JPH06217791A

JPH06217791A - Ｈｉｖ感染の予防及び治療のための組換えヒトｈｉｖ中和モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH06217791A
Application number: JP5098474A
Authority: JP
Inventors: Emilio A Emini; エミリオ・エイ・エミーニ; Anthony J Conley; アンソニー・ジエイ・コンレイ; George E Mark; ジヨージ・イー・マーク; L Syd Johnson; エル・シド・ジヨンソン; David S Pfarr; デイビツド・エス・フアー
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1992-04-01
Filing date: 1993-04-01
Publication date: 1994-08-09
Also published as: RU94045907A; NO943653D0; FI944561A0; EP0577243A3; MX9301858A; YU22693A; NZ251582A; CZ239694A3; AU658987B2; HU9402824D0; HUT70461A; SK116294A3; IL105145A0; FI944561A; CN1081716A; AU3928593A; EP0577243A2; CA2093099A1; BG99074A; WO1993019785A1

Abstract

(57)【要約】【目的】ＨＩＶ−１を中和する組換えヒト免疫グロブリ
ン分子、該免疫グロブリンの製造方法、及び該免疫グロ
ブリンを使用するＨＩＶ−１感染の予防方法。【構成】天然ヒト抗体の抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）
及びフレームワーク（ＦＲ）を含むＤＮＡ構築物を他の
不変域と結合し、組換え宿主細胞中で発現させる。【効果】かかる組換え抗体は、ｉｎｖｉｖｏＨＩＶ−
１感染の治療及び予防に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野及び従来の技術】ｇｐ１２０Ｖ３
ドメインは、約３０個のアミノ酸残基のジスルフィド結
合閉環状ループであることが判明している〔Ｌｅｏｎａ
ｒｄｅｔａｌ．，（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２６５，ｐｐ．１０３７３−８２〕。無傷の
ｇｐ１２０内のまたは合成ペプチドフラグメントとして
のループは抗ＨＩＶ−１型特異的ウイルス中和抗体に結
合して誘発する〔Ｇｏｕｄｓｍｉｔｅｔａｌ．，
（１９８８），ＡＩＤＳ，２，ｐｐ．１５７−１６４；
Ｇｏｕｄｓｍｉｔｅｔａｌ．，（１９８８），Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，ｐ
ｐ．４４７８−４４８２；Ｈｏｅｔａｌ．，（１９
８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１，ｐｐ．２０２４−２
０２８；Ｊａｖａｈｅｒｉａｎｅｔａｌ．，（１９
８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８６，ｐｐ．６７６８−６７７２；Ｋｅｎｅａｌｙ
ｅｔａｌ．，（１９９８），ＡＩＤＳＲｅｓ．，
５，ｐｐ．１７３−１８２；Ｒｕｓｃｈｅｅｔａ
ｌ．，（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，ｐｐ．３１９８−３２０２〕。
従って、Ｖ３ドメインは主要中和決定基と称されてい
る。抗Ｖ３ループ抗体のｉｎｖｉｔｒｏ特性として、
ウイルス中和活性、ウイルスが宿主細胞ＣＤ４に結合し
て中和する能力、及びウイルス感染細胞と未感染細胞の
融合を防ぐ能力が比較的高いことが挙げられる〔Ｌｉｎ
ｓｌｅｙｅｔａｌ．，（１９８８），Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，６２，ｐｐ．３６９５−３７０２；Ｓｋｉｎｎｅ
ｒｅｔａｌ．，（１９８８），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，
６２，ｐｐ．４１９５−４２００〕。Ｂｅｒｍａｎらは
チンパンジーを、組換え発現させた哺乳動物細胞誘導ｇ
ｐ１２０またはそのｇｐ１６０前駆体で免疫した〔Ｂｅ
ｒｍａｎｅｔａｌ．，（１９９０），Ｎａｔｕｒ
ｅ，３４５，ｐｐ．６２２−６２５〕。該被検動物にウ
イルス抗原を投与すると、ｇｐ１２０を接種したチンパ
ンジーにおいてのみ感染防御が認められた。防御と相関
した免疫応答が測定されたのは抗Ｖ３ループ抗体だけで
あった。Ｇｉｒａｒｄらは、数匹のチンパンジーに一連
の免疫原を接種したが、その最後はＶ３ループ特異的合
成免疫原であった〔Ｇｉｒａｒｄｅｔａｌ．，（１
９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８８，ｐｐ．５４２−５４６〕。この最後の接種
の後にのみ有意なウイルス中和活性が誘発された。抗原
投与すると、チンパンジーは完全に防御されるかまたは
遅延感染を示した。最後にＥｍｉｎｉらは、チンパンジ
ー感染のｉｎｖｉｔｒｏ中和実験において、感染防御
または遅延感染は抗Ｖ３ループウイルス中和抗体の存在
に相関すると報告した〔Ｅｍｉｎｉｅｔａｌ．，
（１９９０），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４，ｐｐ．３６４
７−３６７８〕。

【０００２】最近ではＷａｒｄらが、ヒトＩｇＧのＦｃ
域とＣＤ４ウイルスレセプターのウイルス結合ドメイン
とからなるキメラ分子も、ウイルス接種の前に投与すれ
ば、チンパンジーのＨＩＶ−１感染を予防し得ることを
示している〔Ｗａｒｄｅｔａｌ．，（１９９１），Ｎ
ａｔｕｒｅ．３５２，ｐｐ．３４３−４３６〕。しかし
ながら、抗Ｖ３ループ抗体とは対照的に、ウイルスＣＤ
４結合をブロックする物質はｉｎｖｉｔｒｏＨＩＶ−
１感染の中和性が弱く、それらの作用は、ｇｐ１２０−
ＣＤ４結合親和性を修飾することにより容易に減少され
る〔Ｌａｙｎｅｅｔａｌ．，（１９９１），Ｊ，Ｖ
ｉｒｏｌ．，６５，ｐｐ．３２９３−３３００；Ｋａｎ
ｇｅｔａｌ．，（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，ｐｐ．６１７１
−６１７５；Ｔｈａｌｉｅｔａｌ．，（１９９１），
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，ｐｐ．５００７−５０１
２〕。

【０００３】Ｅｍｉｎｉらは、最近、単一ＨＩＶ−１株
（IIIｂ）に特異的なマウス／ヒトキメラモノクローナ
ル抗体がチンパンジーにおいて、ウイルスに暴露する前
及び後の両方でＨＩＶ−１ IIIｂ感染を予防し得るこ
とを示した〔Ｅｍｉｎｉｅｔａｌ．，（１９９
２），Ｎａｔｕｒｅ．３５５，ｐｐ．７２８−７３
０〕。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＨＩ
Ｖ−１を中和する新規の組換えヒト免疫グロブリンを提
供すること、及び、ＨＩＶ−１中和性ヒト免疫グロブリ
ンの新規の組換えヒトＦＡｂ部分及びＦｖ部分を提供す
ることである。本発明は更に、ヒトＨＩＶ−１中和性免
疫グロブリンにおける新規のＤＮＡ配列を提供すると共
に、この新規の免疫グロブリンＤＮＡ配列を含む発現ベ
クターをも提供する。新規の免疫グロブリンＤＮＡ配列
を有する発現ベクターを含む組換え宿主細胞及び修飾ヒ
ト不変域を有する組換えＨＩＶ−１中和性ヒト免疫グロ
ブリンも提供される。更に、組換えＨＩＶ−１中和性ヒ
ト免疫グロブリンを投与することによりＨＩＶ−１感染
を予防する方法及び組換えＨＩＶ−１中和性ヒト免疫グ
ロブリンを投与することによるＨＩＶ−１感染を治療す
る方法も開示する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】組換えＨＩＶ−１中和性
ヒト免疫グロブリン及び該組換え免疫グロブリンを宿主
細胞中でクローニング及び発現する方法を開示する。Ｈ
ＩＶ−１中和性ヒト免疫グロブリンまたはヒト不変域コ
ーディングＤＮＡに組換え融合した免疫グロブリンの抗
原相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓ，ＣＤＲ）を
コードするＤＮＡを発現ベクター中にクローニングし、
組換え宿主細胞中で発現させる。

【０００６】本発明は、ＨＩＶ−１中和性ヒト免疫グロ
ブリン並びに独自の免疫グロブリンの組換え構築及び発
現に係わる。独自の組換え免疫グロブリンはＨＩＶ−１
中和抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでいる。組換
えＨＩＶ−１中和ＣＤＲを含む免疫グロブリンは、元の
天然免疫グロブリンとは異なるＨ鎖及び／またはＬ鎖の
フレームワーク領域を含むように組換え修飾し得る。

【０００７】組換え修飾免疫グロブリンは、例えば、任
意の他のＩｇＧイソタイプまたは他のクラスの免疫グロ
ブリンからＩｇＧ１イソタイプの免疫グロブリンに変換
され得る。

【０００８】本発明は更に、ＨＩＶ−１に暴露する前ま
たはＨＩＶ−１に暴露した後に組換えＨＩＶ−１中和性
免疫グロブリンを投与することにより、ＨＩＶ感染を予
防する方法をも含む。本発明は更に、組換えＨＩＶ−１
中和性免疫グロブリンを投与することによるＨＩＶ感染
の治療をも含む。

【０００９】更に本発明は、（ｉ）ＣＤＲ及びフレーム
ワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ，ＦＲ）領域を含む可変ド
メインを突然変異誘発及び組立てし；（ii）細胞中にト
ラスフェクトされると結合活性及び特異性決定に十分な
タンパク質を分泌する少なくとも１つの可変域を含む発
現ベクターを作製し；且つ（iii）適当な細胞系中でＨ
鎖及びＬ鎖発現ベクターを同時増幅することからなる、
修飾抗体を構築及び発現する方法をも含む。

【００１０】本発明は更に、動物モノクローナル抗体由
来のＣＤＲをヒト免疫グロブリンフレームワークに、得
られた組換えヒト抗体がヒトに投与されたときに免疫原
性が弱まるかまたは非免疫原性であるように組み込むた
めの組込み方法をも提供する。組換え免疫グロブリン
は、治療目的で投与されたときに自己タンパク質と認識
されるのが好ましい。この“ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａ
ｔｉｏｎ）”法によって、組換え抗体は、ヒトに投与さ
れたときに弱免疫原性または非免疫原性となるが故に、
治療物質として有効となる。本発明は更に、（後述する
ように）適当なフレームワーク領域が同定され得るとい
う条件で、任意の動物モノクローナル抗体を組換えヒト
モノクローナル抗体に組換え変換することを含むものと
する。本発明は、個々の、または、Ｌ鎖もしくはＨ鎖ま
たは無傷の免疫グロブリンとして組み合わされた、ヒト
及び動物ＣＤＲ領域並びにヒトフレームワーク領域のヌ
クレオチド及びアミノ酸配列並びにその保存されながら
に修飾された変異体をも含むものとする。動物モノクロ
ーナルとしては、限定的ではないが、ＨＩＶ−１に結合
するネズミモノクローナル抗体や、Ａｍｅｒｉｃａｎ
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ
ＴＣＣ）によって管理されているハイブリドーマ細胞バ
ンクに寄託されておりＡＴＣＣＣａｔａｌｏｇｏｆ
ＣｅｌｌＬｉｎｅｓ＆Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，
Ｎｏ．６，１９８８に記載されているハイブリドーマに
よって産生される適当なｍＭＡｂを挙げることができ
る。

【００１１】本明細書中、全てのアミノ酸の３文字及び
１文字表示は当分野における標準表示に従っており、そ
れらを以下に列挙する。

【００１２】アラニンＡｌａＡロイシンＬｅｕＬアルギニンＡｒｇＲリシンＬｙｓＫアスパラギンＡｓｎＮメチオニンＭｅｔＭアスパラギン酸ＡｓｐＤフェニルアラニンＰｈｅＦシステインＣｙｓＣプロリンＰｒｏＰグルタミン酸ＧｌｕＥセリンＳｅｒＳグルタミンＧｌｕＱトレオニンＴｈｒＴグリシンＧｌｙＧトリプトファンＴｒｐＷヒスチジンＨｉｓＨチロシンＴｙｒＹイソロイシンＩｌｅＩバリンＶａｌＶ本発明は、ＨＩＶ−１を中和し得る独自の抗体を構築及
び発現する方法及び手段に係わる。ＨＩＶ−１陽性個体
から与えられるヒト血液標本を中和抗体を発現する末梢
Ｂ細胞源とした。かかる細胞をエプスタイン−バールウ
イルス（ＥＢＶ）感染によって無限増殖化し、次いで個
々のＢ細胞クローンを、固相ＥＬＩＳＡフォーマットに
おいて、ＨＩＶ−１株ＭＮのＶ３ループを与えるペプチ
ド配列に結合する抗体を分泌する能力についてスクリー
ニングした。このアッセイで陽性を示したＢ細胞クロー
ンを、ＳＨＭ−Ｄ３３細胞系（ネズミ×ヒトヘテロハイ
ブリドーマ，ＡＴＣＣＣＲＬ１６６８）に融合する
ことにより安定化した。得られたＢ細胞−ヘテロハイブ
リドーマクローンを、固相ＥＬＩＳＡにおいて、ＭＮ
Ｖ３ループペプチドを認識する抗体の産生についてスク
リーニングした。このような作業によって、産生された
抗体が、ＨＩＶ−１暴露の疑いのあるケースでは予防処
置のための、またＨＩＶ−１陽性個体においては治療の
ための物質を開発するのに極めて有効となり得るかどう
かの、安定ヒト抗体産生細胞の同定及び単離の基準が確
立される。

【００１３】種々の方法のいずれかを使用して、抗ＨＩ
Ｖ−１抗体コーディングＤＮＡを分子クローニングする
ことができる。かかる方法としては、限定的ではない
が、適当な発現ベクター系において抗体を含むｃＤＮＡ
ライブラリーを構築し、抗体遺伝子を直接機能発現させ
る方法を挙げることができる。別の方法としては、バク
テリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に
構築された抗体含有ｃＤＮＡライブラリーを、抗体フラ
グメントのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌク
レオチドプローブを用いてスクリーニングすることがあ
る。

【００１４】他のタイプのライブラリー及び他の細胞ま
たは細胞タイプから構築されたライブラリーもまた、抗
ＨＩＶ−１抗体コーディングＤＮＡを単離するのに有効
であり得ることは、当業者には容易に明らかである。他
のタイプのライブラリーとしては、限定的ではないが、
４４７細胞以外のＢ細胞またはＢ細胞系から誘導された
ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムＤＮＡライブラリーを
挙げることができる。

【００１５】抗ＨＩＶ−１抗体を産生する細胞または細
胞系から適当なｃＤＮＡライブラリーを作製し得ること
は、当業者には容易に明らかである。抗ＨＩＶ−１抗体
を単離するためのｃＤＮＡライブラリーを作製するのに
使用される細胞または細胞系の選択は、まず、本明細書
に十分に記載する方法を使用して、細胞が産生した抗Ｈ
ＩＶ−１抗体を測定することにより行なう。

【００１６】ｃＤＮＡのライブラリーの作製は、当分野
において良く知られた標準技術によって実施することが
できる。良く知られたｃＤＮＡライブラリー構築技術は
例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．
Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２）に見ることができ
る。

【００１７】抗ＨＩＶ−１抗体をコードするＤＮＡは適
当なゲノムＤＮＡライブラリーからも単離し得ることは
当業者には容易に明らかである。

【００１８】ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当分
野において良く知られた標準技術によって実施すること
ができる。良く知られたゲノムＤＮＡライブラリー構築
技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２）に見ることがで
きる。

【００１９】上述のヒトＢ細胞系から得られる抗体可変
域、即ちＬ鎖及びＨ鎖をヒト不変域と一緒に組み込む下
記の方法は、組換えＤＮＡ配列を作製するのに好まし
い。かかる組換えＤＮＡを使用して、ヒトドナーＢ細胞
誘導抗体の抗原特異性を保持する組換えヒト抗体を発現
するように哺乳動物細胞をトラスフェクトすることがで
きる。組換え免疫グロブリンは、治療目的で投与された
ときに自己タンパク質と認識されるのが好ましい。ヒト
ヘテロハイブリドーマ、例えば記載のヒトハイブリドー
マ細胞から、グアニジニウムイソチオシアネートを用い
た細胞溶解を含む標準的な方法を使用して、全ＲＮＡが
抽出される〔Ｃｈｉｒｇｗｉｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．１８：５２９４−５２９９（１９７９）〕。

【００２０】他の抗ＨＩＶ−１抗体産生細胞も、抗ＨＩ
Ｖ−１抗体分子の全部または一部をコードする組換えＤ
ＮＡ分子の作製に適していることは、当業者には容易に
明らかである。かかる抗ＨＩＶ−１産生細胞としては、
限定的ではないが、ＧｏｒｎｅｙＭ．Ｋ．ｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）８８：３２３８−３２４２（１９９１）；Ｒｏｂ
ｉｎｓｏｎＪ．Ｅ．ｅｔａｌ．，ＡＩＤＳＲｅ
ｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．６：５６７−５７９
（１９９０）；ＰｏｓｎｅｒＭ．Ｒ．ｅｔａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：５３２５−４３３１（１
９９１）；ＨｏＤ．Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６５：４８９−４９３（１９９１）；Ｔｉｌｌｅ
ｙ，Ｓ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈｖｉｒｏ
ｌ．１４２：２４７−２５９（１９９１）及びＡＴＣＣ
ＣａｔａｌｏｇｕｅｏｆＣｅｌｌＬｉｎｅｓ
ＡｎｄＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ，第７版，１９９２に記載
されているものが挙げられる。後述する４４７−５２Ｄ
ヘテロハイブリドーマは、本発明に記載する独自の方法
の主要例として使用される。

【００２１】ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）が、κもしく
はλＬ鎖と、イソタイプ：α（ＩｇＡ）、δ（Ｉｇ
Ｄ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）及びμ（ＩｇＭ）の
いずれかのＨ鎖とを含むことは当業者には容易に明らか
である。

【００２２】５種類の異なる抗体Ｈ鎖イソタイプは抗体
分子全体に異なる特性を与える。例えば、ＩｇＡは体分
泌（乳、唾液、涙、並びに、呼吸器系及び腸管内分泌）
における主要抗体クラスであり、一般に、腸、気管支、
生殖管、または、乳、唾液及び涙管をライニングする上
皮細胞表面に認められる。ＩｇＭは、抗原に対する一次
抗体応答の初期段階で血液中に分泌される主要抗体クラ
スであり、通常は全部で１０個の抗原結合部位を有する
多価抗体である。ＩｇＥは、ほとんどの細胞及び好塩基
性白血球上のレセプターに高い親和性を示し、典型的に
はアレルギー反応に関与する。ＩｇＤは休止Ｂ細胞表面
に認められ、その機能は不明確である。ＩｇＧは、血液
中の免疫グロブリンの主要クラスを構成するものであ
り、二次免疫応答においてコピー産生される。そのＦｃ
域は食細胞に結合して食作用を助けことができ、Ｆｃ域
は（ＩｇＭのように）補体系を活性化し得る。またＩｇ
Ｇは、胎盤を通過して胎児の血流中に進入し得る唯一の
抗体である。

【００２３】正常ヒト免疫グロブリンクラスＧは、異な
る生化学的特性を有する４つのサブクラスを含む。正常
ＩｇＧは約７０％のＩｇＧ１、１８％のＩｇＧ２、８％
のＩｇＧ３及び３％のＩｇＧ４からなる。抗原暴露の経
路及び継続時間、抗原タイプ及び遺伝的バックグラウン
ドは全てが、産生されるＩｇＧ抗体のサブクラスに影響
し得る。免疫グロブリンの主要クラスとして、免疫及び
疾患の両方におけるＩｇＧ及びＩｇＧサブクラスの役割
は極めて重要である。

【００２４】組換えＤＮＡ技術によって、天然抗体とは
異なるＨ鎖クラスまたはサブクラスを有する組換え抗Ｈ
ＩＶ抗体を生産することが望ましい。例えば天然抗体が
ＩｇＭ（または他の免疫グロブリンクラス）であると、
これは、呼吸器系、腸管または生殖管内に分泌される組
換え抗体分子を製造する場合にはＩｇＡよりも望ましく
ない。当分野において公知の組換えＤＮＡ技術によっ
て、ＩｇＭＨ鎖不変域を、ＩｇＡＨ鎖で置き換え、組換
え発現させることができる。更に、より高い補体系活性
化特性を有する抗体を組換え生産することが望ましい場
合には、ＩｇＧ３天然抗体をＩｇＧ１抗体に組換え修飾
することができる。

【００２５】抗体分子を１つのＩｇＧサブクラスから他
のＩｇＧサブクラスへ組換えＤＮＡ技術によって変換す
ることは、本発明においては抗ＨＩＶ抗体４４７−５２
Ｄを使用して示す。天然形態の４４７−５２ＤはＩｇＧ
３であるが、それを下記の組換えＤＮＡ操作によってＩ
ｇＧ１に変換するものである。本明細書で使用する組換
えＤＮＡ操作は、ＩｇＧ以外の免疫グロブリンＨ鎖クラ
スを変換すること、及びＩｇＧ１以外の１つのＩｇＧサ
ブクラスを変換することに適用し得ることは当業者には
容易に明らかである。

【００２６】ヒトＶＨシグナル配列及びヒトＣγ３’末
端配列、並びにヒトＶλ抗体シグナル配列及びヒトＣλ
３’末端配列を与えるオリゴデオキシヌクレオチドプラ
イマー対（図１）を、本明細書に記載の全てのオリゴデ
オキシヌクレオチドプライマーのように、Ａｐｐｌｉｅ
ｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ３８１ＡＤＮＡ合成装置に
おいて合成し、濃ＮＨ₄ＯＨで処理することにより樹脂
から取り外し、ＮＡＰ−５カラム上で脱塩し、Ｈ₂Ｏで
希釈する。約１μｇの全ＲＮＡを、ＡＭＶ逆転写酵素約
２００単位（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及びＨ鎖またはＬ鎖いず
れかに対する相補鎖プライマー約１０ｐｍｏｌを使用
し、４２℃で約３０分間逆転写させる。逆転写酵素を約
９５℃で約５分間で熱失活させ、約１００μｌのＰＣＲ
緩衝液中に各々約５０ｐｍｏｌのプライマー対と２５単
位のＴａｑポリメラーゼとを含む反応液を調製する。約
４５サイクル（１’，９４℃：２’，５５℃；２’，７
２℃）の増幅を行ってから予想されるＤＮＡフラグメン
ト（Ｈ鎖及びＬ鎖に対してそれぞれ約１４００及び７０
０塩基対（ｂｐ）のＤＮＡフラグメント）をゲル精製す
る。中間プラスミド中にサブクローニングする前に、か
かるＤＮＡをＥｃｏＲＩ（Ｈ鎖）またはＥｃｏＲＩ及び
ＳａＩＩ（Ｌ鎖）で消化し、次いでアガロースゲル電気
泳動によって精製する。Ｈ鎖ｃＤＮＡは、既存のＫｐｎ
Ｉ部位とＢａｍＨＩ部位の間にＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部
位が作製されているプラスミドｐＵＣ１８の誘導体中に
クローニングし、一方、Ｌ鎖はプラスミドｐＵＣ１８中
にクローニングする。上記ＰＣＲ増幅配列を与える複数
クローンを増殖し、ＤＮＡ配列決定を行なう。ヒトＨ鎖
可変域を与える固有のＤＮＡ配列を、推定アミノ酸配列
を分析することにより得、同様にヒトλＬ鎖可変域も得
る。後述するクローン化４４７−５２ＤｃＤＮＡの配
列から、Ｈ鎖はγ３不変域に結合したサブグループIII
Ｈ鎖可変域に最もよく類似しており、Ｌ鎖可変域は、λ
不変域に結合したサブグループＩ可変域に類似であるこ
とが判った。本明細書に記載の組換え４４７−５２Ｄ抗
体は、４４７−５２Ｄヘテロハイブリドーマの一部とし
て認められるＶ域と、（天然γ３に代えて）ヒトγ１
と、λ２不変域とを含むように組立てられる（成熟組換
え４４７−５２Ｄ免疫グロブリンの配列は図２ａ及び図
２ｂに示す）。

【００２７】上述の方法によって得られるクローン化抗
体ｃＤＮＡは、適当なプロモーターと他の適当な転写調
節エレメントとを含む発現ベクター中に分子クローニン
グし、原核または真核宿主細胞中に移入して組換え抗体
を産生させることにより、組換え発現させることができ
る。かかる操作技術はＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔａ
ｌ．（上掲）に十分に記載されており、当分野において
良く知られている。

【００２８】真核細胞発現ベクターは以下のように構築
される。本明細書において発現ベクターとは、遺伝子の
クローン化コピーの転写及び適当な宿主中でのそれらの
ｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と定義され
る。かかるベクターを使用して、細菌、藍藻、植物細
胞、酵母細胞、昆虫細胞及び動物細胞のような種々の宿
主中で真核細胞遺伝子を発現させることができる。更
に、種々のウイルスベースの系を使用して免疫グロブリ
ンを発現させることもできる。

【００２９】特別に設計されたベクターによって、細菌
−酵母または細菌−動物細胞のような宿主間でＤＮＡを
シャトル化することができる。適正に構築された発現ベ
クターは、宿主細胞中で自己複製するための複写開始
点、選択可能なマーカー、少数の有効制限酵素部位、高
コピー能力、及び強力なプロモーターを含む必要があ
る。プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに
結合させてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義さ
れる。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡが高頻度で合成
開始されるものである。発現ベクターとしては、限定的
ではないが、クローニングベクター、修飾クローニング
ベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルス
を挙げることができる。

【００３０】種々の哺乳動物発現ベクターを使用して、
哺乳動物細胞中で組換え抗ＨＩＶ−１抗体を発現させる
ことができる。組換え抗体発現に適当となり得る市販の
哺乳動物発現ベクターとしては、限定的ではないが、ｐ
ＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴＩ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９
３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１
０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（Ａ
ＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３
７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９
８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、
ｐＵＴＣａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）及びλＺＤ３５
（ＡＴＣＣ３７５６５）を挙げることができる。

【００３１】抗ＨＩＶ−１抗体をコードするＤＮＡは、
組換え宿主細胞中で発現させるための発現ベクター中に
クローニングすることもできる。組換え宿主細胞は、限
定的ではないが、細菌、酵母、哺乳動物細胞（例えばヒ
ト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯目由来の細胞系）及び昆
虫細胞（例えばショウジョウバエ誘導細胞系）のような
原核細胞及び真核細胞を挙げることができる。適当とな
り得てしかも市販されている哺乳動物種から誘導された
細胞系としては、限定的ではないが、ＣＶ−１（ＡＴＣ
ＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ
１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５
１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３
（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣ
ＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ
２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、Ｂ
Ｓ−Ｃ１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）及びＭＲＣ−５
（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）を挙げることができる。

【００３２】発現ベクターは、限定的ではないが、形質
転換、トランスフェクション、原形質融合及びエレクト
ロポレーションといった多数の技術のうちのいずれかに
よって宿主細胞中に導入することができる。発現ベクタ
ーを含む細胞をクローニングによって増殖し、個々に分
析して、抗ＨＩＶ−１抗体タンパク質を産生するか判定
する。抗体発現宿主細胞クローンの同定は、限定的では
ないが、抗抗体との免疫学的反応性、宿主細胞に伴なう
抗ＨＩＶ−１抗体の存在といった幾つかの手段によって
行ない得る。

【００３３】抗体ＤＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏ生産合成
ｍＲＮＡを使用して発現させ得る。合成ｍＲＮＡは、限
定的ではないが、コムギ胚抽出物、網赤血球抽出物のよ
うな種々の無細胞系においても効率的に翻訳され得る
し、限定的ではないが、カエル卵母細胞中にマイクロイ
ンジェクトするような細胞ベースの系中でも効率的に翻
訳され得るが、好ましいのはカエル卵母細胞中へのマイ
クロインジェクションである。

【００３４】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によ
って５種類のＤＮＡフラグメントを生成するのに必要な
プライマーを与える約８つのオリゴデオキシヌクレオチ
ドプライマー（図３）を合成する。ターミナルオリゴデ
オキシヌクレオチドプライマー（図３のＡ１とＡ２）を
除く全てに、４４７−５２ＤヘテロハイブリドーマのＨ
鎖Ｖ域に対応する配列、または４４７−５５２ＤＶ域
に結合されるべきシグナル及びイントロンフラグメント
と相補的な配列と、少なくとも１５塩基の５’末端相補
配列とを、続いてこれら３種のフラグメントのＰＣＲ組
換えを可能とするように組み込んだ〔Ｄａｕｇｈｅｒｔ
ｙ，Ｂ．Ｌ．ｅｔａｌ．，ＤＮＡ９：４５３−４５
９，１９９０〕。各々が約５０ｐｍｏｌの適当なプライ
マー対（Ｓ１とＳ２、Ｈ１とＨ２、及びＩ１とＩ２）
を、４４７−５２ＤＨ鎖を与えるプラスミドＤＮＡ約１
０ｎｇ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ約２．５単位と
混合し、約２５サイクルのＰＣＲ増幅を実施した（サイ
クル時間：１’，９４℃；１’，５５℃；２’，７２
℃）。アガロースゲル電気泳動によって精製した５つの
反応生成物、即ち約１０ｎｇの各ＤＮＡフラグメント
を、ターミナルオリゴデオキシヌクレオチドプライマー
（Ａ１とＡ２、図３）及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（図４参照）と混合する。混合したフラグメントをＰＣ
Ｒ増幅する（２５サイクル：２’，９４℃；２’，５５
℃；２’，７２℃）。シグナル及びイントロン配列が付
加したＨ鎖Ｖ域のＤＮＡをＨｉｎｄIII及びＸｈｏＩで
消化した後、アガロースゲル電気泳動によって増幅ＤＮ
Ａを精製し、ヒトγ１Ｈ鎖不変域を含むベクターｐ９１
０３の適合部位中にクローニングする（図５参照）。こ
のベクターは以下のように構築される。ヒトγ１不変域
のＰＣＲ増幅の鋳型として作用させるため、ｃｏｓＩｇ
９コスミドクローン〔ＦｌａｎａｇａｎａｎｄＲａ
ｂｂｉｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ３００：７０９−７１３，
１９８２〕からＤＮＡを精製する。各々約５０ｐｍｏｌ
の適当なプライマー対（Ｇ１とＧ２、図１）を、ヒトγ
１不変域エキソンを含むコスミドＤＮＡ約１０ｎｇ及び
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ約２．５単位と混合し、約
２５サイクルのＰＣＲ増幅を実施する（サイクル時間：
１’，９４℃；１’，５５℃；２’，７２℃）。反応生
成物をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、アガ
ロースゲル電気泳動によって精製し、ＨＩＶ−１プロモ
ーターのフラグメントを含む中間ベクター（ｐ９１０
２）中にクローニングする（塩基対−１１７〜＋８０；
Ｓｉｅｋｅｖｉｔｚｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３８：１５７５，１９８７に記載のｐＣＤ２３）。シ
グナルペプチド及びイントロンが付加したＬ鎖Ｖ域をＨ
ｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気
泳動によって増幅ＤＮＡを精製し、ＨｉｎｄIII及びＥ
ｃｏＲＩで予め消化しておいたＦＦＦＦベクター（後
述）中に、ヒトＬ鎖不変域エキソンを与えるＤＮＡフラ
グメントと一緒にクローニングする。この後者のＤＮＡ
フラグメントは、ヒトλ２不変域遺伝子座を含むＥｃｏ
ＲＩ／ＨｉｎｄIIIを含む１０ｎｇのプラスミド＃２０
８ＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより得られる。各々約
５０ｐｍｏｌの適当なプライマー対（Ｃ１とＣ２、図
１）を該プラスミドＤＮＡ及び約２．５単位のＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼと混合し、約２５サイクルのＰＣＲ
増幅を実施する（サイクル時間：１’，９４℃；２’，
５５℃；２’，７２℃）。６２０塩基対の反応生成物を
ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、アガロース
ゲル電気泳動によって精製してから、上述の３断片結合
体に含ませた。得られた発現クローンを分析したとこ
ろ、ＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩで消化し、次いでアガ
ロースゲル電気泳動すると、推定で約１．２ｋｂのＬ鎖
コーディング挿入物が得られることが明らかとなった。

【００３５】Ｈ鎖及びＬ鎖免疫グロブリン分子は、異な
る免疫グロブリンコーディング配列を含むこと以外は同
一のプラスミドから転写される。免疫グロブリン発現ベ
クターの好ましい前駆体は、ＨＩＶ−１ＬＴＲプロモ
ーターの一部分（キャップ部位に対して−１１７〜＋８
０）、複数クローニング部位及びＳＶ４０後期ポリアデ
ニル化シグナルを含む上述のごときものである（図
７）。プラスミドｐＥＥ１４（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ，Ｌｔ
ｄ．）は、ｐＳＺ９０１５と称されるこのベクター内の
大部分のＤＮＡ配列の供給源である。ｐＥＥ１４ベクタ
ーのＣＭＶＩＥプロモーターは、ＭｌｕＩ及びＨｉｎｄ
IIIで消化することにより除去する。プロモーターを除
いた８ｋｂのベクターＤＮＡをアガロースゲル電気泳動
によって精製し、１９７塩基対のＨＩＶＬＴＲ（−１
１７〜＋８０）とＭｌｕＩ及びＨｉｎｄIII末端（図１
に示したプライマー対とｐＣＤ２３ＣＡＴプラスミドＤ
ＮＡ鋳型とを使用して得られるもの）とを含む約２００
塩基対のＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントに連結する。Ｈ
鎖γ１不変域はｐ９０１５ベクター中にＸｂａＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ２．０ｋｂフラグメントとして、未関連Ｈ鎖Ｖ域
と一緒に挿入され、ベクターｐＳＰ７２／５８．２／Ｌ
１６ＶＨ／γ１ＭＲＣが生成される。

【００３６】４４７Ｈ鎖可変域及びＩｇＧ１不変域と４
４７Ｌ鎖可変域及びλ２不変域とを含むプラスミドＤＮ
Ａを、感受性哺乳動物細胞中にトラスフェクトするため
に増殖及び精製する。それぞれＨ鎖及びλＬ鎖をコード
する約１０μｇで同量のプラスミドを、標準的なリン酸
カルシウム沈澱法によってヒト胎児腎細胞系２９３（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ１５７３）中にトランスフェクトす
る。培養上清を固相ＥＬＩＳＡ（後述）によってアッセ
イしたところ、ヒトλＬ鎖／ヒトＩｇＧ１免疫グロブリ
ンを含むことが判明した。Ｉｍｍｕｌｏｎ−２（Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈＬａｂｓ．）の複数の９６ウェルプレート
を、約４℃のリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中に約１０
μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトλ鎖不変域モノクローナル抗
体（カタログ＃０５−４１０１，ＺｙｍｅｄＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を含む溶液を用いて一晩か
けて被覆し、ＰＢＳ中に約１％のウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含む溶液を用いて約３７℃で約１時間かけ
てブロックする。ＰＢＳで繰返し洗浄した後、１％ＢＳ
Ａを含むＰＢＳで希釈した試料（組換え４４７−５２Ｄ
抗体またはＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ製のヒトλ／
ＩｇＧ１を含む状態調節培地）を加えて２つ同じものを
作り、３７℃で１時間インキュベートする。約７．８ｎ
ｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの範囲のＩｇＧ１濃度を
使用し、標準較正曲線を作成した。約１％のＢＳＡを含
むＰＢＳ中の西洋ワサビペルオキシダーゼ（カタログ＃
０５−３３２０，ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ）に結合させたマウス抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ
モノクローナル抗体の１：４００希釈液の約５０μｌア
リコートを用いて、結合し且つ十分に凝集したヒトＩｇ
Ｇ１を検出する。約３７℃で約１時間インキュベートし
次いで洗浄した後、０．０３％過酸化水素を含む約０．
１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ４．２中に約１ｍＭ２，
２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６
−スルホン酸）を含む溶液を加え、室温で２０分間イン
キュベートすることにより、結合した複合体の量を検出
する。４１５ｎｍにセットしたＥＬＩＳＡプレート読取
り装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎｃ．）を用いてウェルの
吸着を測定する。或いは、ＭＮ単離体の配列に基づいた
２６残基ペプチドで被覆したプレートにおいて固相ＥＬ
ＩＳＡを実施する。ペプチド（ＮｌｅＣｙｓＴｙｒＡｓ
ｎＬｙｓＡｒｇＬｙｓＡｒｇＩｌｅＧｌｙＰｒｏＧｌｙ
ＡｒｇＡｌａＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｈｒＬｙｓＡｓｎＩ
ｌｅＩｌｅＧｌｙＣｙｓ配列番号１）は、予め活性化
したペンタフルオロフェニルエステルを使用する固相Ｆ
ｍｏｃ化学作用及びヒドロキシベンジルトリアジン活性
化によって合成する。Ｉｍｍｕｌｏｎ−２プレートを約
１μｇ／ｍｌのペプチドを用いて一晩かけて被覆し、Ｐ
ＢＳ中約１％のウシ胎児血清でブロックする。上述のご
とく、結合した４４７−５２Ｄ抗体を検出する。一時的
な発現の後にトランスフェクトされたヒト２９３細胞に
よって分泌される抗体を、プロテインＡクロマトグラフ
ィーによって精製する。組換え４４７−５２Ｄ抗体の濃
度を上述のＥＬＩＳＡによって測定し、固有のＨＩＶ−
１血清型の感染性を中和する能力を示すことにより効能
を試験した。

【００３７】培養液を抗体及びウイルスに７〜８日間暴
露した後の細胞生存率を測定することにより、無細胞Ｈ
ＩＶ−１ウイルス感染の中和及び細胞対細胞伝播の阻害
を定量化するために、以下のアッセイを実施する。試験
する抗体を細胞増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウ
シ胎児血清）で次々と２倍に希釈し、９６ウェル皿（Ｃ
ｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｐ．）のウェル中に１００μｌずつ
入れる。１００μｌのウイルスストック（慢性感染Ｈ９
細胞または新たに作製した慢性感染ＦＤＡ／Ｈ９細胞か
ら調製したもの；細胞密度２×１０⁵細胞／ｍｌで平板
培養した慢性感染細胞集団由来の３日間状態調節した培
地を清澄化し、７日間アッセイにおいて全てのＭＴ−４
細胞を死滅させる最終希釈度のウイルスストックの１０
倍の希釈度を抗原投与量として選択する）を各ウェルに
加え、ウイルス−抗体混合物を３７℃で１時間インキュ
ベートする。ＭＴ−４細胞〔Ｈａｒａｄａｅｔａ
ｌ．，（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，ｐｐ５
６３−５６６〕を各ウェルの５０μｌの培地に加え（１
×１０⁴細胞／ウェル）、皿を３７℃で７日間インキュ
ベートし、この時点で終点を決定する。ＭＴ−４細胞死
滅を阻害する最終抗体希釈液の濃度が、中和終点として
報告される。

【００３８】中和アッセイの結果を図８に示すが、これ
は、調査した各ＨＩＶ−１血清型に対して、組換えヒト
４４７−５２Ｄ抗体の有効性はヒトヘテロハイブリドー
マ誘導４４７−５２Ｄ抗体と等しいことを示している。
この結果から、ヒトλ及びγ１不変域をもって発現され
た組換え構築抗体は、そのＶ３ＰＮＤループとの相互
作用を変えるようには修飾されていないことが判る。

【００３９】そのＨ鎖及びＬ鎖の可変域が４４７−５２
Ｄヒトヘテロハイブリドーマ抗体の残基を含み、親ヘテ
ロハイブリドーマ抗体の特異性及び効能を完全に保持す
る完全な組換え４４７−５２ＤヒトＨＩＶ−１中和抗体
の構築が開示される。

【００４０】本明細書に記載の組換えヒト抗ＨＩＶ−１
抗体は天然抗体と同じ抗原特異性を有し、広域のＨＩＶ
−１中和活性スペクトルを保持していることは当業者に
は容易に明らかである。更に、組換えＨＩＶ−１特異的
抗体分子を提供するために、本発明の方法に従って他の
抗ＨＩＶ抗体が製造され得ることも当業者には容易に明
らかである。

【００４１】ｇｐ１２０糖タンパク質に関係するエピト
ープのようなＨＩＶ−１の中和エピトープに対するヒト
ＩｇＧｍＡｂを産生する細胞系は、ヒト末梢血単核細胞
をＥＢＶ形質転換し、所望の特異性を有する抗体を産生
する細胞系を選択し、選択したＥＢＶ形質転換細胞を異
種骨髄腫細胞系に融合することにより製造される。得ら
れるヘテロハイブリドーマ細胞は各々が、選択した親の
ＥＢＶ形質転換細胞によって産生される抗体のエピトー
プ特異性（例えばｇｐ１２０エピトープに対する特異
性）を有するヒトｍＡｂを産生する。

【００４２】本発明の細胞及び抗体によって認識される
１つ以上の中和エピトープを含むｇｐ１２０糖タンパク
質は、公知のＨＩＶ−１株のいずれか、例えば比較的一
般的なＭＮ株から誘導され得る。

【００４３】“異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍ
ａ）”なる用語は、非ヒト骨髄腫細胞系とヒト骨髄腫細
胞系とを融合することで製造されるハイブリッド細胞を
意味する。典型的には、マウス骨髄腫または形質細胞腫
細胞がヒト骨髄腫細胞の融合相手となる。このような非
ヒト及びヒトの骨髄腫及び異種骨髄腫細胞系は当分野に
おいては公知であり、Ｔｅｎｇ，Ｎ．Ｎ．ｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）８０：７３０８（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒ，
Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ２：７（１９
８３）；及びＧｒｕｎｏｗ，Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０６：２５７−２６５（１
９８８）に報告されている細胞系を例に挙げることがで
きる。

【００４４】本発明においては、選択されたＥＢＶ形質
転換ヒト細胞に対する融合相手として異種骨髄腫細胞を
使用して、本発明のヘテロハイブリッドが製造される。

【００４５】好ましい実施体においては、異種骨髄腫Ｓ
ＨＭ−Ｄ３３が融合相手として使用される。この細胞系
は、寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ１６６８でＡＴＣＣから
入手可能である。

【００４６】本明細書中“ヘテロハイブリドーマ”なる
用語は、１種の抗体産生細胞と異種骨髄腫とを融合する
ことで製造されるハイブリッド細胞系を指す。“ヘテロ
ハイブリドーマ”なる用語は他では、抗体産生ヒトリン
パ様細胞系とネズミ骨髄腫細胞とを融合することで得ら
れるような、任意の種間のハイブリドーマを指して使用
されている。しかしながら、本明細書中で使用されるこ
の用語はもっと狭義に定義される。

【００４７】本発明の１つの実施態様においては、ヒト
抗体産生細胞をマウス−ヒト異種骨髄腫と融合する。好
ましい実施態様においては、ヘテロハイブリドーマは、
ＨＩＶの中和エピトープに対する抗体を産生するＥＢＶ
形質転換ヒトリンパ細胞をヒト−マウス異種骨髄腫と融
合したものである。より好ましい実施態様においては、
ヒト−マウス異種骨髄腫はＳＨＭ−Ｄ３３と称される細
胞系である。

【００４８】“中和エピトープ（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉ
ｎｇｅｐｉｔｏｐｅ）”なる用語は、該エピトープに
特異的な抗体に結合されたとき、ウイルスが中和される
結果となるエピトープを意味する。例えばシンシチウム
形成のようなウイルスの任意の生物学活性を中和するこ
とは、本明細書で使用される“中和”の範囲内である。

【００４９】ＨＩＶ−１ｇｐ１２０の中和エピトープ
に対するヒトｍＡｂを生成するために、ヒト末梢血リン
パ細胞を、例えばＧｏｒｎｙ，Ｍ．Ｋ．ｅｔａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）
８６：１６２４−１６２８（１９８９）に記載のごとく
ＥＢＶによって形質転換する。

【００５０】形質転換する細胞は、抗ＨＩＶ−１抗体を
産生する個体の血液から誘導するのが好ましい。

【００５１】ＥＢＶ形質転換細胞培養体を、問題のエピ
トープに対する抗体についてスクリーニングする。１つ
の実施態様においては、エピトープはｇｐ１２０タンパ
ク質の中和エピトープであり、スクリーニングは、精製
ｇｐ１２０、そのフラグメント、またはその一部を与え
る合成ペプチドを使用して実施される。好ましい実施態
様においては、アミノ酸３０６−３２８（配列は上記参
照）を与えるＶ３ループ由来の合成２３ｍｅｒペプチド
を使用してｇｐ１２０のＶ３ループのエピトープに対す
る抗体に対して培養体をスクリーニングする。このよう
なペプチドのほかに、６個以上のアミノ酸を有する別の
ペプチドも、所望のエピトープ特異性の抗体産生細胞を
同定するためにＥＢＶ形質転換細胞をスクリーニングす
るのに有効である。

【００５２】上記スクリーニング作業には当分野におい
てよく知られた多数のイムノアッセイのいずれかを使用
し得る。好ましいイムノアッセイはＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚ
ｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ
Ａｓｓａｙ）である。このようなアッセイを使用し、培
養液上清の所望の特異性及びイソタイプの抗体の存在を
試験する。

【００５３】陽性ＥＢＶ形質転換培養液を、当分野にお
いて公知の多数のクローニング法のいずれか、例えば２
倍希釈法（ｄｏｕｂｌｉｎｇｄｉｌｕｔｉｏｎ）によ
って繰返しクローニングする。所望の抗体特異性に対し
て陽性であると判明した培養液から得た細胞を異種骨髄
腫細胞系の細胞と融合してヘテロハイブリドーマを生成
する。次いで融合細胞を、約１〜１００細胞／ウェルの
密度で培養することによりクローニングする。

【００５４】ヘテロハイブリドーマによって産生された
抗体の特異性は、当分野において良く知られたイムノア
ッセイ法によって評価する。好ましい実施態様において
は、ＥＬＩＳＡ及び放射性免疫沈降法（ＲＩＰ）が使用
される。抗原調製物は、ＨＩＶ−１ビリオン（例えばＭ
Ｎ株）、ウイルスもしくは感染細胞の溶解物（例えばＭ
Ｎ及びＨＴＬＶ−IIIＢ溶解物）、ｇｐ１２０のような
ウイルスタンパク質、または上述の２３ｍｅｒのような
組換えもしくは合成ウイルスペプチドからなる。

【００５５】本発明のｍＡｂはＩｇＧイソタイプのもの
であり、ヘテロハイブリドーマ細胞培養液の上清から回
収し、当分野においては公知の通常のＩｇＧ精製法によ
って精製することができる。かかる方法としては、限定
的ではないが、プロテインＡセファロースアフィニティ
ークロマトグラフィー、ＡｆｆｉｇｅｌＢｌｕｅ（Ｂ
ｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）及びプロテイン
Ａセファロースクロマトグラフィーの組合せ、または高
速液体クロマトグラフィーを挙げることができる。

【００５６】ＨＩＶ−１に感染したヒトまたはＨＩＶ−
１感染の危険性のあるヒトに投与した場合、本発明の抗
体は治療または予防効果を与え得る。特に危険性のある
かかる個体は当分野においては良く知られており、例え
ば注射針による刺傷を介してＨＩＶ−１に暴露された医
療従事者が挙げられる。

【００５７】更に本発明の抗体は、患者がＨＩＶ−１に
暴露されたかまたは感染したかどうか判定するのに使用
されるタイプの診断アッセイに有効である。

【００５８】更に該抗体は、それらが特異性を示すＨＩ
Ｖタンパク質の発現を分析するのにも有効である。

【００５９】本発明のＨＩＶ特異的ヒトｍＡｂを使用し
て、ＨＩＶ感染個体またはＡＩＤＳを患う個体を治療す
ることができる。本発明の抗体は、多数の公知の経路の
いずれかで非経口的にまたは経小腸的に投与される。例
えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内または髄腔
内に投与し得る。或いは、または同時に、経口、直腸内
または腟内経路でも投与し得る。抗体は更に、子宮内治
療のための羊膜腔内に投与することもできる。好ましい
経路は静脈内及び筋肉内経路である。

【００６０】投与する抗体の量は、レシピエントの年
齢、体調及び体重、もしあれば同時に受けている治療の
種類、治療頻度、並びに所望の効果の特性に従う。ｍＡ
ｂの有効量は１日当たり約０．１〜約５００ｍｇ、好ま
しくは１日当たり約３〜約３０ｍｇである。治療は、当
業者には容易に確定されることであるが、数日、数週、
数ケ月または場合によっては数年にわたって抗体の注入
または注射を要する。

【００６１】典型的な治療レジメは、有効量の投与抗体
を１週間〜約６ケ月間にわたり投与することからなる。
治療効果を得るのに必要な治療期間は、疾患の程度及び
段階並びに各患者の個体特性に従って患者ごとに異な
る。

【００６２】各治療に必要な合計量が、複数投与または
単回投与において投与され得る。ｍＡｂは、単独で投与
してもよいし、または例えばＡＺＴのようなＨＩＶ−１
感染に対する他の治療薬もしくは他の疾患症状に対する
治療薬と一緒に投与してもよい。

【００６３】本発明のｍＡｂは、ＨＩＶ−１感染妊婦に
投与することもできる。本発明の抗体はＩｇＧイソタイ
プのものであるので、胎盤を通過して胎児に到達し得
る。これで胎児の感染を予防し得るし、或いは感染胎児
に対して有効な治療となり得る。

【００６４】本発明の抗体を含む医薬組成物は、抗体が
その目的を達成するのに有効な量で含まれる全ての組成
物を含む。抗体のほかに本発明の医薬組成物は、活性化
合物を医薬的に使用され得る製剤に加工するのを容易に
する賦形剤及び助剤を含む、適当な医薬的に容認可能な
担体を含むことができる。本発明の範囲内の別の医薬組
成物は、本発明の抗体と当分野においては公知の静脈内
免疫グロブリン調製物との混合物である。

【００６５】医薬組成物は、注射によってまたは経口的
に投与するのに適した溶液とすることができ、この場合
には、約０．０１〜９９％、好ましくは約２０〜７５％
の活性成分（即ち抗体）を賦形剤と一緒に含む。経口投
与用の医薬組成物としては錠剤及びカプセルを挙げるこ
とができる。直腸投与及び腟内投与し得る組成物として
は座薬を挙げることができる。

【００６６】本発明のｍＡｂは、細胞毒性物質に結合し
て抗毒素として使用することもできるし〔例えばＶｉｔ
ｅｔｔａｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１
０９８−１１０４（１９８７）参照〕、抗ＨＩＶ薬物を
含むリポソームの表面またはかかる薬物を特異的に標的
とする毒素もしくは感染細胞に対する毒素に組み込むこ
ともできる。本明細書において、“抗毒素（ｉｍｍｕｎ
ｏｔｏｘｉｎ）”なる用語は、抗体と１種以上の毒素、
薬物、放射性核種または細胞毒性物質との結合体を指
す。毒性部分は、本発明の抗体に化学的に結合される
か、または組換えＤＮＡ技術によって連結され得る。こ
のような結合体においては、毒性タンパク質またはその
活性フラグメントをコードするＤＮＡを、ｍＡｂのＨ
鎖、Ｌ鎖または両方の全部または一部をコードするＤＮ
Ａに連結する。このような遺伝子構築物及びこれらを製
造する方法は当分野において公知である。本発明の抗体
に結合し得る毒素としては、リシン、ジフテリア毒素、
シュードモナス毒素、腫瘍壊死因子α及び当分野におい
て公知の他のものを挙げることができる。

【００６７】本発明のｍＡｂを抗毒素として使用する典
型的な治療においては、抗体を、単独ではＨＩＶ感染細
胞にも未感染細胞にも毒性を示すリシンのような毒素に
結合させる。細胞毒性物質を抗体に結合することによ
り、抗体が結合しなかった隣の未感染細胞には毒素が使
用されず、抗体が毒素を送達した標的細胞に対して極め
て局所的に、高レベルの毒素効率が得られる。

【００６８】ＨＩＶ抗ウイルス治療は、ウイルス複製サ
イクルの詳細な理解の上に成り立っており、ほとんど全
ての複製ステップが定義可能なことで、ウイルス複製を
妨害する可能性が与えられている。まず、ＨＩＶが細胞
に結合するのを妨害する治療化合物が使用し得る。組換
えＣＤ４は、ウイルスｇｐ１２０エンベロープタンパク
質に結合することにおいて細胞レセプターと競合するこ
とによりウイルスに対する“分子おとり（ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒｄｅｃｏｙ）”として作用する。これまでの有
効な物質のほとんどは次の段階、即ちＤＮＡプロウイル
スの形成に、逆転写酵素（ＲＴ）を阻害することにより
作用していた。このような物質としてはＡＺＴ及び他の
ヌクレオシド類縁体、例えばジデオキシシトシン（ｄｄ
Ｃ）及びジデオキシイノシン（ｄｄＩ）や、非ヌクレオ
シド類縁体を挙げることができる。次なる標的は、プロ
ウイルスＤＮＡ由来のウイルスＲＮＡの合成、成熟、及
び核から原形質への輸送であり、これにはｔａｔ及びｒ
ｅｖ機能のインヒビターが関与する。ウイルスｍＲＮＡ
は翻訳される必要があるが、実験ベースではこのステッ
プはアンチセンスオリゴヌクレオチドによって特異的に
阻害され得る。最後に、ウイルスタンパク質は凝集して
新たなウイルス粒子を形成する必要があるが、これは、
特定のウイルスプロテイナーゼに依存する。このプロテ
イナーゼは結晶化されており、インヒビターは同定され
ている〔Ｒｏｂｅｒｔｓｅｔａｌ．，（１９９
０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，ｐｐ．３５８−３６
２〕。

【００６９】本発明は、組換えＨＩＶ中和抗体と、ＨＩ
Ｖ感染及びＡＩＤＳの治療または予防に有効な１種以上
の物質との併用にも係わる。例えば本発明の組換え抗体
は、暴露前及び／または暴露後に、有効量のＨＩＶに対
して有効な他の抗ウイルス物質、免疫調節物質、抗感染
物質またはワクチンと併用して、有効に投与し得る。

【００７０】本発明の組換え抗ＨＩＶ抗体と他の抗ＨＩ
ＶまたはＡＩＤ治療物質との併用は、ＨＩＶ感染の予防
または治療並びにその後のＡＩＤＳのような病理学的状
態の治療に有効である。ＡＩＤＳの治療またはＨＩＶ感
染の予防もしくは治療は、限定的ではないが、広範なＨ
ＩＶ感染の状態：ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連合併
症）、症候性及び無症候性の実際のもしくは潜在的なＨ
ＩＶ暴露を治療することを含む。例えば、本発明の化合
物の併用は、例えば輸血、血液製剤の使用、偶発的な注
射針の刺傷、体液への暴露、または手術中の患者の血液
への暴露のようなＨＩＶへ暴露されたと推定される後ま
たは前のＨＩＶ感染を治療または予防する上で有効であ
る。

【００７１】上記目的で、本発明の組換え抗ＨＩＶ抗体
と他の抗ＨＩＶまたはＡＩＤＳ治療化合物とは、経口的
に、非経口的に（皮下注射または注入技術を含む）、吸
入スプレーで、直腸内に、腟内に、慣用の無毒性の医薬
的に容認可能な担体、アジュバント及びビヒクルを含む
単位用量形態で一緒に投与される。

【００７２】本発明によれば、更に、ＨＩＶ感染及びＡ
ＩＤＳの予防及び治療のための混合医薬組成物が提供さ
れる。治療は、かかる治療が必要な患者に、医薬担体
と、治療上有効量の本発明の組換え抗ＨＩＶ抗体及び抗
ＨＩＶまたはＡＩＤＳ治療用化合物の混合物とを投与す
ることを含む。

【００７３】上記混合医薬組成物は、経口投与可能な懸
濁液もしくは錠剤、鼻孔スプレー、注射用無菌調製液
（例えば注射用無菌水性もしくは油性懸濁液）、または
座薬の形態とし得る。

【００７４】懸濁液として経口投与される場合、かかる
組成物は医薬製剤分野で公知の技術に従って調製され、
当分野においては公知の、増量用の微晶質セルロース、
懸濁剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウ
ム、増粘剤としてのメチルセルロース、及び甘味料／香
料を含み得る。即時放出錠剤としてはかかる組成物は、
当分野においては公知の微晶質セルロース、リン酸ジカ
ルシウム、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ラクトー
ス及び／または他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、
希釈剤及び滑沢剤を含み得る。

【００７５】鼻孔エーロゾルまたは吸入によって投与さ
れる場合、かかる組成物は医薬製剤分野で公知の技術に
従って調製され、当分野においては公知の、ベンジルア
ルコールもしくは他の適当な保存剤、バイオアベイラビ
リティーを増強するための吸着プロモーター、フルオロ
カーボン、及び／または他の可溶化剤もしくは分散剤を
使用し、生理食塩溶液として製剤化され得る。

【００７６】注射用溶液または懸濁液は、適当な無毒性
の非経口投与に容認可能な希釈剤または溶剤（例えばマ
ンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンガー溶
液または等張塩化ナトリウム溶液）、または適当な分散
剤もしくは湿潤及び懸濁剤（例えば合成モノまたはジグ
リセリドを含む無菌の無刺激・不揮発性オイル及びオレ
イン酸を含む脂肪酸）を使用して、公知の技術に従って
調製し得る。

【００７７】座薬の形態で直腸または腟内投与する場合
には，かかる組成物は、薬物を、常温では固体であるが
体温では液化及び／または溶解して薬物を放出する適用
な非刺激性賦形剤、例えばコカバター、合成グリセリド
エステルまたはポリエチレングリコールと混合すること
により製剤化し得る。

【００７８】本発明の化合物は、ヒトに、体重１ｋｇ当
たり１ｍｇ〜５ｇの投与量を１回でまたは数回に分割し
て経口投与し得る。しかしながら、任意の特定の患者に
対する特定の投与量、投与比（ｄｏｓａｇｅｒａｔｉ
ｏ）、及び投与頻度は変化し、使用する特定化合物の活
性または効能、化合物の代謝安定性及び作用時間、患者
の年齢、体重、体調、性別、食事、投与の形態及び時
間、分泌速度、薬物組合せ、特定状態の程度、治療中の
宿主などの種々の要因に従う。

【００７９】本発明の新規の混合医薬組成物は、本明細
書に記載の組換え抗ＨＩＶ抗体を、ＨＩＶ複製を妨害ま
たは阻害するように機能する１種以上の抗ＨＩＶ剤及び
ＡＩＤＳ関連病態の治療用物質と一緒に含む。かかる抗
ＨＩＶ剤としては、限定的ではないが、ウイルスが細胞
レセプターに付着するのを妨害するもの（例えば可溶性
ＣＤ４及び関連ペプチド、硫酸デキストラン、Ｎ−ブチ
ルＤＮＪ）；ウイルスアセンブリインヒビター（例え
ばカスタノスペルミン、６−０−ブタノイルカスタノス
ペルミン、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉ
ｏｎ）インヒビター）；限定的ではないがヌクレオシド
類縁体（例えばＡＺＴ、ｄｄＣ、ｄｄＩ、ｄ４Ｔ、Ａｚ
ｄＵ、Ａ−６９９９２、ＩＡＦ−ＢＣＨ１８９、ｃａｒ
ｂｏｖｉｒ、Ｆａｓｃａｒｎｅｔ、Ｇａｎｃｉｃｌｏｖ
ｉｒ及びＡｃｙｃｌｏｖｉｒ）及び非ヌクレオシト類縁
体（例えば下記のようなヒドロキシピリドン：３−
｛［（４，７−ジクロロベンゾオキサゾール−２−イ
ル）メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メチル−２−
（１Ｈ）−ピリジノン、３−｛［（４，７−ジメチルベ
ンゾオキサゾール−２−イル）メチル］アミノ｝−５−
エチル−６−メチル−２−（１Ｈ）−ピリジノン、３−
｛［（７−クロロベンゾオキサゾール−２−イル）メチ
ル］アミノ｝−５−エチル−６−メチル−２−（１Ｈ）
−ピリジノン、３−｛［（７−メチルベンゾオキサゾー
ル−２−イル）メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メ
チル−２−（１Ｈ）−ピリジノン、３−｛［（４−フル
オロベンゾオキサゾール−２−イル）メチル］アミノ｝
−５−エチル−６−メチル−２−（１Ｈ）−ピリジノ
ン、３−｛［（７−フルオロベンゾオキサゾール−２−
イル）メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メチル−２
−（１Ｈ）−ピリジノン、３−｛［（ベンゾオキサゾー
ル−２−イル）メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メ
チル−２−（１Ｈ）−ピリジノン、３−｛［（４−クロ
ロベンゾオキサゾール−２−イル）メチル］アミノ｝−
５−エチル−６−メチル−２−（１Ｈ）−ピリジノン、
３−｛［（４−フルオロ−７−クロロベンゾオキサゾー
ル−２−イル）メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メ
チル−２−（１Ｈ）−ピリジノン、及び３−［２−（ベ
ンゾオキサゾール−２−イル）エチル］−５−エチル−
６−メチル−２−（１Ｈ）−ピリジノン）を含む逆転写
酵素インヒビター；転写トランス活性化インヒビター
（例えば７−クロロ−５−（２−ピリル）−３Ｈ−１，
４−ベンゾジアゼピン−２（Ｈ）−オン、またはＲｏ５
−３３３５のようなｔａｔ及びｒｅｖタンパク質インヒ
ビター）；レトロウイルスプロテイナーゼインヒビター
（例えば酵素遷移状態、基質または反応中間体の構造の
非加水分解性化学的模擬体、Ｒ０３９−８９５９〔Ｈｏ
ｆｆｍａｎＬａＲｏｃｈｅ〕）；及びアンチセンス
オリゴヌクレオチド使用のウイルス遺伝子発現インヒビ
ターを挙げることができる。ＡＩＤＳ関連病態の治療に
有効な物質としては、限定的ではないが、日和見感染治
療薬、インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニ
ー刺激因子、インターロイキン２、腫瘍壊死因子及びエ
リトロポエチンを挙げることができる。

【００８０】本発明の好ましい実施態様においては、組
換え抗ＨＩＶ抗体は、ＨＩＶ逆転写酵素インヒビター及
び／またはＨＩＶプロテイナーゼインヒビターと一緒に
医薬組成物中に配合される。好ましい逆転写酵素インヒ
ビターは上述のアミノピリドンである。好ましいプロテ
イナーゼインヒビターは、ヒドロキシエチルアミン遷移
状態模擬体、例えばＲ０３１−８９５９（Ｈｏｆｆｍａ
ｎＬａＲｏｃｈｅ）である。最も好ましいのは、組換
え抗ＨＩＶ抗体と１種以上の上述の逆転写酵素阻害アミ
ノピリドンの併用である。

【００８１】更に、本発明の組換え抗ＨＩＶ抗体は、暴
露前及び／または暴露後に、例えば以下の表に記載する
ようなＡＩＤＳ抗ウイルス薬、免疫調節薬、抗感染薬を
有効量で併用して投与し得る。

【００８２】

【表１】

【００８３】

【表２】

【００８４】

【表３】

【００８５】

【表４】

【００８６】

【表５】本発明の組換え抗ＨＩＶ抗体と、ＡＩＤＳ抗ウイルス
薬、免疫調節薬、抗感染薬またはワクチンとの併用の範
囲は上述の表には制限されず、原則としてＡＩＤＳ治療
に有効な任意の医薬組成物との併用が含まれることが理
解されよう。

【００８７】以下、実施例を与えて本発明を説明する
が、本発明はこれらの実施例に制限されることはない。

【００８８】

【実施例】実施例１ＨＩＶ−１に対するヒトモノクローナル抗体の最適生産この実施例の目的は、ＨＩＶ−１に対するヒトｍＡｂを
生産する細胞系を確立するための最適条件を調査するこ
とである。

【００８９】方法７４のＨＩＶ血清反応陽性個体から誘導した末梢血リン
パ球をＥＢＶを用いて形質転換した。ＨＩＶに対する抗
体を産生した培養体を増殖させ、放射線照射ＧＫ５支持
細胞において２倍希釈法（５０００〜１０細胞／ウェ
ル）によって数回クローニングした。７４標本のうちの
５つは、クローニング及び融合により処理することがで
きた。最初のクローニングと同時に（即ち培養開始の５
〜７週間後）、増殖培養体由来のリンパ芽球様細胞を異
種骨髄腫細胞ＳＨＭ−Ｄ３３と融合した。抗ＨＩＶ陽性
ハイブリッドを１００〜１細胞／ウェルでクローニング
した。ｍＡｂの特異性をＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッ
ト及びＲＩＰによって試験した。

【００９０】結果ＥＢＶ単独によるＰＢＬの無限増殖化により、ヒトｍＡ
ｂを合成する２つの細胞系が生成された。しかしなが
ら、ＥＢＶ形質転換細胞をＳＨＭ−Ｄ３３に融合する
と、ヒトｍＡｂを産生する５つのハイブリッド系が得ら
れた。全ての細胞系は６〜１２ケ月培養した。

【００９１】

【表６】血液細胞をＥＢＶ形質転換してから異種骨髄腫に融合す
ることは、ＨＩＶ−１に対するヒトｍＡｂを生成するの
に最も有効な方法であると見られ、ＥＢＶ形質転換のみ
よりも有効である。

【００９２】実施例２被検者４１人の無症候性ＨＩＶ血清反応陽性個体が実験に参加
した。ＨＩＶに対する血清抗体の存在を、市販のＥＬＩ
ＳＡ（ＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）によって試験
し、ＮｏｖａｐａｔｈＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔＡｓｓ
ａｙ（ＢｉｏＲａｄ）使用のウェスタンブロットによっ
て確認した。各被検体由来のリンパ球ＣＤ４及び及びＣ
Ｄ８表現型が、Ｌｅｕ３ａ及びＬｅｕ２ａ抗体（Ｂｅｃ
ｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ提供）を使用して、Ｃｙｔ
ｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｆII（Ｏｒｔｈｏ）使用のフロー
サイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によ
って確認された。末梢血白血球はＣｏｕｌｔｅｒＣｏ
ｕｎｔｅｒによってカウントし、分画カウント（ｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｏｕｎｔｓ）を手作業で実施し
た。

【００９３】下記の表に示す既出基準〔Ｚｏｌｌａ−Ｐ
ａｚｎｅｒ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：５４０４（１９
８７）〕に基づいて患者を４つのカテゴリに分類するよ
うに、免疫学的段階分けシステムを使用し、疾患の進行
について患者を分類した。

【００９４】

【表７】スクリーニングに使用する合成ペプチドＨＩＶ−１のＭＮ株のｇｐ１２０Ｖ３ループの２３ア
ミノ酸に広がるペプチド（２３ｍｅｒペプチド）を固相
法〔ＰｅｎｉｎｓｕｌａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｉｎｃ．Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ〕によって合成した。ペ
プチドは配列：ＴｙｒＡｓｎＬｙｓＡｒｇＬｙｓＡｒｇ
ＩｌｅＨｉｓＩｌｅＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇＡｌａＰ
ｈｅＴｙｒＴｈｒＴｈｒＬｙｓＡｓｎＩｌｅＩｌｅＧｌ
ｙ（配列番号２）を有していた。このペプチドをＥＬＩ
ＳＡアッセイに使用し、これに対して反応性を示す抗体
をスクリーニングした。

【００９５】ＥＢＶ形質転換細胞系の確立ＨＩＶ−１に対するｍＡｂを合成するヒト細胞系を製造
する方法はＧｏｒｎｙｅｔａｌ．，１９８９（上掲）
によって記載されている。末梢血単核細胞をエプスタイ
ン−バールウイルス（ＥＢＶ）と一緒にインキュベート
し、９６ウェルマイクロプレート中で３〜４週間培養し
た。ＥＬＩＳＡにおいて２３ｍｅｒペプチドを使用して
培養液上清中の抗体をスクリーニングした後、抗体に対
して陽性の上清を有する培養液から得た細胞を増殖し、
数回にわたって継代培養し、最終的にフラスコ中で増殖
させた。かかる細胞はリンパ芽球様細胞と称される。

【００９６】細胞融合異種骨髄腫細胞（マウス−ヒトハイブリッド）ＳＨＭ−
Ｄ３３〔ＴｅｎｇＮ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：７３０８
（１９８３）〕を、１５％ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−
グルタミン、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）及びスト
レプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したＩｓｃ
ｏｖｅ改良ダルベッコ培地（完全培地）中で増殖させ
た。定期的に抗生物質Ｇ４１８を２００μｇ／ｍｌで用
いてネオマイシン感受性変異体を排除しながら、異種骨
髄腫細胞を培養した。

【００９７】融合する２日前に、ＳＨＭ−Ｄ３３細胞を
濃度１〜２×１０⁵細胞／ｍｌの濃度で培養した（対数
増殖）。細胞生存率は、エリスロシンＢ色素排除によっ
て評価したところでは９５％を超えていた。

【００９８】ＳＨＭ−Ｄ３３細胞をリン酸緩衝塩類溶液
で２回洗浄し、次いで一次培養液から増殖させたもので
クローニングはしていないリンパ芽球様細胞と混合し
た。細胞は比１：３で混合し、遠心した。次いでペレッ
トに１ｍｌの５０％ポリエチレングリコール１３００−
１６００（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ）を１分間
で一定に撹拌しながら加え、更に１分間撹拌を続けた。
次の５分間で、細胞をＩｓｃｏｖｅ培地で希釈し、２０
０×ｇで遠心することによりペレット化してから、細胞
を完全培地中に静かに再懸濁させ、９６ウェルマイクロ
プレート内に８×１０⁴細胞／１００μｌ／ウェルの濃
度で塗り広げた。翌日、各ウェルに１×１０⁴マウス腹
膜細胞を支持細胞として加え、０．５ｍＭヒポキサンチ
ン、０．２μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン（Ｈ
ＡＴ）及び１μＭウワバイン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉ
ｃａｌｓ）の存在下に培養を続けた。ＨＡＴを補充した
新鮮な完全培地を１週間に２回ずつ繰返し供給した。２
〜３週間後、全ての培養ウェルを、上述のペプチドに対
する抗体産生についてスクリーニングし、２３ｍｅｒペ
プチドに反応性を示す抗体を産生するヘテロハイブリッ
ドを２４ウェルプレート内で増殖させた。ＥＬＩＳＡで
測定して最高レベルの抗体（及びＩｇＧ）を産生したハ
イブリッドを１００、２５及び（少なくとも２回は）１
細胞／ウェルの濃度でクローニングした。

【００９９】抗体検出及び特性分析培養液上清をＥＬＩＳＡによって２３ｍｅｒに対してス
クリーニングした。Ｉｍｍｕｌｏｎ２プレート（Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ）を合成ペプチド（１μｇ／ｍｌ）を用いて
４℃で一晩かけて被覆し、炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
９．６で希釈した。プレートを３回洗浄し、培養液上清
を各ウェルに加え、３７℃で９０分間インキュベート
し、次いで洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ（Ｚｙ
ｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に結合させたヤギ
抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異性）を加え、３７℃で更に９０
分間インキュベートし、上述のごとく洗浄した。基質と
してｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＳｉｇｍａＣ
ｈｅｍｉｃａｌｓ）を３０分間かけて加え、ＭＲ７００
マイクロプレート読取り装置（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）にお
いて４０５ｎｍにおける吸収を読み取った。

【０１００】抗体結合の特異性をラジオイムノ沈降法
（ＲＩＰ）によって評価した。ＲＩＰアッセイは、Ｐｉ
ｎｔｅｒら〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１２：
７３５（１９８８）〕の方法により、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈ
ｕｎｔｅｒ試薬（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅ
ａｒ）を使用して¹²⁵Ｉ標識したＨＴＬＶ−IIIＢ溶解物
（ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａ）及び／またはＭＮ
溶解物（ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて実施した。培養液上清をウ
イルス溶解物と一緒にインキュベートし、Ｇｏｒｎｙら
（上掲）及びＰｉｎｔｅｒら（上掲）によって記載され
ているように更に処理した。

【０１０１】ヒト抗体の分析抗体イソタイプをＥＬＩＳＡによって決定した。Ｉｍｍ
ｕｌｏｎ２プレートを１μｇ／ｍｌの２３ｍｅｒで被覆
し、培養液上清と一緒にインキュベートした。ＩｇＧ
ｍＡｂのサブタイプを、４つのサブクラスのヒトＩｇＧ
（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対するアル
カリ性ホスファターゼ標識マウスｍＡｂによって検出し
た。

【０１０２】ｍＡｂのＬ鎖を、ヒトκ鎖またはλ鎖（Ｄ
ａｋｏｐａｔｔｓ）に対するウサギ抗体で被覆したマイ
クロプレート使用のＥＬＩＳＡによって分析した。使用
した誘導抗体（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ）はそれぞれアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ
抗ヒトκ鎖及びヤギ抗ヒトλ鎖（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ
ｉｃａｌｓ）であった。

【０１０３】ＩｇＧ定量もＥＬＩＳＡによって行なっ
た。プレートをヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異性）で被覆
し、一連の希釈培養液上清と一緒にインキュベートし
た。結合したＩｇＧを、アルカリ性ホスファターゼ標識
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異性）を用いて検出した。ア
フィニティー精製ヒトＩｇＧ（ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋ
ｎｉｋａ−Ｃａｐｐｅｌ）を標準として使用した。自動
ＭＲ−７００マイクロプレート読取り装置（Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してプレー
トを読取り、標準曲線を作成した。

【０１０４】エピトープマッピングｍＡｂの厳密な特異性を、ＥｐｉｔｏｐｅＭａｐｐｉ
ｎｇＫｉｔ〔ＣａｍｂｒｉｇｅＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＶａｌｌｅｙＳｔｒｅａ
ｍ，ＮｅｗＹｏｒｋ〕を使用して決定した。これは、
Ｇｅｙｓｅｎら〔Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）８１：３９９８−４００２（１９８４）〕によっ
て開発された方法を使用してプラスチックピン上にヘキ
サペプチドを合成するものである。２３ｍｅｒにまたが
る１８個の順次重複するヘキサペプチドをプラスチック
ピン上にｉｎｓｉｔｕ合成し、更に２つの対照ペプチ
ドを合成した。ペプチドを脱保護し（ｄｅｐｒｏｔｅｃ
ｔｅｄ）、次いで製造業者指示に従って洗浄及び乾燥し
た。ピンの構成が９６ウェルマイクロプレートに適合し
ているので、製造業者によって推奨されるように、ＥＬ
ＩＳＡアッセイを標準マイクロプレートにおいて実施し
た。即ち、全てのペプチド含有ピンを、１％オボアルブ
ミン及び１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中の０．
１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１：１０に希釈した試験中の細
胞系由来の培養液上清と反応させた。次いで、ピンを洗
浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇ
Ｇと反応させた。ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ−７００プレー
ト読取り装置において４０５ｎｍにおける吸収として呈
色反応を読み取った。

【０１０５】結果４１のＨＩＶ血清反応陽性個体から誘導した全部で４６
の血液標本をＥＢＶで処理して形質転換した。３〜４週
間培養した後、ＥＬＩＳＡによって明らかになったとこ
ろでは、平均２．９％のウェルがＶ３ループの２３ｍｅ
ｒに対する抗体について陽性であった。表ＩＩは、評点
１を有する患者のグループにおいて陽性ウェルの割合が
僅かに上昇しているが、別の疾患重症レベルを有する患
者由来の陽性培養液の産生においては有意な差はなかっ
たことを示している。

【０１０６】

【表８】陽性ウェルから得たリンパ芽球様細胞を更に２４ウェル
プレート中で増殖させ、１週間に１度、２３ｍｅｒペプ
チド使用のＥＬＩＳＡによって新鮮な培養液上清の抗体
特異性について試験した。２３ｍｅｒに対する特異的抗
体を高レベルで産生した２つのリンパ芽球様細胞系，２
５７−２（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１０４８３）及び２６８−
１１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１０４８２）を２倍希釈法（１
０，０００〜１０細胞／ウェル）によってクローニング
した。抗体を産生し続ける最低細胞密度で平板培養した
ウェルから得た細胞を１００〜１０細胞／ウェルで更に
３回クローニングした。

【０１０７】最初のクローニングと同時に、両リンパ芽
球様細胞系（２５７−２，２６８−１１）を異種骨髄腫
細胞ＳＨＭＤ−３３と融合した。全てのウェルがハイ
ブリッド細胞の増殖を示した。融合の３週間後、２５７
−２ヘテロハイブリッドを平板培養した１８３のウェル
のうちの５０（２９％）及び２６８−１１ヘテロハイブ
リッドを平板培養した４８のウェルのうちの４３（９０
％）が、２３ｍｅｒに対する抗体を含むことが判明し
た。各融合から、（ＥＬＩＳＡにおける吸収に基づい
て）最高濃度の抗体を産生する１８のクローンを２４ウ
ェルプレートにおいて増殖させた。抗体の産生を週ごと
にモニターし、最高の特異的抗体及びＩｇＧ濃度を与え
る細胞生成上清をクローニング用に選択した。ヘテロハ
イブリドーマをまず１００及び２５細胞／ウェルで、次
いで１細胞／ウェルで２回クローニングした。

【０１０８】リンパ芽球様細胞系２５７−２（ＡＴＣＣ
＃ＣＲＬ１０４８３）及び２６８−１１（ＡＴＣＣ＃Ｃ
ＲＬ１０４８２）はそれぞれ６．４及び３．８μｇＩ
ｇＧ／ｍｌ／１０⁶細胞／２４時間を産生したが、関連
ヘテロハイブリドーマ２５７−２Ｄ（ＡＴＣＣ＃ＨＢ
１０４８０）及び２６８−１１Ｄ（ＡＴＣＣ＃１０４８
１）はそれぞれ２０．５及び１１．３μｇＩｇＧ／ｍ
ｌ／１０⁶細胞／２４時間を産生した。２３ｍｅｒをマ
イクロタイタープレートのウェルに１ｎｇ／ｍｌ（図
１）ほどの低い濃度で結合させたときでさえ、ｍＡｂは
ＥＬＩＳＡにおいて２３ｍｅｒと反応することが判明し
た。

【０１０９】かかるｍＡｂの特異性をＲＩＰによって更
に規定し、その結果を図２に示す。両ｍＡｂはＨＩＶ_MN
のｅｎｖにコードされるタンパク質ｇｐ１２０には反応
するが、ＨＴＬＶ−III_Bから誘導されるｇｐ１２０とは
反応しないことから、かかるｍＡｂのタイプ特異性が明
らかとなった。

【０１１０】ｍＡｂは、λＬ鎖を有するＩｇＧイソタイ
プであることが判った。表IIIは、２種のＥＢＶ形質転
換親系及び２種の関連ヘテロハイブリドーマの幾つかの
特性を示している。ＥＢＶ形質転換系は文献〔Ｋｏｚｂ
ｏｒ，Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ
４：７２（１９８３）；Ｃａｓａｌｉ，Ｐ．ｅｔａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：４７６（１９８６）；
及びＳｔｅｉｎｉｔｚ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ２６９：４２０（１９７７）〕に記載されているほ
とんどのＥＢＶ形質転換系よりもかなり多く産生する
が、ヘテロハイブリドーマは、２４時間でＥＢＶ形質転
換系の３倍のＩｇＧを産生する。

【０１１１】

【表９】各抗体の厳密な特異性を決定するために、アミノ酸５つ
ずつ重複した一連のヘキサペプチドを与える重複ヘキサ
ペプチドを使用してエピトープマッピングを実施した。
１つのマイクロプレートで４つの試料を同時に試験し得
るように、各ペプチドを４つずつ合成した。重複抗原領
域及びかかる実験結果を表ＩＶに示す。

【０１１２】血清反応陰性血清プールは反応性を示さな
かった。血清反応陽性血清試料（ＨＩＶ血清反応陽性個
体の血清を１：１０００に希釈したもの）は全てのピン
とバックグラウンドレベル以上で反応し、Ｖ３ループの
先端及び右側の領域ＰＧＲＡＦＹＴＴ（配
列番号３）に広がる３つのピンとの反応にピークを示し
た。

【０１１３】１：１０（３．７μｇ／ｍｌ）に希釈した
ｍＡｂ２５７−２Ｄは、ループＲ−Ｋ−Ｒ−Ｉ−Ｈ−Ｉ
−Ｇ（配列番号４）の先端の左側のアミノ酸３０９−３
１５を与える２つの隣接するヘキサペプチドに強力に結
合した。ｍＡｂ２６８−１１Ｄ（５．４μｇ／ｍｌ）
は、アミノ酸配列Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ（配列番号
５）に広がる１つのヘキサペプチドに結合した。表ＩＶ
は、２つのｍＡｂによって認識された重複抗原領域を示
す。

【０１１４】

【表１０】上記結果は、２５７−２Ｄが認識する最小の反応性ペプ
チド（エピトープの核）は、Ｖ３ループの保存先端の左
側に位置するＫＲＩＨＩ（配列番号２３）であ
ることを示している。フランキングＮ及びＣ末端アルギ
ニン及びグリシン残基もこのｍＡｂの結合に寄与し得
る。ｍＡｂ２６８−１１Ｄは、ループの先端及び２つ
の隣接Ｎ末端アミノ酸に広がるＨＩＧＰＧＲ
（配列番号５）からなる単一ヘキサペプチドに結合し
た。

【０１１５】実施例３ＥＢＶ形質転換リンパ球を長期増殖しないヒトヘテロハ
イブリドーマ生産方法ＥＢＶ無限増殖化細胞を２４ウェルマイクロプレート内
で２〜３週間増殖させた後、ＥＢＶ形質転換細胞と異種
骨髄腫ＳＨＭ−Ｄ３３とを通常に融合した。これは、培
養開始後５〜７週間に相当する。しかしながら、培養ウ
ェルの大部分（９０％以上）が増殖期間中にｍＡｂ産生
に対して陰性となるため、増殖期間はｍＡｂ生産におい
て極めて重要である。従って本発明者らは、増殖期間を
除外し、培養開始の３〜４週間後に融合を行なう別の方
法を試験した。即ち、ＥＢＶ形質転換細胞を含む９６ウ
ェルプレートを、培養開始の３〜４週間後にＨＩＶ−１
に対する抗体の存在についてスクリーニングした。抗Ｈ
ＩＶ−１抗体を産生する全てのウェルから得た細胞をプ
ールし、実施例２に記載のごとく異種骨髄腫ＳＨＭ−Ｄ
３３と直ちに融合した。

【０１１６】結果４つのＨＩＶ血清反応陽性個体から誘導されたＰＢＬ
は、ＥＢＶ形質転換してから早期融合すると、ＨＩＶ−
１に対するｍＡｂを分泌する８種の細胞系を産生した。
ＲＩＰ及びＥＬＩＳＡによって評価したところ、６種の
ｍＡｂはＨＩＶ−１のｐ２４に対するものであり、２種
のｍＡｂはｇｐ４１に対するものであった。実施例１及
び２に記載のごとくＥＢＶ形質転換またはＥＢＶ形質転
換及び融合によって、３００の患者から２１の安定系を
得た。これは、２０〜４０ｍｌの患者血液を使用した場
合には１００患者標本当たり６〜７の系に相当する。本
実施例に記載の“早期融合法”を使用して、４つ患者標
本から８つの系を得たが、安定な抗体産生系を得る効率
の有意な増加があった。

【０１１７】考察陽性ウェルを増殖しないＥＢＶ形質転換細胞の早期融合
は、ＨＩＶ−１に対するヒトｍＡｂを生産する本発明者
らの従前の方法よりも効果的な方法である。

【０１１８】実施例４モノクローナル抗体アフィニティーの評価Ｂ．Ｆｒｉｇｕｅｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ７７：３０５−３１９（１９８５）
に記載のＥＬＩＳＡ法を使用し、ヒトｍＡｂの解離定数
（Ｋ_d）を決定した。簡単に述べると、２５７−２Ｄ及
び２６８−１１Ｄの培養液上清をそれぞれ０．５及び
０．６μｇ／ｍｌの濃度で試験した。上述の２０ｍｅｒ
（ＭＷ＝２７０２Ｄａ）を蒸留水に濃度１ｍｇ／ｍｌ
（３．７×１０^-4Ｍ）で溶解し、リン酸緩衝塩類溶液ｐ
Ｈ７．２で希釈し、１０^-5〜１０^-8Ｍの濃度で使用し
た。上清及びペプチドを同量で混合し、１６時間後、混
合物を、２３ｍｅｒ（１μｍ／ｍｌ）で被覆したプレー
トに加え、未結合ｍＡｂの量をＥＬＩＳＡによって測定
した。Ｋ_dを決定するためにＫｌｏｔｚ法のＦｒｉｇｕ
ｅｔ改良法〔Ｆｒｉｇｕｅｔｅｔａｌ．，上掲〕に
従ってデータをプロットした。

【０１１９】ｍＡｂ２５７−２Ｄ及び２６８−１１Ｄ
のＫ_dはそれぞれ２．３×１０^-7及び５．９×１０^-7Ｍ
であることが判明した。かかる値は、ＩｇＧｍＡｂに
ついて他の研究者〔Ｆｒｉｇｕｅｔｅｔａｌ．，上
掲；Ｌａｒｓｓｏｎ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：５６９−５７６（１９８
７）〕によって報告されている範囲内にある。ヒトリン
パ芽球様細胞系（２５７−２及び２６８−１１）によっ
て産生されるｍＡｂのＫ_dは、関連ヘテロハイブリドー
マ（２５７−２Ｄ及び２６８−１１Ｄ）によって産生さ
れるｍＡｂと同様であった。上述のＫ_dは、２０ｍｅｒ
ペプチドに対するｍＡｂの結合についてのものである。
天然ｇｐ１２０分子に対するｍＡｂのＫ_dは、ｍＡｂが
反応するエピトープに対するタンパク質分子全体の立体
構造が原因となってより低いことが考えられる。

【０１２０】実施例５ＨＩＶ感染性の中和ＭＴ−２細胞のＨＩＶ感染の阻害を測定するプラークア
ッセイを使用し、ヒト補体の存在下または不在下での本
発明のｍＡｂの中和活性を検出した〔Ｃ．Ｖ．Ｈａｎｓ
ｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．１
２８：（１９９０）；Ｈａｒａｄａｅｔａｌ．，
（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，ｐｐ．５６３
−５６６〕。即ち、ｍＡｂを５０％アッセイ培地〔Ｈａ
ｎｓｏｎｅｔａｌ．，上掲〕及び５０％の正常ヒト血
漿プールで順次希釈した。血漿プールはヒト補体源とし
て作用した。補体存在下の試験においてはｍＡｂ及びウ
イルスを３７℃で１８時間インキュベートした。補体不
在下の試験においては、血漿プールを熱失活させ、ｍＡ
ｂ及びウイルスをかかる条件下で３７℃で１時間インキ
ュベートした。プラークカウントに基づき初期ウイルス
の５０％が中和された希釈度を、各希釈度における平均
プラークカウントの３次回帰分析を使用して補間するこ
とにより計算した。

【０１２１】結果２５７−２Ｄ及び２６８−１１Ｄ由来の上清液をＨＩＶ
_MNと一緒に１時間（補体なし）インキュベートしてか
ら、許容ＭＴ−２細胞に加えると、それぞれ３．０及び
２３．０ｎｇ／ｍｌのｍＡｂ濃度に相当する１：４，７
００及び１：２，０００の希釈度で５０％中和が達成さ
れた（表５）。ＨＴＬＶ−IIIＢの中和は認められなか
った。

【０１２２】２５７−２Ｄ及び２６８−１１Ｄ由来のｍ
Ａｂを、抗体をウイルスと一緒にヒト補体の存在下に１
８時間インキュベートするという感受性のより高いアッ
セイで試験すると、それぞれ０．３及び１．１ｎｇ／ｍ
ｌのｍＡｂ濃度に相当する１：４４，０００及び１：４
１，０００の希釈度で中和が達成された。ここでも、か
かる条件下でＨＴＬＶ−IIIＢの中和は生じなかった。

【０１２３】Ｇｏｒｎｙ，Ｍ．Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８
６：１６２４−１６２８（１９８９）に既に記載されて
いる、ＨＩＶトランスメンブランタンパク質ｇｐ４１に
特異的なヒトｍＡｂ５０−６９及びコアタンパク質ｐ２
４に特異的なｍＡｂ７１−３１を並行して試験したが、
両ＨＩＶ株に対する中和活性は実質的に示されなかっ
た。

【０１２４】

【表１１】実施例６分岐ウイルス株と反応するＨＩＶ−１Ｖ３ループに対
するヒトｍＡｂ上述の方法を使用し、ＨＩＶ_MNｇｐ１２０のＶ３ループ
に特異的なヒトｍＡｂを産生する別のＥＢＶ形質転換細
胞系及びヘテロハイブリドーマを生産した。幾つかのヘ
テロハイブリドーマを３８６−Ｄ、３９１−Ｄ、４１９
−Ｄ、４４７−５２Ｄ、４７７−Ｄ、３１１−１１Ｄ、
３９１−９５Ｄ及び４１２−Ｄと称した。かかるｍＡｂ
の幾つかの反応性パターンを（上述の）２５７−２Ｄ及
び２６８−１１Ｄと比較し、下記の表６に示す。

【０１２５】

【表１２】上記結果から以下の結論が導かれる。（１）Ｖ３ループ
の先端はヒトｍＡｂによって認識されるエピトープクラ
スターを構成する；（２）ヒトｍＡｂはＥＬＩＳＡにお
いて、分岐ＨＩＶ−１株由来の合成Ｖ３ペプチドの一部
または全部と交差反応する；（３）主にループの最も保
存されている領域のＮ末端の領域に対するｍＡｂ（２５
７−２Ｄ）を含む試験した全ての抗Ｖ３（ＭＮ）ヒトｍ
Ａｂは、ＭＮウイルスを中和する；（４）コアエピトー
プ内の５つのアミノ酸のうち２つを交換しても交差中和
が生じ得る（例えば２５７−２ＤはＭＮ及びＳＦ−２と
反応する）が、コアエピトープ内のある種の変更は中和
活性を阻害する（例えば２６８−１１ＤはＭＮとは反応
するがIIIＢとは反応しない）；及び（５）ＥＬＩＳＡ
で検出される交差反応は、生物学的アッセイで測定され
る交差反応性よりも厳密ではない。

【０１２６】ＨｕＭｏＡｂ４４７−５２Ｄが反応するエ
ピトープを更に同定するために、ＨｕＭｏＡｂを、スク
リーニングに使用する２３ｍｅｒによって与えられるＶ
３_MNの領域に広がる１８のヘキサペプチドとの反応性に
ついて試験した。各ヘキサペプチドは隣のヘキサペプチ
ドとアミノ酸５つずつ重複していた。Ｇｅｙｓｅｎｅｔ
ａｌ．，（１４）の方法を使用してポリエチレンピン
上にｉｎｓｉｔｕ合成されたヘキサペプチドを、２９
μｇ／ｍｌのＨｕＭｏＡｂを含む培養液上清と反応させ
た。図１は、ＨｕＭｏＡｂが３種のヘキサペプチド、即
ちＨＩＧＰＧＲ（配列番号１３）、ＩＧＰＧＲＡ（配列
番号１４）及びＧＰＧＲＡＦ（配列番号１５）と反応し
たことを示している。かかるデータから、ＨｕＭｏＡｂ
４４７−５２Ｄが作用するエピトープはｈｉＧＰＧＲａ
ｆ（ここで大文字のアミノ酸コードはエピトープのコア
を表わし、小文字は、エピトープの結合に寄与し得るフ
ランキングアミノ酸を表わす）であることが判る。

【０１２７】領域内のどのアミノ酸がＨｕＭｏＡｂの結
合に不可欠であるか決定するため、ＨＩＧＰＧＲヘキサ
ペプチドの各残基が１９種のアミノ酸で置換された一連
のヘキサペプチドをポリエチレンピン上で合成した。即
ち１１５種類のヘキサペプチドを合成し、それぞれをＨ
ｕＭｏＡｂ４４７−５２Ｄと濃度ｍｇ／ｍｌで反応させ
た。この実験結果を図７に示す。実験結果から、ＨＩＧ
ＰＧＲの１番目、２番目及び５番目の残基はかなり変更
し得、尚検出可能な反応性を示すことが判る。例えば２
番目のＩをＣ、Ｄ及びＥに変えるような許されない置換
は、これまでに配列決定されたウイルス単離体において
は決してまたはめったに見られない〔Ｍｅｙｅｒｓｅ
ｔａｌ．，（１９９０），Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ
ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｌｏ
ｓＡｌａｍｏｓ；ＬａＲｏｓａｅｔａｌ．，（１９
９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，ｐｐ９３２〕。しか
しながら、上記ヘキサペプチドの３番目、４番目及び６
番目の残基は、ペプチドのＨｕＭｏＡｂと反応する能力
を阻害することなく変更することはできない。これらの
データから、ＨｕＭｏＡｂ４４７−５２Ｄのコアエピト
ープは最も正しくはＧＰＸＲと表され、このエピトープ
にフランク配置するアミノ酸配列は、このコアエピトー
プの抗体認識に実質的には寄与しないことが示唆され
る。

【０１２８】実施例７分岐ＨＩＶ株のＶ３ループの合成ペプチドに対するヒト
ｍＡｂの交差反応性と親和性の関係上述のヒトｍＡｂの反応性を、プレート上に濃度１μｇ
／ｍｌで被覆した種々の合成ペプチド（１９ｍｅｒ〜２
３ｍｅｒ）に対する直接ＥＬＩＳＡによって測定した。
かかるペプチドへの結合の解離定数（Ｋ_d）として測定
した抗体親和性を、上述の実施例４に記載のごとく決定
した。

【０１２９】結果を表７に示す。２〜４μｇ／ｍｌの抗
Ｖ３ヒトｍＡｂはＥＬＩＳＡにおいて、ＨＩＶ−１株Ｍ
Ｎ、ＳＦ−２及びＲＦのＶ３領域の合成ペプチドと交差
反応した。ＨＩＶ−１株IIIＢから誘導されたＶ３ペプ
チドとの反応は検出されなかった。かかるペプチドへの
結合に対するＫ_dは≧１０^-6Ｍ（ＲＦに結合した２６８
−１１Ｄ）から１０^-7Ｍ（ＭＮに結合した２６８−１１
Ｄ）であった。

【０１３０】

【表１３】上記結果から以下の結論が導かれる：（１）ＨＩＶ−１
Ｖ３領域に特異的なヒトｍＡｂは、ＥＬＩＳＡまたは
抗体親和性で測定したところでは、分岐ウイルス株のＶ
３領域に交差反応性を示す；（２）種々のＶ３ペプチド
に対するヒトｍＡｂの親和性は約１桁以上変動し得る；
（３）単に関連エピトープのアミノ酸配列だけでは親和
性の差は説明されない；及び（４）同一のエピトープ特
異性を有するヒトｍＡｂでも、異なるＶ３ペプチドに対
しては親和性が変化する。

【０１３１】実施例８多数の別のヒトｍＡｂを生産し、上述の方法を使用して
試験した。これらの抗体並びにそれらの特異性及び親和
性を下記の表８に記載する。

【０１３２】５種のヒトｍＡｂの解離定数と中和能の相
関を分析した。結果は、これら２つの特性には直接相関
があり、Ｖ３ループ由来の２３ｍｅｒペプチドへの結合
の親和性はウイルス中和能の優れた指標であることを示
唆している。

【０１３３】

【表１４】

【０１３４】

【表１５】実施例９組換え４４７−５２Ｄ抗体の製造Ｌ鎖の可変ドメインが、ヒトλ２不変域の短いイントロ
ンセグメントとλ２不変域コーディングドメインとを含
むＤＮＡフラグメントに融合された、ヘテロハイブリド
ーマ４４７−５２ＤＬ鎖可変域のシグナル配列及びＬ
鎖イントロン配列付加物を含む抗体を作製した。Ｈ鎖の
可変ドメインも同様に、ヒトγ１不変域の短いイントロ
ンセグメント及びゲノム形態のヒトγ１コーディングド
メインを含むフラグメントに融合された、同じシグナル
配列及びＨ鎖イントロン配列が付加されたヘテロハイブ
リドーマ４４７−５２ＤのＨ鎖Ｖ域から誘導した。

【０１３５】全ＲＮＡを、グアニジウムイソチオシアネ
ートによる細胞溶解を含む標準的な方法〔Ｃｈｉｒｇｗ
ｉｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：５２９４
−５２９９（１９７９）〕を使用して４４７−５２Ｄヘ
テロハイブリドーマ細胞から抽出した。ヒトλＬ鎖可変
域及びλＬ鎖不変域のシグナルペプチド内の配列または
ヒトＨ鎖可変域及びＨ鎖γ３不変ドメインのフレームワ
ーク１内の配列を与えるオリゴデオキシヌクレオチドプ
ライマーのセット（図１）を、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍ３８１ＡＤＮＡ合成装置において標準的
なホスホアミド化（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）
によって合成した。濃ＮＨ₄ＯＨで処理することにより
オリゴデオキシヌクレオチド（オリゴ）を樹脂から取り
出し、製造業者推奨に従って、（オリゴ長が４５塩基以
下の場合には）ＮＡＰ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）上でＨ₂Ｏ溶出液、また（オリゴ長が４５塩基以上
の場合には）ＯＰＣカラム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）で２０％アセトニトリル溶出
液を用いて脱塩した。全ＲＮＡ（２μｇ）を、５０ｍＭ
ＴＲＩＳＨＣｌ，ｐＨ８．３、７５ｍＭＫＣｌ、
３ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ及び２０単位の
ＲＮＡｓｉｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む緩衝液（終
容積２０μｌ）中で、ＡＭＶ逆転写酵素（２００単位，
ＢＲＬ）及びＨ鎖またはＬ鎖を与える不変域相補鎖プラ
イマー１０ｐｍｏｌを使用し、４２℃で３０分間逆転写
させた。逆転写酵素を熱失活させ（９５℃，５分間）、
反応液を、１００μｌのＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭＴＲ
ＩＳＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．５
ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチン、各々２００μ
ＭのｄＮＴＰ）中に、各々５０ｐｍｏｌのプライマー対
と２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥ
ｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）を含むように調製した。実質的
にＳａｉｋｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３
０：１３５０−１３５４（１９８５）及びその他〔Ｍｕ
ｌｌｉｓｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：
２６３−２７３（１９８６）；Ｄａｗａｓａｋｉａｎ
ｄＷａｎｇ，ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉ
ｃｈ，Ｅｄ．，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹ，
ｐｐ．８９−９７（１９８９）；Ｔｕｎｇｅｔａ
ｌ．，同前，ｐｐ．９９−１０４（１９８９）〕に記載
のごとく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施
した。ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒ
ｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ；１’，９４℃；２’，５５℃；２’７２℃）によ
って４５サイクル増幅した後に、予想された１４００及
び７００塩基対（ｂｐ）のＤＮＡフラグメントをゲル精
製した。かかるＤＮＡを中間プラスミド中にサブクロー
ニングする前に、ＤＮＡをＥｃｏＲＩ（Ｈ鎖）またはＥ
ｃｏＲＩ及びＳａｌＩ（Ｌ鎖）で消化し、アガロースゲ
ル電気泳動によって精製した。Ｈ鎖ｃＤＮＡは、既存の
ＫｐｎＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間にＮｃｏＩ及びＮｏ
ｔＩ部位を挿入したｐＵＣ１８誘導体中にクローニング
し、Ｌ鎖はｐＵＣ１８中にクローニングした。かかるＰ
ＣＲ増幅配列を与える複数クローンを、既出方法〔Ｍａ
ｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ
Ｙ，１９８２〕によって、５０μｇ／ｍｌアンピシリン
を含むＬＢ寒天プレート上で平板培養したＤＨ５形質転
換Ｅ．ｃｏｌｉから単離した。Ｂｉｒｎｂｏｉｎａｎ
ｄＤｏｌｙ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．
７：１５１５（１９７９）のＤＮＡ調製方法を使用して
プラスミドＤＮＡを細菌から抽出し、二重鎖プラスミド
ＤＮＡを、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（Ｕｎｉｔ
ｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）と、
最初は製造業者推奨のプロトコルに従ってＴ７及びＳＰ
６特異的配列決定プライマー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とを使用し、ＤＮＡの配列を決定し
た。ヒトγ３Ｈ鎖を与える固有のＤＮＡ配列を得、同様
にヒトλＬ鎖配列を与える配列も得た。

【０１３６】ＰＣＲ増幅によって５種のＤＮＡフラグメ
ントを生成するのに必要なプライマーを与える８種のオ
リゴデオキシヌクレオチド（図３）を合成した。ターミ
ナルオリゴデオキシヌクレオチドを除く全てに組み込ん
だのは、４４７−５２ＤヘテロハイブリドーマのＨ鎖Ｖ
域またはＬ鎖Ｖ域に対応する配列、または４４７−５２
ＤＶ域に結合されるべきシグナル及びイントロンフラ
グメントと相補的な配列並びに１５塩基以上の５’末端
相補配列である（図３及び図４参照）。適当なプライマ
ー対（各々５０ｐｍｏｌ）を、４４７−５２ＤＨ鎖ｃＤ
ＮＡまたは４４７−５２ＤＬ鎖ｃＤＮＡを与えるプラス
ミドＤＮＡ１０ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位、
ＰＣＲ反応成分及び緩衝液と混合し、２５サイクルのＰ
ＣＲ増幅を実施した（サイクル時間：１’，９４℃；
１’，５５℃；２’，７２℃）。アガロースゲル電気泳
動によって精製した５種の反応生成物を、ターミナルオ
リゴデオキシヌクレオチドプライマー対（図３及び図
４）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ反応成分及
び緩衝液と適当に混合し（各々１０ｎｇのＤＮＡフラグ
メント）、次いで組換えフラグメントを上述のごとき２
５サイクルのＰＣＲによって増幅した。シグナル及びイ
ントロン配列付加Ｈ鎖Ｖ域をＨｉｎｄIII及びＸｈｏＩ
で制限エンドヌクレアーゼ消化してから、増幅されたＤ
ＮＡをアガロースゲル電気泳動によって精製し、以下の
ように得られるヒトγ１不変域を含むベクター（ｐ９１
０３）の適合部位中にクローニングした（図５に示
す）。ｃｏｓＩｇ９コスミドクローン（Ｆｌａｎａｇａ
ｎａｎｄＲａｂｂｉｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ３００：
７０９−７１３，１９８２）からＤＮＡを精製して、ヒ
トγ１不変域のＰＣＲ増幅用の鋳型として作用させた。
各々５０ｐｍｏｌの適当なプライマー対（Ｇ１及びＧ
２，図１）を、ヒトγ１不変域エキソンを含むコスミド
ＤＮＡ１０ｎｇ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５
単位と混合して、２５サイクルのＰＣＲ増幅を実施した
（サイクル時間：１’，９４℃；１’，５５℃；２’，
７２℃）。ＰＣＲ生成物をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩエン
ドヌクレアーゼで消化し、アガロースゲル電気泳動によ
って精製し、前記制限酵素で予め消化しておいたｐ９１
０２ベクター中にクローニングした。上述のごとき誘導
された４４７−５２ＤＨ鎖可変域及びゲノムＤＮＡのＰ
ＣＲ増幅によって誘導されたヒトγ１不変域の両方を含
むベクターを与える個々のクローンを使用して、組換え
修飾された４４７−５２ＤコーディングドメインのＤＮ
Ａ配列を検証した（図２ａ）。

【０１３７】上述のＰＣＲ増幅されたシグナル及びイン
トロン付加Ｌ鎖Ｖ域をＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化
し、このＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動
によって精製して、４４７−５２ＤヒトＬ鎖組換えベク
ターを構築した。このＶ域コーディングＤＮＡを、ヒト
Ｌ鎖不変域エキソンを与えるＤＮＡフラグメントと一緒
に、ＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩで予め消化しておいた
ｐＳＰ７２／５８．２／Ｌ１６ＶＨ／γ１ＭＲＣ（下
述）中にクローニングした。先のヒトＬ鎖不変域エキソ
ンを与えるＤＮＡは、ヒトλ２不変域遺伝子座を含むＥ
ｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントを含む１０ｎｇの
プラスミド＃２０８ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得ら
れる。各々５０ｐｍｏｌの適当なプライマー対（Ｃ１及
びＣ２，図１）を、プラスミドＤＮＡ及び２．５単位の
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと混合して、２５サイクル
のＰＣＲ増幅を実施した（サイクル時間：１’，９４
℃；２’，５５℃；２’，７２℃）。６２０塩基対の反
応生成物をＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、
アガロースゲル電気泳動によって精製してから、上述の
３片連結に含ませた。得られたクローンの分析から、Ｈ
ｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩで消化し次いでアガロースゲ
ル電気泳動で精製すると、推定約１．２ｋｂのＬ鎖コー
ディング挿入物が明らかとなった。個々の細菌クローン
を増殖させてＤＮＡを得、再構成された可変域及びその
フランキングλ不変ドメインの配列（図２ｂ）を検証す
るために、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）と、まず最
初はＴ７及びＳＰ６特異的配列決定プライマーとを使用
してＤＮＡの配列を決定した。４４７−５２ＤＨ鎖及び
Ｌ鎖発現ベクターを与えるプラスミドＤＮＡを増殖させ
〔Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，上掲〕、レシピエ
ント哺乳動物細胞中にトランスフェクトするために精製
した〔Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，上掲；Ｂｉｒ
ｂｉｏｎａｎｄＤｏｌｙ，上掲〕。

【０１３８】Ｈ鎖及びＬ鎖免疫グロブリン分子を、異な
る免疫グロブリンコーディング配列を含む以外は同一の
プラスミドから転写させる。免疫グロブリン発現ベクタ
ーの好ましい前駆体は、ＨＩＶ−１ＬＴＲプロモータ
ーの一部分（キャップ部位に対して−１１７〜＋８
０）、複数のクローニング部位、及びＳＶ４０後期ポリ
アデニル化シグナルを含む上述のごときものである（図
６）。プラスミドｐＥＥ１４（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ，Ｌｔ
ｄ．）は、ｐＳＺ９０１５と称されるこのベクター内の
大部分のＤＮＡ配列の供給源である。ｐＥＥ１４ベクタ
ーのＣＭＶＩＥプロモーターをＭｌｕＩ及びＨｉｎｄII
Iで消化することにより除去した。プロモーターを除い
た８ｋｂのベクターＤＮＡをアガロースげる電気泳動に
よって精製し、１９７塩基対のＨＩＶＬＴＲ（−１１
７〜＋８０）とＭｌｕＩ及びＨｉｎｄIII末端（図１に
示したプライマー対と、ＤｅＭａｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ａ．
ｅｔａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅｓ及びＲａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌｓ４：８２９−８３５，１９９１によって記載さ
れているＲＥＰ３／ＨＩＶ−ＬＴＲＣＤＲグラフト１
Ｂ４−ＶｋヒトＣｋ／ＨｙｇＢプラスミドＤＮＡ鋳型と
を使用して得られる）とを含む約２００塩基対のＰＣＲ
増幅ＤＮＡフラグメントに連結した。Ｈ鎖γ１不変域
を、２．０ｋｂのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントと
してｐ９０１５ベクター中に、未関連Ｈ鎖Ｖ域と一緒に
挿入し、ベクターｐＳＰ７２／５８．２／Ｌ１６ＶＨ／
γ１ＭＲＣを生成した。Ｈ鎖を含むプラスミドをｐＨＩ
Ｖ４４７ＶＨと称し、Ｌ鎖を含むプラスミドをｐＨＩＶ
４４７Ｖλと称した。それぞれＥ．ｃｏｌｉ宿主中の両
プラスミドは本発明出願日以前にＡｍｅｒｉｃａｎＴ
ｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２
３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅＭＤに寄託してあり、入手に制限はなく、ブタ
ペスト条約の条項及び要請に従う。プラスミドを含む
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主は、ｐＨＩＶ４４７ＶＨＣγ１に対し
てはＡＴＣＣ寄託番号６８９４５が、ｐＨＩＶ４４７Ｖ
λ／Ｃλに対しては６８９４３が割当てられている。

【０１３９】Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする同量（１０μ
ｇ）のプラスミドを、標準的なリン酸カルシウム沈澱法
によって、ヒト２９３細胞中にトランスフェクトした
〔ＤｅＭａｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ａ．ｅｔａｌ．，上
掲〕。但し、ＨＩＶ−１ＴＡＴコーディングプラスミ
ドとの同時トランスフェクションは、本明細書に記載の
ＨＩＶ−１ＬＴＲ発現ベクターをトランス活性化して
得られる高い転写レベルを得るに必要ないことが判っ
た。培養液上清液を、ヒトλＬ鎖を含むＩｇＧ１免疫グ
ロブリンの分泌について、トラッピングまたは固相ＥＬ
ＩＳＡ（下述）によって評価した。

【０１４０】状態調節哺乳動物細胞増殖培地において発
現された４４７−５２Ｄ組換え抗体の量を定量するため
に、ＥＬＩＳＡを実施した。Ｉｍｍｕｌｏｎ−２（Ｄｙ
ｎａｔｅｃｈＬａｂｓ）９６ウェルプレートを、４℃
のリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中に１０μｇ／ｍｌの
マウス抗ヒトλ鎖不変ドメインモノクローナル抗体（カ
タログ＃０５−４１０１，ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む溶液を用いて一晩かけて
被覆し、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を用いて３７℃で１時間かけてブロックした。ＰＢＳで
繰返し洗浄してから、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈し
た試料（組換え４４７ー５２Ｄ抗体またはＳｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌから得られるヒトλ／ＩｇＧ１標準抗
体を含む調整培地）を加えて同じものを２つ作り、３７
℃で１時間インキュベートした。７．８ｎｇ／ｍｌ〜５
００ｎｇ／ｍｌの範囲のＩｇＧ１濃度を使用し、標準較
正曲線を作成した。約１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中の西
洋ワサビペルオキシダーゼ（カタログ＃０５−３３２
０，ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）
に結合させたマウス抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃモノクローナ
ル抗体の１：４００希釈液の約５０μｌアルコートを用
いて、結合し且つ十分に凝集したヒトＩｇＧ１を検出し
た。３７℃で１時間インキュベートし次いで洗浄した
後、０．０３％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸ナト
リウム，ｐＨ４．２中に１ｍＭ２，２’−アジノ−ビ
ス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）を
含む溶液を加え、室温で２０分間インキュベートするこ
とにより、結合した複合体の量を検出した。４１５ｎｍ
にセットしたＥＬＩＳＡプレート読取り装置（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ，Ｉｎｃ．）を用いてウェルの吸着を測定した。
或いは、ＭＮ単離体の配列に基づく２６残基ペプチドで
被覆したプレートにおいて固相ＥＬＩＳＡを実施した。
ペプチド（ＮｌｅＣＳＹＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦ
ＹＴＴＫＮＩＩＧＣＳ配列番号１）を、予め活性化した
ペンタフルオロフェニルエステルを使用する固相Ｆｍｏ
ｃ化学作用及びヒドロキシベンジルトリアジン活性化に
よって合成した。Ｉｍｍｕｌｏｎ−２プレートを約１μ
ｇ／ｍｌのペプチドを用いて一晩かけて被覆し、ＰＢＳ
中約１％のウシ胎児血清でブロックした。上述のごと
く、結合した４４７−５２Ｄ抗体を検出した。一時的な
発現の後にトランスフェクトされたヒト２９３細胞によ
って分泌される抗体を、標準的なプロテインＡクロマト
グラフィー〔ＤｅＭａｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ａ．ｅｔａ
ｌ．，上掲〕によって精製した。

【０１４１】組換え４４７−５２Ｄ抗体の濃度を上述の
ＥＬＩＳＡによって測定し、固有のＨＩＶ−１血清型感
染性を中和する能力を示すことにより効能を試験した。

【０１４２】培養液を抗体及びウイルスに７〜８日間暴
露した後の細胞生存率を測定することにより、無細胞Ｈ
ＩＶ−１ウイルス感染の中和及び細胞対細胞伝播の阻害
を定量化するために、以下のアッセイを実施した。試験
する抗体を細胞増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウ
シ胎児血清）で次々と２倍に希釈し、９６ウェル皿（Ｃ
ｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｐ．）のウェル中に１００μｌずつ
入れた。１００μｌのウイルスストック（慢性感染Ｈ９
細胞または新たに作製された慢性感染ＦＤＡ／Ｈ９細胞
から製造したもの；細胞密度２×１０⁵細胞／ｍｌで平
板培養した慢性感染細胞集団由来の３日間状態調節した
培地を清澄化し、７日間アッセイにおいて全てのＭＴ−
４細胞を死滅させる最終希釈度のウイルスストックの１
０倍の希釈液を抗原投与量として選択した）を各ウェル
に加え、ウイルス−抗体混合物を３７℃で１時間インキ
ュベートした。ＭＴ−４細胞を各ウェルの５０μｌの培
地中に加え（１×１０⁴細胞／ウェル）、皿を３７℃で
７日間インキュベートし、この時点で終点値を決定し
た。ＭＴ−４細胞死滅を妨げる最終抗体希釈液の濃度を
中和終点として報告した。

【０１４３】中和アッセイの結果を表９に示すが、これ
は、調査した各ＨＩＶ−１血清型に対して、組換えヒト
４４７−５２Ｄ抗体の有効性がヒトヘテロハイブリドー
マ誘導４４７−５２Ｄ抗体と等しいことを示している。
この結果から、ヒトλ及びγ１不変ドメインを用いて発
現させた組換え構築抗体は、そのＶ３ＰＮＤループと
の相互作用を変えるようには修飾されておらず、組換え
抗体は天然抗体の生物学的活性を保持していることが判
る。

【０１４４】

【表１６】実施例１０大量の組換え４４７抗体を生産するために、発現系を構
築して使用した。発現系は、サイトメガロウイルス仲介
早期（ＣＭＶＩＥ）転写プロモーター及びグルタミンシ
ンテターゼ（ＧＳ）選択及び増幅カセットを使用してお
り、種々の哺乳動物細胞系に適用可能である〔Ｂｅｂｉ
ｎｇｔｏｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ１０：１６９−１７５，１９９２〕。Ｃｅｌｌｔｅ
ｃｈ，Ｌｔｄから基本ベクターｐＥＥ１２及びｐＥＥ６
を入手し、これを使用して、ＧＳ遺伝子産物の他に、Ｈ
鎖及びＬ鎖の免疫グロブリンペプチドを転写する単一プ
ラスミドを生成し、ｐ６３．７９ｒ４４７と称した。こ
のｒ４４７発現ベクターを構築する方法には、他の免疫
グロブリン配列を含む既存の基本ベクターを使用した。

【０１４５】ｒ４４７抗体のＶ域を含むｐＨＩＶ／４４
７Ｖ_H／Ｃγ１プラスミド（図５）のＤＮＡ５０μｇを
制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII及びＸｈｏＩで消
化した。約８００ｂｐのＨ鎖４４７Ｖ域フラグメント
を、（ＴＡＥ；４０ｍＭＴＲＩＳベース，１ｍＭＥ
ＤＴＡ，ｐＨ８．０を酢酸でｐＨ７．４に調整した溶液
中に調製した）０．８％アガロース中のゲル電気泳動に
よって精製し、切り出したＤＮＡフラグメントを、最小
量のＴＡＥで直径３／４インチの透析チューブ（ＢＲ
Ｌ）中に入れ、１５０ボルト，３０分間の電気泳動によ
ってＤＮＡを電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅ）し
た。得られたＤＮＡ溶液を透析チューブから取り出し、
フェノール／クロロホルムで２回洗浄し、次いでエタノ
ール沈澱によってＤＮＡを濃縮し、ＴＥ（１０ｍＭＴ
ＲＩＳＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）中に
再懸濁させた。

【０１４６】同様に、ＣＭＶＩＥプロモーター、ＧＳ遺
伝子転写単位及びアンピシリン耐性マーカーを含むｐＥ
Ｅ１２／５８．２Ｌ１６Ｖ_H／Ｃγ１プラスミドのＤＮ
Ａ５０μｇを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII及び
ＥｃｏＲＩで消化した。７０８７ｂｐのｐＢＲ３２２を
基本とするベクターのＤＮＡフラグメントを上述のごと
く精製した。このＤＮＡフラグメント約２μｇを、ｐＨ
ＩＶ／４４７ＶＨ／Ｃγ１（上述）由来の８００ｂｐの
ＤＮＡフラグメント約０．９μｇと混合し、１０分の１
の量の１０倍濃連結緩衝液（６６０ｍＭＴＲＩＳ−Ｈ
Ｃｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、１０ｍ
ＭＡＴＰ、ｐＨ７．５）を加え、更に約２５単位のＴ
₄ＤＮＡリガーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈ
ｅｉｍ）を加えた。混合液（最終ＤＮＡ濃度２８．９ｎ
ｇ／ｍｌ）を室温で１時間インキュベートしてＤＮＡフ
ラグメントを連結させ、次いでリガーゼを熱失活させ
（６５℃，５分間）、反応物質をフェノール／クロロホ
ルム抽出し、フェノール沈澱によってＤＮＡを濃縮し
た。ＤＮＡをｄＨ₂Ｏ中に再懸濁させ、溶液を製造業者
推奨の緩衝液濃度に調整してから制限エンドヌクレアー
ゼＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩを加えた。３７℃で１時間イ
ンキュベートした後、消化されたＤＮＡを上述のごとく
０．８％アガロースゲ上で電気泳動した。上述したよう
に、所望の７８８７ｂｐの連結ＤＮＡフラグメントをゲ
ルから取り出し、ＤＮＡを電気溶出し、エタノール沈澱
によって濃縮した。ＬＤＰサイクル（図８）に記載した
ような、ＤＮＡフラグメントを連結し、制限酵素消化
し、精製する手順を使用して、結合プラスミドベクター
を構築するのに通常必要とされる時間を短縮した。

【０１４７】４１５８ｂｐのＤＮＡフラグメント内に、
一方は１２００ｂｐの４４７λＬ鎖配列を含み、他方は
ヒト免疫グロブリンγ１不変域及びＣＭＶＩＥプロモー
ターを含む、２つのプラスミドＤＮＡ（ｐＨＩＶ／４４
７Ｖ_L／Ｃλ及びｐＥＥ１２／５８．２Ｌ１６Ｖ_H／Ｃγ
１）各々約５０μｇをそれぞれ制限酵素ＨｉｎｄIII及
びＥｃｏＲＩまたはＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し
た。かかる２つのＤＮＡフラグメントを、前述のごとき
０．８％アガロースゲル中で電気泳動して精製し、更に
電気溶出した。これら２つのＤＮＡフラグメント（それ
ぞれ１８．８ｍｎＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ）と先に得
た７８８７ｂｐＤＮＡフラグメント（５００ｎｇ）とを
使用し、３つのＤＮＡフラグメントの結合体を調製し
た。１倍濃連結緩衝液（上述）中に終濃度１１．８５μ
ｇ／ｍｌのＤＮＡと５単位のＴ₄ＤＮＡリガーゼとを含
む反応液を室温で１時間インキュベートし、１：５に希
釈してから、製造業者指示に従ってコンピテントＥ．ｃ
ｏｌｉ株ＨＢ１０１（ＢＲＬ）を形質転換するために１
μｌを使用した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉ
ｇｍａ）を含むＬＢ寒天プレートから形質転換体を選択
し、所望の組換えプラスミド配列の存在を評価するため
にＤＮＡを抽出した（図７参照）。ｐ６３．７９ｒ４４
７と称した発現プラスミドは４４７γ１Ｈ鎖、４４７λ
Ｌ鎖、ＧＳ選択カセット、並びに原核性プラスミドアン
ピシリン選択及び隣接複製開始点をコードした。

【０１４８】ベクターｐＥＥ１２／５８．２Ｌ１６Ｖ_H
／Ｃγ１（上述）を、Ｂｅｂｉｎｇｔｏｎら（上掲）に
よって記載されたｐＥＥ１２ベクターから構築した。Ｈ
ｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩで消化した後、ｐＥＥ１２ベ
クターと、ヒト化抗体５８．２のＨ鎖Ｖ域を含む中間ベ
クター（ｐＳＰ７２；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ）とを、
ＸｂａＩ形質転換Ｅ．ｃｏｌｉによってヒトγ不変域に
融合した。ｐＥＥ１２／５８．２Ｌ１６Ｖ_H／Ｃγ１ｔ
を含むクローンを同定した。次いでこのプラスミドＤＮ
ＡをＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断して、プラスミドの
大部分が付加したままのＨ鎖Ｖ域から、Ｈ鎖Ｃγ１ｔ域
を分離した。オリゴＧ１及びＧ２と鋳型としてのコスミ
ドクローンｃｏｓＩｇ９ＤＮＡを使用したＰＣＲ増幅
〔ＦｌａｎａｇａｎａｎｄＲａｂｂｉｔｓ，Ｎａｔ
ｕｒｅ３００：７０９−７１３，１９８２〕によっ
て、ヒトＣγ１コーディングドメインの短縮形を得た。
各々５０ｐｍｏｌの適当なプライマー対（Ｇ１とＧ２，
図１）を、ヒトγ１不変域エキソンを含むコスミドＤＮ
Ａ１０ｎｇ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５単位
と混合し、２５サイクルのＰＣＲ増幅を行った（サイク
ル時間：１’，９４℃；１’，５５℃；２’，７２
℃）。ＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、
アガロースゲル電気泳動によって精製し、ベクターのｐ
ＥＥ１２／５８．２Ｌ１６Ｖ_Hを含む部分にクローニン
グした。上述のごとく誘導された４４７Ｈ鎖可変域とヒ
トγ１不変域の短縮形とを含むベクターを与える個々の
クローンを同定及び単離した。

【０１４９】ヒトモノクローナル抗体４４７のＨ鎖及び
Ｌ鎖コーディング域を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主中の最終
プラスミドｐ６３．７９ｒ４４７は本明細書の出願日以
前にＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ
Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに寄託されてお
り、入手は制限されず、ブタペスト条約の条項及び要請
に従う。プラスミドｐ．６３．７９ｒ４４７を含むＥ．
ｃｏｌｉ宿主にはＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ６８９４４
が割当てられている。

【０１５０】実施例１１ＮＳ／０細胞のトランスフェクションＮＳ／０細胞を、１０％熱失活ウシ胎児血清及び４ｍＭ
グルタミンを補充したＩｓｃｏｖｅ最少必須培地中
で、５〜６．５％ＣＯ₂にセットした加湿インキュベー
ター内に３７℃に維持し、指数関数的に増殖させた。

【０１５１】トランスフェクション用プラスミドを、制
限酵素を用いて固有部位で消化することにより直線化し
た。好ましい固有部位は、ベクターのアクテリアル（ａ
ｃｔｅｒｉａｌ）配列内の、外来遺伝子発現配列の外側
に位置するものである。制限消化後、ＤＮＡをフェノー
ル抽出、フェノール／クロロホルム（１：１）抽出及び
クロロホルムによる最終抽出によって除タンパク質し、
生物学的安全キャビネット内の無菌条件下で、終濃度
０．２〜０．４Ｍの塩化ナトリウム及び７０％エタノー
ルを使用して沈澱させた。ＤＮＡを無菌蒸留水中に、計
算濃度１μｇ／１μｌで再懸濁させた。ＤＮＡは、直ち
に使用するかまたは使用するまで凍結（−２０℃）し
た。

【０１５２】トランスフェクション当日、ＮＳ／０スト
ック培養液において生存可能な細胞数をカウントした。
トランスフェクションキュベット１つ当たり全部で１×
１０⁷個の生存可能な細胞を使用した。まず細胞を室温
で３，０００×ｇで５分間遠心することにより回収し、
次いでペレット化した細胞を無菌リン酸緩衝塩類溶液
（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳ中に濃度１０⁷細胞／
８００μｌで再懸濁させた。この時点から細胞懸濁液を
氷上に維持した。１０⁷個の細胞を、生物学的安全キャ
ビネット内で無菌条件下に、０．４ｃｍ（電極間の距
離）のＢｉｏＲａｄキュベット上に静かに移した。溶液
中の直線化プラスミドＤＮＡ４０μｇを細胞と静かに混
合し、キュベットを氷上に５分間維持した。エレクトロ
ポレーション前に、キュベットの外側を拭き取り、“Ｂ
ｉｏＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ”のキュベットホ
ルダー内に入れた。遺伝子パルサーを、１５００Ｖで３
μＦ／パルスを分配するようにセットした。２連続パル
スを使用した。次いでキュベットを氷上に２〜５分間置
き、細胞を、５０ｍｌ使い捨て滅菌試験管内に４ｍＭグ
ルタミンではなくて１ｍＭグルタミンを含む３０ｍｌの
改良増殖培地に移入した。３０ｍｌのうち１０ｍｌの細
胞懸濁液を１つの９６ウェルマイクロタイター皿内に、
約１００μｌ／ウェルで分配し、（残りの２０ｍｌのう
ちの）１０ｍｌの細胞懸濁液を１０μｌの改良増殖培地
で希釈し、２つの９６ウェルマイクロタイター皿に、約
１００μｌ／ウェルで分配し、最後の１０ｍｌの細胞懸
濁液は、３０ｍｌの改良増殖培地で希釈し、４つの９６
ウェルマイクロタイター皿に、約１００μｌ／ウェルで
分配した。これらのプレートを、５〜６．５％ＣＯ₂及
び３７℃にセットした加湿インキュベーター内で一晩イ
ンキュベートした。

【０１５３】選択培地：選択培地は下記の通りであっ
た。

【０１５４】Ｉｓｃｏｖｅ最少必須培地（グルタミン非
含有；Ｓｉｇｍａ）１０％透析ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ製）１Ｘヌクレオシド＊１Ｘアスパラギン＊＊＊５０Ｘリボヌクレオシドストック溶液：３５ｍｇアデノシン３５ｍｇグアノシン３５ｍｇシチジン１２ｍｇチミジン（それぞれＳｉｇｍａ製，細胞培養用）無菌蒸留水で１
００ｍｌに調製。０．１μフィルターユニットを通して
濾過殺菌し、１０ｍｌアリコート中に凍結（−２０
℃）。

【０１５５】＊＊１００Ｘアスパラギン：６００ｍｇ／
１００ｍｌ無菌蒸留水、０．１μフィルターユニットを
通して濾過殺菌し、４℃で保管。

【０１５６】選択：トランスフェクションの２４時間
後、各９６ウェルマイクロタイター皿に１００μｌの選
択培地を与え、５〜６．５％ＣＯ₂及び３７℃にセット
した加湿インキュベーターにおいてコロニーが現れるま
でインキュベートした。これには約３〜３．５週間を要
した。ウェルが乾燥し始めないうちは供給は必要でなか
った。プレートを３〜４日ごとにモニターした。コロニ
ーが成長したウェルは最終的に黄色に変わり、この時点
でそれらのウェルを、５０〜１００μｌの上清を取り、
（生存可能なクローンを維持するために）ウェルに選択
培地を再供給することにより評価した。

【０１５７】実施例１２第１の実験においては、ＨＩＶ−１中和抗体の精製調製
物をチンパンジーに静脈経路によって用量３６ｍｇ／ｋ
ｇで投与した。２４時間後に、７５匹のチンパンジーに
感染量のＨＩＶ−１IIIｂ変異体を静脈投与することに
より、被検動物を抗原投与した。被検動物は、抗原投与
時に１：３２０の循環ウイルス中和抗体力価を示した。
未処理の対照チンパンジーにも同時にウイルスを接種し
た。

【０１５８】表１０は上記実験の結果を示す。末梢血単
核細胞（ＰＢＭＣ）からのウイルス単離を基づくと、対
照動物（３９匹）はまず抗原投与の３週間後にウイルス
感染の徴候を示した。この被検動物は特に抗原投与の６
週間後に血清変換を起こし、７２週間の観察期間中、抗
体及びウイルス単離は陽性を維持した。これとは対照的
に、抗体処理被検動物（２８９匹）にはウイルス感染の
徴候は認められなかった。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）による動物ＰＢＭＣにおけるウイルス特異的核酸を
検出しようとしたが、陰性であった。

【０１５９】

【表１７】

【０１６０】

【表１８】表１０の脚注ａＣβ１抗体調製物をプロテインＡアフィニティーク
ロマトグラフィーによって精製した。該抗体を２８９匹
のチンパンジーに投与した翌日、被検動物に抗原を投与
した。抗原ウイルスはＬａｒｒｙＡｒｔｈｕｒａｎ
ｄＰｅｔｅｒＦｉｓｈｉｎｇｅｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ
ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって提供さ
れ、Ｅｍｉｎｉら（上掲）によって記載されているよう
に抗原投与時に定量した。チンパンジーは、実験動物保
護基準：ｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｎａｔｉ
ｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ
ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓを満足するかまたはこれを超え
る条件下に維持した。

【０１６１】ｂｐ．ｃ．：誘発後（ｐｏｓｔ−ｃｈａ
ｌｌｅｎｇｅ）。

【０１６２】ｃＲｏｂｅｒｔｓｏｎｅｔａｌ．，
¹⁴に記載のごとくＨＩＶ−１のIIIｂ変異体を使用し、
ウイルス中和抗体力価を細胞培養液中で測定した。アッ
セイに使用したウイルスの量は、チンパンジー抗原投与
に使用した量と同一であった。値は、記載した通り、有
効ウイルス中和を与える最高血清希釈度の逆数で示す。

【０１６３】ｄＥｍｉｎｉら（上掲）による記載のご
とく、抗ＨＩＶ−１ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッ
ト反応性抗体を測定した。（＋）ＥＬＩＳＡ反応陽性及
びウェスタンブロット反応複数バンド。（＋／−）ウェ
スタンブロット反応ｇｐ１２０のみのバンド，ＥＬＩＳ
Ａ陰性。（−）ＥＬＩＳＡ陰性及びウェスタンブロット
反応バンドなし。

【０１６４】ｅ４つの方法を使用し、チンパンジーＰ
ＢＭＣのｉｎｖｉｔｒｏ培養によってウイルスを単離
した。（１）チンパンジーＰＢＭＣを同数のマイトジェ
ン活性化ヒトＰＢＭＣと一緒に、ＩＬ−２及びＤＥＡＥ
−デキストランを含む培地中で同時培養した。（２）チ
ンパンジーＰＢＭＣをフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）
によって活性化し、次いで方法１によって同時培養し
た。（３）チンパンジーＰＢＭＣをＰＨＡで刺激し、次
いでＩＬ−２を含む培地中で単独培養した。（４）チン
パンジーＰＢＭＣを同数の活性化ヒトＰＢＭＣと一緒
に、ＰＨＡ及びＩＬ−２を補充した培地中で同時培養し
た。各ケースで、培養液は１０ｍｌ中に１×１０⁷のチ
ンパンジー細胞を含んでいた。培養液を５％ＣＯ₂雰囲
気下に３７℃で４週間インキュベートした。１週間ごと
に、培地上清をＨＩＶ−１ｐ２４抗原産生について評
価した。上記方法のいずれによるウイルス増殖でも、ウ
イルス単離は陽性と考えられた。

【０１６５】ｆチンパンジーＰＢＭＣ中のＨＩＶ−１
特異的核酸の存在をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
よって評価した。ＤＮＡは、ＰＢＭＣから、細胞試料を
１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．３、１．０ｍＭ
ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０、０．５％ＳＤＳ、１５０μｇ
／ｍｌプロテイナーゼＫ中で６０℃で６０分間インキュ
ベートすることにより得た。フェノール／クロロホルム
抽出した後、ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。１〜３
μｇのＤＮＡをＰＣＲに使用した。各反応混合液は、Ｄ
ＮＡの他に、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＴｒ
ｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、各々
０．０３２ｍＭのｄＮＴＰ、各々５０ｎｇのプライマー
及び１．０単位のＴａｑポリメラーゼを含んでいた。Ｈ
ＩＶ−１ｇａｇ特異的プライマー対ＳＫ３８／３９を使
用した。３５反応サイクルを実施した。各サイクルは９
４℃のインキュベーション１．５分間及び５６℃のイン
キュベーション３．０分間からなった。反応に次いで増
幅産物を、ＳＫ１９プローブを用いたハイブリダイゼー
ションによって検出した。ＰＣＲアッセイの感受性は、
ＤＮＡ試料当たり１０ＨＩＶ−１特異的コピーである
ことが判った。

【０１６６】ｇＮＤ：実験せず（ＮｏｔＤｏｎｅ）実施例１３上記の最初の防御知見（実施例１０）に次いで、ウイル
ス抗原投与後に投与したときのＨＩＶ−１中和抗体の防
御作用を評価するために第２実験を実施した。２群のチ
ンパンジー（２９９匹及び１９６匹）にそれぞれ７５チ
ンパンジー感染量のＨＩＶ−１ IIIｂを静脈内接種し
た。接種の１０分後、２９９匹の被検動物に、抗体を３
６ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。全量（約２００
ｍｌ）を３０分間で送達した。投与終了時の循環中和抗
体力価は１：６４０であった。１９６匹のチンパンジー
は処理しなかった。

【０１６７】上記実験結果を表１１に与える。対照チン
パンジー（１９６匹）はまず、抗原投与の６週間後にＰ
ＢＭＣからのウイルス単離が陽性となった。対照動物は
８週目に血清変換し、４８週間の観察期間中、ウイルス
単離及び抗体は陽性を維持した。抗体処理したチンパン
ジー（２９９匹）は、期間中持続ウイルス感染の徴候を
示さなかった。被検動物ＰＢＭＣにおけるウイルス特異
的核酸についてのＰＣＲ分析は陰性であった。

【０１６８】上記知見は、抗Ｖ３ループ、即ちＨＩＶ−
１中和抗体が、他のウイルス特異的免疫応答の不在下
に、ＨＩＶ−１持続感染を予防し得るという最初の直接
的な証拠を与えている。

【０１６９】

【表１９】

【０１７０】

【表２０】表１１の脚注ａ表１の脚注の技術説明参照のこと。

【０１７１】ｂＣβ１投与（テキスト参照）の直後に
得た血清を使用し、抗体力価を測定した。Ｃβ１投与前
のウイルス中和抗体力価は１０未満であった。

【０１７２】実施例１４ＨＩＶ単離４つの方法を使用し、チンパンジーＰＢＭＣのｉｎｖ
ｉｔｒｏ培養によってウイルスを単離した。（１）チン
パンジーＰＢＭＣを同数のマイトジェン活性化ヒトＰＢ
ＭＣと一緒に、ＩＬ−２及びＤＥＡＥ−デキストランを
含む培地中で同時培養した。（２）チンパンジーＰＢＭ
Ｃをフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）によって活性化
し、次いで方法１によって同時培養した。（３）チンパ
ンジーＰＢＭＣをＰＨＡで刺激し、次いでＩＬ−２を含
む培地中で単独培養した。（４）チンパンジーＰＢＭＣ
を同数の活性化ヒトＰＢＭＣと一緒に、ＰＨＡ及びＩＬ
−２を補充した培地中で同時培養した。各ケースで、培
養液は１０ｍｌ中に１×１０⁷のチンパンジー細胞を含
んでいた。培養液を５％ＣＯ₂雰囲気下で３７℃で４週
間インキュベートした。１週間ごとに、培地上清をＨＩ
Ｖ−１ｐ２４抗原産生について評価した。上記方法の
いずれによるウイルス増殖でも、ウイルス単離は陽性と
考えられた。

【０１７３】実施例１５ＰＣＲによるＨＩＶ核酸の検出チンパンジーＰＢＭＣ中のＨＩＶ−１特異的核酸の存在
をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって評価した。
ＤＮＡは、ＰＢＭＣから、細胞試料を１０ｍＭＴｒｉｓ
ＨＣｌ，ｐＨ８．３、１．０ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ
８．０、０．５％ＳＤＳ、１５０μｇ／ｍｌプロテイナ
ーゼＫ中で６０℃で６０分間インキュベートすることに
より得た。フェノール／クロロホルム抽出した後、ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させた。１〜３μｇのＤＮＡをＰ
ＣＲに使用した。各反応混合液は、ＤＮＡの他に、１．
５ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐ
Ｈ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、各々０．０３２ｍＭのｄ
ＮＴＰ、各々５０ｎｇのプライマー及び１．０単位のＴ
ａｑポリメラーゼを含んでいた。ＨＩＶ−１ｇａｇ特異
的プライマー対ＳＫ３８／３９を使用した。３５反応サ
イクルを実施した。各サイクルは９４℃のインキュベー
ション１．５分間及び５６℃のインキュベーション３．
０分間からなった。反応に次いで増幅産物を、ＳＫ１９
プローブを用いたハイブリダイゼーションによって検出
した。ＰＣＲアッセイの感受性は、ＤＮＡ試料当たり１
０ＨＩＶ−１特異的コピーであることが判った。

【０１７４】実施例１６ヒトモノクローナル抗体によるｉｎｖｉｔｒｏＨＩＶ
− １感染の中和リンパ趨向性及びリンパ球溶解性単離体のＭＴ−４細胞
における中和試験のために、抗体を次々と２倍に希釈し
た一連の溶液を調製し、各試験ウェルに１００μｌを使
用した。１００μｌのウイルスストック希釈液を各試験
ウェルに加え、ウイルス−抗体混合液を３７℃で１時間
インキュベートし、次いで、５０μｌの培地中の１×１
０⁴個のＭＴ−４細胞を各ウェルに加えた。培養液を７
日間インキュベートし、抗体中和終点を決定した。中和
終点は、ＭＴ−４細胞死滅を阻害する最終希釈度の抗体
希釈調製液として決定した。各試験について未感染ＭＴ
−４細胞も培養し、各分析においてウイルスストックを
再滴定した。マクロファージ−単球性単離体ＳＦ−１６
２のウイルス中和試験を、一次マクロファージ−単球培
養液中で実施した。ＳＦ−１６２ストックの１／１０希
釈液を、次々と２倍に希釈した一連の抗体希釈液と混合
し、３７℃で１時間インキュベートし、各混合液を、
２．０×１０⁵細胞を含むマイクロタイタープレートウ
ェルに加えた。各試験において、有意な中和力価を有す
るヒト陽性血清、並びに非中和陰性ヒト血清及び抗体ま
たは血清の不在下に感染した細胞をも試験した。全ての
マクロファージ／単球培養液に新鮮な培地を、感染の
５、８、１２、１４及び２１日後に供給した。ｐ２４Ｅ
ＬＩＳＡ（ＣｏｕｌｔｅｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）に
よってウイルス産生を評価するために、１８、２１及び
２４目に培地を回収した。更に、ｐ２４ＥＬＩＳＡによ
って細胞内ウイルスを評価するために、２４日目に感染
マクロファージ／単球細胞を溶解した。中和終点は、ｐ
２４産生の不在によって立証されるｉｎｖｉｔｒｏマ
クロファージ／単球感染を阻害した最後希釈度の抗体調
製物として決定した。結果は表１２に示す。

【０１７５】

【表２１】

【０１７６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：24 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Nle Cys Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly Cys 20 配列番号：２配列の長さ：23 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly 20 配列番号：３配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr 1 5 配列番号：４配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Lys Arg Ile His Ile Gly 1 5 配列番号：５配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 His Ile Gly Pro Gly Arg 1 5 配列番号：６配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Tyr Asn Lys Arg Lys Arg 1 5 配列番号：７配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Lys Arg Lys Arg Ile 1 5 配列番号：８配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Lys Arg Lys Arg Ile His 1 5 配列番号：９配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Lys Arg Ile His Ile 1 5 配列番号：10 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Lys Arg Ile His Ile Gly 1 5 配列番号：11 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Ile His Ile Gly Pro 1 5 配列番号：12 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ile His Ile Gly Pro Gly 1 5 配列番号：13 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 His Ile Gly Pro Gly Arg 1 5 配列番号：14 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ile Gly Pro Gly Arg Ala 1 5 配列番号：15 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Pro Gly Arg Ala Phe 1 5 配列番号：16 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Pro Gly Arg Ala Phe Tyr 1 5 配列番号：17 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Arg Ala Phe Tyr Thr 1 5 配列番号：18 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Ala Phe Tyr Thr Thr 1 5 配列番号：19 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Phe Tyr Thr Thr Lys 1 5 配列番号：20 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Phe Tyr Thr Thr Lys Asn 1 5 配列番号：21 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Tyr Thr Thr Lys Asn Ile 1 5 配列番号：22 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Thr Lys Asn Ile Ile 1 5 配列番号：23 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Lys Asn Ile Ile Gly 1 5 配列番号：24 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Lys Arg Ile His Ile 1 5 配列番号：25 配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Pro Gly Arg 1 配列番号：26 配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr 1 5 10 15 配列番号：27 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val 1 5 10 15 Thr Ile Gly Lys Ile Gly 20 配列番号：28 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Thr Thr Lys Asn Ile Ile 20 配列番号：29 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ile Tyr Arg Lys Gly Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe His 1 5 10 15 Thr Thr Arg Gln Ile Ile 20 配列番号：30 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Tyr Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe His 1 5 10 15 Thr Thr Gly Arg Ile Ile 20 配列番号：31 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Asn Val Arg Asn Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe His 1 5 10 15 Thr Thr Lys Arg Ile Thr 20 配列番号：32 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Asn Val Arg Arg Ser Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Arg 1 5 10 15 Thr Arg Glu Ile Ile Gly 20 配列番号：33 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Asn Thr Ser Arg Gly Ile Arg Ile Gly Pro Gly Arg Ala Ile Leu 1 5 10 15 Ala Thr Glu Arg Ile Ile 20 配列番号：34 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Lys Gly Pro Gly Arg Val Ile Tyr 1 5 10 15 Ala Thr Gly Gln Ile Ile 20 配列番号：35 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Ala Thr Gly Asp Ile Ile 20 配列番号：36 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 CGGAATTCAG GTGCAGCTGC AGCAGTCTGG 30 配列番号：37 配列の長さ：37 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 CCGAATTCGC GGCCGCACTC ATTTACCCGG AGACAGG 37 配列番号：38 配列の長さ：42 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 GGCGTCGACT CACCATGGCC GGCTCCCCTC TCYTCCTCAC CC 42 配列番号：39 配列の長さ：34 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 CCGAATTCGC GGCCGCCTAT GAACATTCTG TAGG 34 配列番号：40 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 GATCCTCGAG GATTCTAGAA GGGTCAGATG TCGGTGTTG 39 配列番号：41 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 GATCGAATTC CTGGGATCCT GCAGCTCTAG 30 配列番号：42 配列の長さ：43 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 TTACTCGAGA CGCGTACTAG TGAGCTTGCT ACAAGGGACT TTC 43 配列番号：43 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 ATTTCTAGAA AGCTTTATTG AGGCTTAAGC 30 配列番号：44 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 TATACTCGAG CAGACACTGG ACGCTGAACC 30 配列番号：45 配列の長さ：35 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 TATATGATCA GAATTCGCCC GGGAAGTATG TACAG 35 配列番号：46 配列の長さ：1380 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTAAAGC CTGGGGGGTC CCTCAGACTC 60 ACCTGTGTAG CCTCTGGTTT CACGTTCAGT GATGTCTGGC TGAACTGGGT CCGCCAGGCT 120 CCAGGGAAGG GGCTGGAGTG GGTCGGCCGT ATTAAAAGCA GAACTGATGG TGGGACAACA 180 GACTACGCTG CATCCGTGAA AGGCAGATTC ACCATCTCAA GAGATGACTC AAAAAACACG 240 CTATATCTGC AAATGAATAG CCTGAAAACA GAGGACACAG CCGTTTATTC CTGCACCACA 300 GATGGTTTTA TTATGATTCG GGGAGTCTCC GAGGACTACT ACTACTACTA CATGGACGTT 360 TGGGGCAAAG GGACCACGGT CACCGTGAGC TCAGCCTCCA CCAAGGGCCC ATCGGTCTTC 420 CCCCTGGCAC CCTCCTCCAA GAGCACCTCT GGGGGCACAG CGGCCCTGGG CTGCCTGGTC 480 AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT CAGGCGCCCT GACCAGCGGC 540 GTGCACACCT TCCCGGCTGT CCTACAGTCC TCAGGACTCT ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG 600 ACCGTGCCCT CCAGCAGCTT GGGCACCCAG ACCTACATCT GCAACGTGAA TCACAAGCCC 660 AGCAACACCA AGGTGGACAA GAAAGTTGAG CCCAAATCTT GTGACAAAAC TCACACATGC 720 CCACCGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA 780 CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG 840 AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT 900 GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC 960 ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 1020 GCCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA 1080 CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT GAGCTGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC 1140 TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG 1200 CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC 1260 TACAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC 1320 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT 1380 配列番号：47 配列の長さ：654 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 CAGTCTGTGT TGACGCAGCC GCCCTCAGTG TCTGCGGCCC CAGGACAGAA GGTCACCATC 60 TCCTGCTCTG GAAGCAGCTC CAACATTGGG AATAATTATG TATTGTGGTA CCAGCAGTTC 120 CCAGGAACAG CCCCCAAACT CCTCATTTAT GGCAATAATA AGCGACCCTC AGGGATTCCT 180 GACCGATTCT CTGGCTCCAA GTCTGGCACG TCAGCCACCC TGGGCATCAC CGGACTCCAG 240 ACTGGGGACG AGGCCGATTA TTTCTGCGCA ACATGGGATA GCGGCCTGAG TGCTGATTGG 300 GTGTTCGGCG GAGGGACCAA GCTGACCGTC CTAAGTCAGC CCAAGGCTGC CCCCTCGGTC 360 ACTCTGTTCC CGCCCTCCTC TGAGGAGCTT CAAGCCAACA AGGCCACACT GGTGTGTCTC 420 ATAAGTGACT TCTACCCGGG AGCCGTGACA GTGGCCTGGA AGGCAGATAG CAGCCCCGTC 480 AAGGCGGGAG TGGAGACCAC CACACCCTCC AAACAAAGCA ACAACAAGTA CGCGGCCAGC 540 AGCTATCTGA GCCTGACGCC TGAGCAGTGG AAGTCCCACA GAAGCTACAG CTGCCAGGTC 600 ACGCATGAAG GGAGCACCGT GGAGAAGACA GTGGCCCCTA CAGAATGTTC ATAG 654 配列番号：48 配列の長さ：54 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 CATTCGCTTA CCCTGCAGAA GCTTGTTGAC TAGTGAGATC ACAGTTCTCT CTAC 54 配列番号：49 配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 GGAGTGGACA CCTGTGGAG 19 配列番号：50 配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 GGTGAGTCCT TACAACCTC 19 配列番号：51 配列の長さ：44 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 GAATGTGCCT ACTTTCTAGA CTCGAGTATA AATCTCTGGC CATG 44 配列番号：52 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 CTCCACAGGT GTCCACTCCG AGGTGCAGCT GGTGGAGTC 39 配列番号：53 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 GAGGTTGTAA GGACTCACCT GAGCTCACGG TGACCGTGG 39 配列番号：54 配列の長さ：54 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 CATTCGCTTA CCCTGCAGAA GCTTGTTGAC TAGTGAGATC ACAGTTCTCT CTAC 54 配列番号：55 配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 GGAGTGGACA CCTGTGGAG 19 配列番号：56 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 CTCCACAGGT GTCCACTCCC AGTCTGTGTT GACGCAGCC 39 配列番号：57 配列の長さ：79 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 GAATGTGCCT ACTTTCTAGA CTCGAGAACT GAGGAAGCAA AGTTTAAATT CTACTCACGA 60 CTTAGGACGG TCAGCTTGG 79 配列番号：58 配列の長さ：18 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 CATTCGCTTA CCCTGCAG 18 配列番号：59 配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 GAATGTGCCT ACTTTCTAG 19

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えクローニングに使用される、抗体のＨ鎖
及びＬ鎖をコードするＤＮＡ内の配列を与えるＤＮＡオ
リゴヌクレオチドプライマーを示す。

【図２Ａ１】組換えベクターによって産生される４４７
−５２Ｄ抗体のＨ鎖の全ヌクレオチド配列を示す。

【図２Ａ２】組換えベクターによって産生される４４７
−５２Ｄ抗体のＨ鎖の全ヌクレオチド配列を示す。

【図２Ｂ】組換えベクターによって産生される４４７−
５２Ｄ抗体のＬ鎖の全ヌクレオチド配列を示す。

【図３】４４７−５２Ｄ抗体のＨ鎖及びＬ鎖に対する可
変ドメインを構築するのに使用されるＤＮＡオリゴヌク
レオチドプライマーを示す。

【図４】抗体４４７−５２ＤのＨ鎖及びＬ鎖の可変域の
ための組換えクローニング操作の概略図である。

【図５】組換え抗体のヒトγ１Ｈ鎖を含むプラスミドｐ
ＨＩＶ／４４７ＶＨ／Ｃγ１の概略図である。

【図６】組換え抗体のＬ鎖を含むプラスミドｐＨＩＶ／
４４７Ｖλ／Ｃλの概略図である。

【図７】Ｌ鎖及びヒトγ１Ｈ鎖の両方を含むプラスミド
ｐ３６．７９ｒ４４７の概略図である。

【図８】ｐ３６．７９ｒ４４７を生産するに使用される
クローニング方法の概略図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年１月２７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 5/26 15/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者アンソニー・ジエイ・コンレイアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19341、エクストン、ビドル・ドライブ・231 (72)発明者ジヨージ・イー・マークアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 08550、プリンストン・ジヤンクシヨン、リツチモンド・コート・４ (72)発明者エル・シド・ジヨンソンアメリカ合衆国、メリーランド・20874、ジエマンタウン、アンバサダー・ドライブ・13545 (72)発明者デイビツド・エス・フアーアメリカ合衆国、メリーランド・20879、ゲイザースバーグ、キヤリツジ・ウオーク・コート・21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】２種以上のＨＩＶ血清型の単離体に対し
てＨＩＶ中和性である組換えヒト抗ＨＩＶ抗体またはそ
のフラグメント。
【請求項２】前記抗体またはフラグメントが、III
Ｂ、ＭＮ、ＡＬ−１、ＳＦ−２、ＷＭＪ−２、ＲＦ、Ｄ
Ｕ６５８７−５及びＤＵ７８８７−７からなる群から選
択される２種以上のＨＩＶ−１単離体を中和する請求項
１に記載の組換えヒト抗ＨＩＶ抗体またはそのフラグメ
ント。
【請求項３】前記中和抗体またはフラグメントが、ｇ
ｐ１２０のＨＩＶ−１中和エピトープに結合する請求項
１に記載の組換えヒト抗ＨＩＶ抗体またはそのフラグメ
ント。
【請求項４】前記ＨＩＶ−１ｇｐ１２０の中和エピ
トープがｇｐ１２０のＶ３ループ内にある請求項３に記
載の組換えヒト抗ＨＩＶ−１抗体またはそのフラグメン
ト。
【請求項５】前記ＨＩＶｇｐ１２０Ｖ３ループの
中和エピトープがアミノ酸配列ＧＰＸＲを含み、前記Ｘ
が任意のアミノ酸である請求項４に記載の組換えヒト抗
ＨＩＶ−１抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】前記ＨＩＶｇｐ１２０Ｖ３ループの
中和エピトープが、アミノ酸配列ＧＰＧＲを含む請求項
５に記載の組換えヒト抗ＨＩＶ−１抗体またはそのフラ
グメント。
【請求項７】ＨＩＶ−１単離体IIIＢ、ＭＮ、ＡＬ−
１、ＳＦ−２、ＷＭＪ−２、ＲＦ、ＤＵ６５８７−５及
びＤＵ７８８７−７を中和する組換えヒト抗ＨＩＶ抗体
またはそのフラグメント。
【請求項８】前記中和抗体またはフラグメントが、Ｈ
ＩＶ−１ｇｐ１２０の中和エピトープに結合する請求
項７に記載の組換えヒト抗ＨＩＶ抗体またはそのフラグ
メント。
【請求項９】前記ＨＩＶ−１ｇｐ１２０の中和エピ
トープがｇｐ１２０のＶ３ループ内にある請求項８に記
載の組換えヒト抗ＨＩＶ−１抗体またはそのフラグメン
ト。
【請求項１０】前記ＨＩＶｇｐ１２０Ｖ３ループ
の中和エピトープがアミノ酸配列ＧＰＸＲからなり、前
記Ｘが任意のアミノ酸である請求項９に記載の組換えヒ
ト抗ＨＩＶ−１抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１】前記ＨＩＶｇｐ１２０Ｖ３ループ
の中和エピトープが、アミノ酸配列ＧＰＧＲからなる請
求項１０に記載の組換えヒト抗ＨＩＶ−１抗体またはそ
のフラグメント。
【請求項１２】抗体Ｈ鎖クラスがＩｇＧであり、該抗
体が、ＨＩＶ−１単離体IIIＢ、ＭＮ、ＡＬ−１、ＳＦ
−２、ＷＭＪ−２、ＲＦ、ＤＵ６５８７−５及びＤＵ７
８８７−７を中和する組換えヒト抗ＨＩＶ抗体またはそ
のフラグメント。
【請求項１３】前記抗体Ｈ鎖サブクラスがＩｇＧ₃で
あり、該抗体が、ＨＩＶ−１血清型単離体IIIＢ、Ｍ
Ｎ、ＡＬ−１、ＳＦ−２、ＷＭＪ−２、ＤＵ６５８７−
５及びＤＵ７８８７−７を中和する請求項１２に記載の
組換えヒト抗ＨＩＶ抗体またはそのフラグメント。
【請求項１４】前記Ｈ鎖ＩｇＧサブクラス域がＩｇＧ
₁サブクラス域に遺伝子的に修飾されており、該抗体
が、ＨＩＶ−１血清型単離体IIIＢ、ＭＮ、ＡＬ−１、
ＳＦ−２、ＷＭＪ−２、ＤＵ６５８７−５及びＤＵ７８
８７−７を中和する請求項１３に記載の組換えヒト抗Ｈ
ＩＶ抗体またはそのフラグメント。
【請求項１５】プロモーター配列と、２種以上のＨＩ
Ｖ血清型を中和するＨＩＶ中和抗体のＬ鎖またはＨ鎖の
可変ドメインの全部または一部をコードするＯＲＦと、
適当な転写終結配列とを含む発現カセット。
【請求項１６】前記ＯＲＦが、ＨＩＶ−１中和抗体の
Ｌ鎖またはＨ鎖の可変ドメインをコードし、前記抗体が
２種以上のＨＩＶ−１血清型を中和する請求項１５に記
載の発現カセット。
【請求項１７】前記ＯＲＦが、抗体４４７−５２Ｄの
Ｌ鎖またはＨ鎖の可変ドメインをコードする請求項１６
に記載の発現カセット。
【請求項１８】少なくとも１つのプロモーター配列
と、ＨＩＶ−１中和抗体のＬ鎖をコードする第１ＯＲＦ
及びＨ鎖をコードする第２ＯＲＦと、適当な転写終結配
列とを含む発現カセット。
【請求項１９】前記第１及び第２ＯＲＦがＨＩＶ−１
中和抗体のＬ鎖及びＨ鎖をコードし、前記抗体が、２種
以上のＨＩＶ−１単離体を中和する請求項１８に記載の
発現カセット。
【請求項２０】前記第２ＯＲＦがＩｇＧのＨ鎖をコー
ドする請求項１９に記載の発現カセット。
【請求項２１】前記第２ＯＲＦがＩｇＧ１のＨ鎖をコ
ードする請求項２０に記載の発現カセット。
【請求項２２】前記第１及び第２ＯＲＦが抗体４４７
−５２ＤのＬ鎖及びＨ鎖をコードする請求項１９に記載
の発現カセット。
【請求項２３】前記ＩｇＧのＨ鎖のサグクラス域がＩ
ｇＧ₁サグクラス域に遺伝子的に修飾されている請求項
２０に記載の発現カセット。
【請求項２４】プロモーター配列と、ＨＩＶ中和抗体
のＬ鎖またはＨ鎖の可変ドメインの全部または一部をコ
ードするＯＲＦと、適当な転写終結配列とからなる発現
カセットを含む宿主細胞。
【請求項２５】各々が、プロモーター配列と、ＨＩＶ
中和抗体のＬ鎖またはＨ鎖の可変ドメインの全部または
一部をコードするＯＲＦと、適当な転写終結配列とから
なる２つの発現カセットを含む宿主細胞。
【請求項２６】ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号６８９４５を
有する請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２７】ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号６８９４３を
有する請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２８】ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号６８９４４を
有する請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２９】２種以上のＨＩＶ血清型単離体に対し
てＨＩＶ中和性を示す組換えヒト抗ＨＩＶ抗体またはそ
のフラグメントと、生理学的に容認可能な希釈剤または
担体とを含む医薬組成物。
【請求項３０】前記組換えヒト抗ＨＩＶ抗体が、III
Ｂ、ＭＮ、ＡＬ−１、ＳＦ−２、ＷＭＪ−２、ＲＦ、Ｄ
Ｕ６５８７−５及びＤＵ７８８７−７からなる群から選
択される２種以上のＨＩＶ−１血清型単離体を中和する
請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】前記組換えヒトＨＩＶ−１中和抗体ま
たはそのフラグメントが、ＨＩＶ−１血清型単離体III
Ｂ、ＭＮ、ＡＬ−１、ＳＦ−２、ＷＭＪ−２、ＲＦ、Ｄ
Ｕ６５８７−５及びＤＵ７８８７−７を中和する請求項
２９に記載の医薬組成物。
【請求項３２】第１及び第２抗ＨＩＶ−１物質を含む
医薬組成物であって、前記第１物質が、２種以上のＨＩ
Ｖ単離体を中和する組換え抗ＨＩＶ抗体であり、前記第
２物質が非抗体ＨＩＶインヒビターである医薬組成物。
【請求項３３】前記非抗体ＨＩＶインヒビターが、逆
転写酵素インヒビター、プロテアーゼインヒビター、転
写トランス活性化インヒビター、アンチセンスオリゴヌ
クレオチド及びウイルス付着インヒビターからなる群か
ら選択されるクラスのＨＩＶインヒビターに由来するも
のである請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】前記非抗体ＨＩＶインヒビターが逆転
写酵素インヒビターである請求項３３に記載の医薬組成
物。
【請求項３５】前記逆転写酵素インヒビターが、３−｛［（４，７−ジクロロベンゾオキサゾール−２−
イル）メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メチル−２
−（１Ｈ）−ピリジノン、３−｛［（４，７−ジメチルベンゾオキサゾール−２−
イル）メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メチル−２
−（１Ｈ）−ピリジノン、３−｛［（７−クロロベンゾオキサゾール−２−イル）
メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メチル−２−（１
Ｈ）−ピリジノン、３−｛［（７−メチルベンゾオキサゾール−２−イル）
メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メチル−２−（１
Ｈ）−ピリジノン、３−｛［（４−フルオロベンゾオキサゾール−２−イ
ル）メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メチル−２−
（１Ｈ）−ピリジノン、３−｛［（７−フルオロベンゾオキサゾール−２−イ
ル）メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メチル−２−
（１Ｈ）−ピリジノン、３−｛［（ベンゾオキサゾール−２−イル）メチル］ア
ミノ｝−５−エチル−６−メチル−２−（１Ｈ）−ピリ
ジノン、３−｛［（４−クロロベンゾオキサゾール−２−イル）
メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メチル−２−（１
Ｈ）−ピリジノン、３−｛［（４−フルオロ−７−クロロベンゾオキサゾー
ル−２−イル）メチル］アミノ｝−５−エチル−６−メ
チル−２−（１Ｈ）−ピリジノン、及び３−［２−（ベンゾオキサゾール−２−イル）エチル］
−５−エチル−６−メチル−２−（１Ｈ）−ピリジノンからなる群から選択される請求項３４に記載の医薬組成
物。