CN103936836B - 具有抗肿瘤活性的靶向PD-L1IgV亲和肽D2 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的靶向PD-L1？IgV的D-构型亲和肽D2产品及其制备和应用。该亲和肽D2特异性结合于PD-L1？IgV区，其氨基酸序列为KHAHHTHNLRLP，分子量为1459.8。亲和肽D2通过Fomc固相多肽合成法制备，在制备抗结肠癌药物中作为主要活性成分发挥作用。本发明所提供的亲和肽D2通过利用镜像噬菌体展示肽库筛选技术，以D-PD-L1？IgV为靶点进行高通量筛选获得。发明人通过小鼠体内荷瘤实验，证明了亲和肽D2具有较好的抗肿瘤活性，能明显抑制小鼠体内肿瘤的增长，从而为基于PD-L1的药物研究和开发提供新的思路和理论基础。

Description

具有抗肿瘤活性的靶向PD-L1IgV亲和肽D2

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性多肽产品的筛选、制备及应用，更具体的，本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的靶向PD-L1IgV的D-构型亲和肽D2产品及其制备和应用。

背景技术

近年来，肿瘤的防控形势非常严峻。随着临床诊断、手术治疗、化疗和放疗等水平的提高，使得一部分病人能够得到早发现、早治疗，并且获得较好的预后，但是，寻找新的治疗手段和治疗药物一直是全球范围内的研究热点。与传统的治疗方法相比，肿瘤免疫治疗能够激活或者诱导肿瘤患者建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发的肿瘤细胞，并且建立免疫记忆，阻止肿瘤的复发和转移。

在肿瘤免疫治疗过程中，负性共刺激分子主要介导免疫耐受和逃逸，而前人在肿瘤免疫治疗过程中遇到的最大挑战就是由于肿瘤免疫耐受和逃逸所导致的疗效不佳。因此，探讨通过抑制负性共刺激分子所介导的信号通路以打破机体已经建立的对肿瘤细胞的免疫耐受具有重要的理论意义和应用价值。

T细胞的激活需两个来自细胞外的信号刺激，即淋巴细胞活化的双信号作用。细胞活化的第一信号主要来自细胞抗原识别受体（TCR）与MHC分子抗原肽复合物的特异性结合，此过程为抗原识别。细胞活化的第二信号又称共刺激信号，是由抗原递呈细胞（APC）和细胞表面的粘附分子提供。这些粘附分子被称为共刺激分子，是一类细胞膜表面分子，可为T、B细胞的活化提供辅助信号，从而调节细胞的增殖、活化及分化。根据产生的效应不同，可将共刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子。正性共刺激分子包括CD28、ICOS、4-1BB等分子，而负性共刺激分子则包括CTLA-4、PD-1、TIM-3等分子。

PD-1/PD-L1作为B7/CD28家族成员，已被证实通过抑制T细胞的活化和增殖来负调控免疫应答，并在调节免疫耐受、肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。因而利用PD-L1的阻断剂作为肿瘤免疫治疗药物或佐剂具有很好的应用前景和安全性，而现有技术中，尚缺少较好的PD-L1的阻断剂产品。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有较好抗肿瘤活性的靶向PD-L1IgV的D-构型亲和肽D2产品，可以特异性利用PD-L1I蛋白IgV区（D-PD-L1IgV）作为结合靶点，从而最终阻断PD-1/PD-L1的活化，解除对T细胞的活化和增殖的抑制作用，从而发挥抗肿瘤作用。

具体而言，本发明采用的技术方案如下：

一种具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽D2，属于D-构型，特异性结合于PD-L1IgV区，其氨基酸序列为：Lys-His-Ala-His-His-Thr-His-Asn-Leu-Arg-Leu-Pro，即K-H-A-H-H-T-H-N-L-R-L-P，分子量为1459.8。

所述具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽D2，添加药学上可接受的载体或/和添加剂后，在制备抗结肠癌（CT26）药物中作为主要活性成分发挥作用。

所述具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽D2，通过Fomc固相多肽合成法人工合成。

现有技术中对PD-1/PD-L1复合物的晶体结构研究认为，与受体PD-1结合的部位主要是PD-L1的胞外段IgV区，因此发明人通过构建人PD-L1IgV区的原核表达载体，得到人PD-L1胞外段IgV区蛋白，并以其为靶点来筛选亲和肽，进而对其作为肿瘤免疫治疗药物和佐剂的可能性进行研究。

在对靶点进行高通量筛选亲和肽过程中，发明人采用了库容量大、操作简便的噬菌体展示肽库技术进行了筛选。噬菌体展示肽库技术是将外源蛋白或多肽序列插入在M13噬菌体衣壳蛋白pⅢ的N末端，通过蛋白的融合表达将插入的随机多肽序列展示在噬菌体表面。由于展示多肽位于pⅢ的N末端，这些小肽通常能够保持较为独立的空间结构，从而能够模拟配体与特异性受体靶标相互作用。由于通过噬菌体展示肽库筛选所得到的多肽均为天然氨基酸残基所组成，易被酶降解且体内半衰期较短。镜像噬菌体筛选技术即以筛选靶蛋白的D-构型镜像分子为靶标，通过噬菌体展示肽库技术筛选能够与其结合的多肽配基，再合成这些多肽配基的镜像分子—D-构型多肽配基。由于筛选得到的天然多肽配基能特异性结合D-构型靶蛋白，根据镜像对称关系，D构型多肽配基也能特异性结合天然构型的靶蛋白，因此该D-构型多肽即为天然靶蛋白的镜像配基。因此，发明人选用由D-构型氨基酸人工合成的PD-L1IgV区蛋白作为靶点，通过镜像噬菌体筛选技术得到D-构型的亲和肽，从而大幅度提高其抵抗酶降解的能力以延长体内作用半衰期。

本发明通过利用镜像噬菌体展示肽库筛选技术，以D-PD-L1IgV为靶点进行高通量的筛选，人工合成了具有抗肿瘤活性的D-构型亲和肽D2。发明人进一步通过小鼠体内荷瘤实验，证明了本发明所提供的靶向PD-L1IgV亲和肽D2具有较好的抗肿瘤活性，能明显抑制小鼠体内肿瘤的增长，从而为基于PD-L1的药物研究和开发提供新的思路和理论基础。

附图说明

图1是亲和肽D2的质谱鉴定图；

图2是亲和肽D2的瘤旁给药对荷CT26结肠癌小鼠体重变化的影响结果图；

图3是亲和肽D2的瘤旁给药对荷CT26结肠癌小鼠瘤体积变化的影响结果图；

图4是亲和肽D2的瘤旁给药对荷CT26结肠癌小鼠瘤重图；

图5是亲和肽D2的腹腔给药对荷CT26结肠癌小鼠体重变化的影响结果图；

图6是亲和肽D2的腹腔给药对荷CT26结肠癌小鼠瘤体积变化的影响结果图；

图7是亲和肽D2的腹腔给药对荷CT26结肠癌小鼠生存期影响结果图；

图8是亲和肽D2酶降解稳定性结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。

实施例1

本发明所提供的具有抗肿瘤活性的PD-L1IgV的D-构型亲和肽D2，特异性结合于PD-L1IgV区，是利用镜像噬菌体展示肽库技术筛选得到的，其氨基酸序列为：

Lys-His-Ala-His-His-Thr-His-Asn-Leu-Arg-Leu-Pro，即K-H-A-H-H-T-H-N-L-R-L-P，分子量为1459.8。

由于通过常规噬菌体展示肽库筛选所得到的多肽均为天然氨基酸残基所组成，易被酶降解且体内半衰期较短。因此，我们选用由D-构型氨基酸人工合成的PD-L1IgV区蛋白作为靶点，通过镜像噬菌体展示技术来筛选得到D-构型的拮抗肽，从而大幅度提高其抵抗酶降解的能力以延长体内作用半衰期。为便于本领域技术人员实施本发明，对其筛选过程简要说明如下：

筛选过程中所用培养基和主要溶液的配制说明如下：

LB液体培养基：称取胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，加超纯水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后室温贮存备用。

LB固体培养基：1LLB液体培养基中加入15g琼脂粉，加热使琼脂粉充分溶解，搅拌均匀并分装为100mL/瓶，121℃灭菌20min，冷却至室温后贮存备用。

LB/IPTG/Xgal平板：将100mLLB固体培养基用微波炉加热溶解，冷却至60℃左右时，加入75μLIPTG/Xgal，小心混匀，避免产生气泡，倾倒入六孔板。平板于4℃冰箱避光贮存备用。IPTG/Xga按以下配方制备：称取0.5gIPTG和0.2gXgal溶于5mLDMF（N，N-二甲基甲酰胺）中，混匀后分装为300μL小份，于-20℃避光贮存。

上层琼脂：称取胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，MgCl₂·6H₂O1g，琼脂糖7g，加超纯水定容至1L，微波炉煮沸3次，使琼脂糖充分溶解，冷却至60℃左右，分装成60mL的小份，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后室温存放备用。

LB-Tet（四环素）平板：微波炉加热溶解100mLLB固体培养基，冷却至60℃左右时，加入100μLTet贮液，混匀后倾倒六平板，待冷却凝固后4℃避光贮存，一周内使用完。四环素（Tet）贮液按以下配方制备：称取200mg盐酸四环素，溶于10mL的无水乙醇中，分装为300μL小份，于-20℃避光贮存。

包被液-0.1MNaHCO₃缓冲液（pH8.6）：称取NaHCO₃0.84g用80mL三蒸水溶解后用NaOH调PH至8.6，定容至100mL，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后4℃存放备用。

封闭液-0.1MNaHCO₃（pH8.6）、5mg/mLBSA：称取NaHCO₃0.84g、BSA0.5g用80mL三蒸水溶解后用NaOH调pH至8.6，定容至100mL，过滤除菌，分装为5mL小份，4℃贮存备用。

洗脱液-0.2M甘氨酸-HCl缓冲液（pH2.2）、1mg/mLBSA：量取50mL0.2M甘氨酸溶液和44mL0.2MHCl溶液，加入200mgBSA，加水定容至200mL，过滤除菌，4℃备用。

中和液-1MTris-HCl缓冲液（pH9.1）：称取12.114gTris碱，适量超纯水溶解，HCl调pH至9.1，定容、过滤除菌，分装备用。

TBS缓冲液-50mMTris-HCL（PH7.5）、150mMNaCl：按以下步骤制备，第一步先称取6.055gTrisbase，用少量双蒸水（300~500ml）溶解，再用浓HCl将pH调至7.5，最后加双蒸水至1000ml，此步骤制备得Tris缓冲液（50mM，PH7.5）；第二步称取NaCl8.766g，先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入第一步所制备的Tris缓冲液（50mM，pH7.5）100ml，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀，高压灭菌即得。

洗涤液（TBST）：0.1%（v/v）Tween-20TBS，TBS即前述TBS缓冲液。

PEG/NaCl：称取PEG-800020g，NaCl14.61g，加超纯水定容至100mL，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温，4℃贮存备用。

筛选步骤：

（1）包被：采用片段拼接技术用D-构型的氨基酸化学合成PD-L1蛋白的IgV区，经过尿素浓度梯度复性后得到目的蛋白D-PD-L1IgV（溶于0.1MpH8.6的NaHCO₃溶液）。用目的蛋白包被96孔板，15μg/孔（150μL，100μg/mL），密闭湿盒4℃孵育过夜；

（2）封闭：弃去包被液，用枪头吸出剩余残液并迅速加满封闭液，密闭湿盒4℃孵育3h；

（3）洗涤：TBST洗涤6次，每次不少于2min，注意无菌操作，动作要快以免微孔板干燥；

（4）结合：快速加入预先用TBST稀释至滴度为2×10¹¹的文库的噬菌体100μL/孔，室温温和摇动1h；在这个过程中，与靶蛋白具有亲和力的噬菌体会结合在蛋白上；

（5）洗涤：TBST洗涤10次，洗去未结合的噬菌体；

（6）洗脱：每孔加入100μL洗脱液，室温温和摇动20min；

（7）中和：用移液枪小心吸出洗脱的噬菌体，转移至预先已加好15μL中和液的灭菌离心管中，温和吹打混匀；

（8）扩增：把第一轮筛选得到的噬菌体与大肠杆菌ER2738加入LB液体培养基（Tet⁺）中共同培养，进行扩增和纯化，得到次级肽库；

（9）滴度测定：分别对各轮筛选得到的噬菌体以及扩增后的次级肽库在LB/IPTG/Xgal平板上进行噬菌体滴度测定，并进行回收率计算，噬菌体回收率=[洗脱噬菌体数/投入噬菌体数]×100%；

（10）重复筛选：将扩增得到的噬菌体投入下一轮筛选，重复上述筛选过程。经5轮亲和筛选，即可使得含目的多肽的噬菌体得到高度富集；

（11）测序：挑取第五轮筛选后的滴度测定平板上的噬菌斑进行扩增，取200μL新鲜扩增的噬菌体贮存液送往金唯智测序公司进行全自动测序，测序引物为-96gⅢ测序引物：5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’。

多肽序列分析：根据DNA测序结果推导其所编码的氨基酸序列，得到拮抗肽的氨基酸序列。

筛选结果：

（1）分别对各轮筛选得到的噬菌体洗脱液进行滴度测定，并计算投入噬菌体回收率，结果见下表。

（2）我们对于筛选得到的非特异性序列和与靶蛋白D-PD-L1IgV亲和力不高的序列进行了淘汰，选择十二肽库对D-PD-L1IgV蛋白进行了镜像筛选，得到两条具有重复克隆的D肽序列，其中包括了D2肽，具体结果如下表。

实施例2

所述具有抗肿瘤活性的PD-L1IgV的D-构型亲和肽D2采用Fomc固相多肽合成法进行合成，合成步骤简要描述如下：

合成过程中所用到的主要试剂有：

封头液：乙酸酐/吡啶溶液（1:1v/v）；

茚检试剂：A.茚三酮/乙醇溶液(5%w/v)，B.苯酚/乙醇(4:1w/v)，C.氰化钾/吡啶(2%v/v)；

脱保护液：哌啶/DMF溶液(20%v/v)；

切割试剂：按体积含量计，TFA（82.5%），H₂O（5%），苯酚（5%），苯甲硫醚（5%），乙二硫醇（2.5%）。

合成步骤简要描述如下：

（1）溶胀树脂、加第一个氨基酸

A．溶胀树脂：取0.3~0.5gRink树脂（与树脂相连的肽的C末端氨基酸为酰胺）置于洗干净且干燥的多肽合成仪内，加入适量的DMF，浸泡30min左右使树脂充分溶胀，真空泵抽出合成仪中的DMF。

B．洗涤：步骤如下，加入适量的DMF，震荡洗涤2min共2次；加入适量的MeOH，震荡洗涤2min共3次；加入适量的DCM，震荡洗涤2min共3次；加入适量的DMF，再震荡洗涤2min共2次。

C．加第一个氨基酸：通过公式计算应该加入的首个氨基酸、HoBt及DIC的量，计算公示如下：

氨基酸质量=树脂质量×2.5倍当量×带有保护基团的氨基酸的相对分子质量，

HOBT质量=树脂质量×2.5倍当量×HOBT的相对分子质量，

DIC用量=树脂质量×2.5倍当量×DIC的相对分子质量，

天平秤取D-Fmoc-氨基酸、HOBT于50mL烧杯，用少量的DMF溶解后加入合成仪中，再用移液枪吸取DIC加入合成仪，将合成仪置于摇床中，室温下反应3h，使氨基酸与树脂发生耦联反应。

Ｄ．洗涤：同步骤B。

E．测取代值：由于在290nm下，芴甲氧羰基有很强的紫外吸收，因此通过测定它的吸光值，用比色法可以来测定第一个氨基酸与树脂结合的情况。挑取步骤D中反应后树脂1~1.5mg，烘干，用电子分析天平准确称量树脂质量；然后将树脂装入5mL的离心管中，加入3mL的脱保护液震荡10min；随后转移进入比色皿中于290nm测定样品OD值；另一比色皿中加入3mL的脱保护液为空白对照，按公式计算取代值，计算公示如下：

取代值=样品OD值/1.65×树脂质量。

取代值在0.4~0.6时最佳，若取代值小于0.4，则表明氨基酸与树脂结合的量过少，应该重复上述过程加第一个氨基酸。

F．封头：向合成仪加入适量的封头液震摇20min共两次。

G．洗涤：同步骤B。

（2）加第二个氨基酸及后续肽链延伸

H.脱保护：合成仪中加入适量的脱保护液，摇床反应20min共2次。

I．洗涤：同步骤B。

J．茚检：挑取步骤I中的少量树脂放入茚检管，分别滴加茚检试剂A液1滴、B液2滴、C液1滴，盖好茚检管，沸水浴2min观察树脂颜色；若为蓝色（Pro、His、Ser脱保护后茚检颜色为红棕色），则脱保护正常；否则须重复脱保护过程。

K．加氨基酸：计算并将称量好的氨基酸以及HOBT用少量DMF溶解后加入多肽合成仪，再用移液枪加入DIC，置于摇床中，室温下反应2.5h。

L．洗涤：同步骤B。

M．茚检：过程同步骤J，若树脂为亮黄色，无蓝斑，则氨基酸缩合完全，可进行下一步反应。若为蓝色，则氨基酸缩合不完全，需重复进行此氨基酸的缩合反应，直至茚检树脂完全呈亮黄色。

N．重复步骤H-M至完成整条肽的缩合反应。

（3）多肽切割

O．脱保护：同步骤H。

P．茚检：同步骤J。

Q．洗涤：同步骤B。

R．切割：在通风橱中配置切割试剂并倒入合成仪，将搅拌器放入合成仪，开始切割反应，搅拌器缓慢搅拌切割2.5h左右。反应完毕后，用真空抽滤泵抽滤出切割试剂，再用DCM洗涤几遍搅拌桨和树脂，并将抽滤得到的切割液装入圆底烧瓶。

S．旋转蒸发：用旋转蒸发仪将切割液中的TFA去除，旋转蒸发仪温度调整为65℃，旋转蒸发10~20min。之后再加入冰乙醚，继续旋转蒸发，10~20min，此步重复6次，由于多肽序列中含有精氨酸和赖氨酸，需进行冰切，以去除侧脸的保护集团。向瓶中加入5mLTFA，置于冰中，摇床上震摇30min。冰切完毕后，继续置于旋转蒸发仪中，旋转蒸发10~20min。

T．沉淀：旋转蒸发完毕后，将切割液倒入装有50mL冰乙醚的烧杯中，冰浴静置30min，使多肽沉淀。

U．离心：吸管吸取烧杯底部乙醚沉淀混合液，2000r/min，离心2min，弃上清收集沉淀，冰乙醚重悬洗涤沉淀5次。

V．烘干：将收集的多肽沉淀于37℃烘箱烘干，电子分析天平称重，计算粗肽产率，将其密封保存于-20℃备用。

（4）RP-HPLC分析和制备纯化多肽

RP-HPLC分析中流动相溶液配制：

流动相A液（1‰TFA溶液）：移液管量取1mLTFA，加入超纯水定容至1000mL，超声波仪器超声除气去泡；

流动相B液（乙腈）：使用色谱纯级乙腈溶液作为流动相B液，注意用超声波仪器超声除气去泡。

多肽纯化制备采用梯度洗脱分离纯化：

W．提前开机30min预热，打开软件操作界面，参数设置：波长设置228nm，流速设置5mL/min；

X．平衡：平衡约30min；

Y．粗肽制备：称取粗肽约20mg，用含特定浓度乙腈的0.1%TFA水溶液（4mL）溶解，0.45μm微孔滤膜过滤后进样。收集主峰产物置于-80℃过夜冻存。

Z．冻干：将冻好的主峰产物样品置于冻干机中冻干24h，之后收集并称量精肽，-20℃密封保存备用。

（5）质谱鉴定

取少量精肽，通过电喷雾电离质谱分析鉴定多肽分子质量，质谱鉴定结果如图1所示，鉴定结果符合预期。

实施例3

以实施例2制备的具有抗肿瘤活性的PD-L1IgV的D-构型亲和肽D2为例，发明人做了进一步的荷瘤小鼠体内实验，具体实验过程如下：

（1）亲和肽D2对荷CT26结肠癌小鼠移植瘤生长抑制实验

选择24只实验用Balb/c小鼠，将鼠源结肠癌（CT26）细胞用生理盐水（NS）将细胞浓度调整至5×10⁶个细胞/mL，常规消毒后将0.1mL细胞悬液（含5×10⁵个细胞）接种于每只Balb/c小鼠右前肢腋窝皮下，持续观察皮下瘤体生长情况。

将实施例2制备的亲和肽D2溶于生理盐水中，制成多肽药物，-20℃分装保存，备用。接种鼠源结肠癌（CT26）细胞9天后，将小鼠按瘤体积分组，每组6只，分为阴性对照组（NS），阳性对照组（5-FU），多肽药物实验组。（给药剂量问题？）

为确定给药方式不同对抗肿瘤效果的影响，发明人进行了前后两次荷瘤实验，两次实验采取不同的给药方式。具体实验设置如下：

第一次荷瘤实验所有实验组均采用瘤旁给药。多肽药物实验组分为高剂量组（2mg/kg）和低剂量组（0.5mg/kg）实验组每3天给药一次，共给药7天；5-Fu阳性对照组每天给药一次，连续给药四天结束。实验期间小鼠自由进食和饮水，每日测量小鼠体重及肿瘤的长（a）短（b）径，并按瘤体积=（π/6）×a×b²计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。给药结束后将小鼠处死取出肿瘤并称重。

第二次荷瘤实验采取腹腔给药方式，给药组分为高剂量组（5.0mg/kg）和低剂量组（2.0mg/kg），每天给药一次，连续给药12天。实验期间小鼠自由进食和饮水，每日测量小鼠体重及肿瘤的长（a）短（b）径，并按公式计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。给药结束后将小鼠处死取出肿瘤并称重。

实验结果见图2—图6。从图2、图5我们可以看出多肽药物组实验小鼠体重正常，阳性对照组因5-FU的毒副作用较大而出现消瘦情况。由此可见，亲和肽D2不仅有一定的抗肿瘤效果，而且没有明显毒副作用。从图3、图4我们可以看出采用瘤旁给药方式时，药物组实验小鼠肿瘤体积和瘤重都比阴性对照组小。高剂量和低剂量差距不大，推测是由于亲和肽D2不易降解，或者剂量相对偏高，因而没有表现出剂量依赖性。从图6我们可以看出采用腹腔给药方式时，药物组实验小鼠肿瘤体积比阴性对照组小。此时，低剂量比高剂量给药组的实验小鼠瘤体积增长相对缓慢，说明2mg/kg剂量的D2能更好的抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。

（2）生存期实验

选择24只实验用Balb/c小鼠，将鼠源结肠癌（CT26）细胞用生理盐水（NS）将细胞浓度调整至5×10⁶个细胞/mL，常规消毒后将0.1mL细胞悬液（含5×10⁵个细胞）接种于每只Balb/c小鼠右前肢腋窝皮下，持续观察皮下瘤体生长情况。

将实施例2制备的亲和肽D2溶于生理盐水中，制成多肽药物，-20℃分装保存，备用。

接种鼠源结肠癌（CT26）细胞9天后，将小鼠按瘤体积分组，每组6只，分为阴性对照组（NS），阳性对照组（5-FU），多肽药物实验组。各组均采用瘤旁给药，每天给药一次，共给药12天，观察小鼠生存状况，记录小鼠死亡时间。

实验结果见图7。从图7我们可以看出D2药物组实验小鼠生存期（2mg/kg组32d至62d，5mg/kg组32d至48d）与阴性对照组（17d至36d）相比显著延长。推测是由于D2肽不易降解，或者剂量相对偏高，因而高剂量组小鼠的生存期与低剂量组相比并没有优势。

实施例4

为检验本发明所提供的亲和肽D2的稳定性，发明人进一步做了酶降解稳定性实验，具体实验过程如下：

将10uL10^-2MD2肽和对照L肽（以PD-L1IgV蛋白为靶标筛选噬菌体十二肽库得到的L-构型亲和十二肽）母液加入190uL血清（用PBS十倍稀释）中，立即震荡混匀，取出20uL混合液，加入离心管中，此时计时为0min，余下的于37℃下继续孵育，并分别在不同的时间点（0min，15min，30min，60min，120min，240min，480min）取出20uL。

将取出的样品加入90uL乙腈震荡混匀以终止酶解过程，样品置于冰上5min，再取出90uL0.5%的冰乙酸稀释以确保酶解过程停止。13000g，15min离心，收集上清，-80℃冻存，至RP-HPLC分析。

从图8可以看出D2在480min后仍然不会被降解，而作为对照的L肽在120min时已经降解了一半。由此可知，D2肽在体内环境不易被降解，能够有效延长其作用时间，从而达到更好的治疗效果。

SEQUENCELISTING

<110>郑州大学

<120>具有抗肿瘤活性的靶向PD-L1IgV亲和肽D2

<130>none

<160>1

<170>PatentInversion3.4

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>靶向PD-L1IgV亲和肽D2

<400>1

LysHisAlaHisHisThrHisAsnLeuArgLeuPro

1510

Claims (3)

1.一种具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽D2，其特征在于，该亲和肽D2属于D-构型，特异性结合于PD-L1IgV区，其氨基酸序列为：Lys-His-Ala-His-His-Thr-His-Asn-Leu-Arg-Leu-Pro，即K-H-A-H-H-T-H-N-L-R-L-P，分子量为1459.8Da。

2.权利要求1所述具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽D2在制备抗结肠癌药物中的应用。

3.权利要求1所述具有抗肿瘤活性靶向PD-L1IgV亲和肽D2的制备方法，其特征在于，通过Fmoc固相多肽合成法制备，具体步骤如下：

（1）溶胀树脂、加第一个氨基酸；

（2）加第二个氨基酸及后续肽链延伸，至完成整条肽的缩合反应；

（3）多肽切割；

（4）RP-HPLC分析和制备纯化多肽。