CN1492040A

CN1492040A - 单克隆人天然抗体

Info

Publication number: CN1492040A
Application number: CNA011407913A
Authority: CN
Inventors: Tc; T·C·罗德曼
Original assignee: Institute for Human Genetics and Biochemistry
Current assignee: Institute for Human Genetics and Biochemistry
Priority date: 1997-11-24
Filing date: 1998-11-24
Publication date: 2004-04-28
Also published as: US6610833B1; CN1285754A; CN1216641C; US20030144486A1; US7122638B2; KR20010032436A; WO1999026656A1; EP1032421A1; IL136335A0; IL136335A; AU1704099A; US7189826B2; JP2002508152A; EP1032421A4; US20030144485A1; CA2310888A1; CA2310888C

Abstract

在这里公开的是产生单克隆人天然IgM抗体的杂交瘤细胞系及其使用方法。该抗体是循环人天然抗体的单克隆等价物。在这里同样公开了药物制剂以及使用单克隆人天然抗体治疗感染HIV－1的病人的方法。

Description

单克隆人天然抗体

发明背景

免疫系统的效应分子包括一组并非由外来抗原诱导的循环免疫球蛋白，可不同地称为“自身抗体”或“天然抗体”。长期以来人们已认识到这种抗体的存在，并将其多种推测功能归类为“自身攻击”或“自身受益”。对于前者，将引起对自身免疫的忧惧，并且习惯上使用术语“自身抗体”。对于后者，命名为“天然抗体”，暗含维持稳态之意。

1994年7月5日提出的美国专利No.08/271,210公开了一种可与人鱼精蛋白上存在的精氨酸富含表位产生免疫反应的循环人天然抗体。1997年2月25日授权的美国专利No.5,606,026公开了在HIV-1的Tat蛋白中具有精氨酸富含表位，并公开了另一种可与HIV-1的Tat蛋白中又一不同表位产生免疫反应的循环人天然抗体。此外，其中还公开了第三种循环的人天然抗体，其可与人乳铁蛋白中存在的一个隐蔽表位产生免疫反应。

已有显示，当病人感染HIV并发展成艾滋病(AIDS)时，上述三种循环的人天然抗体减少并达到最低水平。这些抗体可在任何年龄组的正常人血清中发现，从胎儿脐带血到成年人血清，正是凭借它们普遍存在的特性所以把它们鉴定为天然抗体。

因此，为了在治疗和诊断方面的应用，本领域急需获得这些循环的人天然抗体的单克隆等同物。

发明概述

本发明提供了人天然抗体的单克隆形式。

一方面，本发明提供了杂交瘤细胞系RWL-1(ATCC CRL12431)，一种由EB病毒转化的脐带血细胞和小鼠：人杂合骨髓瘤细胞HMMA融合的产物。

另一方面，本发明提供了由RWL-1细胞生产的单克隆人IgM抗体。

还有另一方面，本发明提供了另一种杂交瘤细胞系RWT-4(ATCC CRL 12472)，一种由EB病毒转化的脐带血细胞和小鼠：人杂合骨髓瘤细胞SHM-D33(ATCC CRL 1668)融合的产物。

还有另一方面，本发明提供了由RWT-4细胞生产的单克隆人IgM抗体。

更进一步，本发明提供了杂交瘤细胞系RWT-12(ATCC CRL12427)，一种由EB病毒转化的人脐带血细胞和小鼠：人杂合骨髓瘤细胞HMMA融合的产物。

更进一步，本发明提供了由RWT-4细胞生产的单克隆人IgM抗体。

更进一步，本发明提供了一种治疗患有由HIV-1引起的感染的病人的方法，此方法包括为治疗上述感染给需要这种治疗的病人施用有效剂量的单克隆抗体，该抗体选自由RWT-4细胞生产的单克隆抗体、RWT-12细胞生产的单克隆抗体，及其混合物。

更进一步，本发明提供了一种增加由HIV-1引起感染的病人的CD₄+T细胞的方法，该方法包括为增加CD₄+T细胞施用一定剂量的抗体，该抗体是由保藏号为ATCC CRL 12472和ATCC CRL 12477的杂交瘤细胞生产的及其混合物。

在进一步的实施方案中，本发明提供了一种药物制剂，其包含选自由保藏号为ATCC CRL 12427和ATCC CRL 12477的杂交瘤细胞生产的单克隆抗体中的分离的人IgM单克隆抗体及其混合物，以及药学可接受的载体。

按照本说明书、权利要求书以及附图，本发明以上及其它方面内容对于本领域普通技术人员将是显而易见的。

附图简述

图1(A-C)是溴化氰(CNBr)裂解乳铁蛋白(LF)和SP80的SDS-PAGE。

A.蛋白质染色。1分子量标记物；2 LF(M)；3碱性PS80；4酸性SP80。所有三种蛋白质(2，3，4)显示了相同的裂解片段1～8。

B.利用SP80(酸性和碱性)免疫的兔血清作免疫转印(immunotransfer)显示，反应位点的多样性以及LF(M)与SP80在反应性上的同源性。

C.利用正常人男性血清作免疫转印显示，该血清仅与三种蛋白质中每一种的片段7发生反应。

图2(A-C)是Tricine的SDS-PAGE。

A.蛋白质染色。1分子量标记物。2 LF(M)；3 SP80(酸性和碱性)。解析的片段7显示出2条不同的带。

B.利用正常人男性血清作免疫转印显示出其反应性特异定位于片段7B。

C.来自人B细胞衍生的杂交瘤之单克隆抗体(Mab)IgM与片段7B的免疫反应性。

图3(A和B)通过FITC标记的抗-人IgM在原位显示一种人精子头部成分与(A)人血清；(B)可同LF片段7B反应的Mab的免疫反应性。

图4(A-C)通过ELISA显示1∶100稀释的5名男性与5名女性的血清和Mab与A、B、C三种物质的反应性。(A)10μg/ml精子衣壳蛋白质释放的成分，伴随诱导游动精子悬液中的顶体反应；(B)10μg/ml纯化的LF(M)片段7B；(C)10μg/ml天然LF(M)(未变性)。A和B的相关反应性表明血清抗体和Mab是与特定成分反应的，并非精子衣壳成分整体。与天然LF(C)不具反应性证实，血清中天然抗体和Mab是与LF在天然状态下并不显露的位点反应。

图5、代表HIV-1的Tat蛋白之12氨基酸肽的序列。肽1～7和9～12显示有5个残基重叠。包括了肽8在内是为提供了精氨酸分布的另一种变体，以确定人血清中可归因于Tat精氨酸富含区的最大反应性。事实上，用肽8显示了抗体与精氨酸富含区(肽7、8、9)反应的最大滴度。用肽4显示了抗体与半胱氨酸富含区(肽4、5)反应的最大滴度。

图6(A和B)

A.IgM

B.IgG

HIV+和HIV-(正常)两组各70份人血清与HIV Tat蛋白反应性的分析。HIV+组血清是从1994年以前采集血清中调集的，因此其特征不会归因于从那时起抗-HIV药物的使用。每一检验板都同时包含HIV+和HIV-标本以及单份正常血清(ST)。每份血清记录的滴度(X)代表X/ST。

滴度以10为间距分组，使得每组血清份数分配于每一间距。HIV+血清的IgM和IgG滴度的分布偏向较低值的间距中，特别是IgM的滴度分布。

图7(A和B)HIV+和HIV-(正常)两组各70份人血清中与肽8(图5)反应的IgM(A)和IgG(B)的滴度分布。在HIV+血清中低滴度或无滴度的IgM和IgG占较大比重，这一点对IgG尤为显著，由此表明与Tat精氨酸富含序列反应的天然抗体的耗尽和HIV的病理进程是相关的。

图8(A和B)HIV+和HIV-(正常)两组各70份人血清中与肽4(图5)反应的IgM(A)和IgG(B)的滴度分布，与HIV+血清中总的Tat反应性抗体滴度较低的整体趋势相一致，但不如与肽8反应性抗体滴度表明的趋势那样严格(图11)。

图9(A和B)

A.CD₄+T细胞计数。

B.系列标本的与Tat蛋白、肽4和肽8(图5)之IgM反应性的滴度，该系列标本来自一位HIV+的男性患者，他诊断为艾滋病后经历五年时间直至死亡。用于CD₄+T细胞计数的每份标本与用于血清分析的每份标本同时获得。CD₄+T细胞数目减少与天然抗体滴度下降二者之间的关系在肽8反应性抗体的滴度中显示特别明显，从而支持了归因于Tat的天然抗体下降可以允许T细胞凋亡的假设。

图10(A和B)

A.CD₄+T细胞计数。

B.系列血清标本中的与Tat蛋白、肽4和肽8(图5)反应的IgM抗体滴度，系列标本的收集经历9年时间，来自一位HIV+的男性患者，据估计他的感染时间超过11年，但并未显示HIV相关病理，也没有进行抗-HIV的治疗。用于血清分析的每份标本与用于CD₄+T细胞计数的每份标本同时获得。天然抗体的滴度和滴度维持的模式与CD₄+T细胞数目在正常范围内的维持具有相关性。

图11(A和B)

A.CD₄+T细胞计数。

B.一位HIV+的男性患者一系列血清标本中与Tat蛋白、肽4和肽8(图5)反应的IgM的滴度。伴随着记录CD₄+T细胞数目显著下降的标本4的报告，开始进行抗-HIV的治疗。治疗6个月之后标本5中CD₄+T细胞数目显著增长，并且与肽8反应的IgM滴度经历了一个超乎寻常的高水平增长。后续的标本表明CD₄+T细胞数目和天然抗体滴度的维持，伴随总体良好的临床状况。

发明详述

在这里引用所有专利、专利申请和参考文献均由此完整引用作为参考。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种可与人乳铁蛋白上存在的一个隐蔽表位产生免疫反应的人天然IgM抗体的单克隆形式。这种抗体是由杂交瘤RWL-1生产，该杂交瘤于1997年11月14日保藏于美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，保藏号ATCC CRL-12431。该杂交瘤如下面实施例1描述，由融合通过EB病毒转化的人脐带血细胞与小鼠：人杂合骨髓瘤细胞的方式产生。该杂交瘤生产IgM同型(isotype)的人单克隆抗体。抗体生产细胞(人脐带血细胞)是新生儿来源的并且抗体是IgM的同型抗体(因而并不穿越胎盘)，这一事实证明此抗体确实为天然抗体。

与乳铁蛋白有免疫反应的IgM抗体已显示存在于一大群正常人血清中，而且它并没有明显的致病作用或与致病有联系，因此其特征可鉴定为天然抗体。这种天然抗体的反应位点从前已有显示(3)，并经此处证实存在于人精子头部的浆膜复合物中。为建立其反应位点的分子鉴定而设计的这些研究证实，精浆中存在约72.6kD蛋白质(2)(这里精确测定为80kD)，其同样存在于精子头部的蛋白质衣壳，并且80kD蛋白质与乳铁蛋白同源，事实上就是乳铁蛋白。这里表明，与所关注的天然抗体特异反应的乳铁蛋白质其构型并非体液中普遍存在的乳铁蛋白的构型。那种构型以及天然抗体的反应性，在体外(图2，4)通过变性天然循环乳铁蛋白揭示，而在体内(图3)揭示存在于人精子头部蛋白质衣壳中掺入的乳铁蛋白之构型与天然抗体的反应性。乳铁蛋白以天然构型存在于精浆中，而当它储存于精子膜/衣壳复合物时，便以某种尚未证明的机制采取了抗体可识别的形式。转变为这种形式并储存在精子表面衣壳中，这一过程可假设发生在睾丸输精管中精子形成的成熟期。因此，与此相关我们注意到，如免疫球蛋白特别是IgM这样的大分子被排斥在输精管腔之外(24)，因而阻止了精子形成时IgM与精子成分发生免疫反应。然而这一屏障并不存在于具有全套可循环抗体的女性生殖道中(23)。因此，这里存在可与LF反应的天然抗体，从而在射精至女性生殖道后可与精子衣壳中的LF发生免疫反应。二者的相互作用可如图3显示在精子衣壳原位发生，并且明确地伴随LF以及其它衣壳和浆膜成分的释放发生(图4)，此时精子依次经历获能和顶体反应；从而为精子穿过卵细胞周围透明带随后进入卵细胞提供了便利(9，10)。既然顶体反应涉及顶体膜与浆膜的融合，盖在上面的蛋白质衣壳成分被解体。因而，要不是受精环境中存在天然抗体能够免疫学消除LF通过卵细胞膜胞吞，进而与配子或原核DNA相互作用的能力，释放的LF可能早已进入卵浆中。

在为LF定义的多种功能和相互作用中，被胞吞并与DNA相互作用的能力越来越引起人们兴趣(7，8，27-29)。特别有趣的是最近报道，LF和DNA的相互作用由序列特异性加以表明(7)。该特异性的分子基础尚未明确，但有理由预计，如果在体内存在LF/DNA相互作用，其是在一明确的操纵体系中发生的。同样符合逻辑地假设，这一体系存在于体细胞有组织的染色体成分中，但不存在于新生的未分化的原核成分中。因而据此上下文，在LF和DNA相互作用中假想的序列特异性的控制可能无法操作。天然抗体选择性地与存在于精子衣壳中(而非普遍的可循环形式)的特定构型之LF反应，可能代表一种幸运的自然选择机制，该机制有两个基础：(1)抑制LF与受精卵的DNA元件相互作用；(2)限制循环天然抗体与在其它部位更普遍的行使重要功能形式的LF发生免疫反应。既然用来提供了本研究重要数据之分泌Mab的杂交瘤来源于人脐带血B细胞，那么可证实天然抗体是与生俱来的。

正如下面实施例2显示，抗体与人体乳铁蛋白上存在的一个表位发生免疫反应，特别是存在于人精子头部蛋白质衣壳中的这种形式的乳铁蛋白。乳铁蛋白是一种存在于精子头部的80kD糖蛋白。伴随受精时诱导的顶体反应，乳铁蛋白(已有显示可与DNA结合并相互作用)能够有效地干扰精子与卵细胞DNA的相互作用。因此本发明抗体的一个用途就是作为体外受精反应的添加物，以防止乳铁蛋白在受精前与精子DNA相互作用。

另外，在本发明的优选实施方案中，提供了可产生与HIV-1 Tab蛋白发生免疫反应的单克隆IgM抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞系RWT-4和RWT-12分别与图5中的肽4和肽8发生免疫反应。以RWL-1为例的这些杂交瘤细胞，通过EBV转化的人脐带血细胞与小鼠：人杂合骨髓瘤细胞融合获得。RWT-4细胞于1998年2月12日保藏于ATCC并获得保藏号No.ATCC CRL 12472，RWT-12细胞于1998年2月25日由ATCC保藏，并获得保藏号No.ATCC CRL 12477。在下面实施例3中显示了每种抗体的表位特异性。

由杂交瘤RWL-1(ATCC CRL 12341)、RWT-4(ATCC CRL 12472)和RWT-12(ATCC CRL 12427)生产的单克隆IgM抗体可以从生产抗体的细胞培养液中分离，并采用本领域具有常规技能的技术人员周知的技术进行纯化，例如硫酸铵沉淀、HPLC(高效液相层析)、柱层析等纯化方法。

本发明的抗体是循环IgM抗体的单克隆等价物，包括在科学(Science)228：1211，1985年鉴定的循环IgM抗体(RWL-1细胞)、和1997年2月20日授权的美国专利No.5,606,026描述的循环IgM抗体(RWT-4和RWT-12细胞)。这些循环抗体在HIV感染个体中缺乏，并且随艾滋病发展而减少。因此。由ATCC CRL 12341、ATCCCRL 12477和ATCC CRL 12472生产的单克隆抗体可以用作预测AIDS发病实验中的阳性对照。

在本发明另一优选的实施方案中，一种治疗患有HIV-1引起的感染的病人的方法，包括给病人施用有效量的治疗HIV-1的天然人IgM抗体，该抗体选自RWT-4细胞生产的抗体、RWT-12细胞生产的抗体，及其混合物。可以想象，给感染HIV-1和患AIDS的病人补充他们所缺乏的天然抗体将对他们具有较好的临床意义。

如下面实施例5显示，HIV-1的Tat蛋白在人体并不刺激诱导产生抗体(见实施例5表1)。这一观察与另一事实相联系：长期生存者(LTS)/长期不发病者(LTNP)这样的病人虽然HIV-1阳性，却不表现任何病症也不发展为AIDS，他们具有与本发明杂交瘤生产的IgM抗体相等的正常水平的循环天然抗体。这就证明施用本发明的单克隆抗体作为治疗疾病的一种疗法的实用性。由于HIV-1的Tat蛋白在建立和维持感染中具有重要的作用，并且该蛋白在人体并不表现免疫原性，因此给感染病人施用本发明的单克隆抗体是一种导入特异性抗Tat蛋白质抗体的方法。

图9、10和11的数据清楚地确立了HIV+人群中CD₄+T细胞数目与两种可与HIV Tat蛋白反应的IgM天然抗体滴度的相关性，特别是与肽4、肽8所示的蛋白质序列反应的IgM天然抗体的滴度(图10)。尤其是与代表Tat蛋白精氨酸富含序列的肽8反应的抗体更鲜明地显示了这种联系。

图9，10和11每幅各展示了相关的独特例子。图9显示一位诊断为AIDS的死亡前5年的HIV+男性病人的临床报告：CD₄+T细胞计数和一系列相关血清标本的抗体检验数据。图10显示来自一位HIV+男性患者标本的相关资料，他的感染时间估计超过11年，但他既没表现出HIV相关病理也没进行抗-HIV的治疗。图11显示来自一位HIV+男性患者标本的数据，表明伴随抗-HIV药物治疗的建立，CD₄+T细胞数目和Tat反应性抗体(尤其是与肽8反应的抗体)的滴度都升高至正常范围内的水平。

既然目前市售的多种静脉内注射用IgG(IVIG)制剂已经检测并证实用于非肠道施用(例如Sandoz Pharmaceuticals或Cutter Biological)，那么本发明的单克隆IgM抗体的施用可以使用一种IVIG制剂作为载体。这些制剂证明对人体非肠道施用是安全的。

一般来说，施用的药物剂量当然将依赖如受药者的年龄、健康状况和体重、当前治疗的类型、治疗的频率等已知因素的不同而不同。通常，活性成分的剂量为大约每千克体重约0.001至约10毫克。针对每个病人的精确剂量、施药频率和治疗时间跨度应该通过对CD₄+T细胞数目升高和其他临床病情减轻指标的测定进行监控。

而在另一优选的实施方案中，提供了一种增加病人CD₄+T细胞数目的方法，其包括为增加CD₄+T细胞数给需要这种治疗的病人施用有效量的抗体，该抗体选自杂交瘤ATCC CRL 124673、ATCC CRL 12477生产的抗体，及其混合物。有效量与上述的有效量相同。

对于非肠道施用，本发明的抗体可以配成药物制剂或作为溶液、悬液、乳浊液或结合一种药学可接受的非肠道载体的冻干粉的剂量形式。这种载体的例子有水、盐溶液、Ringer’s溶液、葡萄糖和5％人血清白蛋白。此外，如上所述的商品化的IVIG制剂可以用作递送本发明多种抗体的载体。

本发明的药物制剂不必构成本发明抗体的有效剂量，因为这一剂量可以通过施用较大量的此制剂获得。

本发明在以下具体的实施例中不意在限定范围地进一步描述。

实施例1

分泌与人乳铁蛋白限定的隐蔽序列反应的单克隆人IgM抗体的杂交瘤RWL-1，是通过人脐带血B细胞与一种人/小鼠杂合骨髓瘤细胞系HMMA融合而创建的(Posner MR，Ellorim H，Santos D.(1987).杂交瘤(Hybridoma)6：611)，如下阐述。

脐带血获自剖腹产的一个正常(但并未鉴定)新生儿，单核细胞用Ficoll-Paque(Pharmacia)进行密度梯度离心分离。收集的细胞用RPMI-1640培养基(Sigma)清洗，加入含EB病毒(从ATCC CRL 1612细胞培养物中获得)培养物的RPMI-1640培养基中，37℃温育2小时。细胞离心下来后重悬在RPMI 1640培养基中，培养基中补充了胎牛血清(FCS)、环孢菌素A、青霉素/链霉素(每毫升10单位青霉素/100mg链霉素)，铺于96孔板(每孔30个细胞)。定期补充培养基，37℃培养5个星期后，ELISA检测每孔之培养物与变性乳铁蛋白片段7B特异反应的IgM单克隆抗体(Mab)(Pruslin FH，Winston R，Rodman Tc.(1991)免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)137：27)(图2C)。

所选EBV无限增殖化B细胞培养物长至细胞浓度为10⁶细胞/孔，然后用5×RPMI-1640(无补充物)冲洗。融合伴侣细胞(HMMA细胞，见Posner，M.R.，等在杂交瘤6：611，1987中描述)生长于RPMI-1640、FCS、青霉素/链霉素和氮杂鸟嘌呤中，并用3×无补充物的RPMI-1640冲洗。10⁶个细胞与等量的EBV无限增殖化B细胞混合。离心混合的细胞培养物，除去上清液并用温热(37℃)的40％聚乙二醇/RPMI-1640(pH 7.2)重悬，保持1分钟。离心细胞，用2×RPMI(pH7.8)冲洗，然后重悬于(10⁶细胞/毫升)补充有20％FCS、HAT(Sigma)、乌本苷、青霉素/链霉素的HY培养基(Sigma)，以10⁵细胞/孔种板。3星期后检测生长的阳性细胞之特异性抗体的存在。阳性抗体孔的内容物有限稀释，以0.5细胞/孔重铺于HY/HT(Sigma)培养基，补充20％FCS、SPIT(Sigma)、青霉素/链霉素。细胞于37℃生长5个星期后重新检测每孔内容物的单克隆抗体的特异性。温育所选培养物，直至生长到浓度为10⁶细胞/毫升，然后400转/分钟离心5分钟。每种细胞沉淀物用5毫升80％FCS、10％DMSO和10％RPMI-1640重悬，以2毫升等分量冻存在-70℃。冻存等分物融化后重新检测存活力和抗体特异性。

杂交瘤于1997年11月14日保藏于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，保藏号ATCC CRL 12431。

实施例2

在以下实施例中采用下面的材料和方法。

LF蛋白

从Sigma(L3770)获得的人乳汁乳铁蛋白命名为LF(M)。精浆LF是从临床正常志愿捐献者库存精浆标本中分离。液化作用后，通过离心获得无精子胞浆，并经DEAE离子交换层析(11)分离成碱性级分和酸性级分。每个级分合并物经凝胶过滤(Sephacryl S 300HR，Pharmacia)，其中各个级分合并物中第一级分在80kD解析，分别命名为SP80-碱性和SP80-酸性。

溴化氰(CNBr)裂解和SDS PAGE

对碱性SP80、酸性SP80和LF(M)的CNBr处理按照文献(12)描述的方法进行。简而言之，每种蛋白质的10mg/ml 70％甲酸溶液与CNBr(过量200倍摩尔量)室温下温育18～24小时。冷冻干燥后，将裂解混合物在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳(图1)。为了低分子量片段的分辨力加强(图2)，在16.5％的Tricine凝胶上进行电泳(13)。

片段7B的特征描述

片段7B从凝胶中切下，用H₂O-SDS抽提后加入KCl沉淀，7B的组成肽段经过对PBS(pH7.2)透析纯化。未处理的无精子精浆蛋白质和天然LF制成PBS溶液。LF片段7B由2个肽组成，这是由Rockefeller大学质谱实验室利用矩阵相关的激光解吸/离子化质谱进行确定的(14)。LF片段7B的肽N-末端测序由洛克菲勒大学的蛋白质测序实验室利用重复Edman降解的循环并用microbore HPLC(15)进行PTH分析来完成。

免疫反应性

LF(M)和酸性SP80、碱性SP80之电泳的Western印迹在Immobilon-P(Millipre)转移膜上进行，并通过化学发光观察。ELISA按标准化方法学(16～18)进行。血清为人LF(M)免疫的兔血清、SP80(酸性的和碱性的结合)免疫的兔血清，以及从临床实验室丢弃血清中随机选择的经性别、年龄鉴定且“无临床发现物”的人血清。与人血清具有反应性的仅有PAGE中的片段7(图1)和解析出的名为7B的清楚条带(图2)。

对片段7B特异的单克隆抗体(Mab)

从正常新生儿脐带血中利用Ficoll-Pague(Pharmacia)密度梯度离心分离出单核细胞，由EB病毒转化(19)。采用标准步骤(20)与亲本细胞系HMMA融合，产生一套分泌IgM的杂交瘤，并通过有限稀释法建立杂交瘤的单克隆性。既然血清与变性乳汁LF(M)和SP80的反应性局限在单个PAGE级分片段(图2)，该片段可从凝胶中分离出来，并和一系列与其它人天然抗体建立特异反应性的蛋白质或肽(16，18)一起得到应用，如用作ELISA中的抗原筛选与片段7B特异反应的单克隆抗体。

LF/SP80在精子头部中的细胞学定位

从自发液化的精浆中获得一部分游动的人类精子，用PBS洗3遍后最终重悬在PBS 1∶500稀释的人血清中，或纯化Mab的PBS溶液中，然后40℃温育过夜。每种悬液经PBS洗3次后，收集的精子温育在FITC标记的抗-人IgM(Sigma)中1小时。精子用PBS洗过，取一滴悬液于一载玻片上，用FITC-特异滤膜进行检查并照相(图3)。

精子衣壳蛋白质级分

通过诱导精子悬液中的顶体反应(21)获得包含精子衣壳成分的级分：游动精子用PBS温和洗后收集，悬浮于含Ca培养基中：2mM CaCl₂，10mM离子载体A23187(Calbiochem)，1mM PMSF(Sigma)，室温温育4小时。精细胞通过低速离心沉淀，通过高速离心后40℃透析过夜除去所得上清液的颗粒。ELISA检测上清液与人血清以及能与LF片段7B反应的Mab之间的反应性(图4)。

结果

这里报道的数据证实了过去的研究：人体精浆中的80kD蛋白质与LF同源(1，2)。无精子精浆通过DEAE离子交换层析(未显示)分级分离，证实80kD蛋白质以2种形式存在：碱性和酸性，其包含聚糖组分(22)。两种形式的SP80与来自人乳汁的LF的CNBr裂解片段在SDS凝胶上是相同的(图1A、2A)。同样，这些片段与SP80免疫的兔血清(图1)或者人乳汁LF(未显示)免疫的兔血清之间免疫反应性的模式也是相应一致的。相似地，从前的报道(4)获得证实：正常人血清未显示与乳汁中天然LF以及从精浆中分离或有联系的SP80之间的免疫反应性(图4)。特别重要的是证实了(图1，2)正常人血清中鉴定的天然抗体(3，4)可与LF和SP80中通过变性这些蛋白质才能暴露的隐蔽序列发生反应(图1，2)。存在于片段7B中的该序列可从LF(M)和SP80的CNBr裂解产物之PAGE(图2)中分离获得。天然抗体的固有存在可凭借一种来自脐带血细胞的杂交瘤之衍生物来证实，该杂交瘤分泌一种与片段7B成分特异性反应的IgM/K(图2，4)。

质谱显示片段7B包含10kD和9kD的2种肽。N末端测序鉴定上样的主要肽序列为DKVER，9kD肽序列为SLDGG。依据LF的CNBr裂解位于甲硫氨酸残基的假设，并参考LF公开的结构(12)，推出两种肽各自的序列，并定位于C叶。建立了一套包含两种肽之衍生线性序列并具有5个残基重叠的12残基肽(表1)。因而，经鉴定人血清IgM与单独检测的任何一条肽没有特异的反应性，这表明天然抗体的基础表位尽管包含在LF片段7B中，但是构象依赖性的。

表位在精子头部的原位定位，通过人血清的细胞免疫反应和与LF(M)/PS80片段7B(图3)特异反应的Mab获得证实。图4提供了进一步的证据，LF以暴露天然抗体表位的构型存在于精子衣壳蛋白质中。顶体反应的诱导后(21)，导致精子头部顶体区表面的蛋白质衣壳/浆膜分散，图4显示了衣壳成分与人血清IgM和Mab之间的反应性。因而图3、4提供证据，体内依次获能和顶体反应后，从精子衣壳中流出的LF可能用于进入精子穿透的卵细胞。然而，既然女性生殖道中存在一整套完整的血浆免疫球蛋白(23)，那么天然抗体将抑制这种LF的可得。

A.表I包含LF片段7B成分的具有重叠的十二肽。

A. Seq.ID No. B. Seq.ID No：D K V E R L K Q V L L H 1 S L D G G Y V Y T A C K 15K Q V L L H Q Q A K F G 2 V Y T A C K C G L V P V 16Q Q A K F G R N G S D C 3 C G L V P V L A E N Y K 17R N G S D C P D K F C L 4 L A E N Y K S Q Q S S D 18P D K F C L F Q S E T K 5 S Q Q S S D P D P N C V 19F Q S E T K N L L F N D 6 P D P N C V D R P V E G 20N L L F N D N T E C L A 7 D R P V E G Y L A V A V 21N T E C L A R L H G K T 8 Y L A V A V V R R S D T 22R L H G K T T Y E K Y L 9 V R R S D T S L T W N S 23T Y E K Y L G P Q Y V A 10 S L T W N S V K G K K S 24G P Q Y V A G I T N L K 11G I T N L K K C S T S P 12K C S T S P L L E A C E 13S P L L E A C E F L R K 14

由此显示(结果)人血清IgM或Mab并未展示与任何肽段的反应性，表明其表位为构象型。

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实施例3：RWT-4和RWT-12杂交瘤细胞系的产生

每种杂交瘤通过人脐带血B细胞和骨髓瘤细胞的融合制备。

用于RWT-4的融合骨髓瘤伴侣是一种由小鼠和人骨髓瘤细胞融合产生的杂合骨髓瘤，获自ATCC：5HMD33。

用于RWT-12的融合骨髓瘤伴侣是HMMA(Posner，M.R.等人，杂交瘤6：611，1987)。

对于每种杂交瘤，脐带血B细胞的获得和无限增殖化见以上实施例1中的描述。

五星期之后，每孔培养液经ELISA检测其与Tat蛋白的反应性。所选培养的EBV无限增殖化细胞的培养液用每种肽进行检测(实施例5显示，图5)。其中，显示只与肽4反应的3份(与肽5低水平反应)和显示只与肽8反应的3份(与肽7、9低水平反应)EBV无限增殖化细胞被选择与各自融合用的骨髓瘤伴侣进行融合，如以上实施例1描述。注意方法步骤的修改：融合细胞(代表杂交瘤)以每孔0.5个细胞铺板，确保每孔接种不超过1个细胞，从而保证其单克隆性。

细胞在补充有20％胎牛血清、SPIT(Sigma)和青霉素/链霉素的NY/HT培养基(Sigma)中长至浓度为10⁶细胞/毫升，400转/分离心5分钟。

每份细胞沉淀悬浮于包含80％胎牛血清、10％DMSO和10％RPMI-1640的培养基，分为2ml一份贮存于-70℃或液氮中。那些代表杂交瘤RWT-4和RWT-12的部分冻存细胞分别于1998年2月12日和1998年2月25日保藏于ATCC。

实施例4：杂交瘤细胞系RWT-4和RWT-12特异反应性的检测

将每种包含杂交瘤分泌的特异IgM单克隆抗体的培养液进行处理，回收抗体。

培养液在Centricon C-100柱中浓缩除去盐和所有分子量小于100kD的蛋白质。然后浓缩液通过Pharmacia S-300柱中体积排阻凝胶。洗脱液的第一峰经SDS聚丙烯酰胺凝胶以检测纯度，显示代表特定IgM的轻链和重链的2条带，无其它带。洗脱物在一新柱中再浓缩至200μg/ml。

每种单克隆抗体的轻链用过氧化物酶标记的抗-γ和抗-κ抗体进行ELISA鉴定。

每种单克隆抗体的重链(表位特异性)用一组肽进行ELISA鉴定。

轻链鉴定

ELISA：1.未标记的rb＞IgM

2.Mab或总人IgM(Sigma)

3.过氧化物酶标记的抗-κ或抗-λ

过氧化物酶标记抗-λ 0ab 总IgM RWT-4 Mab

1∶4k 01 0.24 0.73

1∶6k 01 0.16 0.54

1∶10k 0 0.12 0.37

抗-κ

1∶4k 04 0.55 0.06

1∶6k 01 0.36 0.04

1∶10k 0 0.23 0.02

结论：RWT-4轻链为λ

抗-λ 0ab 总IgM RWT-12Mab

1∶4k 02 0.89 0.03

1∶6k 01 0.65 0.02

1∶10k 07 0.45 0.01

抗-κ

1∶4k 04 ＞1.00 0.80

1∶6k 03 0.83 0.57

1∶10k 02 0.56 0.39

结论：RWT-12轻链为κ

按照TAT肽特异性确定表位

ST RWT-4 Mab RWT-12 Mab

Pep 1 .01 .03 .05

2 .02 .02 .04

3 .03 .01 0

4 .48 .94 .02

5 .20 .35 .12

6 .07 .01 .07

7 .16 .07 .36

8 .12 .07 .42

9 0 .02 .01

10 0 .01 .03

11 0 0 0

12 .33 .16 .72

总Tat蛋白 .49 .55 .44

这里肽12在实施例5、图6中命名为肽8。

因此

这里图2

7 7

12 8

8 9

9 10

10 11

11 12

12 8

稀释度：ST血清1∶100

Mab 1μl/1ml杂交瘤细胞

这些数据代表每一抗原抗体反应20次独立检验的平均值。

实施例5

在本实施例中使用以下材料和方法。

血清

人

图6中报告的70份HIV+和70份HIV-血清于1994年以前收集，并用来检验与Tat蛋白的反应性。因此HIV+血样组的特征不能归因于从1994年开始的抗-HIV治疗的应用。70份HIV+血清中有52份用于表I的表位分析，其中还包括了另外8份HIV+血清，也就是总共有60份来自未经治疗的HIV+病人血清用于表I的表位分析。图9、10、11中系列HIV+血清是具有临床资料和相应治疗记录的用于临床检验的标本之等分样品。表I中80份正常(HIV-)血清是从用于预先检查仅做年龄、性别和“无临床发现物”鉴定的标本，以及实验室人员捐献标本中收集的。

黑猩猩

获得的总共22份血清来自成年黑猩猩，证实为正常血清：16(7份雄性，9份雌性)份来自YERKES地区灵长类中心(Emory大学)；6(2份雌性，4份雄性)份来自LEMSIP(NYU医学中心)。后面一组中1份雄性和1份雌性血清分别在接种HIV感染的细胞后22个月和10个月收集。

猴

从正常猴获得共32份血清：20份来自YERKES的恒河猴，1份来自LEMSIP，2份来自LARC(实验动物研究中心，洛克菲勒大学)，4份猪尾恒河猴(pig tail macaques)血清和5份狒狒血清来自LARC。还有血清从接种SIV(Mac 239)感染的细胞的恒河猴获得，并且从LingiZhong博士(Aaron Diamond AIDS研究中心，洛克菲勒大学)那里获得由SIV Mac 239培养物无细胞上清液接种恒河猴6个月后的2份血浆标本。

兔

20份(10份雄性，10份雌性)新西兰白兔(此前未经任何处理)血清由James Nolan(纽约，特殊手术医院)提供，10份获自LARC。1份由HIV Tat蛋白免疫后的兔血清标本获自Intracel Corp(Isaquah，WA.)

小鼠

30只正常成年小鼠：12只Balb/C，6只C57black，2只MRL-1pr和10只Swiss Webster的血清获自LARC。对1只Balb/c和1只Swiss Webster用HIV Tat蛋白/佐剂施加3次系列免疫，仅用佐剂对1只Balb/c和1只Swiss Webster施加免疫。表I数据中包括的血清表示每只小鼠末次免疫接种16星期后收集的标本。

抗原

冻干形式的重组Tat蛋白获自Intracel公司。每小瓶蛋白的反应性和工作稀释度按照单份(标准)人血清(16)进行标准化。Tat肽(图5)显示了与发表的HIV Tat氨基酸线性排列(17)相一致的重叠序列，并按照过去描述的方法(14)制备。最近的综述(26)确证Tat是一种高度保守的HIV蛋白质，与多种HIV分化体展示的序列只有较小偏差。

ELISA

所有血清均等量分装冻存于-70℃以减小反复冻融的影响。ELISA流程经过严格标准化和统计学评估(例如15，16)。每份血清/抗原最少经3次独立试验检测。对每份抗原的校正血清O.D.值表示，血清/抗原读出的O.D.值减去血清背景(无抗原)的O.D.值。校正O.D.值0.10可认为阳性。如果校正O.D.值为0.08～0.15，另外重复3次试验。对于人和黑猩猩血清检测，每一滴度板条包含单份标准血清(ST)，最终滴度按X/ST计算。过氧化物酶标记的抗-人IgG或IgM(KPL)用于全部的人和黑猩猩血清。发现抗猴IgM或IgG(KPL)与黑猩猩血清不反应，但依据所有特异性标准和比例对不同猴血清检测的血清稀释度是合适的。类似地，抗小鼠IgM或IgG(Sigma)和抗免IgM或IgG(KPL)筛选了特异性和稀释度相关的反应性梯度。既然针对每一物种的过氧化物酶标记抗体来自山羊血清，ELISA包含一个额外的封闭步骤，即在洗涤抗原之后、使用种特异性待检血清之前用1％正常山羊血清来封闭，以确保没有表现出的反应性的部分可归因于山羊血清。

表1

IgM IgG
IgM IgG		物种血清肽编号 1 4 8 Tat 1 4 8 Tat
人雄性 40 0 40 38 40雌性 40 0 40 40 40HIV+ 60 0 60 46 60	0 38 31 381 40 36 401 60 21 60	物种血清肽编号 1 4 8 Tat 1 4 8 Tat
人雄性 40 0 40 38 40雌性 40 0 40 40 40HIV+ 60 0 60 46 60	0 38 31 381 40 36 401 60 21 60	黑猩猩雄性 11 0 11 10 11雌性 11 0 11 11 11HIV+  2 0 2 2 2	0 11 9 110 11 8 110 2 2 2
猿猴32 0 0 0 0SIV+ 3 0 0 0 1	0 32 2 210 3 3 3	黑猩猩雄性 11 0 11 10 11雌性 11 0 11 11 11HIV+  2 0 2 2 2	0 11 9 110 11 8 110 2 2 2
猿猴32 0 0 0 0SIV+ 3 0 0 0 1	0 32 2 210 3 3 3	兔正常 30 0 2 0 0Tat+ 1 1 0 0 1	0 3 0 01 1 0 1
小鼠正常 30 0 0 0 0仅加佐剂 2 0 0 0 0Tat+ 2 0 0 0 0	0 2 0 10 0 0 02 0 0 2	兔正常 30 0 2 0 0Tat+ 1 1 0 0 1	0 3 0 01 1 0 1

结果

人

图6呈现的实验资料为IgM和IgG与HIV+和HIV-(正常)血清的Tat蛋白的反应性。如方法部分中所述，那些HIV+血清是从不同于在1994年中期以前普遍运用的药物(如AZT)的、未接受任何抗-HIV药物治疗的病人中采集的。对两组70份血清各自滴度集合的比较表明，HIV+组的IgM滴度明显地低于HIV-组的水平(图6A)。然而，无论是有关比较的两组血清还是未显示的单份血清中，同一份血清的Tat-反应性IgG滴度的分布与Tat-反应性IgM滴度相比呈现出随机性。那些IgG滴度可能代表天然抗体的成熟形式(27，28)，或者是由具有与Tat蛋白区域充分一致的序列而反映为Tat-反应性的无关抗原独立诱导的抗体。

两组人群血清的表位分析显示(表1)，与Tat蛋白的全部IgM反应性局限于2个不相邻序列：一个包括拥有半胱氨酸富含区的肽4、肽5，另一个包括精氨酸富含区的肽7、肽8、肽9(图1)。与表1数据相一致，所有(80份)HIV-(正常)男性和女性血清都具有可与Tat蛋白以及肽4所示表位反应的显著的IgM滴度，而除2份以外所有其他HIV-血清具有与肽8所示表位反应的显著的IgM滴度。所有60份HIV+血清都具有与Tat蛋白和肽4所示序列反应的较低但显著的IgM抗体滴度，而60份中只有46份具有与肽8所示的精氨酸富含序列反应的IgM。即使对于阳性范围内的HIV+血清，与肽8反应的IgM水平较低(图7)，明显表明其耗尽的趋势比与肽4反应的IgM更甚(图8)。可以认为IgG抗体(表I)代表了IgM天然抗体的成熟形式(27，28)和/或那些由某种外来抗原因子独立诱导的抗体。后者可能适用于与肽1反应的IgG(图5)，存在于HIV-血清中，而不存在于Tat诱导的和HIV+血清中(表1)。图7和图8资料证实，与肽8反应的天然抗体(图7)比与肽4反应的天然抗体(图8)更严格地反映出与Tat反应的天然抗体的下降趋势。图9、10、11显示出与Tat反应的IgM天然抗体滴度与HIV的致病进程，以及建立的病程指标CD₄+T细胞数目是相关的(29)。每张图显示了从单个病人的系列标本获得的数据，包括与Tat蛋白、肽4和肽8反应的IgM检测滴度以及CD₄+T细胞数目的临床实验报告。图9的系列标本从一位诊断为AIDS的HIV+男性收集，经历5年多时间直至他死亡。每一个与Tat蛋白反应的IgM滴度值反映出同一份标本与肽4和肽8反应的IgM滴度值的综合。尤为突出的是，与肽8的反应性急剧上升之后骤然下降，同时，在死亡前8个月收集的标本事实上CD₄+T细胞已完全消失。图10显示一位HIV+男性病人系列标本的资料，该病人感染时间据估计长达11年以上，并且未经抗-HIV药物治疗也无HIV发病症状，因而符合长期生存者(LTS)或长期不发病者(LTNP)的标准(12，13)。与Tat蛋白、肽4和肽8反应的IgM天然抗体滴度的维持模式类似于正常(HIV-)人的该种模式(14，16)。高水平IgM滴度，特别是与肽8反应的IgM滴度，与CD₄+T细胞数目维持在正常范围内相关。一位HIV+病人在报告CD₄+T细胞数目下降之后开始抗病毒治疗(图11)，他的系列标本显示出类似的相关性。经过一段时期的治疗，CD₄+T细胞数目和天然抗体滴度尤其是与肽8反应的抗体滴度开始上升。此后的连续标本表明CD₄+T细胞数目和抗体滴度维持在正常范围内，伴随病人总体上健康的状态。

黑猩猩

所有22份正常黑猩猩血清(表1)具有与Tat蛋白和肽4反应的IgM和IgG抗体的显著滴度。对于肽8，其中21份血清显示明显的IgM反应性，17份血清显示显著的IgG反应性。2只HIV接种的黑猩猩血清显示出与Tat蛋白、肽4和肽8所示序列反应的显著的IgG和IgM反应性，而不与其他肽反应。因此，黑猩猩的天然抗体群与人类相似。

猴

32份正常血清中未检测到与Tat蛋白或其任何组成肽反应的IgM(表1)。3只SIV感染猴中一只显示了与Tat蛋白的反应性。然而所有32份血清显示了与肽4的IgG反应性，21份血清显示了与Tat蛋白的IgG反应性。2份正常恒河猴血清与所有3份SIV感染的恒河猴血清显示了与肽8的IgG反应性。

兔

30份正常兔血清中，2份显示了与肽4的IgM反应性，然而未伴有可检测的与Tat蛋白反应的IgM。这2份与另外1份正常兔血清显示了与肽4的IgG反应性，但同样未检测到与Tat蛋白的反应性。Tat免疫的兔血清显示了与肽1和Tat蛋白的IgM反应性，以及与肽4、肽1和Tat蛋白的IgG反应性。这种分布提示，在正常的和Tat免疫的兔血清中都有与肽4反应的IgM和IgG，反映出一种在装配型Tat蛋白中检测不到的外来抗原的反应。Tat免疫的兔血清中表现的与肽1的IgM和IgG反应性可归因于免疫原的诱导，因为反映出的肽1的反应性与Tat蛋白高的反应性类似。

小鼠

血清获自30只正常小鼠，2只Tat/佐剂免疫的小鼠和2只仅用佐剂免疫的小鼠，其中没有一份血清显示与Tat蛋白或任何肽的IgM反应性(表1)。30份正常小鼠血清中，2份显示与肽4的IgG反应性，另外一份显示与Tat蛋白的IgG反应性。2份仅用佐剂免疫的小鼠血清未显示任何反应性，而2份Tat/佐剂免疫的小鼠血清却显示出与肽1和Tat蛋白相当高的反应性(＞1.0)。显然，对于兔和小鼠，Tat蛋白是一种诱导特异针对肽1所示序列的抗体反应的有力诱导物。

讨论：

Tat蛋白的重要性早在HIV感染的致病序列中通过其在细胞附着和病毒进入过程中所起作用显示出来。体外研究的事实表明，Tat参与了主要由Tat肽7、8、9(图5)所示的碱性结构域介导的内化作用(30，31)。病毒在细胞内增殖也依赖于Tat，通过Tat与病毒RNA的Tar区域相互作用导致反式激活(18，19)。由Tat肽4、5(图5)所示的半胱氨酸区域在Tat/Tar结合和随后的HIV复制过程中发挥了重要的作用(18，19)。因此，由Tat介导的病毒进入和激活内化病毒复制这两种活性依赖于Tat的序列，该序列包含两种天然IgM抗体的表位，这两种天然抗体存在于本研究检验的所有人和黑猩猩血清中，而在其他哺乳动物如猴、兔、小鼠的血清中(表1)并不存在。

根据表位特异性，我们提出，那些天然抗体在HIV感染后的早期提供了或贡献了人体宿主耐受HIV致病性的一种机制。通过人体宿主的天然抗体阻滞病毒进入和细胞内复制，而SIV感染的恒河猴却缺乏这种阻滞作用，这种现象可对以下现象作出解释：在SIV感染的恒河猴中T淋巴细胞的转换率远高于HIV感染中人的转换率(32，33)。尽管HIV+人外周血细胞中CD₄+T细胞群体的耗尽的准确机制尚未专门建立，本研究的图9、10、11的系列标本中却证明了CD₄+T细胞数目与Tat-反应性天然抗体滴度之间的关系。在每一系列标本中，CD₄+T细胞数目与抗体滴度的维持和下降平行。

然而，那些天然抗体偶然性地阻滞Tat-相关的致病过程，有可能因免疫系统将抗体反应的Tat序列识别为自身抗原从而诱导耐受而受到限制(21，22)。

天然免疫和适应性免疫各自独立对等的原理最近获得许多关注(6，7，8)，其有希望进一步澄清自我识别进而耐受的机制和事件。因此，自我耐受之基本的和起作用的事件似乎为涉及天然抗体产生的T和/或B细胞的去除或关闭(23)。因此，当Tat抗原负荷增加，可能抑制了Tat-反应性天然抗体的产生，丧失抗体介导的对Tat攻击性的限制，从而终止了发病潜伏期。体外实验描述的Tat的一种致病活性为诱导编程性细胞死亡(29)。Tat-反应性天然抗体可能阻碍Tat作用，因此有助于维持HIV感染后早期的表现潜伏性，这种假设被以下观察所支持：定义为LTS(长期生存者)(12)或LTNP(长期不发病者)(13)的人极少显示T细胞编程性死亡的迹象(21)，并且如我们证实(图10)，保持正常水平的天然抗体。与此相关的报道(34)为黑猩猩对AIDS病程的耐受伴随T细胞水平的维持，极其少见Tat诱导的编程性细胞死亡。

尽管T细胞以编程性死亡耗尽的机制尚未完全理解，但最近研究表明Fas/Fas配体系统在HIV诱导的CD₄+T细胞编程性死亡过程中并非调节因子(35，36)。然而尤其引起争论的是，最近报道SIV(mac239)体外诱导的外周血单核细胞编程性死亡由Fas/Fas配体系统所介导(37)。SIV和HIV在编程性细胞死亡介导的机制之间的差异与本研究的主题十分相关，即HIV与人体免疫系统的相互作用显然是独特的。体外研究干扰素对病毒复制的干扰效果表明了HIV和SIV另一显著差异。干扰效果似乎为在SIV感染细胞中主要与干扰素阻碍病毒DNA合成有关，但在HIV感染细胞中却不是如此(38)。

B细胞和T细胞的编程性死亡可归因于Tat的作用(29)。更为引人注目的是越来越多的文献报道Tat参与导致痴呆的神经变性(24)。报道包括Tat剂量依赖的人胚胎神经元培养物编程性细胞死亡(39)，以及从死于AIDS的病人脑组织中检出神经元的编程性死亡(40)。Tat透过血脑屏障的潜在能力支持了体外证实的Tat神经毒效应可在体内发生的可能性。通过对精子染色体蛋白质鱼精蛋白的血管渗透能力和血脑屏障穿透能力的多种分析，我们将这种功能归于鱼精蛋白的精氨酸富含区(41)。Tat的精氨酸富含序列，此处由肽7、8、9(图5)所示，同样天然存在这种能力。特别相关的是，与Tat肽8反应的天然抗体的表位分析表明(16)，与天然抗体反应的表位存在于鱼精蛋白和HIV Tat蛋白特定的精氨酸富含序列中。

两种人天然抗体IgM和IgG的表位相似性表明每种代表同一种抗体的一对同种型。过去我们主张，正常人群中每个人系列标本的两种天然抗体中IgM滴度而非IgG滴度保持稳定，表明IgM为维持稳态型同种型(16)。目前尚未很好理解天然抗体种类转换的机制和效用，并且也并非显而易见，但有希望的是，目前对天然免疫和适应性免疫同种型转换的分子机制和功能方面的研究过程将澄清这种机制和效用(42)。

因此，目前对人Tat反应性天然抗体的同种型抗体IgM和IgG的单独作用进行确定并不可行。然而，显而易见的是HIV+人群中并不发生由免疫原诱导的Tat反应性抗体(表1)。既然猴子、兔和小鼠中可诱导产生Tat反应性抗体(表1)，表明只有人免疫系统不能诱导产生该抗体是独特的。由于假设黑猩猩与人具有高水平的遗传同源性(20)，那么黑猩猩与人具有高水平的遗传同源性(20)，那么黑猩猩血清中与Tat反应的抗体的分布支持了这种遗传特异性的唯一属性(表1)。与人血清平行的证据：HIV感染前后的黑猩猩都具有与Tat肽4和肽8(图5)反应的IgG和IgM抗体，不具有与其它肽反应的抗体(表1)。然而，黑猩猩比HIV+病人对病情发展为AIDS明显地具有更大的天然耐受力(10，11)，这可能违背了某些参与耐受诱导的免疫系统组分的遗传一致性(21，22)。随之产生一个问题：是否是相同的遗传特征与LTS/LTNP患者所赋予的针对HIV损伤的保护作用有关(12，13)？

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序列表

<110>Institute for Human Genetics and and Biochemistry

<120>单克隆人天然抗体

<130>4436/2C074-EP

<140>98961805.3

<141>1998-11-24

<160>36

<170>FastSEQ for Windows Version 3.0

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<400>6Val Cys Phe Ile Thr Cys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr1 5 10

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<400>7Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln1 5 10

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<400>8Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro1 5 10

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<400>9Lys Lys Arg Arg Gln Arg Pro Arg Arg Pro Gln Gly1 5 10

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<400>10Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser1 5 10

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<400>35Val Arg Arg Ser Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser1 5 10

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<213>人

<400>36Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser1 5 10

Claims

1.一种保藏号为ATCC CRL-12431的杂交瘤细胞系。

2.一种由权利要求1的杂交瘤生产的人IgM单克隆抗体，该抗体可与人精子头部存在的乳铁蛋白发生免疫反应。

3.一种保藏号为ATCC CRL 12477的杂交瘤细胞系。

4.一种由权利要求3的杂交瘤生产的分离的人IgM单克隆抗体。

5.一种保藏号为ATCC CRL 12472的杂交瘤细胞系。

6.一种由权利要求5的杂交瘤生产的分离的人IgM抗体。

7.一种治疗患有由HIV-1引起的感染的病人的方法，包括为治疗所述感染给需要这种治疗的病人施用有效量的分离的人单克隆IgM抗体，该抗体选自由杂交瘤细胞系ATCC CRL 12477、ATCC CRL 12472生产的抗体，及其混合物。

8.一种增加患有由HIV-1引起的感染的病人中CD₄+T细胞的方法，包括施用增加CD₄+T细胞有效量的抗体，该抗体选自由保藏号为ATCC CRL 12472、ATCC CRL 12477的杂交瘤细胞系生产的抗体，及其混合物。

9.一种药物制剂，其包含分离的人单克隆IgM抗体，以及药学可接受的载体，其中的抗体选自由保藏号为ATCC CRL 12472、ATCCCRL 12477的杂交瘤细胞系生产的抗体，及其混合物。

10.权利要求9的药物制剂，其中所述的药学可接受的载体是一种IVIG制品。

11.一种制备分泌所产生的单克隆人天然IgM抗体之人杂交瘤细胞的方法，包括如下步骤：

融合EB病毒无限增殖化的脐带血细胞与小鼠：人杂交骨髓瘤细胞；

分离融合细胞；

在限定的条件下将所述融合细胞铺板，且

分离杂交瘤细胞。

12.权利要求1的方法，其中所述单克隆人天然抗体可与人乳铁蛋白免疫反应。

13.权利要求11的方法，其中所述单克隆人天然抗体可与HIV-1的Tat蛋白免疫反应。

14.一种分泌由权利要求11的方法产生的人天然IgM抗体的人杂交瘤细胞。

15.一种通过感染EB病毒无限增殖化的分离的人脐带血细胞。