CN1227610A - 抗cd4和趋化因子受体结构域复合物的抗体及其抵抗hiv感染的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及按照所述的方法及筛选步骤以能表达CD4的T淋巴细胞，例如外周血单核T细胞，胸腺细胞，脾细胞和白血病或淋巴瘤衍生的T细胞系例如HPB－ALL或SUP－T细胞作为免疫原生产的单克隆抗体。本发明单克隆抗体的特性在于其能在体内或体外中和人类免疫缺陷病毒(HIV)及相关的免疫缺陷病毒的原代分离物。此抗体是针对含有与趋化因子受体的结构域结合的CD4蛋白质的宿主细胞抗原复合物的，对第一型的HIV(HIV－1)所有分化体的原代分离物和第二型的HIV(HIV－2)及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的原代分离物具有广泛的中和活性。本发明也涉及筛选及制造此种抗体的方法，能分泌此类抗体的杂交瘤，含有此抗体的药物组合物和在灵长类，包括人类中，用此类抗体在接触病毒前后预防免疫缺陷病毒所造成的感染，此类抗体的原靶为可表达CD4的淋巴细胞。
Description
发明概述
本发明涉及按照所述的方法及筛选步骤以能表达CD4的T淋巴细胞，例如外周血单核T细胞，胸腺细胞，脾细胞和白血病或淋巴瘤衍生的T细胞系例如HPB-ALL或SUP-T细胞作为免疫原生产的单克隆抗体。本发明单克隆抗体的特性在于其能在体内或体外中和人类免疫缺陷病毒(HIV)及相关的免疫缺陷病毒的原代分离物。此抗体是针对含有与趋化因子受体的结构域结合的CD4蛋白质的宿主细胞抗原复合物的，对第一型的HIV(HIV-1)所有分化体的原代分离物和第二型的HIV(HIV-2)及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的原代分离物具有广泛的中和活性。本发明也涉及筛选及制造此种抗体的方法，能分泌此类抗体的杂交瘤，含有此抗体的药物组合物和在灵长类，包括人类中，用此类抗体在接触病毒前后预防免疫缺陷病毒所造成的感染，此类抗体的原靶为可表达CD4的淋巴细胞。
发明背景
距发现HIV为获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)病毒以来已有12年，而对艾滋病毒的分子克隆和表征也已有10年，尽管有许多的研究致力于疫苗的开发，但对HIV疫苗及其免疫疗法的发展仍存在许多的困难。这些障碍包括HIV-1的变异性，病毒的多种传染途径/方式，以及有关预防HIV感染所必需的免疫反应知识的不足。在1995年7月28日发表的一篇文章(细胞82:175-176)中，David Baltimore要所有这个领域中的科学家退一步想为什么在动用了美国国家卫生院(NIH)10％的预算后，对于此种病毒感染仍一无所知。
早期对有效的重组HIV-1外壳亚单位疫苗(如gp120和gp160疫苗产品)抱持乐观的态度，因在数次临床试验中的疫苗血清能在体外中和实验室所分离出的HIV-1(Belshe等人，JAMA,1994,272:475；Keefer等人，AIDS Res Hum Retroviruses,1994,10:1713)。但此种乐观态度不久即因疫苗血清无法中和由病人体内分离出的HIV-1原代分离物而有所动摇(Hanson,AIDS Res Hum Retroviruses,1994,10:645；Mascola等人，传染病杂志，1996,173:340)。这些令人失望的结果使得NIH在1994年6月决定延缓进行数种基于重组外壳蛋白质的HIV亚单位疫苗的昂贵的大型功效试验。
HIV-1的原代分离物获自病人外周血单核细胞(PBMCs)或具有未感染的PBMCs的血浆所作的有限培育。它们非常类似能感染人类的HIV株(Sawyer等人，病毒学杂志，1994,68:1342；Cornelissen等人，病毒学杂志，1995,69:1810)。HIV-1的原代分离物可很容易与常用的已适应实验室环境的亲T型细胞的病毒如Ⅲb/LAI,SF2，和MN，区分开来，这些病毒已在人类T淋巴样细胞系中生存了好几代的时间且已完全能适应在这些T细胞系中生长。首先，大部分原代分离物为亲M细胞的病毒。它们不易在培养的T细胞系中生长，相反，虽然它们也可以感染初级T细胞，但一般而言这类病毒是亲单核细胞或巨噬细胞的(Cheng-Mayer等人，科学，1988,240:80)。其次，原代分离物对由重组可溶性形式的病毒受体蛋白质CD4(rsCD4)所作的体内中和具有相当高的抗性，需要比实验室株多200-2700倍的rsCD4(Daar等人，PNAS USA,1990,87:6574-6578)。第三点，原代分离物对以gp120疫苗所引发的中和性抗体也具有抗性(Mascola等人)。
原代分离物包括可在PBMC培养中诱发合胞体形成的合胞体诱发分离物(SI)和非合胞体诱发(NSI)分离物两种。在SI原代分离物中，大部分能在对HIV-敏感的T细胞系MT2中进行复制，但少数可在宽容性较小且已转化的T细胞系如CEM或H9中进行复制，这些细胞一般用来培养适于实验室生存的分离物。非合胞体诱发(NSI)原代分离物只能在外周血的初级T细胞中进行培养。
早期对艾滋病疫苗的乐观态度一方面也来自猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的灭活病毒制品。SIV与HIV-1在外观，基因排列，感染及疾病发展过程均极为类似，因此使得SIV在恒河猴中的感染成为探索不同艾滋病疫苗策略的一种极佳的模型。以此模型所作的早期研究显示在人类T细胞系中生长且在佐剂中配制的SIV的灭活制品可保护实验接种了以人类细胞培育出的高感染性SIV病原性变体的恒河猴不受病毒的感染(Desrosiers等人，PNAS USA,1989,86:6353-6357；Murphey-Corb等人，科学，1989,246:1293)。意料之外的是，当用在同源性猴子细胞上生长的SIV原种来攻击免疫的动物时这种保护作用就丧失了。
稍后由以猴子细胞培育的SIV和未感染的人类细胞进行的免疫研究中发现在那些早期SIV研究中对病毒感染的保护作用可能是因其刺激了对异种人类宿主细胞蛋白质而非病毒编码抗原的免疫应答所致(Stott，自然，1991,353:393)。牵涉到SIV的被动免疫实验中的一些证据显示某些抗细胞抗体在缺乏细胞介导的免疫下可能对SIV所造成的感染有保护作用(Gardner等人，AIDS Res Hum Retroviruses,1995,11:843-854)。
由抗细胞抗体所提供的对SIV感染的保护性免疫机制目前仍不清楚。由抗细胞抗体所介导的对SIV感染的保护作用的可能机制之一牵涉到与病毒结合的细胞蛋白质。已知免疫缺陷病毒如HIV和SIV均会与细胞蛋白质结合，此蛋白质可能得自当病毒由宿主细胞膜上芽生时的宿主细胞。某些与主要组织相容性复合体(MHC)结合的细胞蛋白质，β2-微球蛋白，HLA-DR，和第Ⅰ类HLA分子的抗体，参与体外中和SIV和HIV-1的实验室株(Arthur等人，科学，1991,258:1935)。除了与MHC结合的表面蛋白质外，Montefiori等人(病毒学，1994,205:82；AIDS Res HumRetroviruses,1995,11:1429)最近在以人类细胞培育的SIV及HIV-1病毒表面上鉴别出三种补体控制蛋白质，CD46,CD55，和CD59，因此出现了这些宿主细胞分子也可被病毒利用作为躲避补体病毒溶解机制的可能性。另一抗细胞抗体的保护机制可能是通过以一种以前所不知道的方式抑制免疫缺陷病毒对免疫系统细胞的活性介导的。似乎有一种与宿主T细胞表面CD4结合的宿主细胞抗原复合物能促进病毒的结合和进入，进而成为保护性抗细胞抗体的靶。
在本发明仍在进行的阶段中，近来也有报导指出除了宿主抗原复合物上的CD4受体能与HIV结合外，其它因子或HIV共同受体也能影响HIV的复制，进入或融合。这些包括由CD8+T细胞所产生的三种能抑制HIV的趋化因子(Cocchi等人，科学，1995,270:1811-1815)；一种在表达CD4的细胞上的亲T型而非亲M型的HIV-1融合和进入的CXC-CKR4共同受体(亦称为融合素或LESTR)(Feng等人，科学，1996,272:873)，能结合三种抑制性趋化因子(Cocchi等人)之β-趋化因子受体CC-CKR5以作为亲M型而非亲T型的HIV-1的共同受体(Doranz等人，细胞，1996,85:1149；Dragic等人，自然，1996,381:667；Choe等人，细胞，1996,85:1135；Deng等人，自然，1996,381:661；Alkhatib等人，科学，1996,272:1955)，及作为亲M和双亲性HIV共同受体的其它β-趋化因子受体(CC-CKP2b和CC-CKR3)(Doranz等人，细胞，1996,85:1149)。据报导这些共同受体是与以前描述的G蛋白偶联且具有七个跨膜区段的受体(Loetscher等人，生物化学杂志，1994,264:232；Samson等人，生物化学，1996,35:3362)。
为了能更精确地鉴别这种能引发保护反应的推定的细胞蛋白质，且更好地表征由抗细胞抗体所介导的保护作用机制，本发明人针对抗多种细胞抗原：β2-微球蛋白，MHC第Ⅰ类HLA A,B,C分子及MHC第Ⅱ类HLADR蛋白质，和其它与T细胞系有关的T细胞抗原的一组单克隆抗体的成员鉴定了其中和HIV的活性，以鉴别出那些能在体外微小空斑中和测定中能够中和HIV原代分离物的抗体。实验目的是测定那些具有此种活性之抗体的中和活性的范围；并确定在适当的动物模型中此种体外活性是否可以被有效地转换成体内活性。
这些实验的结果显示，除了针对包含CD4的宿主细胞抗原复合物的抗体外，没有任何一种其它抗细胞抗体(排除CD4特异性抗体)，能在中和测定中有效地中和HIV原代分离物。这些结果也显示针对包含与趋化因子受体结构域结合的CD4的宿主细胞抗原复合物的抗体能促进与rsCD4的结合。再者，被鉴别出具有所需性质的抗体能抑制猴子体内SIV所引起的感染及小鼠体内HIV-1对重组的人类免疫系统的感染。本发明的简要说明
本发明首次提供的抗体及其同源物可以：(1)抑制HIV与表达CD4的细胞之间的结合，(2)抑制HIV诱发的在表达CD4的细胞间的合胞体形成，(3)有效中和由第Ⅰ型HIV的所有分化体，及各种第Ⅱ型HIV和SIV中分离出的原代分离物对CD4阳性细胞的体外感染，(4)在接触这些病毒之前或之后有效中和HIV-1的原代分离物对CD4阳性细胞的体外感染，(5)当这些抗体以非经肠胃途径施用，即静脉或腹膜内注射时，可以预防HIV和SIV的原代分离物对灵长类包括恒河猴及人类的感染，(6)以接触前和接触后方式预防HIV-1的原代分离物对经人类外周血淋巴细胞重组的SCID小鼠(hu-PBL-SCID)的感染。
因此本发明涉及可与表达CD4之人类细胞表面上的含CD4的人类宿主细胞抗原复合物结合且具有中和HIV的原代分离物，即由患者身上所分离出且仅在外周血单核细胞(PBMC)中传代不超过3-5次的病毒能力的抗体。更明确地说，本发明是关于针对存在于含有与趋化因子受体例如CC-CKR5的结构域结合的CD4蛋白质的宿主细胞抗原复合物上的抗原决定簇的抗体，能广泛有效地中和所有HIV-1分化体的原代分离物及各种HIV-2和SIV的原代分离物。本发明也涉及经静脉内和/或腹膜内途径以5-10×106表达CD4的细胞，优选衍生自人类T白血病或淋巴瘤的细胞系例如来自患有T型急性淋巴母细胞白血病患者的HPB-ALL细胞，或来自患有T细胞非霍金氏淋巴瘤患者的SUB-T细胞免疫非人类哺乳动物制备此抗体的方法，清洗细胞后重新悬浮于PBS或佐剂如弗氏完全佐剂中；接着进行两次以上的静脉或腹膜内注射5-10×106清洗后悬浮于无佐剂的PBS中的细胞。已知由免疫动物产生的抗体其血清抗体具有可结合下列物质的能力：
1．rsCD4；
2．具较强反应性能与趋化因子受体结构域结合的rsCD4；
3．如在高分辨率荧光显微镜下所示呈帽状分布的表达CD4的细胞包括HPB-ALL或SUP-T细胞的表面；
4．以下任一肽：衍生自rsCD4的AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375；和
5．中和HIV的原代分离物。
本发明的抗体可进一步表征为通过HIV或SIV的原代分离物在ED50＜50mg/Kg的浓度下感染灵长类动物或hu-PBL/SCID小鼠提供被动免疫。
本发明也包括能分泌具有这些特性之抗体的杂交瘤。含这些抗体的预防及治疗组合物，用于预防由那些原靶为表达CD4的淋巴细胞的感染因子所造成的灵长类动物，包括人类的免疫缺陷病毒感染。本发明的抗体及其同源物可识别含CD4分子，特别是当与存在于CD4表达细胞上的其它趋化因子受体如CC-CKR5的结构域结合时，的宿主细胞抗原复合物上＂不连续的散布的构象性＂表位。这些抗体结合在衍生自人类CD4四个胞外域中任一结构域的合成模拟物(表1；SEQ ID NO:1)上，所说的胞外域包括以下肽：CD4的AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，和AA361-AA375。
本发明也涉及抗体同源物。这些包括单克隆抗体，重组抗体，重组嵌合抗体(其抗体结构域来自某种动物且与人类抗体结构域或人源化抗体融合)。本发明的抗体同源物优选的是具有重链及轻链的完整的免疫球蛋白分子。此外，本发明的CD4反应性抗体同源物可以以Fab片段，Fab′片段，F(ab′)2片段，F(v)片段或任何具有上述结合性质的其它免疫球蛋白片段形式存在。
本发明所提供的优选的抗体或抗体同源物为称为B4或M2或B13的小鼠单克隆抗体。同时也提供了能产生本发明的抗体同源物的杂交瘤，通过培养这些细胞筛选及制造此抗体同源物的方法，及制备本发明杂交瘤的方法。
表1 用于抗CD4表位定位实验的CD4肽
*：肽通过作为CD4肽段一部分存在的两个内源性半胱氨酸残基形成环状或者是在CD4肽段的N端和C端上加上半胱氨酸残基以促进其环化。(C)：在现存的CD4肽片段中加上的额外的半胱氨酸。≠：HBVTh(FFLLTRILTIPQSLD,SEQ ID NO:2)代表衍生自HBsAg蛋白质具有非选择性T辅助细胞功能的肽段。GG：插在CD4位点和T辅助细胞表位之间作为间隔基的(甘氨酸-甘氨酸)。附图的简要说明
| 肽抗原 | 肽抗原 | 肽抗原 | 肽抗原 | ||||
| 代码 | 描述 | 代码 | 描述 | 代码 | 描述 | 代码 | 描述 |
| p1403a | CD4(41-55) | p1483a | CD4(238-249) | p1590a | (C) CD4(104-115)(C)* | p1624a | (C) CD4(36-47)(C)* |
| p1405a | CD4(81-92) | p1485a | CD4(168-179) | p1608a | CD4(16-25)(C)* | p1687a | (C) CD4(349-353)(C)* |
| p1460c | CD4(60-109) | p1486a | CD4(126-137) | p1609a | (C) CD4(118-128)(C)* | p1689a | (C) CD4(913-226)(C)* |
| p1461a | (C) CD4(35-59)(C)* | p1487a | CD4(114-125) | p1610a | (C) CD4(127-141)(C)* | p1693a | (C) CD4(235-251)(C)* |
| p1462a | CD4(29-59) | p1488a | CD4(118-129) | p1611a | (C) CD4(138-146)(C)* | p1701a | CD4(361-375) |
| p1468a | CD4(47-64) | p1489a | CD4(102-113) | p1614a | (C) CD4(38-45)(C)* | p1702a | CD4(14-22) |
| p1a574 | CD4(364-375) | p1490a | CD4(94-105) | p1615a | (C) CD4(39-44)(C)* | p1761a | CD4(123-134) |
| p1476a | CD4(352-363) | p1491a | CD4(90-101) | p1616a | (C) CD4(40-43)(C)* | p1767b | HBVTh-GG- CD4(6-20) |
| p1477a | CD4(340-351) | p1492a | CD4(85-96) | p1617a | (C) CD4(52-54)(C)* | p1768a | CD4(154-165) |
| p1478a | CD4(324-335) | p1493a | CD4(138-149) | p1618a | (C) CD4(51-55)(C)* | p1768b | HBVTh-GG- CD4(154-165) |
| p1479a | CD4(318-329) | p1494a | CD4(160-171) | p1619a | (C) CD4(48-52)(C)* | p1813b | HBVTh-GG- CD4(79-88) |
| p1480a | CD4(303-314) | p1495a | CD4(206-217) | p1620a | (C) CD4(85-90)(C)* | p1816d | CD4(1-20) |
| p1481a | CD4(297-308) | p1496a | CD4(218-229) | p1622a | (C) CD4(104-108)(C)* | p1868a | CD4(297-351)* |
| p1482a | CD4(276-287) | p1589a | (C) CD4(79-96)C)* | p1623a | (C) CD4(108-112)(C)* | ||
图1代表由核酸序列中所推测出的人类CD4的氨基酸序列(SEQ IDNO:1)，即宿主抗原复合物的一部分。氨基酸以单字母代码表示如下：丙氨酸：A 半胱氨酸：C 组氨酸：H 甲硫氨酸：M苏氨酸：T 精氨酸：R 谷氨酰胺：Q 异亮氨酸：I苯丙氨酸：F 色氨酸：W 天冬酰胺：N 谷氨酸：E亮氨酸：L 脯氨酸：P 酪氨酸：Y 天冬氨酸：D甘氨酸：G 赖氨酸：K 丝氨酸：S 缬氨酸：V使用Littman等人的校正编号系统(细胞，1988,55:541),AA1-AA110,AA111-AA181,AA182-AA287,AA288-AA375,AA376-AA393，和AA394-AA433分别代表CD4分子的第一，二，三，及第四个胞外域，跨膜结构域，及胞质区。
图2示出了三个理论上可能的表位构型。抗体仅以Fv片段的略图描绘。实心长方形代表与表位的氨基酸相接触的抗体部分。表位的氨基酸以小圆圈表示。如果表位的氨基酸形成一条连续的肽序列，则此表位可被认定为＂呈线性＂(如MAbs E31及E6)；如果因构象折叠使氨基酸在空间上相邻的两个或数个肽段上分散开，则此表位可被称为＂不连续的＂(如MAbs J33,H5,D5,E2及I26)。最极端的例子被称为＂不连续的散布的＂，其中许多不连续的位点，衍生自复合物中一或一个以上的分子，通过构象折叠联合形成一延伸的表位(例如MAbs B4和M2的表位)(由Meloen等人修饰，Ann Biol Clin,1991,49:231)。
图3是六种真正的抗CD4抗体，两种能识别含与趋化因子受体结合的CD4的宿主细胞抗原复合物，和豚鼠αrsCD4血清在表达CD4的HPB-ALL细胞上所观察到的三种不同结合类型的简单示意图：帽状，不规则斑点状及团状。在免疫荧光测定中，于高分辨率荧光显微镜下B4或M2与HPB-ALL细胞的结合呈现帽状(A)的荧光点。每一种抗CD4抗体或豚鼠αrsCD4血清与HPB-ALL细胞的结合呈现不规则斑点状(B)的荧光点。标记了FITC的HIV-1的gp120蛋白质与HPB-ALL细胞的结合则呈现团状(C)的荧光点分布。
图4显示在剂量依赖性研究中，趋化因子受体CC-CKR5第3结构域肽(p2047a)对各种单克隆抗体结合rsCD4活性的增强百分比。
图5显示Mab B4对rsCD4/趋化因子受体CC-CKR5第3结构域肽混合物比对rsCD4亲合力增强的量化图(IC50 rsCD4)。本发明的详细说明
在此所用的＂第Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的原代分离物＂是将患者外周血单核细胞(PBMCs)或具有未感染的PBMCs的血浆作有限的培育，至第五代，而得来的。可借助三种很重要的性质将原代分离物与已适应实验室环境的病毒株，例如已在人类T型淋巴样细胞系中传代多次的Ⅲb/LAI,SF2和MN加以区分。首先，大部分的原代分离物不易在T细胞系中生长。例如，许多在PBMC培养中诱发合胞体形成的原代分离物(SI分离物)会在对HIV敏感的MT2T细胞系中进行复制，但只有少数会在宽容性较小的T细胞系如CEM或H9中进行复制。非合胞体诱发原代分离物(NSI分离物)则只能在初级T细胞中进行复制。其次，它们与已适应实验室环境的病毒株在对重组可溶形式的病毒受体蛋白质CD4(rsCD4)的体外中和作用的敏感度上不相同(Daar等人，PNAS USA,1990,87:6574-6578)。第三点，已适应实验室环境的病毒株对具有病毒外壳特异性的抗体的中和作用敏感，而原代分离物则是抗性的(Sawyer等人，病毒学杂志，1994,68:1342；Mascola等人，传染病杂志，1996,173:340)。如实施例1所示，表2的实验室株，如HIV-1MN，对抗-V3抗体的中和作用相当敏感，而另两种原代分离物则是抗性的，甚至对抗-V3制品也是抗性的，抗-V3制品对HIV-1MN的中和滴度为1:203,080。
但是，抗细胞抗体对HIV实验室株和原代分离物的中和趋势与抗病毒蛋白质外壳抗体不同。在实施例2的表3中，针对β2微球蛋白，MHC第Ⅰ级HLAA,B,C，和MHC第Ⅱ级HLADR，及其它已知的T细胞表面抗原的单克隆抗体无法抑制衍生自实验室细胞系的HIV-1MN株或HIV-1B分化体原代分离物所引起的感染，而针对HPB-ALL所产生的单克隆抗体(Mab B4)却对rsCD4蛋白质有中等程度的反应性且能与HPB-ALL细胞及与趋化因子受体如CC-CKR5结构域结合的rsCD4蛋白质强烈的结合，且已知其可有效地中和HIV-1的原代分离物(表3,7，和13)，但对衍生自实验室细胞系的HIV-1 MN株的中和活性则较小(表13)。在体外微小空斑测定中，已知当B4浓度低于10μg/mL(表3,7，和13)时较只对CD4有特异性的抗体(表7)能更有效地中和HIV原代分离物。因此，看起来原代分离物对抗含CD4的宿主细胞抗原复合物抗体较为敏感。
已知MAb B4的中和活性可延伸包括对HIV-2和SV的交叉中和(表14)。这些结果(表7,13)强烈显示在与HIV有关的细胞蛋白质中，有一个含CD4及共同受体，例如，趋化因子受体CC-CKR5的宿主细胞抗原复合物，它是具有交叉中和活性抗体的靶。共同受体是能使HIV融合，进入的受体或抑制因子。
对于抗含CD4的抗原复合物抗体广泛的中和活性的机制目前仍不清楚。含CD4的宿主细胞抗原复合物在介导HIV所造成的感染及疾病中可能扮演一个双重的角色：作为可供HIV结合的T细胞表面受体以及作为容许HIV产生细胞融合及进入的受体或HIV抑制因子。在此所用＂含CD4蛋白质的宿主细胞抗原复合物＂一词是指含可供HIV结合的受体与可作为HIV抑制因子或容许HIV产生细胞融合及进入的共同受体例如，CC-CKR5，的复合物。此分子复合物仅在表达CD4的细胞的表面上表达。其与以基因重组方式表达的可溶性CD4蛋白质分子在血清学上及功能上均大不相同。
在此所用＂CD4＂一词是指任何由天然存在的CD4基因所编码的CD4蛋白质。
在此所用＂表达CD4的细胞或CD4阳性细胞＂一词是指所有在其表面能表达CD4糖蛋白的细胞。此类细胞包括表达CD4的T淋巴细胞，例如，外周血T细胞，胸腺细胞，脾细胞，等和衍生自白血病或淋巴瘤的T细胞系细胞，如HPB-ALL或SUP-T1细胞。
在此所用＂重组可溶性CD4＂或＂rsCD4＂一词是指含有人类CD4的AA1-AA375的多肽(图1，SEQ ID NO:1)。
在此所用＂含CD4的宿主细胞抗原复合物＂或＂细胞表面CD4抗原复合物＂一词是指含CD4的细胞膜结构，CD4是一种包含了四个胞外域，一个跨膜结构域，及一个胞质区的50kD糖蛋白(图1,SEQ ID NO:1)，它与其它相关的宿主细胞蛋白质，如趋化因子受体的结构域复合。
CD4最初被描述为T辅助淋巴细胞的一种细胞表面标记。之后发现CD4稀少地在单核细胞，朗格汉氏细胞，小神经胶质细胞，及B细胞亚型上表达。同时也发现CD4分子可作为MHC第Ⅱ级分子的受体直接参与抗原特异性T辅助细胞的活化。1984年，发现人类CD4是HIV的受体(Dalgleish等人，自然，1984,312:763)。HIV外壳糖蛋白，gp120，与CD4的结合是病毒进入其靶细胞的第一步。
目前已对CD4分子进行了详细的定位研究，是以CD4特异性单克隆抗体所作的结合研究及反面推导如CD4结构修饰，例如，氨基酸的取代，缺失或插入与产生的CD4的功能改变的相互关系来进行的(Sattentau等人，科学，1986,234:1120；Peterson和Seed，细胞，1988,54:65；Jameson等人，科学，1988,240:1335；Sattentau等人，J.Exp Med,1989,170:1319；Hasunuma等人，免疫学杂志，1992,148:1841；Burkly等人，免疫学杂志，1992,149:1779；Davis等人，自然，1992,358:76)。这些定位研究使得人们能构建CD4分子的结构-功能图谱。已知许多CD4特异性单克隆抗体具有中和HIV实验室株的活性。但却未有人对这些具HIV中和活性的抗体通过接触HIV之前或之后的方式体内抑制原代分离物所造成的感染的能力进行评估。也从未有报导指出任一以上抗体对含CD4的宿主细胞抗原复合物(特别是当其与趋化因子受体的结构域结合时)具有反应性。
CD4的第一个胞外域与免疫球蛋白在三个互补性决定区(CDRs)具有同源性。已知CD4分子胞外域的第1及第2结构域与第Ⅱ级MHC分子的结合位点有关，而单独第1结构域则与HIV的结合及合胞体的形成有关。HIV外壳糖蛋白gp120的结合位点位于第1结构域中类似CDR2环的地方(Peterson和Seed，细胞，1988,54:65；Landau等人，自然，1988,334:159；Clayton等人，自然，1988,335:363；Arthos等人，细胞，1989,57:469；Sattentau等人，J.Exp.Med.,1989,170:1319)。已知在第1结构域中与CDR3区域互相重叠的分立区与合胞体的形成有关(Kalyanaraman等人，免疫学杂志，1990,145:4072；Camerini和Seed，细胞，1990,60:747；Corbeau等人，免疫学杂志，1993,150:290)。
由这些参考文献中，可以得出结论CD4的特异性抗体与免疫系统间的作用方式可能有以下数种：首先，抑制表达CD4的T细胞与其它活化T细胞，B细胞，或单核细胞之间第Ⅱ级CD4的反应；其次，传送信号至T细胞以抑制正常含CD4的T细胞所介导的免疫调控功能；第三，通过当同时捕获T细胞受体分子引发的编程性细胞死亡使表达CD4的T细胞死亡；第四，抑制CD4和HIV之间的相互作用，以抑制HIV所介导的免疫病理反应。基于以上这些结论，CD4抗体似乎是能预防及治疗HIV感染和与HIV相关的疾病(包括艾滋病)的最佳物质。而且，CD4抗体可能对预防那些不希望发生的免疫反应也非常有用，例如移植排斥，或治疗自体免疫疾病如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，或牛皮癣。有许多研究均以抗CD4抗体为其研究主题。目的是希望这些可抑制HIVgp120与CD4结合的抗体能防止合胞体的形成和预防由HIV所造成的感染。
两种完全定性的抗CD4抗体，Leu3A和OKT4A，已知能有效地抑制HIV所诱发的合胞体的形成。由Chiba的美国专利5,171,838中已知单克隆抗体Leu3A所能识别的表位精确定位于与HIV-1gp120结合位点的CDR2区域重叠的一段15个氨基酸AA49-AA63。已知单克隆抗体OKT4A所识别的表位已被定位于与HIV-1gp120结合位点重叠，在AA16-AA49之间的CD4位点(Jameson等人，科学，1988,240:1336。注：在Jameson的文章中所公开的CD4序列与显示于本发明图1,SEQ IDNO:1中的CD4序列之间有9个氨基酸的移码)。但此两种抗体在治疗HIV所造成的感染上的应用非常有限，因其无法结合或作用于已结合到HIVgp120上的CD4分子(Burkly等人，WO 92/09305)。此似乎是因表位与gp120结合位点的接近所造成的位阻。
其它已知的抗CD4抗体对HIV诱发的合胞体的形成有一些作用，包括MT151,MT413,13B8-2,OKT4E,VIT4和MT321(Dalgleish等人，自然，1984,312:763；Sattentau等人，科学，1986,234:1120；Davis等人，自然，1992,358:76；Corbeau等人，免疫学杂志，1993,150:290)。已知这些抗体可结合靠近第一结构域的CDR3区，与OKT4A和Leu3A所结合的表位不同的决定簇。但是，同OKT4A和Leu3A一样，它们也无法与已结合了HIVgp120的CD4分子结合，因此限制了它们的使用用途(Burkly等人，WO92/09305)。
另一组抗CD4的单克隆抗体，包括单克隆抗体5A8，如Burkly等人所述(出处同上)，也同样可以抑制HIV介导的合胞体的形成。表征单克隆抗体5A8的表位定位研究结果(p.81-82,WO 92/09305)发现单克隆抗体5A8能识别CD4中的一个构象表位，包括CD4的第一及第二结构域且两个位置对5A8的结合是必须且“足够的”。同时也发现连接第一及第二结构域的杆状β链中的AA83-AA105有很大的影响，且第二结构域中的AA105-AA131对5A8与CD4的结合是绝对必要的。至于CD4的第三及第四结构域和其它复合的细胞表面抗原则并未参与这种反应。
以前曾有建议使用抑制HIV与CD4阳性细胞间的结合和/或抑制HIV诱发的合胞体形成的那些能与CD4反应的单克隆抗体作为被动免疫预防剂来预防因意外接触引起的感染及中止受感染的母亲和婴孩之间的垂直感染(Rieber等人，Lancet,1990,336:1007；Rieter等人，PNAS,1992,89:10792；Attanasio等人，传染病杂志，1993,168:515)。但是，大部分这些抗CD4抗体只以HIV实验室株作过体外中和活性分析试验，从未通过接触病毒之前或之后的应用对任一抗体作过其体内抑制原代分离物造成的感染能力的评估。
已知这种体外病毒中和结果不一定变为对HIV的体内功效。特别是大家都知道rsCD4无法在受HIV-1感染的患者中发挥抗病毒作用(Daar等人，PNAS USA,1990,87:6574-6578)，尽管其具有很高的体外中和病毒活性。
在本发明之前，没有任何一种已知的抗CD4抗体被报导过能与CD4的所有四个结构域结合，或紧密地接触，以能抑制HIVgp120与人类CD4的初始结合，同时有效地中和HIV第1及第2型和SIV的各种原代分离物的感染性，并且能通过结合后的抗病毒机制具有这种中和能力。
依据本发明，所提供的抗体可与CD4的所有四个结构域结合，或接触，且当与趋化因子受体结合时可进一步提高其结合的效果。这些抗体能抑制HIVgp120与人类CD4的初始结合，同时有效地中和HIV第1及第2型和SIV的原代分离物的感染性，并且能通过结合后的抗病毒机制发挥这种作用。本发明的单克隆抗体及其同源物首次证明了一种能抵抗灵长类及huPBL/SCID小鼠模型的重组人类免疫系统中免疫缺陷病毒的原代分离物所造成的感染的抗体在动物体内的功效(实施例17和18)。
具有这些性质的抗体，例如单克隆抗体B4，很显然能在以药物治疗HIV感染和与HIV相关的疾病例如艾滋病上提供一些好处。与已知的抗CD4抗体不同的是，B4或其同源物可在HIV与含CD4的细胞表面抗原复合物结合之前和之后用来阻断其结合，且其能提供有效的保护作用以免受各种原代分离物的感染，包括交叉保护作用。
本发明的单克隆抗体是第一种被证明能在灵长动物模型及重组的人类免疫系统中对免疫缺陷病毒原代分离物产生有效的体内中和作用的单克隆抗体。如实施例2-18所示的本发明抗体的体外及体内中和作用结果，以及在此所述的性质的有机结合，显示其在意外接触病毒前后在预防人类受世界性第1及第2型HIV株感染上非常有用。
基于由实施例2-16和19-20中所得的结果概括出以下对本发明有用的抗体的性质：
1．在ELISA测定中与rsCD4的结合；
2．在免疫荧光测定中与表达CD4的细胞的结合，其结合模式于高分辨率荧光显微镜下观察时呈现＂帽状＂；
3．抑制HIVgp120与表达CD4的细胞的结合；
4．与已结合了HIVgp120的表达CD4的细胞的结合；且
5．在体外微小空斑测定中以＜10μg/mL的浓度中和HIV的原代分离物，对50％中和活性而言浓度优选在0.01-10μg/mL之间，对90％中和活性而言浓度优选在0.1-35μg/mL之间。优选的是，本发明的抗体也能展现。
6．当rsCD4事先与趋化因子受体结构域肽一起温育时可提高在ELISA测定中与rsCD4的结合；
7．与以下肽所代表的CD4四个结构域中任一个的结合：CD4的AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。
具有这些性质的抗体对预防和治疗其由原靶是CD4阳性细胞的感染因子所造成的人类疾病特别有效。因此，本发明提供了含有这些抗体或其同源物的预防和治疗组合物，以及使用这些抗体组合物的方法，该组合物对由原靶是CD4阳性细胞的感染因子所造成的人类疾病，例如，与HIV相关的疾病包括各种程度的艾滋病的预防及治疗特别有用。
如文中所述，＂抗体同源物＂是指包含一种或多种选自免疫球蛋白轻链，免疫球蛋白重链，和它们的抗原结合片段的多肽的蛋白质，其具有以上所述的结合及中和活性。抗体同源物包括IgA,lgG,IgE,IgD,IgM类型的完整的免疫球蛋白(及其亚型)，并具有K或λ轻链。具有上述性质的抗体或其同源物的片段，例如，Fab片段，Fab′片段，F(ab′)2片段，F(v)片段，重链单体或二聚物，轻链单体或二聚物，含一重链和一轻链的二聚物，或其类似物均涵盖于本发明的范畴中。抗体同源物也包括人源化重组抗体及嵌合抗体。在整个说明书中，＂本发明的抗体＂一词及其类似物均涵盖其同源物。
如文中所述，＂CD4阳性细胞表面抗原复合物＂或＂含CD4的细胞表面抗原复合物＂是指本发明抗体的结合位点。复合物可包括与趋化因子受体，例如CC-CKR5的结构域结合的CD4。
如文中所述，＂人源化重组抗体＂是指初始衍生自非人类哺乳动物的抗体，其中利用基因重组技术以人类免疫球蛋白轻链或重链上相应区域的氨基酸来取代部分或全部表达CD4的细胞上未用于与CD4细胞表面复合物结合的氨基酸。
如文中所述，＂重组嵌合抗体＂是指初始衍生自非人类哺乳动物的抗体，其中利用DNA重组技术以另一不同种的哺乳动物，优选的是人类，的免疫球蛋白轻链或重链上相应区域来取代轻链，重链或两者的全部或部分绞链和恒定区。
如文中所述，＂Leu3A＂是抗CD4小鼠单克隆抗体，目前商业上有来自Becton Dickinson Immunocytometry Systems,San Jose,CA的，目录号为340133的FITC缀合物出售。
如文中所述，＂OKT4A＂是抗CD4小鼠单克隆抗体，目前商业上有来自Ortho Diagnostic Systems,Raritan,NJ的，目录号为OK704010的FITC缀合物出售。
如文中所述，＂5A8＂是详述于PCT WO 92/09305的抗CD4小鼠单克隆抗体。
如文中所述，＂B4模仿剂＂是能引起单克隆抗体B4与人类重组可溶性CD4(rsCD4)或与表达CD4的细胞上的人类细胞表面CD4抗原复合物的结合至少降低30％的化合物。依据本发明的抗体
本发明的抗体或抗体同源物可与含CD4的宿主细胞抗原复合物特异性结合。复合物可包括与趋化因子受体，如CC-CKR5的结构域结合的CD4。在间接免疫荧光测定中，以高分辨率荧光显微镜观察它们与表达CD4的细胞的结合模式呈特征性＂帽状＂。
本发明的抗体可与含CD4的宿主细胞抗原复合物上散布的不连续的表位特异性结合。复合物可包括与趋化因子受体，例如CC-CKR5分子的结构域结合的CD4，能抑制HIVgp120与表达CD4的细胞之间的结合，同时能在已结合了HIVgp120后与含CD4的宿主细胞抗原复合物结合，并抑制多种HIV原代分离物对表达CD4的细胞所造成的感染。
优选的是那些能够抑制HIVgp120与表面CD4的结合，且可以病毒结合之前和之后的方式抑制所有第1及第2型HIV原代分离物对CD4细胞的感染。
依据本发明最优选的抗体包括如下所述的小鼠单克隆抗体B4(IgG2a),M2(IgG1)和B13(IgG2a)。
本发明的抗体及其同源物对HIV感染及各种阶段的艾滋病具有预防及治疗作用，因其可在HIVgp120与CD4阳性淋巴细胞表面上的含CD4的宿主细胞抗原复合物结合之前和之后预防宿主细胞的复制性感染。因此它们能预防HIV的感染并阻止病毒扩散到其它未感染的细胞上。本发明的抗体及其同源物有独特的效用因其能抑制HIV在与表达CD4的细胞结合后所造成的感染。用于本发明抗体的筛选测定
普通技术人员可很容易地以已知的方法确定某一抗体或其同源物是否具有上述特性以鉴定本发明的抗体或其同源物。
为确定某一抗体是否能与人类CD4结合，可以使用任何以rsCD4蛋白质作为固相抗原的传统结合测定方法。通过使用一种酶标记的对免疫球蛋白特异的二级抗体，可很方便地利用ELISA试验或类似的试验进行有用的rsCD4结合测定，其中免疫球蛋白属于产生抗体同源物的物种。
抗体或其同源物与表达CD4的人类细胞上的含CD4的宿主细胞抗原复合物的结合可通过以具有荧光标记的特异性免疫球蛋白二级抗体来作染色，其中免疫球蛋白属于产生所测试的抗体或其同源物的相同物种，或者以采用与衍生自趋化因子受体的肽，如肽2047结合的rsCD4蛋白质的ELISA试验来检测。以一种荧光活化的细胞分选器(＂FACS＂)或高分辨率荧光显微镜来测定能与抗体反应的细胞百分比及其荧光强度。结合在细胞上的抗体可以用高分辨率荧光显微镜来观察，其呈特征性＂帽状＂的荧光分布。适合此目的的表达CD4的细胞为表达CD4的T淋巴细胞，例如人类外周血T细胞，胸腺细胞，和脾细胞或表达CD4的白血病T细胞系如HPB-ALL或SUP-T。以已知的方法来分离这些细胞。例如，以Ficoll-Hypaque离心法可以分离出正常T淋巴细胞，以离心法可以分离出恶性T细胞。
可以使用任何适当的竞争性测定方法来确定某一特定抗体是否能抑制HIVgp120与人类CD4之间的结合。可用的测定方法包括，例如，ELISA，间接免疫荧光测定，及其它类似的方法。优选的是，事先将细胞与抗体一起温育来测定标记的HIVgp120与表达CD4的细胞上的CD4之间的结合能力。
HIVgp120抑制对CD4有反应的单克隆抗体与表达CD4的细胞之间结合的能力是通过事先将HIVgp120与表达CD4的细胞一起温育，并定量预先结合的HIVgp120抑制抗体与细胞间结合的程度来评价的。抗体与表达CD4的细胞间的结合通过FACS分析或高分辨率荧光显微镜，使用对产生所测试的抗体的物种具有特异性的荧光标记的二级抗体来进行定量。
用于上述测定中的HIVgp120可由以HIV感染的细胞，HIV本身，经HIVgp120基因转化后的宿主细胞，以表达gp120的重组病毒感染的宿主细胞，或分离的gp120来提供。优选的是重组产生的gp120。目前市面上有纯化的，重组HIVgp120产品出售(美国生物技术公司，Cambridge,MA)。
可使用任何已知的合胞体测定方法来评估某一特定抗体抑制HIV在表达CD4的细胞中诱发合胞体形成的能力。优选的是，将原代分离物或受HIV感染的表达CD4的组织培养细胞(如，H9)加到MT-2细胞培养物中。之后加入不同量的抗体。阴性对照组则只加常规培养基，或添加与HIV无关的抗体。也可使用诱发巨大合胞体的病毒株作为阳性对照组。就诱发巨大合胞体的病毒株而言，在温育后，以肉眼观察确定合胞体或蚀斑的形成数量来评定所有培养物。用这种方法来评定抗体抑制合胞体形成或降低细胞培养物中形成的蚀斑的数目的能力。
可监测HIV感染的任何指征来确定某一特定抗体是否能抑制HIV对表达CD4的细胞所造成的感染。有用的HIV感染的体外指示物包括，例如，HIV核心抗原p24的分泌。优选的是，在有或没有抗体存在下于受到HIV感染的表达CD4的细胞培养物中通过比较HIV p24量的多寡来确定对HIV感染的抑制。
可使用p24病毒抗原的定量测定来评估某一特定抗体抑制表达CD4的细胞受到HIV感染的能力。优选的是以p24病毒抗原中和测定来测定抗体在指明的稀释度下对侵入病毒的中和活性(Wrin等人，病毒学杂志，1995,69:39-48)。在这种p24HIV病毒测定中，病毒的感染性及中和活性可通过用p24ELISA测定PBMC培养物中所累积的p24抗原来定量(Coulter免疫学，Hialeah,FL)。
可以用ELISA或其它类似的方法来确定某一特定抗体是否对含CD4的宿主细胞抗原复合物比对rsCD4分子具有更高的结合性质。在此测定方法中，可通过使用标记的对免疫球蛋白特异的二级抗体来检测抗体与含CD4的宿主细胞抗原复合物结合的能力，此免疫球蛋白属于用rsCD4产生抗体的物种，rsCD4事先与衍生自可能与CD4结合的受体结构域的肽一起温育。该肽选自IL8Rα的第3结构域(p2029a),CC-CKR2b的第2及3结构域(p2087a,p2088a),CC-CKR3的第1和4结构域(p2079a,2082a)，和CC-CKR5的第3结构域(p2047a)。
可以用ELISA或其它类似的方法来确定某一特定抗体是否能与衍生自人类CD4的肽结合。在此测定方法中，可通过使用标记的对免疫球蛋白特异的二级抗体来检测抗体与这些肽之间的结合能力，此免疫球蛋白属于产生抗体的物种。
可以用ELISA或其它类似的方法来确定某一特定抗体是否能与衍生自人类趋化因子受体的肽结合。在这样的测定中，可通过使用标记的对免疫球蛋白特异的二级抗体来检测抗体与这些肽之间的结合能力，此免疫球蛋白属于产生抗体的物种。
抗体与肽间的结合优选的是通过在rsCD4 ELISA中的抑制性研究先将能与rsCD4反应的抗体与上述或表1中所列的CD4肽一起温育，接着再将抗体-肽复合物与包被有rsCD4或rsCD4/趋化因子受体肽的微孔一起温育来测定的。本发明的抗体同源物的类型及其制备
本发明的抗体包括能呈现如上述B4新颖特性的抗体与抗体同源物两大类，其特性可以上述及实施例2-18的步骤来确定。本发明的抗体可以是完整的单克隆抗体、完整的重组抗体、完整的嵌合型抗体、完整的人源化重组抗体或能呈现出结合及中和B4、M2和B13的抗原结合部位。A．单克隆抗体
本发明中最优选的抗体类型为由本发明中的杂交瘤所制备的完整的单克隆抗体。用于制备单克隆抗体的技术已众所周知(参见Kennett等人，＂制备和表征单克隆抗体的方法＂，单克隆抗体、杂交瘤：生物分析中的新领域，Plenum出版社，pp363-419,1980)。
用于产生本发明的抗体的含CD4的宿主细胞抗原复合物包括表达CD4的人类细胞，如，能表达CD4的外周血淋巴细胞、胸腺细胞或源自表达CD4的人类T细胞系。
这点与Kung等人在美国专利号4,381,295中所述有所出入，该专利认为＂事实上，在本申请中发现使用恶性T细胞系作为抗原发现会产生无法制造所须[T4]抗体的杂交瘤＂。(第四栏，54-56行)。事实上，Kung及其同事报告在8个急性淋巴T细胞白血病(第十四栏，45行)及大部分的T细胞系(第51行)中未观察到OKT4的反应性，因此得出结论恶性T细胞系为不适当的免疫原。
用来生产本发明抗体的免疫原来自表达CD4细胞的可靠的来源，优选的来自例如衍生自患有急性T淋巴母细胞白血病病人(T-ALL)HPB-ALL的T细胞系或来自患有非霍金氏淋巴瘤病人(T-NHL)的T细胞系SUP-T1的T细胞系。
为不受限于理论，一般均相信使用能表达CD4的细胞例如HPB-ALL,SUP-T细胞或MT-2作为免疫原，较使用分离的CD4或重组可溶性CD4(如rsCD4)，更能引发本发明抗体的产生。使用能表达CD4的细胞可在细胞表面为含CD4的宿主细胞抗原复合物提供更适宜的构象，此为单独CD4分子所无法提供的。
可以标准的方法完成免疫接种。单位剂量及免疫方法视哺乳动物的种类、其免疫状况、体重和施用的制剂中含CD4的宿主细胞抗原复合物之量而定。
在一实施例中，每一用于接种小鼠的表达CD4的细胞制剂中至少含约5-10×106的细胞。典型的，小鼠在第0天经腹膜接种能表达CD4的T细胞，在有或无佐剂存在下以PBS彻底清洗使其完全没有任何残存的培养基蛋白质。第一次接种后约14天至6个月，优选为15-30天，小鼠便由腹膜在没有任何佐剂存在下进行第一次能表达CD4 T细胞的加强接种，其中能表达CD4的T细胞清洗后重新悬浮于PBS。并可施以额外的加强免疫。优选为在没有佐剂下以多次加强免疫使其达高度免疫。
在进行融合前三天，由静脉注射最后一剂加强免疫(没有佐剂下悬浮于PBS中能表达CD4的T细胞)。依上述方法，或更明确的来说，依用于本发明抗体存在的表12的条件对被免疫的哺乳动物的血清进行筛检是否有本发明抗体存在。从血清可与rsCD4反应的被免疫的哺乳动物中分离出脾细胞。可以任何周知的脾细胞与永生的细胞系融合的方法来制造本发明的杂交瘤。
典型的，永生细胞系(例如骨髓瘤细胞系)和脾细胞衍生自相同的哺乳动物中。有用的哺乳动物包括小鼠、大鼠和恒河猴。优选的，脾细胞衍生自近交BALB/c小鼠株或杂交CD1小鼠株中(Jackson Labs,Bar Harbour,ME)。优选的永生细胞系是对含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基(＂HAT＂培养基)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。最优选的小鼠骨髓瘤细胞系是P3×63-AG8.653(ATCC,Rockville,MD,catalog No.CRL 1580)。典型的，以聚乙二醇(PEG)来融合对HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞系与小鼠脾细胞。再以HAT培养基来筛选由此融合所产生的杂交瘤细胞，HAT培养基会杀死那些未融合及未能有效融合的骨髓瘤细胞，而未融合的脾细胞则会在数天后自然死亡。
产生依据本发明的抗体的杂交瘤细胞可用上述筛选方法筛选培养上清液而检出。优选的，初次筛选时通过其与rsCD4自身的结合活性可选择“偏好”与事先已与一衍生自趋化因子受体CC-CKR5外部第三结构域的肽(例如p2047)预温育的rsCD4有结合活性的抗体。通过比较相应的rsCD4/p2047复合物与单独rsCD4之ELISA结果来测定所提高的结合活性。此种简单的重复初级筛选(rsCD4/p2047 vs.rsCD4)可去除大部分(＞90％)对不含CD4表面抗原有反应性的抗体。以此种对与CC-CKR5分子第三外部结构域的肽结合的rsCD4，而非单独的rsCD4的偏好反应性所筛选出的抗体须再经过第二种能否与含CD4细胞的细胞表面抗原复合物结合筛选，其是通过表征它们与表达CD4的细胞例如，HPB-ALL或SUP-T细胞的结合性来筛选。以衍生自与抗体相同物种的荧光标记的免疫球蛋白二级抗体来检测此结合情形，并以FACS分析或荧光显微镜来加以量化，且以荧光显微镜来进行观察。并以用于检测合胞体形成抑制情形的MT-2微小空斑中和试验或用于检测病毒复制抑制情形的p24抗原中和分析来进一步检测这些对能表达CD4的细胞有结合反应性的抗体其中和HIV-1原代分离物，例如，23135的能力。
选择那些能分泌对rsCD4/p2047有较优先结合性质和/或在ELISA中对rsCD4有结合活性，在间接免疫荧光分析中能对表达CD4的细胞染色，及对浓度＜10μg/mL的HIV原代分离物呈现中和活性的抗体的细胞集落进行最后的克隆及亚克隆。
为制备本发明中完整的单克隆抗体的抗体，将在上述筛选分析中呈阳性反应的杂交瘤以已知的条件在营养培养基中培养一段足以使其将单克隆抗体分泌至培养基的时间。适宜杂交瘤细胞的培养技术及培养基早已为大众所周知(参见，例如，Kennett等人，单克隆抗体，出处同前)。收集那些含有所要抗体的特定杂交瘤培养基的上清液。
或者，通过将筛选出的杂交瘤细胞注射至一未免疫的小鼠的腹腔内来制备所要的抗体。杂交瘤细胞将会在小鼠的腹腔中增生，分泌的抗体则会累积在腹水中(Kennett等人，单克隆抗体，出处同前)。以针头由腹腔中抽取腹水即可获得所要的抗体。
本领域普通技术人员知道，依据本发明所制备的单克隆抗体可很容易的从特定的杂交瘤细胞培养基上清液或腹水中加以纯化。B．重组抗体及其编码DNA
依据本发明，抗体同源物可以是由已用编码如本发明免疫球蛋白轻链及重链的DNA转化过的宿主细胞生产的重组单克隆抗体。重组抗体可以周知的遗传工程技术来合成。
例如，重组抗体可通过克隆编码来自产生本发明的抗体的杂交瘤细胞的抗体其免疫球蛋白轻链及重链的cDNA或基因组DNA来制备。之后再将编码这些多肽的cDNA或基因组DNA插入重组表达载体中，使两组基因均与其自身控制转录和翻译的基因调控序列可操纵地相连。选择能与所选宿主细胞基因表达相容的表达载体及其控制表达的调控基因序列。典型的，轻链及重链的基因被插入同一表达载体上以使两者的基因表达呈可操纵地相连。
可以原核或真核细胞作为表达宿主。优选的在真核宿主细胞中进行表达，因这种细胞较原核细胞更能装配及分泌出正确折叠且具免疫活性的抗体。
应了解上述步骤的一些改变均应视为仍在本发明的范围中。
宿主细胞有可能只制造出完整抗体的一部分，例如轻链或重链的二聚物，依据本发明这些仍然属于抗体的同源物。例如，可能需要以编码本发明抗体轻链或重链的DNA(但不是两者)来转化宿主细胞。也可用重组DNA技术来编码除去在CD4结合时非必需的轻链或重链或两者均有的部分或全部DNA序列，亦即，编码Fab′片段的DNA。依据本发明，由此种截短的DNA分子所表达的分子是抗体同源物。C．嵌合型及人源化重组抗体及其编码DNA
可用编码上述重组抗体的DNA作为起始物来制备嵌合型或人源化重组抗体。通过以含有所要免疫球蛋白轻链及重链DNA的合适的表达载体来转化宿主细胞以制备嵌合型重组抗体，其中编码重和/或轻链DNA的铰合区及恒定区的全部或部分DNA已用不同物种免疫球蛋白的重或轻链相应结构域的DNA取代。当原始重组抗体非人源时，优选的是用人编码铰合区及恒定区的DNA序列进行取代。嵌合型重组抗体例子具有小鼠的可变结构域及人的铰合区及恒定区。参见，美国专利号4,816,397及Morrison等人，＂嵌合型人抗体分子：小鼠抗原结合结构域及人恒定区＂，美国国家科学院院报，1984,81:6851-55。
人源化重组抗体是通过用由内含编码所要非人类免疫球蛋白轻及重链的DNA的适当表达载体转化宿主细胞而制备的，其中编码与CD4抗原复合物结合无关的氨基酸，包括分布在互补性决定区(CDRs)中的框架序列的全部或部分DNA已用来自所期望的人类免疫球蛋白轻或重链相应结构域的DNA序列加以取代。参见，P.T.Jones等人，＂以来自小鼠的相应DNA取代人抗体中互补性决定区的DNA＂，自然，1986,321:522-25。
本发明中最优选的人源化重组抗体含有散布在其人类框架序列中的B4＂CDRs＂序列。D．依据本发明在转基因哺乳动物中制备的抗体同源物
内源灭活免疫球蛋白基因座且含编码人重链及轻链基因序列的转基因序列的小鼠同型接合杂交瘤，可分泌含有人重链及轻链的抗体同源物。这些转基因抗体同源物，通过分别的ELISA可结合到重组可溶性CD4分子上且优选为结合在与衍生自CC-CKR5趋化因子受体第三外部结构域的肽(即，p2047)相结合的rsCD4上，且通过表达CD4的细胞的间接免疫荧光染色可结合在含CD4的人宿主细胞抗原复合物上，并具有能直接中和所有HIV-1分化体的原代分离物和HIV-2及SIV不同的原代分离物的活性，且与单克隆抗体B4具有类似的抗体结合性质，其可以上述标题为单克隆抗体的段落A中所述的免疫接种及筛选过程来制备。
更明确的来说，如Smith等人在WO 93/12227中所描述的一种转基因小鼠，其特点是带有HC1或HC2基因型，以其不具功能的JH位点及能重新排列以编码人类重链的转基因和能重新排列以编码人类轻链的转基因的同型接合体取代正常BALA/c或CD1小鼠作为免疫接种的宿主。E．依据本发明属于非完整抗体的抗体同源物
同源物也包括本发明抗体的片段。此类片段可以衍生自上述任一完整抗体的片段。例如，与宿主细胞抗原复合物结合的片段，以及衍生自上述抗体多肽的单体或二聚物，依据本发明这些物质本身也属于抗体同源物。有用的此类抗体同源物包括Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、F(v)片段、重链单体或二聚物、轻链单体或二聚物、含有一重链一轻链的二聚物，及其类似物。依据本发明前述片段通常是有用的抗体同源物。
可以化学方法产生抗体片段，亦即以蛋白酶，例如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶切割完整抗体，也可选择性地以还原剂来处理切割过的产物。或者，以带有截短的重链和/或轻链基因或截短的重链和轻链基因的融合基因转化的宿主细胞来制备这些有用的片段。可以用还原剂，如1,4-二硫苏糖醇来处理完整的抗体，再进行纯化以分离各链。也可由编码任一期望的重或轻链但非两者均有的DNA转化的宿主细胞来制备重和轻链单体(参见，Sastry等人，美国国家科学院院报，1989,86:5728-32)。能制备本发明抗体的细胞
本发明也提供了能制造本发明抗体的细胞及细胞培养物。此类细胞包括能制造本发明的单克隆抗体的杂交瘤。
此外，本发明也通过培养能产生此抗体的细胞提供了一种能制造本发明抗体的方法。培养此类细胞及分离其所制造的抗体方法为大众所熟知。。这些方法包括细胞培养技术以及腹水的生成。
同时也提供了一种用以产生本发明杂交瘤的方法，包括用表达CD4的细胞对一非人类哺乳动物进行免疫接种的步骤。
在此步骤中作为免疫原的细胞来自一可靠来源的表达CD4的细胞系，例如，衍生自人类白血病或淋巴瘤的T细胞系如衍生自患有急性T-型淋巴母细胞白血病病人(T-ALL)的HPB-ALL细胞或患有非霍金氏淋巴瘤病人(T-NHL)的SUP-T1细胞系，第一次接种时将其溶于PBS，或完全弗氏佐剂中腹膜注射，之后的加强免疫注射则采腹膜或静脉注射且完全不用佐剂。本发明的药物组合物及方法
本发明的抗体及其同源物可作为预防及治疗性药物组合物来防止由原靶为表达CD4的淋巴细胞的感染物所造成的疾病。此类疾病包括HIV感染和相关的疾病包括艾滋病。
优选的用于人类的本发明的药物组合物包括本发明的抗体，诸如一种或多种小鼠单克隆抗体B4或M2或B13及其同源物，诸如小鼠/人嵌合型重组抗体、人源化重组抗体或这些抗体的抗原结合部位。优选为与单克隆抗体B4或M2或B13或人源化嵌合型重组抗体有类似结合性质的小鼠/人嵌合型重组抗体的药物组合物。
本发明的药物组合物可进一步包含其它用于预防HIV感染的治疗剂。例如，本发明的抗体同源物可和能抑制反转录酶的抗反转录药剂，如AZT一同使用，或与能抑制HIV蛋白酶的药剂一同使用。此外，本发明的药物组合物可进一步包含抗病毒药剂例如干扰素，或免疫抑制剂如环胞菌素。
此外，一种或多种抗体同源物也可与两种或多种前述治疗剂一同使用。此种组合疗法的优点是可使用较低剂量的治疗药剂，因此可避免当使用各种单一药剂时可能会有的毒性或副作用。
本发明的药物组合物包含依据本发明的一种或多种免疫治疗有效量的抗体同源物，或其衍生物，且优选的为药学可接受的载体。＂免疫治疗有效量＂意指足够能防止因HIV感染或艾滋病，或由原靶为表达CD4的淋巴细胞的感染因子所引起的其它疾病所造成的免疫应答作用的量。＂药学可接受的载体＂意指不会在所施用的病人身上引发过敏反应或其它不适宜影响的载体。
合适的药学可接受的载体包括，例如，一种或多种水、生理盐水、磷酸缓冲盐液、右旋糖、甘油、乙醇和其它类似物，以及上述物质的组合。药学可接受的载体可进一步包括能提高抗体同源物的保存期限或效用的微量辅助性物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。
本发明的组成可以有许多不同形式。这些包括，例如，固体、半固体和液体的剂型，例如片剂、丸剂、粉末、溶液、分散液或悬浮液、脂质体、栓剂、注射用及输液用溶液。优选的形式视施用方式及其预防或治疗应用而定。优选的组合物是注射用及输液用的溶液的形式。
本发明优选的药物组合物与那些用于人被动免疫的其它抗体的组合物类似。优选的施用方式是非肠道施用。
此领域普通技术人员应不难了解，本发明抗体同源物的免疫治疗有效量将视施用程序、所施用的抗体同源物的单位剂量、抗体同源物是否与其它治疗药剂一同施用、病人的免疫及健康情况、所施用的特定抗体同源物的抗病毒活性而定。
预防HIV感染的免疫治疗，如每单位剂量的抗体同源物(完整抗体)其免疫治疗有效量范围为每公斤患者体重约1至100mg，优选为每公斤患者体重约5至50mg，最优选为每公斤患者体重约5mg。应每两周施用一次单位剂量，且当有意外接触情况如被针头刺伤后优选的应立即施用。可以数种方法来测定其抗病毒效果，包括病毒负荷。然而，应了解也可使用低或高剂量及其它施用程序。
非完整抗体的抗体同源物的治疗方法有些不同，视其体积及药学性质而定。
为了能更充分了解本发明而给出下列实施例。这些实施例只是为了说明之用，因此本发明的范围在任何情况下并不因此而受到限制。实施例1在体外中和试验中以针对HIV-1gp120的抗体来比较对实验室株与HIV原代分离物的敏感性以抗体来测定其中和病毒能力的特定步骤
细胞 将人类T细胞系MT-2(No.237,NIH AIDS研究及参考试剂方法目录)培育在如前述有15％胎牛血清的DMEM培养基中(Hanson等人，临床微生物杂志(J Clin Microbiol),1990,28:2030-2034)。以Ficoll-Hypaque梯度分离法由新鲜淡黄色外表的单元中分离出属阴性血清供体的HIV-1外周血单核细胞(PBMC)(Organon Teknika公司，Durham,NC)。以0.5％PHA-P(Difco Laboratories,Detroit,MI)刺激所得的PBMC。3至4天后，除去含有PHA-P的培养基并让细胞培养在含有15％胎牛血清、900μg/mL谷胺酰胺、抗生素及5％白介素-2的RPMI培养基中(Cellular Products,Inc.,Buffalo,NY)。
病毒 HIV-1MN是适应了实验室环境的病毒株，目前由位于马里兰州百沙士达市的美国国家卫生院维持并以永久性感染的H9细胞系方式提供(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog no.402)，我们由此制备出无细胞浓缩物。通过与PBMC共培养由患者的PBMC中制备HIV-1的原代分离物。通过PBMC以不超过3-5代的方式制备原代分离物的细胞浓缩培养物且通过离心加以分类。(Sawyer等人，病毒学杂志，1994,68:1342-1349)。此由位于加州柏克莱加州健康服务部门的卡尔汉森(Carl Hanson)提供。
MT-2微小空斑中和分析试验 在测定中和HIV抗体的滴度时采用的方法是，先让一系列稀释过的血清或抗体与固定量的HIV预温育，之后感染对HIV敏感的MT-2细胞，并在单层细胞上形成由HIV引发的微小空斑。无论是由适应了实验室环境的病毒株分离的产物或是原代分离物，由于微小空斑代表MT-2细胞与受HIV感染的细胞融合后所产生的巨大合胞体所形成，此分析方法只适用于SI分离物；且无论是由病毒至细胞或细胞至细胞间传递的抑制情形均可以此分析法来作评估，因为合胞体形成的抑制是由抗体对HIV颗粒或是HIV感染的细胞的作用所造成的，即，此方法可同时测定病毒对细胞HIV诱导的融合或细胞至细胞间HIV诱导的融合的抑制情形。可通过所降低的微小空斑数目，即在一周后观察由伯比定碘(propidium iodide)染色的空斑数目来观察中和的情形(参见，Hanson等人 ，临床微生物学杂志，1990,28:2030-2034)。在此分析法中，病毒及血清或抗体均以50％合并的、去纤维蛋白的、正常人类血浆稀释以除去任何非特异性的增高或抑制效果。
血清及抗体 GP抗-gp120N-端V3MN是从一种已被超免疫的豚鼠体内收集的血清(Wang等人，科学，1991,254:285-288)，其中带有相应于HIV-1MN的gp120多变的V3结构域中的N-端部分(抗-N-端V3MN)的合成肽抗原。GP抗-gp120N-端V3的文库血清是来自三只以肽混合物进行超免疫的豚鼠体内收集的血清，此肽混合物是约1×1013可能的HIV-1N-端V3序列的总合(抗-N-端V3文库)。用于豚鼠免疫接种的N-端V3MN和N-端V3免疫原库是如Walfield等人所述可用于产生带有数种实验室HIV-1株的中和活性的多克隆抗体的多分支N-端V3合成肽免疫原(Koff等人编辑，艾滋病研究综述(AIDS Research Reviews)，第18章，Marcel Dekker:纽约，1993)。另一种抗-gp120抗体是重组人单克隆抗体(Mab)，命名为IgG1b12，其带有对CD4上gp120的结合位点的特异性(抗gp120CD4-BS)(Burton等人，科学，1994,266:1024-1027)。由长时间无症状但血清呈阳性的HIV-1捐赠者的骨髓制备的抗体-噬菌体展示文库中以Fab片段的方式生成IgG1b12，将其克隆到重组DNA IgG1表达载体中来转换成完全人类抗体。此被视为用于中和各类HIV原代分离物的抗体的一种最佳标准(Burton等人，出处同前)。结果：
抗-N-端V3MN豚鼠抗血清、抗-N-端V3文库豚鼠抗血清和IgG1b12(抗gp120 CD4-BS)的HIV-1中和活性的比较示于表2。基于HIV-1MN实验室株和两种HIV-1原代分离物(23135和BR014)来测定两种抗-N-端V3血清的中和活性。以两种原代分离物(23135和BR014)来测定抗-gp120CD4结合位点的抗体的中和活性。以MT-2微小空斑中和活性分析试验来测量中和活性，以多克隆抗体血清稀释滴度表示的终点(50％和90％)和以单克隆抗体浓度(μg/mL)表示的结果示于表2。
HIV-1MN，生长于T细胞系H9的适应了实验室环境的病毒株，对两种抗-N-端V3抗血清的中和活性都非常敏感，但相对于较不具有菌株特异性的抗-N-端V3库抗血清，抗-N-端V3M的活性要高出四倍。PBMC培育的原代分离物则对任一抗-N-端V3血清的中和活性具有抵抗力。但是，至少一种原代分离物可被抗-gp120CD4结合位点，IgG1b12中等程度地中和。这些结果反应出实验室HIV-1株与原代分离物之间对中和反应敏感度的差异，表示实验室HIV-1株对于菌株特异性的抗-gp120N-端V3抗体的敏感性，原代分离物对这类抗体的耐受性，以及某些原代分离物被针对宿主CD4受体上gp120结合的抗体所中和的敏感性。
表2
针对HIV-1实验室株和HIV-1原代分离物抗-gp120抗体的中和活性
*wpi：免疫接种后的周数
| 样品 | HIV株 | |||
| 实验室株 | 原代分离物 | |||
| MN | 23135 | BR014 | ||
| 50％抑制 | 90％抑制 | 50％抑制 | 50％抑制 | |
| GPαgp120 N-端V3 MN[G.P.No.4279-4280；12wpi*] | 1∶203,080 | 1∶39,840 | ＜1∶10 | ＜1∶10 |
| GPαgp120 N-端V3库[.P.No.6546,6547；8wpi*] | 1∶23,968 | 1∶6,182 | ＜1∶10 | ＜1∶10 |
| MAb IgG1b12(αgp120) | - | - | 12.8μg/mL | ＞50μg/mL |
实施例2
针对HIV-1原代分离物的抗宿主细胞抗体其体外中和活性的表征
以蛋白A亲和层析法由腹水中纯化单克隆抗体并由血浆中纯化豚鼠抗-gp120N-端V3的多克隆抗体。在无菌磷酸缓冲盐液(PBS)中以1mg/mL重构抗体并制备其在PBS中一系列的稀释液，以用于HIV-1的中和分析试验。单独分析每一种抗体并合并入第7-15组混合物中以显示不同特异性抗体间有或无协同作用。以两种原代分离物通过MT-2微小空斑中和试验分析来测定抗HIV-1的中和活性并以终点(50％和90％)的抗体浓度(μg/mL)来表示。结果：
表3的结果显示抗两组分化体BHIV-1的原代分离物(23135和BR014)的抗体中和活性，此类抗体包括对各种细胞表面抗原(第1和2组，HLA DR的单克隆抗体ID1和80A；第3组，HLAA、B、C重链的单克隆抗体A1.4；第4组，β2-微球蛋白的单克隆抗体H28；和第5组，针对含CD4蛋白质的宿主细胞抗原复合物的B4)具有特异性的小鼠单克隆抗体，以取自HIV-1MN的gp120的N-端V3结构域的合成肽免疫接种豚鼠所制备出的抗gp-120N-端V3MN的多克隆抗体(第6组)，这些抗体的混合物(第7-15组)，和五种额外的针对充分表征的抗T细胞抗原的单克隆抗体(第16组，E罗赛受体的单克隆抗体(Erosettereceptor)；第17组，T3抗原的单克隆抗体；第18组，Leu1的单克隆抗体；第19组，T8抗原的单克隆抗体；和，第20组，T细胞抗原受体的单克隆抗体C37)(Wang等人，杂交瘤1986,5:179-190)。
在表3的实验中所测试的11种抗体中，只有衍生自以T细胞系HPB-ALL免疫接种的小鼠的单克隆抗体，B4(第5组)(本发明优选的实施方案之一，其对含CD4的宿主细胞受体抗原复合物具有独特的结合活性)，对原代分离物表达出非常强的中和活性。第7-15组的抗体混合物只在含有B4时才有中和活性。第7-10和15组与第11-14组的结果类似。此外，比较第5、第9、10、15和第7和8组的中和活性显示混合物的中和活性主要由B4造成的。其它抗体只会稀释B4的中和活性且并无证据显示抗本发明含CD4的宿主细胞抗原复合物的抗体(Mab B4)和其它抗细胞抗体或抗-gp120N-端V3抗体间有任何协同作用。没有任何一种已知在HPB-ALL细胞上表达的单克隆抗体抗其它T细胞抗原，在可检测的水平上中和HIV-1原代分离物。
表3 抗宿主细胞抗原的单克隆抗体对HIV-1所有B分化体
原代现场分离物的中和活性(MT-2微小空斑中和测定)
| 组别 | 抗体类型 | HIV株 | |||
| 23135 | BR014 | ||||
| 50％ 抑制 | 90％ 抑制 | 50％ 抑制 | 90％ 抑制 | ||
| 1 | MAb α HLA DR(ID1) | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | 71.4μg/mL | ＞100μg/mL |
| 2 | MAb α HLA DR(80A) | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL |
| 3 | MAb α HLA A,B,C 重链 (A1,4) | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | 47.6μg/mL | ＞100μg/mL |
| 4 | MAb αβ2 微球蛋白 (H28) | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL |
| 5 | MAb B4 (αHPB-ALL) | 0.21μg/mL | 1.54μg/mL | 0.19μg/mL | 1.63μg/mL |
| 6 | 多克隆 IgG α N- 端 V3 MN | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL |
| 7 | Ab 混合物 gps 1+2+3+4+5[当量比] | 1.05μg/mL | 4.37μg/mL | 0.75μg/mL | 4.13μg/mL |
| 8 | Ab 混合物 gps 1+2+3+4+5+6[当量比] | 1.17μg/mL | 5.75μg/mL | 1.17μg/mL | 8.08μg/mL |
| 9 | Ab 混合物 gps 1+5[当量比] | 0.51μg/mL | 0.96μg/mL | 0.49μg/mL | 2.52μg/mL |
| 10 | Ab 混合物 gps 1+5+6[当量比] | 0.60μg/mL | 3.51μg/mL | 0.75μg/mL | 3.32μg/mL |
| 11 | Ab 混合物 gps 1+6[当量比] | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL |
| 12 | Ab 混合物 gps 2+6 [当量比] | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL |
| 13 | Ab 混合物 gps 3+6 [当量比] | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL |
| 14 | Ab 混合物 gps 4+6 [当量比] | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL |
| 15 | Ab 混合物 (Fr,gPs 5+6 [当量比] | 0.46μg/mL | 2.52μg/mL | 0.67μg/mL | 3.14μg/mL |
| 16 | MAbαE：罗赛受体 | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL |
| 17 | MAbαT3 | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL |
| 18 | MAbαLeul | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL |
| 19 | MAbαT8 | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL |
| 20 | MAbαT 细胞抗原受体(C37) | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL |
实施例3
以HPB-ALL细胞免疫接种BALB/c小鼠
产生抗含CD4的宿主抗原复合物的单克隆抗体
测定单克隆抗体与rsCD4和表达CD4的细胞之间反应性的特定方法rsCD4 由商业来源(美国生物科技公司，剑桥，MA)及国家卫生院(MIH)艾滋病研究中心和参考药剂计划中获得纯化的重组可溶性CD4。
以rsCD4的ELISA试验测定抗CD4反应性 于4℃下在96孔板上以每孔100μL的量包被溶于10mM NaHCO3缓冲液，pH9.5,0.25μg/mL的rsCD4，温育过夜。将rsCD4包被的孔与250μL溶于PBS中3％(重量百分比)的明胶在37℃下温育1小时以封闭非特异性蛋白质结合位点，以含有0.05％(体积百分比)TWEEN20的PBS清洗3次后晾干。以内含20％(体积百分比)正常羊血清、1％(重量百分比)明胶和0.05％(体积百分比)TWEEN 20的PBS稀释测试样品，除非特定指明否则所有稀释均为1∶20(体积比)。将100μL的稀释样品加入每一孔中并使其在37℃下反应1小时。之后以0.05％(体积百分比)溶于PBS的TWEEN 20清洗6次以除去未结合的标记过的抗体。将100μL溶于1％(体积百分比)正常羊血清，稀释比为1∶1000的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠-IgG或山羊抗豚鼠-IgG,0.05％(体积百分比)溶于PBS的TWEEN20加入每个小孔中并在37℃下温育15分钟。之后以0.05％(体积百分比)溶于PBS的TWEEN 20清洗孔6次以除去任何未结合的标记过的抗体结合物并使其与100μL内含0.04％(重量百分比)邻苯二胺(OPD)和溶于柠檬酸钠缓冲液，pH5.0,0.12％(体积百分比)过氧化氢的混合物作用15分钟。加入100μL 1.0M H2SO4中止反应并测量产物在492nm(A492)的吸光度。
以间接免疫荧光染色来测定对于表达CD4的细胞的反应性 先以内含1％BSA的PBS来清洗每孔中所含0.5×106的表达CD4的细胞(即，HPB-ALL或SUP-T1细胞系)，之后使其与指定的单克隆抗体或豚鼠抗-rsCD4血清在室温下温育45分钟。在细胞与第一种染色的抗体温育后，以同样的清洗液清洗细胞2次再与1∶500稀释的荧光标记的(FITC)-山羊抗小鼠IgG或(FITC)-结合山羊抗豚鼠IgG二级抗体(Cappel,MalvernPA)一同于室温下作用45分钟。再次以同样的清洗液清洗染色的细胞，之后以细胞荧光图谱和/或免疫荧光显微镜来测定染色的细胞比例、染色强度及更优选的每一抗体的抗原结合的模式进行荧光分析。结果：
HPB-ALL细胞系是衍生自患有急性淋巴母细胞白血病患者的恶性人类T细胞系，以间接免疫荧光观察，其具有以下膜的表型：CDS+(T1/Leu+)，能表达的CD4(T4/Leu3A+),CD8+(T8/Leu2/C8+),CD3+(T3/Leu4+),CD6+(T6/Leu6+),CD2+(T11/Leu5/D9+),CD25+(Tac+),HLA-A、B、C和β2微球蛋白+,HLA-DR-(Wang等人，1986，出处同前)。以腹膜注射方式对BALB/c小鼠接种5-10×106经PBS清洗过的溶于弗氏完全佐剂中呈指数函数生长的HPB-ALL细胞，之后每隔一周至两周再由腹膜追加注射5-10×106经PBS清洗过不含任何佐剂的呈指数函数生长的细胞，总计期限为三个月。最后一次静脉注射5×106经PBS清洗过的HPB-ALL细胞后3天，将脾切除并由此制备单核细胞悬浮液。以聚乙二醇(PEG)来处理单核脾细胞以使其能与骨髓瘤细胞和体细胞杂交。将融合细胞悬浮后加入96孔板中温育，以上述rsCD4 ELISA方法筛选含有特异作用于rsCD4抗体的孔。收集rsCD4反应性的杂交瘤并于96孔平底培养皿中在有饲养细胞存在下以限制性稀释法筛选单细胞克隆。随后先以rsCD4-ELISA试验筛选这些亚克隆杂交瘤细胞系是否对rsCD4有反应，之后再进一步筛选这些对rsCD4有反应的细胞系其抗体是否能与HPB-ALL细胞作用。只有两个细胞系，称为B4和M2，对rsCD4有中等程度的反应性且能染色HPB-ALL细胞，选择这两株细胞系进行随后的再克隆，通过腹膜内注射1×107细胞至以姥鲛烷刺激过的nu/nu小鼠体内腹水的形式维持细胞。实施例4-13中表征了由此两株细胞所分泌出的抗体，以及其它能与CD4反应的单克隆抗体的结合与中和活性。
实施例4
通过用rsCD4免疫BALB/c小鼠
所产生的真正的CD4特异性单克隆抗体结果：
BALB/c小鼠在第0天以腹膜注射方式接种10μg溶于弗氏完全佐剂(CFA)的rsCD4，并且分别在第21、42和137天追加注射10μg溶于弗氏不完全佐剂(ICFA)的rsCD4，且在第145天以10μg溶于PBS的rsCD4作最后一次静脉注射的加强免疫。在最后一次加强免疫后3天将脾切除并进行融合。以rsCD4-ELISA来筛选那些含有能与rsCD4反应的抗体的孔。收集四个杂交瘤细胞，命名为E6、E31、H5和J33并进行单细胞克隆。随后将这些杂交瘤细胞进行再克隆并维持以用于在腹水中培育。在对照组中，于第0天以100μg溶于弗氏完全佐剂的rsCD4免疫接种一只豚鼠，并于第14和28天加强免疫100μg溶于弗氏不完全佐剂的rsCD4。分别于第28和42天收集该动物血清作为抗-rsCD4的阳性对照组。
实施例6-10中表征了四株杂交瘤及其抗体的结合与中和活性，以及其与其它单克隆抗体B4和M2的比较。
实施例5通过免疫接种HPB-ALL细胞至BALB/c小鼠并追加接种gp120-rsCD4
复合物产生的真正的CD4特异性单克隆抗体结果：
BALB/c小鼠在第0天以腹膜注射方式接种5×106溶于弗氏完全佐剂(CFA)的HPB-ALL细胞，并且在第28天追加注射5x106溶于弗氏不完全佐剂(ICFA)的HPB-ALL细胞，再于第56天开始每周一次以溶于ICFA的HIV-1gp120-rsCD4复合物(每次10μg)作加强免疫接种持续3周。在最后一次加强免疫后3天将脾切除并进行融合。检出那些含有能与rsCD4反应的抗体的孔。收集三个杂交瘤细胞，命名为D5、E2和I26，并进行筛选、克隆和再克隆，维持这些杂交瘤用于在腹水中培育。
实施例6-10中表征了此三株杂交瘤细胞系及其抗体的结合与中和活性，以及其与其它单克隆抗体B4和M2的比较。
实施例6能与CD4反应的单克隆抗体和多克隆抗体其各自的结合活性与其中和
HIV原代分离物的活性的表征测定单克隆抗体与rsCD4、结合了衍生自CCKR5表面分子的肽的rsCD4、合成的CD4肽以及与表达CD4的细胞之间反应性的特定方法
以抗体来测定病毒的中和活性的方法详述于实施例1中，而测定抗体与rsCD4及与含表达CD4的细胞的细胞表面结合的方法则详述于实施例3中。本实施例则只提供测定抗体与合成的CD4肽的反应性及用以确定表位图谱的ELISA抑制试验分析的详细步骤及方法。
合成的CD4肽列于表1的肽是以Merrifield固相合成法以Fmoc化学法于应用生物系统肽自动合成仪(Applied Biosystems automatedpeptide synthesizers)上所合成出来的(型号430、431和433A)。在所期望肽的装配后，依标准程序以三氟醋酸将肽由树脂中切出并除去氨基酸侧链上的保护基团。对于环肽，将切下的肽溶于15％DMSO水溶液中48小时以加速分子内两半胱氨酸间二硫键的形成。表1中标有*号的肽是如此环化的。其它肽则为线形。标号有*号的肽则含有甘氨酸-甘氨酸的间隔基及来自乙型肝炎病毒(HBV)的T细胞辅助表位。以HPLC来纯化所切出，萃取及清洗后的肽并以质谱仪及反相HPLC来进行表征。
以合成的CD4肽为底物的ELISA试验 以合成的CD4肽为底物的ELISA试验方法除了抗原包被步骤外与前述rsCD4的ELISA试验方法基本类似，其中将微孔板于37℃下与5μg/mL指定的CD4肽，而非4℃下0.25μg/mL的rsCD4，反应1小时进行包被。
ELISA抑制试验分析 通过在rsCD4结合稀释终点稀释后的样品预先与浓度范围在1.67mg/mL至16.7μg/mL的竞争性肽于37℃下预温育1小时来测定在rsCD4 ELISA试验中由肽引发的抗体结合活性的抑制。将预温育的样品与肽混合物直接用于上述标准的rsCD4 ELISA试验中。以相对于在无肽存在下预温育过的适当稀释后的相同单克隆抗体来计算抑制百分比。同样以类似的方法在rsCD4结合稀释终点，指定浓度的竞争性rsCD4与稀释样品预温育，以测量在rsCD4-ELISA试验中由rsCD4所引发的抗体结合的抑制。
间接免疫荧光抑制分析 以间接免疫荧光染色技术来进行竞争性抑制分析，将细胞与各种干扰剂在一特定步骤中温育并在每两次作用之间以同样的清洗液清洗两次。结果：
由上述实施例3、4和5所述的融合实验中筛选出9个能与CD4反应的单克隆抗体进一步分析其(1)通过间接免疫荧光分析其与表达CD4的细胞的反应模式，(2)以直接结合及间接抑制ELISA试验作为固相抗原(如表1中合成的CD4肽)来测定其在CD4上的抗原性，且(3)以MT2微小空斑中和分析试验测定其中和HIV原代分离物的能力。
抗体特性测定 除了属于鼠免疫球蛋白γ2a,k型的单克隆抗体B4外，所有其它的单克隆抗体以鼠杂交瘤亚同型化试剂盒(Calbiochem,SanDiego,CA,Cat.No.386445)检测后发现均属于γ1,k型(表7)。所选出的9种能与CD4反应的单克隆抗体，如在rsCD4ELISA试验(表4)中所示均与rsCD4蛋白质表现出免疫反应活性，其中与单克隆抗体J33、H5、E6、E2和I26有较强结合活性，与单克隆抗体D5结合活性较弱，而与单克隆抗体B4、M2和E31有中等强度的结合活性。由先前以溶于完全和不完全佐剂中的100μg rsCD4进行免疫接种的动物体在第28天取血后所获得的豚鼠抗-rsCD4血清在rsCD4ELISA试验中对rsCD4具有极高的反应性，其反应终点滴度大于105。已知此血清对rsCD4的多个结构域均具有反应性因此在接下来的抗体特性实验中被用作真正抗Cd4的阳性对照组，参见表4、7、8。
表4 以衍生自CD4分子胞外域1-4的特定合成肽来
定位各类CD4反应性单克隆抗体的抗原决定簇
| MAb | 个别肽在ELISA试验中于492nm下的吸光度 | |||||||||||||
| D1(1-111) | D2(112-181) | D3(182-286) | D4 (297-375) | sCD4 | ||||||||||
| 1816d(1-20) | 1858HBVTh-(1-20) | 1403a(41-55) | 1461a(35-59*) | 1852(68-92)(1-20) | 1589a(79-96*) | 1460c(60-109) | 1612a(133-151*) | 1817b(118-165*) | 1689a(213-226*) | 1693a(235-251*) | 1868a(297-351*) | 1701a(361-375*) | ||
| B4 | 0.125 | 0.166 | 0.115 | 0.117 | 0.285 | 0.180 | 0.165 | 0.101 | 0.295 | 0.155 | 0.226 | 0.257 | 0.217 | 1.424 |
| M2 | 0.201 | 0.189 | 0.084 | 0.081 | 0.192 | 0.129 | 0.159 | 0.090 | 0.179 | 0.113 | 0.168 | 0.158 | 0.185 | 0.871 |
| E6 | 0.065 | 0.094 | 2.046 | 2.195 | 0.082 | 0.052 | 0.069 | 0.053 | 0.085 | 0.054 | 0.074 | 0.064 | 0.067 | 2.007 |
| E31 | 0.062 | 0.088 | 0.062 | 0.071 | 0.080 | 0.064 | 0.069 | 0.077 | 1.936 | 0.060 | 0.085 | 0.063 | 0.065 | 0.936 |
| H5 | 0.065 | 0.087 | 0.058 | 0.065 | 0.115 | 1.972 | 2.003 | 0.244 | 0.211 | 0.057 | 0.088 | 0.064 | 0.073 | 1.984 |
| J33 | 0.132 | 0.138 | 0.067 | 0.083 | 1.046 | 0.063 | 0.100 | 2.348 | 2.022 | 0.063 | 0.087 | 0.116 | 0.081 | 2.059 |
| D5 | 1.095 | 0.175 | 0.061 | 0.059 | 0.084 | 0.058 | 0.057 | 0.069 | 0.063 | 0.067 | 1.972 | 0.061 | 0.064 | 0.335 |
| E2 | 0.088 | 0.182 | 0.058 | 0.058 | 0.060 | 0.054 | 0.054 | 0.063 | 0.069 | 2.169 | 0.063 | 0.056 | 0.055 | 2.083 |
| I26 | 0.197 | 0.292 | 0.060 | 0.057 | 0.063 | 0.056 | 0.057 | 0.060 | 0.056 | 0.054 | 2.310 | 0.058 | 0.062 | 2.182 |
| GpαrsCD4A492nm#滴度[Log10] | 2.140# | 1.936 | 0.180 | 2.027 | 1.995 | 0.241 | 0.498 | 2.027 | 1.965 | 0.164 | 0.336 | 1.921 | 0.126 | 1.935 |
| ＞5 | ＞5 | ＜2 | 4.472 | 4.779 | 2.046 | 2.419 | ＞5 | ＞5 | ＜2 | 2.168 | ＞5 | ＜2 | ＞5 | |
凡A492大于0.150的样品均视为具有反应性且为寻找方便起见在其反应值下加底线。
#豚鼠抗-rsCD4血清(4wpi)以1∶1000稀释度在492nm 下的吸光值。
*环形肽。
每一单克隆抗体上的表位的鉴定 通过表1中所列的合成CD4肽以直接结合实验来鉴定CD4分子上能被每一单克隆抗体识别的表位。这些肽依现有人CD4的前两个结构域(Wang等人，自然，1990,348:411)及由现有小鼠CD4分子的同源分析所推断出的第3及第4结构域(Brady等人，科学，1993,260:979)的3D结构所设计，以使合成CD4肽与天然CD4之间血清学交叉反应活性达到最大。其与片段的结合同其与rsCD4的结合类似。以酶于一系列稀释的免疫分析中来确定每一抗体的结合，对于结合的鼠抗体的检测，起始抗体浓度为50μg/mL，并以指定的肽或rsCD4作为固相抗原。在以肽及rsCD4为底物的ELISA试验中，以吸光度来表示结合的结果。为简化识别模式，只有经一系列稀释后浓度最高的抗体达到50μg/mL的反应信号的结果才被显示出来。认为A492大于0.150的样品具有反应性。表4中有下划线的结果表示其结合反应呈阳性。由此种细密分析的结果参照CD4的一级氨基酸序列(表4)，检定所有单克隆抗体中肽结合位点及其表位所在的结构域。
由表4所示的肽的反应模式将9种抗体分成3组(图2)。第一组的抗体能识别线性表位位点且包括两种分别称为E6和E31的抗体。由一合成肽可知此类抗体可识别线性表位结构域(表4)。更明确的来说，发现单克隆抗体E6识别位于来自与CDR2GP120结合结构域互相重叠的第一结构域的一个短至15个氨基酸确定的结构域之外的表位(AA41-AA55)，且E3可以和一大的环形肽AA118-AA165反应。
第2组的抗体，包括五种单克隆抗体H5、J33、E2、D5和I26，可与一衍生自CD4中两个结构域的线性肽反应，偶而则优选与其中的一个结构域作用(表4)，因此定性这类抗体为可识别不连续构象的表位。更明确的来说，H5主要是与CD4分子第一结构域中的CDR3区(AA79-AA96)反应，且对以环形肽AA133-AA151和AA118-AA165为特征的CD4分子第二结构域具有中等程度的反应性；J33则主要是与以环形肽AA133-AA151为特征的CD4第二结构域的中心位点反应，且对分别来自CDR1和CDR3结构域的带有对结构域内二硫键形成均有贡献的肽(AA1-AA20)和(AA68-AA92)的人工二聚物(P1852，表4)为特征的第一结构域具有中等程度的反应性；D5可识别分别以环形肽AA1-AA20和AA235-AA251为特征的第一及第三结构域中两段氨基酸；E2主要识别以环形肽AA235-AA251为特征的第三结构域中的一段氨基酸，对于以杂合肽1858为特征的CD4分子的N-端(AA1-AA20)具有中等程度的反应性；I26识别的结构域其大部分与D5重叠，对以一环形肽AA235-AA251为特征的第三结构域较具反应性。
以纯化的rsCD4或充分确定的rsCD4-gp120复合物免疫接种小鼠所得的前两组抗体，其对天然CD4分子有很强的反应性且对CD4分子中的各个结构域具有较强的反应性，因此可视为真正的抗-CD4的抗体。
最后，第三组的单克隆抗体B4及M2，如rsCD4ELISA试验中所示即使在饱和浓度下(50μg/mL)仍可对天然CD4分子表现出中等程度的反应性(表4)，对于衍生自CD4分子中许多的肽如AA1-AA20、AA79-AA96、AA118-AA165、AA213-AA226、AA235-AA251、AA297-AA351和AA361-AA375则只有非常弱的反应性。有趣的是，B4对CDR2的第一结构域的反应性，即已知抗-CD4抗体Leu3A和OKT4A结合的位点在其与其它肽的反应性比较时丧失。因此第三组中的这两个抗体属于可识别分散的、不连续构象的表位的抗体。
会干扰B4-rsCD4与M2-rsCD4反应的模拟肽的检定 为进一步破译CD4分子可能的与B4和M2两抗体接触的位点，于rsCD4 ELISA试验中测试衍生自靠近B4-rsCD4或M2-rsCD4结合反应结构域(表4)的肽其抑制B4-rsCD4与M2-rsCD4反应的能力。
将rsC4 ELISA试验中终反应浓度(即，对B4为10μg/mL，对M2则是20μg/mL)所产生的信号作为竞争性肽结合实验中的阳性对照组。
表5显示在rsCD4 ELISA试验结果中所得的抑制百分比，其中CD4肽经过一系列的稀释并分别在B4与固态结合的rsCD4结合之前与0.1mL10μg/mL的B4一起温育。将肽以1.67mg/mL、167μg/mL和16.7μg/mL(分别称浓度1、浓度2和浓度3)的浓度用于竞争性抑制实验中。只有对B4-rsCD4反应显示出极强抑制或增强效果的肽才显示出来以用于比较。增强效果是以抑制的负值来表示。
表6显示在rsCD4 ELISA试验中所得结果的抑制百分比，其中选定的CD4肽以如表5的程序进行一系列的稀释并分别在M2与固态结合的rsCD4结合之前与0.1mL20μg/mL的M2一起温育。只有对M2-rsCD4反应显示出极强抑制或增强效果的肽才显示出来以用于比较。
如表5所示，B4与rsCD4的结合可被衍生自CD4分子的AA1-AA20、AA6-AA20、AA81-AA92、AA79-AA88、AA154-AA165和AA297-AA351的肽强烈抑制，显示这些结构域参与与CD4相关构象的表位的形成。与Y.Chiba(出处同前)的单克隆抗体Leu3A及Jameson等人(出处同前)的单克隆抗体OKT4A报告不同的是，来自AA36-AA47结构域的肽可明显增强B4与rsCD4的结合，因此暗示AA30-AA47对B4的结合可能是空间上的相近而非直接参与。抑制位点通常位于分子内二硫键的周围(表5)。对于M2抗体也可观察到各类仅略有不同的CD4肽类似的抑制及增强模式(表6)。
表5
特定CD4肽对＂B4-rsCD4＂反应的竞争性抑制或增强
| 肽代码 | 肽的描述(CD4AA) | 肽浓度对“B4-rsCD4”反应的抑制百分比 | ||
| 浓度1 | 浓度2 | 浓度3 | ||
| 1816d | CD(1-20) | 64 | 53 | 29 |
| 1767b | HBVTh-CD4(6-20) | 76 | 68 | 35 |
| 1405b | HBVTh-CD4(81-92) | 89 | 52 | 20 |
| 1813b | HBVTh-CD4(79-88) | 93 | 69 | 32 |
| 1768a | CD4(154-165) | 82 | 37 | 6 |
| 1768b | HBVTh-CD4(154-165) | 76 | 44 | 11 |
| 1868a | CD4(297-351*) | 38 | 30 | 19 |
| 1624a | CD4(36-47) | -215 | -207 | -108 |
*环形肽
表6
特定CD4肽对＂M2-rsCD4＂反应的竞争性抑制或增强
| 肽代码 | 肽的描述(CD4 AA) | 肽浓度对“B4-rsCD4”反应的抑制百分比 | ||
| 浓度1 | 浓度2 | 浓度3 | ||
| 1816d | CD(1-20) | 74 | 60 | 17 |
| 1767b | HBVTh-CD4(6-20) | 82 | 72 | 43 |
| 1405b | HBVTh-CD4(81-92) | 88 | 53 | 16 |
| 1813b | HBVTh-CD4(79-88) | 92 | 70 | 37 |
| 1768a | CD4(154-165) | 86 | 36 | 19 |
| 1768b | HBVTh-CD4(154-165) | 85 | 45 | 25 |
| 1868a | CD4(297-351*) | 56 | 43 | 17 |
| 1624a | CD4(36-47) | -261 | -251 | -141 |
*环形肽
实施例7
单克隆抗体在表达CD4的细胞的细胞表面的结合性质
将9种能与CD4反应的单克隆抗体及豚鼠抗-rsCD4血清用于各种间接免疫荧光分析中以检测在HPB-ALL细胞表面上其表位的细胞表面表达及检测HIV-1gp120与能被各种CD4反应性抗体识别的CD4表位之间的空间关系。结果：
表7总结了由三个融合实验中所培育的鼠单克隆抗体的结果，其涉及(1)它们的亚型；(2)在rsCD4ELISA试验中它们与rsCD4的反应性；(3)在间接免疫荧光分析中其与表面CD4的反应性，以细胞反应性的百分比，染色程度(0-3+)及结合模式表示；(4)已结合的HIV-gp120干扰抗体与含CD4的宿主细胞抗原复合物结合的能力；(5)已结合的抗体抑制HIVgp120与含CD4宿主细胞抗原复合物结合的能力，和(6)抗体中和HIV-1原代分离物，如23135，的能力。
已结合在细胞膜所结合的CD4上的HIVgp120结合位点与能被各类可和CD4反应的单克隆抗体识别的CD4表位之间的空间关系特别详列于表7中的第(3)、(4)和(5)项中。以用FITC标记的抗小鼠IgG、用FITC标记的抗豚鼠IgG或用FITC标记的gp120对HPB-ALL细胞进行间接免疫荧光染色来显示其与CD4之间的结合模式。模式显示了在无gp120(3)存在下抗-CD4小鼠单克隆抗体的结合，在有已结合的单克隆抗体(5)存在下FITC标记的gp120的结合，及在有已结合的gp120(4)存在下单克隆抗体的结合。单克隆抗体B4和M2其独特的中和活性与其它七种抗CD4单克隆抗体在CD4上的结合位点不同，但有时靠近B4结合位点，显示于第(5)及第(6)项中。
表7 单克隆抗体与rsCD4及表面CD4受体复合物的反应性
以及单克隆抗体对HIVgp120与CD4细胞结合的抑制
| 克隆 | 小鼠Ig同型 | 免疫原 | (2)A492mm与rsCD4的反应性 | (3)HPB-ALL表面CD4的结合模式 | (4)单克隆抗体对已结合了gp120的HPB-ALL细胞的反应性抑制是或否 | (5)与已结合了单克隆抗体的HPB-ALL细胞的结合抑制是或否 | (6)能中和HIV-1原代分离物(23135)的50％终点浓度 |
| B4 | γ2a, | HPB-ALL(PBS) | 1.424 | ＞90％；3+(A) | ＞90％；2+(A)Yes,partial | 0；是 | 0.21μg/mL |
| M2 | γ1, | HPB-ALL(PBS) | 0.871 | ＞90％；3+(A) | ＞90％；2+(A)；Yes,partial | 0；是 | 0.38μg/mL |
| E6 | γ1, | rsCD4(CFA,ICFA) | 2.007 | ＞90％；2+(B) | 0；Yes | 0；是 | 59μg/mL |
| H5 | γ1, | rsCD4(CFA,ICFA) | 1.984 | ＞90％；1+(B) | ＞90％；1+(B)；No | ＞90％；1+(C)；否 | 45.5μg/mL |
| E31 | γ1, | rsCD4(CFA,ICFA) | 0.936 | ＞90％；1+(B) | ＞90％；1+(B)；No | ＞90％；1+(C)；否 | ＞100μg/mL |
| J33 | γ1, | rsCD4(CFA,ICFA) | 2.059 | ＞90％；1+(B) | ＞90％；1+(B)；No | ＞90％；1+(C)；否 | ＞100μg/mL |
| D5 | γ1, | HPB-ALL(CFA,ICFA)+gp120rsCD4复合物 | 1.930 | ＞90％；1+(B) | 0 | ＞90％；1+(C)；否 | ＞10μg/mL |
| E2 | γ1, | HPB-ALL(CFA,ICFA)+gp120rsCD4及合物 | 2.020 | 10％；1+(B) | 0 | ＞90％；1+(C)；否 | ＞10μg/mL |
| 126 | γ1, | HPB-ALL(CFA,ICFA)+gp120rsCD4复合物 | 0.793 | 0 | 0 | ＞90％；1+(C)；否 | ＞10μg/mL |
| PBS | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A | ＞90％；1+(C)；否 | N/A |
| gpαrsCD4 | N/A | rsCD4(CFA,ICFA) | Log10滴度=＞5 | ＞90％；1+(B) | ＞90％；1+(B)；否 | ND | ＜1∶10稀释 |
能识别一衍生自CD4gp120结合位点中与CDR2部位重叠的第一结构域(AA41-AA55)的约15个氨基酸大小的线性表位(Wang等人，自然，1990 348:411和Ryu等人，自然，1990,348:419)的单克隆抗体E6，可与rsCD4蛋白质及HPB-ALL细胞强烈反应，显示此HIV结合位点更多地暴露于表面的本质。
然而，即使真正的抗-CD4单克隆抗体J33、H5、和E2在rsCD4ELISA试验中可对rsCD4分子呈现较强烈的反应活性，但在HPB-ALL细胞上却只观察到约中等程度的染色活性。对这些单克隆抗体而言，分数1+代表在细胞表面CD4抗原复合物中其表位的暴露程度较小。此外，先前表征过能高度识别来自rsCD4及第1、2和4结构域的免疫表位的豚鼠抗-rsCD4血清(实施例6)，在间接免疫荧光试验中也只对HPB-ALL细胞表达出中等程度的染色活性，再一次显示在CD4阳性细胞表面上对于CD4分子较低的暴露机率。相反，单克隆抗体B4和M2却均能对细胞造成高度的染色，虽然其与rsCD4的反应活性仅为中等程度，此结果显示接触位点除了CD4外可能尚有共同受体的参与，共同受体与CD4一同形成含有CD4的宿主细胞抗原复合物。此点也可由B4-rsCD4反应可被数种衍生自CD4的肽所抑制而看出(表5)，显示细胞表面上有一大的包含CD4蛋白质的抗原复合物(图3)且其整体结构与rsCD4及含CD4的细胞表面抗原复合物的结构不同。
以单克隆抗体抑制gp120与CD4细胞间的结合 这些单克隆抗体的结合特性的进一步评估是通过评定其抑制HIV与能表达CD4的HPB-ALL细胞结合的能力。方法是在细胞已先和个别单克隆抗体(100μL浓度为50μg/mL的饱和浓度)作用的条件下，或是以PBS作为负对照组，随后将细胞温育在100μL，以1∶200稀释的FITC标记的HIV-gp120中。在与原代分离物和标记的二级抗体温育的过程之间清洗细胞2次。
对先以PBS，接着以FITC-gp120进行温育的细胞，可观察到其细胞表面亮度值为1+的特征小簇状染色模式(表7及图3)。此种FITC-gp120-HPB-ALL特征染色模式也可在先以单克隆抗体H5、E31、J33、D5、E2或I26温育后接着以FITC-gp120染色的细胞中观察到，因此显示这些抗体缺乏抑制FITC-gp120结合的能力，且说明了gp120的结合位点与这些抗-CD4抗体的结合位点并无关联。然而，先以单克隆抗体B4、M2或E6染色却可完全抑制FITC-gp120的特征染色模式，显示这些抗体对CD4-gp120结合的强烈抑制活性，也说明了gp120的结合位点与B4、M2和E6的结合位点相互关联。与E6不同，抗体B4或M2无法识别CD4上HIV的结合位点(即，CDR2部位)，因此一般认为此种B4或M2的抑制活性是由于空间位阻所造成的。
通过gp120抑制单克隆抗体与表达CD4的细胞间的结合对先以gp120结合到表达CD4的细胞上，再评价能与CD4反应的单克隆抗体结合所产生的效果。
先将1×106HPB-ALL细胞与来自HIV-1ⅢB株(AmericanBiotechnologies,Inc.,Cambridge,MA)的过量的10μg gp120在37℃下温育45分钟。以清洗缓冲液将经gp120处理过的HPB-ALL细胞清洗2次后依上述间接免疫荧光染色步骤与特定单克隆抗体一起温育。
结果发现只有E6与表达CD4的细胞间的结合因先与gp120结合而被完全抑制(表7,(4))。E6所识别的表位位置靠近那些能被OKT4A及Leu3A识别的位点。单克隆抗体B4和M2与表达CD4的细胞间的结合则不因先与gp120结合而受到显著影响，显示此两种抗体在HIV结合后仍能与表达CD4的细胞结合。此项观察结果为实施例16中(参见表16和17)在病毒结合后抗体B4所呈现出的体外中和活性水平以及在hu-PBL-SCID小鼠模型中(参见实施例18，表20)以B4体内接触之后预防HIV的功效提供了一种可能的机理。
实施例8
以单克隆抗体中和HIV原代分离物结果：
当9种能与CD4反应的单克隆抗体及豚鼠抗-rsCD4血清以上述的MT-2微小空斑试验(实施例1)来测试其中和HIV-1原代分离物23135的能力时，只有B4和M2显出颇强的抑制活性，分别在0.21和0.38μg/mL的浓度下产生50％的抑制效果(表7,(6))。抗体E6可识别的位点靠近HIV gp120结合位点，同时也接近OKT4A和Leu3A可识别的位点，而H5主要识别CD4第一结构域中位于CDR3部位的一个位点，两者均只有微弱的中和活性，50％终点浓度分别是59和45.5μg/mL。与单克隆抗体B4和M2不同，其它真正的抗-CD4单克隆抗体在抑制微小空斑形成的试验中(即，以HIV-1原代分离物抑制细胞融合与感染)未呈现对原代分离物明显的中和活性。尽管豚鼠抗-rsCD4血清与rsCD4强烈反应，此血清即使在高抗血清稀释浓度下(＜1∶10)也无法抑制HIV所引发的细胞融合及感染。
实施例9
用于筛选杂交瘤的最佳免疫接种及筛选方法
基于表7中的信息，我们可在此及表12中得出如下结论：当小鼠以新鲜清洗过的不含佐剂的CD4细胞进行超免疫接种时可成功制造出能分泌对含CD4宿主细胞抗原复合物有高度反应性抗体的杂交瘤。为提高能与表达CD4的细胞反应的杂交瘤细胞系的产生机率，首先将HPB-ALL或SUPT1细胞与抗T细胞表面抗原的单克隆抗体混合物一起温育，包括能抗HLAA-B、C、CD3、T细胞受体、CD8、CD6、CD2和CD5抗原的抗体，以避免除了含CD4的抗原复合物外的HPB-ALL细胞表面抗原暴露于宿主免疫系统，因此可使宿主免疫反应较易针对细胞表面含CD4的抗原的复合物，此抗原复合物包含HIV受体及共同受体。一种简便的筛选方法包含了三个步骤，首先是在ELISA试验中筛选能与rsCD4反应和/或相对于rsCD4偏好与事先已用一衍生自趋化因子受体第三外部结构域的肽，p2047，温育过的rsCD4反应的杂交瘤；随后是在能与rsCD4/p2047和rsCD4反应的细胞系中以间接免疫荧光分析来筛选出可和能表达CD4的细胞(例如HPB-ALL和SUP-T1细胞)进行强烈反应的细胞系；接着是由能和表面CD4反应的杂交瘤中筛选能分泌具有HIV-1原代分离物中和活性的抗体的杂交瘤，如标准MT2微小空斑减少分析所测。
实施例10
能与CD4反应且其结合特性类似B4的单克隆抗体的筛选
结合特性类似B4的单克隆抗体的鉴别可通过竞争性免疫抑制分析从CD4反应性抗体中容易的鉴别出，此法可由(1)以下述rsCD4ELISA系统制备的偶联有HRP的单克隆抗体B4，或(2)在如间接免疫荧光分析系统中伴随FITC-抗生物素染色的HPB-ALL细胞制备生物素化的单克隆抗体B4，以检测阳性B4信号的产生。
以琥珀酰亚胺制备生物素化单克隆抗体B4
以蛋白A亲和层析法纯化单克隆抗体B4并调整其浓度为每mL PBS中1mg。将0.71mg N-羟基琥珀酰亚胺生物素(Biotin-X-NHS,BoehringerMannheim Biochemicals,Indianapolis,IN,Cat.No.1008960)溶于0.31mL二甲基亚砜(DMSO)(Boehringer Mannheim Biochemicals,Cat.No.1418165)中，随后加入5mg溶于5mL PBS中的B4以使生物素与B4之摩尔比达50比1。混合物于室温下搅拌2小时接着在2-8℃下对PBS充分透析，使B4的终浓度为0.71mg/mL。在竞争性免疫荧光染色分析中以生物素化B4作为示踪剂来观察各种单克隆抗体对＂表达B4-CD4的细胞＂反应的抑制情形。
过碘酸盐法来制备偶联辣根过氧化物酶的单克隆抗体B4
酶与抗体间的偶联反应基本上依Wilson及Nakane所述方法，(Knapp等人，eds,1978Elisevier/North-Holland Biomedical出版社，免疫荧光及相关染色技术(Immunofluorescence and Related StainingTechniques),p215)，在酶与抗体间的摩尔比为0.48∶1的条件下来进行。在偶联反应后于PBS中对辣根过氧化物酶偶联的单克隆抗体B4充分透析使抗体终浓度为0.18mg/mL。在竞争性ELISA试验中此偶联物以50μg/mL的浓度来抑制各种单克隆抗体对＂B4-CD4细胞＂的反应。
竞争性抑制及其检测 表8显示9种抗-CD4单克隆抗体(单克隆抗体B4、M2、E6、H5、J33、E31、D5、E2和I26)和豚鼠抗-rsCD4血清在＂生物素化B4与表面含有CD4的复合物＂间反应的竞争性抑制结果。以间接免疫荧光分析来进行竞争性抑制分析研究，其中在每一测试中将0.5×106能表达CD4的HPB-ALL细胞与以每100μL含饱和浓度10μg/mL的特定抗体或1∶50稀释的豚鼠血清一起温育，充分清洗后，再以100μL生物素化B4(由0.71mg B4/mL的溶液的1∶1000的稀释液)作第二种染色，充分清洗后，再以100μL溶于PBS(pH 8.2)中1∶250稀释的FITC-抗生物素蛋白质示踪剂进行第三次染色(Pierce Chemical Co..Rockford IL,Cat.21221)。
表9显示9种抗-CD4单克隆抗体(单克隆抗体B4、M2、E6、H5、J33、E31、D5、E2和I26)与＂HRP B4-rsCD4＂反应的竞争性抑制的结果。以直接的rsCD4ELISA试验来进行竞争性抑制反应，其中固相所用rsCD4包被的孔已先用CD4肽1624a预处理以提高B4的结合信号。rsCD4包被的孔于120μL、50μg/mL HRP偶联的单克隆抗体B4存在下加入30μL各类抗体(每一孔100μL，浓度为50μg/mL)。结果：
如表8所示，在所有测试过的单克隆抗体及豚鼠抗-rsCD4血清中，在间接免疫荧光分析中只有B4和M2能有效地抑制HPB-ALL细胞的生物素化B4(1∶1000稀释)及FITC-抗生物素蛋白质染色(Pierce ChemicalCo.,1∶250稀释)。同样如表9所示，在所有测试过的单克隆抗体中，在rsCD4 ELISA分析中只有单克隆抗体B4和M2能对HRP-B4与rsCD4分子之间的结合呈现出高于45％的抑制效果。因此可以HRP偶联的或生物素化的B4作为示踪剂，以竞争性免疫分析来有效筛选得到能分泌结合活性(包括其对HIV原代分离物的中和活性)类似B4的抗体的杂交瘤，此筛选法较体外功能性筛选法例如标准MT2微小空斑中和分析试验更加容易。更重要的是，7种真正的抗-CD4单克隆抗体中(即，单克隆抗体E6、H5、J33、E31、D5、E2和I26)没有一种能有效的与B4竞争对rsCD4及对细胞表面上CD4受体复合物的结合位点的反应(表8及9)。
表8
通过能与CD4反应的单克隆抗体抑制＂生物素化单克隆抗体B4与细胞表
面上CD4受体复合物＂之间的反应
| 单克隆抗体(10μg/mL) | 间接免疫荧光分析 | ||
| 阳性细胞百分比 | 染色强度 | 抑制 | |
| PBS+生物素化B4+抗生物素蛋白质-FITC | ＞95 | 2.0 | 阳性对照组 |
| PBS+抗生物素蛋白质-FITC | 0 | 0 | N/A |
| B4 | 0 | 0 | 是 |
| M2 | 0 | 0 | 是 |
| E6 | ＞95 | 2.0 | 否 |
| H5 | ＞95 | 2.0 | 否 |
| E31 | ＞95 | 2.0 | 否 |
| J33 | ＞95 | 2.0 | 否 |
| D5 | ＞95 | 2.0 | 否 |
| E2 | ＞95 | 2.0 | 否 |
| I26 | ＞95 | 2.0 | 否 |
| G.P.αrsCD4血清 | ＞95 | 2.0 | 否 |
表9
通过能与CD4反应的单克隆抗体抑制＂HRP偶联的单克隆抗体B4与
rsCD4＂之间的反应
1．以每孔0.1mL0.25μg/mL的rsCD4在4℃下过夜包被孔来进行竞争性ELISA试验。以每孔0.1mL,50μg/mL的合成肽1624(表1)在37℃下处理孔板1小时以提高反应性。2．测试个别单克隆抗体其对过氧化物酶偶联的单克隆抗体B4(B4-HRP)与rsCD4结合的竞争性抑制作用。将120μL50μg/mL、120μL的B4-HRP与30μL50μg/mL的单克隆抗体混合。以30mL PBS而非所测试的单克隆抗体作为对照组。将每孔100μL的混合物移至rsCD4包被的孔板中以测试＂B4-HRP-rsCD4＂的反应性。3．抑制％计算如下：
| 单克隆抗体(50μg/mL) | A492nm | 抑制％ |
| PBS | 1.658 | 0 |
| 空白 | 0.049 | N/A |
| B4 | 0.338 | 80 |
| M2 | 0.884 | 47 |
| E6 | 1.262 | 24 |
| H5 | 1.222 | 26 |
| E31 | 1.494 | 10 |
| J33 | 1.105 | 33 |
| D5 | 1.468 | 11 |
| E2 | 1.533 | 8 |
| I26 | 1.530 | 8 |
[(PBS对照组的A492nm-含有竞争性单克隆抗体的样品的A492nm)÷PBS对照组的A492nml×100
实施例11通过rsCD4抑制＂B4-rsCD4＂而非＂B4-表面含CD4的复合物＂的反应：
单克隆抗体是与含CD4的宿主抗原复合物反应结果：
表10显示在间接rsCD4ELISA试验中以rsCD4作为固相抗原(0.25μg/mL,0.1mL/孔，4℃，过夜包被)，并以0.2μg/mL,0.1mL/孔的条件纯化B4以得到A492nm读数为0.679为阳性对照组，测定“B4-rsCD4”的竞争性抑制所得结果。将浓度由0.008至25μg/mL的rsCD4与纯化的B4于室温下在与固相rsCD4温育前预先温育1小时。如表10所示，1μg/mL的rsCD4与2μg/mL的B4的预混物可抑制B4与固相rsCD4之间的50％反应。
表11显示在间接免疫荧光分析中以HPB-ALL细胞(每次测试用0.1mL，其中含0.2-0.5×106细胞)作为靶细胞且将每次测试用0.1mL浓度0.71μg/mL的生物素化B4以使95％呈阳性反应的细胞其染色强度达到3+，将浓度由0.005至50μg/mL的rsCD4在与表达CD4的HPB-ALL细胞作用前预先与生物素化B4于室温下温育1小时。如表11所示，与rsCD4ELISA试验相反，即使当rsCD4浓度高达50μg/mL时也不会抑制染有B4的HPB-ALL细胞。与真正抗CD4抗体的未修饰的CD4位点相比，此种反应显示在含CD4细胞表面抗原复合物上存在有一新的可被B4识别的位点。此结果也可由HPB-ALL细胞的免疫荧光分析所得结果来证实，其通过事先用rsCD4吸附完全去除真正抗CD4单克隆抗体(结果未显示)。
所有在能与CD4反应的单克隆抗体与rsCD4、衍生自CD4的合成肽，及可表达CD4的HPB-ALL细胞上的结合反应性的观察，可总结为以下四点：
(1)如表4所示，单克隆抗体B4和M2可与rsCD4中等程度反应类似与分子的一种部分反应性，而在rsCD4ELISA试验中7种真正的抗-CD4单克隆抗体中有5种(即，E6、H5、J33、E2和I26)以及豚鼠抗-rsCD4血清可与rsCD4有较强的反应；
(2)如表7所示，所有真正的抗-CD4单克隆抗体和豚鼠抗-rsCD4血清与HPB-ALL细胞间微弱的反应呈现特征性＂不规则斑点状＂结合模式(模式B)，与单克隆抗体B4和M2的＂帽状＂结合模式不同(模式A)；
(3)如表8所示，先以饱和浓度20μg/mL的真正的抗-CD4单克隆抗体或豚鼠抗-rsCD4血清的1∶50饱和稀释液与能表达CD4的HPB-ALL细胞一起温育，不会抑制后续生物素化B4与HPB-ALL细胞间之结合，而对单克隆抗体B4和M2则会影响；且
(4)如表10和11所示，可用2μg/mL B4与1μg/mL rsCD4反应来抑制＂B4-rsCD4＂间50％的反应，而即使0.71μg/mL生物素化的B4与浓度高达50μg/mL的rsCD4反应也不会抑制＂B4-含CD4宿主细胞抗原复合物＂之间的反应。
基于以上四点发现，可得出单克隆抗体B4和M2的结合特异性可通过其包括了延伸超过单独的CD4蛋白质位点以包括含有CD4的宿主细胞表面抗原复合物的位点很容易与其它真正的抗-CD4抗体加以区分，其中CD4仅是宿主细胞抗原复合物的一部分。
表10
通过rsCD4抑制＂B4a-rsCD4b＂间的反应
| rsCD4(μg/mL) | A492nm | ％抑制c |
| 25 | 0.055 | 91.9 |
| 5 | 0.061 | 91.0 |
| 1.0 | 0.340 | 49.9 |
| 0.2 | 0.633 | 6.7 |
| 0.04 | 0.637 | 6.1 |
| 0.008 | 0.711 | -4.7 |
| 0 | 0.679 | 0 |
a纯化的单克隆抗体B4=2μg/mL
b4℃下以0.25μg/mL rsCD4包被过夜
c％抑制=[(对照组的A492nm-抑制浓度的A492nm)/对照组的A492nm]×100
表11
通过rsCD4c抑制＂B4a-表面含CD4的复合物b＂间的反应
a每一测试中以100μL、0.71μg/mL生物素化B4进行染色。b每一测试中使用100μL、0.2-0.5×106细胞。c在与HPB-ALL细胞温育之前先将100μL、2倍于指定浓度的rsCD4与100μL生物素化的B4在室温下一起温育1小时。
| rsCD4(μg/mL) | HPB-ALL细胞染色 | 抑制 | |
| ％阳性细胞 | 染色模式 | ||
| 50 | ＞95 | 3+ | 否 |
| 5 | ＞95 | 3+ | 否 |
| 0.5 | ＞95 | 3+ | 否 |
| 0.05 | ＞95 | 3+ | 否 |
| 0.005 | ＞95 | 3+ | 否 |
| 0 | ＞95 | 3+ | N/A |
实施例12由来自表达CD4的人类T细胞系进行免疫的HC1和/或HC2转基因小鼠
中制备人类免疫球蛋白之单克隆抗体
本实施例叙述由小鼠同种接合子制备人杂交瘤的过程，此同种接合子包括去活化的内源性免疫球蛋白部位及编码人类重链及轻链氨基酸序列的转基因人序列。依上述实施例3的免疫程序由这些以表达CD4的人类T细胞系进行免疫接种的转基因鼠制备的杂交瘤可以分泌包含人类重链及轻链氨基酸序列的单克隆抗体。由这些杂交瘤中所筛选出的细胞系，依表12的规则，其可分泌能与含CD4蛋白质的人宿主细胞抗原复合物结合的抗体，该抗体对于所有分化体HIV-1的原代分离物以及HIV-2和SIV的各类原代分离物均具有广泛的交叉中和活性，同时对单克隆抗体B4也有类似的抗体结合性质。
表12
制备由杂交瘤所分泌可有效中和HIV-1原代分离物的含CD4宿主细胞抗
原复合物的抗体的优选的免疫接种及筛选程序
| 优选的免疫接种程序 | 优选的筛选程序 |
| 能表达CD4的T细胞(如，HPB-ALL或SUP-T1 T细胞系)，2-10×106[第一次接种：腹膜注射，CFA或PBS；其它加强免疫：腹膜注射，和/或静脉注射(≥4x)；PBS] | 1)在rsCD4 ELISA试验中呈阳性反应；2)对能表达CD4的HPB-ALL或SUP-T1的T细胞阳性；且3a)以MT2微小空斑中和分析试验抑制HIV-1的原代分离物；或3b)通过预先将能与rsCD4反应的抗体与HPB-ALL细胞一起温育再以生物素化B4(如，表8)染色细胞来抑制“B4-rsCD4”反应；或3c)通过将HRP偶联的B4(如，表9)与个别rsCD4抗体一起温育以抑制“B4-rsCD4”之间的反应 |
更明确地说，如Smith等人于WO 93/12227中所述的具有HC1或HC2基因型的转基因小鼠，其同种接合子中有一在功能上不连续的JH基因座且含一能重组以编码人类重链及轻链序列的转基因，此类小鼠以来自能表达CD4的人类白血病T细胞系，HPB-ALL，的细胞进行免疫。在第0天将约100μl含5-10×106细胞的PBS以腹膜注射法，或更优选的以静脉注射或两法同时使用，导入小鼠体内。每隔一周便追加注射一次，至少重复四次，最后一次注射三天后进行融合的步骤。将脾脏切下且将约150×106的脾细胞与约30×106融合伴侣细胞(P3×63Ag8.653细胞系；ATCC)依Kohler和Milstein，自然，1975,256:495-97所述的标准程序进行融合。在接下来的数周进行多次融合，每一次之后都再接着每两周和或每个月加强免疫一次且每次都是在最后一次注射后三天进行融合。
如实施例3以ELISA试验来测试长大的杂交瘤及其上清液与rsCD4结合的能力。以偶联过氧化物酶的抗人类免疫球蛋白的二级抗体来检测人类抗体的存在与否。
一级杂交瘤是由以限制性稀释法所培养出的单细胞克隆并评估其是否能分泌可与rsCD4反应的人类单克隆抗体。为测定这些单克隆抗体是否也能识别含CD4蛋白质的宿主细胞抗原复合物，以类似检测B4与HPB-ALL或SUP-T细胞系间反应的间接免疫荧光染色来测试能与rsCD4反应的细胞系的上清液的反应性。
生长良好及能否产生大量单克隆抗体这两点在筛选值得培育的杂交瘤细胞系时也是重要的因素。
在所有生长良好且能分泌大量可与rsCD4及表达CD4的细胞反应的抗体的细胞系中，进一步测试这些细胞系的上清液其中和HIV原代分离物的活性。更明确的来说，以前述的MT2微小空斑中和试验分析来测试针对，例如HIV-1分化体B的原代分离物23135的50％及90％终点稀释度，起始稀释浓度为1∶2。选择那些具有对HIV-1很强中和活性的细胞系进行进一步的亚克隆。所筛选的杂交瘤可分泌人类免疫球蛋白，其对能中和HIV和SIV原代分离物的含CD4的宿主细胞抗原复合物上不连续构象的表位具有特异性的结合活性。这些人类单克隆抗体是用于接触HIV之前和之后预防HIV感染的候选抗体。
实施例13
抗含CD4的宿主细胞抗原复合物的抗体对所有类型
HIV-1分化体的广泛交叉中和活性的证明结果：
将抗体对实验室株MN和HIV-1A,B,C,D和E型分化体的原代分离物的中和活性互相作一比较。将这些原代分离物培养在PBMC中，而HIV-1MN则培养在如实施例1所述的H9细胞中。以MT2微小空斑法(实施例1)来进行中和分析，结果列于表13。
表13比较了由第5、9组和实施例4(表3)的第15组的单克隆抗体、实施例1所述的αgp120CD4-BS的单克隆抗体IgG1b12、实施例2(表3)所述第6组的抗-gp120 N-端V3多克隆抗体和市售对大部分HIV-1B型分化体的N-端序列有特异性的小鼠抗-gp120N-端V3单克隆抗体50.1对HIV-1所有类型分化体之间的交叉中和活性。单克隆抗体50.1(Repligen公司，Cambridge MA)是以衍生自HIV-1MNgp120的N-端V3环尖端的合成肽作为免疫原所制备的。此单克隆抗体可识别的表位是Lys-Arg-Ile-X-Ile-Gly-Pro(Wrin等人，病毒学杂志(J Virol),1995,69:39-48)。
表13中和HIV-1A,B,C,D,E型分化体的原代分离物#
(MT-2微小空斑中和测定)
| 组* | 抗体类型 | 实验室株MN H9 | UGO29分化体 A | 23135 PBL分化体B | BRO14 PBL分化体B | ZIM 748分化体C | UG266分化体D | THO36分化体E | |||||||
| 50％ | 90％ | 50％ | 90％ | 50％ | 90％ | 50％ | 90％ | 50％ | 90％ | 50％ | 90％ | 50％ | 90％ | ||
| 5 | MAb B4 | 20.4μg/mL | 66.7μg/mL | 1.17μg/mL | 6.76μg/mL | 0.21μg/mL | 1.54μg/mL | 0.19μg/mL | 1.63μg/mL | 0.54μ/gmL | 2.82μg/mL | 2.52μg/mL | 25.6μg/mL | 0.54μg/mL | 3.32μg/mL |
| 6 | G.p.Ig αN- 端V3 MN | 0.2μg/mL | 2.1μg/mL | - | - | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | - | - | - | - | - | - |
| 9 | 由gps 1-5所得的抗体 | ＞100μg/mL | ＞100μg/mL | 1.38μg/mL | 7.14μg/mL | 0.51μg/mL | 0.98μg/mL | 0.49μg/mL | 2.52μg/mL | 0.94μg/mL | 4.37μg/mL | 6.76μg/mL | 50μg/mL | 0.84μg/mL | 4.37μg/mL |
| 15 | 由gps 5和6所得的抗体 | 0.2μg/mL | 1.9μg/mL | 2.26μg/mL | 9.43μg/mL | 0.46μg/mL | 2.52μg/mL | 0.67μg/mL | 3.14μg／mL | 0.80μg/mL | 4.61μg/mL | 3.51μg/mL | 31.3μg/mL | 0.94μg/mL | 4.13μg/mL |
| IgG1b12 | mAb αgp120 | - | - | 11.9μg/mL | 38.5μg/mL | 16.7μg/mL | 41.7μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | 6.94μg/mL | ＞50μg/mL | 50μg/mL | ＞50μg/mL |
| MAb50.1 | mAb αgp120 (N-端V3) | 0.004μg/mL | 0.02μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL | ＞50μg/mL |
*：与相应于表2的抗体组有同样的抗体组成的抗体混合物
-：未测试
#：各型HIV-1原代分离物分化体是由WHO艾滋病的全球计划所提供。
抗体B4(第5组)对HIV-1A-E型分化体的原代分离物分化体具有很强的中和活性，但对实验室改造的MN株的中和活性则很弱。将B4与其它抗细胞抗体及抗-N-端V3抗体一起使用只会减弱B4对原代分离物的中和活性(第9和15组)。其它对原代分离物有效的抗体，IgG1b12(其能与gp120的CD4结合位点相结合)，对各型分化体原代分离物呈现的交叉中和活性较B4弱(＂IgG1b12＂组)，且只对A,B,和D型分化体的原代分离物有较微弱的中和活性。只能中和两种B型分化体原代分离物的一种。相反，抗-N-端V3抗体、单克隆抗体50.1及抗-N-端V3MN多克隆抗体(第6组和＂单克隆抗体50.1＂)对适应了实验室环境的病毒株有很强的中和活性，但对原代分离物(包括同型B型分化体的原代分离物)的中和活性则很微弱。只有合并使用B4及抗-N-端V3抗体(第15组)才能同时对实验室株及原代分离物表达出很强的中和活性。
总之，抗-gp120N-端V3抗体对适应了实验室环境的病毒株的中和活性较强，而本发明的独特的B4抗体则对A-E型分化体的原代分离物有较强的中和活性。而且，相对于αgp120CD4-BS抗体，(其是少数已知的能对某些HIV-1原代分离物呈现交叉中和活性的抗体之一)，本发明的抗体是唯一一种能对HIV-1之A,B,C,D，和E型分化体原代分离物有很强中和活性的抗体。
实施例14
本独特抗体对HIV-2或SIV的中和活性的证明以抗体来测定病毒中和活性的特殊步骤
p27抗原中和试验分析 将滴定的病毒原液与一系列抗体稀释液混合并以此感染用促细胞分裂剂刺激过的人PBMC细胞，且将感染后的细胞温育5天(Gardner等人，AIDS Res Hum Retroviruses,1995,11:843-854)。通过p27ELISA试验来测试所培育的PBMC细胞中所累积的SIVp27抗原以定量测定病毒的最大感染力及中和活性(Coulter SIV p27 EIA,Coulter Immunology,Hialeah,FL)。以抗体浓度来表示中和活性百分比，表示相对于未处理过(最大值)的培养物中p27浓度所累积的p27浓度的减少。
感染力降低分析(IRA) 进行IRA试验(white-Scharf等人，病毒学(Virology),1993,192:197-206)。改变用来感染PBMC细胞的病毒量，在固定量抗体存在下(此处为10μg/mL)以测定IRA中和活性。以被10μg/mL抗体去活化＞95％的感染单位来表示IRA的结果。
病毒HIV-2ROD是培养在H9细胞中的病毒株(NIH AIDSResearch and Reference REagent Program Catalog no.207)。HIV-2287，是由一实验室感染的猴子血浆所分离出的一种原代分离物，SIV251,SIV239，和HIV-1/SIV重组SHIVⅢB和SHIV89.6是在人T细胞系中传代的实验室株，由David Montefiori(Duke大学，Durham,NC)所提供。其中SIV251的一管浓缩液已在灵长类PBMC细胞中传代过。重组SHIVⅢB，和SHIV89.6为带有衍生自所示HIV-1B型分化体的HIV-1外壳蛋白质的SIV。结果：
表14的实验是B4(实施例4，表3的第5组)和多克隆抗-N端-V3MN抗体(表3的第6组)对各类HIV-2、SIV和重组SHIV分离物的中和活性的比较。表中显示出各分离物的名称。以感染力降低分析(IRA)来测定HIV-2287的中和活性(White-Scharf等人，病毒学(Virology),1993,192:197-206)。以被10μg/mL抗体去活化之＞95％的感染单位来表示IRA结果。以实施例1中所述之MT-2分析来测定HIV-2ROD的中和活性。SIV251、SIV239，和HIV-1/SIV重组体SHIVⅢB和SHIV89.6的中和活性由p27抗原中和分析来测定，(Gardner等人，AIDS Res HumRetroviruses,1995,11:843-854)对感染的PBMC培养物在50％终点浓度测定，其中有一组B4对在PBMC中培养的SIV251的中和活性的测定在80％终点浓度测定。50％和80％终点浓度是在以抗体处理过的培养物中与未处理过的培养物相比中可检测到的p27抗原的部分。
表14 以单克隆抗体B4中和SIV,SHIV和HIV-2
| 组别 | 抗体类型 | HIV-2287 * | HIV-2ROD # | SIV251 @ | SIV239 @ | SHIV@ⅢB | SHIV@89.6 | SIV251 @(huPBMC) | |
| PBMC IRA | 50％ | 90％ | 50％ | 50％ | 50％ | 50％ | 80％ | ||
| 5 | MAb B4 | 57(1.5对数致死率) | 0.7μg/mL | 8.5μg/mL | 2.0μg/mL | 1.3μg/mL | 0.679μg/mL | 0.088μg/mL | 1.0μg/mL |
| 6 | Gp Igαgp120 N-端V3 MN | 59.5(i.e.0对数致死率) | - | - | - | - | ＞10.0μg/mL | ＞10.0μg/mL | - |
*使用10μg/mL的单克隆抗体B4在感染力降低分析中
#使用MT-2微小空斑中和分析试验
@使用p27抗原中和分析试验
B4对所有表14中的HIV-2、SIV和SHIV株均有中和活性。相比之下，前述能有效中和实验室株的抗N-端V3MN抗体(实施例1和13，表2和13)的中和活性却对任一重组SHIV均无效，即使这些基因重组株处于适应实验室生长条件的状况。因此，显然，独特的且具很强中和活性的抗体其交叉中和活性可延伸到包括HIV-2和SIV，无论其是适应了实验室环境的病毒株或原代分离物，也无论其是以T细胞系或PBMC来培养，均是本发明独特的特性。
此观察显示本发明的抗体可用于SIV感染的恒河猴和以SIV和HIV-2感染的猪尾恒河猴的动物模型测试，以测试抗体的保护效果。
实施例15
独特抗体对已适应黑猩猩的HIV-1的中和活性的证明结果：
比较B4及前已表征的IgG1 b12(抗-gp120CD4结合位点)抗体对B型分化体HIV-1原代现场分离物，HIV-1DH-12，(生长在黑猩猩的PBL)的中和活性，结果显示于表15中。
以MT-2及IRA法来测定B4的中和活性，而只以IRA法测定IgG1b12的中和活性。对B4以被10μg/mL抗体去活化的＞95％的感染单位表示IRA的结果，且对IgG1b12以被25μg/mL抗体去活化的＞95％的感染单位表示IRA的结果。
比较现有MT-2分析结果与表3和13(第5组)的结果显示一独特可与CD4反应的抗体，B4，可对已适应黑猩猩的HIV-1呈现相当于以人类PBMC培育的初级分离株的中和活性。比较IRA的结果发现，B4可对已适应黑猩猩的HIV-1呈现较抗-gp120CD4结合位点抗体IgG1b12高出多于一倍的中和活性。因此，本发明的一种抗体显然较已知有原代分离物中和活性的单克隆抗体对已适应黑猩猩的HIV-1更具活性。
这些结果表明本发明的抗体可用于在黑猩猩体内HIV-1感染的测试模型，用以测试抗体的保护效果。
表15
抗体对黑猩猩PBL培育的HIV-1原代分离物
DH-12(B型分化体)的中和
*通过感染力降低分析#通过MT-2微小空斑中和分析试验
| 单克隆抗体 | DH-12(B型分化体) | DH-12(B型分化体) | |
| PBMC IRA* | 50％抑制# | 90％抑制# | |
| B4 | 每次培育以10μg/mL所得3.0对数致死率 | 0.33μg/mL | 2.1μg/mL |
| IgG1 b12(αgp120) | 每次培育以25μg/mL所得1.375对数致死率 | - | - |
实施例16
通过B4中和HIV-1原代分离物的动力学研究结果：
表16和17显示用B4中和HIV-123135(一种B型分化体的原代分离物)的动力学研究。表16显示在MT-2微小空斑中和分析试验中，于病毒加入后0至24小时期间内两种不同浓度B4、2和20μg/mL的中和活性的动力学分析。以添加所示病毒稀释液后的存活百分比来表示中和活性。表17显示向细胞加入病毒后0至96小时期间加入20μg/mLB4来中和HIV-1 23135的动力学研究。由于延长时间因此需要以p24抗原中和分析试验来检定对所示稀释浓度的所加病毒的中和活性(Wrin等人，病毒学杂志(JVirol),1995,69:39-48)。在此p24检定中，以一系列滴定过的病毒稀释液感染PBMC并将被感染细胞温育四天。在指定时间加入一定浓度的抗体。通过p24ELISA试验(Coulter Immunology,Hialeah FL)测定PBMC培养物中所累积的p24抗原以定量病毒的感染力及其中和活性。以相对于未经处理的培养物中p24浓度，用抗体处理过的培养物中可检测到的p24浓度百分比来表示所得结果，即，结果相当于以微小空斑计数的病毒存活百分率，虽然p24的测量较易受到背景的影响。
表16显示在感染后1小时，B4可完全中和以2μg/mL的浓度所加入的病毒。在20μg/mL浓度下，抗体的作用可持续至24小时后。表17显示当时间延长至96小时的结果且显示在感染后长达48小时后，以20μg/mLB4可有效中和病毒。这些结果显示构建了即使在细胞已接触病毒之后可防止体外感染的一种独特抗体，且提示此抗体对于接触HIV后的预防治疗可能有效。
表16
单克隆抗体B4所介导的对HIV原代现场分离物23135(B型分化体)
中和活性的动力学(0-24小时)
(MT-2微小空斑中和分析试验)
| 加入单克隆抗体的时间(病毒感染后) | 单克隆抗体的浓度(μg/mL) | 病毒存活百分比 | ||
| 病毒稀释液 | ||||
| 1∶75 | 1∶150 | 1∶300 | ||
| 0 | 2 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 20 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | |
| 0.5 | 2 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 20 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | |
| 1.0 | 2 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 20 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | |
| 2.0 | 2 | 4.2 | 1.9 | 2.2 |
| 20 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | |
| 6.0 | 2 | 17.2 | 15.9 | 29.2 |
| 20 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | |
| 24.0 | 2 | 87.0 | 64.1 | 59.4 |
| 20 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | |
表17
单克隆抗体B4所介导的对HIV原代现场分离物23135(B型分化体)
中和活性的动力学分析(0-96小时)
(p24抗原中和活性分析试验)
| 加入单克隆抗体的时间(接种病毒后) | 病毒稀释度 | p24平均值(pg)(20μg/mLB4) | p24平均值(pg)(病毒对照组，无B4) | 病毒存活百分比 |
| 0小时 | 1∶751∶1501∶300 | 371736 | 23671292922 | 1.61.33.9 |
| 24小时 | 1∶751∶1501∶300 | 16811264 | 249920611626 | 6.75.43.9 |
| 48小时 | 1∶751∶1501∶300 | 1896035 | 223018451125 | 8.53.33.1 |
| 72小时 | 1∶751∶1501∶300 | 654353295 | 222019941565 | 29.517.718.8 |
| 96小时 | 1∶751∶1501∶300 | 2023913672 | 174723581976 | 115.838.734.0 |
实施例17
针对SIVmac251感染的恒河猴被动免疫测定保护不受SIV感染的特定步骤
上述有关本发明抗体中和活性的研究表征了浓度、动力学及对于中和HIV-2和SIV原代分离物以及HIV-1所有类型分化体的原代分离物的B4的中和活性范围。这些体外特性以及在灵长类动物间CD4氨基酸序列高度的保守性，提示本发明B4的实施例在体内针对3种免疫缺陷病毒的感染有与体外高度相似的保护效果。因此，本发明的保护效果可用B4针对以SIV感染的试验性恒河猴，一种对于人类艾滋病极佳的动物模型的感染实验，来加以评估。
病毒浓缩液及体内SIV感染 用来进行感染的病毒浓缩液是获自R Desrosiers的原型SIVmac251株(New England Regional PrimateResearch Center,Southborough MA)。所有感染均以静脉注射方式完成接种，以由恒河猴PBMC中所分离的约10 AID50未经克隆的SIVmac251分离物来进行(Desrosiers等人，PNAS USA,1989,86:6353-6357)。对照组中未接种的两只猴子均以静脉注射给予同样剂量的病毒浓缩液且发现其均被持久性感染。在感染后定期对动物取血并以检测病毒抗原血症及血清转变的血清学检测，及用来检测病毒PBMC和血浆共培育的血清学检测来监测其感染。
SIV的血清学分析 血清转变是被SIV感染后的一种结果，可以酶免疫分析(EIA)检测，此是基于可和SIV产生交叉反应的HIV-2肽抗原(HIV-1,2EIA；United Biomedical,Inc.,Hauppauge NY)，且其可被用来测定SIV跨膜蛋白质(gp36)上一主要免疫N端结构域(氨基酸序列588-603)的血浆抗体的终点滴度。
SIVp27抗原分析 以一种SIV特异性单克隆抗体为底物的抗原捕获EIA分析(Coulter Immunology,Hialeah,FL)来检测体内及体外的复制性病毒感染。对于未稀释血浆体内阳性反应结果以＞0.05ng/mL值来表示。
SIV分离及终点稀释分析 将恒河猴PBMC以Ficoll-Hypaque梯度由全血中分离。将2mL未稀释的澄清的血浆或分离的PBMC加入到用促细胞分裂剂刺激的人类PBMC中。在添加了20U/mL IL-2及200U/mL抗干扰素α(两者均购自Collaborative Research.Waltham,MA),2.5×10-2mM2-巯基乙醇和2μg/mL Polybrene(两者均购自Sigma)，且含10％胎牛血清(Sigma,St.Louis MO)的RPM1-1640的生长培养基中维持培养物，并保持在37℃,5％CO2下。每周对培养上清液进行两次分析并持续4-6周以测定是否存在p27抗原。如果某一上清液样品在连续三次测试中其p27抗原均呈阳性则确定该培养物为阳性(Coulter SIV p27EIA,Coulter Immunology,Hialeah,FL)。为定量猴子PBMC中SIV的感染程度，将PBMC系列稀释并以类似的方法与人PBMC共培育。在第14天对培养物进行终点稀释分析同时测定p27抗原。
设计及方法 6只用于下述研究中的猴子是由TSI灵长类动物中心梅森实验室(Worcester MA)成群培养的成年恒河猴及年轻的恒河成猴。他们对SIV、SRV-1、SRV-2、SRV-5和STLV-1的抗体呈血清阴性。这些动物饲养于室内且依美国实验室动物协会的管理照料标准及遵守该标准由华盛顿特区实验室资源研究院实验室动物照管及使用委员会所订定的实验室动物照管及使用原则来照顾及使用。将动物依体重随机分为对照组及治疗组。
第1组中的两只猴子给予PBS，第2组中的4只猴子在由静脉给予10AID50的SIVmac251之前先由静脉灌注4mg/kg以蛋白A亲和层析法所分离的单克隆抗体B4。结果：
收集处理前、攻击前及攻击后1小时、1、3、15、22、29和36天后的血液。以rsCD4酶免疫分析测定所有样品中抗-CD4/趋化因子受体抗体的血浆水平，发现在灌注后第1天即已降低至最大值的一半，此很可能由于渗透及猴子外周血及淋巴组织中表达CD4的细胞的结合已达饱合之故。在第15、22和29天，收集所有猴子的血浆样品并以SIV p27抗原分析测试其中的p27抗原。
在第15天，发现对照组中的两只猴子(第1组中第170和110号)受到感染，显示为其血清中SIV p27抗原呈阳性(表18)。相比之下，在第15天，接受4mg/kgB4注射的实验组第2组中的四只猴子只有1只受到感染(表18)。
接下来，在第22和29天以p27免疫分析来分析所有猴子体内收集的血浆样品，这些结果确证了猴子体内在第15天所观察到的SIV抗原血症的结果。
另一项评估SIV感染的参数是监测动物的免疫状态是否有SIV反应性的血清转变发生。在对照组第1组的两只猴子均产生抗-SIV抗体，此由病毒攻击后2-3周内开始的HIV1,2(SIV)EIA测试来加以检测(表19)。当血清的吸光值超过由未经免疫接种未受感染的猴子体内所得无反应性对照血清(NRC)的吸光值的四倍时，被定义为血清反应阳性。表19中划有下划线的数值代表其有血清转变。一并列出供参考具有强反应性的对照组血清(SRC)的数值。实验组第2组中受保护的3只猴子(DW3,GN-端V3和NU3)在整个测试期间其血清均呈阴性反应。因此，在实验组中通过p24抗原血症发现唯一受SIV感染的猴子(G4B)，在测试期间也产生抗-SIV抗体。
于第15,22和29天收集两组中6只猴子体内的PBMC细胞。将这些天所得血浆及PBMC样品与以促细胞分裂剂刺激的人类PBMC一起混合并以病毒培育来检测SIV感染。连续培育3周并分析共培养物上清液中是否存在p27抗原。同样，对照组中的两只猴子(第170和110号)及实验组中未受保护的一只猴子(G4B)均受到感染，其证据为PBMC及血浆样品之病毒培育均呈现阳性(表18)。
结论：这结果显示以中等剂量(4mg/kg)的单克隆抗体B4为恒河猴进行被动免疫接种可有效地保护大部分(75％)的猴子不受SIV原代分离物及接下来以一定的SIVmac251剂量攻击所造成的感染，此剂量可有效地感染在所有先前实验动物及本实验中2只对照组动物中的2只动物。
表18 以单克隆抗体B4为恒河猴进行被动免疫随后用SIVmac251攻击
*p27抗原血症呈阳性的三只动物在整个监测期间其结果均呈阳性(直到141天)，而3只受保护的动物在同样监测期间均保持阴性。#以限制性稀释所作的共同培养的结果是用第15和22天所取样本所作。@真正的转变时间请参见表19。
| 组别 | 猴子号码 | 保护 | D27抗原血症*(第15大) | 血清转变@ | 病毒分离物# | |
| PBMC(第15天) 血浆 | ||||||
| 第1组在以10AID50的SIV攻击前1小时施用PBS | 170110 | 无无 | 阳性(2.21ng)阳性(1.43ng) | 是(3周)是(3周) | 阳性(9.0)阳性(10.0) | 阳性阳性 |
| 第2组在以10AID50的SIV攻击前1小时施用单克隆抗体B4(4mg/kh) | DW3G4BNU3GV3 | 是无是是 | 阴性＜0.049ng)阳性(＞0.8ng)阴性(＜0.049ng)阴性(＜0.049ng) | 否是(3周)否否 | 阴性阳性(8.5.10.5)阴性阴性 | 阴性阳性阴性阴性 |
表19 恒河猴以SIVmac251攻击后其血清转变状况
| 病毒攻击后的天数 | 血清转变状况 | |||||||
| 0 | 8 | 15 | 22 | 29 | 43 | |||
| 第1组 | 170 | 0.215 | 0.232 | 0.268 | 2.024 | 2.023 | 2.169 | +3周 |
| 110 | 0.055 | 0.060 | 0.053 | 0.451 | 2.161 | 2.194 | +3周 | |
| 第2组 | DW3 | 0.060 | 0.065 | 0.058 | 0.064 | 0.063 | 0.053 | - |
| NU3 | 0.058 | 0.054 | 0.058 | 0.124 | 0.054 | 0.065 | - | |
| G4B | 0.075 | 0.091 | 0.070 | 1.863 | 2.184 | 2.078 | +3周 | |
| GV3 | 0.056 | 0.071 | 0.051 | 0.055 | 0.056 | 0.057 | - | |
SRC=0.777NRC=0.078Cutoff=4×NRC=0.312
实施例18
单克隆抗体B4介导的针对由人类免疫缺陷病毒
原代分离物的感染的接触之前和接触之后的保护
已证明单克隆抗体(MAbs)和多克隆血清可保护非人之灵长类及以人类外周血淋巴细胞重组的SCID(hu-PBL-SCID)小鼠不受HIV-1(Emini等人，病毒学杂志(J Virol),1990,64:3674；Prince等人，AIDS Res HumRetroviruses,1991,7:971；Emini等人，自然(Nature),1992,355:728；Safrit等人，AIDS,1993,7:15)和SIV(Putkonen等人，自然(Nature),1991,352:436；Lewis等人，疫苗(Vaccine),1993,11:1347)的感染，这支持了以免疫预防来对抗HIV-1感染的观念。然而发现这些研究使用的抗病毒抗原的单克隆或多克隆抗体却只能中和衍生自T细胞系的实验室株，而对免疫缺陷病毒的原代分离物却无效。
在本研究中，以单克隆抗体B4来测定以本发明的单克隆抗体，即，针对含CD4蛋白质和趋化因子受体的宿主细胞抗原复合物上不连续构象的表位且对所有HIV原代分离物均具有广泛的中和活性的抗体，进行被动免疫接种是否具有体内保护不受HIV-1原代分离物引起的感染的能力。本研究的目的是证明施用B4可保护带有严重合并免疫缺陷(SCID)及用正常人类外周血淋巴细胞(hu-PBL)移植的小鼠(称为hu-PBL-SCID小鼠)不受以可抗中和的HIV原代分离物攻击所造成的感染。选用hu-PBL-SCID小鼠模型进行效果评估是因许多涉及多只动物的实验组可在相对短的时间内以合理的花费完成，这是唯一HIV-1感染保护研究的替代动物模型，即用HIV-1感染的猩猩，所无法提供的优点。在SCID小鼠体内重建人类免疫系统及测定保护不受HIV-1感染的详细步骤
单克隆抗体 用于本研究的对照抗体是小鼠骨髓瘤细胞系PRC5.4(ATCC No.TIB12)分泌的小鼠IgG2a，其结合特异性目前仍未知。B4和IgG2a PRC5.4均用蛋白A亲和层析柱纯化并在使用前重新以2mg/mL的浓度悬浮于无菌PBS中。所有抗体都是以腹膜注射方式注射到hu-PBL-SCID小鼠体内。
SCID小鼠的重构将用于本研究的CB.17scid/scid小鼠保持在特定的无病原菌的状态。经由腹膜注射2×107悬浮于0.5mL PBS中刚分离出的正常人类PBL细胞以重建非渗漏型基因型。在注射PBL2周后，以ELISA试验(SangStat,Menlo Park,CA)分析小鼠血清中是否有人类免疫球蛋白存在以确定重构过程是否成功。只有人类免疫球蛋白呈阳性的小鼠才用于本HIV-1感染研究中。
病毒浓缩液 用前述受感染的PBL的上清液制备HIV-1AD6病毒浓缩液(Ho等人，N Engl J Med,1989,321:1621-5)并滴定出其在hu-PBL-SCID小鼠体内的感染力。以每毫升50％小鼠受感染的剂量(MID50)来表示。
病毒中和分析 以前述p24抗原分析来测定HIV-1的中和性(Ho等人，病毒学杂志(J Virol),1991 65:489-493)。以相对于未经抗体处理的对照孔的经抗体处理过的培养孔释放至培养上清液中的p24抗原降低的百分比来定义中和活性。
hu-PBL-SCID小鼠的病毒攻击 选择已知对大部分中和性抗体具有抗性的AD6作为本研究中HIV-1的原代分离物。所有感染步骤及hu-PBL-SCID小鼠的维持均在符合第3级生物安全的动物房中进行。在PBL重构后2周对hu-PBL-SCID小鼠进行感染。对小鼠由腹膜注射0.5mL含10MID50不含细胞的HIV-1病毒稀释液。在此之前已在hu-PBL-SCID小鼠中以滴定法确定病毒接种物可感染至少80％的hu-PBL-SCID小鼠。
以共培养法检测HIV-1 在以病毒感染后3周，处死小鼠并以前述方法(Safrit等人，AIDS 1993,7:15-21)由腹腔灌洗液及脾脏中收集细胞。将这些来自小鼠的2×105腹腔灌洗液细胞或5×106脾细胞(10倍系列稀释)与来自HIV-1血清阴性捐赠者的2×106PHA活化的人PBL细胞在终点稀释培养物中温育。每周观察此共培养物上清液中是否有HIV-1 p24核心抗原存在，连续观察4周。如果单一样品中含＞1000pg/mL或连续两个样品含＞200pg/mL的p24抗原，则认为培养物是HIV-1阳性。以含有可检测得到的受感染细胞的最高稀释度的孔作为反应终点，病毒滴度以每106细胞中组织细胞感染剂量来表示。单克隆抗体B4在接触病毒之前和接触之后的有效预防剂量和动力学研究实验1设计及方法 为评价接触病毒之前预防的保护效果，在接种HIV-1之前1小时由腹膜中注射溶于0.5mL PBS的单克隆抗体B4。有两组小鼠注射了单克隆抗体B4(第2和3组，每组n=6，浓度分别是50mg/kg和5mg/kg)，一组则注射了来自骨髓瘤RPC5.4的不相关IgG2a(第1组，n=4浓度是50mg/kg)。由腹膜对先前经免疫接种的小鼠感染10 MID50的HIV-1原代分离物AD6。
为评价在接触病毒之后的保护效果，将第4组的动物用病毒攻击后30分钟注入浓度为50mg/kg的B4。每只小鼠平均重20g。在以病毒攻击后3周处死小鼠并从腹腔灌洗液及脾脏中收集细胞，以病毒培育法来测定感染性。结果：在任何一组动物中均未发现由抗体所引发的毒性。如表20A所示，由与PHA活化的人类PBL细胞共培养4周后的腹腔灌洗液细胞或脾细胞上清液中收获HIV-1，这些人类PBL细胞来自第1组以对照50mg/kgIgG2a刺激的4只小鼠中的3只(第4296,4297和4303号)，显示此对照组中75％的感染率。在以病毒攻击前1小时(第2和3组)或病毒攻击后0.5小时(第4组)(表20A)，注射50mg/kg(第3和4组)或5mg/kg(第2组)B4的18只小鼠体内均未发现病毒。实验2设计及方法 为此接触病毒后的保护实验，在施用任何抗体前由腹膜注射10MID50的HIV-1原代分离物AD6以感染小鼠。在以HIV-1感染后，立即对对照组第1组的小鼠(n=5)腹膜注射5mg/kg小鼠IgG2a(RPC5.4)。第2组的小鼠(n=4)在以病毒攻击后立刻注射50mg/kg B4。在2、4和24小时后，在第3、4和5组的动物(每组n分别是4,4,5)注射50mg/kgB4；且1小时后，在第6和7组的动物(每组n是4)分别注射15mg/kg和5mg/kg的B4。每只小鼠平均重20g。在以病毒攻击后3周处死小鼠并由腹腔灌洗液及脾脏收集细胞，并以病毒培育法来测定感染性。结果： 在任何一组动物中均未发现由抗体所引发的毒性。如表20B所示，由与PHA活化的人类PBL细胞共培养4周后的腹腔灌洗液细胞和脾细胞上清液中收获HIV-1，这些人类PBL细胞来自第1组以5mg/kgIgG2a(RPC5.4)刺激的5只小鼠中的3只(第4467,4471和4473号)，显示对照组中60％的感染率。在病毒攻击后0、2或4小时后曾接受50mg/kg(第2,3和4组)B4；或在病毒攻击后1小时中曾接受15mg/kg(第6组)和5mg/kg(第7组)的后两组小鼠(共21只)体内未发现HIV-1，如表20B所示。在第5组的4只小鼠中有2只小鼠(第4469和4472号)可用病毒培养物检测到HIV-1，此组动物在病毒攻击后24小时曾接受50mg/kgB4。然而，只在第4469号动物的腹膜冲洗液中发现有HIV-1(表20B)。实验3设计及方法 特别的，接触病毒后的保护实验，以所测的最低浓度的B4(5mg/kg)重复，直到接触后4小时。在施用任何抗体前由腹膜注射10MID50的HIV-1原代分离物AD6攻击小鼠。在以HIV-1攻击后，立即由腹膜对对照组第1组的小鼠(n=5)注射5mg/kg的小鼠IgG2a(RPC5.4)。第2组的小鼠(n=5)在以病毒攻击后立刻注射5mg/kg的单抗B4。在1、2和4小时后，分别向第3、4和5组的动物(每组n是5)注射浓度为5mg/kg的单抗B4。每只小鼠平均重约20g。在以病毒攻击后3周处死小鼠并由腹腔灌洗液及脾脏收集细胞，以病毒培育法来测定感染性。结果： 在任何一组动物中均未发现由抗体所引发的毒性。如表20C所示，由与PHA活化的人PBL细胞共培养4周后的腹腔灌洗液细胞或脾细胞上清液中收获HIV-1，这些人PBL细胞来自第1组以5mg/kgIgG2a(RPC5.4)刺激的5只小鼠，显示对照组中100％的感染率。在病毒攻击后0、1、2或4小时后曾接受5mg/kg B4的第2、3、4和5组的20只小鼠体内未发现HIV-1(表20C)。
表20A
以单克隆抗体B4在hu-PBL-SCID小鼠中接触之前
和接触之后HIV-1AD6感染的预防
实验1
| 实验组 | 由hu-PBL-SCID小鼠体内收获的HIV-1：第4周共培物 | ||||
| 腹膜液 | 脾脏 | 培育终点 | TCID/106细胞 | ||
| 1 | 小鼠IgG2a单克隆抗体(RPC5.4)(50mg/kg剂量)4296429742994303 | ++-+ | ++-+ | 5×1035×105-5×104 | 2002＜0.220 |
| 2 | 单克隆抗体R4，攻击前1小时(5mg/kg剂量)428542874290430543064311 | ------ | ------ | ------ | ＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2 |
| 3 | 单克隆抗体B4，攻击前1小时(50mg/kg剂量)428942914295430043014302 | ------ | ------ | ------ | ＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2 |
| 4 | 单克隆抗体B4，攻击后30分钟(50mg/kg剂量)426142844307430843104312 | ------ | ------ | ------ | ＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2 |
表20B
实验2
| 实验组 | 由hu-PBL-SCID小鼠体内收获的HIV-1：第4周共培物 | ||||
| 腹膜液 | 脾脏 | 培育终点 | TCID/106细胞 | ||
| 1 | 小鼠IgG2，(RPC5.4,5mg/kg剂量)，攻击后0小时44624465446744714473 | --+++ | --+++ | --5×1065×1065×102 | ＜0.2＜0.20.20.22000 |
| 2 | 单克隆抗体B4，(50mg/kg剂量)，攻击后0小时4475448644884490 | ---- | ---- | ---- | ＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2 |
| 3 | 单克降抗体B4，(50mg/kg剂量)，攻击后2小时45004501450345054509 | ----- | ----- | ----- | ＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2 |
| 4 | 单克隆抗体B4,(50mg/kg剂量)，攻击后4小时44764495449745064511 | ----- | ----- | ----- | ＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2 |
| 5 | 单克降抗体B4,(50mg/kg剂量)，攻击后24小时4469447244744477 | ---- | ---- | -5×104-- | ＜0.220＜0.2＜0.2 |
| 6 | 单克隆抗体B4,(15mg/kg剂量)，攻击后1小时4478448144894504 | ---- | ---- | ---- | ＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2 |
| 7 | 单克隆抗体B4,(5mg/kgd剂量)，攻击后1小时4485449244964499 | ---- | ---- | ---- | ＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2 |
表20C
实验3
以单克隆抗体B4在hu-PBL-SCID小鼠中接触之前与接触之后HIV-
1AD6感染的预防
| 实验组 | 由hu-PBL-SCID小鼠体内收获的HIV-1：第4周共培物 | ||||
| 腹膜液 | 脾脏 | 培育终点 | TCID/106细胞 | ||
| 1 | 小鼠IgG2a(RPC5.4)(5mg/kg剂量)，攻击后0小时46304634464746524664 | +++++ | +++++ | 5×1055×1015×1015×1055×101 | 220,00020,000220,000 |
| 2 | 单克隆抗体B4,(5mg/Kg剂量)，攻击后0小时46364639464046604666 | ----- | ----- | ----- | ＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2 |
| 3 | 单克隆抗体B4,(5mg/kg剂量)，攻击后1小时46434644464546464648 | ----- | ----- | ----- | ＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2 |
| 4 | 单克隆抗体B4,(5mg/kg剂量)，攻击后2小时46424649465046534656 | ----- | ----- | ----- | ＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2 |
| 5 | 单克隆抗体B4,(5mg/kg剂量)，攻击后4小时46514654465746584659 | ----- | ----- | ----- | ＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2＜0.2 |
总之，由以上三个连续的实验中所得的结果显示在体内动物模型中无论是在接触病毒以前或以后，以单克隆抗体B4来对动物进行被动免疫接种，可完全保护动物体不受代表性HIV-1原代分离物的感染。
由于人类因职业之故而暴露于HIV-1之下的情况极为罕见，估计因意外而造成的接触＜1人体感染剂量。因此，可以用浓度远低于目前用于SCID小鼠实验中(本实施例5和50mg/kg的剂量分别造成＞10μg/mL和＞100μg/mL的血清抗体浓度)的血清抗体浓度保护人体因职业之故接触HIV所造成的感染。
在接触病毒之前的模式中，观察到5mg/kg,15mg/kg和50mg/kg的浓度可完全保护动物体不受高剂量(10MID50)HIV-1原代分离物AD6的感染。在接触病毒之后的模式中，观察到50mg/kg剂量在大于4小时但少于24小时的间隔中的完全保护效果，5mg/kg剂量的效果则至少为4小时。这些结果显示了单克隆抗体B4在本发明实施例中可用于因职业性接触HIV-1长达4小时后的预防保护效果。
实施例19
以代表趋化因子受体结构域的合成肽研究
＂单克隆抗体B4-rsCD4-趋化因子受体结构域＂之间的反应合成趋化因子受体结构域的肽
列于表21和22中的趋化因子受体结构域的肽是以Merrifield固相合成技术以Fmoc化学法在应用生物系统自动肽合成仪(型号430、431和433A)上合成的。在所需的肽装配完成后，依标准程序以三氟醋酸处理树脂以将肽由树脂上切出，并去除氨基酸侧链上的保护基团。标有≠号的肽中也含有甘氨酸-甘氨酸间隔基以及来自B型肝炎病毒的T细胞辅助表位。被切出、萃取且清洗过的肽以HPLC进行纯化并以质谱仪及反相HPLC来表征。以特定ELISA试验来定量＂单克隆抗体B4-rsCD4-趋化因子受体结构域＂之间的反应
除了抗原包被的步骤外，以类似于此处所述的rsCD4ELISA(实施例3)步骤进行特定的ELISA试验，其中于4℃下如表22中已和0.25μg/mLrsCD4预温育过的各种浓度(0、0.016、0.063、0.25、1和4μg/mL)的趋化因子受体结构域的肽过夜包被微孔板。结果： 在特定ELISA试验中未发现单克隆抗体B4(浓度分别为10,1、0.1和0.01μg/mL)可和任何单独的趋化因子受体结构域的肽作用，其中微孔在rsCD4不存在的情况下于37℃用5μg/mL指定的趋化因子受体结构域的肽包被1小时。
表21以趋化因子受体结构域肽来研究＂单克隆抗体
B4-rsCD4-趋化因子受体结构域＂之间的反应
| 肽抗原* | 肽抗原* | 肽抗原* | 肽抗原* | ||||
| 代码 | 描述 | 代码 | 描述 | 代码 | 描述 | 代码 | 描述 |
| p1987# | LESTR(1-38)-GG-HBVTh | p2011# | IL8Rβ(1-46)-GG-HBVTh | p2033# | C5a-R(1-32)-GG-HBVTh | p2048a | CC-CKR5(261-277) |
| p1988a | LESTR(106-111) | p2012# | IL8Rβ(106-120)-GG | p2034a | C5a-R(91-116) | p2079b# | CC-CKR3(1-35)-GG |
| p1990# | LESTR(181-203)-GG-HBVTh | p2027a | CC-CKR1(168-203) | p2035a | C5a-R(171-205) | p2080a | CC-CKR3(92-107) |
| p1991a | LESTR(262-285) | p2028a | CC-CKR1(261-287) | p2036a | C5a-R(261-286) | p2081a | CC-CKR3(92-73-204) |
| p1999# | CC-CKR1(1-34)-GG-HBVTh | p2029a | IL8Rα(168-203) | p2041a | LESTR(103-114) | p2082a | CC-CKR3(265-281) |
| p2004# | CC-CKR1(94-107)-GG-HBVTh | p2030a | IL8Rα(259-296) | p2045# | CC-CKR5(1-29)-GG-HBVTh | p2086b# | CC-CKR2b(143)-GG-HBVTh |
| p2007# | IL8Rα(1-39)-GG-HBVTh | p2031a | IL8Rβ(179-208) | p2046a | CC-CKR5(88-102) | p2087a | CC-CKR2b(100-114) |
| p2008# | IL8Rα(100-111)-GG-HBVTh | p2032a | IL8Rβ(270-302) | p2047a | CC-CKR5(168-199) | p2088a | CC-CKR2b(182-207) |
| p2089a | CC-CKR2b(269-285) | ||||||
#:HBVTh(FFLLTRILTIPQSLD)代表肽片段，其中带有衍生自HBsAg之杂乱的T辅助细胞功能。
GG:(Gly-Gly)为插在趋化因子受体结构域与T辅助细胞表位间的间隔基。
*：趋化因子受体胞外域肽抗原是依由核酸序列中所推出的氨基酸编码系统命名的：
表22
代表如“单克隆抗体B4-rsCD4”结合反应中的趋化
因子受体结构域的肽的结构描述
| 趋化因子受体类型 | 代表趋化因子受体结构域的肽代码 | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | ||
| α | IL8Rα | 2007 | 2008 | 2029a | 2030a |
| IL8Rβ | 2011 | 2012 | 2031a | 2032a | |
| C5a-R | 2033 | 2034a | 2035a | 2036a | |
| β | CC-CKR1 | 1999 | 2004 | 2027a | 2028a |
| CC-CKR2b | 2086b | 2087a | 2088a | 2089a | |
| CC-CKR3 | 2079b | 2086a | 2081a | 2082a | |
| CC-CKR5 | 2045 | 2046 | 2047a | 2048a | |
| Fusin(LESTR) | 1987 | 1988a | 1990 | 1991a | |
以rsCD4ELISA试验只能检测到单克隆抗体B4和rsCD4之间非常微弱的反应，其中微孔在4℃下与用0.25μg/mL的rsCD4包被过夜。
然而，当rsCD4(0.25μg/mL)与各种浓度的每一种指定趋化因子受体结构域的肽预温育时，由特定的ELISA OD492读数可观察到rsCD4与单克隆抗体B4间不同的结合模式。在先的rsCD4与某种趋化因子受体结构域的肽(如，CC-CKR2b的第2和3结构域，CC-CKR5的第3结构域，CC-CKR3第四结构域)作用，可显著增加rsCD4与单克隆抗体B4之间的结合。此种增强效果与所用肽的浓度相关。在所有10,1,0.1和0.01μg/mL的单克隆抗体B4浓度中均可观察到此种增强的＂单克隆抗体B4-rsCD4＂间的反应。
增强程度，如单克隆抗体B4-rsCD4结合的OD492读数所测得的增加，用特定的趋化因子受体结构域肽的最佳浓度来计算通常为1μg/mL,当与0.25μg/mL的单克隆抗体B4单独同rsCD4结合相比时。如下表23所示，基于0.1μg/mL单克隆抗体B4的最佳浓度的特定的信号增加百分比将结果分成0至8个等级。
表23总结了8种趋化因子受体中所有4个外部结构域对单克隆抗体B4结合的贡献。如表23中所示，单克隆抗体B4与rsCD4间的结合可被数种趋化因子受体结构域的肽增强，当其受到与各种共同受体接触的干扰时，其对CD4构象产生杂乱的信号。对一涉及多重免疫调控功能分子如CD4而言，我们可以合理地假设其暴露的表面存在此种动态性质。此发现也可用来解释为什么定位可被单克隆抗体B4识别的表位如此困难。其不连续且散布的表位无法轻易的以如表4中所示由CD4肽表示的线性或不连续的位点加以表征。通过表23中的数据也可知其也涉及由如表22中各种趋化因子受体结构域肽所代表的位点。总之，可被B4识别的位点是一高度散布构象的表位，其中包含来自与趋化因子受体接触的CD4，一种HIV的共同受体的位点，且此表位对宿主细胞与HIV的结合和/或HIV的入侵十分重要，这由其在接触病毒后作为中和病毒主要靶位的地位所反应出。
表23
以趋化因子受体结构域来增强单克隆抗体B4与rsCD4间的结合
浓度为1μg/mL肽时的增强程度：*浓度为4μg/mL肽时的增强程度0-50％ 0 250-300 5+50-100 1+ 300-350 6+100-150 2+ 350-400 7+150-200 3+ ＞400 8+200-250 4+
| 趋化因子受体类型 | 由各受体结构域所造成的增强的程度 | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | ||
| α | IL8Rα | 1+ | 0 | 3+ | 1+ |
| IL8Rβ | 0 | 0 | 0 | 1+ | |
| C5a-R | 2+ | 2+ | 2+ | 0 | |
| β | CC-CKR1 | 0 | 2+ | 0 | 0 |
| CC-CKR2b | 3+ | 4+ | 5+ | 0 | |
| CC-CKR3* | 3+ | 1+ | 2+ | 8+ | |
| CC-CKR5 | 0 | 2+ | 5+ | 0 | |
| Fusin(LESTR) | 1+ | 2+ | 0 | 0 | |
实施例20
rsCD4和趋化因子受体之间的反应及单克隆抗体亲和性的研究以趋化因子受体CC-CKR5第3结构域的肽增进rsCD4与抗-CD4中和性抗体之间的亲和性
实施例19的表23清楚显示以CC-CKR2b(第2和3结构域)可增强＂单克隆抗体B4-rsCD4＂间的结合程度＞4+，以CC-CKR3(第4结构域)为8+，以CC-CKR5(第3结构域)为5+，至于以相当于CXC-CKR4(亦称Fusin或LESTR)的肽则只有微弱效果。
近来，Feng等人(科学(Science),1996,272:872)报告称受体CXC-CKR4是使亲T细胞的HIV-1株有效侵入靶细胞的共同受体，但一连串后续报导中(Doranz等人，细胞(Cell),1996,85:1149；Dragic等人，自然(Nature),1996,381:667；Choe等人，细胞(Cell),1996,85:1135；Deng等人，自然(Nature),1996,381:661；Alkhatib等人，科学(Science),1996,272:1955)则详述了β-趋化因子受体CC-CKR5、CC-CKR2b和CC-CKR3是亲M型HIV-1(即造成感染的原代分离物)的共同受体。
如表13中第5组所示，单克隆抗体B4对中和所有各类型分化体的原代分离物比对中和亲T型实验室株MN H9更有效。因此有必要检查由于趋化因子受体肽所增加的抗CD4抗体与rsCD4之间的亲和力与原代分离物中和活性两者之间的相关或不相关的关系。在此增强效果实验中使用了代表亲M型HIV-1原代现场分离物共同受体CC-CKR5第3结构域的肽2047a及四种浓度为0.1μg/mL的抗CD4单克隆抗体，以及具中和活性的单克隆抗体B4及M2和无中和活性的单克隆抗体E6及J33。
如图4所示，只有两种中和性抗体(亦即单克隆抗体B4及M2)在以由肽2047a增强的＂单克隆抗体B4-rsCD4＂间结合性质时表达出明显的剂量相关性。此种强化效果在用1μg/mL的肽2047a与0.25μg/mLrsCD4预温育后可达最佳。
定量单克隆抗体B4对rsCD4/趋化因子受体CC-CKR5肽混合物所增强的亲和力与单独使用rsCD4时所增强的亲和力ELISA抑制试验分析
在以rsCD4(0.25μg/mL)或事先与CC-CKR5第3结构域(D3)肽2047a(1μg/mL)预温育的rsCD4(0.25μg/mL)包被的微孔板上进行rsCD4诱导的单克隆抗体B4结合反应的抑制。单克隆抗体B4在rsCD4和rsCD4/CC-CKR5-D3包被的微孔板上的终点结合浓度，在基于能使特定的孔OD492读数为1.0的单克隆抗体B4浓度下，分别预定为2μg/mL和0.1μg/mL。对单克隆抗体B4与特定的包被的微孔结合的抑制是用0至10μg/mL的rsCD4稀释样品与预定终点浓度的单克隆抗体B4(即，对rsCD4包被的孔为2μg/mL，而对rsCD4/CC-CKR5-D3包被的孔则为0.1μg/mL)在37℃下预温育1小时，再以实施例3所述的标准的rsCD4ELISA试验来进行测定。
如图5所示，在浓度为2μg/mL及0.1μg/mL的特定的单克隆抗体B4存在下，能造成单克隆抗体B4-rsCD4和单克隆抗体B4-rsCD4/CC-CKR5-D3反应50％抑制(IC50)的rsCD4浓度分别为0.72μg/mL和0.047μg/mL。因此，单克隆抗体B4对混有CC-CKR5-D3(肽2047a)的rsCD4与单克隆抗体对单独存在rsCD4相比，所增加的单克隆抗体B4的亲和力定量为增加15倍。
实施例21
通过用SUP-T免疫CD1小鼠产生抗含CD4宿主细胞抗原复合物的单克隆抗体
SUP-T细胞(NIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramCatalog No.100)，(是衍生自人淋巴瘤的T-细胞系)，被用来免疫CD1小鼠。起始注射为10×106个溶于弗氏完全佐剂中的细胞，经腹膜注射。之后如实施例3所述多次加强免疫，每隔两周以腹膜注射5-10×106个细胞。最后两次加强免疫带有弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂。其余的加强免疫则施用清洗过的溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)的细胞。在最后一次免疫接种后施行脾切除。如实施例3所述制备单核脾细胞，以与NS-1小鼠骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤并进行克隆。
之后杂交瘤上清液以rsCD4ELISA试验筛选反应性，且以rsCD4/p2047a ELISA试验筛选增强的反应性。肽2047a(p2047a)是实施例19,20及表21所描述的CC-CKR5第三结构域的肽。rsCD4/p2047aELISA试验在0.25μg/mLrsCD4及1μg/mLp2047a包被的孔中进行，如实施例20所述对其进行优化。杂交瘤中之一所分泌的抗体命名为B13，它在rsCD4ELISA试验中的A492值为0.353，在rsCD4/p2047aELISA试验中的A492值为1.526。即B13在ELISA试验中呈现出对rsCD4/p2047a的反应比对rsCD4强。B13杂交瘤再经10次稀释及筛选亚克隆，每一次循环得到的克隆可分泌rsCD4反应性单克隆抗体，且其在ELISA试验中对rsCD4/p2047a有增强反应。单克隆抗体B13(MAbB13)的特性属于IgG2a亚型，与MAb B4的亚型相同。
单克隆抗体B13再以实施例11中所述的竞争性间接免疫荧光分析法进一步分析表明B13对单克隆抗体B4与含CD4宿主细胞抗原复合物结合的抑制能力。生物素化的单克隆抗体B4与先与B13上清液或小鼠抗CD4抗血清温育后的SUP-T靶细胞一同温育。对照组的细胞被染色至FITC染色强度为+3，细胞染色阳性率为95％。相反，在抗CD4血清中预温育后，大于95％的SUP-T细胞染色强度为1.5至2.0，而先与B13上清液温育后的细胞则观察不到被染色。因此可得出结论象单克隆抗体B4一样，B13能特异地与含CD4宿主细胞抗原复合物结合。
单克隆抗体B13与单克隆抗体B4的相似性也可由其对各类型的HIV-1原代分离物的中和活性的比较证明。单克隆抗体B13与单克隆抗体B4中和活性的比较是通过对HIV-1A、B、C、D和E各型分化体的中和活性来比较。病毒、宿主细胞及MT-2微小空斑中和分析实验如实施例13所述。B13和B4对各类型病毒间交叉中和活性的相似性如表24所示。
表24
单克隆抗体B13对HIV-1 A、B、C、D、E各型分化体初级分离
物的中和作用(MT-2微小空斑中和分析)
*加入Th 036的病毒数很少。这通常比加入与其它实验相当时的病毒数会产生明显较高的中和活性。因此，此结果是针对TH036中和活性的定性表示，不应与其他的HIV-1分离物所得结果做定量比较。
| 抗体 | 中和活性 (μg/mL) | |||||||||||
| UG 029 PBL(分化体A) | 23135pBL(分化体B) | ZIM748(分化体C) | UG046(分化体D) | UG266PBL(分化体D) | TH036PBL(分化体E) | |||||||
| 50％ | 90％ | 50％ | 90％ | 50％ | 90％ | 50％ | 90％ | 50％ | 90％ | 50％ | 90％ | |
| MAb B13 | 1.07 | 4.35 | 0.42 | 1.2 | 0.12 | 0.76 | 1.23 | 10.5 | 1.5 | 14.3 | 0.3* | 0.6* |
| MAb B4 | 0.45 | 0.78 | 0.13 | 0.35 | 0.12 | 0.25 | 0.28 | 3.73 | 0.65 | 10.2 | 0.08* | 0.5* |
序列表(1)一般资料：
(ⅰ)申请人：王长怡(Wang,Chang Yi)
(ⅱ)发明名称：针对宿主细胞抗原复合物且能在接触HIV前后保护宿主细胞不受HIV感染的抗体
(ⅲ)序列数目：2
(ⅳ)通讯地址：
(A)收件人：Morgan & Finnegan,L.L.P.
(B)街道：345公园大道
(C)城市：纽约
(D)州：纽约
(E)国别：美国
(F)邮政编码：10154-0053
(ⅴ)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：专利出版#1.0，第1.25版
(ⅵ)目前申请资料：
(A)申请号：待指定
(B)申请日：1997年6月3日
(C)分类：
(ⅶ)在先申请资料：
(A)申请号：08/808,374
(B)申请日：1997年2月28日
(C)分类：
(ⅶ)母案申请资料：
(A)申请号：08/657,149
(B)申请日：1996年6月3日
(C)分类：424
(ⅷ)律师/代理人资料：
(A)姓名：玛利亚C.H.林
(B)注册号码：29,323
(C)参考/证书号：1151-4145PC
(ⅸ)电讯资料：
(A)电话：(212)415-8745
(B)传真：(212)751-6849(2)SEQ ID NO:1的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：433个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1：Asn Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val
5 10Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile
15 20Gln Phe His Trp Lys Asn Trp Asn Gln Ile Lys Ile25 30 35Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro
40 45Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser
50 55 60Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys
65 70Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys
75 80Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu85 90 95Val Phe Gly Leu Thr Ala Ash Ser Asp Thr His Leu
100 105Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser
110 115 120Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser
125 130Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu
135 140Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr145 150 155Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val
160 165Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln
170 175 180Lys Ala Ser Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu
185 190Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro Leu Ala Phe Thr Val
195 200Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp Gln205 210 215Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Ile
220 225Phe Asp Leu Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg
230 235 240Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu Gln Met Gly Lys Lys
245 250Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu Pro
255 260Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu265 270 275Glu Ala Lys Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn
280 285Leu Val Val Met Arg Ala Thr Gln Leu Gln Lys Asn
290 295 300Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro Lys
305 310Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala
315 320Lys Val Ser Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu325 330 335Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp Gln Cys Leu Leu Ser
340 345Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Ash Ile Lys
350 355 360Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met
365 370Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu
375 380Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg385 390 395Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met Ser
400 405Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys
410 415 420Gln Cys Pro His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro
425 430Ile(2)SEQ ID NO:2的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2：Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln
5 10Ser Leu Ile
15
Claims (62)
1．含CD4趋化因子受体的宿主细胞抗原复合物的抗体的制备方法，包括：
a．使用表达CD4的T细胞作为免疫原，这些T细胞选自下列组中：
ⅰ．选自由外周血单核T细胞，胸腺细胞或脾细胞组成的组的正常T淋巴细胞；或
ⅱ．选自由SUP-T和HPB-ALL组成的组的衍生自T淋巴瘤或白血病的T细胞系细胞；
b．分离并以PBS清洗表达CD4的T细胞；
c．以腹膜内注射方式对动物进行免疫接种，这些动物包括BALB/c小鼠，CD1小鼠，转基因小鼠，大鼠，或恒河猴，这些动物均注射有5-10x106分离且以PBS清洗过的PBS或弗氏完全佐剂中的T细胞，接着每周或每两个月以5-10x106分离且以PBS清洗过的不含佐剂的T细胞进行多次腹膜内强化注射，总共3至6个月，最后一次强化注射是在进行融合以形成杂交瘤之前3天以静脉内方式进行的；
d．测试接受免疫接种动物的血清是否含可与rsCD4结合的抗体；
e．将曾接受免疫接种且其血清在步骤d中呈阳性的动物的脾脏切除以获得脾细胞；
f．将脾细胞与无限增殖恶性细胞系的细胞进行融合以形成杂交瘤，克隆此杂交瘤并筛选能分泌具有下列特性的抗体的杂交瘤：
ⅰ．与rsCD4结合；
ⅱ．在免疫荧光测定中可与表达CD4的细胞结合，其中结合的模式在高分辨率荧光显微镜下呈＂帽状＂；
ⅲ抑制HIVgp120与表达CD4的细胞间的结合；
ⅳ．与已结合了HIVgp120的表达CD4的细胞结合；及
ⅴ．在体外微小空斑测定中于＜10μg/mL的浓度下可中和HIV原代分离物，对50％中和活性而言浓度优选的是在0.01-10μg/mL之间，而对90％中和活性而言浓度优选的是在0.1-35μg/mL之间。
2．如权利要求1所述的方法，其中分泌出的抗体的特点进一步包含
ⅵ．以HIV或SIV原代分离物对灵长类动物或hu-PBL/SCID小鼠进行感染提供被动免疫，其ED50为＜50mg/kg。
3．如权利要求2所述的方法，其中分泌出的抗体的特点进一步包含
ⅶ．与以下肽代表的CD4的4个胞外域中的任一个结合：AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。
4．如权利要求3所述的方法，其中分泌出的抗体的特点进一步包含
ⅷ．优先与rsCD4/趋化因子受体而非rsCD4结合。
5．如权利要求4所述的方法，其中趋化因子受体是CC-CKR5D3肽。
6．如权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中表达CD4的细胞是SUP-T细胞。
7．如权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中表达CD4的细胞是HPB-ALL细胞。
8．如权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中动物是BALB/c或CD1小鼠。
9．如权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中动物是含有编码人类重链及轻链的转基因人类序列的转基因小鼠。
10．以权利要求1所述的方法制备出的抗体，具有以下的特性：
ⅰ．与rsCD4结合；
ⅱ．在免疫荧光测定中可与表达CD4的细胞结合，其中结合的模式在高分辨率荧光显微镜下呈＂帽状＂；
ⅲ抑制HIVgp120与表达CD4的细胞间的结合；
ⅳ．与已结合了HIV-1gp120的表达CD4的细胞结合；及
ⅴ．在体外微小空斑测定中于＜10μg/mL的浓度下可中和HIV原代分离物，对50％中和活性而言浓度优选的是在0.01-10μg/mL之间，而对90％中和活性而言浓度优选的是在0.1-35μg/mL之间。
11．以权利要求10的方法制备出的抗体，其中所分泌出的抗体的特点进一步包含：
ⅵ．以HIV或SIV原代分离物对灵长类动物或hu-PBL/SCID小鼠进行感染提供被动免疫，其ED50是＜50mg/kg。
12．以权利要求11的方法制备出的抗体，其中分泌出的抗体的特点进一步包含
ⅶ．与以下肽所代表的CD4的4个胞外域中的任一个结合：AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。
13．以权利要求12的方法制备出的抗体，其中分泌出的抗体的特点进一步包含
ⅷ．优先与rsCD4/趋化因子受体而非rsCD4结合。
14．以权利要求13的方法制备出的抗体，其中趋化因子受体是CC-CKR5D3肽。
15．一种能分泌出如权利要求10、11、12、13或14的抗体的杂交瘤。
16．一种具有以下特性的抗体：
ⅰ．与rsCD4结合；
ⅱ．在免疫荧光测定中可与表达CD4的细胞结合，其中结合的模式在高分辨率荧光显微镜下呈＂帽状＂；
ⅲ抑制HIVgp120与表达CD4的细胞间的结合；
ⅳ．与已结合了HIVgp120的表达CD4的细胞结合；及
ⅴ．在体外微小空斑测定中于＜10μg/mL的浓度下可中和HIV原代分离物，对50％中和活性而言浓度优选的是在0.01-10μg/mL之间，而对90％中和活性而言浓度优选的是在0.1-35μg/mL之间。
17．如权利要求16的抗体，其进一步的特点是：
ⅵ．以HIV或SIV原代分离物对灵长类动物或hu-PBL/SCID小鼠进行感染提供被动免疫，其ED50是＜50mg/kg。
18．如权利要求17的抗体，其进一步的特点是：
ⅶ．与以下肽代表的CD4的4个胞外域中的任一个结合：AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。
19．如权利要求18的抗体，其进一步的特点是：
ⅷ．优先与rsCD4/趋化因子受体而非rsCD4结合。
20．如权利要求19的抗体，其中趋化因子受体是CC-CKR5D3肽。
21．如权利要求16、17、18、19或20的抗体，其中抗体是M2或B13。
22．一种能分泌如权利要求16、17、18、19或20之抗体的杂交瘤。
23．一种能分泌如权利要求16、17、18、19或21项的抗体的杂交瘤。
24．一种包含如权利要求16、17、18、19或20的抗体的药物制剂。
25．一种包含抗体的药物制剂，此抗体选自由B4,M2和B13组成的组。
26．如权利要求25的药物制剂，其中包含B4。
27．如权利要求25的药物制剂，其中包含M2。
28．如权利要求25的药物制剂，其中包含B13。
29．一种通过腹膜内注射来施用含有具有以下特性的抗体的药物制剂在哺乳动物体内对HIV提供被动免疫的方法：
ⅰ．与rsCD4结合；
ⅱ．在免疫荧光测定中可与表达CD4的细胞结合，其中结合的模式在高分辨率荧光显微镜下呈＂帽状＂；
ⅲ抑制HIVgp120与表达CD4的细胞间的结合；
ⅳ．与已结合了HIVgp120的表达CD4的细胞结合；及
ⅴ．在体外微小空斑测定中于＜10μg/mL的浓度下可中和HIV原代分离物，对50％中和活性而言浓度优选的是在0.01-10μg/mL之间，而对90％中和活性而言浓度优选的是在0.1-35μg/mL之间。
30．如权利要求29的方法，其中抗体的进一步特点是：
ⅵ．以HIV或SIV原代分离物对灵长类动物或hu-PBL/SCID小鼠进行感染提供被动免疫，其ED50是＜50mg/kg。
31．如权利要求30的方法，其中抗体的进一步特点是：
ⅶ．与以下肽代表的CD4的4个胞外域中的任一个结合：AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。
32．如权利要求31的方法，其中抗体的进一步特点是：
ⅷ．优先与rsCD4/趋化因子受体而非rsCD4结合。
33．如权利要求31的方法，其中趋化因子受体是CC-CKR5D3肽。
34．如权利要求29、30、31、32、或33的方法，其中药物制剂通过静脉注射来施用。
35．如权利要求29、30、31、32或33的方法，其中药物制剂是以每公斤体重1mg至100mg的剂量范围来施用的。
36．如权利要求34的方法，其中药物制剂是以每公斤体重5mg至50mg的剂量范围来施用的。
37．如权利要求35的方法，其中药物制剂是以每公斤体重5mg的剂量来施用的。
38．一种嵌合抗体，其中可变的结合结构域衍生自具有下列特性的抗体：
ⅰ．与rsCD4结合；
ⅱ．在免疫荧光测定中可与表达CD4的细胞结合，其中结合的模式在高分辨率荧光显微镜下呈＂帽状＂；
ⅲ抑制HIVgp120与表达CD4的细胞间的结合；
ⅳ．与已结合了HIVgp120的表达CD4的细胞结合；及
ⅴ．在体外微小空斑测定中于＜10μg/mL的浓度下可中和HIV原代分离物，对50％中和活性而言浓度优选的是在0.01-10μg/mL之间，而对90％中和活性而言浓度优选的是在0.1-35μg/mL之间。
39．如权利要求38的嵌合抗体，其进一步的特点是：
ⅵ．以HIV或SIV原代分离物对灵长类动物或hu-PBL/SCID小鼠进行感染提供被动免疫，其ED50是＜50mg/kg。
40．如权利要求39的嵌合抗体，其进一步的特点是：
ⅶ．与以下肽代表的CD4的4个胞外域中的任一个结合：AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。
41．如权利要求40的嵌合抗体，其进一步的特点是：
ⅷ．优先与rsCD4/趋化因子受体而非rsCD4结合。
42．如权利要求41的嵌合抗体，其中的趋化因子受体是CC-CKR5D3肽。
43．一种嵌合抗体，其中可变的结合结构域衍生自M2。
44．一种嵌合抗体，其中可变的结合结构域衍生自B4。
45．一种嵌合抗体，其中可变的结合结构域衍生自B13。
46．一种人源化抗体，其中可变的结合结构域衍生自具有下列特性的抗体：
ⅰ．与rsCD4结合；
ⅱ．在免疫荧光测定中可与表达CD4的细胞结合，其中结合的模式在高分辨率荧光显微镜下呈＂帽状＂；
ⅲ抑制HIVgp120与表达CD4的细胞间的结合；
ⅳ与已结合了HIVgp120的表达CD4的细胞结合；及
ⅴ．在体外微小空斑测定中于＜10μg/mL的浓度下可中和HIV原代分离物，对50％中和活性而言浓度优选的是在0.01-10μg/mL之间，而对90％中和活性而言浓度优选的是在0.1-35μg/mL之间。
47．如权利要求46所述的人源化抗体，其进一步的特点是：
ⅵ．以HIV或SIV原代分离物对灵长类动物或hu-PBL/SCID小鼠进行感染提供被动免疫，其ED50是＜50mg/kg。
48．如权利要求47所述的人源化抗体，其进一步的特点是：
ⅶ．与以下肽代表的CD4的4个胞外域中的任一个结合：AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351，或AA361-AA375。
49．如权利要求48所述的人源化抗体，其进一步的特点是：
ⅷ．优先与rsCD4/趋化因子受体而非rsCD4结合。
50．如权利要求49的人源化抗体，其中趋化因子受体是CC-CKR5D3肽。
51．一种人源化抗体，其中可变的结合结构域衍生自M2。
52．一种人源化抗体，其中可变的结合结构域衍生自B4。
53．一种人源化抗体，其中可变的结合结构域衍生自B13。
54．如权利要求46、47、48、49、50、51、52或53的人源化抗体，是以基因重组方式制备而成的。
55．如权利要求16、17、18、19或20的抗体片段，其中的片段选自由Fab′,F(ab′)2,F(v)，重链单体或二聚物，轻链单体或二聚物，由一重链和一轻链所组成的二聚物所组成的组中。
56．抗体B4的片段，其中的片段选自由Fab′,F(ab′)2,F(v)，重链单体或二聚物，轻链单体或二聚物，由一重链和一轻链所组成的二聚物所组成的组中。
57．如权利要求38、39、40、41、42、43、44或45的抗体片段，其中的片段选自由Fab′,F(ab′)2,F(v)，重链单体或二聚物，轻链单体或二聚物，由一重链和一轻链所组成的二聚物所组成的组中。
58．如权利要求46、47、48、49、50、51、52或53的抗体片段，其中的片段选自由Fab′,F(ab′)2,F(v)，重链单体或二聚物，轻链单体或二聚物，由一重链和一轻链所组成的二聚物所组成的组中。
59．通过酶促消化如权利要求16、17、18、19或20的抗体获得的片段。
60．通过酶促消化B4获得的片段。
61．通过酶促消化如权利要求38、39、40、41、42、43、44或45的抗体获得的片段。
62．通过酶促消化如权利要求46、47、48、49、50、51、52或53的抗体获得的片段。
Applications Claiming Priority (6)
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Publications (1)
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