CN1081716A - 用于预防和治疗hiv感染的重组人hiv-中和性单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了中和HIV-1的重组人免疫球蛋 白分子，产生该免疫球蛋白的方法和使用该免疫球蛋 白防止HIV-1感染的方法，含有天然人抗体的互补 决定区(CDRS)和框架(FRS)的DNA构件与其他 不变区结合，并且在重组宿主细胞中表达。这些重组 抗体可以用于治疗和预防体内HIV-1感染。

Description

已经发现gp120V3区是一个由二硫键连结的大约30个氨基酸残基的闭合环[Leonard  et  al.，（1990），J.Biol.Chem.，265，pp.10373-82]。这个环不管是与完整的gp  120相连，还是作为一个合成肽片段，它可以结合并激发抗-HIV1型特异性病毒中和性抗体[Goudsmit  et  al.，（1988），AIDS，2，pp.157-164;Goudsmit  et  al.，（1988），Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85.pp.4478-4482;Ho  et  al.（1987），J.Virol.，61，pp.2024-2028;Javaherian  et  al.，（1989），Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，pp.6768-6772;Kenealy  et  al.，（1989），AIDS  Res.，5，pp.173-182;Rusche  et  al.，（1988），Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，pp.3198-3202]。因此，V3区被命名为主要的中种决定簇。抗-V3环抗体的体外特征包括相当强的病毒中和活性，中和下述病毒与宿主细胞CD4受体结合的能力，和防止病毒感染细胞和未感染细胞融合的能力[Linsley  et  al.，（1988），J.Virol.62，pp.3695-3702;Skinner  et  al.，（1988），J.Virol.，62，pp.4195-4200].Berman  et  al.用来源于哺乳动物细胞的重组表达的gp120或其gp160前体对黑猩猩进行免疫[Berman  et  al.，（1990），Nature，345，pp.622-625]。当病毒袭击动物时，只在用gp120接种过的那些黑猩猩体内发现可防止感染的保护作用。仅检测到的与保护作用相关的免疫应答是抗-V3环抗体。Girard  et  al曾用一系列免疫原对几个黑猩猩进行接种，最后使用的免疫原是V3环特异性合成免疫原[Girard  et  al.，（1991），Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，pp.542-546]。只有在此最后接种后才激发出显著的病毒中和活性。当病毒袭击时，或者完全阻止黑猩猩受感染或表现出延迟感染。最后，Emini等人报道了一种对黑猩猩感染性的体外中和研究，其中防止感染或推迟感染也与抗-V3环病毒中和抗体的存在有关[Emini  et  al.，（1990），J.Virol.，64.pp.3647-3678]。

最近，Ward等人证明，如果在接种病毒前给药，由人IgG  Fc区和CD4病毒受体的病毒结合区组成的嵌合分子也能防止HIV-1感染黑猩猩[Ward  et  al.，（1991），Nature，352，pp.434-436]。但是，与抗-V3环抗体相比而言，阻止病毒-CD4结合的试剂是体外HIV-1感染的弱中和剂，并且它们的活性作用容易受改变gp120-CD4结合亲和力的变化而减弱[Layne  et  al.，（1991），J.Virol.65，pp.3293-3300;Kang  et  al.，（1991），Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，pp.6171-6175;Thali  et  al.，（1991），J.Virol.，65，pp.5007-5012]。

Emini等人最近证明，预先或之后与病毒接触，抗单-HIV-1毒株（IIIb）的鼠/人嵌合单克隆抗体都能防止HIV-1  IIIb感染黑猩猩[Emini  et  al.，（1992），Nature，355，pp.728-730]。

因此，本发明目的就是提供能中和HIV-1的新型重组人免疫球蛋白和提供中和人HIV-1的FAb和Fv部分的新型重组人免疫球蛋白。本发明还提供人HIV中和性免疫球蛋白的新型DNA序列和提供含有该新型免疫球蛋白DNA序列的表达载体的重组宿主细胞和具有经修饰的人不变区的重组HIV-1中和性人免疫球蛋白。本发明还公开了一种通过施用重组HIV-1中和性人免疫球蛋白治疗HIV-1感染的方法。

本发明公开了重组HIV-1中和性人免疫球蛋白以及在宿主细胞中克隆和表达该重组免疫球蛋白的方法。将编码HIV-1中和性人免疫球蛋白或该免疫球蛋白的互补决定区（CDR）的DNA与编码人不变区的DNA重组融合后克隆到表达载体中，并在重组宿主细胞中表达。

图1  表示用于重组克隆操作中的代表位于抗体重链和轻链编码DNA内的序列的DNA寡聚核苷酸引物。

图2A&B  表示447-52D抗体的重链的完整核苷酸序列，和2B表示447-52D抗体的轻链的完整核苷酸序列，它们是由重组表达载体产生的。

图3  表示用于构建447-52D抗体的重链和轻链可变区的DNA寡聚核苷酸引物。

图4  是抗体447-52D重链和轻链可变区的重组克隆方法示意图。

图5  是含有重组抗体人γ1重链的质粒pHIV/447VH/Cγ1示意图。

图6  是含有该重组抗体轻链的质粒pHIV/447Vλ/Cλ示意图。

图7  是含有轻链和人γ1重链的质粒p63.79r447示意图。

图8  是用于产生p63.79r447的克隆步骤示意图。

本发明涉及HIV-1中和性人免疫球蛋白和特定的免疫球蛋白的重组构建和表达。该特定的重组免疫球蛋白含有HIV-1中和性互补决定区（CDR）。对含有HIV-1中和性CDR的重组免疫球蛋白可以进行重组修饰，使之含有不同于原始天然免疫球蛋白的重链和/或轻链骨架区。

例如，可以将重组修饰的免疫球蛋白从任何其他IgG同型或其他类型的免疫球蛋白转化成IgG1同型。

本发明还包括一种通过在暴露于HIV-1之前或之后使用重组HIV-1中和性免疫球蛋白来防止HIV感染的方法。本发明还包括通过使用重组HIV-1中和性免疫球蛋白给药治疗HIV-1感染。

本发明还包括一种构建和表达经改变的抗体的方法，包括：（ⅰ）诱变和装配包括CDRs以及骨架（FRs）区的可变区;（ⅱ）制备一种表达载体，该载体包括至少一种可变区，在转染到细胞中时，可以分泌足够用于测定亲和性和特异性的蛋白;和（ⅲ）在合适细胞系中共扩增重链和轻链表达载体。

本发明还提供了将动物单克隆抗体CDRs掺入人免疫球蛋白骨架的重组方法，这种掺入使得所产生的重组人抗体当给人给药时，是弱免疫原性或非免疫原性的。当用于治疗目的给药时，优选识别重组免疫球蛋白为自身蛋白。这种“人体化”方法使得重组抗体可用作治疗剂，因为它们是弱免疫原性或非免疫原性。本发明还认为应当包括如果能够鉴别出一种合适的骨架任何动物单克隆抗体可向重组人单克隆抗体重组转化，（如下所述）。本发明还应当包括单独的人和动物CDR区及人骨架区或其结合为一种轻链或重链形式或完整免疫球蛋白和它们的保守修饰变异体的核苷酸和氨基酸序列。该动物单克隆可以包括，但不局限于，那些能结合HIV-1的鼠单克隆抗体和由杂交瘤产生的合适mMAbs，该杂交瘤已寄存于美国典型培养物保藏中心下属的杂交瘤细胞库中，在ATCC的细胞系和杂交瘤目录中描述为No.6，1988。

如本文所使用的，全部的氨基酸三字母和单字母定义与现有技术的标准定义相一致，并列于下面：

丙氨酸  Ala  A  亮氨酸  Leu  L

精氨酸  Arg  R  赖氨酸  Lys  K

天冬酰胺  Asn  N  蛋氨酸  Met  M

天冬氨酸  Asp  D  苯丙氨酸  Phe  F

半胱氨酸  Cys  C  脯氨酸  Pro  P

谷氨酸  Glu  E  丝氨酸  Ser  S

谷氨酰胺  Gln  Q  苏氨酸  Thr  T

甘氨酸  Gly  G  色氨酸  Trp  W

组氨酸  His  H  酪氨酸  Tyr  Y

异亮氨酸  ILe  I  缬氨酸  Val  V

本发明涉及一种能够中和HIV-1的特定抗体的构建和表达方法及工具物质。取自HIV-1阳性个体的人血标本作为表达中和抗体的外周B细胞来源。通过Epstein-Barr病毒（EBV）感染使这些细胞保持存活，然后以固相ELISA方法筛选那些能够分泌抗体的单一B细胞克隆，其中该抗体可以结合一种代表HIV-1毒株MN之V3环的肽序列。随后将这种检测中的阳性B细胞克隆通过与SHM-D33细胞系（一种鼠×人异种杂交瘤，ATCC  CRL  1668）副合而稳定。用一种固相ELISA方法从所产生的B细胞异种杂交瘤克隆中筛选那些能产生识别和分离稳定的产生人抗体的细胞的标准，其中所产生的抗体能够用于制备成一种物质以对有可能接触HIV-1情况时进行预防性治疗，和对HIV-1阳性患者进行治疗。

可以用任何各种不同的方法对编码抗HIV-1抗体的DNA进行分子克隆。这些方法包括，但不局限于，在一种合适表达载体系统中构建一种含有抗体的cDNA文库后，对抗体基因进行直接功能表达。另一种方法是用一种根据抗体片段氨基酸序列设计的标记寡聚核苷酸探针，筛选一种在噬菌体或穿梭质粒载体中构建的含有抗体的cDNA文库。

对于那些本领域中的熟练技术人员可以显而易见地想到，可用其他类型的文库，以及从其他细胞或细胞类型构建的文库来分离编码抗-HIV-1抗体的DNA。其他类型的文库包括，但不局限于，从除447细胞外的其他B细胞或B细胞系获得的cDNA文库，和基因组DNA文库。

对于本领域中的熟练技术人员可以显而易见地想到，可以从产生抗HIV-1抗体的细胞或细胞系制备合适的cDNA文库。用所有上述和下面详细描述的步骤通过首先测定产生抗-HIV-1抗体的细胞选择出用于制备cDNA文库的细胞或细胞系以分离抗-HIV-1抗体。

可以用本领域中公知的标准技术来制备cDNA文库。公知的cDNA文库构建技术可以见，例如，Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.，Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual（Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  Spring  Harbor，New  York，1982）。

也可以从一种合适的基因组DNA文库中分离编码抗-HIV-1抗体的DNA，这对于本领域中的熟练技术人员来说也是显而易见的。

可以通过本领域中公知的标准技术进行基因组DNA文库的构建。公知的基因组DNA文库构建技术可见于Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.，Moleculer  Cloning：A  Laboratory  Manual（Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  Spring  Harbor，New  York，1982）。

优选下列的方法来制备重组DNA序列，该序列结合了抗体可变区，从上述人B细胞系获得的轻链和重链，并结合有人不变区。可用这些重组DNAs转染哺乳动物细胞以表达重组人抗体，该抗体保持有对人供体B细胞衍生的抗体的抗原特异性。优选地，当以治疗目的给药时，该重组免疫球蛋白将被识别为自身蛋白。使用标准方法，例如包括用异硫氰酸胍进行的细胞溶解反应[Chirgwin  et  al.，Biochem.18：5294-5299（1979）]从人异种杂交瘤，例如，上述的人异种杂交瘤细胞，提取总RNA。

对于那些本领域中的熟练技术会显而易见地想到，其他产生抗HIV-1抗体的细胞也适于制备编码部分或全部抗-HIV-1抗体分子的重组DNA分子。这种产生抗-HIV-1抗体的细胞包括，但不限于，Gorney  M.K.等人Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）88：3238-3242（1991）;Robinson  J.E.et  al.，AIDS  Res.Hum.Retrovir.6：567-579（1990）;Posner  M.R.et  al.，J.Immunol.146：5325-4331（1991）;Ho  D.D.et  al.，J.Virol.65：489-493（1991）;Tilley，S.A.et  al.，Research  Virol.142：247-259（1991）和见ATCC细胞系及杂交瘤目录，第七版，1992所描述细胞。下述的447-52D异种杂交瘤可用作本文公开的特定方法的基本范例。

还应当提出的是，本领域中的熟练技术人员会显而易见地想到，人免疫球蛋白（Ig）可含有γ或λ轻链，或者是下列重链同型中的任何一个：α（IgA），δ（IgD），ε（IgE），γ（IgG）和mμ（IgM）。

这五种不同的抗体重链同型赋于整个抗体分子不同的特性。例如，IgA是机体内分泌液（奶、唾液、眼泪、和呼吸道、消化道分泌液）中的一类主要抗体，并且通常是存在于肠、支气管、生殖道或乳房、唾液管和泪管的上皮细胞的表面。IgM是在初级抗体与抗原应答的早期分泌到血液中的一类主要抗体，并且是多价抗体，通常总共有10个抗原结合位点。IgE对于大多数细胞和嗜碱性白细胞上的受体具有高亲合性，典型地是与过敏反应有关。IgD存在于静止B细胞的表面，其功能尚不清楚。IgG构成血液中的主要免疫球蛋白种类，大量地产生于二级免疫反应过程，Fc区能结合到吞噬细胞上促进吞噬作用，Fc区能激活补体系统（如IgM一样），并且是唯一的一种能穿过胎盘进入胎儿血流的抗体。

一般的人免疫球蛋白G含有4个具有不同生化特征的亚单位。一般IgG由大约70%IgG1，18%IgG2，8%IgG3和3%IgG4组成。接触抗原的途径和时间长短，抗原的类型，以及遗传背景都会影响所产生的IgG抗体的亚单位。作为主要的免疫球蛋白类型，IgG和IgG亚单位在免疫和疾病中的作用是相当重要的。

希望能通过重组DNA技术产生一种与天然抗体具有不同重链或亚单位的重组抗-HIV抗体。例如，天然抗体可以是一种IgM（或其他免疫球蛋白），在为了产生能分泌到呼吸道、肠道或生殖道的重组抗体分子时，这种IgM不如IgA合乎需要。通过本领域中已知的重组DNA技术，可以用IgA重链替代IgM重链不变区并进行重组表达。另外，如果希望通过重组方法产生一种具有更大的补体系统激活特性的抗体，可以将IgG3天然抗体通过重组方法改变成IgG1抗体。

在本发明中描述了使用抗-HIV抗体447-52D通过重组DNA技术从一种IgG亚单位向另一个IgG亚单位的抗体分子转变。447-52D的天然形式是IgG3，可通过下述的重组DNA步骤将它转变成IgGI。对于本领域中的普通技术人员可显而易见地知道，这里所用的重组DNA技术也适合于转化除IgG外的其它免疫球蛋白重链单位，和适用于转化一种除IgG1外的IgG亚单位。

在一种Applied Biosystem 381A DNA合成器上合成代表人VH信号序列和人C-γ3′-端序列和人V-λ抗体信号序列以及人C-λ序列3′端序列的寡聚核苷酸引物对（图1），并用浓NH₄OH处理从树脂上取下，在一种NAP-5柱上脱盐并用H₂O洗脱。本文所述的所有寡聚核苷酸引物也是如此制备。利用AMV反转录酶，大约200单位（Boehringer  Mannheim  Biochemicals）和大约10pmole的重链或轻链的互补链引物于42℃对大约1μg的总RNA进行反转录大约30分钟。在大约95℃下加热大约5分钟使反应转录酶灭活，制备的反应液含有大约100μl  PCR缓冲液，大约50pmole的每种配对引物和25单位的Taq聚合酶。进行大约45次扩增循环（1′，94℃;2′，55℃;2′，72℃），然后，通过凝胶电泳纯化所需的DNA片段（对于重链和轻链分别大约是1400或700碱基对[bp]DNA片段）。在亚克隆到中间质粒之前，先用EcoRⅠ（重链）或EcoRⅠ和SaIⅠ（轻链）消化这些DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将重链cDNA克隆到质粒pUC18的衍生物中，其中该质粒已通过基因工程方法在以前存在的KpnⅠ和BamHⅠ位点之间引入了NcoⅠ和NotⅠ位点，而将轻链克隆到质粒pUC18中。使代表这些PCR扩增序列的多克隆生长，并进行DNA序列测定。通过分析预测的氨基酸序列获得一种代表人重链可变区的特定DNA序列，并且以同样的方式获得人λ轻链可变区。下述已克隆的447-52D  cDNA的序列表明，重链非常类似于连接到一个γ3不变区上的亚组Ⅲ重链可变区，而轻链可变区类似于连接到一个λ不变区上的亚组Ⅰ可变区。将本文所述的重组447-52D抗体装配成含有发现是447-52D异种杂交瘤一部分的V-区和人γ1（取代天然γ3）和λ2不变区（成熟重组447-52D免疫球蛋白的序列示于图2a和2b）。

可通过分子克隆技术克隆到一个含有合适启动子和其他合适转录调节成份的表达载体中，并转移到原核或真核宿主细胞中对用上述方法获得的克隆抗体cDNA进行重组表达，以产生重组抗体。这种操作技术全部记载于Maniatis，T.et  al.，如前所述，并且在现有技术中是公知的。

按照下述方法构建真核表达载体。表达载体在这里定义为在合适宿主中转录基团的克隆拷贝和译其mRNAs所需要的DNA序列。可以用这种载体在各种不同宿主如，细菌，兰-绿藻，植物细胞，酵母细胞，昆虫细胞和动物细胞中表达真核生物基因。也可以用各种以病毒为基础的系统表达该免疫球蛋白。

特定设计的载体可以允许DNA穿梭于宿主如细菌-酵母或细菌-动物细胞之间。一种合适构建的表达载体应当包含：一种用于在宿主细胞中自主复制的复制源点，选择性标记，有限数目的有用的限制酶位点，进行高复制数目的一种潜能，和强化的启动子。启动子定义为一种指导RNA聚合酶结合DNA和起动RNA合成的DNA序列。强启动子是一种能引起mRNAs以高效率起动的启动子。表达载体可以包括，但不限于，克隆载体，经修饰的克隆载体，特定设计的质粒或病毒。

可以用各种哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达重组抗-HIV-1抗体。商业上可获得的适合于重组抗体表达的哺乳动物表达载体，包括但不限于，pMClneo（Stratagene），pXTI（Stratagene），pSG5（Stratagene），EBO-pSV2-neo（ATCC37593），pBPV-1（8-2）（ATCC37110），pdBPV-MMTneo（342-12）（ATCC37224），pRSVgpt（ATCC37199），PRSVneo（ATCC37198），pSV2-dhfr（ATCC37146），pUTCag（ATCC37460），和λZD35（ATCC37565）。

可以将编码抗-HIV-1抗体的DNA克隆到一种表达载体中以用于在重组宿主细胞中表达。重组宿主细胞可以是原核或真核细胞，它包括但不限于细菌，酵母，哺乳动物细胞包括但不限于细菌，人细胞系，牛，猪，猴和啮齿动物来源，以及昆虫细胞包括但不限于来源于果蝇属的细胞系，从商业上可获得的合适的哺乳动物品种来源的细胞，包括但不限于，CV-1（ATCC  CCL70），COS-1（ATCC  CRL1650），COS-7（ATCC  CRL1651），CHO-K1（ATCC  CCL61），3T3（ATCC  CCL92），NIH/3T3（ATCC  CRL1658），HeLa（ATCC  CCL2），C127I（ATCC  CRL1616），BS-C1（ATCC  CCL26）和MRC-5（ATCC  CCL171）。

可以通过下列技术中的任何一种将表达载体导入到宿主细胞中，这些技术包括但不限于转化，转染，原生质体融合和电击穿。使含有表达载体的细胞克隆繁殖，并分别单独进行分析以确定它们是否产生抗-HIV-1抗体蛋白。可通过几种方法来识别表达抗体的宿主细胞克隆，包括但不限于，与抗抗体抗体进行免疫反应的活性，以及宿主细胞相关性抗HIV-1抗体的存在。

也可以用体外产生的合成mRNA进行抗体DNA的表达。合成mRNA可以在各种无细胞的系统中有效地转译，这些系统包括但不限于小麦芽胚提取物和网状细胞提取物，并且也可以在基于细胞系统中有效地转译，这些系统包括但不限于向蛙卵母细胞中微量注射，其中优选的是向蛙卵母细胞中微量注射。

合成了大约8个寡聚脱氧核苷酸引物（图3），它们代表了通过聚合酶链反应（PCR）扩增产生5个DNA片段所必需的引物。结合到所有除末端以外的寡聚脱氧核苷酸引物（图3，A1&A2）中的是那些与447-52D异种杂交瘤的重链V-区相应的序列或与被结合到447-52D  V-区的信号序列和内含子区片段互补的序列，而且在5′-末端互补区至少有15个碱基，以允许这三个片段随后进行PCR控制的重组反应（Daugherty，B.L.et  al.，DNA9：453-459，1990）。约各50pmol的合适引物对（S1&S2，H1&H2，和Ⅰ1和Ⅰ2）与大约10ng的代表447-52D重链的质粒DNA，大约2.5单位的Taq  DNA聚合酶结合，并且进行大约25个循环的PCR扩增反应（循环周期：1′，94℃;1′，55℃;2′72℃）。将这五个反应的产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，以每种DNA片段大约10ng，与末端寡聚脱氧核苷酸引物（A1&A2，图3）和Taq  DNA聚合酶（见图4）结合。使结合的片段进行PCR扩增（共25个循环：2′，94℃;2′，55℃;2′，72℃）。在用HindⅢ和XhoⅠ对附带有信号和内含子序列的重链V-区DNA进行限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA，并克隆到含有人γ1重链不变区的载体p9103的相应位点（见图5）。按照下述构建体载体。从COSIg  9粘性质粒克隆（Flanagan  and  Rabbits，Nature  300：709-713，1982）纯化DNA，并用作人γ1不变区PCR扩增反应的模板。将合适的各50pmole的引物对（G1&G2，图1）与大约10ng含有人γ1不变区外显子的粘性质粒DNA，大约2.5单位的Taq  DNA聚合酶结合，并进行大约25个循环的PCR扩增反应（循环周期：1′，94℃;1′，55℃;2′，72℃）。用XhoⅠ和EcoRⅠ限制酶消化反应产物，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化，然后克隆到含有HIV-1启动子片段（碱基对-117至+80;Siekevitz等人，Science  238：1575，1987描述的pCD23）的中间载体（p9102）中。用HindⅢ和XbaⅠ对附带有信号肽和内含子的轻链V-区进行消化，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA，然后克隆到FFFF载体中（如下所述），该载体预先已用HindⅢ和EcoRⅠ消化，并具有一个代表人轻链不变区外显子的DNA片段。后一个片段是通过对10ng的质粒＃208DNA进行PCR扩增获得，该DNA含有一种包含人λ2不变区位点的EcoRⅠ/HindⅢ片段。将合适引物对（C1和C2，图1），大约各50pmole，与质粒DNA，大约2.5单位的Taq  DNA聚合酶结合，并进行25个循环的PCR扩增反应（循环周期：1′，94℃;2′，55℃;2′，72℃）。用XbaⅠ和EcoRⅠ限制酶对620碱基对的反应产物进行消化，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化，然后包裹在上述的三个片段连结作用中。在用HindⅢ和EcoRⅠ对它们消化并进行琼脂糖凝胶电泳之后，对所得到的表达克隆进行分析可得到所期望的大约1.2千碱基的编码轻链的插入子。

从除含有不同免疫球蛋白编码序列外其余相同的质粒中转录重链和轻链免疫球蛋白分子。免疫球蛋白表达载体的优选前体是一种上述的含有部分HIV-1LTR启动子（-117至+80，与“帽”位点相关），一种多克隆位点和SV40后期多聚腺苷酸化信号（图7）的前体。质粒pEE14（Celltech，Ltd）是这个载体（命名为pSZ9015）中大多数DNA序列的来源。用MluⅠ和HindⅢ消化去掉pEE14载体的CMVIE启动子。通过琼脂糖凝胶电泳使去掉启动子的8Kb载体DNA纯化，并将其连接到一个大约200碱基对的PCR扩增DNA片段上，该片段含有197个碱基对的HIV  LTR（-117-至+80）和MluⅠ及HindⅢ末端（用图1所述的引物对和pCD23CAT质粒DNA模板获得的）。将重链γ1不变区作为XbaⅠ/EcoRⅠ2.0Kb片段与一种不相关的重链V-区一起置于p9015载体中，产生载体pSP72/58.2/L16VH/γ1MRC。

使含有447重链可变区和IgG1不变区以及447轻链可变区和λ2不变区的质粒DNA生长，并纯化，以转染到受体哺乳动物细胞中。将大约10μg等量的编码重链和λ轻链的质粒通过标准磷酸钙沉淀方法转染到人胚肾细胞系293（ATCC  CRL1573）中。通过固相Elisa（下述）检测培养液上清液发现含有一种人λ轻链/人IgG1免疫球蛋白。于大约4℃下，用溶于磷酸缓冲盐溶液（PBS）中的大约10μg/ml的鼠抗-人λ链不变区单克隆抗体（Cat，＃05-4101，Zymed  Laboratories，Inc.）溶液覆盖Immulon-2（Dynatech  Labs.）96-孔平板过夜，并且在37℃下用溶于PBS中的大约1%牛血清白蛋白（BSA）阻滞1小时。用PBS反复洗涤之后，加入在含有1%BSA的PBS中稀释的样本（含有购自Sigma  Chemical的重组447-52D抗体或人λ/IgG1的限制性培养基），设置二个重复，并在37℃下保温1小时。用从大约7.8ng/ml至大约500ng/ml的IgG1浓度范围建立标准校定曲线。用大约50μl等份量的溶于含有大约1%BSA的PBS中的、鼠抗-人IgG1  Fc单克隆抗体与辣根过氧化酶（Cat＃-3320，Zymed  Laboratories，Inc.）的结合物的1∶400稀释液检测结合的和完成装配的人IgG1。在37℃下保温1小时并洗涤之后，加入大约1mM的溶于约0.1M柠檬酸钠（PH4.2，含有0.03%过氧化氢）中的2，2′-连氮基-双（3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸）并于室温下保温20分钟对结合物进行定量检测，用ELISA平板阅读器（Bio-Rad，Inc.）设置在415nm处测定孔中的吸收率。也可以用基于MN分离物的序列得到的26残基肽覆盖平板进行固相ELISA。通过使用预活化五氟苯基酯的固相Fmoc化学方法和羟基苯三嗪活化反应合成该肽（NleCysTyrAsnLysArgLysArgIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsnIleIleGlyGys  SEQ.ID.NO.：1）。用大约1μg/ml肽覆盖Immulon-2平板过夜，并且用大约溶于PBS的1%胎牛血清阻滞。按照上述方法检测结合的447-52D抗体。通过蛋白A色谱分析对转染人293细胞后瞬时表达分泌的抗体纯化。通过上述的ELISAs测定重组447-52D抗体的浓度，通过证明其中和HIV-1的特异血清型感染的能力而测定其效价。

将培养物暴露于抗体和病毒7-8天后，测定细胞存活率，来对无细胞HIV-1病毒感染的中和作用和对细胞至细胞扩散的抑制进行定量分析。在细胞生长培养基（RPMI1640+10%胎牛血清）中制备要检测抗体的二倍系列稀释液，并将100μl体积的稀释液置于一个96孔培养盘的孔中（Costar，Corp.）。向每个孔中加入100μl的病毒原液（从慢性感染的H9细胞或从新建立的慢性感染的FDA/H9细胞制备;将使从慢性感染的细胞群制备的平板细胞密度为2×10⁵细胞/mL的3天的限制性培养基澄清，选择比病毒原液的最终稀释液大10倍的稀释液作为激发剂量，它能在7天的检测时间内杀死全部MT-4细胞），并使病毒-抗体混合物在37℃下保温1小时。向每个孔中加入含MT-4细胞[Harada  et  al.，（1985），Science，229，pp  563-566]的50μl培养基并将培养皿在37℃下保温7天，此时确定为终点。能够防止MT-4细胞杀伤作用的最终抗体稀释浓度称为中和反应终点。

中和反应检测的结果见图8，并且表明对于所研究的每一种HIV-1血清型来说，重组人447-52D抗体的效能等同于人异种杂交瘤来源的447-52D抗体的效能。这些结果表明重组构建的抗体（用人λ和γ1不变区表达的）并没有通过这种方法被修饰而改变了它与V3PND环的相互反应性。

本发明公开了完整重组447-52D人HIV-1中和抗体的构建，它的重链和轻链可变区含有447-52D人异种杂交瘤抗体的残基，并完全保留了母体异种杂交瘤抗体的特异性和效能。

对于本领域中的熟练技术人员可以显而易见地想到，本文公开的重组抗-HIV-1抗体具有与天然抗体相同的抗原特异性，而且也保留了广谱的HIV-1中和活性。对于本领域中的熟练技术人员也可以显而易见地想到根据本发明公开的方法可以生产其他的抗-HIV抗体，以提供一种重组HIV-1-特异性抗体分子。

通过EBV转化人外周血单核细胞，并选择制备所需特异性抗体的细胞系，然后将所选择的EBV转化细胞与杂种骨髓瘤细胞系融合，来产生能制备抗HIV-1中和性抗原决定簇如与gp120糖蛋白相关的决定簇的人IgG  mAb的细胞系，所产生的异种杂交瘤细胞各自制备一种人单克隆抗体，它具有通过选择母体EBV-转化细胞产生的抗体的抗原决定簇特异性（如：对gp120抗原决定簇）。

gp120糖蛋白含有一种或几种能被本发明细胞和抗体识别的中和性抗原决定簇，该糖蛋白可来源于任何已知的HIV-1毒株，如相当普通的MN毒株。

该术语“杂交骨髓瘤”是指通过将一种非人骨髓瘤细胞系与一种人骨髓瘤细胞系融合产生的一种杂交细胞。典型地，鼠骨髓瘤或浆细胞瘤细胞是人骨髓瘤细胞的融合配体。这种非人和人骨髓瘤和杂交骨髓瘤细胞系在本领域中是公知的，并且Teng，N.N.等人报道了有代表性的细胞系，Proc.Natl.Acad.Sci（USA）80：7308（1983）;Kozbor，D.et  al.，Hybridoma  2：7（1983）;和Granow，R.et  al.，J.Immunol.Meth.106：257-265（1988）。

如本发明所述，用杂交骨髓瘤作为融合配体，用于选择EBV-转化的人细胞，以产生本发明的异种杂交瘤。

在一个优选实施例中，用杂交骨髓瘤SHM-D33作为融合配体。此细胞系可从ATCC获得，入藏号为ATCC  CRL1668。

本发明所用术语“异种杂交瘤”是指通过将一种产生抗体的细胞种类与杂交骨髓瘤融合产生的一种杂交细胞系。该术语“异种杂交瘤”也可以在其他地方使用，来表示任何种间杂交瘤，例如一种由产生抗体的人淋巴细胞系细胞和鼠骨髓瘤细胞融合所产生的杂交瘤。但是，本发明所用术语进行了更窄地定义。

在本发明的一个实施方案中，将产生抗体的人细胞与一种鼠-人杂交骨髓瘤融合。在一个优选方案中，将一种产生抗HIV中和性抗原决定簇的抗体的EBV转化人淋巴细胞，与一种人-鼠杂交骨髓瘤融合产生异种杂交瘤。在更优选的实施例中，人-鼠杂交骨髓瘤是一种命名为SHM-D33的细胞系。

该术语“中和性抗原决定簇”是指一种当被特异于这种抗原决定簇的抗体结合时，能够中和该病毒的抗原决定簇。对病毒任何生物活性的中和，例如合体细胞形成，都落入本发明所说“中和”的范围。

为了产生抗HIV-1gp120中和性抗原决定簇的人mAbs，按照Gorny，M.K等人所述，Proc.Nat′l.Acad.Sci（USA）86：1624-1628（1989），用EBV转化人外周血淋巴细胞。

优选地，所要转化的细胞是来源于能产生抗-HIV-1抗体的个体血液。

筛选EBV-转化细胞的培养物中抗有意义抗原决定簇的抗体。在一个实施方案中，该抗原决定簇是一种gp120蛋白的中和性抗原决定簇，并且用纯化的gp120，它的一个片段，或代表其部分的合成肽进行筛选。在一个优选实施例中，用一种来源于代表氨基酸306-328（见上述的序列）的V3环的合成23聚体肽，筛选培养物中抗gp120V3环的抗原决定簇的抗体。除了这种肽以外，其他具有至少6个氨基酸的肽也可用于筛选EBV-转化的细胞，以识别能产生具有所需抗原决定簇特异性的抗体的细胞。

可以使用本领域中公知的任何一种免疫测定方法进行这种筛选步骤。优选的免疫测定是酶联免疫吸附测定法，即ELISA。使用这种方法，可以检测培养物上清中是否有所需特异性和同型抗原的抗体的存在。

通过任何本领域中已知克隆方法，例如双稀释法，重复克隆阳性EBV-转化的培养物。也将发现对所需抗体特异性阳性的培养细胞与杂交骨髓瘤细胞融合，产生一种异种杂交瘤。通过以每孔大约1-100细胞的密度培养来进一步克隆融合细胞。

通过本领域中公知的免疫测定方法确定由异种杂交瘤产生的抗体的特异性。在一个优选方案中，使用ELISA和放射免疫沉淀（RIP）方法。抗原制剂包括HIV-1病毒粒子（如MN-毒株），病毒或感染细胞的溶解物，如MN和HILV-IIIB溶解物，病毒蛋白如gp120，或重组或合成病毒肽，如上述的23聚体。

本发明的mAbs是IgG同型的，并且可以从异种杂交瘤细胞培养的上清回收，并通过本领域中已知的用于纯化IgG的惯用方法纯化。这些方法包括，但不限于，蛋白-A琼脂糖亲和层析，Affigel兰（BioRad，Richmond，CA）和蛋白-A琼脂糖层析的结合使用，或高效液相色谱分析。

当给感染有HIV-1或具有HIV感染危险的人施用本发明抗体时，它可提供治疗或预防性的益处。这些尤其是危险的个体在本领域中是已知的，并且包括那些由于针头沾染上HIV-1而感染的健康保健工作人员。

本发明的抗体也可用于诊断所使用的类型以确定某病人是否暴露于或感染上HIV-1。

还可以用本发明抗体分析其特异性HIV蛋白的表达。

可以用本发明的HIV-特异性人mAb治疗感染有HIV或患有AIDS的个体。可以通过任何已知的途径进行本发明抗体的非肠道或肠道给药。例如，给药可以是皮下、静脉内、肌肉、腹膜内、经皮、或鞘内给药。也可以，或者同时进行口服、直肠或阴道内给药。该抗体也可以羊膜腔内给药用于子宫内治疗。优选的给药途径是静脉内或肌肉内给药。

抗体给药剂量取决于受试者的年龄、健康状况和体重，配合治疗的种类，治疗的次数，和所期望效果的性质。mAbs的有效量每天从大约0.1至大约500mg，优选的是从大约3至大约30mg/每天。治疗也许会需要输液或注射该抗体几天，几周，几个月或甚至几年的时间，这可由本领域中的熟练技术人员容易地确定。

一种典型的治疗方案包括有效量抗体的给药在1周和大约6个月之间。达到治疗效果所需的治疗周期会因病人不同而不同，取决于疾病的严重程度和发展阶段以及每个病人的个体特征。

用于每个治疗的总剂量可以通过多剂量或单剂量给药。mAbs可以单独给药，或者与其他治疗HIV-1感染的药，如AZT，或治疗其他疾病综合症的药物联合给药。

本发明的mAbs可以用于HIV-1感染的孕妇。由于本发明的抗体是IgG同型，它们可以穿过胎盘而到胎儿。这样可以防止胎儿感染或者，为感染的胎儿提供有效的治疗。

包含本发明抗体的药物组合物包括所有含达到治疗目的的有效量的抗体的组合物。除了抗体以外，该药物组合物可以含有合适的药物学上可接受的载体，它包括赋形剂和辅剂，这些物质有助于把活性化合物制成可以作药用的制剂。本发明范围内的另外一种药物组合物是本发明抗体与本领域中已知的免疫球蛋白静脉给药制剂的组合物。

药用组合物包括通过注射或口服给药的合适溶液，并含有大约0.01%至99%，优选的是大约20-75%的活性成份（也即该抗体），再加有赋形剂。用于口服给药的药用组合物包括片剂和胶囊。能直肠和阴道给药的组合物包括栓剂。

可以将本发明的mAbs结合到细胞毒性药剂上，并用作免疫毒素（见，例如，Vitetta  et  al.Science238：1098-1104（1987），或结合到含有抗-HIV药物或毒素的脂质体表面上，以使这些药物或毒素特异性地击中感染细胞。本文所用术语“免疫毒素”是指一种抗体与一种或几种毒素，药物，放射性核素或细胞毒性药剂的结合物。毒素成份部分可以用化学方法结合到本发明抗体上，或者也可通过重组DNA技术连接。在这种连接方式中，编码毒性蛋白或其活性片段的DNA连接到编码完整或部分mAb重链，轻链或二者的DNA上。这种遗传结构及其制备方法在本领域中是已知的。可以接合到本发明抗体上的毒素包括蓖麻子蛋白，白喉毒素，假单胞菌毒素，肿瘤坏死因子-α和其他本领域中已知的毒素。

在使用本发明mAbs的典型治疗方案中，抗体连接到一种单独使用就对HIV-感染和未感染的细胞有毒性的毒素上如蓖麻子蛋白。通过将细胞毒药剂结合到抗体上，以高度定位方式获得高水平的抗靶细胞的毒性效力，其中抗体转动毒素到达靶细胞，而对抗体未结合的邻近未感染细胞没有损伤。

HIV抗病毒疗法基于对病毒复制循环的详细理解，而且几乎每一个可定义的复制步骤都为干扰病毒复制提供可能性。能够作为治疗剂干扰结合到细胞上的HIV的化合物是可获得的。重组CD4可以作为病毒的一种“引诱分子”与能结合病毒gp120包裹蛋白的细胞受体竞争。到目前为止最成功的药剂可通过抑制反转录酶（RT）影响下一个阶段，DNA原病毒的形成。这些试剂包括AZT和其他核苷类似物如双脱氧胞嘧啶（ddc）和双脱氧次黄嘌呤核苷以及非核苷类似物。下一个目标是来源于原病毒DNA的病毒RNA的合成、成熟和从细胞核向细胞质的转运，它包括tat和rev功能的抑制剂。病毒mRNA必须是被转译的，而根据实验，用反意寡聚核苷酸可以特异性地抑制这一步骤。最后，必须把病毒蛋白装配形成新的病毒颗粒，而这需要一种特异性病毒蛋白酶。已经结晶出这种蛋白酶，并已鉴定出其抑制剂[Roberts  et  al.（1990）.Science.748，pp.358-362]。

本发明还涉及重组HIV-中和抗体与一种或几种用于治疗或预防HIV感染和艾滋病的药剂的组合物。例如，本发明重组抗体的有效给药方式是，在感染前和/或感染后的期间，与有效量的其他抗HIV的有效抗病毒剂、免疫修饰剂，抗-感染剂或疫苗联合使用。

本发明的重组抗-HIV抗体与其他抗-HIV剂或艾滋病治疗剂的结合物可用于预防或治疗HIV感染以及治疗继发的病理状态如艾滋病。治疗艾滋病或预防或治疗HIV感染定义为包括，但不限于，治疗广泛范围的HIV感染状态：艾滋病、ARC（艾滋病相关性综合症），有症状的和无症状的，实际或潜在地接触HIV。例如，在怀疑接触HIV之后或之前，如因输血、使用血液制品，偶而的针刺，接触体液，外科手术中接触病人血液等，可使用本发明化合物的结合物治疗或预防HIV感染。

为了此目的，本发明重组抗-HIV抗体与其他抗-HIV或艾滋病治疗化合物联合给药，给药途径可以是口服、非肠道给药（包括皮下注射或输液技术），喷雾吸入给药，直肠给药或阴道给药，该给药以含有惯用的非毒性药学上可接受的载体，佐剂和赋形剂的剂量单位形式给药。

因此，根据本发明，还提供了用于预防和治疗HIV感染和艾滋病的联合药用组合物。这种治疗包括给需要这种治疗的病人使用一种药物载体和一种治疗有效量的本发明重组抗-HIV抗体和抗-HIV或艾滋病治疗化合物的组合物。

这些联合药物组合物可以是可口服给药的悬浮液或片剂、鼻吸入喷雾剂;无菌注射剂，例如，无菌注射水溶液或油脂性悬浮剂或栓剂。

当以悬浮液口服给药时，这些组合物可根据本领域中公知的药物制剂技术制备，并且可以含有本领域中已知的微晶纤维素来将大块分开，含有藻酸或藻酸钠作为悬浮剂，以及甜味剂/调味剂。作为快速释放片剂，这些组合物可含有本领域已知的微晶纤维素、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁，乳糖和/或其他赋形剂，粘合剂，膨胀剂，崩解剂，稀释剂，和润滑剂。

当以鼻用气雾剂或吸入剂给药时，这些组合物可根据本领域中公知的药物制剂技术制备，并且可制备成盐溶液，使用本领域中已知的苯甲醇或其他合适的防腐剂，吸收促进剂以增加生物利用率，碳氟化物，和/或其他增溶剂或分散剂。

可以根据已知技术使用合适的非毒性，直肠外可接受的稀释剂或溶剂，如甘露醇，1，3-丁二醇，水，林格氏液或等渗氯化钠溶液，或合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂，如无菌、无味的固定油，包括合成的单一或二甘油酯和脂肪酸，包括油酸制备注射溶液或悬浮液。

当以栓剂形式直肠或阴道给药时，这些组合物的制备可以是将药物与合适的非刺激性赋形剂，如可可脂，合成甘油酯或聚乙二醇混合制得，这些赋形剂在常湿下是固态的，但在体温下是液态体和/或溶解以释放出药物。

本发明化合物可以1mg至5g/Kg体重的剂量范围以单剂量或分剂量形式口服人体给药。但是，应当指出的是，特定的剂量水平、剂量比率和剂量频率对于任何特定病人而有所不同，并取决于各种因素包括所使用特定化合物的活性或效能，化合物的代谢稳定性和作用时间长短，病人的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食情况、给药方式和时间，释放速度、药物组份，特定病情的严重程度和病人正在进行的治疗情况。

本发明的新联合药物组合物包含本文公开的重组抗-HIV抗体。并结合一种或几种能干扰或抑制HIV复制的抗-HIV药剂以及治疗艾滋病相关症状的药物。这些抗-HIV药剂包括但不限于那些能干扰病毒向细胞受体上结合的抗-HIV药物（如，可溶性CD4，和相关的肽，硫酸葡聚糖，N-丁基DNJ）;病毒装配抑制剂（如：栗精素Castanospermine，6-O-丁酰基栗精素，肉豆蔻酰化抑制剂）;反转录酶抑制剂包括但不限于核苷类似物（如：AZT，ddC，ddI，d4T，AzdU，A69992，IAF-BCH189，Carbovir，Fascarnet，Ganciclovir和无环鸟苷）和非核苷类似物如羟基吡啶酮（如：

3-｛[4，7-二氯苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（4，7-二甲基苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（7-氯苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（7-甲基苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（4-氟苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（7-氟苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（4-氯苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（4-氟-7-氯苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，和

3-[2-（苯并噁唑-2-基）乙基]-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮）;转录反激活反应（Trans-activation）的抑制剂（例如：tat和rev蛋白抑制剂，如7-氯-5-（2-吡咯基）-3H-1，4-苯并二氮杂草2（H）-烷，或Ro5-3335）;反转录病毒蛋白酶抑制（例如：一种非水解化学相似结构的酶过渡态，底物或反应中间体，RO39-8959[Hoffman  La  Roche]）;以及用所义寡聚核苷酸抑制病毒基因表达。用于治疗艾滋病相关症状的药剂包括，但不限于，治疗机会性感染的药剂，干扰素，粒细胞巨噬细胞菌落刺激因子，白细胞介素2，肿瘤坏死因子和红细胞生成素。

在本发明的一个优选方案中，将重组抗-HIV抗体与HIV反转录酶抑制剂和/或HIV蛋白酶抑制一起结合到药物组合物中。优选的反转录酶抑制剂是上述的氨基吡啶酮。优选的蛋白酶抑制剂是羟基乙基胺过渡态相似结构，例如RO31-8959（Hoffman  La  Roche）。最优选的是重组抗-HIV抗体和一种或几种上述能抑制氨基吡啶酮的反转录酶的结合物。

另外，本发明的重组抗-HIV抗体的有效给药方式可以是在感染前和/或感染后的一段时间，与有效量的艾滋病抗病毒剂、免疫调节剂、抗感染剂，如下表中的药物结合给药。

表

抗病毒剂

药物名称  生产厂家  功用主治

AL-721  Ethigen  ARC,PGL

(Los Angeles,CA)  HIV阳性,AIDS

重组人干扰素β  Triton Biosciences  AIDS,Kaposi's

(Almeda,CA)  肉瘤,ARC

Acemannan  Carrington Labs  ARC

(Irving,TX)  (也见免疫调节剂)

Cytovene  Syntex  视力

危险性CMV

Ganciclovir  (Palo Alto,CA)  外周性CMV

视网膜炎

药物名称  生产厂家  功用主治

d4T  Bristol-Myers  AIDS,ARC

二去氢脱氧-  (New York NY)

胸苷

ddI  Bristol-Myers  AIDS,ARC

二脱氧肌苷  (New York NY)

EL10  Elan Corp,PLC  HIV感染

(Gainesville,CA)  (也见

免疫调节剂)

膦酰基甲酸三钠  Astra Pharm.  CMV视网膜炎,

Products,Inc.  HIV感染,other

(Westborough,MA)  CMV感染

双脱氧胞苷;  Hoffman-La Roche  AIDS,ARC

ddC  (Nutley,NJ)

Novapren.  Novaferon Labs,Inc.  HIV抑制剂

(Akron,OH)

Diapren,Inc.

(Roseville,MN,marketer)

药物名称  生产厂家  功用主治

肽T  Peninsula Labs  AIDS

八肽序列  (Belmont,CA)

Zidovudine;AZT  Burroughs Wellcome  AIDS,adv,ARC

(Rsch.Triangle Rark,  儿童AIDS,

NC)  Kaposi's肉瘤,

无症状性HIV

感染,轻度艾滋病,

神经系统并发症,

与其他疗法结合,

健康保健工作者

防御前感染后

安莎霉素LM427  Adria Laboratories  ARC

(Dublin,OH)

Erbamont

(Stamford,CT)

糖酐酯  Ueno Fine Chem.  AIDS,ARC,HIV

Ind.Ltd.  阳性无症状

(Osaka,Japan)

药物名称  生产厂家  功用主治

病毒唑  Viratek/ICN  无症状性HIV阳性,

(Costa Mesa,CA)  LAS,ARC

α干扰素  Burroughs Wellcome  Kaposi's肉瘤,

(Rsch.Triangle  HIV与反转录病毒

Park,NC)  共同感染

无环鸟苷  Burroughs Wellcome  AIDS,ARC,

无症状性HIV阳性,

与AZT结合使用。

免疫调节剂

药物名称  生产厂家  功用主治

在免疫吸附柱中  Advanced Biotherapy  AIDS,ARC

能中和PH不稳性  Concepts

α异常干扰素  (Rockville,MD)

的抗体

AS-101  Wyeth-Ayerst  Labs.  AIDS

(Philadelphia,PA)

Bropirimine  Upjohn  进展性AIDS

(Kalamazoo,MI)

药物名称  生产厂家  功用主治

Acemannan  Carrington Labs,Inc.  AIDS,ARC

(Irving,TX)  (也见抗病毒药)

CL246,738  American Cyanamid  AIDS,Kaposi's

(Pearl River,NY)  肉瘤

Lederle Labs

(Wayne,NJ)

EL10  Elan Corp,PLC  HIV感染

(Gainesville,GA)  (也见抗病毒药)

γ干扰素  Genentech  ARC,与TNF

(S.San Francisco,  (肿瘤坏死因子)

CA)  联合使用

粒细胞  Genetics Institute  AIDS

巨噬细胞菌落  (Cambridge,MA)

刺激因子  Sandoz

(East Hanover,NJ)

药物名称  生产厂家  功用主治

粒细胞  Hoeschst-Roussel  AIDS

巨噬细胞菌落  (Somerville,NJ)

刺激因子  Immunex

(Seattle,WA)

粒细胞  Schering-Plough  AIDS

巨噬细胞菌落  (Madison,NJ)

刺激因子  AIDS,与AZT合用

HIV核心颗粒  Rorer  血清阳性HIV

免疫刺激剂  (Ft.Washington,PA)

IL-2  Cetus  AIDS,与AZT

白介素2  (Emeryville,CA)  联合用药

IL-2  Hoffman-La Roche  AIDS,ARC,HIV,

白介素-2  (Nutley,NJ)  与AZT联合用药

Immunex

静脉内免疫球蛋白  Cutter Biological  儿童艾滋病,与

(人)  (Berkeley,CA)  W/AZT联合用药

药物名称  生产厂家  功用主治

IMREG-1  Imreg  AIDS,Kaposi's

(New Orleans,LA)  肉瘤,ARC,PGL

IMREG-2  Imreg  AIDS,Kaposi's

(New Orleans,LA)  肉瘤,ARC,PGL

Imuthiol二乙基  Merieux Institute  AIDS,ARC

二硫氨基甲酸酯  (Miami,FL)

α-2干扰素  Schering Plough  Kaposi's肉瘤

(Madison,NJ)  w/AZT:AIDS

蛋氨酸  TNI Pharmaceutical  AIDS,ARC

内啡肽  (Chicago,IL)

MTP-PE  Ciba-Geigy Corp.  Kaposi's肉瘤

胞壁酰基三肽  (Summit,NJ)

粒细胞  Amgen  AIDS,与W/

菌落刺激因子  (Thousand Oaks,CA)  AZT联合用药

药物名称  生产厂家  功用主治

rCD4  Genentech  AIDS,ARC

重组可溶性  (S.San Francisco,

人CD4  CA)

rCD4-IgG杂交体  AIDS,ARC

重组可溶性  Biogen  AIDS,ARC

人CD4  (Cambridge,MA)

α2a干扰素  Hoffman-La Roche  Kaposi's肉瘤

(Nutley,NJ)  AIDS,ARC,与W/

AZT联合用药

SK&F106528  Smith,Kline & French  HIV感染

可溶性T4  Laboratories

(Philadelphia,PA)

Thymopentin  Immunobiology  HIV感染

Research Institute

(Annandale,NJ)

肿瘤坏死  Genentech  ARC,与W/γ

因子  (S.San Francisco,CA)  干扰素联合用药

抗感染药

药物名称  生产厂家  功用主治

带伯氨喹的  Upjohn  PCP

氯林可霉素  (Kalamazoo,MI)

Fluconazole  Pfizer  隐球菌性脑膜炎,

(New York,NY)  念珠菌病

制霉菌素锭剂  Squibb Corp.  预防口腔念珠菌病

(Princeton,NJ)

Ornidyl  Merrell Dow  PCP

Eflornithine  (Cincinnati,OH)

羟乙磺酸  LyphoMed  PCP治疗

戊烷脒  (Rosemont,IL)

(IM&IV)

Piritrexim  Burroughs Wellcome  PCP治疗

(Rsch.Triangle

Park,NC)

羟乙磺酸  Fisons Corporation  PCP预防

戊烷脒吸入剂  (Bedford,MA)

药物名称  生产厂家  功用主治

螺旋霉素  Phone-Poulenc  隐性担孢子菌性

Pharmaceuticals  腹泻

(Princeton,NJ)

Intraconazole-  Janssen Pharm.  组织胞浆菌病

R51211  (Piscataway,NJ)  隐球菌性脑膜炎

Trimetrexate  Warner-Lambert  PCP

其他

重组人促红素  Ortho Pharm.Corp.  严重贫血并发症

(Raritan,NJ)  和AZT疗法

甲地孕酮  Bristol-Myers  艾滋病及厌食

(New York,NY)  并发症的治疗

总肠内营养剂  Norwich Eaton  腹泻与相关性

Pharmaceuticals  吸收障碍

(Norwich,NY)

应当指出，本发明抗-HIV抗体与艾滋病抗病毒剂、免疫修饰剂、抗-感染剂或疫苗的组合物范围不限于上表中所述，但原则上包括任何用于治疗艾滋病的药物组合物的任何组合物。

下述实施例是对本发明的解释，但不限制本发明。

实施例1

最大量地生产抗HIV-1的人单克隆抗体

此项研究的目的是检查最佳条件以用于建立产生抗HIV-1的人mAbs的细胞系。

方法

用EBV转化来源于74个HIV血清阳性病人的外周血淋巴细胞。在经过辐射的GK5喂养细胞中通过双倍稀释（5000至10细胞/井）将产生抗HIV抗体的培养液繁殖并克隆几次。74个样品中的5个既通过克隆方法又通过融合处理。在第一次克隆进行的同时（即起始培养后5-7周），取繁殖的培养物中的淋巴样干细胞与杂骨髓瘤SHM-D33细胞融合。以100至1细胞/井克隆抗HIV阳性杂交。通过ELISA，Western吸印和RIP，检测mAbs的特异性。

结果

通过EBV单独转化的存活PBL产生合成人mAbs的两个细胞系。但是当EBV-转化的细胞与SHM-D33融合时，获得了5个制备人mAb的杂交系。把所有细胞系培养6-12月。

表Ⅰ

稳定

病人编号  EBV系  稳定杂交体  同型  特异性

167  None  167-7-D  IgG1,lambda  gp41

181  None  181-1-D  IgG2,kappa  gp41

240  None  240-1-D  IgG1,kappa  gp41

238  238-2  238-2-D  IgG1,lambda  p24

241  241-1  241-1-D  IgG1,lambda  p24

用EBV转化血细胞，然后融合到一种杂交骨髓瘤上，似乎是产生抗HIV-1的人mAb的最有效方法，并且比单独用EBV转化更有效。

实施例2

对象：

选择41位无症状HIV-血清阳性个体参加此项研究。通过商业上购得的ELISA（Genetic  Systems）检测和使用Novapath  Immunoblot  Assay（Bio  Rad）进行Western印迹分析确证抗HIV-1血清抗体的存在。通过使用一种Cytofluorograf  Ⅱ（ortho）进行流体血细胞计数，利用Leu  3  a和Leu  2  a抗体（由Becton-Dickinson提供）确定来源于各个受试者的淋巴细胞的CD4和CD8表型。使用一种Coulter计数器进行外周血白细胞计数，并手动进行分辨计数。

使用一种免疫学分期系统将病人按疾病进展情况分类，以便根据下面、以前所述的标准（Zolla-Pazner，S.et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）84：5404（1987））将病人分成4类。

等级序号 CD4:CD8比 CD4细胞数/mm³淋巴细胞数/mm³

0  >1.0  >500  >1500

1  <1.0  >500  >1500

2  <1.0  <500  >1500

3  <1.0  <500  <1500

用于筛选的合成肽

用固相方法（Peninsula  Laboratories，Inc.Belmont，CA）合成全长是HIV-1的MN株的gp120V3环的23个氨基酸的肽（23个聚体肽）。该肽具有下列序列：TyrAsnLysArgLysArgIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsnIleIleGly（SEQ.ID.NO.：2）。将这个肽用于ELISA检测以筛选与之反应的抗体。

建立EBV-转化的细胞系

Gorny等人于1989年（如上所述）描述了能合成抗HIV-1mAbs的人细胞系生产方法。将外周血单核细胞与Epstein-Barr病毒（EBV）保温并在96-孔微滴板上培养3-4周。将该23-聚体肽用于ELISA在培养上清液中筛选抗体，之后，使从培养物中得到的具有上清液抗体阳性的细胞扩展，继续培养几次，最后进一步扩展到烧瓶中，这些细胞称为淋巴样干细胞。

细胞融合

使杂交骨髓瘤（鼠-人杂交体）SHM-D33（Teng  N.H.et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：7308（1983））在补充有15%胎牛血清，2mM  L-谷氨酰胺，青霉素（100单位/ml）和四环素（100μg/ml）（完全培养基）的Iscove′s修饰的Dulbecco′s培养基中生长。将杂交骨髓瘤细胞与抗生素G418以200μg/ml进行周期性培养，以清除新霉素-敏感变异体。

在融合之前两天，将SHM-D33细胞以1-2×10⁵细胞/ml浓度培养（对数生长期）。通过视紫红质B染色排除法确定该细胞的存活率超过95%。

将SHM-D33细胞在磷酸缓冲盐溶液中洗涤两次，然后与从起始培养物中扩展但常未被克隆的淋巴样干细胞一起混合。以1∶3的比率混合细胞，并离心。然后，将1ml的50%聚乙二醇1300-1600（Sigma Chemicals）滴加到沉淀小丸上过一分钟，整个过程不断搅拌，并继续一分钟。在接着的5分钟中，用Iscove′s培养基缓慢稀释该细胞，以200×g离心沉淀之后，将该细胞轻轻地再悬浮于完全培养基中，并以8×10⁴细胞/100μl/孔的浓度置于96-孔微量平板上。第二天，向每孔中加入1×10⁴鼠腹膜细胞作为供养细胞，并且在0.5mM次黄嘌呤，0.2μM氨基喋呤，16μM胸苷（HAT）和1μM鸟本苷（Sigma Chmicals）存在下继续培养。用补充有HAT的新鲜完全培养基每周重复供养两次。两至三周之后，对所有培养孔筛选抗上述肽的抗体的产生，并将产生能与23-聚体肽反应的抗体的异种杂交体扩展到24-孔平板中。以每孔100，25，和（至少两次）1个细胞的浓度克隆那些通过ELISA测定能产生最高含量抗体（和IgG）的杂交体。

抗体检测和特征化

通过ELISA筛选抗23-聚体的培养上清。用稀释于碳酸钠缓冲液，PH9.6的合成肽（1μg/ml）于4℃覆盖Immulon  2平板（Dynatech）过夜。洗涤平板三次，并将培养上清液加到每个孔中，于37℃下保温90分钟，然后洗涤。加入结合到碱性磷酸酶（Zymed  Laboratories）上的山羊抗-人IgG（γ链特异性），并于37℃再保温90°分钟，然后如上进行洗涤。加入底物，对-硝基苯基磷酸盐（Sigma  Chemecals）30分钟，在一种MR700微量平板读数器上（Dynatech）于405nm处读出吸收率。

通过放射免疫沉淀法（RIP）测定抗体结合特异性。通过Pinter et al.方法使用了Bolton-Hunter试剂（New England Naclear）进行RIP检测（J.Immunol.Meth.112：735（1988）），该方法使用了30μg的HTLV-IIIB溶解产物（Organon Teknika）和/或MN溶解产物（Advanced Biotechnologies，Inc.），该产物已用¹²⁵I进行标记。将培养物上清物与病毒溶解产物一起保温，并按Gorny等人（如上所述）和Pinter等人（如上所述）描述的方法进一步处理。

分析人抗体

通过ELISA确定抗体同型。用1μg/ml的23聚体覆盖Immulon2平板，并与培养上清液一起保温。用抗人IgG四种亚单位（Zymed  Laboratories）的碱性磷酸酶标记的鼠mAbs检测IgG  mAb的亚型。

利用抗人K链或λ链的兔抗体（Da  Kapatts）覆盖的微量平板通过ELISA分析mAb的轻链。所用的发生抗体（developing  antibody）分别是碱性磷酸酶结合的山羊抗-人k链和山羊抗人λ链（Sigma  Chemicals）。

通过ELISA还对IgG进行定量分析。用山羊抗-人IgG（γ链特异性）覆盖平板，并与系列稀释的培养上清液一起保温。用碱性磷酸酶标记的山羊抗-人IgG（γ链特异性）检测结合的IgG。用亲和纯化的人IgG（Organon  Teknika-Cappel）作为标准物。用一种自动MR-700微量平板阅读器（Dynatech  Laboratories）阅读平板，并产生标准曲线。

表位图谱测定

使用表位图谱测定药盒（Cambridge  Research  Biochemicals，Valley  Stream，New  York）测定mAb的良好特异性，该方法是使用了Gegsen等人建立的方法（Geysen，H.M.et  al.Proc.Natl.Acad.Sci（USA）81：3998-4002（1984））在塑料针上合成六肽。在塑料针上用两个其他的控制肽原位合成全长23聚体的18个连续、重叠的六肽。根据厂家的说明使肽去除保护、洗涤并干燥。由于塑料针的结构适合于96-孔微量平板，按照厂家的建议在标准微量平板上进行ELISA检测。因此，使所有的含肽针与来源于被测细胞系的培养上清的1∶10稀释液在含有1%卵白蛋白和1%牛血清白蛋白的0.1%吐温-20的PBS进行反应。之后，洗涤塑料针，并使之与辣根过氧化酶结合的山羊抗-人IgG反应。在一种Dynatech  MR-700平板阅读器上于405nm处阅读颜色反应的吸收率。

结果

对来源于41个HIV-血清阳性个体的总共46份血样进行处理并用EBV转化。培养3到4周以后，通过ELISA发现平均2.9%的孔是抗V3环23聚体的抗体阳性。表Ⅱ表明等级序号为1的受试组中阳性孔的百分比略有增加，但是病情不同严重程度的病人出现阳性培养物的情况没有显著差异。

表Ⅱ

由EBV转化的人淋巴细胞产生的特异于MN菌株gp120V3环23聚体的抗体等级序号  培养物的#  孔的#  阳性孔的#(%)

0  1  610  16(2.6%)

1  17  4363  176(4.0%)

2  21  7340  171(2.3%)

3  7  2880  81(2.8%)

将来源于阳性孔的淋巴样干细胞进一步扩展到24孔平板中，并使用23聚体肽通过ELISA每周一次检测新鲜培养物上清液中的抗体特异性。通过双倍稀释（从每孔10，000至10细胞）对能高水平产生抗23聚体特异性抗体的两个淋巴样干细胞系，257-2（ATCC＃CRL10483）和268-11（ATCC＃CRL10482），进行克隆。对以最低细胞密度平板培养孔中得到的继续产生抗体的细胞以100至10细胞/孔进一步克隆三次。

在原始克隆的同时，将两个淋巴样干细胞系（257-2，268-11）与杂交骨髓瘤SHM  D-33融合。所有孔中都表现有杂交细胞生长。融合后三周，在用257-2异杂交体平板培养的183个孔中有50个孔（29%）和在用268-11异杂交体平板培养的48个孔中有43个孔（90%）中发现含有抗23聚体的抗体。从每个融合中，将产生最高浓度抗体（根据ELISA的吸收值）的十八个克隆扩展到24孔平板上。每周监测抗体的产生情况，选择产生最高特异性抗体和IgG浓度的上清液的细胞，进行克隆。以100和25细胞/孔克隆异杂交瘤并以1细胞/孔进一步克隆两次。

淋巴样干细胞系257-2（ATCC＃CRL10483）和268-11（ATCC＃CRL10482）分别产生6.4和3.8μg IgG/ml/10⁶细胞/24小时，同时相关的异杂交瘤257-2D（ATCC＃HB10480）和268-11D（ATCC＃10481）分别产生20.5和11.3μg IgG/ml/10⁶细胞/24小时。当后者以1ng/ml的低浓度结合到微量滴定板的孔中时，在ELISA反应中mAbs表现出与23聚反应（图1）。

通过RIP进一步定义这些mAbs的特异性，其结果如图2中所示。两种mAbs都与env-编码的HIV_MN的蛋白gp120反应，但不与来源于HTLV-III_B的gp120反应，揭示了这些mAbs的类型特异性。

发现该mAbs是带有λ轻链IgG同型的。表Ⅲ表示了两种EBV转化的母细胞系和两个相关异杂交瘤的一些特征。该异种杂交瘤在24小时内产生三倍于EBV转化细胞系产生的IgG，尽管该EBV转化细胞系比现有技术中记载的大多数EBV转化细胞系产生相当多的IgG（Kozbor，D.et  al.，Immunol.Today  4：72（1983）;Casali，P.et  al.，Science  234：476（1986）;和Steinitz，M.et  al.，Nature  269：420（1977））。

表Ⅲ

能产生抗MNgp120  V3环的23聚体的人

单克隆抗体的细胞系的特征

细胞系 活化 同型 IgG浓度^*

257-2  EBV  IgG1  6.4

268-11  EBV  IgG1  3.8

257-2D  EBV+融合  IgG1  20.5

268-11D  EBV+融合  IgG1  11.3

^*μg/10⁶个细胞/ml/24小时

为了定义每种抗体的良好特异性，用重叠六肽进行表位图谱测定，该重叠六肽代表了有5个氨基酸重叠的连续六肽重叠。以四倍的量合成每种肽，这样能够在一个微量平板上同时检测四个样本。该重叠抗原区和这些实验结果见表Ⅳ。

一份血清阴性血清不具有反应性。血清阳性血清样本（从HIV-血清阳性个体中获得的血清1∶1000的稀释液）在上述背景水平与所有塑料针反应，与在V3环的顶端和右边有区域PGRAFYTT（SEQ.ID.NO.：3）的三个塑料针出现反应峰。

MAb  257-2D的1∶10稀释液（3.7μg/ml）与代表环R-K-R-I-H-I-G（SEQ.ID.NO.：4）顶端左边的氨基酸309-315的两个相连六肽强烈结合。MAb268-11D（5.4μg/ml）与覆盖氨基酸序列H-I-G-P-G-R（SEQ.ID.NO.：5）的一种六肽结合。表Ⅳ表示了能被两个mAbs识别的重叠抗原区。

表Ⅳ

人血清和人单克隆抗体与MN  gp120  V3

环的六肽的反应性

ELISA  反应活性  (吸收单位)

针#  SEQ.ID.NO.  六肽  HIV+  HIV-  257-2D  268-11D

血清  血清

3  6  YNKRKR  .338  .195  .256  .243

4  7  NKRKRI  .339  .200  .288  .283

5  8  KRKRIH  .251  .184  .259  .239

6  9  RKRIHI  .308  .1831  .781  .252

7  10  KRIHIG  .286  .1701  .592  .179

8  11  RIHIGP  .302  .177  .276  .135

9  12  IHIGPG  .267  .197  .130  .132

10  13  HIGPGR  .269  .185  .1561  .011

11  14  IGPGRA  .361  .191  .163  .164

12  15  GPGRAF  .243  .103  .208  .132

13  16  PGRAFY  .586  .237  .456  .346

14  17  GRAFYT  .582  .239  .272  .283

15  18  RAFYTT  .658  .239  .333  .350

16  19  AFYTTK  .257  .197  .233  .222

17  20  FYTTKN  .384  .233  .273  .274

18  21  YTTKNI  .362  .171  .259  .259

19  22  TTKNII  .284  .191  .219  .212

20  23  TKNIIG  .305  .198  .164  .141

这些结果表明257-2D识别的最小反应肽（表位核心）是KRIHI（SEQ.ID.NO.：23），它位于V3环保守区顶端的左侧，侧端的N-和C-末端精氨酸和甘氨酸残基也有助于这些mAb的结合。该mAb286-11D结合到一个由HIGPGR（SEQ.ID.NO.：5）组成的单一六肽上，它覆盖了该环的顶端和两个临近N-末端氨基酸。

实施例3

在不延长EBV转化的淋巴细胞扩展情况下

人异种杂交瘤的产生

方法

通常是在24孔微滴板中EBV活化细胞扩展2-3周之后进行EBV转化细胞与异杂交瘤SHM-D33的融合。与等同于培养起始后5-7周。但是，扩展阶段对于mAb的产生非常重要，因为大多数（至少90%）的培养物孔在这一期间变为对mAb的产生呈阴性。因此我们测试了另外一种方法，其中不包括扩展阶段，并且是在培养起始后3-4周发生融合。因此，在培养起始3-4周后筛选培养EBV转化细胞的96孔平板中抗HIV-1抗体的存在。收集所有产生抗HIV抗体的孔中的细胞，并按照实施例2所述立即与杂交骨髓瘤SHM-D33融合。

结果

来源于4个HIV-血清阳性个体的PBL，在EBV转化并早期融合之后，产生了8个分泌抗HIV-1mAb的细胞系。通过RIP和ELISA测定，六个mAb抗p24而有2个mAbs抗HIV-1的gp41。通过如实施例1和2中所述EBV-转化或EBV-转化和融合从300个病人中获得21个稳定细胞系。这等同于当使用20-40ml的病人血样时每100个病人样本中的6-7个细胞系。使用本实施例中所述的“早期融合方法”，从4个病人样本中获得8个细胞系，获得稳定的产生抗体的细胞系的效率明显增加。

讨论

在不扩展阳性孔的情况下进行的EBV转化细胞的早期融合，在抗HIV-1人mAbs产生方面，比我们的已有技术更为有效。

实施例4

单克隆抗体亲和性测定

使用B.Friguet等人所述的方法（J.Immunol.Methods 77：305-319（1985））测定人mAbs的分离常数（Kd）。概括起来说，也就是在分别为0.5和0.6μg/ml的浓度下测定257-2D和268-11D的培养上清液。将上述的20聚体（MW＝2702Da）溶于蒸馏水中达到1mg/ml的浓度（3.7×10^-4M），稀释在磷酸缓冲的盐溶液中，PH7.2，并在浓度范围10^-5至10^-8M时使用。将上清液与肽等体积混合，16小时后，将混合物加到用23聚体（1μg/ml）覆盖的平板上，并通过ELISA测定未结合的mAb的量。根据Friguet对Klotz方法的修饰方法（Friguet et al.，如上所述）将测得数据绘图以确定Kd。

发现mAbs257-2D和268-11D的Kd分别是2.3×10^-7和5.9×10^-7M。这些数据在其他人所报告的有关IgG mAbs的数值范围之内（Friguet et al.，如上所述;Larsson，A.et al.，Molec.Immunol.24：569-567（1987））。由人淋巴样干细胞系（257-2和268-11）产生的mAbs的Ka与那些由相关异杂交瘤（257-2D和268-11D）产生的抗体的Kd相类似。上述的Kd是用于mAbs与20聚体肽的结合。由于完整蛋白分子和mAbs与之反应的表位相符合所产生的作用，这些mAbs的Ka对于天然gp120分子来说偏低。

实施例5

中和HIV感染

使用一种测定对HIV感染MT-2细胞的抑制情况的噬菌斑检测方法，在人补体存在或不存在的情况下测定本发明mAbs的中和活性（C.V.Hanson  et  al.，J.Clin.Micro.128：（1990）;Harada  et  al.，（1985），Science，229，pp.563-566）。因此，将mAbs在50%检测培养基（Hanson  et  al.，如上所述）和50%正常人血浆库中系列稀释。该血浆库作为人补体的来源;为了在补体存在下进行研究，将mAb和病毒在37℃下保温18小时。为了在不存在补体的情况下进行测试，将血浆加热灭活并在这些条件下于37℃将mAb和病毒保温1小时。通过使用对每种稀释液平均噬菌斑数的第三类回归分析这种内插法，根据噬菌斑数来对中和了50%的加入病毒的稀释液进行计算。

结果

当在加入到容纳MT-2细胞之前将来源于257-2D和268-11D的上清液与HIV_MN共培养1小时（无补体），在1∶4，700和1∶2，000的稀释液（相应mAb浓度分别为3.0和23.0ng/ml）中达到50%中和（表5）。没有观察到HTLV-ⅢB的中和作用。

当以一种更敏感的检测方法测试来源于257-2D和268-11D的mAbs时，其中将抗体在人补体存在下与病毒保温18小时，在1∶44，000和1∶41，000的稀释液中（相应的mAb浓度分别为0.3和1.1ng/ml）达到中和。而且，在这些条件下没有出现对HTLV-IIIB的中和。

对Gorny，M.K.等人以前描述的抗HIV横跨膜蛋白gp41特异的人mAb50-69和特异于核心蛋白的p24的mAb71-31进行平行测定，并对于HIV的每一株基本上没表现中和活性。

表Ⅴ

抗HIV人单克隆抗体的中和活性

中和抗体滴度（ng/ml）

1小时  无C'  18小时+C'

mAb  特异性  MN  IIIB  MN  IIIB

257-2D  gp120  1:4700(3)  阴  1:44000(0.3)  阴

268-11D  gp120  1:2000(23)  阴  1:41000(1.1)  阴

50-69  gp41  1:3  阴  1:3  阴

71-31  p24  neg  阴  neg  阴

实施例6

抗HIV-1  V3环的人mABS

与不同病毒株的反应

使用上述的方法，制备能产生抗HIV_MNgp120V3环的人mAbs的其他EBV转化的细胞系和异杂交瘤。几种杂交骨髓瘤分别命名为386-D，391-D，419-D，447-52D，477-D，311-11D，391-95D，和412-D。如下面的表6所示，将这些mAbs中的某些mAbs的反应类型与257-2D和268-11D（上述）的反应类型进行比较。

表Ⅵ

六个抗gp120的人单克隆抗体的HIV型特异性和中和活性

在ELISA中与合成V3的反应活性  中和反应

mAb  核心表位  IIIB  MN  SF-2  RF  IIIB  MN  SF-2  RF

257-2D  KRIHI  -  +  +  +  -  +  +  -

(SEQ.ID.NO.24)

268-11D  HIGPGR  -  +  +  +  -  +  +  -

(SEQ.ID.NO.:5)

386-D  HIGPGR  -  +  +  +  -  +

(SEQ.ID.NO.:5)

391-95D  *  -  +  +  -  -  +

419-D  *  -  +  +  -  -  +

447-52D  GPGR  +  +  +  +  +

(SEQ.ID.NO.:25)

311-11D  RKRIHIGPGRAFYTT  -  +  +  -  -  +

(SEQ.ID.NO.:26)

412-D  (conformational)  +  +  +  -  -  -

^*没测定

从这些结果可得出如下结论：（1）V3环的顶端构成可被人mAbs识别的表面抗原决定簇;（2）人mAbs在ELISA中与某些或所有来源于不同HIV-1株的合成V3肽呈交叉反应;（3）所有检测的抗-V3（MN）人mAbs中和该MN病毒，包括一种主要抗其N末端至该环的最保守区的一个区域的mAb（257-2D）;（4）甚至当核心抗原决定簇中5个氨基酸中的2个发生改变时可出现交叉中和反应（如，257-2D与MN和SF-2反应）但在核心抗原决定基中的某些改变会消除中和活性（如，268-11D与MN反应但不与IIIB反应）;和（5）用ELISA检测的交叉反应性比生物检测中测得的交叉反应性的严格力差得多。

为了进一步识别能与HuMoAb  447-52D反应的抗原决定基，检测HuMoAb与一系列18个六肽的反应活性，这些六肽覆盖了由筛选时用的23聚体代表的V3_MN区;每一个六肽与其相临的六肽有5个氨基酸重叠。用Geysen等人（14），的方法在聚乙烯针上原位合成的六肽与含有29μg/ml HuMoAb的培养上清反应。图1表明HuMoAb与三个六肽，HIGPGR SEQ.ID.NO.：13，IGPGRA SEQ.ID.NO.：14和GPGRAF SEQ.ID.NO.：15发生反应。这些数据表明，与HuMoAb 447-52D具有特异性的抗原决定簇是hiGPGRaf，其中的氨基酸代码大写字母代表抗原决定簇的核心，而小写字母代表旁侧的氨基酸，这些氨基酸也有助于抗原决定基的结合。

为了确定这个区域中那些氨基酸对于HuMoAb的结合是至关重要的，在聚乙烯针上合成一系列六肽，以便用19个氨基酸中的每一种，氨基酸替代HIGPGR六肽中的每一个残基。因此，合成115个六肽，并且用每一种以mg/ml的浓度与HuMoAb  447-52D反应。这项实验的结果示于图7，并且表明HIGPGR的第一、第二和第5个残基在变化很大的情况下仍能表现出可测的反应活性。到目前为止所测序的病毒分离物中从未或仅仅很少见到不允许的替代，如，用C，D和E替代第二位的Ⅰ（Meyers  et  al.，（1990），Theoretical  Biology  and  Biophysics，Los  Alamos;La  Rosa  et  al.，（1990），Science，249，pp932）。但是，为了不消除该肽与HuMoAb的反应能力，这个六肽的第三、第四和第六残基是不能改变的。这些数据表明，HuMoAb  447-52D的核心抗原决定簇最正确的表示为GPXR，而且这个表位所侧带的氨基酸序列对于此核心抗原决定基的抗体识别基本没有作用。

实施例7

人mABS与不同HIV株的V3环合成肽的交叉反应性和亲和性之间的关系

通过直接的ELISA测定上述人mAbs抗不同合成肽（19聚体至23聚体）的反应活性，这些合成肽已以1μg/ml的浓度覆盖在平板上。按照上述实施例4所述的方法以与这些肽结合的分离常数的形式测定抗体亲和性。

结果列于表7。在ELISA中，抗-V3人mAbs以2-4μg/ml浓度与HIV-1毒株MN，SF-2和RF的V3区合成肽有交叉反应。没有检测到与来源于HIV-1毒株IIIB的V3肽有反应。对于结合这些肽的Kd范围从≥10^-6M（268-11D结合RF）至10^-7M（268-11D结合MN）。

表Ⅶ

与来源于下述的V3的

相对  ELISA反应性

mAb  核心表位  结合亲和性  MN  SF-2  RF  IIIB

257-2D  KRIHI  MN=SF2>>RF,IIIB=0  1.8*  1.6  1.6  0.3

(SEQ.ID.NO.24)

268-11D  HIGPGR  MN>SF2>RF,IIIB=0  1.9  1.9  1.3  0.2

(SEQ.ID.NO.5)

386-D  HIGPGR  MN>SF2>>RF,IIIB=0

(SEQ.ID.NO.5)

*在410nm处的吸收值单位

从这些结果可得出如下结论：（1）按照ELISA测定或抗体亲和性，抗HIV-1V3区的人mAbs表现出与不同毒株V3区的交叉反应活性;（2）人mAbs对不同V3肽的亲和性可以有大约1-多个顺序量的改变或更多;（3）对于亲和性的差别不能简单地用相关表位中的氨基酸序列解释;和（4）具有相同表位特异性的人mAbs对于不同V3肽其亲和性也有所变化。

实施例8

使用上述方法产生并检测了一些其他的人mAbs。这些抗体及其特异性和亲和性特征描述于下表8。

对5个人mAbs的分离常数和中和能力之间的相关性进行了分析。这些结果表明这两个特征之间有直接的联系，这说明与来源于Ⅴ3环的23聚体肽的结合亲和性是表示病毒中和反应效率的一个良好预示指标。

表Ⅷ

抗HIV-1gp120表位的人单克隆抗体的特征

                        ELISA        反应性        *

人mAb    同型     表位    MN  SF-2    RF    NY5  IIIB  ELI

257-2D   IgG1,λ  KRIHI    +    +      +     +     -    -

268-11D  IgG1,λ  HIGPGR   +    +      +     +     -    -

386-D    IgG,λ   HIGPGR   +    +      +     +     -    -

447-52D  IgG3,λ  GPGR     +    +      +     +     +    -

447-D    IgG1,λ  HIGP     +    +      -     -     -    -

311-11D  IgG1,λ′  **     +    +      -     +     -    -

391-95D  IgG1,Kappa  **    +    +      -     +     -     -

419-D    IgG1,λ   **      +    +      -     +     -     -

412-D    IgG1,λ   **      +    -      -     +     -     -

表VIII(续)

IgG 50%

亲和性(Kd in mM)  滴度

人  mAb  MN  SF-2  RF  IIIB  ng/ml

257-2D  .23  .22  1.7  NT  1.0

268-11D  .59  2.3  5.3  NT  1.0

386-D  .18  .85  1.7  NT  1.2

447-52D  .56  .32  96  43  NT

447-D  NT  NT  NT  NT  NT

311-11D  7.4  6.0  NT  NT  392.0

391-95D  .9  14.4  NT  NT  4.9

419-D  3.8  .23  NT  NT  12.0

412-D  27  NT  NT  NT  Neg

表VIII(续)

NT：未测试

＊：除447-D以＜5mg/ml测试外，均以10mg/ml对mAbs测试。

＊＊：用表位图谱药盒不确定，但表现出与肽RKPIHIGPGRAFYTT的反应性。

IgG  50%滴度是指中和滴度，以ng/ml表示在无补体情况下18小时该抗体表现出50%中和（257-2D和268-1D除外，它们是无补体情况下1小时测试）。

人mAbs的相关亲和性（从低到高）

HIV

抗原 1.0 1.0 (K_din mM)

MN  412<311<419<391<268=447<257<386

SF-2  311<391<268<386<447～419～257

实施例9

制备一种重组447-52D抗体

制备一种抗体，其中轻链的可变区含有一个信号肽和附带有轻链内含子序列的融合到一个含有人λ2不变区的短内含子片段和λ2不变编码区的DNA片段上的异杂交瘤447-52D轻链可变区的变体。重链可变区同样来源于异杂交瘤447-52D重链V区，并附带有相同的信号序列和一个重链内含子序列，它融合到一个含有人γ1不变区的短内含子片段和基因组形式的人γ1编码区的DNA片段上。

使用标准方法从447-52D异杂交瘤细胞中提取总RNA，该方法是用异硫氰酸胍溶解细胞（Chirgwin et al.，Biochem.18：5294-5299[1979]）。在一种Applied Biosystem 381A DNA合成仪上，通过标准氨基磷酸酯（Phosphoramidite）方法合成一系列寡聚脱氧核苷酸引物（图1），它们代表了人λ轻链可变区和λ轻链不变区的信号肽内序列，或人重链可变区和重链γ3不变区的框架1中的序列。用浓NH₄OH处理后，再在一种NAP-5柱（Pharmacia）上用H₂O洗脱（当寡聚物＜45碱基长时），或者用一种OPC柱子（Applied Biosystem Inc.）按厂家说明用20%乙腈洗脱（当寡聚物＞45碱基长时），来完成从树脂上去掉寡聚脱氧核苷酸（oligos）。使用AMV反转录酶（200单位，BRL）和10pmoles溶于一种含有50mM TRISHCI，PH8.3，75mM KCl，3mM MgCl₂，10mM DTT，和20单位RNAsin（Pharmacia）的缓冲液（最终体积20μl）中的、代表重链或轻链的不变区互补链引物，在42℃下将总RNA（2μg）反转录30分钟。加热使反转录酶灭活（95℃，5分钟），并使反应液再加入100μl的PCR缓冲液（10mM TRIS HCl，PH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.01%明胶，每种dNTP200μM），50pmole的每种配对引物，和2.5单位的Taq聚合酶（Perkin Elmer/Cetus）。基本上按照Saiki等人，Science 230：1350-1354（1985）和其他人（Mullis et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263：273[1986];Dawasaki and Wang，PCR Technology，Principles and Applications for DNA Amplification，Erlich，Ed.，Stockton Press，NY，pp.89-97（1989）;Tang et al.，ibid.pp.99-104[1989]）所述进行聚合物酶链反应（PCR）扩增。用一种DNA热循环仪Thermal Cycler进行45轮扩增之后（Perkin Elmer Cetus Instruments;1′，94℃;2′55℃;2′72℃），通过凝胶纯化所需的1400和700碱基对（bp）DNA片段。在将这些DNA进一步克隆到中间质粒中之前，用EcoRI（重链）或Eco RI和SalI（轻链）消化该DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将重链cDNA克隆到pUC18的衍生物中，在pUC18中已将NcoⅠ和NotⅠ位点置于已经存在的KpnⅠ和BamHⅠ位点中间，并将轻链克隆到pUC18中。从在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上按所述方法生长（Maniatis et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1982）的DH5转化的大肠杆菌中，分离代表这些PCR扩增序列的多克隆。使用Birnboin和Doly的DNA制备方法从细菌中提取质粒DNA（Nucleic Acid Res.7：1515（1979），并使用测序酶Sequenase

（United States Biochemicals）和开始使用T7和SP6特异性测序引物（Boehringer Mannheim）按厂家提供的方法对双链质粒DNAs进行DNA序列测定。获得了一个代表人γ3重链的特定DNA序列，和人λ轻链序列。

通过PCR扩增合成代表产生5个DNA片段所必需引物的8个寡聚脱氧核苷酸（图3）。除末端寡聚脱氧核苷酸外，结合到所有寡聚脱氧核苷酸上的是那些与447-52D异杂交瘤的重链V-区或轻链V-区相应的序列，或者是与结合到447-52D  V-区上的信号序列和内含子片段互补的序列，并且至少15个碱基的5′-末端互补性（见图3和4）。使合适的引物对（各50pmole）与10ng代表447-52D重链cDNA或447-52D轻链cDNA的质粒DNA，2.5单位的Taq  DNA聚合酶，PCR反应成份和缓冲液结合，并进行25轮PCR扩增（循环周期：1′94℃;1′，55℃;2′72℃）。在这五个反应的产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化，再与一种末端寡聚脱氧核苷酸引物对（图3-4），Taq  DNA聚合酶，PCR反应成份和缓冲液适当结合（10ng的每种DNA片段），按照上述方法通过PCR对得到的重组片段进行25轮扩增。在用HindⅢ和XhoⅠ对附带信号序列和内含子序列的重链V-区进行限制性内切酶消化之后，通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA，并将其克隆到一种含有人γ1不变区的按下述方法获得（如图5所示）的载体（p9103）合适位点。从CoSIg9粘性质粒克隆（Flanagan  and  Rabbits，Nature300：709-713，1982）中纯化DNA作为人γ1不变区PCR扩增的模板。将合适的引物对（G1和G2，图1），各50pmole，与10ng含有人γ1不变区外显子的粘性质粒DNA，2.5单位的Taq  DNA聚合酶结合。并进行25轮PCR扩增（循环周期：1′，94℃;1′，55℃;2′72℃）。用XhoⅠ和EcoRⅠ核酸内切酶消化PCR产物，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化，然后克隆到已用上述的限制酶消化的p9102载体中。使用代表含有上述来源的447-52D重链可变区，和由基因组DNA  PCR扩增来源的人γ1不变区的载体的单个克隆，来证实重组修饰的447-52D编码区的DNA序列（图2a）。

用HindⅢ和XbaⅠ消化上述PCR扩增的信号和内含子附带的轻链V-区，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化这一DNA片段，之后构建447-52D人轻链重组载体。将预先已用HindⅢ和EcoRⅠ消化的编码这个V区的DNA与代表人轻链不变区外显子的DNA片段一起克隆到pSP72/58.2/L16VH/γ1MRC（如下述），通过PCR扩增10ng的质粒＃208DNA获得后一片段，它含有包括有人λ2不变区位点的EcoRⅠ/HindⅢ片段。将合适的引物对（C1和C2，图1），各50pmole与质粒DNA，2.5单位的Taq  DNA聚合酶结合，并进行25轮PCR扩增（循环周期：1′，94℃;2′55℃;2′，72℃）。用XbaⅠ和EcoRⅠ限制酶消化此反应的620碱基对产物，并且在最后进行上述的三片段连接之前通过琼脂糖凝胶电泳纯化。在用HindⅢ和EcoRⅠ消化并进一步进行琼脂糖凝胶电泳之后，对这些所得克隆的分析表明有大约1.2千碱基的编码所需轻链的插入区。使单个细菌克隆生长后获得DNA，并使用测序酶Sequenase 和开始时使用T7和SP6特异性测序引物进行DNA序列测定以证实重新构建的可变区和其旁侧λ不变区（图2b）的序列。使代表447-52D重链和轻链表达载体的质粒DNAs生长（Maniatis et al.，如上所述），并纯化，用于转染到受体哺乳动物细胞中（Maniatis et al.，如上所述，Birbion and Doly，如上述）。

从除了含有不同免疫球蛋白编码序列外其他均相同的质粒转录重链和轻链免疫球蛋白分子。优选的免疫球蛋白表达载体的前体，是一种上述的含有部分HIV-1LTR启动子（-117至+80，相对于帽位点），一种多克隆位点，和SV40后期多聚腺苷酸化信号（图6）的前体。质粒pEE14（Cellteoh，Ltd.）是此载体（命名为pSZ9015）内大多数DNA序列的来源。通过用MluⅠ和HindⅢ消化去掉pEE14载体的CMVIE启动子。通过琼脂糖凝胶电泳使这个去掉8Kb的启动子的载体DNA纯化，并连接到一个大约200碱基对PCR扩增的DNA片段上，此片段含有197个碱基对的HIVLTR（-117至+80）和MluⅠ和HindⅢ末端（用图1所述的引物对和De  Martino，J.A.等人所述的REP3/HIV-LTR  CDR-嫁接的1B4-VK人-Ck/HygB质粒DNA模板获得，Antibody，Immunoconjugates，and  Radiopharmaceuticals  4：829-835，1991）。将重链γ1不变区作为一种XbaⅠ/EcoRⅠ2.0Kb片段与一种不相关的重链V区一起置于p9015载体中，产生载体pSP72/58.2/L16VH/γ1MRC。这种质粒由于含有编码重链的质粒的命名为pHIV447VH，含有轻链编码区的质粒命名为pHIV447Vλ。已将在其各自的大肠杆菌宿主中的这两种质粒在本申请日之前寄存于美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn  Drive，Rockville  MD，遵照布达佩期条约的条款和规定，对于其可获得性没有限制。含有该质粒的大肠杆菌宿主其ATCC入藏号PHIV447VHCr1为68945，PHIV447Vλ/Cλ是68943。

除了发现对于本发明所述的HIV-1  LTR表达载体的转活化和产生的高水平转录来说，不需要与HIV-1  TAT编码质粒共同转染这种情况外，需将等量（10μg）的编码重链和轻链的质粒按照标准的磷酸钙沉淀方法转染到人293细胞中（De  Martino，J.A.et  al.，如上述）。通过捕获或固相ELISAs（如下述）分析培养上清液中是否分泌含有人λ轻链的IgG1免疫球蛋白。

建立一种ELISAs方法对在限制性哺乳动物细胞生长培养基中表达的447-52D重组抗体进行定量分析。用一种溶于磷酸缓冲盐（PBS）的10μg/ml的鼠抗人λ链不变区单克隆抗体（Cat＃05-4101，Zymed  Laboratories，Inc.溶液，在4℃下覆盖Immulon-2（Dynatech  Labs）96-孔平板过夜，并用1%牛血清白蛋白（BSA）PBS溶液于37℃下阻遇1小时。用PBS重复洗涤之后，将用含1%BSA的PBS稀释的样本（含有重组447-52D抗体或从Sigma  Chemical得到的人λ/IgG1标准抗体的限制性培养基）加入，设一个重复，并在37℃下保温1小时。用浓度范围为7.8ng/ml至500ng/ml的IgG1构建标准平衡曲线。使用溶于含大约1%BSA的PBS中的鼠抗人IgG1  Fc单克隆抗体与辣根过氧化酶（Cat＃05-3320，Zymed  Laboratories，Inc.）共轭物的1∶400稀释液各50μl等份，来检测结合和完成装配的人IgG1。在37℃保温1小时，并进一步洗涤之后，加入1mM2.2′-连氮基-双（3-乙基苯基噻唑啉-6-磺酸）的0.1M柠檬酸钠溶液，PH4.2，并该溶液还含有0.03%过氧化氢，在室温下保温20分钟，来检测结合的共轭物的含量。用一种ELISA平板阅读仪（Bio-Rad，Inc.）调至415nm测定孔中的吸收值。或者，也可以在用以MN分离物序列为基础的26残基肽覆盖的平板上进行固相ELISAs。通过使用预活化的五氟苯基酯的固相Fmoc化学法和羟苯甲基三嗪活化来合成该肽（NleCSYNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGCS  SEQ.ID.NO.：1）。用1μg/ml的肽覆盖Immulon-2平板过夜，并用1%胎牛血清PBS阻遏。按上述方法对结合的447-52D抗体进行测定。通过标准蛋白A色谱法（De  Martino，J.A.et  al.，如上述）对瞬时表达后的转染人293细胞分泌的抗体进一步纯化。

通过上述的ELISAs测定重组447-52D抗体的浓度，并通过证实其对HIV-1特定血清型感染活性的中和能力来检测其效力。

下面进行的分析是通过测定培养物暴露于抗体和病毒7-8天后的细胞存活率，来对无细胞HIV-1病毒感染的中和以及细胞至细胞扩散的抑制进行定量分析。在细胞生长培养基（RPMI1640+10%胎牛血清）中制备所测抗体的二倍系列稀释液，并将100μl置于96孔培养皿中（Costar，Corp.）。向每孔中加入100μl病毒原液（从慢性感染H9细胞或从新建立的慢性感染FDA/H9细胞制得;使以细胞密度为2×10⁵细胞/mL平板培养的慢性感染细胞群获得的3天限制培养液澄清，并选择比在7天检测时间内能杀死所有MT-4细胞的病毒原液最后稀释液高10倍的稀释液作为激发剂量）并将病毒-抗体混合物在37℃下保温1小时。并将MT-4细胞加入至每孔中的50μl培养基（1×10⁴个细胞/孔），并将培养皿在37℃下保温7天，此时确定为终点。能够防止MT-4细胞杀伤作用的最后抗体稀释液的浓度被称为中和终点。

中和测试的结果列于表9，该数据表明对于所研究的每一种HIV-1血清型，重组人447-52D抗体的效能与人异种杂交瘤来源的447-52D抗体的效能相同。这些结果表明，用人λ和γ1不变区表达的重组构建抗体尚没有以这种方式被修饰以致于改变其与V3PND环的相互作用，并且该重组抗体保留了天然抗体的生物活性。

表9

体外MT-4细胞杀伤作用的中和终点（μg/mL）

重组体  异杂交瘤

HIV-1分离物  447  447

III_B0.78 1.29*

MN  0.19  0.37

AL-1  0.09  0.15

SF-2  0.04  0.04

DU 6587-5  0.09  0.62

DU 7887-7  0.37  0.78

WMJ-2  0.78  1.35

RF  nd  0.62

SF-162  nd  1.98+

＊＝几何平均滴度

+＝在5，8，12，14，21天用新鲜培养基

喂养的巨噬细胞/单细胞初级培养物（2×10⁵细胞/微滴定孔）。通过ELISA（Coulter Immunology，Hialiah，FL）检测限制性培养基中p24病毒核心抗原的存在，并在24天时将每个孔的细胞溶解，并进行相同的检测。终点测定表示为能防止细胞培养物中p24出现的抗体的最终稀释度。

nd＝未检测

实施例10

构建一种表达系统，并用于产生大量的重组447抗体。该表达系统利用巨细胞病毒直接早期（CMVIE）转录启动子和谷氨酰胺合成酶（GS）选择及扩增盒，并且适用于各种不同哺乳动物细胞系（Bebington  et  al.，Biotechnology  10：169-175，1992）。从Celltech，Ltd.获得基本载体，pEE12和pEE6，并用于创造一个单一质粒，命名为p63.79r447，它除了转录GS基团产物外，还可转录重链和轻链免疫球蛋白肽。在构建此γ447表达载体的方法中，利用了已存在的含有其他免疫球蛋白序列的基本载体。

用限制性核酸内切酶HindⅢ和XhoⅠ消化含有r447抗体V-区的pHIV/447V_H/Cγ1质粒的DNA50μg（图5）。有0.8%琼脂糖（在TAE中制备;40mM TRIS碱基，1mM EDTA，PH8.0加乙酸至PH7.4）中通过凝胶电泳纯化大约800碱基对（bp）的重链447V-区片段，将切下的DNA片段置于3/4直径的渗析管（BRL）中，其中含有最小量的TAE，并在150伏电压下通过电泳对核DNA进行电洗脱30分钟。从渗析管中取出所得到的DNA溶液，并且用苯酚/氯仿提取二次，然后通过乙醇沉淀浓缩该DNA，再悬浮于TE（10mM  TRIS  HCl，1mM  EDTA，PH8.0）中。

同样，用限制性核酸内切酶HindⅢ和EcoRⅠ消化含有CMVIE启动子，GS基因转录单位，和氨苄青霉素抗性标记的50μgPEE12/58.2L16V_H/Cγ1质粒DNA。用上述方法纯化7087bp的基于pBR322的载体DNA片段。将大约2μg的这种DNA片段与大约0.9μg的来源于PHIV/447VH/Cr1（如上述）的800bp DNA片段结合，加入十分之一体积的10×连接缓冲液（660mM TRIS-HCl，50mM MgCl₂，10mM DTT，10mM ATP，PH7.5）和大约25单位的T₄DNA连接酶（Boehringer Mannheim）。在室温下将混合物（最终DNA浓度为28.9ng/ml）保温1小时，使DNA片段连接，然后加热灭活连接酶（65℃5分钟），该反应液用苯酚/氯化提取，并通过乙醇沉淀浓缩该DNA。把DNA再悬浮于dH₂O中，将该溶液调至厂家所建议的缓冲液浓度之后，加入限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ。在37℃下保温1小时后，按上述方法在0.8%琼脂糖凝胶上对消化的DNA进行电泳。从凝胶上切下所需的7887bp连接DNA片段，并对DNA进行电洗脱，再通过乙醇沉淀浓缩，方法如上所述。使用如LDP Cycle（图8）所述的方法，其中连接DNA片段，并用限制酶消化和纯化，此方法可以缩短构建复合质粒载体正常所需的时间。

分别用限制酶HindⅢ和EcoRⅠ，或XhoⅠ和HindⅢ，对两种质粒DNA（pHIV/447V_L/Cλ和pEE12/58.2L16V_H/Cγ1）各约50μg进行消化，这两种质粒中一种含有1200bp 447λ轻链序列而另一种在4158bpDNA片段中含有人免疫球蛋白γ1不变区和CMVIE启动子。按前述方法，在0.8%琼脂糖凝胶中电泳进行电洗脱之后使这两种DNA片段纯化。使用上述的两个DNA片段（分别为18.8mn HindⅢ-EcoRⅠ）和上述获得的7887bp DNA片段制备一个三片段DNA连接物。将含有最终浓度为11.85μg/ml的DNA和5单位T₄DNA连接酶的1×连接缓冲液（如上述）的反应液在室温下保温1小时，然后稀释至1∶5，再按厂家所述使用1μl稀释液用于转化感受态大肠杆菌菌株HB101（BRL）。从含有50μg/ml氨苄青霉素（sigma）的LB琼脂平板中选择转化子，提取DNA用于检测所需重组质粒序列的存在（见图7）。命名为p63.79r447的表达质粒编码447γ1重链，447λ轻链，GS选择盒，和原核质粒氨苄青霉素抗性和临近复制的源点。

从Bebington等人（如上述）所述的pEE12载体构建载体PEE12/58.2L16V_H/Cγ1（上述的）。在用HindⅢ和EcoRⅠ消化之后，通过一种XbaⅠ转化大肠杆菌，将pEE12载体和一种含有人特征化抗体58.2的重链V-区的中间载体（pSP72;Promega，Inc.）融合到一种人γ1不变区上。识别带有PEE12/58.2L16V_H/Cγ1t的克隆。用XhoⅠ和EcoRⅠ进一步切割该质粒DNA，使仍带有大块质粒的重链V-区与重链Cγ1t-区分开。使用寡聚物G1和G2，并用粘性质粒克隆cosIg9 DNA作为模板（Flanagan and Rabbits，Nature300：709-713，1982），通过PCR扩增获得人Cγ1编码区的短译本。使合适的引物对（G1和G2，图1）各50pmole与10ng含有人γ1不变区外显子的粘性质粒DNA，2.5单位的Taq DNA聚合酶结合，并进行25轮的PCR扩增（循环周期：1′，94℃;1′，55℃，2′，72℃）。用XhoⅠ和EcoRⅠ消化PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并克隆到含有部分pEE12/58.2L16V_H中-的该载体。识别代表该载体的单个克隆并分离，该载体含有上述来源的447重链可变区，和人γ1不变区的短译本。

含有人单克隆抗体447的重链和轻链编码区的存在于其大肠杆菌宿主中的最终质粒p63.79r447已在本申请日之前寄存于美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn  Drive，Rockville，MD，遵守布达佩斯条约的条款和规定对于其发放没有限制。含有质粒p.63.79r447的大肠杆菌宿主其ATCC保藏号为ATCC68944。

实施例11

转染NS/O细胞

使NS/O细胞在下述培养基中处于指数生长期：该培养基是补充有10%热灭的胎牛血清和4mM谷氨酰胺的Iscov′s最低基本培养基;将它们保持于37℃下的潮湿保温箱中并有5%到6.5%的CO₂。

通过用一种限制酶在特定位点消化使用于转染的质粒线性化;优选的特异性位点是一种位于外源基因表达序列之外，并在该载体acterial序列之中的位点。限制消化之后，通过苯酚提取，苯酚/氯仿（1∶1）提取和最后再用氯仿提取一次，使DNA去蛋白;然后用一种最终浓度为0.2-0.4M氯化钠和70%乙醇，使它在一种生物安全柜中于无菌条件下沉淀，将DNA以一种计算到的浓度1μg/1μl再悬浮于无菌蒸馏水中。这种DNA可以马上使用或冷冻（-20℃）至使用。

要转染当天，计算NS/O培养原液中的存活细胞数。每个转染小杯使用总数为1×10⁷的存活细胞。首先在室温下以3，000×g离心5分钟收集细胞;用无菌磷酸盐缓冲盐（PBS）溶液冲洗沉淀细胞两次，再以每800μl 10⁷个细胞的浓度悬浮于PBS中。从此时开始将细胞悬浮液保持在冰上。将10⁷个细胞轻轻地转移到一种0.4cm（电极间的距离）的Bio Rad小杯中，使之放在生物安全柜处于无菌条件下。将40μg的线性化质粒DNA溶液与细胞轻轻混合，并把小杯置于冰上5分钟。进行电击穿之前，将小杯外边擦干，然后置于“Bio Rad Gen Pulser”的杯槽中。将基因脉冲仪置于每次脉冲1500伏传递5μF。使用两次连续脉冲。然后将小杯置于冰上2-5分钟，再将细胞转移到一种50ml可随意使用的无菌管中，其中有30ml含有1mM谷氨酰胺而不是4mM谷氨酰胺的修饰生长培养基。从30ml中取出10ml细胞悬浮液分布于一种96孔微量滴定培养皿中，大约有孔100μl;用10μl的修饰生长培养基稀释10ml的细胞悬浮液（从剩余20ml中取出），并分散于两个96孔微量滴定培养皿中，大约每孔100μl;用30ml修饰生长培养基稀释最后的10ml细胞悬浮液，并以大约每孔100μl分散于4个96孔微量滴定培养皿中。将这些平板置于潮湿的保温箱中在37℃，5%-6.5%CO₂条件下保温过夜。

选择培养基：

选择培养基如下：

IScove′s最低基本培养基（不含谷氨酰胺;Sigma  10%透析了的胎牛血清（从Hyclone得到）

1X核苷^＊

1X天冬酰胺^＊＊

^＊50X核糖核苷原液：

35mg腺苷

35mg鸟苷

35mg胞苷

12mg胸苷

（每一种都从Sigma得到，细胞培养级）。用无菌水配成100ml。穿过0.1μg滤器单元进行过滤消毒，以10ml等份冰冻（-20℃）储存。

^＊＊100X天冬酰胺：每100ml无菌蒸馏水加600mg，通过0.1μ滤器单元过滤至无菌并于4℃储存。

选择：

转染后24小时对每个96孔微量滴定板补充100μl的选择培养基，并置于一种潮湿的保温箱中于37℃、5%至6.5%CO₂条件下保温直至菌落出现，大约需要3至3.5周的时间。除非孔内开始出现干燥，不需要再补充培养基;每隔3-4天监测一次平板。有菌落生长的孔最终变为黄色，此时从中取出50至100μl上清进行检测，并用选择培养基再补充培养孔（以保持克隆存活）。

实施例12

在开始研究中，将纯化的HIV-1中和抗性体制剂以36mg/Kg的剂量通过静脉途径给黑猩猩给药。24小时后以75个黑猩猩感染剂量的HIV-1  IIIB变异体通过静脉内给药来激发动物。在激发时该动物血液循环中表现于1∶320的病毒中和性抗体效价。给一个未治疗的对照黑猩猩同时进行病毒接种。

表10代表了研究结果。根据以外周血液单核细胞（PBMCs）中分离的病毒发现对照动物（X39）在激发后3周首先表现出病毒感染体征。激发后6周该动物特异性血清转化，并且在72周的观察期该动物保持有抗体和病毒分离阳性。相反，该抗体治疗的动物（X289）一直没有出现病毒感染迹象。试图通过聚合酶链反应（PCR）在动物的PBMCs中检出病毒特异性核酸，结果是阴性。

表10：接触病毒前使用V3环诱导的单克隆抗体给药的保护作用^a

A.对照黑猩猩（X39）

病毒中和  抗-HIV

性抗体  1 ELISA 和  病毒特异性

激发后的周数b 效价c western印迹d 病毒分离e PCR^f

0  10  -  -  -

(1天)  10  -  NDg  ND

1  10  -  -  -

2  10  -  -  -

3  10  -  +  +

4  10  -  +  +

6  10  +  +  +

8  20  +  +  +

10  106  +  +  +

12  320  +  +  +

14  160  +  +  +

16  ≥640  +  +  +

20  ≥640  +  +  +

24  ≥640  +  +  +

28  ≥640  +  +  +

32  ≥640  +  +  +

36  ≥640  +  +  +

40  ≥640  +  +  +

44  ≥640  +  +  +

48  ≥640  +  +  +

52  ≥640  +  +  +

64  ≥640  +  +  +

72  ≥640  +  +  +

表10：（续）

B.接触病毒前抗体治疗的黑猩猩（X289）

病毒中和  抗-HIV

性抗体  1  ELISA 和  病毒特异性

激发后的周数b 效价c western印迹d 病毒分离物e PCR^f

0  <10  -  -  -

(1天)  320  +/-  NDg  ND

1  320  +/-  -  -

2  80  +/-  -  -

3  20  +/-  -  -

4  10  -  -  -

6  <100  -  -  -

8  <10  -  -  -

10  <10  -  -  -

12  <10  -  -  -

14  <10  -  -  -

16  <10  -  -  -

20  <10  -  -  -

24  <10  -  -  -

28  <10  -  -  -

32  <10  -  -  -

36  <10  -  -  -

40  <10  -  -  -

44  <10  -  -  -

48  <10  -  -  -

52  <10  -  -  -

64  <10  -  -  -

72  <10  -  -  -

表10的脚注

a

通过蛋白A-亲和性层析纯化Cβ1抗体制剂。给黑猩猩X289给以抗体1天后袭击该动物。袭击病毒由Larry  Arthur和Peter  Fischinger（National  Cancer  Institute）惠赠，并按Emini等人所述（如上述）在袭击时进行定量分析。该黑猩猩的饲养条件符合或超过美国国家健康研究所关于实验动物保护的标准。

b

P.C.：袭击后

c

按照Robertson等人¹⁴所述用HIV-1的IIIb变异体测定细胞培养基中的病毒中和性抗体效价检测中所用病毒量与用于激发黑猩猩的量相同。该数据与能产生所述有效病毒中和反应的最高血清稀释液成反比。

d

按Emini等人（如上述）所述测定抗-HIV-1  ELISA和Western印迹反应性抗体。（+）指阳性ELISA反应和多反应性Western印迹谱带。（+/-）只代表gp120反应性Western印迹谱带，阴性ELISA。（-）代表阴性ELISA和无Western印迹反应谱带。

e

使用四种方法通过体外培养黑猩猩PBMCs进行病毒分离。（1）在含有IL-2和DEAE-葡聚糖的培养基中将黑猩猩PBMCs与等量分裂素活化的人PBMCs共同培养。（2）用植物血凝素（PHA）活化黑猩猩PBMCs然后按方法1共同培养。（3）用PHA激发黑猩猩PBMCs然后在含有IL-2的培养基中单独培养。（4）在补充有PHA和IL-2的培养基中将黑猩猩→PBMCs与等量活化的人PBMCs共同培养。在每一种方法中，培养物每10ml体积中含有1×10黑猩猩细胞。将培养物在37℃下5%CO₂大气中保温4周的时间。每周检测一次培养基上清液中HIV-1p24抗原的产生情况。通过任何方法的病毒生长被认为是阳性病毒分离物。

f

通过聚合酶链反应（PCR）检测黑猩猩PBMCs中HIV-1特异性核酸的存在。将细胞样本在10mM Tris HCl，PH8.3，1.0mM EDTA，PH8.0，0.5%SDS，150μg/ml蛋白酶K中于60℃下保温60分钟，而从PBMCs中获得DNA。苯酚/氯仿提取之后，用乙醇沉淀DNA。用1-3μg的DNA进行PCR。每种反应混合物除含有DNA外，还含有1.5μM的MgCl₂，10mM Tris HCl，PH8.3，50mM CKl，0.032mM的每种dNTP，50ng的每种引物和1.0单位的Taq聚合酶。使用HIV-1gag特异性引物对SK38/39。进行35次反应循环;每次循环包括：94℃，保温1.5分钟和56℃保温3.0分钟。反应之后，用SK19探针通过杂交反应检测扩增产物。测定出PCR检测的敏感性是每个DNA样本中是10个HIV-1特异性拷贝。

g

ND：未进行测试。

实施例13

在这一首次观察到保护作用（实施例10）之后，再进行第二种研究来评价当在病毒袭击后给药出现的HIV-1中和性抗体的保护作用。通过静脉内给两只黑猩猩（X299和X196）各接种75只黑猩猩感染剂量的HIV-1  IIIb。接种10分钟后，给动物X299以36mg/Kg的剂量通过静脉给药抗体。总量（大约200ml）在30分钟内输完。给药结束时血液循环中中和性抗体的效价是1∶640。黑猩猩X196没有治疗。

研究结果见于表11。对照黑猩猩首先在激发后6周时由PBMCs产生阳性病毒分离物。该对照动物在8周时血清转化，并且在48周的观察期间保留有病毒分离物和抗体阳性。抗体治疗的黑猩猩（X299）到目前为止没有表现出任何持续性病毒感染的征象。对动物PBMCs中病毒特异性核酸的PCR分析也表现为阴性。

这些观察提供了第一手直接资料表明抗V3环，HIV-1中和性抗体在不存在其他病毒特异性免疫反应的情况下能够防止HIV-1持续性感染的发生。

表11：接触病毒前V3环诱导的单克隆抗体给药的保护性作用^a

A：对照黑猩猩（X196）：

表11（续）

B.用抗体治疗接触病毒后的黑猩猩（X299）

表11的脚注

a

见表1脚注中有关技术的描述

b

用cβ1给药（见说明书）后立即获得的血清测定抗体效价。cβ1给药前病毒中和性抗体的效价＜10。

实施例14

HIV分离

用四种方法体外培养黑猩猩PBMCs进行病毒分离。（1）在含有IL-2和DEAE-葡聚糖的培养基中将黑猩猩PBMCs与等量的分裂素活化的人PBMCs共同培养。（2）用植物血凝素（PHA）活化黑猩猩PBMCs，然后按方法1共同培养。（3）用PHA激发黑猩猩PBMCs，然后在含有IL-2的培养基中单独培养。（4）在补充有PHA和IL-2的培养基中将黑猩猩PBMCs与等量的活化人PBMCs共同培养。在每种情况中，该培养物每10ml体积含有1×10⁷个黑猩猩细胞。将培养物在37℃5%CO₂大气中保温培养4周的时间。每周检测一次培养基中HIV-1P24抗原的产生情况。通过任何方法的病毒生长都认为是一种阳性病毒分离培养。

实施例15

通过PCR检测HIV核酸

通过聚合酶链反应（PCR）检测黑猩猩PBMCs中HIV-1特异性核酸的存在。将细胞样本在10mM TRIS HCl，PH8.3，1.0mM EDTA，PH8.0，0.5%SDS，150μg/ml蛋白酶K中于60℃保温60分钟，来从PBMCs中获得DNA。苯酚/氯仿提取之后，用乙醇沉淀DNA。将1-3μg的DNA用于PCR。每种反应混合物除含有DNA外，还含有1.5mM MgCL₂，10mM TRIS HCl，PH8.3，50mM CKl，0.032mM的每种dNTP，50ng的每种引物和1.0单位的Taq聚合酶。使用HIV-1gag特异性引物对SK38/39。进行35次反应循环;每次循环由94℃保温1.5分钟和56℃保温3.0分钟组成。反应之后，用SK19探针通过杂交反应检测扩增产物。PCR检测的敏感性确定为每个DNA样本中10个HIV-1特异性拷贝。

实施例16

人单克隆抗体体外中和HIV-1感染

为了在淋巴细胞营养性和淋巴细胞溶解性分离物的MT-4细胞中进行中和测试，制备抗体的2倍系列稀释液，并且每个测试孔中使用100μL。向每个测试孔中加入100μL的病毒原液，将病毒-抗体混合液在37℃下保温1小时，之后向每个孔中加入含有1×10⁴MT-4细胞的50μl培养基。培养物培养7天，此时定为抗体中和终点。中和终点确定为能防止MT-4细胞杀伤作用的抗体制剂的最后稀释度。每次测试也培养未感染的MT-4细胞，并且每次分析要进行病毒原液效价再测定。在初级巨噬细胞-单核细胞培养物中进行亲巨噬细胞-单核细胞性分离物SF-162的病毒中和测试。将SF-162原液的1/10稀释液与抗体的2-倍系列稀释液混合，在37℃下保温1小时，并将含有2.0×10⁵个细胞的每种混合液加到微量滴定平板孔中。使具有显著中和效价的人阳性血清进行每种测试，并且对一种非中和性阴性人血清和在不存在抗体或血清情况下感染细胞进行每种测试。在感染后5，8，12，14和21天给全部的巨噬细胞/单核细胞补充新鲜培养基。在18，21和24天收集培养基用于P24 ELISA（Coulter/mmunology）以便测定病毒的产生。另外，在24天时将未感染的巨噬细胞/单核细胞溶解通过P24ELISA测定细胞内病毒。中和终点确定为通过不产生P24而证明能防止巨噬细胞/单核细胞体外感染的抗体制剂的最终稀释。结果见表12。

表12：

中和终点  (ug/ml),

HIV-1  SEQ.ID.  几何平均数和(范围)

分离物  NO.:  V3环序列  体外MT-4细胞杀伤测定

IIIB  27  TRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIG  1.29(0.39-1.56)

MN  28  YNKRKRIHIGPGRAFYTTKNII  0.37(0.04-0.78)

AL-1  29  IYRKGRIHIGPGRAFHTTRQII  0.15(0.09-0.19)

SF-2  30  NNTRKSIYIGPGRAFHTTGRII  0.04(0.04)

DU 6587-5  31  SNVRNRIHIGPGRAFHTTKRIT  0.62(0.39-0.78)

WMJ-2  32  NNVRRSLSIGPGRAFRTREIIG  1.35(0.78-1.56)

DU  7887-7  33  NNTSRGIRIGPGRAILATERII  0.78(0.78)

RF  34  NNTRKSITKGPGRVIYATGQII  0.62(0.39-0.78)

在单核细胞/巨噬细胞培养物中的中和终点

SF-162  35  NNTRKSITIGPGRAFYATGDII  1.98(1.25-2.50)

序列表

（1）一般资料：

（ⅰ）申请人：Emini，Emilio

Conley，Anthony

Mark，George

Johnson，L.Syd

P.farr，David

（ⅱ）发明名称：用于预防和治疗HIV感染的重组人HIV-中和性单克隆抗体

（ⅲ）序列数目：59

（ⅳ）联系地址：

（A）地址：Merck  &  Co.，Inc.

（B）街道：126E.Lincoln  Ave

（C）城市：Rahway

（D）州：New  Jersey

（E）国家：美国

（F）邮政编码：07065

（ⅴ）计算机可读形式：

（A）培养基类型：Floppy  disk

（B）计算机：IBM  PC兼容机

（C）操作系统：PC-DOS/MS-DOS

（D）软件：Patentln  Release＃1.0，Version  ＃  1.25

（ⅵ）目前的申请数据：

（A）申请号：

（B）申请日：

（C）分类号：

（ⅷ）代理/代理人资料

（A）姓名：Wallen  Ⅲ，JohnW

（B）登记号：P-35，403

（C）档案号：18709

（ⅸ）电讯资料：

（A）电话：（908）594-3905

（2）SEQ  ID  NO：1的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：24个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：1：

（2）SEQ  ID  NO：2的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：23个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：2：

（2）SEQ  ID  NO：3的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：8个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：3：

Pro  Gly  Arg  Ala  Phe  Tyr  Thr  Thr

1  5

（2）SEQ  ID  NO：4的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：7个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：4：

Arg  Lys  Arg  Ile  His  Ile  Gly

1  5

（2）SEQ  ID  NO：5的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：5：

His  Ile  Gly  Pro  Gly  Arg

1  5

（2）SEQ  ID  NO：6的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：6：

Tyr  Asn  Lys  Arg  Lys  Arg

1  5

（2）SEQ  ID  NO：7的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：7：

Asn  Lys  Arg  Lys  Arg  Ile

1  5

（2）SEQ  ID  NO：8的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：8：

Lys  Arg  Lys  Arg  Ile  His

1  5

（2）SEQ  ID  NO：9的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：9：

Arg  Lys  Arg  Ile  His  Ile

1  5

（2）SEQ  ID  NO：10的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：10：

Lys  Arg  Ile  His  Ile  Gly

1  5

（2）SEQ  ID  NO：11的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：11：

Arg  Ile  His  Ile  Gly  Pro

1  5

（2）SEQ  ID  NO：12的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：12：

Ile  His  Ile  Gly  Pro  Gly

1  5

（2）SEQ  ID  NO：13的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：13：

His  Ile  Gly  Pro  Gly  Arg

1  5

（2）SEQ  ID  NO：14的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：14：

Ile  Gly  Pro  Gly  Arg  Ala

1  5

（2）SEQ  ID  NO：15的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：15：

Gly  Pro  Gly  Arg  Ala  Phe

1  5

（2）SEQ  ID  NO：16的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：16：

Pro  Gly  Arg  Ala  Phe  Tyr

1  5

（2）SEQ  ID  NO：17的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：17：

Gly  Arg  Ala  Phe  Tyr  Thr

1  5

（2）SEQ  ID  NO：18的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：18：

Arg  Ala  Phe  Tyr  Thr  Thr

1  5

（2）SEQ  ID  NO：19的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：19：

Ala  Phe  Tyr  Thr  Thr  Lys

1  5

（2）SEQ  ID  NO：20的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：20：

Phe  Tyr  Thr  Thr  Lys  Asn

1  5

（2）SEQ  ID  NO：21的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：21：

Tyr  Thr  Thr  Lys  Asn  Ile

1  5

（2）SEQ  ID  NO：22的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：22：

Thr  Thr  Lys  Asn  Ile  Ile

1  5

（2）SEQ  ID  NO：23的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：23：

Thr  Lys  Asn  Ile  Ile  Gly

1  5

（2）SEQ  ID  NO：24的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：5个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：24：

Lys  Arg  Ile  His  Ile

1  5

（2）SEQ  ID  NO：25的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：4个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：25：

Gly  Pro  Gly  Arg

1

（2）SEQ  ID  NO：26的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：15个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：26：

（2）SEQ  ID  NO：27的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：27：

（2）SEQ  ID  NO：28的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：28：

（2）SEQ  ID  NO：29的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：29：

（2）SEQ  ID  NO：30的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：30：

（2）SEQ  ID  NO：31的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：31：

（2）SEQ  ID  NO：32的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：32：

（2）SEQ  ID  NO：33的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：33：

（2）SEQ  ID  NO：34的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：34：

（2）SEQ  ID  NO：35的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：22个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：35：

（2）SEQ  ID  NO：36的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：30个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：36：

CGGAATTCAG  GTGCAGCTGC  AGCAGTCTGG  30

（2）SEQ  ID  NO：37的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：37：

CCGAATTCGC  GGCCGCACTC  ATTTACCCGG  AGACAGG  37

（2）SEQ  ID  NO：38的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：42个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：38：

GGCGTCGACT  CACCATGGCC  GGCTCCCCTC  TCYTCCTCACC  C  42

（2）SEQ  ID  NO：39的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：34个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：39：

CCGAATTCGC  GGCCGCCTAT  GAACATTCTG  TAGG  34

（2）SEQ  ID  NO：40的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：39个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：40：

GATCCTCGAG  GATTCTAGAA  GGGTCAGATG  TCGGTGTTG  39

（2）SEQ  ID  NO：41的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：30个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：41：

GATCGAATTC  CTGGGATCCT  GCAGCTCTAG  30

（2）SEQ  ID  NO：42的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：43个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：42：

TTACTCGAGA  CGCGTACTAG  TGAGCTTGCT  ACAAGGGACT  TTC  43

（2）SEQ  ID  NO：43的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：30个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：43：

ATTTCTAGAA  AGCTTTATTG  AGGCTTAAGC  30

（2）SEQ  ID  NO：44的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：30个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：44：

TATACTCGAG  CAGACACTGG  ACGCTGAACC  30

（2）SEQ  ID  NO：45的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：35个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：45：

TATATGATCA  GAATTCGCCC  GGGAAGTATG  TACAG  35

（2）SEQ  ID  NO：46的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：1380碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：46：

（2）SEQ  ID  NO：47的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：654个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：47：

（2）SEQ  ID  NO：48的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：54个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：48：

（2）SEQ  ID  NO：49的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：49：

GGAGTGGACA  CCTGTGGAG  19

（2）SEQ  ID  NO：50的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：50：

GGTGAGTCCT  TACAACCTC  19

（2）SEQ  ID  NO：51的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：44个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：51：

GAATGTGCCT  ACTTTCTAGA  CTCGAGTATA  AATCTCTGGC  CATG  44

（2）SEQ  ID  NO：52的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：39个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：52：

CTCCACAGGT  GTCCACTCCG  AGGTGCAGCT  GGTGGAGTC  39

（2）SEQ  ID  NO：53的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：39个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：53：

GAGGTTGTAA  GGACTCACCT  GAGCTCACGG  TGACCGTGG  39

（2）SEQ  ID  NO：54的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：54个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：54：

（2）SEQ  ID  NO：55的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：55：

GGAGTGGACA  CCTGTGGAG  19

（2）SEQ  ID  NO：56的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：39个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：56：

CTCCACAGGT  GTCCACTCCC  AGTCTGTGTT  GACGCAGCC  39

（2）SEQ  ID  NO：57的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：79个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：57：

（2）SEQ  ID  NO：58的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：58：

CATTCGCTTA  CCCTGCAG  18

（2）SEQ  ID  NO：59的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单链

（D）拓扑：线性

（ⅱ）分子类型：cDNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：59：

GAATGTGCCT  ACTTTCTAG  19

Claims (38)

1、一种重组人抗-HIV抗体或其片段，它对于2或多个HIV血清型分离物具有HIV-中和性。

2、根据权利要求1的重组人抗-HIV抗体或其片段，其中该抗体或片段可以中和选自下列一组中的2或更多个HIV-1分离物：IIIB，MN，AL-1，SF-2，WMJ-2，RF，DU6587-5和DU7887-7。

3、根据权利要求权利要求1的重组人抗-HIV抗体或片段，其中该中和性抗体或片段与一种gp  120的HIV-1中和表位结合。

4、根据权利要求3的重组人抗-HIV-1抗体或片段，其中该HIV-1gp  120的中和表位在gp  120的V3环中。

5、根据权利要求4的重组人抗-HIV-1抗体或片段，其中gp  120V3环的中和表位包含氨基酸序列GPXR，并且X是任何氨基酸。

6、根据权利要求5的重组人抗-HIV-1抗体或片段，其中gp  120  V3环的中和表位包含氨基酸序列GPGR。

7、一种重组人抗-HIV抗体或其片段，它可以中和HIV-1分离物IIIB，MN，AL-1，SF-2，WMJ-2，RF，DU6587-5，和DU7887-7。

8、权利要求权利要求7的重组人抗-HIV抗体或其片段，其中该中和性抗体或片段与一种HIV-1gp  120的中和性表位结合。

9、根据权利要求8的重组人抗-HIV-1抗体或片段，其中该HIV-1gp  120的中和表位是在gp  120的V3环中。

10、根据权利要求9的重组人抗-HIV-1抗体或片段，其中HIV-1gp  120V3环的中和表位是氨基酸序列GPXR，并且X是任何氨基酸。

11、根据权利要求10的重组人抗-HIV-1抗体或片段，其中HIV-1gp120V3环的中和表位是氨基酸序列GPGR。

12、一种重组人抗HIV抗体或其片段，其中该抗体重链类型是IgG，并且该抗体可以中和HIV-1分离物IIIB，MN，AL-1，SF-2，WMJ-2，RF，DU6587-5，和DU7887-7。

13、权利要求权利要求12的重组人抗-HIV抗体或其片段，其中该抗体重链的亚型是IgG3，并且该抗体可以中和HIV-1血清型分离物IIIB，MN，AL-1，SF-2，WMJ-2，DU6587-5，和DU7887-7。

14、权利要求权利要求13的重组人抗-HIV抗体或其片段，其中该重链IgG亚型区被基因修饰成一种IgG1亚型区，并且该抗体可以中和HIV-1血清型分离物IIIB，MN，AL-1，SF-2，WMJ-2，DU6587-5，和DU7887-7。

15、一种表达基因盒，包含一种启动子序列，一种编码全部或部分HIV-中和性抗体轻链或重链可变区的ORF，所说的抗体可以中和2或更多个HIV血清型，和一种合适的转录终止序列。

16、根据权利要求15的表达基因盒，其中该ORF编码一种HIV-1中和性抗体轻链或重链的可变区，所说抗体可以中和2或更多个HIV-1血清型。

17、根据权利要求16的表达基因盒，其中该ORF编码抗体447-52D轻链或重链的可变区。

18、一种表达基因盒，包含至少一种启动子序列，一种编码HIV-1中和性抗体轻链的第一ORF和编码其重链的第二ORF，和一种合适的转录终止序列。

19、根据权利要求18的表达基因盒，其中第一和第二ORFs编码一种HIV-1中和性抗体的轻链和重链，所说抗体可以中和2或更多个HIV-1分离物。

20、根据权利要求19的表达基因盒，其中该第二ORF编码一种IgG重链。

21、根据权利要求20的表达基因盒，其中该第二ORF编码一种IgG1重链。

22、根据权利要求19的表达基因盒，其中第一和第二ORFs编码抗体447-52D的轻链和重链。

23、根据权利要求20的表达基因盒，其中IgG重链或亚型区被基因修饰成一种IgG1亚型区。

24、一种宿主细胞，含有一种表达基因盒，其中所说的表达基因盒包含一种启动序列，一种编码全部或部分HIV中和性抗体轻链或重链可变区的ORF，和一种合适的转录终止序列。

25、一种含有两个表达基因盒的宿主细胞，其中所说的表达基因盒各含有一个启动子序列，一个编码全部或部分HIV中和性抗体轻链或重链可变区的ORF，和一种合适的转录终止序列。

26、一种根据权利要求24的宿主细胞，其美国典型培养物保藏中心的登记号是68945。

27、一种根据权利要求24的宿主细胞，其ATCC登记号是68943。

28、一种根据权利要求25的宿主细胞，其ATCC登记号为68944。

29、一种药物组合物，含有一种重组人抗体-HIV抗体或其片段，它可以中和2或更多个HIV血清型分离物，和一种生理上可接受的稀释剂或载体。

30、一种根据权利要求29的药物组合物，其中该重组人抗-HIV抗体可以中和选自下面IIIB，MN，AL-1，SF-1，WMJ-2，RF，DU6587-5和DU7887-7中的2或更多个HIV-1血清型分离物。

31、根据权利要求29的药物组合物，其中该重组人HIV-中和性抗体或其片段可以中和HIV-1血清型分离物IIIB，MN，AL-1，SF-2，WMJ-2，RF，DU6587-5和DU7887-7。

32、一种被保护个体免受HIV感染的方法，它包括给怀疑感染HIV的物种成员使用一种重组人抗HIV抗体或其片段，它可以中和2或更多个HIV血清型分离物。

33、根据权利要求32的方法，其中重组人抗HIV抗体可以中和选自下列一组IIIB，MN，AL-1，SF-2，WMJ-2，RF，DU6587-5和DU7887-7中的2或更多个HIV-1血清型分离物。

34、根据权利要求32的方法，其中该重组人抗-HIV抗体可以中和HIV-1血清型分离物IIIB，MN，AL-1，SF-2，WMJ-2，RF，DU6587-5和DU7887-7。

35、一种药物组合物，含有一个第一和第二抗HIV药物，其中所说的第一药物是一种可中和2个或更多个HIV分离物的重组抗HIV抗体，并且所说的第二药物是一种非抗体HIV抑制剂。

36、根据权利要求35的药物组合物，其中非抗体HIV抑制剂是选自下列一组的一类HIV抑制剂：反转录病毒抑制剂，蛋白酶抑制剂，转录过渡活化抑制剂，反义寡聚核苷酸，和病毒结合抑制因子。

37、根据权利要求36的药物组合物，其中非抗体HIV抑制剂是一种反转录酶抑制剂。

38、根据权利要求37的药物组合物，其中该反转录酶抑制剂选自下列一组：

3-｛[4，7-二氯苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（4，7-二甲基苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（7-氯苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（7-甲基苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（4-氟苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（7-氟苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（4-氯苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，

3-｛[（4-氟-7-氯苯并噁唑-2-基）甲基]氨基｝-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮，和

3-[2-（苯并噁唑-2-基）乙基]-5-乙基-6-甲基-2-（1H）-吡啶酮）。

Images