CN104531857A - 一种装甲pd-1基因的rna标准物质及其应用 - Google Patents

一种装甲pd-1基因的rna标准物质及其应用 Download PDF

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黄丽萍
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Abstract

本发明提供一种装甲PD-1基因的RNA标准物质及其应用，所述RNA标准物质由如下步骤制得：先获得用于PD-1核酸检测的W基因序列，再获取包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的表达载体，即PET32a-CP载体；然后获取W基因和CP基因的原核表达载体PET32a-CP-PD-1；将原核表达载体转入原核表达菌株中，诱导表达，采用冷冻低温冻融，离心，纯化后，获得表达产物颗粒；接着进行DNase Ⅰ 消化、纯化后，稀释得装甲PD-1基因的RNA标准物质。本发明物质具有稳定性，无生物传染性，耐核糖核酸酶等特性，在免疫抑制因子PD-1核酸检测中作为标准物质。

Description

一种装甲PD-1基因的RNA标准物质及其应用
技术领域
本发明涉及一种装甲PD-1基因的RNA标准物质及其应用。
背景技术
PD-1即程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，最初发现于程序性死亡的T细胞上，PD1主要表达与CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK T细胞、B细胞和活化的单核细胞，主要受T细胞受体（TCR）或B细胞受体(BCR)信号的诱导表达，TNF可增强PD1在这些细胞表面的表达。PD-1有两个配体，PD-L1和PD-L2。当PD-1结合PD-L1或PD-L2后，能抑制已经活化的T细胞的增殖及细胞因子的产生。特别是抑制相应的CD8+ T细胞的功能。因此Quezada、Don M. Benson Jr针对PD1信号通路进行研究，发现抑制PD1信号通路能够重新激活宿主免疫反应抵抗肿瘤发展。许钰杰等通过对肺癌患者化疗前后T细胞表面抑制分子PD1表达情况分析显示在治疗的过程中，PD1等一些抑制分子会降低表达，这间接也说明抑制分子对于癌症的免疫治疗起到关键作用。目前针对PD-1等免疫抑制因子的研究被科学杂志评为科技进展之首。研究这些因子首先就要了解这些因子表达情况。mRNA水平检测尤其重要，利用核酸检测方法可以快速、准确、灵敏的判定PD-1核酸水平，广泛应用于临床样本的检测。
PD-1分子量为55kDa，属于CD28/CTLA-4免疫球蛋白超家族的免疫抑制性受体。又被命名为CD279，人PD-1由5个外显子和4个内含子组成，蛋白结构有胞外区、跨膜区和胞内区组成，胞外区氨基酸序列和CTLA-4、CD28具有一定的同源性。利用PD-1特异性CDS区可以特异检测PD-1核酸的存在。作为核酸检测PD-1的特异性靶点。目前国内还没有诊断PD-1核酸检测试剂及质控产品。因此，研制一种检测PD-1核酸表达水平的质控样品和标准物质，对于临床检测PD-1免疫因子表达情况具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种装甲PD-1基因的RNA标准物质及其应用，该物质具有稳定性，无生物传染性，可真实模拟病毒粒子结构，耐核糖核酸酶等特性，可用于淋巴细胞PD-1基因mRNA水平检测方法和试剂盒的阳性质控物质。
本发明是这样实现的：
一种装甲PD-1基因的RNA标准物质，所述RNA标准物质由如下步骤制得：
步骤10、获得用于PD-1核酸检测的W基因序列，如序列表中SEQ ID NO.1 所示，所述W基因为PD-1基因中的一个片段；
步骤20、获取包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的表达载体：
根据MS2噬菌体基因序列，设计一对特异性引物，所述一对特异性引物如下：MCP1:5'- CGGGGTACCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGC-3'； MCP2: 5'-CGGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3'；预期扩增产物为MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因，即CP基因，并引入双酶切位点：KpnⅠ和BamHⅠ，所述CP基因序列如序列表中SEQ ID NO.４所示；分别双酶切CP基因及PET32a载体，并将CP基因连接到PET32a载体上，最终得到PET32a-CP载体；
步骤30、W基因和CP基因的表达载体的获取：
携带W基因的T载体在Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后，进行凝胶电泳后回收135bp小片段；同时进行PET32a-CP载体Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，进行凝胶回收7115bp大片段，然后利用T4连接酶进行小片段和大片段连接，将W基因插入PET32a载体T7启动子下游，获得原核表达载体PET32a-CP-PD-1；
步骤40、原核表达载体PET32a-CP-PD-1转入原核表达菌株BL21（DE3）PLySs中，诱导表达，采用冷冻低温冻融，离心，纯化后，获得表达产物颗粒；
步骤50、步骤40获得表达产物颗粒进行DNase Ⅰ 消化，然后离心弃沉淀，保留上清，加入终浓度4M硫酸铵，沉淀表达产物，离心弃上清，获得沉淀即是含有PD-1基因的表达产物，最后用1×TE溶液重悬，获得含有PD-1 W基因RNA假病毒颗粒产物；
步骤60、将含有PD-1 W基因RNA假病毒颗粒产物用TE缓冲液稀释，进行VP病毒颗粒OD值测定，依据OD值换算稀释产物，获得内含PD-1基因RNA标准物质，即装甲PD-1基因的RNA标准物质。
进一步地，所述步骤10中，所述W基因可以通过体外化学合成或RT-PCR扩增获得，并连接入T载体，其中T载体含有Not Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点，所述W基因片段处于PD-1的CDS区域；所述RT-PCR扩增引物如下：
PrimerＬ：CAGTTCCAAACCCTGGTGGTT；
PrimerＲ：GGCTCCTATTGTCCCTCGTGC；
该区域可用于体外克隆出人重组PD-1蛋白，因此对于PD-1具有特异性，可用于核酸检测靶点的应用。
进一步地，所述步骤40具体如下：将原核表达载体PET32a-CP-PD-1转入原核表达菌BL21（DE3）PLySs，从中挑选出阳性克隆菌BL21（DE3）PLySs接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，进行诱导表达；最后离心，收集菌体沉淀，用TE缓冲液或PBS洗涤；再次收集沉淀完成后放入-20至-80℃冰箱中隔4-6小时取出至温室，反复3-4次，离心，向沉淀中加入含1~20mg/ml溶菌酶的缓冲液，25~37度孵育20-60min，离心弃去沉淀，获得表达产物颗粒。
进一步地，所述缓冲液为20mM Tris 、0.2M NaCl 、pH8.0。
进一步地，所述的一种装甲PD-1基因的RNA标准物质在免疫抑制因子PD-1核酸检测中作为标准物质的应用。
本发明具有如下优点：
（1）PD-1在未激活淋巴细胞中表达较少，在激活的T淋巴细胞表面上调表达。因此对于PD-1 mRNA微量检测要更灵敏。采用核酸定量PCR的方法正好解决这个难题。本发明采用PD-1重组蛋白CDS区域作为靶点序列，PD-1重组蛋白国内北京义翘神州生物技术有限公司已经上市（产品货号#: 10377-H03H）。因此该PD-1靶点可以作为PD-1核酸水平的检测。
（2）采用Armored技术进行标准物质的构建，应用噬菌体MS2衣壳蛋白包裹靶点核酸，可以有效防止RNase酶对靶点RNA的降解，对于RNA物质具有很好的保护作用，稳定性强。
（3）利用低温冻融和溶菌酶法结合破碎表达菌株细胞。在-20℃以下环境下细菌在有水分的情况下在细胞内会形成冰晶，恢复室温的过程中冰晶会破坏细菌细胞壁，使细胞破裂。同时再利用溶菌酶水解细胞壁肽聚糖链，破坏细胞壁立体空间结构，使细胞破碎更完全。如果只采用一种破碎方法或采用超声波破碎，要么破碎程度不够，要么操作时间长及步骤繁琐。而且超声波破碎易使核酸断裂。因此本发明采用低温冻融结合溶菌酶破碎方法可以有效解决上述问题。
（4）利用DNase Ⅰ对RNA标准物质进行消化，消除菌体基因组DNA对标准物质的影响。如果未对标准物质进行DNase Ⅰ消化，DNA夹杂在标准物质中，对后续的荧光PCR产生假阳性的影响。PCR过程是一个指数级扩增过程，只要几个拷贝的DNA即可产生假阳性现象。
（5）利用饱和硫酸铵对标准物质进行提纯，硫酸铵溶解度大、温度系数小且不易是蛋白质变性，用它对标准物质进行沉析。由于标准物质是由病毒衣壳蛋白包裹着，因此可以进一步去除DNA核酸的干扰。
（6）本发明的标准物质可以和样本进行同时核酸提取，采用TE缓冲液稀释模拟血液样本对核酸提取过程可以全程监控，确保检测结果的准确性。
（7）本发明标准物质只采用噬菌体MS2衣壳蛋白包裹，不含有噬菌体复制蛋白酶，因此该标准物质无传染性，无病毒特性，易于存储与运输。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为pUCm-T载体图谱。
图2为pUCm-T载体的多克隆位点的详细图谱。
图3为pET-32a载体图谱。
图4为pET-32a载体的多克隆位点的详细图谱。
图5为本发明实施例1中PD-1靶点基因逆转录PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图；1和2均为PD-1靶序列产物，M 是DL2000 Marker。
图6为本发明实施例1获取PD-1克隆测序结果比对图。
图7为本发明实施例1低温冻融裂解与未低温冻融荧光定量PCR结果比较图。
图8为本发明实施例1的PD-1标准物质荧光定量PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图；1、2和3分别是1010稀释梯度标准物质荧光定量PCR产物114bp，M是DL2000 Marker。
图9为本发明实施例2标准物质DNA污染与否荧光定量PCR检测图 。
图10为本发明实施例2标准物质荧光定量PCR稳定性检测图。
图11为本发明实施例2标准物质荧光定量PCR均一性检测图。
图12为本发明实施例3的PD-1标准物质梯度稀释检测结果图。
具体实施方式
请参阅图1~12所示，对本发明的实施例进行详细的说明。
本发明涉及一种装甲PD-1基因的RNA标准物质，所述RNA标准物质由如下步骤制得：
步骤10、获得用于PD-1核酸检测的W基因序列，如序列表中SEQ ID NO.1 所示，所述W基因为PD-1基因中的一个片段；
步骤20、获取包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的表达载体：
根据MS2噬菌体基因序列，设计一对特异性引物，所述一对特异性引物如下：
MCP1:5'- CGGGGTACCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGC-3'（如序列表中SEQ ID NO.2 所示）；
MCP2: 5'-CGGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3'（如序列表中SEQ ID NO.3 所示）；
预期扩增产物为MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因，即CP基因，并引入双酶切位点：KpnⅠ和BamHⅠ，所述CP基因序列如序列表中SEQ ID NO.４所示；分别双酶切CP基因及PET32a载体，并将CP基因连接到PET32a载体上，最终得到PET32a-CP载体；
步骤30、W基因和CP基因的表达载体的获取：
携带W基因的T载体在Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后，进行凝胶电泳后回收135bp小片段；同时进行PET32a-CP载体Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，进行凝胶回收7115bp大片段，然后利用T4连接酶进行小片段和大片段连接，将W基因插入PET32a载体T7启动子下游，获得原核表达载体PET32a-CP-PD-1；
步骤40、原核表达载体PET32a-CP-PD-1转入原核表达菌株BL21（DE3）PLySs中，诱导表达，采用冷冻低温冻融，离心，纯化后，获得表达产物颗粒；
步骤50、步骤40获得表达产物颗粒进行DNase Ⅰ 消化，然后离心弃沉淀，保留上清，加入终浓度4M硫酸铵，沉淀表达产物，离心弃上清，获得沉淀即是含有PD-1基因的表达产物，最后用1×TE溶液重悬，获得含有PD-1 W基因RNA假病毒颗粒产物；
步骤60、将含有PD-1 W基因RNA假病毒颗粒产物用TE缓冲液稀释，进行VP病毒颗粒OD值测定，依据OD值换算稀释产物，获得内含PD-1基因RNA标准物质，即装甲PD-1基因的RNA标准物质。
所述步骤10中，所述W基因可以通过体外化学合成或RT-PCR扩增获得，并连接入T载体，其中T载体含有Not Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点，所述W基因片段处于PD-1的CDS区域；所述RT-PCR扩增引物如下：
PrimerＬ：CAGTTCCAAACCCTGGTGGTT（如序列表中SEQ ID NO.5 所示）；
PrimerＲ：GGCTCCTATTGTCCCTCGTGC（如序列表中SEQ ID NO.6 所示）；
该区域可用于体外克隆出人重组PD-1蛋白，因此对于PD-1具有特异性，可用于核酸检测靶点的应用。
所述步骤40具体如下：将原核表达载体PET32a-CP-PD-1转入原核表达菌BL21（DE3）PLySs，从中挑选出阳性克隆菌BL21（DE3）PLySs接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，进行诱导表达；最后离心，收集菌体沉淀，用TE缓冲液或PBS洗涤；再次收集沉淀完成后放入-20至-80℃冰箱中隔4-6小时取出至温室，反复3-4次，离心，向沉淀中加入含1~20mg/ml溶菌酶的缓冲液，25~37度孵育20-60min，离心弃去沉淀，获得表达产物颗粒。
所述缓冲液为20mM Tris 、0.2M NaCl 、pH8.0。
本发明还涉及所述的一种装甲PD-1基因的RNA标准物质在免疫抑制因子PD-1核酸检测中作为标准物质的应用。
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
一、实施1 ：PD-1引物设计及靶序列获取与鉴定，表达载体连接
1、材料
正常人血液PBMC，T载体购于碧云天生物技术有限公司。
2、方法
（1）PD-1引物设计及靶点选择
根据GeneBank公布PD-1基因序列（GenBank: AF363458.1）选择PD-1基因的CDS区域， 利用Blast比对该靶点在GeneBank公布PD-1基因的序列，确定为人类PD-1基因。利用Oligo软件进行引物设计。靶点序列（即Ｗ基因序列）如序列表中SEQ ID NO.1 所示。
（2）获取包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的表达载体：
根据MS2噬菌体基因序列，设计一对特异性引物，所述一对特异性引物如下：
MCP1:5'- CGGGGTACCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGC-3'（如序列表中SEQ ID NO.２ 所示，33bp 下划线为KpnⅠ酶切位点）；
MCP2: 5'-CGGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3'（如序列表中SEQ ID NO.３ 所示，28bp下划线为BamH Ⅰ酶切位点）；
预期扩增产物为MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因，即CP基因，并引入双酶切位点：KpnⅠ和BamHⅠ；分别双酶切CP基因及PET32a载体，并将CP基因连接到PET32a载体上，最终得到PET32a-CP载体.
（3）靶点序列的获取及表达载体的连接
抽取正常人血液1ml，用红细胞裂解液裂解三次后2000转离心5分钟，收集白细胞沉淀，提取其RNA。RNA中加入Oligo(dT)进行42℃逆转录1h。逆转录完成后获得的产物即是cDNA。用此cDNA作为模板，利用PD-1左右引物进行靶点序列PCR扩增，所述PD-1的左右引物如下：
PrimerＬ：CAGTTCCAAACCCTGGTGGTT（如序列表中SEQ ID NO.5 所示）；
PrimerＲ：GGCTCCTATTGTCCCTCGTGC（如序列表中SEQ ID NO.6 所示）。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒进行回收。回收（114bp）片段与T载体进行连接，连接体系为小片段7µl ，T载体0.5µl，T4连接酶0.5µl，T4连接酶10×buffer 1µl；16℃水浴连接1h。进而把连接产物全部转入Top10克隆菌株。过夜培养，次日挑取单克隆，保存菌液，提取质粒送到life technologies 公司测序，将测序结果与正确靶点序列比对，确认完全正确。
对T载体进行Not Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切，同时用相同的酶对pET32a-CP载体进行酶切。电泳回收T载体135bp小片段，pET32a载体回收酶切7115bp大片段。连接体系为小片段8µl，pET32a载体0.5µl，T4连接酶0.5µl，T4连接酶10×buffer 1µl；16℃水浴连接1h，进行Top10克隆菌株转化。过夜培养，次日挑取单克隆菌株，提取质粒，送pET32a-CP-PD-1质粒到life technologies公司测序。测序确认完全正确。
pUCm-T载体(pUCm-T Vector)是用于克隆含有A末端PCR产物的理想载体。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。重点参阅图1和图2，图1为pUCm-T载体图谱，图2为pUCm-T载体的多克隆位点的详细图谱。其中，PCR Products 位置为W基因连接位置，Not Ⅰ 和BamH Ⅰ为连接pET-32a酶切位点。
pET32系列载体是设计用来克隆构建和高水平融合表达表达带有109个氨基酸Trx标签的蛋白质序列。将基因插入到载体的多克隆位点，能够获得融合表达蛋白质。同时融合蛋白包含有His标签和S标签，这些可以用于蛋白表达检测和纯化过程。载体的多克隆位点见下面的图谱图3和图4。需要注意的是图谱中的核苷酸编码顺序是以pBR322载体的复制方向为正方向，所以T7表达区域在图谱中是处于反向的位置。T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。图3为pET-32a载体图谱，图4为pET-32a载体的多克隆位点的详细图谱。其中，CP基因连接入Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点，Not Ⅰ和BamH ⅠⅠ酶切位点插入连接插入T载体上的W基因。
（4）PD-1 RNA片段装甲颗粒表达
将pET32a-CP-PD-1质粒转化到BL21（DE3）pLysS表达菌中。挑取氨苄青霉素平板上BL21（DE3）pLysS阳性单克隆菌，转接到2ml加有氨苄青霉素的LB培养基中，250rpm，37℃过夜培养。
次日，将2ml菌液转接到200ml LB培养基中，250rpm ，37℃培养2-3h，其中在无菌超净台取样测定OD值，当OD值≈0.5时，加入终浓度1mmol/L的异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）。继续诱导培养6h，离心收集菌体。
（5）菌体破裂及装甲颗粒纯化
离心下来的菌体用TE缓冲液或PBS洗涤一次。收集沉淀完成后放入-20度冰箱中隔4-6小时取出至温室，反复3-4次。离心，向沉淀中加入5mg/ml溶菌酶（缓冲液为20mM Tris 、0.2M NaCl pH8.0）500μl。37度孵育45-60min。离心弃去沉淀，获得表达产物颗粒。
然后用DNase Ⅰ进行消化，弃去沉淀，上清加入终浓度4M硫酸铵，沉淀表达产物。离心弃上清，获得沉淀既是装甲PD-1基因的RNA假病毒颗粒。最后用1×TE溶液重悬，获得装甲PD-1 基因RNA假病毒颗粒产物。
（6）PD-1假颗粒病毒荧光定量PCR鉴定
上述获得的装甲PD-1 基因RNA假病毒颗粒产物先进行1000倍稀释，以此作为母液再进行10倍稀释，分别稀释成1010，109，108，107，106，利用EastepTMUniversal RNA Extraction Kit，GoScript™ Reverse Transcription System和GoTag®qPCR Master Mix(均为Promega公司产品)进行RNA提取，cDNA合成及qPCR定量。PCR产物同时进行琼脂糖凝胶电泳检测。
3、结果
（1）PD-1靶点序列的获取
依据GeneBank PD-1基因序列比对，选取PD-1特异的CDS区片段作为包装。以PL和PR作为左右引物进行PCR扩增，获取靶点序列（W基因序列），琼脂糖电泳在114bp处可以看见有特异性目的条带如图5，且经Life Technologies 公司测序与靶点序列比对完全正确，如图6所示。
（2）PD-1克隆载体和表达载体的构建
将测序正确的靶点序列与T克隆载体连接，连接完成后利用T载体上的Not Ⅰ和BamH Ⅰ把靶点序列酶切下来，与同样Not Ⅰ和BamH Ⅰ酶切的pET32a-CP载体进行连接，转化，挑取LB氨苄青霉素抗性板上阳性克隆菌株。提取质粒利用T7 Terminator引物测序，序列与靶点序列完全一致即证明表达载体构建成功。
（3）装甲PD-1的RNA病毒颗粒的鉴定
将装甲PD-1 W基因的RNA病毒颗粒利用EastepTM通用型总RNA提取试剂盒提取RNA，同时提取未经低温冻融法裂解的菌体纯化颗粒。结果显示未经低温冻融而直接采用单一溶菌酶裂解进行病毒样颗粒纯化，在qPCR时比采用低温冻融法纯化荧光曲线更靠前。如图7所示，图7中各曲线表示如下：1、2、3为低温冻融后纯化的样品荧光定量曲线，4、5、6为未低温冻融纯化样品荧光定量曲线 。PCR产物经琼脂糖电泳，在114bp处有预期的目的条带如图8所示。回收测序验证与靶序列完全一致，说明采用此方法制备的PD-1荧光定量标准物质能够检测PD-1核酸。
二、实施例2：装甲PD-1基因标准物质的制备
1、装甲PD-1基因的RNA标准物质颗粒定量定值
将实施例1获取的假病毒颗粒，利用紫外分光光度计测定260nm处OD值检测核酸吸收值确定核酸含量，进行1012， 1011，1010倍浓度稀释进行RNA提取。进行一组不经过反转录直接进行PCR 反应；另一组样本反转录后，再进行PCR 扩增，电泳检测扩增结果。样本稀释后，其中一组不经过反转录直接进行PCR 反应，检测结果均为阴性，表明制备病毒样颗粒悬浮液中和病毒样颗粒内，均没有DNA 模板污染；另一组样本反转录后，再进行PCR 扩增，检测结果为阳性，表明PD-1基因片段（即W基因）已经重组于病毒样颗粒中，而且模板以RNA 形式存在。如图9所示：图9中各曲线表示如下：1、为4℃ 10d条件荧光曲线、2为37℃ 20d荧光曲线、3为4℃ 30d荧光曲线、4为37℃ 10d荧光曲线、5为4℃ 20天荧光曲线、6为37℃ 30d荧光曲线。
当病毒样颗粒含有DNA杂质时，不经过反转录PCR就可以出现荧光曲线，如果没有DNA污染时图9中4,5,6曲线出现在阴性位置，或者在38以后有曲线出现，如果有DNA污染时4,5,6，曲线会在38个循环之前就出会出现类似“S”型曲线。另外也说明直接将病毒样颗粒PCR不会出现阳性结果，说明病毒样颗粒包裹着不是DNA物质，只有经过反转录后如图中1,2,3曲线一样才有荧光曲线出现，这就说明重组病毒样颗粒中包裹的核酸是以RNA形式存在。
2、装甲PD-1基因的RNA标准物质颗粒稳定性试验
将装甲PD-1基因的RNA标准物质稀释108梯度的样本，放置4℃和37℃环境中放置10、20、30天，然后进行RNA提取，逆转录和荧光定量PCR检测，比较荧光曲线Ct值，检测结果如图10，图10中各曲线表示如下：1、为4℃ 10d条件荧光曲线、2为37℃ 20d荧光曲线、3为4℃ 30d荧光曲线、4为37℃ 10d荧光曲线、5为4℃ 20天荧光曲线、6为37℃ 30d荧光曲线。结果显示经过不同存储温度和时间条件下，病毒样颗粒Ct值没有明显的变化，而且结果证明在室温下至少可存在30天且不影响实验结果。将实验结果获得的Ct值进行单因子方差分析进行统计处理，其变异系数为1%，小于5%说明该物质具有很好的稳定性。
3、装甲PD-1基因的RNA标准物质颗粒均一性试验
将标准物质稀释1011梯度，随机抽取五只100ul的标准物质，进行RNA提取，cDNA的转录和荧光定量检测结果显示五只标准物质均在28Ct值附近，采用单因子方差分析进行统计处理，其变异系数为1.5%，小于5%。证明该标准物质具有均一性。结果如图11显示，图11中各曲线表示如下：1、2、3、4、5均为1011假病毒颗粒检验颗粒均一性荧光定量图。
三、实施例3：装甲PD-1基因的RNA标准物质稀释梯度标准品的制备
1、标准物质稀释梯度的建立及鉴定
将实施例1获取的标准物质经紫外风光光度计测定，依据OD值换算出标准物质假病毒颗粒数值，测定出初始浓度病毒颗粒为1013次方，用TE缓冲液进行10倍稀释梯度，分别制备1012、1011、1010、109、108稀释梯度，分别进行RNA提取，逆转录和荧光定量PCR进行梯度检测。采用线性回归方式分析标准曲线，其R值>0.99。荧光结果如图12显示，图12中各曲线表示如下：1为1012假病毒颗粒，2为1011假病毒颗粒，3为1010假病毒颗粒，4为109假病毒颗粒，5为108假病毒颗粒，6为阴性对照，7为假阳性对照。证明利用该标准物质的标准曲线线性回归方程可用于定量分析。
除表达载体pET32a-CP载体是本公司保存在外，本专利所述其余产品均能以常规方式购买或所配置溶液试剂等均可通过常规商业模式获得。
综上可知，本发明具有如下优点：
（1）PD-1在未激活淋巴细胞中表达较少，在激活的T淋巴细胞表面上调表达。因此对于PD-1 mRNA微量检测要更灵敏。采用核酸定量PCR的方法正好解决这个难题。本发明采用PD-1重组蛋白CDS区域作为靶点序列，PD-1重组蛋白国内北京义翘神州生物技术有限公司已经上市（产品货号#: 10377-H03H）。因此该PD-1靶点可以作为PD-1核酸水平的检测。
（2）采用Armored技术进行标准物质的构建，应用噬菌体MS2衣壳蛋白包裹靶点核酸，可以有效防止RNase酶对靶点RNA的降解，对于RNA物质具有很好的保护作用，稳定性强。
（3）利用低温冻融和溶菌酶法结合破碎表达菌株细胞。在-20℃以下环境下细菌在有水分的情况下在细胞内会形成冰晶，恢复室温的过程中冰晶会破坏细菌细胞壁，使细胞破裂。同时再利用溶菌酶水解细胞壁肽聚糖链，破坏细胞壁立体空间结构，使细胞破碎更完全。如果只采用一种破碎方法或采用超声波破碎，要么破碎程度不够，要么操作时间长及步骤繁琐。而且超声波破碎易使核酸断裂。因此本发明采用低温冻融结合溶菌酶破碎方法可以有效解决上述问题。
（4）利用DNase Ⅰ对RNA标准物质进行消化，消除菌体基因组DNA对标准物质的影响。如果未对标准物质进行DNase Ⅰ消化，DNA夹杂在标准物质中，对后续的荧光PCR产生假阳性的影响。PCR过程是一个指数级扩增过程，只要几个拷贝的DNA即可产生假阳性现象。
（5）利用饱和硫酸铵对标准物质进行提纯，硫酸铵溶解度大、温度系数小且不易是蛋白质变性，用它对标准物质进行沉析。由于标准物质是由病毒衣壳蛋白包裹着，因此可以进一步去除DNA核酸的干扰。
（6）本发明的标准物质可以和样本进行同时核酸提取，采用TE缓冲液稀释模拟血液样本对核酸提取过程可以全程监控，确保检测结果的准确性。
（7）本发明标准物质只采用噬菌体MS2衣壳蛋白包裹，不含有噬菌体复制蛋白酶，因此该标准物质无传染性，无病毒特性，易于存储与运输。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
<110> 安特诺生物医药（厦门）有限公司
<120> 一种装甲PD-1基因的RNA标准物质及其应用
<130> 100
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cagttccaaa ccctggtggt tggtgtcgtg ggcggcctgc tgggcagcct ggtgctgcta 60
gtctgggtcc tggccgtcat ctgctcccgg gccgcacgag ggacaatagg agcc 114
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggggtaccc taggaggttt gacctgtgcg agc 33
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgggatccgt tagtagatgc cggagttt 28
<210> 4
<211> 1615
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctaggaggtt tgacctgtgc gagcttttag tacccttgac agggagaacg agaccttcgt 60
cccctccgtt cgcgtttacg cggacggtga gactgaagat aactcattct ctttaaaata 120
tcgttcgaac tggactcccg gtcgttttaa ctcgactggg gccaaaacga aacagtggca 180
ctacccctct ccgtattcac ggggggcgtt aagtgtcacg tcgatagatc aaggtgccta 240
caagcgaagt gggtcatcgt ggggtcgccc gtacgaggag aaagccggtt tcggcttctc 300
cctcgacgca cgctcctgct acagcctctt ccctgtaagc caaaacttga ctcacatcga 360
agtgccgcag aacgttgcga accgggcgtc gaccgaagtc ctgcaaaagg tcacccaggg 420
tgattttaac cttggtgttg ctttagcaga ggccaggtcg acagcctcac aactcgcgac 480
gcaaaccatt gcgctcgtga aggcgtacac tgccgctcgt cgcggtaatt ggcgccaggc 540
gctccgctac cttgccctaa acgaagatcg aaagtttcga tcaaaacacg tggccggcag 600
gtggttggag ttgcagttcg gttggttacc actaatgagt gatatccagg gtgcatatga 660
gatgcttacg aaggttcacc ttcaagagtt tcttcctatg agagccgtac gtcaggtcgg 720
tactaacatc aggttagatg gccgtctgcc gtatccagct gcaaacttcc agacaacgtg 780
taacatatcg cgacgtatcg tgatatggtt ttacataaac gatgcacgtt tggcatggtt 840
gtcgtctcta ggtatcttga acccactagg tatagtgtgg gaaaaggtgc ctttctcatt 900
cgttgtcgac tggctcctac ctgtaggtaa catgctcgag ggccttacgg cccccgtggg 960
atgctcctac atgtcaggaa cagttactga cgtaataacg ggtgagtcca ttgtaagcgt 1020
tgacgctccc tacgggtgga ctgtggagag acagggcact gctaaggccc agatctcagc 1080
catgcatcga ggggtacaat ccgtatggcc aacaactggc gcgtacgtaa agtctccttt 1140
ctcgatggtc cataccttag atgcgttagc attaatcagg caacggctct ctagatagag 1200
ccctcaaccg gagtctgaag cgtggcttct aactttactc agttcgttct cgtcgacaat 1260
ggcggaactg gcgacgtgac tgtcgcccca agcaacttcg ctaacggggt cgctgaatgg 1320
atcagctcta actcgcgttc acaggcttac aaagtaacct gtagcgttcg tcagagctct 1380
gcgcagaatc gcaaatacac catcaaagtc gaggtgccta aagtggcaac ccagactgtt 1440
ggtggtgtag agcttcctgt agccgcatgg cgttcgtact taaatctgga actaaccatt 1500
ccaattttcg ccacgaattc cgactgcgag cttattgtta aggcaatgca aggtctccta 1560
aaagatggaa acccgattcc ctcagcaatc gcagcaaact ccggcatcta ctaat 1615
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagttccaaa ccctggtggtt 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggctcctatt gtccctcgtgc 21

Claims (5)

1.一种装甲PD-1基因的RNA标准物质，其特征在于：所述RNA标准物质由如下步骤制得：
步骤10、获得用于PD-1核酸检测的W基因序列，如序列表中SEQ ID NO.1 所示，所述W基因为PD-1基因中的一个片段；
步骤20、获取包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的表达载体：
根据MS2噬菌体基因序列，设计一对特异性引物，所述一对特异性引物如下：MCP1:5'- CGGGGTACCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGC-3'； MCP2: 5'-CGGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3'；预期扩增产物为MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因，即CP基因，并引入双酶切位点：KpnⅠ和BamHⅠ，所述CP基因序列如序列表中SEQ ID NO.４所示；分别双酶切CP基因及PET32a载体，并将CP基因连接到PET32a载体上，最终得到PET32a-CP载体；
步骤30、W基因和CP基因的表达载体的获取：
携带W基因的T载体在Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后，进行凝胶电泳后回收135bp小片段；同时进行PET32a-CP载体Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，进行凝胶回收7115bp大片段，然后利用T4连接酶进行小片段和大片段连接，将W基因插入PET32a载体T7启动子下游，获得原核表达载体PET32a-CP-PD-1；
步骤40、原核表达载体PET32a-CP-PD-1转入原核表达菌株BL21（DE3）PLySs中，诱导表达，采用冷冻低温冻融，离心，纯化后，获得表达产物颗粒；
步骤50、步骤40获得表达产物颗粒进行DNase Ⅰ 消化，然后离心弃沉淀，保留上清，加入终浓度4M硫酸铵，沉淀表达产物，离心弃上清，获得沉淀即是含有PD-1基因的表达产物，最后用1×TE溶液重悬，获得含有PD-1 W基因RNA假病毒颗粒产物；
步骤60、将含有PD-1 W基因RNA假病毒颗粒产物用TE缓冲液稀释，进行VP病毒颗粒OD值测定，依据OD值换算稀释产物，获得内含PD-1基因RNA标准物质，即装甲PD-1基因的RNA标准物质。
2.根据权利要求1所述的一种装甲PD-1基因的RNA标准物质，其特征在于：所述步骤10中，所述W基因可以通过体外化学合成或RT-PCR扩增获得，并连接入T载体，其中T载体含有Not Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点，所述W基因片段处于PD-1的CDS区域；所述RT-PCR扩增引物如下：
PrimerＬ：CAGTTCCAAACCCTGGTGGTT；
PrimerＲ：GGCTCCTATTGTCCCTCGTGC。
3.根据权利要求1所述的一种装甲PD-1基因的RNA标准物质，其特征在于：所述步骤40具体如下：将原核表达载体PET32a-CP-PD-1转入原核表达菌BL21（DE3）PLySs，从中挑选出阳性克隆菌BL21（DE3）PLySs接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，进行诱导表达；最后离心，收集菌体沉淀，用TE缓冲液或PBS洗涤；再次收集沉淀完成后放入-20至-80℃冰箱中隔4-6小时取出至温室，反复3-4次，离心，向沉淀中加入含1~20mg/ml溶菌酶的缓冲液，25~37度孵育20-60min，离心弃去沉淀，获得表达产物颗粒。
4.根据权利要求3所述的一种装甲PD-1基因的RNA标准物质，其特征在于：所述缓冲液为20mM Tris 、0.2M NaCl 、pH8.0。
5.权利要求1~4任一项所述的一种装甲PD-1基因的RNA标准物质在免疫抑制因子PD-1核酸检测中作为标准物质的应用。
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