CZ239694A3

CZ239694A3 - Recombinant human antibody against hiv, cassette for expression, host cell and a pharmaceutical preparation against hiv

Info

Publication number: CZ239694A3
Application number: CZ942396A
Authority: CZ
Inventors: Emilio A Emini; Anthony J Conley; George E Mark; L Syd Johnson; David S Pfarr
Original assignee: Merck & Co Inc; Medimmune
Priority date: 1992-04-01
Filing date: 1993-03-23
Publication date: 1995-07-12
Also published as: MX9301858A; WO1993019785A1; NO943653L; HUT70461A; NO943653D0; HU9402824D0; FI944561A0; FI944561A; CA2093099A1; RU94045907A; CN1081716A; BG99074A; EP0577243A3; JPH06217791A; YU22693A; AU3928593A; NZ251582A; IL105145A0; ZA932308B; KR950700761A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká rekombinantní lidské neutralizační protilátky proti viru HIV-1, způsobu výroby příslušných imunoglobulinu pro prevenci infekce HIV-1 a také kazety pro expresi, hostitelské buňky, v níž k expresi dochází a farmaceutického prostředku pro prevenci a léčení infekce virem HIV-1 in vivo.

Dosavadní stav techniky

Bylo prokázáno, že oblast gpl2O V3 je uzavřená smyčka přibližné 30 zbytků aminokyselin, vázaných didulfidovou vazbou, jak bylo popsáno v Leonard a další, 1990, J. Biol. Chem., 265, str. 10373 - 82. Tato smyčka ve styku s neporušenou oblastí gpl20 nebo jako syntetický peptidový fragment se váže na neutralizační protilátky, specifické pro virus typu- HIV-1, jak bylo popsáno v publikacích Goudsmit a další, 1988, AIDS,

2, str. 157 - 164, Goudsmit a další, 1988, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 85,’str. 4478 - 4482, Ho a další, 1987, J. Virol. 61, str. 2024 - 2028, Javaherian a další, 1989, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 86, str. 6768 - 6772, Kenealy a další, 1989, AIDS Res., 5, str. 173 - 182, Rusche a další, 1988, Proč.

Nati. Acad. Sci., USA, 85, str. 3198 - 3202. Oblast V3 se tedy nazývá základní neutralizační determinantou. Vlastnosti protilátky proti V3 in vitro zahrnují poměrně vysokou neutralizační účinnost proti viru, schopnost neutralizovat následující vazbu viru na receptor CD4 hostitelské buňky a schopnost zabránit fusi buňky, infikované virem s neinfikovanými buňkami, jak bylo popsáno v Linsley a další, 1988,

A

J. Virol., 62, str. 3695 - 3702, Skinner a další, 1988,

J. Virol., 62, str. 4195 - 4200. Berman a další imunizovali šimpanze oblastí gp20, po expresi této oblasti rekombinantími buňkami savce nebo prekursorem této oblasti, oblastí gpl60 podle publikace Berman a další, 1990, Nátuře, 345, str. 622 - 625. V případě, že se takto imunizovaní šimpanzi dostali do styku s virem, bylo možno pozorovat dostatečnou ochranu pouze u těch opic, které byly očkovány. gpl20. Jedinou sledovatelnou imunologickou odpovědí, která byla v korelaci s dosaženou ochranou, byla protilátka proti V3. Girard a další očkovali několik šimpanzů řadou imunogenních látek, jednou z nich byly syntetické imunogeny, specifické pro smyčku V3, jak bylo popsáno v Girard a další, 1991, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, str. 542 - 546. Podstatnější účinnost ve smyslu neutralizace viru bylo možno pozorovat pouze po očkování uvedenými látkami. Po styku s virem nedošlo k infek ci vůbec nebo k -ní došlo mnohem později. Dále byla popisována neutralizace in vitro, při níž byla ochrana před infekcí nebo zpoždění infekce rovněž v korelaci s přítomností protilátek, neutralizujících virus v místě smyčky V3 podle publikace Emini a další, 1990, J. Virol., 64, str. 3647 - 3678.

V poslední době prokázali Wart a další, že chimérní molekula, složená z oblasti Fc lidského IgG a oblasti viru pro vazbu na receptor CD4 může rovněž chránit šimpanze proti infekci HIV-1 v případě, že je podána před naočkováním virem, jak bylo popsáno v publikaci Ward a další, 1991, Nátuře, 352, str. 434 - 436. Avšak na rozdíl od protilátek proti smyčce V3 jsou látky, které blokují vazbu viru na receptor CD4 slabými látkami pro neutralizaci infektivity vitu HIV-1 in vitro a jejich účinek je mimoto možno snadno snížit změnami afinity vazby gpl20-CD4, jak bylo popsáno v publikacích Layne a další, 1991, J. Virol., 65, str. 3293 - 3300,

Kang a další, 1991, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, str.

6171 - 6175, Thali a další, 1991, J. Virol., 65, str. 5507 až 5012.

Αν současné době prokázali Emini a další, že chimérní p, myší a lidská monoklonální protilátka, specifická pro jediný kmen HIV-1, Illb, může zabránit infekci virem HIV-1 Illb u šimpanzů, a to v případě, že je podána před expozicí i po expozici viru, jak bylo popsáno v Emini a další, 1992, Nátuře,

355, str. 728 - 730.

Vynález si klade za úkol připravit nové rekombinantní lidské imunoglobuliny, které by neutralizovaly HIV-1 a nové rekombinantní části FAb a Fv neutralizačního lidského imunoglobulinu proti HIV-1. Vynález si rovněž klade za úkol připravit nové řetězce DNA, které jsou kódovými řetězci pro lidský neutralizační imunoglobulin proti HIV-1 a vektory pro expresi, obsahující tyto nové kódové řetězce DNA pro uvedený imunoglobulin. Vynález se týká také přípravy hostitelských buněk, obsahujících vektory pro expresi s novými kódovými řetězci DNA pro imunoglobulin a přípravy nového rekombinantního lidského neutralizačního imunoglobulinu proti HIV-1 s modifikovanými konstantními oblastmi. Vynález si klade za úkol navrhnout uvedené látky tak, aby bylo možno předcházet infekci HIV-1 podáním rekombinantního neutralizačního lid- _v ského imunoglobulinu proti HIV-1 a dosáhnout tak ochrany proti uvedené infekci.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří rekombinantní neutralizační lidské imunoglobuliny proti HIV-1 a způsoby pro klonování a expresi těchto rekombinantních imunoglobulinu v hostitelských buňkách. Kódové řetězce pro neutralizační lidské v tom, že se

i) provedou příslušné mutace a sestaví se variabilní oblasti včetně CDR a základních konstrukčních oblastí FR, ii) zkonstruuje se vektor pro expresi, obsahující alespoň jednu variabilní oblast, která má po transfekci buněk za následek sekreci bílkoviny, u níž je možno stanovit její specifičnost a iii) uskuteční se současná amplifikace vektoru pro expresi dlouhého i krátkého řetězce při použití příslušných buněčných linií.

Vynález se rovněž týká rekombinantních metod pro uložení oblasti CDR z jiných monoklonálních protilátek jiných živočichů do konstrukce lidského imunoglobulinu tak, aby výsledná rekombinantní lidská protilátka byla při podání člověku jen slabě imunogenní nebo neimunogenní. Při podání, k léčebným účelům je výhodné, aby takto připravené rekombinantní bílkoviny byly rozpoznávány organismem jako vlastní bílkoviny. Tento postup humanizace způsobí, že takto zkonstruované rekombinantní protilátky budou k léčebným účelům použitelné vzhledem k tomu, že po podání člověku budou jen slabě imunogenní nebo budou neimunogenní. Vynález dále zahrnuje rekombinantní přeměnu monoklonální protilátky jakéhokoliv živočicha na lidskou rekombinantní monoklonální protilátku, postup je možno uskutečnit za předpokladu, že je možno identifikovat vhodnou oblast pro uskutečnění této konstrukce, jak bude dále podrobněji popsáno. Vynález se podrobně zabývá přípravou nukleotidových řetězců a řetězců aminokyselin pro oblasti CDR u člověka a u jiných živočichů, přičemž současně jsou připravovány také lidské konstrukční oblasti odděleně nebo v kombinaci jako krátké nebo dlouhé řetězce nebo jako intaktní imunoglobulin, zahrnuty jsou rovněž jakékoliv konzervativně modifikované varianty. Monoklonální protilátky z jiných živočichů jsou například myší monoklonální protilátky, schopné se vázat na HIV-1 a příslušné mMAb, které jsou produkovány hybridomy, uložené ve sbírce hybridomových buněk ve veřejné sbírce kultur American Type Culture Collection, ATCC, a jsou popsány v katalogu ATCC Catalog of Cell Lines and Hybridomas, č. 6, 1988 .

V průběhu přihlášky se používá pro aminokyseliny označení třemi písmeny i označení jedním písmenem, jde o standardní označení v oboru, zkratky pro jednotlivé amino-

kyseliny jsou	dále	uvedeny:
alanin	Ala	A	leuc in	Leu	L
arginin	Arg	R	lysin	LyS	K
asparagin	Asn	N	methionin	Met	M
kyselina aspargová	Asp	D	fenylalanin	Phe	F
cystein	•Cys	C	prolin	Pro	P
kyselina glutamová	Glu	E	serin	Ser	S
glutamin	Gin	Q	threonin	Thr	T
glycin	Gly	G	tryptofan	Trp	w
histidin	His	H	tyrosin	Tyr	Y
isoleucin	lle	I	valin	Val	v

imunoglobuliny proti HIV-1 nebo pro komplementární determinační oblasti CDR těchto imunoglobulinů, rekombinantně spojené s konstantní lidskou kódovou DNA se klonují a uložením do vektorů pro expresi se dosáhne exprese v rekombinantních hostitelských buňkách.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 jsou znázorněny oligonukleotidové primery pro amplifikaci řetězců DNA, které jsou kódovými řetězci pro dlouhý a krátký řetězec protilátky, oligonukleotidové primery jsou určeny pro rekombinantní klonování.

Na obr. 2A a 2B jsou znázorněny úplné nukleotidové řetězce pro dlouhý řetězec protilátky 447 - 52D a úplný nukleotidový řetězec pro kratší řetězec protilátky 447-52D, tak jak jsou tyto řetězce produkovány při použití rekombinantních vektorů.

Na obr. 3 jsou znázorněny oligonukleotidové primery, které byly použity pro konstrukci různých variabilních oblastí v krátkém i dlouhém řetězci protilátky 447 - 52D.

Na obr. 4 je znázorněn schematický diagram postupu, jímž se provádí rekombinantní klonování variabilních oblastí dlouhého a krátkého řetězce protilátky 447 - 52D.

Na obr. 5 je znázorněn schematický diagram plasmidu pHIV/447VH(Cgammal s obsahem oblasti gamma 1 dlouhého řetězce rekombinantní protilátky.

Na obr. 6 je znázorněn schematický diagram plasmidu pHIV/447Vlambda/Clambda, obsahujícího krátký řetězec rekombinantní protilátky.

Obr. 7 popisuje schematický diagram plasmidu p63.79r447 s obsahem krátkého řetězce a lidského dlouhého řetězce gamma 1.

Na obr. 8 je schematicky znázorněn diagram klonování, které bylo použito k získání plasmidu pc3.79r447.

Popis výhodných provedení

Vynález se týká neutralizačních lidských imunoglobulinů proti HIV-1 a rekombinantní konstrukce a exprese specifických imunoglobulinů. Tyto specifické rekombinantní imunoglobuliny obsahují neutralizační imunoglobuliny pro komplementární determinační oblasti CDR. Imunoglobuliny, obsahující komplementární determinační oblasti CDR pro rekombinantní HIV-1 je možno modifikovat rekombinantním způsobem tak, aby' v dlouhém a/nebo v krátkém řetězci obsahovaly oblasti, které jsou odlišné od odpovídajících oblastí v původním přírodním imunoglobulinu.

Rekombinantní modifikovaný imunoglobulin je například možno převést na isotyp IgGl z jakéhokoliv jiného isotypu IgG nebo jakékoliv jiné skupiny imunoglobulinu.

Infekci HIV je možno předcházet tak, že se rekonbinantní neutralizační imunoglobuliny proti HIV-1 podávají buď před infekci HIV-1 nebo po této infekci. V případě podání po infekci již tedy nejde o prevenci, nýbrž o léčení infekce HIV-1 podáním rekombinantního neutralizačního imunoglobulinu proti HIV-1.

Podstatu vynálezu tvoří také způsob konstrukce a exprese modifikované protilátky, tento postup spočívá

Vynález se týká také způsobů a prostředků pro konstrukci a expresi specifické protilátky, která je schopna neutralizovat HIV-1. Zdrojem periferních buněk B, u nichž dochází k expresi neutralizujících protilátek byly vzorky krve, odebrané od HIV-1-positivnieh jednotlivců. Uvedené buňky pak byly imortalizovány pomocí infekce virem Epstein-Barr, EBV, pak byly jednotlivé klony B-buněk sledovány na svou schopnost vylučovat protilátku, která by se vázala na peptidový řetězec, representující smyčku V3 kmene MN viru HUV-1 při provádění zkoušky ELISA na pevné fázi. Klony B-buněk, které byly při této zkoušce positivní, pak byly stabilizovány fúzí s buněčnou linií SHM-D33 (myší x lidský heterohybridom, ATCC CRL 1668). Výsledné klony heteronybridomu B-buněk byly sledovány na svou schopnost produkovat protilátku, která by rozpoznávala peptid ze smyčky MN V3 při provádění zkoušky ELISA na pevné fázi. Tímto způsobemje možno stanovit kriteria pro identifikaci a izolaci stálých buněk, produkujících lidskou -protilátku, přičemž produkovaná protilátka je potenciálně' použitelná pro další' vývoj .prostředků, použitelných k předcházení infekce HIV, a to v případech, kdy se předpokládá ohrožení infekcí HIV-1 a také k léčebným účelům u jednotlivců, kteří již jsou HIV-1-positivní.

Pro molekulární klonování kódové DNA pro protilátku proti HIV-1 je možno použít kterýkoliv z celé řady známých postupů. Tyto postupy zahrnují například přímou funkční expresi genu pro protilátku s následnou konstrukcí banky cDNA v příslušném systému vektoru pro expresi. Další postup spočívá v tom, že se systematicky sleduje banka cDNA s obsahem protilátky, zkonstruovaná v bakteriofágu nebo ve vektoru, například v plasmidu při použití značené oligonukleotidové sondy, zkonstruované z řetězců aminokyselin jako fragmentů protilátky.

Dále budou popsány některé výhodné postupy pro přípravu rekombinantních řetězců DNA pro variabilní oblasti protilátky, krátké řetězce a dlouhé řetězce ze svrchu popsaných lidských linií B-buněk ve spojení se stálými oblastmi lidského, původu. Tyto rekombinantní DNA je možno použít pro transfekci buněk savců tak, aby u nich docházelo k expresi rekombinantních lidských protilátek, které si uchovávají svou antigenní specifičnost, to znamená specifičnost člověka jako dárce protilátky, odvozené od B-buňky. Je zvláště výhodné, aby v případě podání k léčebným účelům byly rekombinantní imunoglobuliny rozpoznávány jako bílkoviny vlastního těla. Celková RNA se extrahuje z lidských heterohybridomů, například z buněk lidského heterohybridomu, tak jak byly svrchu popsány, při použití standardních metod, které zahrnují například solubilizaci zpracovávaných buněk působením guanidiniumisothiokyanátu způsobem podle publikace Chirgwin a další, Biochem., 18, 5294 - 5299, 1979.

Je zřejmé, že také jiné buňky, produkující protilátky proti HIV-1 budou použitelné pro přípravu rekombinantních molekul DNA, které budou kódovými molekulami pro část nebo pro celou molekulu protilátky proti HIV-1. Takové buňky, produkující protilátky proti HIV-1 byly popsány například v publikacích Gorney Μ. K. a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 88:3238 - 3242, 1991, Robinson J. E. a další, AIFS Res. Hum. Retrovir., 6:567 - 579, 1990, Posner M. R. a další, J. Immunol., 146:5325 - 4331 1991, Ho D. D. a další, J. Virol., 65:489 - 493, 1991, Tilley S. A. a další, Research Virol., 142:247 - 259, 1991 a také ATCC katalog, Catalogue of Cell Lines And Hybridomas, 7. vydání, 1992. Heterohybridom 447-52D, tak jak bude dále popsán, je možno uvést jako primární příklad popsaného postupu.

Odborníkům bude zřejmé, že lidský imunoglobulin Ig může obsahovat lehké řetězce kappa nebo lambda nebo může jít o kterýkoliv z následujících isotypů dlouhých řetězců alfa (IgA),' delta (IgD), epsilon (IgE), gamma (IgG) a ^u (IgM).

Každý z pěti uvedených isotypů dlouhých řetězců proti látky svou přítomností mění vlastnosti celé molekuly protilátky. Například IgA je hlavní skupinou protilátek v sekretech, například v mléce, ve slinách, v slzách a v sekretech dýchacích cest a zažívací soustavy, tyto protilátky je tedy možno běžně nalézt na povrchu epitheliálních buněk, které tvoří výstelku střevních cest, průdušek, pohlavních orgánů nebo vývodů mléčné žlázy, slinných žláz a slzných žláz. IgM je hlavní skupinou protilátek, k jejichž sekreci do krve dochází v průběhu časného období primární tvorby protilátek jako odpovědi na styk s antigenem, jde o multivalentní protilátku, která má obvykle celkem 10 vazných míst pro vazbu antigenů. Typ IgE má vysokou afinitu pro receptory většiny buněk a pro basofilni leukocyty a obvykle se účastní při alergických reakcích. Typ IgD se obvykle nachází na povrchu B-buněk v jejich klidovém stavu, funkce tohoto typu protilátek je prozatím nejasná. Typ IgG je hlavní skupinou imunoglobulinu v krvi a je ve velkém množství produkován při sekundární imunologické odpovědi, oblast Fc se může vázat na fagocytární buňky a tak napomáhat fagocytose, oblast Fc může aktivovat komplementární systém, stejně jako tomu je u typu IgE a jde o jedinou protilátku, která může procházet placentou a dostat se tak do krevního oběhu plodu.

Normální lidský imunoglobulin skupiny G obsahuje čtyři podskupiny, jejichž biologické vlastnosti a biochemie ké vlastnosti jsou odlišné. Normální IgG obsahuje přibližně 70 % IgGl, 18 % IgG2, 8 % iGg3 a 3 % IgG4. Způsob a tvrání styku s antigenem, typ antigenů a také genetické pozadí mohou podstatným způsobem ovlivnit podskupiny protilátky IgG, které budou produkovány. Vzhledem k tomu, že běží o hlavní skupinu imunoglobulinu, má úloha IgG a podskupin této protilátky velkou důležitost pro imunitu a pro různá onemocnění.

Může být žádoucí připravit rekombinantní protilátku proti HIV, která má odlišný dlouhý řetězec nebo podtyp tohoto řetězce než přírodní protilátka při použití rekombinantní DNA. Je například možno postupovat tak, že natývní protilátkou může být IgM nebo jiná skupina imunoglobulinu, které je méně žádoucí než IgA pro přípravu molekuly rekombinantní protilátky, která by měla být vylučována do dýchacích cest, do střevního systému nebo do pohlavních orgánů. Při použití rekombinantní DNA způsobem, jehož princip je v oboru znám, je možno nahradit stálou oblast dlouhého řetězce protilátky typu IgM dlouhým řetězcem protilátky IgA a dosáhnout exprese takto získané rekombinantní protilátky. Mimoto je možno natývní protilátku IgG3 rekombinantně pozměnit za vzniku protilátky IgGl v případech, v nichž je žádoucí získat protilátku s vyšší aktivační schopností pro komplementární systém.

Přeměna molekuly protilátky z jedné podskupiny IgG na jinou podskupinu IgG rekombinantní technikou je v průběhu přihlášky formou příkladu prokázána při použití protilátky 447-52D proti HIV. Protilátka 447-52D ve své přírodní formě je protilátka typu IgG3, která byla přeměněna na protilátku IgGl postupy, které budou dále uvedeny. Odborníkům bude zřejmé, že uvedený rekombinantní postup je možno použít pro přeměnu dlouhých řetězců imunoglobulinu, které jsou odlišné oč protilátky IgG a také pro přeměnu jedné podskupiny IgG na další podskupinu, avšak odlišnou od podskupiny IgGl.

Páry oligodeoxynukleotidových primerů, které jsou znázorněny na obr. 1 a které, představují řetězce v oblasti lidského VH signálního řetězce a lidského C-gamma 3'-zakončení a signální řetězce lidských protilátek V-lambda a také 3 -zakončení lidského řetězce C-lambda je možno syntetizovat na automatickém syntetizátoru DNA, Applied Biosystem 381A, získaný materiál se oddělí od pryskyřice působením koncentrovaného hydroxidu amonného, zbaví se solí na NAP-5, eluce se provádí vodou stejně jako v případě všech dále popsaných oligodeoxynukleotidových primerů. Celková RNA v množství přibližně 1 mikrogram se podrobí reverzní transkripci po dobu přibližně 30 minut při teplotě 42 °C při použití přibližně 200 jednotek reverzní transkriptázy AMV (Boehringer Mannheim Biochemicals), a přibližně 10 pmolů komplementárních primerů pro dlouhý nebo pro lehký řetězec. Reverzní transkriptáza se inaktivuje teplem přibližně 5 minut při teplotě 95 °C a reakční směs se doplní tak, že obsahuje 100 mikrolitrů PCR-pufru, přibližně 50 pmolů každého z párovaných primerů a 25 jednotek Taq-polymerázy. Pak se provede přibližně 45 cyklů amplifikace (1 minuta při 94 °C, minuty při 55 °C a 2 minuty při 72 °C), výsledný produkt se čistí na gelu za získání předpokládaných fragmentů DNA, přibližně 1400 párů baží ve fragmentu DNA pro dlouhý řetězec a 700 párů baží ve fragmentu DNA krátkého řetězce. Před subklonováním v příslušných plasmidech se takto získaná DNA rozštěpí působením EcoRI v případě dlouhého řetězce nebo působením EcoRI a Sáli v případě krátkého řetězce a vzniklé fragmenty se čistí elektroforézou na agarosovém gelu. Pak se cDNA pro dlouhý řetězec klonuje při použití derivátu plasmidů pUC18, v němž byla předběžně vytvořena místa působení enzymů Ncol a Notl mezi již předem existujícími místy působení enzymu Kpnl a BamHI. Krátký řetězec byl klonován při použití plasmidů pUC18. Mnohočetné klony, které představují řetězce, amplifikované pomocí PCR se pěstují a pak se analyzují řetězce DNA těchto klonů. Specifický řetězec DNA, který představuje řetězec pro variabilní oblast dlouhého lidského řetězce, je možno připravit analýzou předem určeného řetězce aminokyselin, obdobným způsobem je možno získat také variabilní oblast lidského krátkého řetězce lambda. Řetězec klonované cDNA pro protilátku 447-52D, tak jak bude dále uveden, prokazuje, že dlouhý řetězec je velmi blízce příbuzný variabilní oblasti dlouhého řetězce podskupiny III, vázané na konstantní oblast gamma 3, kdežto variabilní oblast krátkého řetězce je velmi blízce příbuzná variabilní oblasti podskupiny I, vázáné na konstantní oblast lambda. Rekombinantní protilátka 447-52D, tak jak je v průběhu přihlášky popsána, je zkonstruována tak, aby obsahovala V-oblast, která tvoří část heterohybridomu 447-52D a lidskou oblast gamma 1 (místo natývní oblasti gamma 3) aoblast lambda 2, jde o konstantní oblasti, řetězec úplného rekombinantního imunoglobulinu 447-52D je znázorněn na obr. 2A a 23.

Pro cDNA pro klonovanou protilátku, tak jak je získána svrchu popsanými postupy, je možno dosáhnout rekombinantní exprese pomocí molekulárního klonování ve vektoru pro expresi, který obsahuje vhodný promotor a další příslušné regulační prvky, nutné pro udkutečnění transkripce, takto připravený vektor je pak možno přenést do prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk, které pak mohou produkovat odpovídající rekombinantní protilátky. Postupy, jimiž je možno tyto genetické manipulace uskutečnit, jsou podrobně popsány ve svrchu uvedené publikaci Maniatis T. a další, a jsou v oboru běžně prováděny.

Vektroy, které je možno použít pro expresi v eukaryotických buňkách, je možno zkonstruovat pomocí postupů, kte15 ré budou dále uvedeny. Vektory pro expresi je možno obecně považovat za řetězce DNA, které jsou nezbytné pro uskutečnění transkripce klonovaných kopií genů a pro translaci jejich příslušných mRNA do příslušného hostitele. Vektory tohoto typu je možno použít pro expresi eukaryotických genů u celé řady hostitelů, jako jsou bakterie, modrozelené řasy, rostlinné buňky, buňky kvasinek, hmyzu a různých živočichů. Exprese imunoglobulinů je možno dosáhnout také při použití různých systémů na bázi virů.

Specificky zkonstruované vektory dovolují přenos DNA mezi jednotlivými hostiteli, například mezi bakteriemi a kvasinkami nebo mezi bakteriemi a živočišnými buňkami. Příslušně konstruovaný vektor pro expresi by měl obsahovat následující prvky: počátek replikacepro autonomní replikaci v hostitelských buňkách, označení pro usnadnění selekce, omezený počet použitelných míst působení restrikčních enzymů, dostatečný potenciál pro zajištění vysokého počtu kopií a silné promotory. Promotor je možno obecně definovat jako takový řetězec DNA, který napomáhá uskutečnit vazbu RNA-polymerézy na DNA a tím pomáhá uskutečnit syntézu RNA. Silný promotor je takový promotor, který způsobuje počátek tvorby mRNA s vysokou frekvencí. Vektory pro expresi.mohou obsahovat vektory různého typu, je možno použít například běžné vektory pro klonování, modifikované vektory pro klonování, specificky konstruované plasmidy nebo viry.

Pro expresi rekombinantních protilátek proti HIV-1 v buňkách savců je možno použít celou řadu vektorů pro expresi u savců. Z běžné dostupných a dodávaných vektorů pro expresi u savců, které mohou být vhodné pro použiti při expresi rekombinantních protilátek, je možno uvést například vektory pMClneo (Stratagene), pXTI (Stratagene) , pSG5 (Stratagene), EB0-pSV2-neo (ATCC 37593),·paPV-1(8-2 ) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12)(ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUTCag (ATCC 37460) a lambdaZD35 (ATCC 37565).

Kódová DNA pro protilátku proti HIV-1 může být také klonována při použití vektoru pro expresi v rekombinantní hostitelské buňce. Jako rekombinantní hostitelskou buňku je v tomto případě možno použít prokaryotické nebo eukaryotické buňky, může jít například o buňky bakterií, kvasinek nebo savců, v případě savců může jít například o buněčné linie člověka, Skotu, vepře, opice nebo hlodavců nebo také hmyzu, v tomto případě může například jít o buněčné linie, odvozené od Drosophila. Buněčné linie, odvozené od různých čeledí savců, které jsou použitelné a které jsou běžně komerč ně dostupné zahrnují například buněčné linie CV-1 (ATCC CCL 70). COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CH0-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C1 (ATCC CCL 26) a MRC-5 (ATCC CCL 171).

Vektor pro expresi je možno dohostitelských buněk uložit kterýmkoliv z velkého počtu známých postupů, jako je například transformace, transfekce, fuse protoplástů nebo otevření pórů působením elektrického proudu. Buňky, obsahující vektor pro expresi je možno klonovat a jednotlivě analyzovat tak, aby bylo možno stanovit, zda u nich dochází k produkci protilátky proti HIV-1. Identifikace klonů hosttelských buněk, u nichž dochází k expresi příslušné protilátky je možno uskutečnit celou řadou způsobů, jde například o stanovení imunologické reaktivity při použití protilátek proti protilátkám a o průkaz protilátky proti HIV-1, přítomné v hostitelské buňce.

Exprese DNA pro protilátku je možno dosáhnout také pomocí syntetické mRNA, která byla produkována in vitro.

Tuto syntetickou mRNA je možno s vysokou účinností přenést do různých bezbuněčných systémů, může jít například o extrakty z pšeničných klíčkůnebo o extrakty z retikulocytů, účinné translace je však možno dosáhnout i v různých systémech s obsahem buněk, je například možno provést mikroinjekce do žabích vajíček, přičemž z uvedených metod je výhodným .postupem právě mikroinjekce do žabích vajíček.

Jak je zřejmé z obr. 3, bylo syntetizováno přibližně osmu oligodeoxynukleotidových primerů, jde o primery, potřebné k uskutečnění polymerázové řetězové reakce, PCP-reakce pro amplifikaci pěti fragmentů DNA. Do všech těchto primerů, s výjimkou posledního oligodeoxynukleotidového primeru byly uloženy ty řetězce, které odpovídají V-oblasti dlouhého řetězce heterohybridomu 447-52D nebo řetězce, komplementární k signálnímu řetězci a fragmentům.intronů, které jsou určeny pro spojení ve V-oblasti 447-52D a alespoň 15 baží 5'-terminálního komplementárního řetězce tak, aby mohlo dojít k následující PCR-řízené rekombinaci uvedených tři fragmentů způsobem podle publikace Daugherty B. L, a další, DNA 9, -453 - 459, 1990. Příslušný pár primerů, Sl a S2, Hl a H2 a II a 12, přibližně 50 pmolů každého z těchto řetězců se uvede do reakce s přibližně 10 ng DNA pla.smidu, představující úsek pro dlouhý řetězec 447-52D, přibližně 2,5 jednotkami Taq DNA-polymerázy a pak se uskuteční přibližně 25 cyklů PCR-amplifikace (jeden cyklus: 1 minuta při 94°C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C). Produkty z pěti reakcí tohoto typu se pak Čistí při použití elektroforézy na agarosovém gelu, načež se spojí, jde o přibližně 10 ng každého fragmentu DNA spolu s terminálními oligoceoxynukleotidovými primery (Al a A2, z obr. 3) a o Taq DNA-polymerázu (obr. 4). Spojené fragmenty se amplifikují pomocí PCR (25 cyklů: 2 minuty při 94 °C, 2 minuty při 55 °C, 2 minuty při 72 °C). Po rozštěpení působením restrikcní endonukleázy, přiněmž dojde k rozštěpení dlouhého řetězce V-oblasti DNA v blízkosti signálního řetězce a řetězce intronu působením enzymu HidlII a Xhol s amplifikovaná DNA čistí při použití elektroforézy na agarosovém gelu a pak se klonuje v kompatibilních místech vektoru p9103, který obsahuje stálou oblast dlouhého řetězce gamma 1 člověka, jak je znázorněno na obr. 5. Tento vektor je možno zkonstruovat následujícím způsobem. Příslušná DNA se čistí z klonu kosmidu coslg9, popsaného v publikaci Flanagan a Rabbits, Nátuře 300, 709 - 713, 1982 a použije se jako matrice pro PCR-amplifikaci lidské konstantní oblasti gamma 1. Příslušný pár primerů (G1 a G2, z obr. 1), přibližně 50 pmolů každého z těchto primerů se naváže na přibližně 10 ng DNA-kosmidu, která obsahuje exony konstantní lidské oblasti gamma 1, přibližně 2,5 jednotkami Taq DNA polymerázy a pak se uskuteční přibližně 25 cyklů PCR-amplifikace (jeden cyklus: 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C). Pro,dukt reakce se rozštěpí restrikčními enzymy Xhol a EcoRI, čistí se elektroforézou na anarosovém gelu a klonuje ve vektoru p9102, který obsahuje fragment promotoru HIV-1 (v rozsahu párů baží -117 až +80, jde o pCD23, popsaný v Siekevitz a další, Science 238, 1575, 1987. Signální peptid a V-oblast krátkého řetězce v sousedství intronu.se rozštěpí při použití restrikčních enzymů HindlII a Xbal a aplifikovaná DNA se čistí při použití elektroforézy na agarosovém gelu a pak se klonuje ve vektoru FFFF, který bude dále popsán a který byl předem rozštěpen při použití restrikčních enzymů HindlII a EcoRI, souběžně s fragmentem DNA, který představuje kódový řetězec pro exon konstantní oblasti lidského krátkého řetězce. Tento posledně uvedený fragment je možno získat PCR-amplifikací 10 ng DNA plasmidu ± 208 s obsahem fragmentu EcoRI/HindlII, který zahrnuje část konstantní oblasti lidského úseku lambda 2. Příslušný pár příměrů (Cl a C2, z obr. 1), přibližně 50 pmolu každého z těchto primerů se Uvede do reakce s DNA plasmidu a přibližně 2,5 jednotkami Taq DNA polymerázy a pak se uskuteční přibližně 25 cyklů PCR-amplifikace (1 cyklus: 1 minuta při 94 °C, minuty při 55 °C a 2 minuty při 72 °C). Produkt reakce o velikosti 620 párů baží se rozštěpí pomocí restrikčních enzymů Xbal a EcoRI a rozštěpený materiál se čistí- elektroforézou na agarosovém gelu a pak se užije pro svrchu popsanou vazbu tří fragmentů. Při analýze výsledných klonů pro expresi je možno prokázat přítomnost uloženého lehkého řetězce o velikosti přibližně 1,2 kb po rozštěpení materiálu působením restrikčních enzymů HindlII a EcoRI s následnou elektroforézou na agarosovém gelu.

Molekuly imunoglobulinu s obsahem dlouhého řetězce a krátkého řetězce se podrobí transkripci z plasmidu, které jsou totožné až na to, že obsahují kódové řetězce pro jiný imunoglobulin. Výhodným prekursorem pro vektor pro expresi imunoglobulinu je vektor, který byl svrchu popsán a který obsahuje, část LTP promotoru z HIV-1 (baze -177 až +80, vztaženo na počátek), místo pro klonování a polyadenylační signál SV40, jak je znázorněno na obr. 7. Plasmid pEE14 (Ce.lltech, Ltd.) je zdrojem pro většinu řetězců DNA v uvedeným vektoru, který byl označen pSZ9015. Promotor CMVIE vektoru pEE14 byl odstraněn rozštěpením pomocí restrikčních enzymů Mlul a HindlII. DNA vektoru bez uvedeného promotoru o velikosti 8 kb se čistí při použití elektroforézy na agaroso vém gelu a pak se naváže na fragment DNA o velikosti přibliž ně 250 párů baží po PCR-amplifikaci, obsahující 197 párů baží promotoru LTR z HIV (-117 až +80) a zakončení po působení enzymů Mlul a HindlII (fragment byl získán při použití párů příměrů z obr. 1 a DNA plasmidu pCD23CAT jako matrice). Konstantní oblast gamma 1 dlouhého řetězce pak byla uložena do vektoru p9015 jako fragment Xbal/EcoRI o velikosti 2,0 kb spolu s V-oblasti dlouhého řetězce odlišného původu, čímž vznikl vektor pSP72/58.2/L16VH/gamma 1MRC.

DNA plasmidu s obsahem variabilní oblasti dlouhého řetězce 447 a konstantní oblasti IgGl a s obsahem lehkého řetězce 447 (jeho variabilní oblasti) a konstantní oblasti lambda 2 se pak pěstuje a čistí pro transfekci hostitelské buňky savce. Stejné množství přibližně 10 mikrogramů kódového plasmidu pro dlouhý řetězec a kódového plasmidu pro krátký řetězec lambda se použije pro transfekci, která se uskuteční běžným postupem s použitím srážení fosforečnanem vápenatým, jako hostitelská buňka se užije lidská buněčná linie 293 embryonálních buněk ledvin (ATCC CRL 1573). Supernatanty kultury byly zkoumány zkouškou Elisa na pevné fázi, tak jak bude dále podrobněji popsáno, a bylo prokázáno, že obsahují lidský krátký řetězec lambda/1ídský imunoglobulin IgGl. Plotny Immulon-2 (Dynatech. Labs.) s 95 vyhloubeními se přes noc opatří povlakem přibližně 10 mikrogramů/ml roztoku myší monoklonální protilátky proti konstantní oblasti lidského řetězce lambda (číslo v katalogu 05-4101, Zymed Laboratories, lne.) ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem (PBS) při teplotě přibližně 4 °C a pak se přidá na jednu hodinu při teplotě 37 °C přibližně 1 % sérového albuminu skotu (BSA) v PBS. Po opakovaném promytí při použití PBS se vzorky (upravené prostředí, obsahující rekombinantní protilátku 447-52D nebo lidský lambda/IgGl, Sigma Chemical) zředěné v PBS s obsahem 1 % BSA přidají a směs se inkubuje jednu hodinu při teplotě 37 °C, každá zkouška se uskuteční ve dvojím provedení. Zkonstruují se standardní kalibrační křivky při použití koncentrací IgGl v rozmezí přibližně 7,8 až 500 ng/ml. Vázaný a volný lidský IgGl se prokazují při použití podílu po 50 mikrolitrech při ředění 1 : -400, ředí se myší monoklonální protilátka proti lidskému IgGl, Fc, konjugovaná na peroxidázu z křenu (číslo katalogu 05-3320, Zymed Laboratories, lne.), k ředění se užije PBS s obsahem přibližně 1 % BSA. Směs se inkubuje přibližně 1 hodinu při teplotě 37 °C, po následném promytí se množství vázaného konjugátu stanoví přidáním přibližně 1 mM kyseliny 2,2 -azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonové) v 0,1 M citrátu sodného o pH .4,2 s obsahem 0,03 % peroxidu vodíku, směs se inkubuje 20 minut při teplotě místnosti. Adsorbance ve vyhloubeních se stanoví odečítacím zařízením pro plotny ELISA (Bio-Rad, lne.), nastaveným na 415 nm. Zkoušku ELISA na pevné fázi je možno uskutečnit také při použití ploten, opatřených, povlaky peptidu s 25 zbytky aminokyselin na bázi řetězce izolátu MN. Peptid s řetězcem (NleCysTyrAsnLysArgLysArglleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsnllelleGlyCys, řetězec č. 1) se syntetizuje na pevné fázi metodou s použitím Fmoc,. jde o použití předem aktivovaných pentafluorfenylesterů při aktivaci hydroxybenzyltriazinem. Plotny Immulon-2 se opatří povlakem přibližně 1 mikrogram/ml peptidu přes noc a blokují se při použití přibližně 1% fetálního séra skotu v PBS. Detekce vázané protilátky 447-52D se provádí svrchu uvedeným způsobem. Protilátka, která je vylučována lidskými buňkami 293 po transfekci se po přechodné expresi čistí chromatografií bílkoviny A. Koncentrace rekombinantní protilátky 44752D se stanoví svrchu popsanou zkouškou ELISA a protilátka se pak čistí a zkouší na svou účinnost průkazem schopnosti neuťrizovat infektivitu specifických serotypů HIV-1.

K stanovení rozsahu neutralizace bezbuněčného infekčního viru HIV-1 a ke stanovení inhibice šíření infekce z buňky na buňku se provádí následující zkouška, při níž se měří přežívání buněk po působení protilátky a viru na kultury po dobu 7 až 8 dnů. Sériové ředění protilátky (vždy na dvojnásobek předchozí koncentrace), se uskuteční v živném prostředí, které bylo užito pro pěstování buněk

I (RPMI 1640 + 10 % fetálního telecího séra) a 100 mikrolitrů tohoto prostředí se uloží vždy do jednoho vyhloubení plotny s 96 vyhloubeními (Costar Corp.). 100 mikrolitrů zásobního viru (připraveného z chronicky infikovaných buněk H9 nebo z nově vytvořených chronicky infikovaných buněk FDA/H9, prostředí z chronicky infikovaných buněk se po 3 dnech nanese - 5 pri hustotě buněk 2 x 10 buněk/ml, prostředí se vyčeří a jako zkušebná dávka se užije 10-násobek posledního ředění zásobního viru, které ještě usmrtilo do 7 dnů všechny buňky

MT-4) se přidá do každého vyhloubení a směs viru a protilátky se inkubuje 1 hodinu při 37 °C. Pak se do každého vyhloubení přidají buňky MT-4 podle publikace Harada a další, 1985,

Science, 229, str. 563 - 566, užije se 1 χ IQ⁴ buněk/vyhloubení v 50 mikrolitrech živného prostředí, plotna se pak inkubuje 7 dnů při teplotě 37 °C a pak sě odečítá výsledek.

Koncentrace posledního ředění protilátky, při němž je možno zabránit uhynutí buněk MT-4 se uvádí jako koncový neutralizační bod.

Výsledky zkoušek na neutralizaci jsou znázorněny na obr. 8. Z výsledků je zřejmé, že účinnost rekombinantní lidské protilátky 447-52D je stejná jako účinnost protilátky, odvozené od lidského heterohybridomu 447-52D, výsledek je stejný pro každý ze sledovaných serotypů HIV-1. Tento výsledek prokazuje, že rekombinantně zkonstruovaná protilátka, jejíž exprese byla uskutečněna spolu s konstantními lidskými oblastmi lambda a gamma 1 nebyla modifikována do té míry, aby došlo ke změně interakcí této protilátky se smyčkou viru V3 PND.

Vynález se tedy týká konstrukce úplné rekombinantní lidské neutralizační protilátky 447-52D proti HIV-1, jejíž variabilní oblasti dlouhého a krátkého řetězce obsahují zbytky, odpovídající zbytkům protilátky lidského heterohybridomu 447-52D, přičemž dochází k úplnému uchování specifičnosti a účinnosti původní protilátky, produkované uvedeným heterohybri domem.

Je zřejmé, že rekombinantní lidská protilátka proti HIV-1, připravená svrchu uvedeným způsobem má zcela stejnou antigenní specifičnost jako přírodní protilátka a rovněž si uchovává široké spektrum neutralizační účinnosti proti HIV-1. Odborníkům je také zřejmé, že při použití postupů, uvedených v průběhu přihlášky je možno připravit také jiné protilátky proti HIV, takže je možno získat molekuly specifických rekombinantních protilátek proti HIV-1.

Buněčné linie, které produkují lidský IgG mAb pro neutralizaci epitopu HIV-1, například epitopů, spojených s glykoproteinem gpl2O je možno získat EBV-transformací mononukleárních buněk z lidské periferní krve s následnou selekcí buněčných linií, které produkují protilátku s požadovanou specifičností, pak se uskuteční fúze EBV-transformovaných buněk po selekci s buněčnou linií heteromyelomu. Výsledné buňky heterohybridomu pak produkují lidskou protilátku mAb, která je specifická proti určitému epitopu, například proti epitopu gpl2O viru HIV, jde o modifikované protilátky, produkované EBV-transformovanými buňkami.

Glykoprotein gpl2O, který obsahuje jeden nebo větší počet epitopů pro neutralizaci, rozpoznávaných buňkami a protilátkami proti vynálezu js možno odvodit od kteréhokoliv ze známých kmenů HIV-1, například od poměrně běžného kmene MN viru HIV.

Pod pojmem heteromyelom se rozumí hybridní buněčná linie, která je vytvořena myelomovou buněčnou linií původu, odlišného od lidského původu a lidskou buněčnou linií myelomu. Obvykle se jako druhá buňka pro fúzi s buňkou lidského myelomu vodí buňka myelomu nebo plasmocytomu myši. Takové buněčné linie, které jsou tvořeny buněčným materiálem myelomu lidského původu a myelomu, odlišného od lidského původu jsou v oboru velmi dobře známy, jako příklady těchto buněčných linií je možno uvádět linie, které jsou popsány v publikacích Teng N. N. a další, Proč. Nati. Acad.Sci. USA, 80, 7308, 1983, Kozbor D. a další, Hybridoma, 2, 7, 1983 a Grunow R. a další, J. Immunol. Meth., 106, 257 - 265, 1988.

Při provádění způsobu podle vynálezu se užijí buňky heteromyelomu jako partnerský buněčný materiál pro fúzi s EBV-transformovanými lidskými buňkami po selekci za vzniku heterohybridomu podle vynálezu.

Ve výhodném provedení se užijí jako partnerský buněčný materiál pro fúzi buňky heteromyelomu SHM-D33. Tuto buněčnou linii je možno získat z veřejné sbírky kultur ATCC pod číslem ATCC CRL L668.

Pod pojmem heterohybridom, tak jak je v průběhu přihlášky užíván, se rozumí hybridní buněčná linie, která byla připravena fúzí buněk z jedné čeledi, produkujících protilátku a buněk heteromyelomu. Pojem heterohybridom je také někdy užíván k označení jakéhokoliv hybridomu buněk z různých čeledí, například k označení hybridomu, vzniklého fúzí lidské lymfocytoidní buněčné linie, produkující protilátky a buněk krysího myelomu. Avšak pojem, tak jak je užíván v průběhu přihlášky, je více vymezen.

V jednom z provedení vynálezu se uskuteční fúze buněk lidského původu, produkujících protilátku s buněčným materiálem heteromyelomu myš-člověk. Ve výhodném provedení je heterohybridom výsledkem fúze EBV-transformovaných lidských lymfocytů, produkujících protilátku k neutralizačnímu epitopu HIV s buněčným materiálem heteromyelomu člověk-myš. Ve velmi výhodném provedení se jako heteromyelom člověk-myš užije buněčná linie, označovaná SHM-D33.

Pod pojmem neutralizační epitop se rozumí epitop, který po vazbě na protilátku, specifickou pro tento epitop způsobí neutralizaci viru. Pod pojem neutralizace tak jak je v průběhu přihlášky používán, pak spadá neutralizace jakékoliv biologické aktivity viru, může jít například o tvorbu syncytia.

Aby bylo možno připravit lidskou mAb proti neutralizačnímu epitopu gp!2O viru HIV-1, transformují se lidské lymfocyty z periferní krve pomocí EBV, například způsobem podle publikace Gorny Μ. K. a další, Proč. Nati., Acad. Sci. USA,

86, 1624 - 1628, 1989.

S výhodou se postup provádí tak, že se buněčný materiál, určený pro transformaci získá z krve jednotlivce, který produkuje protilátky proti HIV.

Kultury EBV-transformovaných buněk se pak zkoumají na tvorbu protilátek proti zvolenému epitopu. V jednom z provedení vynálezu je neutralizačním epitopem glykoprotein gpl2O a zkouška na tvorbu protilátky se provádí při použití čištěného gpl2O, jeho fragmentu nebo syntetického peptidu, který tvoří část tohoto epitopu. Ve výhodném provedení vynálezu se kultury transformovaných buněk zkoumají na produkci protilátek proti smyčky V3 glykoproteinu gpl2O při použití syntetického peptidového 23-meru ze smyčky V3 v rozsahu aminokyselin 306 - 328, řetězec byl uveden svrchu. Kromě tohoto peptidu je možno použít pro selekci E3V-transformovaných buněk další peptidy s obsahem alespoň šesti aminokyselin, tímto způsobem je možno identifikovat buněčný materiál, který produkuje protilátky se specifičností proti požadovanému epitopu.

Při sledování buněčného materiálu na produkci protilátek je možno použít známé imunologické zkoušky. Výhodnou imunologickou zkouškou je imunoabsorpční zkouška s použitím enzymu, obvykle označovaná ELISA. Při použití této zkoušky se supernatanty kultury vyšetřují na přítomnost protilátek s požadovanou specifičností a isotopem.

Pozitivní EBV-transformované kultury se opakovaně klonují jakýmkoliv způsobem klonování, který je v oboru znám, například při použití dvojnásobného ředění. Buňky z kultur, produkujících protilátku s požadovanou specifičností je možno podrobit fúzi s buněčným materiálem linie heteromyelomu za vzniku heterohybridomu. Buňky po uskutečněné fúzi se pak klonují při hustotě kultury přibližně 1 až 100 buněk v jednom, vyhloubení.

Specifičnost protilátky, která je produkována heterohybridomem je možno stanovit známými imunologickými zkouškami. Ve výhodném provedení je možno použít zkoušku ELISA a radioimunologické srážení RIP. Prostředek s obsahem antigenů obsahuje viriony HIV-1, například kmene MN, rozrušený virus nebo rozrušené infikované buňky, například lysáty kmene MN a HTLV-IIIB, virové bílkoviny, například gpl20 nebo rekombinantní nebo syntetické peptidy viru, například svrchu popsaný 23-mer.

Protilátky mAb podle vynálezu náleží k isotypů IgG a je možno je izolovat ze supernatantu kultur buněk heterohybridomu a pak čistit některým ze známých způsobů, použitelných pro čištění IgG. Tyto metody zahrnují například afinitní chromatografií bílkovin na Sepharose, kombinaci chromatografie s použitím Affigel Blue (BioPad, Richmond, CA) a chromatografie na Sepharose s proteinem-A nebo je možno použít vysokotlakou kapalinovou chromatografií.

Při podání lidem, indikovaným HIV-1 nebo ohroženým infekcí HIV je možno protilátkami podle vynálezu dosáhnout příznivého léčebného nebo profytaktického účinku. Jednotlivci, kteří jsou zvláště ohroženi infekcí, jsou nyní sledováni a existují také pracovní skupiny zdravotníků, specializované na prevenci infekce HIV-1.

Protilátky podle vynálezu je možno využít také k diagnostickým zkouškám, jimiž je možno prokázat, zda byl nemocný vystaven infekci nebo zda.již byl infikován virem HIV-1.

Protilátky podle vynálezu je dále možno použít také pro průkaz exprese bílkovin HIV, proti nimž jsou uvedené protilátky specifické.

Protilátka mAb lidského původu podle vynálezu, specifická proti HIV může být použita k léčení jednotlivců, kteří jsou infikováni HIV nebo trpí onemocněním AIDS. Protilátky proti vynálezu je možno podávat parenterálně nebo enterálně jakýmkoliv.známým způsobem. Protilátky mohou například být podávány podkožně, nitrožilně, nitrosvalově, intraperitoneálně, transdermálně nebo také intrathekálně. Protilátky je možno alternativně nebo současně podávat také perorálně, rektálně nebo do pochvy. Protilátky je možno podávat také do amniotické dutiny při léčení plodu ještě v děloze. Výhodným způsobem podání je podání nitrožilní a nitrosvalové.

Dávka protilátky, která má být podána bude záviset na věku, zdravotním stavu a na hmotnosti nemocného, na druhu současně používaného léčení, na frekvenci léčebných zákroků a na povaze požadovaného účinku. Účinná množství protilátky mAb se pohybuje v rozmezí 0,1 až 500 mg denně, s výhodou 3 až 30 mg denně. Léčení může vyžadovat infuzi nebo injekce protilátky v průběhu dnů, týdnů, měsíců a někdy i let, jak je odborníkům zřejmé.

Při typickém způsobu podávání se účinné množství protilátky podává v intervalech jeden týden až v průběhu 6 měsíců. Doba trvání takového léčení, jíž je zapotření k dosažení léčebného účinku, bude u různých nemocných různá v závislosti na závažnosti jejich onemocnění, na stádiu, v němž se onemocnění nachází a na ostatních podmínkách, v nichž se nemocný nachází.

Celková dávka, jíž je zapotřebí pro léčení v jednotlivých případech', může být podána ve formě většího počtu dávek nebo jako jediná dávka. Protilátka mAb může být podávána sama o sobě nebo je možno ji podávat s dalšími léčebnými prostředky, které jdou současně používány proti infekci HIV-1, jako jsou například AZT nebo je možno ji podávat s léčebnými látkami proti příznakům jiných onemocnění.

Protilátky mAb podle vynálezu mohou být podávány také těhotným ženám, které jsou infikovány HIV. Vzhledem k tomu, že protilátky podle vynálezu jsou isotypu IgG, mohou procházet placentou a dostanou se do organismu plodu. Tímto způsobem je možno zabránit infekci plodu v těle matky nebo je možno již infikovaný plod účinně léčeit.

Farmaceutické prostředky, které obsahují protilátky podle vynálezu, mohou být jakékoliv prostředky, v nichž je protilátka obsažena v množství, které je dostatečné pro dosažení požadovaného léčebného účinku. Kromě uvedené protilátky mohou tyto farmaceutické prostředky obsahovat ještě vhodné farmaceutické nosiče a pomocné látky, které mohou usnadnit zpracování účinných látek na prostředky, vhodné pro farmaceutické použití. Dalším farmaceutickým prostředkem, který rovněž spadá do rozsahu vynálezu, může být prostředek, který obsahuje kombinaci protilátky podle vynálezu se známým .nitrožilně podávaným prostředkem s obsahem imunoglobulinu.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu zahrnují vhodné roztoky, určené pro injekční nebo perorální podání, které obsahují 0,01 až 99, s výhodou 20 až 75 % účinné složky, v tomto případě protilátky, spolu s pomocnými látkami. Výhodnými farmaceutickými prostředky pro perorální podání jsou tablety a kapsle. Farmaceutickými prostředky, které je možno podávat rektálně nebo do pochvy, jsou čípky.

Protilátky mAb podle vynálezu mohou být konjugovány s cytotoxickými látkami a použity jako imunotoxiny, tak jak je například popsáno v publikaci Vitetta a.další, Science, 238:1098 - 1104, 1987, nebo mohou být začleněny do povrchu liposomů, obsahujících účinné látky proti HIV nebo toxiny tak, aby bylo možno specificky zacílit tyto účinné látky nebo toxiny a přivést je až k infikovaným buňkám, na něž mají působit. Pojem imunotoxin, tak jak je v průběhu přihlášky použit, označuje konjugát protilátky s jedním nebo větším počtem toxinů, účinných látek, radionuklidů nebo látek s cytotoxickým účinkem. Toxická část tohoto konjugátu je vázána na protilátku podle vynálezu chemicky nebo může být vázána s použitím rekombinantní technologie DNA. Při tomto typu vazby se kódová DNA pro toxickou bílkovinu nebo pro její účinný fragment váže na kódovou DNA pro celý dlouhý řetězec, krátký řetězec nebo oba řetězce protilátky mAb nebo pro části těchto struktur. Genetické konstrukce tohoto typu a způsoby, kterými je možno tyto konstrukce vytvořit jsou v oboru známy. Z toxinů, které je možno vázat na protilátky podle vynálezu je možno uvést ricin, toxin záškrtu, toxin Pseudomonas, faktor alfa nekrosy nádorů a další v oboru známé toxiny.

Při typickém způsobu léčení, při němž je protilátka mAb podle vynálezu užita jako imunotoxin, látka vázána na toxin, například na ricin je uvedená protikterý je sám o sobě toxický jak pro buňky, které jsou infikovány HIV, tak pro neifikované buňky. Vazbou cytotoxické protilátku je možno dosáhnout vysoké úrovr ku tak, že tento účinek je lokalizován na nimž je toxická látka přiváděna pomocí poi takže sousední neinfikované buňky, na ně protilátka neváže, zůstanou uchráněny.

sloučeniny na ě roxického účincílové buňky, k žité protilátky, se specifická

Protlvirová léčba proti HIV je zaležena na dokonalé téměř každý dejak zasáhnout do které interferují znalosti replikačního cyklu viru, přičemž finovaný stupeň replikace nabízí možnost, replikace viru. Jsou dostupné sloučeniny, s vazbou HIV na buněčný materiál. Například rekombinantní

CD4 působí tím způsobem, že je s virem v kompetici o buněčné receptory, na něž se váže obalová bílkovina viru, gpl20. Až dosud nejúspěšnější účinné látky proti virové infekci jsou zaměřeny na následující stupeň, v němž se tvoří DNA proviru a způsobují inhibice reverzní transkriptázy RT.

Tyto látky zahrnují AZT a další nukleosidové analogy, například dideoxycytosin ddC a dideoxyinosin ddl a také nenukleosidové analogy. Dalším cílovým stupněm může být syntéza, zrání a transport virové RNA z provirové DNA z jádra do cytoplasmy, tohoto pochodu se účastní inhibitory funkcí tat a rev. Virová mRNA musí dospět k translaci a podle výsledků . provedených pokusů je tento stupeň možno specificky inhibovat při použití antimediátorových oligonukleotidů. Konečně musí být bílkoviny viru sestaveny do nové částice viru, tento pochod závisí na činnosti specifické proteinázy viru.

Tato proteináza již byla připravena v krystalickém stavu a byly identifikovány inhibitory tohoto enzymu a popsány v publikaci Roberts a další, 1990, Scince, 248, str. 358 -362.

Podstatu vynálezu tvoří také kombinace rekombinantní neutralizační protilátky proti HIV s jednou nebo větším počtem sloučenin, rovněž použitelných k léčení nebo prevence infekce HIV a choroby AIDS. Rekombinantní protilátku podle vynálezu je například možno s dobrým výsledkem podávat před vystavením infekci a/nebo po ohrožení touto infekcí v kombinaci s účinným množstvím jiných látek s protivirovým účinkem,' rovněž účinným proti infekci HIV, spolu s imunomodulačními látkami, s prótiinfekčními látkami nebo vakcínami.

Kombinace rekombinantní protilátky proti HIV podle vynálezu a dalších látek, které jsou účinné proti HIV a proti chorobě AIDS, může být vhodná pro použití při prevenci nebo při léčení již vzniklé infekce HIV a k léčení pathologických stavů, které jsou důsledkem této infekce, jako je choroba AIDS. Léčení AIDS nebo prevence nebo léčení infekce HIV je definováno jako léčení široké škály stavů, které jsou důsledkem infekce virem HIV. Jde například o chorobu. AIDS, o ARC, což je komplex příznaků, příbuzný· AIDS, v Obou případech jde o léčení ještě bezpříznakových stavů nebo stavů, při nichž již došlo ke vzniku chorobných p je možno uskutečnit také v případě skutečn ciálního ohrožení infekcí HIV. Kombinace s vynálezu je například použitelná při léčen infekce HIV po nebo před předpokládaným oh fekcí, například v případě krevní transfus krevních derivátů, při náhodném bodnutí in styku s tělesnými tekutinami nebo při styk v průběhu chirurgického zákroku.

ďznaků, léčení ;ho nebo potenloučenin podle nebo prevenci rožením touto ine, při použití jekční jehlou, při u s krví nemocného

Pro uvedené účely je možno podávat protilátku prodi HIV podle vynálezu a dalš použitelnou proti HIV nebo pro léčení choř naci, a to perorálně, parenterálně, včetně nebo infuse, inhalací ve formě spreje, rek pochvy při použití lékových forem s obsahe vek, které kromě účinných látek mohou obsa xické, z farmaceutického hlediska přijatel né látky nebo nosná prostředí.

-ekombinanřní sloučeninu, :by AIDS v kombipodkožní injekce t:álně nebo do n jednotlivých dá'íovat běžné netoié nosiče, pomockombinace farmaa pro léčení inuvedených chorobPodstatu vynálezu tedy rovněž tvoří ceutických prostředků, určená pro prevenci fekce HIV a choroby AIDS. V průběhu léčení ných stavů se nemocným podává spolu s vhodným farmaceutickým nosičem kombinace léčebně účinného množství rekombinantní protilátky proti HIV podle vynálezu a dalších sloučenin, účinných proti infekci HIV nebo použitelných při léčení choroby AIDS.

Tyto kombinační farmaceutické prostý formu suspenzí nebo tablet, určených pro pe může jít o spreje pro podání na nosní slizn prostředky pro injekční podání, například i ve vodě nebo v oleji nebo o čípky.

edky mohou mít rorální podání, ici, o sterilní njekční suspenze

V případě perorálního podání ve formě suspenze je možno uvedené farmaceutické prostředky připravovat známým způsobem pro výrobu farmaceutických prostředků, prostředky mohou obsahovat mikrokrystalickou celulosu pro zvětšení svého objemu, kyselinu alginovou nebo alginát sodný jako činidlo, napomáhající vzniku suspenze,· méthylcelulosu pro úpravu viskosity a sladidla nebo látky pro úpravu chuti tak, jak jsou v oboru známy. Pokud jde o tablety, které mají okamžitě uvolnit účinnou látku, mohou tyto tablety obsahovat mikrokrystalickou celulosu, hydrogenfosforečnan vápenatý, škrob, stearan hořečnatý, laktosu a/nebo jiné pomocné látky, dále pojivá, složky pro zvýšení objemu, látky, napomáhající rozpadu tablet, ředidla a kluzné látky, tak jak jsou v oboru obecně používány.

Při podání ve formě aerosolu na nosní sliznici nebo pro podání inhalací je uvedené prostředky rovněž možno připravit způsobem, známým pro výrobu farmaceutických prostředků tohoto typu. Může jít o roztoky ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, které jako konzervační látky mohou obsahovat benzylalkohol nebo jiné vhodné sloučeniny, dále mohou roztoky obsahovat látky, podporující vstřebávání pro zvýšení biologické dostupnosti účinných látek, fluorované uhlovodíky a/nebo jiná f oboru známá solubilizační nebo dispergační činidla.

Roztoky nebo suspenze, určené pro injekční podání mohou být rovněž připraveny způsobem, který je v oboru znám pro výrobu tohoto typu farmaceutických prostředků při použití vhodných netoxických, pro parenterální podání přijatelných ředidel nebo rozpouštědel, jako jsou například mannitol, 1,3-butandiol, voda, Ringerův roztok nebo isotonický roztok chloridu sodného, dále mohou prostředky obsahovat vhodná dispergační činidla nebo smáčedla a také činidla, napomáhající vzniku suspenze, jako steriln: včetně syntetických mono- nebo diglyceridů nenasycené alifatické kyseliny včetně kyše.

fixované oleje, a nasycené i iny olejové.

V případě rektálního podání nebo podání do pochvy ve formě čípků je uvedené farmaceutické prostředky možno připravit smísením účinné látky s nedráždivým nosným prostředím, jako je kakaové máslo, syntetické glyceridy nebo polyethylenglykoly, jde o látky, které se pacházejí při běžných teplotách v pevném stavu, avšak jejich stav se mění na kapalný při teplotě těla, přičemž současně dochází k uvolnění účinné látky.

Sloučeniny podle vynálezu je možno ý lidském lékařství podávat perorálně v rozmezí dávek 1 mg až 5 g/kg tělesné hmotnosti, a to jednotlivě nebo rozděleně v několika dílčích dávkách. Je zřejmé, že určitá dávka, systém podávání těchto dávek a frekvence podávání u určitého nemocného se buče měnit a bude záviset na celé řadě faktorů, například na účinnosti použité sloučeniny, na její metabolické stálosti a délce jejího působení, na věku nemocného, jeho tělesné hmotnosti, jeho celkovém zdravotním stavu, pohlaví, způsobu stravování, způsobu a frekvenci podání účinné látky, na rychlosti jejího vylučování, na specifické kombinaci účinných látek, na závažnosti léčeného onemocnění a na všech ostatních podmínkách.

Nové kombinační farmaceutické prostředky podle vynálezu obsahují rekombinantní protilátku proti HIV podle vynálezu v kombinaci s jednou nebo větším počtem dalších účinných látek proti HIV, které působí tím způsobem; že přerušují nebo způsobují inhibici replikace HIV, nebo může být v kombinaci obsažena jiná látka, určená pro léčení stavů, příbuzných nebo spojených s chorobou AIDS. Tyto účinné látky proti HIV zahrnují například ty sloučeniny, které hráni vazbě viru na buněčný receptor, jde například o rozpustnou sloučeninu CD4 a příbuzné peptidy, dextransulfát nebo N-butyl DNJ, dále je možno použít inhibitory konečného sestavení viru, například castospermin, 5-0-butanoylcastanospermin a inhibitory myristoyláce, použít je možno také inhibitory reverzní transkriptázy, například některé nukleosidové analogy, jako AZT, ddC, ddl, D4T, AzdU, A-69992, IAF-BCH189, carbovir, Fascarnet, Ganciclovir a Acyclovir a některé nenukleosidové analogy, například některé hydroxypridony, jako jsou

3-//(4,7-dichlorbenzoaxazol-2-yl)methyl/amino/-5-ethy1-6-methy1-2-(1H)-pyridinon,

3-//(4,7-dimethylbenzoxazol-2-yl)methyl/amino/Č5-ethyl-6-methyl-2-(1H)-pyridinon,

3—//(7-chlorbenzoxazol-2-yl)methyl/amino/-5-ethyl-6-methyl-2-(lH)-oyridinon,

3-//(7-methylbenzoxazol-2-yl)methyl/amino/-5-ethyl-6-methyl-2-(1H)-pyridinon,

3-//(4-fluorbenzoxazol-2-yl)methy1/amino/-5-ethy1-6-methy1-2-(1H)-pyridinon,

3-//(7-fluorbenzoxazol-2-yl)methyl/amino/-5-ethy1-6-methy1-2-(1H)-pyridinon,

3—//(benzoxazol-2-yl)methyl/amino/-5-ethyl-6-methyl-2-(1H)-pyridinon,

3-//(4-chlorbenzoxazol-2-yl)methyl/amino/-5-ethy1-6-methyl-2-(lH)-pyridinon,

3-//(4-fluor-7-chlorbenzoxazol-2-yl)methyl/amino/-5-ethyl-6-methyl-2-(1H)-pyridinon, a

3-/2-(benzoxazol-2-yl)ethyl/-5-ethy1-6-methy1-2-(1H)-pyridinon, inhibitory transkripce transaktivace, například inhibitory bílkovin tat a řev, jako 7-chlor-5-(2-pyrryl)-3H-1, 4-benzodiazepin-2(H)-on nebo Ro5-3335, dále inhibitory proteinázy retrovirů, jako nehydrolyzovatelné chemické analogy struktury přechodného stavu enzymu, substrátu nebo reakčního meziproduktu, například R039-8959 (Hoffman La Roche) a použít je možno také inhibici genetické exprese virů při použití antimediátorových oligonukleotidů. Prostředky pro léčení AIDS a příbuzných stavů zahrnují také látky pro léčení průběžných infekcí, interferon, faktor pro stimulaci kolonií makrofágů, interleukin 2, faktor nekrosy nádorů a arythropoetin.

Ve výhodném provedení vynálezu se rekombinantní protilátka proti HIV kombinuje ve farmaceutickém prostředku s inhibitorem reverzní transkriptázy HIV a/nebo inhibitorem proteinázy HIV. Výhodným inhibitorem reverzní transkriptázy je sloučenina se svrchu uvedené skupiny aminopyridonů. Výhodnými inhibitory proteinázy jsou látky, napodobující přechodný stav hydroxyethylaminu, například R031-8959 (Hoffman La Roche) Nejvýhodnější jsou kombinace rekombinantní protilátky proti HIV a jednoho nebo většího počtu aminopyridonů jako inhibitorů reverzní transkriptázy.

Mimoto je možno rekombinantní protilátku proti HIV podle vynálezu s úspěchem podávat před infekcí a/nebo po ní v kombinaci s účinným množstvím protivirových látek proti AIDS, imunomodulátorů, protiinfekčních prostředků a podobně, tak jak jsou uvedeny v následující tabulce.:

Tabulka

Protivirové látky

sloučenina	výrobce	indikace
AL-721	Ethigen (Los Angeles,CA)	ARC, PGL, HIV positivita, AIDS
rekombinantní lidský interferon beta	Triton Biosciences (Almeda,CA)	AIDS, Kaposiho sarkom, ARC
Acemannan	Carrington Labs (Irving, TX)	ARC (viz také imunomodulátory)
Cytovene	Syntex	hrozící oční CMV
Ganciclovir	Syntex (Palo Alto, CA)	periferní CMV retinitis
d4T (didehydrodeoxythimidin)	Bristol-Myers (New York,.NY)	AIDS, ARC
ddl (dideoxyinosin)	Bristol-Myers (New York, NY)	AIDS, ARC
EL1O	Elán Corp. PLC (Gainesville,GA)	infekce HIV (viz také imunomO’ dulátory)
Fosfonomravenčan trisodný	Astra Pharm. Products, lne. (Westborough, MA)	CMV retinitis, infekce HIV, jiné ι CMV infekce

sloučenina	výrobce	indikace
Dideoxycytidin ddC	Hoffman-La Roche (Nutley, NJ)	AIDS, ARC
Novapren	Novaferon Labs, lne. (Akron, OH) Diapren, lne. (Roseville, MN)	inhibitor HIV
Peptid T	Peninsula Labs	AIDS
oktapeptid	(Belmont, CA)
Tudovudin, AZT	Burroughs Wellcome (Rsch.Triangle Park, NC)	pokročilá AIDS, ARC, pediatrická AIDS, Kaposiho sarkom, infekce HIV bez příznaků, mírnější průběh HIV, neurologické poruchy, kombinace s dalším léčením, profylaxe po přímém ohrožení u zdravotníků
Ansamycin LM 427	Adria Laboratories (Dublin, OH) , Erbamont (Stamford, CT)	ARC
óextransulfát	Ueno Fine Chem. Ind. Ltd. (Osaka, Japonsko)	AIDS, ARC, HIV positivita bez příznaků
Virazole	Viratek/ICN	HIV positivita bez
Ribavirin	(Costa Mesa,CA)	příznaků, LAS, ARC

sloučenina	výrobce	indikace
Alpha Interferon	Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park, NC)	Kaposiho sarkom, HIV v kombinaci w/retrovir
Acyclovir	Burroughs Wellcome	AIDS, ARC, HIV positi vita bez příznaků, kombinace s AZT
Imunomodulátory
Protilátka neutralizující pH-labilní alfa-aberantni interferon v imunoadsorpčním- sloupci	Advanced Biotherapy Concepts (Rockville, MD)	AIDS, ARC
AS-1O1	Wyeth-Ayerst Labs (Philadelphia,PA)	. AIDS
Bropi rimine	Upjohn (Kalamazoo, MI)	AIDS v pokročilém stavu
Acemannan	Carrington Labs, lne.. (Irving,TX)	AIDS, ARC (viz také pr.otivirové látky
CL246 738	American Cyanamid AIDS, Kaposiho (Pearl River,NY) sarkom

Lederle Labs (Wayne, NJ) sloučenina

EL1O výrobce indikace

Elán Corp. PLC infekce HIV (viz (Gainesvi1le, GA) také protivirové látky)

Gamma Interferon

Genentech (S. San Francisco, CA)

ARC, v kombinaci s TNF (faktor nekro nádorů)

Faktor stimulující tvorbu kolonií granulocytů a makrofágů

Faktor stimulující tvorbu kolonií· granulocytů a makrofágů

Imunostimulační částice jádra HIV

IL-2

Interleukin-2

Genetics Insti- AIDS **· tute (Cambridge, MA)

Sandoz (East Ha^over, NJ)

Koechst(Somervi Immunex (Seattle loussel .le, NJ)

WA)

AIDS

Schering+Plough (Madison, NJ)

AIDS v kombinaci s AZT

Rorer seropositivní HIV (Ft. Washington,

PA)

Cetus (Emeryvi le,CA)

AIDS, v kombinaci S AZT sloučenina výrobce indikace

IL-2 Interleukin-2	Hoffman-La Roche (Nutley, NJ) Immunex	AIDS, ARC, HIV, v kombinaci a AZT
Nitrožilní imunoglobulin (lidský)	Cutter Biological (Berkeley, CA)	AIDS v pediatrii, v kombinaci s AZT
IMREG-1	Imreg (New Orleans, LA)	AIDS, Kaposiho sarkom, ARC, PGL
IMREG-2	Imreg (New Orleans, LA)	AIDS, Kaposiho sarkom, ARC, PGL
Imunothiol (diethyldithiokarbamát)	Merieux Institute (Miami, PL)	:AIDS, ARC
Alfa-2 interferon	Schering Plough · (Madison, NJ)	Kaposiho sarkom, spolu s AZT, AIDS
Methionin-enkephalin	TNI Pharmaceutical (Chicago, IL).	AIDS, ARC
MTP-PE (muramyltripeptid)	Ciba-Geigy Corp. (Summit, NJ)	Kaposiho sarkom
faktor stimulující kolonie granuloxytů	Amgen (Thousand Oaks, CA)	AIDS, v kombinaci S AZT
rCD4 (rekombinantí rozpustný lidský CD4 )	Genentech (S. San Francisco, CA)	AIDS, ARC

sloučenina rCD4-IgG-hybridy rekombinantní rozpustný lidský CD4

Interferon alfa 2a výrobce indikace

Genenteoh

Biogen (Cambridge, MA)

AIDS, ARC

Hoffman(Nutley

La Roche NJ )

Kaposiho sarkom, AIDS, ARC, v kombinaci s AZT

SK a F106528 rozpustný T4

Tymopentin faktor nekrosy nádorů, TNF

Clindamycin s Primaquinem

Fluconazole

Šmith, Kline a	HIV infekce
Erench L (Pbilade	aboratories lphia, PA)
Immunobi	ology	HIV infekce
Research	Institute
(Annanda	le, NJ)
Genentec	h	ARC, v kombinaci
( S, S an	Francisco,	s gamma-interfe-
CA)		ronem)
Up john		PCP

(Kalamazoo, MI

Pfizer (New Yor)<, NY)

Pastille (nystatinové pastilky)

Ornidy1

Eflornithine

Squibb C (Princet

Merrell (Cincinn crp. cn, NJ)

Dow ati, OH) kryptokoková meningitis, kandidiáza prevence orální kandidiázy

PCP

sloučenina výrobce indikace

Pentamidine isethionate (IM a IV)

Piritrexim

LyphoMed.

(Rosemont, IL)

Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park, NC)

PC? léčení

PCP léčení pentamidinisethionát pro inhalaci

Spiramycin

Intraconazol

R51211

Trimetrexate

Jiné látky rekombinantní lidský erythropoetin

Megestrol Acetate

Fisons Corporation (Bedford, MA)

Rhone-Poulenc Pharmaceuticals (Princeton, NJ)

Janssen Pharm. (Piscataway, NJ)

Warner-Lambert

Ortho.Pharm.Corp. (Raritan, NJ)

Bristol-Myers (New York, NY)

PCP profylaxe kryprosporidiální průjem hisroplasmosa, kryptokoková meningitis

PCP těžká anemie při léčbě AZT léčení anorexie při AIDS

- 44 sloučenina výrobce indikace úplná enterální výživa

Norwich

Pharmac (Norwic

Eaton euticals h. NY) průjem a malabsorpční syndrom

Je samozřejmé, že možn protilátky proti HIV podle vy proti HIV, s imunomodulátory, vakcínami nejsou vyčerpány sl v předchozí tabulce, avšak v binace s farmaceuticky použi léčení některých příznaků při sti kombinace rekombinantní nálezu s protivirovými látkami protiinfekčními látkami ne|o pučeninami, které byly uvedtifiy ásadě zahrnují jakékoliv komtelnými látkami, vhodnými pro

AIDS.

Praktické provedení vyn jícími příklady, které však n$ vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 álezu bude osvětleno násle mají sloužit k omezení roz u— ahu

Optimalizace produkce lidských monoklonálních protilátek proti HIV-1

Předmětem těchto pokusů minky pro tvorbu a pěstování protilátky mAb proti HIV-1.

bylo zjistit optimální po<.·buněčných linií, produkujících

Metody

Lymfocyty z periferní krve, získané od 74 jednotlivců se seropositivitou HIV byly transformovány při použití E3V. Kultury, produkující protilátky proti HIV byly pomnoženy a několikrát klonovány na ozářených buňkách GK5 při použití vždy dvojnásobného zředění v rozmezí 5000 až 10 buněk/vyhloubení). Pět z uvedených 74 vzorků bylo možno dále zpracovávat klonováním i fúzí. Současně s prvním'klonováním, to znamená 5 až 7 týdnů po založení kultury byla uskutečněna fúze lymfoblastoidních buněk z expandovaných kultur s buňkami heteromyelomu SHM-D33. Hybridy, které byly positivní pro HIV byly klonovány při použití 100 až 1 buňka na jedno vyhloubení. Specifičnost získaných protilátek mAb byla prokazována pomocí zkoušky ELISA, Western blot a RIP.

Výsledky

Samotná imortalizace PBL při použití EBV dala vznik dvěma buněčným liniím, u nichž docházelo k produkci lidských protilátek mAb. Avšak v případě, že byla uskutečněna fúze buněk, transformovaných EBV a buněk SHM-D33, bylo získáno pět hybridních linií, produkujících lidské protilátky mAb. Všechny tyto buněčné linie byly pěstovány po dobu 5 až 12 měsíců.

Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce I, v nož jsou uvedeny isotypy a specifičnost takto získaných protilátek.

		- 46
		T a b	u 1 k a I
číslo	stálé	stálé	isotyp	spec
nemocného	EBV-linie	hybridy
167	žádná	167-7-D	IgGl, lambda	gp41
181	žádná	181-1-D	IgG2, kappa	gp41
240	žádná	240-1-D	IgGl, kappa	gp41
238	238-2	238-2-D	IgGl, lambda	p24
241	241-1	241-1-D	IgGl, lambda	p24

EBV-transformace krevních buněk, následovaná fúzí s heteromyelomovými buňkami jé zřejmě nejúčinnější metodc pro získání lidských protilátek mAb proti HIV-1 a je účir nější než samotná EBV-transfořmace.

Příklad

M-ateriál

V případě této série pokusů se pokusu účastnila dUupina 41 HlV-seropositivních o^ob bez příznaků. Přítomnost protilátek proti HIV-1 v krevním séru byla prokazována bc dodávanou zkouškou ELISA (Genetic Systems) a potvrzena z kcu Western blot při použití zkušebního balíčku Novapath Immunoblot Assay (BioRad). Fenotypy CD4 a CD8 lymfocytů 2 každého jednotlivce byly stane

Leu 3a a Leu 2a (Becton-Dickin při použití přístroje Cytofluorograf II (Ortho). Počet pe riferních bílých krvinek byl Zpracováván s pomocí zařízer

Coulter Counter a diferenciální propočet byl proveden rudňě.

l· o

Žne ušvény při použití protilátel son) průtokovou cytometrií

Postup choroby u jednotlivých nemocných byl sledován při použití imunologického systému pros tanovení stadie onemocnění tak, že nemocní byli rozděleni do čtyř skupin na základě následujících, již dříve stanovených kriterií podle publikace Zolla-Pazner S. a další, Proč. Kati. Acad. Sci. USA, 84:5404, 1987, tato krieria jsou uvedena v následující tabulce:

hodnocení	poměr CD4:CD8	CD4/mm^	lymfocyty/
0	>1,0	>500	1500
1	<1,0	> 500	<1500
2	<1,0	< 500	x 1500
3	<1,0	Z. 500	<1500

Syntetické peptidy, užité pro vyšetření

Peptid s obsahem 23 aminokyselin ze smyčky V3 oblasti gpl20 kmene MN viru HIV-1 (23-mer) byl syntetizován metodou na pevné fázi (Peninsula Laboratories, Inc., Belmont, CA). Peptid má násl-edující řetězec:

TyrAsnLysArgLysArfIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThr LysAsnllelleGly (řetězec č. 2).

Tento peptid byl užit při provádění zkoušky ELISA pro zjištění přítomnosti protilátek, které s tímto peptidem reagovaly.

- 48 Tvorba EBV-transformovaných buněčných linií

Způsob přípravy lidských buněčných linií, produkul cích protilátky mAb proti HIVj-1 byl popsán ve svrchu uve| né publikaci Gorny a další, 1989. Mononukleární buňky z riferní krve byly inkubovány spolu s virem Epstein-Barr, EBV a byly pěstovány po dobu 3 až 4 týdny na mikroplotná] s 96 vyhloubeními. Po vyšetřehí supernatantů kultur na p| tomnost protilátek při použiti svrchu uvedeného 23-meru zkoušky ELISA byly buňky z kultur s positivními supernatl na protilátky pomnoženy, několikrát přeneseny do další k| tury a nakonec dále pomnoženy; v lahvích. Tyto buňky jsou] pak označovány jako lymfoblastoidní buňky.

mie:jh

Ííijnty i{l —

Fúze buněk

Buněčný materiál heteromyelomu (hybrid myš-člověkhj SHM-D33, popsaný v publikaci Teng N. H. a další, Proč. Nařtl Acad. Sci., USA, 80:7308, 198β byl pěstován na Iscovem mpjprostředí, které bylo doplpěa, 2 mM L-glutaminu, 100 jedogramy/ml streptomycinu za difikovaném Dulbeccově živném no 15 % fetálního telecího sé notkami/ml penicilinu, 100 mi vzniku úplného prostředí. Buňky heteromyelomu byly perio ky pěstovány v přítomnosti antibiotika G418 v koncentrac 200 mikrogramů/ml tak, aby bylo možno vyloučit varianty citlivé na neomycin.

10Dva dny před fúzí byly buňky SHM-D33 pěstovány př] koncentraci 1 až 2 x 10° buněk/ml, šlo o logaritmickou rihstovou fázi. Životnost buněk, sledované vylučováním barviffe erythrosin B, byla vyšší než 95 %.

Buňky SHM-D33 byly dvakrát promyty fyziologickým roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem a pak byly smíšeny s lymfoblastoidními buňkami, které byly pomnoženy z počáteční kultury, avšak ještě nebyly klonovány. Buněčný materiál byl smísen v poměru 1 3 a odstředěny. K usazenině byl přidán 1 ml 50% polyethylenglykolu 1300 až 1500 (Sigma Chemicals) po kapkách v průběhu 1 minuty za stálého míchání a směs byla míchána ještě další minutu. V průběhu následujících 5 minut byl buněčný materiál pomalu zředěn Iscoveho prostředím a po dalším odstředění při 200 g, byly buňky opatrně znovu uvedeny do suspenze v úplném prostředí a naneseny na mik.ro4 plotny s 96 vyhloubeními pri koncentraci 8 x 10 buněk na 100 mikrolitrů roztoku v jednom vyhloubení. Následujícího dne byly jako živné buňky přidány peritoneální buňky myši v množství 1 x 10 na každé vyhloubení a kultury byly dále pěstovány v přítomnosti 0,5 mM hypoxanthinu, 0,2 fflikroM aminoprerinu, 16 mikroM thymidinu (HAT) a 1 mikroM uabainu (Sigma Chemicals). Postup byl opakován dvakrát týdně při použití čerstvého úplného prostředí, doplněného HAT. Po dvou ažd třech týdnech byly kultury ve všech vyhloubeních analyzovány na produkci protilátek s použitím svrchu uvedeného peptidu a heterohybridy, produkující protilátky, reagující se svrchu uvedeným 23-merem, byly množeny na plotnách s 24 vyhloubeními. Hybridy, které produkovaly nejvyšší množství protilátek (a IgG), měřeno zkouškou ELISA byly klonovány při použití 100, 25 a (alespoň dvakrát) jedna buňka na jedno vyhloubení.

Detekce protilátek a stanovení jejich vlastností

Supernatanty kultury byly sledovány zkouškou ELISA při použití svrchu uvedeného 23-meru. Plotny Immulon 2 (Dynatech) byly přes noc při teplotě 4 °C povlékány syntetickým peptidem v koncentraci 1 mikrogram/ml, zředěným puf- 50 rem s uhličitanem sodným o pHi 9,6 . Pak byly plotny třikrát promyty a do každého vyhloubení byl přidán supernatant kultury, plotny byly inkubovány $0 minut při teplotě 37 °C a pak byly omyty. Pak byla přidána kozí protilátka proti lidskému IgG, specifická proti řetězci gamma a konjugovaná alkalickou fosfatázou (Zymed Laboratories) a směs byla iíi kubována dalších 90 minut při teplotě 37 °C a znovu promyta stejně jako svrchu. Substrát,\p-nitrofenylfosfát (Sigma Chemicals) byl přidán na 30 minut a pak byla odečtena absorbance při 405 nm při použití odeěítacího zařízení pro mikropLot ny, MR 700 (Dynatech).

Specifičnost vazby protilátky byla stanovena rádi imunologickým srážením RIP. Zkouška RIP byla provedena podle publikace Pinter a další, J. Immunol. Meth., 112:7$5,

1983 při použití 30 mikrogramů lysátu HTLV-IIIB (Organon

Teknika) a/nebo lysátu kmene MN (Advanced Biotechnologie 125 lne . ) , značeným při použití I a Bolton-Hunterova reakč ního činidla (New England Nuclear). Supernatanty kultur byly inkubovány s rozrušeným virem a pak dále zpracovávány podle svrchu uvedených publikací Gorny a další, a Pinter a další.

Analýza lidských protilátek

Isotypy protilátek bylý stanoveny pomocí zkoušky ELISA. Plotny Immulon 2 byly povlečeny při použití 1 mik:'ogram/ml svrchu uvedeného 23-meru a inkubovány spolu se su4pernatanty kultur. Podtyp IgG protilátky mAb byl stanoveni pomocí alkalickou fosfatázou značené myší protilátky mAb i proti čtyřem podskupinám lidského IgG (Zymed Laboratories).

bylo možno provádět zkoušku ELISA obvyklým způsobem na standardních mikroplotnách podle doporučení výrobce.

Tímto způsobem byla zajištěna reakce všech hrotů s obsahem peptidů se supernatanty jednotlivých buněčných linií, které byly podrobeny zkouškám při ředění 1 : 10 v 0,1% Tween-20 v PBS s obsahem 1 % vaječného albuminu a 1 % sérového albuminu Skotu. Pak byly hroty omyty a byla prováděna reakce s kozí protilátkou proti lidskému IgG, konjugovanou s peroxidázou z křenu. Barevná reakce byla odečítána na odečítacím zařízení MR-700 (Dynatech) při 405 nm.

Výsledky

Bylo zpracováno celkem 46 vzorků krve, které byly odebrány 41 HlV-seropositivním jednotlivcům a u všech těchto vzorků byla uskutečněna transformace při použití EBV.

Po 3 až 4 týdnech pěstování bylo v průměru 2,9 % vyhloubení positivních na přítomnost protilátky proti 23-meru smyčky V3, jak bylo možno prokázat pomocí zkoušky ELISA.

Z následující tabulky II je zřejmé, že množství positivních vyhloubení v % je mírně zvýšeno ve skupině jednotlivců s hodnocením 1, avšak nebylo možno prokázat žádný statisticky významný rozdíl, pokud jde o získání positivních kultur od nemocných s odlišným stupněm závažnosti celkového onemocnění

Krátký řetězec mAb bylanalyzován zkouškou ELISA při použití mikroploten, opatřených povlakem králičích ptotilátek proti lidskému řetězci kappa nebo lambda (Dakopatts^ Použitými vyvíjecími protilátkami byly kozí protilátky ptbti lidskému řetězci kappa, konjugované s alkalickou fosfatátpu a kozí protilátky proti lidskému řetězci lambda (Sigma Chemicals ) .

specifických proti řetěze ředěnými supernatanty kult .[ iry ek ;ače:er.ý ikaíha rařiKvantitativní stanovení IgG bylo rovněž uskutečněno pomocí zkoušky ELISA. Plotny byly opatřeny povlakem kozí protilátek proti lidskému IgG gamma a inkubovány se sériově

Vázaný IgG byl pak prokazován i při použití kozích protilá proti lidskému IgG, specifických proti řetězci gamma a z ných alkalickou fosfatázou. Jako standard byl použit čiš lidský IgG, čištěný afinitní phromatografií (Organon Tekfi -Cappel). Plotny byly odečítáhy a z výsledků byla vytvoř standardní křivka při použití i automatického odečítacího zení pro mikroplotny MR-700 (Dynatech Laboratories).

Mapování epitopů

Jemná specifičnost mAb byla prokazována při použiltíí zkušebního balíčku pro mapování epitopů (Cambridge Reseapjch Biochemicals, Valley Stream, New York), který využívá me vyvinuté a popsané v publikaci Geysen a další, Proč. NatL Acad. Sci., USA, 81:3998 - 4002, 1984, postup spočívá v že se na plastických hrotech syntetizují hexapeptidy. Ti způsobem bylo syntetizováno 18 postupně se překrývajícíc hexapeptidů v rozsahu svrchu uvedeného 23-meru a dva dal řídicí peptidy. Tyto peptidy byly zbaveny ochranných skut>

tbm, njto n

í iin, tzie promyty a sušeny podle návodu výrobce. Vzhledem k tomu, komfigurace hrotů odpovídala 96 vyhloubením na mikroplotíě

Tabulka II

Produkce protilátek, specifických proti 23-meru kmene MN, smyčky V3 oblasti gpl2O u E3V-transformovaných lidských lymfocytů hodnocení počet počet počet positivních kultur vyhloubení vyhloubení v %

0	1	510	15	(2,5	%)
1	17	4353	175	(4,0	%)
2	21	7340	171	(2,3	%)
3	7	2880	81	(2,8	%)

Lymfoblastoidní buněčný materiál z positivních vyhloubení byl dále množen na plotnách s 24 vyhloubeními a jednou týdně byly provedeny zkoušky s čerstvým supernatantem kultury na specifičnost protilátek zkouškou ELISA při použití svrchu uvedeného 23-meru. Dvě lymfoblastoidní buněčné linie, 257-2 (ATCC č. CRL 10483) a 258-1 (ATCC CRL 10482), které produkovaly vysoké množství specifické protilátky proti 23-meru byly klonovány při použití vždy dvojnásobného zředění v rozmezí 10 000 až 10 buněk na vyhloubení. Buněčný materiál z vyhloubení s nejnižší hustotou buněk, při níž stále ještě docházelo k produkci protilátek byl dále třikrát klonován při použití 100 až 10 buněk/vyhloubení.

Současně s počátečním klonováním byla uskutečněna fúze obou typů lymfoblastoidních buněčných linií, 257-2 i

258-11 s heterpmyelomem SHM D-33. Ve všech vyhloubeních došlo k růstu hybridních buněk. Po 3 týdnech po uskutečnění fúze bylo prokázáno, že 50 že 183 vyhloubení, tj. 29 %

- 54 vyhloubení s heterohybridy 25742 a 43 ze 48 vyhloubení, tj. 90 % vyhloubení s heterohybridními buňkami 268-11 obsahovalo protilátky proti 23-meru. Z každé uskutečněné fúze bylo množeno 18 klonů, u nichž bylo možno prokázat běžnou zkouškou ELISA nejvyšší něčný materiál byl množen na p koncentraci protilátek, bu lotnách s 24 vyhloubeními.

Produkce protilátek byla sledována každý týden a supernatant z buněk, produkujících nejvyšší množství specifické protilátky a nejvyšší množství IgG byl vybrán pro klonováhí. Heterohybridomy byly klonovány při použití 100 a 25 buněkb /vyhloubení a pak ještě dvakrát při použití jedné buňky n jedno vyhloubení.

Lymfoblastoidní buněčné linie 257-2 (ATCC č. CRL 10 483) a 268-11 (ATCC č. CRL 10482) produkovaly 6,4 a 3, mikrogramů IgG/ml/10⁰ buněk/24 hodin. Příbuzné heterohybr domy, 257-2D (ATCC č. HB 10480) a 268-11D (ATCC č. 10481 produkovaly 20,5 a 11,3 mikrogramů IgG/ml/ΙΟθ buněk/24 holin Bylo prokázáno, že při reakci ELISA reagují protilátky mAb; s 23-merem v případě, že tento_:peptid je vázán na vyhloubení mikrotitračních ploten i při ták nízkých koncentracích, jako je 1 ng/ml, jak je zřejmé z obp. 1.

Specifičnost těchto protilátek mAb byla dále proka ována pomocí RIP, výsledky jsou znázorněny na obr. 2. Obě protilátky typu mAb reagovaly s obalovou bílkovinou gpl20

HIV, kmene MN, avšak nikoliv s gpl20 kmene HTLV-IIIB, což prokazuje specifičnost těchto protilátek né protilátky mAb jsou iso rtbda. V následující tabulce osti dvou EBV-transformova příbuzných heterohybridomu

Bylo prokázáno, že uvedp typu IgG s krátkým řetězcem la: III jsou uvedeny některé vlastn ných rodičovských linií a dvou

Heterohybridomy produkují třikrát vyšší množství IgG v průběhu 24 hodin než EBV-transformované buněčné linie, přestože EBV-transformované linie produkují podstatně vyšší množství než většina EBV-transformovaných buněčných linií, které; byly až dosud v literatuře popsány (Rozbor D. a další, Immunol. Today, 4:72, 1983, Casali P. a další, Science, 234:475, 1985, a Steinitz M. a další, Nátuře 259:420, 1977).

Tabulka III

Vlastnosti buněčných linií, produkujících lidské monoklonální protilátky, specifické pro 23-mer smyčky V3 oblasti gpl20 kmene MN buněčná imortalizace isotyp koncentrace IgG linie

257-2	EBV	IgGl	6,4
268-11	EBV	IgGl	3,8
257-2D	EBV + fúze	IgGl	20,5
2'68-llD	EBV + fúze	IgGl	11,3

mikrogramy/10 buněk/ml/24 hodin.

Aby bylo možno definovat jemnou specifičnost každé protilátky, bylo uskutečněno mapování epitopů při použití překrývajících se hexapeptidů, které se překrývaly pěti aminokyselinami. Každý peptid byl syntetizován ve čtyřnásobném provedení, takže bylo možno provést zkoušky se čtyřmi vzorky současně na jedné mikroplotně. Překrývající se antigenní oblasti a výsledky pokusů jsou shrnuty v tabulce IV.

- 56 Směs sér od seronegatiýních jedinců je za těchto p mínek nereaktivní. Vzorek séra od seropositivního jedince (positivního na HIV v ředění 1 : 1000) reaguje s úrovní n úrovní pozadí se všemi hroty, nejvyšší reakce byla prokáz pro tři hroty v rozsahu oblasti PGRAFYTT, jde o ře tězec č. 3 na vrcholu a na pravé straně smyčky V3.

odad ána

Protilátka mAb 257-2D v ředění 1 : 10, tj. v konc traci 3,7 mikrogramů/ml se silně vázala na dva sousední hexapeptidy, představující zbytky aminokyselin v rozmezí 309 až 315 vlevo od vrcholu smyčky, R-K-R-I-H-I-G, jde o řetězec č. 4. Protilátka mAb 268-11D se v koncentraci 5, mikrogramů/ml vázala na hexapeptid, představovaný řetěze aminokyselin H-I-G-P-G-R, jde řetězec č. 5. V následuj tabulce IV jsou uvedeny překrývající se antigenní oblast které jsou rozpoznávány oběma svrchu uvedenými protilátk typu mAb.

hm cí i

.rni

23, který je Og aú

11D

Uvedené výsledky prokazují, že nejmenším reaktivn peptidem, to znamená jádrem epitopu, který je rozpoznávái|i protilátkou 257-2D je K R I HJ, řetězec č.

uložen ná levé straně konzervovaného hrotu smyčky V3 ničující N- a C-terminální zbytky argininu a glycinu moho rovněž přispívat k uskutečnění vazby. Protilátka mAb 368 se váže na jediný hexapeptid s řetězcem Η I G P G R, jde o řetězec č. 5, který se nachází na hrotu smyčky, a na d^iřpřilehlé N-terminální aminokyseliny.

Tabulka IV

Reaktivita lidského krevního séra a lidských monoklonálních protilátek s hexapeptidy smyčky V3 oblasti gpl2O kmene MN

Ο< ΖΓ

Reaktivita ELISÁ (jednotky absorbance)

hrot č .	řetězec č .	Hexapeptid	HIV+ sérum	HTVs e rum	257-2D	268-11
3	•6	YNKRKR	0,338	0,195	0,256	0,243
4	7	NKRKRI	0,339	0,200	0,288	0,283
5	8	KRKRIH	0,251	0,184	0,259	0,239
6	9	RKRIHI	0,308	0,1831	0,781	0,252
7	10	KRIHIG	0,285	0,1701	0,592	0,179
8	11	RIHIGP	0,302	0,177	0,276	0,135
9	12	IHIGPG	0,257	0,197	0,130	0,132
10	13	HIGPGR	0,269	0,185	0,1561	0,011
11	14	IGPGRA	0,361	0,191	0,163	0,164
12	15	GPGRAF	0,243	0,103	0,208	0,132
13	15.	PGRAFY	0,586	0,237	0,456	.0,346
14	17	FRAFYT	0,582	0,239	0,272	0,288
15	18	RAFYTT	0,658	0,239	0,333	0,350
16	19	AFYTTK	0,257	0,197	0,233	0,222
17	20	FYTTKN	0,384	0,233	0,273	0,274
18	21	YTTKNI	0,362	0,171	0,259	0,259
19	22	TTKNII	0,284	0,191	0,219	0,212
20	23	TKNIIG	0,305	0,198	0,164	0,141

Příklad 3 i

Produkce lidského heterohybridomu bez delší expanze EBV-transformovaných lymfocytů

Metoda

Fúze EBV-transformovaných buněk a buněk heteromye])omů SHM-D33 se obvykle provádí :po 2 až 3 týdnech expanze EBV-imortalizovaných buněk na mikroplotnách s 24 vyhloube nimi. Jde tedy o dobu 5 až 7 týdnů po založení kultury. Cbdobí expanze je však velmi kritické pro produkci protilátky mAb vzhledem k tomu, že větširia, alespoň 90 % vyhloubení se v průběhu této doby stává negativní, pokud jde o produkci uvedené protilátky. Z tohoto důvodu byl zkoušen alternativní postup, při němž byla doba expanze vynechána a fúze byla uskutečněna 3 až 4 týdny po založení kultury. To znamená že vyhloubení ploten s 96 vyhloubeními s obsahem EBV-trarlsformovaných buněk byla sledována na přítomnost protilátky proti HIV-1 3 až 4 týdny po založení kultury. Buněčný materiál ze všech vyhloubení, v nichž se tvořila protilátka proti HIV byl spojen a okamžitě byla provedena fúze s heteromye|lomem SHM-D33 způsobem podle příkladu 2.

Výsledky

PBL od čtyř jednotlivců, s positivním sérem proti HIV produkovaly osm buněčných linií vylučujících protilá proti HIV-1 typu mAb po EBV-transformaci a časné fúzi. Š protlátek mAb bylo specifických proti oblasti p24 a dvě protilátky proti oblasti gp4l HIV-1, jak bylo prokázáno zkou mi RIP a ELISA. Celkem 21 stálých linií od 300 nemocných bylo získáno EBV-transformací a popřípadě fúzí podle pří dů 1 a 2. Toto množství je ekvivalentní 6 až 7 buněčným tku e st škakl a60 podle Friguetovy modifikace Klotzova postupu, tak jak byla popsána ve svrchu uvedené publikaci Frigueta a salších, čímž bylo možno stanovit K^.

Bylo prokázáno, že hodnoty K. pro protilátky mAb -7 ^G -7

257-2D a 268-11D jsou 2,3 x 10 a 5,9 x 10 M. Tyto hodnoty jsou v rozmezí, které uvádějí jiní autoři pro IgG mAb, například ve svrchu uvedené bublikaci Friguet a další, a v publikaci Larsson A. a další, Molec. Immunol., 24:569 až 576, 1987. Hodnoty pro mAb,' produkované lidskou lymfoblastoidní buněčnou linií 257-2 a 268-11 byly podobné hodnotám pro mAb, produkované příbuznými heterohybrodomy 257-2D a 268-11D. Hodnoty K^, které byly svrchu popsány se týkají vazby mAb na 20-mer. Hodnoty těchto mAd pro natývní molekuly oblasti gpl20 mohou být nižší vzhledem k příspěvku celé molekuly bílkoviny k epitopům, s nimiž protilátky typu mAb reagují.

Příklad 5

Neutralizace infektivity HIV

Zkouška s použitím plaků, jíž je možno měřit inhibici infekce HIV u buněk MT-2 byla užita pro zjištění neutraližační účinnosti mAb podle vynálezu v přítomnosti neno v nepřítomnosti lidského komplementu podle publikací C. V. Hanson a další, J. Clin. Micro., 128, 1990 a Harada a další, 1985, Science, 229, str. 563 až 566. Protilátky mAb byly sériově ředěny v 50% prostředí pro provedení zkoušky podle svrchu uvedené publikace Hansona a dalších a v 50% směsi normální lidské plasmy. Směs lidské plasmy byla užita jako zdroj lidského komplementu pro zkoušky, prováděné v přítomnosti komplementu, protilátka mAb a virus byly inkubovány

100 nemocných v případě, zf 20 až 40 ml krve. Při použ liniím odebraným ze vzorků od se od jednoho nemocného užije tí časné fúze, popsané v torfito příkladu bylo ze vzorků od 4 nemocných získáno 8 linií, což je významné zvýšení účinnosti při získávání stálých buněčných linií, které p dukují protilátky.

rmovaných buněk bez expanze dbení je účinnějším postupe

Diskuse

Časná fúze EBV-transfo materiálu z positivních vyhloubeni ,ie ucinne.isím postupeiti: než předchozí postupy pro produkci lidských protilátek t pu mAb proti HIV-1.

Příklad 4

Stanovení afinity monoklonální protilátky konstant lidských proti ly prováděny tak, že supern byly podrobeny zkouškám v 1 am abnrozpuštěn v destilované vodě

M, roztok byl zředěn fysodného s fosfátovým pufrem _ c _ Q ích v rozmezí 10 až 10 M. eny ve stejných objemech a

Stanovení disociačních tek mAb, bylo prováděno při použití zkoušky ELISA způsob podle publikace B. Friguet a další, J. Immunol. Methods, 77:305 - 319, 1985. Zkoušky by tanty kultur 257-2D a 268-11D centraci 0,5 a 0,5 mikrogramů/ml. Svrchu popsaný 20-mer molekulovou hmotností 2702 byl na koncentraci 1 mg/ml, 3,7 x ziologickým roztokem chloridu o pH 7,2 a použit v koncentrac Supernatant a peptid byly smis po 15 hodinách byla výsledná směs přidávána na plotny, které byly opatřeny povlakem 23-rr|eru v koncentraci 1 mikrognam na ml a množství nenavázané protilátky mAb bylo měřeno pomocí zkoušky ELISA. Takto získané údaje byly vyneseny do grfafu hodin při teplotě 37 °C. Pro zkoušky v nepřítomnosti komplementu byly směsi plasmy inaktivovány teplem a protilátky mAb a virus byly za těchto podmínek inkubovány 1 hodinu při teplote 37 C. Redení, při němž bylo 50 % původního viru neutralizováno na bázi počtu plaků bylo vypočítáno interpolací při použití analýzy regerese třetího řádu a na bázi průměrného počtu plaků při jednotlivých ředěních.

Výsledky

V případě, že byly supernatanty 257-2D. a 268-11D inkubovány s kmenem MN HIV po dobu 1 hodiny bez komplementu před přidáním buněk MT-2, bylo dosaženo 50% neutralizace při ředění 1 : 4700 a 1 : 2000, což odpovídá koncentracím mAb 3,0 a 23,0 ng/ml, jak je uvedeno v tabulce 5. Nebylo možno pozorovat žádnou neutralizaci HTLV-IIIB.

V případě, že byly prováděny zkoušky na protilátky mAb z 257-2D a 268-11D při použití citlivější zkoušky, při níž byly protilátky inkubovány s virem 18 hodin v přítomnosti lidského komplementu, bylo dosaženo neutralizace při ředěních 1 : 44 000 a 1 : 41 000, což odpovídá koncentracím mAb 0,3 a 1,1 ng/ml. Ani za těchto podmínek nedošlo k žádné neutrizaci HTLV-IIIB.

Lidské protilátky mAb 50 - 69, specifické pro HIV transmembránovou bílkovinu gp41 a mAb 71 - 31 proti bílkovině jádra p24, tak jak byly popsány v Gorny Μ. K. a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 86:1624 - 1628, 1989, byly zkou šeny současně, přičemž nebylo možno prokázat žádnou neutralizační účinnost ani pro jeden z kmenů HIV.

Tabulko.

V

Neutralizační účinnost proti HIV lidskýc monoklonálních protilátek mAb specifičnost titr neutralizačních protilátek 1 h bez C' 16 h + C'

MN IIIB MN ng/ml

TIB

257-2D	gpl20
268-11D	gpl20
50-69	gp41
71-31	p24

1:4700

1:2000 (3) neg (23) neg

1:44000(0,3) 1:41000(1,1) neg neg

Příklad 6

1:3 neg neg neg

Lidské protilátky mAb proti s různými kmeny virů srr yčce

V3

HIV-1 reagují

Při použití svrchu uved další EBV-transformované buněč produkující lidské protilátky V3 kmene MN viru HIV, oblast g myelomů byly označeny 386-D, 3 311-11D, 391-95D a 412-D. Reak tilátek mAb byly srovnávány s protilátek z 257-2D a 268-11D, v následující tabulce 6.

ených postupů byly vytvoře né linie a heterohybridomy mAb, specifické pro smyčku pl20. Některé z těchto het 91-D, 419-D, 447-52D, 477,tivity některých z těchto reaktivitou svrchu popsaný získané výsledky jsou shr roj rola uty

Tabulka VI

Specifičnost a neutralizační účinnost šesti lidských monoklonálních protilátek proti gpl2O HIV reaktivita ELISA neutralizace k syntetické V3

mAb	epitop jádra	IIIB	MN	SF-2 RF	IIIB MN	SF-2 RF
257-2D	KRIHI (řetězec č.	24)	-	+	+ +	- +	+ -
268-11D	HIGPGR (řetězec č.	5)	-	+	+ +	- +	4- -
386-D	HIGPGR (řetězec č.	5	-	+	+ +	- +
391-95D	X		-	+	+	- +
419-D	X		-	+	+ -	~ -r
447-52D	GPGR (řetězec č.	25)	+	' +		. .+
311-11D	•rkrihigpgrafytt (řetězec č. 26)	-	+	4- —	+
412-D	(konformační)	+	+	+ -	— —

Nebylo stanoveno

Uvedené výsledky vedou k následujícím závěrům.

1) Hrot smyčky V3 je tvořen shlukem epitopů, které jsou rozpoznávány lidskými protilátkami mAb..2) Lidské protilátky mAb zkříženě reakgujá při.zkoušce ELISA s některými nebo se všemi syntetickými peptidy V3 z odlišných kmenů HIV-1.

3) Všechny zkoumané lidské prptilátky mAb proti V3 (MN) r|e utralizují virus MN včetně jedné mAb (257-IID), primárně specifické proti oblasti, ulomené N-terminálně vzhledem 1 nejkonzervovanější oblasti smy čky. 4) Ke zkřížené neutra!

zaci může dojít i v případě záměny dvou z pěti aminokyse

1in v epitopu jádra (například 25 avšak některé změny v epitopu účinnost (například 268-11D ré

-IID reaguje s MN a SF-2) jádra vylučují neutralizaci! aguje s MN a nikoliv s IIIB a 5) zkřížená reaktivita, prokázaná zkouškou ELISA je méně vymezena než zkřížená reaktivi kého pokusu.

ta, měřená v průběhu biolog ícAby bylo možno blíže identifikovat epitop, s nímž reaguje lidská protilátka HuMoAb 447-52D, byly s touto protilátkou provedeny zkoušky na reaktivitu se skupinou 18 hexapeptidů z oblasti smyčky Ý3 kmene MN, představované 23-merem, který byl původně užit pro analýzu. Každý hexapeptid se překrývá se sousedním hexapeptidem pěti aminokyselinami. Hexapeptidy, které byly syntetizovány in šitu na polyethylenových hrotech při použití svrchu uvedeného po stupu Geysena a dalších, (14) supernatanty kultur s obsahem obr. 1 je znázorněno, že tato byly uvedeny do reakce se 29 mikrogramů/ml HuMoAb. N protilátka reaguje se třem hexapeptidy a to HIGPGR, řetězec č. 13, IGPGRA, řetězec 14 a GPGRAF, řetězec č. 15. Podle těchto údajů je pravdě podobné, že epitop, proti němuž je HuMoAb 447-52D záměře je hiGPGRaf, kde velká písmena znamenají jádro epitopu a malá písmena znamenají přilehlé aminokyseliny, které rov: mohou přispívat k vazbě epitopu.

nez

Aby bylo možno stanoví uvedené oblasti je kritická p ethylenových hrotech syntetizp která z aminokyselin z vazbu HuMoAb, byla na po vána skupina hexapeptidů t ho

-yak, že každý ze zbytků v hexapeptidu HIGPGR byl nahrazen každou z 19 aminokyselin. Bylo tedy syntetizováno 115 hexapeptidů a každý z nich byl uveden do reakce s HuMpAb 447-52D v koncentraci mg/ml. Výsledky tohoto pokusu jsou znázorněny na obr..-7 a je pravděpodobné, že první, druhý a pátý zbytek řetězce HIGPGR, může být podstatněji měněn při zachování prokazatalené reaktivity. Substituce, které nelze provést, to znamená C, D a použití E místo I v poloze 2 není možno nikdy nebo je možno pouze vzácně pozorovat v izolátech viru jejichž řetězec byl až dosud analyzován, jak bylo popsáno například v Meyers a další, 1990, Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos a LaRosa a další, 1990, Science, 249 str. 932. Avšak třetí, čtvrtý a šestý zbytek tohoto hexapeptidu není možno pozměnit bez ztráty schopnosti peptidu reagovat s HuMoAb. Tyto údaje napovídají, že jádro epitopu HuMoAb 447-52D je nejpravděpodobněji GPXR a řetězce aminoky selin, sousedící s tímto epitopem pravděpodobně v podstatě nepřispívají k rozpoznávání tohoto epitopu protilátkou.

Příklad 7

Vztah mezi zkříženou reaktivitou a afinitou lidských protilátek mAb k syntetickým peptidům smyčky. V3 z různých kmenů HIV

Reaktivita lidských protilátek mAb, tak jak byly svrchu popsány, byla přímo měřena zkouškou ELISA proti různým syntetickým peptidům (19-mery až 23-mery), které byly naneseny formou povlaku na plotny v koncentracích 1 mikrogram/ml. Afinita protilátky měřená jako disociační konstanta Kd pro vazbu na tyto peptidy byla stanovena tak, jak bylo uvedeno svrchu v příkladu 4.

Získané výsledky jsou bhrnuty v následující tabul

7. Lidské protilátky typu mAb proti smyčce V3 v množství až 4 mikrogramy/ml reagovaly zkříženě se syntetickými tidy v oblasti V3 kmene MN, SjF-2 a RF HIV-1 v průběhu zkj: ky ELISA. Žád-vou reakci nebylo možno prokázat pro peptid V3, odvozený od kmene IIIB HIV-1. Konstanty Kd pro vazbu na tyto peptidy se pohybovaly --------' >

268-11D na RE) až 10 ? M (vaz v rozmezí 2 10 ^υ M (vazba ba 268-11D na MN).

mAb

Tabul

VII epitop jádra

Rela af ini tivní ta vazby reaktivita při pro V3 z

MN SF-2 RF

257-2D	KRIHI řetězec	č.	24	MN=SF2 »RE,	1,8^X	1,6	1,6
IIIB='	j
268-11D	HIGPGR			MN iS:	F2 > RF ,	1,9	1,9	1,3
	řetězec	č .	5	IIIB-i	D
386-D	HIGPGR			MN > S	RF,
	řetězec	Č.	5	IIIB=(	1

Jednotky absorbance při 410 nm.

e ep-UŠILISA

IIIB

1,3 >, 2

Uvedené výsledky vedou k následujícím závěrům.

1) Lidské protilátky mAb specifické pro oblast V3 HIV-1 mají zkříženou reaktivitu k oblastem V3 z jiných kmenů viru, jak je možno prokázat zkouškou ELISA nebo zkouškou na afinitu protilátek. 2) Afinita lidských protilátek mAb k různým peptidům V3 se může měnit o jeden řád i více, 3) rozdíly v afinitě není možno jednoduše vysvětlit na základě řetězce aminokyselin v příslušném epitopu a 4) lidské proti látky mAb'se specifičností k témuž epitopu se liší svou afi nitou k různým peptidům V3.

Příklad 8

Byla produkována další skupina lidských protilátek typu mAb a zkoušena svrchu uvedenými.postupy. Produkované protilátky a jejich vlastnosti, pokud jde o specifičnost a afinitu, jsou popsány v následující tabulce VIII.

Korelace mezi disociačními konstantami a neutralizač ní schopností pěti lidských protilátek mAb byla analyzována Výsledky prokazují přímý vztah mezi oběma uvedenými vlastnostmi , takže podle afinity vazby k 23-meru ze smyčky V3 bude pravděpodobně možno dobře předpovědět účinnost při neutralizaci viru.

•fc.

Η¹

PO

I σ

H

Oq

O σ

a a to ω

H t£> Η í£> Η Η

I I I o to h cn h σ σ

H	H	(-i
Oq	Oq	Oq
O	Ω	Ω

Η' 2 Η

03 03

2 3 θ' Ό σ' a σ a σ

X XXX x xxx

I III i iii

-U

-J

I o

w

0q

O h

σ σ

Cl σ

	ω	PO	PO
tL	co	σ>	a
J 1	O) 1	co 1	o
1 (JI	1 o	1 t—>	1 PO
ΓΟ		μ-»	σ
σ		σ

H	H	HH	l-l
0q	03	0Q	0Q
Ω	O	O	O
CO	·*	i—1	i—¹

|—I JJ) |_ι 1—1

3 σ 03 σ 3 3 σ cl σ σ

CL 0) CL CL c c

Ω	2	Γ-
a	l-l	Η	X
Ω	O	Ω	Ht
a	a	a	X
	o	Ω	Hf
	a	a

iiiii a

HCl ω

03' >

σ

H ω

o r+ <<

Ό o

σ

Η·

ΓίΟ

Ό co a

ι a

ΡΟ φ 03 77 c+ a η· a <

Η·

C+ ►< W cn a

H a

H > H

Vlastnosti lidských monoklonálních protilátek, specifických pro epitopy gpl2O HIV4+ I—¹ΙΌ I σ

ΓΌ

Ο

2	ω	ω	2	2	ω	ΙΌ	ΓΌ	2
ř—*	ω	1—ι	2	2	03	σ>	σ	Η·
10	1—*	(-J	3	3	σ	ω	3	2
1	I	1	1	1	I	I	1	ω
σ	ω	Μ	σ	σ	σ	i—¹	ΙΌ	2
	σι	I—>		ΓΌ		t—1	σ	3'
	σ	σ		σ		σ
								3
								>
								σ
ω	ο	3	2	ο	ο	ο	ο	V.	ω
-	-	-	>3	»		-	-	2	2
03	ω	2		σ	i—·	σ	ΙΌ		Η·
				σ>	ω	ω	ω		0
									Η·
	Η-¹								2
Ο	2	σ	2	ο	ο	ΓΌ	ο	σ	Ď5
-	*	-	>3	-		·»		2
ΓΌ	2	ο		ω	03	ω	ΓΌ	I	—-
ω				ΓΌ	σ		ΓΌ	ΙΌ
									2
				!0					<
2	2	3	2	σ>		σ		3
•3	Η	►3	>3			-	·*	3	3
					3	ω	<3		2

								1—ί
2	2	2	2	2	2	2		ΗΗ
>3	>3	33	Η	ω	3	33		ί—ί

Tabulka VIII - pokračování

I σι <0

Η-¹		ω ω
ηο	2	ΙΌ
	·*
Ο	ω	Ο

2 +-¹ Η⁴ Η—¹

4-3 Ι“3 «* ·< χ

ΓΌ Ο Ο

Ο cn

Ο <5^

C+ ct

Ο

ω

2

03

2

ΓΌ

χ

υ

• X

X

2

x

2

□

Ο

σ

0

α

X

1

X

Η

03

ω

..

ΙΌ

Ρ-

0)

1

X

cra

X

1—'

<<

ct

ο

Ρ-

σ

X

ρ

η

<

-

C

ct

η

C-1.

3

x

3

<

N

3

2

Ρ'

X

Ο

3

O

X

O

Η

X

Ρ

1

O

σ

3

O

X

<

03

Ο

χ

ΟΟ

X

3

p

<<

Η)

Τ

η

C

P-

H

O

ω<

,—i

Ρ-

θ'

0

u-i

0

x<

X

O

.η

η

X

ω

03'

u>

3

ί—)

Ρ-

σ

Ρ-

ο

ct

o

ct

X

ΓΌ

X

<<

4—1

X

<

X

3

03

ί—'

03'

<

3

x;

O

ω

<<

X

Μ

3

pj

<

η

Λ

1-·¹

X

C

3

O

3

O

I—¹

Ρ-

X

03

fl>

<

P-

X

Ο

b

3

O

x<

X

o

ω

CQ

ω

σ

α

cra

3

ω<

3

r-

·—»

X

ο

c

0

p'

O

Μ¹

<<'

Ο

0

Cj.

3

<

Ο

<

O

N

O

ω

--¹

X

0'

3

·-

X

3

X

to

Α

-

0

ο

0

ω

C

O

o

h

Ο

3

<<

C

m<

N<

3

>

X

Η

rs

o

3

X

σ

Η

3

α

o

X

σ

Λ

1—¹

03

C

X

3

ω

to

ζ—V

X

Η

C

ct

P'

3

0

Ρ-

Η

P-

3

00

3

ΙΌ

χ

Ν

0

X

\

>

σι

Λ,

Ρ-

0)

1-

J

O

X

3

X

co

□

0

Ο

I-

3

H-*

Ρ-

C

Ρ-

c<

H

•

<

b

ω

Ν<

0

X

P'

ω

ω<

σ

X

C.

<

X

O<

3

η

J—ι

Η'

ο

Ο

Ξ

X

3

ω

-

Ν

Η

Hl

O

co

Ο

X

Η

2

3

N<

σ>

Λ

X

00

C

H

Ul

<

ο

Η

O

X

ct

<<

3

X

C

X

3

<

b

ΙΌ

ω<

η

Ο

Η

O

P'

σ>

W

Ι-Ι

X

x

C0

Ρ\

ο

Ρ-

>

3

,—i

A

II

3

C

X

3

O

<]

Λ

Ο

3'

<

X

3

Ο

Α

O

3

<1

X

ς

-

<

00

C

Ι-

•

3'

H

Α

•

. X

3

ω

ο

Ο

>

P'

H

Ν

π

O

ω

ΓΌ

X

?

X

ω

σ

ο

C

P-

<

<1

ζ—.

3

;

X

<<'

χ

η

(·

O

Cj.

α

η

(1

1

X

P-

Λ

ο

·

í

c»

3

<

3

C

ř

-

X

3

(13

h

1

3

O

ω

2

3

0

1 '

<

c

C0

--—

ct

c

»

W<

σ

C

c

>

3

X

<1

ω

<

X

<] 1

<

S

<<

σ

<<

ί

1

1—1

-

Cj.

O

Ρ-

Γ

X

3

f

J

X

*

3

o

Ο

O

3

C

τ

)

X

3'

s<

3'

ΙΌ

l·

1.

N

X

σ

3'

<<

ο

►

i

3

H

ι

I-

J\

O

3

ΙΌ

c

]<

-

σ

C

N<

x<

03

O

Η-

Χ-

Ο)

Tabulka VIII - pokračování

I <1 ο

I i

Příklad 9

Příprava rekombinantní protilátky 447-52D

Byla připravena protilátka, v níž variabilní oblast krátkého řetězce obsahuje signální řetězec a řetězec intronu krátkého řetězce heterohybridomu 447-52D, a to jeho variabilní oblasti ve fúzi S fragmentem DNA, obsahujícím krátký řetězec intronu konstatní oblasti lambda 2 člověka a kódovou oblast pro konstantní lambda 2. Variabilní oblast dlouhého řetězce je podobným způsobem odvozena od V-oblasti dlouhého řetězce heterohybridomu 447-52D, k níž je připojen stejný řetězec intronu dlouhého řetězce ve fúzi s fragmentem, obsahujícím krátký úsek intronu lidské konstantní oblastí gamma 1 a kodovou oblast gamma 1 člověka ve formě genomu.

Z buněk heterohybridomu 447-52D byla extrahována celková RNA při použití standardních metod, zahrnujících solubilizaci buněk guanidiniumisothiokyanátem podle Chirgwin a další, Biochem. 18:5294 - 5299, 1979. Skupiny oligodeoxynukleotidových primerů (obr. 1), představující řetězce v rámci signálního peptidu variabilní oblasti a konstantní oblasti lidského krátkého řetězce lambda nebo v rámci variabilní oblasti dlouhého řetězce lambda 1 a stálé oblasti gamma 3 dlouhého řetězce byly syntetizovány standardním postupem s použitím fosforamiditu při použití syntetizačního zařízení pro DNA, Applied Biosystem 381A. Oddělení oligodeoxynukleotidů od pryskyřice bylo uskutečněno působením koncentrovaného amoniaku s následným odstraněním solí na sloupci NAP-5 (Pharmacia) při eluci vodou (oligonukleotidy měly kratší řetězec než 45 baží) nebo na sloupci OFC (Applied Biosystems lne.), v tomto případě byl k eluci použit 20% gonukleotidy měly délku vět výrobců. Celková RNA v množ na reversní transkripci po C při použití enzymu AMV re bylo 200 jednotek enzymu (E si

RL) otě 95 °C a reakční směsi 1 PCR-pufrem (10 mM TRIS HCl yacetonitril (v případě, že oli než 45 baží) podle doporučení štvi 2 mikrogramy byla podrobe dobu 30 minut při teplotě 42 versní transkriptázy, použito a 10 pmolů primerů komplementárního řetězce konstantní ot lasti dlouhého nebo krátkého řetězce v konečném objemu 20 mikrolitrů pufru, obsahujícího 50 mM TRIS HCl o pH 8,2 75 mM KOI, 3 mM MgClg, 10 mM ETT a 20 jednotek RNAsin (Pharmacia). Reversní transkriptáza byla inaktivována působením tepla 5 minut při tepl ly doplněny na 100 mikrolitrů o pH 8,3, 50 mM KOI, 1,5 mM Mg*Cl₂, 0,01 % želatiny a 200 mikromol každého z dNTP), 50 pmolů každého z párovaných merů a 2,5 jednotek Taq-polymerázy (Perkin Elmer/Cetus). Pak byla prováděna PCR-amplifi psaným v Saiki a další, Scienc dalších obdobných publikacích,

Spring Harbor Symp. Quant. Bio Dawasaki a Wang, PCR Technolog tions for DNA Amplification, E NY, str. 89 - 97, 1989, Tung ε 1989. Bylo uskutečněno celkem užití zařízení DNA Thermal Cyc ments), jeden cyklus byl 1 mír nkace v podstatě způsobem, boe 230:1350 - 1354, 1985 a λ jako Mullis a další, Cold 1., 51:263 - 273, 1986, y, Principles and Applicarlich, Ed., Stockton Press další, tamtéž, str. 99 45 cyklů amplifikace při p ler (Perkin Elmer Cetus lne uta při 94 C, dvě minuty °C a 2 minuty při 72 °C, ps.k bylo provedeno čištění p truΪ ři dre<

pokládaných fragmentů DNA, obs ahujících 1400 a 700 párů ba zí (bp) na gelu. Před subkloncváním těchto řetězců DNA v příslušných plasmidech byly ře působením restrikčního enzymu ecori v případě dlouhého řetězce nebo EcoRI a Sáli v případě krátkého řetězce a zísl fragmenty byly čištěny elektrcif orézou na agarosovém gelu těžce těchto DNA rozštěpeny EcoRI v případě dlouhého ane

Řetězec cDNA pro dlouhý řetězec byl klonován v derivátu plasmidu pUC18, do nějž byla zařazena místa působení enzymů Ncol a Notl mezi již existující místa působení enzymů KpnI a BamHI, krátký řetězec byl klonován v plasmidu pUC18. Mnohočetné klony pro tyto řetězce, amplifikované pomocí PCR byly izolovány z DH5-transformovaných buněk E. coli, pěstovaných na LB agarových plotnách s obsahem 50 mikrogramů/ml ampicilinu způsobem podle Maniatis a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982. DNA plasmidu byla z bakterií extrahována z bakterií při použití postupu podle publikace Birnboin a Doly, Nucleic Acid Res., 7: 1515, 1979, a DNA plasmidu s dvojitým řetězcem pak byla podrobena analýze řetězce při použití enzymu Sequenase (United States Biochemicals), a s použitím specifických primerů pro analýzu řetězce, T7 a SP6 (Boehringer Mannheim) podle návodu výrobce. Tímto způsobem byl získán řetězec, který odpovídal lidskému dlouhému řetězci gamma 3 a řetězec, odpovídající lidskému krátkému řetězci lambda.

Jak je zřejmé z obr. 3, bylo syntetizováno osm oligodéoxynukleotidů, představujících primery, které bylo nutno získat, aby bylo možno PCR-amplifikací připravit pět fragmentů DNA. Do všech oligodeoxynukleotidů s výjimkou terminálních, byly uloženy řetězce, odpovídající V-oblasti dlouhého řetězce nebo V-oblasti krátkého řetězce heterohybridomu 447-52D nebo řetězce, komplementární k signálnímu řetězci a k fragmentu intronu, určené ke kombinaci s V-oblastmi heterohybridomu 447-52D a alespoň 15 baží 5'-terminální komplementarity, jak je znázorněno na obr. 3 a 4. Příslušný pár primerů, vždy v množství 50 pmolů byl uveden do reakce s 10 ng DNA plasmidu, představující cDNA pro dlouhý řetězec 447-52D nebo cDNA pro krátký řetězec 447-52D, 2,5 jednotek

Taq-polymerázy DNA, složky a pufry, jichž je zapotřebí k uskutečnění PCR-reakce a pak bylo uskutečněno 25 cyklů PCR amplifikace, přičemž jeden cykl spočíval v zahřátí n^ 1 minutu na 94 °C, na 1 minutu na 55 °C a na 2 minuty na 72 °C. Produkty těchto pěti reakcí byly čištěny elektroforézou na agarosovém gelu a pak byly příslušným způsobe* uváděny do reakce (10 ng každého fragmentu DNA) s párem primeru , terminálními oligodeoxynukleotidy, jak je znázorněno na obr. 3 a 4, s Taq-polymerázou DNA, reakčními složkami a pufry pro uskutečnění PCR-reakce a takto znovu) navázané fragmenty byly amplifikovány pomocí PCR svrchu uvedeným způsobem, provedeno tylo 25 cyklů. Pak byla puso bením restrikčních endonukleáz odštěpena oblast signálníb řetězce a řetězce intronu v so řetězce, užity byly enzymy Hin DNA byla čištěna elektroforézo vána v kompatibilních místech usedství V-oblasti dlouhého dlll a Xhol a amplifikovaná u na agarosovém gelu a klonovektoru p9103, obsahujícího lidskou konstantní oblast gamma 1 a získaného následujícím způsobem, který je také znázor něn na obr. 5. DNA byla čišt na z klonu kosmidu coslg9 podle publikace Flanagan a Rabbi Nátuře, 300: 709 - 713, 1982 a

-amplifikaci konstantní oblast pár primeru (G1 a G2, na obr. byl uveden do reakce s 10 ng D lidské konstantní oblasti gamm použita jako matrice pro P i lidského gamma 1. Příslušhý 1), 50 pmolů každého primerja, NA kosmidu s obsahem exonu a 1, 2,5 jednotkami Taq-polVets,

Rmerázy DNA a pak bylo provedeno 25 cyklů PCR-amplifikace, přičemž při jednom cyklu bylo provedeno vždy zahřátí 1 mi nutu na 94 °C, 1 minutu na 55 °C a 2 minuty na 72 °C. Tak připravený produkt PCR byl rozštěpen působením endonukleá Xhol a EeoRI, čištěn elektroforézou na agarosovém gelu a pak klonován ve vektoru p91O2, uvedenými restrikčními enzymy.

předem rozštěpeném svrchu Jednotlivé klony, představující vektor, obsahující jak variabilní oblast dlouhého řetězce 447-52D, odvozeného svrchu uvedeným způsobem a také lidskou konstantní oblast gamma 1, odvozenou z DNA-genomu PCR-amplifikací byly užity k ověření řetězce DNA kódové oblasti pro rekombinantně modifikovaný 447-52D, jak je zřejmé z obr. 2a.

Rekombinantní vektor pro krátký řetězec 447-52D byl zkonstruován po rozštěpení PCR-amplifikovaného signálního řetězce a intronu, sousedícího s V-oblastí krátkého řetězce, jak bylo svrchu popsáno, působením HindlII a Xbal s následným čištěním vzniklého fragmentu DNA elektroforézou na agarosovém gelu. Tato kódová DNA pro V-oblast byla klonována v plasmidu pSP72/58.2/L16VH/gammalMRC, který bude dále popsán a který byl předběžně rozštěpen enzymy HindlII a EcoRI spolu s fragmentem DNA pro exoh lidské konstantní oblasti lehkého řetězce. Tento druhý fragment byl získán PCR-amplifikací 10 ng DNA plasmidu 208 s obsahem fragmentu po rozštěpení EcoRI/HindlII, zahrnujícího konstantní oblast lidského lambda 2. Příslušný pár primerů (Cl a C2 z obr. 1), a to 50 pmolů každého z primerů bylo uvedeno do reakce s DNA plasmidu, 2,5 jednotkami Taq-polymerázy DNA a pak bylo provedeno 25 cyklů PCR-amplifikace, přičemž v průběhu každého cyklu byla směs zahřáta na 1 minutu na 94 °C, na 2 minuty na 55 °C a na 2 minuty na 72 °C. Produkt reakce, obsahující 620 párů baží byl rozštěpen restrikčními enzymy Xbal a ECoRI a získaný materiál byl čištěn elektroforézou na agarosovém gelu před použitím pro uskutečnění vazby svrchu uvedeným způsobem. Při analýze takto získaných klonů bylo možno prokázat očekávanou uloženou část kódového řetězce pro lehký řetězec o 1,2 kb po rozštěpení enzymy HindlII a EcoRI s následnou elektroforézou na agarosovém gelu. DNA byla získána pěstováním jednotlivých bakteriálních klonů a pak byla uskutečněna analýza řetězce takto získané DNA

R při použití enzymu Sequenase primery T7 a SP6 pro analýzu řit řetězec rekonstruované v sousedství konstantní oblast na obr. 2b. DNA plasmidu, pře presi dlouhého a krátkého ře pedel svrchu uvedené publikac těna pro použití při transfek publikace Maniatise a dalšíchné publikace Birbion a Dolyhc , použity byly specifické řetězce, aby bylo možno ově riabilní oblasti a v jeho lambda, jak je znázorněno dstavující vektory pro exzce 447-52D byla pěstována e Maniatise a dalších a čiš ci buněk savců rovněž podle , a také podle svrchu uvede ).

ttě

Transkripce molekul irr kého řetězce byla uskutečněna né až na to, že obsahují odli globuliny. Výhodným základním globulinů je některý ze svrch' sáhují část LTR-promotoru HIV přední části), místo pro mnohočetné klonování a polyaderylační signál SV40, jak je znázorněno naobr. 6. Plasmid pEE14 (Celltech, Ltd.) je zdrojem většiny řetězců DNA v unoglobulinu dlouhého a krátz plasmidů, které jsou toložšné kódové řetězce pro imurovektorem pro expresi imuncu popsaných vektorů, které ob1 (-117 až +80, vzhledem 1 tomto vektoru, který byl ozna vektoru pEE14,byl odstraněn r Mlul a HindlII. Vektor DNA be byl čištěn elektroforézou na PCR-amplifikovaný fragment DN obsahující 197 párů baží LTRa zakončení Mlul a HindlII (z rů, popsaného na obr. 1 a mat čen pSZ9O15. Promotor CMVIE ozštěpením působením enzymů z promotoru o velikosti 8 kb agarosovém gelu a navázán na A o přibližně 200 párech bajzi, promotoru HIV (-117 až +80) ískaná při použití párů pri|merice DNA 1B4-Vk lidského

Ck/HygB-plasmidu s naroubovaným REP3/HIV-LTR, tak jak byl popsán v publikaci DeMartino Immunoconjugates, and Radioph 1991. Konstantní oblast gamma

A. a další, Antibody, armaceuticals, 4, 829 - 835 1 dlouhého řetězce byla ulože na do vektoru p9015 jako fraginent o velikosti 2,0 kb po štěpení Xbal/EcoRI spolu s nepříbuznou V-oblastí dlouhého řetězce za vzniku vektoru pSP72/58.2/L16VH/gamma 1MRC. Plasmidy byly označeny pHIV447VH v případě plasmidu s obsahem dlouhého řetězce a pHIV447Vlambda pro plasmid s obsahem krátkého řetězce. Oba uvedené plasmidy byly ve svém hostiteli E. coli uloženy před podáním předmětné přihlášky do veřejné sbírky kultur American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville MD, a jsou bez omezení dostupné v souladu s předpisy a požadavky Budapeštské úmluvy. Hostitelské kmeny E. coli, které tyto plasmidy obsahují, jsou v uvedené sbírce kultur označeny čísly 68945 v případě plasmidu pHIV447VHgammal a 68943 v případě plasmidu pHIV447Vlambda/ /Clambda.

Stejná množství vždy 10 mikrogramů plasmidu, obsahujících kódový řetězec pro dlouhý a pro krátký řetězec byla užita k transfekci při použití standardního srážení fosforečnanem vápenatým, byly použity lidské buňky 293 podle svrchu uvedené publikace DeMartino J. A. a další, s výjimkou současné transfekce s kódovým plasmidem pro HIV-1 TAT, v tomto případě nebylo nutno provést transaktivaci a tak dosáhnout vysoké úrovně transkripce vektoru pro expresi HIV-1 LTR. Supernatanty kultur byly sledovány, například provedením zkoušky ELISA na pevné fázi, tak jak bude dále podrobněji popsáno, prokazována byla sekrece imunoglobulinu IgGl, obsahujícího lidský krátký řetězec lambda.

Byla vyvinuta zkouška ELISA pro kvantitativní stanovení množství rekombinantní protilátky 447-52D, k jejíž expresi došlo v upraveném růstovém prostředí v savčích buňkách. Plotny s 96 vyhloubeními Immulon-2 (Dynatech Labs), byly přes noc opatřeny povlakem roztoku monoklonální myší protilátky proti stálé oblasti lidského řetězce lambda v koncentraci 10 mikrogramů/ml (číslo v katalogu 05-410

Zymed Laboratories, lne.) ve sodného při teplotě 4 °C, pa vým albuminem skotu (BSA) v 37 °C. Po opakovaném promytí (v upraveném prostředí s obs 447-52D nebo standardní lids Chemical) zředěny v PBS s ob ní a inkubovány 1 hodinu při vény standardní kalibrační k ί, ridu sérofyziologickém roztoku chlo k byla reakce blokována 1%

PBS celkem 1 hodinu při teplotě při použití PBS byly vzorky ahem rekombinantní protilátky ké protilátky lambda/IgGl, Sigma sáhem 1 % BSA ve dvojím proyedeo, teplotě 37 C. Pak byly př:. řivky při použití koncentrač

IgGl v rozmezí 7,8 až 500 ng/ml. Vázaný lidský IgGl byl kazován ve vzorcích s objemem 50 mikrolitrů při ředění 1 myší monoklonální protilátky gované s peroxidázou z křenu prae pro:400 proti lidskému IgGl Fc, korjju(číslo v katalogu 05-3320,

Zymed Laboratories, lne.) v PBS s obsahem přibližně 1 %

Po inkubaci jednu hodinu při mytí bylo prokázáno množství teplotě 37 ^UC a následném p vázaného konjugátu přidánín

BSA.

ro1 mM kyseliny 2,2 -azin-bis($-ethylbenzthiazolin-6-sulfqnové, v 0,1 M citrátu sodném o pH 4,2 s obsahem 0,03 % peroxidu vodíku, inkubace trvala 20 minut při teplotě místností. Adsorbance ve vyhloubeních byla stanovena odečítacím zařízením pro plotny ELISA (Bio-Rad, Ir.c.) při 414 nm. Alternativně byla prováděna zkouška ELISA povlakem peptidů s 26 zbytky MN. Tento peptid (NleCSYNKRKP č. 1) byl syntetizován metodo na pevné fázi na plotnách na bázi řetězce izolátů kme IHIGPGRAFYTTKNIIGCS, řetěze u Fmoc na pevné fázi při poně užití předem aktivovaných pentafluorfenylesterů při akti vaci hydroxybenzyltriazinem. PÍ otny Immulon-2 byly přes no opatřeny povlakem peptidů, který byl použit v koncentrač mikrogram/ml s následným bl okováním působení 1% fetáln ího séra skotu v PBS. Detekce vázané protilátky 447-52D byla prováděna svrchu uvedeným způ sobem. Protilátka, která byla vylučována lidskými buňkami 2Θ3 po transfekci na základě přechodné exprese, pak byla č

í.štěna chromatografii s pouk itím standardní bílkoviny A, prováděnou podle publikace DeMartino J. A. a další, tak jak byla svrchu uvedena).

Koncentrace rekombinantní protilátky 447-52D byla stanovena svrchu popsanou zkouškou ELISA a byla pak zkoušena na svou účinnost průkazem schopnosti neutralizovat infektivitu určitých serotypů HIV-1.

Následující zkouška byla uskutečněna tak, aby bylo možno kvantitativně vyjádřit neutralizaci bezbuněčného viru HIV-1 a také inhibici šíření této infekce od buňky k buňce, zkouška byla uskutečněna stanovením doby přežívání buněk po vystavení kultury působení protilátky a viru po dobu 7 až 8 dnů. Bylo připraveno sériové ředění zkoumané protilátky v prostředí pro růst buněk (RPMI 164.0 + 10% fetální telecí sérum) tak, že následující ředění bylo vždy dvojnásobkem ředění předchozího a vzorky po 100 mikrolitrech byly uloženy do vyhloubení plotny s 96 vyhloubeními (Costar Corp.). Pak bylo do každého vyhloubení přidáno 100 mikrolitrů zásobního roztoku viru (připraveného z chronicky infikovaných buněk H9 nebo z nově připravených chronicky infikovaných buněk FDA/H9, živné prostředí chronicky infikovaných buněk, 'pěstovaných 3 dny bylo užito při hustotě 2 x 10 buněk/ml po vyěeření, ředění na 10-nasobek předchozího ředění zásobního roztoku viru, který způsobí uhynutí všech buněk MT-4 v průběhu 7 dnů se volí jako zkoumaná dávka viru). Pak se směs viru a protilátky inkubuje 1 hodinu při teplotě 37 °C. Do každého vyhloubení se přidají buňky MT-4 v množství 1 χ 10⁴ buněk/vyhloubení v 50 mikrolitrech živného prostředí a plotny se inkubují 7 dnů při teplotě 37 °C, po této době se zkouška ukončí. Koncentrace protilátky v posledním ředění, jímž je možno zabránit uhynutí buněk MT-4 se považuje za koncovou neutralizační hodnotu pro protilátku.

Výsledky neutralizační zkoušky jsou shrnuty v následující tabulce IX a prokazují, že účinnost rekombinant ní lidské protilátky 447-52D j protilátky, odvozené od hetero ze sledovaných serotypů viru H prokazuje, že rekombinantně zk jichž expresi dochází při zach oblastí lambda a gamma-1 nebyl e stejná jako účinnost lidsxé hybridomu 447-52D pro každý IV-1. Tento výsledek zřejmě onstruované protilátky, k j ování konstantních lidských / modifikovány až do té mír/, těchto protilátek se smyčkou aby došlo k porušení interakcí V3 PND, takže si tyto rekombinlantní protilátky uchovávají biologickou účinnost nativní protilátky.

a IX

Koncový bod neutralizace v mikrogramech/ml při zkoušce in vitro na uhynutí buněk MT-4 isolát HIV-1 rekombinantní proti Látka 447 heterohybridom

447 isolát HIV-1 IIIB MN

AL-1

SF-2

DU 6587-5 DU 7887-7 WMJ-2 RF

SF-162

3,78	1,29^X
3,19	0,37
3,09	0,15
3,04	0,04
(3,09	0,62
0,37	0,78
(3,78	1,35
nd	0,62
nd	1,98 +

mikrogramů DNA plasmidu pHIV/447V_T,/Cgammal, tak n

jak je znázorněn na obr. 5, s obsahem V-oblasti protilátky r-447 bylo rozštěpeno působením restrikčních endonuleáz HindlII a Xhol. Fragment oblasti V dlouhého řetězce 447, obsahující přibližně 800 párů baží (bp) byl čištěn elektroforézou na gelu s obsahem 0,8 % agarosy (připraven v TAE, mM TRIS baze, 1 mM EDTA, o pH 8,0, kyselina octová do pH 7,4), odštěpený fragment DNA byl užložen do dialyzační trubice s průměrem 2 cm (BRL) s obsahem co nejmenšího objemu TAE a pak byla uskutečněna elektroeluce DNA elektroforézou, prováděnou 30 minut při 150 V. Výsledný roztok DNA byl z dialyzační trubice odstraněn a dvakrát extrahován směsí fenolu a chloroformu, pak byla DNA koncentrována srážením působením ethanolu a znovu uvedena do suspenze v pufru TE (10 mM TRIS HC1, 1 mM EDTA o pH8,0).

Obdobným způsobem bylo 50 mikrogramů DNA plasmidu pEE12/58.2L16V_U/Cgammal, obsahujícího promotor CMVIE, transrl kripční jednotku genu GS a jako značení gen pro odolnost proti ampicilinu rozštěpeno působením restrikčních endonukleáz HindlII a EcoRI. Fragment DNA vektoru o 7087 bp na bázi pBR322 byl čištěn svrchu uvedeným způsobem. Přibližně 2 mikrogramy tohoto fragmentu DNA bylo navázáno na přibližně 0,9 mikrogramů fragmentu DNA o velikosti 800 bp z plasmidu pHIV/447Vj_j/Cgammal, který byl popsán svrchu a byla přidána jedna destina objemu desetinásobné koncentrace pufru pro vazbu (650 mM TRIS-HC1, 50 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 10 mM ATP, o pH 7,5), mimoto bylo přidáno 25 jednotek T4-DNA-ligázy (Boehringer Mannheim). Směs (při konečné koncentraci DNA 28,9 ng/ml) byla inkubována jednu hodinu při teplotě místnosti, aby mohlo dojít k vazbě fragmentů DNA, pak byla ligáza inaktivována působením tepla po dobu 5 minut při teplotě 55 °C, reakční směs byla extrahována směsí fenolu a x = geometrický průměr titru + = primární kultury makrofágů a monocytů v množství 2xlC buněk/vyhloubení mikrotitrační plotny byly pěstovány tak,.že čerstvé prostředí 12, 14 a 21. Upravené živr bylo přidáno ve dnech 5, £ é prostředí bylo podrobeno zkouškám na přítomnost antjigenu p24 jádra viru pomocí zkoušky ELISA (Coulter Imriunology, Hialiah, FL) , ve dni 24 byly buňky z každého vyhloubení rozrušeny a podrobeny téže zkoušce. Koncový bod byl stanoven jako poslední ředění protilátky¹, které zabránilo přítomností p24 v kultuře buněk.

nd = nebylo provedeno.

Příklad 10

Byl zkonstruován systén právu velkých množství rekombi systému pro expresi bylo využi kripci· z cytomegaloviru (CMVIH byla užita syntetáza glutamint tento systém pro expresi je p odlišné buněčné linie savců,

Bebington a další, Biotechnol

Základní vektory, pEE12 a pEEG Celltech, Ltd. a byly použity rý byl označen p63.79r447 a by ci peptidů imunoglobulinů s dl kromě produktu genu GS. Při kc expresi r447 bylo využito již torů, které obsahovaly řetěze pro expresi a použit pro přinantní protilátky 447. V tomto to časného promotoru pro thans ), jako označení pro selekdi (GS) v amplifikační kazetě oužitelný pro různé navzájem j|ak bylo popsáno v publikac cjgy, 10, 169 - 175, 1992.

byly získány od výrobce pro vytvoření plasmidu, kt 1 schopen zajistit transkr^pouhým i s krátkým řetězcem nstrukci tohoto vektoru pro existujících základních vek pro odlišné imunoglobuliny chloroformu a DNA byla koncentrována srážením ethanolem.

Pak byla DNA znovu uvedena do suspenze v dl-^O a pak byly přidány restrikční endonukleázy EcoRI a Xhol po úpravě roztoku na koncentraci pufru podle doporučení výrobce. Po inkubaci jednu hodinu při teplotě 37 °C byla rozštěpená DNA čištěna elektroforézou na 0,8% agarosovém gelu svrchu uvedeným způsobem. Požadovaný fragment o 7887 bp, získaný vazbou fragmentů DNA byl z gelu vyříznut a DNA byla izolována elektroelucí a koncentrována srážením ethanolem svrchu uvedeným způsobem. Postup, který byl označen jako cyklus LDP a je znázorněn na obr. 8, spočívá v tom, že se fragmenty DNA navzájem naváží, rozštěpí působením restrikčních enzymů a pak se čistí. Tento cyklus byl použit ke zkrácení doby, jíž je obvykle zapotřebí pro konstrukci složitějších plasmidů jako vektorů.

Přibližně 50 mikrogramů DNA každého z obou plasmidů (pHIV/447V_L/Clambda a pEE12/58.2L15V_H/Cgammal), z nichž jeden obsahoval krátký řetězec 447 lambda o velikosti 1200 bp a druhý obsahoval konstantní oblast lidského imunoglobulinu gamma 1 a promotor CMVIE se 4158 bp fragmentu DNA, bylo rozštěpeno působením restrikČních enzymů HindlII a EcoRI nebo Xhol a HindlII. Oba tyto fragmenty DNA byly čištěny elektroforézou na 0,8% agarosovém gelu s následnou elektroelucí, jak bylo popsáno svrchu. Vazba tří fragmentů DNA byla připravena při použití svrchu uvedených dvou fragmentů DNA (18,8 mn HindlII.RcoRI) a svrchu získaného fragmentu DNA o velikosti 7887 bp, tento fragment byl použit v množství 500 ng. Reakční směs, obsahující konečnou končen traci.DNA 11,85 mikrogramů/ml a 5 jednotek T4-DNA-ligázy v obvyklé koncentraci pufru pro vazbu, jehož složeni bylo uvedeno svrchu, byla inkubována jednu hodinu při teplotě místnosti a pak byla zředěna v poměru 1:5, načež byl mikrolitr této směsi použit ního kmene E. coli HB101 (BRL)¹ pro transformaci kompetentpodle návodu výrobce. Trarsformované kmeny byly podrobeny! selekci na plotnách LB-agsru s obsahem 50 mikrogramů/ml la extrahována pro vyhodnocení rekombinantního plasmidu, jak Tento plasmid pro expresi byl kódové řetězce pro dlouhý řetě řetězec lambda 447, kazetu prc ní, kterým je gen pro odolnost v těsném sousedství kód pro po ampicilinu (Sigma) a DNA bypřítomnosti požadovaného je znázorněno na obr. 7. označen p63.79r447 a obsahúje zec gamma 1 447, pro krátký selekci GS a selekční znaqeproti ampicilinu a mimoto čátek replikace.

Svrchu popsaný vektor pEE12/58.2L16V_U/Cgammal byl

Π který byl popsán ve svrchu další. Po rozštěpení působě vektor pEE12 a vektor pSP72 zkonstruován z vektoru pEE12, uvedené publikaci Bebington a ním enzymů HindlII a EcoRI byl (Promega, lne.) obsahující V-oblast dlouhého řetězce hume nizované protilátky 58.2 spojen fúzí s konstantní oblastí gamma 1 lidského původu v míst coli. Pak byly identifikovány PEE12/58.2L16V_H/Cgammalt. Tato štěpena působením enzymu Xhol dlouhého řetězce byla oddělena těžce se stále připojenou větš verze lidské kódové oblasti Cg fikací při použití oligonukleo coslg9 jako matrice podle publ Nátuře 300, 709 - 713, 1982. P nukleotidy G1 a G2 z obr. 1, to primerů bylo navázáno na 10 exonů lidské konstantní oblast -DNA-polymerázy a pak bylo pro ě Xbal z transformantů E. klony, obsahující plasmid DNA plasmidu pak byla roza EcoRI, oblast Cgammalt od V-oblasti dlouhého řeí částí plasmidu. Zkrácená ammal byla získána PCR-amplitidů G1 a G2 a klonu kosmiqu ikace Flanagan a Rabbits, říslušný pár primerů, oligcto 50 pmolu každého z těchng DNA kosmidu s obsahem i gamma 1, 2,5 jednotek Tacvedeno 25 cyklů PCR-amplifikace, 1 cyklus spočíval v zahřívání 1 minutu na teplotu na teplotu 94 °C, 1 minutu na teplotu 55 °C a 2 minuty na 72 °C. Produút PCR byl rozštěpen působením enzymů Xhol a EcoRI, čištěn elektroforézou na agarosovém gelu a pak klonován v plasmidu pEE12/58.2L15V,,-části vektoru. Jednotlivé

Π klony, představující vektor s obsahem variabilní oblasti dlouhého řetězce 447 a zkrácené verze konstantní oblasti lidského gamma 1 byly identifikovány a izolovány.

Výsledný plasmid p63.79r447, obsahující kódové oblasti pro dlouhý řetězec i pro krátký řetězec lidské monoklonální protilátky 447 byl ve svém hostiteli E. coli uložen před podáním předmětné přihlášky do veřejné sbírky kultur American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD a je přístupný bez omezení v souladu s podmínkami a požadavky Budapeštské úmluvy. Hostitelský kmen E. coli, který obsahuje plasmid p63.79r447 byl do sbírky zařazen pod číslem ATCC 68944.

Příklad 11

Transfekce buněk NS/O

Buňky NS-0 byly udržovány v exponenciální fázi růstu v živném prostředí, které bylo tvořeno Iscoveho minimálním základním prostředím, doplněným 10 % fetálního séra skotu, inaktivovaného. teplem a 4 mM glutaminu, buněčný materiál byl udržován při teplotě 37 °C ve vlhkém inkubátoru v přítomnosti 5 až 6,5 % oxidu uhličitého.

Plasmid pro transfekci byl linearizován rozštěpením působením restrikčního enzymu v jediném místě. Toto místo bylo s výhodou uloženo vně cizorodého genu, k jehož expresi mělo dojít, to znamená, v řetězci vektoru..Po rozštěpení byla DNA deproteinizována extr směsí fenolu a chloroformu v trakcí chloroformem, pak byla podmínek v laboratoři pro bio konečné koncentrace 0,2 až 0,4 ethanolu. Pak byla DNA znovu u ní destilované vodě v koncentr pb lp

Tato DNA pak byla okamžitě pou^ -20 °C až do použití.

akcí fenolem, pak extrakcí měru 1:1a nakonec exDNA vysrážena za sterilních gické postupy při použití

M chloridu sodného a 70% vedena do suspenze ve steriL aci 1 mikrogram/1 mikrolitr ita nebo byla zmrazená na

Při provádění transfekc tura buněk NS/O se známým počt „ 7

Bylo užito celkem 1 x 10 živo s byla použitá zásobní kulem životaschopných buněk, taschopných buněk na jednu kyvetu pro uskutečnění transfekce. Buněčný materiál byl nejprve oddělen odstředěním při 3000 g po dobu 5 minut přjí teplotě místnosti, usazenina buněk byla dvakrát promyta sterilním fyziologickým roztokem chloridu sodného s fosfá tovým pufrem, PBS, a pak byla znovu uvedena do suspenze v

PBS v koncentraci 10 buněk na

800 mikrolitrů. Suspenze bu něk byla od tohoto okamžiku uložena do ledu. 10^z buněk by lo přeneseno opatrně do kyvety (BioRad) se vzdáleností me zi elektrodami 0,4 cm za sterilních podmínek v laboratoři pro provádění biologických pokusů. Pak bylo k buněčnému meinearizované DNA plasmidu ještě 5 minut ponechána v teriálu přidáno 40 mikrogramů ve formě roztoku a kyveta byla ledu. Před otevřením pórů působením elektrického proudu byla vnější strana kyvety otřena do sucha a pak byla kyveta uložena do držáku zařízení BioRad Gene Pulser. Toto zařízení pak bylo nastaveno na 3 puls. Bylo užito dvou po sobě následujících pulsů. Pak byla kyveta uložena do ledu na dobu 2 až 5 minut, načež byl buněčný materiál přenesen do 30 ml modifikovaného růstového prostředí, které obsahovalo místo svrchu uvedených 4 mM glutaminu pouze 1 mM glutaminu ve sterilní zkumavce pro jedno použití s objemem 50 ml. 10 ml buněčné suspenze z původních 30 ml bylo uloženo do mikrotitrační plotny s 95 vyhloubeními, na každé vyhloubení bylo užito přibližně 100 mikrolitrů suspenze. 10 ml buněčné suspenze ze zbývajících 20 ml bylo zředěno 10 mililitrů modifikovaného živného prostředí a rozděleno do dvou mikrotitračních ploten s 95 vyhloubeními, přibližně 100 mikrolitrů na jedno vyhloubení. Posledních 10 ml buněčné suspenze bylo zředěno 30 ml modifikovaného růstového prostředí a rozděleno do čtyř mikrotitračních ploten s 95 vyhloubeními přibližně po 100 mikrolitrech na vyhloubení. Tyto plotny pak byly inkubovány přes noc v inkubátoru s vlhkým prostředím při teplotě 37 °C v přítomnosti 5 až 6,5 % oxidu uhličitého.

Prostředí pro selekci

Pro selekci bylo použito živné prostředí s následujícím složením:

Iscoveho minimální základní prostředí, prosté glutaminu (Sigma) % dialyzovaného fetálního séra skotu (Hyclone) lx nukleosidy . . xx lx asparagm ^x 50x zásobní roztok nukleosidů:

mg adenosinu 35 mg guanosinu 35 mg cytidinu 12 mg thymidinu.

Složky roztoku byly získány od Sigma s čistotou, vhodnou pro použití v buněčných kulturách. Směs byla doplněna na 100 ml sterilní dest:

sterilizován filtrací přes fil 0,1 mikrometru a skladován při s objemem 10 ml.

ilovanou vodou. Roztok byl trační jednotku s otvory teplotě -20 °C po podílecl na 100 ml sterilní destilovase do každého vyhloubení mi ími přidá 100 mikrolitrů pro inkubují v inkubátoru s 37 °C v přítomnosti 5 až 6 ž vyrostou kolonie, což trvjá zapotřebí přidávat další yhloubení počnou vysychat h 3 až 4 dny. Vyhloubení, v je možno rozeznat podle Jmto okamžiku se materiál ve zkoušek, odstraní se 50 až do vyhloubení se doplní pro ržen růst životaschopných

XX lOx asparagin: užije se 600 mg asparaginu né vody, roztok se zfiltruje přes filtrační jednotku ε otvory 0,1 mikrometru a skladuje při 4 °C.

Selekce hodin po transfekci se do každého vyhloubení mikro titrační plotny s 96 vyhlouben středí pro selekci a plotny se vlhkým prostředím při teplotě oxidu uhličitého tak dlouho, a přibližně 3 až 3,5 týdnů. Není viny s výjimkou případů, kdy v Plotny se sledují v intervalec nichž počnou vyrůstat kolonie, tvorby žlutého zabarvení, v to vyhloubení odebere k provádění 100 mikrolitrů supernatantu a středí pro selekci, aby byl ud klonů.

i89

Příklad 12

Při provádění první zkoušky byla čištěna neutralizační protilátka proti HIV-1 podána nitrožilně šimpanzovi v dávce 36 mg/kg. Po dalších 24 hodinách byla šimpanzovi podána varianta HIV-1 Illb, použit byl 75násobek infekční dávky pro šimpanze. V době podání viru bylo možno prokázat v krevním oběhu šimpanze titr neutralizační protilátky proti viru 1 : 320. Virus byl současně podán také kontrolnímu šimpanzovi, který nebyl předběžně ošetřen.

V následující tabulce X jsou uvedeny výsledky této zkoušky. Kontrolní šimpanz (x 39) začal po třech týdnech po podání viru jevit známky infekce, zvláště bylo možno izolovat virus z mononukleárních buněk periferní krve, PBMC. Po 6 týdnech po podání viru se vytvořily protilátky a po dobu dalších 72 týdnů pozorování bylo možno v krvi prokázat protilátku a také virus. Na druhé straně šimpanz (x289), jemuž byla podána protilátka byl prostý příznaků virové infekce. U tohoto šimpanze, nebylo možno prokázat v PBMC pomocí PCR-reakce žádnou nukleovou kyselinu, specifickou pro použití virus.

Tabulka X Ochranný účinek monoklonální protilátky³ proti smyčce V3, podané před podáním viru σ' tn uj nj -ř- ro oo -> o σ'

UJ

NJ

NJ NJ NJ t—‘ ť— t-* t-*

CO.Í-OP.Í-NJOttCt-ř-UNJH

<10 <10 <10 <10

ΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛ<>ΛΛ 1J U Λ

I-¹ H· h-¹ h- h-¹ A +- t— KHHHMHNCSNiMH O ©© OOOOOOOOOOOOOOOO

O + + + + lili

I I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I d I tra

I I I I I I I I I I I I I I I I I I Ί I I a I

Ό rt	w
O <<' CL Cb P' 3
3 <<	vx
H'	H·
n	3
< o	Ό
H·	P
3	3
C	N
σ Cl*	*·
T5 H·	Cj.
3 «Π-	o
Ο 3	3
rt	c
H- 3 (—' o	. N<
P> C	σ
<*+ Čť	<<
·	I—¹
<< O n c 'M	P Ό O O. P' 3 P
3 O 13	O)
0 Ul H)	3
rt rt CQ	0
H- O >	rt
3	H·
I 3 P	t-¹
H	P'
< σ	ct
1 1—'
H-¹ O rt	P
Cb	T3 3< O a n
< H·	o
H· N	CL
3 O	P'
C	3
OP	H'
O O T) 35	3 < H· 3 C
3 O
O 3	X
t-b	ΓΌ
< «	03
Η· (fl	©
3 Ό C Φ P O

Tabulka X - pokracov

P'

H'

I <0

I-'

Poznámky k tabulce X:

a

Protilátka C-betal byl fií při použití protei 1 po podání protilátky byl získán od Larry Ar (National Cancer Insti podání bylo stanoveno tak jak byla uvedena s za podmínek, které vyh vějsí než podmínky, st Institutes of Health p in čištěna afinitní chromatoferau A. Virus byl podán ve dn. šimpanzovi x289. Použitý virus zhura a Peter Fischingera ute) a jeho množství v okamžiku bodle publikace Emini a další, vrchu. Šimpanzi byli chován:, ovovaly nebo byly ještě příznianovené United States National

Ό péči o laboratorní zvířaz

a.

Virus byl podán nitrožilně, jak bylo uvedeno svrch.

Titr protilátky, neutr v buněčné kultuře při způsobem podle publikab Množství viru, užité v viru, které bylo užito převrácenou hodnotu ne dosáhnout účinné neutr

Protilátky proti HIV-1 při zkoušce ELISA a Westeriji blot byly stanoveny podle publikace Emini a další uvedené svrchu. ( + ) znamená positivní reakci ELIS^. a mnohočetné pásy při zkoušce Western blot. (+/-) znamená reaktivní pás při zkoušce Western blot po^ze pro gpl20 a negativní zkoušku ELISA. (-) znamená Negativní zkoušku ELISA a žádný reaktivní pás při zkoušce Western blot.

al izující virus byl stanoveip boužití varianty HIV-1 Illb e Robertson a další, 14. pokusu bylo totožné s množ u šimpanzů. Hodnoty uváděj jvyššího ředění, jímž je mo alizace viru.

tvím no

Izolace viru byla prov byly pěstovány in vit bděna tak, že PBMC šimpanze při použití čtyř postupů:

ro

1) PBMC šimpanzů byly pěstovány současně se stejným počtem mitogrnem aktivovaných lidských PBMC v živném prostředí s obsahem. IL-2 a DEAE-dextranu.

2) PBMC šimpanzů byly aktivovány při použití fytohemaglutininu PHA a pak pěstovány jako v odstavci 1).

3) PBMC šimpanzů byly stimulovány PHA a pak byly pěstovány samy o sobě v prostředí s obsahem IL-2.

4) PBMC šimpanzů byly pěstovány současně se stejným počtem aktivovaných lidských PBMC v prostředí, které bylo doplněno PHA a IL-2.

V každém z těchto případě obsahovaly kultury 1 x 10 buněk šimpanzů v objemu 10 ml. Kultury byly inkubovány při teplotě 37 °C v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého celkem 4 týdny. Pak byly supernatanty podrobeny zkouškám na přítomnost antigenu p24 HIV-1 v týdenních intervalech. Růst viru, stanovený kteroukoliv z uvedených metod byl považován za positivní izolaci viru.

Přítomnost nukleových kyselin, specifických pro PBMC šimpanzů byla stanovena pomocí PCR-reakce. DNA byla získána z PBMC inkubací vzorků buněk v 10 mM tris HCl o pH 8,3,.1,0 mM EDTA o pH 8,0, 0,5 % SDS, 150 mikrogramů/ml proteinázy K celkem 50 minut při teplotě 60 °C. Po extrakci směsí fenolu a chloroformu byla DNA srážena ethanolem. Pro PCR-reakci bylo užito 1 až 3 mikrogramů DNA. Každá z reakčních směsí obsahovala kromě DNA ještě 1,5 mM MgClgj 10 mM tris HCl o pH 8,3, 50 mM KC1, 0,032 mM každého z dNTP, 50 ng každého primeru a 1,0 jednotek Taq-polymerázy. Pro PCR-reakci bylo užito vždy 1,5 mikromolu DNA. Pokud jde o priméry, byl užit specifický pár primerů SK38/39 pro HI akčních cyklů, při kažjl 1,5 minuty zahřátí na tí na 56 °C. Po ukonč produkt prokazován hyb Citlivost PCR-zkoušky fických kopií HIV-1 na

ND = nebylo provedeno.

/-1 gag. Bylo provedeno 35 eém cyklu bylo uskutečněno 94 °C a pak na 3 minuty zah i reakce byl amplifikovaný idizací při použití sondy jyla stanovena jako 10 spec vzorek DNA.

na aen

BK19 :lPříklad 13 dle ipek lát·

Po počátečních zkouškách, provedených způsobem po příkladu 10 byla provedena da ší zkouška na ochranný úči protilátky, neutralizující HIV-1 v případě, že tato prot ka byla podána po působení viru. Dva šimpanzi, x299 a xl<)6 byli naočkováni nitrožilně 75--násobkem infekční dávky kmene HIV-1 Illb. 10 minut po naočkování viru byla šimpanzovi x299 nitrožilně podána protilátka v dávce 36 mg/kg. Celkový objem přibližně 200 ml byl podán v průběhu 30 minut. Titr protilátky v krevním oběhu na konci podávání byl 1 : 640. Šimpan:, xl96 byl ponechán bez ošetřeni.

Získané výsledky jsou XI. U kontrolního šimpanze xlí izolovat virus z PBMC 6 týdnů ho zvířetejbylo možno prokázat a u tohoto šimpanze bylo možnc látku v průběhu 48 týdnů pozo byla podána protilátka těsně dosud možno pozorovat žádné zr virem. Také PCR-analýza na nu pro virus v PBMC tohoto šimpar shrnuty v následující tabulce bylo možno poprvé positivně po styku s virem. U kontroDnítvorbu protilátek po 8 týdnech izolovat jak virus, tak protahováni. U šimpanze x299, jenfuž styku s virem, nebylo až ámky přetrvávající infekce eovou kyselinu, specifickcfú ze byla negativní.

F° kl a

4>4>4>tOLúts>tsJN>(—‘ I—·(—*(—« f—i Φ

Μί-οσ'^κι^Όαισ'ί'Μοοοσ'ί'ωΝΗ 3_o i—¹

K- Ν' (v Ν' θ' o σ' cr> co η-* λζ\λλλ_ΛΛΛΛ

-Ρ- -Ρ- -Ρ- 4>- ro σ'. 00 00 (Ό Η-‘ t—* >—>»— (— >_ ^_ι ΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟ

T3 (ΓΙ-	>
Ο << a a	•
piv 3
□ <<	0
P'	3
•o	c+
< 0	3
P·	O
3	H
c	3 Ρ» W< P·
Ό c+	3
3 p·	Ό
0 c+	3
cl- 3	3
P· P·¹ 3	N
pj> φ	X
et C	p(
7Γ rt-	(O
<< ·	σι

Ό η

ο

C+ ρω <<

ο<

ο

Π)

Ό C Μ i (D r Ο Μ H r+ c+ W

Ρ· ο > 3

0 Η < σ

I Ρ*

Ρ¹ ο ρω ρ7Γ

C ω

<

Ρ·

Φ + ·+- + -τ + + + ΡΡ + + Ρ + + + + t--i-T-T-T-r-r-ř-ř + +

1111^ <

ρ·

C

Ν

Ο

PJ

Ο

Φ

Tabulka XI: Ochranný účinek podání monoklonální protilátky

ΪΙ

•σ	33
3	o
O <	3)
Ρ·	ω
3	T3
C	Φ
tn	O

X' GJ GJ oo -Ρ' o σ' nj nj nj nj t— i—* »—· t—· 00 4> O 00 θ' JN NJ

CL

CN 4N GJ NJ HO 3

Λ Z\ Λ

Z\ Z\

H-h-l—‘H^H^H-h-HJCO o o o o o o coo

HUU CN NJ NJ O O O

CN .£»

O ď

lilii + + + + +

IIIII iiiii

Ό η0 <<'

CL CL

03' □ 3 ‘C

H'

CO

UX

H·

N o

C

N<

ct

H- cr

O rt- << rt 3 Η* H- 03

H- 3

03' O 3 rt C O zr rt 'C · tn rt «< X c

cn

3	s:	M	3'
3	o	r	3
0	cn	H	03
ct	rt	ω
H-	O 3	>	3 3
2 H	3	03	O ct
<	σ		H·
1	μ-.		i—¹
H*	0 ct		03' ct X^- 03
<	H-		X
H·	N		ΓΌ
3	O		ω
C	I—¹ 03 O O		ω

3.33 3 <3 O OO <

η· tn 3 3 C O tn o

Tabulka XI - pokračování

Tato pozorování jsou prvním přímým důkazem toho, že neutralizační protilátka proti smyčce V3 viru HIV-1 může v nepřítomnosti další imunologické odpovědi, specifické pro virus zabránit vzniku trvalé infekce HIV-1.

Poznámky k tabulce XI:

Vysvětlení je stejné jako v poznámkách k tabulce X.

^b Titr protilátek byl stanoven při použití séra, které bylo odebráno okamžitě po podání Cbetal, jak je popsáno v textu. Titr neutralizačních protilátek před podáním Cbetal byl nižší než 10.

Příklad 14

Izolace HIV

Izolace viru byla uskutečněna tak, že PBMC šimpanze byly pěstovány in Vitro pomocí čtyř metod:

1) PBMC šimpanzů byly pěstovány současně se stejným počtem mitogrnem aktivovaných lidských PBMC v živném prostředí s obsahem IL-2 a DBAB-dextranu.

V každém z těchto případě obsahovaly kultury 1 x 10

Kultury byly inkubovány 15 5 % oxidu uhličitého buněk šimpanzů v objemu 10 ml. při teplotě 37 °C v atmosféře celkem 4 týdny. Pak byly supernatanty podrobeny zkouškám na přítomnost antigenu p24 tervalech. Růst viru, stanoven ných metod byl považován za po

HIV-1 v týdenních iný kteroukoliv z uvedesitivní izolaci viru.

Příklad 15

Detekce nukleové kyseliny HIV pomocí PCR

Přítomnost nukleových kyselin, šimpanzů byla stanovena pomocí získána z P3MC inkubací vzorků HC1 o pH 8,3, 1,0 mM EDTA o pr mikrogramů/ml proteinázy K ce lotě 50 °C. Po extrakci směsí byla DNA srážena ethanolem. Pit* užito 1 až 3 mikrogramů DNA. si obsahovala kromě DNA ještě tris HC1 o pH 8,3, 50 mM KCl, dNTP, 50 ng každého primeru a merázy. Pro PCR-reakci bylo u DNA. Pokud jde o primery, byl specifických pro P3MC PCR-reakce. DNA byla buněk v 10 mM tris 8,0, 0,5 % SDS, 150

])kem 50 minut při tepfenolu a chloroformu o PCR-reakci bylo

Každá z reakčních smě1,5 mM MgCl₂, 10 mM 0,032 mM každého z 1,0 jednotek Taq-polyito vždy 1,5 mikromolu užit specifický pár eno 35 re-, u bylo uskutečněno na pak na 3 minuty zahřáe byl amplifikovaný při použití sondy SKI 9 anovena jako 10 szeciDNA.

primerů SK3S/33 pro HIV-1 gag akčních cyklů, při každém cyk 1,5 minuty zahřátí na 94 °C a ti na 55 °C. Po ukončení reak produkt prokazován hybridizac Citlivost PCR-zkoušky byla st fických kopií HIV-1 na vzorek

Příklad 16

Neutralizace infektivity HIV in vitro lidskými monoklonálními protilátkami

Pro neutralizační testy s lymfotropními a lymfocytolytickými isoláty na buňkách MT-4 byla použita vždy dvojnásobná ředění protilátek, pro každé vyhloubení bylo užito 100 mikrolitrů ředění. Do každého vyhloubení bylo přidáno 100 mikrolitrů ředění zásobního viru a směs viru a protilátky byla inkubována 1 hodinu při 37 °C'a pak bylo přidáno do každého vyhloubení 1 x 10 buněk MT-4 v 50 mikro.l i třech živného prostředí. Kultury byly inkubovány 7 dní, pak byl stanoven koncový neutralizační bod pro protilátku jako poslední ředění, které zabránilo uhynutí buněk MT-4. Neinfikované buňky byly pěstovány při každé zkoušce a vždy byla prováděna retitrace zásobního viru. Neutralizační zkoušky na izolátu SF-162 byly provedeny na primárních kulturách makrofágů a monocytů. Zásobní materiál SF-162 v ředění 1 : 10 hyl smísen se sériovým ředěním protilátky vždy ve dvojnásobném následném ředění a po inkubaci 1 hodinu při 37 °C byla směs přidána do vyhloubení plotny s obsahem 3 x 10 buněk. V každém testu byla provedena také zkouška s lidským positivním sérem s vysokým neutralizačním titrem a s negativním lidským sérem a s buňkami, které byly infikovány, v nepřítomnosti protilátky nebo séra. Ke kulturám makrofágů a monocytů bylo přidáno čerstvé prostředí ve dnech 5, 8, 12, 14 a 21 po infekci. Ve dnech 18, 21 a 24 bylo odebráno prostředí na p24 ELISA (Coulter Immunclogy) pro stanovení produkce viru. Mimoto byly kultury rozrušeny ve dni 24 pro stanovení viru v buňkách zkouškou p24 ELISA. Koncový bod neutralizace byl určen jako poslední ředění,.

které zabránilo infekci, průkaz byl proveden nepřítomností p24. Výsledky jsou shrnuty v tabulce XII.

co

I t-* σ' bo

?0	a	5 o
	a	3 <q

	xj	1 σ\
	00	bo Ln
	00	00
	xj I	xj 1
	1 Xj	1 Ln

N

I

M

H

H cd h m W t—I O < I-* I tU-l·-* rt

Tabulka XII

LO

Ln

LO LO LO LO LO 4> LO N3 (—i o bO bO bO Ό 00 xj

CO g

kň ►< > 1-3 CD O i—i H

3<

(0

O< rt • fix

N (D

O

3<

O rt n><

N

ÍD

O ω

o<

X <<

<

ω

O bO

Ln

I bO

Ln

O

3 < X
SD	o
X X	3
3 C	O
O 1—'	o
Η) X	<
£0' C	<<
oo 3<
C’ a>	σ 0
3	CL
O
□	□
0	2
o
<<	ct
rť
c°	Ď> r-J
C3	H·

N

O <T>

o	o	t-»
θ'		LO
	00	Ln

o c>

θ' c> bO j:· zx

O o

O C)

Ln zx.

O

L0

O

I

O xj xJ xJ 00 00 xz I

L0 Cb <o 5I o

L0 xj bO \D o

o

I o

Zx

o	o
o	L0
4>	\O
o	H⁴

xj Ln 00 θ'

Ln

Cb

XJ

•Ό zx.	X
3x	o
C°'C	3
3 cra	O
ΠΧ-χχ	0
rs 3	<
i—1	<<
3 x-	σ
C	o
xcra	CL
o □ 0	3
C 3	O
ct- (D	c
H rt	rt
3	3
σ η·	3
c O	1—¹
□ X	H·
ÍDí^s	N
X	B5
3	o ÍD

1-3

I .fc.

101Údaje o řetězcích

1) Obecné informace:

i) Přihlašovatel: Emini, Emilio

Conley, Anthony Mark, George Johnson,'L. Syd Pfarr, David ii) Název vynálezu: Rekombinantní lidská protilátka proti HIV, kazeta pro expresi, hostitelská buňka a farmaceutický prostředek proti HIV iii) Počet řetězců: 59 iv)

Adresa pro korespondenci:

A)	adresát:	Merck and Co.,	lne
B)	ulice :	126 E. Lincoln	Ave
c)	město:	Rahway
D)	stát:	New Jersey
E)	země:	USA
F)	ZIP:	07065

v) Forma, odečitatelná počítačem:

A) typ prostředí: Floppy disk

B) počítač: IBM PC-kompatibilní

C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS

D) Software: Patent In Release č. 1.0, verze č.1.25 vi) Údaje o předmětné přihlášce:

A) číslo PV: PV 2396-94

B) datum přihlášení: 30. 9. 1994

C) klasifikace:

viii) Údaje o zástupci pův

A) jméno: Wallen II

B) č. registrace: PC) č. spisu: 18709 xi ) Telekomunikační info A) telefon: (908) 59

2) Informace o řetězci č. 1:

i) charakteristika řetě

A cdní přihlášky PCT

I, John W.

35,403 rmace:

4-3905 žce :

délka: 24 aminoky

B) druh řetězce

C) typ řetězce:

D) topologie:

selin řetězec aminokyselin jednoduchý lineární ii) Typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 1:

Nle Cys Tyr Asn Lys Arg Ly 1 5 s Arg Ile Gly Pro Gly Arg A 10 la

Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly Cys

2) Informace o řetězci č. 2:

i) charakteristika řetě z;ce:

A)

B)

C)

D) délka: 23 aminoky druh řetězce: řet typ řetězce: jedn topologie: lineár selin šzec aminokyselin sóuchý ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 2:

103

Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala

5 10

Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly 15 20

2) Informace o řetězci č. 3:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 8 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce S. 3:

Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr 1 5

2) Informace o řetězci ě. 4: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 7 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 4:

Arg Lys Arg Ile His Ile Gly 1 5

2) Informace o řetězci č. 5:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 6 aminokyselin

104

B) druh řetězce: rete

C) typ řetězce: jedno

D) topologie: lineárr) ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 5:

zec aminokyselin duchy

His Ile Gly Pro Gly jýrg 1 5

2) Informace o řetězci č. 6: i) charakteristika řetězcle:

A) délka: 6 aminokyselin

B) druh řetězce: řetěz

C) typ řetězce: jednod

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 6:

ec aminokyselin uchý

Tyr Asn Lys Arg Lys Ar 1 5

Informace o řetězci č. 7:

i) charakteristika řetěze

A) délka: 6 aminokyselin

B) druh řetězce: řetěz

C) typ řetězce: jednodh

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 7:

ec aminokyselin chý

Asn Lys Arg Lys Arg 11$ 1 5

105

2) Informace o řetězci č. 8:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 5 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 8:

Lys Arg Lys Arg lle His 1 5

2) Informace o řetězci č. 9:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 5 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce ě. 9:

Arg Lys Arg lle His lle 1 .5

2) Informace o řetězci č. 10: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 5 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární

- 106 ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 10:

Lys Arg Ile His Ile 01y 1 5

2) Informace o řetězci č. 11:

i) charakteristika řetězcé:

A) délka: 6 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 11:

Arg Ile His Ile Gly Pro 1 5

Informace o řetězci č. 12:

i) charakteristika řetězce

A) délka: 6 aminokyseli

B) druh řetězce: řetěze

C) typ řetězce: jednodu

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 12:

c aminokyselin chý

Ile His Ile Gly Pro Gly 1 5

107

2) Informace o řetězci č. 13:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 6 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: jednoduchý ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 13:

His Ile Gly Pro Gly Arg 1 5

2) Informace o řetězci č. 14:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 6 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý .

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce ě. 14:

Ile Gly Pro Gly Arg Ala 1 5

2) Informace o řetězci č.15: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 6 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární

108 ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce ě. 15:

Gly Pro Gly Arg Ala Ph$ 1 5

2) Informace o řetězci ě. 15:

i) charakteristika řetězce

A) délka: 5 aminokysel

B) druh řetězce: řetězů

C) typ řetězce: jednodiji

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 15:

:.n c aminokyselin chý

Pro Gly Arg Ala Phe Tyi‘ 1 5

2) Informace o řetězci č. 17: i) charakteristika řetězce

A) délka: 6 aminokyseli

B) druh řetězce: řetěze

C) typ řetězce: jednotíc

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce c. 17:

c aminokyselin chý

Gly Arg Ala Phe Tyr Thr 1 5

109

2).Informace o řetězci č. 18:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 6 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 18:

Arg Ala Phe Tyr Thr Thr 1 ⁵

2) Informace o řetězci č. 19:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 6 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce Č. 19:

Ala Phe Tyr Thr Thr Lys 1 5

2) Informace o řetězci Č. 20: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 6 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární

Phe Tyr Thr Thr Lys A$n 1 5

Informace o řetězci č. 21:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 6 aminokyselir

B) druh řetězce: řetězec! aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduohý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 21:

Tyr Thr Thr Lys Asn Ile 1 5

2) Informace o řetězci č. 22: i) charakteristika řetězce

A) délka: 6 aminokyseli

B) druh řetězce: řetěze

C) typ řetězce: jednodu

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid z aminokyselin chý xi) popis řetězce č. 22:

Thr Thr Lys Asn Ile Ile 1 5

111

2) Informace o řetězci δ. 23:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 6 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 23:

Thr Lys Asn Ile Ile Gly 1 5

2) Informace o řetězci č. 24: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 5 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typmolekuly: peptid xi) popis řetězce č. 24:

Lys Arg Ile His Ile 1 5

2) Informace o řetězci č. 25: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 4 aminokyseliny

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární

- 118 ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 25

Gly Pro Gly Arg 1

2) Informace o řetězci ě. 26 i) charakteristika řetězce

A) délka: 15 aminokyselin aminokyselin chý

B) druh řetězce: řetěz

C) typ řetězce: jednodý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 26:

Arg Lys Arg Ile His II 1 5

Thr Thr 15

Gly Pro Gly Arg Ala Phe T 10

2) Informace o. řetězci č. 27:

i) charakteristika řetězce

A) délka: 22 amlnokysel

B) druh řetězce: řetěze

C) typ řetězce: jednodt

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 27:

Thr Arg Kys Ser Ile Arg m

c aminokyselin chý

Ala Phe Val Thr Ile Gly 15

Ile Gin Arg Gly Pro Gly Afg 10

Lys Ile Gly

113

2) Informace o řetězci č. 28: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 22 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 28:

Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg 1 5 10

Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile 15 20

2) Informace o řetězci č. 29:

i)	charakteristika řetězce:
	A) délka: 22 aminokyselin
	B) druh řetězce: řetězec aminokyselin
	C) typ řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární
ii )	typ molekuly: peptid
xi )	popis řetězce ě. 29:
	Ile Tyr Arg Lys Gly Arg Ile His 1 5	Ile Gly Pro Gly Arg 10
	Ala Phe His Thr Thr Arg Gin Ile 15 20	Ile

2) Informace o řetězci č. 30: i) charakteristika řetězce:

114

A) délka: 22 aminokyse

B) druh řetězce: řetězé

C) typ řetězce: jednodjí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 30:

in c aminokyselin chý

Asn Asn Thr Arg Lys Se 1 5

Ala Phe His Thr Thr Glý 15

Ile Tyr Ile Gly Pro Gly 10

Arg Ile Ile

2) Informace o řetězci č. 31:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 22 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 31

Ser Asn Val Arg Asn Arg 1 5

Ile His Ile Gly Pro Gly 10

Ala Phe His Thr Thr Ly 15

2) Informace o řetězci č. 32: i) charakteristika řetězcě délka: 22 aminokyse druh řetězce: řetěz

Arg Ile Thr 20 lin ec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární

115 ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č . 32:

Asn Asn Val Arg Arg Ser Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg 1 5 10

Ala Phe Arg Thr Arg Glu Ile Ile Gly 15 20

2) Informace o řetězci č. 33:

i )	charakteristika řetězce:
	A) délka: 22 aminokyselin B) druh řetězce: řetězec aminokyselin C) typ řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární
ii)	typ molekuly: peptid
XÍ )	popis řetězce č. 33:
	Asn Asn Thr Ser Arg Gly Ile Arg Ile Gly Pro Gly Arg 1 5 10
	Ala Ile-Leu Ala Thr Glu Arg Ile Ile 15 20
Informace o řetězci č. 34:
i)	charakteristika řetězce:

A) délka: 22 aminokyselin

B) druh řetězce: řetězec aminokyselin

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid

116 xi) popis řetězce č. 34:

Asn Asn Thr Arg Lys Ser 1 5

Ile Thr Lys Gly Pro Gly P 10

Val Ile Tyr Ala Thr Gly 15

Gin Ile Ile 20

2) Informace o řetězci č. 35: i) charakteristika řetězce

A) délka: 22 aminokysel

B) druh řetězce: řetěze

C) typ řetězce: jednodu

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis řetězce č. 35:

in c aminokyselin chý

Asn Asn Thr Arg Lys Ser 1 5

Ile Thr Ile Gly Pro Gly j 10

Ala Phe Tyr Ala Thr Gly 15

Asp Ile Ile 20

Informace o řetězci č. 36:

i) charakteristika řetězce

A) délka: 30 párů baží

B) druh řetězce: nukleo'

C) typ řetězce: jednoču

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 36:

vá kyselina chý

CGGAATTCAG GTGCAGCTGC AGCAGTCTGG

117

2) Informace o řetězci č. 37: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 37 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 37.:

CCGAATTCGC GGCCGCACTC ATTTACCCGGAGACAGG

2) Informace o řetězci ě. 38: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 42 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyseliny

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce c. 38:

GGCGTCGACT CACCATGGCC GGCTCCCCTC TCYTCCTCACC C

2) Informace o řetězci č. 39: i) charakteristika řetězce:

A)

B)

C)

D) délka: 34 párů baží druh řetězce: nukleová kyselina typ řetězce: jednoduchý topologie: lineární

- 118 ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 39:

CCGAATTCGC GGCCGCCTAT GAACATTCTG TAGG

2) Informace o řetězci č. 40: i) charakteristika řetězce

A) délka: 39 párů baží

B) druh řetězce: nukleo

C) typ řetězce: jednodu^

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce c. 40:

vá kyselina :hý

GATCCTCGAG GATTCTAGAA GGGTCAGATC TCGGTGTTG

2) Informace o řetězci č. 41:

i) charakteristika řetězce

A) délka: 30 párů baží

B) druh řetězce: nukleoý

C) typ řetězce: jednoduc):

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA á kyselina hý xi) popis řetězce č. 41:

GATCGAATTC CTGGGATCCT GOAGCTCTAG

119

2) Informace o řetězci č. 42: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 43 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 42:

TTACTCGAGA CGCGTACTAG TGAGCTTGCT ACAAGGGACT TTC

2) Informace o řetězci č. 43: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 30 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 43:

ATTTCTAGAA AGCTTTATTG AGGCTTAAGC

2) Informace o řetězci č. 44: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 3o párů baží

B)

C)

D) druh řetězce: nukleová kyselina typ řetězce: jednoduchý topologie: lineární

120 ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce ě. 44:

TATACTCGAG CAGACACTGG

GCTGAACC

2) Informace o řetězci ě. 45:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 35 párů baží

B) druh řetězce: nukleo^á kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 45:

TATATGATCA GAATTCGCCC G

OGAAGTATG TACAG

2) Informace o řetězci č. 45:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 1380 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 46:

121 'w ΐ ΌΛΐίΛΌ - W

ΟΓ’Γ''»/“' * Γ· <-* — w *J >w ·~Λ J KJ <. «.

Gn.GGiGCAGC TGGxGGAG.C TGGGGGAGGG 77GG7AAAGG C7GGGGGG7G

ACG7G7G7AG CG7C7GG777 CACG77CAG7 GA7G7C7GGG 7GAAC7GGG7

CCAGGGAAGG GGG7GGAG7G GG7CGGCGG7 A77AAAAGCA GAAC7GA7GG TGGGACAAGA

GAC7ACGC7G CATCCG7GAA AGGCAGA77C ACCA7C7CAA GAGA7C-AC7.C AAAAAACAGG

C7ATA7CTGC AAA7GAA7AG CGTGAAAACA GAGGACACAG CGG777A77C C7GCACCACA

GA J.GG 1 i i i A 77A±GA77CG GGGAG7C7CC GAGGACTAC7 ACTA.G-AC7A CAíGGACGí.

7GGGGCAAAG GGACCACGG7 CACCG7GAGC TCAGGC7CCA CGAAGGGGGG A7CGG7C77C

CGCG7GGCAC CC7CCTCCAA GAGCACG7C7 GGGGGCACAG CGGCCG7GGG C7GCG7GG7C

AAGGACTAC7 TCCCCGAACC GG7GACGG7G TCG7GGAAC7 CAGGGGGCG7 GACGAGCGGC

G7GCACACC7 TCCCGGC7G7 CC7ACAG7CC TCAGGACTC7 AC7CCC7CAG CAGCG7GG7CACCG7GCCC7 CCAGCAGC7T GGGCACCCAG ACC7ACATC7 GCAACG7GAA. TCACAAGCCC

AGCAACACCA AGGTGGACAA GAAAGT7GAG CCCAAA7C77 G7GACAAAAC TCACACATGC

CGACCG7GCG CAGCACC7GA AC7CC7GGGG GGACCGTCAÁ

CGCAAGGACA	* ^r· * τ L i -			GG7GC-ACC-7G
AGGCACC-AAG	ACCC7GAC-G7	Q ů i -Δ Q	-p /- a «-* r· r> /-> r-~~ i* <· · 1 <3 kj J. ΛΌ C i ŮJ LÍ.“	r· Τ' rr» — A · — 1'Vi Ό Kw Λ -
GCCAAC-ACAA	AGCCGCGGGA	GGAGCAG7AC	AACAC-CAGG7 ACCC-7G7GC-7	CAGCG7CCIC
ACCG7CC7GC	ACCAGGACTG	GC7GAATGGC	AAGGAGTACA AGxGGAAGGx	C7CCAACAAA
GCCC7CGCAG	CCCCCA7CGA	C-AAAACCA7C	TCCAAAGCGA AAGGGGAGGG	CCGAGAACGA
CAGG7G7ACA	CCC7GCCCCC	A7CCCGGGA7	GAGCTGACCA AGAACCAGG7	CAGCC7C-ACC
7GCC7GG7CA	AAGGC77C7A	TCCCAGCGAC	ATCGCCGTGG AGxGGGAGAG	p a k »*p p r> υΛΛ i
CCGGAGAACA	ACTACAAGAC	CACGCCTCCC	GTGCTGGACT CCGACGGC7C	CT7C77CC7C
7ACAGGAAGC	TCACCG7GGA	CAAGAGCAGG	TGGCAGCAGG GGAACGTCTT	C7CA7GC7CC
G7GA7GCA7G	AGGC7C7GCA	GAACCACTAC	ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT	ěTCTCCGGGa

127

2) Informace o řetězci č. 47:

i) charakteristika řetězce

A) délka: 654 párů baz

B) druh řecězce: nukle

C) typ řetězce: jednodý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 47:

va xyse. chý

CAGTCTGTGT TGACGCAGCG

TCCTGCTCTG GAAGCAGCTC

CCAGGAACAG CCCCCAAACT

GACCGATTCT CTGGCTCCAÁ

ACTGGGGACG AGGCCGATTA

GTGTTCGGCG GAGGGACCAA “ - - ů * u X d

ATAAGTGACT TCTACCCGGG

AAGGCGGGAG TGGAGACCAC

AGCTATCTGA GGCTGACGGG

ACGCATGAAG GGAGCACCG

GCCCTCAGTG

CAACAITGGG

CCTCATTTAT

GTCTGGCACG

TTTCTGCGCA

GCTGACCGTC

ΤΓ ¹

AGCCGTGACA

CACACCCTCC

TGAGCAGTGG

GGAGAAGACA

CTGCGGGCC CAGGACAGAA GCTCACCA-C

AATAATTATG TATTGTGGTA CCAGCAGT7C

CÍGCAATAATA AGCGACCCTC AGGGATTCCT

TCAGCCACCC TGGGCATCAC CGGACTCCAG

ACATGGGATA GCGGCCTGAG TGCTGATTGG

TAAGTCAGC CCAAC-GCTGC CCCCTCGGTC .“-“C'», νΛΛΑ,Λ Λ««\.υ.·.υήυί U J. 'J - Iw - Qp-pprtpmpp « .-.γVACAAAGCA ACAACAAGTA CGCGGCCAG AjAGTCCCACA GAAGCTACAG CTGCCAGGTC

TGGCCCCTA CAGAATGTTC ATAG

2) Informace o řetězci č. 48:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 54 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární

123 ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 48:

CADTCC “A CC

TAGC (1

2) Informace o řetězci č. 49:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 19 párů bázi

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 49:

GGAC-TGC-ACA CCTGTGGAG

2) Informace o řetězci č. 50: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 19 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 50

GGTGAGTCCT TACAACCTC

2) Informace o řetězci č. 51:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 44 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 51: ‘ '

GAATGTGCCT ACTTTCTAGA Q

TCGAGTATA AATCTCTGGC CATG

2) Informace o řetězci č. 52:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 39 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduphý

D) topologie: lineární I ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce S. 52:

CTCCACAGGT GTCCACTCCG AGGTGCAGCT GGTGGAGTC

2) Informace o řetězci č. 53: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 39 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární

- 125 ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 53:

GAGGTTGTAA GC-ACTCACCT GAGCTCACGG TGACCGTC-G

2) Informace o řetězci č. 54:

i) charakteristika řetězce:

A) délka: 54 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina '

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce o. 54:

CATTCGCTTA CCCTGCAGAA GCTTGTTGAC TAGTGAGATC ACAGTTCTCT CTAC

2) Informace o řetězci č. 55: i) charakteristika řetězce

A) délka: 19 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 55:

GGAGTGGACA CCTGTGGAG

- 125 2) Informace o řetězci č. 56:

i) charakteristika řetězce ová kyselina

A) délka: 39 párů baží

B) druh řetězce: nukle

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 56:

CTCCACAGGT GTCCACTCCC >GTCTGTGTT GACGCAC-CC

2) Informace o řetězci č. 57 i) charakteristika řetězci

A) délka: 79 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 57:

GAATGTGCCT ACTTICTAGA CTCGAGAACT

CTTAGGACGG TCAGCTTGG

3AGGAAGCAA AGTTTAAATT CTACTCACG;

2) Informace o řetězci č. 58 i) charakteristika řetězci:

127

A) délka: 18 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) tyo řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 58:

CATTCGCTTA CCCTGCAG

2) Informace o řetězci č. 59: i) charakteristika řetězce:

A) délka: 19 párů baží

B) druh řetězce: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA xi) popis řetězce č. 59:

GAATGTGCCT ACTTTCTAG

Zastupuje:

- 128 typů HIV.

DU 7887-7,

PATENTOV její fragment podle nároku 1, její fragment podle nároku 3, ve smycce V3 neutralizačního e

6. Rekombinantní lidsk. její fragment podle nároku 5, řetězec aminokyselin GPGR s gpl2O HIV.

É

Claims

NÁROKY

= protilátka proti HIV nebo

auje alespoň dva izoláty ser oá protilátka nebo její fragn ent i alespoň dva izoláty HIV-1

-2, WMJ-2, RF, DU 6587-5 a

á protilátka proti HIV nebo

se schopností se vázat na

J-l.

s á protilátka proti HIV nebo

se schopností se vázat na

gpl2O HIV-1.

á protilátka proti HIV-1 net ⁰ 5

4, se schopností se vázat ηε

á jakoukoliv aminokyselinu,

epitopu gpl2O HIV.

á protilátka proti HIV-1 net o

se schopností se vázat na j

čky V3 neutralizačního epitc pu á protilátka proti HIV-1 net o

izoláty IIIB, ΜΝ, AL-1, SF-2

7-7 HIV-1.

j

- 129

8. Rekombinantní lidská protilátka proti HIV nebo její fragment podle nároku 7, se schopností se vázat na neutralizační epitop gpl2O HIV-1.

9. Rekombinantní lidská protilátka proti HIV nebo její fragment podle nároku 8, se schopností se vázat na smyčku V3 neutralizačního epitopu gpl2O.HIV-1.

10. Rekombinantní lidská protilátka proti HIV nebo její fragment pcdle nároku 9, se schopností se vázat na řetězec aminokyselin GPXR, v němž X znamená jakoukoliv aminokyselinu ve smyčce V3 neutralizačního epitopu gpl20 viru HIV-1.

11. Rekombinantní lidská protilátka proti HIV nebo její fragment pcdle nároku 10, se schopností se vázat na řetězec aminokyselin GPGR smyčky V3 neutralizačního epitopu gpl20 HIV-1.

12. Rekombinantní lidská protilátka proti HIV nebo její fragment s dlouhým řetězcem IgG a se schopností neutralizovat izoláty IIIB, MN, AL-1, SF-2, WMJ-2, RF, DU 6587-5, a DU 7887-7 HIV-1.

13. Rekombinantní lidská protilátka proti HIV nebo její fragment podle nároku 12 s dlouhým řetězcem protilátky typu IgG3 a se schopností neutralizovat izoláty IIIB, MN, AL-1, SF-2,

WMJ-2, DU 6578-5 a DU 7887-7 serotypů HIV-1.

14. Rekombinantní lidská protilátka proti HIV nebo její fragment podle nároku 13, kde oblast dlouhého řetězce podskupiny IgG je geneticky modifikována na oblast podskupiny IgGl a protilátka neutralizuje izoláty IIIB, MN, AL-1, SF-2, WMJ-2, DU 6578-5 a DU 7887-7 serotypů HIV-1.

- 130

15. Kazeta pro expresi obsahující řetězec promoto ru, o

celý kód ORF nebo jeho část pro variabilní oblast krátkéh řetězce nebo dlouhého řetězce protilátky, neutralizující HIV, přičemž tato protilátka neutralizuje alespoň dva se typy HIV a příslušný řetězec pro ukončení transkripce.

?o16. Kazeta pro expresi podle nároku 15, kde ORF j kódem pro variabilní oblast křátkého řetězce nebo dlouhé řetězce protilátky, neutralizu jící HIV-1, přičemž tato p e

ho

70tilátka neutralizuje alespoň dva serotypy HIV-1.

17. Kazeta pro expresi je kódem pro variabilní oblasif hého řetězce protilátky 447-52 podle nároku 16, v níž ORF krátkého řetězce nebo dloiji

D.

18. Kazeta pro expresi tězec promotoru, první ORF s řetězec a druhý ORF s kódovým protilátky, neutralizující HIV terminátoru transkripce.

obsahující alespoň jeden jódovým řetězcem pro krátký řetězcem pro dlouhý řetěze -1 a mimoto příslušný řetě neec

19. Kazeta pro expresi a druhý ORF obsahují kódové ře tězec protilátky neutralizují ka neutralizuje alespoň dva i podle nároku 18, v níž prvípí těžce pro krátký a dlouhý řeí HIV-1, přičemž tato protilátztoláty HIV-1.

20. Kazeta pro expresi ORF obsahuje kódový řetězec pr

21. Kazeta pro expresi ORF obsahuje kódový řetězec pr podle nároku 19, v níž druljiý o dlouhý řetězec IgG.

podle nároku 20, v níž druljiý o dlouhý řetězec IgGl.

- 131

22. Kazeta pro expresi podle nároku 19, v níž první a druhý ORF obsahují kódové řetězce pro krátký řetězec a pro dlouhý řetězec protilátky 447-52D.

23. Kazeta pro expresi podle nároku 20, v níž je oblast dlouhého řetězce podskupiny IgG modifikována geneticky na oblast podskupiny IgGl.

24. Hostitelská buňka s obsahem kazety pro expresi, vyznačující se tím, že tato kazeta pro expresi obsahuje řetězec promotoru, ORF s obsahem kódového řetězce pro celou variabilní oblast krátkého řetězce nebo dlouhého řetězce protilátky, neutralizující HIV nebo pro část této variabilní oblasti a příslušný řetězec pro ukonče ní transkripce.

25. Hostitelská buňka s obsahem dvou kazet pro expresi, vyznačující se tím, že. každá z těchto kazet pro expresi obsahuje řetězec promotoru, ORF s obsa hem kódového řetězce pro celou variabilní oblast krátkého řetězce nebo dlouhého řetězce protilátky, neutralizující HIV nebo pro část této variabilní oblasti a příslušný řetězec pro ukončení transkripce.

25. Hostitelská buňka podle nároku 24, vyznačující se tím, že je uložena ve veřejné sbírce kultur American Type Culture Collection pod číslem 68945.

27. Hostitelská buňka podle nároku 24, v y znáčů j í c í s e t í m , že je uložena ve veřejné sbírce kultur American Type Culture Collection pod číslem 68943.

- 135

Anotace PV 2396-94

Název vynálezu: Rekombinantní lidská protilátkaproti HIV, kazeta pro expresi, hostitelská buňka a farmaceutický prostředek proti HIV

Řešení se týká rekombi globulinu, neutralizujících HI imunoglobulinu a způsobu preve; těchto imunoglobulinů. Řešení DNA s obsahem komplementárních nativní lidskou protilátku a rekombinantních hostitelských šení je možno použít k léčení nantních lidských molekul irfiunoV-l, způsobu výroby těchto nce infekci HIV-1 při použ: zahrnuje rovněž konstrukce oblastí CDR a rámce FR prtj) ^xpresi příslušné kazety v buňkách. Jednotlivé prvky a prevenci infekce HIV in γίνο,

:.ti re- 132

28. Hostitelská buňka podle nároku 25, vyznačující se t i m , že je uložena ve veřejné sbírce kultur American Type Culture Collection pod číslem 68944.

29. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t i m , že jako svou účinnou složku obsahuje rekombinantní lidskou protilátku proti HIV nebo její fragment, přičemž tato protilátka neutralizuje alespoň dva izoláty serotypů HIV a mimoto ředidlo nebo nosič, přijatelný z fyziologického hlediska.

30.. Farmaceutický prostředek podle nároku 29, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní lidskou protilátku proti HIV, neutralizující alespoň dva izoláty serotypů HIV-1 ze skupiny IIIB, MN, AL-1, SF-2, WMJ-2, RF, DU 6587-5 a DU 7887-7.

31. Farmaceutický prostředek podle nároku 29, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní lidskou protilátku proti HIV nebo její fragment, neutralizující izoláty IIIB, MN, AL-1, SF-2, WMJ-2, RF, DU 6587-5 a DU 7887-7 serotypů HIV-1.

3eh Způsob pasivní ochrany”proti infekci HIV, vyznačující i m , že se jedincům, ohroženým infekcí HIV podá^rékombinantní lidská protilátka proti HIV nebo její/fragment, 'neutralizující alespoň dva izoláty serotypůHIV.

Způsob podle nároku 32, vyznačující se t i m , že se podá rekombinantní lidská protilátka proti HIV, neutralizující alespoň dva izoláty serotypů

HIV ze skupiny IIIB, MN, AL-1, SF-2, WMJ-2, RF, DU 6578-5 a DU 7887-7.

- 133 /fyX Způsob podleknárokv setím, že se podá rejťomť proti HIV, neutralizujíc^ izo WMJ-2, RF, DU 6578-5% DU 7887
2, vyznačující inantní lidská protilátka ity IIIB, MN, AL-1, SF-2, 7^x-serotypů HIV-1.

35. Farmaceutický prostředek, vyznačujíc L se t i m , že obsahuje dvě účinné látky proti HIV, přič první účinnou látkou je rekombinantní protilátka proti HI neutralizující alespoň dva izoláty HIV a druhou účinnou lát kou je inhibitor HIV, odlišný od protilátky.

;mz

V,

36. Farmaceutický pros značující se tím lišný od protilátky obsahuje i tvořené inhibitory reverzní tr teinázy, inhibitory transakti torové oligonukleotidy a inhib tř edek podle nároku 35, vy že jako inhibitor HIV, od ňhibitory HIV ze skupiny, anskriptázy, inhibitory pro ční transkripce, antimediá tory přilnutí viru.

edek podle nároku 36, m , že jako inhibitor HIV inhibitor reverzní transva

37. Farmaceutický prost vyznačující se t odlišný od protilátky obsahuje kriptázy.

38. Farmaceutický prost vyznačující se t transkriptázy volí ze skupiny edek podle nároku 37, m , že se inhibitor rever zni
3-// (4,7-dichlorbenzoxazol-2-y|. )methyl/amino/-5-ethy1-6-methy1-2-(1H)-pyridinon,

3-//(4,7-dimethylbenzoxazo1-2-ý1)methyl/amino/-5-ethy1-6-methy1-2-(1H)-pyridinon,

3-//(7-chlorbenzoxazol-2-yl)me -2-(1H)-pyridinon, thy1/amino/-5-ethy1-6-methy1- 134

3-//(7-methylbenzoxazol-2-y1)methyl/amino/-5-ethyl-6-methy1-2-(1H)-pyridinon,

3-//(4-fluorbenzoxazol-2-y1)methyl/amino/-5-ethy1-5-methy1-2-(1H)-pyridinon,

3-//(7-fluorhenzoxazol-2-yl)methyl/amino/-5-ethyl-5-methy1-2-(1H)-pyridinon,

3—//(benzoxazol-2-yl)methyl/amino/-5-ethy1-6-methy1-2-(1H)-pyridinon,

3-//(4-chlorbenzoxazol-2-yl)methyl/amino/-5-ethy1-6-methy1-2-(1H)-pyridinon,

3-//(4-fluor-7-chlorbenzoxazol-2-y1)methyl/amino/-5-ethyl-5-methyl-2-(1H)-pyridinon a

3-/2-(benzoxazol-2-yl)ethyl/-5-ethy1-6-methy1-2-(1H)-pyridinon.

Zastupuje:

wo 93/19785

PCT/US93/02629

1/16

NA z heterohybridomu 447

Amplifikace těžkého řetězce cul EcoRI PvuII

5'-CGGAAT7C AGGTGCAGCTGCAGCAGfrCTGG-3' řetězec č. 36

EcoRI Notl 5'-CCGAATTC GCGGCCGCACTCATTTA !CCGGAGACAGG-3' řetězec č. 37

Amplifikace lehkého řetězce cE)NA z heterohybridomu 447

Sáli Ncol Nael

5'-GGCGTCGAC TCACCATG GCCGGCTCCCCTCTC(C/T)TCCTCACCC-3'

EcoRI Notl řetězec č. 38

5'-CCGAATTC GCGGCCGC CTATGAACÁTTCTGTAGG-3' řetězec č. 39

Amplifikace konstantní oblasti) lambda

Xhol Xbal

Cl 5'-GATCCTCGAG GATTCTAGA AGGGTtt EcoRI BanHI

C2 5'-GATCGAATTC CTGGGATCC TGCAGÍTCTAG-3'

AGATGTCGGTGTTG-3' řetězec ě. 40 řetězec č. 41

Amplifikace HIV-1 LTR, fragmentu -117 až +80 Xhol Mlul Spěl

5'-TTACTCGAG ACGCGT ACTAGT GACjCTTGCTACAAGGGACTTTC-3' Xbal HlndlII

5'-ATTTCTAGA AAGCTT TATTGAGGC'

AfIII TAAG C-3' řetězec č. 42 řetězec c. 43 řetězec č. 44

Amplifikace konstantní oblasti gamma

Xhol

G1 5'-TATACTCGAG CAGACACTGGACGCTljAACC-3'

Bell EcoRI Xnal

G2 5'-TATATGATCA GAATTC GCCCGGG AAGTATGTACAG-3' řetězec č. 45

FIG.1

WO 93/19785

PCT/US93/02629

2/16

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTCAGACTC

tú

Φ

O

1—1

c μ

<

<

φ

μ

μ

i—1 o

H ít w

>

>.

CL r_|

μ o

En

H >1

c

pť to

μ

H φ

CL

O

CL

1>1

CD μ

H

Ε-ι

r-í (Ú

H fO >

>

Eh

Cl

Φ

to

<

>1

H μ

<D

w

>1

φ

1—1

El

• H

CL

Í>1

μ rH

H μ

0)

0)

Eh w

O

El

CL

E-t >1 r—1

i—!

El μ

fÚ

φ >

H ω

tú

Φ

i—1

C

<

Γ—1 »—1

El ft

>

1—1

El to (0

>1 >

El

μ i—1

<

< Μ o

o

Ο

Γ

El

ΓΌ t—i

μ

CN

Eh

>3

1—I

Eh l>i

r—1

El

CL

to

El μ

Η

μ

o μ

Ο in φ

τ—1 !—1 pť ω

CN

ρζ to

ίμ

El φ

El ι-1

Η-1

El

μ

>1

ιΗ

γΗ

El (0

>

ÍL

μ

O

El

El

Ο (Ό

ΟΛ «—1

rH t—1

El

Φ

X

Η

to

p£ >1

<1

ι—1

<

μ

CL

μ

<

Eh

c

pť to

ρ£

PÍ

ρ£ to

pť >1

ρ£

ρζ μ

φ

Η w

CL

<

to

PÍ

Εη

CL

<

to

<

<

μ

<

μ

φ

El ω

φ

El ι—1

<

Η

μ c

PÍ

Εη

C\J

Φ

El

El

CL

O <

μ

Lu <

<

>1

to

pť

Pí

El tú

>

μ

φ

El ω

tú

<

El tú

<

μ

X

El

El

Cl

<

to

WO 93/19785

3/1B

PCT/US93/02629

rf

SL

X

1—i

O o

cj

X o

X (0 o

E-i σι ti*

X

LD

CJ >

I—1

Eh

C\1 υ

. ÍL

CO

CJ

CL

o

o

X

rf

CO

Eh

rf

X

CJ rf

o

o co

CJ

X

c?

cj >1

X

o

X

CJ

rf

E-t

o

Sl

CJ

Sl

rf

cj

O

rf >1

C)

X co

X

X

o

X >L

O

C

C)

rf >1

rf >1

C)

X

X

X

X

C)

X »—1

O

ÍL

C)

X (0

rf

CJ >

X

X

p i

CJ fO

CJ

Sl

c>

O

1—1

rf >1

o

O rf

X

X

rf o

rf >4

O

CJ

Ci o

C) rCJ

XI ro rf

cn o

OJ rf

X ro

X

X ro

E<

CJ

CL

CJ

CL

C)

rf

W

rf co

o

CJ rf

CJ rf

CJ

CJ

P

CJ

P

rf

rf

X

rf rH

o

CJ

CJ

CJ

CJ

E<

rf

Cl

o

Cl

O

CJ

X

CJ

Φ

CJ

rf

X

X co

rf

rf co

CJ rH

CJ

rf !>i

X fO

Et

rf

XI

• CJ >

CJ

CJ

P

rf >1

o

X o

CJ

X

(J

CJ

XI

CJ

CJ

rf

CJ

Cl

CJ

Cn

CJ

CJ (1)

CJ sl

Et

O rf co o

CJ rf o

CJ

UO

X c

X

X

Φ

Γ

CJ

OJ rf co ro

X

X ro

CJ

rf rf

rf

X

rf

CJ

X

CJ

X

CJ

X

Φ

X

Φ

CJ

rf

rf

rf c

X

Φ

CJ

<

X

X

X

CJ

CJ

CJ

rf

X

(J

CJ

P

X

0)

X

O

X

X

rt!

CJ

XI

X

CL

ň'

X

Cl

X

Í>1

C'

rf

Í>1

CJ

X

CT

X

X

CJ

CJ

cj

rf

P

X

CL

CT

X

Φ

rf

CO

c

CJ

X

CJ rf

EΦ

CJ <—l

X

O

X fO

CL

ΓCJ >

X

CJ

P rO

X

Φ >

CJ

X

Ci

CJ

CO

Φ

CJ

Í>1 co

X

CJ

CJ

S>1

Ci

CJ

X

CL

CJ

CJ í>1

CJ

P

X

X

Φ

CJ

CJ

X co

CJ fO

CJ

X

X

CJ rf

Cl

CJ fO

X

CJ l—1

Ei

CJ rf

Sl

O rf

Sl

Φ

LíO

CJ

X

CO

X rf

X tO

CJ

Í>1

X

CJ

X rf

CJ

CJ

Cl

CJ >1

Φ

CJ i—1

CO

CJ

CJ sl

X

Sl

Φ

o φ

co

X co

X

o

Sl fO

CJ

X >

rf

X

Cl

CJ

Sl

X

CJ

Φ

X

rf co

X

CJ to fO

rf

>

O rf

X

Cl ro

CJ

Sl

X

X

CJ

Φ

E-i

X

CO

Ci

o

Sl

X

o

Φ

X

X

CO

Í>i

u

X

CJ

Sl

CJ

CJ

ÍL

CO

rf ro íč

CJ

I-1

X

CJ rf >1

CJ

P

X

X

Φ

CJ

o

X

CL

CJ

Ci

CJ

Sl

X

CJ

CL

FIG. 2A2

WO 93/19785

PCT/OS93/02629
4/16 ro <C

CM

O

Lu

O t>1

X

CO

rt) co o

i—l o

X rt o

Li o

>1

O

>1 oo o

Ch >

X

CL i—1

X rgf

X m

o

Ll

Lf)

1—1

LO

CO

Γ rt)

Ll i·

o

O

X rt

X

Li

CO

>

X

rt)

X

CL

o

M

Ll

co

CO

X

rt

rt) •r|

o

-H

Ll

rt)

X

rt) ω

ffi

3)

CL

o rt

Ll

E-t c

X

Ll

rt

X

O

rt

řť co

X

X

X

X

rt) ω

tí) rt)

X

X

CL

O rt

p

X

co

rt

r“H

X rt

X rt

X rt

O rt)

X

>

X

X

>1

Li

c

CL

rt

o rH

rt

co

rt) co

X

X

o

X co

rt)

rt)

X

CL

rt)

Ll

Li

co

X co

1—1

o rt

rt) >1

)>l

>1

X rt

X

CO

X

E-t

Η

X

>

o

O c

o rt

O rt

O

X

Ll o

rt)

M r—1 rt) co rX rt

X

X

Ch rt

Lf) rt

Lf) rt.

rt)

Lf)

X

LO rt)

X

LO

X

CO

X

CO

cl

rt) tó

Ll

rt) co

>4

X

yO

)>1

Ll

X

X

X

E-t

X

CL

Ll

rt)

Ll

Ll

rt)

rt

rt

X

Ll

r—{

X

CO

X ω

rt)

X

CL

rH

Ll

c

rt

>1

X rt

rt

rt)

X

rt) i—1

X

>

X co

Ll

X

X

rt

X)

rt) r-H

X

X rt

X (1)

rt)

X

<

X

>

X

r—1

rt) rt

co

rt

X rt

X rt

X

h~l

X rt

>

X

o

X

X

o

i—1

rt

co

rt

Ll

X rt

E-t rt

>1

r—(

O

CL

O >

O

E-t

X

O

X o

Ch rt) rt

Lf)

X rt <—1

Li

Γ

CL oo

X

rt)

X

Lf)

X

LO rt

LO rt) co r*

Li

<

<

W

rt)

CL

O

Li

X

rt) rt

Ll

rt

X rt

X

CL|

CL

<

CO

>

rt)

rt

rt

Li

co

rt)

X

X)

X

X

rt

<

>1

Li

X

CL

Fi

CL

E-t

CO

rt)

X

CL

Ll

Ll

Ll

CO

rt)

Ž>1

X

Li

X

>Ί

X

X

rt)

X

CL

rt)

X

X

CL

co

X

c

rt) co

rt)

X

E-t rt

rt) co

Li

<

3)

>

rt) rt)

CL

co

X

Ll

Li

rt)

rtj )>1

X rt

X

rt

Li

rt)

XI

>

rt)

X

rt)

CO

CL

WO 93/19785

PCT/US93/02629
5/16

CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG

1—1

E-t

C

(0 o

pť

CO o

E-t >

co ρς rt

LD

Λ

E-t co

CO co

rt

-H

E-t rt

O

K

r—1

H

nj

co

>

O >

rt i—1

p

fO

rt

H

E-t >

o

Γ—1

CÚ

H (0

H >

>

CO

O κθ

E-i bÓ

i—1

o

k

o

Ck

XÍ

rt co

rt

E-t

rt

=-1 i—1 o

i—1

O

Π3

ΓE-t rt ro >

ΟΟ >

co rt p

O kl

1—1

<

>1

o

E-t

E-t

rt

Ck

k

kl

rt

Ch

E-t

E-t

rt >4

C

Xi

rt co

rt

H

rt rt

—1 tr

CD

kl

E-t

Xi

rt rt

E-t

Ck

kl

co

CD

rt bo

rt

W

rt kl

CD

ι—i

i—l

E-t co

<;

H o

>

o

P

LD

P r—1

CD co rt

Γ—1

CO

P

E-t

CD

kl

kl

dr

kl

Ck

XÍ

rt

CO

E-t

rt

Ck

rt

P

co

rt

Γ—1

rt

rt co

CO

bÓ

rt •H

rt kl

ffi

rt

U kl

kl

CD

Ck

rt co

P rt co

CD o

rt bo kl t-H rt kl i—1 o

u c

fO t—1 rt co >

rt rt kl

k <D

CD w

H

CZ) i—1

r—-i

Π3

H fO >

>

r-l

co cú

rt bo >

rt kl tr

u co kl

bo rt

E-t kl

co bo

rt bo

E-t

rt

kl o

k xi co rt bO

co

E-t

H kl

P <D

rt i—1

W

c

CO co

rt bo rt

rt kl kl

bO bo

r-l

E-t

C

E-t

C rH

rt co

rt rt

P

P r-l

E-t

CD

kl

P

Ck r—i

k o

E-t

Eo tr r0

Ck k

rt co rt

rt

c k

rt r-|

Ck

co

CO bo

rt

-H kl

bc k

P x:

E-t

CD

E-t

kl co

bo

E-t (0 kl

>

rt

k i—1

Xi rt

rt

E-t

FIG.2A4

WO 93/19785
6/16

PCT/IJS93/02629

>4

C q

o

O o

o d

O

r4 o

Eo

Φ

Γ o

Cu, ro <

Eo θ'!

Id d

o

q i—1 o

q t—1 >1

CN

Φ

1—1 <, r-4 rH

Eo

O r-4 r-4 i—1

Eo d

O d

H d

Cn

O

L

to

C

Φ

L

Φ

cn

Eo d

o

<

<

co

<

Eo d

o

o

i-4

L

L

o

L

H to

Φ

Φ

o d

>

<

W

H

CO

o

C

c

q

to

r—1

<

r-4

<

1—|

o

to

C

d

d

r-4

řť cn

L

<

cn

o

fV <

Η

Eo

<

(0

cn

q

L

<

to

řť to

<

r-4

Φ

<

d

tí.

d

Eo

CO o

o to

O l

O i—1 o

d in d

rH d

rEo (0

CO <

cn o

o <

r-1 <

to r-4 >

CN <

i—1 <

cn rH q

t—1 (0 i—1 q

řť to

to

Φ

r—1

Eo

Φ

říj d

d

<

d

L

q

Φ

i—1

O

*4)

H

Eo

1—i

Eo <Ú

H w

<

H4

>

O φ

to d

d

Eo i—1

<

cn

<

cn

L

<

1-4

<

<

d

O

L

Cn

L

Eo

O d

L

Φ

L

Η

<

<

W

d

tn

L

Li

<

to

Φ

>4

d

<

d

to co

d

<

Eo

q

<

Eo >4

L

<

i—1

>4

<

to

d

O o

O d

O

Η

Eo

O

Eo

CO o

Φ

in

Φ r—1 cn

O

E-i r-4 o

L t—1

Eo d

CN

to i—1 <

HO t—1 d

r—1

Eo d

i—1 <

d

u

q

to

L

u

L

Eo

Φ

í-H

<

to

d

d

Eo

Eo

Π3

L

řť cn

c

u <-1

d

to

<

tn

<

<

to

<

d

<

<

L

í—1

c

o >4

<

to

Eo ctí

cn

o d

E-t

Eo

>

<

o

q

r-4

q

□

H

O

Η (0

Eo

Φ

<

r-4

o d

>

d

o to

c

cn

o

r-4

<

Γ—1

to

L

<

Eo

d

FIG.2A5

SUBSTITUTE SHEET

WO 93/19785

PCT/1JS93/02629
7/16

CJ μ

E-I k*I o

cj ω

O cj ι—1

I-i

H ω

>

o

CJ co

O ω

CO cj

I—i

O bh rH o

Ll

Eh

CJ

o

CM

tf

Μ

Η

Li

CJ <D

o

CD

Η

CO

H ω

CJ ω

CJ q

H

Λ

Eh (D

Eh

CM

cj

A

CJ ι—1

o

LÍ

H ίθ

o

CD

CJ >

Eh

CO

o q

o

q

pť ω

Eh

CD

tf tf

o (-4

O

o

L

CJ f—t

o

CD

CJ cj

tf

CO o

o q

O co

Ch tf r—í

UO pť

KTt

CN o

CJ

CO rí.

q r—1 o

q ,—1 o

q

tf r—1

tf

1—i

cj

O

o c

o

a

cj

L

cj

Li

o

X

H

E-i

tf

H

O

Cn

o

L

cj

Li

tf

Í>1

tf tf

Eh

Ε cj

Li

u

Κ

o ω

tf •r~

tf co

cj q

o

ω

u c

tf >,

tf

u.

tf qi

tf tf

CJ

CL

cj σ

tf co

tf •ro cj tf o

o q

>

o i—l co o

C

CN

E-i d

CO

H a

cj >

1—1 o

q

o

Li

EH (I

u £

CJ

tf

o

rt

u q

o

r~

H (1)

tf r

CJ ►J

cj c

CJ co

E-1

Eh

a.

H

CJ q

tf Ό o q Η ω tf ω tf >1 tf qi

SUBSTITUTE

SHEET

O

C\1 o

Ll.

I

II

WO 93/19785

PCT/US93/02629
8/16

CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATC

CD

O

E-t

O q

1—1 o

E-t o

Li

O i—1

H i—1

E-t p4 r0

CL ro

i—1 q

t-l

E-t

O

CN q

rt ι—1

E-t r-l

E-t

0)

E-t

o

rt

1—1

Ll

i-H

q

>1

On

<0

rt i—1

.—1

i—1

>

cn

L

rt

Ll

Ll

úl

rt >1

<D

Ll

E-t

E-t

E-t

E-t

q

CL,

O

Cl)

i—t

L

Ll

E-t ι—1

O

E-t

E-t

CL

H

On

q

rt

C7>

On

rH

E-t ω

Li

1—1

E-t

Ll

rt r—1

cn

q

Ll

H <0

p£

On

E-t

0)

tú

>

eO

Ll

p0

to o

H

Li o

E-t q

o

Li

Η

Ch rt

On in řť cn

I—1

rt

E-t

E-t t—1 eO <N rt

Et

(0

E-t q

E-t q

r0

I—1

rt cn

rt cn

i—l

rt

p£ rt

rt rt

rt

M

E-t q

On

rt

Li

0)

p0 cn

i—1

0)

říj rt

E-t ω

w— r-l

>1

E-t

Ll

L m

(0

r—)

rt úl

>

E-t

E-t

rt

Et

C\j

L

E-t

0)

E-t <D

On . ·

0)

H .—1

E-t

Γ—1

r—| o

rt

H

rt

H

q

U q

E-t

Ll

Ll,

Li

rt cn

H <D

0) cl

rt rt

U

Ll

E-t ω

Li

q

cn

M

O

E-t <D

rt >1

cl o

E-t o

Ll

O rt

LI

q

Γ

Li ro pť cn

Ch u

Ll

i—I

<υ t-l úl t—1 o

G)

o

<

ω

Ll

E-t

Ll

Ll

O

On

ω

Li

ι—1

Η

rt ω

Ol.

q

PO >1

to

E-t

Ll

cl)

r—1

r-l

Cl)

Ll

rt

E-t

Ή

E-t

Ll

<

Li

Φ

to

(1)

E-t

>

E-t ω

E-t

E-t

CL

Li

cn

rt tP

(1)

úl

i—1

Ll

E-t o

rt

C

Li

O

CO

r-l

ω

Li

.rt cn

E-t ω

CL

rt

WO 93/19785
9/16

-'1 j

PCT/US93/02M9 o

CL o

l—1 o

Cl

O

Em (0 o

Em

Ch

Em

Em

LD >

t—1

CM

Em

CL

CO

Cl

Em

tn

O

Φ

o

Ί

o tn

O r~4

>1

o

Cl

o

M

o

Φ

M

<

W

o

CL

O

Cl

O

O r

tn

CO <

r—{

Ch

CM o

<

CO co

o

CL

Em

Cl

C

Φ

Em

ω

<

Cl

řť

O

Λ

Em φ

rtj

Em

d

»42 rO

i—1

Em

i—1

Em (U

Em

O <

>

o ω

Cl

o

2>l

£2

<

E-i

O

.i

<

>1

o

H

Em

O

Cl o

Em

UO

Em

CL r—{

C r·

CM

tn co d

co

o <

1

o

r—1

1—1

o

<

o

<

>1

<

1—1

i—1

CL

>1

<

tn

r—1

Em

o 1

Φ

o

i—1

Em d

Em

ω

O

Em

CL

Em

Cl

1—|

Em

O

J3

Em d



<—1

Φ

O

Em fO

Cl

Γ0 >

tn

-=3¹ t>1

Cl

CL i—1

Cí fO

Φ >

<

ω

Cl

Φ

φ d

<

ω

C

Em

Cl d

<

tn

Em

<

fO

<

ro r—1

i—l

<

tn

tn íč

ří

Í>1

Cl

fL d

c

O

CL tn uo

Cl

-ϊΓ

Em

Em f0

(0 ι—1

Γ—1 tf

c

ι—1 ι—1

Em fO

>

C

Φ

d d

Em

i—1

H

Em fO

>

r—1

í—t

<

Cl

<

ί>Ί

Φ

r-l ω

o

C co

Φ

Cl ω

CL

Cl

Μ

>.

CL

H

Em

Φ

M

Em d

CL

Em

CL

Φ

CL d

<

tn

CL

Em

C

Φ

φ d

w

Cl

Φ d

Em i—1

H

<

M

FIG.2B2

PCT/US93/02629

WO 93/19785
10/16 μ

H

O

O

OJ o

H f0 o

CO

w

Cb >

LD

LO o

LD c

IO

o

i—1

<—1

fO

co

Ό

o

1—1

Í>1

<

q

E-t

E-t ω

o

μ

<

μ

>1

0)

E-t

H

<

w

H ω

ω

μ

E-t

CO

>1

<

>1

X

E-t

H

E-t

C

μ

řť

ω

CD

r*H

<

řť

C

tn

<

μ

ω

μ

X!

<

<

H

O μ

o co

O

H rH

Γ <

•H ro μ

Lf)

ω

LO o

ffi <χ>

u

CL

q μ

(0

Ή

ο

ι—1

Η ω

<

řC co

C0

ι~4

řť

řť ίμ

Η (ϋ

<ζ

X

XI

>

μ

α

<

μ

ω

μ

χ

H ω

X

X

<

Η

q

C0

μ

<

ι—1

řť

CL

XI

<

μ

χ

<

γΗ

<

Γ—1

<

Ε-ι

μ

X

1—1

X

μ

X

Π3 o

<

Η ο

CL ο

>

cn μ

lo μ

ι~Ι μ

χ

m χ

LO χ

<

Η

X

<

X

μ

<

rH

X <υ

QJ

<

γ-4

μ

£μ

H (0

CD

ι—ι

>

<

<

>1

<

ι—I

X

0)

<

I—1

XI

(ΰ

X μ

X

C0

ι—I

>1

<

•Η

<

X

Η

Κ

C0

μ

μ

éC

ο

χ

<

X

<

ω

<

X

FIG.2B3
11/16

WO 93/19785 , co v

>o o

o

N >0

P o

PÍ tn >u o

o

N ><D

P o

>P

I

CJ

PCT/US93/02629

V tn >o o

o

N ><D

P <D >C| ω

tn

KI KJ

Oi

Oco «X o O CJ CJ oΟ Λ o

<D

N

KD

P <D >P c

c <c

CT <

CT

U

TJ c

tn

Q_ p- *c

UO UO UO —< cu —> CO CO ·—

Lf tD γ ι/j m

CJ o

ΙΟ

O c

P—

CJ

K >o t o a <d b N {— >a >t >U «X

<x . t— o

CJ

JZ *x

X

CJ

o

t—1

CJ d

ua <E

X

LJ

<C

Ρ

Ο

LZ'

LZ m

i

CJ p— cj o

£ o

P~

L3

CJ

O u

o.

co c

Já

LJ

K <C

CD’

CO co

I

CJ

CJ

Já

CJ

CJ <£

CJ

CJ

ΡΟ

P- C_ «3

P- t_ I— Ιο c cz}

P“

O LZ o tr cj < i— t-J co < P- c_ <c u <C ' LJ (_ t I

O LJ «X CJ PCJ CJ <z CJ P— CJ <E cj CJ c c i— CJ

CJ

CD c

CJ

I in cr ir>

oj — ru •k

Q_

LJ

Š

CJ «X

CJ

CJ cr cr P· cr CJ ΡΟ u o <«x < P- {_ P- «3 cj tz CJ cr o ρ- ca p- < «X cr cj cr ι T

CJ c

CJ

CJ

CJ p“

CJ c

CJ

CJ

P—

CD

P—

CJ

CJ «X

CJ c

CJ

CJ

ΡΟ

I

UO ΙΓ UO — o. —· co co _i ,-,^τιτι 1TC CU

FPT

o co

c

<c

CJ

CJ

CJ ►—1 c

ΡO

CD

JX

CJ

Ο

X

CJ

O «X

o

·—* «X

Ρd

CJ

Ο ja <x

CJ

X

Ρo

Ο «X

pCJ

PCJ

P— c

o

1—

«X

Ρ

ΡΟ

Ο «X

o

CJ

CJ o

P— <x

CD o

<x c

LJ

I uo cu

co tn σ>

tn

* •

KD >u

O o

<D <D

N

N

KD

KD s

P

P ί(D ο

>C >c ε

•H

ί» co α

CO t

CJ

CJ <c

«X

Pc o

o >o

CJ

Pβ

Ρ1—

Ο

Ρ*rH o

Ο ř, .

o «X

S-i

-X

Ρ•H

PΟ

P— o

CX o

CJ

B

CJ pB /rf o

CD

Cu

P—

1—

t— <X

Ή <E <x c

o

CD r-t e

uo uo

Prf »H

B w—<

OJ

Em c

«X «X <D

Eh hO o

1W -‘ ή
12/16

WO 93/19785

PCT/US93/02629

A1

SI

SIGNÁL

S2 H1

12·

INTRON —A2 ^—11

SIGNÁL T

1 \L1

SIGNÁL

447 VH

447 VH

447 VL

447 VL

FIG.4

-/ H2 \ I

INTRON

INTRON

L2

PCT/LJS93/02629

WO 93/19785
13/16 o

GO

O m

o

L_1_ z—.

OJ

XS

CS o

\D co »—4 v—(

OJ

CT· cr>

CT* \_>·

h** ·—t ►—, »—1 z

cS

O ·—(

1—)

JZt

JC ♦—1 cu

X

X c

o.

CZ) x

CD «

WO 93/19785 PCT/US93/02629

15/16

FIG.7

i

WO 93/19785

PCT/OS93/02629

16/16

SUBSTITUTE SHEET

Eco Rl

Hind III