HUT70461A - Recombinant human hiv-neutralizing monoclonal antibodies for prevention and treatment of hiv invention - Google Patents

Description

A találmány tárgyát olyan rekombináns humán HIVelleni ellenanyagok és fragmenseik képezik, melyek legalább két HlV-izolátummal szemben semlegesítő hatásúak. A találmány tárgyát képező ellenanyagok előnyösen az alábbi csoportból választott két vagy több HIV-l-izolátumot képesek semlegesíteni: IIIB, MN, AL-1, SF-2, WMJ-2, RF, DU 6587-5 és DU 7887-7. A semlegesítő ellenanyag vagy fragmense a gpl20-fehérje egy HIV-l-semlegesítő epitópjához kötődik.

A találmány tárgyát képezik még HIV-fertőzés kezelésére alkalmas, fenti ellenanyagokat és/vagy fragmenseiket tartalmazó gyógyászati készítmények is.

A gpl20-fehérje V3-doménjéről kimutatták, hogy egy diszulfid-híddal kapcsolt hurok, mérete körülbelül 30 aminosav [ Leonard és mtsai.: Journal of Biological Chemistry 265, 10373-82 (1990)] . A hurok, akár az érintetlen gpl20-ban, akár szintetikus peptid fragmens formájában, megköti és kiváltja a HIV-elleni 1 típusra specifikus vírus-semlegesítő ellenanyagokat [Goudsmit és mtsai.: AIDS 2, 157-264 (1988); Goudsmit és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 4478-4482 (1988); Ho és mtsai.: J. Virol. 61, 2024-2028 (1987); Javaherian és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 6768-6772 (1988); Kenealy és mtsai.: AIDS Rés. _5, 173-182 (1989); Rusche és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 3198-3202 (1988)] . Ennek megfelelően, a V3-domént tekintik a fő semlegesítő determinánsnak. A V3-hurok-elleni ellenanyag in vitro jellemzői közé tartozik a viszonylag erős vírus-semlegesítő aktivitás, az a képessége, hogy a vírusnak a gazdasejt CD4-receptorhoz való kapcsolódása után is képes semlegesíteni a vírust, és képes megakadályozni a vírussal fertőzött és a vírussal nem fertőzött sejtek fúzióját [Linsley és mtsai.: J. Virol. 62, 36953702; Skinner és mtsai.: J. Virol. 62, 4195-4200 (1988)] . Berman és munkatársai csimpánzokat immunizáltak rekombináns módszerrel expresszált emlős sejt eredetű gpl20szal, illetve annak gpl60 prekurzorával [ Berman és mtsai.: Natúré 345, 622-625 (1990)] . Az állatok vírussal való fertőzése után a fertőzés elleni védelem kizárólag azokban a csimpánzokban volt megfigyelhető, amelyeket gpl20-szal injekcióztak be. Az egyetlen mért immunválasz, amely megfelelt a védelemnek, a V3-hurok-elleni ellenanyag volt. Girard és munkatársai számos csimpánzt oltottak be egy sorozat immunogénnel, amelyek közül az utolsók a V3-hurok-specifikus szintetikus immunogének voltak [Girard és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 542-546 (1991)] . Jelentős vírussemlegesítő hatás csak ez után az utolsó oltás után váltódott ki. A fertőzésre a csimpánzok vagy teljes védettséget mutattak, vagy késleltetett fertőzést. Végezetül Emini és munkatársai csimpánz fertőzési vizsgálatokban in vitro semlegesítést írtak le, mikor is a fertőzés elleni védelem vagy a fertőzés késleltetése szintén korrelációt mutatott a V3-hurok-elleni vírus-semlegesítő ellenanyaggal [Emini és mtsai.: J. Virol. 64, 3647-3678 (1990)] .

Újabban Ward és munkatársai mutatták ki, hogy a humán IgG Fc-régiójából és a CD4-vírus receptorkötő doménjéből álló kiméra molekula szintén képes megakadályozni a csimpánzok HIV-l-fertőződését, ha a vírussal való fertőzés előtt adjuk be [ Ward és mtsai.: Natúré 352, 434-436 (1991)] . Azonban a V3-hurok-elleni ellenanyaggal szemben azok az ágensek, amelyek blokkolják a vírus-CD4 kötődést, az in vitro HIV-l-fertőződés gyenge semlegesítő!, és hatásuk könnyen megszűnik a gpl20-CD4 kötés affinitásának megváltozásával [ Layne és mtsai.: J. Virol. 65, 3293-3300 (1991); Kang és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 6171-6175 (1991); Thali és mtsai.: J. Virol. 65, 5007-5012 (1991)] .

Emini és munkatársai újabban igazolták, hogy egyetlen HIV-l-törzsre (Illb) specifikus egér/ember kiméra monoklonális ellenanyag képes megakadályozni a HIV-1Illb-fertőződést csimpánzokban, mind a vírussal való találkozás előtt, mind utána [Emini és mtsai.: Natúré 355, 728-730 (1992)] .

Tehát a jelen találmány tárgyát új, rekombináns humán immunglobulinok és fragmenseik, valamint előállításuk képezi, mely immunoglobulinok és fragmensek semlegesítő hatásúak HIV-l-re vonatkozóan. A találmány tárgyához tartozik továbbá HIV-l-et semlegesítő humán immunglobulinok új humán FAB- és Fv-részeinek előállítása. A jelen találmány továbbá a humán HIV-l-et semlegesítő immunglobulinok új DNS-szekvenciáira, valamint az új immunglobulin DNSszekvenciákat tartalmazó expressziós vektorokra vonatkozik. A találmány vonatkozik továbbá az új immunglobulin DNS-szekvenciákat tartalmazó vektorokat hordozó rekombináns gazdasejtekre, valamint a módosított humán konstans • · · * * ♦ * · · · · ····· ··

- 5 régiókat tartalmazó rekombináns HIV-l-semlegesítő humán immunglobulinokra. A találmány tárgya továbbá eljárás a HIV-l-fertőzés megakadályozására, oly módon, hogy rekombináns HIV-l-semlegesítő humán immunglobulinokat adagolunk, valamint eljárások a HIV-l-fertőzés kezelésére, oly módon, hogy rekombináns, HIV-l-et semlegesítő humán immunglobulinokat adagolunk.

A találmány tárgyát rekombináns HIV-l-semlegesítő humán immunglobulinok, valamint a rekombináns immunglobulinok klónozására és expresszálására szolgáló eljárások képezik. A HIV-l-et semlegesítő humán immunglobulinokat vagy az immunglobulin komplementaritást meghatározó régiókat (CDR) kódoló DNS-t rekombináns módszerekkel humán konstans régiókat kódoló DNS-hez fúzionáltatva expressziós vektorokba klónozzuk, majd rekombináns gazdasejtekben expresszáltatjuk.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a csatolt ábrák leírását.

Az 1. ábrán láthatók a rekombináns klónozásban használt, az ellenanyag nehéz és könnyű láncát kódoló DNS-ben levő szekvenciákat képviselő DNS-oligonukleotid indító molekulák.

A 2A és 2B ábrán látható a 447-52D-jelű ellenanyag nehéz lánca komplett nukleotid szekvenciája, a 2B ábrán a 447-52D-jelű ellenanyag könnyű láncának teljes nukleotid szekvenciája látható, a rekombináns vektorok által előállított módon.

fii

A 3. ábrán a 447-52D-jelű ellenanyag nehéz és könnyű láncai variábilis doménjeinek készítésében használt DNSoligonukleotid indító molekulák láthatók.

A 4. ábrán a 447-52D-jelű ellenanyag nehéz és könnyű láncai variábilis régióinak rekombináns klónozási eljárásainak sematikus diagramjai.

Az 5. ábrán a rekombináns ellenanyag humán gamma-1 nehéz láncát tartalmazó pHIV/447VH/Cyl plazmid sematikus diagrammja látható.

A 6. ábrán a rekombináns ellenanyag könnyű láncát tartalmazó pHIV/447VX/C% plazmid sematikus diagrammja látható.

A 7. ábrán mind a könnyű láncot, mind a humán gamma1 nehéz láncot tartalmazó p63.79r447-jelű plazmid sematikus diagrammja látható.

A 8. ábrán a p63.79r447-jelű plazmid előállításában alkalmazott klónozási stratégia sematikus diagrammja látható .

A jelen találmány tárgyát HIV-l-et semlegesítő humán immunglobulinok, valamint az egyedi immunglobulinok rekombináns módszerrel való előállítása és expresszálása képezi. Az egyedi rekombináns immunglobulinok tartalmazzák a HIV-l-semlegesítő komplementaritást meghatározó régiókat (CDR). A rekombináns, HIV-l-et semlegesítő CDR-t tartalmazó immunglobulinok rekombináns módszerekkel úgy módosíthatók, hogy az eredeti, természetes immunglobulintól eltérő nehéz és/vagy könnyű lánc keretrégiókat tar talmazzanak .

A rekombináns módszerekkel módosított immunglobulinok például IgGl-izotípusúvá alakíthatók, bármely más IgG-izotípusról, illetve más immunglobulin osztályról.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás HIVfertőzés megakadályozására, oly módon, hogy a rekombináns HIV-semlegesítő immunglobulint vagy a HIV-l-fertőzés előtt, vagy a HIV-l-fertőzés után adjuk be. A jelen találmány tárgya továbbá a HIV-l-fertőzés kezelése, rekombináns HIV-l-semlegesítő immunglobulin beadásával.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás a megváltoztatott ellenanyag készítésére és expresszálására, ami abban áll, hogy: (i) a variábilis régió doménjeinek mutagenezise és összerakása, beleértve a CDR-eket és keret (FR) -régiókat ; (ii) expressziós vektor készítése, amely legalább egy variábilis régiót tartalmaz, amely a sejtekbe való transzfekció után annyi fehérje expresszióját eredményezi, amely elég az aviditás és specifitás meghatározáshoz; és (iii) a könnyű- és nehéz lánc expressziós vektorok együtt amplifikálása a megfelelő sejtvonalakban.

A jelen találmány vonatkozik továbbá állati monoklonális ellenanyagokból származó CDR-ek humán immunglobulin keretekbe rekombináns módszerekkel történő beépítésére, oly módon, hogy a keletkező rekombináns humán immunglobulin vagy nem immunogén, vagy csak gyengén immunogén lesz, ha embereknek adjuk be. A rekombináns immunglobulinokat előnyösen saját fehérjeként ismeri fel a szervezet, ha terápiás céllal beadjuk őket. Ez a ”humanizálási módszer a rekombináns ellenanyagokat hasz nos terápiás ágensekké teszi, mivel egyáltalán nem lesznek immunogének, vagy csak gyengén immunogének lesznek, ha embereknek beadjuk őket. A találmány tárgya továbbá bármely állati monoklonális ellenanyag rekombináns konverziója rekombináns humán monoklonális ellenanyaggá, azzal a feltétellel, hogy egy megfelelő keretrégió azonosítható (amint azt az alábbiakban ismertetjük) . Szándékaink szerint a jelen találmány tárgyát képezik a humán és állati CDR régiók, valamint a humán keretrégiók nukleotid és aminosav szekvenciái, vagy szeparálva, vagy könnyű vagy nehéz láncba kombinálva, vagy intakt immunglobulinként, és annak, bármely konzervatív módon konzervált vari ánsaiként. Az állati monoklonális ellenanyagok közé tartozhatnak, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, azok a rágcsáló monoklonális ellenanyagok, amelyek kötődnek a HIV-l-hez, valamint a megfelelő mABok, amelyeket a Hybridoma Cell Bank-ban letétbe helyezett hibridómák termelnek [ az American Type Culture Collection, azaz ATCC, az Egyesült Államok Nemzeti Sejtbankja tartja fenn] , és az ATCC katalógus Cell Lines & Hibridomas részében vannak leírva (No. 6, 1988).

A továbbiakban mindegyik aminosav hárombetűs és egybetűs jelzése megfelel a szakterületen használt standard jelzéseknek, amelyeket az alábbiakban foglalunk öszsze:

Alanin	Alá	A	Leucin	Leu	L
Arginin	Arg	R	Lizin	Lys	K
Aszparagin	Asn	N	Metionin	Met	M
Aszparaginsav	Asp	D	Fenilalanin	Phe	F

Cisztein	Cys	D	Prolin	Pro	P
Glutaminsav Glu	E	Szerin	Ser	S
Glutamin	Gin	Q	Treonin	Thr	T
Glicin	Gly	G	Triptofán	Trp	w
Hisztidin	His	H	Tirozin	Tyr	Y
Izoleucin	Ile	I	Valin	Val	V
A jelen találmány vonatkozik továbbá olyan módsze-
rekre és	eljárásokra, me	lyek alkalmasak	a HIV-1	semlege-
sítésére	képes	egyedi	ellenanyagok	készítésére és
expresszálására. A	HIV-1	-pozitív betegek	által	adott vér

a forrása a semlegesítő ellenanyagokat expresszáló perifériális B-sejteknek. Ezeket a sejteket Epstein-Barrvírussal (EBV) fertőzve tesszük örökéletűvé, majd az egyedi B-sejt kiónokat átvizsgáljuk, hogy képesek-e olyan ellenanyagot szekretálni, amely képes a HIV-l-MN-törzs szilárd fázisú ELISA formátumban bemutatott V3-hurkát reprezentáló peptidjéhez kötődni. Az ebben a vizsgálatban pozitívnak bizonyult B-sejt kiónokat ezt követően stabilizáljuk, oly módon, hogy az SHM-D33-sejtvonallal fúzionáltatjuk (ez egy rágcsáló x humán heterohibridóma, ATCC CRL 1668). A kapott B-sejt-heterohibridóma kiónokat átvizsgáljuk, hogy képesek-e olyan ellenanyagokat termelni, amelyek felismerik az MN V3-hurok peptidet szilárd fázisú ELISA-ban. Ezek az eljárások képezik az alapját a stabil humán ellenanyag-termelő sejtek azonosításának és felismerésének, amely sejtek által termelt ellenanyag potenciálisan jól használható olyan anyag kifejlesztésében, amelyet profilaktikusan lehet alkalmazni feltételezett

HIV-l-fertőzés megelőzéses kezelésében, valamint HIV-1pozitív betegek kezelésében.

Számos különböző eljárás alkalmazható HIV-l-elleni ellenanyagot kódoló DNS-molekuláris klónozásában. Ezek közé a módszerek közé tartozik, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, az ellenanyag gén közvetlen funkcionális expressziója, egy ellenanyag-tartalmú cDNS-könyvtárnak megfelelő expressziós vektorrendszerben való elkészítése után. Egy másik módszer egy bakteriofág vagy plazmid ingázó vektorban készített ellenanyagtartalmú cDNS-könyvtár átvizsgálása olyan jelzett oligonukleotid próbákkal, amelyeket az ellenanyag fragmensek aminosav szekvenciája alapján terveztünk.

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy más típusú könyvtárak, valamint más sejtekből vagy sejttípusokból készített könyvtárak is használhatók HIV-l-elleni ellenanyagot kódoló DNS-izolálására. A más típusú könyvtárak közé tartoznak, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, a más, nem a 447-es B-sejtekből vagy B-sejtvonalakból származó cDNSkönyvtárak, valamint a genomiális cDNS-könyvtárak.

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a megfelelő cDNS-könyvtárak olyan sejtekből vagy sejtvonalakból állíthatók elő, amelyek HIV-l-elleni' ellenanyagot termelnek. A HIV-l-elleni ellenanyag izolálására használható cDNS-könyvtár készítésére használt sejteket vagy sejtvonalakat úgy választjuk ki, hogy először megmérjük a sejt által termelt HIV-l-elleni ellenanyag • · ·· »· ········ ··· · · ♦ · ·«···«·· ···«··· ···»·· ♦· ♦β· · · ·· ···»· »·

- 11 mennyiségét, az előzőkben valamint a későbbiekben ismertetett eljárások alkalmazásával.

cDNS-könyvtárak készítését a szakterületen jártas szakember számára jól ismert standard technikákkal végezhetjük. A jól ismert cDNS-könyvtár készítési eljárások megtalálhatók például kézikönyvben is [ Sambrook és

mtsai. :	Molecular Cloning:	A Laboratory Manual,	2.	kia-
dás .,	Cold Spring Harbor	Laboratory Press,	NY,	USA
(1989)]	•
A	szakterületen jártas	szakember számára az	is	nyíl-

vánvaló, hogy a HIV-l-elleni ellenanyagot kódoló DNS-egy megfelelő genomiális DNS-könyvtárból is izolálható.

A genomiális DNS-könyvtárak készítését a szakterületen jártas szakember számára jól ismert módszerekkel végezhetjük. A jól ismert genomiális DNS-könyvtár készítési eljárások megtalálhatók például kézikönyvben is [ Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)] .

Az alábbi eljárásokat előnyösen alkalmazhatjuk olyan rekombináns DNS-szekvenciák előállítására, amelyek tartalmazzák az ellenanyag variábilis régióit, az előzőkben ismertetett, B-sejtvonalakból előállított könnyű- és nehéz láncokat, humán konstans régiókkal kombinálva. Ezek a rekombináns DNS-ek használhatók emlős sejtek transzfektálására, azzal a céllal, hogy olyan rekombináns humán ellenanyagot expresszáljunk, amely megtartja a humán donor B-sejtjéből származó ellenanyag antigénspecifitását. Előnyösen a rekombináns immunglobu • · • ♦ · • · · linókat a szervezet saját fehérjéiként ismeri fel, ha terápiás céllal adjuk be. Az össz-RNS-t extraháljuk a humán heterohibridómákból, például az ismertetett humán heterohibridóma sejtekből, standard módszerek alkalmazásával, például guanidium-izotiocianáttal végzett sejt szolubilizálással [ Chirgwin és mtsai.: Biochem., 18, 5294-5299 (1979)] .

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy más HIV-l-elleni ellenanyagot termelő sejtek is alkalmasak olyan rekombináns DNS-molekulák előállítására, amelyek a teljes HIV-l-elleni molekulát, vagy annak egy részét kódolják. Az ilyen HIV-l-elleni ellenanyagokat termelő sejtek közé tartoznak azok, amelyeket az alábbi publikációkban közöltek, nélkül, hogy csak ezekre korlátoznánk magunkat [ Girney, M.K. és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 88, 3238-3242 (1991), Robinson J.E. és mtsai.: AIDS Rés. Humán Retrovir., (5, 567-579 (1990); Posner M.R. és mtsai.: J. Immunoi., 146, 5325-5331 (1991); Ho D.D. és mtsai.: J. Virol., 65, 489-493 (1991); Tilley, S.A. és mtsai.: Research Virol., 142, 247-259 (1991); ATCC Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7. kiadás (1992)] . Az alábbiakban ismertetett 447-52D-jelű heterohibridómát használjuk elsődleges példaként az ismertetendő egyedi eljárás leírásakor.

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló továbbá az is, hogy a humán immunglobulin (lg) tartalmazhat kappa vagy lambda könnyű láncokat, illetve lehet az

• ········ • · ········ alábbi nehéz lánc izotípusok egyike: alfa (IgA), delta(IgD), epszilon (IgE), gamma (IgG) és mű (IgM).

Az öt különböző ellenanyag nehéz lánc izotípus különböző tulajdonságokkal látja el a teljes ellenanyag molekulát. Például az IgA a fő ellenanyag osztály a szekretált testnedvekben (tej, nyál, könnyek, valamint légzési és bél szekréciók), és általában a beleket, hörgőket, szaporító szerveket, illetve az emlő-, nyál- és könnyvezetéket borító epiteliális sejtek felszínén található meg. Az IgM a vérbe szekretált ellenanyagok fő osztálya, egy antigénre adott primer ellenanyag válasz korai fázisában, és multivalens, általában összesen 10 antigén kötőhelyet tartalmaz. Az IgE-nek nagy affinitása van a legtöbb sejten és bazofil leukocitán megtalálható receptorokhoz, és általában az allergiás reakciókban játszik szerepet. Az IgD a nyugalomban levő B-sejtek felszínén található, funkciója még nem világos. Az IgG az immunglobulinok fő osztálya a vérben, bőségesen termelődik a szekunder immunválaszokban, az Fc-régió képes a fagocita sejtekhez kötődni, elősegítve a fagocitózist, az Fcrégió képes aktiválni a koplementrendszert (úgy mint az IgM) , és ez az egyetlen ellenanyag, amely képes átjutni a placentán, és belép a magzati vérkeringésbe.

A normális G osztályú humán immunglobulin 4 alosztályt tartalmaz, amelyeknek eltérő biokémiai jellemzőik vannak. A normál IgG körülbelül 70% IgGl-et, 18% IgG2-t, 8% IgG3-at és 3% IgG4-et tartalmaz. Az antigénnel való érintkezés módja és időtartama, az antigén típusa és a genetikai háttér mind érintheti a termelt IgG alosztály

típusát. Mivel az immunglobulinok fő osztálya, ezért az IgG és az IgG alosztályok nagy jelentőséggel bírnak mind az immunitásban mind a betegségben.

Kívánatos lehet rekombináns DNS-technikákkal olyan rekombináns HIV-l-elleni ellenanyag előáltítására, amely a természetes ellenanyagétól eltérő nehéz lánc osztályt vagy alosztályt tartalmaz, nyag lehet IgM (vagy más kevésbé kívánatos mint az

Például a természetes ellenaimmunglobulin osztály), amely IgA olyan rekombináns ellenanyag molekulák előállítására, amelyek a légző-, emésztővágy szaporítószervekbe szekretálódnak. A szakterületen jártas szakember számára jól ismert rekombináns DNStechnikákkal az IgM nehéz lánc konstans régiója egy IgA nehéz lánccal helyettesíthető, és rekombináns módszerek kel expresszálható. Emellett egy IgG3 természetes ellena nyag rekombináns módszerrel IgGl ellenanyaggá változtatható, amikor arra van szükség, hogy rekombináns módszer rel egy olyan ellenanyagot állítsunk elő, amelynek erő sebb a komplement rendszert aktiváló tulajdonsága.

Az egyik IgG alosztályba tartozó ellenanyag molekulának egy másik IgG alosztályba tartozó ellenanyaggá való alakítását rekombináns DNS-technikával a jelen találmány leírásában a 442-52D-jelú HIV-elleni ellenanyagon keresztül mutatjuk be. A 447-42D-jelű ellenanyag természetes formájában egy IgG3, amelyet IgGl-gyé alakítunk az alábbi rekombináns DNS-eljárások alkalmazásával. A szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára nyilvánvaló, hogy az alábbiakban ismertetett rekombináns DNSelj árások alkalmazhatók más, IgG-től eltérő immunglobulin «··· «· ········ ··· ««*» ········ ♦ ♦ w ··»· ······ ·· ·*· · · ·· ··♦ ·· ··

- 15 nehéz lánc osztályoknak az átalakítására, és egy IgGl-től eltérő IgG alosztálynak az átalakítására.

Az oligodezoxinukleotid indító molekula párokat (1. ábra), amelyek a humán VH szignál-szekvenciában és a humán C-gamma 3’-végben, valamint a humán V-lambda ellenanyag szignál szekvenciájában és a humán C-lambda 3'végében található szekvenciákat képviselik, egy Applied Biosystem 318A DNS-szintetizátorral szintetizáljuk meg, a gyantáról tömény ammónium-hidroxidos mosással távolítjuk el, ΝΑΡ-5-oszlopon sómentesítjük, majd vízzel eluáljuk, csakúgy mint az összes, a továbbiakban ismertetett oligodezoxinukleotid indító molekulák esetében. Össz-RNSt, amelynek a mennyisége körülbelül 1 pg, reverztranszkripciós eljárásba viszünk körülbelül 30 percre 42° C-on, körülbelül 200 egység AMV-reverz-transzkriptáz (Boehringer Mannheim Biochemicals), és körülbelül 10 pmol komplementer lánc indító molekula felhasználásával, mind a nehéz mind a könnyű láncok esetében. A reverztranszkriptázt hővel inaktiváljuk (95°C, körülbelül 5 perc), majd a reakcióelegyet úgy állítjuk be, hogy körülbelül 100 pl PCR-pufferben körülbelül 50 pmólt tartalmazzon ez egyes páros indító molekulákból, valamint 25 egységet a Taq-polimerázból. Körülbelül 45 amplifikációs ciklust (1 perc 94°C, 2 perc 55°C, 2 perc 72°C) követően a várt DNS-fragmenseket (körülbelül 1400 illetve 700 bázispár méretű DNS-fragmensek a nehéz illetve a könnyű lánc esetében) gélen tisztítjuk. A közbenső plazmidokban való klónozás előtt ezeket a DNS-eket vagy EcoRI (nehéz lánc), vagy EcoRI és SalII (könnyű lánc) restrikciós en« · «* * · ··· · · * · • · ' »·*« • · *»· · *

- 16 • · ··· ·· · ··· · ·· · · ·· «·· ·· · · zimekkel emésztjük, majd agaróz-gélelektroforézissel tisztítjuk. A nehéz-lánc-cDNS-t a pUC18-plazmid egy származékéban klónozzuk, amelybe Ncol és NotI hasítási helyeket építettünk be a már meglévő KpnI- és BamHI-helyek közé, mig a könnyű láncot a pUC18-plazmidba klónozzuk. Több, ezeket a PCR-rel amplifikált szekvenciákat tartalmazó kiónt szaporítunk, majd DNS-szekvencia meghatározásnak vetjük alá. Egy egyedi DNS-szekvenciát, amely egy humán nehéz lánc variábilis régiót képvisel, úgy kapunk meg, hogy elemezzük a megjósolt aminosav-szekvenciát, és a humán lambda könnyű lánc variábilis régiót is hasonlóképpen kapjuk meg. Az alábbiakban ismertetett, klónozott 447-52D-cDNS-ek szekvenciája azt mutatja, hogy a nehéz lánc nagyon erősen hasonlít a gamma 3 konstans régióhoz kapcsolt, III-as alcsoportba tartozó nehéz lánc variábilis régióhoz, míg a könnyű lánc variábilis régió hasonlít egy olyan, I-es alcsoportba tartozó variábilis régióhoz, amely egy lambda konstans régióhoz kapcsolódik. Az alábbiakban ismertetett rekombináns 447-52D-jelű ellenanyagot úgy állítjuk össze, hogy a 447-52D-jelű heterohibridóma részeként talált V-régiókat tartalmazza, valamint a humán gamma 1 (a természetes gamma 3) és lambda 2 konstans régiókat tartalmazza (a természetes rekombináns 447-52Djelű immunglobulin szekvenciáját a 2A és 2B ábrákon mutatjuk be) .

A klónozott ellenanyag cDNS-t az előzőkben ismertetett módszerekkel lehet előállítani rekombináns expreszszió révén, oly módon, hogy egy megfelelő promotert és más megfelelő transzkripciós szabályozó elemeket tártál • · · · · ·· » ··· · · ♦ · · • · « · · · «· ««· ·♦ ·· mazó expressziós vektorba klónozzuk, majd prokarióta illetve egy eukarióta gazdasejtbe visszük át, a rekombináns ellenanyag előállítása céljából. Az ilyen manipulációk elvégzésére alkalmas technikákat már részletesen leírták [ Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)] .

Az eukarióta expressziós vektorokat az alábbiakban ismertetett módon készítjük el. Az expressziós vektorokat az alábbiakban úgy definiáljuk, mint olyan DNSszekvenciákat, amelyek a gének klónozott másolatainak transzkripciójához és mRNS-ük transzlációjához szükségesek egy megfelelő gazdasejtben. Az ilyen vektorok használhatók eukarióta gének expresszálására számos különböző gazdaszervezetben, mint például baktériumokban, kék-zöld algákban, növényi sejtekben, élesztő sejtekben, rovarsejtekben és állati sejtekben. Az immunglobulinok számos különböző vírus-alapú rendszerben is expresszálhatók.

A specifikusan tervezett vektorok lehetővé teszik, hogy a DNS-t különböző gazdaszervezetek között ingáztassuk, azaz például baktérium-élesztő vagy baktérium-állat sejtek között. Egy megfelelően tervezett expressziós vektornak az alábbi elemeket kell tartalmaznia: egy replikációs origót ahhoz, hogy autonóm módon tudjon replikálódni a gazdasejtekben, szelektálható genetikai bélyegeket, korlátozott számú hasznos restrikciós enzim hasítási helyet, potenciális képességet a magas kópiaszám elérésére, valamint erős promotereket. Egy promotert úgy definiálunk, mint egy olyan DNS-szekvenciát, amely az RNS • ·· ♦

• « Λ··* «

polimerázt úgy irányítja, hogy kötődjön a DNS-hez és iniciálja az RNS szintézist. Az erős promoter, amely a mRNS iniciálódását magas frekvenciával végzi. Az expressziós vektorok tartalmazhatnak, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, klónozó vektorokat, módosított klónozó vektorokat, speciálisan tervezett plazmidokat vagy vírusokat.

Számos különböző emlős expresszió vektor használható rekombináns HIV-l-elleni ellenanyag expresszálására emlős sejtekben. A kereskedelmi forgalomban levő emlős expreszsziós vektorok közé, amelyek alkalmasak lehetnek rekombináns ellenanyag expresszálására, tartozhatnak, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, a pMClneo (Stratagene), pXTI (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EB0-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37189), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUTCag (ATCC 37460) és XZD35 (ATCC 37565).

A HIV-l-elleni ellenanyagot kódoló DNS-t klónozhatjuk egy expressziós vektorban, hogy egy rekombináns gazdasejtben expresszáljuk. A rekombináns gazdasejtek lehetnek eukarióta vagy prokarióta sejtek, beleértve, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, a baktériumokat, élesztőket, emlős sejtvonalakat, beleértve, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, a baktériumokat, humán, szarvasmarha, sertés, majom és rágcsáló eredetű sejtvonalakat, valamint a rovarsejteket, beleértve, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, a drosophila eredetű sejtvonalakat. Az emlősök-

bői származó sejtvonalak, amelyek megfelelhetnek és kereskedelmi forgalomban vannak, lehetnek az alábbiak, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk:

CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1	(ATCC CRL 1650),	COS-7	(ATCC
CRL 1651),	CHO-KI (ATCC	CCL	61) ,	3T3 (ATCC CCL	92),
NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa	(ATCC	CCL 2),	C127I	(ATCC
CRL 1616) ,	BS-C1 (ATCC CCL	26)	és MRC-	-5 (ATCC	CCL 171).

Az expressziós vektort a gazdasejtbe számos különböző technikával bejuttathatjuk, beleértve, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, a transzformációt, a transzfekciót, a protoplaszt-fúziót és az elektroporációt. Az expressziós vektort tartalmazó sejteket klónozással szaporítjuk, és egyenként elemezzük, hogy meghatározzuk, termelnek-e HIV-l-elleni ellenanyag fehérjét. Az ellenanyagot expresszáló gazdasejt kiónok azonosítása számos különböző eszközzel elvégezhető, beleértve, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az antiellenanyagokkal való immunológiai reakciót, és a gazdasejthez kapcsolódó HIV-l-elleni ellenanyag jelenlétét.

Az ellenanyag DNS-expresszióját elvégezhetjük in vitro készített szintetikus mRNS alkalmazásával is. A szintetikus mRNS-t hatékonyan transzlációba vihetjük kü-

lönböző sejtmentes	rendszerekben, beleértve, anélkül,
hogy igényünket az	ismertetettekre korlátoznánk, a bú-
zacsíra-kivonatokát	és a retikulocita-lizátumokat, emel-

lett hatékonyan transzlációba vihetők sejtes rendszerekben is, beleértve, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, a béka oocitákba való mikroinjek-

ciózást, amelyeknél a béka oocitába való injekciózás az előnyös megoldási mód.

Körülbelül nyolc oligodezoxinukleotid indító molekulát szintetizálunk (3. ábra), amelyek azokat az indító molekulákat képviselik, amelyek ahhoz kellenek, hogy polimeráz-láncreakcióval (PCR) öt DNS-fragmenst amplifikáljunk. A terminális oligodezoxinukleotid indító molekulák kivételével (3. ábra, Al és A2) mindegyik indító molekula tartalmazza azokat a szekvenciákat, amelyek megfelelnek a 447-52D-jelű heterohibridóma nehéz lánc Vrégiójának, illetve azokat a szekvenciákat, amelyek komplementerek azokkal a szignál- vagy intron-szekvenciákkal, amelyeket a 447-52D-V-régióba kell kombinálni, és legalább 15 bázist tartalmaz az 5’-terminális komplementaritás biztosításához, hogy ezzel lehetővé tegye ennek a három fragmensnek az ezután következő PCR-vezérelt rekombi-

nációját [ Daugherty,	B.L. és mtsai.: DNA, 9, 453-459
(1990)] · A megfelelő	indító molekula párt (SÍ és S2, Hl

és H2, valamint II és 12), mindegyikből körülbelül 50 pmólt, körülbelül 10 ng plazmid DNS-sel hozzuk össze, amely a 447-52D-jelű nehéz láncot képviseli, majd körülbelül 2,5 egység Taq-DNS-polimerázt adunk hozzá, és körülbelül huszonöt PCR-amplifikációs ciklust hajtunk végre (1 perc 94°C; 1 perc 55°C, 2 perc 72°C) . Az öt reakció termékeit agaróz-gélelektroforézissel tisztítjuk, majd egyesítjük, mindegyik DNS-fragmensből körülbelül 10 ng-ot használva, a terminális oligodezoxinukleotid indító molekulákkal (Al és A2, 3. ábra) valamint a Taq DNSpolimerázzal (lásd 4. ábra). Az egyesített fragmenseket

·· 9 ♦··€> * • ·9 9 ··· · 99 • · · ·· 999·

- 21 PCR-rel amplifikáljuk (25 ciklus: 2 perc 95°C, 2 perc 55° C, 2 perc 72°C). A szignál- és intron-szekvenciákkal ellátott nehéz lánc V-régió DNS-ek Hindin és Xhol restrikciós endonukleázokkal való emésztése után az amplifikált DNS-t agaróz-gélelektroforézissel tisztítjuk, majd a p9103-vektor kompatibilis hasítási helyére klónozzuk, amely vektor tartalmazza a humán gamma 1 nehéz lánc konstans régiót (lásd 5. ábra). Ezt a vektort az alábbiak szerint készítjük. A DNS-t a coslg9-kozmid klónból tisztítjuk [ Flanagan and Rabbits, Natúré, 300, 709-713 (1982)], majd templátként használjuk a humán gamma 1 konstans régió PCR-amplifikálásához. A megfelelő indító molekula párt (G1 és G2, 1. ábra), mindegyikből körülbelül 50 pmólt, körülbelül 10 ng kozmid-DNS-sel kombináljuk, amely a humán gamma 1 konstans régió exonjait tartalmazza, majd körülbelül 2,5 egység Taq DNS-polimerázt adunk hozzá, majd 25 PCR ciklusban amplifikáljuk (1 perc 94°C, 1 perc 55°C, 2 perc 72°C) . A reakció termékét Xhol és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztjük, agarózgélelektroforézissel tisztítjuk, majd a p9102 intermedier vektorba klónozzuk, amely a HIV-l-promoter egy fragmensét tartalmazza [ -117 - +80-as bázispárok; pCD23;

fragment fragmens

Siekevitz és mtsai.: Science, 238, 1575 (1987)] . A szignál peptiddel és intronnal ellátott könnyű lánc V-régiót Hindui és Xbal restrikciós enzimekkel emésztjük, majd az amplifikált DNS-t agaróz-gélelektroforézissel tisztítjuk, és az FFFF vektorba klónozzuk (leírását lásd később), amelyet előzetesen HindlII és EcoRI restrikciós enzimek-

kel emésztettünk, egy olyan DNS-fragmenssel együtt, amely egy humán könnyű konstans régió exont jelent. Ez utóbbi fragmenst PCR-amplifikálással. kapjuk, amelyben 10 ng-ot használunk a #208 DNS-ből, amely a humán lambda-2 konstans-régió-lokusz EcoRI/HindlII-fragmensét tartalmazza. A megfelelő indító molekula párt (Cl és C2, 1. ábra), mindegyikből körülbelül 50 pmólt, a plazmid DNS-sel kombináljuk, majd körülbelül 2,5 egység Taq DNS-polimerázt adunk hozzá és 25 PCR amplifikációs ciklust hajtunk végre (1 perc 94°C, 2 perc 55°C, 2 perc 72°C) . A reakció 620 bázispár méretű termékét Xbal és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd agaróz-gélelektroforézissel tisztítjuk, mielőtt az előzőkben említett három-résztvevős ligálási reakcióba vinnénk. A kapott expressziós kiónok elemzéséből kiderült, hogy a várt, körülbelül 1,2 kilobázis méretű könnyű láncot kódoló inszert benne van a kiónban. Az elemzést HindlII és EcoRI restrikciós enzimekkel való emésztéssel, majd agaróz-gélelektroforézissel végezzük .

A nehéz lánc és könnyű lánc immunglobulin molekulákat olyan plazmidokról írjuk át, amelyek azonosak, illetve az a különbség közöttük, hogy más immunglobulint kódoló szekvenciákat tartalmaznak. Az immunglobulin expreszsziós vektor előnyös kiindulási molekulája az, amelyet az előzőkben ismertettünk, amely a HIV-l-LTR-promoter egy részét tartalmazza (-117 - +80, a cap helyhez viszonyítva) , valamint tartalmaz egy többszörös klónozó helyet és az SV40 késői poliadenilezési szignálját (7. ábra). A pEE14-plazmid (Celltech, Ltd.) az eredete a legtöbb, eb• ·

- 23 ben a vektorban szereplő DNS-szekvenciának. A plazmid jele pSZ9015. A pEE14-vektor CMVIE-promoterét Miül- és HindlII-emésztéssel távolítottuk el. A 8 kb méretű promoter-mínusz vektor-DNS-t agaróz-gélelektroforézissel tisztítjuk, majd egy körülbelül 200 bázispár méretű PCRrel amplifikált DNS-fragmenssel ligáljuk, amely 197 bázispárt tartalmaz a HIV-LTR-ből (-117 - +80), és Mlulvalamint HindlII-végei vannak (úgy kapjuk, hogy az 1. ábrán közölt indító molekula párt valamint a pCD23CATplazmid DNS-templátot tartalmazza. A nehéz lánc gamma 1 konstans régiót a p9015-vektorban egy 2,0 kb méretű Xbal/EcoRI fragmens képviseli, egy vele nem rokon nehéz lánc V-régióval együtt, így kapjuk a pSP72/58,2/L16VH/y IMRC-vektort.

A 447 nehéz lánc variábilis és az IgGl konstans régiókat, illetve a 447 könnyű lánc variábilis és a lambda 2 konstans régiókat tartalmazó plazmid-DNS-eket befogadó emlőssejtek transzformálása céljából szaporítjuk és tisztítjuk. A nehéz láncot és a lambda könnyű láncot kódoló plazmidokból azonos mennyiséget, körülbelül pg-ot transzfektálunk kalcium-foszfát precipitációs a 293-as humán embrionális vese sejtvonalba eljárással (ATCC CRL

1573). A tenyészetek felülúszóiról szilárd fázisú ELISA vizsgálattal (leírását lásd az alábbiakban) kiderült, hogy egy humán lambda lánc/humán IgGl immunglobulint tartalmaznak. Immulon-2 (Dynatech Labs.) 96-mérőhelyű lemezeket borítunk éjszakán át 10 pg/ml koncentrációjú egér anti-humán lambda lánc konstans dómén monoklonális ellenanyag oldattal (kát. sz. #05-4101, Zymed Laboratories,

Inc.) foszfáttal puffereit sóoldatban, körülbelül 4°C-on, majd körülbelül 1%-os szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA) blokkoljuk foszfáttal puffereit sóoldatban, körülbelül 1 óra hosszat, körülbelül 37°C-on. Foszfáttal puffereit sóoldattal való ismételt mosás után a mintákat (kondicionált tápközeg, amely rekombináns 447-52D-jelű ellenanyagokat vagy a Sigma Chemical-tól származó humán lambda/IgGl-et tartalmaz) 1% BSA tartalmú PBS-ben hígítjuk, majd két párhuzamosban visszük a lemezre és 1 óra hosszat 37°-on inkubáljuk. Standard kalibrációs görbéket készítünk, oly módon, hogy körülbelül 7,8 ng/ml és körülbelül 500 ng/ml közötti koncentrációjú IgG-t használunk erre a célra. A megkötött és teljesen összeállt humán IgGl-et torma-peroxidázhoz kötött egér anti-humán-IgGl-Fc monoklonális ellenanyag (kát. sz. #05-3320, Zymed Laboratories, Inc.) körülbelül 1% BSA-t tartalmazó PBSben készült 1:400-as hígítása 50 μΐ-es alikvot részeivel mutatjuk ki. Körülbelül 1 óra hosszat inkubáljuk körülbelül 37°C-on, majd mossuk, és a megkötött konjugátum menynyiségét úgy mutatjuk ki, hogy körülbelül 1 mmol 2,2'azino-bisz(3-etilbenztiazolin-6 szulfonsav)-at adunk hozzá körülbelül 0,1 mol/1 nátrium-citrát oldatban (pH=4,2), amely 0,03% hidrogén-peroxidot tartalmaz, majd 20 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A mérőhelyek abszorbanciáját 415 nm-re állított ELISA lemezleolvasóval (Bio-Ras, Inc.) határozzuk meg. Egy másik módszer szerint szilárd fázisú ELISA vizsgálatokat végzünk olyan lemezeken, amelyeket az MN-izolátum szekvenciája alapján készített 25 egységből álló pepiiddel borítunk. A peptidet • · ·

- 25 (NleCysTyrAsnLysArgLysArglleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsnllelleGlyCys, SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 1) szilárd fázisú Fmoc-kémiával szintetizáljuk, előre aktivált pentafluorofenil-észterek és hidroxibenziltriazinaktiválás alkalmazásával. Immulon-2 lemezeket borítunk éjszakán át körülbelül 1 gg/ml peptiddel, majd körülbelül 1% borjúmagzat-szérum PBS-es oldatával borítjuk. A megkötött 447-52D-jelű ellenanyag kimutatását az előzőkben ismertetett módon végezzük. A transzfektált humán 293 sejtek által tranziens expressziót követően szekretált ellenanyagot protein A kromatográfiával tisztítjuk. A rekombináns 447-52D-jelű ellenanyag koncentrációját az előzőkben ismertetett ELISA módszerekkel határozzuk meg, majd a hatékonyságukat úgy ellenőrizzük, hogy igazoljuk a HIV-1 egyedi szerotípusait semlegesítő képességét.

Az alábbi vizsgálatot azért végezzük el, hogy menynyiségileg meghatározzuk a sejtmentes HIV-l-vírus által okozott fertőzés semlegesítésének, valamint a sejtrőlsejtre terjedés gátlásának mértékét, oly módon, hogy mérjük a sejtek túlélését az ellenanyag tenyészetekkel és a vírussal való érintkezés után 7-8 nappal. A vizsgált ellenanyagból kétszeres sorozathigítást készítünk sejtszaporító táptalajban (RPMI64O+1O% borjúmagzat szérum), majd 100 μΐ-es térfogatokat teszünk a 96-mérőhelyes lemez mérőhelyeibe (Costar, Corp.). A vírus törzsoldatból 100 μΐt (előállítása krónikusan fertőzött H9 sejtekből, vagy újonnan létrehozott krónikusan fertőzött FDA/H9 sejtekből; 2x10$ sejt/ml sejtsűrűségben szélesztett, krónikusan • · ·

- 26 fertőzött sejtpopulációból származó háromnapos kondicionált táptalajt megtisztítunk, majd fertőző dózisként akkora dózist választunk, amely tízszer nagyobb, mint az a dózis amellyel a vírus törzsoldatból készített utolsó hígítás egy hétnapos vizsgálatban elpusztította az összes MT-4 sejteket) adunk az egyes mérőhelyekhez, majd a vírus-ellenanyag keveréket 1 óra hosszat 37°C-on inkubáljuk. MT-4 sejteket [ Harada és mtsai.: Science, 229, 563-566 (1985) adunk az egyes mérőhelyekhez (1x10^ sejt/mérőhely) 50 μΐ szaporító táptalajban, majd a lemezt 7 napig 37°C-on inkubáljuk, amikor a végpontot meghatározzuk. Az utolsó ellenanyaghigítás koncentrációját, amely megakadályozza az MT-4 sejtek pusztulását, tekintjük a semlegesítés végpontjának. A semlegesítési vizsgálatok eredményeit a 8. ábrán mutatjuk be, és ezek azt mutatják, hogy a rekombináns humán 447-52D-jelű ellenanyag potenciálja azonos a humán heterohibridóma eredetű 447-52D-jelű ellenanyagéval minden egyes vizsgált HIV-1 esetében. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a rekombináns módszerrel készített ellenanyag, amelyet humán lambda és gamma 1 konstans doménekkel expresszálunk, oly módon módosult, hogy megváltozott a kölcsönhatása a V3-PND-hurokkal.

Egy teljes rekombináns 447-52D-jelű humán HIV-1semlegesitő ellenanyag készítését írjuk le, amelynek nehéz és könnyű lánc variábilis doménjei tartalmazzák a 447-52D-jelű humán heterohibridóma ellenanyag maradékait, a kiindulási heterohibridóma ellenanyag specifitásának és potenciáljának teljes megtartásával.

• · • · « • · · ·♦ · • ·« ·

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánva27 ló, hogy az alábbiakban ismertetett rekombináns humán

HIV-l-elleni ellenanyag ugyanazzal az antigén specifitással rendelkezik mint a természetes ellenanyag, és emellett megtartja a HIV-1-semlegesitő aktivitás széles spektrumát. A szakterületen jártas szakember számára az is nyilvánvaló, líthatók a jelen találmányban ismertetett módszerekkel, és így rekombináns HIV-l-specifikus ellenanyag molekulák állithatók elő.

A HIV-1 egy semlegesítő epitópja, azaz a gpl20glikoproteinhez kapcsolódó epitópok elleni humán

IgG monoklonális ellenanyagot készítő sejtvonalakat

EBV transzformációval állítjuk elő humán perifériális vér mononukleáris sejtjeiből, majd a sejtvonalakat azon az alapon szelektáljuk, hogy termelnek-e a keresett specifitással rendelkező ellenanyagot, majd a kiválasztott EBV-transzformált sejteket egy heteromielóma sejtvonallal fúzionáltatjuk.

Az összes keletkező heterohibridóma sejt termel a kiválasztott szülő EBVtranszformált sejtek által termelt ellenanyag epitópspecifitásával (azaz a gpl20-epitópra specifikus) rendelkező humán monoklonális ellenanyagot.

A gpl20-glikoprotein, amely egy vagy több, a jelen találmány szerinti sejtek és ellenanyagok által felismert semlegesítő epitópot tartalmaz, származhat bármelyik is törzsből.

mert HÍV törzsből, azaz például a viszonylag általános MN • · ·

A heteromielóma szakkifejezés alatt olyan hibrid sejtet értünk, amelyet egy nem-humán mielóma sejtvonal és egy humán mielóma sejtvonal fúziójával állítunk elő. Tipikus esetben egy egér mielóma vagy plazmacitóma sejt a humán mielóma sejt fúziós partnere. Az ilyen nem-humán és humán mielóma valamint heteromielóma sejtvonalak jól ismertek a szakterületen, és publikált sejtvonalak lehetnek rájuk jó példák [Teng, N.N. és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 8JD, 7308 (1983); Kozbor, D. és mtsai.: Hybridoma, 2, 7 (1983); Grunov, R. és mtsai.: J. Immunoi. Meth., 106, 257-265 (1988)] .

A jelen találmányban a heteromielóma sejteket használjuk fúziós partnerekként kiválasztott EBVtranszformált humán sejtekhez, hogy így a találmány szerinti heterohibridómákat előállítsuk.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az SHM-D33-heteromielómát használjuk fúziós partnerként. Ez a sejtvonal az ATCC-nél hozzáférhető, ATCC CRL1668 letéti szám alatt.

A heterohibridóma szakkifejezés jelentése a továbbiakban olyan hibrid sejtvonal, amelyet egy ellenanyagot termelő, egyik fajhoz tartozó sejt és egy heteromielóma fúziójával állítunk elő. A heterohibridóma szakkifejezést máshol is használják bármely fajok közötti hibridóma jelölésére, mint amilyen például egy ellenanyagot termelő humán limfocitoid sejtvonal sejtje és egy rágcsáló mielóma sejt között jön létre. Ebben a leírásban ezt a szakkifejezést szűkebb értelemben használjuk.

• · • · ♦ ···

A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint a humán ellenanyagot termelő sejtet egy egér-humán heteromielómával -fúzionáltatjuk. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint a heterohibridóma annak eredményeképpen jön létre, hogy egy EBV-vel transzformált humán limfocitát, amely a HÍV egyik semlegesítő epitópja elleni ellenanyagot termel, egy egér-humán heteromielómával fúzionáltatjuk. Egy még előnyösebb megvalósítási mód szerint, a humán-egér heteromielóma az SHM-D33 jelű sejtvonal .

A semlegesítő epitóp szakkifejezés alatt egy olyan epitópot értünk, amely, ha egy erre az epitópra specifikus ellenanyagot köt meg, a vírus semlegesítését eredményezi. A vírus bármely biológiai aktivitásának semlegesítése, azaz például a szincícium képződés a továbbiakban a semlegesítés érvénye alá esik.

Ahhoz, hogy humán mAB-okat készítsünk a HIV-1 gpl20semlegesítő epitópja ellen, humán perifériális vér limfocitákat

Gorny, M.K.

transzformálunk EBV-vel, amint azt például és munkatársai ismertetik [ Gorny, M.K. és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences,

USA, 86, 1624-1628 (1989)] .

A transzformálandó sejtek előnyösen egy olyan egyed ből származnak, aki HIV-l-elleni ellenanyagokat termel.

Az EBV-vel transzformált sejtek tenyészeteit átvizsgáljuk, hogy van-e bennük a számunkra érdekes epitóp elleni ellenanyag. Az egyik megvalósítási mód szerint az epitóp a gpl20-fehérje semlegesítő epitópja, és a szűrővizsgálatot tisztított gpl20-szal, annak egy fragmensével, vegy • · ·♦♦···♦ . · · · « ·· «·· · ♦ ·· ··· ·♦ egy részét reprezentáló szintetikus pepiiddel végezzük. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint a tenyészeteket a gpl20 V3-hurok-epitópja elleni ellenanyag jelenlétére úgy vizsgáljuk át, hogy a V3-hurokból származó szintetikus 23 tagú peptidet használunk, amely a 306-328-as aminosavakat tartalmazza (a szekvenciát lásd az előzőkben) . Az ilyen peptid mellett további peptidek, amelyek legalább 6 aminosavból állnak, jól használhatók az EBVvel transzformált sejtek átvizsgálására, ahhoz, hogy azonosítsuk a kívánt epitóp specifitással rendelkező ellenanyagokat termelő sejteket.

Bármelyik, a szakterületen jártas szakember számára jól ismert immunoassay (speciális immunológiai vizsgálati eljárás) használható ebben a szűrővizsgálatban. Egy előnyös immunoassay az enzimhez kapcsolt imunszorbens vizsgálat, azaz az ELISA. Egy ilyen vizsgálat felhasználásával a tenyészet felülúszóiban megvizsgáljuk, hogy jelen vannak-e a keresett specifitású és izotípusú ellenanyagok.

A pozitív, EBV-vel transzformált tenyészeteket ismételten klónozzuk, a számos ismert klónozási módszer bármelyikét, azaz például a duplázó hígítás módszerét alkalmazva. A keresett ellenanyagspecifitásra pozitívnak talált tenyészetekből származó sejteket is fúzionáltatjuk a heteromielóma sejtvonallal, egy heterohibridóma előállítása céljából. A fúzionáltatott sejteket ezt követően klónozzuk, körülbelül 1-100 sejt/mérőhely sűrűségben tenyésztve .

• * • · · • · · · · ··· ♦· ««

- 31 A heterohibridóma által termelt ellenanyag specifitását immunoassay módszerekkel határozzuk meg, amelyek jól ismertek a.szakterületen. Egy előnyös megvalósítási mód szerint ELISA és radioimmunprecipitációs (RIP) módszereket használunk. Az antigén készítmény HIV1-virionokat, (például az MN törzsből), a fertőzött sejtek vagy vírusok lizátumait, azaz például az MN- és HTLV-

III-lizátumokat, virális fehérjéket, azaz például gpl20at, illetve rekombináns vagy szintetikus virális peptideket, azaz például az előzőkben ismertetett 23 tagú peptidet tartalmaz.

A jelen találmány szerinti mAB-ok az IgG-izotípusba tartoznak, a heterohibridóma sejttenyészetek felülúszóiból nyerhetők ki, és a szakterületen az IgG tisztítására ismert szokványos módszerekkel tisztíthatok. Az ilyen módszerek közé tartoznak, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, a protein-A Sepharose affinitás-kromatográfia, az Affigel Blue (BioRad, Richmond, CA) és a Protein-A Sepharose kromatográfia kombinációja, illetve a nagynyomású folyadékkromatográfia.

Ha HIV-l-gyel fertőzött, vagy HIV-l-fertőzés kockázatának kitett embereknek adjuk be, akkor a jelen találmány szerinti ellenanyagok terápiás és profilaktikus előnyöket jelenthetnek. A szakterületen jól ismertek azok az emberek, akik különösen ki vannak téve ennek a kockázatnak, ilyenek például az egészségügyben dolgozók, akik injekcióstű révén kerülhetnek érintkezésbe a HIV-l-gyel.

A jelen találmány szerinti ellenanyagok különösen jól használhatók az olyan típusú diagnosztikai vizsgála• · ·

tokban, amelyekben azt vizsgálják, hogy egy beteg érintkezésbe került-e, illetve fertőzött-e HIV-l-gyel.

Az ellenanyagok arra is kiválóan megfelelnek, hogy elemezzük azoknak a HIV-fehérjéknek az expresszióját, amelyekre specifikusak.

A jelen találmány szerinti HIV-specifikus humán mAB használható olyan betegek kezelésére, akik HIV-vel fertőződtek, illetve AIDS-ben szenvednek. A találmány szerinti ellenanyagokat parenterálisan vagy enterálisan adhatjuk be az ismert utak bármelyikét alkalmazva. A beadás lehet például szubkután, intravénás, intramuszkuláris, transzdermális vagy intratekális. Egy másik, vagy ezzel egyidejű beadási út lehet az orális, rektális vagy vaginális út. Az ellenanyagokat az in utero kezeléshez a magzatüregbe is beadhatjuk. Az előnyös adagolási út az intravénás és az intramuszkuláris.

A beadott ellenanyag dózisa függ a beteg korától, egészségi állapotától és testsúlyától, a párhuzamos kezelés módjától, ha van ilyen, a kezelés gyakoriságától, és a kívánt hatás természetétől. A mAB-ok hatásos mennyisége körülbelül 0,1-500 mg per nap, előnyösen körülbelül 3-30 mg per nap. A kezeléshez szükség lehet az ellenanyag infúziójára vagy injekciózására napokon, heteken, hónapokon, vagy éppen éveken át, ami a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló.

Egy tipikus kezelési tartomány abból áll, hogy az ellenanyagból hatásos mennyiséget adunk be körülbelül egy hétig vagy körülbelül hat hónapig. A terápiás eredmény eléréséhez szükséges kezelés időtartama betegről betegre • · · • · · · .< · * · · ·.·♦..

változik, függ a betegség súlyosságától és stádiumától, és az egyes betegek egyedi jellemzőitől.

Az egyes kezeléshez szükséges teljes dózist beadhatjuk több adagban, illetve egyetlen dózisban. A mAB-okat beadhatjuk egyedül, illetve más, a HIV-l-fertőzés elleni gyógyszerekkel együtt, mint például AZT-vel, vagy más betegségtünetek elleni gyógyszerekkel együtt.

A jelen találmány szerinti mAB-ok beadhatók HIV-vel fertőzött várandós mamáknak. Mivel a jelen találmány szerinti ellenanyagok IgG-izotípusúak, ezért képesek átjutni a placentán és bejutni a magzatba. Ez megakadályozhatja a magzat fertőződését, illetve egy fertőzött magzat számára hatékony terápiát biztosíthat.

A találmány szerinti ellenanyagokat tartalmazó gyógyászati készítmények az összes olyan készítményt magukba foglalják, amelyekben az ellenanyag elegendő mennyiségben található ahhoz, hogy a célját elérje. Az ellenanyag mellett a gyógyászati készítmények tartalmazhatnak még megfelelő, gyógyászatilag elfogadható hordozókat, beleértve a töltőanyagokat és a kiegészítő anyagokat, amelyek megkönnyítik az aktív anyag készítmény formába vitelét, amelyek azután már a gyógyászatban használhatók. Egy további gyógyászati készítmény, amely a jelen találmány oltalmi körébe tartozik, a találmány szerinti ellenanyag kombinációja egy intravénás immunglobulin készítménnyel, amint az a szakterületen ismert.

A gyógyászati készítmények lehetnek megfelelő oldatok az injekciós vagy orális úton való beadáshoz, amelyek az aktív adalékanyagból (azaz az ellenanyagból) körűibe• · ··

- 34 lül 0,01-99 százalékot tartalmaznak, előnyösen körülbelül 20-75 százalékot, a töltőanyaggal együtt. Az orális beadásra készített gyógyászati készítmények lehetnek tabletták és kapszulák. A rektálisan és vaginálisan beadható készítmények lehetnek kúpok.

A jelen találmány szerinti mAB-ok konjugálhatók citotoxikus ágensekkel, és immuntoxinokként használhatók [ Vitetta és mtsai.: Science, 238, 1098-1104 (1987)] , vagy HIV-elleni gyógyszereket vagy toxinokat tartalmazó liposzómák felszínére vihetők rá, hogy ezáltal az ilyen gyógyszereket vagy toxinokat specifikusan a fertőzött sejtekhez vezéreljük. A továbbiakban az immuntoxin szakkifejezés egy ellenanyagnak egy vagy több toxinnal, gyógyszerrel, radioaktív anyaggal vagy citotoxikus ágenssel képezett konjugátumát jelenti. Egy toxikus anyag vagy kémiai kötéssel konjugálódik a jelen találmány szerinti ellenanyaghoz, , illetve egy másik módszer szerint rekombináns DNS-technológia alkalmazásával ligálhatjuk. Egy ilyen ligálásban a toxikus fehérjét vagy annak egy aktív fragmensét kódoló DNS-t a mAB nehéz láncot, könnyű láncot, vagy mindkettőt, illetve ezek egy részét kódoló DNShez ligáljuk. Az ilyen genetikai konstrukciók és előállításuk módja jól ismert a szakterületen. A jelen találmány szerinti ellenanyagokhoz konjugálható toxinok lehetnek az alábbiak: ricin, diftéria toxin, Pseudomonas toxin, tumor-nekrózis faktor alfa, és más, a szakterületen ismert toxinok.

Egy tipikus kezelésben, amelyben a jelen találmány szerinti mAB-okat immuntoxinokként használjuk, az ellena• ·

- 35 nyagot egy toxinhoz, azaz például

ricinhez konjugáljuk, amely egymagában toxikus mind a HIV-vel fertőzött, mind a fertőzetlen sejtekre. A citotoxikus anyagot az ellenanyaghoz kapcsolva, a toxikus hatékonyság magas szintje érhető el, erősen lokalizált módon, az ellen a célsej t ellen, amelyhez az ellenanyag elszállította a toxint, megóvva a szomszédos, fertőzetlen sejteket, amelyekhez az ellenanyag nem kötődik.

A HIV-antivirális terápia a virális replikációs cik lus részletes megismerésén alapul, és a replikációnak majdnem az összes meghatározható lépése kínálja a lehetőséget, hogy megzavarjuk a vírus replikációját. A terápiához olyan anyagok állnak rendelkezésünkre, amelyek megzavarják a HIV-nek a sejtekhez való kötődését. A rekombináns CD4 mint molekuláris csali” működik a vírus számára, a virális gpl20-burokfehérjét megkötő celluláris receptorokkal versengve. A jelenleg leghatékonyabb ágensek a következő lépést érintik, azaz a DNS-provírus képződését, a reverz-transzkriptáz (RT) gátlásával. Az ilyen ágensek közé tartozik az AZT valamint más nukleozidanalógok, mint például a didezoxicitidin (ddC) és a didezoxiinozin (ddl), valamint a nem-nukleozid analógok.

A következő megcélzott lépések a provirális DNS-ről készült virális RNS szintézise, érése és a sejtmagból a citoplazmába való transzportja, ami magába foglalja a tat és rév funkció-inhibitorait. A virális RNS-nek transzlálódnia kell, és kísérleti alapon ez a lépés specifikusan gátolható antiszensz oligonukleotidokkal. Végezetül, a virális fehérjéknek össze kell állniuk, hogy új vírus ré···

szecskéket hozzanak létre, és ez egy specifikus virális proteináztól függ. Ezt a proteinázt kristályosították, és az-inhibitorait azonosították [ Roberts és mtsai.:

Science, 248, 358-362 (1990)] .

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a rekombináns HIV-semlegesítő ellenanyag kombinációi egy vagy több, a HIV-fertőzés és AIDS kezelésében vagy megelőzésében jól használható ágenssel.

Például a jelen találmány szerinti rekombináns ellenanyag hatékonyan adható be, a pre-expoziciós vagy poszt-expozíciós periódustól függően, hatékony mennyiségű egyéb, HÍV ellen hatékony antivirális ágensekkel, immunmodulátorokkal, anti-infektív ágensekkel vagy vakcinákkal .

A jelen találmány szerinti rekombináns HIV-elleni ellenanyag, és egyéb, HIV-elleni vagy anti-AIDS ágensek jól használhatók a HIV-vel való fertőzés megelőzésében vagy kezelésében, illetve az azt következő patológiás állapotok, mint például az

AIDS kezelésében.

Az AIDS kezelését, illetve a HIV-vel való fertőzés megelőzését vagy kezelését úgy definiáljuk, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, mint amely a HIV-fertőzés sok különböző állapotának kezelését tartalmazza: AIDS,

ARC (AIDS-hez kapcsolódó komplex) , mind szimptómás mind aszimptómás, valamint a HIV-vel való aktuális vagy potenciális kezés. Például a jelen találmány szerinti vegyületek kombinációja jól használható HIV-fertőzés kezelésére vagy megelőzésére, a HIV-vel való feltételezett érintkezés után vagy előtt, azaz például vértranszfúzió, vérkészít37 • · ·

menyek használata, véletlen tűszúrás, testfolyadékokkal való érintkezés, illetve sebészeti beavatkozás során a beteg vérével való érintkezés alkalmából.

Ezekre a célokra a jelen találmány szerinti rekombináns HIV-elleni ellenanyagot, és egyéb, HIV-elleni vagy anti-AIDS hatóanyagokat kombinációban adjuk be, vagy orálisan, vagy parenterálisan (beleértve a szubkután injekciókat vagy infúziós technikákat), inhalációs permetben, rektálisan vagy vaginálisan, olyan dózisok formájában, amelyek szokványos, nem-toxikus gyógyászatilag elfogadható hordozókat, adjuvánsokat és töltőanyagokat tartalmaznak.

Tehát a jelen találmány tárgyát képezi továbbá gyógyászati készítmények kombinációja HIV-fertőzés és AIDS megelőzésére és kezelésére. A kezelés magába foglalja egy gyógyászati hordozó, valamint a jelen találmány szerinti rekombináns HIV-elleni ellenanyag és a HIV-elleni vagy AIDS hatóanyag kombinációjának beadását az ilyen kezelésre szoruló betegnek.

Ezek a gyógyászati készítmény kombinációk lehetnek orálisan beadható szuszpenzió, tabletta, orrpermet, steril injekció készítmények, azaz például steril, injekciózható vizes vagy olajos szuszpenzió formájúak, illetve lehetnek kúpok.

Ha orálisan adjuk be szuszpenzió formájában, akkor ezeket a készítményeket a szakterületen jártas szakember számára a gyógyászati készítmények területén jól ismert technikákkal állítjuk elő, és tartalmazhatnak mikrokristályos cellulózt, hogy nagy tömegük legyen, alginsavat vagy nátrium-alginátot szuszpendáló ágensként, metilcellulózt a viszkozitás növelésére, valamint a szakterületen jártas szakember számára ismert édesítő/ízesitő szereket.

Mint azonnal felszabaduló tabletták, ezek a készítmények tartalmazhatnak mikrokristályos cellulózt, dikalciumfoszfátot, keményítőt, magnézium-sztearátot, laktózt és/vagy egyéb töltőanyagokat, kötőanyagokat, kiterjesztő anyagokat, dezintegráló anyagokat, hígítószereket és csúsztató anyagokat.

Ha orrpermet formájában vagy inhalálással adjuk be, akkor ezeket a készítményeket a gyógyászati készítmények formázása szakterületen jól ismert módszerekkel állítjuk elő, és készíthetünk belőle oldatokat, például sóoldat ban, benzil-alkoholt vagy egyéb konzerváló szert alkalmazva, adszorpció elősegítőket a biológiai hozzáférhetőség fokozására, fluorozott szénhidrogéneket, valamint egyéb a szakterületen jártas szakember számára ismert oldatban tartó vagy diszpergáló anyagokat alkalmazva.

Az injektálható oldatokat vagy szuszpenziókat a szakterületen ismert módon készíthetjük el, alkalmas, nem-toxikus, parenterálisan elfogadható hígítóanyagokat vagy oldószereket használva, mint amilyen például a mannit, 1,3-butándiol, víz, Ringer oldat vagy izotóniás nát rium-klorid oldat, illetve megfelelő diszpergáló, nedve sítő és szuszpendáló ágenseket használva, beleértve a szintetikus mono- és diglicerideket, zsírsavakat, bele értve az olaj savat.

Ha rektálisan vagy vaginálisan adjuk be kúpok formájában, akkor ezeket a készítményeket úgy állíthatjuk elő, » · hogy a hatóanyagot megfelelő, nem irritáló töltőanyaggal, mint például kakaóvajjal, szintetikus gliceridészterekkel vagy polietilén-glikollal keverjük össze, amelyek szobahőmérsékleten szilárdak, de testhőmérsékleten folyékonnyá válnak és/vagy feloldódnak, felszabadítva a hatóanyagot.

A jelen találmány szerinti hatóanyagokat orálisan is beadhatjuk embereknek, 1-5 mg/testsúly kg dózisban, egyetlen, vagy több dózisban. Az azonban nyilvánvaló, hogy a specifikus dózisszint, dózis arány és a dózis gyakorisága egy adott betegnél változhat, és számos faktortól függ, mint például a használt specifikus hatóanyag aktivitása vagy potenciálja, a hatóanyag metabolikus stabilitása és hatásának hossza, a beteg kora, testsúlya, általános egészségi állapota, neme, étrendje, a beadás módja és ideje, az ürítés sebessége, a gyógyszerek kombinációja, az adott állapotok súlyossága, és a kezelésen áteső gazda.

A jelen találmány szerinti új gyógyászati készítmény kombinációk tartalmazzák az ismertetett rekombináns HIVelleni ellenanyagot, egy vagy több HIV-elleni ágenssel kombinálva, amelyek úgy működnek, hogy megszakítják vagy gátolják a HÍV replikációját, valamint az AIDS-hez kapcsolódó állapotok kezelésére alkalmas hatóanyaggal kombinálva. Ezek a HIV-elleni ágensek lehetnek, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, olyan ágensek, amelyek megzavarják a vírus kötődését a celluláris receptorhoz (mint például az oldható CD4 és rokon peptidek, dextrán-szulfát, N-butil DNJ); a vírus összeállásá« nak-inhibitorai (például kasztanospermin,

6-O-butanoilkasztanospermin, mirisztilezés-gátlók);

reverztranszkriptáz-inhibitorai, beleértve, anélkül, hogy igé nyünket az ismertetettekre korlátoznánk, a nukleozid analógókat (AZT, ddC, ddl, d4T, AzdU, karbovir, Fascarnet, Ganciclovir és a nem nukleozid analógok, mint

A-69992, IAF-BCH189,

Acyclovir) , valamint például a hidroxipiridonok (például 3-{ [ (4, 7-diklórbenzoxazol-2-il)metil] amino-5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon, 3-{ [ (4,7-dimetil benzoxazol-2-il)metil] -amino-5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon, {[ (4,7-diklórbenzoxazol-2-il)metil] amino-5-etil-6metil-2-(1H)-piridinon,

3-{ [ (, 7-klórbenzoxazol-2il)metil] amino-5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon,

3-{[ (7metilbenzoxazol-2-il)metil] amino-5-etil-6-metil-2-(1H)piridinon,

3-{ [ (4-fluorobenzoxazol-2-il)metil] amino-5etil-6-metil-2-(1H)-piridinon, 3-{ [ (7-fluorobenzoxazol-2il) metil] amino-5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon,

3{[ (benzoxazol-2-il)metil] amino-5-etil-6-metil-2-(1H)piridinon, 3-{ [ (4-klórbenzoxazol-2-il)metil] amino-5-etil6-metil-2-(1H)-piridinon, 3-{ [ (4-fluor-7-klórbenzoxazol2-il)metil] -amino-5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon, és 3[ 2-(benzoxazol-2-il)etil] -5-etil-6-metil-2-(1H)piridinon;

a transzkripció transz-aktivátorainakinhibitorai (mint például a tat és rév fehérjékinhibitorai, azaz

7-klór-5-(2-pirril)-3H-1,4benzodiazepin-2-(H)-on, vagy

Ro5-3335), a retrovirális proteináz-inhibitorok (például egy enzimatikus aktivált állapot, szubsztrát, vagy reakció intermedier szerkezetét utánzó, nem hidrolizálódó kémiai struktúrák, RO39-8959

	- 41 -	• · · ····· • · · · ♦ · • * · · ♦ * · • · « »·«· * · · · · · ·	»· · * · « ··· · ·· · · • · · · · « • · * »4 ·«
[ Hoffman	La Roche] ) ;	valamint	a virális	genetikai
expresszió	inhibitorai,	antiszensz	oligonukleotidok al-

kalmazásával. Az AIDS-hez kapcsolódó állapotok kezelésében jól használható hatóanyagok közé tartoznak, anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, az opportunista fertőzéseket kezelő ágensek, az interferon, a granulocita makrofág telepstimuláló faktor, az interleukin-2, a tumor nekrózis faktor és az eritropoietin.

A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a rekombináns HIV-elleni ellenanyagot egy gyógyászati készítményben HIV-reverz-transzkriptáz-inhibitorral és/vagy HIV-proteináz-inhibitorral kombináljuk. Az előnyös reverz-transzkriptáz-inhibitorok az előzőkben felsorolt amino-piridonok. Az előnyben részesített proteinázinhibitorok a hidroxietilamin aktivált állapot mimetikumok, például a RO31-8959 (Hoffman LaRoche). A legelőnyösebbek a rekombináns HIV-elleni ellenanyag valamint egy vagy több reverz-transzkriptázt gátló, az előzőkben felsorolt aminopiridon kombinációi.

Emellett a jelen találmány szerinti rekombináns HIVelleni ellenanyag hatékonyan beadható, expozíció előtti vagy utáni periódusokban, AIDS antivirális szerekkel, immunmodulátorokkal, fertőzés elleni szerekkel kombinálva, mint például azokkal, amelyeket az alábbi táblázatban sorolunk fel.

• ·

- 42 TÁBLÁZAT

Gyógyszer neve

AL-721

Rekombináns humán

Interferon béta

Acemannan

Cytovene

Ganciclovir d4T

Didehidrodezoxitimidin ddl

Didezoxiinozin

EL10

Trinátrium

Foszfonoformát

Didezoxicitidin

ANTIVIRÁLIS SZEREK

Gyártó

Ethigen (Los Angeles, CA)

Triton Biosciences (Almeda, CA)

Carrington Labs (Irving, TX)

Syntex (Palo Alto, CA)

Bristol-Myers (New York, NY)

Bristol-Myers (New York, NY)

Elán Corp. PLC (Gainesville, GA)

Astra Pharm.

Products, Inc.

(Westborough, MA)

Hoffman-LaRoche (Nutley, NJ)

Indikáció

ARC, PGL

HIV-pozitív, AIDS AIDS, Kaposi szarkóma, ARC

ARC (lásd még immunmodulátorok) látást fenyegető CMV perifériális CMV retinitisz

AIDS, ARC

AIDS, ARC

HIV-fertőzés (lásd még immunmodulátorok) CMV retinitisz, HIV-fertőzés, más CMV fertőzések AIDS, ARC

Gyógyszer neve

Novapren

- 43 -	• · · ···«· • · * · « · • · · · · · · • · · ·· ·· • · « · · · ·
Gyártó	Indikáció

Novaferon Labs,Inc. HIV-inhibitor (Akron, OH)

Diapren, Inc.

(Roseville, MN, terjesztő)

Peptid T

Oktapeptid szekvencia Zidovudin; AZT

Peninsula	Labs	AIDS
(Belmont,	CA)

Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle

Park, NC)

Ansamycin IM 427

Adria Laboratories (Dublin, OH)

Erbamont

AIDS, adv, ARC gyermek AIDS, Kaposi szarkóma, aszimptomatikus HÍV-fertőzés, kevésbé súlyos HIV-fertőzés, neurológiai tünetek, más terápiákkal kombinálva, expozíció utáni profilaxis egészséges egészségügyi dolgozóknál ARC (Stamford, CT)

Gyógyszer neve	Gyártó	Indikáció
Dextrán-szulfát	Ueno Fine Chem.	AIDS, ARC, HÍV
	Ind. Ltd	pozitív,
	(Osaka, Japán)	aszimptomatikus
Virazol	Viratek/ICN	aszimptomatikus
		HÍV
Ribavirin	Burroughs Wellcome	Kaposi szarkóma,
	(Rsch. Triangle	HÍV, Retrovirrel
	Park, NC)	kombinálva
Acyclovir	Burroughs Wellcome	AIDS, ARC,
		aszimptomatikus
		HIV-pozitív, AZT-
		vei kombinálva
	IMMUNMODULÁTOROK
Gyógyszer neve	Gyártó	Indikáció
A pH-labilis, alfa	Advanced Biotherapy	AIDS, ARC
aberráns Interfe-	Concepts
ront semlegesítő	(Rockville, MD)
ellenanyag immun-
adszorpciós
oszlopban
AS-101	Wyeth-Ayerst Labs.	AIDS
	(Philadelphia, PA)
Bropirimine	Up j ohn	Kifejlett AIDS
	(Kalamazoo, MI)
Acemannán	Carrington Labs,	AIDS, ARC
	(Irving, TX)	(lásd még
		antivirálisok)

- 45 • · · * * · • · · · · · ··· · · · · • · * · * · · *· ·* · · *

Gyógyszer neve	Gyártó	Indikáció
CL246,738	American Cyanamid	AIDS, Kaposi
	(Pearl River, NY) Lederle Labs (Wayne, NJ)	szarkóma
EL10	Elán Corp, PLC	HIV-fertőzés
	(Gainesville, GA)	lásd még antivirálisok)
Gamma Interferon	Genentech	ARC, TNF-fel
	(S. Francisco, CA)	(tuomr nekrózis faktor)
Granulocita	Genetics Institute	AIDS
makrofág telepsti-	(Cambridge, MA)
muláló faktor	Sandoz (East Hanover, NJ)
Granulocita	Hoechst-Roussel	AIDS
makrofág telepsti-	(Somerville, NJ)
muláló faktor	Immunex (Seattle, WA)
Granulocita	Schering-Plough	AIDS
makrofág telepsti-	(Madison, NJ)
muláló faktor		AIDS, AZT-vel kombinálva
HIV-mag részecske	Rorer	szeropozitív HÍV
immunstimuláns	(Ft. Washington,PA)
IL-2	Cetus	AIDS, AZT-vel
Interleukin-2	(Emeryville, CA)	kombinálva
IL-2	Hoffmann-La Roche	AIDS, ARC, HÍV,

• * · · · • · • · ♦ • ···» * ·

Gyógyszer neve	Gyártó	Indikáció
Interleukin-2	(Nutley, NJ)	AZT-vel
	Immunex	kombinálva
Immunglobulin	Cutter Biological	gyermek AIDS,
intravénás	(Berkeley, CA)	AZT-vel
(humán)		kombinálva
IMREG-1	Imreg	AIDS, Kaposi
	(New Orleans, LA)	szarkóma, ARC,
IMREG-2	Imreg	PGL AIDS, Kaposi
	(New Orleans, LA)	szarkóma, ARC,
Imuthiol Diethyl	Merieux Institute	PGL AIDS, ARC
Dithio Carbamate	(Miami, FL)
Alpha-2 interferon	Schering-Plough	Kaposi szarkóma
	(Madison, NJ)	AZT-vel: AIDS
Metionin-Enkefalin	TNI Pharmaceutical	AIDS, ARC
MTP-PE	(Chicago, IL) Ciba-Geigy Corp.	Kaposi szarkóma
Murami1-tripeptid	(Summit, NJ)
Granulocita	Amgen	AIDS, AZT-vel
telepstimuláló	(Thousand Oaks, CA)	kombinálva
faktor rCD4	Genentech	AIDS, ARC
Rekombináns, oldódó	(S. San Francisco,
humán CD4	CA)
rCD4-IgG hibridek		AIDS, ARC
Rekombináns, oldódó	Biogen	AIDS, ARC
humán CD4	(Cambridge, MA)

• ♦ • · ·*· - 47 -	.··. .·· ·” ·»··»· · · - · · • · ·· · · χ ·· • · · » · ·.· ·· • · ···· ·· ·♦· · · Indikáció
Gyógyszer neve	Gyártó
Interferon alfa 2a	Hoffmann-LaRoche	Kapósi szarkóma
	(Nutley, NJ)	AIDS, ARC, AZT-
		vei kombinálva
SK&F106528	Smith,Kline&French	HIV-fertőzés
oldódó T4	Laboratories
	(Philadelphia, PA)
Thymopentin	Immunbiology	HIV-fertőzés
	Research Institute
	(Annandale, NJ)
Tumor nekrózis	Genentech	ARC, gamma
faktor, TNF	(S. San Francisco,	inteferonnal
	CA)	kombinálva

FERTŐZÉS ELLENI ANYAGOK

Gyógyszer neve

Clindamycin

Primaquin-nel

Fluconazole

Pastille

Nystatin Pastille

Ornydil

Eflornithine

Pentamidine

Isethionate

Gyártó

Upj ohn (Kalamazoo, MI)

Pfizer (New York, NY)

Squibb Corp.

(Princeton, NJ)

Merrell Dow (Cincinnati, OH)

LyphoMed (Rosemont, IL)

Indikáció

PCP kriptokokkuszos meningitisz, kandidiázis orális kandidiázis megelőzése

PCP

PCP kezelés (IM & IV) • · ·

♦ ·♦·

Gyógyszer neve

Piritrexim

Pentamidine isethionate inhalálásra

Spiramycin

IntraconazoleR51211

Trimetrexate

Rekombináns humán Eritropoietin

Megestrol Acetate

Teljes enterális lás

Gyártó

Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park, NC)

Fisons Corporation (Bedford, MA)

Rhone-Poulenc

Pharmaceuticals (Princeton, NJ) Janssen Pharm. (Piscataway, NJ)

Warner-Lambert

EGYÉB

Ortho Pharm. Corp. (Raritan, NJ)

Bristol-Myers (New York, NY)

Norwich Eaton Pharmaceuticals (Norwich, NY)

Indikáció PCP kezelés

PCP profilaxis kriptospiridiális hasmenés hisztoplazmózis kriptokokkuszos meningitisz

PCP

AZT kezeléshez kapcsolódó súlyos vérszegénység AIDS-hez kapcsolódó anorexia kapcsolódó tápláhasmenés és alultáplálás

Az nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti rekombináns HIV-elleni ellenanyag AIDS vírus elleni anyagokkal, fertőzés elleni anyagokkal vagy vakcinákkal való kombiná-

- 49 dóinak oltalmi köre nem korlátozódik a fenti táblázatban felsoroltakra, hanem elvileg ide tartozik minden olyan gyógyászati készítmény kombinációval való kombináció, amely használható az AIDS kezelésében.

Az alábbi példákat a találmány illusztrálása céljából adjuk meg, anélkül azonban, hogy ezekre korlátoznánk magunkat.

1. Példa

A HIV-l-elleni humán monoklonális ellenanyagok előállításának optimalizálása

Ennek a munkának az a célja, hogy megállapítsuk azokat az optimális körülményeket, amelyek a HIV-l-elleni humán mAB-k előállításához szükségesek.

Módszerek szeropozitív egyedből származó perifériális vér limfocitákat transzformálunk EBV-vel. A HIV-elleni ellenanyagokat termelő tenyészeteket felnövesztjük, többször klónozzuk besugárzott GK5 tápláló sejteken, kettőző hígítást alkalmazva (5000 - 10 sejt/mérőhely) . A 74 egyedből ötöt lehetett mind klónozással, mind fúziókkal feldolgozni. Az első klónozással egy időben (azaz 5-7 héttel a tenyészet indítása után), a kiterjesztett tenyészetekből származó limfoblasztoid sejteket SHM-D33 heteromielóma sejtekkel fúzionáltatjuk. A HIV-elleni pozitív hibrideket 100 - 1 sejt/mérőhely koncentrációban klónozzuk. A mAB-ok specifitását ELISA-val, Western blot-tal és RIP-vel vizsgáljuk.

• · • · · *··

IMt · * » • » « * · · «

Eredmények

A PBL-ek EBV-vel örökéletűvé tétele két olyan sejtvonalat eredményezett, amelyek humán mAB-okat termelnek. Amikor azonban az EBV-vel transzformált sejteket SHM-D33-mal fúzionáltattuk, 5 olyan sejtvonalat kaptunk, amelyek humán mAB-t termeltek. Mindegyik sejtvonalat 6-12 hónapig tenyésztettük.

1. táblázat

Beteg kódja	Stabil EBV vonalak	Stabil hibridek	Izotípus	Specifitás
167	Nincs	167-7-D	IgGl,	lambda	gp41
181	Nincs	181-1-D	IgG2,	kappa	gp41
240	Nincs	240-1-D	igei,	kappa	gp41
238	238-2	238-2-D	IgGl,	lambda	p24
241	241-1	241-1-D	IgGl,	lambda	p24

A vérsejtek transzformációja, majd ezt követően egy heteromielómához való fúziója tűnik a leghatékonyabb módszernek HIV-l-elleni humán mAB-ok előállítására, és ez sokkal hatékonyabb, mint a csak EBV-vel való transzformáció .

2. Példa aszimptomatikus HIV-szeropozitiv beteg vett részt a kísérletben. A HIV-l-elleni szérum ellenanyagok jelenlétét kereskedelmi forgalomban levő ELISA-val (Genetic

Systems) vizsgáltuk, majd Western blot-tal igazoltuk, • * <* - · ··; · * · · ··· · · » ν .. .......

♦ · · »··* · ·· ··» · >

Novapath Immunoblot Assay-vel (BioRad). Az egyes betegekből származó limfociták CD4 és CD8 fenotípusát Leu 3a és Leu 2a ellenanyagokkal határozzuk meg (BecktonDickinson), áramlási citometriával, Cytofluorograf Il-t alkalmazva (Ortho). A perifériális vér fehér vérsejtszámát egy Coulter Counterrel dolgozzuk fel, a különbség számokat manuálisan határozzuk meg.

A betegeket a betegség előrehaladottsági foka alapján osztjuk csoportokba, egy immunológiai lépcsőrendszert használva, amelyben a betegeket négy kategóriába osztják, az alábbi, előzetesen publikált kritériumok alapján

[ Zolla-Pazner, S. és mtsai.: Proceedings of the National
Academy of	Sciences,	USA, 8_4, 5404	(1987)] :
Skála szám	CD4:CD8	arány	CD4 se	jt/mm3	Limfocita/mm3
0	>1, 0		>500		>1500
1	<1, 0		>500		>1500
2	<1,0		<500		>1500
3	<1, 0		<500		<1500

A szűrővizsgálatban használt szintetikus peptid

Egy peptidet, amely a HIV-1 MN-törzse gpl20-V3hurkának 23 aminosavát tartalmazza (23 tagú peptid), szilárd fázisú eljárással szintetizáltunk meg (Peninsula Laboratories, Inc., Belmont, CA) . A peptid szekvenciája az alábbi: TyrAsnLysArgLysArglleHisIleGlyProGlyArgAlaPhe TyrThrThrLysAsnllelleGly (SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM:2) .

Ezt a peptidet használtuk ELISA-ban a vele reagáló ellenanyagok szűrővizsgálatában.

• ♦ • ·

- 52 ··* • · ·♦ ···· •· ·«··· • ·ν* · <* · * · · * ···· • ·

EBV-vel transzformált sejtvonalak létrehozása

A HIV-l-elleni mAB-okat termelő humán sejtvonalak készítési eljárását Gorny és munkatársai közölték [ Gorny,

M. K. és mtsai.: Proceedings of the National Academy of

Sciences, USA, 86, 1624-1628 (1989)] . A perifériális vér mononukleáris sejteket Epstein-Barr-vírussal inkubáltuk, majd 3-6 hétig 96-mérőhelyű mikrotiter lemezeken inkubáltuk. A tenyészet felülúszókban levő ellenanyagok ELISA-val való átvizsgálása után (a 23 tagú peptid alkalmazásával), az ellenanyag vizsgálatban pozitívnak bizonyult felülúszókból származó tenyészetek sejtjeit elszaporítottuk, néhányszor átoltva őket, végezetül lombik méretre növesztettük fel. Ezeket a sejteket hívják limfoblasztoid sejteknek.

Sejtfúzió

Az SHM-D33 heteromielómát (egér-humán hibrid) [ Teng,

N. H. és mtsai.: Proceedings of the National Academy of

Sciences, USA, EK), 7308 (1983)] Iscove-féle módosított

Dulbecco táptalajban növesztjük, amelyet 15% borjúmagzat, szérummal, 2 mmol/1 L-glutamáttal, 100 egység/ml penicillinnel és 100 pg/ml sztreptomicinnel egészítettünk ki (komplett táptalaj). A heteromielóma sejteket időközönként 200 pg/ml G418 antibiotikum jelenlétében tenyésztjük, hogy elimináljuk a neomicin-érzékeny variánsokat.

Két nappal a fúzió előtt az SHM-D33 sejteket 1-2 x 105 sejt/ml koncentrációban tenyésztjük (log-fázisú növekedés) . A sejtek életképessége, eritozin B festékkizárás alapján meghaladja a 95%-ot.

Az SHM-D33 sejteket kétszer mossuk foszfáttal puffereit sóoldatban, majd a limfoblasztoid sejtekkel keverjük őket össze, amelyeket a kiindulási tenyészetből felszaporitottunk, de még nem klónoztunk. A sejteket 1:3 arányban keverjük össze, majd centrifugáljuk. Ezután egy perc alatt 1 ml 50%-os polietilén-glikolt (1300-1600 átlagos mólsúly, Sigma Chemicals) adunk cseppenként az üledékhez állandó keverés közben, amit még egy percig folytatunk. A következő öt percben a sejteket lassan meghígítjuk Iscove-féle táptalajjal, majd 200 x g-vel való ülepítés után a sejteket óvatosan felszuszpendáljuk komplett táptalajban, és 96-mérőhelyű mikrotiter lemezekre szőlészt jük 8xl0⁴ sejt/100 μΐ/mérőhely koncentrációban. A következő napon lxlO⁴ egér peritoneális sejtet adunk minden egyes mérőhelyhez tápláló sejtekként, majd a tenyésztést tovább folytatjuk 0,5 mmol/1 hipoxantin, 0,2 gmol/l aminopterin, 16 μιηοΐ/ΐ timidin (HAT) és 1 μιηοΐ/ΐ ouabain (Sigma Chemicals) jelenlétében. A táplálást hetente kétszer megismételjük, HAT-tal kiegészített friss komplett táptalajjal. Két vagy három hét elteltével mindegyik tenyészetnek megvizsgáljuk az ellenanyag termelését az előzőkben említett pepiiddel szemben, majd a 23 tagú peptiddel reagáló ellenanyagokat termelő heterohibrideket 24mérőhelyű lemezeken elszaporítjuk. Azokat a hibrideket, amelyek a legtöbb ellenanyagot (és IgG-t) termelték ELISA mérés alapján, 100, 25 és (legalább kétszer) 1 sejt per mérőhely koncentrációban klónoztuk.

Ellenanyag kimutatás és jellemzés

A tenyészetek felülúszóit a 23 tagú peptiddel szem- ben vizsgáljuk, ELISA-val. Immulon 2 lemezeket (Dynatech) borítunk éjszakán át 4°C-on a szintetikus peptiddel (1 μ g/ml), amelyet nátrium-karbonát pufferben (pH=9, 6) hígítottunk. A lemezeket háromszor mossuk, majd a tenyészet felülúszókat hozzáadjuk az egyes mérőhelyekhez és 90 percig inkubáljuk 37°C-on, majd mossuk. Alkálikus foszfatázhoz konjugált kecske anti-humán IgG-t (Zymed Laboratories) (gamma-lánc specifikus) adunk hozzá, majd további 90 percig inkubáljuk 37°C-on, és a fentiek szerint mossuk. A szubsztrátot, a p-nitrofenil-foszfátot (Sigma Chemicals) 30 percre adjuk hozzá, majd az abszorbanciát 405 nm-en olvassuk le egy MR 700 Microplate Reader-rel (Dynatech).

Az ellenanyagkötődés specifitását radioimmunprecipitációval (RIP) becsüljük meg. A RIP vizsgálatokat Pintér és munkatársai módszerével végezzük [ Pintér és mtsai.: J. Immunoi. Meth., 112, 735 (1988)] , μg !25j__vei jelzett (Bolton-Hunter reagenssel, New England Nuclear) HTLV-IIIB-lizátumot (Organon Teknika) és/vagy MN-lizátumot (Advanced Biotechnologies, Inc.) használva. A tenyészetek felülúszóit a virális lizátumokkal inkubáljuk, majd feldolgozzuk a leírások szerint [ Gorny, M.K. és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 86, 1624-1628 (1989);

Pintér és mtsai.: I. Immunoi. Meth., 112, 735 (1988)] . A humán ellenanyagok elemzése

Az ellenanyagok izotípusát ELISA-val határozzuk meg.

Immulon 2 lemezeket borítunk 1 μg/ml koncentrációjú 23 • · tagú pepiiddel, majd a tenyészet felülúszóval inkubáljuk. Az IgG mAB altípusát a humán IgG négy altípusa ellen készített, alkalikus foszfatázzal konjugált egér monoklonális ellenanyagokkal (Zymed Laboratories) mutatjuk ki.

A mAB könnyű láncát ELISA-val vizsgáljuk, a humán kappa vagy lambda lánc elleni nyúl ellenanyagokkal (Dakopatts) borított mikrotiter lemezeket használva. A használt előhívó ellenanyagok alkalikus foszfatázzal kapcsolt kecske anti-humán kappa lánc és kecske anti-humán lambda lánc ellenanyagok (Sigma Chemicals).

Az IgG mennyiségi mérését is ELISA-val végezzük. A lemezeket kecske anti-humán mAB-vel borítjuk (gamma lánc specifikus), majd sorozatban hígított tenyészet felülúszókkal inkubáljuk. A megkötött IgG-t alkalikus foszfatázzal jelzett kecske anti-humán IgG-vel (gamma lánc specifikus) mutatjuk ki. Az affinitás-tisztított humán IgG-t (Organon Teknika-Cappel) használjuk standardként. A lemezeket leolvassuk, majd standard görbéket készítünk egy automatizált MR-700 Microplate Reader segítségével (Dynatech Laboratories).

Epitóp térképezés

A mAB	finom-specifitását az	Epitópe	Mapping	Kit
(Cambridge	Research	Biochemicals,	Valley	Stream,	New
York) alkalmazásával	határozzuk meg	, amely	a	Geysen	és
munkatársai	által	kifej lesztett	módszert		alkalmazza
[ Geysen és	mtsai.: Proceedings of the National	Academy	of

3998-4002 (1984)] hexapeptidek műanyag

Sciences, USA, 81, tűkön való szintetizálására. Tizennyolc szekvenciális • · ·

átfedő hexapeptidet szintetizálunk, amelyek lefedik a 23 tagú peptidet, in situ, a műanyag tűkön, két további kontroll peptiddel együtt. A peptidekről eltávolítjuk a védőcsoportokat, majd mossuk és szárítjuk, a gyártó előírásai szerint. Mivel a tűk konfigurációja illik a 96mérőhelyű mikrotiter lemezekhez, az ELISA vizsgálatokat standard mikrotiter lemezeken végezzük, a gyártó által javasolt módon. Ezáltal az össze peptid-tartalmú tűt hagyjuk reagálni a vizsgálandó sejtvonalak tenyészetének felülúszójával (1:10 hígítás, 0,1% Tween-20 PBS-ben, amely 1% ovalbumint és 1% szarvasmarha szérumalbumint tartalmaz). Ezután a tűket mossuk és torma-peroxidázzal konjugált kecske anti-humán IgG-vel reagáltatjuk. A színreakciót egy Dynatech MR-700-as lemezleolvasóval olvassuk le, 405 nm-en mért abszorbancia formájában.

HIV-szeropozitív betegből származó összesen 46 vérmintát dolgoztunk fel és transzformáltunk EBV-vel. 3-4 hetes tenyésztés után a mérőhelyeknek átlag 2,9%-a volt pozitív a V3-hurok 23-tagú peptidje elleni ellenanyaggal, ELISA alapján. A 2. táblázatból látható, hogy a pozitív mérőhelyek százaléka enyhén nőtt azokban a csoportokban, amelyeknek a skálaszáma 1 volt, de nem volt jelentős növekedés a pozitív tenyészetek számában olyan betegeknél, akik a betegség eltérő súlyossági szintjében szenvedtek.

2. táblázat

Az MN-törzs gpl20-V3-hurok 23-tagú peptidjére specifikus ellenanyagok előállítása EBV-vel transzformált humán limfocitákkal

Skála szám	Tenyészetek száma	Mérőhelyek száma	Pozitív mérőhelyek száma (%)
0	1	610	16 (2,6%)
1	17	4363	176 (4,0%)
2	21	7340	171 (2,3%)
3	7	2880	8 (2,8%)

A pozitív mérőhelyekből származó limfoblasztoid sejteket tovább növesztjük 24 mérőhelyes lemezeken, majd hetenként egyszer a friss tenyészet felülúszóknak ELISA-val megvizsgáljuk az ellenanyag specifitását, a 23 tagú peptid felhasználásával. Két limfoblasztoid sejtvonalat, a 257-2-t (ATCC #CRL10483) és a 268-11-et (ATCC #CRL10482), amelyek magas szinten termelik a 23 tagú peptid ellen specifikus ellenanyagokat, kettőző hígítással klónozzuk (1000-10 sejt per mérőhely) . Azokat a sejteket, amelyek a legkisebb sejtsűrűséggel szélesztett mérőhelyekből származnak, és továbbra is termelik az ellenanyagokat, még háromszor klónozzuk 100-10 sejt/per mérőhely koncentrációban .

Az eredeti klónozással egy időben mindkét limfoblasztoid sejtvonalat (257-2, 268-11) az SHM-D33 heteromielómával fúzionáltatjuk. Mindegyik mérőhelyben megfigyelhető a hibrid sejtek növekedése. Három héttel a

fúzió után a 257-2 heterohibriddel beoltott 183 mérőhelyből 50-ben (29%), és a 268-11 heterohibriddel beoltott 48 mérőhelyből 43-ban (90%) találtunk a 23 tagú peptid elleni ellenanyagokat. Minden egyes fúzióból az ellenanyag legmagasabb koncentrációját termelő tizennyolc kiónt (ELISA alapján) 24 mérőhelyes lemezekre szaporítjuk fel. Az ellenanyagok termelődését hetente ellenőrizzük, majd azokat a sejteket választjuk ki klónozásra, amelyek a legspecifikusabb ellenanyagot és a legnagyobb IgG koncentrációt termelték. A heterohibridómákat 100-25 sejt per mérőhely koncentrációban klónozzuk, majd ezt követően 1 sejt/mérőhely koncentrációban.

Miközben a limfoblasztoid sejtvonalak (257-2, ATCC #CRL10483; és 268-11 ATCC #CRL10482) termelése 6,4 illetve 3,8 gg IgG/ml/10® sejt/24 óra, a rokon heterohibridómák, a 257-2D (ATCC #HB 10480) és a 268-11D (ATCC #10481) termelése 20,5 illetve 11,3 μg IgG/ml/10⁶ sejt/24 óra. A mAB-okat ELISA-ban reagáltattuk a 23 tagú pepiiddel, amikor a peptid a mikrotiter lemezek falához volt kötve 1 ng/ml koncentrációban (1. ábra).

Ezeknek a mAB-oknak a specifitását tovább is meghatároztuk RIP-pel, aminek az eredményei a 2. ábrán láthatók. Mindkét mAB reagál a HIV^jj env által kódolt gpl20fehérjével, de nem reagál a ΗΤΙιν-ΙΙΙβ-ből származó gpl20szal, mutatva ezzel ezeknek a mAB-oknak a típusspecifitását.

A mAB-okról kiderült, hogy IgG izotípusúak, lambda könnyű láncokkal. A 3. táblázatban a két EBV-vel transzformált kiindulási sejtvonal és a két rokon heterohibridóma jellemzői láthatók. A heterohibridómák háromszor annyi IgG-t termelnek 24 óra alatt mint az EBVvel transzformált sejtvonalak, még úgy is, hogy az EBVvel transzformált sejtvonalak jóval többet termelnek mint a legtöbb, a szakirodalomban ismertetett EBV-vel transzformált sejtvonal [Kozbor, D. és mtsai.: Immunoi. Today, 4, 72 (1983); Casali, P. és mtsai.: Science, 234, 476 (1986); Steinitz, M. és mtsai.: Natúré, 269, 420 (1977)] .

3. táblázat

Az MN-gpl20-V3-hurok 23 tagú peptidjére specifikus humán monoklonális ellenanyagokat termelő sejtvonalak jellemzői

Sej tvonal	Örökéletűvé tétel	Izotípus	IgG koncentráció*
257-2	EBV	IgGl	6,4
268-11	EBV	IgGl	3, 8
257-2D	EBV+fúzió	IgGl	20, 5
268-11D	EBV+ fúzió	IgGl	11,3

* pg/10⁶ sejt/ml/24 óra

Ahhoz, hogy meghatározzuk az egyes ellenanyagok finom-specifitását, epitóp térképezést végzünk átfedő hexapeptidekkel, amelyek öt aminosavval átfedő szekvenciális hexapeptideket képviselnek. Mindegyik peptidet négy párhuzamosban szintetizáljuk, így lehetséges négy minta megvizsgálása egyszerre, egyetlen mikrotiter lemezen. Az • · · · · átfedő antigén régiókat, valamint ezeknek a kísérleteknek az eredményeit a 4. táblázatban mutatjuk be.

A szeronegatív szérumok egy csoportja nem reagált. Egy szeropozitív szérumminta (HIV-szeropozitív egyedekből származó szérum 1:1000 hígításban) a háttérszínt felett reagált az összes tűvel, csúcsreakciót azzal a három tűvel adva, amelyek aPGRAFYTT (SZEKVENCIAAZONOSÍTÓSZÁM: 3) régiót tartalmazzák a V3-hurok csúcsán és a jobb oldalán.

A 257-2D mAB, 1:10 hígításban (3,7 gg/ml) erősen kötődött két szomszédos hexapeptidhez, amelyek az R-K-R-IH-I-G (SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 4) hurok csúcsa bal oldalának 309-315-ös aminosavait képviselik. A 268-11Das mAB (5,4 μ9/ιη1) egy olyan hexapeptidhez kötődött, amely a H-I-G-P-G-R (SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 5) aminosav szekvenciát fedi le. A 4. táblázatban láthatók a két mAB által felismert átfedő antigén régiók.

I

4. táblázat

A humán szérumok és humán monoklonális ellenanyagok reagálása az MN-gpl20-V3-hurok hexapeptidjeivel

ELISA reaktivitás (abszorbancia egység)

Tű# SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: Hexapeptid HIV+_____HIV257-2D 268-11D

Szérum

3	6	YNKRKR	.338	.195	.256	.243
4	7	NKRKRI	.339	.200	.288	.283
5	8	KRKRIH	.251	.184	.259	.239
6	9	RKRIHI	.308	.1831	.781	.252
7	10	KRIHIG	.286	.1701	.592	.179
8	11	RIHIGP	.302	.177	.276	.135
9	12	IHIGPG	.267	.197	.130	.132
10	13	HIGPGR	.269	.185	.1561	.011
11	14	IGPGRA	.361	.191	.163	.164
12	15	GPGRAF	.243	.103	.208	.132
13	16	PGRAFY	.586	.237	.456	.346
14	17	GRAFYT	.582	.239	.272	.288
15	18	RAFYTT	.658	.239	.333	.350
16	19	AFYTTK	.257	.197	.233	.222
17	20	FYTTKN	.385	.233	.273	.274
18	21	YTTKNI	.362	.171	.259	.259
19	22	TTKNII	.284	.191	.219	.212
20	23	TKNIIG	.305	.198	.164	.141
	Ezek az	eredmények	azt mutatják,	hogy a	legkisebb

reaktív peptid (az epitóp magja), amelyet felismer a 2572D, a KRIHI (SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓ SZÁM: 23), a V3-hurok megőrzött hegyének bal oldalán helyezkedik el. A határoló N-terminális és C-terminális arginin és glicin csoportok is hozzájárulhatnak ennek a mAB-nak a kötődéséhez. A 26811D mAB egyetlen hexapeptidhez kötődik, amelynek szekvenciája Η I G P G R (SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 5), és a hurok hegyére, valamint a két szomszédos N-terminális aminosavra terjed ki.

3. Példa

Humán heterohibridóma termelés az EBV-vel transzformált limfociták megismételt kiterjesztése nélkül

Módszer

Az EBV-vel transzformált sejtek és az SHM-D33 heteromielóma fúzióját általában az EBV-vel örökéletűvé tett sejtek 24 mérőhelyes mikrotiter lemezeken való kiterjesztése után 2-3 héttel hajtjuk végre. Ez megfelel 57 hétnek a tenyészet indítása után. A kiterjesztési periódus azonban nagyon kritikus a mAB előállítása szempontjából, mivel a tenyészet mérőhelyek többsége (legalább 90%) negatívvá válik ebben a periódusban a mAB termelésre. Ennélfogva egy alternatív módszert vizsgáltunk meg, amelyből a kiterjesztési periódust kihagytuk, és a fúziót a tenyészet indítása után 3-4 héttel hajtottuk végre. Ekkor az EBV-vel transzformált sejteket tartalmazó 96mérőhelyű lemezeket vizsgáltuk át egy HIV-l-elleni ellenanyag szempontjából, 3-4 héttel a tenyészet indítása után. Az összes olyan mérőhelyből származó sejteket, amelyek HIV-elleni ellenanyagot termeltek, összegyűjtöttük, ♦ »» és azonnal fúzionáltattuk az SHM-D33 heteromielómával, a

2. példában leírtak alapján.

Eredmények

HIV-szeropozitív egyedből származó PBL 8 olyan sejtvonalat eredményezett, amelyek HIV-l-elleni mAB-ot szekretálnak EBV transzformáció után, korai fúziót követően. Hat mAB a HIV-l-p24, 2 mAB a HIV-l-gp41 fehérjéje elleni ellenanyagot termel, RIP-pel és ELISA-val meghatározva. 300 betegből származó 21 stabil sejtvonalat EBV transzformálással állítunk elő, illetve EBV transzformálással és fúzióval, az 1. és 2. példában leírtak alapján. Ez egyenértékű 6-7 sejtvonal per 100 beteg aránnyal, mikor is a beteg véréből 20-40 ml-t használunk. Az ebben a példában ismertetett korai fúziós módszert használva 8 sejtvonalat kaptunk 4 betegmintából, ami jelentős növekedés a stabil ellenanyag-termelő sejtvonalak létrehozásának hatékonyságában.

Az EBV-vel transzformált sejtek korai fúziója a pozitív sejtek kiterjesztése nélkül egy sokkal hatékonyabb módszer mint a mi korábbi technikánk a HIV-l-elleni humán mAB-ok előállítására.

4. Példa

A monoklonális ellenanyag affinitásának meghatározása

A humán mAB-ok disszociációs konstansának meghatározását ELISA módszerrel végezzük, Friguet és munkatársai leírása szerint [Friguet és mtsai.: J. Immunoi. Methods, 77, 305-319 (1985)] . Röviden, a 257-2D és 268-11D tenyészetek felülúszóit 0,5 és 0,6 pg/ml koncentrációban vizs64 gáljuk. Az előzőkben ismertetett 20 tagú peptidet (molekulasúlya 2702 Da) desztillált vízben oldjuk 1 mg/ml koncentrációban (3,7 χ 10^-4 mol/1), foszfáttal puffereit sóoldatban (pH=7,2) hígítjuk, majd 10^-5 - 10^-8 mol/1 koncentrációban használjuk. A felülúszót és a peptidet 16 óra elteltével azonos térfogatban keverjük össze, a keveréket a 23 tagú peptiddel borított lemezekhez adjuk (1 μ g/ml), majd a megkötetlen mAB mennyiségét ELISA-val mérjük. Az adatokat a Klotz-módszer Friguet-féle módosítása szerint ábrázoljuk [Friguet és mtsai.: J. Immunoi. Methods, 77, 305-319 (1985)] , a meghatározása céljából.

A 257-2D és 268-11D mAB-ok értékét 2,3 x 10~7 és

5,9 x 10^-7 mol/1 közöttinek találtuk. Ezek az értékek megegyeznek azokkal,amelyek mások írtak le IgG mAB-okra [Friguet és mtsai.: J. Immunoi. Methods, 77, 305-319 (1985); Larsson, A. és mtsai.: Molec. Immunoi., 24, 569576 (1987)] . A 257-2 és 268-11 humán limfoblasztoid sejtvonalak által termelt mAB-ok Kj értékei hasonlóak azoknak a mAB-oknak az értékeihez, amelyeket a rokon heterohibridómák (257-2D és 268-11D) termelnek. A fentiekben ismertetett értékek a mAB-oknak a 20 tagú pepiidhez való kötődésére vonatkoznak. Ezeknek a mAB-oknak a természetes gpl20-molekulákra vonatkozó értékei lehetnek alacsonyabbak, annak következtében, hogy a teljes fehérje molekula konformációja hozzájárul az epitópokéhoz, amelyekkel a mAB-k reagálnak.

• · ffíf · «· · • « ·«»*

5. Példa

A HIV-fertőzés semlegesítése

Egy tarfolt vizsgálatot használtunk, amely az MT-2 sejtek HIV-vel való fertőzésének gátlását méri, a jelen találmány szerinti mAB-ok semlegesítő aktivitásának kimutatására, a humán komplement jelenlétében illetve távollétében [C. V. Hanson és mtsai.: J. Clin. Micro., 128 (1990); Harada és mtsai.: Science, 229, 563-566 (1985)] .

Tehát a mAB-okat sorozathígításnak vetettük alá 50%-os vizsgáló táptalaj [ C.V. Hanson és mtsai.: J. Clin. Micro., 128 (1990)] és 50%-os normál humán plazma pool összetételű közegben. A plazma pool a humán komplement forrása; a komplement jelenlétében végzett vizsgálatokhoz a mAB-ot és a vírust 18 óra hosszat inkubáljuk 37°C-on. A komplement távollétében végzett vizsgálatokhoz a plazma poolt hővel inaktiváljuk, majd a mAB-ot és a vírust ilyen körülmények között inkubáljuk 1 óra hosszat 37°C-on.' Azt a hígítást, amelynél a bevitt vírus 50%-a semlegesítődik a tarfolt számok alapján, az egyes hígításoknál kapott átlagos tarfolt számok harmadrendű regressziós elemzésének alapján, interpolálással határozzuk meg.

Eredmények

Ha a 257-2D és 268-11D felülúszó folyadékokat HIVj^j vírussal inkubáljuk 1 óra hosszat (nincs komplement), mielőtt a permisszív MT-2 sejteket hozzáadnánk, az 50%-os semlegesítést 1:4700 és 1:2000 hígításoknál érjük el, ami megfelel a 3,0 és 23,0 ng/ml mAB koncentrációnak (5. táblázat). A HTLV-IIIB semlegesítését nem figyeltük meg.

• * ··

Ha a 257-2D-ből és a 268-llD-ből származó mAB-okat egy sokkal érzékenyebb vizsgálatban vizsgáljuk, amelyben az ellenanyagokat a vírussal 18 óra hosszat inkubáljuk humán komplement jelenlétében, a semlegesítést 1:44000 és 1:41000 hígításban értük el, ami megfelel a 0,3 és 1,1 ng/ml mAB koncentrációnak. A HTLV-IIIB semlegesítését megint nem figyeltük meg ilyen körülmények között.

A HIV-gp41 transzmembrán fehérjére specifikus 50-69 humán mAB-ot, és a p24-magfehérjéré specifikus 71-31 mABot, amelyeket korábban Gorny és munkatársai írtak le [ Gorny, M.K. és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 86, 1624-1628 (1989)] párhuzamosan vizsgáltuk, és lényegében nem mutattak semlegesítő aktivitást egyik HIV-törzzsel szemben sem.

5. táblázat

A HIV-elleni humán monoklonális ellenanyagok semlegesítő aktivitásának meghatározása

Semlegesítő ellenanyag titerek (ng/ml) óra, nincs C' 18 óra + C'

mAB	Specifitás	MN	IIIB	MN	IIIB
257-2D	gpl20	1 :4700 (3)	neg	1:44000(0,3)	neg
268-11D	gpl20	1:2000 (23)	neg	1:41000(1,1)	neg
50-69	gp41	1:3	neg	1:3	neg
71-31	p24	neg	neg	neg	neg

··*· ·

- 67 • · «· · ’ ··· · 9 9 · • · · ·«<« ·· ·»· · ·

6. Példa

A HIV-l-V3-hurok-elleni humán mAB-ok különböző vírustörzsekkel reagálnak

Az előzőkben ismertetett módszereket alkalmazva további EBV-vel transzformált sejtvonalakat és a HlV^jq gpl20 V3-hurkára specifikus humán mAB-okat termelő heterohibridómákat állítottunk elő. A heteromielómák közül néhánynak a jele 386-D, 419-D, 447-52D, 477-D, 31111D, 391-95D és 412-D. Ezek közül a mAB-ok közül néhánynak a reaktivitási mintázatát a 257-2D és a 268-11D (a fentiekben ismertettük) mAB-ok mintázatával hasonlítjuk össze.

···

6. táblázat

Hat, a gpl20-ra specifikus humán monoklonális ellenanyag

HIV-tipus-specifitása és semlegesítő aktivitása

ELISA-ban a szintetikus

V3-mal reagál Semlegesítés

mAB	Mag epitóp IIIB MN SF-2 RF	IIIB	MN SF-2 RF
257-2D	KRIHI - + + + (SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM:24		+ + -
268-11D	HIGPGR - + + + (SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM:5)		+ + -
368-D	HIGPGR - + + + (S ZEKVENCIA-AZONO S í TÓ S ZÁM:5)		+
391-95D	* - + +	-	+
419-D	* - + + -	-	+
447-52D	GPGR + + + + (S ZEKVENCIA-AZONO S í TÓ S ZÁM:2 5)		+
311-11D	RKRIHIGP- + + GRAFYTT (S ZEKVENCIA-AZONO S í TÓ S ZÁM:2 6)	—	+
412-D * Nincs	(konformá- + + + ciós) meghatározva

Ezeknek az eredményeknek az alapján a következő következtetéseket lehetett levonni: (1) A V3-hurok hegye a humán mAB-ok által felismert epitópok csoportját tartalmazza; (2) a humán mAB-ok keresztreakciót adnak ELISA-ban néhány, vagy az összes, különböző HIV-l-törzsből származó szintetikus V3-peptiddel; (3) mindegyik megvizsgált antiV3-(MN) humán mAB semlegesíti az MN vírust, beleértve az

egyik olyan mAB-ot (257-2D),amely elsődlegesen a hurok legjobban megőrződött régiójának N-terminális régiója ellen irányul; (4) kereszt-semlegesítés akkor is előfordulhat, ha a magban levő 5 aminosavból 2 megváltozik (például a 257-2D reakciója az MN-nel és SF-2-vel), de a mag epitópban végzett bizonyos változtatások megszüntetik a semlegesítő aktivitást (például a 268-11D reagál az MNnel, de nem reagál a IIIB-vel) ; és (5) az ELISA-val kimutatott keresztreaktivitás sokkal kevésbé szigorú, mint egy biológiai vizsgálattal mért keresztreaktivitás.

Ahhoz, hogy tovább azonosítsuk azt az epitópot, amellyel a 447-52D-jelű HuMoAb reagál, a HuMoAb-nek megvizsgáltuk a reaktivitását egy 18 tagú hexapeptid sorozattal szemben, amely a szűrővizsgálatban használt 23 tagú peptid által képviselt V3mn régiót fedi le; mindegyik hexapeptid öt aminosvban fed át a szomszéd pepiiddel. A hexapaptideket, amelyeket in situ szintetizáltunk polietilén tűkön, Geysen és munkatársai módszerének alkalmazásával [ Geysen és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81, 3998-4002 (1984)] , 29 gg/ml HuMoAb-ot tartalmazó tenyészet felülúszókkal reagáltat-

tűk. Az 1.	ábrán látható,	hogy a	HuMoAb három
hexapeptiddel	reagált, a	HIGPGR-rel	(SZEKVENCIA-
AZONOSÍTÓSZÁM:	13), az	IGPGRA-val	(SZEKVENCIA-
AZONOSÍTÓSZÁM:	14) és a	GPGRAF-fal	(SZEKVENCIA-

AZONOSÍTÓSZÁM: 15). Ezek az adatok azt sugallják, hogy az epitóp, amelyre a 447-52D-jelű HuMoAb specifikus, a hiGPGRaf, ahol a nagybetűs aminosav kódok az epitóp magját jelentik, a kisbetűs kódok pedig a határoló aminosa• · · vakat jelentik, amelyek szintén hozzájárulhatnak az epitóp megkötéséhez.

Annak meghatározására, hogy a régión belül mely aminosavak kritikusak a HuMoAb megkötésében, egy sorozat hexapeptidet szintetizáltunk polietilén tűkön, oly módon, hogy a HUGPGR hexapeptidnek minden egyes aminosavát helyettesítettük a többi 19 aminosavval. így 115 hexapeptidet szintetizáltunk, és mindegyiket reagáltattuk a 447-52D-jelű HuMoAb-bal, mg/ml koncentrációban. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 7. ábrán láthatjuk, és azt sugallják, hogy a HIGPGR-ben az első, a második és az ötödik csoport jelentősen változtatható, és még kimutatható az aktivitás. A nem engedélyezett helyettesítések, például a C, D, és E az I helyett a második pozícióban ritkán láthatók az eddig szekvenált vírus-izolátumokban [ Meyers és mtsai.: Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos (1990); LaRosa és mtsai.: Science, 249 932 (1990)] . Ennek a hexapeptidnek a harmadik, negyedik és hatodik csoportja azonban nem változtatható meg anélkül, hogy ne rontanánk el a pepiidnek a HuMoAb-hoz való kapcsolódási képességét. Ezek az adatok azt sugallják, hogy a 447-52D-jelű HuMoAb mag epitópját a legpontosabban a GPXR szekvencia jellemzi, és az ezt az epitópot határoló aminosav szekvenciák nem járulnak hozzá jelentős mértékben ennek a mag epitópnak az ellenanyag-felismeréséhez.

* ·

•» · · · · • · · · · • · · * · «·· *· ·· . Példa

A humán mAB-ok és a különböző HIV-törzsek V3-hurkának szintetikus peptidjei közötti keresztreaktivitás és affinitás közötti kapcsolat

A humán mAB-ok reaktivitását, amelyet az előzőkben ismertettünk, direkt ELISA-val mértük különböző szintetikus peptidekkel szemben (19 - 23 tagú peptidek) , amelyekkel 1 pg/ml koncentrációban borítottunk lemezeket. Az ellenanyag-affinitást, amit az ezekkel a peptidekkel való kötődés disszociációs konstansa (Kd) formájában mértünk, az előző, 4. példában leírtak alapján határoztuk meg.

Az eredmények a 7. táblázatban láthatók. Az anti-V3 humán mAB-ok 2-4 gg/ml koncentrációban ELISA-ban keresztreakciót adnak az MN, SF-2 és RF HIV-l-törzsek V3hurkának megfelelő szintetikus peptidekkel. Nincs kimutatható reakció a IIIB HIV-l-törzsből származó V3peptiddel. Az ezekhez a peptidekhez való kötődés Kd értékei > 10~⁶ mol/1 (a 286-11D kötődése az RF-hez) és 10~^ mol/1 (a 286-11D kötődése az MN-hez) között változnak.

• · ·

7. táblázat

MN=SF2»RF, IIIB=

Relatív kötő affinitás

ELISA reaktivitás különböző V3-hurkokkal	IIIB
MN	SF-2	RF
0 1,8* )	1,6	1,6	0,3
0 1,9	1,9	1,3	0,2

mAB

Mag epitóp

257-2D KRIHI (SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM:24

268-11D HIGPGR MN>SF2>RF, IIIB= (SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM:5)

368-D HIGPGR MN>SF2»FR, IIIB=0 (S ZEKVENCIA-AZONO S í TÓ S ZÁM:5)

Abszorbancia egységek 410 nm-en mérve

Ezek az eredmények az alábbi következtetésre vezettek: (1) A HIV-1 V3-régióra specifikus humán mAB-ok keresztreaktivitást mutatnak az eltérő vírustörzsek V3régióira, ELISA-val vagy ellenanyag affinitás alapján mérve; (2) a humán mAB-oknak a különböző V3-peptidekhez való affinitása egy vagy több nagyságrenddel is változhat; (3) az affinitásbeli különbségeket nem lehet egyszerűen a megfelelő epitópban található aminosav szekvenciával magyarázni; és (4) az azonos mAB specifitással rendelkező humán mAB-oknak változik az affinitásuk a különböző V3-peptidekhez.

8. Példa

Számos további humán mAB-ot állítottunk elő és vizsgáltunk az előzőkben ismertetett módszerek alkalmazásával. Ezeket az ellenanyagokat, specifitásukat és

t. · ·« ··· f · · » · • · · · · ·

4« ·*· »· » · affinitás! jellemzőiket az alábbi, 8. táblázatban ismertetjük.

Öt humán mAB esetében vizsgáltuk az összefüggést a disszociációs konstans és a semlegesítő kapacitás között. Az eredmények azt mutatják, hogy közvetlen összefüggés van e két tulajdonság között, sugallva, hogy a V3-hurok 23 tagú peptidjéhez való kötődés affinitása jól jelzi a vírus semlegesítés hatékonyságát.

8. táblázat

A HIV-l-gpl20-epitópokra specifikus humán monoklonális

ellenanyagok jellemzői
Humán mAB	Izotípus	ELISA reaktivitás *
Epitóp	MN SF-2	RF	NY5	IIIB	ÉLI
257-2D	IgGl, lambda	KRIHI	+	+	+	+	-	-
268-11D	IgGl, lambda	HIGPGR	+	+	+	+	-	-
386-D	IgG, lambda	HIGPGR	+	+	+	+	-	-
447-52D	IgG3, lambda	GPGR	+	+	+	+	+	-
311-11D	IgGl, lambda	* *	+	+	-	+	-	-
391-95D	IgGl, kappa	* *	+	+	-	+	-	-
419-D	IgGl, lambda		+	+	-	+	-	-
412-D	IgGl, lambda	**	+			+		__

8. táblázat (folytatás)

IgG 50%

Humán mAB	Affinitás	(Kd mmol/l-ben)	Titer ng/ml
MN	SF-2	RF	IIIB
257-2D	,23	,22	1,7	NT	1,0
268-11D	,59	2,3	5, 3	NT	1,0
386-D	,18	, 85	1,7	NT	1,2
447-52D	,56	,32	96	43	NT
447-D	NT	NT	NT	NT	NT
311-11D	7,4	6, 0	NT	NT	392, 0
391-95D	,9	14,4	NT	NT	4,9
419-D	3, 8	,23	NT	NT	12, 0
412-D	27	NT	NT	NT	Neg

Lábjegyzetek:

NT: nincs vizsgálva * 10 mg/ml koncentrációjú mAB-okkal vizsgálva, kivéve a 477-D-t,amelyet < 5mg/ml koncentráció-ban vizsgáltunk ** nincs meghatározva az Epitópe Mapping Kit-tel, de kimutattuk róla, hogy reagál a RKRIHIGPGRAFYTT peptiddel.

Az IgG 50%-os titer a semlegesítési titernek felel meg, jelezve a koncentrációt ng/ml-ben, amely koncentrációban az ellenanyag 50%-os semlegesítést mutat 18 óra alatt, komplement nélkül (kivéve a 257-D és 268-1D mAB-okat, amelyeket 1 óra hosszat vizsgáltunk komplement nélkül) .

A humán mAB-ok relatív affinitása

HÍV

Antigén...........1,0.......1,0...........(Kd mmol/l-ben)

MN 412 < 311 <419 <391 <268=447 < 257 < 386

SF-2 311 < 391 < 268 < 386 < 447-419-257

9. Példa

Rekombináns 447-52D-jelű ellenanyag előállítása

Egy olyan ellenanyagot állítottunk elő, amelyben a könnyű lánc variábilis doménje egy szignál szekvenciát, valamint a 447-52D-jelű heterohibridóma könnyű lánc intron-szekvenciával meghosszabbított könnyű lánc variábilis régióját tartalmazza, egy olyan DNS-fragmenshez fúzionáltatva, amely a humán lambda 2 konstans régióbak egy rövid intron szekvenciáját tartalmazza, valamint a lambda 2 régiót kódoló domént. A nehéz lánc variábilis doménje hasonló módon származik a 447-52D-jelű nehéz lánc V-régiójából, amelyhez ugyanazt a szignál szekvenciát és nehéz lánc intron szekvenciát kapcsoltuk, egy olyan fragmenshez fúzionáltatva, amely a humán gamma 1 konstans régió rövid intron szekvenciáját tartalmazza, valamint a humán gamma 1-et kódoló domént a genomiális formájában.

Az össz-RNS-t standard módszerekkel extraháljuk a 447-52D-jelű heterohibridóma sejtekből, ami magában foglalja a sejt szolubilizálását guanidium-izotiocianáttal [ Chirgwin és mtsai.: Biochem., 18, 5294-5299 (1979)] . Az oligonukleotid indító molekulák sorozatát (1. ábra), amely a humán lambda könnyű lánc variábilis régió szignál

peptidjében és a lambda könnyű lánc konstans régiójában levő szekvenciákat reprezentálja, illetve amely a humán nehéz lánc gamma 3 konstans dómén variábilis régiója 1-es keretében levőket reprezentálja, standard foszforamidit eljárásokkal szintetizáljuk egy Applied Biosystems 391A DNS-szintetizátoron. Az oligodezoxinukleotidokat (oligók) a gyantáról tömény ammmónium-hidroxiddal távolitjuk el, majd NAP-5 oszlopon (Pharmacia) sómentesítjük vizes elúcióval (amikor az oligonukleotidok hossza több mint 45 bázispár), vagy OPC oszlopon (Applied Biosystems) 20%-os acetonitriles elúcióval (amikor az oligonukleotidok 45 bázisnál rövidebbek), a gyártók előírásai szerint. ÖsszRNS-t (2 pg) reverz-transzkripciónak vetünk alá (30 perc, 42°C) AMV reverz-transzkriptázzal (200 egység, BRL), valamint 10 pmol, a konstans régió komplementer szál indító molekuláival, amelyek vagy a könnyű vagy a nehéz láncot képviselik, egy pufferben (végtérfogat 20 μΐ) , amelynek összetétele 50 mmol/1 TRIS-HC1 (pH=8,3), 75 mmol/1 KC1, 3 mmol/1 MgC12, mmol/1 DTT és 20 egység RNAsin (Pharmacia).

A reverz-transzkriptázt hővel inaktiváljuk (95°C, 5 perc), majd a reakcióelegy összetételét úgy ál lítjuk be, hogy 100 μΐ PCR puffért (10 mmol/1 TRIS-HC1, pH=8,3, 50 mmol/1 KC1, 1,5 mmol/1 MgC12, 0,01% zselatin, 200-200 pmol az egyes dNTP-kből), 50-50 pmol az egyes párosított indító molekulákból, és 2,5 egység Taq polimerázt (Perkin Elmer/Cetus) tartalmazzon. A polimeráz láncreakció (PCR) amplifikálást lényegében a Saiki és munkatársai [Saiki és mtsai.: Science, 230, 1350-1354 (1985)] , valamint mások [ Mullis és mtsai.: Cold Spring

Harbor Symp. Quant. Bioi., 51, 263-273 (1986); Dawasaki and Wang, PCR Technology, Principles and Applications fór DNA Amplification, szerk.: Erlich, Stockton Press, NY, 89-97 (1989); Tung és mtsai.: PCR Technology, Principles and Applications fór DNA Amplification, Erlich, Ed., Stockton Press, NY, 99-104 (1989)] leírása szerint hajtjuk végre. Egy DNS-termociklizáló készülékkel (Perkin Elmer Cetus Instruments) végzett 45 amplifikálási ciklus után (1 perc 94°C, 2 perc 55°C, 2 perc 72°C) a várt 1400 és 700 bázis méretű DNS-fragmenseket gélen tisztítjuk. Mielőtt ezeket a DNS-eket intermedier plazmidokba szubklónoznánk, a DNS-eket vagy EcoRI (nehéz lánc) vagy EcoRI és Sáli (könnyű lánc) restrikciós enzimekkel emésztjük, majd agaróz-gélelektroforézissel tisztítjuk. A nehéz lánc cDNS-t a pUC18 egy származékába klónozzuk, amelyben az Ncol és NotI hasítási helyeket a már előzőleg is benne levő KpnI és BamHI hasítási helyek közé helyezzük el, míg a könnyű láncot pUC18-ba klónozzuk. Az ezeket a PCR-rel amplifikált szekvenciákat reprezentáló kiónokat transzformált Escherichia coli DH5-sejtekből izoláljuk, amely sejteket 50 gg/ml ampicillint tartalmazó LBagarlemezekre szélesztettünk, majd az ismert eljárások szerint szaporítottunk [ Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)] . A plazmid DNS-eket Bimbóim és Doly módszerével izoláljuk a baktériumokból [ Bimbóim and Doly, Nucleic Acids Research, T_, 1515 (1979)], majd a kétszálú plazmid DNS-eket DNS-szekvencia meghatározásnak vetjük alá, Sequenase (United States

« ··

Λ ·*

Biochemicals) , valamint először T7 és

SP6 specifikus szekvenáló indító molekulák (Boehringer Mannheim) alkal mazásával, a gyártó által javasolt protokollt használva.

A humán gamma 3 nehéz láncot reprezentáló egyedi DNSszekvenciát kapunk.

Nyolc oligodezoxinukleotidot (3. ábra) szintetizálunk, amelyek azokat az indító molekulákat reprezentálják, amelyek PCR amplifikálással öt DNS-fragmens előállításához szükségesek. A terminális oligodezoxinukleotid kivételével mindegyik tartalmazza azokat a szekvenciákat, amelyek megfelelnek a 447-52D-jelű nehéz lánc Vrégiójának vagy könnyű lánc V-régiójának, illetve a 44752D-jelű V-régiókkal kombinálandó szignál és intron fragmenseknek, és az 5'-terminális komplementaritásból legalább 15 bázist tartalmaznak (lásd 3. és 4. ábra). A megfelelő indító molekula párt (mindegyik 50 pmol) 10 ng plazmid DNS-sel kombináljuk, amely vagy a 447-52D-jelű nehéz lánc cDNS-t vagy a 447-52D-jelű könnyű lánc cDNS-t reprezentálja, majd 2,5 egység Taq DNS-polimerázt, PCR reakciókomponenst és puffért adunk hozzá, majd huszonöt (25) PCR amplifikálási ciklust végzünk (a ciklus: 1 perc 94°C, 1 perc 55°C, 2 perc 72°C) . Az öt reakció termékét agaróz gélen való tisztítás után megfelelően kombináljuk (mindegyik DNS-fragmensből 10 ng-ot) egy terminális oligodezoxinukleotid indító molekula párral(3. és 4. ábra), Taq DNS-polimerázzal, PCR reakciókomponensekkel és pufferrel, majd a következő rekombinált fragmenseket PCRrel amplifikáljuk az előzőkben ismertetett módon, 24 ciklusban. A szignál- és intron-szekvenciával megtoldott ne·· ·· •«9 • · ·· ···· •· ·····

• · ♦ · ·· héz lánc V-régiót Hindin és Xhol restrikciós enzimekkel való emésztés után az amplifikált DNS-t agarózgélelektroforézissel tisztítjuk, majd egy olyan vektor (p9103) kompatibilis helyére klónozzuk, amely tartalmazza a humán gamma 1 konstans régiót (előállítását lásd az alábbiakban, lásd még 5. ábra). A DNS-t a coslg9-kozmidklónból tisztítjuk [ Flanagan and Rabbits, Natúré, 300, 709-713 (1982)], hogy olyan templátként működjön, amely a humán gamma 1 konstans régió PCR amplifikálásában használható. A megfelelő indító molekula párból (G1 és G2, 1. ábra) 50-50 pmolt kombinálunk 10 ng kozmid DNS-sel, amely a humán gamma-1 konstans régió exonjait tartalmazza, valamint 2,5 egység Taq DNS-polimerázzal, és 25 PCR ciklust végzünk vele (a ciklus: 1 perc 94°C, 1 perc 55°C, 2 perc 72°C) . A PCR terméket Xhol és EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, agaróz-gélelektroforézissel tisztítjuk, majd az előzőleg említett restrikciós enzimekkel már megemésztett p9102 plazmádba klónozzuk. Az egyes kiónokat, amelyek azt a vektort reprezentálják, amely tartalmazza mind az előzőekben ismertetett módon előállított 447-52D-jelű nehéz lánc variábilis régiót, mind a humán gamma 1 konstans régiót, amely a genomiális DNS-ből PCR amplifikálással származik, használjuk arra a célra, hogy igazoljuk a rekombináns módszerekkel módosított, 447-52Dt kódoló dómén DNS-szekvenciáját (2A ábra).

A 447-52D-jelű humán könnyű láncot tartalmazó rekombináns vektort úgy állítjuk elő, hogy a PCR-rel amplifikált, szignál és intron szekvenciával megtoldott könnyű lánc V-régiót, amelyet az előzőkben ismertettünk,

HindlII és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, majd ezt a DNS-fragmenst agaróz-gélelektroforézissel tisztítjuk. Ezt a V-régiót kódoló DNS-t a pSP72/58.2/L16VH/ylMRCvektorba klónozzuk (az előzőkben ismertettük), amelyet előzőleg HindlII és EcoRI restrikciós enzimmel emésztettünk, egy olyan DNS-fragmenssel együtt, amely egy humán könnyű lánc konstans régió exont tartalmaz. Ez utóbbi fragmenst 10 ng #208-plazmid-DNS PCR-amplifikálásával állítjuk elő, amely egy, a humán lambda-2 konstans régió lokuszt lefedő EcoRI/HindlII-fragmenst tartalmaz. A megfelelő indító molekula párt (Cl és C2, 1. ábra), mindegyikből 50-50 pmolt, a plazmid DNS-sel és 2,5 egység Taq DNS-polimerázzal kombináljuk, majd 25 PCR amplifikációs ciklust hajtunk végre (egy ciklus: 1 perc 94°C, 2’ 55°C, 2' 72°C) . A reakció 620 bázispár méretű termékét Xbal és EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd agarózgélelektroforézissel tisztítjuk, mielőtt az előzőkben ismertetett három-fragmenses ligálásba vinnénk. A keletkező kiónok elemzésével megtaláltuk a várt, körülbelül 1,2 kb méretű, könnyű láncot kódoló inszertet, HindlII és EcoRI restrikciós enzimekkel való emésztés, majd agarózgélelektroforézissel való tisztítás után. A DNS-t az egyes baktérium kiónok növesztése után nyerjük ki, majd DNS-szekvencia meghatározásnak vetjük alá, Sequenase alkalmazásával, először T7 és SP6 specifikus indító molekulákat alkalmazva, hogy igazoljuk a rekonstruált variábilis régió és az azt határoló lambda konstans régió dómén szekvenciáját (2B ábra). A 447-52D-jelű nehéz és könnyű láncot tartalmazó expressziós vektorokat reprezentáló

plazmid DNS-eket elszaporítjuk [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)], majd annyira megtisztítjuk, hogy befogadó emlős sejtekbe lehessen transzfektálni [Sambrook és mtsai.: Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, 2. Kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989) ; Bimbóim and Doly, Nucleic Acids Research, Ί_, 1515 (1979)] .

A nehéz lánc és könnyű lánc immunglobulin molekulákat olyan plazmidokról írjuk át, amelyek azonosak, illetve közöttük csak annyi a különbség, hogy eltérő immunglobulint kódoló szekvenciát tartalmaznak. Az immunglobulin expressziós vektor egy előnyös kiindulási molekulája az, amelyet az előzőkben ismertettünk, és amely tartalmazza a HIV-l-LTR-promoter egy részét (-117-től a +80-ig, a cap helyhez viszonyítva), egy többszörös klónozó helyet, valamint az SV40 késői poliadenilezési jelét (6. ábra). A pEE14-plazmid (Celltech, Ltd.) az eredete az ebben a vek torban levő legtöbb DNS-szekvenciának, jele pSZ9015. A pEE14-vektor CMVIE promoterét Miül és HindlII restrikciós enzimes emésztéssl távolítjuk el. A 8 kb méretű promoter mínusz DNS-t agaróz-gélelektroforézissel tisztítjuk, majd egy körülbelül 200 bázispár méretű, PCR-rel amplifikált

DNS-fragmenssel ligáijuk, amely a HIV-LTR-ből 197 bázispárt tartalmaz (-117-től +80-ig), és Miül valamint

HindlII végekkel rendelkezik (előállítása: az 1. ábrán ismertetett indító molekula pár és a REP3/HIV-LTR CDRgraftolt 1B4-Vk Humán-Ck/HygB plazmid DNS-templát segítségével) [ DeMartino,

J.A.

és mtsai.: Antibody, • η 4

Immunoconjugates, and Radiopharmaceuticals, £, 829-835 (1991)] . A nehéz lánc gamma 1 konstans régiót egy 2,0 kb méretű Xbal/EcoRI fragmens formájában visszük be a p9015vektorba, egy vele rokonságban nem álló nehéz lánc Vrégióval együtt, így kapjuk a pSP72/58.2/L16VH/ylMRCvektort. A plazmidok jele pHIV447VH a nehéz láncot tartalmazó plazmid esetében, illetve pHIV447VX a könnyű láncot tartalmazó plazmid esetében. Mindkét plazmidot a megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben helyeztük letétbe a jelen leírás benyújtása előtt, az American Type Culture Collection-nél (12301 Parklawn Drive, Rockville MD) , a hozzáférés korlátozása nélkül, a Budapesti Egyezmény alapján. A plazmidokat tartalmazó Escherichia coli gazdaszervezetek az alábbi ATCC letéti számokat kapták: 68495 a pHIV447VHCyl plazmid, illetve 68943 a pHIV447VX/CX plazmid esetében.

A nehéz láncot és a könnyű láncot kódoló plazmidokból azonos mennyiséget (10 pg) transzfektálunk a standard kalcium-foszfát precipitációs eljárással humán 293 sejtekbe [ DeMartino, J.A. és mtsai.: Antibody, Immunoconjugates, and Radiopharmaceuticals, 4, 829-835 (1991)], azzal az eltéréssel, hogy egy HIV-l-TAT-ot kódo ló plazmiddal való transzaktiváláshoz, ko-transzfekció nem volt szükséges a és az ismertetett HIV-l-LTR expreszsziós vektor magas szinten expresszálódott. A tenyészet felülúszót a humán lambda könnyű láncot tartalmazó IgGl immunglobulin szekréciója szempontjából szilárd fázisú

ELISA-k alkalmazásával vizsgáltuk meg (a leírást lásd később) .

ELISA-kat fejlesztettünk ki kondicionált emlős sejt növesztő táptalajba expresszált 447-52D-jelű rekombináns ellenanyagok mennyiségének meghatározására. Immulon-2 (Dynatech Labs) 96-mérőhelyű mikrotiter lemezeket borítunk éjszakán át 10 μg/ml koncentrációjú egér anti-humán lambda lánc konstans dómén monoklonális ellenanyag oldattal (kát. sz. #05-4101, Zymed Laboratories, Inc.), foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS) 4°C-on, majd 1%-os szarvasmarha szérumalbumin (BSA) oldattal (PBS-ben) blokkoljuk 1 óra hosszat 37°C-on. PBS-sel való ismételt mosás után a mintákat (kondicionált közeg, amely rekombináns humán lambda/IgGl standard ellenanyagot [ Sigma Chemical]

1% BSA-t tartalmazó

PBS-ben hígítjuk, majd két párhuzamosban visszük fel és óra hosszat 37°C-on ínkubáljuk. A standard kalibrációs görbéket 7,8 ng/ml és 500 ng/ml koncentrációtartományba eső IgG oldatokkal készítjük el. A megkötött és teljesen összeállt humán IgGl-et torma-peroxidázzal konjugált egér anti-humán-IgGl-Fc monoklonális ellenanyag ikat. sz.

#05-3320, Zymed Laboratories, Inc.)

1% BSA-t tartalmazó PBS-ben való 1:400-as hígításának μΐ-es alikvot részeiből mutatjuk ki. 1 óra hosszat inkubáljuk

37°C-on, majd mossuk, és a megkötött konjugátum mennyiségét 1 mmol/1 2,2'-azino-bisz(3-etilbenztiazolin-6szulfonsav) 0,03% hidrogénperoxidot tartalmazó 0,1 mol/1 nátrium-citrát (pH=4,2) oldatának hozzáadásával határozzuk meg, szobahőmérsékleten való perces inkubálás után. A mérőhelyek abszorbanciáját egy ELISA lemezleolvasóval határozzuk meg (BioRad, Inc.), 415 nm-re állítva.

• ··*· « ·»· · · « » .. .:. · • > * ···· ., ·· »·· · .

- 84 Egy másik módszer szerint szilárd fázisú ELISA-kat hajtunk végre az MN-izolátumok szekvenciája alapján készített 26 tagú peptiddel borított lemezeken. A peptidet (NleCSYNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGCS, SZEKVENCIAAZONOSÍTÓSZÁM:!) szilárd fázisú Fmoc-kémiával szintetizáljuk, előre aktivált pentafluorofenil észterek és hidroxibenziltriazin aktiválás alkalmazásával. Immulon-2 lemezeket borítunk 1 gg/ml koncentrációjú peptiddel éjszakán át, majd 1%-os, PBS-ben készült szarvasmarha szérumalbuminnal blokkoljuk. A megkötött 447-52D-jelű ellenanyag kimutatását az előzőkben ismertetett módon végezzük. A transzfektált humán 293 sejtek által a tranziens expressziót követően szekretált ellenanyagot standard protein A kromatográfiával tisztítjuk [DeMartino, J.A. és mtsai.: Antibody, Immunoconjugates, and

Radiopharmaceuticals, £, 829-835 (1991)] .

A rekombináns 447-52D-jelű ellenanyag koncentrációját az előzőkben ismertetett ELISA-kkal határozzuk meg, majd megvizsgáljuk a hatékonyságát, azon az alapon, hogy kimutatjuk a HIV-1 egyedi szerotípusainak fertőzőképességét semlegesítő kapacitását.

Az alábbi vizsgálatot azért végeztük el, hogy menynyiségileg meghatározzuk a sejtmentes HIV-l-vírusfertőzés semlegesítését, valamint sejtről sejtre terjedés gátlását, oly módon, hogy mérjük a sejtek túlélését, azután hogy a tenyészeteket 7-8 napra érintkezésbe hoztuk az ellenanyaggal és a vírussal. A vizsgált ellenanyagból kétszeres hígítási sort készítünk sejt növesztő táptalajban (RPMI1640 + 10% borjúmagzat szérum), majd 100 μΐ térfoga85 tokát teszünk egy 96-mérőhelyű mikrotiter lemez mérőhelyeibe (Costar Corp.). A vírus törzsoldat 100 μΐ-ét (krónikusan fertőzött H9 sejtekből vagy újonnan létrehozott, krónikusan fertőzött FDA/H9 sejtekből készítve; a 2 x 10⁵ sejt/ml sűrűségben szélesztett, krónikusan fertőzött háromnapos sejtpopuláció táptalaját megtisztítjuk, majd tízszer annyit, mint az a hígítás a vírus törzsoldatból, amennyi az összes MT-4 sejtet elpusztítja egy hétnapos vizsgálatban, választunk fertőző dózisként) hozzáadjuk az egyes mérőhelyekhez,majd a vírus-ellenanyag keverékeket 1 óra hosszat 37°C-on inkubáljuk. Az egyes mérőhelyekhez MT-4 sejteket adunk (1 x 10^ sejt/mérőhely) 50 μΐ tenyésztő táptalajban, majd a lemezt 7 napig 37°C-on inkubáljuk, mikor is a végpontot meghatározzuk. Annak az utolsó ellenanyag hígításnak a koncentrációját, amely megakadályozza az MT-4 sejt elpusztítását, jelezzük mint a semlegesítés végpontját.

A semlegesítési vizsgálatok eredményeit a 9. táblázatban mutatjuk be, ezek azt jelzik, hogy a rekombináns humán 447-52D-jelű ellenanyag potenciálja azonos a humán heterohibridómából származó 447-52D-jelű ellenanyagéval, az egyes vizsgált HIV-l-szerotípusokra. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a rekombináns módszerekkel készített ellenanyag, amelyet humán lambda és gamma 1 konstans doménekkel expresszáltunk, nem módosult úgy, hogy megváltoztassa a kölcsönhatásait a V3-PND-hurokkal, és a rekombináns ellenanyag megtartja a természetes ellenanyag biológiai aktivitásait.

• ·

9. Táblázat

Semlegesítési végpont (gg/ml) MT-4 sejtek in vitro pusztításában

HIV-l-izolátum	Rekombináns I	leterohibrid
IIIB	447	447
MN	0,78	1,29*
AL-1	0,19	0,37
SF-2	0, 04	0,04
DU 6587-5	0,09	0, 62
DU 7887-7	0,37	0,78
WMJ-2	0,78	1,35
RF	nd	0, 62
SF-162	nd	1, 98 +

* = Geometriai átlagtiter

A makrofág/monocita primer tenyészeteket (2x10$ sejt/mikrotiter mérőhely) az 5., 8., 12., 14. és 21. napon friss táptalajjal tápláljuk. A kondicionált táptalajt

ELISA-val megvizsgáljuk a p24 vírus mag-antigén jelenléte szempontjából (Coulter Immunology, Hialiah, FL) , majd a 24. napon az egyes mérőhelyekben levő sejteket lizáltatjuk és ugyanennek a vizsgálatnak vetjük alá. A végpontot úgy határozzuk meg, mint az ellenanyagnak az utolsó hígítása, amely megelőzi a p24 megjelenését a sej ttenyészetben.

nd = nincs kísérlet

10. Példa

Egy expressziós rendszert készítünk és alkalmazunk azzal a céllal, hogy nagy mennyiségben állítsuk elő a rekombináns 447-es ellenanyagot. Az expressziós rendszer a Cytomegalovírus közvetlen korai (CMVIE) transzkripciós promoterét valamint a glutamin-szintetáz (GS) szelekciós és amplifikációs kazettát használja, és számos különböző emlős sejtvonalban használható [ Bebington és mtsai.: Biotechnology, 10, 169-175 (1992)] . Az alapvektorokat, a pEE12-t és a pEE6-ot a Celltec Ltd-től vettük, és arra használtuk, hogy egyetlen plazmidot készítsünk belőlük, jele p63.79r447-jelű, amely mind a nehéz mind a könnyű lánc immunglobulin peptideket átírja, a GS géntermék mellett. A módszer, amellyel ezt az r447 expresszió vektort készítettük, létező alapvektorokat használ, amelyek más immunglobulin szekvenciákat tartalmaznak.

A pHIV/447Hji/Cyl plazmidból (amely az r447 ellenanyag V-régióját tartalmazza, 5. ábra) 50 pg-ot emésztünk a HibdIII és Xhol restrikciós enzimekkel. A közelítőleg 800 bázispár méretű nehéz lánc 447-V-régió-fragmenst gélelektroforézissel tisztítjuk, 0,85 %-os agarózban (TAE-ben készítve; 40 mmol/1 TRIS-bázis, 1 mmol/1 EDTA pH=8,0, ecetsavval pH=7,5-re állítva), majd a kivágott DNS-fragmenst egy 1,9 cm átmérőjű dialízis csőbe (BRL) tesszük, minimális mennyiségű TAE-pufferrel együtt, majd a DNS-t elektroeluáljuk, 30 percig 150 volttal végzett elektroforézissel. A kapott DNS-oldatot eltávolítjuk a dialízis csőből, majd kétszer extraháljuk fenol/kloroform eleggyel, majd a DNS-t etanolos kicsapással betöményítjük és TE pufferben oldjuk (10 mmol/l TRIS-HC1, 1 mmol/l EDTA pH=8,0).

Hasonlóképpen, a pEE12/58.2L16Vh/Cy1 plazmidból, amely a CMVIE promotert, a GS gén transzkripciós egységét és az ampicillin rezisztencia markert tartalmazza,

HindlII és EcoRI restrikciós endonukleázokkal emésztjük. A 7087 bázispár méretű pBR322 alapú vektor DNS-fragmenst az előzőkben leírt módon tisztítjuk. Ebből a DNSfragmensből körülbelül 2 gg-ot a pHIV/447VH/Cyl plazmidból származó, 800 bp méretű DNS-fragmensnek körülbelül 0,9 μg-jával elegyítjük, majd egytized térfogatnyi lOx ligáló puffért (660 mmol/l TRIS-HC1, 50 mmol/l MgC12, 10 mmol/l DTT, 10 mmol/ ATP, pH=7,5) adunk hozzá, majd körülbelül 25 egység T4 DNS-ligázt (Boehringer Mannheim). Az elegyet (a végső DNS-koncentráció 28,9 ng/ml) szobahőmérsékleten 1 óra hosszat inkubáljuk, hogy a DNS-fragmensek ligálódjanak, majd a ligáz hővel való inaktiválását követően (65°C 5 percig) a reakciót fenol/kloroform eleggyel extraháljuk, és a DNS-t etanolos kicsapással töményítjük. A DNS-t desztillált vízben oldjuk, majd EcoRI és Xhol restrikciós endonukleázokat adunk hozzá, miután az oldat összetételét a gyártó által javasolt pufferkoncentrációra állítottuk be. 1 óra hosszat 37°C-on való inkubálás után az emésztett DNS-t elektroforetizáljuk egy 0,8%-os agaróz gélen, az előzőkben leírt módon. A keresett 7887 bázispár méretű ligáit DNS-fragmenset kivágjuk a gélből, majd a DNS-t elektroeluáljuk és etanolos kicsapással töményítjük, az előzőkben leírt módon. Az eljárást, amelyet LDP ciklus néven írunk le (8. ábra), amelyben a DNS89

fragmenseket ligáljuk, restrikciós enzimmel emésztjük, majd tisztítjuk, használjuk arra, hogy megrövidítsük azt az időt, amely normális esetben szükséges komplex plazmid vektorok előállításához.

Mind a pHIV/447Vl/CX mind a pEE12/58.2L16Vj]/Cyl plazmidokból, amelyek közül az egyik az 1200 bázispár méretű 447 lambda könnyű láncot, a másik a humán immunglobulin gamma 1 konstans régiót és a CMVIE promotert tartalmazza a 4158 bázispár méretű DNS-fragmensen belül, 5050 pg-ot emésztünk Hindin és EcoRI restrikciós enzimekkel, illetve Xhol és HindlII restrikciós enzimekkel. Ezt a két DNS-fragmenset 0,8%-os agaróz gélen végzett gélelektroforézis után az előzőkben leírt módon elektroelúzióval tisztítjuk. Egy három-fragmenses DNSligálást hajtunk végre az említett két DNS-fragmenssel (18,8 mn Hindi II-EcoRI) és a 7887 bázispár méretű, az előzőkben leírt módon előállított DNS-fragmenssel (500 ng) . A reakcióelegyet, amelyben a DNS-végkoncentráció 11,85 pg/ml, és 5 egység T4 DNS-ligázt tartalmaz lx ligáló pufferben (az előzőkben ismertettük az összetételét), szobahőmérsékleten inkubáljuk 1 óra hosszat, majd felhasználás előtt 1:5 arányban hígítjuk, és 1 pl-t használunk kompetens Escherichia coli HB101(BRL)-törzs transzformálására, a gyártó előírásai szerint. A transzformánsokat LB-agarlemezeken szelektáljuk, amelyek 50 pg/ml ampicillint (Sigma) tartalmaznak, majd a DNS-t extraháljuk, hogy kiértékeljük, a keresett rekombináns plazmid szekvenciák jelen vannak-e (lásd 7. ábra). A p63.79r447-jelű jelű expressziós plazmid kódolja a 447 gamma 1 nehéz láncot, a 447 lambda könnyű láncot, a GS szelekciós kazettát és prokarióta ampicillin szelekciós markert, valamint a szomszédos replikációs origót.

A pEE12/58.2L16Vpj/Cyl vektort (lásd fent) a pEE12 vektorból készítjük, amelyet Bebington és munkatársai írtak le Bebington és mtsai.: Biotechnology, 10, 169-175 (1992)] . A pEE12 vektort és egy intermedier vektort (pSP72; Promega Inc.), amely egy humanizált 58.2 ellenanyag nehéz lánc V-régiót egy humán gamma 1 konstans régióhoz Xbal hasítási helyen keresztül fúzionáltatva tartalmaz, HindlII és EcoRI restrikciós enzimekkel való emésztése után Escherichia coli-ba transzformáljuk. A pEE12/58.2L16Vjj/Cyl vektort tartalmazó kiónokat azonosítjuk. Ezt a plazmid DNS-t ezt követően Xhol és EcoRI restrikciós enzimekkel hasítjuk, elválasztva a nehéz lánc Cy lt-régiót a nehéz lánc V-régiótól, a még hozzá kapcsolódó többi plazmid résszel együtt. A humán Cyl-et kódoló dómén egy rövidített verzióját PCR amplifikálással állítjuk elő a G1 és G2 oligonukleotidok és a coslg9-kozmid klón DNStemplátként való alkalmazásával [ Flanagen and Rabbits, Natúré, 300, 709-713 (1982)] . A megfelelő indító molekula párból )G1 és G2, 1. ábra) 50-50 gg-ot kombinálunk 10 ng kozmid DNS-sel, amely a humán gamma-1 konstans régió exonjait tartalmazza, majd 2,5 egység Taq DNS-polimerázt adunk hozzá és 24 pCR ciklust alkalmazunk (egy ciklus: 1 perc 94°C, 1 perc 55°C, 2 perc 72°C) . A PCR terméket Xhol és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztjük, agarózgélelektrof orézissel tisztítjuk, majd a pEE12/58.2L16Vj| plazmidba klónozzuk, amely a vektor egy részét tartalmaz• · • ·· « * • · · · · ♦·· ·· · · za. Az olyan vektort hordozó egyes kiónokat, amelyek mind a 447 nehéz lánc előzőkben leírt módon készített va riábilis régióját mind a humán gamma 1 konstans régió rovidített verzióját tartalmazzák, azonosítjuk és izoláljuk.

A végső, p63.79r447-jelű plazmidot, amely a

447-es humán monoklonális ellenanyagnak mind a nehéz láncát mind a könnyű láncát kódoló régiót tartalmaz, az

Escherichia coli gazdaszervezetében letétbe helyezzük ennek a bejelentésnek a benyújtási időpontja előtt az

American Type Culture

Collection-nél (12301 Parklawn

Drive, Rockville, MD) , a hozzáférés korlátozása nélkül, és a Budapesti Egyezmény előírásai szerint. A p63.79r447jelű plazmidot tartalmazó Escherichia coli gazdaszervezet az ATCC 68944 ATCC letéti számot kapta.

ll. Példa

Az NS/0 sejtek transzfekciója

Az NS/0 sejteket exponenciális növekedési fázisban tartjuk az alábbi táptalajban: Iscove-féle Minimális eszszenciális táptalaj, 10% hővel inaktivált borjúmagzat szérummal és 4 mmol/1 glutaminnal kiegészítve; 37°C-on inkubátorban.

A transzfekcióhoz használt plazmidot egy egyedi hasítási hellyel rendelkező restrikciós enzimmel emésztve linearizáljuk;

az előnyös egyedi restrikciós hasítási hely az idegen géneket kódoló szekvenciákon kívül található, a vektor baktérium szekvenciákat tartalmazó részé92

ben. A restrikciós enzimmel való emésztés után a DNS-t fehérjementesítjük fenolos extrakcióval, fenol/kloroform 1:1 arányú eleggyel való extrakcióval, majd egy végső kloroformos extrakcióval; azután steril körülmények között kicsapjuk egy biológiai biztonsági kabinetben, 0,20,4 mol/1 nátrium-klorid és 70% etanol végkoncentrációt használva. A DNS-t steril desztillált vízben oldjuk, számított 1 pg/ml koncentrációban. A DNS-t vagy azonnal használjuk, vagy felhasználásig -20°C-ra lefagyasztva használjuk.

A transzfekció napján az NS/O törzstenyészetből meghatározzuk az élő sejtek számát. Egy transzfekciós küvettában összesen lxlO⁷ életképes sejtet használunk. A sejteket először centrifugálással összegyűjtjük (5 perc, 3000/perc, szobahőmérséklet), majd a kiülepedett sejteket kétszer mossuk steril foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS) , majd PBS-ben szuszpendáljuk 10^ sejt/800 μΐ koncentrációban. A sejtszuszpenziót ettől kezdve jégen tartjuk. 107 sejtet óvatosan átviszünk egy 0,4 cm-es (az elektródák közötti távolság) BioRad küvettába, steril körülmények között, egy biológiai biztonsági kabinetben. 40 pg oldatban levő, linearizált plazmid DNS-t keverünk öszsze óvatosan a sejtekkel, majd a küvettát 5 percig jégen tartjuk. Az elektroporáció előtt a küvetta külsejét szárazra töröljük, majd egy BioRad Gene Pulser küvettatartójába tesszük. A gén pulzátort úgy állítjuk be, hogy 3 pF-ot adjon le impulzusonként 1500 volt mellett. Két egymás után következő impulzust használunk. A küvettát azután 2-5 percre jégre tesszük, majd a sejteket • ·

V ·

30 ml módosított növesztő táptalajba tesszük, amely 4 mmol/1 glutamin helyett 1 mmol/1 glutamint tartalmaz, egy ml-es egyszer használatos steril csőben. A 30 ml sejtszuszpenzióból 10 ml-t egy 96-mérőhelyű mikrotiter lemezre osztunk szét, mérőhelyenként körülbelül 100 μΐ-t;

ml sejtszuszpenziót (a megmaradt 20 ml-ből) 10 ml módosított növesztő táptalajjal hígítjuk,majd két 96 mérőhelyű mikrotiter lemezre osztjuk szét, mérőhelyenként körülbelül 100 μΐ-t; a végső 10 ml sejtszuszpenziót 30 ml módosított növesztő táptalajjal hígítjuk, majd négy 96mérőhelyű mikrotiter lemezre osztjuk szét, mérőhelyenként körülbelül 100 μΐ-t. Ezeket a lemezeket éjszakán át egy nedvesített levegőjű inkubátorban inkubáljuk, 5-6,5% CO2 tartalom mellett.

Szelektív táptalaj

A szelektív táptalaj összetétele az alábbi:

Iscove-féle Minimum Esszenciális Táptalaj (glutaminmentes, Sigma)

10% dializált borjúmagzat szérum (a Hyclone-tól) lx nukleozidok* * lx aszparagin** *50x ribonukleozid törzsoldat:

mg adenozin mg guanozin mg citidin mg timidin (mindegyik a Sigma-tól, sejttenyészet minőség), 100 ml-re feltöltve steril desztillált vízzel.

Szűréssel « · sterilezzük, 0,1 μ-os szűrőegységen, majd lefagyasztva tároljuk (-20°C-on) 10 ml-es alikvot részekben.

**100x Aszparagin: 600 mg per 100 ml steril desztillált víz, szűréssel sterilezve egy 0,1 μ-os szűrőegységen, majd 4°C-on tárolva.

Szelekció órával a transzfekció után mindegyik 96-mérőhelyű mikrotiter lemezt 100 μΐ szelekciós táptalajjal tápláljuk, majd egy nedvesített levegőjű inkubátorban inkubáljuk, amelyet 37°C-ra állítottunk (5-6,5% CO₂ tartalom) , ameddig nem jelennek meg a telepek (ehhez körülbelül 3-3,5 hétre van szükség) . Nincs szükség táplálásra, hacsak a mérőhelyek nem kezdenek el kiszáradni; a lemezeket 3-4 naponként ellenőrizzük. Azokat a mérőhelyeket, amelyekben a telepek kezdenek sárgulni, úgy vizsgáljuk, hogy 50-100 μΐ felülúszót eltávolítunk belőlük, majd a sejteket újra tápláljuk szelektív táptalajjal (hogy fenntartsuk az életképes telepeket).

12. Példa

Az első vizsgálatban HIV-l-semlegesítő ellenanyag tisztított készítményét adtuk be intravénásán egy csimpánznak, 36 mg/kg dózisban. Az állatot 24 órával később 75 csimpánz fertőző dózisnak megfelelő HIV-1-IIIbvariánssal fertőzzük intravénásán. Az állatban 1:320 keringő vírus semlegesítő ellenanyag figyelhető meg a fertőzés időpontjában. Egy kezeletlen kontroll csimpánzt ezzel egy időben beoltunk a vírussal.

• ·

A 10. táblázatban láthatjuk a vizsgálat eredményeit. A kontroll állat (x39) a vírusfertőzés első jeleit a fertőzés után 3 héttel mutatta, a perifériális vér mononukleáris sejtjeiből (PMCB-k) izolált vírus alapján. Ez az állat specifikusan szerokonvertált 6 héttel a fertőzés után, és ellenanyag valamint vírus izolálás pozitív maradt a 72 hetes megfigyelési periódusban. Ezzel szemben az ellenanyaggal kezelt állat (x289) mentes maradt a vírusfertőzés jeleitől. Az állat PCMB-jéből való vírusspecifikus nukleinsav polimeráz láncreakcióval való kimutatási kísérlet negatív volt.

10. táblázat

A V3-hurok elleni monoklonális ellenanyag³ fertőzés előtti beadásának védő hatása

A. Kontroll Csimpánz (X39)

Vírus semlegesítő ellenanyag specifikus

Hét p. c¹* titer^c

HIV-l-elleni ELISA és Western

Vírus

Vírus blofd izolálás^e PCR^

0	10	-	-	-
nap)	10	-	ND9	ND
1	10	-	-	-
2	10	-	-	-
3	10	-	+	+
4	10	-	+	+
6	10	+	+	+
8	20	+	+	+
10	106	+	+	+
12	320	+	+	+
14	160	+	+	+
16	>640	+	4-	+
20	>640	+	+	+
24	>640	+	+	+
28	>640	+	+	+
32	>640	+	+	+
36	>640	+	+	+
40	>640	+	+	+
44	>640	+	+	+
48	>640	+	+	+
52	>640	+	+	+
64	>640	+	+	+
72	>640	+	+	+

B. Fertőzés előtt kezelt csimpánz (X289)

Vírus semlegesítő ellenanyag specifikus

Hét p.eb titer^c

HIV-l-elleni
ELISA és	Vírus
Western	Vírus

blot^ izolálás^e PCR^

0	<10	-	—	-
(1 nap)	320	±	ND9	ND
1	320	±	-	-
2	80	+	-	-
3	20	+	-	-
4	10	-	-	-
6	<100	-	-	-
8	<10	-	-	-
10	<10	-	-	-
12	<10	-	-	-
14	<10	-	-	-
16	<10	-	-	-
20	<10	-	-	-
24	<10	-	-	-
28	<10	-	-	-
32	<10	-	-	-
36	<10	-	-	-
40	<10	-	-	-
44	<10	-	-	-
48	<10	-	-	-
52	<10	-	-	-
64	<10	-	-	-
72	<10	—	—	-
Lábjegyzetek	a 10. táblázathoz
a A Cfil	ellenanyag	készítményt	protein-A	affinitás-

kromatográfiával tisztítottuk.

Az állatokat egy nappal azután fertőzzük meg, hogy az ellenanyagot beadtuk az x289 csimpánznak. A fertőző vírus Larry Arthur és Peter

Fischinger ajándéka volt (National Cancer Institute), mennyiségileg a fertőzés időpontjában Emini és munkatársai módszerével határoztuk meg [Emini és mtsai.: J.

Virol., 64, 3647-3678 (1990)] . A csimpánzokat olyan körülmények között tartottuk, amelyek megfelelnek, illetve jobbak a United States National Institute of Health laboratóriumi állatok tartásáról kiadott irányelveknek.

h p.c.: fertőzés után ^c A virus-semlegesítő ellenanyag titert sejttenyészetben mérjük, a HIV-l-IIIb variánsát használva, Robertson és munkatársai leírása szerint A vizsgálatban használt vírus mennyisége megegyezik a csimpánz megfertőzésére használt mennyiséggel. Az értékek annak a legmagasabb szérumhígításnak az inverzét mutatják, amelyeknél a leírás szerint hatékony vírus semlegesítés jön létre.

d A HIV-l-elleni ELISA és Western-blot reaktív ellenanyagokat Emini és munkatársai módszerével mérjük [ Emini és mtsai.: J. Virol., 64, 3647-3678 (1990)] .

(+) Pozitív ELISA reakció és többszörösen reaktív Western biot sávok.

(±) Csak gpl20-reaktív Western biot csík, negatív ELISA.

(-) Negatív ELISA, és nincsenek Western biot reaktív csíkok .

^e A vírusok izolálását csimpánz PBMC-k in vitro tenyésztésével végezzük, négy módszer alkalmazásával.

(1) A csimpánz PBMC-ket együtt tenyésztjük azonos számú, mitogénnel aktivált humán PBMC-vel, IL-2-t és DEAEdextránt tartalmazó közegben.

(2) A csimpánz PBMC-ket fitohemagglutininnel (PHA) aktiváljuk,majd az 1. módszer szerint együtt tenyésztjük.

(3) A csimpánz PBMC-ket PHA-val serkentjük, majd önmagában tenyésztjük IL-2-t tartalmazó közegben.

(4) A csimpánz PBMC-ket együtt tenyésztjük azonos számú aktivált PBMC-vel, PHA-val és IL-2-vel kiegészített ·» » ><· · · • · ·· ► · « · ··· · ·« · F • · · · · · ·· ·«· ·· ·* táptalajon. Mindegyik, esetben a tenyészetek 1χ1(Ρ csimpánz sejtet tartalmaznak 10 ml térfogatban. A tenyészeteket 37°C-on 4 hétig inkubáljuk 5% CC>2~t tartalmazó atmoszférában. A tenyészet felülúszóknak hetenként megvizsgáljuk a HIV-l-p24 termelését. A vírus növekedést bármelyik módszerrel pozitív vírus izolálásnak tekintjük.

A csimpánz PBMC-kben a HIV-l-specifikus nukleinsav jelenlétét polimeráz láncreakcióval (PCR) vizsgáljuk. A DNS-t a PBMC-kből úgy izoláljuk, hogy a sejtmintákat 10 mmol/1 TRIS-HC1 (pH=8,3), 1 mmol/1 EDTA (pH=8,0), 0,5%

SDS, 150 pg/ml proteináz-K összetételű oldatban inkubáljuk 60 percig. Fenol/kloroform eleggyel végzett extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk. A PCR-hez 1-3 pg DNS-t használunk. Mindegyik reakcióelegy a DNS-mellett 1,5 mmol/1 MgCl₂-t, 10 mmol/1 TRIS-HCl-t (pH=8,3), 50 mmol/1 KCl-t, 0,032 mmolt az egyes dNTP-kből, 50 ng-ot az egyes indító molekulákból, valamint 1,0 egység Taqpolimerázt. A SK38/39 HIV-l-gag-specifikus indító molekula párt használjuk. 35 ciklust hajtunk végre, az egyes ciklusok: 1,5 perc inkubálás 94°C-on, 3 perc inkubálás 56° C-on. A reakciót követően az amplifikált terméket SK19 próbával végzett hibridizálással mutatjuk ki. A PCR vizsgálat érzékenységét 10 HIV-specifikus kópia per DNS-minta értéknek határoztuk meg.

ND: nincs kísérlet.

13. Példa

A védelemnek ezt a kezdeti megfigyelését követően egy második vizsgálatot végeztünk egy HIV-l-et semlege···

- 100 sitő ellenanyag védő hatásának felmérésére, esetben, amikor vírusfertőzés után adjuk be.

abban az

Két csimpánzt (x299 és xl96) oltottunk be intravénásán 75 csimpánz fertőző dózis HIV-l-IIIb-vel. Tíz perccel a beoltás után az x299 állatnak az ellenanyagból intravénásán 36 mg/kg dózist adtunk be. A teljes térfogatot (körülbelül 200 ml) 30 perc alatt adtuk be. Az adagolás végén a keringésben levő semlegesítő ellenanyag titer 1:640 volt. Az xl96 csimpánzt nem kezeltük.

A vizsgálat eredményeit a 11. táblázatban mutatjuk be. A kontroll csimpánzból (xl96) először a fertőzés után héttel lehetett a PBMC-kből vírust izolálni. A kontroll állat a 8. héten szerokonvertált, és mind a vírus izolálásra mind az ellenanyagra pozitív maradt a 48 hetes megfigyelési periódusban. Az ellenanyaggal kezelt csimpánz (x299) a mai napig nem mutatta jelét annak, hogy vírusfertőzés maradt fenn benne. Az állat PBMC-iből sem le hetett PCR-rel vírusspecifikus nukleinsavat kimutatni.

Ezek a megfigyelések szolgáltatják az első közvetlen bizonyítékot, hogy a V3-hurok-elleni HIV-l-semlegesitő ellenanyag, egyéb vírusspecifikus immunválasz nélkül képes megakadályozni egy hosszan tartó HIV-l-fertőzés kialakulását .

···

- 101 -

11. táblázat

A V3-hurok-elleni monoklonális ellenanyag³ fertőzés utáni beadásának védő hatása

A. Kontroll Csimpánz (X196)

Vírus semlegesítő ellenanyag specifikus Hét p.c titer

HIV-l-elleni

ELISA és

Western

Vírus

Vírus biot izolálás PCR

0	<10	-	-	-
nap)	<10	-	ND	-
1	<10	-	-	-
2	<10	-	-	-
3	<10	-	-	-
4	<10	-	-	-
6	<10	-	±	+
8	<10	+	+	+
10	<10	+	+	+
12	10	±	+	+
14	20	+	+	+
16	80	+	+	+
18	80	+	+	±
20	160	+	+	+
24	320	+	±	+
28	±640	+	+	+
32	±640	±	±	+
36	±640	±	+	+
40	±640	+	+	+
44	±640	+	+	+
48	±640	+	+	+

·**· «

- 102 B. Fertőzés után ellenanyaggal kezelt csimpánz (X299)

Hét p.c	Vírus semlegesítő ellenanyag titer	HIV-l-elleni ELISA és	Vírus specifikus PCR
Western biot	Vírus izolálás
0	640b	±b	-	-
(1 nap)	320	±	ND	ND
1	320	+	-	-
2	160	±	-	-
3	80	±	-	-
4	20	-	-	-
6	10	-	-	-
8	<10	-	-	-
10	10	-	-	-
12	<10	-	-	-
14	<10	-	-	-
16	<10	-	-	-
18	<10	-	-	-
20	<10	-	-	-
24	<10	-	-	-
28	<10	-	-	-
32	<10	-	-	-
36	<10	-	-	-
40	<10	-	-	-
44	<10	-	-	-
48	<10	-	-	-

Lábjegyzetek a 11. táblázathoz ^a Lásd az 1. táblázat lábjegyzeteit a technikai részleteket illetően.

^b Az ellenanyag titereket közvetlenül a Cfil beadás után vett szérumból határozzuk meg (lásd szöveg). A vírussemlegesítő ellenanyag titer a CBl beadás előtt <10.

14. Példa

HIV-izolálás

A vírusok izolálását csimpánz PBMC-k in vitro te nyésztésével végezzük, négy módszer alkalmazásával.

103 ·· · ·««· · ........

• · ·· ·« ... « .... ··· · · « ......

..· .:. : ···· ......· ·· (1) A csimpánz PBMC-ket együtt tenyésztjük azonos számú, mitogénnel aktivált humán PBMC-vel, IL-2-t és DEAEdextránt tartalmazó közegben.

(2) A csimpánz PBMC-ket fitohemagglutininnel (PHA) aktiváljuk,majd az 1. módszer szerint együtt tenyésztjük.

(3) A csimpánz PBMC-ket PHA-val serkentjük, majd önmagában tenyésztjük IL-2-t tartalmazó közegben.

(4) A csimpánz PBMC-ket együtt tenyésztjük azonos számú aktivált PBMC-vel, PHA-val és IL-2-vel kiegészített táptalajon. Mindegyik esetben a tenyészetek lxlC)7 csimpánz sejtet tartalmaznak 10 ml térfogatban. A tenyészeteket 37°C-on 4 hétig inkubáljuk 5% CC>2^_t tartalmazó atmoszférában. A tenyészet felülúszóknak hetenként megvizsgáljuk a HIV-l-p24 termelését. A vírus növekedést bármelyik módszerrel pozitív vírus izolálásnak tekintjük.

15, Példa

A HIV-nukleinsav kimutatása PCR-rel

A csimpánz PBMC-kben a HIV-l-specifikus nukleinsav jelenlétét polimeráz láncreakcióval (PCR) vizsgáljuk. A DNS-t a PBMC-kből úgy izoláljuk, hogy a sejtmintákat 10 mmol/1 TRIS-HC1 (pH=8,3), 1 mmol/1 EDTA (pH=8,0), 0,5%

SDS, 150 pg/ml proteináz K összetételű oldatban inkubáljuk 60 percig. Fenol/kloroform eleggyel végzett extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk. A PCR-hez 1-3 pg DNS-t használunk. Mindegyik reakcióelegy a DNS-mellett 1,5 mmol/1 MgCl₂-t, 10 mmol/1 TRIS-HCl-t (pH=8,3), 50 mmol/1 KCl-t, 0,032 mmolt az egyes dNTP-kből, 50 ng-ot az egyes indító molekulákból, valamint 1,0 egység Taq

104 ·«· « ·· ·«·· · * · ····

polimerázt. A SK38/39 HIV-l-gag specifikus indító molekula párt használjuk. 35 ciklust hajtunk végre, az egyes ciklusok: 1,5 perc inkubálás 94°C-on, 3 perc inkubálás 56° C-on. A reakciót követően az amplifikált terméket SK19 próbával végzett hibridizálással mutatjuk ki. A PCR vizsgálat érzékenységét 10 HIV-specifikus kópia per DNS-minta értéknek határoztuk meg.

16. Példa

A HIV-l-fertőzőképesség semlegesítése in vitro humán monoklonális ellenanyaggal

A limfotróp és limfocitolitikus-izolátumok MT-4 sejtjeiben végzett semlegesítési vizsgálatokhoz az ellenanyagokból kétszeres hígítási sort készítünk, majd minden egyes mérési mérőhelyhez 100 μΙ-t használunk. Az egyes mérési mérőhelyekhez 100 μΐ törzsoldatot adunk, majd a vírus-ellenanyag keverékeket 1 óra hosszat 37°C-on inkubáljuk, azután pedig lxlO⁴ MT-4 sejtet adunk 50 μΐ tenyésztő táptalajban az egyes mérőhelyekhez. A tenyészeteket 7 napig inkubáljuk, ekkor meghatározzuk az ellenanyag semlegesítési végpontját. A semlegesítési végpontot úgy definiáljuk, mint azt az utolsó ellenanyag hígítást, amely megakadályozza az MT-4 sejtek pusztulását. A kezeletlen MT-4 sejteket az egyes vizsgálatokban tenyésztjük, majd minden egyes elemzésnél újra titráljuk a vírus törzsoldatot. Az SF-162 makrofág-monocita-izolátum vírus semlegesítési tesztjeit primer makrofág-monocitatenyészetekben végezzük. Egy SF-162 törzsoldat 1/10 hígítását az ellenanyagok kétszeres sorozathígításával kever-

105 • * jük, 1 óra hosszat 37°C-on inkubáljuk, majd az egyes keverékeket 2,0x10^ sejtet tartalmazó mikrotiter lemezhez adjuk. Egy humán pozitív szérumot, jelentős semlegesítő titerrel, futtatunk minden egyes tesztben, valamint egy nem-semlegesítő negatív humán szérumot is, és az ellenanyag vagy szérum távollétében fertőzött sejteket. Mindegyik makrofág/monocita tenyészetet friss táptalajjal táplálunk a fertőzés utáni 5, 8, 12, 14 és 21 napon. A közeget a p24 ELISA-hoz (Coulter Immunology) a 18, 21 és 24. napon gyűjtjük,, ahhoz hogy meghatározzuk a vírus termelődését. Emellett a fertőzött makrofág/monocita sejteket a 24. napon lizáltatjuk, hogy az intracelluláris vírust ELISA-val meg tudjuk határozni. A semlegesítési végpontot úgy definiáljuk, mint az ellenanyag készítménynek az utolsó hígítása, amely megakadályozza az in vitro makrofág/monocita fertőzést, amit a p24 termelődés hiánya igazol. Az eredményeket a 12. táblázatban mutatjuk be.

• · ·

- 106 -

12. táblázat

Semlegesítési végpont (gg/ml),

HIVizolátumok	SZÉK.	Geometriai átl	ag és (tart.) sej tpusztítási-
AZ. SZ .	V3-hurok szekvencia	In vitro vizsgála	MT-4 t
IIIB	27	TRKSIRIQRGP GRAFVTIGKIG	1,29	(0,39	- 1,56)
MN	28	YNKRKRIHIGP GRAFYTTKNII	0,37	(0,04	- 0,78)
AL-1	29	IYRKGRIHIGP GRAFHTTRQII	0,15	(0,09	- 0,19)
SF-2	30	NNTRKSIYIGP GRAFHTTGRII	0, 04	(0,04)
DU 6587-5	31	SNVRNRIHIGP GRAFHTTKRIT	0, 62	(0,39	- 0,78)
WMJ-2	32	NNVRRSLSIGP GRAFRTREIIG	1,35	(0,78	- 1,56)
DU 7887-7	33	NNTSRGIRIGP GRAILATERII	0,78	(0,78)
RF	34	NNTRKSITKGP GRAILATERII	0, 62	(0,39	- 0,78)

Semlegesítési végpont

Makrofág/monocita tenyészetben

SF-162

NNTRKSITIGP GRAFYATGDII

1, 98 (1,25 - 2,50)

107

Az alábbiakban ismertetjük a találmány tárgyát képező szekvenciák jellemző adatait.

AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 24 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 1:

Nle Cys Tyr Asn Lys Arg Lys	Arg Ile Gly Pro Gly
1 5	10
Arg Alá Phe Tyr Thr Thr Lys	Asn Ile Ile Gly Cys
15	20

A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 23 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 2:

Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro

10

Gly Arg Alá Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly

108

A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 8 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 3:

Pro Gly Arg Alá Phe Tyr Thr Thr

5

A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 7 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 4:

Arg Lys Arg Ile His Ile Gly

5

Az 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

109

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 5:

His Ile Gly Pro Gly Arg

5

A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 6:

Tyr Asn Lys Arg Lys Arg

5

A 7. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 7:

Asn Lys Arg Lys Arg Ile

5

A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav • ·

- 110 - ...... .

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: JLineáris _ ________

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 8:

Lys Arg Lys Arg Ile His

5

A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 9:

Arg Lys Arg Ile His Ile

5

A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltipus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 10:

Lys Arg Ile His Ile Gly • · ·

- 111 A 11. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 11:

Arg Ile His Ile Gly Pro

5

A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 12:

Ile His Ile Gly Pro Gly

5

A 13. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 13:

His Ile Gly Pro Gly Arg

5

A 14. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 14:

Ile Gly Pro Gly Arg Ala

5

A 15. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav ·

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 15:

Gly Pro Gly Arg Ala Phe

5

A 16. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

···

- 113 Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 16:

Pro Gly Arg Alá Phe Tyr

5

A 17. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 17:

Gly Arg Alá Phe Tyr Thr

5

A . AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 18-ról:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 18:

Arg Alá Phe Tyr Thr Thr

- 114 ·*· ·

·· ·

A 19. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 19:

Alá Phe Tyr Thr Thr Lys

5

A 20. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 20:

Phe Tyr Thr Thr Lys Asn

5

A 21. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

- 115 -

* · • ···	• ·♦	*	♦ •
• ··	•		* *

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 21:

Tyr Thr Thr Lys Asn Ile

A 21. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 21:

Tyr Thr Thr Lys Asn Ile

5

A 22. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 22:

Thr Thr Lys Asn Ile Ile

5

A 23. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

116

Hossz: 6 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 23:

Thr Lys Asn Ile Ile Gly

5

A 24. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 5 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 24:

Lys Arg Ile His Ile

5

A 25. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 4 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 25:

Gly Pro Gly Arg

117

A 26. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 15 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 26:

Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg

10

Alá Phe Tyr Thr Thr

A 27. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 22 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 27:

Thr	Arg	Lys	Ser	Ile	Arg	Ile	Gin	Arg	Gly Pro Gly
1				5					10
Arg	Alá	Phe	Val	Thr	Ile	Gly	Lys	Ile	Gly
		15					20

A 28. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

118

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 22 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris - -A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 28:

Thr	Asn	Lys	Arg	Lys	Arg	Ile	His	Ile	Gly Pro Gly
1				5					10
Arg	Alá	Phe	Tyr	Thr	Thr	Lys	Asn	Ile	Ile
		15					20

A 29. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 22 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 29:

Ile Tyr Arg Lys Gly Arg Ile	His Ile Gly Pro Gly
1 5	10
Arg Alá Phe His Thr Thr Arg	Gin Ile Ile
15	20

A 30. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 22 aminosav

Típus: aminosav * ·

119 ·« ·

J» · · • * · »

Száltipus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 30:

Asn	Asn	Thr	Arg	Lys	Ser	Ile	Tyr	Ile	Gly Pro Gly
1				5					10
Arg	Alá	Phe	His	Thr	Thr	Gly	Arg	Ile	Ile
		15					20

A 31. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 22 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 31:

Ser Asn	Val	Arg	Asn	Arg	Ile	His	Ile	Gly Pro Gly
1			5					10
Arg Alá	Phe	His	Thr	Thr	Lys	Arg	Ile	Thr
	15					20

A 32. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 22 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid • 4

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 32:

Asn	Asn	Thr	Ser	Arg	Gly	Ile	Arg	Ile	Gly Pro Gly
1				5					10
Arg	Alá	Ile	Leu	Alá	Thr	Glu	Arg	Ile	Ile
		15					20

A 33. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 22 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 33:

Asn Asn	Thr	Ser	Arg	Gly	Ile	Arg	Ile	Gly Pro Gly
1			5					10
Arg Alá	Ile	Leu	Alá	Thr	Glu	Arg	Ile	Ile
	15					20

A 34. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 22 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 34:

Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Lys Gly Pro Gly

121

Arg Val Ile Tyr Ala Thr Gly Gin Ile Ile

20

A 35. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 22 aminosav

Típus: aminosav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 35:

Asn Asn	Thr	Arg	Lys	Ser	Ile Thr	Ile	Gly Pro Gly
1			5				10
Arg Ala	Phe	Tyr	Ala	Thr	Gly Asp	Ile	Ile
	15				20

A 36. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 30 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 36:

CGGAATTCAG GTGCAGCTGC AGCAGTCTGG

A 37. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 37 bázispár

122

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 37:

CCGAATTCGC GGCCGCACTC ATTTACCCGG AGACAGG

A 38. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 42 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 38:

GGCGTCGACT CACCATGGCC GGCTCCCCTC TCYTCCTCACC C

A 39. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 34 bázispár—

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 39:

CCGAATTCGC GGCCGCCTAT GAACATTCTG TAGG

A 40. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

123

	99	9	··	·
	9 9	99	• ·	« *
	999	9	99	• 9
* * · · » · ·	9	9	• ·	9 9
• · » · « « *	99	999	··	9b
*' · · «

Hossz: 39 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 40:

GATCCTCGAG GATTCTAGAA GGGTCAGATG TCGGTGTTG

A 41. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 30 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 41:

GATCGAATTC CTGGGATCCT GCAGCTCTAG

A 42. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia, jellemzői:

Hossz: 43 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 42:

TTACTCGAGA CGCGTACTAG TGAGCTTGCT ACAAGGGACT TTC

A 43. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

124

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 30 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 43:

ATTTCTAGAA AGCTTTATTG AGGCTTAAGC

A 44. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 30 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 44:

ATATCTCGAG CAGACACTGG ACGCTGAACC

A 45. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 35 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 45:

TATATGATCA GAATTCGCCC GGGAAGTATG TACAG

A 46. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 1380 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 46:

GAGGTGCAGC ACCTGTGTAG CCAGGGAAGG GACTACGCTG CTATATCTGC GATGGTTTTA TGGGGCAAAG CCCCTGGCAC AAGGACTACT GTGCACACCT ACCGTGCCCT AGCAACACCA

CCACCGTGCC CCCAAGGACA AGCCACGAAG GCCAAGACAA ACCGTCCTGC GCCCTCCCAG CAGGTGTACA TGCCTGGTCA CCGGAGAACA TACAGCAAGC GTGATGCATG

TGGTGGAGTC CCTCTGGTTT GGCTGGAGTG CATCCGTGAA AAATGAATAG TTATGATTCG GGACCACGGT CCTCCTCCAA TCCCCGAACC TCCCGGCTGT CCAGCAGCTT AGGTGGACAA

CAGCACCTGA CCCTCATGAT ACCCTGAGGT AGCCGCGGGA ACCAGGACTG CCCCCATCGA CCCTGCCCCC AAGGCTTCTA ACTACAAGAC TCACCGTGGA AGGCTCTGCA

TGGGGGAGGC CACGTTCAGT GGTCGGCCGT AGGCAGATTC CCTGAAAACA GGGAGTCTCC CACCGTGAGC GAGCACCTCT GGTGACGGTG CCTACAGTCC GGGCACCCAG GAAAGTTGAG

ACTCCTGGGG CTCCCGGACC CAAGTTCAAC GGAGCAGTAC GCTGAATGGC GAAAACCATC ATCCCGGGAT TCCCAGCGAC CACGCCTCCC CAAGAGCAGG CAACCACTAC

TTGGTAAAGC GATGTCTGGC ATTAAAAGCA ACCATCTCAA GAGGACACAG GAGGACTACT TCAGCCTCCA GGGGGCACAG TCGTGGAACT TCAGGACTCT ACCTACATCT CCCAAATCTT

GGACCGTCAG CCTGAGGTCA TGGTACGTGG AACAGCACGT AAGGAGTACA TCCAAAGCCA GAGCTGACCA ATCGCCGTGG GTGCTGGACT TGGCAGCAGG ACGCAGAAGA

CTGGGGGGTC TGAACTGGGT GAACTGATGG GAGATGACTC CCGTTTATTC ACTACTACTA CCAAGGGCCC CGGCCCTGGG CAGGCGCCCT ACTCCCTCAG GCAACGTGAA GTGACAAAAC

TCTTCCTCTT CATGCGTGGT ACGGCGTGGA ACCGTGTGGT AGTGCAAGGT AAGGGCAGCC AGAACCAGGT AGTGGGAGAG CCGACGGCTC GGAACGTCTT GCCTCTCCCT

CCTCAGACTC CCGCCAGGCT TGGGACAACA AAAAAACACG CTGCACCACA CATGGACGTT ATCGGTCTTC CTGCCTGGTC GACCAGCGGC CAGCGTGGTG TCACAAGCCC TCACACATGC

CCCCCCAAAA GGTGGACGTG GGTGCATAAT CAGCGTCCTC CTCCAACAAA CCGAGAACCA CAGCCTGACC CAATGGGCAG CTTCTTCCTC CTCATGCTCC GTCTCCGGGT

- 126 -.....

A 47. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 645 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 47:

CAGTCTGTGT TGACGCAGCC GCCCTCAGTG TCCTGCTCTG GAAGCAGCTC CAACATTGGG CCAGGAACAG CCCCCAAACT CCTCATTTAT GACCGATTCT CTGGCTCCAA GTCTGGCACG ACTGGGGACG AGGCCGATTA TTTCTGCGCA GTGTTCGGCG GAGGGACCAA GCTGACCGTC ACTCTGTTCC CGCCCTCCTC TGAGGAGCTT ATAAGTGACT TCTACCCGGG AGCCGTGACA AAGGCGGGAG TGGAGACCAC CACACCCTCC AGCTATCTGA GCCTGACGCC TGAGCAGTGG ACGCATGAAG GGAGCACCGT GGAGAAGACA

TCTGCGGCCC CAGGACAGAA GGTCACCATC AATAATTATG TATTGTGGTA CCAGCAGTTC GGCAATAATA AGCGACCCTC AGGGATTCCT TCAGCCACCC TGGGCATCAC CGGACTCCAG ACATGGGATA GCGGCCTGAG TGCTGATTGG CTAAGTCAGC CCAAGGCTGC CCCCTCGGTC CAAGCCAACA AGGCCACACT GGTGTGTCTC GTGGCCTGGA AGGCAGATAG CAGCCCCGTC AAACAAAGCA ACAACAAGTA CGCGGCCAGC AAGTCCCACA GAAGCTACAG CTGCCAGGTC GTGGCCCCTA CAGAATGTTC ATAG

127

A 48. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 54 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 48: CATTCGCTTA CCCTGCAGAA GCTTGTTGAC TAGTGAGATC ACAGTTCTCT CTAC

A 49. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 19 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 49:

GGAGTGGACA CCTGTGGAG

Az 50. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 19 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS * «

- 128

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 50:

GGTGAGTCCT TACAACCTC

Az 51. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 44 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 51: GAATGTGCCT ACTTTCTAGA CTCGAGTATA AATCTCTGGC CATG

Az 52. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 39 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 52:

CTCCACAGGT GTCCACTCCG AGGTGCAGCT GGTGGAGTC

Az 53. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 39 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

129

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 53:

GAGGTTGTAA GGACTCACCT GAGCTCACGG TGACCGTGG

Az 54. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 54 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 54: CATTCGCTTA CCCTGCAGAA GCTTGTTGAC TAGTGAGATC ACAGTTCTCT CTAC

Az 55. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 19 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 55:

GGAGTGGACA CCTGTGGAG

Az 56. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 39 bázispár

Típus: nukleinsav

• R ·

130

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 56:

CTCCACAGGT GTCCACTCCC AGTC-TGTGTT GACGCAGCC

Az 57. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 79 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 57:

GAATGTGCCT ACTTTCTAGA CTCGAGAACT GAGGAAGCAA

AGTTTAAATT CTACTCACGA CTTAGGACGG TCAGCTTGG

Az 58. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

Hossz: 18 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 58:

CATTCGCTTA CCCTGCAG

Az 59. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A szekvencia jellemzői:

131 ···· ··. ··· • · a ? * ·· ·····

A : ··;·

Hossz: 19 bázispár

Típus: nukleinsav

Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: cDNS

Szekvencia leírás: SZEKVENCIA-AZONOSÍTÓSZÁM: 59:

GAATGTGCCT ACTTTCTAG

Claims (3)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Két vagy több HIV-szerotípus-izolátummal szemben semlegesítő hatású rekombináns humán HIV-elleni ellenanyag vagy fragmense. - ----- · ' '

2. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag vagy fragmense, azzal jellemezve, hogy az ellenanyag vagy fragmense az alábbi csoportból kiválasztott két vagy több HIV-1-izolátummal szemben semlegesítő hatású: IIIB, MN, AL-1, SF-2, WMJ-2, RF, DU 6587-5 és DU 7887-7.

3. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag vagy fragmense, azzal jellemezve, hogy a semlegesítő ellenanyag vagy fragmense a gpl20 egy HIV-l-semlegesítő epitópjához kötődik.

4. A 3. igénypont szerinti ellenanyag vagy fragmense, azzal jellemezve, hogy a HIV-l-gpl20-semlegesítő epitópja a gpl20 V3-hurkában található.

5. A 4. igénypont szerinti ellenanyag vagy fragmense, azzal jellemezve, hogy a HIV-gpl20-V3-hurok semlegesítő epitópja tartalmazza a GPXR aminosav szekvenciát, ahol X jelentése bármely aminosav.

6. Az 5. igénypont szerinti ellenanyag vagy fragmense, azzal jellemezve, hogy a HIV-l-gpl20-V3-hurok semlegesítő epitópja a GPGR aminosav szekvenciát tartalmazza .

7. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag vagy fragmense, azzal jellemezve, hogy a IIIB, MN, AL-1, SF-2, WMJ-2, RF, DU 6587-5 és DU 7887-7 HIV-l-izolátumokkal szemben semlegesítő hatású.

133

8. A 7. igénypont szerinti ellenanyag vagy fragmense, azzal jellemezve, hogy a semlegesítő ellenanyag vagy fragmense a HIV-l-gpl20 egy semlegesítő epitópjához kötődik.

9. A 8. igénypont szerinti ellenanyag vagy fragmense, azzal jellemezve, hogy a HIV-l-gpl20-semlegesítő epitópja a gpl20 V3-hurkában van.

10. A 9. igénypont szerinti ellenanyag vagy fragmense, azzal jellemezve, hogy a HIV-l-gpl20-V3-hurok semlegesítő epitópja a GPXR aminosav szekvencia, ahol X jelentése bármely aminosav.

fragmense,

10. igénypont szerinti ellenanyag vagy azzal jellemezve, hogy a HIV-l-gpl20semlegesítő epitópja a GPGR aminosav szekvencia.

12. A

7. igénypont szerinti ellenanyag vagy fragmense, azzal jellemezve, hogy az ellenanyag nehéz lánca az IgG osztályba tartozik.

13. A 12. igénypont szerinti ellenanyag vagy fragmense, azzal jellemezve, hogy az ellenanyag nehéz lánca az IgG3 alosztályba tartozik.

14. A 13. igénypont szerinti ellenanyag vagy fragmense, azzal jellemezve, hogy az ellenanyag nehéz lánc IgG-alosztály-régiója genetikailag IgG^-alosztályrégióra van módosítva.

15. Expressziós egység, azzal jellemezve, hogy promoter szekvenciát, legalább egy ORF-et - mely ORF-ek olyan HIV-semlegesítő ellenanyag könnyű láncának vagy nehéz láncának variábilis doménjét vagy annak egy részét kódolják, amely ellenanyag két vagy több HIV-szero- típussal szemben semlegesítő hatású - és megfelelő transzkripciós terminációs szekvenciát tartalmaz.

16. A 15. igénypont szerinti expressziós egység, azzal jellemezve, hogy az ORF egy HV-l-et semlegesítő ellenanyag könnyű vagy nehéz láncát kódolja, amely ellenanyag két vagy több HIV-l-szerotípussal szemben semlegesítő hatású.

17. A 16. igénypont szerinti expressziós egység, az- zal jellemezve, hogy az ORF a 447-52D-jelű ellenanyag könnyű láncának vagy nehéz láncának variábilis dóménjét kódolja.

18. A 15. igénypont szerinti expressziós egység, azzal jellemezve, hogy egy ORF egy HIV-semlegesítő ellenanyag könnyű láncát, egy másik ORF pedig az ellenanyag nehéz láncát kódolja. _____

19. A 18. igénypont szerinti expressziós egység, azzal jellemezve, hogy egy ORF és egy másik ORF egy, ket tő vagy több HIV-l-izolátummal szemben semlegesítő hatású ellenanyag könnyű és nehéz láncát kódolja.

20. A 19. igénypont szerinti expressziós egység, azzal jellemezve, hogy az egyik ORF IgG nehéz láncot kódol .

21. A 20. igénypont szerinti expressziós egység, azzal jellemezve, hogy az egyik ORF IgGl nehéz láncot kódol .

22. A 19. igénypont szerinti expressziós egység, azzal jellemezve, hogy az ORF-ek a 447-52D-jelű ellenanyag könnyű és nehéz láncát kódolják.

135 • · * « a · · · ·« · · · · · • «· ··

23. A 20. igénypont szerinti expressziós egység, azzal jellemezve, hogy az IgG nehéz lánc alosztály régió IgG^ alosztály régióra van módosítva.

24. Legalább egy expressziós egységet tartalmazó gazdasejt, azzal jellemezve, hogy az expresziós egység (ek) promoter szekvenciát, HIV-semlegesítő ellenanyag könnyű láncának vagy nehéz láncának variábilis dóménjét vagy annak egy részét kódoló ORF-et és megfelelő transzkripciós terminációs szekvenciát tartalmaz(nak).

25. A 24 . igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy két expressziós egységet tartalmaz.

26. A 24. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy American Type Culture Collection letéti száma 68945.

27. A 24. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy American Type Culture Collection letéti száma 68943.

28. A 24. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy American Type Culture Collection letéti száma 68944.

29. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy HIV-elleni hatóanyagot, mely hatóanyagok egyike olyan rekombináns humán HIV-elleni ellenanyag vagy fragmense, amely két vagy több HIV-szerotípus-izolátummal szemben semlegesítő hatású, valamint gyógyszergyártásban alkalmazott hordozó és/vagy segédanyagokat tartalmaz.

30. A 29. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a rekombináns humán HIVelleni ellenanyag az alábbi csoportból származó két vagy » «

136 ·’* «

*··::

• ···· • · több HIV-1-izolátummal szemben semlegesítő hatású: IIIB, MN, AL-1, SF-2, WMJ-2, RF, DU 6587-5 és DU 7887-7.

31. A 29. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a rekombináns humán HIVelleni ellenanyag vagy fragmense a IIIB, MN, AL-1, SF-2, WMJ-2, RF, DU 6587-5 és DU 7887-7 HIV-1-szerotípusizolátumokkal szemben semlegesítő hatású.

32. A 29. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy egy első és egy második HIVelleni hatóanyagot tartalmaz, amely első hatóanyag olyan rekombináns HIV-elleni ellenanyag, amely két vagy több HIV-izolátummal szemben semlegesítő hatású, és amely második hatóanyag egy nem ellenanyag-típusú HIV-inhibitor.

33. A 32. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a nem ellenanyag-típusú HIVinhibitor az alábbi HIV-inhibitorok valamelyike: reverztranszkriptáz-inhibitorok, proteinázinhibitorok, transzkripció-transzaktiváció-inhibitorok, antiszensz oligonukleotidok és vírustapadás-inhibitorok.

37. A 36. igénypont szerinti gyógyászati készítmények, azzal jellemezve, hogy a nem ellenanyag-típusú HIVinhibitor egy reverz-transzkriptáz-inhibitor.

38. A 37. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a reverz-transzkriptáz-inhibitor az alábbi inhibitorok valamelyike:

3-{ [ (4,7-diklórbenzoxazol-2-il)metil] -amino} -5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon,

3—{[ (4, 7-dimetilbenzoxazol-2-il)metil] -amino}-5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon, ·· • · ··· ·· · ·« ·· ··

137

3-{ [ (7-klórbenzoxazol-2-il)metil] amino} -5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon,

3-{ [ (7-metilbenzoxazol-2-il) metil] amino} -5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon,

3-{ [ (4-fluorobenzoxazol-2-il)metil] amino} -5-etil-6-metil-2- (1H)-piridinon,

3-{ [ (7-fluorobenzoxazol-2-il)metil] amino} -5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon,

3-{ [ (benzoxazol-2-il)metil] amino} -5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon,

3—{[ (4-klórbenzoxazol-2-il)metil] amino} -5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon,

3-{ [ (4-fluor-7-klórbenzoxazol-2-il)metil] -amino} -5-etil-6-metil-2-(1H)-piridinon, és

3-[ 2-(benzoxazol-2-il) etil] -5-etil-6-metil-2-(1H)piridinon.