemia promielocítica aguda con translocaciones entre los cromosomas 15 y 17 - [t(15;17)(q22;q12);] RARA/PML; (ICD-O 9866/3);

• AML con translocaciones entre los cromosomas 9 y 11 -[t(9;11)(p22;q23);] MLLT3/MLL;

• AML con translocaciones entre los cromosomas 6 y 9 -[t(6;9)(p23;q34);] DEK/NUP214;

• AML con inversiones en el cromosoma 3 - [inv(3)(q21q26.2)] o translocaciones internas en el mismo -[t(3;3)(q21 ;q26.2);] RPN1/EVI1;

• AML megacarioblástica con translocaciones entre los cromosomas 1 y 22 -[t(1 ;22)(p13;q13);] RBM15/MKL1;

• AML con NPM1 mutado

• AML con CEBPA mutado.

[0189]La AML con cambios relacionados con la mielodisplasia incluye a pacientes que han tenido un síndrome mielodisplásico (SMD) o una enfermedad mieloproliferativa (EMP) documentada previamente que luego se ha transformado en AML, o que tienen anomalías citogenéticas características de este tipo de AML (con antecedentes previos de SMD o EMP que han pasado desapercibidos en el pasado, pero la citogenética sigue siendo sugestiva de antecedentes de SMD/EMP). Esta categoría de AML se da con mayor frecuencia en personas de edad avanzada y suele tener peor pronóstico.:

• AML con cariotipo complejo

• Anomalías desequilibradas

- AML con deleciones del cromosoma 7 -[del(7q);].

- AML con deleciones del cromosoma 5 -[del(5q);].

- AML con aberraciones cromosómicas desequilibradas en el cromosoma 17 -[i(17q)/t(17p);].

- AML con deleciones del cromosoma 13 -[del(13q);].

- AML con deleciones del cromosoma 11 -[del(11q);].

- AML con aberraciones cromosómicas desequilibradas en el cromosoma 12 -[del(12p)/t(12p);]. - AML con deleciones del cromosoma 9 -[del(9q);].

- AML con aberraciones en el cromosoma X -[idic(X)(q13);]

• Anomalías equilibradas

- AML con translocaciones entre los cromosomas 11 y 16 - [t(11;16)(q23;q13.3);], sin relación con quimioterapia o radiación ionizante previas.

- AML con translocaciones entre los cromosomas 3 y 21 - [t(3;21)(q26.2;q22.1);], sin relación con quimioterapia o radiación ionizante previas.

- AML con translocaciones entre los cromosomas 1 y 3 -[t(1 ;3)(p36.3;q21.1);].

- AML con translocaciones entre los cromosomas 2 y 11 - [t(2;11 )(p21 ;q23);], sin relación con quimioterapia o radiación ionizante previas.

- AML con translocaciones entre los cromosomas 5 y 12 -[t(5;12)(q33;p12);].

- AML con translocaciones entre los cromosomas 5 y 7 -[t(5;7)(q33;q11.2);].

- AML con translocaciones entre los cromosomas 5 y 17 -[t(5;17)(q33;p13);].

- AML con translocaciones entre los cromosomas 5 y 10 -[t(5;10)(q33;q21);].

- AML con translocaciones entre los cromosomas 3 y 5 -[t(3;5)(q25;q34);].

[0190]Las neoplasias mieloides relacionadas con la terapia incluyen pacientes que han recibido quimioterapia y/o radiación previas y posteriormente desarrollan AML o SMD. Estas leucemias pueden caracterizarse por anomalías cromosómicas específicas y a menudo conllevan un peor pronóstico.

Sarcoma mieloide.

[0191]Las proliferaciones mieloides relacionadas con el síndrome de Down incluyen la denominada "mielopoyesis anormal transitoria" y la "leucemia mieloide asociada al síndrome de Down".

[0192]La neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas incluye la denominada "neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas".

[0193]La AML no categorizada de otro modo incluye subtipos de AML que no entran en las categorías anteriores, como:

• AML con diferenciación mínima

• AML sin maduración

• AML con maduración

• Leucemia mielomonocítica aguda

• Leucemia monoblástica y monocítica aguda

• Leucemia eritroide aguda

• Leucemia megacarioblástica aguda

• Leucemia basófila aguda

• Panmielosis aguda con mielofibrosis.

[0194]El sistema de clasificación franco-americano-británico (FAB) divide la AML en ocho subtipos, de M0 a M7, en función del tipo de célula a partir del cual se desarrolló la leucemia y de su grado de madurez. Esto se hace examinando el aspecto de las células malignas con microscopía óptica y/o utilizando la citogenética para caracterizar cualquier anomalía cromosómica subyacente. Los subtipos tienen diferentes pronósticos y respuestas al tratamiento.

[0195]La fisiopatología de la AML es compleja. La célula maligna en la AML es el mieloblasto. En la hematopoyesis normal, el mieloblasto es un precursor inmaduro de los glóbulos blancos mieloides; un mieloblasto normal madurará gradualmente hasta convertirse en un glóbulo blanco maduro. En la AML, sin embargo, un solo mieloblasto acumula cambios genéticos que detienen la célula en su estado inmaduro e impiden la diferenciación. Una mutación de este tipo por sí sola no causa leucemia; sin embargo, cuando dicha "detención de la diferenciación" se combina con otras mutaciones que alteran los genes que controlan la proliferación, el resultado es el crecimiento incontrolado de un clon inmaduro de células, que da lugar a la entidad clínica de la AML.

[0196]Gran parte de la diversidad y heterogeneidad de la AML se debe a que la transformación leucémica puede ocurrir en un número de diferentes pasos a lo largo de la vía de diferenciación. Los modernos esquemas de clasificación de la AML reconocen que las características y el comportamiento de la célula leucémica (y de la leucemia) pueden depender de la fase en la que se detuvo la diferenciación.

[0197]Se pueden encontrar anomalías citogenéticas específicas en muchas personas con AML; los tipos de anomalías cromosómicas a menudo tienen importancia pronóstica. Las translocaciones cromosómicas codifican proteínas de fusión anormales, generalmente factores de transcripción cuyas propiedades alteradas pueden causar la "detención de la diferenciación". Por ejemplo, en la leucemia promielocítica aguda, la translocación t(15;17) produce una proteína de fusión PML-RARa que se une al elemento receptor del ácido retinoico en los promotores de varios genes mieloides específicos e inhibe la diferenciación mieloide.

[0198]Los signos y síntomas clínicos de la AML son el resultado del crecimiento de células clonales leucémicas, que tienden a desplazar o interferir con el desarrollo de células sanguíneas normales en la médula ósea. Esto provoca neutropenia, anemia y trombocitopenia. A su vez, los síntomas de la AML suelen deberse a la escasez de estos elementos sanguíneos normales. En raras ocasiones, las personas con AML pueden desarrollar un cloroma, o tumor sólido de células leucémicas fuera de la médula ósea, que puede causar diversos síntomas en función de su localización.

[0199]Típicamente, el tratamiento de primera línea de la AML consiste principalmente en quimioterapia, y se divide en dos fases: terapia de inducción y post-remisión (o consolidación). El objetivo de la terapia de inducción es lograr una remisión completa reduciendo el número de células leucémicas a un nivel indetectable; el objetivo de la terapia de consolidación es eliminar cualquier enfermedad residual indetectable y lograr la curación. El trasplante de células madre hematopoyéticas suele considerarse si fracasa la quimioterapia de inducción o tras una recidiva, aunque a veces también se utiliza como tratamiento de primera línea en personas con enfermedad de alto riesgo. Continúan los esfuerzos por utilizar inhibidores de la tirosina cinasa en la AML.

[0200]Más recientemente, el Gemtuzumab ozogamicina fue aprobado por la FDA para el tratamiento de la AML recidivante o refractaria CD33-positiva. Gemtuzumab es un anticuerpo monoclonal frente a CD33 unido a un agente citotóxico de la clase de las calicheamicinas. CD33 o Siglec-3 (lectina 3 similar a Ig de unión al ácido siálico, SIGLEC3, SIGLEC-3, gp67, p67) suele considerarse un antígeno de superficie de las células mieloides, pero también se encuentra en algunas células linfoides, como las células T activadas y los linfocitos T asesinos (NK). El CD33 también se expresa en la mayoría de los blastos leucémicos, lo que convierte a este antígeno en una diana terapéutica útil, pero su expresión también se observa en las células hematopoyéticas normales, aunque la expresión suele disminuir con la maduración de las células madre.

[0201]Los efectos secundarios comunes asociados con la terapia anti-CD33 incluyeron escalofríos, fiebre, náuseas y vómitos. Los efectos secundarios graves incluían mielosupresión grave (supresión de la actividad de la médula ósea, que interviene en la formación de diversas células sanguíneas [encontrada en el 98% de los pacientes]), trastornos del sistema respiratorio, síndrome de lisis tumoral, hipersensibilidad de tipo III, oclusión venosa, infección y muerte. El fármaco aprobado se comercializa como Mylotarg®, y la etiqueta contiene un recuadro de advertencia por hepatotoxicidad, incluida la enfermedad venooclusiva hepática (EVO) grave o mortal, también conocida como síndrome de obstrucción sinusoidal (SOS). Las reacciones adversas más frecuentes (>15%) fueron hemorragia, infección, fiebre, náuseas, vómitos, estreñimiento, cefalea, aumento de AST, aumento de ALT, erupción cutánea y mucositis. Las reacciones adversas graves asociadas a gemtuzumab ozogamicina son la hepatotoxicidad (incluida la enfermedad venooclusiva), las reacciones relacionadas con la infusión (incluida la anafilaxia) y la hemorragia.

[0202]Los inventores de la presente divulgación contemplaron que las toxicidades asociadas con la focalización de marcadores mieloides amplios, como CD33, pueden reducirse eficazmente seleccionando una diana cuya expresión sea más restrictiva para las células asociadas a la enfermedad, excluyendo al mismo tiempo las células normales/sanas de linaje mieloide, incluidas las plaquetas. El reconocimiento de que la expresión de LRRC33 está restringida a un subconjunto limitado de células mieloides presenta la oportunidad de dirigirse más estrechamente a las células asociadas a la enfermedad sin afectar negativamente a las células normales/sanas que se ven afectadas por los enfoques existentes, como la terapia anti-CD33.

[0203]En consecuencia, mientras que la heterogeneidad de la patología de la AML ha hecho que el tratamiento universal sea un reto, el hallazgo de que LRRC33 se expresa altamente en las células de la AML proporciona ventajosamente una nueva oportunidad terapéutica. Así, la presente invención incluye el uso de inhibidores de LRRC33 para el tratamiento de la AML. Un inhibidor de LRRC33 según la invención se utiliza en el tratamiento de AML (por ejemplo, AML recién diagnosticada/de novo, AML recidivante y AML refractaria) en un sujeto humano (p. ej., adultos y sujetos pediátricos). En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento implican administrar a un paciente con AML una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un dominio de unión para LRRC33 y un dominio Fc que se une a FcR y es capaz de desencadenar ADCC de células diana que expresan LRRC33 en la superficie celular. El objetivo de esta terapia es destruir selectivamente las células que expresan LRRC33, por ejemplo, las células de la AML, tanto en la circulación como en la médula ósea. Dicha terapia puede administrarse junto con una terapia adicional, como un inhibidor de la tirosina quinasa y/o un trasplante (p. ej., trasplante de médula ósea, trasplante de células madre, etc.).

[0204]Se contempla que dirigirse a células que expresan LRRC33, en comparación con dirigirse a células que expresan CD33, proporcionará un enfoque terapéutico más seguro que probablemente muestre efectos secundarios adversos reducidos. Así, un inhibidor de LRRC33 de la presente divulgación se utiliza en un método para reducir las toxicidades asociadas con la terapia actual de AML (terapia anti-CD33) en un sujeto humano. En comparación con una terapia anti-CD33, se espera que una terapia con un inhibidor de LRRC33 cause menos acontecimientos adversos, entre los que se incluyen: hepatotoxicidad (como enfermedad hepática veno-oclusiva); reacciones relacionadas con la infusión (como anafilaxia); hemorragia (p. ej., debido a trombocitopenia prolongada); prolongación del intervalo QT; infección (menos frecuencia y/o menos gravedad); muerte (es decir,mayor supervivencia) y, toxicidad embriofetal. En consecuencia, un inhibidor de LRRC33 para su uso como se describe en el presente documento (en particular para su uso en el tratamiento de la leucemia, tal como AML) puede provocar efectos secundarios adversos reducidos (p. ej., seleccionados de los descritos anteriormente) en relación con una terapia anti-CD33. Un inhibidor de LRRC33 para su uso como se describe en el presente documento (en particular para su uso en el tratamiento de la leucemia, como la AML) puede provocar una toxicidad reducida en relación con una terapia anti-CD33, por ejemplo cuando se utiliza una cantidad eficaz del inhibidor de LRRC33 y la terapia anti-CD33. La terapia anti-CD33 puede ser Gemtuzumab ozogamicina. La AML puede ser CD33-positiva en recidiva o refractaria. Además, el tratamiento con el inhibidor de LRRC33 puede mejorar la supervivencia libre de eventos en el subgrupo de pacientes con citogenética de riesgo adverso.

[0205]Debido a su capacidad de dirigirse a una subpoblación más selectiva de células en los pacientes, la terapia con el inhibidor de LRRC33 puede proporcionar una eficacia mejorada con respecto a las terapias actualmente disponibles. La eficacia puede establecerse sobre la base de la supervivencia libre de acontecimientos, medida, por ejemplo, desde la fecha de aleatorización hasta el fracaso de la inducción, la recidiva o la muerte por cualquier causa. Se contempla que el inhibidor de LRRC33 pueda lograr una mejora de la supervivencia global en poblaciones de pacientes tales como aquellos con AML recién diagnosticada (que reciban monoterapia o terapia combinada), aquellos con AML en recidiva y/o refractaria. En algunas realizaciones, la terapia con el inhibidor de LRRC33 logra una probabilidad de supervivencia de al menos 0,4 (p. ej., 0,40, 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, etc.) a los 24 meses según lo determinado por cualquier medida adecuada, como la trama de Kaplan-Meier de supervivencia libre de eventos dentro de una población de pacientes.

CML

[0206]En algunas realizaciones, el trastorno proliferativo hematológico que puede tratarse de acuerdo con la presente invención es la leucemia mieloide crónica (CML). La CML es una forma de leucemia caracterizada por el crecimiento aumentado y no regulado de células predominantemente mieloides en la médula ósea y la acumulación de estas células en la sangre. La CML es un trastorno clonal de las células madre de la médula ósea en el que se produce una proliferación de granulocitos maduros (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) y sus precursores. Es un tipo de enfermedad mieloproliferativa asociada a una translocación cromosómica característica denominada cromosoma Filadelfia. En la actualidad, la CML se trata en gran medida con inhibidores de la tirosina quinasa (TKI) dirigidos (Bcr-Abl), que han permitido mejorar drásticamente las tasas de supervivencia a largo plazo.

[0207]No obstante, una fracción significativa de la población de pacientes no responde o es resistente al tratamiento estándar que comprende inhibidores de la tirosina cinasa. Por lo tanto, una terapia dirigida a LRRC33 descrita en el presente documento puede proporcionar una opción de tratamiento eficaz para los pacientes con CML. En consecuencia, la presente invención incluye el uso de inhibidores de LRRC33 para el tratamiento de la CML. En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento implican administrar a un paciente con CML una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un dominio de unión para LRRC33 y un dominio Fc que se une a FcR y es capaz de desencadenar ADCC de células diana que expresan LRRC33 en la superficie celular. El objetivo de esta terapia es atacar y destruir selectivamente las células que expresan LRRC33, por ejemplo, las células de CML, tanto en la circulación como en la médula ósea. Dicha terapia puede administrarse junto con una terapia adicional, como un inhibidor de la tirosina quinasa y/o un trasplante (p. ej., trasplante de médula ósea, trasplante de células madre, etc.).

[0208]En algunas realizaciones, se emplea un inhibidor de LRRC33 como agente ADC para tratar la CML. En algunas realizaciones, el inhibidor de LRRC33 se utiliza para el tratamiento de pacientes con CML recién diagnosticada, en recidiva o refractaria. En comparación con una terapia dirigida ampliamente a las células mieloides, el inhibidor de LRRC33 no ataca a las células mieloides normales. Así pues, LRRC33 es una diana más selectiva para las células asociadas a la enfermedad y puede proporcionar una mayor seguridad y tolerabilidad (toxicidades reducidas), en relación con otras terapias.

ALL

[0209] En algunas realizaciones, el trastorno proliferativo hematológico que puede tratarse de acuerdo con la presente invención es la leucemia linfocítica aguda (ALL). La leucemia linfoblástica aguda, también conocida como leucemia linfocítica aguda o leucemia linfoide aguda (ALL), es una forma aguda de leucemia, o cáncer de los glóbulos blancos, caracterizada por la sobreproducción y acumulación de glóbulos blancos cancerosos e inmaduros, conocidos como linfoblastos. En las personas con ALL, los linfoblastos se producen en exceso en la médula ósea y se multiplican continuamente, provocando daños y la muerte al inhibir la producción de células normales (como glóbulos rojos y blancos y plaquetas) en la médula ósea y al extenderse (infiltrarse) a otros órganos. La ALL es más frecuente en la infancia.

[0210]Se han encontrado mutaciones funcionales de la línea germinal de algunos genes relacionados con el cáncer en la ALL familiar o enriquecidas en casos que implican exposición a la radiación (p. ej., PAX5, ETV6 y CDKN2A), que explican la susceptibilidad a la ALL en una pequeña proporción de personas, mientras que grandes estudios de asociación de todo el genoma revelaron una predisposición hereditaria múltiple al riesgo de ALL, incluidos polimorfismos de nucleótido único (SNP) en los loci ARID5B, IKZF1, CEBPE, PIP4K2A, GATA3 y CDKN2A entre diversas poblaciones.

[0211]Las tres categorías terapéuticamente distintas de ALL que pueden ser identificadas por inmunofenotipificación de marcadores de superficie de los linfocitos anormales son: ALL linfoblástica B (esta categoría puede subdividirse según la correlación del inmunofenotipo de las células de la ALL con las fases del desarrollo normal de las células B); ALL de Burkitt (corresponde a la ALL-L3); y, ALL de células T. La detección precoz de la ALL es crucial para un tratamiento eficaz. El objetivo suele ser inducir una remisión duradera, definida como la ausencia de células cancerosas detectables en el organismo (normalmente menos del 5% de blastos en la médula ósea). El tratamiento de la leucemia aguda puede incluir quimioterapia, esteroides, radioterapia, tratamientos intensivos combinados (incluidos los trasplantes de médula ósea o de células madre) y factores de crecimiento.

[0212]El objetivo de la inducción de la remisión es eliminar rápidamente la mayoría de las células tumorales y conseguir que el paciente entre en remisión. Se define como la presencia de menos del 5% de blastos leucémicos en la médula ósea, células sanguíneas normales y ausencia de células tumorales en la sangre, y ausencia de otros signos y síntomas de la enfermedad. La profilaxis del sistema nervioso central (CNS) debe comenzar durante esta fase del tratamiento y continuar durante el periodo de consolidación/intensificación. La justificación se basa en la presencia de afectación del CNS en el 10%-40% de los pacientes adultos en el momento del diagnóstico. La combinación de prednisolona o dexametasona, vincristina, asparaginasa (mejor tolerancia en pacientes pediátricos) y daunorrubicina (utilizada en la ALL en adultos) se utiliza para inducir la remisión. La profilaxis del sistema nervioso central puede realizarse mediante irradiación, citarabina metotrexato o citarabina liposomal. En la ALL con cromosoma Filadelfia positivo, la intensidad del tratamiento de inducción inicial puede ser inferior a la que se ha administrado tradicionalmente.

[0213]En la fase de consolidación/intensificación del tratamiento, se utilizan altas dosis de quimioterapia multimedicamentosa intravenosa para reducir aún más la carga tumoral. Dado que las células de la ALL a veces penetran en el CNS, la mayoría de los protocolos incluyen la administración de quimioterapia en el líquido del CNS (p. ej., quimioterapia intratecal). Algunos centros administran el fármaco a través del reservorio Ommaya (un dispositivo que se coloca quirúrgicamente bajo el cuero cabelludo y se utiliza para administrar fármacos al líquido cefalorraquídeo y extraer líquido cefalorraquídeo para realizar diversas pruebas). Otros centros realizarían múltiples punciones lumbares según fuera necesario para la realización de pruebas y la administración de tratamientos. Los protocolos típicos de intensificación utilizan vincristina, ciclofosfamida, citarabina, daunorrubicina, etopósido, tioguanina o mercaptopurina administrados en bloque en diferentes combinaciones. Para la protección del CNS, se suele utilizar metotrexato intratecal o citarabina combinados con o sin irradiación craneoespinal (el uso de radioterapia en la cabeza y la columna vertebral). La recidiva en el sistema nervioso central se trata con la administración intratecal de hidrocortisona, metotrexato y citarabina.

[0214]Durante la fase de mantenimiento, el objetivo es eliminar cualquier célula residual que no haya sido eliminada por los regímenes de inducción e intensificación de la remisión. Aunque estas células son pocas, provocarán una recidiva si no se erradican. Para ello, se suele utilizar mercaptopurina oral diaria, metotrexato oral una vez a la semana, un ciclo de 5 días de vincristina intravenosa una vez al mes y corticosteroides orales. La duración de la terapia de mantenimiento es de 2-3 años.

[0215]En consecuencia, la presente divulgación incluye el uso de inhibidores de LRRC33 para el tratamiento de la ALL. En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento implican administrar a un paciente con ALL una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un dominio de unión para LRRC33 y un dominio Fc que se une a FcR y es capaz de desencadenar ADCC de células diana que expresan LRRC33 en la superficie celular. Dicha terapia tiene como objetivo atacar y eliminar selectivamente las células que expresan LRRC33, por ejemplo, las células de ALL, tanto en circulación como dentro de la médula ósea. Dicha terapia puede administrarse junto con una terapia adicional, como un inhibidor de la tirosina quinasa y/o un trasplante (p. ej., trasplante de médula ósea, trasplante de células madre, etc.).

[0216]En algunas realizaciones, se emplea un inhibidor de LRRC33 como agente ADC para tratar la ALL. En algunas realizaciones, el inhibidor de LRRC33 se utiliza para el tratamiento de pacientes con leucemia linfoblástica aguda (ALL) precursora de células B recién diagnosticada, en recidiva o refractaria. En comparación con la terapia actual, como la terapia anti-CD22, que se dirige a los linfocitos B maduros, el inhibidor LRRC33 no ataca a las células B normales. Esto se ve corroborado por los datos que muestran que las células B normales aisladas de individuos sanos no muestran una proteína LRRC33 elevada en la superficie celular, medida por FACS. Esto indica que LRRC33 es una diana más selectiva para las células asociadas a la enfermedad y puede proporcionar una mayor seguridad y tolerabilidad (toxicidad reducida), en relación con la terapia anti-CD22.

[0217]La citogenética (el estudio de los grandes cambios característicos en los cromosomas de las células cancerosas) es un importante factor predictivo del resultado. En algunas realizaciones, la población de pacientes adecuada se encuentra dentro de uno o más de los siguientes subtipos citogenéticos:

• Una translocación entre los cromosomas 9 y 22, conocida como cromosoma Filadelfia, se produce en aproximadamente el 20% de los casos de ALL en adultos y en el 5% de los casos pediátricos.

• Una translocación entre los cromosomas 4 y 11 se produce en aproximadamente el 4% de los casos y es más frecuente en lactantes menores de 12 meses.

• No todas las translocaciones de cromosomas conllevan un peor pronóstico. Algunas translocaciones son relativamente favorables. Por ejemplo, la hiperdiploidía (>50 cromosomas) es un buen factor pronóstico. • Los cambios en el número de copias en todo el genoma pueden evaluarse mediante citogenética convencional o cariotipado virtual. El cariotipo virtual de matriz SNP puede detectar cambios en el número de copias y el estado LOH, mientras que el arrayCGH sólo puede detectar cambios en el número de copias. Se ha descrito LOH neutra (disomía uniparental adquirida) en loci clave de la ALL, como el gen CDKN2A, que tiene importancia pronóstica. El cariotipo virtual de matriz SNP puede detectar fácilmente LOH de copia neutra. Las matrices de CGH, FISH y citogenética convencional no pueden detectar LOH de copia neutra.

[0218]Los métodos de tratamiento pueden combinarse con terapia adicional para tratar la ALL, como quimioterapia, esteroides, radioterapia, tratamientos intensivos combinados (incluidos trasplantes de médula ósea o células madre), factores de crecimiento e inmunoterapia.

CLL

[0219]En algunas realizaciones, el trastorno proliferativo hematológico que puede tratarse de acuerdo con la presente invención es la leucemia linfocítica crónica de células B (CLL-B), también conocida como leucemia linfoide crónica (CLL). La CLL es un tipo común de leucemia en adultos. La CLL afecta a los linfocitos B, que se originan en la médula ósea, se desarrollan en los ganglios linfáticos y normalmente combaten las infecciones produciendo anticuerpos.

[0220]En la CLL, las células B crecen de forma descontrolada y se acumulan en la médula ósea y la sangre, donde desplazan a las células sanguíneas sanas. La LLC es una fase del linfoma linfocítico pequeño (SLL), un tipo de linfoma de células B, que puede presentarse principalmente en los ganglios linfáticos. La CLL y la SLL se consideran la misma enfermedad subyacente.

[0221]Los regímenes de quimioterapia combinada son eficaces tanto en la CLL recién diagnosticada como en la recidivante. Las combinaciones de fludarabina con agentes alquilantes (ciclofosfamida) producen mayores tasas de respuesta y una supervivencia libre de progresión más prolongada que los agentes únicos, entre los que se incluyen: FC (fludarabina con ciclofosfamida),<f>R (fludarabina con rituximab), FCR (fludarabina, ciclofosfamida y rituximab) y CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona).

[0222]La quimioinmunoterapia con FCR ha demostrado mejorar las tasas de respuesta, la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global en un gran ensayo aleatorizado en pacientes con CLL seleccionados por su buen estado físico. Los agentes alquilantes aprobados para la CLL incluyen la bendamustina y la ciclofosfamida.

[0223]La presente divulgación incluye el uso de inhibidores de LRRC33 para el tratamiento de la CLL. En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento implican administrar a un paciente con CLL una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un dominio de unión para LRRC33 y un dominio Fc que se une a FcR y es capaz de desencadenar ADCC de células diana que expresan LRRC33 en la superficie celular. El objetivo de esta terapia es atacar y destruir selectivamente las células que expresan LRRC33, por ejemplo, las células CLL, tanto en la circulación como en la médula ósea. Dicha terapia puede administrarse junto con otras terapias adicionales, como las enumeradas anteriormente.

[0224]En algunas realizaciones, se emplea un inhibidor de LRRC33 como agente ADC para tratar la CLL. En algunas realizaciones, el inhibidor de LRRC33 se utiliza para el tratamiento de pacientes con CLL recién diagnosticada, en recidiva o refractaria. En comparación con una terapia dirigida a los linfocitos B maduros, el inhibidor LRRC33 no ataca a las células B normales. Esto se ve corroborado por los datos que muestran que las células B normales aisladas de individuos sanos no muestran una proteína LRRC33 elevada en la superficie celular, medida por FACS. Esto indica que LRRC33 es una diana más selectiva para las células asociadas a la enfermedad y puede proporcionar una mayor seguridad y tolerabilidad (toxicidades reducidas), en relación con otras terapias.

Mieloma múltiple

[0225]En algunas realizaciones, el trastorno proliferativo hematológico que puede tratarse de acuerdo con la presente invención es el mieloma múltiple (MM). El<m>M, también conocido como mieloma de células plasmáticas, es un cáncer de células plasmáticas, un tipo de glóbulo blanco normalmente encargado de producir anticuerpos. En fases avanzadas, pueden aparecer dolores óseos, hemorragias, infecciones frecuentes y anemia. Las complicaciones pueden incluir la amiloidosis. El mieloma múltiple se considera tratable pero generalmente incurable. Las remisiones pueden producirse con esteroides, quimioterapia, talidomida o lenalidomida y trasplante de células madre. A veces se utilizan bifosfonatos y radioterapia para reducir el dolor de las lesiones óseas.

[0226]En caso de sospecha de mieloma múltiple se realiza un estudio esquelético. Se trata de una serie de radiografías del cráneo, el esqueleto axial y los huesos largos proximales. La actividad del mieloma aparece a veces como "lesiones líticas" (con desaparición local del hueso normal debido a la reabsorción), y en la radiografía de cráneo como "lesiones punzantes" (cráneo en forma de bote de pimienta). La resonancia magnética (RM) es más sensible que la radiografía simple en la detección de lesiones líticas, y puede sustituir al estudio esquelético, especialmente cuando se sospecha una enfermedad vertebral. Ocasionalmente se realiza un TAC para medir el tamaño de los plasmocitomas de partes blandas. Las gammagrafías óseas no suelen tener ningún valor adicional en el estudio de los pacientes con mieloma (no hay formación de hueso nuevo; las lesiones líticas no se visualizan bien en la gammagrafía ósea).

[0227]Normalmente se realiza una biopsia de médula ósea para estimar el porcentaje de médula ósea ocupado por células plasmáticas. Este porcentaje se utiliza en los criterios de diagnóstico del mieloma. La inmunohistoquímica (tinción de determinados tipos celulares mediante anticuerpos contra proteínas de superficie) permite detectar células plasmáticas que expresan inmunoglobulina en el citoplasma y, ocasionalmente, en la superficie celular; las células del mieloma suelen ser CD56, CD38, CD138, CD319 positivas y CD19 y CD45 negativas. En el mieloma también puede realizarse una citogenética con fines pronósticos, incluyendo un FISH específico de mieloma y un cariotipo virtual.

[0228]En algunas realizaciones, el paciente es diagnosticado con el CD138 y/o el antígeno de superficie CD319 (SLAMF7) como marcadores de células de mieloma. Otras pruebas de laboratorio útiles incluyen la medición cuantitativa de IgA, IgG, IgM (inmunoglobulinas) para buscar paresia inmunitaria, y beta-2 microglobulina que proporciona información pronóstica. En el frotis de sangre periférica, suele observarse la formación derouleauxde los glóbulos rojos, aunque esto no es específico.

[0229]La reciente introducción de un inmunoensayo comercial para la medición de cadenas ligeras libres ofrece potencialmente una mejora en el seguimiento de la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento, en particular cuando la paraproteína es difícil de medir con precisión por electroforesis (por ejemplo, en el mieloma de cadenas ligeras, o cuando el nivel de paraproteína es muy bajo). Las investigaciones iniciales también sugieren que la medición de las cadenas ligeras libres también puede utilizarse, junto con otros marcadores, para evaluar el riesgo de progresión de una gammapatía monoclonal de significado indeterminado (GMSI) a mieloma múltiple.

[0230]Este ensayo, el ensayo de cadenas ligeras libres en suero, ha sido recomendado recientemente por el Grupo de Trabajo Internacional sobre Mieloma para el cribado, diagnóstico, pronóstico y seguimiento de las discrasias de células plasmáticas.

[0231] El pronóstico del mieloma varía mucho en función de diversos factores de riesgo. La Clínica Mayo ha desarrollado un modelo de estratificación del riesgo denominado Mayo Stratification for Myeloma and Risk-adapted Therapy (mSMART) que divide a los pacientes en categorías de alto riesgo y de riesgo estándar. Se considera que tienen mieloma de alto riesgo los pacientes con deleción del cromosoma 13 o hipodiploidía por citogenética convencional, t(4;14), t(14;16) o 17p- por estudios de genética molecular, o con un alto índice de etiquetado de células plasmáticas (3% o más).

Linfoma

[0232] En algunas realizaciones, el trastorno proliferativo hematológico que puede tratarse de acuerdo con la presente invención es el linfoma. El linfoma es un grupo de tumores de las células sanguíneas que se desarrollan a partir de los linfocitos. Existen varios subtipos de linfomas, pero las dos categorías principales son los linfomas de Hodgkin (LH) y los linfomas no Hodgkin (LNH). La Organización Mundial de la Salud (OMS) incluye otras dos categorías como tipos de linfoma: el mieloma múltiple y las enfermedades inmunoproliferativas. Alrededor del 90% de los linfomas son linfomas no Hodgkin.

[0233] Los factores de riesgo del linfoma de Hodgkin incluyen la infección por el virus de Epstein-Barr y antecedentes familiares de la enfermedad. Los factores de riesgo de los tipos comunes de linfomas no hodgkinianos incluyen las enfermedades autoinmunes, el VIH/SIDA, la infección por el virus linfotrópico T humano, los medicamentos inmunosupresores y algunos pesticidas. A continuación, puede realizarse un diagnóstico médico por imagen para determinar si el cáncer se ha extendido y dónde. En la mayoría de los casos, el linfoma se extiende a los pulmones, el hígado y/o el cerebro.

[0234] El tratamiento puede incluir uno o más de los siguientes elementos: quimioterapia, radioterapia, terapia dirigida y cirugía. En algunas realizaciones, el sujeto ha recibido al menos una terapia adicional de este tipo.

[0235] La clasificación, el tratamiento y el pronóstico pueden diferir según: Si se trata o no de un linfoma de Hodgkin; Si la célula que se está replicando es una célula T o una célula B; El lugar de donde surge la célula; El linfoma también puede extenderse al sistema nervioso central, a menudo alrededor del cerebro en las meninges, lo que se conoce como meningitis linfomatosa (LM).

[0236] El linfoma de Hodgkin es uno de los tipos de linfoma más comúnmente conocidos y difiere de otras formas de linfoma en su pronóstico y en varias características patológicas. La división en linfomas Hodgkin y no Hodgkin se utiliza en varios de los sistemas de clasificación más antiguos. Un linfoma de Hodgkin se caracteriza por la presencia de un tipo de célula denominada célula de Reed-Sternberg.

[0237] Los linfomas no Hodgkin, que se definen como todos los linfomas excepto el linfoma de Hodgkin, son más frecuentes que el linfoma de Hodgkin. Hay una gran variedad de linfomas en esta clase, y las causas, los tipos de células implicadas y el pronóstico varían según el tipo. La incidencia del linfoma no Hodgkin aumenta con la edad. Se divide a su vez en varios subtipos.

[0238] La clasificación de la OMS, publicada en 2001 y actualizada en 2008, se basa en los fundamentos de la "clasificación revisada del linfoma europeo-americano" (REAL). Este sistema agrupa los linfomas por tipo celular (es decir, el tipo celular normal que más se parece al tumor) y características fenotípicas, moleculares o citogenéticas definitorias. Los cinco grupos se muestran en la tabla. El linfoma de Hodgkin se considera por separado dentro de las clasificaciones de la OMS y las precedentes, aunque se reconoce que es un tumor de linfocitos, aunque marcadamente anormales, de linaje de células B maduras.

[0239] De las muchas formas de linfoma, algunas se clasifican como indolentes (por ejemplo, el linfoma linfocítico pequeño), compatibles con una larga vida incluso sin tratamiento, mientras que otras formas son agresivas (por ejemplo, el linfoma de Burkitt), causando un rápido deterioro y la muerte. Sin embargo, la mayoría de los linfomas agresivos responden bien al tratamiento y son curables. El pronóstico, por tanto, depende del diagnóstico correcto y de la clasificación de la enfermedad, que se establece tras el examen de una biopsia por un patólogo (normalmente un hematopatólogo).

[0240] Los subtipos de linfoma según la clasificación de la OMS incluyen: Neoplasias de células B maduras; Neoplasias de células T maduras y linfocitos T asesinos (NK); Neoplasias linfoides precursoras; Linfoma de Hodgkin; Trastornos linfoproliferativos asociados a inmunodeficiencias.

Myelofibrosis

[0241] En algunas realizaciones, los trastornos proliferativos hematológicos que pueden tratarse de acuerdo con la presente invención incluyen trastornos mieloproliferativos, como la mielofibrosis. El denominado grupo "clásico" de trastornos mieloproliferativos crónicos BCR-ABL (Ph) negativos incluye la trombocitemia esencial (TE), la policitemia vera (PV) y la mielofibrosis primaria (PMF).

[0242] La mielofibrosis es un tipo de leucemia crónica, por ejemplo, un cáncer que afecta a los tejidos hematopoyéticos del cuerpo, y es un trastorno neoplásico clonal de la hematopoyesis, la formación de componentes celulares sanguíneos, que altera la producción normal de células sanguíneas del cuerpo. El resultado es una extensa cicatrización de la médula ósea, que provoca anemia grave, debilidad, fatiga y, a menudo, un agrandamiento del bazo. Es uno de los trastornos mieloproliferativos, enfermedades de la médula ósea en las que se produce un exceso de células en alguna fase. La producción de citocinas, como el factor de crecimiento de fibroblastos, por parte del clon celular hematopoyético anormal (especialmente por parte de los megacariocitos) conduce a la sustitución del tejido hematopoyético de la médula ósea por tejido conectivo a través de la fibrosis colágena. La disminución del tejido hematopoyético merma la capacidad del paciente para generar nuevas células sanguíneas, lo que provoca una pancitopenia progresiva, es decir, una escasez de todos los tipos de células sanguíneas. Sin embargo, la proliferación de fibroblastos y la deposición de colágeno es un fenómeno secundario, y los propios fibroblastos no forman parte del clon celular anormal.

[0243]La mielofibrosis puede estar causada por células madre sanguíneas anormales en la médula ósea. Las células madre anómalas producen células maduras y poco diferenciadas que crecen rápidamente y se apoderan de la médula ósea, provocando fibrosis (formación de tejido cicatricial) e inflamación crónica.

[0244]La mielofibrosis primaria se asocia a mutaciones en la Janus quinasa 2 (JAK2), el receptor de trombopoyetina (MPL) y la calreticulina (CALR), que pueden conducir a la activación constitutiva de la vía JAK-STAT, produciéndose una cicatrización progresiva, o fibrosis, de la médula ósea. Los pacientes pueden desarrollar hematopoyesis extramedular, es decir, la formación de células sanguíneas que se produce en lugares distintos de la médula ósea, ya que las células hemopoyéticas se ven obligadas a migrar a otras zonas, en particular el hígado y el bazo. Esto provoca un agrandamiento de estos órganos. En el hígado, el tamaño anormal se denomina hepatomegalia. El agrandamiento del bazo se denomina esplenomegalia, que también contribuye a causar pancitopenia, sobre todo trombocitopenia y anemia. Otra complicación de la hematopoyesis extramedular es la poiquilocitosis, o presencia de hematíes de forma anormal.

[0245]El principal lugar de hematopoyesis extramedular en la mielofibrosis es el bazo, que suele estar notablemente agrandado en los pacientes que padecen mielofibrosis. Como consecuencia del agrandamiento masivo del bazo, a menudo se producen múltiples infartos subcapsulares en el bazo, lo que significa que, debido a la interrupción del suministro de oxígeno al bazo, se produce la muerte parcial o completa del tejido. A nivel celular, el bazo contiene precursores de glóbulos rojos, precursores de granulocitos y megacariocitos, destacando los megacariocitos por su número y por sus formas anormales. Los megacariocitos pueden estar implicados en la fibrosis secundaria que se observa en esta enfermedad.

[0246]Se ha sugerido que el TGFβ puede estar implicado en el aspecto fibrótico de la patogénesis de la mielofibrosis (véase, por ejemplo, Agarwal et al., "Bone marrow fibrosis in primary myelofibrosis: pathogenic mechanisms and the role of TGFβ" (2016) Stem Cell Investig 3:5). La patología de la médula ósea en la mielofibrosis primaria se caracteriza por fibrosis, neoangeogénesis y osteosclerosis, y la fibrosis se asocia a un aumento de la producción de colágenos depositados en la ECM.

[0247]Basándose en el hallazgo de que TGFβ es un componente del nicho leucémico de la médula ósea, se contempla que dirigirse al microambiente de la médula ósea con inhibidores de TGFβ puede ser un enfoque prometedor para reducir las células leucémicas que expresan moléculas presentadoras que regulan la disponibilidad local de TGFβ en el tejido afectado.

[0248]En consecuencia, un aspecto se refiere a métodos para tratar la mielofibrosis primaria. El método comprende administrar a un paciente que padece mielofibrosis primaria una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un inhibidor de TGFβ que provoca una reducción de la disponibilidad de TGFβ.

[0249]En algunas realizaciones, el inhibidor de TGFβ es un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une a un complejo proTGFβ inactivo (p. ej., latente), impidiendo así la liberación de TGFβ activo o maduro del complejo, inhibiendo eficazmente el paso de activación. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno se une específicamente a un complejo proTGFβ que está asociado con LRRC33, GARP, LTBP1, LTBP3 o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo o porción del mismo se une selectivamente a un complejo proTGFβ que está asociado con LRRC33 o GARP (pero no con LTBP1 o LTBP3). En algunas realizaciones, el anticuerpo o porción del mismo se une específicamente a un complejo proTGFβ que está asociado con LRRC33. En algunas realizaciones, el anticuerpo o porción del mismo se une específicamente a un complejo proTGFβ que está asociado con GARP.

[0250]Alternativa o adicionalmente a las realizaciones discutidas anteriormente, el inhibidor de TGFβ es un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une a LRRC33 o GARP y comprende un dominio para funciones efectoras adicionales. En algunas realizaciones, el dominio para la función efectora adicional puede ser un dominio Fc o similar a Fc para mediar la ADCC en las células diana.

[0251]Alternativa o adicionalmente a las formas de realización discutidas anteriormente, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo puede incluir una fracción adicional para transportar "una carga útil" de interés. Algunos ejemplos de cargas útiles adecuadas son, entre otros: fármacos terapéuticos, toxinas, marcadores y etiquetas de detección/imagen, etc. Dicha carga útil puede consistir en entidades químicas, pequeñas moléculas, polipéptidos, ácidos nucleicos, radioisótopos, etc.

[0252]Dado que la mielofibrosis es una enfermedad progresiva que manifiesta muchas facetas de patología en múltiples tejidos u órganos afectados, el enfoque terapéutico puede variar en función de la progresión de la enfermedad. Por ejemplo, en el sitio primario de la enfermedad (la médula ósea), se contempla que la terapia adecuada incluya un inhibidor de LRRC33 descrito en el presente documento, que se dirige específicamente a las células hematopoyéticas que expresan LRRC33. Esto puede lograrse mediante la administración de una composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente a un complejo proTGFβ presentado por LRRC33 e inhibe la activación de TGFβ en el paciente. También puede lograrse mediante la administración de una composición que comprenda un anticuerpo que se una específicamente a un LRRC33 e induzca la muerte de las células diana en el paciente. Alternativamente, estos enfoques pueden combinarse para utilizar un anticuerpo que es un inhibidor de la activación de TGFβ y también contiene una fracción adicional para mediar la citotoxicidad celular. Por ejemplo, la fracción adicional puede ser un dominio Fc o similar a Fc para inducir ADCC o una toxina conjugada con el anticuerpo como carga útil (p. ej., ADC).

[0253]Aunque la mielofibrosis puede considerarse un tipo de leucemia, se caracteriza por la manifestación de fibrosis secundaria. Debido a que se sabe que el TGFβ regula aspectos de la homeostasis de la ECM, cuya desregulación puede conducir a la fibrosis tisular, se contempla que en algunas realizaciones, es deseable inhibir las actividades del TGFβ asociadas con la ECM. En consecuencia, los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen e inhiben proTGFβ presentado por LTBPs (tales como LTBP1 y LTBp3) están comprendidos en esta invención. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos adecuados para tratar la mielofibrosis son "permisivos al contexto" en el sentido de que pueden unirse a múltiples contextos del complejo proTGFβ, tales como los asociados con LRRC33, GARP, LTBP1, LTBP3, o cualquier combinación de los mismos.

[0254]Las poblaciones adecuadas de pacientes con neoplasias mieloproliferativas que pueden tratarse con las composiciones y métodos aquí descritos incluyen: a) una población de pacientes que es Filadelfia (+); b) una población de pacientes que es Filadelfia (-); c) una población de pacientes que se clasifica como "clásica" (PV, ET y PMF); d) una población de pacientes portadores de la mutación JAK2V617F(+); e) una población de pacientes portadores de JAK2V617F(-); f) una población de pacientes con JAK2exón 12(+); g) una población de pacientes con MPL(+); y h) una población de pacientes con CALR(+). En algunas realizaciones, el paciente tiene hematopoyesis extramedular. En algunas realizaciones, la hematopoyesis extramedular se produce en el hígado, el pulmón, el bazo y/o los ganglios linfáticos. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica de la presente invención se administra localmente a uno o más de los sitios localizados de manifestación de la enfermedad.

Fibrosis

[0255]Los inhibidores de LRRC33 y las composiciones relacionadas aquí descritas se usan como terapéuticos en un método para tratar afecciones fibróticas, como fibrosis de órganos del pulmón, riñón, hígado, corazón, útero y/o la piel, y/o fibrosis de médula ósea. La bibliografía sugiere que los macrófagos activados, como los macrófagos derivados de monocitos que son reclutados en el tejido lesionado/fibrótico, se diferencian y contribuyen a la fibrosis tisular persistente (véase, por ejemplo, Misharin et al. (2017) "Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span" J. Exp. Med. 214(8): 2387-2404). En estos casos, la selección de subpoblaciones de macrófagos polarizados M2 puede tener efectos beneficiosos para mejorar la fibrosis sin agotar los monocitos circulantes normales. Basándose en el reconocimiento de que la expresión de LRRC33 está muy restringida a las subpoblaciones de macrófagos asociadas a la enfermedad, el uso de un inhibidor de LRRC33 tal como se contempla en el presente documento proporcionaría beneficios terapéuticos al tiempo que minimizaría los efectos no diana (p. ej., reduciendo las toxicidades). Por el contrario, la depleción sistémica de células mieloides, como los monocitos, o la inhibición amplia de la migración de monocitos a los lugares de lesión tisular pueden causar efectos secundarios no deseados (p. ej., toxicidades).

Cardiomiopatía

[0256]La miocardiopatía, como la miocardiopatía no isquémica (MNIC) resultante de hipertensión de larga duración, valvulopatía y/o mutaciones genéticas, es una causa importante de insuficiencia cardíaca. Observaciones recientes sugieren que los macrófagos derivados de monocitos (p. ej., macrófagos infiltrantes no residentes que son reclutados al lugar de la lesión), en particular, pueden tener un impacto perjudicial sobre la función cardiaca (véase: Liao et al., (2018) "Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy." Proc Nat'l Acad Sci https://doi.ora/10.1073/pnas.1720065115). Las pruebas sugieren que los macrófagos derivados de monocitos y transportados por la sangre que se reclutan en la hipertrofia por sobrecarga de presión en fase tardía son perjudiciales, y que el bloqueo de su infiltración, a diferencia de los macrófagos residentes en el corazón que pueden proporcionar una adaptación miocárdica compensatoria, mejora la angiogénesis miocárdica y preserva la función cardíaca.

[0257]Por lo tanto, se contempla que un inhibidor de LRRC33 puede ser útil para dirigirse a macrófagos activados que son reclutados al tejido cardíaco. El inhibidor de LRRC33 puede bloquear los macrófagos asociados a la enfermedad, mejorando así la angiogénesis miocárdica y preservando la función cardiaca, o de otro modo para prevenir la insuficiencia cardiaca o mejorar los síntomas de la enfermedad cardiaca. Así, la invención incluye el uso de un inhibidor de LRRC33 en un método para el tratamiento de cardiomiopatía en un paciente que comprende administrar una cantidad eficaz del inhibidor de LRRC33 al sujeto para tratar la enfermedad cardiaca.

[0258]La miocardiopatía a tratar con el uso de un inhibidor de LRRC33 incluye, pero no se limita a lo siguiente: Las miocardiopatías primarias/intrínsecas pueden ser genéticas (p. ej.,miocardiopatía hipertrófica; miocardiopatía arritmogénica del ventrículo derecho (MAVD); no compactación del VI; canalopatías iónicas; miocardiopatía dilatada (MCD); miocardiopatía restrictiva (MCR)); adquiridas (por ejemplo,Miocarditis por estrés; Miocarditis, inflamación y lesión del tejido cardíaco debida en parte a su infiltración por linfocitos y monocitos; Miocarditis eosinofílica, inflamación y lesión del tejido cardíaco debida en parte a su infiltración por eosinófilos; Miocardiopatía isquémica (no incluida formalmente en la clasificación como consecuencia directa de otro problema cardíaco)). Las miocardiopatías secundarias/extrínsecas pueden incluir: Metabólicas/de almacenamiento (p. ej.,enfermedad de Fabry; hemocromatosis); Endomiocárdicas (p. ej.,fibrosis endomiocárdica; síndrome hipereosinofílico); Endocrinas (p. ej.,diabetes mellitus; hipertiroidismo; acromegalia); Cardiofaciales (p. ej.,síndrome de Noonan); Neuromusculares (p. ej.,distrofia muscular; ataxia de Friedreich); así como Miocardiopatía asociada a la obesidad.

[0259]En algunas realizaciones, las células diana son Ly6Chi, CX3CR1-positivas, y/o CCR2/CD192-positivas. Ventajosamente, el inhibidor de LRRC33 es capaz de agotar preferentemente los macrófagos activados, derivados de monocitos, asociados a la enfermedad, que son reclutados al tejido lesionado frente a los macrófagos residentes cardíacos que desempeñan una función protectora.

Terapias Combinadas

[0260]La divulgación abarca además composiciones farmacéuticas y métodos relacionados utilizados como terapias combinadas para tratar sujetos que pueden beneficiarse de la inhibición de TGFβin vivo.En cualquiera de estas formas de realización, dichos sujetos pueden recibir terapias combinadas que incluyen una primera composición que comprende al menos un inhibidor de TGFβ, por ej., anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, descrito en el presente documento, junto con una segunda composición que comprende al menos una terapéutica adicional destinada a tratar la misma enfermedad o afección clínica o enfermedades que se solapan. La primera y la segunda composición pueden actuar sobre la misma diana celular o sobre dianas celulares distintas. En algunas formas de realización, la primera y segunda composiciones pueden tratar o aliviar el mismo conjunto o superposición de síntomas o aspectos de una enfermedad o condición clínica. En algunas formas de realización, la primera y segunda composiciones pueden tratar o aliviar un conjunto separado de síntomas o aspectos de una enfermedad o condición clínica. Por poner sólo un ejemplo, la primera composición puede tratar una enfermedad o afección asociada a la señalización de la TGFβ, mientras que la segunda composición puede tratar la inflamación o fibrosis asociada a la misma enfermedad, etc. Estas terapias combinadas pueden administrarse conjuntamente. La frase "junto con", en el contexto de las terapias combinadas, significa que los efectos terapéuticos de una primera terapia se solapan temporal y/o espacialmente con los efectos terapéuticos de una segunda terapia en el sujeto que recibe la terapia combinada. Así, las terapias combinadas pueden formularse como una única formulación para la administración concurrente, o como formulaciones separadas, para la administración secuencial de las terapias.

[0261]El agente adicional añadido a una monoterapia proporciona beneficios clínicos suplementarios, relativos a la monoterapia. En algunas realizaciones, los beneficios clínicos suplementarios son efectos aditivos. En formas de realización preferidas, las terapias combinadas producen efectos sinérgicos en el tratamiento de una enfermedad. El término "sinérgico" se refiere a los efectos que son mayores que los efectos aditivos (porej.,mayor eficacia) de cada monoterapia en conjunto.

[0262]En algunas formas de realización, las terapias combinadas que comprenden una composición farmacéutica descrita en el presente documento producen una eficacia que es globalmente equivalente a la producida por otra terapia (como la monoterapia de un segundo agente), pero se asocian con menos efectos adversos no deseados o toxicidad menos grave asociada con el segundo agente, en comparación con la monoterapia del segundo agente. En algunas formas de realización, dichas terapias combinadas permiten una dosificación más baja del segundo agente pero mantienen la eficacia global. Dichas terapias combinadas pueden ser especialmente adecuadas para poblaciones de pacientes en las que se justifique un tratamiento a largo plazo y/o que incluyan a pacientes pediátricos.

[0263]En consecuencia, la divulgación proporciona composiciones farmacéuticas y métodos para su uso en terapias combinadas para la reducción de la activación de la proteína TGFβ1 y el tratamiento o prevención de enfermedades o afecciones asociadas con la señalización de TGFβ1, como se describe en el presente documento.

[0264]Por consiguiente, los métodos o las composiciones farmacéuticas comprenden además una segunda terapia. En algunas realizaciones, la segunda terapia puede ser útil para tratar o prevenir enfermedades o afecciones asociadas con la señalización de TG Fμl. La segunda terapia puede disminuir o tratar al menos uno o varios síntomas asociados a la enfermedad diana. La primera y la segunda terapias pueden ejercer sus efectos biológicos mediante mecanismos de acción similares o no relacionados; o bien una o ambas terapias pueden ejercer sus efectos biológicos mediante una multiplicidad de mecanismos de acción.

[0265] Debe entenderse que las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden tener la primera y segunda terapias en el mismo portador farmacéuticamente aceptable o en un portador farmacéuticamente aceptable diferente para cada realización descrita. Además, debe entenderse que la primera y la segunda terapias pueden administrarse simultánea o secuencialmente dentro de las realizaciones descritas.

[0266] Uno o más anticuerpos anti-LRRC33, o porciones de unión a antígeno de los mismos, o inhibidores de LRRC33 de la invención pueden usarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Ejemplos de los agentes terapéuticos adicionales que pueden utilizarse con un anticuerpo anti-LRRC33, o inhibidor de LRRC33 de la invención incluyen, pero no se limitan a, un inhibidor de indoleamina 2,3-dioxigenasa, un inhibidor de tirosina quinasa, inhibidor de Ser/Thr quinasa, un inhibidor de quinasa dual específico. En algunas realizaciones, dicho agente puede ser un inhibidor de PI3<k>, un inhibidor de PKC, un inhibidor de MAPK, un inhibidor de quinasa p38, un inhibidor de JAK. En algunas realizaciones, dicho agente puede ser un inhibidor de miostatina, un agonista de VEGF, un agonista de IGFI, un agonista de FXR, un inhibidor de CCR2, un inhibidor de CCR5, un inhibidor dual de CCR2/CCR5, un inhibidor de lisil oxidasa-tipo-2, un inhibidor de ASK1, un inhibidor de Acetil-CoA Carboxilasa (ACC), Pirfenidona, Nintedanib, un inhibidor de GDF11, y similares.

[0267] En algunas formas de realización, el agente adicional es un inhibidor del punto de control. En algunas realizaciones, el agente adicional se une a una molécula de coestimulación de células T, como moléculas de coestimulación inhibitorias y moléculas de coestimulación activadoras. En algunas realizaciones, el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de PD-1, un antagonista de PD-L1, una proteína de fusión de PD-L1 o PD-L2, un antagonista de CTLA4, un agonista de GITR, un anticuerpo anti-ICOS, un anticuerpo anti-ICOSL, un anticuerpo anti-B7H3, un anticuerpo anti-B7H4, un anticuerpo anti-TIM3, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-OX40, un anticuerpo anti-CD27, un anticuerpo anti-CD70, un anticuerpo anti-CD47, un anticuerpo anti-41 BB, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-CD40, un anticuerpo anti-CD38, un anticuerpo anti-KIR, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD137, un anticuerpo anti-CD74, un anticuerpo anti-CD68, un anticuerpo anti-CD20, un virus oncolítico y un inhibidor de PARP. En algunas realizaciones preferidas, el agente adicional es un antagonista de la señalización PD-1, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en un antagonista PD-1, un antagonista PD-L1, una proteína de fusión PD-L1 o PD-L2. En algunas realizaciones preferidas, el agente adicional es un inhibidor de la tirosina quinasa,p. ej.,un inhibidor de Bcr/Abl. En algunas formas de realización, la terapia adicional es radiación. En algunas formas de realización, el agente adicional es un agente quimioterapéutico. En algunas formas de realización, el agente quimioterapéutico es Taxol. En algunas formas de realización, el agente adicional es un agente antiinflamatorio. En algunas formas de realización, el agente adicional inhibe el proceso de reclutamiento de monocitos/macrófagos y/o la infiltración tisular. En algunas formas de realización, el agente adicional es un inhibidor de la activación de las células estrelladas hepáticas. En algunas formas de realización, el agente adicional es un antagonista del receptor de quimioquinas,por ej.,antagonistas CCR2 y antagonistas CCR5. En algunas formas de realización, dicho antagonista del receptor de quimioquinas es un antagonista específico dual, como un antagonista CCR2/CCR5. En algunas formas de realización, el agente adicional que se administrará como terapia combinada es o comprende un miembro de la superfamilia TGFβ de factores de crecimiento o reguladores de los mismos. En algunas formas de realización, dicho agente se selecciona entre moduladores (por ej.,inhibidores y activadores) de GDF8/mioostatina y GDF11. En algunas formas de realización, dicho agente es un inhibidor de la señalización GDF8/mioostatina. En algunas formas de realización, dicho agente es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un complejo de miostatina pro/latente y bloquea la activación de la miostatina. En algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un complejo de miostatina pro/latente y bloquea la activación de la miostatina no se une a la miostatina madura libre. En algunas realizaciones, una terapia adicional comprende la terapia CAR-T.

[0268] En algunas realizaciones, dichas terapias combinadas pueden comprender una vacuna contra el cáncer (es decir,una composición inmunogénica que comprende un antígeno tumoral). Dichas terapias combinadas pueden comprender además un inhibidor del punto de control inmunitario. Se contempla que el inhibidor de LRRC33 según la presente divulgación puede potenciar los efectos anticancerígenos potenciando la inmunidad antitumoral a la vez que facilita el acceso de células efectoras dentro de la EMT.

[0269] Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias o terapias de combinación convencionales que carecen del grado de selectividad/especificidad logrado por la presente invención.

[0270] Esta invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Expresión de LRRC33 en determinados tipos celulares y células cancerosas.

[0271] LRRC33 es una molécula presentadora de TGFβ descrita recientemente, que mantiene el factor de crecimiento TGFβ unido a la superficie celular y retenido en forma latente hasta su activación por integrinas u otras señales extracelulares. Buscamos en varias bases de datos disponibles públicamente, incluyendo HPA, GTex y FANTOM5 y observamos que LRRC33 se expresa a niveles bajos en la mayoría de los tejidos, pero está enriquecida en tejidos asociados con la producción de células mieloides y linfoides (ganglio linfático, bazo, médula ósea). Véase FIG. 1-4.

[0272]También buscamos en los datos disponibles públicamente en la Enciclopedia de Líneas Celulares de Cáncer para buscar la expresión de LRRC33 en líneas celulares asociadas al cáncer. Encontramos una sobreexpresión significativa (q<0,05) de LRRC33 en varias líneas celulares de origen mieloide y linfoide (4-16 veces frente al nivel de expresión medio en todas las líneas celulares de cáncer examinadas). Se trata de líneas asociadas a la leucemia mieloide aguda, el mieloma de células plasmáticas, la leucemia linfoblástica aguda de células T y la leucemia mieloide crónica. Log2(cambio múltiplo) se muestra en negrita para las líneas cuya regulación en positivo es estadísticamente significativa frente a la media de todas las líneas analizadas). Además, observamos que este enriquecimiento en linajes mieloides y linfoides es exclusivo de LRRC33, ya que la expresión de GARP, LTBP1 y LTBP3 está por debajo de la media de todas las líneas analizadas.

[0273]Estos datos sugieren que dirigirse a LRRC33 puede ser un medio de dirigirse a la señalización de TGFβ en cánceres mieloides y linfoides. Dado que estos cánceres son altamente inmunosupresores, una forma de atacarlos podría ser inhibiendo el TGFβ presentado por LRRC33 en estas células, evitando así los efectos globales del TGFβ: Supresión de células T efectoras mediada por TGFβ, inducción de Treg e inmunosupresión por estas células, y perpetuación de la inmunosupresión por macrófagos M2. Alternativamente, LRRC33 podría servir como diana para la destrucción celular mediada por ADCC en tumores linfoides o mieloides a través de mecanismos mediados por Fc u otros.

[0274]Los inhibidores de puntos de control son cada vez más investigados para su uso no sólo en tumores sólidos, sino también en tumores del sistema inmune. Los datos de expresión de la Enciclopedia de Líneas Celulares del Cáncer demuestran que tanto las células leucémicas mieloides como las linfocíticas expresan niveles muy bajos de PD-L1 (CD274), que es utilizado por las células tumorales para unirse a PD-1 en las células T y suprimir una respuesta antitumoral. Esto sugiere que las leucemias pueden responder mal a los tratamientos anti-PD-1 o anti-PD-L1, lo que podría hacer que dirigirse a TGFβ sea un enfoque atractivo.

[0275]Se dispone de varios modelos de ratón singénico de leucemia. Muchos modelos singénicos están disponibles comercialmente, así como los correspondientes datos de expresión, disponibles públicamente a través de bases de datos. En su sitio web, los trabajos publicados muestran las respuestas del crecimiento tumoral a la inhibición de los puntos de control en varios modelos. Nuestros análisis de varias bases de datos y trabajos publicados han revelado tasas de respuesta muy pobres a los tratamientos anti-PD-1 y anti-CTLA4 en varios modelos de leucemia de la base de datos. El análisis de los datos de RNAseq del único modelo de leucemia que se perfiló (L1210) para la expresión de las moléculas presentadoras de TGFb confirma nuestros hallazgos en las bases de datos de líneas celulares y enfermedades humanas. De todos los modelos tumorales perfilados, las células L1210 expresan los niveles más altos de LRRC33 y niveles claramente bajos de GARP, LTBP1 y LTBP3. Al igual que las líneas celulares humanas, las células L1210 expresan predominantemente la isoforma TGFb1. Estos datos sugieren que el modelo de ratón L1210 se correlaciona bien con el perfil de expresión encontrado en líneas celulares humanas y muestras de pacientes con AML.

Ejemplo 2: Un subconjunto de macrófagos polarizados expresa selectivamente LRRC33.

[0276]Se describió previamente que la señalización de TGFβ está implicada en la maduración y diferenciación de y eventuales fenotipos de macrófagos (ver FIG.6). Se ha sugerido que los macrófagos derivados de monocitos (como los macrófagos intersticiales del parénquima pulmonar) expresan LRRC33. Otros estudios de macrófagos polarizados han revelado que no todos los macrófagos polarizados expresan LRRC33. Encontramos que los llamados macrófagos clásicos de tipo M1 muestran una baja expresión de LRRC33, mientras que los macrófagos M2 mostraron una elevada expresión de LRRC33. Inesperadamente, entre los subtipos de macrófagos M2, observamos expresión de LRRC33 sólo en M2c y M2d, macrófagos de tipo TAM. Los primeros son los llamados macrófagos "profibróticos" y los segundos son los "de tipo TAM" o que imitan el fenotipo asociado a los tumores. Estos resultados muestran que la expresión de LRRC33 está restringida a un subconjunto selectivo de macrófagos polarizados.

[0277]La evidencia sugiere que las células tumorales y/o las células estromales tumorales circundantes secretan una serie de citoquinas, factores de crecimiento y quimioquinas, que pueden influir en los fenotipos (p. ej.,activación, diferenciación) de varias células en la TME. Por ejemplo, el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF o CSF-1) es un conocido factor derivado de tumores, que puede regular el fenotipo de la enfermedad, como la activación de TAM.

[0278]Se realizaron análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para examinar los efectos de una exposición a M-CSF sobre la expresión de LRRC33 en macrófagos. Brevemente, se recogieron PBMC humanas de donantes sanos. Las células primarias se cultivaron durante una semana, en un medio que contenía un 10% de suero humano, más GM-CSF o M-CSF. Para inducir varios fenotipos de macrófagos M2, las células se cultivaron durante 2-3 días adicionales en presencia de IL-10 y TGFβ para el subtipo M2c, e IL-6 para el subtipo M2d. En los análisis FACS se utilizaron anticuerpos contra los marcadores de la superficie celular indicados en la figura. La selección inmunomagnética CD14+ indica monocitos.

[0279] Sorprendentemente, los resultados mostraron que la regulación en positivo de la superficie celular LRRC33 en macrófagos fue significativamente elevada tras la exposición a M-CSF (también conocido como CSF-1). La FIG.11A muestra que los macrófagos tratados con M-CSF son uniformemente macrófagos polarizados M2. Además, la exposición al M-CSF hace que los macrófagos expresen uniformemente LRRC33 en la superficie celular (véase FIG.11B). Como se resume en la FIG.11C, se observó una expresión robusta de LRRC33 en la superficie celular de los macrófagos activados por M-CSF.

[0280] Basándose en estos datos, se calculó la densidad de la superficie celular de LRRC33. Como se muestra en la FIG.12, LRRC33 es un marcador específico de macrófagos humanos derivados de monocitos madurados con M-CSF. Por término medio, hay 163.731 moléculas superficiales de LRRC33 por célula en la superficie de estos macrófagos. Descubrimos que otros marcadores mieloides que son objetivos terapéuticos actuales muestran una densidad de superficie celular similar, pero no marcan específicamente una subpoblación de macrófagos promotores de tumores por encima de otras subpoblaciones de macrófagos. Los macrófagos "M1" sesgados GM-CSF IFNy en rojo y los macrófagos sesgados MCSF en verde muestran una expresión superficial similar para CD33 sobre el control de isotipo en gris(centro), mientras que los macrófagos M1 y M-CSF muestran niveles similares de CD115 oCSF1R(derecha).Estos resultados apoyan la noción de que dirigiéndose a LRRC33 es posible atacar de forma más selectiva las células asociadas a la enfermedad sin afectar a otras células.

[0281] Para confirmar aún más la expresión selectiva de la superficie celular de LRRC33 en subconjuntos de tipos celulares, se procesó sangre total de 5 donantes para citometría de flujo y se tiñó para CD33 y LRRC33 usando c D14 para denotar monocitos y CD10 para denotar neutrófilos. Las células B también se analizaron utilizando CD19. Como se muestra en la FIG.13, los Monocitos y Neutrófilos Humanos muestran poca o ninguna expresión superficial de LRRC33 directamente ex vivo en contraste con CD33.

[0282] La terapia actualmente disponible para la AML (p. ej.,anti-CD33) está asociada con toxicidades potencialmente peligrosas. Para confirmar la noción de que el inhibidor de LRRC33 proporciona un enfoque ventajoso que permite un mayor nivel de selectividad entre tipos celulares (subpoblaciones de células), se realizaron análisis de ARN. Los datos de Bloodspot muestran que el ARN de LRRC33 se expresa de forma elevada y uniforme en diversos tipos de AML y en niveles más bajos en poblaciones de precursores hematopoyéticos. La expresión media de CD33 en varios subtipos de AML es similar a la de LRRC33, sin embargo la expresión es más variable (FIG.14).

Ejemplo 3: Las Tregs suprimen la proliferación de Teffector.

[0283] Llevamos a cabo un ensayo de supresión de Treg humanas para evaluar la función Treg dependiente de TGFβ in vitro. Se establecieron condiciones de ensayo para evaluar de forma fiable las actividades Treg dependientes de TGFβ. Como se muestra en la FIG.7, la proliferación de células efectoras T se suprime mediante la adición de TGFβ o de Tregs que expresan GARP. Este efecto puede revertirse mediante la adición de nuestro anticuerpo inhibidor que inhibe la activación de TGFβ asociada a GARP. El protocolo general del ensayo se muestra en la FIG.8.

Ejemplo 4: Regulación en positivo de GARPILAP en Tregs activadas.

[0284] Se activaron células T CD4+ humanas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para inducir el fenotipo Treg caracterizado por los marcadores de superficie celular CD25+/Foxp3+/CD4+ y se sometieron a análisis de citometría de flujo. Como se muestra en la FIG.9, tras la activación de las células T, la expresión de GARP y LAP aumenta.

Ejemplo 5: Modelo metastásico 4T1.

[0285] Se utilizó el modelo metastásico de células 4T1 para explorar la inhibición de TGFβ1 in vivo. Este modelo ofrece una biología bien caracterizada dependiente de TGFβ y Treg. Una semana después de una inyección IV de 25.000 células 4T1 en los ratones, medimos la carga metastásica pulmonar. Observamos niveles significativos de Tregs y macrófagos en los pulmones de ratón del modelo de metástasis 4T1.

Ejemplo 6: Ensayo de internalización.

[0286] La FIG.15 muestra los resultados de un estudio de internalización. Las células THP1 se estimularon durante la noche con PMA para inducir la expresión superficial de LRRC33 y su adherencia al plástico de cultivo tisular. Al día siguiente, las células se tiñeron con anticuerpos a 10ug/ml durante 1 hora. Un subconjunto de células se lavó y pasó a un medio de cultivo celular y a 37 °C durante 1 o 2 horas, mientras que otro subconjunto (tiempo 0) se fijó inmediatamente. Otro subconjunto de células se lavó y se mantuvo a 4°C. La internalización se detectó utilizando anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos contra los isotipos de los anticuerpos primarios. Gemtuzumab y SRL1, un anticuerpo de ratón específico humano contra LRRC33, se internalizan de forma similar.

[0287] En un experimento separado, un segundo anticuerpo LRRC33, CL1, fue probado en un ensayo de internalización esencialmente como se describió anteriormente, y se obtuvieron resultados similares (datos ahora mostrados).

Ejemplo 7: Generación de aglutinantes LRRC33.

[0288]Los aglutinantes LRRC33 se produjeron utilizando los siguientes métodos.

Generación de clones de hibridoma

[0289]Las proteínas recombinantes y/o complejos proteicos proporcionados a continuación fueron expresados en células Expi293F (disponibles en Thermo) y purificados para ser utilizados como antígenos. Se transfectaron tanto la molécula presentadora (p. ej.,LRRC33) como proTGFβ (que contiene el subdominio y el dominio del factor de crecimiento) para una expresión óptima. En algunos casos, la construcción proteínica contenía una marcación His con fines de purificación.

[0290]La siguiente tabla enumera proteínas o complejos proteicos expresados recombinantemente que se utilizaron para inmunización y/o cribado posterior (por ejemplo,selección positiva o selección negativa).

[0291]Una cohorte de cinco ratones BALB/cJ de ocho semanas de edad (Jackson Laboratory) fueron dosificados subcutáneamente con LRRC33 covalentemente complejado con TGFβ1 y su prodominio. Los ratones fueron inmunizados ocho veces con LRRC33-proTGFβ1 humano y dos veces con LRRC33-proTGFβ1 de ratón a lo largo de seis semanas (10 μg por dosis). El inmunógeno descrito se emulsionó en adyuvante completo de Freund (CFA), para la primera inmunización, y en adyuvante incompleto de Freund (IFA; Sigma) para los refuerzos sucesivos. Se sangraron los ratones los días 15 y 33, y se analizaron los títulos séricos para determinar la unión específica a LRRC33. Cuatro días después del último refuerzo, se practicó la eutanasia a dos ratones y se prepararon esplenocitos para la fusión.

[0292]Se fusionaron esplenocitos agrupados con la línea celular de mieloma Sp2/0-Ag14 (ATCC®) en una proporción de 1:1 utilizando un protocolo de fusión estándar. Las células recién fusionadas se sembraron en 102 placas de 96 pocillos que contenían medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) con 10% de suero de ternera bovina, 10.000 unidades/ml de pencilina, 10.000 μg/ml de estreptomicina, 3,5% de suplemento de clonación de hibridomas (Sigma), 100 μM de hipoxantina, 0,4 μM de aminopterina y 16 μM de timidina. El medio se sustituyó el séptimo día utilizando la misma formulación de medio descrita anteriormente sin aminopterina.

Cribado de clones de hibridoma mediante ELISA

[0293]En los días 13 y 14, se recogieron sobrenadantes de hibridoma y se analizaron para especificidad LRRC33 por ELISA. Brevemente, se recubrieron placas de 384 pocillos con 20 μl de antígeno recombinante en tampón fosfato salino (PBS) a 1 μg/ml durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado (PBS con 0,05% de Tween 20) y se bloquearon con 80 μl de tampón de bloqueo (PBS con 1% de albúmina sérica bovina y 0,05% de Tween 20). Tras una hora de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces y se transfirieron 20 μl de sobrenadante de hibridoma a cada pocillo. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente, se lavaron con tampón tres veces y se añadieron 20 μl de IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante diluida a 1:5.000. Tras esta incubación final de una hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces y se añadieron 20 μl de sustrato TMB One Component (Surmodics) por pocillo. Tras diez minutos de incubación a temperatura ambiente, se detuvo la reacción pipeteando 20 μl de ácido sulfúrico 0,18 M en cada pocillo. La absorbancia se analizó a 450 nm utilizando un lector de placas EnVision (Perkin Elmer).

Cribado de clones de hibridoma mediante citometría de flujo

[0294]Se analizaron sobrenadantes de hibridoma seleccionados para determinar la unión a LRRC33 expresado en la superficie celular mediante citometría de flujo. Brevemente, las células THP1 en RPMI-1640 y las células P388D1 en DMEM con un 10% de suero bovino fetal y pencilina/estreptomicina se estimularon durante la noche en un 5% deoo2 a 37°C con 100 nM de acetato de miristato de forbal (PMA). Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 100.000 células/pocillo. Tras la incubación de una noche, las células se lavaron tres veces con tampón FACS (PBS con 1% de BSA y 0,1% de azida sódica) y se resuspendieron en 50 μl de tampón de bloqueo de receptores Fc (TrueStain FcX; BioLegend) a 10 μg/ml durante 10 minutos en hielo. Sin retirar el tampón de bloqueo, se transfirieron aproximadamente 35 μl de sobrenadante de hibridoma a cada pocillo y se incubaron en hielo durante una hora. Las células se lavaron tres veces con tampón FACS y se fijaron con paraformaldehído al 1,5% en PBS refrigerado durante 30 minutos. Las muestras se lavaron tres veces con tampón FACS y, tras el tercer lavado, se colocó en cada pocillo 1ug/mL de IgG de cabra anti-ratón FC-Alexa647 en tampón FACS durante 1 hora en hielo. Tras una última serie de lavados, se añadieron 200 μl de tampón FACS a cada pocillo y se extrajeron manualmente las células del fondo de los pocillos. Las muestras se transfirieron a una placa de 96 pocillos con fondo en U, se adquirieron en el citómetro de flujo Attune NxT (Life Technologies) y se analizaron con el software FlowJo (BD).

[0295]Las diversas características y realizaciones de la presente invención, a las que se hace referencia en las secciones individuales anteriores se aplican, según proceda, a otras secciones, mutatis mutandis. Por consiguiente, las características especificadas en una sección pueden combinarse con las especificadas en otras secciones, según proceda.

[0296]Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar mediante experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención aquí descritas. Dichos equivalentes están comprendidos en las reivindicaciones siguientes.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de LRRC33 para su uso en:

(a) tratamiento de un trastorno proliferativo hematológico, un tumor sólido y/o fibrosis en un sujeto; y/o (b) un método de tratamiento de un sujeto mediante el agotamiento de las células que expresan LRRC33 en la superficie celular en el sujeto, comprendiendo el método una etapa de administración al sujeto del inhibidor de LRRC33 en una cantidad eficaz para reducir el número de células que expresan LRRC33 en la superficie celular, en la que el sujeto padece una enfermedad asociada con la sobreexpresión de LRRC33 y/o activación anormal de macrófagos, y en la que la enfermedad es una fibrosis, miopatía o tumor; y/o

(c) un método terapéutico, que comprende revertir un entorno inmunosupresor de la enfermedad, con el fin de reforzar la inmunidad de un sujeto

en el que el inhibidor es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a un epítopo presente en la porción extracelular de LRRC33 o complejo que contiene LRRC33 presente en la superficie celular,

y en el que el anticuerpo induce la internalización de LRRC33 de la superficie celular o del complejo que contiene LRRC33.

2. El inhibidor de LRRC33 para uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de LRRC33 J comprende además un agente citotóxico.

3. El inhibidor de LRRC33 para uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el sujeto tiene un trastorno proliferativo hematológico seleccionado entre leucemia, linfoma, mielofibrosis y mieloma múltiple.

4. El inhibidor de LRRC33 para uso según la reivindicación 3, en el que el trastorno proliferativo hematológico es una leucemia, en el que opcionalmente la leucemia es leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL) o leucemia mieloide crónica (CML).

5. El inhibidor de LRRC33 para uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el inhibidor de LRRC33 es para uso en el tratamiento de un tumor sólido, opcionalmente en el que el tumor sólido está enriquecido con macrófagos asociados a tumores (TAM).

6. El inhibidor de LRRC33 para uso según la reivindicación 5, en el que el tumor sólido está enriquecido con macrófagos M2c y/o de tipo<t>A<m>(M2d).

7. El inhibidor de LRRC33 para uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el inhibidor de LRRC33 es para uso en tratamiento de fibrosis, en el que la fibrosis comprende un tejido fibrótico enriquecido con macrófagos derivados de monocitos, en el que opcionalmente la fibrosis es fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis hepática, fibrosis cardiaca, fibrosis de médula ósea, fibrosis uterina y/o fibrosis cutánea.

8. El inhibidor de LRRC33 para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el inhibidor de LRRC33 agota las células que expresan LRRC33 de superficie celular, en el que las células que expresan LRRC33 de superficie celular son: TAM, TAN, MDSC, CAF, células leucémicas, células madre hematopoyéticas, células progenitoras mieloides, células progenitoras linfoides, células progenitoras megacariocito-eritroides, megacariocitos, monocitos, células B, células<n>K, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y/o macrófagos.

9. El inhibidor de LRRC33 para uso según la reivindicación 8, en el que las células que expresan LRRC33 en la superficie celular son MDSC, y en el que las MDSC están presentes en el microambiente tumoral.

10. El inhibidor de LRRC33 para uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el tratamiento revierte un entorno de enfermedad inmunosupresora en el sujeto, opcionalmente en el que el entorno de enfermedad es un EMT o tejido fibrótico.

11. El inhibidor de LRRC33 para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, u 8, en el que el inhibidor es para uso en un método para tratar una leucemia en un sujeto, en el que la administración del inhibidor de LRRC33 a una dosis eficaz causa menos toxicidades en comparación con una terapia CD33, en el que opcionalmente las toxicidades incluyen: hepatotoxicidad, reacciones relacionadas con la infusión, hemorragia, prolongación del intervalo QT, infección, anemia, toxicidad embriofetal, y/o muerte.

12. El inhibidor de LRRC33 para uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el inhibidor de LRRC33 potencia la inmunidad del huésped contra el cáncer en el sujeto, en el que el sujeto se trata con una terapia contra el cáncer, en el que opcionalmente, la terapia contra el cáncer es una terapia CAR-T, una terapia inhibidora de puntos de control, una quimioterapia o una radioterapia.

13. El inhibidor de LRRC33 para uso según la reivindicación 12, en el que la inmunidad del huésped se potencia reduciendo la inmunosupresión.

14. El inhibidor de LRRC33 para uso según la reivindicación 12 o 13, en el que el uso del inhibidor de LRRC33 hace que el cáncer responda mejor a la terapia contra el cáncer.

15. El inhibidor de LRRC33 para uso según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que el sujeto recibe una cantidad reducida de la terapia contra el cáncer en comparación con una monoterapia para lograr el mismo beneficio/eficacia terapéutica o equivalente.

16. El inhibidor de LRRC33 para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la LRRC33 está asociada con un complejo TGFβ latente, en el que opcionalmente el complejo TGFβ latente es un complejo TGFβ1 latente.

17. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une a LRRC33 humana o a un complejo que comprende LRRC33 humana en una superficie celular, en la que el anticuerpo comprende un agente citotóxico, y en la que el anticuerpo no se une a GARP humano.