CN115197299A - Pd-1受体及其配体pd-l1双靶向的非抗体结合多肽或其衍生物及其应用 - Google Patents

Pd-1受体及其配体pd-l1双靶向的非抗体结合多肽或其衍生物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PD‑1受体的非抗体结合多肽或其衍生物，所述非抗体结合多肽包括主链和连接在主链上的至少一个支链，支链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，主链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.7所示。本发明还提供了编码所述非抗体结合多肽的多核苷酸以及重组载体、宿主细胞。本发明还提供了一种制剂，其包含所述非抗体结合多肽或其衍生物，所述制剂为药物或细胞标识试剂。本发明还提供了所述非抗体结合多肽或其衍生物用于制备肿瘤检测剂、免疫调节药物、抗肿瘤药物的用途。本发明提供的非抗体结合多肽分子量小，渗透性好，可以人工合成，成本较低，没有动物源性，安全性高，与特定分子的结合性好，具有类似甚至优于单克隆抗体的功能。

Description

PD-1受体及其配体PD-L1双靶向的非抗体结合多肽或其衍生 物及其应用
技术领域
本发明属于于医药生物技术领域，具体涉及一种PD-1受体的非抗体结合多肽或其衍生物及其应用。
背景技术
程序性细胞死亡受体-1(PD-1)是一个288氨基酸残基的膜蛋白受体，被表达在T细胞、B细胞和髓细胞等多种免疫细胞。PD-1有细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)和细胞程序性死亡-配体2(PD-L2)；PD-1与配体的结合上调E3-泛素连接酶CBL-b和c-CBL，下调T细胞受体表达，抑制T细胞的活化及细胞因子的释放。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。
PD-1及其配体负调节免疫反应，实验显示PD-1敲除小鼠更容易发生狼疮样肾小球肾炎和扩张性心肌病。PD-1和PD-L1结合启动T细胞的程序性死亡，抑制白介素-2(IL-2)和干扰素IFN-γ分泌。病毒LCMV感染实验研究表明，PD-1和PD-L1相互作用抑制病毒特异性CD8细胞的激活和增殖，而抗体药物等阻断PD-L1和PD-1的结合，增加IL-2分泌，逆转CD8细胞的负性调节作用。
PD-1的配体PD-L1在多种癌细胞高度表达，PD-L1/PD-1是癌细胞免疫逃逸的关键信号通路，抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用可以增强体外T细胞的抗肿瘤活性。目前已有九种抗体药物上市，作用于靶点PD-1的纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)和卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)均为人源化或完全人免疫球蛋白G(4IgG4)抗体；作用于靶点PD-L1的阿特朱单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)和度伐鲁单抗(Durvalumab)是人源化或完全人的IgG1抗体。尚无PD-1和PD-L1双靶向药物上市。
亲和力是影响分子靶向类药物疗效、用药剂量和毒副作用的重要因素之一，由结合区域、结合面积，凹凸结合的立体构型合适度共同决定。亲和力可用解离常数(Kd)表征，Kd值越小，亲和力越大。纳武利尤单抗的主要结合位点是PD-1的“N环”结构，结合面积约为
Figure BDA0003012865790000011
Figure BDA0003012865790000012
Kd为1.45nmol/L；帕博利珠单抗结合的主要部位是C′D环结构，结合面积约为
Figure BDA0003012865790000013
Figure BDA0003012865790000014
Kd值为27pmol/L；西米普利单抗的Kd值为6.11nmol/L；特瑞普利单抗和信迪利单抗主要与FG环结合，结合面积分别为
Figure BDA0003012865790000015
和
Figure BDA0003012865790000016
Kd值分别为0.324nmol/L和0.25nmol/L；卡瑞利珠单抗主要与CC′环和FG环结合，结合面积为
Figure BDA0003012865790000021
Kd值为3.31nmol/L。阿特朱单抗通过来自重链的3个CDR环和来自轻链的1个CDR环结合PD-L1的前β-折叠，即主要通过覆盖BC、CC′、C′C″和FG环中的残基来主导结合，结合面积为
Figure BDA0003012865790000022
Kd值400pmol/L；阿维鲁单抗的结合表位区域主要由PD-L1的C链、C′链、F链、G链和CC′环构成，结合面积为
Figure BDA0003012865790000023
Kd值为42.1pmol/L；度伐鲁单抗的结合区域是PD-L1上的CC′环和N末端区域，结合面积为
Figure BDA0003012865790000024
Kd值为667pmol/L。
中国专利ZL201710324664.7公开了一种结合PD-1受体的非抗体结合蛋白PD-1-nABP284，其能够特异性结合PD-1受体，体外实验显示nABP284阻断PD-L1配体和PD-1结合，增进T淋巴细胞IL-2分泌和癌细胞杀伤效应，抑制小鼠体内肿瘤生长。与单克隆抗体相比，非抗体结合多肽容易合成和控制质量，很少诱导免疫原性，具有较好的肿瘤组织靶向性和渗透能力，生产成本较低，但是nABP284与PD-1受体的亲和力比较弱，没有实验显示nABP284与PD-1的配体PD-L1有结合能力。
发明内容
本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够显著提高与PD-1的亲和力以及对PD-L1的阻断效应、改善免疫细胞白介素-2的分泌和癌细胞杀伤能力的PD-1受体的非抗体结合多肽。
本发明的另一个目的是提供所述非抗体结合多肽的应用。
为了实现以上发明目的，本发明提供了一种PD-1受体的非抗体结合多肽或其衍生物，其中，所述非抗体结合多肽包括主链和连接在所述主链上的至少一个支链，所述支链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述主链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.7所示。至少一个(诸如一个、两个、三个等)支链(SHHHRL)的氨基酸L(Leu)与主链上的氨基酸K(Lys)相连接，由此实现主链与支链的连接。优选地，所述非抗体结合多肽的主链的的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，支链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(该非抗体结合多肽可命名为nABP386)，支链中的氨基酸L与主链中第27位的氨基酸K相连接；或者，所述非抗体结合多肽的主链的的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，支链的氨基酸序列如SEQID NO.3所示(该非抗体结合多肽可命名为nABP486)，支链中的氨基酸L与主链中第7位的氨基酸K相连接。或者，所述非抗体结合多肽的主链的的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，支链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(该非抗体结合多肽可命名为nABP786)，支链中的氨基酸L与主链中第7位的氨基酸K相连接。
本发明还提供了一种多核苷酸，其编码所述非抗体结合多肽。
优选地，编码所述非抗体结合多肽的所述主链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述非抗体结合多肽的所述支链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，编码所述非抗体结合多肽的所述主链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述非抗体结合多肽的所述支链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，编码所述非抗体结合多肽的所述主链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码所述非抗体结合多肽的所述支链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种重组载体，其包含所述多核苷酸。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包含所述重组载体。
本发明还提供了一种制剂，其包含所述非抗体结合多肽或其衍生物，所述制剂为药物或细胞标识试剂。
优选地，当所述制剂为药物时，还包括药学上允许的辅料或载体；当所述制剂为细胞标识试剂时，还包括分子标识上允许的载体或辅料。
优选地，所述制剂包含非抗体结合多肽或其衍生物与药物分子和/或可被检测的标记连接而成的化合物；所述非抗体结合多肽的主链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.2或SEQ ID NO.7所示，支链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述药物分子具有预防和/或治疗PD-1免疫检查点激活的肿瘤、自身免疫疾病，所述肿瘤优选为PD-L1表达上调的肿瘤，包括但不限于黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、软组织肉瘤、头颈部肿瘤。
优选地，所述可被检测的标记包括荧光试剂、核素或放射试剂中的一种或多种的组合。
本发明还提供了所述非抗体结合多肽或其衍生物用于制备肿瘤和免疫性疾病检测剂的用途。优选地，所述肿瘤和免疫性疾病为PD-L1和PD-1表达异常的疾病。
本发明还提供了所述非抗体结合多肽或其衍生物用于结合PD-1分子或PD-1阳性细胞的标记物或制剂的用途。
本发明还提供了所述非抗体结合多肽或其衍生物在制备用于标记、鉴定、富集、分选或纯化PD-1阳性细胞的制剂中的应用。优选地，所述PD-1分子来自细胞总蛋白、细胞分泌性蛋白或活细胞表面。所述PD-1阳性细胞包括但不限于T细胞、NK细胞和白血病细胞。
本发明还提供了所述非抗体结合多肽或其衍生物用于制备免疫调节药物的用途。
特别地，本发明还提供了所述非抗体结合多肽在制备用于体内治疗PD-L1分泌增加的疾病的免疫调节药物中的应用；或所述非抗体结合蛋白在制备用于增进体外培养的免疫细胞的肿瘤杀伤效应的制剂中的应用。
本发明还提供了所述非抗体结合多肽或其衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途。所述肿瘤优选为PD-L1表达上调的肿瘤，包括但不限于黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、软组织肉瘤、头颈部肿瘤。优选地，本发明还提供了所述非抗体结合多肽或其衍生物作为PD-1和PD-L1通路阻断剂的用途。
体外实验证明，nABP486与PD-1结合亲和力的Kd值为11.9nmol/L；nABP386为75.1nM，明显高于nABP284的Kd值11.8μM。
进一步实验显示nABP486与PD-L1结合亲和力的Kd值为54.2nmol/L，表明nABP486具有PD-1和PD-L1双靶向结合作用。
进一步实验显示nABP786与PD-1结合亲和力的Kd值为5.84nmol/L，与PD-L1结合亲和力的Kd值为16.7nmol/L，表明nABP786具有PD-1和PD-L1双靶向结合作用，与nABP486比较，靶向分子结合的亲和力更高。
通过研究发现，nABP386或nABP486可以特异性地结合淋巴细胞表面的PD-1，同时，相较于现有技术中的nABP284，本发明中的nABP386和nABP486对于PD-1的亲和力显著提高。
通过研究发现，nABP386或nABP486与PD-L1配体竞争性结合肿瘤细胞株Jurkat T细胞表面的PD-1受体，发挥类似于PD-1靶向单克隆抗体药物的竞争性结合作用，并且相较于现有技术中的nABP284，本发明中的nABP386和nABP486有更好的阻断效果。
通过研究发现，nABP386或nABP486与淋巴细胞表面PD-1受体结合，可反转舌癌细胞表面PD-L1对淋巴细胞的抑制作用，恢复淋巴细胞白介素-2的分泌，说明nABP386和nABP486发挥了类似于PD-1靶向单克隆抗体药物的体液免疫调节作用，并且相较于现有技术中的nABP284，本发明中的nABP386和nABP486有更好的效果。
通过研究发现，nABP386或nABP486对外周血来源的淋巴细胞、舌癌细胞和Jurkat细胞均无毒性作用，nABP386或nABP486添加到淋巴细胞与舌癌细胞株CAL27共培养的培养液中，增加了淋巴细胞对癌细胞的杀伤作用，类似于PD-1靶向单克隆抗体药物的抗肿瘤作用，并且相较于现有技术中的nABP284，本发明中的nABP386和nABP486具有更好的效果。
与治疗性抗体相比，本发明的非抗体结合多肽nABP486和nABP786具有PD-1和PD-L1双靶向结合作用，而且非抗体结合多肽nABP386或nABP486或nABP786是人工合成的，具有较低的免疫原性、较高的体内稳定性、较好的肿瘤穿透性、增强的肿瘤积累和较低的制造成本。
综上所述，本发明提供的非抗体结合多肽nABP386或nABP486或nABP786具有诸多优点。首先，非抗体结合多肽分子量小，渗透性好；其次，可以人工合成，成本较低，没有动物源性，安全性高；与特定分子的结合性好，可以发挥类似甚至优于单克隆抗体的功能；再次，本发明提供的非抗体结合多肽nABP386或nABP486或nABP786拥有接近单克隆抗体的PD-1亲和力，相较于发明专利(ZL201710324664.7)PD-1受体的非抗体结合多肽nABP284，改善了其亲和力较弱的缺点；重要的是非抗体结合多肽nABP486或nABP786具有PD-1和PD-L1双靶向结合作用，优于单克隆抗体单向抑制效果。
附图说明
图1是人PD-1、PD-1的主要结合区域示意图以及人PD-L1、nABP284、nABP38、nABP486的氨基酸序列及其同源性比较：A图为人PD-1与人PD-L1的的两个主要结合区域，区域1包括A121 K124 R125等氨基酸残基，区域2包括Q66等氨基酸残基；B图为通过电脑模拟，模拟能够增强nABP284亲和力的组氨酸短链与人PD-1的模拟结合位点；C图为人PD-L1、nABP284、nABP38、nABP486的氨基酸序列和它们之间的同源性比较。
图2是nABP284、nABP386、nABP486或nABP786与重组人PD-1蛋白的亲和力测试结果，以及nABP486或nABP786与重组人PD-L1的亲和力测试结果：A为nABP284、B为nABP386、C为nABP486、E为nABP786对PD-1结合的亲和力通过表面等离子体共振(SPR)技术测定结果；D为nABP486、F为nABP786对PD-L1结合的亲和力通过SPR技术测定结果。
图3是nABP284、nABP386、nABP486分别与Juekat T细胞表面的PD-1特异性结合的免疫荧光结果。
图4是不同浓度的nABP284、nABP386、nABP486分别与表达PD-1的Jurkat T细胞的结合率结果。
图5为nABP284、nABP386、nABP486竞争结合细胞表面PD-1能力的实验结果。
图6为nABP284、nABP386、nABP486对重组人PD-L1蛋白的中和能力结果。
图7示出了nABP284、nABP386、nABP486对各种细胞功能的影响。其中，A图示出了体外培养诱导人外周血单核细胞(PBMCs)的方法(通过体外培养诱导的PBMCs被称为细胞因子诱导杀手细胞(Improving cytokine-induced killer cells，iCIKs))，以及PBMCs和iCIKs表面PD-1的表达比例；B图示出了经过不同浓度的IFN-γ刺激48小时后，Cal27细胞表面PD-L1的表达量；C图示出了nABP284、nABP386、nABP486对Juekat T细胞、Cal27细胞、iCIKs的细胞毒性检测结果；D图示出了nABP284、nABP386、nABP486阻断PD-1/PD-L1结合增加细胞白介素分泌功能的检测结果；E图示出了nABP486阻断PD-1/PD-L1结合增进淋巴细胞肿瘤杀伤的检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。
实施例中所用到的主要研究方法包括AutoDock及Pymol软件模拟，非抗体结合多肽与抗体免疫荧光共标记共聚焦显微镜观察、表面等离子体共振技术、流式细胞术、细胞毒性实验、免疫印迹、酶联免疫吸附测定等。实验操作若未特别说明，均为本领域技术人员所掌握的常规实验操作。所用试剂若未特别说明，均为商业渠道购买获得。
实施例中部分试剂说明如下：
人PD-1重组蛋白(PD1-H5221，Acro Biosystems)，人PD-L1重组蛋白(PD1-H82F3,Acro Biosystems),人PD-1抗体(ab52587，abcam),人PD-1流式抗体(130-120-389,Miltenyi Biotec),APC Streptavidin(405207,Biolegend),山羊抗鼠IgG二抗(ab150115，abcam)，RPMI1640(R6504，Sigma-Aldrich)，DMEM/F12(D0697，Sigma-Aldrich),胎牛血清(FBS,10099-141,Gibco)，重组人白介素-2(200-02，PEPROTECH),人重组γ干扰素(300-02，PEPROTECH),Phorbol 12-myristate 13-acetate(1652981,PeproTech),IonomycinCalcium Salt(5608212,PeproTech),PD-1功能性单克隆抗体(16-9989-82，eBioscience|Thermo Fisher Scientific)，Anti-CD3单克隆抗体(T210，TAKARA)。
1、细胞的获取及培养
人急性T淋巴细胞白血病细胞系(Jurkat T cells)和人舌鳞状细胞癌细胞系(Cal27 cells)从中国科学院典型培养保存委员会细胞库购得(中国上海)。Jurkat Tcells用含有10％FBS的RPMI1640培养基培养；Cal27 cells用含有10％FBS的DMEM/F12培养基培养；人外周血单核细胞(PBMCs)从健康成年捐赠者的外周血中通过密度梯度离心法获得，并使用含有10％FBS、2000U/ml IFN-γ、10ng/ml IL-2的RPMI1640培养基培养。
2、新肽的设计与合成
搜索了人类PD-L1与人类PD-1结合的关键区域，并将PD-L1关键区域的氨基酸残基序列与噬菌体展示技术筛选的nABP284氨基酸序列(SEQ ID NO.9，SRLKEIANSPTQFWRMVARNTLGGAKQSLNIEHARL)进行比较，nABP284中的2 RLKEIA 7和28Q，被认为是特异性结合的关键区域。基于PD-1关键结合区域附近的Y68和E136之间的裂缝正好足以容纳氨基酸侧链上的环形结构，同时考虑到组氨酸具有咪唑环，假设加入组氨酸可以增强nABP284与PD1的结合亲和力，因此，在nABP284的关键结合区附近增加组氨酸，形成支链，得到nABP386和nABP486。例如，对于nABP386，支链中的亮氨酸L与主链中第27位的赖氨酸K相连接；对于nABP486和nABP786，支链中的亮氨酸L与主链中第7位的赖氨酸K相连接。
新肽委托强耀生物通过固相合成法合成，并通过高效液相色谱法和电喷雾质谱法对对新肽进行质量检测。
3、新肽的亲和力分析
使用BiocoreT100，通过表面等离子体共振(SPR)技术对肽的亲和力进行检测。pH4.5条件下使用交联剂EDC/NHS使芯片(CM5)表面酯化；在5ug/ml的浓度下将人重组PD-1蛋白或PD-L1蛋白偶联到芯片上；用1M乙醇胺盐酸盐(pH8.5)封闭芯片上多余的有活性的羧基；将未包被人重组PD-1蛋白的通道设置为参比通道；所有SPR信号通过减去参比通道的相应值来校准；用运行缓冲液(pH7.4，100mMTris，150nMNaCl，0.005％吐温-20)对肽原液进行一系列浓度的稀释；对于nABP284的亲和力分析，一轮SPR测量使用七个浓度(20、10、5、2.5、1.25、0.625和0.3125uM)，对于nABP386，nABP486和nABP786的亲和力分析，一轮SPR测量使用七个浓度(2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125uM)。每一轮的结合和解离后，用10mM甘氨酸-HCl(pH2.5)再生CM5芯片。最终通过拟合Biacore软件上的传感图曲线来计算获得肽的亲和力(Kd值)。
4、新肽特异性结合的免疫荧光和流式细胞术分析
以下实验分为实验组和对照组。实验组采用50ng/ml的Phorbol 12-myristate13-acetate(PMA)和1ug/ml的Ionomycin Calcium Salt(Ionomycin)刺激Jurkat T细胞24小时使其表达PD-1，把几乎不表达PD-1的未受刺激的Jurkat T细胞作为对照组。免疫荧光分析，收集1x106 Jurkat T细胞，在室温下用2％BSA封闭1小时，以减少非特异性结合。封闭后，收集细胞，与10uM带有FITC(绿色荧光)的肽在37℃下孵育1小时。然后用PBS洗涤细胞三次，用4％多聚甲醛固定。用PBS洗涤三次，细胞沉淀用1：100稀释的PD-1抗体(ab52587)重悬，4℃孵育过夜。用PBS洗涤三次，用山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(ab150115)对细胞进行染色，4℃避光孵育1小时。用PBS洗涤三次，用1：1000的4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)染细胞核，用PBS洗涤三次，防荧光淬灭封片剂封片。此外，用Image J软件分析荧光共焦显微镜图像，评估多肽竞争PD-1位点的能力。用于流式细胞仪分析，收集2x105JurkatT细胞，在室温下用2％BSA封闭1小时，以减少非特异性结合。然后与10或40uM带有FITC(绿色荧光)的肽在4℃孵育1小时。用PBS洗涤三次，最后用500ul PBS重悬细胞，并转移到流式管，用流式细胞仪(CytoFLEX，BECK MANCOULTER，美国)进行分析。
5、新肽的中和实验
将Jurkat T细胞分为两组，实验组提前24小时用50ng/ml的Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)和1ug/ml的Ionomycin Calcium Salt(Ionomycin)刺激，未受刺激的Jurkat T细胞作为对照组。每管收集5X105个细胞，用FACS缓冲液(含2％BSA的PBS)洗涤一次，用FACS缓冲液将人PD-L1重组蛋白(PD1-H82F3,Acro Biosystems)稀释到4ug/ml，用FACS缓冲液将PD-1结合肽稀释成一系列浓度(0.4、1.33、4、13.3、40uM。随后，将两种工作溶液(PD-L1蛋白稀释剂和肽稀释剂)，用等体积混合，将100ul不同浓度的混合液与细胞一起加入到离心管中，在4℃条件下孵育1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞三次，每管加入0.12ug/ml APC Streptavidin(405207,Biolegend)，在4℃条件下孵育1小时，用FACS缓冲液洗涤细胞三次，500ul PBS重悬细胞，将细胞悬液转移到流式管中，用流式细胞仪进行分析。
6、新肽的细胞毒性检测
细胞毒性通过细胞计数试剂盒-8(CCK8，Dujindo，日本)进行测定，分别在96孔板中加入Jurkat T细胞(每孔4000个细胞)、PBMCs(每孔4000个细胞)或Cal27细胞(每孔2000个细胞)，培养24小时。在培养基中分别加入一系列浓度(1,2,3,4,8,16,32,64uM)的nABP284、nABP386、nABP486，细胞在细胞培养箱中培养24小时之后，在每孔中加入10ul的CCK-8溶液，在细胞培养箱中继续培养2小时。采用VictorX5多层平板阅读器(PerkinElmer，新加坡)测量了450nm时每孔的吸光度。细胞活力(％)通过以下公式计算：细胞活力(％)＝[(A样本-A基线)/(A控制-A空白)x100％。A样本表示实验孔的吸光度(含细胞、CCK-8溶液、培养基和肽稀释液)A基线代表基线孔的吸光度(不含细胞、含CCK-8溶液、培养基和肽稀释剂)；A控制代表对照孔的吸光度(含细胞，CCK-8溶液，培养基，不含肽稀释液)；A空白代表空白孔的吸光度(不含细胞、含CCK-8溶液、培养基和不含肽稀释液)。
7、激活的Jurkat T细胞与刺激后的cal27细胞共培养，分析Jurkat T细胞活性
用50ng/ml的Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)和1ug/ml的IonomycinCalcium Salt(Ionomycin)刺激Jurkat T细胞24小时，用500U/ml的IFN-γ刺激CAL27细胞48小时，刺激后的Jurkat T细胞用nABP284，nABP386，nABP486(10uM)或PD-1功能级单克隆抗体(2ug/ml，J116，eBioscience|ThermoFisher Science)在37℃提前孵育1小时，将刺激后的CAL27细胞以每孔1x104的数量加入96孔板中，待CAL27细胞粘附后，丢弃上清液，按4：1的比例每孔加入Jurkat T细胞以及200ul培养基。在共培养24小时后收集上清液，用ELISA试剂盒(88-7025-86,Thermo Fisher Scientific)检测上清液中IL-2的含量。
8、新肽对改良细胞因子诱导的杀伤细胞(improving cytokine-induced killeriCIK)肿瘤杀伤效率的影响
将人外周血与PBS以1：1的比例混合，将混合物添加到相同体积的Ficoll液面之上，保持混合液和Ficoll的液面分层，采用密度梯度离心(400g，20min)分离人外周血成分。细胞培养皿用10ug/ml Anti-CD3单克隆抗体(T210，TAKARA)包被，4℃过夜，将分离后的PBMCs加入到包被好的培养皿中，加入含有10％胎牛血清、2000U/ml IFN-γ、10ng/ml IL-2的RPMI1640作为培养基，每三天更换一次培养基。培养10天。把这种活化的PBMCs称作细胞因子诱导的杀伤细胞(improving cytokine-induced killer cells，iCIKs)。
对于iCIKs介导的细胞杀伤力分析。用500U/ml IFN-γ刺激Cal27细胞48小时，iCIKs用nABP284，nABP386，nABP486(10uM)或PD-1功能级单克隆抗体(2ug/ml，J116，eBioscience|ThermoFisher Science)在37℃提前孵育1小时，随后，将刺激后的CAL27细胞以每孔1x104的数量加入96孔板中，待CAL27细胞粘附后，丢弃上清液，按10：1的比例每孔加入iCIKs细胞以及100ul培养基。将96孔板在250g下离心4分钟，以确保iCIKs与cal27细胞充分接触。培养6小时后，用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒检测培养基中乳酸脱氢酶(LDH)水平，用VictorX5多层平板阅读器(PerkinElmer，新加坡)在490nm检测吸光度。
9、统计分析
统计分析采用GraphPad Prism 8软件进行，所有数据均采用t检验或单向方差分析(*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001；ns，无显着性差异)。实验数据为三次独立实验的平均值。
结果：
1、优化nABP284，合成新肽
1.1 nABP284的特征。
nABP284的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。本研究采用固相法合成nABP284，ESI-MS/HPLC确认了nABP284及其纯度。如图3-A所示，利用免疫荧光技术确定nABP284是否能与Jurkat T细胞表面表达的PD-1特异性结合。为了检测nABP284与重组人PD-1蛋白的结合亲和力，使用表面等离子体共振(SPR)(图2，A)。
NABP284与PD-1以中度亲和力特异性地结合。流式细胞术显示nABP284与受刺激的Jurkat T细胞表面PD-1的结合率随着浓度的增加而增加(图3，B和C)。
1.2设计nABP386，nABP486和nABP786
通过分析RCSBPDB中PD-1及其配体PD-L1(4ZQK)配合物的结构，比较人PD-L1与nABP284的同源性，发现nABP284上的2RLKEIA7和28Q两个区域与PD-L1胞外域中的125RKYDA121和66Q具有同源性，这正是PD-1和PD-L1结合的关键区域，特别是，这些序列的A121K124和R125残基是PD-1和PD-L1结合的关键决定因素(图1，A和C)。称这个包括A121K124和R125的区域为“区域1”。同时，针对PD-1在Y68和E136之间的间隙，设计了“SHHHRL”基序，组氨酸上的咪唑环可能具有与该热点相结合的潜力。使用Autodock和Pymol进行的计算机模拟结构分析表明，“SHHHRL”的三个组氨酸咪唑环可以与PD-1区域1中的氨基酸残基结合，并形成氢键，增强结合(图1，B)。综上所述，通过比较nABP284与PD-L1的同源性，并在可能与PD-1结合的区域添加含有“SHHHRL”的氨基酸链，获得了两个新的肽nABP386和nABP486(图1，C)。
为了改善nABP486双靶向PD-1和PD-L1结合亲和力，进一步优化了nABP486主链氨基酸序列，获得第三个新肽nABP786(图1，D)。
1.3 nABP386，nABP486和nABP786的合成
委托中国多肽公司(江苏)用Fmoc化学合成nABP386，nABP486和nABP786。新肽经ESI-MS/HPLC纯度分析确认。
2、新型PD-1结合肽的结合特异性和亲和力
表面等离子体共振(SPR)检测nABP386，nABP486和nABP786与PD-1的结合亲和力(Kd值)。将人重组PD-1蛋白包被在CM5芯片上，检测到nABP386，nABP486和nABP786的Kd值分别为75.1nmol/L，11.9nmol/L和5.84nmol/L(图2，B、C和E)，明显高于nABP284的Kd值11.8μmol/L(图2，A)。
将人重组PD-L1蛋白包被在CM5芯片上，检测到nABP486和nABP786的Kd值分别为52.4nmol/L和16.7nmol/L表明非抗体结合多肽nABP486和nABP786具有PD-1和PD-L1双靶向结合作用(图2，D)。
未受PMA刺激的Jurkat细胞几乎不表达PD-1，相反，PMA刺激的Jurkat T细胞则高表达PD-1(图3，A)。为了证明nABP386和nABP486与PD-1的结合特异性，使用新的多肽分别与刺激前后的Jurkat T细胞结合。如图3-A所示，nABP386和nABP486可以与PMA和离子霉素刺激下表达PD-1的Jurkat T细胞结合，而未刺激的Jurkat T细胞几乎没有结合。与nABP284相比，新的多肽对表达pd-1的Jurkat T细胞具有更高的结合率，同样，结合率与浓度成正相关(图4，A和B)。这些结果表明nABP386和nABP486与表达PD-1的Jurkat T细胞的结合是由PD-1介导的特异性结合。
3、新肽的阻断和中和能力
这些研究的目的是为了确定与nABP284相比，新肽结合能力的增强是否反映在阻断和中和能力的增强。用PMA和离子霉素预刺激Jurkat T细胞24小时。与nABP284、nABP386、nABP486或功能性抗PD-1抗体孵育1小时后，与未处理的Jurkat细胞相比，能够结合在与多肽孵育过的Jurkat T细胞表面的PD-1位点数量明显减少(图5，A)。平均荧光强度的定量表明，nABP284、nABP286和nABP486都具有阻断受刺激Jurkat T细胞表面PD-1的能力，在相同浓度下，nABP486比A和B具有更强的阻断能力，nABP284和nABP386之间没有显著差异(图5，B)。
接下来，研究了nABP284和新肽对重组人PD-L1蛋白的中和能力。作为PD-1的配体，PD-L1可以与PD-1特异性结合。在与表达PD-1的Jurkat T细胞结合之前，将nABP284、nABP386或nABP486与重组人PD-L1蛋白在一系列浓度下混合。通过流式细胞术测定重组人PD-L1蛋白的结合率，结果表明，通过增加nABP284、nABP386或nABP486的浓度，可以抑制人PD-L1重组蛋白与刺激后过表达PD-1的Jurkat T细胞的结合(图6，D)。在中和能力方面，与nABP284相比，nABP386和nABP486更强，在三个肽中，nABP486的中和能力最强(图6，A-D)。
4、新肽拯救Cal27细胞对JurkatT细胞的抑制作用
PMA和离子霉素刺激Jurkat T细胞后，PD-1位点在细胞表面高表达(图3，A)，同时Jurkat T细胞会分泌大量的IL-2。同样，随着预先刺激的IFN-γ浓度的增加，Cal27细胞表面的PD-L1位点数量增加(图7，B)。细胞因子分泌水平是评价T细胞功能的重要指标。共培养后，Cal27细胞通过PD-1和PD-L1的相互作用抑制Jurkat T细胞，通过ELISA检测IL-2水平的降低表现出来(图7，D)。检查新肽是否能比nABP284更有地效阻止PD-1与PD-L1的相互作用，在确定nABP284、nABP386,nABP486对Cal27和Jurkat T细胞没有直接细胞毒性后(图7，C)，添加了nABP284、nABP386、nABP486或anti-PD-1功能抗体进入培养系统，结果表明，与对照组相比，在添加了nABP284、nABP386、nABP486或抗PD-1抗体后，共培养体系中IL-2水平显著增加(图7，D)。因此，nABP284和新肽可以通过阻断PD-1和PD-L1的相互作用来恢复Jurkat T细胞的抑制，其中nABP486在这三个肽中具有最好的阻断作用。
5、新肽增进iCIKs的肿瘤细胞杀伤效率
如图7中A所示，从志愿者的外周血中分离出PBMCs，通过一系列细胞因子的刺激，包括OKT-3、IL-2和IFN-γ，把这些激活的PBMCs称为细胞因子诱导杀伤细胞(iCIKs)。流式细胞术显示，与新分离的PBMCs相比，细胞因子诱导杀伤细胞(iCIKs)显著过表达PD-1(图7，A)。将IFN-γ刺激的cal27细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞(iCIKs)共培养，ELISA检测培养基中LDH浓度，评价iCIKs对cal27细胞介导的细胞毒性。由于PD-1/PD-L1通路的存在，iCIKs对cal27细胞的细胞毒性相对较弱(图7，E),作为上面的实验中最有效的肽,在iCIKs和cal27细胞的共培养系统中添加nABP486，与对照组相比，显著增加了iCIKs的杀伤力(图7，E)。考虑到nABP486对Cal27细胞没有直接杀伤能力(图7，C)，上述实验结果表明nABP486可以通过阻断PD-1和PD-L1的相互作用，增强iCIKs介导的细胞毒性(图7，A和E)。
在本研究中，证明了从先前的研究中发现的nABP284中优化的两个新肽(nABP386和nABP486)对阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用有更好的效果。与PD-1结合的nABP386或nABP486的亲和力明显高于nABP284。这些肽可以阻断人重组PD-L1与受刺激的JurkatT细胞表面PD-1的结合。通过将这些肽添加到共培养系统中，可以逆转cal27细胞对JurkatT细胞和PBMCs的抑制作用。总之，结果表明，从nABP284中优化的新肽，特别是nABP486，对PD-1和PD-L1之间的相互作用具有良好的阻断能力。
实验中的表面等离子体共振(SPR)表明Kd与PD-1结合的nABP386约为75.1nM和11.9nm。nABP284与PD-1的结合亲和力的Kd值11.8μM。而且nABP486与PD-1结合亲和力的Kd值为11.9nM,与PD-L1结合亲和力的Kd值54.2nM，有PD-1和PD-L1双靶向结合作用。这种PD-1和PD-L1双靶向阻断作用，有望提高肿瘤免疫检查点抑制的治疗效果。
这些SPR结果表明，在对nABP284进行优化后，从nABP284进化而来的两个肽与PD-1的结合亲和力高于PD-L1。通过比较噬菌体展示技术直接筛选的PD-1结合肽序列和PD-L1的胞外结构域，推测了nABP284的关键结合区，并通过在nABP284的关键区域添加组氨酸来修饰nANP284，这也是nABP284形成的侧链。与nABP284相比，与PD-1结合的新肽的亲和力显著提高，这可能是一种更有效的方法来优化噬菌体展示技术直接筛选的目标结合肽。
通过中和实验得到的肽的半效抑制浓度(IC50)表明，在低浓度下，新的肽有效地阻断了PD-L1与PD-1的结合。以Jurkat细胞和cal27细胞共培养系统为模型，模拟PD-1表达肿瘤细胞对活化淋巴细胞的体外抑制作用，并通过评价培养基中IL-2的浓度来证明抑制程度。活化的Jurkat细胞与nABP386、nABP486或功能性PD-1抗体孵育后，PD-1与PD-L1的相互作用可逆转活化的Jurkat细胞的抑制，nABP486表现出优于PD-1抗体更显著的效果。从人外周血中分离PBMCs，用抗CD3抗体、IL-2和IFN-γ等细胞因子培养10天获得iCIK细胞。与PBMC比较，ICIK细胞表面提高了PD-1表达水平。当舌癌CAL27细胞与iCIK共培养时，舌癌细胞抑制iCIK细胞的肿瘤杀伤能力，用nABP486或功能性PD-1抗体预处理受刺激的iCIK可显著增强其逆转舌癌细胞的免疫逃逸，增进iCIK细胞的舌癌细胞杀伤能力。同时nABP486表现优于PD-1功能性抗体。这些体外实验表明，从PD-1结合肽nABP284中优化的两个新肽(nABP386和nABP486)具有阻断PD-1与PD-L1相互作用的能力。与噬菌体展示技术直接筛选的nABP284相比，nABP386和nABP486在相同浓度下具有更好的阻断效果，且nABP486优于nABP386。
对于免疫检查点抑制剂，体内稳定性和半衰期与靶位点的结合亲和力是重要的评价标准。添加支链一般会增加肽在体内的稳定性。与nABP284、nABP386和nABP486相比，它们都有一个支链(SHHHRL)，这会增加两个新肽在体内的稳定性，从而减缓从循环中去除的速度。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 中山大学附属口腔医院
广州一代医药科技有限公司
<120> PD-1受体及其配体PD-L1双靶向的非抗体结合多肽或其衍生物及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Arg Leu Lys Glu Ile Ala Asn Ser Pro Thr Gln Phe Trp Arg Met
1 5 10 15
Val Ala Arg Asn Thr Leu Gly Asn His Ala Lys Gln Ser Leu Asn Ile
20 25 30
Glu His Ala
35
<210> 2
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser His His His Arg Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ala Asn Ser Pro Thr
1 5 10 15
Gln Phe Trp Arg Met Val Ala Arg Asn Thr Leu Gly Asn Gly Ala Lys
20 25 30
Gln Ser Leu Asn Ile Glu His Ala
35 40
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser His His His Arg Leu
1 5
<210> 4
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaaggctga aggaaatagc aaattcacct acacagttct ggaggatggt tgcacgaaac 60
acactgggga atcacgcaaa acagtctttg aatatcgaac acgca 107
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcacaccacc acaggctgaa gctgaaggaa atagcaaatt cacctacaca gttctggagg 60
atggttgcac gaaacacact ggggaatgga gcaaaacagt ctttgaatat cgaacacgca 122
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcacaccacc acaggctg 18
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser His His His Arg Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ala Asn Cys Ser Pro
1 5 10 15
Thr Gln Phe Lys Cys
20
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcacaccacc acaggctgaa gctgaaggaa atagcaaatt gctcacctac acagttcaag 60
tgc 63
<210> 9
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ser Arg Leu Lys Glu Ile Ala Asn Ser Pro Thr Gln Phe Trp Arg Met
1 5 10 15
Val Ala Arg Asn Thr Leu Gly Gly Ala Lys Gln Ser Leu Asn Ile Glu
20 25 30
His Ala Arg Leu
35

Claims (10)

1.一种PD-1受体及其配体PD-L1双靶向的非抗体结合多肽或其衍生物，其特征在于，所述非抗体结合多肽包括主链和连接在所述主链上的至少一个支链，所述支链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述主链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.7所示。
2.一种多核苷酸，其特征在于，其编码根据权利要求1所述的非抗体结合多肽。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述非抗体结合多肽的所述主链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述非抗体结合多肽的所述支链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述非抗体结合多肽的所述主链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述非抗体结合多肽的所述支链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述非抗体结合多肽的所述主链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码所述非抗体结合多肽的所述支链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.一种重组载体，其特征在于，其包含根据权利要求2至5任一项所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，其包含根据权利要求6所述的重组载体。
8.一种制剂，其特征在于，所述制剂包含根据权利要求1所述的非抗体结合多肽或其衍生物，所述制剂为药物或细胞标识试剂。
9.根据权利要求1所述的非抗体结合多肽或其衍生物用于制备肿瘤及免疫性疾病检测剂的用途。
10.根据权利要求1所述的非抗体结合多肽或其衍生物用于制备免疫调节药物或抗肿瘤药物的用途。
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