ES2270461T3

ES2270461T3 - Anticuerpos contra un complejo de cd4 y un dominio receptor de quemoquina, y sus usos contra las infecciones de vih.

Info

Publication number: ES2270461T3
Application number: ES97926870T
Authority: ES
Inventors: Chang Yi Wang
Original assignee: United Biomedical Inc
Current assignee: United Biomedical Inc
Priority date: 1996-06-03
Filing date: 1997-06-03
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2017-06-03
Also published as: DE69736474T2; BRPI9709524B8; BR9709524A; WO1997046697A3; EP0910659A2; CA2256306A1; ATE335835T1; CA2256306C; DE69736474D1; BRPI9709524B1; JP2000511775A; DK0910659T3; EP0910659B1; WO1997046697A2; CN1227610A

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A ANTICUERPOS MONOCLONALES PRODUCIDOS MEDIANTE LA UTILIZACION DE LINFOCITOS T QUE EXPRESAN CD4, COMO CELULAS T MONONUCLEARES SANGUINEAS PERIFERICAS, TIMOCITOS, ESPLENOCITOS Y LINEAS CELULARES DE CELULAS T DERIVADAS DE LINFOMA O LEUCEMIA, COMO HPB-ALL O SUP-T, COMO INMUNOGENO, DE ACUERDO CON LOS PROTOCOLOS Y PROCEDIMIENTOS DE SELECCION DESCRITOS. LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES DE LA PRESENTE INVENCION SE CARACTERIZAN POR SU CAPACIDAD PARA NEUTRALIZAR IN VIVO E IN VITRO AISLADOS PRIMARIOS DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA (VIH) Y DE VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA RELACIONADOS. DICHOS ANTICUERPOS SE DIRECCIONAN CONTRA UN COMPLEJO ANTIGENICO DE LA CELULA HUESPED, QUE COMPRENDE LA PROTEINA CD4 ASOCIADA CON DOMINIOS DE RECEPTORES DE QUIMIOQUINA, Y PRESENTAN ACTIVIDADES NEUTRALIZANTES AMPLIAS FRENTE A AISLADOS PRIMARIOS PROCEDENTES DE TODOS LOS CLADOS DE VIH TIPO 1 (VIH-1) Y A AISLADOS PRIMARIOS DE VIH DE TIPO 2 (VIH-2) Y AL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA EN SIMIOS (SIV). LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN METODO PARA SELECCIONAR Y PRODUCIR DICHOS ANTICUERPOS, HIBRIDOMAS QUE SECRETAN DICHOS ANTICUERPOS, COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LOS COMPRENDEN Y METODOS PARA LA PREVENCION PRE- Y POSTEXPOSICION DE LA INFECCION DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA EN PRIMATES, INCLUYENDO A LOS HUMANOS, MEDIANTE DICHOS ANTICUERPOS CUYAS DIANAS PRIMARIAS SON LOS LINFOCITOS QUE EXPRESAN CD4.

Description

Anticuerpos contra un complejo de CD4 y un dominio receptor de quemoquina, y sus usos contra las infecciones por VIH.

Resumen de la invención

Esta invención está dirigida a anticuerpos monoclonales producidos por medio del uso de linfocitos T que expresan a CD4, tales como las células T mononucleares de la sangre periférica, las células de una línea celular T derivadas de timocitos, esplenocitos y de leucemia o de linfoma tales como HPB-ALL o SUP-T como los inmunógenos de acuerdo con los protocolos y procedimientos de selección descritos. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención se caracterizan por su habilidad para neutralizar in vitro e in vivo a los aislados primarios del Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) y los virus de inmunodeficiencia relacionados. Los anticuerpos se dirigen contra un complejo de antígeno de célula huésped que contiene proteína CD4 en asocio con los dominios de los receptores de quemoquina y que tienen una amplia actividad de neutralización contra los aislados primarios de todas los clados del VIH tipo 1 (VIH-1) y los aislados primarios del VIH tipo 2 (VIH-2) y el Virus de Inmunodeficiencia Simia (VIS). La presente invención está dirigida también a un método para selección y producción de tales anticuerpos, hibridomas que segreguen tales anticuerpos, a composiciones farmacéuticas que contengan a tales anticuerpos. Lo revelado también se relaciona con métodos para prevención pre y postexposición de la infección con el virus de inmunodeficiencia en primates, incluidos los humanos, por medio de tales anticuerpos cuyos objetivos primarios son los linfocitos que expresan CD4.

Antecedentes de la invención

A pesar de la investigación intensiva por una vacuna en los 12 años desde el descubrimiento inicial del VIH como el virus del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) y los 10 años desde la clonación molecular y caracterización del virus del SIDA, aún subsisten los principales obstáculos para el desarrollo de una vacuna e inmunoterapia para el VIH. Estos obstáculos incluyen la variabilidad del VIH-1, las múltiples rutas y modos de transmisión del virus, y la falta de comprensión de las respuestas inmunes necesarias para la prevención de la infección con el VIH. En un artículo publicado en julio 28 de 1995 (Cell 82:175-176), David Baltimore invitó a todos los científicos en el ramo a retroceder y reflexionar sobre por qué esta infección con el virus, contra el cual se emplea el 10% del presupuesto de los Instituto Nacionales de Salud de los Estados Unidos (INS), permanece tan enigmá-
tica.

Existió un optimismo temprano por vacunas eficientes con una subunidad recombinante de la envoltura del VIH-1 (por ejemplo, los productos de la vacuna con gp120 y gp160) dado que se encontró que los sueros para vacunación de diferentes ensayos clínicos fueron capaces de neutralizar aislados de laboratorio del VIH-1 in vitro (Belshe y colaboradores, JAMA, 1994, 272:475; Keefer y colaboradores, AIDS Res Hum Retroviruses, 1994, 10:1713). Este optimismo se vio sacudido cuando se encontró que los sueros para vacunación eran muy ineficientes para neutralizar aislados primarios de VIH-1 en pacientes (Hanson, AIDS Res Hum Retroviruses, 1994, 10:645; Mascola y colaboradores, J Infect Dis, 1996, 173: 340). Estos hallazgos frustrantes condujeron a los INS a decidir en junio de 1994 a posponer los costosos ensayos de eficacia a gran escala de diferentes vacunas con subunidades del VIH basadas en proteínas recombinantes de la envoltura.

Los aislados primarios del VIH-1 se obtienen por medio de un cultivo limitado de células mononucleares de sangre periférica del paciente (CMSP) o de plasma con CMSP infectadas. Ellas se parecen mucho a las cepas del VIH responsables por la infección en humanos en el campo (Sawyer y colaboradores, J Virol, 1994, 68:1342; Cornelissen y colaboradores, J Virol, 1995, 69:1810). Los aislados primarios se pueden distinguir fácilmente de los virus T trópicos comúnmente utilizados adaptados en el laboratorio tales como IIIb/LAI, SF2 y MN que han pasado con el tiempo a líneas celulares humanas de linfoide T y están bien adaptados para crecer en estas líneas celulares T. Primero, la mayoría de los aislados primarios son M trópico. Ellos no crecen fácilmente en líneas celulares T cultivadas, en vez de eso, son monocitos o macrófagos trópicos, aunque también pueden infectar células T primarias (Cheng-Mayer y colaboradores, Science, 1988240:80). Segundo, los aislados primarios son altamente resistentes a una neutralización in vitro por formas solubles recombinantes de la proteína viral receptora CD4 (rsCD4) que requiere 200-2700 veces más rsCD4 que las cepas de laboratorio para una neutralización comparable (Daar y colaboradores, PNAS USA, 1990, 87:6574-6578). Tercero, los aislados primarios son también resistentes a los anticuerpos de neutralización producidos por medio del uso de vacunas de gp120 (Mascola y colaboradores).

Los aislados primarios incluyen tanto aislados que inducen sincitio (SI) que inducen la formación de sincitio en cultivos de CMSP como aislados que no inducen sincitio (NSI). Entre los aislados primarios SI, la mayoría replicarán en la línea de células T especialmente sensibles MT2, pero pocas pueden replicar en las líneas de células T transformadas menos permisivas tales como CEM o H9 que son comúnmente utilizadas para el cultivo de aislados adaptados en el laboratorio. Los aislados primarios que no inducen sincitio (NSI) pueden cultivarse solamente en células T primarias de sangre periférica.

El optimismo temprano por una vacuna para el SIDA fue causado también por los estudios sobre preparaciones de virus inactivados del Virus de Inmunodeficiencia Simia (VIS). Las similitudes entre VIH-1 y VIS en morfología, organización genética, procesos de infección y de enfermedad hacen de la infección con el VIS en monos rhesus, un excelente modelo en el cual explorar diferentes estrategias de vacunas contra el SIDA. Los primeros estudios en este modelo mostraron que las preparaciones inactivadas de VIS crecieron en líneas de células T humanas y formuladas en adyuvante pueden proteger a los macacos de la infección después de una inoculación experimental con variantes patógenas altamente infecciosas de VIS cultivado en células humanas (Desrosiers y colaboradores, PNAS USA, 1989, 86:6353-6357; Murphey-Corb y colaboradores, Science, 1989, 246:1293). Inesperadamente, esta protección se perdió cuando se utilizó el material cultivado de VIS sobre células homólogas de mono para la provocación de los animales inmunizados.

Luego de que se demostró a través de estudios de inmunización con VIS cultivado en células de mono y en células humanas infectadas que la protección de la infección en aquellos primeros estudios del VIS probablemente resultó de la estimulación de respuestas inmunes a proteínas xenogénicas de células huésped humanas en vez de a antígenos codificados por el virus (Stott, Nature, 1991, 353:393). Los experimentos de inmunización pasiva que involucran al VIS han proveído alguna evidencia que sugiere que ciertos anticuerpos anticélula pueden contribuir a la protección contra la infección por el VIS en ausencia de inmunidad mediada por la célula (Gardner y colaboradores, AIDS Res Hum Retroviruses, 1995, 11:843-854).

El mecanismo para la inmunidad protectora para la provocación por el VIS proveída por anticuerpos anticélula no ha sido delineado aún. Un mecanismo propuesto es que la protección mediada por anticélulas a partir de la infección por el VIS, puede involucrar proteínas de células asociadas con el virus. Los virus de inmunodeficiencia tales como el VIH y el VIS son conocidos por incorporar proteínas celulares probablemente obtenidas a partir de la célula huésped ya que los virus brotan de la membrana de la célula huésped. Los anticuerpos de algunos de los principales complejos de histocompatibilidad (PCH) asociados a proteínas celulares, microglobulina \beta_{2}, HLA-DR, y moléculas HLA clase I, han sido implicados en la neutralización in vitro de cepas de laboratorio del VIS y el VIH-1 (Arthur y colaboradores, Science, 1991, 258:1935). Además de las proteínas de superficie asociadas al PCH, Montefiori y colaboradores (Virology, 1994, 205:82; AIDS Res Hum Retroviruses, 1995, 11:1429) identificaron recientemente tres complementos de proteínas de control, CD46, CD55, y CD59, sobre la superficie del VIS y del VIH-1 cultivados en células humanas surgiendo la posibilidad de que estas moléculas de las células huésped pudieran ser también utilizadas por los virus como un mecanismo para evadir la virólisis del complemento. Un mecanismo alternativo propuesto es que la protección por medio de anticuerpos anticélula pueda ser mediada por medio del bloqueo de la actividad de los virus de inmunodeficiencia contra las células del sistema inmune en una forma no reconocida anteriormente. Parece ser que un complejo antígeno célula huésped asociado con CD4 sobre la superficie de las células T huésped las que facilitan el enlazamiento y la entrada viral y que pueden actuar como un objetivo para los anticuerpos anticélula
protectores.

Agadjanyan y colaboradores, (1994, J. Virol. 68, 485-403) revelan una línea de células T humanas que expresan CD4, conocidas como SupT-1.

Otra línea de células T humanas que expresan CD4, conocida como HPB-ALL, es descrita, por ejemplo, por Archuleta y colaboradores, (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6105-6109), Rigaut y colaboradores, (1995, Eur. J. Immunol. 25, 2077-2082) y por Hashemi y colaboradores, (1996, J. Immunol. 156, 3660-3667).

Además del receptor CD4 del complejo antígeno célula huésped para el enlazamiento del VIH, otros factores o correceptores del VIH que afectan la replicación, entrada o fusión del VIH han sido recientemente reportados mientras que el trabajo sobre la presente invención seguía adelante. Estos incluyen a tres quemoquinas producidas por las células T CD8^{+} (Cocchi y colaboradores, Science, 1995, 270:1811-1815) que se reportan por ser supresoras del VIH; un correceptor CXC-CKR4 (también llamado fusina o LESTR) sobre las células que expresan CD4 para la fusión y entrada del VIH-1 en T trópico pero no en M trópico (Feng y colaboradores, Science, 1996, 272:873), un receptor de \beta-quemoquina CCCKR5 que enlaza a las tres quemoquinas inhibidoras (Cocchi y colaboradores) como un correceptor para el VIH-1 M trópico, pero no para T trópico (Doranz y colaboradores, Cell, 1996, 85:1149; Dragic y colaboradores, Nature, 1996, 381:667; Choe y colaboradores Cell, 1996, 85:1135, Deng y colaboradores, Nature, 1996, 381:661; Alkhatib y colaboradores, Science, 1996, 272:1955), y otros receptores de \beta-quemoquina (CC-CKR2b y CCCKR3) como correceptores para el VIH M y dual trópico (Doranz y colaboradores, Cell, 1996, 85:1149). Se exponen estos correceptores por ser los receptores acoplados a la proteína G previamente descrita con siete segmentos transmembrana (Loetscher y colaboradores, J. Biol. Chem., 1994, 264:232; Samson y colaboradores, Biochemistry, 1996,
35:3362).

Para identificar en forma más precisa a la proteína celular putativa que puede ser estimulante de respuestas protectoras, y para caracterizar mejor el mecanismo de protección mediado por anticuerpos anticélula, las actividades de neutralización del VIH fueron caracterizadas por el presente inventor para los miembros de un panel de anticuerpos monoclonales dirigidos contra múltiples antígenos celulares: microglobulina \beta_{2}, proteínas del PCH clase I HLA A, B, C, del PCH clase II HLA DR, y otros antígenos de células T asociados con una línea de células T, para identificar a aquellas que son capaces de neutralizar a los aislados primarios del VIH en un ensayo de neutralización en microplaca in vitro. Los experimentos se condujeron para determinar el alcance de tal actividad neutralizante, si la hay, para los anticuerpos que se encontró que poseen tal actividad; y para determinar si tal actividad in vitro puede ser traducida en una eficacia in vivo en un modelo(s) animal(es) apropiado(s).

Los resultados de estos experimentos demostraron que, excepto por los anticuerpos dirigidos contra un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4, ningún otro anticuerpo anticélula que incluya exclusivamente anticuerpos específicos para CD4, pueden neutralizar a los aislados primarios del VIH-1 tan efectivamente en los ensayos de neutralización. Los resultados también mostraron que los anticuerpos dirigidos contra un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 junto con los dominios de los receptores de quemoquina, exhiben un enlazamiento mejorado con rsCD4. Además, se identifican los anticuerpos con las propiedades deseadas y pueden bloquear in vivo la infección por el VIS en monos y la infección in vivo por VIH-1 del sistema inmunológico humano reconstituido en ratones.

Breve descripción de la invención

La presente invención provee, por primera vez, anticuerpos y homólogos de los mismos capaces de: (1) bloquear el enlazamiento del VIH a las células que expresan CD4, (2) bloquear la formación de sincitio inducido por VIH entre las células que expresan CD4, (3) neutralizar efectivamente la infección in vitro de las células positivas con CD4 por medio de los aislados primarios de todos los clados del VIH tipo 1, y de diversos aislados primarios del VIH tipo 2 y del VIS, (4) neutralizar en forma efectiva la infección in vitro de las células positivas con CD4 por medio de los aislados primarios del VIH-1, tanto pre como postexposición a estos virus; y (5) prevenir la infección de primates incluidos los monos rhesus y los humanos por medio de aislados primarios de VIH y de VIS cuando se administran estos anticuerpos por vía parenteral, esto es, por vía intravenosa o intraperitoneal, y (6) prevenir la infección de ratones SCID (hu-PBL-SCID) reconstituidos con linfocitos de sangre periférica humana por medio de aislados primarios de VIH-1 tanto en las formas de pre y postexposición.

Esta invención está, por lo tanto, dirigida a anticuerpos monoclonales como se define en la reivindicación 9 que se enlazan al complejo antígeno célula huésped humana que contiene CD4 sobre la superficie de células humanas que expresan CD4 con la capacidad de neutralizar a los aislados primarios del VIH, esto es, aislados del paciente pasados no más de 3-5 veces solamente en las células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Más específicamente, esta invención se relaciona con anticuerpos, dirigidos contra determinantes antigénicos presentes sobre un complejo antígeno célula huésped expuestos sobre la superficie que contenían a la proteína CD4 junto con los dominios de los receptores de quemoquina tales como CC-CKR5, que tienen actividad de neutralización amplia y eficaz contra los aislados primarios de todos los clados del VIH-1 y aislados primarios diversos del VIH-2 y
del VIS.

La presente invención está dirigida también a un proceso para producir un anticuerpo para un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 y una porción de un receptor de quemoquina que comprende:

a.: Utilizar como inmunógeno a las células T que expresan CD4 seleccionadas del grupo que consiste de:

i.: linfocitos T normales seleccionados del grupo que consiste de células T mononucleares de sangre periférica, timocitos o esplenocitos; o

ii.: células de la línea de las células T derivadas de linfoma T o de leucemia, seleccionadas del grupo que consta de SUP-T1 y HPB ALL;

b.: Separar y lavar a las células T que expresan CD4 en PBS;

c.: Inmunizar intraperitonealmente a un animal seleccionado del grupo que consiste de: ratones BALB/c; ratones CD1, ratones transgénicos que tienen el genotipo HC1 o HC2 que abriga un transgén capaz de reorganizarse para codificar una cadena liviana de una secuencia humana; ratas; o monos rhesus; con 5-10 x 10^{6} de las células T separadas y lavadas con PBS en PBS o adyuvante completo de Freund, seguido por impulsos intraperitoneales múltiples a intervalos semanales o bimensuales con 5-10 x 10^{6} células T separadas y lavadas con PBS sin adyuvante para un total de tres a seis meses, con el último impulso administrado en forma intravenosa tres días antes de la fusión para formar hibridomas;

d.: Analizar el suero del animal inmunizado por la presencia de anticuerpos que se enlacen a rsCD4;

e.: Realizar una esplenectomía sobre el animal inmunizado con el suero analizado positivo en la etapa d, para obtener esplenocitos;

f.: Fusionar los esplenocitos a las células de una línea celular maligna inmortal para formar hibridomas, clonando los hibridomas y seleccionando los hibridomas que segreguen anticuerpos que tengan las siguientes características:

i.: Enlazamiento a rsCD4;

ii.: Enlazamiento a CD4 sobre la superficie de las células que expresen CD4 en un ensayo de inmunofluorescencia en donde el patrón de enlazamiento es en la forma de "caperuzas" cuando se examinan con un microscopio de fluorescencia;

iii.: Bloqueo del enlazamiento de la gp120 del VIH a células que expresen CD4;

iv.: Enlazamiento a células que expresen CD4 anteriormente enlazadas con la gp120 del VIH;

v.: Neutralización de los aislados primarios del VIH en un ensayo in vitro en microplaca en donde una concentración en el rango de 0,01-10 \mug/mL de los anticuerpos secretados causa 50% de neutralización de los aislados primarios del VIH o una concentración en el rango de 0,1-35 \mug/mL causa 90% de neutralización de los aislados primarios del VIH; y

vi.: Enlazamiento preferencial a un complejo de rsCD4 y a una porción de un receptor de quimoquina sobre rsCD4.

Los anticuerpos producidos por los animales inmunizados se reconocen por la habilidad de sus anticuerpos en el suero para enlazarse a:

1.: rsCD4;

2.: rsCD4 en asocio con dominios de los receptores de quemoquina con una reactividad mejorada;

3.: la superficie de las células que expresan CD4 incluyen a las células HPB-ALL o SUP-T1 en forma de "caperuza" como se muestra con un microscopio de fluorescencia de alta resolución;

4.: cualquiera de los péptidos: ie antidos contra determinantes antigdos no mAA_{1}-AA_{20}, AA_{81}-AA_{92}, AA_{79}-AA_{88}, AA_{60}-AA_{109}, AA_{118}-AA_{165}, AA_{235}-AA_{251}, AA_{297}-AA_{351}, o AA_{361}-AA_{375} derivados de rsCD4; y

5.: para neutralizar aislados primarios del VIH como se especifica en la reivindicación 9.

Los anticuerpos de la presente invención pueden caracterizarse además mientras proveen inmunidad pasiva a partir de la infección por medio de aislados primarios del VIH o del VIS a primates o a ratones hu-PBL/SCID, a un ED_{50} de <50 mg/kg.

La presente invención también incluye a los hibridomas que secretan los anticuerpos que tienen estas características. También se contemplan las composiciones profilácticas pre y postexpuestas que contienen a estos anticuerpos para la prevención de la infección con el virus de inmunodeficiencia en primates, incluidos los humanos, causada por agentes infecciosos cuyos objetivos primarios son los linfocitos que expresan CD4. Los anticuerpos y homólogos de los mismos de esta invención reconocen epítopos "conformacionales esparcidos en forma discontinua" sobre un complejo antígeno célula huésped que contiene la molécula CD4 particularmente cuando está asociada con dominios de otros receptores de quemoquina tales como CC-CKR5 presente sobre células que expresan CD4. Los anticuerpos que se enlazan a miméticos sintéticos derivados de cualquiera de los cuatro dominios extracelulares de CD4 humana (Tabla 1: SEQ. ID. NO: 1) que contiene a los péptidos AA_{1}-AA_{20}, AA_{81}-AA_{92}, AA_{79}-AA_{88}, AA_{60}-AA_{109}, AA_{118}-AA_{165}, AA_{235}-AA_{251}, AA_{297}-AA_{351}, y AA_{361}-AA_{375} de CD4.

La presente invención también se relaciona con homólogos de anticuerpos. Estos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos recombinantes con dominios de anticuerpo de una especie de un animal fusionado a dominios de anticuerpo humano y anticuerpos humanizados. Los homólogos del anticuerpo de la invención son preferiblemente moléculas de inmunoglobulina intacta que tienen cadenas livianas y pesadas. Además, los homólogos del anticuerpo reactivo de CD4 de esta invención pueden estar en la forma de fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos F(v) o cualquier otro fragmento de inmunoglobulina que tenga las propiedades de enlazamiento descritas anteriormente.

También se proveen hibridomas que producen homólogos del anticuerpo de esta invención, un proceso para seleccionar y producir los homólogos del anticuerpo por medio del cultivo de estas células, y un proceso para producir los hibridomas de esta invención.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 describe la secuencia de aminoácidos del CD4 humano (SEQ ID NO: 1), una parte del complejo antígeno huésped, como se deduce de la secuencia de ácido nucleico. Los aminoácidos se representan por medio de códigos de letras sencillas como sigue:

Ala:A	Cys:C	His:H	Met:M	Thr:T
Arg:R	Gln:Q	Ile:I	Phe:F	Trp:W
Asn:N	Glu:E	Leu:L	Pro:P	Tyr:Y
Asp:D	Gly:G	Lys:K	Ser:S	Vat:V

Utilizando el sistema de numeración corregida de Littman y colaboradores, (Cell, 1988, 55:541), AA_{1}-A_{110}, AA_{111}-AA_{181}, AA_{182}-AA_{287}, AA_{288}-AA_{375}, AA_{376}-AA_{393}, AA_{394}-AA_{433} representan respectivamente el primero, segundo, tercero, y cuarto dominios extracelulares, el dominio transmembrana, y el dominio citoplasmático de la molécula CD4.

La Figura 2 muestra representaciones esquemáticas de las tres configuraciones de epítopo teóricamente posibles. El anticuerpo se representa solamente como un esquema burdo del fragmento Fv. Las casillas rellenas indican que parte del anticuerpo hace contacto con los aminoácidos del epítopo. Los aminoácidos del epítopo se representan por medio de círculos pequeños. Si los aminoácidos del epítopo forman una secuencia continua de péptidos, se considera que el epítopo es "lineal" (por ejemplo, los MAb E31 y E6); si los aminoácidos se distribuyen en dos, o algún péptido que es espacialmente adyacente se extiende debido a plegamiento conformacional, el epítopo se llama "discontinuo" (por ejemplo, los Mab J33, H5, D5, E2 y 126). El caso más extremo ha sido llamado "esparcido discontinuo" en el cual numerosos sitios discontinuos, derivados ya sea de una o más de una molécula en un complejo, se combinan por medio de plegamiento conformacional para formar un epítopo extendido (por ejemplo, los epítopos de los Mab B4 y M2) (modificados a partir de Meloen y colaboradores, Ann Biol Clin, 1991, 49:231).

La Figura 3 describe en dibujos esquemáticos los tres tipos diferentes de enlazamiento a las células HPB-ALL que expresan CD4: caperuzas, parches y agrupaciones observados para seis anticuerpos anti-CD4 auténticos, dos anticuerpos reconocen un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 en asociación con un receptor de quemoquina, y un suero de con arsCD4 de conejillo de indias. En un ensayo de inmunofluorescencia, el enlazamiento de B4 o M2 a células HPB-ALL se manifiesta como manchas fluorescentes en la forma de "caperuzas" (A) sobre las células bajo un microcopio de fluorescencia de alta resolución. El enlazamiento para cada uno de los anticuerpos anti-CD4 o los arsCD4 de conejillo de indias a las células HPB-ALL se manifiesta como manchas fluorescentes en la forma de "parches" (B). El enlazamiento de la proteína gp120 del VIH-1 marcado con FITC a las células HPB-ALL se manifiesta como manchas fluorescentes en la forma de "agrupaciones" (C).

La Figura 4 describe el % de mejora de la actividad de enlazamiento de rsCD4 para diferentes anticuerpos monoclonales, ejercida por el péptido del dominio 3 de CC-CKR5 del receptor de quemoquina (p2047a) en un estudio de dependencia con la dosis.

La Figura 5 describe la cuantificación (IC_{50} de rsCD4) de la afinidad mejorada de Mab B4 para la mezcla del péptido del dominio 3 de CC-CKR5 del receptor de quemoquina/rsCD4 vs. rsCD4.

Descripción detallada de la invención

Como se utiliza aquí, los "aislados primarios del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1)" se obtienen por medio de un cultivo limitado, de hasta cinco pasadas, de células mononucleares de sangre periférica de un paciente (CMSP) o de plasma con CMSP no infectadas. Los aislados primarios se pueden distinguir por medio de tres propiedades importantes de las cepas adaptadas en el laboratorio tales como IIIb/LAI, SF2 y MN que han sido pasadas con el tiempo a líneas celulares linfoides T humanas. Primero, la mayoría de los aislados primarios no crecen fácilmente en líneas de células T. Por ejemplo, muchos aislados primarios que inducen formación de sincitio en un cultivo de CMSP (aislados SI) se replicarán en las líneas celulares MT2T especialmente sensibles al VIH, pero pocas se replican en líneas de células T menos permisivas tales como CEM o H9. Los aislados primarios que no inducen sincitio (NIS) se replicarán únicamente en células T primarias. Segundo, ellas difieren de las cepas adaptadas en el laboratorio en su sensibilidad a la neutralización in vitro por medio de formas recombinantes solubles de la proteína viral receptora CD4 (rsCD4) (Daar y colaboradores, PNAS USA, 1990, 87:6574-6578). Tercero, las cepas adaptadas en el laboratorio son sensibles a neutralización por medio de anticuerpos con especificidades por la envoltura viral, mientras que los aislados primarios son resistentes (Sawyer y colaboradores, J Virol, 1994, 68:1342; Mascola y colaboradores, J Infect Dis, 1996, 173:340). Como se muestra en el Ejemplo 1, Tabla 2, cepas de laboratorio tales como MN del VIH-1, son muy sensibles a la neutralización por medio de anticuerpos anti-V3 mientras que dos aislados primarios son resistentes, aún a una preparación anti-V3 con un título de neutralización contra MN del VIH-1 de 1:203.080.

Sin embargo, la neutralización de las cepas del VIH de laboratorio y de los aislados primarios por medio de anticuerpos anticélula sigue una dirección diferente que la de los anticuerpos antienvoltura. En el Ejemplo 2 Tabla 3, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra microglobulina \beta_{2}, PCH clase I HLA A, B, C, y PCH clase II HLA DR, y otros antígenos de superficie bien caracterizados de células T no inhibieron la infección ya sea por la cepa MN del VIH-1 derivada de la línea celular de laboratorio o por un aislado primario del clado B del VIH-1, mientras que un anticuerpo monoclonal (Mab B4) producido contra HPB-ALL que tiene una reactividad moderada contra la proteína rsCD4 y un fuerte enlazamiento a las células HPB-ALL y a la proteína rsCD4 junto con los dominios de receptores de quemoquina tales como CC-CKR5, se encontró altamente efectivo en la neutralización de aislados primarios del VIH-1 (Tablas 3, 7 y 13) pero menos efectivo en la neutralización de una cepa MN del VIH-1 derivada de una línea celular de laboratorio (Tabla 13). Se encontró que los aislados primarios del VIH neutralizado por B4 en un ensayo en microplaca in vitro a una concentración de <10 \mug/mL (Tablas 3, 7 y 13) con una eficiencia mucho mayor que los anticuerpos con especificidad exclusiva por CD4 (Tabla 7). Por lo tanto, los aislados primarios parecen ser sensibles en forma preferencial al anticuerpo del complejo antígeno célula huésped que contiene anti-CD4.

Se encontró también que la actividad neutralizante de Mab B4 se extiende para incluir neutralización cruzada de VIH-2 y VIS (Tabla 14). Estos resultados (Tablas 7, 13) sugieren fuertemente que entre las proteínas celulares asociadas con el VIH, existe un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 y un correceptor(es), por ejemplo el receptor de quemoquina CC-CCKR5, que s un objetivo para el anticuerpo de neutralización cruzada. El(los) correceptor(es) se delinea(n) como factores de fusión, entrada o supresión del VIH.

Los mecanismos para la amplia actividad de neutralización del complejo antiantígeno que contiene CD4 no son claros. El CD4 que contiene al complejo antígeno célula huésped puede jugar un papel doble en la mediación de la infección y la patogénesis del VIH: tanto como receptor de superficie de célula T para el enlazamiento del VIH, como receptor para fusión y entrada a la célula por parte del VIH o un factor supresor del VIH. Como se lo utiliza aquí, "complejo antígeno célula huésped que contiene proteína CD4" se refiere a un complejo que contiene un recepto para el enlazamiento del VIH y correceptor(es) asociado(s), por ejemplo CC-CCKR5, para un factor de supresión del VIH o de fusión y entrada a la célula por parte del VIH. Este complejo molecular se expresa exclusivamente sobre la superficie de una célula que expresa CD4. Serológica y funcionalmente, es distinto de la molécula de proteína CD4 soluble expresada en forma recombinante.

Como se lo utiliza aquí, "CD4" significa cualquier proteína CD4 codificada por un gen para la CD4 de ocurrencia natural.

Como se lo utiliza aquí, "células que expresan CD4 o células con CD4+" son células que presentan la glicoproteína CD4 sobre sus superficies. Tales células incluyen linfocitos T que expresan CD4, por ejemplo, células T de sangre periférica, timocitos, esplenocitos, etc., y células de línea celular T derivadas de leucemia y de linfoma, por ejemplo, células HPB-ALL o SUP-T1.

Como se lo utiliza aquí, "CD4 soluble recombinante" o "rsCD4" es un polipéptido que consiste de AA_{1}-AA_{375} (Figura 1, SEQ ID NO: 1) de CD4 humano.

Como se lo utiliza aquí, "complejo antígeno célula huésped que contiene CD4" o "complejo antígeno CD4 en la superficie de la célula" representa una estructura de membrana que contiene CD4 como una glicoproteína de 50 kD que contiene cuatro dominios extracelulares, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático (Figura 1, SEQ ID NO: 1) que forma complejo con otras proteínas de la célula huésped involucradas, tales como dominios de receptores de quemoquina.

CD4 fue inicialmente descrito como un marcador de superficie celular para linfocitos T auxiliares. Se encontró posteriormente que CD4 se expresa aquí y allá sobre monocitos, Langerhans, células microgliales, y subconjuntos de células B. Se encontró que la molécula CD4 también participa directamente en la activación de células T auxiliares específicas par antígeno a través de su función como receptora para la molécula PCH clase II. En 1984, se encontró que CD4 humana era la receptora para el VIH (Dalgleish y colaboradores, Nature, 1984, 312: 763). El enlazamiento de la glicoproteína de la envoltura del VIH, gp120, a CD4 representa la etapa inicial en la entrada viral en la célula objetivo.

La molécula CD4 ha sido mapeada extensamente por medio de estudios de enlazamiento con paneles de anticuerpos monoclonales específicos para CD4 y por medio de deducciones negativas tales como la correlación de las modificaciones estructurales de CD4, por ejemplo, sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos, con cambios funcionales resultantes en CD4 (Sattentau y colaboradores, Science, 1986, 234:1120; Peterson y Seed, Cell, 1988, 54:65; Jameson y colaboradores, Science, 1988, 240:1335; Sattentau y colaboradores, J Exp Med, 1989, 170:1319; Hasunuma y colaboradores, J Immunol, 1992, 148:1841; Burkly y colaboradores, J Immunol, 1992, 149:1779; Davis y colaboradores, Nature, 1992, 358:76). Esos estudios de mapeo han permitido la construcción de un mapa de estructura-función para la molécula. Muchos de los anticuerpos monoclonales específicos para CD4 se ha encontrado que tienen actividad neutralizante contra las cepas de laboratorio del VIH. Ninguno de los anticuerpos conocidos por tener actividad de neutralización del VIH ha sido evaluado por su capacidad para inhibir la infección in vivo por medio de aislados primarios ya sea a través del modo de exposición pre o post del VIH. Ninguno de estos anticuerpos se reporta por ser reactivo a un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4, particularmente cuando está asociado con dominios de los receptores de quemoquina.

El primer dominio extracelular de CD4 comparte homologáis con la inmunoglobulina en tres regiones determinantes complementarias (RDC) similar a aquella de las cadenas de inmunoglobulina. Ambos, el dominio 1 y el dominio 2 de la región extracelular de la molécula CD4 se encontró que contribuyen a los sitios de enlazamiento para las moléculas PCH clase II mientras que el dominio 1 solamente estaba involucrado con el enlazamiento del VIH y la formación de sincitios. Se encontró que los sitios de enlazamiento para la glicoproteína gp120 de la envoltura del VIH se localizaban en un bucle como el del CDR2 del dominio 1 (Peterson y Seed, Cell, 1988, 54:65; Landau y colaboradores, Nature, 1988, 334:159; Clayton y colaboradores, Nature, 1988, 335:363; Arthos y colaboradores, Cell, 1989, 57:469; Sattentau y colaboradores, J Exp Med, 1989, 170:1319). Se encontró que un área discreta que se superpone a la región CDR3 en el dominio 1 estaba involucrada en la formación de sincitios (Kalyanaraman y colaboradores, J Immunol, 1990, 145:4072; Camerini y Seed, Cell, 1990, 60:747; Corbeau y colaboradores, J Immunol, 1993,
150:290).

A partir de estas referencias, se puede concluir que los anticuerpos específicos para CD4 probablemente interactúan con el sistema inmunológico en diferentes formas; primero, bloqueando la interacción CD4 clase II entre las células T que expresan CD4 y otras células T activadas, células B, o monocitos; segundo, enviando señales a las células T, inhibiendo así las funciones inmunoreguladoras normales mediadas por CD4 de las células T; tercero, induciendo la muerte celular de las células que expresan CD4 por medio de apoptosis cuando se desencadena por medio de un engranaje simultaneo de las moléculas receptoras de las células T; y cuarto, bloqueando las interacciones entre CD4 y el VIH, para inhibir la inmunopatología mediada por el VIH. Con base en estas conclusiones, los anticuerpos para CD4 parecen ser buenos candidatos para prevenir y tratar la infección con VIH y las enfermedades asociadas con el VIH incluido el SIDA. Y, en un nivel más general, los anticuerpos para CD4 pueden ser útiles para prevenir las respuestas inmunológicas indeseables, tales como el rechazo de transplantes, o curar enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide, el lupus sistémico eritematoso, o la soriasis. Los anticuerpos anti-CD4 han sido el objeto de muchos estudios. Se esperó que los anticuerpos que bloquean el enlazamiento de gp120 del VIH a CD4, evitarían la formación de sincitios y evitarían la infección con VIH.

Se ha demostrado que dos anticuerpos anti-CD4 bien caracterizados, Leu3A y OKT4A, bloquean efectivamente la formación de sincitios inducidos por el VIH. El epítopo reconocido por Mab Leu3A ha sido mapeado en forma precisa hasta una extensión de 15 aminoácidos AA_{49}-AA_{63} traslapando la región CDR2 del sitio de enlazamiento de gp120 del VIH-1 de Chiba, patente estadounidense 5.171.838. El epítopo reconocido por Mab OKT4A ha sido mapeado hasta un sitio CD4 que traslapa al sitio de enlazamiento de gp120 del VIH-1, entre AA_{16}-AA_{49} (Jameson y colaboradores, Science, 1988, 240:1336. Nota: existe una mutación en el marco de 9 aminoácidos entre la secuencia de CD4 revelada en la publicación de Jameson y aquella mostrada en la SEQ ID NO: 1, Figura 1 de la presente invención). Sin embargo, se ha encontrado que ambos anticuerpos tienen aplicaciones limitadas en el tratamiento de la infección con VIH debido a que ellos fallan en enlazarse o en actuar sobre una molécula CD4 que ya está enlazada a gp120 del VIH (Burkly y colaboradores, WO 92/09305). Parece ser impedimento estérico causado por la proximidad de los epítopos al sitio de enlazamiento de gp120.

Otros anticuerpos anti-CD4 que han sido reportados por tener algún efecto sobre la formación de sincitios inducidos por el VIH, incluyen MT151, MT413, 13B8-2, OKT4E, VIT4 y MT321 (Dalgleish y colaboradores, Nature, 1984, 312:763; Sattentau y colaboradores, Science, 1986, 234:1120; Davis y colaboradores, Nature, 1992, 358:76; Corbeau y colaboradores, J Immunol, 1993, 150: 290). Se reporta que estos anticuerpos se enlazan a determinantes cercanos a la región de CDR3 del primer dominio, que s diferente de los epítopos enlazados por OKT4A y Leu3A. Sin embargo, semejante a Leu3a y OKT4A, ellos también fallan en enlazarse a las moléculas CD4 ya enlazadas a gp120 del VIH, limitando su utilidad (Burkly y colaboradores, WO 92/09305).

Otro grupo de anticuerpos monoclonales anti-CD4, incluido Mab 5A8, como lo describen Burkly y colaboradores, ibid, se mostró que también inhibían la formación de sincitios mediada por el VIH. Los resultados de los estudios de mapeo del epítopo (páginas 81-82, WO 92/09305) para caracterizar a Mab 5A8 han conducido a los hallazgos de que 5A8 reconoció a un epítopo conformacional de CD4 que contiene el primero y segundo dominios de CD4 y que se requiere de ambos y "suficiente" para el enlazamiento de 5A8. También se encontró que AA_{83}-AA_{105} de la cepa \beta tipo varilla que conecta al primero y al segundo dominios son influyentes y AA_{105}-AA_{131} del segundo dominio son absolutamente requeridos para el enlazamiento de 5A8 a CD4. Parece ser que no existe relación del tercero y del cuarto dominios de CD4 y de otros antígenos de superficie de células complejas.

Han existido sugerencias previas para emplear anticuerpos monoclonales reactivos a CD4 que han mostrado que inhiben el enlazamiento del VIH a células positivas con CD4 y/o para inhibir la formación de sincitios inducidos por el VIH como agentes inmunoprofilácticos pasivos para prevenir la infección por medio de exposición accidental y para interrumpir la transmisión vertical de una madre infectada a la descendencia (Rieber y colaboradores, Lancet, 1990, 336:1007; Rieter y colaboradores, PNAS, 1992, 89:10792; y Attanasio y colaboradores, J Infect Dis, 1993, 168: 515). Sin embargo, la mayoría de estos anticuerpos anti-CD4 han sido evaluados simplemente por su actividad neutralizante in vitro contra cepas de laboratorio del VIH y ninguno ha sido evaluado por su habilidad para inhibir la infección in vivo por medio de aislados primarios a través ya sea de una aplicación de exposición pre o post.

Se sabe ahora que tales resultados de neutralización viral in vitro no se traducen en una eficacia in vivo contra el VIH. La falla del rsCD4 para extender el efecto antiviral en pacientes infectados con VIH (Daar y colaboradores, PNAS USA, 1990, 87:6574-6578) no obstante que la potente capacidad de neurotransmisión in vitro es especialmente bien conocida.

Antes de la presente invención, ninguno de los anticuerpos anti-CD4 conocidos ha sido reportado por ser capaz de enlazarse a, entrar en intimo contacto con los cuatro dominios de CD4, por ser capaces de bloquear el enlazamiento inicial de gp120 del VIH a la CD4 humana mientras neutraliza también en forma efectiva la infectividad de diferentes aislados primarios de los VIH tipos 1 y 2 y del VIS.

De acuerdo con la presente invención, se proveen anticuerpos que se enlazan a, o hacen contacto con, los cuatro dominios de CD4, y además por tener enlazamiento mejorado cuando se asocian con receptores de quemoquina. Estos anticuerpos son capaces de bloquear el enlazamiento inicial de gp120 del VIH a la CD4 humana mientras neutralizan también efectivamente la infectividad de los aislados primarios del VIH de todos los clados y los diversos aislados primarios del VIH-2 y del VIS. El anticuerpo monoclonal y los homólogos de la presente invención marcan la presente demostración de la eficacia in vivo por medio de un anticuerpo contra la infección por los aislados primarios de los virus de inmunodeficiencia tanto en primates como en un sistema inmunológico humano reconstituido del modelo de ratón huPBL/SCID (Ejemplos 17 y 18).

Los anticuerpos con estas propiedades, por ejemplo, Mab B4, ofrecen claras ventajas para intervención terapéutica en la infección con VIH y en patologías relacionadas con el VIH tal como el SIDA. Diferente a los anticuerpos anti-CD4 conocidos previamente, B4 o sus homólogos podrían ser utilizados para intervenir tanto antes como después del enlazamiento del VIH al complejo antígeno superficie celular que contiene CD4 y proveerá una protección efectiva para la infección por medio e aislados primarios divergentes, incluida la protección cruzada de clados.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención son los primeros que muestran ser eficaces in vivo para la neutralización de los aislados primarios de virus de inmunodeficiencia en un modelo de primate y en el sistema inmunológico humano reconstituido. Los resultados de la neutralización in vivo e in vitro de los anticuerpos de la presente invención como se muestra en los Ejemplos 2-18, junto con la combinación altamente deseable de las propiedades descritas aquí, muestran que ellos serán útiles en la prevención de la infección por el VIH de humanos por las cepas globales de los VIH tipos 1 y 2, ambos antes y después de exposición accidental.

Las propiedades de los anticuerpos útiles para la presente invención se resumen aquí con base en los resultados obtenidos en los Ejemplos 2-16 y 19-20;

1.: Enlazamiento a rsCD4 en un ensayo de ELISA;

2.: Enlazamiento a células que expresan CD4 en un ensayo de inmunofluorescencia donde el patrón de enlazamiento está en la forma de "caperuzas" (Figura 3) cuando se examinaron con un microscopio de fluorescencia de alta resolución;

3.: Bloqueo del enlazamiento de la gp120 del VIH a células que expresan CD4;

4.: Enlazamiento a células que expresan CD4 previamente enlazadas con gp20 del VIH;

5.: Neutralización de aislados primarios del VIH en un ensayo de microplaca in vitro a una concentración de < 10 \mug/mL para una neutralización del 90%;

6.: Enlazamiento mejorado a rsCD4 en un ensayo de ELISA cuando rsCD4 se preincubó con péptidos del dominio del receptor de quemoquina.

Preferiblemente, los anticuerpos de la presente invención también muestran:

7.: Enlazamiento a cualquiera de los cuatro dominios de CD4 representados por los péptidos: AA_{1}-AA_{20}, AA_{81}-AA_{92}, AA_{79}-AA_{88}, AA_{60}-AA_{109}, AA_{118}-AA_{165}, AA_{235}-AA_{251}, AA_{297}-AA_{351}, o AA_{361}-AA_{375} de CD4;

Los anticuerpos con estas características son especialmente útiles en la profilaxis y el tratamiento en humanos de enfermedades causadas por agentes infecciosos cuyos objetivos primarios son las células positivas CD4. Por lo tanto, la presente invención provee composiciones profilácticas y terapéuticas que contienen al anticuerpo o a un homólogo del mismo, útiles para prevenir y tratar enfermedades en humanos causadas por agentes infecciosos cuyos objetivos primarios son las células positivas CD4, por ejemplo, las enfermedades relacionadas con el VIH que incluyen todas los grados de SIDA, así como los métodos que utilizan estas composiciones de anticuerpos.

Como se lo utiliza aquí, un "homólogo de anticuerpo" es una proteína que contiene uno o más polipéptidos seleccionados de las cadenas livianas de inmunoglobulina, cadenas pesadas de inmunoglobulina, y fragmentos de enlazamiento del mismo con el antígeno, que tienen las propiedades de enlazamiento y neutralización enlistadas anteriormente. Los homólogos de anticuerpo incluyen inmunoglobulinas intactas de los tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como los subtipos de las mismas), con cadenas livianas kappa o lambda. Los fragmentos de los anticuerpos o sus homólogos con las características anteriormente enlistadas, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos F(v), monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena liviana, dímeros que consisten de una cadena pesada o liviana o similares, están incluidos dentro del alcance de la presente invención que se define por medio de las reivindicaciones anexas. Los homólogos de anticuerpo también incluyen anticuerpos recombinantes humanizados y anticuerpos quiméricos. A todo lo largo de las especificaciones, el uso el término "anticuerpos de la presente invención" y similares incluyen a sus homólogos.

Como se lo utiliza aquí, el "complejo antígeno de superficie de la célula positiva CD4" o "complejo antígeno de la superficie de la célula que contiene CD4" es un sitio de enlazamiento para los anticuerpos de la presente invención. El complejo puede contener CD4 junto con dominios de receptores de quemoquina, por ejemplo, CC-CKR5.

Como se lo utiliza aquí, un "anticuerpo recombinante humanizado" es un anticuerpo derivado inicialmente de un mamífero no humano en el cual se ha utilizado tecnología recombinante para reemplazar algunos o todos los aminoácidos no utilizados para enlazamiento al complejo CD4 en la superficie de la célula sobre las células que expresan CD4 con aminoácidos de las regiones correspondientes de una cadena liviana o pesada de inmunoglobulina humana.

Como se lo utiliza aquí, un "anticuerpo recombinante quimérico" es un anticuerpo inicialmente derivado de un mamífero no humano, en cuya tecnología de ADN recombinante se ha utilizado para reemplazar todo o parte de las regiones constante y de bisagra de la cadena liviana, la cadena pesada o ambos, con las regiones correspondientes de una cedan liviana o una cadena pesada de inmunoglobulina de un mamífero de una especie diferente, preferiblemente un humano.

Como se lo utiliza aquí, "Leu3A" es el anticuerpo monoclonal murino anti-CD4 comercialmente disponible en una forma conjugada de FITC de Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San José, CA, bajo el número de catálogo 340133.

Como se lo utiliza aquí, "OKT4A" es el anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD4 comercialmente disponible en una forma conjugada de FITC de Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ bajo el número de catálogo OK704010.

Como se lo utiliza aquí, 5A8 es el anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD4 descrito en la PCT WO 92/09305.

Como se lo utiliza aquí, un "agente mimético B4" es un compuesto que causa al menos una reducción del 30% en el enlazamiento del anticuerpo monoclonal B4 tanto en el CD4 soluble humano recombinante (rsCD4) o en el complejo antígeno CD4 en la superficie de la célula humana sobre células que expresan CD4.

Anticuerpos de Acuerdo con esta Invención

Los anticuerpos u homólogos de anticuerpos de la presente invención se enlazan específicamente a un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4. El complejo puede contener CD4 junto con dominios de receptores de quemoquina tales como CC-CCKR5. Esto se muestra por su enlazamiento a células que expresan CD4 en un patrón de "caperuzas" característico en un ensayo indirecto de inmunofluorescencia como el observado por medio de un microscopio de fluorescencia de alta resolución.

Los anticuerpos de esta invención se enlazan específicamente a epítopos esparcidos en forma discontinua sobre un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4. El complejo puede contener CD4 junto con los dominios de receptores de quemoquina tales como la molécula CC-CCKR5. Los anticuerpos de esta invención que bloquean el enlazamiento de gp120 del VIH a las células que expresan CD4, se enlazan al complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 después del enlazamiento previo por medio del gp120 del VIH, inhiben la infección de las células que expresan CD4 por medio de diversos aislados primarios del VIH, y bloquean el enlazamiento de gp120 del VIH al CD4 de la superficie. Se prefiere a aquellos que inhiben la infección de las células con CD4 por medio de todos los aislados primarios del VIH tipos 1 y 2.

Los anticuerpos monoclonales de ratón designados como B4 (IgG2a), M2 (IgG1) y B13 (IgG2a) se describen más adelante.

Los anticuerpos y sus homólogos de esta invención son profilácticos y terapéuticos para la infección con VIH y todos los grados de SIDA debido a que ellos previenen la infección replicativa de las células huésped tanto antes como después de que el gp20 del VIH se ha enlazado a un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 sobre la superficie de linfocitos CD4 positivos, por lo cual ellos son capaces de prevenir la infección con VIH y retardan el esparcimiento del virus a las células no infectadas. Los anticuerpos y homólogos de anticuerpo de esta invención son útiles únicamente ya que inhiben la infección después del enlazamiento del VIH a las células que expresan CD4.

Ensayo de Selección para Anticuerpos de la Presente Invención

Las personas normalmente capacitadas pueden determinar fácilmente, usando métodos conocidos, si anticuerpos particulares o sus homólogos tienen las características descritas anteriormente para identificar anticuerpos o sus homólogos, de acuerdo con la presente invención.

Para determinar si anticuerpos particulares se enlazan a CD4 humana, se puede utilizar cualquier ensayo convencional de enlazamiento que emplee la proteína rsCD4 como antígeno en fase sólida. Los ensayos útiles de enlazamiento de rsCD4 se pueden llevar a cabo convenientemente por medio de formatos ELISA y similares, a través del uso de un anticuerpo secundario marcado con una enzima específico para inmunoglobulinas de especies a partir de las cuales se derivó el homólogo del anticuerpo.

El enlazamiento de anticuerpos o sus homólogos a un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 sobre células que expresan CD4 humana se puede detectar ya sea por medio de coloración de las células con un anticuerpo secundario marcado en forma fluorescente específico para inmunoglobulinas de las mismas especies a partir de las cuales se deriva el anticuerpo o su homólogo que está siendo analizado, o por medio de formatos ELISA que emplean la proteína rsCD4 en combinación con péptidos, por ejemplo el péptido 2047 de los receptores de quemoquina. Se utiliza un clasificador celular activado por fluorescencia ("FACS") o un microscopio de fluorescencia de alta resolución para la determinación del porcentaje de células reactivas al anticuerpo y para el tanteo de la intensidad. El enlazamiento del anticuerpo a las células se puede observar por medio de un microscopio de fluorescencia de alta resolución para mostrar el patrón característico "cap". Las células útiles que expresan CD4 para este propósito son los linfocitos T que expresan CD4, tal como las células T de sangre periférica humana, timocitos, y esplenocitos o una línea de células T de leucemia que expresa CD4 tal como HPB-ALL o SUP-T. Las células se separan por medio de métodos conocidos. Por ejemplo, se pueden separar linfocitos T normales por medio de centrifugación Ficoll-Hypaque y las células T malignas se pueden separar por medio de centrifugación.

Para determinar si un anticuerpo particular bloquea el enlazamiento de gp120 del VIH a CD4 humana, se puede utilizar cualquier ensayo adecuado de competición. Los ensayos útiles incluyen, por ejemplo, ELISA, ensayos de inmunofluorescencia indirecta, y similares. Preferiblemente, se mide la habilidad de gp120 marcada del VIH para enlazar CD4 sobre células que expresan CD4 por incubación previa de las células con el anticuerpo.

La habilidad de gp120 del VIH para bloquear el enlazamiento de un anticuerpo monoclonal reactivo a CD4 a la célula que expresa CD4 se evalúa por medio de la preincubación de gp120 del VIH con las células que expresan CD4 y cuantificando el grado en el cual el enlazamiento previo de gp120 del VIH inhibe el enlazamiento del anticuerpo a las células. El enlazamiento del anticuerpo a las células que expresan CD4 se cuantifica por medio de análisis FACS o microscopía de fluorescencia de alta resolución, utilizando un anticuerpo secundario marcado por fluorescencia específico contra las especies a partir de las cuales se deriva el anticuerpo que está siendo analizado.

La gp120 del VIH utilizada en los ensayos anteriores puede ser proveída por células infectadas con VIH, por el VIH en si mismo, por células huésped transformadas con el gen para gp120 del VIH, por células huésped infectadas con virus recombinante que expresan gp120, o por gp120 aislada. Se prefiere la gp120 del VIH producida en forma recombinante. Tal producto se encuentra comercialmente disponible como una gp120 recombinante purificada del VIH (American Biotechnologies, Inc., Cambridge, MA).

Para evaluar la habilidad de un anticuerpo particular para bloquear la formación de sincitio inducida por el VIH entre las células que expresan CD4, se puede utilizar cualquier ensayo conocido para sincitio. Preferiblemente, se añaden un aislado primario o células de cultivo de tejido que expresan CD4 infectado con VIH (por ejemplo, H9), a cultivos de células MT-2. Se añaden entonces cantidades variables de los anticuerpos. Los controles negativos se complementan con medio d cultivo regular, o con un anticuerpo irrelevante en presencia de VIH. Se puede utilizar también un control positivo con cepas que inducen sincitio gigante. Después de incubación, se hace un recuento de todos los cultivos por medio de cuantificación visual de la formación de sincitio o de placa, en el caso de cepas que inducen sincitio gigante. De esta forma, se registra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la formación de sincitio o para reducir el número de placas formadas en el cultivo.

Para determinar si un anticuerpo particular inhibe la infección de células que expresan CD4 por el VIH, se podría monitorear cualquier indicación de infección por VIH. Los indicadores útiles in vitro de infección por el VIH incluyen, por ejemplo, secreción del antígeno p24 del núcleo del VIH. Preferiblemente, la inhibición de la infección por el VIH se determina por medio de la comparación de los niveles de p24 del VIH en presencia y en ausencia del anticuerpo en cultivos celulares que expresan CD4 infectado con VIH.

Para evaluar la habilidad de un anticuerpo particular para bloquear la infección por VIH de las células que expresan CD4, se puede utilizar un ensayo cuantitativo del antígeno viral p24. Se prefiere un ensayo de neutralización del antígeno p24 para la determinación de la actividad de neutralización a las ilusiones indicadas contra el virus entrante (Wrin y colaboradores, J Virol, 1995, 69:39-48). En este ensayo viral del VIH p24, se cuantifica la infectividad del virus y la neutralización por medio de la determinación del antígeno p24 acumulado por los cultivos de PBMC por ELISA para p24 (Coulter Immunology, Hialeah, FL).

Para determinar si un anticuerpo particular tiene una propiedad mejorada de enlazamiento al complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 sobre el enlazamiento a una molécula rsCD4, son útiles ELISA u otros ensayos similares. En tales ensayos, se puede detectar la habilidad del anticuerpo para enlazar al complejo de antígeno que contiene CD4 a través del uso de un anticuerpo secundario marcado específico para inmunoglobulinas de la especie a partir de la cual se derivó el anticuerpo empleando el rsCD4 que había sido preincubado con un péptido derivado de un dominio de un receptor que se sospecha que está en asociación con CD4. El péptido se selecciona de los péptidos del dominio 3 de IL8R_{\alpha} (p2029a), de los dominios 2 y 3 de CC-CKR2b (p2087a, p2088a), de los dominios 1 y 4 de CC-CKR3 (p2079a y 2082a) y del dominio 3 de CC-CKR5 (p2047a).

Para determinar si un anticuerpo particular se enlaza a un péptido derivado de CD4 humano, son útiles ELISA o ensayos similares. En tales ensayos, la habilidad del anticuerpo para enlazarse a estos péptidos se puede detectar a través del uso de un anticuerpo secundario marcado específico para inmunoglobulinas de la especie de la cual se derivó el anticuerpo.

Para determinar si un anticuerpo particular se enlaza a un péptido derivado del receptor de quemoquina humana, son útiles ELISA o ensayos similares. En tales ensayos, la habilidad del anticuerpo para enlazar a estos péptidos se puede detectar a través del uso de un anticuerpo secundario marcado específico para inmunoglobulinas de la especie de la cual se derivó el anticuerpo.

Preferiblemente, el enlazamiento de un anticuerpo a un péptido se determina a través de estudios de inhibición en un ELISA para rsCD4 incubando primero al anticuerpo reactivo a rsCD4 con los péptidos CD4 enlistados más arriba o en la Tabla 1, seguido por una segunda incubación del complejo péptido-anticuerpo con micropozos recubiertos con péptido receptor rsCD4/quemoquina o recubiertos con rsCD4.

Tipos de Homólogos de Anticuerpo de esta Invención y su Producción

Los anticuerpos de la presente invención incluyen tanto anticuerpos como homólogos de anticuerpo que exhiben la nueva combinación de propiedades de B4, descritas anteriormente, como se caracterizan por medio de los procedimientos anteriormente descritos en los Ejemplos 2-18. Los anticuerpos de esta invención pueden ser anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos recombinantes intactos, anticuerpos recombinantes quiméricos intactos, anticuerpos recombinantes humanizados intactos, o porciones de los mismos para el enlazamiento de antígeno que exhiben las propiedades de enlazamiento y neutralización de B4, M2 y B13.

A. Anticuerpos Monoclonales

Los tipos de anticuerpos más preferidos de la presente invención son los anticuerpos monoclonales intactos producidos por hibridomas de la presente invención. La tecnología para producir anticuerpos monoclonales es conocida (Ver generalmente, Kennett y colaboradores, "Methods for Production and Characterization of Monoclonal Antibodies", en Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A new Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, páginas 363-419, 1980).

Las preparaciones útiles de complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 para la elicitación de anticuerpos de la invención incluyen células que expresan CD4 humana, por ejemplo linfocitos de sangre periférica que expresan CD4, timocitos o células de líneas de células T humanas que expresan CD4.

Esto es contrario a la lixiviación de Kung y colaboradores, US 4.381.295, que establecieron: "En realidad, los actuales solicitantes han descubierto que utilizando una célula T de una línea celular maligna como la formación de hibridomas causada por el antígeno que no produjo al anticuerpo deseado [T4]" (columna 4, líneas 54-56). En realidad, Kung y colaboradores no reportaron reactividad de OKT4 observada con 8 de los 8 casos de leucemia linfática aguda de células T (columna 14, línea 45) y la mayoría de las líneas de célula T (línea 51), y concluyeron así que las líneas malignas de célula T eran inmunógenos indeseables.

El inmunógeno para generar el anticuerpo de la presente invención es de una fuente confiable de células que expresan CD4 preferiblemente a partir de una línea de células T tal como HPB-ALL que se deriva de un paciente con leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL) o SUP-T1 que se deriva de un paciente con linfoma no Hodgkin de células T (T-NHL).

Mientras no se desee estar sujeto por la teoría, se cree que utilizando células que expresan CD4 tales como HPB-ALL, células SUP-T1 o MT-2 como el inmunógeno, en vez de CD4 aislada o formas solubles recombinantes de CD4 (por ejemplo, rsCD4), provoca la generación de anticuerpos de la presente invención. El uso de células que expresan CD4 provee la conformación más favorable sobre la superficie de células para el complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 que no puede ser proveída por la sola molécula CD4.

La inmunización se puede llevar a cabo usando procedimientos estándar. La dosis unitaria y el régimen de inmunización depende de la especie de mamífero inmunizada, de su condición inmunológica, del peso corporal del mamífero, y de la cantidad de complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 en la preparación administrada.

En la modalidad preferida, cada dosis de la preparación celular que expresa CD4 usada para la inmunización de ratones contiene aproximadamente al menos 5-10 x 10^{6} células. Típicamente, el ratón se inmuniza intraperitonealmente el día 0 con las células T que expresan CD4, completamente lavadas en PBS para quedar libres de cualquier proteína del medio de cultivo, con o sin adyuvante. Al ratón se le administra un primer refuerzo en forma intraperitoneal con las células T que expresan CD4 lavadas y resuspendidas en PBS de 14 días a 6 meses después de la inmunización inicial, y preferiblemente 15 a 30 días después de la primera inmunización, en ausencia de cualquier adyuvante. Se pueden administrar refuerzos adicionales. Se prefiere la hiperinmunización con múltiples refuerzos sin adyuvante.

Tres días antes de la fusión, se administra en forma intravenosa el refuerzo final (células T que expresan CD4 en PBS sin adyuvante). El suero del mamífero inmunizado se selecciona de acuerdo con la estrategia descrita anteriormente y más específicamente en la Tabla 12 por la presencia de anticuerpos de la invención. Los esplenocitos se aíslan a partir de mamíferos inmunizados cuyo suero es reactivo con rsCD4. Se utilizan entonces cualquiera de los muchos protocolos conocidos útiles para fusionar esplenocitos y líneas de células inmortalizadas con el propósito de generar hibridomas de esta invención.

Típicamente, la línea inmortal de células (por ejemplo, una línea de células de mieloma) y los esplenocitos se derivan de la misma especie de mamífero. Los mamíferos útiles incluyen ratones, ratas y monos rhesus. Preferiblemente, los esplenocitos se derivan de un ratón consanguíneo de la cepa BALB/c o un ratón no consanguíneo de la cepa CD1 (Jackson Labs, Bar Harbour, ME). Las líneas celulares inmortales preferidas son líneas de células de mieloma de ratón que son sensibles a un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). La línea celular de mieloma de ratón más preferida es la P3x63-AG8.653 (ATCC, Rockville, MD, catálogo No. CRL 1580). Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan a esplenocitos de ratón utilizando polietilén glicol ("PEG"). Las células de hibridoma que resultan de la fusión se seleccionan luego utilizando medio HAT, que mata las células de mieloma no fusionadas y fusionadas improductivamente, mientras que los esplenocitos no fusionados mueren naturalmente después de varios días.

Las células de hibridoma que producen un anticuerpo de acuerdo a la presente invención se detectan por medio de evaluación selectiva de los sobrenadantes de cultivo de hibridoma utilizando los ensayos de selección descritos anteriormente. Preferiblemente, la selección primaria seleccionará anticuerpos que tengan una actividad de enlazamiento "preferencial" para rsCD4 que ha sido preincubada con un péptido (por ejemplo, p2047) derivada del tercer dominio externo del receptor de quemoquina CC-CKR5 durante su actividad de enlazamiento a rsCD4 solamente. El enlazamiento mejorado se detecta comparando los resultados del ELISA obtenidos por medio del complejo rsCD4/p2047 correspondiente vs. rsCD4. Esta simple selección primaria dual (rsCD4/p2047 vs. rsCD4) eliminará la mayoría de anticuerpos (>90%) que tienen reactividad a los antígenos de superficie que no contienen CD4. Los anticuerpos seleccionados por sus reactividades preferenciales a rsCD4 en asocio con el tercer dominio externo de la molécula CC-CKR5 sobre rsCD4, se someten a una evaluación selectiva secundaria para el enlazamiento al complejo antígeno superficie celular que contiene CD4 por medio de la caracterización de su enlazamiento a las células que expresan CD4, por ejemplo, las células HPB-ALL o SUP-T. Tal enlazamiento se detecta por medio de anticuerpos secundarios marcados en forma fluorescente específicos para inmunoglobulinas de la especie a partir de la cual se derivó el anticuerpo, y se cuantificó por medio del análisis FACS o por medio de un microscopio de fluorescencia y observado por microscopía de fluorescencia. Los anticuerpos que tienen reactividad de enlazamiento a las células que expresan CD4 se analizan además por su habilidad para neutralizar aislados primarios de VIH-1, por ejemplo 23135, por medio de un ensayo de neutralización en microplaca de MT-2 para la medición de la inhibición en la formación de sincitio o un ensayo de neutralización del antígeno p24 para la medición de la inhibición de replicación
viral.

Aquellos clones que segregan anticuerpos exhiben enlazamiento preferencial a rsCD4/p2047 y/o actividad de enlazamiento a rsCD4 por los ELISA, que colorean intensamente a las células que expresan CD4 por medio de un ensayo indirecto de inmunofluorescencia, y que exhiben actividad de neutralización contra el aislado primario del VIH a una concentración <10 \mug/ml, se seleccionan para clonación y subclonación finales.

Para producir anticuerpos de esta invención que sean anticuerpos monoclonales intactos, se cultivan los hibridomas analizados positivos en los ensayos de selección anteriores en un medio nutriente bajo condiciones conocidas y durante un tiempo suficiente para permitirle a las células de hibridoma secretar a los anticuerpos monoclonales dentro del medio de cultivo. Las técnicas de cultivo de tejido y el medio de cultivo adecuado para las células de hibridoma son conocidas (ver, por ejemplo, Kennett y colaboradores, Monoclonal Antibodies, supra). Se recolectan los sobrenadantes de cultivo de hibridoma acondicionado que contienen a los anticuerpos deseados.

Alternativamente, se puede producir el anticuerpo deseado inyectando células seleccionadas de hibridoma dentro e la cavidad peritoneal de un ratón no inmunizado. Las células de hibridoma proliferan en la cavidad peritoneal, segregan al anticuerpo, que se acumula como fluido ascites (Kennett y colaboradores, Monoclonal Antibodies, supra). Se cosecha el anticuerpo retirando el fluido ascites de la cavidad peritoneal con una jeringa.

La persona normalmente entrenada en la materia entenderá que los anticuerpos monoclonales de acuerdo con esta invención se pueden purificar con facilidad a partir del sobrenadante del cultivo de hibridoma acondicionado o del fluido ascites.

B. Anticuerpos Recombinantes y ADN que los Codifica

Los homólogos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes producidos por células huésped transformadas con ADN que codifica cadenas livianas y pesadas de inmunoglobulina de acuerdo con esta invención. Los anticuerpos recombinantes se pueden producir por medio de técnicas conocidas de ingeniería genética.

Por ejemplo, los anticuerpos recombinantes se pueden producir por clonación de ADNc o de ADN genómico que codifica a las cadenas livianas y pesadas de inmunoglobulina del anticuerpo deseado de un hibridoma que produce un anticuerpo de acuerdo con esta invención. El ADNc o el ADN genómico que codifican a estos polipéptidos se insertan luego dentro de vectores de expresión recombinante de modo que ambos genes se enlacen operativamente a sus propias secuencias reguladoras, para el control de la transcripción y la traducción. El vector de expresión y las secuencias reguladoras para el control de la expresión se escogen para que sean compatibles para la expresión en la célula huésped seleccionada. Típicamente, tanto los genes de la cadena pesada como de la cadena ligera se insertan dentro del mismo vector de expresión de tal manera que la expresión de ambos se enlace operativamente.

Las células procariotas y eucariotas se pueden utilizar como huéspedes para la expresión. Se prefiere la expresión en células huésped eucariotas porque es más probable que tales células en vez de las células procariotas, se reúnan y segreguen un anticuerpo inmunológicamente activo y adecuadamente plegado.

Se entenderá que las variaciones sobre el procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente invención que se define por medio de las reivindicaciones anexas.

Es posible que las células huésped produzcan porciones de anticuerpos intactos, tales como los dímeros de cadena liviana o los dímeros de cadena pesada, que también son homólogos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, se puede desear transformar una célula huésped con ADN que codifique ya sea la cadena liviana o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo de esta invención. También se puede utilizar la tecnología de ADN recombinante para remover algo o todo el ADN que codifica a cualquiera o a ambas de las cadenas liviana y pesada que no son necesarias para el enlazamiento de CD4, por ejemplo, ADN que codifica fragmentos Fab'. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas truncadas de ADN son homólogos de anticuerpo de acuerdo con esta invención.

C. Anticuerpos Recombinantes Quiméricos y Humanizados y el ADN que los Codifica

El ADN que codifica a los anticuerpos recombinantes descritos anteriormente puede ser utilizado como el punto de partida para producir anticuerpos recombinantes quiméricos o humanizados. Los anticuerpos recombinantes quiméricos se producen por medio de la transformación de una célula huésped con un vector de expresión apropiado que contiene ADN que codifica a las cadenas liviana y pesada de la inmunoglobulina deseada en las cuales todo o parte del ADN que codifica a las regiones constante y de articulación de la cadena pesada y/o de la cadena liviana han sido sustituidas con ADN de la región correspondiente de una cadena liviana o pesada de inmunoglobulina de una especie diferente. Cuando el anticuerpo recombinante original es no humano, se prefiere la sustitución con secuencias humanas que codifican a las regiones constante y de articulación. Un ejemplo de un anticuerpo recombinante quimérico tiene regiones variables de ratón y de articulación humana y regiones constantes. Ver generalmente, la patente estadounidense 4.816.397 y Morrison y colaboradores, "Chimeric Human Antibody Molecules: Mouse Antigen-Binding Domains With Human Constant Region Domains", Proc Nat'l Acad Sci USA, 1984, 81:6851-55.

Los anticuerpos recombinantes humanizados se producen por medio de la transformación de una célula huésped con un vector de expresión adecuado que contiene ADN que codifica a las cadenas deseadas liviana y pesada de inmunoglobulina no humana en las cuales todo o parte del ADN que codifica a los aminoácidos no involucrados en el enlazamiento del complejo antígeno CD4, que incluyen secuencias de armazón entremezcladas entre las regiones determinantes de complementariedad (CDR), han sido sustituidas con ADN de las regiones correspondientes de una cadena liviana o pesada de la inmunoglobulina humana deseada. Ver generalmente, P. T. Jones y colaboradores, "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse", Nature, 1986, 321:522-25.

Los anticuerpos recombinantes humanizados más preferidos de esta invención tienen entremezclados a las "CDR" B4 entre las secuencias humanas del armazón.

D. Homólogos de Anticuerpo de Acuerdo a esta Invención que se Generan en Mamíferos Transgénicos

Los hibridomas de ratones homocigotos para un locus endógeno de inmunoglobulina inactivada y que contiene secuencias transgénicas que codifican a una cadena pesada de secuencia humana y una cadena liviana de secuencia humana, secretan homólogos de anticuerpo que contienen una cadena pesada de secuencia humana y una cadena liviana de secuencia humana. Estos homólogos de anticuerpo transgénico, que se enlazan a la molécula CD4 soluble recombinante y más preferiblemente a rsCD4 en asociación con un péptido (por ejemplo, p2047) derivado del tercer dominio externo del receptor de quemoquina CC-CKR5 por medio de los ELISA respectivos, y para un complejo antígeno célula huésped humana que contiene a la proteína CD4 por coloración indirecta con inmunofluoresceina de células que expresan CD4, que tienen una actividad neutralizante dirigida contra aislados primarios de todos los clados de VIH-1, y aislados primarios diversos de HIV-2 y VIS, y tienen similares propiedades de enlazamiento al anticuerpo que aquella del anticuerpo monoclonal B4, se pueden generar por medio de esquemas de inmunización y selección como los descritos en la sección A, subtitulada Anticuerpos Monoclonales.

Más específicamente, un ratón transgénico caracterizado ya sea por tener al genotipo HC1 o HC2 como se describe en Smith y colaboradores, WO 93/12227, homocigotos para un locus J_{H} funcionalmente desorganizado, y cosechando a un transgén capaz de reorganizarse para codificar a una cadena pesada de secuencia humana y un transgén capaz de reorganizarse para codificar a una cadena liviana de secuencia humana, es utilizado como el huésped para inmunización en vez de un ratón CD1 o BALB/c normal.

E. Homólogos de Anticuerpo de Acuerdo a esta Invención que no son Anticuerpos Intactos

Los homólogos también incluyen fragmentos de los anticuerpos de la presente invención. Tales fragmentos se pueden derivar de cualquiera de los anticuerpos intactos descritos anteriormente. Por ejemplo, los fragmentos de enlazamiento del complejo antígeno célula huésped, así como los polipéptidos diméricos o monoméricos de tamaño natural derivados de los anticuerpos anteriormente descritos son por si mismos homólogos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Los homólogos de anticuerpo útiles de este tipo incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos F(v), monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena liviana, dímeros que consisten de una cadena pesada y de una liviana, y similares. Los fragmentos anteriores generalmente son homólogos de anticuerpo útiles de acuerdo con la presente invención.

Los fragmentos de anticuerpo pueden producirse por medio de métodos químicos, por ejemplo, por medio de escisión de un anticuerpo intacto con una proteasa, tal como pepsina o papaína, y opcionalmente tratando al producto escindido con un agente reductor. Alternativamente, los fragmentos útiles se pueden producir por medio del uso de células huésped transformadas con genes truncados de cadena liviana y/o pesada o fusiones de genes truncados de cadena liviana y pesada. Los monómeros de cadena liviana y pesada se pueden producir por medio del tratamiento de un anticuerpo intacto con un agente reductor, tal como ditiotreitol, seguido de purificación para separar las cadenas. Los monómeros de cadena pesada y liviana también se pueden producir por medio de células huésped transformadas con ADN que codifica ya sea a la cadena liviana o a la cadena pesada deseada, pero no a ambas (ver, Sastry y colaboradores, Proc Nat'l Acad Sci USA, 1989, 86:5728-32).

Células que Producen Anticuerpos de la Presente Invención

La presente invención también provee células y cultivos celulares que producen los anticuerpos de esta invención. Tales células incluyen hibridomas que producen anticuerpos monoclonales de esta invención.

Además, la presente invención provee un método para producir los anticuerpos de la presente invención por medio del cultivo de las células que producen los anticuerpos. Los métodos para cultivar tales células y aislar lo anticuerpos producidos son conocidos. Estos métodos incluyen técnicas de cultivo celular, así como la generación de ascites.

También se provee un método para producir hibridomas de esta invención que comprenden la etapa de inmunizar a un mamífero no humano con células que expresan CD4.

Las células que son utilizadas como inmunógeno para este proceso son las células de una fuente confiable de una línea celular que expresa CD4, por ejemplo, una línea de células T derivada de leucemia o de linfoma tal como HPB-ALL derivada de un paciente con leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL) o SUP-T1 derivada de un paciente con linfoma no Hodgkin de células T (T-NHL) que se suministra intraperitonealmente en PBS, o en adyuvante completo de Freund para la primera inmunización, y administrada libre de cualquier adyuvante, ya sea en forma intraperitoneal o intravenosa para refuerzos posteriores.

Composiciones Farmacéuticas y Métodos de esta Invención

El anticuerpo y los homólogos del mismo de esta invención son útiles en composiciones profilácticas y terapéuticas para prevenir enfermedades causadas por agentes infecciosos cuyos objetivos primarios son los linfocitos que expresan CD4. Tales enfermedades incluyen infección con VIH y enfermedades asociadas incluido el SIDA.

Las composiciones farmacéuticas preferidas de esta invención par administración a humanos incluyen a los anticuerpos de la presente invención, y a los homólogos de los mismos, tales como anticuerpos quiméricos recombinantes humanos/de ratón, anticuerpos recombinantes humanizados o porciones de enlazamiento al antígeno de estos anticuerpos. Las composiciones farmacéuticas contienen anticuerpos quiméricos recombinantes humanos/de ratón con propiedades de enlazamiento similares exhibidas por B4 o M2 o B13 o anticuerpos recombinantes humanizados con propiedades de enlazamiento similares a aquellas exhibidas por B4 o M2 o B13 son las más preferidas.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden contener además otros terapéuticos para la profilaxis de la infección con VIH. Por ejemplo, los homólogos del anticuerpo de esta invención pueden utilizarse en combinación con agentes antirretrovirales que bloquean a la transcriptasa inversa, tales como AZT, o con agentes que inhiben a la proteasa del VIH. Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden contener además agentes antivirales tales como interferones, o agentes inmunosupresores tales como la citosporina.

Además, se pueden utilizar uno o más homólogos de anticuerpo en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Tal combinación de terapias puede utilizar convenientemente dosis menores de los agentes terapéuticos administrados, evitando así una posible toxicidad o efectos adversos asociados con las diferentes monoterapias.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención contienen una cantidad inmunoterapéuticamente efectiva de uno o más homólogos de anticuerpo de acuerdo con esta invención, o forma(s) derivatizada(s) del(de los) mismo(s) y, preferiblemente, un excipiente farmacéuticamente aceptable. Por "cantidad inmunoterapéuticamente efectiva" se entiende una cantidad capaz de prevenir los efectos que comprometen al sistema inmunológico por la infección del VIH o SIDA, o de otras enfermedades causadas por agentes infecciosos cuyos objetivos primarios son los linfocitos que expresan CD4. Por "excipiente farmacéuticamente aceptable" se entiende un portador que no causa una reacción alérgica u otro efecto adverso a pacientes a quienes se les administra.

Los excipientes adecuados farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, uno o más entre agua, suero fisiológico, suero fisiológico amortiguado con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinación de los mismos. Los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden contener además cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, preservantes o amortiguadores, que mejoran la duración en almacenamiento o la efectividad del homólogo de anticuerpo.

Las composiciones de esta intención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación sólidas, semisólidas y líquidas, tales como tabletas, píldoras, polvos, soluciones líquidas, dispersiones o suspensiones, liposomas, supositorios, soluciones inyectables e infusibles. La forma preferida depende del modo deseado de administración y de la aplicación profiláctica o terapéutica. Las composiciones preferidas están en la forma de soluciones inyectables e infusibles.

Las composiciones farmacéuticas preferidas de esta invención son similares a aquellas utilizadas para la inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. La forma preferida de administración es la parenteral.

Será claro para aquellos capacitados en el arte que la cantidad inmunoterapéuticamente efectiva del homólogo de anticuerpo de esta invención dependerá del horario de administración, de la dosis de homólogo de anticuerpo administrada, ya sea que el homólogo de anticuerpo se administre en combinación con otros agentes terapéuticos, del estado inmunológico y de salud del paciente, y de la actividad antiviral del homólogo particular de anticuerpo administrado.

La inmunoterapia para profilaxis de la infección por VIH, esto es, las cantidades inmunoterapéuticamente efectivas por dosis unitaria de un homólogo de anticuerpo que es un anticuerpo intacto, están en el rango aproximadamente de 1 a 100 mg/kg de peso del paciente, preferiblemente, 5 mg/kg a 50 mg/kg de peso del paciente, y más preferiblemente 5 mg/kg de peso del paciente. Las dosis unitarias se deben administrar una vez cada dos semanas, y preferiblemente una vez inmediatamente después de una exposición accidental tal como la punción con una aguja. El efecto antiviral se puede medir por medio de una variedad de métodos, incluida la carga viral. Se reconocerá, sin embargo, que se pueden emplear dosis más altas o más bajas y otros programas de administración.

Los regímenes de tratamiento para homólogos de anticuerpo que no son anticuerpos intactos pueden diferir, dependiendo de su tamaño y de las propiedades farmacéuticas.

Con el propósito de que esta invención pueda ser entendida mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son únicamente para propósitos de ilustración, y no pretenden constituirse de ninguna manera en limitantes para el alcance de invención, ya que el alcance de invención se define por medio de las reivindicaciones anexas.

Ejemplo 1 Comparación de la Susceptibilidad de las Cepas de Laboratorio y los Aislados Primarios de VIH-1 para la Neutralización In Vitro por medio de Anticuerpos Dirigidos Contra la gp120 del VIH Procedimientos específicos para la determinación de la neutralización del virus por el anticuerpo

Células. La línea de células T humanas MT-2 (No. 237, NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog) fue mantenida en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero fetal bovino al 15% como se describió previamente (Hanson y colaboradores, J Clin Microbiol, 1990, 28:2030-2034). Se aislaron las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes seronegativos para VIH-1 a partir de unidades frescas mononucleares de cultivo por medio de separación por gradiente de Ficoll-Hypaqu (Organon Teknika Corp., Durham, NC). Los PBMC resultantes fueron estimulados con PHA-P al 0,5% (Difco Laboratories, Detroit, MI). Después de 3 a 4 días, se removió el medio que contenía PHA-P y se mantuvo a las células en RPMI con suero fetal bovino al 15%, 900 \mug/mL de glutamina, antibióticos, y 5% de interleuquina-2 (Cellular Products, Inc., Buffalo, NY).

Virus. La MN del VIH-1 es una cepa adaptada de laboratorio disponible y mantenida como un cultivo celular H9 persistentemente infectado de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda MD (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog no. 402), a partir de la cual se prepararon patrones concentrados libres d células. Los aislados primarios del VIH-1 se prepararon a partir de las PBMC de un paciente por medio de cocultivo con PBMC. Las reservas de cultivo de aislados primarios se prepararon con no más de 3-5 pasadas a través de las PBMC, y se clarificaron por medio de centrifugación (Sawyer y colaboradores, J Virol, 1994, 68:1342-1349). Ellos fueron suministrados por Carl Hanson del California Department of Health Services, Berkeley CA.

Ensayo de Neutralización de MT-2 en Microplaca. La determinación de la concentración de anticuerpo por neutralización del VIH emplea la preincubación de suero diluido en forma serial o de anticuerpo con una cantidad fija de VIH seguida por la infección de células MT-2 sensibles al VIH y la formación de una monocapa celular que exhibe microplacas inducidas por el VIH. Los resultados se obtienen por cuantificación de las microplacas. El ensayo es adecuado para aislados SI únicamente, ya sea para los aislados primarios o adaptados en el laboratorio, ya que las microplacas representan sincitio gigante formado por células MT-2 que se fusionan a focos de células infectadas con el VIH; y, el ensayo es apropiado para evaluar la inhibición tanto de la transmisión de virus a célula como de célula a célula ya que la inhibición en la formación de sincitio resulta de la acción de anticuerpo ya sea sobre partículas de VIH o de células infectadas con VIH, esto es, el ensayo mide tanto la inhibición de la fusión virus a célula inducida por el VIH como la fusión célula a célula inducida por el VIH. Se observa entonces la neutralización por medio de la reducción de microplacas como se observa por la enumeración de placas coloreadas con yoduro de propidio 1 semana después (Ver, Hanson y colaboradores, J Clin Microbiol, 1990, 28:2030-2034). En este ensayo, tanto el virus como el suero o el anticuerpo se diluyen en plasma humano normal desfibrinado reunido al 50% para anular cualquier efecto inhibidor o de mejora no específica.

Suero y Anticuerpo. GP anti-gp120 N-terminal V3 MN son sueros recopilados de conejillos de indias que habían sido hiperinmunizados (Wang y colaboradores, Science, 1991, 254:285-288) con un antígeno sintético del péptido correspondiente a la porción N-terminal del dominio hipervariable V3 de gp120 de MN del VIH-1 (anti-N-terminal V3 MN). El suero de la genoteca de GP anti-gp120 N-terminal V3 es antisuero reunido de tres conejillos de indias hiperinmunizados con una mezcla compleja de péptidos que representan a una genoteca aproximadamente de 1 x 10^{13} secuencias posibles de V3 N-terminal del VIH-1 (genoteca de anti-N-terminal V3). Los inmunógenos de la genoteca de N-terminal V3 MN y el MN de V3 N-terminal utilizados par alas inmunizaciones de los conejillos de indias eran inmunógenos del péptido sintético V3 N-terminal multiramificado que se puede utilizar para generar anticuerpo policlonal con actividad neutralizante para diferentes cepas de laboratorio del VIH-1, como se describe en Walfield y colaboradores, (Koff y colaboradores, ed., AIDS Research Reviews, Capítulo 18, Marcel Dekker: New York, 1993). Otro anticuerpo anti-gp120 es un anticuerpo monoclonal humano recombinante (MAb) denominado IgG1 b12 con especificidad por el sitio de enlazamiento de gp120 para CD4 (anti gp120 CD4-BS) (Burton y colaboradores, Science, 1994, 266:1024-1027). IgG1 b12 se generó como un fragmento de Fab de una genoteca que exhibe un fago anticuerpo preparado a partir de médula ósea de un donante seropositivo del VIH-1 asintomático durante largo tiempo y que fue convertido en un anticuerpo humano completo por medio de clonación dentro de un vector de IgG1 de ADN recombinante. Es mirado como el estándar dorado de los anticuerpos para neutralización de diversos aislados primarios del VIH (Burton y colaboradores, supra).

Resultados

Una comparación de las actividades de neutralización del VIH-1 de antisuero de conejillo de indias MN de V3 anti-N-terminal, de antisuero de conejillo de indias de la genoteca de V3 anti-N-terminal, e IgG1 b12 (anti-gp120 CD4-BS), se muestra en la Tabla 2. La actividad de neutralización para los dos sueros de V3 anti-N-terminal se determinó sobre la cepa de laboratorio MN del VIH-1 y sobre dos aislados primarios del VIH-1 (23135 y BR014). Se determinó la actividad de neutralización para el anticuerpo en el sitio de enlazamiento de anti-gp120 CD4 sobre los dos aislados primarios, 23135 y BR014. Se determinaron las actividades de neutralización para el Ensayo de Neutralización en Microplaca de MT-2 y se expresan en la Tabla 2 en los puntos finales indicados (50% y 90%) como los valores de concentración de la dilución para los anticuerpos policlonales en el suero y como concentraciones (\mug/mL) para el anticuerpo monoclonal.

MN del VIH-1, la cepa adaptada en el laboratorio se desarrolló sobre la línea de células T H9, fue muy sensible a la neutralización tanto por el antisuero de V3 anti-N-terminal, con MN de V3 anti-N-terminal siendo aproximadamente cuatro veces más potente que el antisuero de la genoteca de V3 anti-N-terminal menos específico para la cepa. Los aislados primarios desarrollados sobre PBMC fueron refractarios a la neutralización por cualquiera de los sueros de V3 anti-N-terminal. Sin embargo, al menos uno de los aislados primarios fue moderadamente neutralizable por el sitio de enlazamiento de anti-gp120 CD4, IgG1 b12. Estos resultados son un reflejo de las diferencias entre el VIH-1 adaptado en el laboratorio y los aislados primarios en susceptibilidad a la neutralización. Ellos indican la sensibilidad de las cepas del VIH-1 adaptadas en el laboratorio para los anticuerpos de V3 N-terminal anti-gp120 específicos de la cepa, la resistencia de aislados primarios a tales anticuerpos, y la sensibilidad de algunos aislados primarios a la neutralización por los anticuerpos dirigidos contra el enlazamiento de gp120 para el receptor CD4 de la célula huésped.

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TABLA 2

2

Ejemplo 2 Caracterización de las Actividades de Neutralización in vitro de los Anticuerpos Anti-Célula Huésped Contra Aislados Primarios del VIH-1

Se purificaron los anticuerpos monoclonales a partir de fluidos de ascites y se purificaron los anticuerpos de V3 N-terminales anti-gp120 policlonales de conejillo de indias a partir del suero por medio de cromatografía de afinidad sobre Proteína A. Se reconstituyeron los anticuerpos como soluciones estériles en Suero Fisiológico Amortiguado con Fosfato (PBS) a razón de 1 mg/mL, y se prepararon como diluciones seriales en PBS para ensayos de neutralización del VIH-1. Se ensayaron los anticuerpos individualmente y se combinaron en las mezclas de los grupos 7-15 a fin de mostrar interacciones sinergísticas entre los anticuerpos de diferentes especificidades o la carencia de las mismas. Las actividades de neutralización contra el VIH-1 se determinaron sobre dos aislados primarios por medio del Ensayo de Neutralización en Microplaca de MT-2 y se expresan en los puntos finales indicados (50% y 90%) como concentraciones de anticuerpo (\mug/mL).

Resultados

Los resultados presentados en la Tabla 3 muestran las actividades de neutralización contra dos aislados primarios de campo del clado B del VIH-1 (23135 y BRO14) de una colección de anticuerpos incluidos los anticuerpos monoclonales de murino con especificidades para diferentes antígenos de superficie celular (grupos 1 y 2, los MAb ID1 y 80A para HLA DR; grupo 3, Mab A1.4 para HLA A, B, C de cadena pesada; grupo 4, Mab H28 para microglobulina \beta_{2}, y grupo 5, B4 para un complejo antígeno célula huésped que contiene a la proteína CD4), una preparación de anticuerpo de MN de V3 N-terminal anti-gp120 policlonal a partir de un conejillo de indias inmunizado con un péptido sintético tomado del dominio V3 N-terminal de gp120 de MN del VIH-1 (grupo 6), mezclas de estos anticuerpos (grupos 7-15), y cinco anticuerpos monoclonales adicionales dirigidos contra antígenos bien caracterizados de células T (grupo 16, Mab para el receptor roseta E, grupo 17, Mab para el antígeno 13, grupo 18, Mab para Leal, grupo 19, Mab para antígeno 18; y,
grupo 20, Mab C37 para el receptor del antígeno de célula T) (Wang y colaboradores, Hybridoma, 1986, 5:179-190).

De los 11 anticuerpos individuales ensayados en el experimento de la Tabla 3, únicamente un MAb derivado de ratón inmunizado con la línea de células T HPB-ALL, B4 (grupo 5), que es una modalidad preferida de la presente invención con una única actividad de enlazamiento hacia un complejo antígeno receptor de la célula huésped que contiene CD4, demostró fuerte neutralización de los aislados primarios. Las mezclas de los grupos de anticuerpos 7-15 mostraron actividades de neutralización únicamente si ellas incluían B4. Comparar los resultados para los grupos 7-10 y 15 para los grupos 11-14. Además, la comparación de las actividades de neutralización del grupo 5, de los grupos 9, 10, 15 y de los grupos 7 y 8 muestra que a la actividad de neutralización de las mezclas solo contribuye B4. Los otros anticuerpos sirven únicamente para diluir la actividad de neutralización de B4 y no existe evidencia de ninguna interacción sinergística entre el anticuerpo dirigido contra el complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 de la invención (Mab B4) y los otros anticuerpos anti-celulares o el anticuerpo de V3 N-terminal anti-gp120. Ninguno de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra otros antígenos de célula T, que se sabe que se expresan sobre las células HPB-ALL, neutralizaron aislados primarios del VIH-1 a ningún nivel detectable.

TABLA 3

3

TABLA 3 (continuación)

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4

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Ejemplo 3 Anticuerpos Monoclonales Dirigidos Contra un Complejo Antígeno Célula Huésped que Contienen CD4 Desarrollada a través de la Inmunización de Ratones BALB/c con Células HPB-ALL Procedimientos Específicos para la determinación de las reactividades del anticuerpo monoclonal con rsCD4, y con células que expresan CD4

rsCD4. Se obtuvo CD4 soluble recombinante purificado (rsCD4) a partir de una fuente comercial (American Bio-Technologies, Inc. Cambridge, MA) y de NIH (USA) AIDS Research and Reference Reagent Program.

Determinación de Reactividad anti-CD4 por medio del ELISA de rsCD4. El ELISA de rsCD4 se llevó a cabo recubriendo placas de microtitulación de 96 pozos por incubación durante la noche a 4°C con rsCD4 a 0.25 \mug/mL utilizando 100 \muL por pozo en amortiguador NaHCO_{3} 10 mM, pH 9,5. Los pozos recubiertos con rsCD4 se incubaron con 250 \muL de gelatina al 3% en peso en PBS a 37°C durante 1 hora para bloquear los sitios de enlazamiento de proteína no específicos, se lavaron tres veces con PBS que contenía 0,05% en volumen de TWEEN 20 y luego se secaron. Las muestras del ensayo (anticuerpos monoclonales o un suero anti-rsCD4 de conejillo de indias) se diluyeron con PBS que contenía 20% en volumen de suero normal de cabra, 1% en peso de gelatina y 0,05% en volumen de TWEEN 20 con diluciones de 1:20 volumen a volumen a menos que se indique otra cosa. Se añadieron 100 \muL de la muestra diluida a cada uno de los pozos y se les permitió reaccionar durante 1 hora a 37°C. Se lavaron luego los pozos seis veces con 0,05% en volumen de TWEEN 20 en PBS para remover los anticuerpos marcados no enlazados. Se añadieron 100 \muL de IgG anti-ratón de cabra marcado con peroxidasa de rábano o IgG anti-conejillo de indias de cabra en una dilución de 1:1000 en suero normal de cabra al 1% en volumen, TWEEN 20 al 0,05% en volumen en PBS a cada pozo y se incubó a 37°C durante 15 minutos. Se lavaron seis veces los pozos con TWEEN 20 al 0,05% en volumen en PBS para remover el conjugado de anticuerpo marcado no enlazado y que reaccionó con 100 \muL de la mezcla del sustrato que contenía 0,04% en peso de ortofenilendiamina (OPD) y 0,12% en volumen de peróxido de hidrógeno en amortiguador citrato de sodio pH 5,0, durante 15 minutos. Se detuvieron las reacciones por medio de 100 \muL de H_{2}SO_{4} 1,0 M y se midió la absorbancia a 492 nm (A492).

Determinación de la reactividad para las células que expresan CD4 por medio de coloración indirecta de inmunofluorescencia. Se lavaron 0,5 x 10^{6} células que expresan CD4 (por ejemplo, células de las líneas celulares HPB-ALL o SUP-T1) por pozo dos veces en PBS que contenía 1% de BSA antes de su incubación con el anticuerpo monoclonal designado o el suero con anti-rsCD4 de conejillo de indias durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación de las células con el primer anticuerpo de coloración, se lavaron las células dos veces más en el mismo amortiguador de lavado y se las incubó con IgG anti-ratón de cabra conjugada con isotiocianato secundario de Fluoresceína (FITC) o reactivo de IgG anti-conejillo de indias de cabra conjugada con (FITC) en una dilución de 1:500 (Cappel, Malvern PA) durante 45 minutos adicionales a temperatura ambiente. Las células teñidas fueron lavadas nuevamente en el mismo amortiguador de lavado y se procesaron las células para análisis de fluorescencia por medio de citofluorografía y/o microscopía de inmunofluorescencia para la determinación del porcentaje de células teñidas, la intensidad de la tinción, y más preferiblemente el patrón de coloración del antígeno para cada uno de los
anticuerpos.

Resultados

La línea celular HPB-ALL es una línea de células T humanas malignas derivadas de un paciente con leucemia linfoblástica aguda que tiene el siguiente fenotipo de membrana reveló por medio de inmunofluorescencia indirecta: CD5+(T1/Leu1+), CD4+(T4/Leu3A+), CD8+(T8/Leu2/C8+), CD3+(T3/Leu4+), CD6+(T6/Leu6+), CD2+(T11/
Leu5/D9+), CD25+(Tac+), HLA-A, B, C y \beta_{2} microglobulina+, y HLA-DR- (Wang y colaboradores, 1986, supra). Los ratones BALB/c se inmunizaron intraperitonealmente con 5-10 x 10^{6} células HPB-ALL que crecen exponencialmente lavadas con PBS en adyuvante completo de Freund para la inmunización inicial seguida por refuerzos semanales o bisemanales intraperitoneales con 5-10 x 10^{6} células que crecen exponencialmente lavadas con PBS suspendidas en PBS sin ningún adyuvante durante un total de tres meses. Se llevó a cabo una esplenectomía 3 días después de la inmunización intravenosa final con 5 x 10^{6} células HPB-ALL lavadas con PBS y se preparó una suspensión celular mononuclear. Los esplenocitos mononucleares se trataron con polietilén glicol (PEG) por fusión con células de mieloma e hibridación de células somáticas. Las células de fusión se dispensaron dentro de los pozos de las placas de microtitulación de 96 pozos, se incubaron, y se seleccionaron los pozos que contenían anticuerpos específicos para rsCD4, como se detectó por medio del ELISA para rsCD4 descrito anteriormente. Se recolectaron los hibridomas reactivos a rsCD4 y se clonaron las células sencillas por medio de un método limitante de la dilución en presencia de células alimentadoras en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pozos. Estos hibridomas subclonados fueron posteriormente evaluados de nuevo selectivamente primero por su reactividad con rsCD4 por medio del ELISA para rsCD4 y luego, se evaluaron selectivamente adicionalmente los clones reactivos de rsCD4 por las actividades de coloración de sus anticuerpos con células HPB-ALL. Solamente dos clones, designados como B4 y M2, que tienen reactividad moderada de rsCD4 y que colorean intensamente a las células HPB-ALL, fueron seleccionadas para una nueva clonación posterior y mantenidas como ascites por medio de una inyección intraperitoneal de 1 x 10^{7} células en ratones nu/nu cebados con Pristane. Las propiedades de enlazamiento y neutralización de los anticuerpos secretados por estos dos clones se caracterizaron, junto con otros anticuerpos monoclonales reactivos a CD4, como se muestra en los Ejemplos 4-13.

Ejemplo 4 Auténticos Anticuerpos Monoclonales Específicos de CD4 Desarrollados a través de Inmunización de Ratones BALB/c con rsCD4 Resultados

Los ratones BALB/c fueron inmunizados intraperitonealmente con 10 \mug de rsCD4 en Adyuvante Completo de Freund (CFA) el día 0, y reforzados con 10 \mug de rsCD4 en Adyuvante Incompleto de Freund (ICFA) los días 21, 42 y 137 con un refuerzo final de 10 \mug de rsCD4 en PBS inyectado en forma intravenosa el día 145. Se llevaron a cabo una esplenectomía y una fusión 3 días después del último refuerzo. Los pozos que contenían anticuerpos reactivos con rsCD4 fueron seleccionados por medio de ELISA para rsCD4. Se recolectaron cuatro hibridomas, designados como E6, E31, H5 y J33 y se clonaron células sencillas. Estos hibridomas fueron clonados nuevamente posteriormente y mantenidos para el desarrollo de ascites. Como control, se inmunizó un conejillo de indias con 100 \mug de rsCD4 en Adyuvante Completo de Freund el día 0, y se hizo un refuerzo con 100 \mug de rsCD4 en Adyuvante Incompleto de Freund los días 14 y 28. Se obtuvo el suero de este animal los días 28 y 42 para servir como control positivo para anti-rsCD4.

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Estos cuatro hibridomas y sus propiedades de enlazamiento y neutralización de anticuerpos fueron caracterizados y comparados con aquellos de los MAb B4 y M2, como se muestra en los Ejemplos 6-10.

Ejemplo 5 Auténticos Anticuerpos Monoclonales Específicos de CD4 Desarrollados a través de Inmunización de Ratones BALB/c con Células HPB-ALL Seguido por Refuerzos con un Complejo gp120-rsCD4 Resultados

Los ratones BALB/c fueron inmunizados intraperitonealmente con 5 x 10^{6} células HPB-ALL en CFA el día 0, reforzados con 5 x 10^{6} células HPB-ALL en ICFA el día 28, seguido por tres refuerzos semanales con complejo gp120-rsCD4 del VIH-1 (10 \mug cada vez) en ICFA comenzando el día 56. Se llevaron a cabo una esplenectomía y una fusión 3 días después del último refuerzo. Se identificaron los pozos que contenían anticuerpos reactivos con rsCD4. Se seleccionaron y clonaron tres hibridomas, designados como D5, E2, y 126, se clonaron nuevamente y se los mantuvo para el desarrollo de ascites.

Estos tres hibridomas y sus propiedades de enlazamiento y neutralización de anticuerpos fueron caracterizados y comparados con aquellos de los MAb B4 y M2, como se muestra en los Ejemplos 6-10.

Ejemplo 6 Caracterización de Anticuerpos Monoclonales y Policlonales Reactivos para CD4 por sus Actividades de Neutralización del Aislado Primario del VIH y de Enlazamiento Individual Procedimientos Específicos para la determinación de reactividades de anticuerpo monoclonal con rsCD4, rsCD4 en asocio con un péptido derivado de la molécula de superficie CCKR5, los péptidos sintéticos CD4, y con células que expresan CD4

El procedimiento para la determinación de la neutralización del virus por medio de un anticuerpo es descrito en el Ejemplo 1, y los procedimientos para la determinación del enlazamiento del anticuerpo a rsCD4 y a la superficie de la célula de las células que expresan CD4 son descritos en el Ejemplo 3. Únicamente se suministran procedimientos específicos para la determinación de las reactividades del anticuerpo con péptidos sintéticos CD4 y los ensayos de inhibición por ELISA para confirmar los resultados del mapeo del epítopo en este ejemplo.

Péptidos sintéticos CD4. Los péptidos enlistados en la Tabla 1 fueron sintetizados por medio de la técnica de síntesis en fase sólida de Merrifield sobre sintetizadores automatizados de péptidos de Applied Biosystems (Modelos 430, 431 y 433A) utilizando química Fmoc. Después del montaje completo del péptido deseado, se trató la resina de acuerdo con un procedimiento estándar utilizando ácido trifluoroacético para escindir al péptido de la resina y desbloquear a los grupos protectores sobre las cadenas laterales de aminoácido. Para un péptido cíclico, se disolvió el péptido escindido en DMSO al 15% en agua durante 48 horas para facilitar la formación del enlace intradisulfuro entre las cisteínas. Los péptidos marcados sobre la Tabla 1 como "han sido ciclizados así". Otros péptidos son lineales. Los péptidos marcados con ‡ también contienen un espaciador gly-gly y un epítopo auxiliador de célula T del virus de la hepatitis B (HBV). Los péptidos, escindidos, extraídos y lavados se purificaron por medio de HPLC y se caracterizaron por medio de espectrometría de masas y HPLC en fase reversa.

Los ELISA basados en el péptido sintético CD4. Los ELISA basados en el péptido sintético CD4 se llevaron a cabo esencialmente lo mismo que el ELISA para rsCD4 descrito aquí anteriormente, excepto por la etapa de recubrimiento del antígeno, en donde los pozos de microtitulación fueron recubiertos durante 1 hora a 37ºC con el péptido CD4 designado con una concentración de 5 \mug/mL, en vez de rsCD4 de 0,25 \mug/mL a 4ºC.

Ensayos de Inhibición por ELISA. La inhibición inducida por el péptido del enlazamiento del anticuerpo el ELISA de rsCD4 fue medida por medio de la preincubación de muestras diluidas, en una dilución de enlazamiento de rsCD4 de punto final, con el péptido competidor en la concentración indicada en el rango desde 1,67 mg/ml hasta 16,7 \mug/mL durante 1 hora a 37ºC. La muestra preincubada y la mezcla del péptido se utilizaron directamente en el procedimiento estándar de ELISA para rsCD4 descrito aquí anteriormente. El porcentaje de inhibición se calculó con relación al anticuerpo monoclonal diluido apropiadamente en forma idéntica que fue preincubado en ausencia e péptido. La inhibición inducida por rsCD4 del enlazamiento del anticuerpo en el ELISA para rsCD4 fue medido en forma similar por medio de preincubación de muestras diluidas, en una dilución de enlazamiento de rsCD4 de punto final, con el péptido rsCD4 competidor en la concentración indicada.

Ensayo de Inhibición por Inmunofluorescencia Indirecta. Para los ensayos de inhibición competitiva empleando la técnica de coloración por inmunofluorescencia indirecta, se incubaron las células con diferentes reactivos de interferencia en una etapa especificada y se las lavó dos veces en el mismo amortiguador de lavado en medio de cualquiera de las dos incubaciones.

Resultados

Nueve anticuerpos monoclonales reactivos a CD4 seleccionados a partir de los tres experimentos de fusión anteriores descritos en los Ejemplos 3, 4 y 5 fueron caracterizados además por (1) sus patrones de reactividad con las células que expresan CD4 por medio del ensayo indirecto de inmunofluorescencia, (2) sus determinantes antigénicos sobre CD4, determinados por medio de los ELISA de inhibición indirecta y de enlazamiento directo utilizando como antígenos en fase sólida a los péptidos sintéticos CD4 cuidadosamente diseñados mostrados en la Tabla 1, y (3) su habilidad para neutralizar aislados primarios del VIH por medio del Ensayo de Neutralización en Microplaca de
MT-2.

Caracterización del Anticuerpo. Con la excepción del anticuerpo monoclonal B4 que es una inmunoglobulina murina del tipo \gamma2a, de tipo \kappa, todos los otros anticuerpos monoclonales son \gamma1, de tipo \kappa (Tabla 7) como se determina por medio del Murine Hybridoma Subisotyping Kit (Calbiochem, San Diego, CA, Cat. No. 386445). De los nueve anticuerpos monoclonales seleccionados reactivos a CD4, todos mostraron inmunoreactividad con la proteína rsCD4 como se demuestra por medio del ELISA para rsCD4 (Tabla 4) con los MAb J33, H5, E6, E2 y 126 teniendo reactividades de enlazamiento relativamente fuertes. Se encontró que el suero con anti-rsCD4 de conejillo de indias obtenido el día 28 de la sangre de un animal previamente inmunizado dos veces con 100 \mug de rsCD4 en adyuvantes completo e incompleto, tiene una reactividad extremadamente alta con rsCD4 por medio del ELISA para rsCD4 con una valoración de punto final >10^{5}. Este suero ha mostrado tener reactividades con dominios múltiples de rsCD4 y es utilizado por lo tanto como un control positivo anti-CD4 autentico en experimentos posteriores de caracterización del anticuerpo. Ver, Tablas 4, 7, 8.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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6

Identificación de determinantes antigénicos para cada uno de los anticuerpos monoclonales. Los esfuerzos para identificar a los determinantes antigénicos sobre la molécula CD4 reconocidos por cada uno de los anticuerpos monoclonales se hicieron a través de estudios de enlazamiento directo con la colección de péptidos sintéticos CD4 mostrados en la Tabla 1. Estos péptidos fueron diseñados de acuerdo a la estructura tridimensional (3-D) disponible para los primeros dos dominios de CD4 humana (Wang y colaboradores, Nature, 1990, 348:411) y la estructura para el tercero y cuarto dominios de la molécula de acuerdo a como se proyectó a partir de un análisis de homología de la estructura 3-D disponible de CD4 de rata (Brady y colaboradores, Science, 1993, 260:979) a fin de maximizar la reactividad serológica cruzada entre la CD4 sintética y la nativa. El enlazamiento a los fragmentos se compara con el enlazamiento a rsCD4. El enlazamiento para cada uno de los anticuerpos se determinó por medio de inmunoensayos enzimáticos en diluciones seriales comenzando con una concentración de anticuerpo de 50 \mug/mL para la detección de anticuerpo murino enlazado, utilizando los péptidos indicados o rsCD4 como antígenos en fase sólida. Los resultados del enlazamiento se expresan como Absorbancias en el péptido y los ELISA basados en rsCD4. Por simplicidad de reconocimiento del patrón, solamente los resultados obtenidos con la concentración más alta de anticuerpo en la serie de diluciones que dan origen a señales de reactividad máxima a 50 \mug/mL fueron presentados para cada uno de los anticuerpos. Las muestras con A_{492} mayor a 0,150 se consideran reactivas. El enlazamiento positivo se denota en la Tabla 4 por medio de una raya inferior. Este esfuerzo intensivo de mapeo resultó en la identificación de sitios de enlazamiento del péptido y la localización
de sus epítopos en referencia con la secuencia primaria de CD4 (Tabla 4) para todos los anticuerpos monoclonales.

Los patrones de reactividad del péptido mostrado en la Tabla 4 separaron los nueve anticuerpos en estos tres grupos (Figura 2). Los anticuerpos del primer grupo reconocieron epítopos lineales e incluyeron dos anticuerpos monoclonales designados como E6 y E31. Se encontró que estos reconocen epítopos lineales presentados por medio de un péptido sintético (Tabla 4). Más específicamente, se encontró que el anticuerpo monoclonal E6 reconoce un epítopo que se localizó exclusivamente para una región especificada por tan solo 15 aminoácidos (AA_{41}-AA_{55}) desde el primer dominio que se superpone a la región de enlazamiento de gp120 del VIH CDR2, y E31 reaccionó con el péptido cíclico más grande AA_{118}-AA_{165}.

Los anticuerpos del segundo grupo, que consisten de cinco anticuerpos monoclonales H5, J33, E2, D5 y I26, se encontró que reaccionan con péptidos lineales derivados de dos regiones de CD4, con reactividad ocasional preferencial con uno (Tabla 4), calificando así a estos anticuerpos como epítopos conformacionales discontinuos de reconocimiento. Más específicamente, se encontró que H5 reacciona primero con la región CDR3 (AA_{79}-AA_{96}) del primer dominio de la molécula CD4 mientras que tiene una modesta reactividad con el segundo dominio de CD4 caracterizado por dos péptidos cíclicos AA_{133}-AA_{151} y AA_{118}-AA_{165}; se encontró que J33 reacciona primero con el centro del segundo dominio de CD4 caracterizado por un péptido cíclico AA_{133}-AA_{151} mientras que tiene una reactividad moderada con el primer dominio, caracterizado por un dímero artificial de péptidos (AA_{1}-AA_{20}) y (AA_{68}-AA_{92}) (P1852, Tabla 4) de las regiones CDR1 y CDR3 respectivamente con ambas contribuyendo a la formación de un enlace disulfuro intradominio; D5 reconoce dos trechos de aminoácidos tanto del primero como del tercero de los dominios caracterizados por los péptidos cíclicos AA_{1}-AA_{20} y AA_{235}-AA_{251} respectivamente; E2 reconoce principalmente un trecho de aminoácidos del tercer dominio caracterizado por péptido cíclico AA_{235}-AA_{251} mientras que tiene una modesta reactividad con la porción N-terminal (AA_{1}-AA_{20}) de la molécula CD4 caracterizada por un péptido híbrido 1858; e I26 reconoce un área que se superpone en gran medida con aquella de D5 por reactividad preferencial con el tercer dominio caracterizado por un péptido cíclico AA_{235}-AA_{251}.

Los anticuerpos de los primeros dos grupos obtenidos de ratones inmunizados con una rsCD4 purificada o un complejo rsCD4-gp120 bien definido, que demuestra fuertes reactividades con rsCD4 nativa y reactividades definitivas con diferentes dominios de la molécula CD4, se consideran anticuerpos anti-CD4 auténticos.

Y finalmente, los anticuerpos monoclonales B4 y M2, del tercer grupo, se encontró que reaccionan moderadamente con la rsCD4 nativa aún en concentración de saturación (50 \mug/mL) como se observa por el ELISA para rsCD4 (Tabla 4), mientras que tiene solamente reactividades débiles con los péptidos de diferentes regiones AA,-AA_{20}, AA_{79}-AA_{96}, AA_{118}-AA_{165}, AA_{213}-AA_{226}, AA_{235}-AA_{251}, AA_{297}-AA_{351} y AA_{361}-AA_{375} de CD4. De manera interesante, la reactividad de B4 por la región de CDR2 del dominio 1, donde los anticuerpos conocidos anti-CD4 Leu3A y OKT4A se reportó que se enlazan, fue perdiéndose en forma conspicua cuando se los compara con sus reactividades con otros péptidos. Los dos anticuerpos de este tercer grupo se califican como epítopos conformacionales dispersos discontinuos de reconocimiento.

Identificación de péptidos miméticos que interfieren con B4-rsCD4 e interacciones con M2-rsCD4. Con el propósito de descifrar más los sitios potenciales de contacto sobre la molécula CD4 tanto para B4 como para M2, se analizaron los péptidos de las regiones cercanas a aquellos que se observó que eran responsables por los enlazamientos de B4-rsCD4 o M2-rsCD4 (Tabla 4) en un ELISA por su habilidad para inhibir las interacciones con B4-rsCD4 y M2-rsCD4.

La señal generada en el punto final de concentración (por ejemplo, 10 \mug/mL para B4 y 20 \mug/mL para M2) en un ELISA para rsCD4 fue empleada como control positivo para los estudios de enlazamiento competitivo del péptido.

La Tabla 5 describe los resultados del porcentaje de inhibición obtenidos en el ELISA para rsCD4 en donde los péptidos diseñados CD4 fueron diluidos en forma serial e incubados individualmente con 0,1 mL de B4 con una concentración de 10 \mug/mL antes del enlazamiento de B4 a rsCD4 enlazada en fase sólida. Los péptidos fueron empleados para inhibición competitiva en concentraciones de 1,67 mg/mL, 167 \mug/mL y 16.7 \mug/mL (conc 1, conc 2, y conc 3, respectivamente). Solo los resultados de estos péptidos que demuestran fuerte inhibición o reforzamiento de la interacción de B4-rsCD4 se muestran para comparación. El reforzamiento se expresa por medio de valores negativos para inhibición.

La Tabla 6 describe los resultados del porcentaje de inhibición obtenidos en el ELISA para rsCD4 en donde los péptidos diseñados CD4 fueron diluidos en forma serial como en la Tabla 5 y fueron individualmente incubados con 0,1 mL de M2 con una concentración de 20 \mug/mL antes del enlazamiento de M2 a rsCD4 enlazada en fase sólida. Solo los resultados de estos péptidos que demuestran fuerte inhibición o reforzamiento de la interacción de M2-rsCD4 se muestran para comparación.

Como se muestra en la Tabla 5, se encontró que el enlazamiento de B4 a rsCD4 está fuertemente inhibido por los péptidos CD4 de las regiones AA_{1}-AA_{20}, AA_{6}-AA_{20}, AA_{81}-AA_{92}, AA_{79}-AA_{88}, AA_{154}-AA_{165}, y AA_{297}-AA_{351}, indicando la relación de estas regiones en la formación del epítopo conformacional asociado a CD4. Contrario a los reportes de Y. Chiba, supra, para Leu3A monoclonal y de Jameson y colaboradores, supra para OKT4A, se observó un mejoramiento significativo para el enlazamiento de B4-rsCD4 con péptidos de las regiones de AA_{36}-AA_{47}, sugiriendo así proximidad espacial pero no relación directa de la AA_{30}-AA_{47} para el enlazamiento de B4. Los sitios de inhibición se localizan frecuentemente alrededor de los enlaces intradisulfuro (Tabla 5). Se observó un patrón similar de inhibición y mejoramiento por medio de los diferentes péptidos CD4 con solo diferencias menores para M2 (Tabla 6).

TABLA 5

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TABLA 6

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Ejemplo 7 Propiedades de Enlazamiento de los Anticuerpos Monoclonales para la Superficie Celular de las Células que Expresan CD4

Los nueve anticuerpos monoclonales reactivos a CD4 junto con el suero anti-rsCD4 de conejillo de indias fueron utilizados en diferentes ensayos indirectos de inmunofluorescencia para la detección de la expresión en la superficie de sus epítopos sobre las células HPB-ALL y para la determinación de la relación especial entre el enlazamiento de gp120 del VIH-1 y los epítopos de CD4 reconocidos por los diferentes anticuerpos reactivos a CD4.

Resultados

La Tabla 7 resume los resultados obtenidos para los anticuerpos monoclonales de murino desarrollados a partir de tres experimentos de fusión relacionados con (1) sus isótopos; (2) sus reactividades con rsCD4 por medio del ELISA para rsCD4; (3) sus reactividades con CD4 de superficie por medio e un ensayo indirecto de inmunofluorescencia que registra el porcentaje de reactividad celular, el grado de coloración (0-3+) y los patrones de enlazamiento; (4) la habilidad del enlazamiento previo de gp120 del VIH para interferir con el enlazamiento de los anticuerpos al complejo antígeno célula huésped que contiene CD4, (5) la habilidad de los anticuerpos enlazados previamente para inhibir el enlazamiento de gp120 del VIH a la superficie del complejo antígeno célula huésped que contiene CD4; y (6) la habilidad de los anticuerpos para neutralizar a los aislados primarios del VIH-1, por ejemplo, 23135.

Las representaciones de las relaciones espaciales entre los sitios de enlazamiento de gp120 del VIH sobre CD4 enlazado a la membrana celular y los epítopos de CD4 reconocidos por los diferentes anticuerpos monoclonales reactivos a CD4 están específicamente dirigidos por los numerales (3), (4) y (5) de la Tabla 7. Los patrones de enlazamiento a CD4 se observan por medio de coloración indirecta para inmunofluorescencia de las células HPB-ALL utilizando IgG antirratón marcado con isotiocianato de Fluoresceína (FITC), IgG anti-conejillo de indias marcado con FITC o gp120 marcado con FITC. Se muestran los patrones para el enlazamiento de monoclonales de murino anti-CD4 en ausencia de gp120 (3), para el enlazamiento de gp120 marcado con FITC en presencia de anticuerpos monoclonales preenlazados (5), y el enlazamiento de anticuerpos monoclonales en presencia de gp120 preenlazado (4). La unicidad de la actividad de neutralización de los anticuerpos monoclonales B4 y M2 comparado con la actividad de neutralización de otros siete anticuerpos monoclonales anti-CD4 que tienen sitios de enlazamiento sobre CD4 distintos de aquellos de B4 o M2, pero en algunos casos cerca de aquel de B4, es dirigido en los numerales (5) y (6).

TABLA 7

9

10

El anticuerpo monoclonal E6, que reconoce a un determinante lineal representado por medio de un tramo de 15 aminoácidos derivados del primer dominio (AA_{41}-AA_{55}) que se superpone a la región CDR2 del sitio de enlazamiento de gp120 de CD4 (Wang y colaboradores, Nature, 1990, 348:411 y Ryu y colaboradores, Nature, 1990, 348:419), se encontró que reacciona fuertemente tanto con la proteína rsCD4 como con la células HPB-ALL indicando una superficie más expuesta natural para este sitio de enlazamiento del VIH.

Sin embargo, a pesar de las reacciones relativamente fuertes exhibidas por los anticuerpos monoclonales anti-CD4 auténticos J33, H5 y E2 por la molécula rsCD4, como se demuestra por medio de los resultados del ELISA para rsCD4, únicamente se observó una coloración moderada de las células HPB-ALL. La anotación +1 para estos KAb indica una condición mucho menos expuesta para sus epítopos sobre el complejo antígeno CD4 en la superficie de la célula. Además, el suero anti-rsCD4 de conejillo de indias previamente caracterizado (Ejemplo 6) para alto reconocimiento de los epítopos inmunodominantes de los dominios 1, 2 y 4 así como de rsCD4, mostró únicamente una coloración moderada de las células HPB-ALL por medio del ensayo indirecto de inmunofluorescencia, indicando nuevamente una exposición total más baja para la molécula CD4 sobre la superficie de las células positivas CD4. En contraste, ambos anticuerpos monoclonales B4 y M2 colorearon las células intensamente a pesar de su reactividad relativamente moderada con rsCD4, indicando que están involucrados contactos con el (los) sitio(s) sobre el(los) correceptor(es) diferente(s) a CD4, correceptor(es) que junto con CD4 forman al complejo antígeno célula huésped que contiene CD4. Esto se demuestra también por medio de la inhibición de la interacción B4-rsCD4 por parte de diferentes péptidos derivados de CD4 (Tabla 5), indicativa de un complejo antígeno mayor que contiene a la proteína CD4 sobre la superficie de la célula (Figura 3) y una diferencia estructural total entre rsCD4 y el complejo antígeno en la superficie de la célula que contiene CD4.

Inhibición del enlazamiento de gp120 a células CD4 por medio de anticuerpos monoclonales. Las características de enlazamiento para estos anticuerpos monoclonales fueron evaluadas adicionalmente por su habilidad para inhibir el enlazamiento del VIH a las células HPB-ALL que expresan CD4 (Tabla 7(5)) con la condición de una incubación previa de las células con un anticuerpo monoclonal individual (100 \muL con una concentración de saturación de 50 \mug/mL), o PBS como control negativo, seguido por incubación posterior de las células con 100 \muL de gp120 del VIH marcado con FITC a una dilución de 1:200. Se lavaron las células dos veces en medio de las incubaciones con anticuerpos primarios y secundarios marcados.

Para las células incubadas primero con PBS seguido de una incubación posterior con la gp120-FITC, se obtuvo un patrón característico de coloración de agrupaciones pequeñas con una marcación de brillantez de 1+ (Tabla 7 y Figura 3). Tal patrón de coloración característico de HPB-ALL de gp120 con FITC fue obtenido también por las células incubadas primero con anticuerpo monoclonal H5, E31, J33, D5, E2, o I26 seguido de coloración de gp120 con FITC, demostrando así una carencia de inhibición de enlazamiento de gp120 con FITC por estos anticuerpos y sugiriendo una carencia de asociación entre el sitio de enlazamiento de gp120 y los sitios de enlazamiento de estos anticuerpos anti-CD4. Sin embargo, la coloración previa con anticuerpo monoclonal B4, M2 o E6 abolió completamente el patrón de coloración característico de gp120 con FITC, indicando la fuerte naturaleza inhibitoria de estos anticuerpos sobre el enlazamiento CD4-gp120 y sugiriendo asociaciones entre el sitio de enlazamiento de gp120 y los sitios de enlazamiento de B4, M2 y E6. Puesto que a diferencia del anticuerpo E6, B4 o M2 no reconocen al sitio de enlazamiento del VIH (esto es, la región CDR2) sobre la CD4, esta actividad inhibitoria de B4 o M2 se interpretó como impedimento estérico.

Inhibición del enlazamiento del anticuerpo monoclonal a las células que expresan CD4 por medio de gp120. El efecto del enlazamiento previo de gp120 a las células sobre el enlazamiento posterior de las células por medio de estos anticuerpos monoclonales reactivos a CD4, también fue evaluado.

Se incubaron primero 10 x 10^{6} células HPB-ALL con una cantidad excesiva de gp120, 10 \mug, de la cepa IIIB del VIH-1 (American Biotechnologies, Inc., Cambridge, MA), a 37ºC durante 45 minutos. Las células HPB-ALL tratadas con gp120 fueron lavadas dos veces en el amortiguador de lavado y luego incubadas con el anticuerpo monoclonal especificado de acuerdo con el procedimiento indirecto de coloración con inmunofluorescencia descrito aquí anteriormente.

Únicamente se encontró que el enlazamiento de E6 a las células que expresan CD4 estaba completamente abolido por medio del enlazamiento previo de gp120 (Tabla 7, (4)). Se hizo un mapeo al epítopo reconocido por E6 (Tabla 4) cerca de aquellos reconocidos por OKT4A y Leu3A. El enlazamiento de los anticuerpos monoclonales B4 y M2 a las células que expresan CD4 no se vio significativamente afectado por el enlazamiento previo de gp120 a las células que expresan CD4, indicando que estos dos anticuerpos pueden enlazarse a las células que expresan CD4 después del enlazamiento al VIH. Esta observación provee un posible mecanismo para la capacidad de neutralización in vitro del anticuerpo B4 a un nivel de enlazamiento postviral mostrado en el Ejemplo 16 (ver Tablas 16 y 17) y la eficacia in vivo de B4 en la prevención postexposición de la infección por VIH como se demuestra en el modelo de los ratones hu-PBL-SCID (Ver Ejemplo 18, Tabla 20).

Ejemplo 8 Neutralización del Aislado Primario del VIH por medio de los Anticuerpos Monoclonales Resultados

Cuando los nueve anticuerpos monoclonales reactivos a CD4 y el suero anti-rsCD4 de conejillo de indias fueron analizados por su habilidad para neutralizar al aislado primario 23135 del VIH-1 por medio de un ensayo en microplaca de MT-2 como se describe aquí (Ejemplo 1), solamente B4 y M2 demostraron una potente actividad inhibitoria dando origen a una inhibición del 50% a concentraciones de 0,21 y 0,38 \mug/mL, respectivamente (Tabla 7, (6)). El anticuerpo E6, que identifica a un sitio cercano al sitio de enlazamiento de gp120 del VIH, próximo a los sitios reconocidos por OKT4A y Leu3A, y H5 que reconoce principalmente un sitio localizado en la región CDR3 del primer dominio de CD4, produjeron ambos solamente una neutralización marginal con 50% de las concentraciones de punto final de 59 y 45,5 \mug/mL, respectivamente. A diferencia de los anticuerpos monoclonales B4 y M2, los otros anticuerpos monoclonales anti-CD4 auténticos no exhiben una actividad de neutralización significativa del aislado primario de acuerdo a lo medido por la inhibición de la formación de microplaca (esto es, la inhibición de la fisión celular y la infección por el aislado primario del VIH-1). A pesar de la fuerte reactividad del suero anti-rsCD4 de conejillo de indias con la rsCD4, este suero no inhibió la fusión ni la infección celular inducida por el VIH aún a las altas concentraciones de la dilución del suero <1:10.

Ejemplo 9 Inmunización Óptima y Estrategia de Evaluación Selectiva para la Selección del Hibridoma

Con base en la información obtenida de la Tabla 7, se concluye aquí y en la Tabla 2 que la hiperinmunización de ratones con células que expresan CD4 libres de adyuvante lavado en forma reciente conduce a la generación exitosa de hibridomas que segregan anticuerpos altamente reactivos con un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4. Para mejorar la frecuencia de generación de los clones de hibridoma reactivos para las células que expresan CD4, se pueden incubar primero las células HPB-ALL o las SUPT1 con una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigida contra los antígenos de superficie de la células T, incluidos los anticuerpos dirigidos a HLA A-B, C, CD3, al receptor de células T, a los antígenos CD8, CD6, CD2 y CD5, para enmascarar a los antígenos de superficie de HPB-ALL diferentes a los del complejo antígeno que contiene CD4 de la exposición al sistema inmunológico del huésped, dirigiendo así preferencialmente la respuesta inmune del huésped hacia la superficie celular de CD4 que incluye al complejo antígeno que contiene tanto al receptor como al(los) correceptor(es) para el VIH. Una estrategia sencilla de evaluación selectiva en tres etapas incluye primero la selección de hibridomas que tengan reactividad positiva con rsCD4 y/o una reactividad preferencial con rsCD4 preincubada con p2047, un péptido derivado del tercer dominio externo del receptor de quemoquina CC-CKR5, sobre aquel con rsCD4, por medio de los ELISA; seguido por la selección entre los clones reactivos a rsCD4/p2047 y rsCD4 para aquellos que tienen fuerte reactividad con las células que expresan CD4 tales como las células HPB-ALL o SUP-T1 por medio del ensayo indirecto de inmunofluorescencia, seguido por la selección contra los hibridomas de superficie reactivos a CD4 para aquellos anticuerpos que segregan con actividades de neutralización para un aislado primario del VIH-1, como se ensayó por medio de un ensayo estándar de reducción de microplaca de MT2, es útil.

Ejemplo 10 Selección de Anticuerpos Monoclonales Reactivos a CD4 con Propiedades de Enlazamiento Similares a Aquellas de B4

Biotinilación del anticuerpo monoclonal B4 utilizando al éster succinimida. El anticuerpo monoclonal B4 fue purificado por medio de cromatografía de afinidad sobre Proteína A y ajustado a 1 mg/mL en PBS. Se disolvieron 0,71 mg de biotina N-hidroxisuccinimida (Biotin-XNHS, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, Cat. No. 1008960) en 0,31 mL de DMSO (Boehringer Mannheim Biochemicals, Cat. No. 1418165) seguido por la adición 5 mg de B4 en 5 mL de PBS resultando en una relación molar de 50 a 1 para la biotina y B4. Se agitó la mezcla durante dos horas a temperatura ambiente seguido por una diálisis extensiva a 2-8°C contra PBS resultando en una concentración final de B4 de 0,71 mg/mL. La B4 biotinilada fue utilizada como trazador en un ensayo competitivo de coloración por inmunofluorescencia para la inhibición de la interacción de las "células que expresan B4-CD4" por medio de diferentes anticuerpos monoclonales.

Conjugación de peroxidasa de rábano (HRP) al anticuerpo monoclonal B4 por medio del método de peryodato. El procedimiento para la conjugación enzima-anticuerpo fue llevado a cabo esencialmente como lo describen Wilson y Nakane, (Knapp y colaboradores, eds, 1978 Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Immunofluorescence and Related Staining Techniques, p215) en una relación molar de enzima a anticuerpo de 0,48 a 1. El conjugado peroxidasa de rábano (HRP)-B4 fue dializado extensivamente en PBS después de la conjugación con una concentración del anticuerpo resultante de 0,18 mg/mL. Este conjugado fue utilizado en una concentración de 50 \mug/mL en un ELISA competitivo para la inhibición de la interacción de "B4-rsCD4" por medio de diferentes anticuerpos monoclonales anti-CD4.

\newpage

Detección e inhibición competitiva. La Tabla 8 describe los resultados obtenidos a partir de un estudio que involucra inhibición competitiva de la interacción del "complejo que contiene CD4 en la superficie de B4" con nueve anticuerpos monoclonales anti-CD4 (los MAb, B4, M2, E6, H5, J33, E31, D5, E2 e I26) y un suero anti-rsCD4 de conejillo de indias. El estudio de inhibición competitiva se llevó a cabo por medio de un ensayo oaconejillo de indias indirecto de inmunofluorescencia, donde se incubaron 0,5 x 10^{6} células HPB-ALL que expresan CD4 con anticuerpos individuales con una concentración de saturación de 10 \mug/mL de a 100 \muL por análisis o el suero de conejillo de indias a una dilución 1:50 también de a 100 \muL por análisis, cabalmente lavada por medio de una segunda coloración con 100 \muL del biotinilado B4 (con una dilución de 1:1000 a partir de una solución patrón de 0,71 mg B4/mL), cabalmente lavada, seguido de una coloración terciaria con 100 \muL de un trazador de avidita con FITC (Pierce Chemical Co., Rockford IL, Cat. No. 21221) con una dilución de 1:250 en PBS (pH 8,2).

La Tabla 9 describe los resultados obtenidos en un estudio que involucra una inhibición competitiva del estudio de la interacción de "HRP B4-rsCD4" con nueve anticuerpos monoclonales anti-CD4 (los MAb B4, M2, E6, H5, J33, E31, D5, E2 y I26). El estudio de inhibición competitiva se llevó a cabo por medio de un ELISA directo de rsCD4 donde los pozos en fase sólida recubierto con rsCD4 fueron pretratados con el péptido CD4 1624a para reforzar las señales de enlazamiento de B4. Los pozos recubiertos con rsCD4 se incubaron con 30 \muL de anticuerpos individuales (50 \mug/mL de a 100 \muL por pozo) en presencia de 120 \muL del anticuerpo monoclonal B4 conjugado con HRP en concentración de 50 \mug/mL.

Resultados

Como se muestra en la Tabla 8, entre todos los anticuerpos monoclonales y el suero anti-rsCD4 de conejillo de indias analizado, únicamente B4 o M2 inhibieron efectivamente la coloración de B4 con botina (con una dilución de 1:1000) y la avidita con FITC (Pierce Chemical Co., con una dilución 1:250) de las células HPB-ALL en un sistema de análisis indirecto de inmunofluorescencia. En las similitudes como las mostradas en la Tabla 9, de todos los anticuerpos monoclonales analizados, únicamente los anticuerpos monoclonales M2 y B4 ejercieron una inhibición mayor al 45% sobre el enlazamiento de HRP-B4 a la molécula rsCD4 en el ELISA para rsCD4. Por lo tanto, la selección efectiva de los anticuerpos que segregan hibridoma que tienen propiedades de enlazamiento similares a aquellas de B4, incluida su actividad de neutralización contra aislados primarios del VIH, se puede lograr a través de inmunoensayos de competición utilizando B4 biotinilado o conjugado con HRP como el trazador, un proceso de selección que es significativamente más fácil que la selección por medio de ensayos funcionales in vitro tales como el ensayo de neutralización en microplaca de MT-2. Más importante, ninguno de los siete anticuerpos monoclonales anti-CD4 auténticos (esto es, los MAb, E6, H5, J33, E31, D5, E2 e I26) pueden competir efectivamente con B4 por reactividad con rsCD4 y los sitios de enlazamiento del complejo receptor de superficie CD4 (Tablas 8 y 9).

TABLA 8

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TABLA 9

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1.: El ELISA por competición se llevó a cabo con placas recubiertas con rsCD4 con una concentración de 0,25 \mug/mL y 0,1 mL por pozo, a 4ºC durante la noche. Se trató la placa con un péptido sintético CD4 p1624a (Tabla 1) a 50 \mug/mL y 100 \muL por pozo, a 37ºC durante 1 hora para mejorar la reactividad.

2.: Los anticuerpos monoclonales fueron analizados individualmente por la inhibición competitiva del enlazamiento del anticuerpo monoclonal B4 conjugado con peroxidasa (B4-HRP) a rsCD4. Se mezclaron 120 \muL de B4-HRP en una concentración de 50 \mug/mL con 30 \muL de anticuerpo monoclonal analizado en una concentración de 50 \mug/mL. Se utilizaron 30 mL de PBS en vez de un anticuerpo monoclonal analizado como control. Se transfirieron 100 \muL por pozo de la mezcla a la placa recubierta con rsCD4 para analizar la interactividad "B4-HRP-rsCD4".

3.: El % de inhibición se calculó como: [(A492nm de PBS de Control - A492 nm de la Muestra que contiene Mab competidor) + A492 nm de PBS de Control] x 100

Ejemplo 11 Inhibición de la interacción "B4-rsCD4" pero no del "Complejo que Contiene CD4 en la superficie-B4" por medio de rsCD4: Mab es Reactiva con un Complejo Antígeno Célula Huésped que Contiene CD4 Resultados

La Tabla 10 describe los resultados obtenidos a partir del estudio que involucra la inhibición competitiva de la interacción "B4-rsCD4" en un sistema de ELISA indirecto para rsCD4 empleando rsCD4 como antígeno en fase sólida (0,25 \mug/mL, 0,1 mL/pozo, 4ºC, recubrimiento durante la noche), y B4 purificado en una concentración de 2 \mug/mL, 0,1 mL/pozo dando origen a una lectura de A492 nm de 0,679 como el control positivo. Las concentraciones crecientes de rsCD4 desde el rango de 0,008 hasta 25 \mug/mL fueron preincubadas con B4 purificada durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la incubación con rsCD4 en fase sólida. Como se muestra en la Tabla 10, la premezcla de 1 \mug/mL de rsCD4 con 2 \mug/mL de B4 inhibirá el 50% de la interacción entre B4 y rsCD4 en fase
sólida.

La Tabla 11 describe los resultados obtenidos en un estudio que involucra inhibición competitiva de la interacción del "complejo que contiene CD4 de superficie-B4 Biotinilado" en un ensayo indirecto de inmunofluorescencia empleando HPB-ALL (0,2-0,5 x 10^{6} células por análisis en 0,1 mL) como células objetivo y B4 biotinilada a una concentración de 0,71 \mug/mL, 0,1 mL por ensayo, que dio una proporción positiva del 95% de células con una intensidad de coloración de 3+. Las concentraciones crecientes de rsCD4 desde el rango de 0,005 hasta 50 \mug/mL fueron preincubadas con la B4 biotinilada durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la incubación con las células HPB-ALL que expresan CD4. Como se muestra en la Tabla 11, en contraste con el sistema de ELISA para rsCD4, no se observó inhibición para la coloración de B4 de las células HPB-ALL cuando se añadió rsCD4 aún hasta la concentración de 50 \mug/mL. Esta reactividad demuestra un nuevo sitio de reconocimiento para B4 del complejo antígeno de superficie celular que contiene CD4, en comparación con el sitio de CD4 que no formó complejo de anticuerpos anti-CD4 auténticos. Este resultado fue confirmado por medio de la coloración de inmunofluorescencia de las células HPB-ALL para los monoclonales anti-CD4 auténticos que fueron completamente removidos por medio de una preabsorción con rsCD4 (no se muestran los datos).

Todas las observaciones sobre las reactividades de enlazamiento de los monoclonales reactivos CD4 con rsCD4, de los péptidos sintéticos derivados de CD4, y de las células HPB-ALL que expresan CD4, se pueden resumir en los siguientes cuatro hallazgos principales:

(1): como se muestra en la Tabla 4, los MAb B4 y M2 reaccionaron moderadamente con rsCD4 que se parece a una reactividad parcial con la molécula mientras que cinco (esto es, E6, H5, J33, E2 e I26) de los siete monoclonales anti-CD4 auténticos y el suero anti-rsCD4 de conejillo de indias lo alcanzaron más firmemente con rsCD4 en un ELISA para rsCD4;

(2): como se muestra en la Tabla 7, todos lo monoclonales anti-CD4 auténticos y el suero anti-CD4 de conejillo de indias reaccionaron débilmente con las células HPB-ALL con un patrón característico de enlazamiento por "parches" (patrón B), distinto del patrón en "caperuzas" de los MAb B4 y M2 (patrón A);

(3): como se muestra en la Tabla 8, la preincubación de las células HPB-ALL que expresan CD4 con los monoclonales anti-CD4 auténticos con una concentración de saturación de 20 \mug/mL o el suero anti-rsCD4 de conejillo de indias en una dilución de saturación de 1:50 no inhibió el posterior enlazamiento de B4 biotinilado a las células HPB-ALL mientras que los MAb B4 y M2 lo hicieron; y

(4): como se muestra en las Tablas 10 y 11, se logró una inhibición de 50% de la interacción "B4-rsCD4" con 2 \mug/mL de B4 con una concentración de 1 \mug/mL de rsCD4 mientras que se observó que no hubo inhibición en la interacción del "complejo antígeno célula huésped que contiene B4-CD4" con 0,71 \mug/mL de B4 biotinilado aún con una concentración de 50 \mug/mL de rsCD4.

Con base en los cuatro hallazgos anteriores, se concluyó que las especificidades de enlazamiento de los MAb B4 y M2 se distinguen fácilmente de aquellas de los anticuerpos anti-CD4 auténticos por medio de la inclusión de sitios que se extienden más allá que los de la proteína CD4 sola para incluir un complejo antígeno de superficie célula huésped que contiene CD4, con CD4 constituyendo únicamente una parte de aquel complejo antígeno célula
huésped.

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TABLA 10

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TABLA 11

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Ejemplo 12 Generación de Anticuerpos Monoclonales de Ig Humana Derivados de Ratones Transgénicos HC1 y/o HC2 Inmunizados con Células de una Línea de Células T Humanas que Expresan CD4

Este ejemplo describe la generación de hibridomas humanos a partir de ratones homocigotos para un locus inactivado de inmunoglobulina endógena y que contiene secuencias transgénicas humanas que codifican una cadena pesada humana y una cadena liviana humana. Los hibridomas generados a partir de estos ratones transgénicos inmunizados con una línea de células T humanas que expresan CD4 de acuerdo al esquema de inmunización descrito en el Ejemplo 3 segregan anticuerpos monoclonales que contienen una cadena pesada de una secuencia humana y una cadena liviana de una secuencia humana. A partir de estos hibridomas se seleccionan los clones, de acuerdo con el algoritmo descrito en la Tabla 12, que segregan anticuerpos que se enlazan a un complejo antígeno célula huésped que contiene a la proteína CD4 con una amplia actividad de neutralización cruzada dirigida contra aislados primarios del VIH-1 a partir de todos los clados y aislados primarios diversos del VIH-2 y VIS, y que tienen propiedades similares de enlazamiento del anticuerpo como aquellas del anticuerpo monoclonal B4.

TABLA 12

17

Más específicamente, se inmuniza un ratón transgénico caracterizado ya sea por tener el genotipo de HC1 o de HC2 como lo describen Smith y colaboradores en WO 93/12227, homólogo para un locus J_{H} funcionalmente desorganizado y se recoge un transgén capaz de reordenamiento para codificar a una cadena pesada de una secuencia humana y a un transgén capaz de reordenamiento para codificar a una cadena liviana de una secuencia humana, con células de una línea de células T leucémicas humanas que expresan CD4, HPB-ALL. Se introducen aproximadamente 5-10 x 10^{6} células en 100 \muL de PBS en un ratón a través de una inyección ya sea intraperitoneal, o más preferiblemente intravenosa o ambas, el día 0. Se repite la inmunización en cada una de las otras semanas al menos cuatro veces con la última inmunización realizada tres días antes de la fusión. Se remueve el bazo y se fusionan aproximadamente 150 x 10^{6} células del bazo aproximadamente a 30 x 10^{6} células asociadas de fusión (línea celular P3x63Ag8.653; ATCC) por medio de métodos estándar (fusión PEG) de acuerdo con Kohler y Milstein, Nature, 1975, 256:495-97. También se pueden llevar a cabo múltiples fusiones en semanas posteriores, cada una siguiendo refuerzos cada dos semanas y/o mensuales y siendo tres días después de un refuerzo intravenoso final.

Se desarrollan los hibridomas y se analizan los sobrenadantes por medio de ELISA para el enlazamiento a rsCD4 como se describe en el Ejemplo 3. Se detectan los anticuerpos humanos con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa dirigidos contra inmunoglobulinas humanas.

Los hibridomas primarios son células sencillas clonadas por medio de dilución limitante y evaluados por la secreción de anticuerpos monoclonales humanos reactivos con rsCD4. Para determinar si estos anticuerpos monoclonales también reconocen al complejo antígeno célula huésped que contiene a la proteína CD4, se analizan los clones reactivos a rsCD4 de los sobrenadantes por una reactividad similar a aquella de B4 con células de la línea celular HPB-ALL o SUP-T por medio de coloración indirecta de inmunofluorescencia.

El buen desarrollo y los altos niveles en la producción de anticuerpo monoclonal son también factores importantes en la escogencia de una línea celular clonal de hibridoma para desarrollo.

Entre los clones que segregan anticuerpos reactivos tanto con rsCD4 como con células que expresan CD4 y que se desarrollan bien y segregan altos niveles de anticuerpo, los sobrenadantes de estos clones se analizan además por su actividad neutralizante dirigida contra aislados primarios del VIH. Más específicamente, ellos se analizan en un ensayo de neutralización en microplaca por MT2 como se describió anteriormente tanto para las diluciones con punto final al 50% como al 90%, comenzando con una dilución 1:2 contra, por ejemplo, el aislado primario 23135 de clados B del VIH-1. Solamente aquellos que demuestren una fuerte actividad neutralizante del VIH-1 se seleccionan para subclonación adicional. Los hibridomas seleccionados segregan inmunoglobulinas humanas con actividades de enlazamiento específicas para epítopos conformacionales discontinuos diseminados sobre un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 que tiene una potente actividad neutralizante contra aislados primarios del VIH y VIS. Estos anticuerpos monoclonales humanos son anticuerpos candidatos para ser utilizados en profilaxis pre y postexposición de la infección por VIH.

Ejemplo 13 Demostración de la Amplia Actividad de Neutralización del Clado Entrecruzado del VIH-1 de un Anticuerpo Dirigido Contra un Complejo Antígeno Célula Huésped que Contiene CD4 Resultados

Las actividades de neutralización de los anticuerpos fueron comparadas sobre la cepa MN de laboratorio y sobre los aislados primarios indicados que representan a los clados A, B, C, D y E del VIH-1. Estos aislados primarios se desarrollaron sobre los PBMC, mientras que el MN del VIH-1 se desarrolló sobre células H9 como se describe en el Ejemplo 1. Los ensayos de neutralización se hicieron por medio del método en Microplaca del MT-2 (Ejemplo 1) y los resultados se representan en la Tabla 13.

La Tabla 13 compara las actividades de neutralización del clado cruzado del VIH-1 de los anticuerpos monoclonales de los grupos 5, 9, y 15 del Ejemplo 4 (Tabla 3) de la IgG b12 del anticuerpo monoclonal BS-CD4 de \alpha gp120 descrita en el Ejemplo 1 (Tabla 2), del anticuerpo policlonal de V3 N-terminal anti-gp120 del grupo 6 del Ejemplo 2 (Tabla 3) y un anticuerpo monoclonal de V3 N-terminal anti-gp120 de murino comercialmente disponible con especificidad por las secuencias de V3 N-terminales de la mayoría de las cepas de clado B del VIH-1, MAb 50.1, MAb 50.1 (Repligen Corporation, Cambridge, MA) surgió contra un inmunógeno de péptido sintético derivado de la punta del bucle de V3 N-terminal de gp120 del MN del VIH-1. El epítopo reconocido por este MAb ha sido definido como Lys-Arg-Ile-X-Ile-Gly-Pro (Wrin y colaboradores, J. Virol, 1995, 69:39-48).

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El anticuerpo único B4 (grupo 5) neutralizó fuertemente a los aislados primarios de los clados A-E del VIH-1 mientras exhibía una actividad de neutralización más débil contra MN, la cepa adaptada en el laboratorio. Combinando B4 con otros anticuerpos anticelulares y V3 anti-N-terminal sirvió solamente para diluir la actividad neutralizante de B4 contra los aislados primarios (grupos 9 y 15). El otro anticuerpo que es efectivo contra aislados primarios, IgG1 b12, que se enlaza al sitio de enlazamiento de la CD4 de la gp120, exhibió un patrón más débil de neutralización cruzada del clado para los aislados primarios que el de B4 (grupo "IgG1 b12"), mostrando una actividad de neutralización relativamente débil únicamente par aislados primarios de los clados A, B y D. Neutralizó únicamente uno de los dos aislados primarios del clado B. En contraste, los anticuerpos de V3 anti-N-terminal, tanto MAb 50.1 como MN V3 anti-N-terminal policlonal (grupos 6 y "MAb 50.1"), fueron potencialmente neutralizados por la cepa adaptada de laboratorio mientras que hubo poca neutralización de los aislados primarios, incluyendo al aislado primario del clado B homotípico. La potente neutralización tanto de la cepa de laboratorio como de los aislados primarios se obtuvo únicamente por medio de la combinación del anticuerpo único B4 con el anticuerpo V3 anti-N-terminal (grupo 15).

En conclusión, los anticuerpos V3 N-terminales anti-gp120 exhibieron neutralización preferencial por la cepa adaptada de laboratorio mientras que el anticuerpo único B4 de la invención exhibió neutralización preferencial por los aislados primarios de los clados A-E. También, en comparación con el anticuerpo \alpha gp120 CD4-BS, que es uno de los pocos anticuerpos en haber mostrado previamente tener actividad de neutralización cruzada del clado contra ciertos aislados primarios del VIH-1, el anticuerpo de la invención fue el único en haber mostrado una fuerte actividad neutralizante a través de todos los aislados primarios que representan a los clados A, B, C, D y E del VIH-1.

Ejemplo 14 Demostración de la Actividad de Neutralización del VIH-2 y de VIS del Anticuerpo Único Procedimientos específicos para la determinación de la neutralización del virus por medio del anticuerpo

Ensayo de Neutralización del Antígeno p27. Las cepas de virus valorados se mezclan con diluciones seriales de anticuerpo y luego se las utiliza para infectar a los PBMC humanos estimulados por mitógeno, y las células infectadas se cultivan durante cinco días (Gardner y colaboradores, AIDS Res Hum Retroviruses, 1995, 11:843-854). La infectividad máxima del virus y la neutralización se cuantifican por medio de la determinación del antígeno VIS p27 acumulado por los cultivos de PBMC por medio de ELISA para p27 (Coulter VIS p27 EIA, Coulter Immunology, Hialeah, FL). La actividad de neutralización se expresa como las concentraciones de anticuerpo que resultan en las reducciones indicadas en porcentaje en la acumulación de p27 comparadas con la concentración de p27 en cultivos no tratados (máximo).

Ensayo de Reducción de Infectividad (IRA). El IRA se llevó a cabo (White-Scharf y colaboradores, Virology, 1993, 192:197-206). Se llega a las determinaciones de neutralización del IRA por medio de la variación de la carga viral utilizada para infectar a los PBMC, en presencia de una cantidad fija de anticuerpo, en este caso 10 \mug/mL. Los resultados del IRA se expresan como unidades infecciosas inactivadas >95% por 10 \mug/mL de anticuerpo.

Virus. VIH-2_{ROD} es una cepa clonada desarrollada sobre células H9 (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog no. 207). VIH-2287, un aislado primario, se obtuvo a partir del plasma de un mono infectado experimentalmente, SIV_{251}, SIV_{239}, y los VIH-1/VIS recombinantes SHIV_{IIIB}, y SHIV_{89.6} son cepas de laboratorio pasadas a líneas de células T humanas, suministradas por David Montefiori (Duke University, Durham, NC). Una cepa de SIV_{251} había sido pasada en los PBMC de primates. SHIV_{IIIB} recombinante, y SHIV_{89.6} son VIS con las envolturas del VIH-1 derivadas de las cepas indicadas de clado B del VIH-1.

Resultados

El experimento mostrado en la Tabla 14 compara las actividades de neutralización de B4 (grupo 5 de la Tabla 3, Ejemplo 4) y de MN V3 anti-N-terminal policlonal (grupo 6 de la Tabla 3) contra diferentes aislados del VIH-2, VIS, y VIHS recombinante. Las designaciones de los aislados son como las mostradas en la tabla. Las determinaciones de la neutralización sobre el VIH-2287 se hicieron por medio del Ensayo de Reducción de la Infectividad (IRA) (White-Scharf y colaboradores, Virology, 1993, 192:197-206). Los resultados del IRA se expresan como unidades infecciosas inactivadas >95% por 10 \mug/mL de anticuerpo. Las actividades de neutralización sobre VIH-2_{ROD} se determinaron por medio de ensayos de MT-2 como se describe en el Ejemplo 1. Los ensayos de neutralización sobre SIV_{251}, SIV_{239}, y los VIH-1/VIS recombinantes SHIV_{IIIB}, y SHIV_{89.6} se determinaron por medio del Ensayo de Neutralización del Antígeno p27 (Gardner y colaboradores, AIDS Res Hum Retroviruses, 1995, 11:843) de los cultivos infectados de PBMC hasta el punto final del 50%, excepto para un conjunto de determinaciones de neutralización para B4 sobre SIV_{251} cultivado sobre PBMC que se llevaron a cabo hasta un punto final del 80%. Los puntos finales al 50% y al 80% son las fracciones de p27 detectables en cultivos tratados con anticuerpo comparado con los cultivos no tratados.

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B_{4} exhibió neutralización para todas las cepas de VIH-2, VIS, y VIHS mostradas en la Tabla 14. En comparación, la neutralización por medio del anticuerpo anti-N-terminal V3 MN previamente mostró ser efectivo sobre la MN del VIH-1adaptada en laboratorio (Ejemplos 1 y 13, Tablas 2 y 13) no fue evidente para ninguno de los VIHS recombinantes a pesar del estatus adaptado en el laboratorio de estas cepas recombinantes. Por lo tanto, es evidente que la actividad cruzada de neutralización de un anticuerpo único y potencialmente neutralizante que se extiende hasta el VIH-2 y VIS, ya sea adaptada en el laboratorio o un aislado primario, ya sea desarrollado sobre líneas de células T o los PBMC, es una propiedad diferente de esta invención.

Esta observación muestra que los anticuerpos de la invención pueden ser analizados en forma útil en el modelo de la infección del animal macaco rhesus por el VIS y los modelos de la infección del animal macaco cola de cerdo por el VIS y el VIH-2, para analizar los anticuerpos por la eficacia protectora.

Ejemplo 15 Demostración de la Actividad de Neutralización de un Anticuerpo Único para el VIH-1 Adaptado al Chimpancé Resultados

Las actividades de neutralización del B4 y del previamente caracterizado IgG1 b12 (sitio de enlazamiento del anti-gp120 CD4) se compararon sobre un aislado primario de campo del VIH-1 del clado B, VIH-1 DH-12, desarrollado en los PBL de chimpancé y los resultados presentados en la Tabla 15.

Se determinó la neutralización tanto para el método del IRA como para el método del MT-2 para B4 y únicamente por medio del método del IRA para IgG1 b12. Los resultados del IRA se expresan como unidades infecciosas inactivadas >95% por 10 \mug/mL de anticuerpo para B4 y como unidades infecciosas inactivadas >95% por 25 \mug/mL de anticuerpo para IgG1 b12.

La comparación de los resultados actuales del ensayo para MT-2 con los resultados de las Tablas 3 y 13 (grupo 5) muestra que un anticuerpo reactivo único para CD4, B4, exhibió una actividad de neutralización comparable contra el VIH-1 adaptado al chimpancé como para las cepas primarias desarrolladas para PBMC humano. La comparación de los resultados del IRA sugiere que B4 exhibe más de un orden de magnitud de más actividad neutralizante contra el VIH-1 adaptado al chimpancé que el anticuerpo IgG1 b12 del sitio de enlazamiento anti-gp 120 CD4. Por lo tanto, un anticuerpo de la invención es claramente más activo contra el VIH-1 adaptado al chimpancé que es el mejor de los anticuerpos monoclonales conocidos previamente que tienen actividad neutralizante aislada primaria.

Estos resultados indican que un anticuerpo de la invención puede ser probada en forma útil en el modelo in vivo de chimpancé para la infección por el VIH, para analizar la eficacia protectora.

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TABLA 15

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Ejemplo 16 Cinéticas de Neutralización por medio de B4 de los Aislados primarios del VIH-1 Resultados

Las Tablas 16 y 17 describen las cinéticas de neutralización por medio de B4 sobre 23135 del VIH-1, un aislado primario de campo del clado B. La Tabla 16 muestra las cinéticas de neutralización para dos concentraciones de B4, 2 y 20 \mug/mL, como los añadidos durante intervalos de 0 a 24 horas después de la adición del virus, utilizando el Ensayo en Microplaca para MT-2. La neutralización se expresa como porcentaje de supervivencia de las diluciones indicadas del virus. La Tabla 17 describe las cinéticas de neutralización de 23135 del VIH-1 por medio de 20 \mug/mL de B4, como los añadidos durante un período de tiempo de 0 a 96 horas transcurrido después de la adición del virus a las células. El tiempo extendido transcurrido necesitó del uso de un Ensayo de Neutralización del Antígeno p24 para la determinación de la actividad de neutralización contra el virus entrante de las diluciones indicadas (Wrin y colaboradores, J Virol, 1995, 69:39-48). En este ensayo p24, se utilizan diluciones seriales de virus valorados para infectar a los PBMC y se cultivan las células infectadas durante cuatro días. Se añade anticuerpo en las concentraciones indicadas y en los períodos indicados. La infectividad y neutralización del virus se cuantifica por medio de la determinación del antígeno p24 acumulado por los cultivos de PBMC por medio del ELISA para p24 (Coulter Immunology, Hialeah, FL). Los resultados se expresan como el porcentaje de p24 detectable en cultivos tratados con anticuerpo, comparado con la concentración de p24 en cultivos no tratados, esto es, los resultados son equivalentes al porcentaje de virus sobreviviente por recuento en microplaca aunque la detección de p24 está más afectada por el ambiente.

La Tabla 16 muestra que el B4 neutraliza completamente al virus entrante en una concentración de 2 \mug/mL hasta 1 hora después de la infección. A una concentración de 20 \mug/mL, el anticuerpo es efectivo más allá de 24 horas. La Tabla 17 muestra los resultados cuando el tiempo transcurrido se extendió hasta 96 horas y muestra una neutralización efectiva por medio de 20 \mug/mL de B4 para la entrada de anticuerpo hasta 48 horas después de la infección. Estos resultados demuestran que un anticuerpo único puede evitar el establecimiento de una infección in vitro aún después de que las células han sido expuestas al virus y sugiere que tal anticuerpo puede ser efectivo para el tratamiento profiláctico después de la exposición al VIH.

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TABLA 16

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TABLA 17

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Ejemplo 17 Inmunización Pasiva de Macacos Rhesus Contra la Infección del VIS_{mac251} Procedimientos específicos para la determinación de la protección contra la infección del VIS

Los estudios anteriores sobre la actividad de neutralización de los anticuerpos de la presente invención caracterizan la concentración, las cinéticas, y la amplitud extendida de B4 para la neutralización de los aislados primarios del VIH-2 y del VIS, así como los aislados primarios de todos los clados del VIH-1. Aquellas caracterizaciones in vitro, junto con el alto grado de conservación entre las secuencias CD4 de las especies primates, sugiere una alta probabilidad para la eficacia protectora in vivo para la modalidad con B4 de la invención contra la infección por causa de los 3 virus de inmunodeficiencia. Por lo tanto, se evaluó la eficacia protectora de la invención por medio de una prueba retadora de B4 contra la infección experimental de macacos rhesus con VIS, y un excelente modelo animal para el SIDA
humano.

Reserva de Virus y Reto in vivo del VIS. La reserva de virus utilizado para retar fue el prototipo de la cepa VIS_{mac251} obtenido con R. Desrosiers (New England Regional Primate Research Center, Southborough MA). Todos los retos fueron inoculaciones intravenosas aproximadamente con 10 AID_{50} del aislado no clonado del VIS_{mac251} producido en los PBMC de Rhesus (Desrosiers y colaboradores, PNAS USA, 1989, 86:6353-6357). A ambos monos no inmunizados del grupo de control se les administró la misma dosis intravenosa de esta reserva de virus y se encontró que eran infectados en forma persistente. Se les hizo sangrado periódico a los animales después del reto y se hizo monitoreo para el establecimiento de la infección por medio de pruebas serológicas para la antigenemia y la seroconservación del virus, y por medio del cocultivo de los PBMC y plasma para la detección del virus.

Ensayos serológicos del VIS. Se detectó la seroconservación como resultado de la infección por el VIS por medio de un inmunoensayo enzimático (EIA) que se basa en un antígeno del péptido del VIH-2 (HZV-1,2 EIA; United Biomedical, Inc., Hauppauge NY) que es reactivo en forma cruzada para el VIS y que puede ser utilizado para determinar un punto final de valoración para los anticuerpos del plasma para la región inmunodominante amino terminal (aminoácidos 588-603) de la proteína transmembrana del VIS (gp36).

Ensayo del Antígeno p27 del VIS. Se utilizó un EIA para la captura del antígeno con base en un anticuerpo monoclonal específico para el VIS (Coulter Immunology, Hialeah, FL) para detectar in vitro e in vivo una infección productiva del virus. Los resultados positivos in vivo se indicaron por medio de valores > 0,05 ng/mL para plasma no diluido.

Aislamiento del VIS y ensayos de dilución hasta punto final. Se separaron los PBMC de Rhesus a partir de sangre entera sobre gradientes de Ficoll-Hypaque. Se añadieron dos mililitros de plasma clarificado no diluido o los PBMC separados a los PBMC humanos estimulados por mitógeno. Se mantuvieron los cultivos con medio de crecimiento RPMI-1640 que contenía suero fetal de ternera al 10% (Sigma, St. Louis, MO), suplementado con 20 U/mL de IL-2 y 200 U/mL de antiinterferón a (ambos de Collaborative Research, Waltham, MA), 2-mercaptoetanol 2,5 x 10-2 mM y 2 \mug/mL de polibreno (ambos de Sigma) y mantenidos a 37ºC, 5% de CO_{2}. Se analizaron los sobrenadantes del cultivo dos veces a la semana hasta por 4-6 semanas por la presencia de antígeno p27. Se determinó que un cultivo era positivo sí las muestras de sobrenadante de las tres fechas consecutivas eran positivas para el antígeno p27 (EIA de Coulter para p27 del VIS, Coulter Immunology, Hialeah, FL). Para la cuantificación del VIS infeccioso en los PBMC de mono, se diluyeron en forma serial los PBMC y se los cocultivó en forma similar a los PBMC humanos. Los cultivos para los ensayos de dilución hasta punto final se terminaron el día 14 y se analizaron por el
antígeno p27.

Diseño y Métodos. Los seis monos que se utilizaron para el estudio que se describe más abajo fueron adultos criados en colonias y macacos rhesus adultos jóvenes de los TSI Primate Center Mason Laboratories (Worcester, MA). Ellos eran seronegativos para los anticuerpos de VIS, VRS-1, VRS-2, VRS-5 y VLTS-1. Estos animales fueron alojados de acuerdo con la American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care Standards y los investigadores inscritos en la Guía para el Cuidado y el Uso de los Animales para Laboratorio preparada por el Comité sobre el Cuidado y el Uso de Animales para Laboratorio del Institute of Laboratory Resources, NRC, Washington D.C. Se repartieron los animales en forma aleatoria dentro de grupos de control y tratamiento de acuerdo con el
peso.

A los dos monos del Grupo 1 se les suministró PBS y a los cuatro monos en el Grupo 2 se les suministró 4 mg/kg de MAb B4, purificado por medio de cromatografía de afinidad en columna de proteína A, por medio de infusión intravenosa 1 hora antes del reto viral intravenoso por 10 AID_{50} de VIS_{mac251}.

Resultados

Se recolectó sangre pretratada, preretada, 1 hora, 1, 3, 15, 22, 29 y 36 días después del reto. Se encontró que el nivel en suero del anticuerpo del receptor anti-CD4/quemoquina, determinado para todas las muestras por medio del inmunoensayo enzimático para rsCD4, disminuye hasta la mitad del valor máximo 1 día después de la infusión, muy probablemente debido a la penetración por, y a la saturación del enlace de las células T de mono que expresan CD4 tanto en sangre periférica como en tejidos linfoides. En los días 15, 22 y 29, se recolectaron las muestras de plasma de todos los monos y se las analizó para el antígeno p27 por medio del Ensayo del Antígeno p27 del VIS.

El día 15, tanto los monos del grupo de control (Nos. 170 y 110 del grupo 1) se encontró que estaban infectados como se demostró por medio de una serología positiva para el antígeno p27 del VIS (Tabla 18). En comparación, para el día 15, únicamente 1 (No. G4B) de los 4 monos en el grupo experimental 2 que recibió 4 mg/kg de B4 se infectó (Tabla 18).

Posteriormente se analizaron las muestras de plasma recolectadas de todos los monos los días 22 y 29 por medio de inmunoensayos para p27. Esos resultados confirmaron el estado de antigenemia del VIS de los monos observados el día 15.

Otro parámetro para la evaluación de la infección por el VIS fue monitorear el estado inmunológico de los animales por seroconversión para la reactividad del VIS. Ambos monos en el grupo 1 de control desarrollaron anticuerpos anti-VIS como se detecta por medio del ensayo EIA del VIH 1,2 (VIS), comenzando 2-3 semanas después del reto viral (Tabla 19). A la seropositividad se le dio puntuación como estando más arriba de un valor límite de 4 veces la absorbancia de los sueros de control no reactivos (NRC) de macacos no retados no inmunizados. La seroconversión se muestra subrayada en la Tabla 19. La absorbancia de un Control Fuertemente Reactivo (SRC) se muestra por referencia. Los tres monos protegidos en el grupo experimental 2 (DW3, GN-terminal V3 y NU3) permanecieron seronegativos durante todo el período analizado. Por lo tanto, el único mono (G4B) del grupo experimental que se encontró infectado con VIS por antigenemia p24, se encontró que había desarrollado también anticuerpos anti-VIS durante este período.

Se recolectaron también los PBMC de rhesus de cada uno de los 6 monos en ambos grupos los días 15, 22 y 29. Se combinaron las muestras de plasma y de PBMC de esos días con los PBMC humanos estimulados por mitógeno para la detección de la infección por el VIS por medio de un cultivo viral. Se continuó el cultivo durante tres semanas y se analizaron los sobrenadantes de estos cocultivos por la presencia de antígeno p27. Nuevamente, ambos monos del grupo de control (Nos. 170 y 110) y el mono no protegido (GB4) del grupo experimental mostraron estar infectados como lo evidenciaron los resultados positivos del cultivo del virus tanto de las muestras de plasma como de PBMC (Tabla 18).

Conclusiones. Estos resultados demostraron que la inmunización pasiva de macacos rhesus con anticuerpo monoclonal B4 con una dosis modesta (4 mg/kg) efectivamente protege a la mayor parte de los monos (75%) de infección por medio de un aislado primario del VIS, después del reto con una dosis de VIS_{mac251}, una dosis que ha causado efectivamente infección persistente en todos los animales históricos de control en 2 de cada 2 animales de control en el presente estudio.

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TABLA 18

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TABLA 19

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Ejemplo 18 Protección Pre y Postexposición contra Aislados primarios de la Infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humana Mediada por el Anticuerpo Monoclonal B4

En soporte del concepto de inmunoprofilaxis contra la infección por el VIH-1, los anticuerpos monoclonales (MAb) y el suero policlonal han mostrado que protegen a los primates no humanos y a los ratones SCID reconstituidos con linfocitos de sangre periférica humana (hu-PBL-SCID) de la infección con VIH-1 (Emini y colaboradores, J Virol, 1990, 64:3674; Prince y colaboradores, AIDS Res Hum Retroviruses, 1991, 7:971; Emini y colaboradores, Nature, 1992, 355:728; Safrit y colaboradores, AIDS, 1993, 7:15) y SIV (Putkonen y colaboradores, Nature, 1991, 352:436; Lewis y colaboradores, Vaccine, 1993, 11: 1347). Se encontró en esos estudios que utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra antígenos virales, sin embargo, que neutralizan únicamente a las cepas de laboratorio derivadas de la línea celular T pero no a los aislados primarios de virus de inmunodeficiencia.

En este estudio, se utilizó al anticuerpo monoclonal B4 para determinar si la inmunización pasiva por medio de un anticuerpo monoclonal de la presente invención, esto es, un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítopo conformacional esparcido en forma discontinua presente sobre un complejo antígeno célula huésped que contiene la proteína CD4 y al receptor de quemoquina y que tienen amplia actividad de neutralización contra todos los aislados primarios del VIH, es protector in vivo contra la infección causada por un aislado primario del VIH-1. El éxito de este estudio fue demostrar que la administración de B4 puede proteger a los ratones con inmunodeficiencia severa combinada (SCID) trasplantada con leucocitos de sangre periférica humana normal (hu-PBL), denominados ratones hu-PBL-SCID, del reto posterior con un aislado primario del VIH que previamente mostró ser resistente a la neutralización. Se escogió al modelo de ratón hu-PBL-SCID por esta evaluación de la eficacia debido a que pueden hacerse muchos grupos experimentales que involucran a múltiples animales con un costo razonable en un tiempo relativamente corto, ventajas estas que no son ofrecidas por el único modelo animal alternativo para los estudios de protección por el reto del VIH-1, la infección por medio del VIH-1 de los chimpancés.

Procedimientos específicos para la reconstitución del sistema inmunológico humano en ratones SCID y la determinación de la protección de la infección por el VIH-1

Los MAb. El anticuerpo de control utilizado en este estudio fue una IgG_{2a} murina, un anticuerpo de especificidad de enlazamiento desconocida, segregado por la línea de células RPC5.4 (ATCC No. TIB12) de mieloma de ratón. Tanto B4 como IgG_{2a} RPC5.4 se purificaron de fluidos de ascites por medio de cromatografía de afinidad en columna sobre proteína A, y se resuspendieron en PBS estéril en una concentración de 2 mg/mL antes de sus uso. Todos los anticuerpos fueron suministrados a ratones hu-PBL-SCID por medio de una inyección intraperitoneal (i.p.).

Reconstitución de ratones con SCID. Los ratones CB.17 scid/scid utilizados en este estudio se mantuvieron bajo condiciones específicas libres de patógenos. Los ratones del fenotipo que no gotea fueron reconstituidos por medio de una inyección i.p. de 2 x 10^{7} PBL humana normal aislada en forma fresca suspendida en 0,5 mL de PBS. Dos semanas después de la inyección de PBL, se confirmó la reconstitución por medio del análisis del suero de los ratones por la presencia de inmunoglobulinas humanas por medio de ELISA (SangStat, Menlo Park, CA). Solamente se utilizaron los ratones positivos para inmunoglobulina humana para los estudios de infección por VIH-1.

Patrones Virales. Se prepararon patrones de virus AD6 del VIH-1 a partir de los sobrenadantes de PBL infectados de acuerdo con lo descrito (Ho y colaboradores, N Engl J Med, 1989, 321:1621-5) y valorados por infectividad en ratones hu-PBL-SCID. Ellos se expresan como el 50% de la dosis patógena para el ratón (MID_{50}) por mililitro.

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Ensayo de neutralización del virus. Las neutralizaciones del VIH-1 se llevaron a cabo por medio de un ensayo p24 como se describió (Ho y colaboradores, J Virol, 1991, 65:489-493). La neutralización se define como el porcentaje de reducción en la cantidad de antígeno p24 liberado dentro de los sobrenadantes del cultivo de los pozos tratados con anticuerpo comparado con los pozos de control no tratados con anticuerpo.

Virus retador de ratones hu-PBL-SCID. El AD6, conocido por ser resistente a la neutralización por la mayoría de los anticuerpos neutralizantes, fue seleccionado como el aislado primario del VIH-1 en este estudio. Todos los procedimientos para infección y mantenimiento de los ratones hu-PBL-SCID se hicieron en una instalación de bioseguridad para animales de nivel 3. La infección de los ratones hu-PBL-SCID se llevó a cabo 2 semanas después de la reconstitución de PBL. Los ratones fueron inyectados en forma i.p. con 0,5 mL de las reservas diluidas del VIH-1 libre de células que contienen 10 MID_{50}. Se determinaron previamente los inóculos de virus por medio de titulación en ratones hu-PBL-SCID y se mostró que infectan al menos al 80% de los ratones hu-PBL-SCID.

Detección del VIH-1 por medio de un cocultivo. Tres semanas después del reto viral, se sacrificaron loa ratones y se recobraron las células del lavado peritoneal y los bazos como se describió (Safrit y colaboradores, AIDS 1993, 7:15-21). Luego se incubaron 2 x 10^{5} células de lavado peritoneal ó 5 x 10^{6} células de bazo de los ratones (con diluciones seriales de 1 a 10) con 2 x 10^{6} PBL activado por PHA de donantes humanos seronegativos para el VIH-1 en un cultivo por dilución hasta punto final. Se monitorearon los cocultivos semanalmente por la presencia de antígeno central p24 del VIH-1 en el cultivo sobrenadante hasta por 4 semanas. Los cultivos se consideraron positivos para el VIH-1 si una muestra única contenía >1000 \mug/mL o si 2 muestras consecutivas contenían >200 \mug/mL de antígeno p24. El pozo con la dilución más alta que contenía células infectadas detectables fue tomado como el punto final, y las concentraciones de virus se expresaron como Dosis Infecciosas de Cultivo de Tejido (TCID) por
10^{6} células.

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Estudios Cinéticos y de Dosificación para la efectividad de la profilaxis pre- y postexposición por medio de MAb B4

Experimento 1

Diseño y métodos. Para la evaluación de la protección por preexposición, se inyectó intraperitonealmente al anticuerpo monoclonal B4 en 0,5 mL de PBS 1 hora antes de la inoculación del VIH-1. Dos grupos de ratones recibieron MAb B4 (Grupos 2 y 3, n = 6 por grupo, en una concentración de 50 mg/kg y 5 mg/kg respectivamente), y un grupo recibió el IgG_{2a} irrelevante de ratón de mieloma RPC5.4 (Grupo 1, n = 4 en una concentración de 50 mg/kg). Los ratones previamente inmunizados fueron retados entonces intraperitonealmente con 10 MID_{50} del aislado primario AD6 del VIH-1.

Para la evaluación de la protección postexposición, el Grupo 4 de animales (n = 6) fue retado con el virus y 30 minutes después recibió B4 en una concentración de 50 mg/kg. Cada uno de los ratones pesó un promedio de 20 g. Tres semanas después del reto viral, los ratones fueron sacrificados y se recolectaron células del bazo y de lavado peritoneal para la determinación de infección por medio del cultivo del virus.

Resultados: No se observó toxicidad por causa del anticuerpo en ninguno de los grupos de animales. Como se muestra en la Tabla 20A, se recuperó el VIH-1 en cultivos realizados a las 4 semanas de que tanto las células de esplenocitos como de lavado peritoneal que fueran cocultivadas con los PBL humanos activados por PHA de tres (Nos. 4296, 4297 y 4303) de los ratones en el grupo 1 se les diera 50 mg/kg de la IgG_{2a} de control, demostrando una tasa de inefectividad del 75% para este grupo de control. No se recuperó el virus a partir de ninguno de los dieciocho ratones a los que se les dio B4 ya sea 50 mg/kg (grupos 3 y 4) ó 5 mg/kg (grupo 2), administrada 1 hora antes de (Grupos 2 y 3) ó 0,5 horas después del reto viral (Grupo 4) (Tabla 20A).

Experimento 2

Diseño y métodos. Para este experimento de protección postexposición, los ratones fueron retados intraperitonealmente con 10 MID_{50} del aislado primario AD6 del VIH-1 antes de la administración de ningún anticuerpo. Los ratones del Grupo de control 1 (n = 5) fueron inyectados intraperitonealmente con una dosis de 5 mg/kg de IgG_{2a} de ratón (RPC5.4) inmediatamente después del reto con VIH-1. A los ratones del Grupo 2 (n = 4) se les administró 50 mg/kg de MAb B4 inmediatamente después del reto. Dos, cuatro y 24 horas después, los animales de los Grupos 3, 4 y 5 (n = 4, 4, 5 por grupo, respectivamente) recibieron MAb B4 en una concentración de 50 mg/kg; y 1 hora después, los animales de los Grupos 6 y 7 (n = 4 por grupo) recibieron MAb B4 en una concentración de 15 mg/kg y 5 mg/kg respectivamente. Cada uno de los ratones pesó un promedio de 20 g. Tres semanas después del reto viral, los ratones fueron sacrificados y se recolectaron células de bazo y de lavado peritoneal para la determinación de infección por medio del cultivo del virus.

Resultados: No se observó toxicidad por parte de anticuerpo en ningún grupo de los animales. Como se observa en la Tabla 20B, se recuperó el VIH-1 en cultivos realizados a las 4 semanas de que tanto las células de esplenocitos como de lavado peritoneal que fueran cocultivadas con los PBL humanos activados por PHA de tres (Nos. 4467, 4471 y 4473) de los cinco ratones en el grupo 1 se les diera 5 mg/kg de la IgG_{2a} (RPC5.4), demostrando una tasa de inefectividad del 60% para este grupo de control. No se recuperó el virus a partir de ninguno de los veintiún ratones de los Grupos 2, 3, 4, 6 y 7 a los que se les había suministrado MAb B4 ya sea 50 mg/kg (grupos 2, 3 y 4) o, 2 ó 4 horas después para los dos últimos grupos, como se observa en la Tabla 20B. El VIH-1 fue detectado por medio del cultivo del virus en dos de los cuatro ratones del Grupo 5 (Nos. 4469 y 4472), el grupo que había recibido 50 mg/kg de MAb B4 24 horas después del reto. Sin embargo, se recuperó el VIH-1 a partir de lavado peritoneal únicamente el animal No. 4469 (Tabla 20B).

Experimento 3

Diseño y métodos. Los experimentos de protección postexposición, específicamente, fueron repetidos con la concentración más baja de B4 (5 mg/kg) probada hasta el momento para un período de postexposición hasta de 4 horas. Los ratones fueron retados intraperitonealmente con 10 MID_{50} del aislado primario AD6 del VIH-1 antes de la administración de cualquier anticuerpo. Los ratones de control del Grupo 1 (n = 5) fueron inyectados intraperitonealmente con una dosis de 5 mg/kg de la IgG_{2a} de ratón (RPC5.4) inmediatamente después del reto con el VIH-1. A los ratones del Grupo 2 (n = 5) se les administró 5 mg/kg de MAb B4 inmediatamente después del reto. Una, dos, y cuatro horas después, los animales de los Grupos 3, 4 y 5 recibieron respectivamente (n = 5 por grupo) MAb B4 en una concentración de 5 mg/kg. Cada uno de los ratones pesó un promedio de 20 g. Tres semanas después del reto viral, los ratones fueron sacrificados y se recolectaron células de bazo y de lavado peritoneal para la determinación de infección por medio del cultivo del virus.

Resultados: No se observó toxicidad por causa del anticuerpo en ninguno de los grupos de animales. Como se muestra en la Tabla 20C, se recuperó el VIH-1 en cultivos realizados a las 4 semanas de que tanto las células de esplenocitos como de lavado peritoneal que fueran cocultivadas con los PBL humanos activados por PHA de los cinco ratones en el grupo 1 se les diera 5 mg/kg de la IgG_{2a} (RPC5.4), demostrando una tasa de inefectividad del 100% para este grupo de control. No se recuperó el virus a partir de ninguno de los veinte ratones de los Grupos 2, 3, 4 y 5 a los que se les dio MAb B4 en una concentración de 5 mg/kg a las 0, 1, 2 ó 4 horas después del reto viral, como se muestra en la Tabla 20C.

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TABLA 20A

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TABLA 20A (continuación)

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TABLA 20B

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TABLA 20B (continuación)

35

TABLA 20B (continuación)

37

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TABLA 20C

38

TABLA 20C (continuación)

39

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En resumen, los resultados obtenidos a partir de los anteriores tres experimentos secuenciales demostraron inequívocamente que la inmunización pasiva con MAb B4 proveen una protección completa para la infección por medio de un asilado primario representativo del VIH-1 en un modelo animal in vivo tanto en los modos pre y postexposi-
ción.

Ya que la infección de humanos después de una exposición ocupacional al VIH-1 es rara, la mayoría de las exposiciones clínicas accidentales se estima que son \leq 1 dosis infectiva humana. Por lo tanto, la protección de los humanos de la infección después de una exposición ocupacional al VIH se puede obtener con concentraciones de anticuerpo en suero mucho menores que aquellas utilizadas en el estudio actual del ratón SCID (las dosis de 5 y 50 mg/kg del presente Ejemplo dan origen a un pico de concentraciones de anticuerpo en suero de >10 \mug/mL y >100 \mug/mL respectivamente).

La protección completa contra una dosis alta (10 MID_{50}) de la infección con AD6 del VIH-1 fue observada a concentraciones de 5 mg/kg, 15 mg/kg y 50 mg/kg en un modo de preexposición. La protección completa para un intervalo mayor a 4 horas y menor a 24 horas con una concentración de 50 mg/kg y al menos hasta de 4 horas con una concentración de 5 mg/kg, fue observada en un modo de postexposición. Estas observaciones indican la utilidad de la modalidad con MAb B4 de la invención para profilaxis hasta de 4 horas después de la exposición ocupacional
al VIH-1.

Ejemplo 19 Estudio de las Interacciones del "Dominio del Receptor de Quemoquina-rsCD4-MAb B4" Empleando Péptidos Sintéticos que representan a los Dominios del Receptor de Quemoquina Péptidos sintéticos del dominio del receptor de quemoquina

Los péptidos del domino del receptor de quemoquina enlistados en las Tablas 21 y 22 fueron sintetizados por medio de la técnica de síntesis en fase sólida de Merrifield sobre sintetizadores automatizados de péptidos de Applied Biosystems (Modelos 430, 431 y 433A) utilizando química Fmoc. Después del montaje completo del péptido deseado, se trató la resina de acuerdo a un procedimiento estándar utilizando ácido trifluoroacético para escindir al péptido de la resina y desbloquear los grupos protectores sobre las cadenas laterales de aminoácidos. Los péptidos marcados por medio de ‡ también contienen un espaciador gly-gly y un epítopo colaborador de células T del virus de la hepatitis B (VHB). Los péptidos escindidos, extraídos y lavados fueron purificados por medio de HPLC y caracterizados por medio de espectrometría de masas y HPLC en fase reversa.

Cuantificación de las interacciones del "Dominio Receptor de Quemoquina rsCD4-MAb B4" por medio de los ELISA respectivos

Los ELISA respectivos fueron realizados esencialmente como el ELISA para rsCD4 descritos aquí (Ejemplo 3) excepto por la etapa de recubrimiento del antígeno, en donde los posos para microtitulación fueron recubiertos durante la noche a 4ºC con diferentes concentraciones (0, 0.016, 0.063, 0.25, 1 y 4 \mug/mL) del péptido designado del dominio del receptor de quemoquina como en la Tabla 22, que había sido preincubado con 0,25 \mug/mL de rsCD4.

Resultados: No se detectó interacción entre MAb B4 (en concentraciones de 10, 1, 0.1 y 0.01 \mug/mL) y ninguno de los péptidos individuales del dominio del receptor de quemoquina fue detectado de acuerdo a las mediciones por medio del ELISA respectivo donde los micropozos fueron recubiertos durante 1 hora a 37ºC con el péptido designado del dominio del receptor de quemoquina en una concentración de 5 \mug/mL en ausencia de rsCD4.

TABLA 21

41

TABLA 21 (continuación)

43

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TABLA 22

45

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Únicamente se detectó una reactividad marginal entre MAb B4 y rsCD4 como se midió por medio del ELISA para rsCD4 donde los pozos de microtitulación se recubrieron con rsCD4 únicamente en una concentración de 0,25 \mug/mL a 4ºC durante la noche.

Sin embargo, cuando rsCD4 (en una concentración de 0,25 \mug/mL) se preincubó con diferentes concentraciones de cada péptido designado del dominio de quemoquina, se observaron diferentes patrones de enlazamiento de MAb B4 con rsCD4 de acuerdo a como se midió por medio de las respectivas lecturas de OD_{492} por ELISA. La interacción previa de rsCD4 con ciertos péptidos del dominio del receptor de quemoquina (por ejemplo, los dominios 2 y 34 de CC-CKR2b, el dominio 3 de CC-CKR5, y el dominio 4 de CC-CKR3) contribuyó significativamente al enlazamiento de rsCD4 a MAb B4. Tal refuerzo es dependiente de la concentración del péptido. Esta tendencia del mejoramiento de la interacción "MAb B4-rsCD4" fue consecuentemente observada con todas las concentraciones de MAb B4 de 10, 1, 0.1 y 0.01 \mug/mL.

El grado de mejoramiento, como el medido por medio del incremento en OD_{492} del enlazamiento de MAb B4-rsCD4, se calculó para la concentración más óptima para el respectivo péptido del dominio del receptor de quemoquina, generalmente con una concentración de 1 \mug/mL, cuando se lo compara con el enlazamiento de MAb B4 a rsCD4 solamente a una concentración de 0,25 \mug/mL. Se hizo una gradación desde 0 hasta 8 con base en el respectivo % de incremento en la señal para la concentración más óptima de MAb B4 a 0,1 \mug/mL como se muestra más abajo en la Tabla 23.

La Tabla 23 resume las contribuciones al enlazamiento de MAb B4 por medio de los cuatro dominios externos de ocho receptores de quemoquina. Como se muestra en la tabla 23, el enlazamiento de MAb B4 a rsCD4 se mejoró por medio de diferentes péptidos del dominio del receptor de quemoquina que señala una naturaleza promiscua para la conformación de CD4 ya que se perturba por el contacto con diferentes coreceptores. Para una molécula como CD4 involucrada con múltiples funciones inmunoreguladoras, es razonable asumir tal naturaleza dinámica por su superficie expuesta. Este hallazgo también explica la dificultad en el mapeo del epítopo reconocido por MAb B4. Se caracteriza como un epítopo discontinuo y espaciado que no puede ser descrito fácilmente por medio de los sitios lineales o discontinuos presentados por medio de los diferentes péptidos CD4 mostrados en la Tabla 4. Se caracteriza además aquí por medio de los datos de la Tabla 23 para involucrar también a los sitios presentados por los diferentes péptidos del receptor de quemoquina mostrados en la Tabla 22. En resumen, el sitio de reconocimiento de B4 es un epítopo conformacional altamente esparcido que contiene sitios de CD4 en contacto con el receptor de quemoquina, un correceptor, para el VIH, y este epítopo es crítico para el enlazamiento del VIH a las células huésped y/o la entrada del VIH como lo reflejado por medio de su status como un objetivo para la neutralización viral
postexposición.

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TABLA 23 Mejoramiento del Enlazamiento MAb B4-rsCD4 por Medio de los Dominios del Receptor de Quemoquina

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0-50%	0	250-300	5+

50-100	1+	300-350	6+

100-150	2+	350-400	7+

150-200	3+	>400	8+

200-250	4+

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Ejemplo 20 Estudios sobre rsCD4 y las Interacciones del Receptor de Quemoquina y la Afinidad del Anticuerpo Monoclonal Afinidad mejorada de rsCD4 por los anticuerpos neutralizantes anti-CD4 por medio del péptido del dominio 3 de CC-CKR5 del receptor de quemoquina

La Tabla 23 mostrada en el Ejemplo 19 reveló grados significativos de mejoramiento del enlazamiento "MAb B4-rsCD4" por medio de CC-CKR2b (dominios 2 y 3) de >4+, por medio de CC-CKR3 (dominio 4) de 8+ y por medio de CC-CKR5 (dominio 3) de 5+, mientras que únicamente se afectó el mejoramiento marginal por medio de los péptidos correspondientes a los dominios de CXC-CKR4 (también llamado fusina o LESTR).

Recientemente, Feng y colaboradores (Science, 1996, 272:872) reportaron que el receptor CXC-CKR4 fue el coreceptor responsable por la entrada eficiente de las cepas T-trópicas del VIH-1 dentro de las células objetivo mientras que una serie de reportes que siguieron (Doranz y colaboradores, Cell, 1996, 85:1149; Dragic y colaboradores, Nature, 1996, 381:667; Choe y colaboradores Cell, 1996, 85:1135; Deng y colaboradores, Nature, 1996, 381:661; Alkhatib y colaboradores, Science, 1996, 272:1955) documentaron que los receptores de \beta-quemoquina CC-CKR5, CCCKR2b y CC-CKR3 fueron los coreceptores para M-trópica del VIH-1, los aislados primarios responsables por el establecimiento de la infección.

Como se muestra por medio del Grupo 5 en la Tabla 13, se encontró que MAb B4 era más efectivo en la neutralización de los aislados primarios de campo de todos los clados, que la cepa MN H9 T-trópica de laboratorio. Por lo tanto, fue relevante para examinar la asociación o la carencia de la misma entre las mejoras para la afinidad de los anticuerpos anti-CD4 por rsCD4 mientras contribuyó por medio del péptido del receptor de quemoquina y del aislado primario de campo a las actividades de neutralización. El péptido 2047a que representa al dominio 3 de CC-CKR5, un correceptor para los aislados primarios de campo del VIH del tipo M-trópico, y se emplearon cuatro anticuerpos monoclonales en una concentración de 0,1 \mug/mL con los Mab B4 y M2 teniendo actividad neutralizante y los MAb E6 y J33 careciendo de los mismos para este estudio de reforzamiento.

Como se muestra en la Figura 4, únicamente los dos anticuerpos de neutralización (esto es, los MAb B4 y M2) demostraron un reforzamiento significativo del enlazamiento "MAb-rsCD4" por medio del péptido 2047a en una forma que depende de la dosis. Este reforzamiento fue más óptimo cuando se preincubó 1 \mug/mL del péptido 2047a con 0,25 \mug/mL de rsCD4.

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Cuantificación de la afinidad mejorada de MAb B4 por el receptor de quemoquina de rsCD4 de la mezcla del péptido del dominio 3 de CC-CKR5 sobre rsCD4 solo Ensayos de inhibición por ELISA

La inhibición inducida por rsCD4 del enlazamiento de MAb B4 se llevó a cabo sobre placas de microtitulación recubiertas con rsCD4 (0,25 \mug/mL) o rsCD4 (0,25 \mug/mL) preincubado con el péptido 2047a (1 \mug/mL) del dominio 3 (D3) de CC-CKR5. Las concentraciones de enlazamiento en punto final para MAb B4 sobre rsCD4 y los pozos de microtitulación recubiertos con rsCD4/CC-CKR5-D3, fueron predeterminados como 2 \mug/mL y 0,1 \mug/mL respectivamente, con base en las concentraciones de MAb B4 que suministraron lecturas OD_{492 \ nm} de 1,0 sobre los respectivos pozos de microtitulación. Se midió entonces la inhibición del enlazamiento de mAb B4 con los pozos de microtitulación respectivamente recubiertos por muestras de preincubación diluidas de rsCD4 en el rango entre 0 y 10 \mug/mL, con MAb B4 en las concentraciones predeterminadas de punto final de MAb B4 (esto es, 2 \mug/mL para los pozos recubiertos con rsCD4 y 0,1 \mug/mL para los pozos recubiertos con rsCD4/CC-CKR5-D3) durante 1 hora a 37ºC seguido por el procedimiento estándar de ELISA para rsCD4 descrito aquí en el Ejemplo 3.

Las concentraciones de rsCD4 que dan origen a un 50% de inhibición (esto es, IC_{50}) del enlazamiento de MAb B4-rsCD4 y MAb B4/CC-CKRS-D3 fueron de 0,72 \mug/mL y de 0,047 \mug/mL en presencia de la respectiva concentración de MAb B4 de 2 \mug/mL y 0,1 \mug/mL, como se muestra en la Figura 5. Por lo tanto, la afinidad mejorada de MAb B4 por rsCD4 mezclada con CC-CKRS-D3 (péptido 2047a) sobre aquel de MAb B4 por rsCD4 solo, se puede cuantificar como una mejora de 15 veces.

Ejemplo 21 Anticuerpo Monoclonal Dirigido Contra un Complejo Antígeno Célula Huésped que Contiene CD4 desarrollado a través de la Inmunización de Ratones CD1 con SUP-T

Las células SUP-T (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Catálogo No. 100), una línea de células T derivada de linfoma humano, fueron utilizadas para inmunizar ratones CD1. La administración inicial fue de 10 x 10^{6} células en Adyuvante Completo de Freund, suministradas en forma intraperitoneal. Esto fue seguido por refuerzos múltiples de 5-10 x 10^{6} células administradas intraperitonealmente en una programación bisemanal, como se describe en el Ejemplo 3. Los dos últimos refuerzos se suministraron con Freund Completo y con Freund Incompleto. De lo contrario, los refuerzos fueron de células lavadas suministradas en suero fisiológico amortiguado con fosfato (PBS). Se llevaron a cabo las esplenectomias después de la inmunización final. Se prepararon esplenocitos mononucleares fusionados con células de mieloma de ratón NS-1, se obtuvieron hibridomas y se clonaron como se describe en el Ejemplo 3.

Los sobrenadantes de hibridoma fueron seleccionaos entonces por reactividad por medio del ELISA para rsCD4, y por la reactividad mejorada sobre un ELISA para rsCD4/p2047a. El péptido 2047a (p2047a) es el péptido del dominio 3 de CC-CKR5 descrito en los Ejemplos 19, 20 y la Tabla 21. El ELISA para rsCD4/p2047a fue realizado en pozos de microtitulación recubiertos con rsCD4 en una concentración de 0,25 \mug/mL y p2047a en una concentración de 1 \mug/mL, como se optimiza en el Ejemplo 20. Uno de los anticuerpos segregados por el hibridoma, designado como B13, que exhibió un A_{492} de 0,353 sobre el ELISA para rsCD4 y un A_{492} de 1,526 por medio del ELISA para rsCD4/p2047a. Esto es, B13 exhibe una reactividad mejorada de rsCD4/p2047a comparado con la reactividad de rsCD4 por medio de ELISA. El hibridoma B13 fue sometido entonces a 10 ciclos más de subclonación por medio de dilución y selección. Cada ciclo produjo clones que segregaron anticuerpo monoclonal reactivo rsCD4 con reactividad mejorada de rsCD4/p2047a por medio de ELISA. El anticuerpo monoclonal B13 (MAb B13) se caracterizó como perteneciente al isotipo de la IgG2a, el mismo isotipo de MAb B4.

Se analizó además a MAb B13 por medio del ensayo competitivo indirecto de inmunofluorescencia descrito en el Ejemplo 11 para demostrar la habilidad de B13 para inhibir el enlazamiento de MAb B4 con el complejo anticuerpo célula huésped que contiene CD4. Se incubó MAb B4 biotinilado con células objetivo SUP-T que habían sido preincubadas ya sea con un sobrenadante B13 o con antisuero anti-CD4 de ratón. Se colorearon las células de control con una intensidad de coloración FITC de +3 con una proporción de positivos del 95%. En contraste, más del 95% de las células SUP-T se colorearon hasta una intensidad de 1,5 a 2,0 después de preincubación en anti-CD4, y se observó la no coloración de las células después de preincubación con sobrenadante B13. Se puede concluir que semejante a MAb B4, B13 se enlaza específicamente con el complejo antígeno célula huésped que contiene CD4.

Se demostró también la similitud de MAb B13 con MAb B4 por medio de la comparación de la actividad de neutralización contra los aislados primarios del VIH-1 de diversos clados. Las actividades de neutralización de MAb B13 se compararon con aquellas de MAb B4 sobre los aislados primarios que representan a los clados A, B, C, D y E del VIH-1. Los virus, células huésped, y el Ensayo para la Neutralización en Microplaca de MT-2 fueron como se describe en el Ejemplo 13. La similitud entre las actividades de neutralización cruzada del clado de B13 y B4 se muestran en la Tabla 24.

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(Tabla pasa a página siguiente)

47

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: United Biomedical, Inc., 25 David Drive, Hauppause, New York 11788

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpo Contra un Complejo Antígeno Célula Huésped para la Protección Pre y Postexposición de Infección por el VIH

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A): DIRECCIÓN: Morgan & Finnegan, L.L.P.

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(B): CALLE: 345 Park Avenue

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(C): CIUDAD: New York

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(D): ESTADO: NY

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(E): PAÍS: Estados Unidos

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(F): ZIP: 10154-0053

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(v): FORMA QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B): COMPUTADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25

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(vi): DATOS DE LA SOLICTUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: Para ser asignado

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 3 de junio de 1997

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA SOLICTUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: 08/808.374

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 28 de febrero de 1997

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA SOLICTUD PRINCIPAL:

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(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: 08/657.149

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 3 de junio de 1996

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(C): CLASIFICACIÓN: 424

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(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Maria C. H. Lin

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 29.323

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(C): REFERENCIA/NÚMERO DEL EXPEDIENTE: 1151-4145PC

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(ix): INFORMACIÓN DE LAS TELECOMUNICACIONES:

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(A): TELÉFONO: (212) 415-8745

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(B): TELEFAX: (212) 751-6849

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 433 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

48

49

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 15minoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2

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\sa{Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln}

\sac{Ser Leu Ile}

Claims

1. Un proceso para la producción de un anticuerpo para un complejo antígeno célula huésped que contiene CD4 y una porción de un receptor de quimoquina que comprende:

b.: Separar y lavar a las células T que expresan CD4 en PBS;

i.: Enlazamiento a rsCD4;

2. Un proceso de acuerdo a la Reivindicación 1 en donde las características de los anticuerpos secretados comprenden además:

vii.: Suministrar inmunidad pasiva a la infección por medio de aislados primarios del VIH o del VIS para primates o ratones hu-PBL/SCID, con un ED_{50} < 50 mg/kg.

3. Un proceso de acuerdo a la Reivindicación 2 en donde las características de los anticuerpos secretados comprenden además:

viii.: El enlazamiento a cualquiera de los cuatro dominios extracelulares de CD4 como los representados por los péptidos AA_{1}-AA_{20}, AA_{81}-AA_{92}, AA_{79}-AA_{88}, AA_{60}-AA_{109}, AA_{118}-AA_{165}, AA_{235}-AA_{251}, AA_{297}-AA_{351}, y AA_{361}-AA_{375}.

4. Un proceso de acuerdo a la Reivindicación 1 en donde la porción de un receptor de quemoquina es el péptido del Dominio 3 de CC-CKR5, que tiene la secuencia de residuos aminoácidos AA_{168}-AA_{199} de CC-CKR5.

\newpage

5. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, en donde las células que expresan CD4 son células SUP-T1.

6. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, en donde las células que expresan CD4 son células HPB-ALL.

7. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, en donde el animal es un ratón BALB/c o CD1.

8. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, en donde el animal es un ratón transgénico que contiene secuencias transgénicas humanas que codifican a una cadena pesada humana y a una cadena liviana humana.

9. Un anticuerpo que tiene las siguientes características:

i.: Enlazamiento a rsCD4;

10. Un anticuerpo de acuerdo a la Reivindicación 9 caracterizado además por:

11. Un anticuerpo de acuerdo a la Reivindicación 10 caracterizado además por:

12. Un anticuerpo de acuerdo a la Reivindicación 9 en donde la porción de un receptor de quemoquina es el péptido del Dominio 3 de CC-CKR5 que tiene la secuencia de residuos aminoácidos AA_{168}-AA_{199} de CC-CKR5.

13. Un hibridoma que secreta un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 9-12.

14. Una preparación farmacéutica que contiene a un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 9-12.

15. El uso de un anticuerpo de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9-12 en la preparación de una composición farmacéutica para conferir inmunidad pasiva para el VIH.

16. Un uso de acuerdo a la Reivindicación 15 en donde el anticuerpo está de acuerdo con la reivindicación 10.

17. Un uso de acuerdo a la Reivindicación 16 en donde el anticuerpo está de acuerdo además con la reivindicación 11.

18. Un uso de acuerdo a la Reivindicación 17 en donde el anticuerpo está de acuerdo además con la reivindicación 12.

19. Un uso de acuerdo a cualquiera de la reivindicaciones 15-18, en donde la composición farmacéutica es adecuada para administración intravenosa.

20. Un uso de acuerdo a cualquiera de la reivindicaciones 15-18, en donde la composición farmacéutica es adecuada para administración en un nivel de dosis en el rango de 1 mg/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal.

\newpage

21. Un uso de acuerdo a la reivindicación 19 en donde la composición farmacéutica es adecuada para administración en un nivel de dosis en el rango de 5 mg/kg hasta 50 mg/kg de peso corporal.

22. Un uso de acuerdo a la reivindicación 19 en donde la composición farmacéutica es adecuada para administración en un nivel de dosis de 5 mg/kg de peso corporal.

23. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12 que es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

24. Un anticuerpo humanizado de acuerdo a la reivindicación 23.

25. Un fragmento de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12 en donde el fragmento se selecciona del grupo que consiste de Fab', F(ab')_{2}, y F(v).

26. Un fragmento de un anticuerpo quimérico o de un anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en donde el fragmento se selecciona del grupo que consiste de Fab', F(ab')_{2}, y F(v).