CN1303394A - 用于预防和治疗hiv感染和免疫疾病的肽组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了含有一种与CD4的CDR－2类结构域的一部分同源的序列的肽,所述的序列与辅助T细胞表位共价相连,并任选地与其它的免疫刺激序列相连。本发明提供了这种肽作为免疫原诱导哺乳动物产生高滴度的多克隆自体抗体的应用,这种抗体对CD4表面复合体具有特异性。这些自体抗体防止HIV病毒颗粒与CD4+细胞的结合。这些肽可用于药物组合物种,提供针对HIV感染的免疫治疗,以及防止HIV感染。

Description

用于预防和治疗HIV感染和免疫疾病的肽组合物
发明领域
本发明涉及肽组合物作为免疫原的应用，其中包含的每个肽包括一个由抗宿主细胞HIV受体/共同受体复合物的抗体识别的目标抗原性位点。该复合物包含与趋化因子受体结构域有关的CD4。目标抗原位点是线形共价连接的环状，其串联连接(1)通过化学偶联一种载体蛋白，或优选地(2)通过化学偶联或更优选通过直接合成连接一种肽辅助T细胞表位和其它免疫刺激肽序列。更具体地说，本发明涉及该肽组合物作为诱导健康哺乳动物包括人产生高效价抗体的免疫原的应用，所述抗体具有抗1型HIV(HIV-1)所有进化枝的原代分离株和2型HIV(HIV-2)原代分离株的广泛的中和活性。本发明还涉及将所述肽组合物用作免疫原预防和治疗免疫缺陷病毒感染以及治疗不希望的免疫应答例如移植排斥、自体免疫疾病例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、和牛皮癣的方法。
发明背景
虽然14年以来由于HIV的发现和表征对其疫苗已有深入研究，但对HIV疫苗和免疫治疗的发展还存在重大障碍。这些障碍包括HIV-1的变异性、对该病毒结构缺乏认识、以及对预防HIV感染必需的免疫应答缺乏了解。参见D.Burton和J.Moore，天然药物(NatureMedicine),1998,4:496-48。美国政府AIDS疫苗研究委员会首脑于1998年2月1日声称，预防AIDS的安全疫苗距测试仍然需要十年以上，因为关于身体免疫系统如何工作仍然有很多还处于未知状态(http:∥cnn.com/HEALTH/9802/01/aids.vaccine.search)。
早先对于有效的重组HIV-1包膜亚单位疫苗(例如，gp120和gp160疫苗产品)很乐观，已知来自几个临床实验的疫苗血清能够体外中和HIV-1的实验室分离体(Belshe等，美牛皮癣国医学协会杂志(J.Am.Med.Assoc．),1994,272:475；Keefer等，AIDS研究，人逆转录病毒(AIDS Res.Hum Retroviruses),1994,10:1713)。当发现这种疫苗血清对于中和HIV-1原代患者分离体大部分无效(Hanson,AIDS研究，人类逆转录病毒，1994,10:645；Mascola等，传染病杂志，1996,173:340)时，这种乐观动摇了。这些令人失望的结果导致NIH在1994年6月决定推迟几种基于HIV亚单位疫苗的重组包膜蛋白的花费巨大的大规模效果实验。
目前HIV疫苗的研究集中在原代分离株，其被认为在导致人类感染方面比通常使用的实验室株系更类似HIV株系(Sawyer等，病毒学杂志，1994,68:1342；Wrin等，病毒学杂志，1995,69:39)。HIV-1的原代分离株通过患者PBMC或血浆与未感染的PBMC进行限制性培养得到。可以通过下面描述的表型轻易将原代病毒从已在人T淋巴细胞系中传代若干次并已在这些T细胞系中良好生长的T细胞系适应(TCLA)病毒例如Ⅲb/LAI、SF2、和MN中分辩出来：
(1)不象TCLA病毒，大多数原代分离株不易在T细胞系中生长。
(2)不象TCLA病毒是全合胞体诱导性的，原代分离株包括在PBMC培养中诱导合胞体形成的双合胞体诱导(SI)分离体和非合胞体诱导(NSI)分离体。在SI原代分离株中，大多数将在，尤其是在HIV-敏感T细胞系MT2中复制，而极少能够在通常用于培养TCLA分离体的几乎不许可的T细胞系例如CEM或H9中复制。非合胞体诱导(NSI)原代分离株仅在原代T细胞中复制。
(3)原代分离株在体外对病毒受体蛋白CD4(rsCD4)的重组可溶形式的中和具有高度抗性，对于等量中和比TCLA株系需要200-2700多倍的rsCD4(Daar等，PNAS USA,1990,87:6574-6578)。
(4)原代分离株也对中和应用gp120(包膜)疫苗诱导的抗体具有抗性。相比较而言，TCLA株系对于对病毒包膜具有特异性的抗体的中和是灵敏的(Sawyer等，病毒学杂志，1994,68:1342；Mascola等，1996)。
原代分离株的这些表型特征起因于HIV的尚不太了解的结构特征，尤其是与抗-env抗体相关的病毒包膜的难以研究的特性(D.Burton和J.Moore，天然药物，1998,4:495-498)。病毒的变异性，一种基因型特征，也成为研制全世界范围有效的HIV疫苗的一个障碍(Mascola等，1996)。这些因素共同造成研制抗易于生长的TCLA同型株系的针对病毒的AIDS疫苗的没有预期到的失败。一种研制HIV疫苗的替代途径可以通过以下方法进行，干扰宿主细胞的HIV受体，由此通过防止HIV与易感细胞结合或融合而阻断感染。针对细胞的研究提供了克服HIV包膜高度变异性和表型多样性的方法。
SIV恒河猴短尾猿模型中的主动和被动免疫研究提示了进行防止HIV感染的针对细胞的研究，其显示抗-细胞抗体有效地致力于保护免受感染(Stott，自然，1991,353:393)。另外，抗CD4的单克隆抗体，一种MHCⅡ类分子的T细胞受体和HIV结合的初级受体，长期以来已经知道其在HIV-1中和分析中以CD4表位而非病毒株系依赖性方式阻断感染(Sattentau等，科学，1986；234:1120)。在该免疫预防研究中，已经发现抗-CD4单克隆抗体有效地阻断细胞被原代分离株感染(Daar等，美国国家科学院科学进展，1990,87:6574；Hasunuma等，免疫学杂志，1992,148:1841)。
其它潜在有效的涉及细胞的研究包括靶向趋化因子受体CXCR4、CCR5、CCR2b、和CCR3，最近它们被鉴定为HIV的共同受体(Feng等，科学，1996,272:872；Doranz等，细胞，1996,85:1149)。这些共同受体与CD4一起行使功能，起动病毒包膜糖蛋白与宿主细胞膜的后期结合相互作用以及逆转录病毒复制的后期侵入步骤(Chackerian等，病毒学杂志，1997；71:3932)。
进行有效HIV结合和融合需要CD4和共同受体表明这些分子之一或二者都可能是细胞-导向策略抑制感染的很好目标。抗宿主细胞CD4/共同受体复合物的抗体已经显示影响HIV感染的结合和后期结合步骤(Wang,WO97/46697)。这些抗体中和HIV的合胞体诱导(SI)和非合胞体诱导(NSI)株系的病毒到细胞或细胞到细胞传送。
结合CCR5的趋化因子拮抗剂也显示能够有效地防止SI和NSI病毒感染(Simmons等，科学，1997,276:276)。中和NSI分离体尤其有意义，因为据信NSI株系负责大多数HIV传送，并往往对中和TCLA分离体的抗-HIV抗体具有抗性(Fauci,1996)。靶向HIV细胞受体的试剂使人们不需要面对病毒包膜多样化表型和高变异性，并另外提供了潜在的针对HIV-2和SIV的中和活性(Chen等，病毒学杂志，1997,71:2705；Pleskoff等，病毒学杂志，1997,71:3259；WO97/46697)。
据一个共同待审的专利申请(WO97/46697)报道，促进病毒结合和侵入宿主T细胞的、包括宿主T细胞表面上的CD4和趋化因子共同受体的宿主细胞受体/共同受体复合物是中和抗体的有效目标。在该申请中，发明人证明了所得到的抗体特异性地抗这种细胞表面的抗原复合物。在被HIV-1原代分离株中和的HPB-ALL细胞上的细胞表面抗原应答过程中，没有培育出其它的抗-细胞抗体。该申请中描述的具有所需性质的抗体能够阻断猴子被SIV感染、在小鼠中重建的人免疫系统被HIV-1体内感染、人细胞被多样化表型和基因型的HIV-1原代分离株在体外感染、以及阻断人细胞被HIV-2感染。这些包含CD4受体与趋化因子共同受体联合的细胞表面抗原复合物成为保护性抗-细胞抗体的目标。
抗CD4/共同-受体复合物的抗-细胞抗体比抗病毒包膜的抗-病毒抗体表现更有效的抗相关HIV株系的中和模式。如共同待审的申请(WO97/46697)所示，产生的抗HPB-ALL的单克隆抗体(MAb B4)对重组的可溶性CD4(rsCD4)蛋白质具有中等反应性，同时强烈结合HPB-ALL细胞。发现对CD4/共同受体细胞表面复合物的特异性在中和HIV-1原代分离株中高度有效，但在中和TCLA株系中几乎无效。相比较而言，抗-env抗体对TCLA株系的优先中和表现相反的模式。
发现MAb B4在体外微平板分析中以＜10μg/ml的浓度中和HIV原代分离株。相比较而言，对于重组的可溶性CD4(rsCD4)具有高滴度(＞5Log10)特异性的多克隆抗体没有表现对HIV原代分离株的任何中和活性，尽管它们具有强烈的T细胞结合活性。因此，原代分离株可能对细胞表面CD4/共同受体抗原复合物具有特异性的抗体比对具有单纯CD4特异性的抗体优先敏感。由抗-CD4/共同受体复合物的抗体进行的HIV中和的广泛表征包括MAb B4和其类似物MAb M2和MAb B13(WO97/46697)。
针对CD4/共同-受体复合物的抗体的广泛的中和活性的机制还不清楚，因为那些细胞表面复合物在介导HIV感染过程中作用多变，正如同那些抗体具有影响HIV感染的结合和后期结合步骤的能力所示的那样(Wang,WO97/46697)。CD4/共同受体细胞表面复合物在介导HIV感染和发病过程中可能具有双重作用：(1)作为HIV结合、细胞被HIV融合和侵入的T细胞表面受体；或(2)作为HIV抑制因子。
然而，虽然这些物质对抑制HIV感染有效，但是上述细胞-指向的拮抗剂或抗体不能被用作预防性疫苗。以前描述的细胞-指向拮抗剂或抗体(WO97/46697)不是免疫原，而且不能被用作预防性疫苗。它们是被动免疫剂。需要频繁施用这些物质，以维持全部受体被占据的血清浓度才能发挥它们的功效。通过主动免疫诱导抗CD4/共同受体复合物的主动抗-自身抗体应答的疫苗对于保护性免疫应当是优选的。这种疫苗，如果能够被研制出来，应当提供长期有效的抗感染保护，同时需要少量免疫原不频繁和方便施用。
对于效果，这类疫苗的免疫原成分必需包含或类似一个B细胞表位，一个在宿主细胞受体/共同受体复合物上的相关位点，具有足以诱导交叉-抑制抗体的可靠性，同时保留足以避免不利免疫抑制作用的位点特异性。虽然中和HIV的抗-细胞抗体，包括具有中和活性的抗-CD4抗体已经可以得到，但这类合成抗原的模拟位点目前还不容易鉴定。已报道的用于中和的抗-CD4单克隆抗体(Burkly等，免疫学杂志，1992,149:1779)和Wang等报道的广泛中和的抗-CD4/共同受体的单克隆抗体(WO97/46697)识别CD4上的不易复制的不连续构型位点。缺乏易受攻击位点的准确知识，从长重组免疫原中选择有用的宿主细胞抗原性目标并对其复制非常困难。通过CD4免疫得到的大多数抗体缺乏具有实用价值的特异性(Davis等，自然，1992,358:76)。例如，rsCD4的高滴度高免疫抗血清缺乏中和HIV原代分离株的活性(WO97/46697)。而且，对T细胞抗原的广泛区域具有广泛反应性的抗体可能会过度免疫抑制(Reimann等，AIDS研究，人类逆转录病毒，1997,13:933)。
另外，虽然CD4的大量绘图研究已经制作出分子的结构功能图谱(Sattentau等，科学，1986,234:1120)；Peterson和Seed，细胞，1988,54:65；Jameson等，科学，1988,240:1335；Sattentau等，实验医学杂志，1989,170:1319；Hasunuma等，免疫学杂志，1992,148:1841；Burkly等，免疫学杂志，1992,149:1779；Davis等，自然，1992,358:76)，这些图谱没有提供预测易感效应子位点的足够精确的结构模型，从而使其可能被复制成为合成肽。公开的CD4模型没有公开有用的基于CD4的免疫原。
除了合适的位点-特异性，有效HIV疫苗的受体/共同受体免疫原必需具有高度免疫刺激作用，以便诱导足够产生保护水平的抗体应答。这些免疫原还必需设计成能够克服对自身分子表现的强烈耐受性。因此，还需要具备足够免疫力的免疫原。
本发明的一个目的在于提供具有所需的位点特异性和免疫力的肽组合物，作为预防HIV感染的免疫原。
本发明的有用的合成肽免疫原的改进的免疫原性和适当的特异性已经通过一系列鉴定和设计合成肽免疫原的方法的组合而实现。这些方法包括：(1)一种有效地鉴定有效高亲合力目标表位的程序；(2)通过引入环形限制(cyclic constraints)稳定合成肽上的目标位点的结构特征的方法，从而使对自身分子的交叉反应最大化；(3)通过将它与含有广泛反应性的混杂T辅助细胞(Th)表位混合增强B细胞目标表位免疫原性的方法；和(4)通过应用组合的肽化学增大T细胞表位的全部功能的方法，由此进一步适应远亲后代种群的变异的免疫应答性。
合成肽已经被用于“表位作图”，以鉴定用于研制新疫苗和诊断试剂的蛋白质表面的免疫结构域决定簇或表位。表位作图应用一系列目标蛋白质上对应区域的重叠肽，以鉴定参与抗体-免疫原决定簇相互作用的位点。通常，表位作图应用长度相对较短的肽，以精确检测线性决定簇。已知最快的表位作图法是PEPSCAN，它是基于同时合成数百个偶联到固体支持物上的长度为8-14个氨基酸的重叠肽。检测偶联肽的结合抗体的能力。PEPSCAN研究在定位线性连续决定簇方面有效，但对于鉴定模拟不连续效应子位点所需的表位无效，例如HIV受体/共同-受体结合位点(Meloen等，Ann Biol.Clin.,1991,49:231-242)。一种替代方法依赖于一系列长度范围从15-60个残基不等的嵌套重叠肽合成物。这些较长的肽是可靠的，但需要通过一系列独立的固相肽合成法繁琐地合成，而不是通过快速和同步PEPSCAN合成。得到的一系列嵌套重叠肽然后可以用于在例如实验免疫和中和感染系统中分析抗体结合，以便鉴定包括简单不连续表位的最佳呈递的免疫结构域决定簇。该方法通过Wang等关于来自HTLVⅠ/Ⅱ(US5476765)和HCV(US 5106726)的免疫结构域位点作图研究示例说明。它被用于选择gp120序列上HIV中和表位最佳出现的精确位置(Wang等，科学，1991,254:285-288)。
肽免疫原通常比蛋白质更柔韧，不易保持任何优选结构。因此通过引入环形限制来稳定肽免疫原是有用的。一种准确环化的肽免疫原可以模拟和保持目标表位的构象，由此诱导真正分子上与该位点具有交叉反应性的抗体。例如，通过添加有利安排的半胱氨酸残基，然后经巯基环化，能够在合成肽上更准确地复制存在于真正表位上的环形结构(Moore，合成肽第二章：用户指南，ed.Grant,WH Freeman andCompany:New York,1992,pp/63-67)。
影响来源于受体/共同受体复合物的肽免疫原的免疫原性的另一个重要因素是通过与宿主T-辅助细胞受体和第Ⅱ类MHC分子反应的T辅助细胞表位将该肽呈递给免疫系统(Babbitt等，自然，1985,317:359-361)。T-辅助表位(Th)通常由载体蛋白质提供，由于难于生产准确限定的肽-载体结合物、大多数抗体对载体应答的错误指向、以及载体诱导的表位抑制使所述载体蛋白质同时存在缺点(Cease,InternRev Immunol,1990,7:85-107；Schutze等，免疫学杂志，1985,135:2319-2322)。或者，T细胞辅助可以通过含有Th位点的合成肽刺激。因此，被称为混杂Th的第Ⅱ类Th表位诱导有效的T细胞辅助，并能够与自身具备很低免疫原性的合成B细胞表位混合，以产生有效的肽免疫原(US 5759551)。设计良好的混杂Th/B细胞表位嵌合肽能够诱导Th应答以及随之而来的靶向表现多样性MHC单倍体的种属多样性种群的大多数成员中的B细胞位点的抗体应答。混杂Th可以通过来源于有效外源性抗原的特异性序列提供，例如麻疹病毒F蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、和沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)。一些已知的混杂Th已经显示在强化相当于十肽激素的低免疫原性肽方面是有效的(US 5759551)。
混杂Th表位长度范围为约15-约40个氨基酸残基(US5759551)，通常具有共同的结构特征，可以含有特异性标志序列。例如，共同特征是两性分子螺旋，它是疏水氨基酸残基占据螺旋一面，带电荷和极性残基占据周围面的α-螺旋结构(Cease等，美国国家科学院科学进展，1987,84:4249-4253)。表位通常含有其它的一级氨基酸模式，例如一个Gly或带电荷残基后跟随两到三个疏水残基，其后依次跟随一个带电荷或极性残基。该模式描述了一种被称为Rothbard序列的模式。另外，表位通常遵循1、4、5、8原则，其中一个带阳性电荷的残基后第四位、第五位和第八位跟随疏水残基，与1、4、5、8位定位在同一侧上的两性螺旋一致。因为所有这些结构由共同的疏水、带电荷和极性氨基酸构成，所以各结构能够在同一个Th表位中同时存在(Partidos等，遗传病毒学杂志(J Gen Virol)，1991,72:1293-99；Alexander等，免疫学，1994,1:751-761)。即使不是全部，但大多数混杂T细胞表位含有至少一个上述周期性。这些特征可以被插入“理想化人工Th位点”的设计。
来源于外源病原体的混杂Th表位包括例如，但不限于，乙肝表面抗原和核心抗原辅助T细胞表位(HBsTh和HBcTh)，百日咳毒素辅助T细胞表位(PT Th)，破伤风毒素辅助T细胞表位(TT Th)、麻疹病毒F蛋白辅助T细胞表位(MVF Th)、沙眼衣原体主要外膜蛋白辅助T细胞表位(CT Th)、白喉毒素辅助T细胞表位(DT Th)、镰状疟原虫环孢子体辅助T细胞表位(PF Th)、曼森氏血吸虫三糖磷酸盐异构酶辅助T细胞表位(SM Th)，及大肠杆菌TraT辅助T细胞表位(TraT Th)。病原体衍生的Th在US 5759551中的SEQ IDNOS:2-9和42-52列出；衣原体辅助位点P11在Stagg等，免疫学，1993,79:1-9中列出；HBc肽50-69在Ferrari等，临床研究杂志，1991,88:214-222中列出。
有用的Th位点还可以包括组合的Th，其将选择的简并位点插入理想化的Th位点的设计中。在Wang等(WO 95/11998)中，一类特别组合表位被称之为“结构性合成抗原文库”或SSAL。结构如SSAL表位的Th由组织围绕一种不变残基的结构框架的位置取代物组成。SSAL的序列通过排列混杂Th的一级氨基酸序列确定，在构成Th肽独特结构的位置上保留相对不变的残基，并在与识别多变性MHC限制元件有关的位置上提供简并性。MHC-结合基因座的不变和可变位置以及优选氨基酸列表已有公开(Meister等，疫苗，1995,13:581-591；Alexander等，免疫学，1994,1:751-761)。
SSAL的所有成员在一个单一固相肽合成中与目标B细胞表位和其它序列同时产生。Th文库序列保留了混杂Th的结构基因座并提供对广泛单倍体的反应性。例如，从麻疹病毒F蛋白质中得到一种混杂表位之后，模拟被描述为SSAL1TH1的简并Th表位(Partidos等，1991)。SSAL1TH1与LHRH目标肽一同应用。象麻疹表位一样，SSAL1TH1遵循Rothbard序列和1、4、5、8规则：1               5                   10                  15Asp-Leu-Ser-Asp-Leu-Lys-Gly-Leu-Leu-Leu-His-Lys-Leu-Asp-Gly-LeuGlu Ile      Glu Ile Arg      Ile Ile Ile    Arg Ile Glu      IleVal         Val          Val Val Val         Val          ValPhe         Phe          Phe Phe Phe         Phe          Phe
将带电荷残基Glu或Asp加在位置1，以增加Th疏水侧周围的电荷。然后在两性螺旋疏水侧的2、5、8、9、10、13和16位保留疏水残基，2、5、8、9、10、13和16位的可变性提供了一种具有结合广泛MHC限制元件能力的表面。SSAL特征的静作用在于增大了人工Th的免疫抑制的范围(WO95/11998)。
按照本发明，已经用精确的表位图谱、环状限制、插入混杂Th表位或理想化的混杂Th、以及理想化的SSAL Th表位设计了对HIV有效的肽免疫原。这种肽是优选的，因为它们是安全有效的。由于通过精确定位和环化作用以及应用广泛反应性Th应答表位而优化的HIV受体/共同受体结合位点的有效呈递，相信本发明的肽免疫原提供了免疫效力。
发明概述
本发明的肽组合物包含一种或多种如上述设计的肽免疫原。该肽组合物是有效地预防和治疗HIV感染和免疫疾病的疫苗的基础。由于本发明的肽成分呈现中和CD4的CDR2-样结构域的受体/共同受体效应子位点而成为优选。这些肽由于(1)具有优化的位点特异性，其通过CDR2-样结构域的精确表位作图和考虑到CDR2的自身构型而选择的环化作用得到，以及(2)它们的广泛反应性Th应答，使它们诱导有效的抗体应答。
按照本发明，提供了一种或多种肽，每种肽包括定位在CD4的CDR2结构域上相应效应子位点的两个肽序列，或其免疫功能类似物。
另外，通过化学偶联共价连接的载体蛋白质，或更优选通过化学偶联共价连接合成的免疫刺激成分(例如混杂Th表位)，或更优选通过直接肽合成赋予本发明肽的目标位点更强的免疫原性。载体蛋白质和免疫刺激成分的具体实例已有提供，例如，匙孔帽贝血蓝蛋白载体、改性的百日咳内毒素A(PEA)、Th表位(例如，SEQ ID NO:6)、和一般的免疫刺激肽(例如，耶尔森氏鼠疫杆菌的侵袭素肽(Inv)(SEQ ID NO:7)。
本发明的合成肽可以由下式表示：(A)n-(Th)m-(B)o-(CD4-CDR2抗原肽)-X
或(A)n-(CD4-CDR2抗原肽)-(B)o-(Th)m-X
或(CD4-CDR2抗原肽)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
或(Th)m-(B)o-(CD4-CDR2抗原肽)-(A)n-X其中：
各A独立地为一个氨基酸，或一种一般性免疫刺激肽；
各B独立地为一个氨基酸或其它化学键；
X为一个氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
Th为一个辅助T细胞表位或一个免疫增强类似物或其片段；
“CD4-CDR2抗原肽”是一种能够诱导与CD4表面复合物反应的抗体的肽抗原；
n为从1-约10的数；
m为从1到约4的数；和
o为从0到约10的数。
本发明的肽组合物包含从约30到约115个氨基酸残基，优选从约40到约90个氨基酸残基，更优选从约50到约80个氨基酸残基的肽免疫原。
本发明的组合物任选地进一步含有佐剂和/或给药载体和其它加入疫苗制剂的常规成分。本发明提供了剂量说明，以便产生对抗目标CD4-CDR2效应子位点的免疫治疗抗体。
本发明首次提供了能够在哺乳动物体内诱导抗体的合成肽，其保护性对抗来自多种进化枝的HIV原代分离株感染。
当对宿主施用含有本发明肽组合物的疫苗制剂时，对本发明肽组合物的抗体应答通过以下几方面对宿主提供抗HIV感染的保护或治疗：(1)阻断HIV与CD4-表达细胞结合，(2)阻断CD4-表达细胞之间HIV-诱导的杂交细胞形成，(3)在体外有效中和CD4阳性细胞被来自HIV1型和HIV2型所有进化枝的原代分离株感染，和(4)预防被HIV的原代分离株感染。
这种肽组合物对于预防和治疗HIV-1所有进化枝的原代分离株和HIV-2的原代分离株引起的HIV感染，以及对于治疗不期望的CD4细胞-介导的免疫应答例如抑制排斥、和自主免疫疾病例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、和牛皮癣有用。
附图简述
图1描述了人CD4的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，它是宿主细胞抗原CD4/共同受体复合物的一部分，它由核酸序列推测出。
氨基酸用下面的标准单字母代码表示：
Ala:A  Cys:C His:H  Met:M Thr:T Arg:R  Gln:Q
Ile:I  Phe:F Trp:W  Asn:N Glu:E Leu:L  Pro:P
Tyr:Y  Asp:D Gly:G  Lys:K Ser:S Val:V编号系统是Littman等中描述的(细胞，1988,55:541)。下化线区(AA27-AA66)是本发明的CD4-CDR2抗原肽来源的区域。
发明详述
本文使用的“1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的原代分离株”通过在来自供体的外周血单核细胞(PBMC)上限制性培养至第5代得到。原代分离株可以从已经在人T-淋巴细胞系中传代若干次的T细胞系适应性(TCLA)实验室株系例如Ⅲb/LAI、SF2、和MN中分辩出来。首先，大多数原代分离株不易在T细胞系中生长，它们表现合胞体诱导(SI)和非-合胞体诱导(NSI)表型。例如，很多在PBMC培养物中诱导合胞体形成的原代分离株将在HIV-特别敏感的MT2 T细胞系中复制，但很少一部分在几乎不许可的T细胞系例如CEM或H9中复制。NSI原代分离株将仅在原代T细胞中复制。其次，它们与TCLA株系不同之处在于它们在体外对病毒受体蛋白质CD4的重组可溶形式(rsCD4)的中和的敏感性(Daar等，PNAS USA,1990,87:6574-6578)。第三，实验室-适应性株系对特异于病毒包膜的抗体的中和敏感，而原代分离株是抗性的(Sawyer等，病毒学杂志，1994,68:1342；Mascola等，传染病杂志，1996,173:340)。
本文使用的“CD4”指所有由天然存在的CD4基因编码的CD4蛋白质。起初CD4被描述成一种T-辅助淋巴细胞的细胞表面标识。之后发现CD4很少在单核细胞、岛细胞、小神经胶质细胞、和B细胞类成分上表达。还发现CD4分子通过其作为MHCⅡ类分子受体的功能直接参与抗原-特异性T辅助细胞的激活。在1984年，发现人CD4是HIV的受体(Dalgleish等，自然，1984,312:763)。HIV包膜糖蛋白，gp120与CD4的结合代表病毒侵入目标细胞的第一步。人CD4的氨基酸序列从Maddon等的文献中引入本文(细胞，1985,42:93；和Littman等，细胞，1988,55:541)，如图1和SEQ ID NO:1所示。
本文使用的“重组可溶性CD4”或“rsCD4”是一种由人CD4的AA1-AA375组成的重组微生物或细胞表达的多肽(图1,SEQ IDNO:1)。
本文使用的“表面CD4复合物”或“含有CD4的表面复合物”或“含有CD4的表面受体/共同受体复合物”指CD4蛋白质在其自然环境中在哺乳动物细胞表面和/或与任何相关膜蛋白复合在一起出现的完整自身CD4蛋白质。
本文使用的术语“免疫原”涉及一种肽组合物，当其对宿主施用时，能够诱导针对存在于CD4的CDR2结构域(SEQ ID NOS:2和3)上的目标效应子位点的抗体，产生对来源于1型HIV(HIV-1)和2型HIV(HIV-2)所有进化枝的原代分离株具有广泛中和活性的高效价抗体。图1中CDR2-CD4目标位点用下化线表示，同时在SEQ IDNOS:2和3中列出。
本发明的“CD4-CDR2抗原肽”的长度约为25至50，优选30到46个氨基酸之间，含有两个由28到40个氨基酸残基的插入序列分隔开的半胱氨酸残基。插入序列可以是SEQ ID NO:1的残基27-66所代表序列的任何连续部分，或者可以是一种SEQ ID NO:1的残基27-66的免疫学功能类似物。
本文使用的肽结合物指含有共价连接有Th辅助表位肽的CD4-CDR2抗原肽，除了分子的直接肽合成之外，可通过任何其它方法进行共价连接。CD4-CDR2抗原肽于Th表位肽共价偶联以形成肽结合物的实例是硫醇-卤族乙酰胺偶联，硫醇-马来酰亚胺偶联，硫醇-硫醇链间二硫键形成等。
本文使用的“肽免疫原”指一种肽或肽结合物，其含有共价连接有Th表位肽的CD4-CDR2抗原肽，任选进一步含有一种常规的免疫刺激肽，一种连接物，和本文进一步描述的间隔区；其具有诱导抗CD4-CDR2抗原肽的抗体的能力。
本文使用的术语“类似物”指与高达约10％氨基酸的保守取代具有基本上相同氨基酸序列的肽。保守取代是其中一个氨基酸被另一个氨基酸取代，优选从同类氨基酸(例如，疏水、极性、带电荷等)中的一个取代，但不明显改变肽的免疫学性质的那些取代。类似物可以人工得到，也可以作为本文公开的肽序列的天然存在变异体出现。
免疫学功能类似物是诱导免疫系统基本上相同反应，例如，T-细胞应答、B-细胞应答、或诱导抗特定抗原的抗体的类似物。
本发明涉及新的肽组合物用作免疫原的应用。该免疫原对于通过主动免疫在哺乳动物包括人体内产生高效价的抗CD4的CDR2结构域上的效应位点(SEQ ID NOS:2和3)的抗体是有用的。本发明的免疫原对于预防和治疗免疫缺陷病毒感染以及对于指不期望的CD4+细胞-介导的免疫应答，例如移植排斥和自主免疫疾病例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、和牛皮癣。
这种特异性CD4-反应性抗体在预防和治疗HIV感染和免疫疾病方面的应用，即一种免疫治疗，能够通过用对CD4的CDR2-样结构域上的位点特异的“位点靶向”抗体预防性治疗被动获得。如本文所述，更优选的治疗可以通过主动免疫，即通过用含有一种或多种本发明的肽免疫原的组合物接种宿主实现。这些免疫原诱导宿主产生自身位点靶向CD4-CDR2反应性抗体，该抗体具有抗1型HIV(HIV-1)和2型HIV(HIV-2)所有进化枝的原代分离株的广泛中和活性。相信这些主动免疫将提供比被动免疫更有效和长期的保护。
人CD4(SEQ IDNOS:2和3)的CDR2-样结构域上的目标位点(SEQ ID NOS:2和3)是构象限制性的，即通过在N和C末端添加半胱氨酸残基环化(SEQ ID NOS:4和5)。该目标位点还可以包括含有1-5个来自SEQ ID NOS:2和3末端之一附加氨基酸的SEQ IDNOS:4和5的免疫类似物(例如，SEQ ID NOS:10和11)，只要保留有单一二硫键的环结构。
通过将目标位点化学偶联到载体蛋白质，例如，匙孔帽贝血蓝蛋白、(KLH)和改性的百日咳内毒素A(PEA)上，进一步将其修饰成为免疫原性CD4-CDR2抗原肽。该基于“CD4-CDR2抗原肽-载体蛋白质”的疫苗的缺陷在于(1)目标抗原位点的弱的免疫原性，一种与几乎所有自身-抗原相关的内在问题；(2)很大一部分抗载体蛋白质的非功能性抗体；和(3)载体-诱导的表位抑制潜力。
因此通过化学偶联或优选通过直接肽合成串联附加化学定义为混杂Th和/或其它免疫刺激肽，赋予肽免疫原性是优选的。本发明的优选的免疫原使不相关抗体的产生减至最小，从而刺激对“目标序列”更为专一的免疫应答。理想的抗体具有与CD4表面复合物的反应性，但不产生可能使预防和治疗HIV感染和免疫疾病的免疫治疗过程复杂化的不期望的副作用。而且，靶向所需位点的位点特异性抗体可以在遗传多样化宿主群中通过应用混杂Th更广泛地产生。这些抗体应答产生对1型和2型HIV所有进化枝的原代分离株具有广泛中和活性的高效价抗体。
本发明还涉及应用所述肽组合物作为免疫原预防和治疗免疫缺陷病毒以及治疗CD4细胞-介导的不期望的免疫应答例如移植排斥、和自主免疫疾病例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、和牛皮癣。
与特异于rsCD4的抗体有所不同，特异于包含CD4的宿主细胞表面受体/共同-受体复合物的抗体可能在以下几个方面与免疫系统相互作用：
1．它们可能阻断CD4-表达性T细胞和其它活性T细胞、B细胞、或单核细胞之间的CD4-Ⅱ类相互作用；
2．它们可能给T细胞传送信号，因此抑制正常CD4+T-细胞介导的免疫调节功能；
3．它们可能通过T细胞受体分子同时接合引发细胞凋亡，而诱导CD4-表达性细胞死亡；
4．它们阻断CD4和HIV之间的相互作用，其抑制HIV-介导的免疫病理学。
抗含有CD4的表面复合物的抗体是预防和治疗HIV感染和HIV-相关性疾病包括AIDS的良好侯选物。在一个更普遍的水平上，抗表面CD4复合物的抗体可能对于预防或治愈CD4-表达性T细胞介导的不期望的免疫应答，例如移植排斥、和自主免疫疾病例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、或牛皮癣有效。
由本发明的肽组合物产生的抗体的特性基于实施例1-5得到的结果概括如下：
1．在ELISA分析中结合rsCD4；
2．在免疫荧光分析中结合CD4-表达性细胞；和
3．在体外微平板分析中中和中和抗性-HIV原代分离株。
具有这些特征的抗体在预防和治疗主要目标为CD4-阳性细胞的感染原导致的人类疾病中尤其有用。因此，本发明提供了肽组合物作为免疫原，用于预防和治疗主要目标为CD4-阳性细胞的感染原导致的人类疾病，特别是HIV-相关性疾病包括AIDS的所有阶段。本发明还提供了这些抗体组合物的应用方法。
本发明的肽组合物包括肽免疫原，其插入定位在CD4的CDR2-样结构域上相应目标效应子位点的两个肽序列之一(SEQ ID NOS:2和3)，或其免疫功能类似物。该免疫原的特征在于它们诱导抗CD4的CDR2结构域上的CD4/共同-受体效应子位点的中和抗体。该免疫原依靠经(1)精确的表位作图；(2)由于它们的自身构象，环化以限制它们的构象；和(3)它们广泛的反应性Th应答获得的其优化的位点特异性，来诱导保护性抗体应答。
具体地说，目标位点来自自身人CD4序列的CDR2-样结构域。人CD4的氨基酸序列来自Maddon等(细胞，1985；42:93；和Littman等，细胞，1988；55:541-)的文献，将其引入本文，在图1和SEQID NO:1中表示。CD4-CDR2目标位点如图1中的下划线部分所示，并在SEQ ID NOS:2和3中列出。本发明的肽组合物优选作为含有目标位点(SEQ ID NOS:2和3)的合成肽产生，其中目标物通过在或靠近其自身序列的N末端和C末端插入半胱氨酸残基被修饰，以便促进环化肽的形成(例如SEQ ID NOS:4和5)。
本发明的肽组合物还包括可能含有来自SEQ ID NOS:2和3末端之一的1-5个附加氨基酸的SEQ ID NOS:4和5的免疫类似物(例如，SEQ ID NOS:10和11)，只要保留有单一二硫键的环结构。目标位点还包括含有一个长度约为25-50个氨基酸、具有来自SEQ ID NOS:2和3的连续氨基酸序列的环化肽的免疫功能类似物。环状结构是本发明的基本要素，因为含有目标位点的线性对应物的肽不能诱导具有中和HIV原代分离株活性的抗体。
另外，通过将载体蛋白质与合成的免疫刺激物质例如来源于致病性病毒和细菌的混杂Th表位、人工混杂Th表位、和常规免疫刺激肽共价连接，赋予本发明的肽的目标位点免疫原性。载体蛋白质和免疫刺激物质的具体实例已有提供，例如匙孔帽贝血蓝蛋白(KLH)载体蛋白质、改性的百日咳内毒素A(PEA)载体蛋白质、来源于乙肝病毒表面抗原的Th(SEQ ID NO:8)、人工Th(例如，SEQ ID NO:6)、和来源于耶尔森氏鼠疫杆菌的常规免疫刺激侵袭素肽(Inv)(SEQID NO:7)。
本发明的完全合成肽可以由下式表示：(A)n-(Th)m-(B)o-(CD4-CDR2抗原肽)-X
或(A)n(CD4-CDR2抗原肽)-(B)o-(Th)m-X
或(CD4-CDR2抗原肽)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
或(Th)m-(B)o-(CD4-CDR2抗原肽)-(A)n-X
其中：
每个A独立地为氨基酸、α-NH2、或常规免疫刺激肽；
每个B独立地选自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亚胺基(ε-N)Lys-、和-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亚胺)-；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
Th是一种辅助T细胞表位或一种免疫增强类似物或其片段；
“CD4-CDR2抗原肽”如前面的定义，优选为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5，或其交叉反应性免疫功能类似物；
n为1至约10；
m为1至约4；和
o为0至约10。
本发明的肽组合物含有长度约为30到115个氨基酸残基，优选约为40到90个氨基酸残基，更优选约为50到80个氨基酸残基的肽免疫原。
如果A为一种氨基酸，它可以是任何天然存在的或非天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸包括但不限于D-氨基酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺氨酸、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸等。而且，如果m大于1，二个或三个A基团为氨基酸，那么每个氨基酸可以独立地相同或不同。
如果A为一种侵染素的结构域，则它可以是来自耶尔森氏鼠疫杆菌种侵染素蛋白的免疫刺激表位。这种免疫刺激特性来源于这种侵染素结构域与T细胞上存在的β1整联蛋白分子相互作用的能力。发现与β1整联蛋白相互作用的侵染素结构域的特定序列已经由Brett等描述(欧洲免疫学杂志，1993；23:1608)。
在US 5759551中已经描述过用于连接混杂Th表位的侵染素结构域(Inv)的一种优选实施方式，其经参考插入本文。Inv结构域优选具有如下序列：Thr-Ala-Lys--Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-Gln-Phe
                                                 (SEQ ID NO:7)或为来源于另一种耶尔森氏鼠疫杆菌种侵染素蛋白相应区域的其免疫刺激类似物。这种类似物还可以含有取代、删除或株系变异，只要类似物保留免疫刺激特性。这种侵染素结构域优选通过一种间隔区结合，只要将氨基酸“A”添加到Th肽上。
在一个优选实施方式中，n为3，(A)3依次为一种侵染素结构域(Inv)、甘氨酸和甘氨酸。
(B)o任选为一种间隔区，可包括天然存在或上述非天然存在的氨基酸。每个B独立地相同或不同。载体蛋白质通过间隔区(例如，Lys-Lys-Lys)经化学偶联与肽共价结合。(B)o氨基酸还可以为一种位于混杂Th表位和CD4-CDR2抗原肽(SEQ ID NOS:4和5)之间的间隔区，例如Gly-Gly或εNLys，以便诱导有效的抗体应答。除了使Th表位与B细胞表位(例如SEQ ID NOS:4和5)和其免疫类似物物理分隔，一种间隔区例如Gly-Gly可以破坏Th表位与CD4-CDR2抗原肽结合产生的所有人工二级结构，因此减弱了Th和/或B细胞应答之间的干扰。
(B)o的氨基酸还可以构成一种作为增强Th和IgE结构域分隔作用的柔韧性绞链的间隔区。在免疫球蛋白重链绞链区中发现了编码柔韧性绞链的序列的实例。柔韧性绞链序列通常富含脯氨酸。一种特别有用的柔韧性绞链为序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ IDNO:9)，其中Xaa为任意氨基酸，优选为天冬氨酸。由(B)o氨基酸提供的构象间隔使本发明的肽免疫原和合适Th细胞和B细胞之间的相互作用更为有效，由此增强了对Th表位和抗体-诱导性表位以及它们的交叉相互反应性和免疫功能类似物的免疫应答。
Th是一种含有Th表位的氨基酸序列(天然或非天然氨基酸)。Th表位可以由连续或不连续表位构成，因此不是Th的每一个氨基酸一定是表位的一部分。Th表位，包括Th表位的类似物和片段，能够增强或刺激对CD4-CDR2抗原肽(例如，SEQ ID NOS:4和5，以及其免疫功能类似物)的免疫应答。表现为免疫结构域和混杂的Th表位在动物和人群中与广泛的趋异进化MHC型具有高度和广泛的反应性(Partidos等，1991；US 5759551)。本发明肽的Th结构域约具有10到50个氨基酸，优选约具有10到30个氨基酸。当出现多重Th表位(即m≥2)，则每个Th表位独立地相同或不同。Th片段是Th表位的连续部分，其足以增强或刺激对CD4-CDR2抗原肽(例如，SEQID NOS:4和5)，和/或对其免疫功能类似物的免疫应答。
本发明的表位包括来源于外源病原体以及作为实施例提供的那些表位，但不限于此，乙肝病毒表面和核心抗原辅助T细胞表位(HBsTH和HBc Th)、百日咳毒素辅助T细胞表位(PT Th)、破伤风毒素辅助T细胞表位(TT Th)、麻疹病毒F蛋白辅助T细胞表位(MVF Th)、沙眼衣原体主要外膜蛋白辅助T细胞表位(CT Th)、白喉毒素辅助T细胞表位(DT Th)、镰状疟原虫环孢子体辅助T细胞表位(PF Th)、曼森氏血吸虫三糖磷酸盐异构酶辅助T细胞表位(SM Th)，及大肠杆菌TraT辅助T细胞表位(TraT Th)。病原体衍生的Th在US 5759551中的SEQ ID NOS:2-9和42-52列出；衣原体辅助位点P11在Stagg等，免疫学，1993,79:1-9中列出；HBc肽50-69在Ferrari等，临床研究杂志，1991,88:214-222中列出，它们经参考插入本文，并一起在本文中SEQIDNOS:8、13、38-58(表8)列出。
Th表位进一步包括人工理想化Th，例如，SEQ ID NOS:6,12,36,59(表9)，及其免疫功能类似物。Th的功能类似物包括免疫增强类似物、交叉反应性类似物和这些Th表位的片段。功能性Th类似物进一步包括在Th表位中保守地取代、添加、删除和插入1至约10个氨基酸残基，其基本上不改变Th表位的Th刺激功能。
本发明的肽结合物还包括与一种载体蛋白质(例如匙孔帽贝血蓝蛋白)偶联的CD4-CDR2抗原肽(例如SEQ ID NOS:4或5)。
本发明的优选肽是含有CD4-CDR2抗原肽(例如SEQ ID NOS:4或5，或其免疫功能类似物)和Th表位、以及任选地含有一种常规免疫刺激位点，例如，Inv(SEQ ID NO:7)。在一个更为优选的实施方式中，TH表位是一种来源于外源病原体的HBs Th、HBc Th、MVFTh、PT Th、TT Th、CT Th或HIV Th或一种理想化的人工Th、或它们的免疫功能类似物。任选地，A是一种常规免疫刺激肽，例如，Inv(SEQ ID NO:7)，优选经Gly-Gly或εNLys间隔区结合。
修饰位点的结构基于取自人CD4的CDR2-样结构域的肽序列(SEQ ID NO:1的氨基酸27-66)，或者来源于另一个物种的类似物序列。所述CD4-CDR2目标位点接受下列修饰：
(1)在靠近N-末端侧添加或插入一个半胱氨酸残基，
(2)在靠近C-末端侧，优选在或靠近66位或一个类似位置添加或插入一个半胱氨酸残基，和
(3)在保留的半胱氨酸之间形成一个二硫键，从而产生一个环状结构。
所述肽结构还可以包括1到5个取自CD4的27-66或39-66片段末端之一的附加氨基酸，只要保留单一二硫键环状结构(例如，SEQ IDNOS:10和11)。优选地，自身序列中非预期用于环化的任何插入半胱氨酸将被，例如丝氨酸，保守取代。
例如，人CD4-CDR2目标位点(SEQ IDNOS:2和3)通过在或靠近N-和C-末端加入半胱氨酸(例如，SEQ ID NOS:4和5)，或者通过在N-末端添加一个半胱氨酸和在C末端附近进行一个半胱氨酸取代(例如，将67位的Phe取代为Cys，得到SEQ ID NOS:10和11)的方式环化。具有下列序列的修饰、环化、和重叠的CD4-CDR2抗原肽通过实施例的方式提供：
Cys His Trp Lys Asn Trp Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly  Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys LeuAsn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp GlnGly Asn Cys                      (SEQ ID NO.:4)Cys Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser LysLeu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp AspGln Gly Asn Cys                     (SEQ ID NO.:5)Cys His Trp Lys Asn Trp Asn Gln Ile Lys Ile Leu GlyAsn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys LeuAsn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp GlnGly Asn Cys Pro Leu Ile Ile            (SEQ ID NO.:10)Cys Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser LysLeu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp AspGln Gly Asn Cys Pro Leu Ile Ile        (SEQ ID NO:11)在这些实施例中，修饰位置通过黑体字说明。
通过含有本发明的CD4-CDR2抗原肽的肽免疫原诱导的抗体与宿主细胞的含有CD4的表面受体/共同受体复合物交叉反应，并中和HIV的原代分离株。其它物种的细胞表面CD4的相应目标抗原性位点同样也能够来源于相关物种的同源片段。
CD4-CDR2抗原肽的交叉反应性和免疫功能类似物(SEQ IDNOS:4、5、10和11)可以进一步包括保守取代、添加、删除、或插入一到四个氨基酸残基，只要该肽类似物能够诱导与CD4-CDR2(SEQ IDNOS:2、3、4和5)交叉反应性和具有中和HIV原代分离株活性的免疫应答。保守取代、添加、和插入对于本领域技术人员是已知的，并可以用天然或本文限定的非-天然氨基酸轻易地实现。
本发明的优选的肽免疫原为含有以下组成分的肽：(1)本文中称之为CD4-CDR2抗原肽的环状、修饰的CD4-CDR2位点(例如，SEQID NOS:4、5、10和11)或其免疫类似物，和(2)表位肽。更优选的肽免疫原是那些含有环化CD4-CDR2抗原肽(SEQ ID NOS:4、5、10和11)或其交叉反应性和免疫功能类似物的串联结构；一种间隔区(例如，Gly-Gly或εNLys)；一种选自HBs Th、HBc Th、MVF Th、PT Th、TT Th、SMTh、HIVTh的Th表位(例如，SEQ ID NOS:8、38-50、55)，一种人工Th(例如，SEQ ID NOS:6、12、36、59)、或一种其类似物；和任选地，一种Inv结构域(SEQ ID NO:7)或其类似物。
本发明的肽免疫原可以通过本领域普通技术人员公知的化学合成法制备。参见，例如，Fields等，《合成肽：用户指南》第三章，Grant,W.H.编，Freeman和Co.,New York,NY,1992,p.77。因此，可以应用固相合成法--自动匹配Merrifield技术，用t-Boc或Fmoc化合物保护α-NH2，并应用商业提供的侧链保护的氨基酸合成肽。用于肽合成的适当装置的实例为430A或431型应用生物系统肽合成仪(the Applied Biosystems肽Synthesizer Models 430A or 431)。
完成所需肽免疫原的装配后，按照标准程序处理树脂，以从树脂上切除肽，并使氨基酸侧链上的功能基团脱封闭。通过HPLC纯化游离肽，通过例如氨基酸分析、质谱、和/或通过测序鉴定生化特征。肽的纯化和特征鉴定方法对于本领域技术人员是公知的。
其它产生本发明的含有CD4和Th位点的肽结构物的化学方法包括通过形成一种“硫醚”键连接卤族乙酰化和半胱氨酰化肽。例如，可以将一个半胱氨酸加到含Th肽的C末端，半胱氨酸的硫基可以用于与结合到CD4-CDR2抗原肽的N-末端的亲电基团形成一个共价键(例如，一个半胱氨酸的一个N-(氯乙酰)或一个源于马来酰亚胺的α-或ε-NH2基)。在该模式中，含有Th-(B)o-(CD4-CDR2抗原TAI)或其反向，(CD4-CDR2抗原肽)-(B)o-Th，有或没有常规免疫刺激位点的肽结合物组合物可以得到，其中连接物“B”之一为Gly-Gly、(ε-N)Lys、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亚胺(ε-N)Lys-，或者-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亚胺)-。
本发明的免疫原还可以是聚合的。可以通过将免疫原与交联剂利用常规方法反应实现，例如通过戊二醛和赖氨酸残基的-NH2之间的反应。
通过另一种方法，即通过应用一个添加到免疫原N-末端的附加半胱氨酸残基使合成肽免疫原聚合或共聚合。N-末端半胱氨酸的巯基可以用于与卤族乙酰基修饰的氨基酸或一种结合于分支的多聚-赖氨酰核心分子(例如，K2K、K4K2K或K8K4K2K)的N-末端赖氨酸残基的马来酰亚胺基来源的α-或ε-NH2基形成一种“硫醚”键。还可以通过在一种分支的多聚赖氨酰核心树脂上直接合成所需的肽结构，使本发明的免疫原聚合成为一种分支结构(Wang等，科学，1991；254:285-288)。
或者，较长的合成肽免疫原可以通过公知的重组DNA技术合成。一些关于DNA技术的标准手册提供了详细的制备本发明肽的方法。为了构建编码本发明肽的基因，将氨基酸序列逆向翻译成一种核酸序列，优选利用应用于基因将在其中表达的有机体的优化密码子。接着，制备合成基因，通常通过合成编码肽和任何必需调控元件的重叠寡核苷酸。将合成基因插入适当的克隆载体，得到重组体并鉴定特征。然后在选择的表达系统和宿主适合的适当条件下表达肽。
上述核酸自身可以用作称之为“DNA疫苗”的成分。在本发明的所述实施方式中，通过将编码所述肽的核酸，优选应用在人类细胞中优化表达的密码子和启动子，导入患者自身细胞，诱导本发明的免疫原性肽在那些细胞中表达。制备和应用DNA疫苗的方法公开于US专利5580859,5589466，和5703055；同时参见WO97/02840和W.McKonnell和F.Askari，新英格兰医学杂志，1996,334:2-45，它们均经被参考插入本文。认为制备和应用本发明的肽和肽结合物的方法在本发明的范围内。
本发明的肽组合物的效果可以通过注射动物例如，豚鼠，然后通过检查免疫血清中和HIV原代分离株的能力，监测对CD4-CDR2抗原肽的激素免疫应答证实，如实施例中的详细描述。
本发明的另一方面提供了一种在一种药物可接受的传送系统中含有一种免疫有效量的一种或多种本发明的肽免疫原的疫苗组合物。该免疫原性组合物用于预防和治疗免疫缺陷病毒感染以及用于治疗不期望的CD4-表达性T细胞介导的免疫应答例如移植排斥、和自主免疫疾病例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、和牛皮癣
因此，可以应用佐剂、乳化剂、药物可接受载体或其它疫苗组合物中常规提供的成分将本发明的肽组合物配制成一种免疫原性组合物。可以用于本发明的佐剂或乳化剂包括明矾、不完全弗氏佐剂、liposyn、皂甙、角鲨烯、L121、emulsigen、单磷脂酰脂类A(MPL)、二甲基-二-十八烷基溴化氨(DDA)、QS21、ISA206、和ISA 720，以及其它已知的有效佐剂和乳化剂。本领域普通技术人员能够容易地确定所述制剂，所述制剂还包括速释和/或缓释制剂，以及用于诱导系统免疫性和/或诱导局部粘膜免疫性的制剂，其可以通过，例如，免疫原包封或与微粒共同给药实现。本发明的疫苗可以通过任何常规途径给药，包括皮下、口服、肌内、或其它非肠道或肠道途径给药。同样，免疫原可以作为单剂量或多剂量给药。本领域普通技术人员能够容易地确定免疫方案。
本发明的免疫原性组合物含有一种有效量的一种或多种本发明的肽免疫原和一种药物可接受的载体。在一种适当剂量单位剂型中的组合物通常含有每公斤体重约0.5μg到约1mg的免疫原。如果以多剂量给药，可以方便地分成每剂量单位制剂的适当量。例如，初始剂量，例如0.2-2.5mg，优选1mg的由本发明的肽组合物表示的免疫原将通过注射优选肌肉内注射给药，然后施用重复剂量(增强量)。剂量将根据患者的年龄、体重和一般健康状况而定，正如疫苗和治疗领域公知的那样。
含有两种或多种Th表位的本发明肽免疫原混合物的疫苗可以在更广泛的人群中增强免疫效果，由此提供了一种对CD4-CDR2抗原肽(例如，SEQ ID NOS:4和5)的改善的免疫应答。
对本发明的合成CD4-CDR2免疫原的免疫应答可以通过捕获在O’Hagan等(疫苗，1991；9:768)描述类型的生物可降解微粒中或其上传送来改进。可以将免疫原与或不与佐剂一起包封，所述微粒能够运载一种免疫刺激佐剂。微粒还可以与肽免疫原一同给药，以加强免疫应答，包括特别适用于病毒例如HIV经粘膜运送的局部粘膜免疫性，并提供用于口服给药和局部给药的延时或周期性应答的时间-控制释放(O’Hagan等，1991；和Eldridge等，1991；28:287)。
为了更好地理解本发明，阐述下列实施例。这些实施例仅为了举例说明，并不构成对本发明范围的任何形式的限制。
实施例
以下实施例的目标抗原位点肽通过实施例1中描述的固相法合成。每种肽可以由下式表示：(A)n-(Th)m-(B)o-(CD4-CDR2抗原肽)或者(A)n-(CD4-CDR2抗原肽)-(B)o-(Th)m，但上面描述的其它通式也被包括在本发明之内。CD4目标抗原位点是一种环状肽，由SEQ IDNOS:4、5、10、和11示例说明，但包括长度约为25-50个氨基酸、具有来源于SEQ ID NOS:2或3的一个连续氨基酸序列和一个结合在环状结构的N-或C-末端的附加的5个氨基酸序列的环状肽的免疫功能类似物也应该在本发明范围内。
用于这些实施例的每种肽具有Gly-Gly或Nlys作为Th和修饰的CD4-CDR2目标位点免疫元件之间的(B)o间隔区，某些插入一种任选的含有Inv-Gly-Gly(其中Inv(SEQ ID NO:7)与抗原肽(例如，SEQID NOS:32-35)偶联)的(A)3元件，但本发明的肽还含有其它间隔区(例如，SEQ ID NO:9,NLys)或没有间隔区。Th表位，如表8中的示例，包括来源于外源病原体例如乙肝病毒表面和核心抗原和麻疹病毒F蛋白的混杂辅助位点，和表8中显示的其它Th表位(SEQ IDNOS:8、13、和43-58)以及表9所示的人工Th(例如SEQ ID NOS:6、12、36、59)。这些实施例的肽还包括一种任选的常规免疫刺激位点(例如SEQ ID NO:7)。另外，本发明不限于Inv作为附加的免疫刺激元件。
实施例1
表面CD4/共同受体复合物上的潜在效应子位点的鉴定A．肽的设计
在人CD4的所有四种结构域内的位点以及代表四种趋化因子受体的外部结构域的共同受体位点，包括CC-CKR1、CC-CKR2b、CC-CKR3、CCKR5和LESTR被选择出来作为肽的模拟物。因为识别的“表位”(WO97/46697)是一种天然构型，因此来源于上述受体/共同受体的线形肽均不与MAb B4强烈反应，虽然在存在某些来源于WO97/46697所示的趋化因子共同受体结构域的肽时，MAb B4与rsCD4的反应性被显著增强。
尽管MAb B4与任何单一CD4-或趋化因子共同受体来源肽缺乏强烈的反应性，但是检测到MAb B4对来源于CD4多种区域(AA1-A20,AA81-92,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-251,AA297-AA351,or AA361-AA375)的弱反应性。这提示了一种不同的辅助设计合成肽的研究，其将诱导对MAb B4识别的构象位点相邻的位点具有反应性的高度亲和抗体，用来抑制目标细胞的HIV感染。
因此这种遍布CD4的所有四种结构域和多种趋化因子共同受体的外部结构域的潜在位点序列将被设计，和被合成作为目标肽，并通过将来源于HBsAg(SEQ ID NO:8)和Inv(SEQ ID NO:7)的混杂Th与目标位点连接构建肽(如表1和表2所示)，合成免疫原。这些结构域中的特定CD4被选择用于环化，其基于Brookhaven关于人CD4的表面暴露环的3-维模型预测(http:www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids)。将特定环状限制安置到这些肽中，以便使目标抗原位点和天然CD4分子之间的交叉反应最大化。
因此，表1和2中的几个合成结构用天然序列中没有发现、引入的半胱氨酸合成，以产生Brookhaven模型所预测的环结构模拟物中的二硫键环。在某些情况下，用丝氨酸取代天然存在的半胱氨酸，以便防止形成对该模型不利的构型。对于趋化因子共同受体来源肽，它们天然结构模拟物中外部结构域2和3肽之间的交联，如表2最右边所示，通过各自结构域中自然存在的半胱氨酸残基形成。
表1描述栏中标*的位点已经设计具有特定环化。其它肽位点是线形的。表1和2的构型栏中标“a”的肽代表单独的CD4或CCKR目标抗原位点。它们被用作基于肽的ELISA的底物抗原。标“b”的肽如图所示被合成与HBs Th位点(SEQ ID NO:8)串联连接的目标抗原位点。标“c”的肽是如表1和2所示与Inv结构域的免疫刺激肽(SEQ ID NO:7)串联合成的“b”构建体的变异体。设计为“d”的肽是与通过一个Gly-Gly连接结合到N-末端的第二Th肽，CT P11 TH(SEQ ID NO:13)串联合成的“b”构建体的变异体。标“e”的肽被合成成为具有定位在C末端的TH位点和构建体N-末端的目标抗原位点的若干“b”。标“g”的肽代表一种直接在多聚赖氨酸核心树脂上合成的分支四聚肽。标“x”的肽代表含有一种双链结构的肽，所述双链结构通过存在于各自链上的自然存在的半胱氨酸残基形成链间二硫键连接而成。
表1和2所示实验中应用，但没有在这里显示的其它Th位点应用了人工TH位点‘1、4、9 PALINDROMIC”(SEQ ID NO:6)和“SynTh(1、2、4)”(SEQ ID NO:12)。还制备了C末端上定位有Inv位点的肽，以及N末端上(CD4-CDR2抗原肽-GG-Th-GG-Inv)的CD4-CDR2抗原，但没有显示。
还应用用于分隔目标抗原位点和Th位点的Gly-Gly间隔区，以及分隔Th和Inv或第二Th免疫刺激位点的间隔区，合成了用于研究表1和2的“b”、“c”、“d”、“e”、“x”、和“其它”Th免疫原性肽。筛选得到的肽免疫原，得到具有在免疫的宿主中诱导具有下列特性的抗体能力的侯选目标抗原位点：
1．在ELISA分析中结合目标抗原位点；
2．在ELISA分析中，在CD4来源的抗原肽的情况下结合rsCD4，
3．在免疫荧光分析中结合表达含有CD4的细胞表面受体/共同受体复合物的T细胞；和
4．在体外微平板分析中中和中和抗性-HIV原代分离株。B．侯选目标抗原肽的筛选：1．CD4-和趋化因子受体-来源的目标抗原肽的合成
表1和2中列出的、其相应构型为“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、或“x”的肽分别通过Merrifield固相合成技术在AppliedBiosystems自动肽合成仪(430、431和433A型)上应用Fmoc化学合成。通过提供SEQ ID NO:6的设计中指定的适当比率的、用于在特定可变位置偶联的可替换氨基酸混合物，制备含有一种用于人工T细胞表位“(1、4、9 PALINDROMIC)Th”(SEQ ID NO:6)的构建合成抗原文库(SSAL)的肽免疫原。具有为B细胞目标抗原位点或其它SSAL TH位点而设计的文库的SSAL肽能够以类似方式合成。当完成这些所需肽的组装后，按照标准程序应用三氟乙酸处理树脂，以从树脂上切除肽，并使氨基酸侧链上的保护基团脱封闭。对于环状肽，将切除下来的肽在15％DMSO水溶液中静置48小时，以促进链内半胱氨酸之间二硫键的形成。通过HPLC纯化经切除、提取和清洗的肽，通过质谱和反相HPLC鉴定特征。1．CD4和趋化因子受体-来源的目标抗原位点-特异性免疫血清的功能效果和评价的形成
按照如下描述的抗体应答血清学分析的实验免疫方案的指示评价肽组合物的免疫原性效果。标准实验设计：
免疫原：
(1)个体肽免疫原；或
(2)含有等摩尔比率的、各方案所指示的肽免疫原的混合
物。剂量：
每次免疫0.5 ml中含有100 μg，除非另有说明。途径：
肌内，除非另有说明。佐剂：
(1)弗氏完全佐剂(CFA)/不完全佐剂(IFA)；
(2)0.4％明矾(氢氧化铝)；或
(3)如说明的其它佐剂。每组每个免疫原一种佐剂。剂量方案：
0、2和4周；或0、3和6周；或另有说明。CFA/IFA组在
0周接受CFA，在跟着的几周接受IFA。明矾或其它指定佐
剂组对于所有剂量均接受同样的配方。取血方案：
第0、3、6、和8周，或另有说明。动物品种：
Duncan Hartley豚鼠组数：
3只豚鼠/组分析：
用于每种免疫血清的抗-肽活性的具体ELISA。固相底物是对应“a”型的目标抗原肽(例如，CD4目标抗原肽，趋化因子受体来源的肽，等)。
采血，处理成血清，在通过ELISA用目标抗原肽测定效价之前储藏。2．血清和抗体
在几个血清学分析中评价下列血清学反应物，来源于豚鼠的免疫血清或者鼠科动物或人化单克隆抗体。如上述在免疫后的各时间点得到抗rsCD4、CD4-和趋化因子共同受体-来源的目标抗原位点的所有豚鼠血清。其它血清学反应物通过以前的研究或所述外界资源获得。它们偶尔为了比较的目的而被引入。
例如gp抗-gp120 V3 MN(抗-V3 MN)是从经一种相应于来自HIV-1 MN gp120的超可变V3结构域的合成肽抗原超免疫的豚鼠中收集的血清(Wang等，科学，1991,254:285-288)。从用约1013可能性HIV-1 V3序列的SSAL表示的肽复杂混合物超免疫的豚鼠中得到的GP抗-gp120 V3 MN文库血清汇集抗血清(抗-V3 SSAL)。用于免疫豚鼠的V3 MN和V3 SSAL免疫原是多分支的V3合成肽免疫原，其用于产生具有中和几种如Walfield等(《AIDS研究综述》第18章，Koff等编，Marcel Dekker:New york,1993,pp.345-360)所述的HIV-1实验株系的活性的多克隆抗体。
另一种抗-gp120抗体是一种被称为IgG1 b12的重组人单克隆抗体，其对CD4的gp120结合位点具有特异性(抗-gp120 CD4-BS)(Burton等，科学，1994,266:1024-1027)。从长期无症状的HIV-1血清阳性供体的骨髓制备的抗体-噬菌体陈列文库中产生作为一种Fab片段的IgG1 b12，然后通过克隆到重组DNA IgG1表达载体中将其转化成一种完全人类抗体。它被看作中和多样性HIV原代分离株的抗体的“黄金标准”(Burton等，同上)。3．抗-肽的ELISA
通过ELISA(酶联免疫吸附分析)，应用相应的“a”型目标抗原肽作为免疫吸附剂涂布的96孔平底微滴度平板确定抗-肽的抗体活性。浓度为5μg/ml的目标抗原肽溶液的等分样(100μL)在37℃保温1小时。用3％明胶/PBS溶液封闭平板，再次于37℃保温1小时。然后干燥封闭平板，用于分析。实验免疫血清的等分样(100μL)，在样品稀释缓冲液中用1∶100的稀释度起始，然后将十倍连续稀释液加入肽涂布的平板中。平板在37℃保温1小时。
用0.05％PBS/TWEEN_缓冲液冲洗平板六次。加入适当稀释度的在结合稀释缓冲液(含有0.5 M NaCl、和正常山羊血清的磷酸盐缓冲液)中的100μL辣根过氧化物酶标记的山羊-抗-品种特异性抗体。平板在37℃保温1小时，然后如上述清洗。然后加入间苯二胺底物溶液的等分样(100μL)。用5-15分钟的时间形成颜色，然后加入50μL2N H2SO4终止酶颜色反应。在平板读数仪中记录各孔A492的含量。基于吸收度的线性回归分析，将截止A492置于0.5，计算以吸收度倒数的Log10显示的ELISA效价。该截止值是精确的，因为进行每次分析稀释正常豚鼠对照样品的值均少于0.15。4．确定与rsCD4、和与CD4-表达细胞的抗体反应能力
a．通过rsCD4 ELISA确定抗-CD4的反应性
从商业途径(美国生物技术公司，Cambridge,MA)和从NIH(USA)AIDS研究和参考试剂项目(NIH(USA)AIDS Research and ReferenceReagent Program)得到纯化的重组可溶性CD4(rsCD4)。用0.25μg/ml rsCD4的10mM NaHCO3缓冲液(pH9.5)每孔置100μL，在4℃保温过夜，得到的涂布96-孔微滴度平板用于进行rsCD4 ELISA。将250μL 3％重量的明胶PBS溶液加入rsCD4-涂布的孔中，于37℃保温1小时，以封闭结合位点的非特异性蛋白质，用含有体积百分比为0.05％TWEEN 20的PBS清洗3次，然后干燥。
用含有体积百分比为20％的正常山羊血清、重量百分比为1％的明胶和体积百分比为0.05％的TWEEN 20的PBS以1∶20的体积对体积稀释度连续稀释免疫血清或单克隆抗体，除非另有说明。将100μL的稀释样品加入各孔，使其在37℃反应1小时。然后用体积百分比为0.05％TWEEN 20的PBS溶液清洗孔六次，以除去未结合的标记抗体。向各孔中加入在体积百分比为1％的正常山羊血清、体积百分比为0.05％TWEEN 20的PBS中稀释度为1∶1000的100μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗-小鼠IgG或山羊抗-豚鼠IgG，于37℃保温15分钟。用体积百分比为0.05％TWEEN 20的PBS清洗孔6次，以除去未结合的标记抗体结合物，然后与100μL含有重量百分比为0.04％间苯二胺(OPD)和体积百分比为0.12％过氧化氢的柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)底物混合物反应15分钟。加入100μL 1.0 M H2SO4中止反应，测定492nm(A492)的吸收度。计算Log10抗体效价的倒数，评价各实验样品的终点反应性，如插入的线形回归，如抗-肽ELISA的描述。
a．通过间接免疫荧光染色确定对CD4-表达细胞的反应性
每孔0.5×106CD4-表达细胞(例如，HPB-ALL、MT2或SUP-T1细胞系的细胞)在含有1％BSA的PBS中清洗两次，之后将它们与指定的免疫血清或单克隆抗体，以各实验所确定的最佳浓度，在室温下保温45分钟。当细胞与第一染色抗体保温后，在同样的清洗缓冲液中再清洗两次，然后与适当稀释度的第二种荧光素异硫氰酸酯(FITC)-结合的山羊抗-小鼠IgG或(FITC)-结合的山羊抗-品种特异性IgG试剂(Cappel,Malvern PA)一起在室温下保温45分钟。被染色的细胞再次在同样的清洗缓冲液中清洗，处理细胞通过用于确定染色细胞百分数和染色密度的细胞荧光照相和/或免疫荧光显微镜进行荧光分析。
b．间接荧光抑制分析
为了比较应用间接免疫荧光染色技术的“生物素酰化单克隆抗体B4-T细胞”的结合抑制分析，首先将细胞与干扰试剂或适当稀释的免疫血清共同保温，然后在同样的清洗缓冲液中清洗两次，之后加入生物素酰化的单克隆抗体B4。通过随后与适当稀释的FITC-抗生物素蛋白共同保温，完成CD4-表达T细胞的染色，然后再清洗三次，之后通过细胞荧光照相或高分辩荧光显微镜分析。5．通过抗体确定病毒中和
a．细胞
将人T细胞系MT-2(ATCC 237)在如以前所述的添加15％胎牛血清的Dulbecco’s改进Eagle培养基(Hanson等，临床微生物杂志，1990,28:2030-2034)中维持生长。通过Ficoll-Hypaque梯度分离(Organon Teknika Corp.,Durham,NC)从血沉棕黄层单元中分离HIV-1血清阴性供体的外周血单核细胞(PBMC)。得到的PBMC用0.5％PHA-P(Difco Laboratories,Detroit,MI)刺激。3-4天后，除去含PHA-P的培养基，细胞在添加15％胎牛血清、900μg/ml谷氨酰胺、抗生素、和5％白介素-2(Cellular Products,Inc.,Buffalo,NY)的RPMI中维持。
b．病毒
HIV-1 MN是一种由国立卫生研究所，Bethesda MD(NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program Catalog no.402)提供和维持的、作为持续感染的H9细胞培养物的TCLA株系，从中制备无细胞浓缩贮备液。通过PBMC共培养从患者PBMC制备HIV-1的原代分离株。制备在PBMC中不超过3-5代的原代分离株储备培养物，然后通过离心澄清(Sawyer等，病毒学杂志，1994,68:1342-1349)。California健康服务部，Berkeley CA的Carl Hanson提供它们。
c．MT-2微噬斑中和分析
应用连续稀释的血清或抗体与固定量的HIV预保温，随后感染HIV-敏感MT-2细胞，并形成显示HIV诱导的微噬斑的细胞单层，来确定HIV-中和抗体的效价。结果通过微噬斑定量记分。该分析仅适用于SI分离体，是TCLA还是原代分离株，因为微噬斑代表由MT-2细胞与HIV-感染细胞融合形成的巨大合胞体。该分析适用于评价病毒对细胞和细胞对细胞传递的抑制，因为合胞体形成的抑制来自抗体对HIV颗粒或HIV-感染细胞的作用，即，该分析测定了病毒对细胞HIV-诱导的融合或细胞对细胞HIV-诱导的融合的抑制。然后1周后通过列举propidium碘染色的噬斑观察到的噬斑的减少观察中和作用(参见，Hanson等，临床微生物学杂志，1990,28:2030-2034)。在该分析中，病毒和血清或抗体在50％汇集的、去除纤维蛋白的正常人血浆中稀释，以忽略任何非特异性增强或抑制效应。C．结果
用于免疫原性和初步功能研究的侯选CD4-或趋化因子共同受体-来源的目标抗原位点和肽在表1和2中描述。
用“b”或“c”型目标抗原位点如上述免疫豚鼠，除非表3和4中另有说明，首次免疫后的第6或8周收集的免疫血清通过抗-肽ELISA和rsCD4 ELISA如程序中的描述进行分析。
如表3和4中所示，大多数CD4-和趋化因子共同受体来源的肽免疫原具有高度免疫原性，因为它们诱导效价在2.5到＞5 Log10范围内的抗-肽抗体，除了肽p1590b、p1699b、p1699c和p1700b。含有CD4受体长片段(例如，p1612c、p1678b、p1678c、p1686b、p1697b、p1697b、p1817b、p1889b和p1901b)以及一些环化的目标位点的CD4-来源的抗原位点与rsCD4高度交叉反应，如同它们相应的＞3.5 Log10的抗-rsCD4的ELISA效价所示(参见表3,A2栏)。每种肽构建体与rsCD4的交叉反应性是不可预测的。而且，该rsCD4交叉反应性不延伸到相应宿主细胞表面的、肽构建体具有高度CD4交叉反应性的CD4，通过用HPB-ALL或MT2细胞系间接免疫荧光染色仅发现p1697b和p1901b与CD4表达T细胞具有强烈反应性(表3,B栏)。
相比较而言，来源于CD4目标抗原位点、具有环状结构的肽(例如p1472b、p1472c)或来源于CDR2结构域(例如p1403b、p1471c)的血清与CD4表达T细胞强烈反应，尽管它们与rsCD4的交叉反应性较低(表3,B栏)。对于趋化因子共同-受体，发现来源于肽构建体p1990、p1999、p2028、p2047、p2048、p2049、p2087和p2089的血清，其中大多数具有来自共同受体1、3或4结构域的序列，与“表面受体/共同受体复合物”反应(表4,B栏)。
上述结果表明与rsCD4或表明受体/共同受体复合物的交叉反应性是一种复杂且不可预测的现象，其被仅能够通过实验观察推测的构象特征影响。
还通过上述MT-2微噬斑中和分析筛选了由上述肽构建体获得的免疫血清(初始免疫后6或8周)的抗HIV-1B进化枝原代分离株VL 135的中和活性。尽管在某些免疫血清中存在与rsCD4或“表面CD4/共同受体复合物”交叉反应的高效价抗体，但该中和抗体未显示显著水平(表3和4,C栏)。
进一步评价与CD4-表达T细胞具有高亮度免疫荧光染色模式的免疫血清的抑制或阻断MAb B4与CD4表达T细胞结合的能力，以便确定靠近MAb B4识别构象表位的不连续位点的潜在效应子位点。从这些实验得到的结果可能得出有效地设计新的肽免疫原的思路。通过涉及“MAb B4-T细胞”结合的免疫荧光染色抑制的实验进行上述评价。将CD4+目标T细胞(例如，MT2 T细胞)与适当稀释(例如1∶10)的免疫原预保温，然后将细胞与生物素酰化的MAb B4和FITC-结合的抗生物素蛋白按照前面描述的详细程序共同保温。
在所有被评价的免疫血清中，仅发现通过用来源于CD4-CDR2结构域的肽p1471c免疫产生的血清抑制MAb B4的结合(表5)。用趋化因子共同受体来源肽免疫得到的那些血清不干扰“MAb B4-T细胞”的结合。该“MAb B4-T细胞”结合抑制作用的缺乏可能部分与抗体对潜在效应位点表现不够理想的亲合力有关，可能不单因为目标抗原位点所代表的位点至MAb B4识别位点的空间距离所致。
除了一个之外的全部抗受体和共同受体肽的超免疫血清均不能抑制MAb B4与T细胞的结合，而且没有表现抗HIV原代分离株的中和活性。进一步进行如下尝试，基于CD4序列中p1471的位置，设计具有目标的新的肽构建体，以捕获表面CD4上的潜在效应位点，通过“MAb B4-T细胞结合”抑制研究提供了线索。
更具体地说，含有在CD4-CDR2结构域周围、按照SEQ ID NO:1编号系统跨越20-75位氨基酸残基的目标抗原位点的肽被再次设计，在特别强调保留该区3D-结构的情况下，通过在来源于具有环状结构、大小在30-45个氨基酸之间的CDR2区的肽的N-和C-末端插入半胱氨酸残基重新设计了覆盖该区的其它肽构建体。来源于所述区域的代表性肽构建体的氨基酸序列如表6所示。
初始免疫后6或8周收集免疫血清，按照类似于前面筛选中所述的方法评价。在41个被评价的目标抗原位点中，发现p205、p2189、p2190、和p2240(SEQ ID NOS:4,11,10，和5)，即“c”构建体(SEQ IDNOS:32-35)能够诱导抗HIV-1原代分离株的中和抗体(表6)。分离株VL135(表6)(Sawyer等，病毒学杂志，1994,68:1342-1349)是一种代表性的中和抗性原代分离株。它不是一种能够用于提供表观但易误导阳性的非典型性中和敏感性原代分离株(D.Burton and J.Moore，天然药物，1998,4:495-48)。因此，这里观察到的病毒中和作用不是一种容易被中和的病毒的钝化作用，而证明是对HIV野生分离株攻击所产生的保护性免疫。在AIDS研究领域还未曾观察到化学概念的免疫原诱导具有上述严格HIV中和功能的抗体。尽管MAb B4对任何C4-CDR2结构域位点肽缺乏结合活性(如共同待审的专利申请公开文本WO97/46697中所示)，本文证明CD4-CDR2目标位点靠近构成中和性单克隆抗体B4的识别位点的不连续分布表位。该识别位点可能含有来自CD4所有四种结构域的的肽位点，这可能由于MAb B4识别的“包含CD4的表面受体/共同受体复合物”的弧形性质。这种“表面CD4”不同于众所周知的rsCD4的延伸3D-模型。值得注意的是仅某些来源于CD4-CDR2区的目标抗原位点，即跨越更宽区域并表现位环状肽的那些(例如，p2057c、p2189c、p2190c和p2240c,SEQ IDNOS:32-35)，诱导所述中和抗体。
实施例2肽p2057c和p2240c产生的超免疫血清表明广泛的抗HIV多种原代进
化枝的反应性中和抗体
如表7所示，在一个与MAb B4证明模式的平行模式中，来源于肽免疫原p2057c和p2240c(SEQ ID NOS:32和35)初始免疫后15和12周采集血样的超免疫血清均证明具有显著的、90％的抗HIV多种进化枝原代分离株的中和抗体效价。中和抗体效价范围为增加的级数，对于进化枝D、A、B(DH12)、E到B(VL 135)和进化枝C的原代分离株(是针对p2057c的免疫血清，SEQ ID NO:32)为1∶20至1∶185；对于进化枝D、B(DH12)、A、E到进化枝B(VL 135)的原代分离株(是针对p2240c的免疫血清，SEQ ID NO:35)为1∶20到1∶324。为了测定当量值，将MAb B4对HIV-1进化枝D、A、E、C、B(DH12)的原代分离株到进化枝B(原代分离株VL 135)的中和活性定在25.6μg/ml-1.54μg/ml范围内。相比较而言，针对N段gp120 V3区域的豚鼠血清及针对HIV-1 MN(MAb 50.1)gp120 N段的V3区域或较少变异构形的gp120 CD4结合位点(MAb IgG1b12)的单克隆抗体无法中和任何这类中和抗性HIV原代分离株。如表7所证明的，抗p2057c和抗p2240c的免疫血清(针对HIVA到E型原代分离株可提供90％的中和作用)的1∶20至1∶300稀释度近似为MAb B4在约300μg/ml的未稀释血清中的浓度(数值得自等量中和活性的血清稀释浓度与MAb B4浓度计算(即，MAb B4的平均浓度(μg/ml)x抗每种相应分离株的中和活性的免疫血清稀释系数)。
实施例3在具有保护恒河猴抗SIVmac251感染功效的血清中，
中和抗体效价的相互关系
在共同待审的专利申请WO97/46697中，通过MAb B4对抗以SIV实验性感染恒河猴的攻击实验评价MAb B4的保护功效及其在体内对中和抗体的相互关系，这也是针对人类AIDS常用的实验动物模型。
在该研究中，用MAb B4灌注恒河猴，在处理前、攻击前、及攻击后1小时的时间点收集血清用于评价。通过对预校正的MAb B4曲线的rsCD4免疫分析确定MAb B4抗体的血清浓度，发现对所有接受5mg/kg体重剂量的所有动物，MAb B4抗体的血清浓度均在30-45μg/ml范围内。在一年的监测期内，3/4接受MAb B4的动物可以被保护而对抗SIVmac251。存在于被攻击动物体内血清中的MAb B4的浓度(即，30-45μg/ml)远低于抗-(CD4-CDR2抗原肽)抗体的预估浓度(约300μg/ml)，它是已由一种含p2057c或p2240c(SEQ IDNOS:32和35)的免疫原成分免疫宿主后，存在宿主体内免疫血清中的抗体。
因此，以本发明的包含SEQ ID NOS:4、5、10和11或其类似物的本发明肽组合物免疫的宿主可预期具有保护性免疫性，从而避免被HIV多种进化枝的分离株所感染。
实施例4
包含一种混杂人工Th表位的免疫原性肽组合物
依照(SEQ ID NO:6)-Gly-Gly-(SEQ ID NO:5)的设计，合成一种人工Th/CD4-CDR2抗原肽，并命名为SEQ ID NO:60。
SEQ ID NO:60的肽被配制于ISA 206/DDA。ISA 206/DDA是一种油/水乳剂，其中将二甲基十八烷基溴化铵(DDA)分散于MONTANIDETM ISA 206(30mg/ml)(MONTANIDETM ISA 206是由SEPPIC Inc.,Fairfield,NJ)提供的油性可代谢溶液)。接着油性悬浮液以1∶1的体积比乳化于水性肽溶液，其已调整多肽含量以提供在最终0.5ml制备物中所需剂量量的肽组合物。
在上述制剂中，在0、3和6周接受100μg/剂量的豚鼠中建立SEQID NO:60的免疫原性。通过实施例1中描述的抗-肽ELISA，利用SEQ ID NO:5作为用于固相底物的环化目标抗原位点肽确定免疫原性。全部六只豚鼠均成功地血清转化成ELISA反应性。
显著地，还发现SEQ ID NO:60在大量动物中具有高度免疫原性和功能活性。在不完全弗氏佐剂(IFA)中配制含有SEQ ID NO:60的免疫原性组合物，300μg/剂量，然后在第0、3、和6周通过肌内注射施用给猪。经血清转化的猪及取自第8周的血清通过MT-2微噬斑中和作用分析(实施例1)测试对抗原代分离株HIV-1 VL135的中和作用活性。猪血清样品对以1∶249稀释度注入的病毒提供50％的中和作用；对1∶97稀释度则提供90％中和作用。因此，用本发明的肽组合物免疫赋予大型动物宿主一种免疫反应，这种反应包括抗体对包含CD4的宿主细胞受体和中和HIV的活性。
实施例5
本发明的代表性肽构建体
表10中所示的本发明的免疫原性肽是完全合成的构建体，其通过实施例1中描述的固相法合成。该表中的每种肽均可由式(A)n-(Th)m-(B)o-(CD4-CDR2抗原)-X表示，但前面公开的其它通式所代表的肽应当理解为在本发明的肽范围内。CD4-CDR2抗原序列是SEQ IDNO:4或5。所示的免疫原性肽包含人工Th位点(如表9所示)。该实施例的每种肽在免疫原性元件之间都有Gly-Gly间隔区，但本发明的肽还可能具有其它间隔区，例如εNLY或无间隔区。材料和方法
如实施例1所述将表10所列出的本发明的代表性肽构建体(SEQID NOS:60、61、和62)合成、切除、环化和纯化。配制所述肽构建体，免疫小动物例如豚鼠或大动物例如猪或狒狒，用于评价它们的免疫原性。将肽在体积为0.5ml的包含代表性乳化剂或佐剂例如ISA51、ISA720、DDA或单磷脂酰脂类A(MPL)中悬浮。对于豚鼠肽剂量为100μg，对于猪或狒狒为300μg，将动物肌肉内接种。
如表1的说明，动物在0、3和6周接受注射。通过实施例1描述的rsCD4 ELISA评价初始免疫后5、8或其它指定周测试血样对rsCD4的交叉反应性，然后仍然按照实施例1所述进一步测试它们中和HIV-1原代分离株的能力。结果
代表性肽构建体均具有相关的免疫原性，所有被测试的肽均诱导对相应rsCD4的强烈的位点-导向交叉反应性，正如在抗-人rsCD4ELISA中Log10效价超过3.5所示(表11)。还观察到从豚鼠、猪、和狒狒中得到的免疫血清具有中和HIV-1原代分离株(例如，VL135)的作用。狒狒血清的该功能性交叉反应性非常值得注意，因为狒狒血清中和人HIV原代分离株的作用几乎为一种人类系统。因此，该灵长类动物模型有力地指明了本发明的肽构建体作为通过主动免疫预防和/或免疫治疗HIV感染的试剂的功效。
                     表1
来源于CD4的肽的结构描述
   代码                描述   形式+     代码     描述     形式+
    - rsCD4     a     p1616 (C)CD4(40-43)(C)  *     b,c
  p1403 CD4(43-55)     b,c     p1617 (C)CD4(52-54)(C)*     b,c
  p1404 (C)CD4(38-47)(C)*     b,c     p1618 (C)CD4(51-55)(C)*     b,c
  p1405 CD4(81-92)     b,c     p1619 (C)CD4(48-52)(C)*     b,c
  p1406 CD4(18-29)     b,c     p1620 (C)CD4(85-90)(C)*     b,c
  p1460 CD4(1-109)     a     p1621 (C)CD4(85-89)(C)*     b,c
  p1468 CD4(47-64)     b,c     p1622 (C)CD4(85-90)(C)*     b,c
  p1469 CD4(39-45)     b,c     p1678 (C)CD4(291-306)(C)*     b,c
  p1470 (C)CD4(36-45)(C)*     b,c     p1679 (C)CD4(297-302)(C)*     b,c
  p1471 CD4(39-67)     b,c     p1680 (C) CD4(303-315)(C)*     b,c
  p1472 (C)CD4(115-130(C→S)-137)     b,c     p1681 (C)CD4(309-313)(C)*     b,c
  p1518 CD4(60-109)     b,c     p1682 (C)CD4(314-328)(C)*     b,c
  p1585 (C)CD4(36-47)(C)*     b,c     p1683 (C)CD4(291-306)(C)*     b,c
  p1586 (C)CD4(42-59)(C)*     b,c     p1684 (C)CD4(315-346)(C)*     b,c
  p1587 (C)CD4(44-56)(C)*     b,c     p1685 (C)CD4(338-343)(C)*     b,c
  p1588 (C)CD4(46-55)(C)*     b,c     p1686 (C)CD4(341-360)(C)*     b,c
  p1589 (C)CD4(79-96)(C)*     b,c     p1687 (C)CD4(349-353)(C)*     b,c
  p1590 (C)CD4(104-115)(C)*     b,c     p1688 (C)CD4(202-205)(C)*     b,c
  p1608 CD4(16-25)(C)*     c     p1689 (C)CD4(213-226)(C)*     b,c
  p1609 (C)CD4(118-128)(C)*     c     p1690 (C)CD4(217-221)(C)*     b,c
  p1610 (C)CD4(127-130(C→S)-141)(C)*     c     p1691 (C)CD4(228-239)(C)*     b,c
  p1611 (C)CD4(138-146)(C)*     c     p1692 (C)CD4(231-237)(C)*     b,c
  p1612 (C)CD4(133-153)(C)*     c     p1693 (C)CD4(235-251)(C)*     b,c
  p1613  CD4(159-169)(C)*     c     p1694 (C)CD4(243-246)(C)*     b,c
  p1615 (C)CD4(39-44)(C)*     b,c     p1695 (C)CD4(247-259)(C)*     b,c
  p1696 (C)CD4(250-255)(C)*     b,c     p1817 CD4[118-130(C)-159(C)-165]*     b
  p1697 (C)CD4(274-286)(C)*     b,c     p1818 CD4(81-92))XCD4(6-20)     bxa
  p1698 (C)CD4(277-282)(C)*     b,c     p1820 CD4(154-165)XCD4(117-140)     axb
                           表1(续页)
代码 描述 构成 代码 描述 构成
p1699 CD4(168-182) b,c p1821 CD4(154-165)XCD4(123- a  x  b
p1700 (C)CD4(151-178)(C)* b,c p1848 CD4[(68-92)-M] a
p1701 CD4(361-375) b,c p1856 CD4(79-88)XCD4(1-20) a  x  b
p1702 CD4(14-22) b p1857 CD4(79-88)XCD4(1-20) b  x  a
p1761 CD4(123-134) b p1858 CD4(1-20) b
p1763 CD4(72-92) b P1864 CD4(1-20))XCD4(156-173) b  x  a
p1765 (C)CD4(70-84) b p1868 CD4(297-351)* b
p1766 CD4(6-26) b p1875 CD4(87-98) b
p1767 CD4(6-20) b p1876 CD4(81-98) b
p1768 CD4(154-165) b p1877 CD4(76-98) b
p1769 CD4(156-173) b p1878 (C)CD4(77-98)(C)* b
p1770 CD4(146-170) b p1879 (C)CD4(77-103)* b
p1771 CD4(117-140) b p1880 CD4(72-103)* b
p1773 CD4(72-92)XCD4(6-26) a  x  b p1886 CD4(341-375) b
p1775 CD4(72-92)XCD4(6-20) a  x  b p1889 CD4(213-251) b
p1777 CD4(117-140))XCD4 a  x  b p1901 CD4(1-26) b
p1778 CD4(117-140))XCD4 a  x  b p1905 CD4(303-C345-353)* b
p1780 CD4(123-134))XCD4 a  x  b p2037 (C)CD4(68-C84-88)* b
p1781 CD4(123-134))XCD4 a  x  b p2038 (C)CD4(68-C84)* b
p1783 CD4(6-20)XCD4(72-92) a  x  b p2078 CD4(1-20) e
p1784 CD4(6-26)XCD4(72-92) a  x  b p2100 (C)CD4(68-C84-92)* b
p1813 CD4(79-88) b p2101 (C)CD4(68-C84-98)* b
+  肽构建体的构成被命名为a,b,c,e,g，和x，其中：a代表目标抗原位点b代表HBsTh-GG-目标抗原位点c代表Inv-GG-HBsTh-GG-目标抗原位点e代表目标抗原位点-GG-HBsThg代表在K2KAA核心上的分支四聚体目标抗原位点x代表通过链间二硫键交联的肽链* 通过在或靠近目标抗原位点N和C端的半胱氨酸环化的肽
                          表2
来源于β趋化因子受体的肽的结构描述
趋化因子受体的类型                              代表趋化因子受体外部结构域的肽抗原
           1              2              3             4                2/3
代码 描述 构成 代码 描述  +  代码 描述  + 代码 描述  + 代码  描述   +
CC-CKR1# p1999  AA1-AA34  e  p2004 AA94-AA107  e  p2027 AA168-AA203  b  p2028 AA261-AA287  b p2006  AA94-AA107XAA172-AA203  dxa
CC-CKR2# p2086  AA1-AA43  e  p2087 AA100-AA114  b  p2088 AA182-AA207  b  p2089 AA269-AA285  b p2091  AA100-AA114XAA182-AA207  bxa
CC-CKR3# p2079  AA1-AA35  e  p2080 AA92-AA107  b  p2081 AA173-AA204  b  p2082 AA265-AA281  b p2084  AA92-AA107XAA173-AA204  bxa
CC-CKR5# p2045  AA1-AA29  e  p2046 AA88-AA102  b  p2047 AA168-AA199  b  p2048 AA261-AA277  b p2049  AA88-AA102XAA168-AA199  axa
Fusin(LESTR)# p1987  AA1-AA38  e  p2041 AA103-AA114  b  p1990 AA181-AA203  e  p1991 AA262-AA285  b p1996  AA181-203XAA106-AA111  dxa
+  肽构建体的构成被列作a,b,d,e，和x，其中：a代表目标抗原位点b代表HBsTh-GG-目标抗原位点d代表CTP11Th-GG-HBsTh-GG-目标抗原位点e代表目标抗原位点-GG-HBsThx代表通过一个链间二硫键交联的两个肽链#趋化因子外部结构域肽，从下面描述的核酸序列推测出的氨基酸序列的编号系统
LESTR(Loetscher et al，生物化学杂志，1994,269:232)
CC-CKR1,CC-CKR2b,CC-CKR3,CC-CKR5(M.Samson等，生物化学(Biochemistry) 1996,35,3362)
                          表3
通过ELISA及中和分析确定的CD4-来源肽的免疫原性和功能图谱
肽代码 B  C 肽代码  A1  A2  B  C 肽代码  A1 A2 B C
rsCD4 ＞5 +++ ＜1∶10 p1588  b  4.3  3.2 - ＜1∶10 p1621  c  3.5 1.1 - ＜1∶10
p1403 b  4.3 2.6 +++ ＜1∶10 p1588  c  4.3  3.2 - ＜1∶10 p1622  b  4.3 1.1 - ＜1∶10
p1403 c  4.3 2.1 Tr ＜1∶10 p1589  b  4.3  2.2 - ＜1∶10 p1678  b  2.8 4.5 + ＜1∶10
p1404 b  2 ＜1 Tr ＜1∶10 p1589  c  4.3  2.2 - ＜1∶10 p1678  c  4.3 4.5 + ＜1∶10
p1404 c  4.3 2.6 ++ ＜1∶10 p1590  b  4.8  1.7 - ＜1∶10 p1679  b  2.5 2.1 - ＜1∶10
p1405 b  4.3 1.1 - ＜1∶10 p1590  c  4.8  1.7 - ＜1∶10 p1679  c  2.5 1.9 + ＜1∶10
p1405 c  ＞5 1.8 - ＜1∶10 p1608  c  3.3  0.8 tr ＜1∶10 p1680  b  4.5 2.9 ++ ＜1∶10
p1406 b  4.3 0.9 - 1∶12 p1609  c  4.3  1.5 tr ＜1∶10 p1680  c  4.5 2.5 ++ ＜1∶10
p1406 c  4.3 0.9 - ＜1∶10 p1610  c  3.3  ＜1 - ＜1∶10 p1681  b  4.3 1.8 ++ ＜1∶10
p1460 a  4.3 2.4 - ＜1∶10 p1611  c  2  1.9 tr ＜1∶10 p1681  c  3.5 1.6 + ＜1∶10
p1460 # 3.3 1.2 - ＜1∶10 p1612  c  ＞5  ＞5 - ＜1∶10 p1682  b  ＞5 2.7 + ＜1∶10
p1469 b 4.3 2.6 - ＜1∶10 p1613  c  4.3  1.0 tr ＜1∶10 p1682  c  ＞5 2.7 + ＜1∶10
p1469 c 4.3 3.1 Tr ＜1∶10 p1614  b  ＞5  1.9 - ＜1∶10 p1683  b  ＞5 1.8 + ＜1∶10
p1470 b 3 0.5 Tr ＜1∶10 p1614  c  ＞5  2.6 - ＜1∶10 p1683  c  4.0 1.6 + ＜1∶10
p1471 a 3.3 2.5 - ＜1∶10 p1615  b  2.0  1.3 - ＜1∶10 p168 4  b  ＞5 2.9 + ＜1∶10
p1471 b 3.3 2.8 Tr ＜1∶10 p1615  c  4.3  1.7 - ＜1∶10 p1684  c  ＞5 2.5 ++ ＜1∶10
 p1471 c 4.3 2.7 ++ ＜1∶10 p1616  b  ＞5  1.1 tr ＜1∶10 p1685  b  ＞5 1.8 + ＜1∶10
p1472 b 4.3 1.3 +++ ＜1∶10 p1616  c  3.8  1.2 - ＜1∶10 p1685  c  3.0 1.6 + ＜1∶10
p1472 c 4.3 1.8 +++ ＜1∶10 p1617  b  ＞5  1.2 - ＜1∶10 p1686  b  4.3 4.1 + ＜1∶10
p1518 b 4.3 3.7 - ＜1∶10 p1617  c  2.0  1.4 - ＜1∶10 p1686  c  4.3 3.5 tr ＜1∶10
p1518 c 4.3 3.7 - ＜1∶10 p1618  b  ＞5  1.0 - ＜1∶10 p1687  b  4.3 2.9 ++ ＜1∶10
p1585 b 4.3 3.0 - ＜1∶10 p1618  c  4.3  1.1 - ＜1∶10 p1687  c  4.3 2.0 + ＜1∶10
p1585 c 4.3 3.0 - ＜1∶10 p1619  b  4.3  1.4 - ＜1∶10 p1688  b  ＞5 2.4 + ＜1∶10
p1586 b 4.3 3.2 - ＜1∶10 p1619  c  4.3  1.4 - ＜1∶10 p1688  c  4.3 2.4 + ＜1∶10
p1586 c 4.3 3.2 - ＜1∶10 p1620  b  ＞5  1.7 tr ＜1∶10 p1689  b  4.3 2.9 ++ ＜1∶10
p1587 b 4.3 3.2 - ＜1∶10 p1620  c  ＞5  1.4 - ＜1∶10 p1689  c  3.8 2.5 ++ ＜1∶10
p1587 c 4.3 3.2 - ＜1∶10 p1621  b  ＞5  1.4 - ＜1∶10 p1690  b  3 2.1 ++ ＜1∶10
                          表3(续页)
肽代码  A1  A2 B  C 肽代码 A1  A2  B  C
 p1690  c  2.0  1.9 ++ ＜1∶10  p1771  b ＞5  2.8 +++ ＜1∶10
 p1692  b  4.3  1.7 + ＜1∶10  p1773  x ＞5  1.2 - ＜1∶10
 p1693  c  4.3  2.7 + ＜1∶10  p1775  x  4.3  1.3 - ＜1∶10
 p1694  b  3.0  1.8 - ＜1∶10  p1777  x  4.5  1.7 - ＜1∶10
 p1694  c  3  1.8 Tr ＜1∶10  p1778  x ＞5  2.7 - ＜1∶10
 p1695  b  3.0  2.0 ++ ＜1∶10  p1780  x ＞5  1.2 ++ ＜1∶10
 p1695  c  2.5  2.1 + ＜1∶10  p1781  x ＞5  2.7 - ＜1∶10
 p1696  b ＞5  1.8 + ＜1∶10  p1783  x  4.3  1.2 - ＜1∶10
 p1696  c ＞5  1.9 Tr ＜1∶10  p1784  x  4.3  1.4 - ＜1∶10
 p1697  b ＞5  4.2 ++ ＜1∶10  p1813  b  3.3  1.5 - ＜1∶10
 p1697  c  3.5  2.1 + ＜1∶10  p1817  b ＞5  4.5 + ＜1∶10
 p1697  c  3.5  2.1 ++ ＜1∶10  p1818  x ＞5  1.3 - ＜1∶10
 p1698  b  3.5  1.7 - ＜1∶10  p1820  x ＞5  2.5 tr ＜1∶10
 p1698  c  2.0  1.8 - ＜1∶10  p1821  x ＞5  1.3 - ＜1∶10
 p1699  b  1.5  - - ＜1∶10  p1848  q ＞5  3.1 +++ ＜1∶10
 p1699  c  1.5  - - ＜1∶10  p1856  x  4.3  1.5 - ＜1∶10
 p1700  b  1.5  - - ＜1∶10  p1857  x ＞5  2.3 - ＜1∶10
 p1700  c  2.5  1.7 - ＜1∶10  p1864  x  3  2.5 +++ ＜1∶10
 p1701  b ＞5  2.2 ++ ＜1∶10  p1878  b  4  2 - ＜1∶10
 p1701  c ＞5  2.6 ++ ＜1∶10  p1889  b ＞5  4.4 1.5 ＜1∶10
 p1761  b  4.3  2.2 ++ ＜1∶10  p1901  b ＞5  4 3 ＜1∶10
 p1763  b  4.3  2.1 - ＜1∶10  p2037  b ＞5  NT tr ＜1∶10
 p1765  x  3.5  1.3 - ＜1∶10  p2038  b  4.3  NT - ＜1∶10
 p1766  b ＞5  1.2 - ＜1∶10  p2078  b  4.3  NT ++ ＜1∶10
 p1767  b  3.8  3.0 - ＜1∶10  p2100  b  3.5  NT + ＜1∶10
 p1768  b ＞5  1.4 - ＜1∶10  p2101  b  3.0  NT tr ＜1∶10
 p1769  b ＞5  1.3 - ＜1∶10
图例，表3：
#:p1460-BSA结合物
A1:Log10 ELISA  抗-目标抗原位点的倒数效价
A2:Log10 ELISA抗-rsCD4的倒数效价
B:IFA(间接免疫荧光染色分析)
C：在MT-2中和分析中，对进化枝B HIV-1 VL 135 50％抑制时的血清稀释度
g：分支的四聚体肽
tr：痕量NT： 未检测
                                表4
通过ELISA和中和分析得到的趋化因子的免疫原性和功能图谱
趋化因子受体的类型 代表趋化因子受体结构域的肽抗原
1 2 3  4 2/3
代码 A B C 代码 A B C 代码 A B C 代码 A B C 代码 A B C
CC-CKR1 p1999 ＞5 +++ ＜1∶10  p2004 ＞5 - ＜1∶10 p2027 2.5 - ＜1∶10 p2028  4.3 ++ ＜1∶10 p2006 ＞5 - ＜1∶10
CC-CKR2 p2086 4.3 - ＜1∶10 p2087b 4.3 ++ ＜1∶10 p2088 ＞5 - ＜1∶10 p2089  4.3 + ＜1∶10 p2091 3.5 - ＜1∶10
CC-CKR3 p2079 4.3 tr ＜1∶10 p2080  b 3.0 - ＜1∶10 p2081 3.0 - ＜1∶10 p2082  2.5 tr ＜1∶10 p2084  4.3 tr ＜1∶10
CC-CKR5 p2045 ＞5 tr ＜1∶10 p2046  b 3.0 tr ＜1∶10 p2047 3.5 ++ ＜1∶10 p2048  4.8 +++ ＜1∶10 p2049  4.3 ++ ＜1∶10
Fusin(LESTR) p1987 ＞4 tr ＜1∶10 p2041  b 4.3 - ＜1∶10 p1990 2.5 ++ ＜1∶10 p1991  3.5 ＜1∶10 p1996 ＞5 - ＜1∶10
A:Log10 ELISA抗-目标抗原位点倒数效价B:IFA(间接免疫荧光染色分析)C：在MT-2中和分析中对进化枝B HIV-1 VL 135 50％抑制的血清稀释度tr：痕量
                              表5
CD4-或趋化因子共同受体来源肽产生的免疫血清对MAB B4结合MT2 T细胞的抑制作用
Figure A9980664300531
+    IFA
#抑制性IFA
*参见表2有关肽代码描述的图解
仅培养基
                            表6
肽诱导抗HIV原代分离株的中和抗体的能力
肽代码 目标抗原位点的描述 目标抗原肽的氨基酸序列(a) 形成 A1  A2  B  C
 p1403  CD4(43-55)(SEQ ID NO:14) FLTKGPSKLNDRA  b  4.3  2.6 ++ ＜1∶10
 c  4.3  2.1 tr ＜1∶10
 p1404 (C)CD4(38-47)(C)*(SEQ ID NO:15) (C)GNQGSFLTKG(C)  b  2 ＜1 tr  NT
 c  4.3  2.6 ++ ＜1∶10
 p1468  CD4(49-63)(SEQ ID NO:16) GPSKLNDRADSRRSLWDQ  b  4.3  3.1 tr ＜1∶10
 c  4.3  2.4 - ＜1∶10
 p1469  CD4(39-45)(SEQ ID NO:17) NQGSFLT  b  4.3  2.6 - ＜1∶10
 c  4.3  3.1 tr ＜1∶10
 p1470  CD4(37-46)*(SEQ ID NO:18) (C)ILGNQGSFLT(C)  b  3  0.5 tr ＜1∶10
 c  1.5  0.8 - ＜1∶10
 p1471  CD4(39-67)(SEQ ID NO:19) NQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNF  b  3.3  2.8 tr ＜1∶1
 c  4.3  2.7 - ＜1∶10
 p1518  CD4(60-109)(SEQ ID NO:20) SKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGLTANSDTHLL  b  4.3  3.7 - ＜1∶10
 c  4.3  3.7 -  ＜1∶10
 p1585  CD4(36-47)*(SEQ ID NO:21) (C)ILGNQGSFLTKG(C)  b  4.3  3.0 -  ＜1∶10
 c  4.3  3.0 -  ＜1∶10
 p1586  CD4(42-59)*(SEQ ID NO:22) (C)SFLTKGPSKLNDRADSRR(C)  b   4.3   3.2 -  ＜1∶10
 c   4.3   3.2 -  ＜1∶10
  p1587   CD4(44-56)*(SEQ ID NO:23) (C)LTKGPSKLNDRAD(C)  b   4.3   3.2 -  ＜1∶10
 c   4.3   3.2 -  ＜1∶10
  p1588   CD4(46-55)*(SEQ ID NO:24) (C)KGPSKLNDRA(C)  b   4.3   3.2 -  ＜1∶10
 c   4.3   3.2 -  ＜1∶10
  p1589   CD4(79-96)*(SEQ ID NO:25) (C)SDTYICEVEDQKEEVQLL(C)  b   4.3   2.2 -  ＜1∶10
 c   4.3   2.2 -  ＜1∶10
                     表6(续)
肽代码 目标抗原位点的描述 目标抗原肽的氨基酸序列(a) 形成  A1  A2   B  C
 p1614  CD4(38-45)(C)*(SEQ  ID  NO:26)  (C)GNQGSFLT(C)   b  ＞5  1.9   NT  ＜1∶10
  c  ＞5  2.6   NT  ＜1∶10
  p1615   CD4(39-44)(C)*(SEQ  ID  NO:27)  (C)NQGSFL(C)   b  2.0  1.3   NT  ＜1∶10
  c  ＞4  1.7   NT  ＜1∶10
  p1616   CD4(40-43)(C)*(SEQ ID NO:28)  (C)QGSF(C) b ＞5  1.1   NT  ＜1∶10
 c  3.5  1.2   NT  ＜1∶10
 p1617  CD4(52-54)(C)*(SEQ ID NO:29) (C)NTR(C) b ＞5  1.2   NT  ＜1∶10
 c 2.9  1.4   NT  ＜1∶10
 p1618  CD4(51-55)(C)*(SEQ ID NO:30) (C)LNTRA(C) b ＞5  1.0   NT  ＜1∶10
 c ＞4  1.1   NT  ＜1∶10
 p1619  CD4(48-52)(C)*(SEQ ID NO:31) (C)PSKLN(C) b ＞4  1.4   NT  ＜1∶10
 c ＞4  1.4   NT  ＜1∶10
 p2057 (C)CD4(27-66)(C)*(SEQ ID NO:4) (C)HWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNTRADSRRSLWDQGN(C)   b  ＞5   4.4   NT  ＜1∶10
  c   4.5   ＞5   NT   1∶165
  p2189   (C)CD4(39-71)*[F67→C](SEQ ID NO:11) (C)NQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGN(C)PLII   c   ＞5   ＞5   +++   1∶23
  p2190   (C)CD4(27-71)*[F67 → C](SEQ ID NO:10) (C)HWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGN(C)PLII   c   ＞5   ＞5   +++   1∶15
  p2240   (C)CD4(39-66)(C)*(SEQ ID NO:5) (C)NQGS ELTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGN(C)   c   ＞4   ＞5   +++   1∶283
A1:Log10 ELISA  抗-目标抗原位点倒数效价
B:IFA
A2:Log 10 ELISA  抗-rsCD4倒数效价
C：在MT-2中和分析中对进化枝B HIV-1 VL 135 50％抑制的血清稀释度
*：环化肽
                                   表7单克隆抗体和免疫血清中和进化枝A、B、C、和E的HIV-1原代分离株(MT-2微噬斑中和分析)
抗体类型 UGO29#(进化枝A) VL 135(进化枝B) ZIM  748#(进化枝C) UG266#(进化枝D) TH036#(进化枝E) DH12#(进化枝B)
90％ 90％ 90％ 90％ 90％ 90％
αp2057c(SEQ ID NO:32)(15 wpi) 1∶20 1∶157  1∶184 1∶20 1∶87 1∶20
 αp2240c(SEQ ID NO:35)(12 wpi) 1∶76 1∶324  NT 1∶20 1∶102 1∶36
 MAb B4  6.76μg/ml 1.54μg/ml  2.82μg/ml 25.6μg/ml 3.32μg/ml  2.1μg/ml
 αN-端V3MN  ＞100μg/ml ＞100μg/ml ＞100μg/ml ＞100μg/ml ＞100μg/ml ＞100μg/ml
 Ig G1 b12 MAb α gp120  38.5μg/ml 41.7μg/ml ＞50μg/ml ＞50μg/ml ＞50μg/ml  NT
 MAb 50.1 α gp120(N-terminal V3)  ＞50μg/ml ＞50μg/ml ＞50μg/ml ＞50μg/ml ＞50μg/ml ＞50μg/ml
#：由WHO关于AIDS的全球计划提供HIV-1原代分离株。
                            表8
外源病原体来源的Th表位的氨基酸序列
    Th的描述   SEQ ID NO:     氨基酸序列
MVF288-302 ThMVF258-277 ThTT830-844 ThTT947-966 ThPT149-176 ThTT73-99 ThPT18-41 ThHBs19-32 ThHBc120-140 ThHBc21-40 ThHBc50-69TT615-631 ThHIV gp41 Th6(N-)HIV gp41 Th6(C-)CT A8106-130 ThCTP11ThDT1 ThDT4 ThPF ThSM ThTraT1ThTraT4ThTraT6Th     383940414243448454647484950511352535455565758  LSEIKGVIVHRLEGVGILESRGIKARITHVDTESYKKQYIKANSKFIGITELKKFNNFTVSFWLRVPKVSASHLKKLRRLLYMIYMSGLAVRVHVSKEEQYYDYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKGAYARCPNGTRALTVAELRGNAELFFLLTRILTIPQSLDVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSDFFPSVRDLLDTASALYREPHHTALRQAILCWGELMTLAWVRDIIDDFTNESSQKTRAGRAILHIPTRIRQGLERAVAEGTDRVIEVLQRAGRAILALNIWDRFDVFTLGATSGYLKGNSTINKPKGYVGKEDSETADNLEKTVAALSILPGHGEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAATNFVESCDIEKKIAKMEKASSVFNVVNSKWFKTNAPNGVDEKIRIGLQGKIADAVKAKGGLAAGLVGMAADAMVEDVNSTETGNQHHYQTRVVSNANK
                            表9
人工Th表位的氨基酸序列
Th的描述 SEQ ID NO: 氨基酸序列
1,4,9 PALINDROMIC  6 ISEIKGVIVHKIEGIMT  RT  TRM TML   L V
 Syn  Th  (1,2,4) 12  KKKIITITRIITIITTID
IS(1,4,9  PALINDROMIC)LF简化 36 ISISEIKGVIVHKIEGILFT  RT  TR  T
IS(1,4,9  PALINDROMIC)LF 59 ISISEIKGVIVHKIEGILFMT RT  TRM TML  L  V
                               表10
本发明的其它代表性肽
肽代码 Th表位的描述 目标B肽 代表性肽构建体的氨基酸序列
2249  b(Seq.ID No:60) 1,4,9PALINDROMIC Th(Seq.ID No.6) (C)X(39-66)(C)，环化(Seq.ID No.5)   ISEIKGVIVHKIEGI-GG-MT  RT  TRM TML   L  V(C)NQ GSFLTKGPSK  LNDRADSRRS  LWDQGN (C)
  1902  b(Seq.ID No:61)   IS(1,4,9 PALINDROMIC Th简化游离)LF(Seq.ID  No.  36) (C)X(39-66)(C)，环化(Seq.ID No.5)   ISISEIKGVIVHKIEGILF-GG-T  RT    TR  T(C)NQ  GSFLTKGPSK  LNDRADSRRS  LWDQGN  (C)
  2249 f(Seq.ID No.62)   gp41  Th6  (N end)(Sq.ID No.50)-GG-1,4,9 PALINDROMIC Th(Seq.ID No.6) (C)X(39-66)(C)，环化(Seq.ID No.5) AVAEGTDRVIEVLQRAGRAIL-GG-ISEIKGVIVHKIEGI-GG-MT  RT    TRM  TML   L  V(C)NQ GSFLTKGPSK LNDRADSRRS LWDQGN (C)
                                表11
本发明代表性肽的免疫原性
动物种 组# 佐剂和免疫方案 肽代码 代表性肽构建体的描述   WPI 在目标抗原上的Log10ELISA效价 中和分析得出的血清效价(HIV-1 Clade B VL135)
50％抑制 90％抑制
豚鼠     1     水包油型乳剂(0,3，水包油型乳剂6 WPI)     P2249 b(Seq IDNo.60)     1,4,9 PALINDROMIC Th-GG-(C)X(39-66)(C)，环化(SeqID No.6)-GG-(SeqID No.5)   5     3.806     23     12
  8     4.000     161     56
 10     4.500     382     118
 12     5.000     1078     324
    2     水包油型乳剂(0,3,6 WPI) p1902 b(Seq IDNo.61) IS(1,4,9 PALINDROMIC Thsimplified lib)LF-GG-(C)X(39-66)(C)，环化(Seq ID No.36)-GG-(Seq IDNo.5)  5     4.684     24     12
 8      over     178     95
 10      over     345     111
猪     1     水包油型乳剂(0,3，水包油型乳剂6 WPI)     p1902 b(Seq IDNo.61)     IS(1,4,9 PALINDROMIC Th简化游离)LF-GG-(C)X(39-66)(C)，环化(Seq ID No.36)-GG-(Seq IDNo.5)   5     4.500     106     35
8 5.050 209 102
    2     水包油型乳剂(0,3,6 WPI)     p2249f(Seq IDNo.62)     gp41 Th6(N end)-GG-1,4,9PALINDROMIC Th-GG-(C)X(39-66)(C)，环化(Seq ID No.50)-GG-(Seq IDNo.6)-GG-(Seq ID No.5)   5      4.688       99     31
8 5.237 496 140
狒狒     1     水包油型乳剂(0,3,6 WPI)     p2249f(Seq IDNo.62)     gp41 Th6(N end)-GG-1,4,9PALINDROMIC Th-GG-(C)X(39-66)(C)，环化(Seq ID No.50)-GG-(Seq IDNo.6)-GG-(Seq ID No.5)   15      4.570       25     11
  23      4.894       37     12
38 4.689 45 13
序列表(1)总信息：
(ⅰ)申请人：联合生物医学公司，等
(ⅱ)发明名称：用于预防和治疗HIV感染和免疫疾病的肽组合物
(ⅲ)序列数目：61
(ⅳ)通讯地址：
  (A)地址：MORGAN & FINNEGAN
  (B)街：345 Park Avenue
  (C)市：New York
  (D)州：NY
  (E)国家：USA
  (F)邮政编码：10154-0054
(ⅴ)计算机可读形式：
  (A)媒体类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容机
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：Word 7.0
(ⅵ)在先申请数据：
  (A)申请号：US 09/100,409
  (B)申请日：20-JUNE-1998
  (C)分类号：514
(ⅶ)当前申请数据：
  (A)申请号：待定
  (B)申请日：21-JUNE-1999
  (C)分类号：
(ⅷ)代理机构和代理人信息：
  (A)名称：MARIA C.H.LIN,ESQ。
  (B)注册号：29,323
  (C)参考/记录号：1151-4154PCl
(ⅸ)电讯信息：
  (A)电话：212-758-4800
  (B)电传：212-751-6849(2)SEQ ID NO：1的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：433氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val1               5                   10Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile
    15                  20Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile25                 30                   35Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro
       40                   45Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser50                   55                  60Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys
            65                  70Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys
    75                  80Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu85                  90                  95Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu
        100                 105Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser110          115                         120Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser
            125                 130Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu
    135                 140Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr145                 150                 155Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln ASn Gln Lys Lys Val
        160                 165Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln170                  175                 180Lys Ala Ser Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu
            185                 190Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro Leu Ala Phe Thr Val
    195                 200Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp Gln205                 210                 215Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Ile
        220                 225Phe Asp Leu Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg
230                 235                 240Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu Gln Met Gly Lys Lys
            245                 250Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu Pro
    255                 260Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu265                 270                 275Glu Ala Lys Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn
        280                 285Leu Val Val Met Arg Ala Thr Gln Leu Gln Lys Asn
290                 295                 300Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro Lys
            305                 310Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala
    315                 320Lys Val Ser Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu325                 330                 335Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp Gln Cys Leu Leu Ser
        340                 345Asp Ser Ser Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys
350                 355                 360Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met
            365                 370Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu
    375                 380Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg385                 390                  395Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met Ser
        400                 405Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys
410                 415                 420Gln Cys Pro His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro
            425                 430Ile(2)SEQ ID NO:2的信息：
(ⅱ)序列特征：
  (A)长度：40氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:His Trp Lys Asn Trp Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly1               5               10Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys
15                      20Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp25                  30                  35Asp Gln Gly Asn
        40(2)SEQ ID NO:3的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：28氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys1               5                  10Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp
    15                  20Asp Gln Gly Asn25(2)SEQ ID NO:4的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：42氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Cys His Trp Lys Asn Trp Asn Gln Ile Lys Ile Leu1               5                   10Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser
    15                  20Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu25                  30                  35Trp Asp Gln Gly Asn Cys
        40(2)SEQ ID NO:5的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：30氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:Cys Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser1               5                   10Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu
    15                  20Trp Asp Gln Gly Asn Cys25                  30(2)SEQ ID NO:6的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：15氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：1
  (D)其它信息：/注=″Ile,Met或Leu″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：2
  (D)其它信息：/注=″Ser或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：4
  (D)其它信息：/注=″Lys或Arg″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：5
  (D)其它信息：/注=″Gly或Thr-″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：10
  (D)其它信息：/注=″His或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：11
  (D)其它信息：/注=″Lys或Arg″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：12
  (D)其它信息：/注=″Ile,Met或Leu″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：14
  (D)其它信息：/注=″-Gly或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)  名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：15
  (D)其它信息：/注=″Ile,Met或Val″
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Gly Val Ile Val Xaa Xaa Xaa1               5                   10Glu Xaa Xaa
    15(2)SEQ ID NO:7的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：16氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1               5                   10Thr Tyr Gln Phe
    15(2)SEQ ID NO:8的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：15氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln1               5                   10Ser Leu Asp
    15(2)SEQ ID NO:9的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：6氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro1               5(2)SEQ ID NO:1O的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：46氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:Cys His Trp Lys Asn Trp Asn Gln Ile Lys Ile Leu1               5                   10Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser
    15                  20Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu25                  30                  35Trp Asp Gln Gly Asn Cys Pro Leu Ile Ile
        40                  45(2)SEQ ID NO:11的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：34氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:Cys Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser1               5                   10Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu
    15                  20Trp Asp Gln Gly Asn Cys Pro Leu Ile Ile25                  30(2)SEQ ID NO:12的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：18氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr1               5                   10Ile Ile Thr Thr Ile Asp
    15(2)SEQ ID NO:13的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：12氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Lys Glu1               5                   10(2)SEQ ID NO:14的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：13氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala1               5                   10(2)SEQ ID NO:15的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：12氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:Cys Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Cys1               5                  10(2)SEQ ID NO:16的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：18氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg1              5                   10Arg Ser Leu Trp Asp Gln
    15(2)SEQ ID NO:17的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：7氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr1               5(2)SEQ ID NO:18的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：12氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:Cys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Cys1               5                   10(2)SEQ ID NO:19的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：29氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19:Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys1               5                   10Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp
    15                  20Asp Gln Gly Asn Phe25(2)SEQ ID NO:20的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：61氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser1               5                   10Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys
    15                  20Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys25                  30                  35Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu
        40                  45Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu
50                  55                  60Leu(2)SEQ ID NO:21的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：14氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21:Cys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys1               5                   10Gly Cys(2)SEQ ID NO:22的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：20氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22:Cys Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn1               5                   10Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Cys
   15                   20(2)SEQ ID NO:23的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：15氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23:Cys Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg1               5                   10Ala Asp Cys
    15(2)SEQ ID NO:24的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：12氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24:Cys Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Cys1               5                   10(2)SEQ ID NO:25的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：20氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25:Cys Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln1           5                       10Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Cys
   15                   20(2)SEQ ID NO:26的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：10氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:26:Cys Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Cys1               5                   10(2)SEQ ID NO:27的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：8氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:27:Cys Asn Gln Gly Ser Phe Leu Cys1               5(2)SEQ ID NO:28的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：6氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:28:Cys Gln Gly Ser Phe Cys1               5(2)SEQ ID NO:29的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：5氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:29:Cys Asn Thr Arg Cys1               5(2)SEQ ID NO:30的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：7氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:30:Cys Leu Asn Thr Arg Ala Cys1               5(2)SEQ ID NO:31的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：7氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:31:Cys Pro Ser Lys Leu Asn Cys1               5(2)SEQ ID NO:32的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：77氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:32:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1               5                   10Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg
    15                  20Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Gly Gly Cys25                  30                  35His Trp Lys Asn Trp Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly
        40                  45Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys
50                  55                  60Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp
            65                  70Asp Gln Gly Asn Cys
    75(2)SEQ ID NO:33的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：69氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:33:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1               5                   10Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg
    15                  20Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Gly Gly Cys25                  30                  35Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys
        40                  45Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp50                   55                  60Asp Gln Gly Asn Cys Pro Leu Ile Ile
            65(2)SEQ ID NO:34的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：81氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:34:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1               5                   10Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg
    15                  20Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Gly Gly Cys25                  30                  35His Trp Lys Asn Trp Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly
        40                  45Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys
50                  55                  60Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp
            65                  70Asp Gln Gly Asn Cys Pro Leu Ile Ile
 75                     80  (2)SEQ ID NO:35的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：64氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:35:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1               5                   10Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg
    15                  20Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Gly Gly Cys25                  30                  35Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys
        40                  45Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp50                   55                  60Asp Gln Gly Cys(2)SEQ ID NO:36的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：19氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：4
  (D)其它信息：/注=″Ser或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：7
  (D)其它信息：/注=″Lys或Arg″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：8
  (D)其它信息：/注=″Gly或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：12
  (D)其它信息：/注=″His或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：13
  (D)其它信息：/注=″Lys或Arg″(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：16
  (D)其它信息：/注=″Gly或Thr″
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:36:Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa1               5                   10Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu Phe
    15(2)SEQ ID NO:37的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：50氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:37:Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr1           5                       10Ile Ile Thr Thr Ile Asp Gly Gly Cys Asn Gln Gly
    15                  20Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp25                  30                  35Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly
        40                  45Asn Cys
50(2)SEQ ID NO:38的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：15氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:38:Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu1               5                   10Glu Gly Val
    15(2)SEQ ID NO:39的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：20氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:39:Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile1               5                   10Thr His Val Asp Thr Glu Ser Tyr
    15                  20(2)SEQ ID NO:40的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：17氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:40:Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile1               5                   10Gly Ile Thr Glu Leu
    15(2)SEQ ID NO:41的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：22氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:41:Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu1               5                   10Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu
    15                  20(2)SEQ ID NO:42的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：30氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:42:Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met1               5                   10Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu
    15                  20Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr25                  30(2)SEQ ID NO:43的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：27氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:43:Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys1               5                   10Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn
    15                  20Arg Ile Lys25(2)SEQ ID NO:44的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：24氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:44:Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala1               5                   10Leu Thr Val Ala Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu
    15                      20(2)SEQ ID NO:45的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：21氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:45:Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala1               5                   10Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
    15                  20(2)SEQ ID NO:46的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：20氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:46:Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp1               5                   10Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu
    15                  20(2)SEQ ID NO:47的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：20氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:47:Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys1               5                   10Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala
    15                  20(2)SEQ ID NO:48的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：17氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:48:Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu1               5                   10Ser Ser Gln Lys Thr
    15(2)SEQ ID NO:4 9的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：19氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:49:Arg Ala Gly Arg Ala Ile Leu His Ile Pro Thr Arg1               5                   10Ile Arg Gln Gly Leu Glu Arg
    15(2)SEQ ID NO:50的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：21氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:50:Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu Val1               5                   10Leu Gln Arg Ala Gly Arg Ala Ile Leu
    15                  20(2)SEQ ID NO:51的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：25氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:51:Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Ser1               5                   10Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly Tyr Leu Lys Gly Asn
    15                  20Ser25(2)SEQ ID NO:52的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：22氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:52:Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val1               5                   10Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly His Gly
    15                  20(2  SEQ ID NO:53的信息：
(ⅰ)  序列特征：
  (A)长度：39氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:53:Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser1               5                   10Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu
    15                  20Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Thr Asn Phe Val25                  30                  35Glu Ser Cys(2)SEQ ID NO:54的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：21氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:54:Asp Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala1               5                   10Ser Ser Val Phe Asn Val Val Asn Ser
    15                  20(2)SEQ ID NO:55的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：17氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:55:Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro ASn Gly Val Asp1               5                   10Glu Lys Ile Arg Ile
    15(2)SEQ ID NO:56的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：14氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:56:Gly Leu Gln Gly Lys Ile Ala Asp Ala Val Lys Ala1               5                   10Lys Gly(2)SEQ ID NO:57的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：19氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:57:Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp1               5                   10Ala Met Val Glu Asp Val Asn
    15(2)SEQ ID NO:58的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：20氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:58:Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr1               5                   10Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys
    15                  20(2)SEQ ID NO:59的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：19氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：3
  (D)其它信息：/注=″Ile,Met或Leu″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：4
  (D)其它信息：/注=″Ser或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：7
  (D)其它信息：/注=″Lys或Arg″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：8
  (D)其它信息：/注=″Gly或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：12
  (D)其它信息：/注=″His或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：13
  (D)其它信息：/注=″Lys或Arg″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：14
  (D)其它信息：/注=″Ile,Met或Leu″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：16
  (D)其它信息：/注=″Gly或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：17
  (D)其它信息：/注=″Ile,Met或Val″
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:59:Ile Ser Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa1               5                   10Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Leu Phe
    15(2)SEQ ID NO:60的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：51氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：4
  (D)其它信息：/注=″Ser或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：7
  (D)其它信息：/注=″Lys或Arg″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：8
  (D)其它信息：/注=″Gly或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：12
  (D)其它信息：/注=″His或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：13
  (D)其它信息：/注=″Lys或Arg″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：16
  (D)其它信息：/注=″Gly或Thr″
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:60:Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa1               5                   10Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu Phe Gly Gly Cys Asn Gln
    15                  20Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn25                  30                  35Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln
        40                  45Gly Asn Cys
50(2)SEQ ID NO:61的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：70氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：24
  (D)其它信息：/注=″Ile,Met或Leu″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：25
  (D)其它信息：/注=″Ser或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：27
  (D)其它信息：/注=″Lys或Arg″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：28
  (D)其它信息：/注=″Gly或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：33
  (D)其它信息：/注=″His或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：34
  (D)其它信息：/注=″Lys或Arg″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：35
  (D)其它信息：/注=″Ile,Met或Leu″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：37
  (D)其它信息：/注=″Gly或Thr″
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：修饰位点
  (B)位置：38
  (D)其它信息：/注=″Ile,Met或Val″
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:61:Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu Val1               5                   10Leu Gln Arg Ala Gly Arg Ala Ile Leu Gly Gly Xaa
    15                  20Xaa Glu Xaa Xaa Gly Val Ile Val Xaa Xaa Xaa Glu25                  30                  35Xaa Xaa Gly Gly Cys Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr
        40                  45Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser
50                  55                  60Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Cys
            65                  70

Claims (25)

1．一种CD4-CDR2抗原肽，其中所述抗原肽长度在约30到约46个氨基酸之间；其中所述CD4-CDR2抗原肽含有由28到40个氨基酸残基的插入序列分隔开的两个半胱氨酸残基；并且其中所述插入序列是SEQ ID NO:1的27到66位残基所代表的序列的一段连续部分，或者是一种SEQ ID NO:1的27到66位残基的免疫功能类似物。
2．权利要求1的CD4-CDR2抗原肽，其中所述抗原肽选自SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、或其免疫功能类似物。
3．一种长度为约50到约80个氨基酸的合成肽，其含有：
(a)一种辅助T细胞(Th)表位；
(b)一种按照权利要求1的CD4-CDR2抗原肽；和
(c)一种免疫刺激侵染素结构域。
4．一种长度为约50到约80个氨基酸的合成肽，其含有：
(a)一种辅助T细胞(Th)表位；
(b)一种按照权利要求2的CD4-CDR2抗原肽；和
(c)一种免疫刺激侵染素结构域。
5．一种含有与权利要求1的CD4-CDR2抗原肽共价结合的辅助T细胞表位(Th)的肽或肽结合物。
6．一种含有与权利要求2的CD4-CDR2抗原肽共价结合的辅助T细胞表位(Th)的肽或肽结合物。
7．一种由下式表示的肽或肽结合物：
(A)n-(CD4-CDR2抗原肽)-(B)o-(Th)m-X
或
(A)n-(Th)m-(B)o-(CD4-CDR2抗原肽)-X
其中：
每一个A独立地为一种氨基酸，或一种一般性免疫刺激序列；
每一个B选自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亚胺(ε-N)Lys-，和-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亚胺)-；
每一个Th独立地为一种氨基酸序列，该氨基酸序列含有一种辅助T细胞表位、或一种免疫增强类似物或其片段；
CD4-CDR2抗原肽代表权利要求1的一种抗原肽的序列；
X为一种氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
n为从0到约10；
m为从1到约4；和
o为从0到约10。
8．一种由下式表示的肽或肽结合物：
(CD4-CDR2抗原肽)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
或
(Th)m-(B)o-(CD4-CDR2抗原肽)-(A)n-X
其中：
每一个A独立地为一种氨基酸或一种一般性免疫刺激序列；
每一个B选自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亚胺(ε-N)Lys-，和-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亚胺)-；
每一个Th独立地为一种氨基酸序列，该氨基酸序列含有一种辅助T细胞表位、或一种免疫增强类似物或其片段；
CD4-CDR2抗原肽代表权利要求1的一种抗原肽的序列；
X为一种氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
n为从0到约10；
m为从1到约4；和
o为从0到约10。
9．一种由下式表示的肽或肽结合物：
(A)n-(CD4-CDR2抗原肽)-(B)o-(Th)m-X
或
(A)n-(Th)m-(B)o-(CD4-CDR2抗原肽)-X
其中：
每一个A独立地为一种氨基酸，或一种一般性免疫刺激序列；
每一个B选自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亚胺(ε-N)Lys-，和-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亚胺)-；
每一个Th独立地为一种氨基酸序列，该氨基酸序列含有一种辅助T细胞表位、或一种免疫增强类似物或其片段；
CD4-CDR2抗原肽代表权利要求2的一种抗原肽的序列；
X为一种氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
n为从0到约10；
m为从1到约4；和
o为从0到约10。
10．一种由下式表示的肽或肽结合物：
(CD4-CDR2抗原肽)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
或
(Th)m-(B)o-(CD4-CDR2抗原肽)-(A)n-X
其中：
每一个A独立地为一种氨基酸或一种一般性免疫刺激序列；
每一个B选自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亚胺(ε-N)Lys-，或-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亚胺)-；
每一个Th独立地为一种氨基酸序列，该氨基酸序列含有一种辅助T细胞表位、或一种免疫增强类似物或其片段；
CD4-CDR2抗原肽代表权利要求2的一种抗原肽的序列；
X为一种氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
n为从0到约10；
m为从1到约4；和
o为从0到约10。
11．一种按照权利要求3-10任意之一的肽或肽结合物，其中所述Th具有一种选自SEQ ID NOS:6、8、12、13、36、或36-59的氨基酸序列。
12．一种按照权利要求11的肽或肽结合物，其中所述Th具有一种选自SEQ ID NOS:6或8的氨基酸序列。
13．一种按照权利要求3-10任意之一的肽或肽结合物，其中n为3，(A)3为(侵染素结构域)-Gly-Gly。
14．一种按照权利要求11的肽或肽结合物，其中至少一个A部分为一种侵染素结构域。
15．一种按照权利要求12的肽或肽结合物，其中至少一个A部分为一种侵染素结构域。
16．一种按照权利要求3-10任意之一的肽或肽结合物，其中所述CD4-CDR2抗原肽选自SEQ ID NOS:4、5、10、或11。
17．一种按照权利要求11的肽或肽结合物，其中所述CD4-CDR2抗原肽选自SEQ ID NOS:4、5、10、或11。
18．一种按照权利要求12的肽或肽结合物，其中所述CD4-CDR2抗原肽选自SEQ ID NOS:4、5、10、或11。
19．一种选自SEQ ID NOS:32、33、34、35、或60的肽。
20．一种药物组合物，其含有一种免疫有效量的权利要求3-10或19之一的肽或肽结合物，还含有一种药物可接受的载体。
21．按照权利要求20的药物组合物，其中所述肽或肽结合物的所述免疫有效量在约0.5μg到约1mg每公斤体重每剂量之间。
22．一种诱导哺乳动物中抗表面CD4复合物的抗体的方法，其包括给所述哺乳动物施用权利要求20的药物组合物。
23．一种诱导哺乳动物中抗表面CD4复合物的抗体的方法，其包括给所述哺乳动物施用权利要求21的药物组合物。
24．一种抑制哺乳动物中HIV结合CD4+细胞的方法，其包括给所述哺乳动物施用权利要求20的药物组合物。
25．一种抑制哺乳动物中HIV结合CD4+细胞的方法，其包括给所述哺乳动物施用权利要求21的药物组合物。
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