CN110312736B

CN110312736B - Pd-l1结合多肽或化合物

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Publication number: CN110312736B
Application number: CN201880008010.6A
Authority: CN
Inventors: 徐霆; 周爱武; 金宇灏; 王玲; 吴杰; 胡红琴; 汪皛皛
Original assignee: Suzhou Alphamab Co Ltd
Current assignee: Suzhou Alphamab Co Ltd
Priority date: 2017-01-23
Filing date: 2018-01-23
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2038-01-23
Also published as: JP2020506908A; US20190352404A1; EP3572429A1; JP7252526B2; EP3572429A4; US11377497B2; CN110312736A; EP3572429A9; WO2018133873A1

Abstract

提供了PD‑L1阻断型重链单域抗体KN035与PD‑L1结合的复合物的晶体结构及其用途。还提供了基于所述晶体结构开发的新型PD‑L1结合多肽或化合物及其用途。

Description

PD-L1结合多肽或化合物

技术领域

本发明涉及医药生物领域，公开了PD-L1阻断型重链单域抗体KN035与PD-L1结合的复合物的高分辨率晶体结构，以及所述晶体结构的用途。本发明还涉及基于所述晶体结构开发的新型PD-L1结合多肽或化合物及其用途。

背景技术

程序性死亡-1(PD-1)是CD28受体家族的成员，该家族包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。该家族的最初成员CD28和ICOS通过添加单克隆抗体后增强T细胞增殖的功能而发现(Hutloff等(1999)，Nature 397:263-266；Hansen等(1980)，Immunogenics 10:247-260)。已经鉴定了PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体，PD-L1和PD-L2，已经表明它们在与PD-1结合后下调T细胞活化和细胞因子分泌(Freeman等(2000)，J Exp Med 192:1027-34；Latchman等(2001)，Nat Immunol 2:261-8；Cater等(2002)，Eur J Immunol 32:634-43；Ohigashi等(2005)，Clin Cancer Res 11:2947-53)。PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)都是可与PD-1结合但是不与其他CD28家族成员结合的B7同源物(Blank等2004)。也已经显示通过IFN-γ刺激上调细胞表面上PD-L1的表达。

PD-L1的表达已经在几种鼠和人类癌症中发现，包括人肺癌、卵巢癌、结肠癌、黑色素瘤和各种骨髓瘤(Iwai等(2002)，PNAS 99:12293-7；Ohigashi等(2005)，Clin CancerRes 11:2947-53)。已有的结果显示，肿瘤细胞高表达的PD-L1通过增加T细胞的凋亡从而在肿瘤的免疫逃逸中起着重要的作用。研究者发现，转染PD-L1基因的P815肿瘤细胞系在体外可抵制特异性CTL的裂解，将其接种小鼠体内后具有更强的致瘤性和侵袭性。这些生物学特性均可通过阻断PD-L1而逆转。敲除PD-1基因的小鼠，阻断PD-L1/PD-1通路，则接种肿瘤细胞不能形成肿瘤(Dong等(2002)，Nat Med 8:793-800)。也已经提示PD-L1可能与肠粘膜炎症有关，并且PD-L1的抑制防止了与结肠炎有关的萎缩病(Kanai等(2003)，J Immunol 171:4156-63)。

最近，使用抗体阻断PD1/PD-L1相互作用的免疫疗法已经在临床上获得惊人的疗效，显示出持续的肿瘤抑制以及改善的患者生存时间。至少有两种PD1抗体(Optivo和Kytruda)已经获批，若干种PD-L1抗体进入后期临床研发。然而，关于这些抗体如何结合并阻断PD1/PD-L1相互作用的结构信息十分有限，阻碍了该疗法的进一步发展。

发明内容

本发明提供一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述多肽能够特异性结合PD-L1并阻断PD-L1和PD1的相互作用。在一些实施方案中，所述多肽不包含SEQ ID NO:1的抗体的CDR1和/或CDR2的氨基酸序列。SEQ ID NO:1的抗体的CDR1氨基酸序列根据不同的定义方式可以选自SEQ ID NO:2、8或24。SEQ ID NO:1的抗体的CDR2氨基酸序列根据不同的定义方式可以选自SEQ ID NO:3、13或25。

在一些实施方案中，所述多肽由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1的抗体的CDR3)组成。

如本发明所用，“PD-L1”或“hPD-L1”指的是人PD-L1。在一些实施方案中，其具有SEQ ID NO:7的序列。

本发明提供一种产生PD-L1结合多肽的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:1的抗体的CDR1和/或CDR2替换为识别另外的靶的抗体的CDR和/或结合另外的靶的多肽，从而产生结合PD-L1和所述另外的靶的多肽。其中所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、8或24所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、13或25所示。

如本发明所用，术语“另外的靶”指的是除PD-L1之外的靶，包括但不限于VEGFR、ERBB家族蛋白、CMET等肿瘤抗原，或者CTLA4等免疫检查点相关抗原。

本发明还提供一种PD-L1结合多肽，其是SEQ ID NO:1的抗体的变体，并且其对应于SEQ ID NO:1的抗体的CDR1和/或CDR2的氨基酸序列被识别另外的靶的抗体的CDR和/或结合另外的靶的多肽替换，所述PD-L1结合多肽能够结合PD-L1和所述另外的靶。其中所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、8或24所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、13或25所示。SEQ ID NO:1的抗体的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供一种产生PD-L1结合多肽的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:1的抗体的CDR3嫁接至识别另外的靶的抗体上，从而产生结合PD-L1和所述另外的靶的多肽。其中所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本领域已知许多识别另外的靶，例如VEGFR、CMET或CTLA4等的抗体。

本发明还提供一种产生PD-L1结合多肽的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:1的抗体的CDR3嫁接至具有CDR环样结构的非免疫球蛋白上，从而使得所述非免疫球蛋白能够结合PD-L1。其中所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。所述“非免疫球蛋白”例如具有三个环结构的CTLA4蛋白、fibronectin type III结构域等。在一些实施方案中，所述“非免疫球蛋白”的CDR环样结构被SEQ ID NO:1的抗体的CDR3所替换。

本发明还提供一种产生PD-L1结合多肽的方法，所述方法包括对由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的多肽(对应于SEQ ID NO:1的抗体的CDR3)进行化学修饰，从而使其形成稳定的螺旋结构。例如，可以通过化学修饰的方法使所述多肽形成类似实施例中SEQID NO:1的抗体结合PDL1时其CDR3显示的稳定的螺旋结构。例如，可以通过化学偶联TBMB使所述多肽形成螺旋结构。

本发明还提供一种PD-L1结合多肽，其由本发明上述的方法产生。在一些实施方式中，本发明的PD-L1结合多肽包含SEQ ID NO:10、12、15-18、20、23之一的氨基酸序列。

本发明还提供一种PD-L1结合多肽，其与PD-L1的氨基酸残基I54、Y56、E58、Q66和R113中的一或多个相互作用(结合)。在一些实施方案中，所述结合多肽进一步与PD-L1的氨基酸残基D61、N63、V68、M115、S117、Y123和R125中的一或多个相互作用(结合)。在一实施方式中，所述PD-L1结合多肽不包含SEQ ID NO:2、8或24，和/或SEQ ID NO:3、13或25，和/或SEQ ID NO:4。在一实施方式中，所述PD-L1结合多肽不包含SEQ ID NO:1。

本发明还提供一种晶体复合物，其包括抗PD-L1单域抗体和PD-L1的N端免疫球蛋白可变(IgV)结构域，所述抗PD-L1单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述PD-L1的N端免疫球蛋白可变(IgV)结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。在一些实施方案中，所述晶体复合物属于空间群P61，且晶胞大小为

且α＝β＝90°，γ＝120°。

本发明还提供PD-L1的晶体，其属于空间群C2221，且晶胞大小为

且α＝β＝γ＝90°。

本发明还提供本发明上述晶体复合物的晶体结构的原子坐标集合或其子集。在一些实施方案中，其是附录I中提供的原子坐标集合或其子集。

本发明还提供一种在其上记录有数据的计算机可读介质，所述数据代表本发明上述晶体复合物的晶体结构的原子坐标或其子集；或者附录I中提供的原子坐标或其子集；和/或使用所述原子坐标产生的模型。

本发明提供一种鉴定与PD-L1结合的化合物的计算机辅助方法，所述方法包括下述步骤：

i)将候选化合物的结构与通过本发明的晶体结构的原子坐标或其子集，或者附录I中提供的原子坐标或其子集限定的结构对接，和

ii)鉴定可以与PD-L1结合的候选化合物。

在一些实施方案中，所述原子坐标子集是对应于PD-L1的N端免疫球蛋白可变(IgV)结构域的原子坐标。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括合成或获得所鉴定的候选化合物，并且测定所述化合物是否与PD-L1结合。优选地，所述化合物阻断PD-L1与PD1的结合。

本发明提供一种产生与PD-L1结合的化合物的方法，包括设计结合由PD-L1的氨基酸残基I54、Y56、E58、Q66和R113限定的界面至少一部分的化合物分子，合成所述化合物分子，并且测定所述化合物是否与PD-L1结合。在一些实施方案中，所述方法包括设计结合由PD-L1的氨基酸残基I54、Y56、E58、Q66、R113、D61、N63、V68、M115、S117、Y123和R125限定的界面至少一部分的化合物分子，合成所述化合物分子，并且测定所述化合物是否与PD-L1结合。优选地，所述化合物阻断PD-L1与PD1的结合。

本发明提供一种抗PD-L1抗体，其结合PD-L1上由氨基酸残基I54、Y56、E58、Q66和R113限定的构象表位。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体结合PD-L1上由氨基酸残基I54、Y56、E58、Q66、R113、D61、N63、V68、M115、S117、Y123和R125限定的构象表位。

核酸、载体、宿主细胞

在另一方面中，本发明涉及编码本发明的PD-L1结合多肽的核酸分子。本发明的核酸可为RNA、DNA或cDNA。根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸是基本上分离的核酸。

本发明的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒或YAC。载体可尤其为表达载体，即可提供PD-L1结合多肽体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本发明的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合的表达调控元件(例如启动子、增强子、终止子等)。针对在特定宿主中的表达对所述元件及其序列进行选择为本领域技术人员的常识。对本发明的PD-L1结合多肽的表达有用或必需的调控元件及其他元件的具体实例，例如启动子、增强子、终止子、整合因子、选择标记物、前导序列、报告基因。

本发明的核酸可基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息通过已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。

在另一方面中，本发明涉及表达或能够表达一种或多种本发明的PD-L1结合多肽和/或含有本发明的核酸或载体的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。

适合的细菌细胞包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。

适合的真菌细胞包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞；或者包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。

适合的哺乳动物细胞包括例如HEK293细胞、CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞等。

然而，本发明也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。

本发明还提供制备本发明的PD-L1结合多肽的方法，所述方法通常包含以下步骤：

-在允许表达本发明的PD-L1结合多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；及

-从培养物回收由所述宿主细胞表达的PD-L1结合多肽；及

-任选进一步纯化和/或修饰本发明的PD-L1结合多肽。

在一个优选的实施方案中，本发明的PD-L1结合多肽使用哺乳动物细胞产生。

本发明的PD-L1结合多肽可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞质中、在周质中或在包涵体中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。

用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本发明的PD-L1结合多肽的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。

然而，本发明的PD-L1结合多肽也可以通过本领域已知的其它产生蛋白质的方法获得，例如化学合成，包括固相或液相合成。

免疫缀合物

另一方面，本发明涉及与诸如细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白质等治疗性部分缀合的PD-L1结合多肽。这些缀合物在此被称为“免疫缀合物”。包括一个或多个细胞毒素的免疫缀合物被称作“免疫毒素”。细胞毒素包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。

可用于缀合的治疗剂还包括，例如：抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)，烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，氨茴霉素类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。

能与本发明的PD-L1结合多肽缀合的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、阿里他汀、和它们的衍生物。

可以利用本领域使用的接头技术将细胞毒素与本发明的PD-L1结合多肽缀合。已经用于将细胞毒素与PD-L1结合多肽缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择，例如，在溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的接头，该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。

关于细胞毒素的类型、用于缀合治疗剂与抗体的接头和方法的进一步讨论，参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53：247-264。

本发明的PD-L1结合多肽也可以与放射性同位素缀合，产生细胞毒性放射性药物，也被称作放射性免疫缀合物。能够与诊断或治疗性使用的抗体缀合的放射性同位素的例子包括但不限于碘¹³¹、铟¹¹¹、钇⁹⁰和镥¹⁷⁷。制备放射性免疫缀合物的方法在本领域中已经建立。放射性免疫缀合物的例子可以作为商品获得，包括ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，并且能够利用类似的方法使用本发明的PD-L1结合多肽制备放射性免疫缀合物。

本发明的PD-L1结合多肽也可以与具有需要的生物活性的蛋白质缀合，可用于修饰特定的生物学反应。这样的生物活性蛋白质包括，例如：具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应调节物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、白介素-10(“IL-10”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他免疫因子如IFN等。

将这种治疗性部分与抗体分子缀合的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，Controlled DrugDelivery(2nd Ed.)，Robinson等(ed.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，MonoclonalAntibodies’84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等(ed.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates，”Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。

药物组合物

另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体配制在一起的一种或组合的本发明的PD-L1结合多肽和/或与PD-L1结合的化合物和/或抗PD-L1抗体。这样的组合物可以包含一种或组合的(例如两种或多种不同的)本发明的PD-L1结合多肽或免疫缀合物。例如，本发明的药物组合物可以含有结合靶抗原上的不同表位的抗体分子组合。

本发明的药物组合物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，联合治疗可包括本发明的PD-L1结合多肽或化合物联合至少一种其他的抗肿瘤药物。例如，本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体可以与靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体联合使用。所述靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体包括但不限于，抗EGFR抗体、抗EGFR变体的抗体、抗VEGFa抗体、抗HER2抗体、或抗CMET抗体。优选所述抗体是单克隆抗体。

本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体分子、免疫缀合物包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。

本发明的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保持了亲代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理学作用的盐(参见如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些由诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等无毒性无机酸衍生的盐，以及由诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等无毒性有机酸衍生的盐。碱加成盐包括那些由诸如钠、钾、镁、钙等碱土金属衍生的盐，以及由诸如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒性有机胺衍生的盐。

本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。

可以通过灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合物中。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。

治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。

通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。

可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。

可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一推注，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的对象的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。

对于本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重，10mg/kg体重或20mg/kg体重，或在1-20mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。

或者，本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据分子在患者中的半衰期而不同。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。

本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体的“治疗有效量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于PD-L1相关肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的对象，“治疗有效量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的治疗性化合物能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。

本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明PD-L1结合多肽或化合物或抗体的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

或者，本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。

活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sustainedand controlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利No.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利No.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统：和美国专利No.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利引入本文作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。

在某些实施方案中，本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体可配制为确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个靶向部分，从而增强靶向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。靶向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

疾病预防和治疗

在另一方面，本发明提供了本发明所述PD-L1结合多肽或化合物或抗体、核酸分子、宿主细胞、免疫缀合物及药物组合物在预防和/或治疗与PD-L1相关的疾病中用途和方法。可用本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体预防和/或治疗的PD-L1相关的疾病如下详述。

癌症

本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体对PD-L1的阻断可以增强患者中对癌细胞的免疫应答。PD-L1富含于多种人类癌中(Dong等(2002)Nat Med.8:78 7-9)。PD-1与PD-L1的相互作用导致浸润肿瘤的淋巴细胞减少，T细胞受体介导的增殖减少，以及癌细胞的免疫逃逸(Dong等(2003)J Mol Med 81:281-7；Blank等(2004)Cancer Immunol Immunother[epub]；Konishi等(2004)Clin Cancer Res 10:5094-5100)。抑制PD-L1与PD-1的局部相互作用可以逆转免疫抑制，当PD-L2与PD-1的相互作用也被阻断时，效应是协同的(Iwai等(2002)PNAS 99：12293-7；Brown等(2003)J Immunol 170：1 257-66)。本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体可以单独使用，以抑制癌性肿瘤的生长。或者如以下所述，本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体可以与其它抗肿瘤治疗手段联合使用，例如与其他免疫原性剂、标准癌症疗法或其他抗体分子联合使用。

因此，在一个实施方案中，本发明提供一种预防和/或治疗癌症的方法，包括给该对象施用治疗有效量的本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体，抑制对象中的肿瘤细胞生长。

使用本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体可以预防和/或治疗的优选的癌症包括一般对免疫治疗有应答的癌症。可治疗的优选癌症的非限制性的例子包括肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤(例如转移的恶性黑色素瘤)、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤。可以用本发明的方法治疗的其他癌症的例子包括：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。本发明也可用于治疗转移性癌，特别是表达PD-L1的转移性癌(Iwai等(2005)Int Immunol 17：133-144)。

任选地，本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体可以与免疫原性剂如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞联用(He等(2004)J.Immunol 173：4919-28)。可以应用的免疫原性剂的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，如gp100的肽、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶，或转染后表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。

在人类中，已经表明一些肿瘤是具有免疫原性的，如黑素瘤。预期通过使用本发明的PD-L1结合多肽阻断PD-L1来促进T细胞活化，可以激活宿主中的肿瘤应答。当与肿瘤接种方案联合时，PD-L1阻断剂(如抗PD-L1抗体，例如本发明的PD-L1结合多肽)可能最有效。已经设计了针对肿瘤接种的许多实验策略(参见Rosenberg，S.，2000，Development ofCancer Vaccines，ASCO Educational Book Spring：60-62；Logothetis，C，2000，ASCOEducational Book Spring：300-302；Khayat，D.2000，ASCO Educational Book Spring：414-428；Foon，K.2000，ASCO Educational Book Spring：730-738；参见Restifo，N.和Sznol，M.，Cancer Vaccines，Ch.61，pp.3023-3043，DeVita，V.等(eds.)，1997，Cancer：Principles and Practice of Oncology.第五版)。在这些策略之一中，使用自体或异体肿瘤细胞制备疫苗。已经证明，当肿瘤细胞被转导而表达GM-CSF时，这些细胞疫苗最有效。已经表明GM-CSF是用于肿瘤接种的抗原呈递的强激活剂(Dranoff等(1993)ProaNatl.Acad.Sci U.S.A.90：3539-43)。

各种肿瘤中基因表达和大规模基因表达模式的研究鉴定出许多所谓的肿瘤特异性抗原(Rosenberg，SA(1999)Immunity 10：281-7)。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和产生肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，证明这些抗原中的许多是在宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体可以与重组产生的肿瘤特异性蛋白和/或肽组合使用，以产生针对这些蛋白质的免疫应答。这些蛋白质在正常情况下被免疫系统看作自身抗原，因此对其耐受。肿瘤抗原也可以包括蛋白质端粒酶，该酶是染色体的端粒合成所必需的，并且在85％以上的人类癌中表达，而仅在有限数量的自身组织中表达(Kim，N等(1994)Science 266：2011-2013)。肿瘤抗原也可以是癌细胞表达的“新抗原”，例如由于体细胞突变改变蛋白质序列或产生两种无关序列的融合蛋白(例如，Philadelphia染色体中的bcr-abl)。

其他肿瘤疫苗可以包括来自与人类癌症有关的病毒的蛋白质，如人类乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可以与PD-L1阻断剂(如抗PD-L1抗体，例如本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体)联合应用的另外一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织本身中分离的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白质的片段，这些HSP在向抗原呈递细胞递送以引发肿瘤免疫方面非常有效(Suot，R和Srivastava，P(1995)Science 269：1585-1588；Tamura，Y.等(1997)Science278：117-120)。

树突细胞(DC)是强抗原呈递细胞，可以用来引发抗原特异性应答。DC可以在体外产生，并且载有各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle，F.等(1998)NatureMedicine 4：328-332)。DC也可以通过遗传手段转导，从而也表达这些肿瘤抗原。已经为了免疫而直接将DC融合到肿瘤细胞上(Kugler，A.等(2000)Nature Medicine 6：332-336)。作为接种方法，DC免疫可以与PD-L1阻断剂(如抗PD-L1抗体，例如本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体)有效地组合，以激活更强的抗肿瘤应答。

CAR-T，全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)是另一种有效的恶性肿瘤的细胞治疗方法。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。同时，还可以引入共刺激分子信号序列以提高T细胞的细胞毒活性、增殖性与存活时间，促进细胞因子的释放。患者的T细胞被“重编码”后，可在体外扩增生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞并回输患者体内，实现肿瘤治疗的目的。PD-L1阻断剂(如抗PD-L1抗体，例如本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体)可以与CAR-T细胞疗法联合，激活更强的抗肿瘤应答。

本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体也可以与标准癌症治疗组合。本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体可以与化疗方案有效地组合。在这些例子中，它可以减少施用的化疗剂的剂量(Mokyr，M.等(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。这种组合的一个例子是PD-L1结合多肽或化合物或抗体与氨烯咪胺联用治疗黑素瘤。这种组合的另外一个实例是PD-L1结合多肽或化合物或抗体与白介素-2(IL-2)联用治疗黑素瘤。本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体和化学疗法联用的科学原理是细胞死亡，这是大多数化疗化合物的细胞毒性作用的结果，应会导致抗原呈递途径中的肿瘤抗原水平升高。可以通过细胞死亡与PD-L1阻断协同作用的其他联合治疗有放疗、手术和激素剥夺。这些方案都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管发生抑制剂也可以与本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体组合。血管发生的抑制导致肿瘤细胞死亡，这可以将肿瘤抗原提供给宿主的抗原呈递途径。

本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体还可以与靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体联合使用。所述靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体包括但不限于，抗EGFR抗体、抗EGFR变体的抗体、抗VEGFa抗体、抗HER2抗体、或抗CMET抗体。优选所述抗体是单克隆抗体。

本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体也可以与将Fcα或Fcγ受体表达效应细胞靶向至肿瘤细胞的双特异性抗原联合应用(参见，例如US Patent Nos.5,922.845和5,837,243)。也可以利用双特异性抗体靶向两种不同的抗原。例如，已经利用抗-Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体将巨噬细胞靶向肿瘤部位。这种靶向可以更有效地激活肿瘤特异性应答。利用PD-L1阻断剂可以加强这些应答的T细胞方面。或者，可以利用结合肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标记的双特异性抗体将抗原直接递送至DC。

肿瘤通过多种机制逃避宿主的免疫监视。其中许多机制可以通过灭活肿瘤表达的免疫抑制性蛋白质来克服。尤其包括TGF-β(KehrL J.等(1986)J.Exp.Med.163：1037-1050)、IL-10(Howard，M.和O′Garra，A.(1992)Immunology Today 13：198-200)和Fas配体(Hahne，M.等(1996)Science 274：1363-1365)。其中每种的抗体可以与本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体联用，来抵抗免疫抑制剂的作用，并且有利于宿主的肿瘤免疫应答。

可以用于激活宿主免疫应答的其他抗体可以与本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体联用。抗-CD40抗体能够有效地替代T细胞辅助活性(Ridge，J.等(1998)Nature 393：474-478)，并且可以与本发明的PD-L1结合多肽联用(Ito，N.等(2000)Immunobiology 201(5)527-40)。也可以为了提高T细胞活化的水平而联合对T细胞共刺激分子如OX-40(Weinberg，A.等(2000)Immunol 164：2160-2169)、4-1BB(Melero，I.等(1997)NatureMedicine 3：682-685(1997)和ICOS(Hutloff，A.等(1999)Nature 397：262-266)的活化抗体以及阻断阴性共刺激分子如CTLA-4(例如，美国专利No.5,811,097)或BTLA(Watanabe，N.等(2003)Nat Immunol 4：670-9)、B7-H4(Sica，GL等(2003)Immunity 18：849-61)的活性的抗体。

骨髓移植当前用来治疗造血来源的多种肿瘤。移植物抗宿主疾病是这种治疗的一种后果，移植物对抗肿瘤的应答可以获得治疗性益处。可以利用PD-L1阻断剂提高肿瘤特异性T细胞的有效性。也有几种实验治疗方案涉及抗原特异性T细胞的离体激活和扩增以及这些细胞向受体内的过继转移，以用抗原特异性T细胞对抗肿瘤(Greenberg，R.和Riddell，S.(1999)Science 285：546-51)。这些方法也可以用来激活T细胞对传染原如CMV的应答。预期在本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体存在下离体激活可以提高过继转移的T细胞的频率和活性。因此，本发明还提供了一种离体激活免疫细胞(如PBMC或T细胞)的方法，包括使所述免疫细胞与本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体接触。

感染性疾病

本发明的其他方法用于治疗暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本发明的另一方面提供一种预防和/或治疗对象中的感染性疾病的方法，包括给该对象施用本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体，使得所述对象的感染性疾病得到预防和/或治疗。

类似于对于如上所述的肿瘤的应用，PD-L1阻断剂可以单独使用，或者作为佐剂与疫苗组合使用来刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。特别可以应用该治疗方法的病原体的实例包括当前没有有效疫苗的病原体，或常规疫苗不完全有效的病原体。其中包括但不限于HIV、肝炎病毒(甲、乙、丙)、流感病毒、疱疹病毒、贾第虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌。PD-L1阻断剂特别可用于对抗诸如HIV等病原体已建立的感染，其在感染过程中呈现改变的抗原。在抗人PD-L1抗体给药时，这些新的表位被作为外源物识别，从而引起不受PD-L1的负信号影响的强T细胞应答。

引起可用本发明的方法治疗的感染性疾病的病原体病毒的一些实例包括HIV、肝炎(甲、乙、丙)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6，HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、虫媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和虫媒病毒脑炎病毒。

引起可用本发明的方法治疗的感染性疾病的病原体细菌的一些实例包括衣原体、立克次氏体菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏杆菌、变形菌、雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、霍乱菌、破伤风菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌、钩端螺旋体、和莱姆病细菌。

引起可用本发明的方法治疗的感染性疾病的病原体真菌的一些实例包括假丝酵母(白假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母等)、新型隐球菌、曲霉属(烟曲霉、黑曲霉等)、毛霉属(毛霉、犁头霉、根霉)、申克孢子丝菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和夹膜组织胞浆菌。

引起可用本发明的方法治疗的感染性疾病的病原体寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴、结肠小袋纤毛虫、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴属的种、兰伯贾第虫、隐孢子虫属的种、卡氏肺囊虫、间日疟原虫、果氏巴贝虫、布氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼原虫、鼠弓形体、巴西日圆线虫。

在所有上述的方法中，PD-L1阻断剂可以与其他形式的免疫疗法如细胞因子治疗(例如干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体治疗联合，双特异性抗体治疗提供增强的肿瘤抗原的呈递(参见，例如，Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak(1994)Structure 2:1121-1123)。

自身免疫反应

抗PD-L1抗体可以激起和扩大自身免疫应答。因此，可以考虑利用本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体联合多种自身蛋白质来设计接种方案，以有效地产生对抗这些自身蛋白质的免疫应答，用于疾病治疗。

例如，阿尔茨海默病涉及Aβ肽在脑中淀粉样蛋白沉积物中的不当的积累；针对淀粉样蛋白的抗体应答能够清除这些淀粉样蛋白沉积物(Schenk等(1999)Nature 400：173-177)。也可以使用其他自身蛋白作为靶标，如涉及治疗变态反应和哮喘的IgE，和涉及类风湿性关节炎的TNFα。最后，可以利用PD-L1结合多肽或化合物或抗体诱导抗体对各种激素的应答。中和抗体对生殖激素的应答可以用于避孕。中和抗体对激素和特定肿瘤生长所需的其他可溶性因子的应答也可以被认为是可能的接种靶标。

如上所述，应用PD-L1结合多肽或化合物或抗体的类似方法可以用来诱导治疗性自身免疫应答，以治疗具有不恰当的自身抗原积累的患者，如淀粉状蛋白沉积物包括阿尔茨海默病中的Aβ、细胞因子如TNFα和IgE。

慢性炎性疾病

本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体也可以用来治疗如下疾病，如慢性炎性疾病，如扁平苔藓、T细胞介导的慢性炎性皮肤粘膜病(Youngnak-Piboonratanakit等(2004)Immunol Letters 94；215-22)。因此，在一个方面，本发明提供一种用T细胞消除慢性炎性疾病的方法，包括给对象施用本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体。

疫苗佐剂

本发明的一个方面提供了本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体作为疫苗佐剂的用途。通过共施用PD-L1结合多肽或化合物或抗体和目标抗原(例如疫苗)，可以利用PD-L1结合多肽提高针对抗原的特异性免疫应答。

因此，本发明的一个方面提供了增强对象中对抗原的免疫应答的方法，包括给该对象施用：(i)抗原；和(ii)本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体，使得所述对象中对抗原的免疫应答得到加强。所述抗原可以是，例如，肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。这些抗原的非限定性实例包括以上章节中所述的那些，例如以上所述的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)，或来自上述病毒、细菌或其他病原体的抗原。

检测

在另一方面本发明还提供检测生物学样品中PD-L1的存在或PD-L1的表达水平的方法，包括在本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体与PD-L1之间能够形成复合物的条件下，使所述生物学样品和对照样品接触本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体。然后检测复合物的形成，其中所述生物学样品与对照样品之间复合物形成的差异指示样品中PD-L1的存在或PD-L1的表达水平。

已经发现PD-L1在许多肿瘤中高表达，或者肿瘤或病原体会造成所述肿瘤或病原体感染位点附近的免疫细胞高表达PD-L1。因此，本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体可以用于诊断与PD-L1相关的疾病，例如PD-L1高表达相关的肿瘤或感染性疾病如病毒感染。

在一些实施方案中，本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体还缀合有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。

试剂盒

本发明的范围内还包括试剂盒，该试剂盒包括本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体、免疫缀合物或药物组合物，以及使用说明。该试剂盒可以进一步包括至少一种另外的试剂或一种或多种另外的本发明的PD-L1结合多肽或化合物或抗体(例如，结合PD-L1不同表位的的结合多肽)。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。

序列表

<110> 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司

<120> PD-L1结合多肽或化合物

<130> P2018TC442

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗体株56

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Met Ser Ser Arg Arg

20 25 30

Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val

35 40 45

Ala Lys Leu Leu Thr Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser

100 105 110

Gly Ala Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR1

<400> 2

Gly Lys Met Ser Ser Arg Arg

1 5

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR2

<400> 3

Thr Thr Ser

1

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR3

<400> 4

Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser Gly Ala

1 5 10 15

Phe Gln

<210> 5

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human PDL1-V

<400> 5

Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn

1 5 10 15

Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu Ala

20 25 30

Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln Phe

35 40 45

Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg Gln

50 55 60

Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala Leu

65 70 75 80

Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met

85 90 95

Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val Asn

100 105 110

Ala

<210> 6

<211> 234

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human PDL1-His

<400> 6

Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn

1 5 10 15

Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu Ala

20 25 30

Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln Phe

35 40 45

Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg Gln

50 55 60

Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala Leu

65 70 75 80

Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met

85 90 95

Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val Asn

100 105 110

Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro Val

115 120 125

Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys Ala

130 135 140

Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys Thr

145 150 155 160

Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser

165 170 175

Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe

180 185 190

Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro

195 200 205

Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Asp Lys Leu Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Glu His His His His His His

225 230

<210> 7

<211> 221

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human PDL1

<400> 7

Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn

1 5 10 15

Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu Ala

20 25 30

Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln Phe

35 40 45

Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg Gln

50 55 60

Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala Leu

65 70 75 80

Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met

85 90 95

Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val Asn

100 105 110

Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro Val

115 120 125

Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys Ala

130 135 140

Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys Thr

145 150 155 160

Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Asn Leu Phe Asn Val Thr Ser

165 170 175

Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe

180 185 190

Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro

195 200 205

Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Asp

210 215 220

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR1

<400> 8

Gly Lys Met Ser Ser Arg Arg Cys

1 5

<210> 9

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗体株10

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Val Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Thr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Met Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Asp Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Ala Arg Leu Asn Cys Pro Gly Pro Val Asp Trp Val Pro Met Phe Pro

100 105 110

Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> m1

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Met Ser Ser Arg Arg

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Val Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Thr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Met Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Asp Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser Gly

100 105 110

Ala Phe Gln Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 11

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗体株94

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Leu Asn Ile Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Val Gly Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asp Ser Asp Gly Thr Thr Arg Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Asp Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Arg Leu Asn Cys Pro Gly Pro Val Asp Trp Val Pro Met Phe Pro

100 105 110

Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> m2

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Met Ser Ser Arg Arg

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Val Gly Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asp Ser Asp Gly Thr Thr Arg Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Asp Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser Gly

100 105 110

Ala Phe Gln Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR2

<400> 13

Lys Leu Leu Thr Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pertuzumab抗体重链的CDR2-KABAT

<400> 14

Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 15

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> m3

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Met Ser Ser Arg Arg

20 25 30

Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser

100 105 110

Gly Ala Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 16

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> m4

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Met Ser Ser Arg Arg

20 25 30

Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val

35 40 45

Ala Lys Leu Leu Ala Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser

100 105 110

Gly Ala Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 17

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> m5

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Met Ser Ser Arg Arg

20 25 30

Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val

35 40 45

Ala Lys Leu Leu Thr Ala Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser

100 105 110

Gly Ala Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 18

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> m6

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Met Ser Ser Arg Arg

20 25 30

Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val

35 40 45

Ala Lys Leu Leu Thr Thr Ala Gly Ser Thr Tyr Leu Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser

100 105 110

Gly Ala Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 19

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗体C38

<400> 19

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Tyr Thr Ala Ser Ser Asn

20 25 30

Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Thr Ile Tyr Asn Gly Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Ala Gly Ser Pro Arg Phe Cys Ala Ser Ala Thr Met Thr Gly Gly

100 105 110

His His Leu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 20

<211> 136

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> m7

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Tyr Thr Ala Ser Ser Asn

20 25 30

Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Thr Ile Tyr Asn Gly Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Ala Gly Ser Pro Arg Phe Cys Ala Ser Asp Ser Phe Glu Asp Pro

100 105 110

Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser Gly Ala Phe Gln Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C38 CDR1 plus Cys

<400> 21

Arg Tyr Thr Ala Ser Ser Asn Cys

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C38 CDR2-KABAT

<400> 22

Thr Ile Tyr Asn Gly Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> m8

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Tyr Thr Ala Ser Ser Asn

20 25 30

Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val

35 40 45

Ala Thr Ile Tyr Asn Gly Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser

100 105 110

Gly Ala Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR1

<400> 24

Gly Lys Met Ser Ser Arg Arg Cys Met Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR2

<400> 25

Leu Thr Thr Ser Gly Ser

1 5

附图说明

图1.示出KN035和B7/CD28超家族不同成员的结合特异性。将EK293T细胞分别用表达PD-L1-EGFP、PD-L2-EGFP、mPD-L1-EGFP、B7H3-EGFP、ICOS-EGFP、B7H4-EGFP的质粒转染，并和APC抗人IgG Fc抗体或KN035-Fc+APC抗人IgG Fc抗体孵育。用流式细胞术检测信号。KN035仅仅显示和hPD-L1的高结合亲和力。

图2.示出KN035的活性测定。(A)以不同浓度KN035和Durvalumab处理后CD4+T细胞分泌的INF-γ的水平。(B)通过移植小鼠模型评价KN035的肿瘤抑制活性。其中小鼠接种A375-hPD-L1细胞和PBMC的混合物(比例为4:1)，持续测量肿瘤体积。KN035在三个剂量都显示强抗肿瘤作用，而Durvalumab仅在高浓度(1mg/kg)显示抗肿瘤活性。*p<0.05；ns，不显著。此处所用KN035为与Fc结构域融合的融合蛋白。

图3.示出KN035/hPD-L1的总体结构。(A)KN035的序列和结构。示出了CDR1、CDR2和CDR3以及二硫桥(SS1和SS2)的位置。(B)KN035/PD-L1复合物的结构。PD-L1显示为半透明表面。PD-L1和KN035的二级结构也在图上标明。

图4.示出PD-L1的IgV结构域的结构的重叠图。来自PD-1/PD-L1复合物(PDB:4ZQK，magenta)和KN035/PD-L1的PD-L1IgV结构域、本文解析的游离的PD-L1结构以及之前报道的PD-L1的结构(PDB：5C3T)重叠在一起。

图5.示出KN035/PD-L1复合物的结合界面。(A)KN035(左)和PD-L1(右)结合表面的开放视图。(B)电子云密度图显示KN035的F101残基的苯环和PD-L1的Y56和F115的芳香环叠加并与周围疏水残基形成稳定的相互作用。C,PD-L1突变体结KN035的亲和力变化。一些具体的KN035/PD-L1相互作用如D,E,F所示。G,基于三维晶体结构的PD-L1和PD-L2序列对比显示PD1和KN035结合P-L1表面残基的异同。结合PD1的残基以空心圆标示，结合KN035的以实心倒三角标示，共同的残基以三角圆标示，PD-L2结合PD1的残基以空心正三角标示。H,叠加的PD-L1/KN035和PDL2结构显示PD-L2的W110会阻碍KN035对PD-L2的结合。。

图6.示出KN035/PD-L1和PD-1/PD-L1界面的详细结合相互作用。

图7.示出PD-L1和KN035(A、C)以及PD-L1和PD1(B、D)的结合表面的比较。

图8.示出嵌合抗体m7与m8与人PDL1蛋白结合。

实施例

实施例1、PDL1单域抗体的鉴定和结构分析

实验材料和方法

产生针对hPD-L1的骆驼单域抗体

免疫用的PDL1-Fc融合蛋白由CHO细胞表达(pCDNA4,Invitrogen，Cat V86220)，经Protein A亲和层析纯化得到。选取一只新疆双峰驼(Camelus bactrianus)进行免疫。4次免疫结束后，提取骆驼100ml外周血的淋巴细胞并提取总RNA，使用Super-Script IIIFIRST STRANDSUPERMIX试剂盒按照说明书将提取的RNA反转录成cDNA。然后用巢式PCR扩增编码重链抗体的可变区的核酸片段，构建针对PD-L1的重链单域抗体噬菌体展示文库。库容的大小为1.33×10⁸，插入率达到100％。

用PDL1-Fc融合蛋白10μg/孔包被96孔平板进行针对hPD-L1-Fc的富集筛选。在4轮筛选后获得高亲和力的噬菌体。随机挑选单克隆并进行培养扩增。通过ELISA验证的阳性克隆进行测序，把CDR1、CDR2、CDR3序列均相同的克隆视为同一抗体株，而CDR序列不同的克隆视为不同抗体株。所获得的单域抗体编码基因克隆进PET-32b(Novagen)并在大肠杆菌中表达和纯化。通过竞争ELISA考察PD-L1单域抗体对PD-1与PD-L1相互作用的阻断效果。

hPD-L1以及其和KN035的复合物的制备

将编码人PD-L1氨基酸19-239的基因克隆进pET-28a。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达包涵体形式的带有C端His标签的蛋白(SEQ ID NO:6)。细胞在LB中37℃培养并在OD600达1.0时用0.5mM IPTG进行诱导。进一步在37℃孵育16小时后，离心收集细胞，重悬于含有20mM Tris-HCl pH7.4、1％Triton X-100、20mM EDTA的裂解缓冲液并通过超声处理进行裂解。15000g离心10分钟回收包涵体，用裂解缓冲液洗涤3次，随后用不含Triton X-100的缓冲液洗涤。将包涵体溶解于含6M盐酸胍、500mM EDTA和10mM DTT的20mM Tris pH7.4中。通过离心收集上清并针对10mM HCl水溶液透析。透析后，样品重新溶解于6M盐酸胍并逐滴添加至复性缓冲液(1M Arg hydrochloride,0.1M Tris pH8.0,2mM Na-EDTA,0.25mM氧化型谷胱甘肽和0.25mM还原型谷胱甘肽)。在4℃孵育过夜后，混合物针对10mM Tris pH8.0透析并通过HisTrap Ni-Sepharose柱、HiTrap SP离子交换柱和Superdex 75(GE Healthcare)纯化至均质。其它hPD-L1变体例如I54A、Y56A、E58A、D61A、N63A、Q66A、V68A、R113A、M115A、S117A,、Y123A或R125A通过相同方法制备。

为了制备PD-L1/KN035复合物，hPD-L1的N端IgV结构域类似地克隆至pET28a并在大肠杆菌表达为带有C端His标签的蛋白(SEQ ID NO:5)。其复性在含有0.1mg/ml KN035蛋白的复性缓冲液中进行。PD-L1IgV结构域/KN035复合物(下文称作PD-L1/KN035复合物)随后通过离子交换和凝胶过滤柱(GE Healthcare)纯化。

hPD-L1以及其和KN035的复合物的结晶

纯化的PD-L1以及其和KN035的复合物均浓缩至大约15mg/ml，使用商购缓冲液(Hampton Research，HR2-110)通过沉滴蒸汽扩散法筛选结晶条件，其中0.2μl的蛋白复合物溶液和0.2μl的储液混合。在优化条件后，在室温下从1.4M(NH₄)SO₄、2M Nacl获得衍射质量的PD-L1/KN035晶体。PD-L1的晶体用0.2mM醋酸铵和20％PEG3350的沉淀溶液生长。

结构测定和精化

晶体在母液中用20％甘油冷冻保护，并在液氮中闪冻。通过X-ray衍射并收集衍射数据，并解析结构。

解离速率常数

使用fortéBio Octet K2设备通过蛋白A传感器测量hPD-L1变体和KN035-Fc的结合动力学参数。全部传感器在含0.1％w/v牛血清白蛋白的PBS中活化，在96孔滴定板中以1000rpm搅动，从而最小化非特异性相互作用。全部溶液的最终体积是200μl/孔。探针用10μg/ml KN035饱和40s，然后在PBS+1％BSA中平衡60s。hPD-L1变体在0.1％BSA中制备为2-倍系列稀释液(31.25、62.5、125、250和500nM)并分别和结合在探头上的KN035孵育120s。然后使hPD-L1变体解离320s，取决于观察到的解离速率。通过扣除仅仅暴露于运行缓冲液的对照传感器的数据，校正全部测量值的基线漂移。数据分析和曲线拟合使用Octet软件进行。由于hPD1和hPD-L1之间的亲和力非常低(约8μM)，无法精确测量PD-L1变体和PD1之间的亲和力。

竞争性和夹心ELISA

ELISA板用以2μg/ml溶解于50mM Na2CO3/NaHCO3,pH 9.6的hPD-L1-Fc包被。用含0.05％Tween-20的PBST洗涤平板三次并用含3％BSA的PBS封闭1小时，将系列稀释的KN035添加至含hPD-1-hIgG-生物素(10μg/ml)的ELISA平板并在37℃孵育2h。使用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG检测结合，使用TMB显色并用硫酸终止反应。通过测定450nm的吸光度测定浓度。

分析IFN-γ的产生

通过Ficoll–Hypaque密度梯度离心从健康供体的肝素化的外周血样品获得PBMC。在通过TNF-α诱导之后，收获成熟的树突细胞并通过流式细胞术确认为HLA-DR阳性和PD-L1阳性。在KN035或Durvalumab存在下，将纯化的CD4T细胞以10-20：1的比例添加至含有树突细胞的U型底96孔板中。细胞孵育5天。收集上清液，通过ELISA试剂盒根据说明书测定IFN-γ的水平。

体内研究

为了评价KN035的体内抗肿瘤效果，通过将A375hPD-L1/人PBMC细胞皮下接种进NOD-SCID小鼠(6-12周龄，每组6只)制备异种移植小鼠模型。在肿瘤接种4小时后，腹腔内施用KN035抗体或Durvalumab，之后每周施用一次，持续4周。沿着三个垂直的轴(a、b和c)测量肿瘤大小并计算为肿瘤体积＝(abc)/2。肿瘤体积大于2000mm³的小鼠用二氧化碳处理杀死。

流式细胞分析

KN035-Fc和其它B7/CD28超家族蛋白的结合特定通过流式细胞分析进行评价。将HEK293T细胞接种于T75瓶中的完全DMEM培养基，分别用表达B7/CD28超家族蛋白的质粒转染(PD-L1-EGFP、PD-L2-EGFP、mPD-L1-EGFP、B7H3-EGFP、ICOS-EGFP、B7H4-EGFP)。48小时后，收获细胞并分组。使用APC抗人IgG Fc抗体检测KN035-Fc。通过BD FACSCalibur流式细胞仪使用BD Cellquest软件获取数据。使用FlowJo软件进行数据分析。

实验结果

hPD-L1单域抗体KN035的筛选和鉴定

鉴定到一单域抗体，命名为KN035，序列示于SEQ ID NO：1。该抗体以5.9nM的Kd值特异性结合PD-L1，但是不特异性结合PD-L2或其它该家族的成员(图1)。在竞争ELISA测定中，KN035以420ng/ml的EC50阻断hPD-L1和hPD1的相互作用。当与Fc片段融合之后，KN035相比于Durvalumab能够更有效地在混合淋巴细胞反应中增加T细胞应答以及细胞因子的产生(图2A)。而在免疫共移植肿瘤模型中，KN035显示强抗肿瘤活性，且在较低浓度下比Durvalumab更有效地抑制肿瘤生长(图2B)。这些结果显示KN035是阻断PD-1/PD-L1相互作用的有效抑制剂，具有强抗肿瘤活性。

KN035/PD-L1复合物的整体结构

为了进一步研究PD-L1/KN035相互作用的分子机制，我们将KN035和PD-L1的N端免疫球蛋白可变(IgV)结构域的复合物的晶体结构解析到

的分辨率，而游离PD-L1解析至

的分辨率。建模并精化至良好的几何模型，结果见表1。KN035/PD-L1复合物的晶体结构在不对称单位中含有单个的KN035和PD-L1的N端免疫球蛋白可变(IgV)结构域，比例为1:1。类似于其它sdAb结构，KN035具有典型的IgV支架，其含有形成免疫球蛋白结构域核心结构的4个框架区(FR)，以及分别由7、3、和18个氨基酸残基的构成的三个超变区CDR1(SEQID NO：2)、CDR2(SEQ ID NO：3)和CDR3(SEQ ID NO：4)环(图3A)。KN035的整体结构与已有公开的sdAb结构(PDB:1MEL、1HCV)很好地重叠，对于除了CDR环外的全部残基，其Cα原子的均方根偏差(RMSD)为

类似于其它来自骆驼的sdAb，KN035具有连接B链和F链的保守二硫键(SS1:Cys22-Cys96)。KN035的CDR1环形成一个短的α螺旋，而CDR3环则具有一个短的α螺旋和一个短的3₁₀螺旋，其在sdAB中是独特的。CDR3环的短α螺旋被一个额外的二硫键(SS2：Cys33-Cys113)保持在KN035的C链(图3)，而CDR3环进一步通过其与KN035主体的疏水相互作用而被稳定。

KN035通过其CDR1和CDR3结合PD-L1的IgV结构域，其CDR1和CDR3填充PD-L1的CC’FG链，埋藏总表面积

(图4)。本文解析的PD-L1结构和之前报道的PD-L1结构相比，KN035的结合诱导PD-L1产生微小的构象改变。在KN035/PDL复合物中，连接PD-L1的C链和C‘链的连接环弯曲大约

以与KN035形成相互作用。尽管连接PD-L1的C'链和D链的连接环也偏移大约

这很可能是由于晶体中分子堆积引起的(图4)。这些结果表面PD-L1的结合表面是相对刚性的。

表1结晶学数据收集和精化统计

KN035/PD-L1相互作用表面

KN035的CDR1和CDR3环形成结合表面，其具有由亲水表面包围的疏水补丁，与PD-L1的互补(图5、图6)。观察到显著的π-π堆叠相互作用，其中KN035的Phe101的芳香环与PD-L1的Tyr56的芳香环垂直堆叠(图5B)，其进一步通过其它疏水残基(KN035CDR3中的Val109、Leu108、Ala114和Phe115与PD-L1的Ile54、Val68和Met115)稳定。

突变研究和随后的亲和力测量实验(图5C)显示PD-L1中Tyr56被Ala置换后，其与KN035的结合亲和力被降低超过200倍，而PD-L1中Ile54被Ala置换后亲和力被降低40倍(图5C，表2)。KN035还与PD-L1形成7个氢键和2个离子键，涉及KN035的9个残基和PD-L1的6个残基(表3)。这些极性相互作用包括KN035的Asp99和PD-L1的Arg113之间的强盐桥，该两个残基的侧链完全伸展并且通过周围残基的作用而稳定(图5D)。Arg113被Ala置换使得KN035和PD-L1之间的结合亲和力降低接近90倍。该Arg113的盐桥对KN035很重要，因为KN035与113位是Cys的小鼠PD-L1的结合亲和力几乎可以忽略不计。PD-L1的Glu58和KN035的Ser100形成两个氢键(图5E)，而PD-L1的C'链中的Gln66和KN035的Thr105和Asp103的主链或侧链形成三个氢键(图5F)。PD-L1中Glu58和Gln66类似的置换将KN035结合亲和力分别降低25倍和82倍。因此，这五个残基(图5C)很可能代表PD1/PD-L1结合界面的热点残基。PD-L1中参与形成疏水或极性相互作用的其它残基也在稳定KN035/PD-L1复合物中起重要作用，这些残基的突变均导致约2-10倍的结合亲和力降低(表2)。有趣的是，尽管PD-L1的C链和C’链之间的连接环中的残基Asp61向KN035移动了大约

和CDR1环螺旋中的Ser29和Ser30残基形成氢键，用Ala置换该残基仅仅将亲和力降低3.4倍。这意味着KN035与PD-L1的高结合亲和力主要是由于CDR3环形成的相互作用，而CDR1环形成的相互作用起次要作用。

我们的初步筛选显示KN035以纳摩尔级的亲和力结合hPD-L1，但是却不结合hPD-L2。基于已发表的hPD1/hPD-L1、mPD1/mPDL2复合物的结构和本文所示的KN035/PD-L1复合物结构，对hPDL1、hPDL2和mPDL2的序列进行比对，参与结合的残基高亮显示(图5G)。PDL2在IgV结构域的C和D链之间具有较短的连接环，而在PDL1中对应的较长的连接环形成C和C'链且是KN035的结合表面的一部分。预期缺乏该环降低PDL2与KN035的结合。更重要的是，当将PDL2的结构和PD-L1/KN035复合物的结构重叠时，可以看出PD-L2的Trp101(其是PD-1/PD-L2结合界面中的重要残基，对应PD-L1的Ala121)由于其庞大的侧链将和KN035的CDR3环抵触并阻止PDL2和KN035的结合(图5H)。这些结果表明KN035是针对PD-L1的高特异性抗体且在体内将具有较少脱靶效应。

表2 PD-L1突变体和结合亲和力

PD-1/PD-L1结构比较

之前的结构分析已经显示PD1具有IgV型的拓扑学，其通过GFCC’链的残基(KN035通过CDR环)结合PD-L1(图7A和B)，总埋藏表面积为

然而PD1与PD-L1的结合相对比较弱，Kd为大约5μM，比KN035弱了800多倍。PD1和KN035与PDL1的热点残基形成相类似的相互作用，其结合界面很大程度覆盖KN035的结合界面(图7C和D)。hPD-L1的Arg113和hPD1的Glu136形成盐桥，类似于和KN035的Asp99的盐桥(图5、图7B)。然而，hPD1/hPD-L1复合物中的该盐桥相对较弱，因为Arg113和Glu136的侧链没有很好对齐(图6B)。根据之前关于小鼠PD1和小鼠PD-L1的突变研究，该残基的离子相互作用在mPD1/mPD-L1界面中是非必需的，对应的突变体(Cys133Tyr)与PD1的结合增加约3倍。类似地，在hPD-L1与KN035的结合中提供大约25倍结合亲和力的Glu58，在mPD1结合中是冗余的或者起负作用，Glu58Ser mPD-L1突变体与mPD1的结合要紧密约3倍。同样，mPD1和mPD-L1之间的疏水相互作用看起来主要位于残基115(人中为Met115，而小鼠中是Ile115)而不是如PD-L1的Tyr56，Ile115Ala突变体与mPD1的结合比野生型mPD-L1如大约33倍，而Tyr56Ser突变体与mPD1的结合与野生型相同。相反，KN035/hPD-L1界面的关键疏水相互作用来自Tyr56，类似的hPD-L1变体Met115Ala和Tyr56Ser与KN035的结合亲和力分别降低9倍和200倍。此外，已经显示mPD1和mPD-L1之间的疏水相互作用能够被PD1中的A132L取代所增强，导致对mPD-L1和mPDL2的结合亲和力均被增加。总之，这些结果提示PD1对PD-L1的结合界面并不如KN035。

讨论

现在已经清楚肿瘤细胞经常使用免疫检查点途径作为免疫逃避的主要机制，尤其是针对肿瘤抗原特异的T细胞。因为这些检查点的配体-受体相互作用可以由抗体或重组配体或受体阻断，FDA已经批准若干针对这些途径中的CTLA4和PD-1的抗体用于癌症免疫疗法，许多其他抗体也正在进行临床研究。然而，缺乏这些抗体如何阻断这些免疫检查点的结构信息。本文中，首次报道了此类抗肿瘤抗体KN035和人PD-L1复合时的共结晶结构，这为进一步开发高结合亲和力和特异性的抗体铺设了道路。

之前关于PD-1和其配体的结构研究中，受体/配体结合表面相对平坦(图6B)。我们发现，单域抗体KN035主要通过其CDR3环结合PD-L1的平坦表面，所述CDR3环形成α螺旋和独特的短3₁₀螺旋的转角。KN035与PD-L1纳摩尔级的结合亲和力主要通过其结合表面上的疏水相互作用和离子相互作用，并完全利用形成结合界面的全部残基。例如，KN035的残基Phe101和Asp99最优地排列而与PD-L1的互补结合表面的对应残基Tyr56和Arg113相互作用，相反，PD-L1这两个残基对PD-1的结合贡献很少(图6B和表3)。KN035和PD1与PD-L1结合亲和力的巨大差异的另一因素很可能是由于CDR环的柔性，其适于和界面周围的残基相互作用，而PD-1的结合表面主要由β链形成，其自由度受限。这可能暗示PD-1和PD-L1之间的界面并不有目的地针对最大体内结合亲和力优化，而PD-1和其配体之间微摩尔级的中等结合亲和力给予其最优的免疫激活和抑制。

此外，KN035和PD-L1复合物的结构可以容易地解释KN035不能结合PDL2，这是由于PDL2在C链和D链之间的环较短，且PDL2中Tyr101形成空间位阻。因此该特异性PD-L1单域抗体能够用于进一步的研究以仔细分析PD-L1和PD-L2在肿瘤中的作用，这对于指导不同检查点阻断剂的临床使用可能是关键的。

尽管已发表了PD1和其配体复合物的多个晶体结构，针对PD-1/PD-L1表面的合理设计却很少成功，这很大程度上是由于难于靶向平坦的蛋白表面。本文鉴别的KN035的结合表面将可以提供有用的信息，基于CDR3环的构象选择肽或化学模拟物。更重要的是，KN035CDR3环半独立的折叠将可以用于产生双特异性或多特异性抗体用于组合免疫疗法。

表3 KN035和PD-L1之间的极性相互作用(距离≤

)

实施例2、基于结构分析构建PDL1单域抗体的变体

实验材料和方法

PDL1单域抗体突变体的制备

根据晶体结构，以专利申请CN 106397592A的10号单域抗体(与人PDL1亲和力较低)的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)为母版，将KN035单域抗体的CDR1以及紧接其后的半胱氨酸残基序列(SEQ ID NO：8)与CDR3(SEQ ID No：4)替换到其上，得到突变体1(SEQ ID NO:10)。以专利申请CN106397592A的94号单域抗体(不能阻断人PD1与PDL1相互作用)的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)为母版，将KN035单域抗体的CDR1序列(SEQ ID NO：8)与CDR3(SEQ IDNo：4)替换到其上，得到突变体2(SEQ ID NO:12)。将编码这些KN035单域抗体突变体的基因在C端添加His标签的编码序列，并克隆至pCDNA4哺乳动物表达载体中。将获得的重组载体通过PEI瞬时转染到悬浮培养的人HEK293细胞中。培养6～7天后，取培养上清，通过IMAC亲合层析一步纯化，获得KN035单域抗体突变体蛋白。

以KN035单域抗体的序列(SEQ ID NO:1)为母版，将其中根据KABAT预测得到的CDR2-KABAT序列(SEQ ID NO：13)替换为同为VH3亚型的Pertuzumab抗体重链的CDR2-KABAT(SEQ ID NO：14)(US7879325)，获得新的KN035单域抗体突变体序列m3(SEQ ID NO:15)。通过上述方法，进一步获得m3突变体蛋白。

以KN035单域抗体的序列(SEQ ID NO:1)为母版，将其CDR2(SEQ ID No：3)中的氨基酸残基逐个替换为Ala，得到一系列突变KN035单域抗体序列m4、m5、m6(SEQ ID NO:16-18)。通过上述方法，进一步获得这些突变体蛋白。

PDL1单域抗体CDR3嵌合抗体的制备

将KN035单域抗体的CDR3序列(SEQ ID No：4)，替换到不识别PDL1的单域抗体C38(CN201610332590.7)框架中(SEQ ID NO:19)，得到嵌合了KN035CDR3序列的新的嵌合单域抗体m7(SEQ ID NO:20)。或是将KN035单域抗体中的CDR1+Cys(SEQ ID NO：8)与CDR2-KABAT(SEQ ID NO:13)序列替换为C38序列中的CDR1+Cys(SEQ ID NO:21)与CDR2-KABAT(SEQ IDNO:22)，得到嵌合单域抗体m8(SEQ ID NO:23)。通过上述方法，进一步获得嵌合单域抗体蛋白。

PD-L1变体和PD1之间的亲和力。

使用fortéBio Octet K2设备,利用生物膜干涉技术(Bio-LayerInterferometry，BLI)测量hPD-L1-Fc蛋白和各KN035变体的结合。AHC传感器在该实验中用于固化PDL1-Fc蛋白。其基本步骤如上述，其中AHC固化Threshold 1nm，控制程序设定为结合60s，解离100s。稀释液为0.02PBST20％(pH7.4)，再生液为glycine-HCl(pH1.7)，样品及再生液加样体积均为200μL。得到的结果使用Data analysis 9.0软件对数据进行分析。KN035变体根据不同性质，或制备2-倍系列稀释液(31.25、62.5、125、250和500nM)，或者直接稀释到100nM与1μM。

竞争性ELISA考察KN035变体对PD1-PDL1相互作用的阻断效果

ELISA板用以2μg/ml溶解于50mM Na2CO3/NaHCO3,pH 9.6的hPD-L1-Fc包被。用含0.05％Tween-20的PBST洗涤平板三次并用含3％BSA的PBS封闭1小时，将系列稀释的KN035变体添加至含hPD-1-hIgG-生物素(10μg/ml)的ELISA平板并在37℃孵育2h。使用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG检测结合，使用TMB显色并用硫酸终止反应。通过测定450nm的吸光度测定浓度。

实验结果

KN035单域抗体CDR2突变体的获得，以及亲和力以及阻断功能考察。

通过人HEK293细胞瞬时表达获得一系列CDR2区改变的KN035单域抗体突变体。这些突变体的表达水平与野生型KN035单域抗体接近。IMAC一步纯化后获得的蛋白，通过SDS-PAGE非还原电泳分析，其纯度均大于85％。之后通过fortibio考察这些突变体对人PDL1蛋白的结合情况，得到的KD值与野生型KN035进行比较，其值相差均在一个数量级之内。通过ELISA考察这些CDR2突变体阻断人PDL1-PD1相互作用的活性，发现这些蛋白都具有明确的阻断功能，其相对野生型KN035单域抗体的阻断活性均在70％～130％之间。

KN035CDR3嵌合单域抗体的获得，以及与PDL1的结合情况

通过人HEK293细胞瞬时表达获得两个KN035单域抗体CDR3嵌合体m7与m8。Fortibio分析其对人PDL1蛋白的结合，可以清楚的看到在高浓度以及低浓度下结合以及解离曲线，由此说明，这两个嵌合体都能很好的结合人PDL1蛋白(图8)。

讨论

KN035单域抗体与其靶标蛋白PDL1的共结晶结果显示，KN035单域抗体中，CDR3序列对于PDL1的结合起到了最主要的作用，而CDR2，包括其周围的氨基酸残基(根据KABAT编号得到的更长的CDR2区，SEQ ID NO：13)基本不参与靶标的结合。

发明人考察了一系列KN035突变体，发现将KABAT编码下的CDR2区的序列(SEQ IDNO：13)替换为其他单域抗体、抗体重链的CDR2序列，或者直接替换为其他无功能氨基酸，对单域抗体与PDL1的结合或是对PDL1-PD1的阻断基本没有影响。同样的，将KN035单域抗体的CDR1序列(包括C端的Cys残基，SEQ ID NO：8)以及CDR3序列(SEQ ID NO：4)替换到其他抗体或类似抗体的骨架上，也可以基本保持其原有的活性。虽然解离常数KD值以及阻断EC50有些许波动，但是推测主要由于突变体蛋白的纯度波动造成。

考虑到CDR3是KN035单域抗体的主要功能序列，发明人构建了CDR3嵌合单域抗体，并进一步考察其对PDL1靶标蛋白的结合。两种嵌合抗体都能有效结合PDL1蛋白。

序列表

>SEQ ID NO:1 56

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGKMSSRRCMAWFRQAPGKERERVAKLLTTSGSTYLADSVKGRFTISQNNAKSTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADSFEDPTCTLVTSSGAFQYWGQGTQVTVSS

>SEQ ID NO:2

GKMSSRR

>SEQ ID NO:3

TTS

>SEQ ID NO:4

DSFEDPTCTLVTSSGAFQ

>SEQ ID NO:5Human PDL1-V

TVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNA

>SEQ ID NO:6Human PDL1-His

TVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTDKLAAALEHHHHHH

>SEQ ID NO:7 Human PDL1

TVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREENLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTD

>SEQ ID NO:8

GKMSSRRC

>SEQ ID NO:9 10

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGNIVSSYCMGWFRQAPGKERVGVAAIDSDGTTKYADSMKGRFTISKDNAKNTLDLQMNSLKPEDTAMYYCVARLNCPGPVDWVPMFPYRGQGTQVTVSS

>SEQ ID NO:10 m1

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGKMSSRRCMGWFRQAPGKERVGVAAIDSDGTTKYADSMKGRFTISKDNAKNTLDLQMNSLKPEDTAMYYCVADSFEDPTCTLVTSSGAFQYRGQGTQVTVSS

>SEQ ID NO:11 94

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASLNIFSSYCMGWFRQAPGKQRVGVATIDSDGTTRYVDSVKGRFTISKDNAKNTLDLQMNSLKPEDTAMYYCAARLNCPGPVDWVPMFPYRGQGTQVTVSS

>SEQ ID NO:12 m2

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGKMSSRRCMGWFRQAPGKQRVGVATIDSDGTTRYVDSVKGRFTISKDNAKNTLDLQMNSLKPEDTAMYYCAADSFEDPTCTLVTSSGAFQYRGQGTQVTVSS

>SEQ ID NO:13

KLLTTSGSTYLADSVKG

>SEQ ID NO:14

DVNPNSGGSIYNQRFKG

>SEQ ID NO:15 m3

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGKMSSRRCMAWFRQAPGKERERVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTISQNNAKSTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADSFEDPTCTLVTSSGAFQYWGQGTQVTVSS

>SEQ ID NO:16 m4

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGKMSSRRCMAWFRQAPGKERERVAKLLATSGSTYLADSVKGRFTISQNNAKSTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADSFEDPTCTLVTSSGAFQYWGQGTQVTVSS

>SEQ ID NO:17 m5

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGKMSSRRCMAWFRQAPGKERERVAKLLTASGSTYLADSVKGRFTISQNNAKSTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADSFEDPTCTLVTSSGAFQYWGQGTQVTVSS

>SEQ ID NO:18 m6

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGKMSSRRCMAWFRQAPGKERERVAKLLTTAGSTYLADSVKGRFTISQNNAKSTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADSFEDPTCTLVTSSGAFQYWGQGTQVTVSS

>SEQ ID NO:19

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASRYTASSNCMAWFRQAPGKEREGVATIYNGGGSTAYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCGAGSPRFCASATMTGGHHLFGYWGQGTQVTVSS

>SEQ ID NO:20 m7

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASRYTASSNCMAWFRQAPGKEREGVATIYNGGGSTAYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCGAGSPRFCASDSFEDPTCTLVTSSGAFQYWGQGTQVTVSS

>SEQ ID NO:21

RYTASSNC

>SEQ ID NO:21

TIYNGGGSTAYADSVKG

>SEQ ID NO:23m8

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASRYTASSNCMAWFRQAPGKERERVATIYNGGGSTAYADSVKGRFTISQNNAKSTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADSFEDPTCTLVTSSGAFQYWGQGTQVTVSS

>SEQ ID NO:24

GKMSSRRCMA

>SEQ ID NO:25

LTTSGS

附录I

Claims

1.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述多肽能够特异性结合人PD-L1并阻断PD-L1和PD1的相互作用，

其中所述多肽不包含SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的氨基酸序列，

其中所述多肽包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NOs:15-18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23中任一种的氨基酸序列。

2.晶体复合物，其包括抗PD-L1单域抗体和PD-L1的N端免疫球蛋白可变(IgV)结构域，所述抗PD-L1单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述PD-L1的N端免疫球蛋白可变(IgV)结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且其中所述晶体复合物属于空间群P61，且晶胞大小为

且α＝β＝90°，γ＝120°。

3.PD-L1的晶体，其属于空间群C2221，且晶胞大小为

且α＝β＝γ＝90°，所述PD-L1的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。