JP2888981B2

JP2888981B2 - Ｈｉｖ免疫療法

Info

Publication number: JP2888981B2
Application number: JP6506600A
Authority: JP
Inventors: 典也大野
Original assignee: NITSUSHIN SHOKUHIN KK
Current assignee: NITSUSHIN SHOKUHIN KK
Priority date: 1992-08-24
Filing date: 1993-08-24
Publication date: 1999-05-10
Anticipated expiration: 2014-05-10
Also published as: CA2122044A1; AU5089893A; JPH07502539A; DE69330280T2; EP0662093A1; ATE201698T1; AU674539B2; DE69330280D1; EP0662093A4; EP0662093B1; CA2122044C

Description

【発明の詳細な説明】背景本発明は、一般には、ヒト免疫不全ウィルス（HIV−
１）感染症の予防ならびに治療に有効な物質および方法
に関する。より具体的には、本発明は、HIV−１感受性
あるいはHIV−１感染動物、特にヒト、の受動免疫に有
用なモノクローナル抗体に関する。

HIV−１のin vivoにおける感染過程は、最近のMcCune
の論文、Cell，64,pp.351−363（1991）に紹介されてい
る。すなわち、HIV−１は、Ｔ−細胞、単球／マクロフ
ァージおよびCD4受容体を発現する神経細胞などの様々
な細胞系に感染する。体内でのCD4⁺細胞の大部分は「休
眠状態」あるいは静止状態にあり、特定のシグナルにの
み反応して分裂するので、HIV−１による感染は、CD4⁺
細胞が転写の過程では不活性ウィルスを含むという結果
をもたらす。能動免疫を含む、感染動物の免疫系の刺激
は、免疫系のポリクローナルな活性化、および休眠CD4⁺
細胞の細胞周期のＳ期への移行の信号という結果に表れ
るであろう。増殖中の細胞は、ウィルス粒子を活発に産
生し、感染の拡散を誘発する。HIV−１感染動物の免疫
系の刺激によるこの好ましくない効果を考慮すれば、HI
V−１感染の予防あるいは治療の最も有効な方法は、感
受性あるいは感染動物に抗HIV−１抗体を投与するとい
う、受動免疫にあるといえる。

Jackson et al.,Lancet，2,pp.647−652（1988）は、
後天性免疫不全症候群（AIDS、HIV−１感染により進行
性の免疫系欠陥の症候群）を患ったヒト患者へ、血漿の
形態で抗HIV−１抗体を一回投与すると、一時的に、症
状の軽減、Ｔリンパ球の一過性の増加、日和見感染の頻
度減少、および患者の血漿あるいはリンパ球から培養で
きるHIV−１の割合の減少という結果が見られる旨の報
告をしている。Karpas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,85,pp.9234−9237（1988）も参照のこと。さらに、Em
ini et al.,Nature,355,pp.728−730（1992）は、HIV−
１に曝す以前の動物、チンパンジーへのHIV−１に特異
的に反応する抗体の投与をした結果、ウィルス感染の発
症を防止するとの結果を報告している。これら研究は、
HIV−１中和能力を有する抗体が、HIV−１感染の予防／
治療において有用であることを示唆するものである。

HIV−１の主要な外被タンパク質であるgp120は、細胞
性CD4受容体に結合し、ウィルスの細胞内への侵入を促
進する。糖タンパク質のいくつかのエピトープは、中和
抗体の作製と関連付けられてきている。Ho et al.,Scie
nce,239,pp.1021−1023（1988）は、gp120のアミノ酸25
4−275は、HIV−１の三つの異なる単離株を含むグルー
プ特異的中和の能力を有するポリクローナル抗血清を導
くことを報告している。Haigwood et al.,Vaccines 90,
pp.313−320（1990）およびHo et al.,J.Virol.,65
（１）,pp.489−493（1991）によれば、gp120にあるア
ミノ酸の一次構造からは構成されていないエピトープで
ある、立体構造依存性エピトープは、ウィルスの種々の
株を中和する抗体を誘導しうることを報告している。HI
V−1 gp120のいわゆる「主要中和決定基」（PND）は、g
p120の「V₃ループ」に集中している。Putney et al.,Sc
ience，234,pp.1392−1395（1986）;Rusche et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA，85,pp.3198−3202（1988）;Goud
smit et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,pp.4478−448
2（1988）;Palker et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,
pp.1932−1936（1988）;Holley et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA，85,pp.6800−6804（1991）を参照のこと。V
₃ループは、領域両側面に位置するシステイン残基間の
ジスルフィド結合により作られた超可変領域からなる。
たとえば、HIV−1_MNのV₃ループは、gp120の302と336の
位置の間にあるシステイン残基間のジスルフィド結合に
より形成されている。

種々のHIV−１単離物からのV₃ループの一連のアミノ
酸残基を含む組換えおよび合成タンパク質断片が、単離
あるいは種特異性中和抗体をマウスから得られること
を、Lasky et al.,Science,233,pp.209−212（1986）;P
alker et al.,Supra;Matsushita et al.,J.Virol.62,p
p.2107−2114（1988）；およびJavaherian et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,86,pp.6768−6772（1989）で報告
されている。さらに最近の研究［Putney et al.,supra
およびLaRosa et al.,Science,249,pp.932−935（199
0）］では、V₃ループのβターン構造が、分離株特異性
抗体によって部位認識されることが実証されている。Sc
ott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,pp.8597−8601
（1990）は、PNDも、ヒトにおいて種特異性抗体を誘導
できることを報告している。PNDの超可変性は、エピト
ープにより生成された種特異性中和活性を説明するもの
であろう。

いくつかの研究が、組み換えgp120に対して調製され
た抗体、精製gp120あるいはV₃領域からの合成ペプチド
が、種々のHIV−１分離株を中和することを示唆してい
る。Javaherian et al.,Science,250,pp.1590−1593（1
990）、およびWeisst et al.,Nature,324,pp.572−575
（1986）それぞれは、単離MN株のPNDおよび単離III_B株
から誘導された組み換えgp120それぞれに対応するペプ
チドで免疫処置されたウサギからのポリクローナル血清
による、MNおよび単離III_B株双方の中和を記している。
Haynes et alの米国特許第5,019,387号も参照のこと。

Akerblom et al.,AIDS,4,pp.953−960（1990）には、
III_Bおよび11個の主要HIV−１単離株を中和するモノク
ローナル抗体調製物が記載されている。1991年８月８日
に発行されたWahren et al.,のPCT出願公開公報No.WO 9
1/11198も参照のこと。しかしながら、Akerblomの主要
単離体の分離株相同性は決定されておらず、11個の単離
株は、III_B類似と思われる。Durda et al.,AIDS Res.Hu
m.Retrov.,6,pp.1115−1123（1990）には、MN−およびI
II_B−双方に感染した細胞によるシンシチウム形成を阻
害するが、逆転写酵素活性と相関する結果を得ることが
知られている分析法である「LAV捕獲免疫測定法」によ
って検定した結果、MNウィルスの感染を中和しないこと
を報告している。1990年12月13日公開のScott et al.,
のPCT出願公開公報No.WO 90/15078には、MN株のPNDある
いは「MN様」単離ウィルス株を発現するワクチニヤ・ウ
ィルスで感染した細胞によるシンシチウム形成を阻害す
るモノクローナル抗体が記されている。標準的な逆転写
酵素、p24もしくはMT−２分析法による、活性HIV−１の
複数の株を中和する、「広範に中和する」抗体の存在は
全く実証されていない。1988年12月１日、1990年11月１
日、および1991年７月11日にそれぞれ発行されたタノッ
クスバイオシステムズ社のPCT出願公開公報No.WO 88/
09181、WO 90/12868、およびWO 91/09625;1991年12月26
日に発行されたニューヨーク大学のPCT出願公開公報No.
WO 91/19797、さらにLiou et al.,J.Immunol.,143（1
2）,pp.3967−3975（1989）も参照のこと。

前述文献では、現在まで開発されたHIV−1 PNDとの反
応性を有するモノクローナル抗体が、様々なグループ反
応性を示すことを示唆しておるものの、広範な中和活性
を有しているとは思われない。これら研究によって示さ
れた分離株およびグループ特異的反応性の異なるパター
ンは、アミノ酸配列およびgp120のループ領域の立体構
造に関連するものと思われる。

いくつかの研究により、CD4受容体のみが、ウィルス
感染に原因する細胞性受容体を意味するものでないこと
を示唆している。これらの研究結果は、CD4⁺細胞への感
染を阻害する前述した抗体の患者への投与では、生体の
HIV−１感染に対してはCD4⁺細胞に限定された防御のみ
を提供する可能性を示している。Cheng−Mayer et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84,pp.3526−3530（1988）
は、神経膠細胞CD4分子以外の受容体を含む神経膠細胞
のHIV−１感染を報告している。さらに、Takeda et a
l.,Science,242,pp.580−583（1988）は、抗体/HIV−１
複合体が、受容体媒介エンドサイトーシスによって単球
を感染でき、またウィルス増殖を向上させることを示し
ている。同様の抗体依存性の感染増大が、Halsted et a
l.,Nature,265,pp.739−741（1977）;Peiris et al.,Na
ture，289,pp.189−191（1981）；およびSchlesinger e
t al.,J.Immunol.,127,pp.659−665（1981）にも記載さ
れている。

過去の研究の結果、特定の動物ウィルスは、補体、特
にClqによって、抗体非依存型機構を通じて不活化され
ることを示している。Weiss et al.,Eds.,Cold Spring
Harbour laboratory,New York,pp.1219−1220（1982）
中のWeiss,Molecular Biology of Tumor Viruses,RNA T
umor Viruses;Welsh et al.,Virology,74,pp.432−440
（1976）;Bartholomew et al.,J.Exp.Med.，147,pp.844
−853（1978）;Cooper et al.,J.Exp.Med.,144,pp.970
−984（1976）;Sherwin et al.,Int.J.Cancer,21,pp.6
−11（1978）を参照のこと。Banapour et al.,Virolog
y,152,pp.268−271（1986）には、非加熱血清分画が、H
IV−１の力価や、あるいは末梢血液中の単核細胞に感染
する能力に対しては何等の効果も持たない旨が記載され
ているものの、Spear et al.,J.Virol.,64（12）,pp.58
69−5873（1990）は、補体とHIV−１血清陽性患者から
集められた血清の組み合わせによって処理したHIV−１
の感染力が低減したことを報告している。

つまり、当該技術分野においては、HIV−１に対して
特異的な免疫学的反応性を有する（例えば、ネズミ由来
抗体、ヒト型化抗体、および免疫学的に活性な抗体の断
片を含む）新規のモノクローナル抗体の開発が必要とさ
れているのである。理想的には、かような抗体は、適切
なHIV−１感染宿主細胞となる培養細胞（例えば、H9細
胞）を用いての標準的な逆転写酵素、p24、MT−２、お
よびシンシチウム形成分析法により決定された、複数の
HIV−１株（例えば、III_BおよびMN）の効果的な中和能
力を有することで特徴付けられる。感染あるいは非感染
患者の受動免疫での予測された用途を鑑みれば、かよう
な、モノクローナル抗体は、HIV−１粒子の補体依存性
（すなわち、介在性）ウィルス感染ならびにHIV−１感
染細胞の抗体依存性細胞溶解に有効に関与する能力を有
することが望ましい。

簡単な概要本発明は、配列番号:1に示したアミノ酸配列、グリシ
ン−プロリン−グリシン−アルギニン（Ｇ−Ｐ−Ｇ−
Ｒ）、を含むHIV−1 gp120もしくはgp160タンパク質部
分と特異的に反応し、さらに標準的な逆転写酵素、p2
4、MT−２、およびシンシチウム形成分析法により決定
された、活性HIV−１株MNおよびIII_Bによる培養液中のH
9細胞の感染を中和する能力により特徴付けられるモノ
クローナル抗体を産生する。本発明の生成物は、HIV−
１粒子の補体依存性ウィルス溶解および／またはHIV−
１感染細胞の抗体依存性細胞溶解を誘導する能力により
さらに特徴付けられる。

本発明のモノクローナル抗体は、体液（例えば、血
液）中のHIV−１の存在を決定するための診断方法およ
び／またはキットに使用できる。本発明のモノクローナ
ル抗体は、好ましくはIgG抗体であり、殊にHIV−１感受
性もしくはHIV−１感染した動物、特にヒトの抗HIV−１
治療の目的での使用に好適である。免疫学的有効な量の
モノクローナル抗体の投与により、HIV−１感染患者も
しくはHIV−１感染の危険がある患者に、HIV−１ウィル
ス感染に対する受動免疫を高める効果を有すること、さ
らには、好ましくは、HIV−１粒子の補体依存性ウィル
ス溶解および／または患者のHIV−１感染細胞の抗体依
存性細胞溶解に効果を高めうることが望ましい。

キメラ体あるいは（CDR−移植した抗体を含む）「ヒ
ト型化」抗体、抗体断片、および、特に、特許請求した
モノクローナル抗体を基にした二価抗体は、本発明の範
疇にあるものであり、同様に、原核生物もしくは真核生
物細胞中に生成された組み換え抗体関連生成物も含むも
のである。例えば、FabおよびＦ（ab′）_２断片のよう
な抗体断片は、本発明の抗体の可変領域に関する構造
（配列）情報が決定され次第、大腸菌、酵母、昆虫およ
び哺乳類細胞などの宿主細胞を使用して培養基中で生成
可能である。可変領域に関する配列情報もまた、CDR−
移植した抗体の調製を可能にする。さらに、キメラ抗体
（例えば、マウス／ヒト抗体）は、形質転換したマウス
ミエローマ細胞あるいはハイブリドーマ細胞を用いて調
製でき、また、二価抗体もハイブリッド・ハイブリドー
マ細胞によって生成される。特に意図しているのは、配
列番号:1に示した配列を必須的に含むHIV−1 gp120もし
くはgp160のアミノ酸の配列に特異的に結合する能力、
および逆転写酵素、p24、MT−２、ならびにシンシチウ
ム形成分析法での活性HIV−１株MNおよびIII_Bによる、H
9細胞の感染のin vivoでの中和能力によって特徴付けら
れた抗体の全ての相補的決定領域のアミノ酸の配列を含
むヒト抗体可変領域から必須的に構成される抗体であ
る。このような抗体をコードするDNA配列、当該抗体を
産生する宿主細胞、および当該抗体を産生するための組
換え方法も意図されている。

本発明の範疇には、抗HIV−１治療における、本発明
の生成物と他の免疫学的薬剤および／または化学治療薬
の組み合わせの使用も含む。混合投与に適した薬剤とし
ては、補体、HIV−１タンパクの様々な中和および非中
和領域に結合する抗体、およびAZTのような化学薬剤を
含む。

下記の詳細な説明において述べるように、本発明のモ
ノクローナル抗体は、gp120が本来の立体構造を持つよ
うに、活性HIV−１による適当な宿主の免疫処置によっ
て得られる。

本発明で特に説明を行っているのは、12301パークロ
ーンドライブ、ロックビル、メリーランドに所在のAmer
ican Type Culture Collectionに寄託のために、1991年
４月９日に受領され、A.T.C.C.受託No.HB 10726が付与
されたハイブリドーマ細胞系HB 10726によって産生され
た（NM−01と称する）マウス・モノクローナル抗体;PHL
S Centre for Applied Microbiology ＆ Research、ポ
ーテンダウン、ソールズベリー、英国SP4 OJGに所在
のEuropean Collection of Animal Cell Cultures（ECA
CC）に寄託のために、1993年８月20日に受領され、それ
ぞれECACC受託No.93082022、93082019、93082020、9308
2023、93082018および93082021が付与されたハイブリド
ーマ細胞系によって産生されたNM01 HuVH/HuVK、NM01 H
uVH/HuVFK、NM01 HuVHM/HuVK、NM01 HuVHS/HuVK、NM01
HuVHS/HuVFKおよびNM01 HuVHM/HuVFKと称するNM01のヒ
ト型化抗体である。

本発明の各種の態様と利点が、下記の詳細な説明での
本発明の実施例および実例の記述、図面に関する説明を
考慮すれば明らかになろう。すなわち、図１は、本発明
のモノクローナル抗体および抗体陽性AIDS患者からの免
疫血清を使用した免疫ブロット法により、非感染H9細
胞、HIV−1_MNおよびHIV−1_IIIBウィルスのタンパク質の
オートラジオグラムをまとめたものである。図２には、
本発明の抗体と種々の異なるHIV−１株のV₃ループ領域
に対応するペプチドとの免疫反応性試験の結果をグラフ
で示している。図３は、本発明の抗体およびgp120に対
する他の二つの抗−HIV抗体の、V₃ループ領域に対応す
るペプチドへの結合に関する効果を示す棒グラフであ
る。図4Aから4C、５、6Aから6B、7Aから7B、８および9A
から9Bには、本発明のモノクローナル抗体の生存HIV−
１株によるH9細胞の感染中和に関する能力を、逆転写酵
素、p24、MT−２、およびシンシチウム形成分析法のそ
れぞれで解析した結果をグラフで示している。図10は、
本発明の抗体でのウィルス感染の中和能に対するペプチ
ド阻害の決定のための分析法の結果をグラフで示してい
る。

図11Aから11B、12Aから12F、および13Aから13Fは、本
発明のモノクローナル抗体と補体との組み合わせで処理
されたHIV−１粒子の電子顕微鏡写真である。図14およ
び15には、本発明のモノクローナル抗体、NM−01のＬ鎖
およびＨ鎖それぞれの可変領域のアミノ酸配列、ならび
に三つの異なる抗HIV−１モノクローナル抗体のＬ鎖お
よびＨ鎖のアミノ酸配列を記している。図16および17
は、マウス・モノクローナル抗体NM−01のＬ鎖およびＨ
鎖それぞれの可変領域のアミノ酸配列と、HuVH/HuVKFと
称する本発明のヒト型化NM−01抗体のＬ鎖およびＨ鎖の
アミノ酸配列を相対的に配置してある。図18、19、20、
21および22は、逆転写酵素、p24、MT−２、ならびにシ
ンシチウム形成分析法それぞれによる、本発明のキメラ
およびヒト型化抗体の生物学的活性のスクリーニングの
結果をグラフで示したものである。

実施例下記の実施例は、ハイブリドーマ細胞HB 10726の作
製、配列番号:1のアミノ酸配列Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒを含むペ
プチドならびにHIV−1 gp120（もしくは、その前駆体で
あるgp160）に免疫学的な反応性を有するモノクローナ
ル抗体の該細胞からの単離、および該モノクローナル抗
体の特性に関する本発明の実例を示すものである。

より詳細には、実施例１は、ハイブリドーマ細胞HB 1
0726の産生ならびに該細胞からのモノクローナル抗体NM
−01の単離に関するものである。実施例２は、抗体NM−
01によって認識されるウィルスエピトープの解明に関す
る。実施例３には、各種のHIV−１分離株とモノクロー
ナル抗体との反応特性が記されている。実施例４は、逆
転写酵素およびp24分析法によって実証された、様々な
活性HIV−１株によるH9細胞の感染を中和する能力につ
いての抗体NM−01の反応特性に関する。実施例５は、MT
−２およびシンシチウム形成分析法によってさらに実証
された、活性HIV−１分離株の感染を中和する能力につ
いての、抗体のスクリーニングに関する。実施例６は、
モノクローナル抗体NM−01のHIV−１感染中和特性のペ
プチド阻害に関する。

実施例７では、モノクローナル抗体NM−01のHIV−１
の補体依存性溶解を活性化する能力に関する解析がなさ
れている。実施例８は、モノクローナル抗体NM−01と培
養基中での感受性細胞のHIV−１感染に関する補体とを
組み合わせることによる効果の決定に関する。実施例９
には、モノクローナル抗体NM−01のＨ鎖およびＬ鎖可変
領域のDNAおよび推定アミノ酸配列が記載されている。
実施例10は、モノクローナル抗体NM−01のキメラおよび
ヒト型化体の調製、およびその免疫学的ならびに生物学
的活性のための分析に関する。

実施例１ハイブリドーマ細胞系HB 10726は、OiとHerzenberg,S
elected Methods Cell Immunology,pp.351−372（197
9）およびGodding,J.Immunol.Meth.，39,pp.285−308
（1980）などに記されたような標準的な免疫学的技法を
用いて産生されたものであり、その詳細を以下に説明す
る。

A.活性HIV−1_MNの精製 300mlのHIV−1_NM感染H9細胞培養液を回収し、1500rpm
で５分間、４℃にて遠心分離し、細胞をペレット状にし
た。ウィルスを含んだ上清を分取して保存する一方で、
沈澱物は2100rpmで20分間、再度遠心分離した。二回目
に得られた上清は回収して、先に得られた上清と合わ
せ、この合わせた上清をSW 27ローターを用いて、25000
rpmで90分間、４℃にて超遠心分離し、ウィルス粒子を
ペレット状にした。残った上清液は、廃棄した。ウィル
スペレットは、約10mlのTHE緩衝液（100mM NaCl、10mM
Tris−HCl、pH7.7、1mM EDTA）に再懸濁した。超遠心用
遠沈管には、下層に10mlの50％ショ糖TNE、中層に10ml
の25％ショ糖TNE、そして上層に10mlのウィルス試料を
含むようにし、そして25000rpmで90分間、４℃にて超遠
心分離した。ウィルスは、ショ糖TNE層間に白帯状に沈
澱し、パストゥールピペットで回収した。ウィルスに、
20ml TNE/15mM EDTA（100mM NaCl、10mM Tris−HCl、pH
7.7、15mM EDTA）を添加し、ウィルス試料を25000rpmで
90分間、４℃にて再度遠心分離した。得られたペレット
には、精製された活性HIV−1_MNが含まれていた。

B.免疫処置およびハイブリドーマ調製 100μｇの活性HIV−1_MNを、腹腔内注射による３匹の
２ヶ月齢Balb/cマウスそれぞれを免疫処置するために使
用した。各マウスは３週間後に30μｇのウィルスを注射
され、さらに３週間後に100μｇのウィルス調製物を注
射された。２回目の注射を終えて３日後にマウスを犠牲
にし、脾臓細胞をP3−X63−Ag8−U1細胞（A.T.C.C.寄託
番号CRL 1597）と融合することにより、ハイブリドーマ
細胞系を調製した。ハイブリドーマ細胞系は、慢性的に
感染したH9細胞（10匹）、急性的に感染したH9細胞（９
匹）、および感染したH9細胞膜（３匹）で免疫処置した
マウスの脾臓からも調製された。慢性的に感染したH9細
胞とは、感染後２〜３週間後に逆転写酵素分析法（RT）
で100,000cpm〜150,000cpmの計測値を示す細胞を指し、
一方で急性的に感染したH9細胞とは、感染後10〜12日後
にRTで200,000cpm〜250,000cpmの計測値を示す細胞を指
す。

ハイブリドーマ細胞は、下記の方法によって調製され
る。免疫処置したマウスからの脾臓細胞を集めて、800g
で５分間、遠心した。細胞のペレットから上清を吸引
し、細胞10⁸個当たり1mlの温かい（37℃）50％PEG−150
0をペレットに１分間にわたって添加した（0.25mlを添
加し、ピペットの先端で15秒間ゆっくりと撹拌し、この
操作を繰り返す）。この混合物を、さらに数分間にわた
って、細胞を壊さないように、同じピペットの先端で撹
拌した。1mlの「不完全培地」〔25mM HEPES（Sigma C
o.）、10,000U/mlのペニシリン、および10,000mg/mlの
ストレプトマイシンを補ったRPMI 1640（JRH Bioscienc
es）〕を１分間にわたって同様の方法（15秒毎に、0.25
mlずつ）で添加し、さらに1mlを同じ時間にわたって添
加した。次に、7mlの不完全培地を２〜３分間にわたっ
て（20秒毎に、1mlずつ）撹拌し、細かい細胞の懸濁液
とした。最終懸濁液を、臨床用遠心機にて、500gで５分
間遠心し、上清を除去した。沈澱物を、「完全培地」
〔15％ウシ胎児血清（FBS）を補った上記「不完全培
地」〕中で（撹拌機またはピペットで溶液を吸い上げた
り吸い出したりするのではなく）試験管をゆっくり反転
させることにより、培地1ml当たり細胞が２×10⁶個の濃
度になるまで懸濁する。次に、96ウェルプレートの１ウ
ェル当たりに、この懸濁液の0.1ml（総細胞数２×10
⁵個）を分注した。プレート板を、37℃、７％CO₂の条件
下でインキュベートした。融合の日を０日目とした。

C.HAT選択およびハイブリドーマの最初のスクリーニン
グ融合して24時間後（１日目）、0.1ml HAT培地（10^-4M
ヒポキサンチン、５×10^-7Mアミノプテリン、および1.6
×10^-5Mチミジン）を各ウェルに添加した。２、３、
５、８、11、14、17および21日目に、各ウェルから0.1m
lの培地を除去し、新鮮な0.1ml HAT培地と交換した。２
〜５日目にあっては、ウェルには死んだ細胞しか含まれ
て居ないように見えた。５〜10日目の間に、ハイブリド
ーマが出現し始めた。ハイブリドーマ細胞は、細胞片の
中にあって、非常に屈光性の細胞のコロニーとして視覚
的に容易に認識できた。

D.ハイブリドーマ・スクリーニングハイブリドーマ上清のスクリーニングのために、様々
な分析法が利用されている。HIV−１との反応性を有す
る抗体を分泌するハイブリドーマは当初、ハイブリドー
マ培養物上清を用いたELISAによる、非感染およびMN−
感染H9細胞から調製されたスクリーニング用の膜によっ
て同定されていた。この当初のスクリーニングは、ELIS
Aのデータに生存感染細胞への抗体の結合に関するデー
タを加味した、蛍光抗体法および放射線免疫検定法に引
き継がれた。

ELISA用の細胞膜を、感染あるいは非感染H9細胞から
調製した。細胞は、1mM EDTAを含んだ、pH7.4の、250mM
ショ糖/10mM Tris−HCl緩衝液に懸濁した。懸濁液は、
氷浴中に置いたDounceのホモジェナイザーで、トリパン
ブルー排除試験にて生存細胞が確認されなくなるまで、
均質化した。混合物は、50gにて、２分間、遠心分離し
た。得られたペレットを、再度均質化および遠心分離し
た。二つの上清を合わせ、20,000gにて、20分間、遠心
分離した。ペレットを同じ緩衝液中で再度均質化し、20
分間遠心分離し、そして得られたペレットを7mlの元の2
50mMショ糖−EDTA緩衝液中で再懸濁した。この溶液を、
1mM EDTAを含んだ、2Mショ糖/10mM Tris−HCl緩衝液上
に重層し、80,000gにて、１時間、遠心分離した。その
結果得られた不明確な白い界面を回収し、250mMショ糖
緩衝液中で再懸濁した。タンパク含量をBCA分析法（Pie
ce Chemical Company）で決定した。懸濁液を等分に分
割して、−70℃で保存した。

ELISA法のために、400ng/ウェルの濃度の細胞膜を96
穴ウェルプレートに添加し、25℃で、一晩乾燥した。プ
レートを0.5％Triton−Ｘ（登録商標）／燐酸緩衝液生
理食塩水（PBS）で洗浄し、５％ウシ胎児血清（FBS）/P
BSでブロックし、再度洗浄した。ハイブリドーマ上清
（40μｌ）を、50μｌのPBSで希釈し、ウェルに添加し
て、４℃で、一晩反応させた。洗浄後、セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ（HRP）（Zymed）で標識したウサギ抗
マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）を、ウェルに添加し、25℃で、２
時間反応した。ウェルを0.5％Triton−Ｘ（登録商標）/
PBSで洗浄し、吸光度を405および650nmで測定する前
に、ABTS（Bio−Rad基質キット）の存在下で、20分間イ
ンキュベートした。

ELISAにおいて非感染細胞膜および感染細胞膜双方に
陽性としてスクリーニングされた、慢性的に感染した細
胞および急性的に感染した細胞で免疫処置されたマウス
の脾臓細胞から生じたハイブリドーマの上清は、ハイブ
リドーマから産生された抗体がHIV−１特異性でなかっ
たことを示した。感染細胞膜で免疫処置したマウスの脾
臓細胞から生じた1039個のハイブリドーマの内、５個の
ハイブリドーマの上清が、感染細胞膜と強く反応し、非
感染細胞膜とはかすかにしか反応しなかった。これらハ
イブリドーマ細胞系からの上清に関してウエスターンブ
ロット法を実施したところ、産生された三つのモノクロ
ーナル抗体の内の一つがHIV−1 p55に結合し、他の一つ
がHIV−1 p55とp24に結合し、さらに最後の一つがウエ
スターンブロットにてバンドを生じないことが判明した
（データ示さず）。ELISAの結果を、非感染細胞と感染
細胞から得られた数値の比率として表１に記した。

1187個のハイブリドーマが、活性HIV−1_MN株で免疫処
置したマウスの脾臓細胞から生じた。さらにスクリーニ
ングを実施するために、４つの上清中の抗体が、感染細
胞膜と強く反応し、非感染細胞膜とはかすかにしか反応
しなかったというELISAの結果を基にして、４つのハイ
ブリドーマ細胞系を選択した。

４つのハイブリドーマの上清を限界希釈クローニング
の試料とし、放射性免疫検定法（RIA）によってスクリ
ーニングした。¹²⁵I（Ｒ∝M IgG−¹²⁵I）でラベルした
ウサギ抗マウスIgGを、Sephadex G−50カラム（NEN−Du
pont）にて精製した。非感染H9細胞、あるいはHIV−1_MN
株で感染したH9細胞（150μｌ中に7.5×10⁵個の細胞）
を15ml容量のチューブに入れた。各ハイブリドーマから
の50μｌの上清を非感染細胞および感染細胞が入ってい
るチューブに加え、混合物を、４℃で、一晩インキュベ
ートした。細胞を、2ml PBS/50％Tween−20（登録商
標）で２度洗浄し、洗浄と洗浄の間に、撹拌を行った。
PBS/5％FBS中の50μｌのＲ∝M IgG−¹²⁵I（750,000cp
m）を加え、混合物を４℃で、再度一晩インキュベート
した。インキュベーション後、細胞をPBS/50％Tween−2
0（登録商標）で３度洗浄した。細胞を殺菌するため
に、100μｌのPBS/5％Triton−Ｘ（登録商標）を加え、
シンチレーション容器に標識物質の移動を助けるため
に、100μｌの1M水酸化ナトリウムを加えた。試料は計
測され、RIAの結果を下記表１に非感染細胞のcpm値に対
する感染細胞のcpm値との間の比率として示した。

次に、４つのハイブリドーマ細胞系を蛍光抗体法によ
りスクリーニングした。2mlの非感染H9細胞もしくはHIV
−２感染H9細胞（約１×10⁶個/ml）を、10ml容量の無菌
遠沈管に、10mlのPBS（Ca⁺⁺もしくはMg⁺⁺含まず）と共
に入れた。細菌を10mlのPBSで遠沈管を満たし、撹拌
し、100rpmで５分間遠心し、約100μｌの「乳状の」細
胞懸濁液以外を吸引することにより、一度洗浄した。層
流状態にある間、51mmの10ウェル・スライド（Cell Lin
e Association）を、細胞懸濁液で各ウェルを溢れさ
せ、ピペットの先端で溢れた懸濁液を吸い上げることに
より、懸濁液で覆った。懸濁液で覆われたスライドを風
乾し、常温下で、10分間、メタノール中に固定した。４
つのハイブリドーマのそれぞれからの上清を、非感染細
胞および感染細胞のスライド試料の反応性に関して、非
希釈および1:50の濃度（0.02％スキム・ミルクに希釈し
た上清）にて試験した。15μｌの非希釈あるいは希釈し
た上清をスライドの各ウェルに添加した。スライドを37
℃で、30分間インキュベートし、５分間撹拌しながらPB
S中に浸した。スライドを迅速に蒸留水ですすぎ、層流
風乾した。0.02％スキム・ミルク中で1:80に希釈した、
16μｌのヤギ抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ab）_２断片（C
appel Biomedical）を各ウェルに添加した。スライドを
再度37℃で、30分間インキュベートし、PBS中に浸し
た。スライドをPBS中の0.01％エバンスブルー溶液で５
秒間すすぎ、蒸留水で２度すすいだ。スライドを蛍光抗
体法によって試験し、スクリーニングの結果を表２に示
し、表２において、マウスIgG（MIgG）、5C5抗体（抗−
III_B）および（感染細胞膜によって免疫処置されたマウ
スの脾臓から生じたハイブリドーマからの）Grp.5上清
は、対照抗体である。

ハイブリドーマ細胞系HB 10726は、RIAおよび蛍光抗
体法のデータからして抗体を産生する見込みが最もある
として選択された。この細胞系は、ELISAにおいては最
も高い結合率を示さなかったが、ELISAが乾燥細胞膜へ
の結合性を示すのに対し、RIAと蛍光抗体法の結果が生
存感染細胞への結合性を示すことからRIAのデータが最
も重要である。この細胞系は２回サブクローニングさ
れ、この細胞が産生したモノクローナル抗体をNM−01と
命名した。マウスの腹腔にこの細胞を標準手段によって
注射し、モノクローナル抗体NM−01を腹水からプロテイ
ンＡアフィニティーカラム精製（Pierce）によって濃縮
した。

抗体NM−01のアイソタイプは、型特異的血清（Bio−R
ad）によってIgG_2bと決定された。この抗体（1.8mg/m
l）は、15％FBSでRPMI 1640培地に希釈され、以下の実
施例にて使用された。

実施例２モノクローナル抗体NM−01によって識別されるウィル
スエピトープを特定するために、最初にこの抗体を、精
製されたMNおよびIII_Bウィルス粒子の蛋白との反応性に
関するウエスターンブロット分析法を試み、次に、HIV
−1 gp120のV3ループ領域のアミノ酸配列に対応する重
複しているペプチドとの反応性に関するELISA法により
スクリーニングを行った。

A.ウエスターンブロット分析感染H9細胞の培養上清から精製されたMNおよびIII_Bウ
ィルス粒子を、1.3％SDS/3％β−メルカプトエタノール
中で可溶化し、0.1％SDS/10％ポリアクリルアミドゲル
中での電気泳動の試料とした。ニトロセルロース紙へタ
ンパク質を移した後、細片をブロッキング緩衝液（0.02
M Tris−HCl,pH7.4,0.1M塩化ナトリウム,0.05％標準ヤ
ギ血清および５％脱脂乾燥乳）中で、４℃で、モノクロ
ーナル抗体NM−01と共に一晩インキュベートし、pH7.4
の0.02M Tris−HCl、0.1M塩化ナトリウム、及び0.3％Tw
een（登録商標）で洗浄した。細片は、次に、ビオチン
化ヤギ抗マウスIgG（Zymed）と共に１時間インキュベー
トし、洗浄し、¹²⁵I−ストレプトアビジン（Amersham,A
rlington Heights,IL）でさらに１時間、４℃で、反応
させた。モノクローナル抗体NM−01の反応性は、オート
ラジオグラフィーによって観察した。

オートラジオグラフィーの結果を図１に示し、図１に
おいて、レーン１と３は非感染H9細胞を含んだゲル、レ
ーン４はHIV−1_MN感染H9細胞を含み、レーン２と５はHI
V−1_MNウィルスを含み、およびレーン６と７はHIV−1
_IIIBウィルスを含む。抗体NM−01はレーン１、２および
６のタンパクと反応し、HIV−１血清陽性患者の血清は
レーン３〜５および７のタンパクと反応した。

モノクローナル抗体NM−01は、見かけの分子量約120k
Dを有するMNならびにIII_Bウィルス蛋白との反応性を示
したが、その他のいかなるウィルス抗原のバンドとも反
応せず、この抗体がgp120のエピトープを認識すること
を示唆した。

比較のために、Wahren et al.,のPCT公開公報No.91/1
1198に記載されたモノクローナル抗体F58/H3およびP4/D
10を、（受託No.90011607および90011608それぞれを）E
CACCから入手し、モノクローナル抗体NM−01でのウェス
ターン・ブロット法に沿って、組換えHIV−1_MNgp120（A
gmed社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）、組換
えHIV−1_IIIBgp120（DuPont−NEN、ボストン、マサチュ
ーセッツ州）、天然HIV−1_MNgp120、および天然HIV−1
_IIIBgp120への結合性に関して試験を行った。ウェスタ
ーン・ブロット分析は、ウサギ抗マウス二次抗体を抗体
の結合を検出するための比色分析に用いた以外は、上述
した手順と同様にして行った。モノクローナル抗体NM−
01は、天然のMNおよびIIIB gp120と共に、MNおよびIIIB
由来の組換えgp120双方と反応した。しかしながら、モ
ノクローナル抗体F58−H3およびP4/D10は、天然HIV−1
_IIIBgp120およびHIV−1_IIIB由来の組換えgp120としか反
応しなかった。

B.ELISAによるエピトープ解析抗体NM−01により認識されるgp120の特異的エピトー
プを同定するために、抗体をgp120のV3ループ領域に対
応する重複しているペプチドとの反応性に関してELISA
によってスクリーニングした。Multiple Peptide Syste
ms,San Diego,CAによって合成したペプチドは、HIV−1
_MNgp120のアミノ酸302−316、312−326および322−336
に対応していた。

３つのペプチド（ウェル当たり、250ng/50μl 0.1Mホ
ウ酸緩衝液、pH8.0）を２枚のImmulonプレート（Dynate
ch）にて、37℃で、一晩インキュベートした。プレート
をPBSで洗浄し、PBS/0.1％Tween（登録商標）/0.1％ウ
シ血清アルブミン（BSA）で、室温で、１時間かけてブ
ロックした。ブロッキング剤を除去し、100μl HAT培地
中で希釈した異なる量の抗体NM−01またはマウスIgG（M
IgG）をプレートに添加した。抗体を、室温で、２時
間、反応させた。プレートを水道水で10回洗浄した。1:
1000に希釈したHRP接合ウサギ抗マウス第二抗体を、PBS
/0.05％Tween（登録商標）/0.5％BSAに入れ、ウェル毎
にその100μｌを添加した。プレートを室温で、１時間
インキュベートし、そして水道水で10回洗浄した。ABTS
基質（Bio−Rad）を添加し、20分間後に、650nmでプレ
ートの吸光度測定を行った。

配列番号:2〜４にはペプチドのアミノ酸配列が示され
ており、表３には抗体MIgGとHAT培地を陰性対照とした
重複したペプチドを用いた分析法の結果を示した。

V3ループのアミノ酸302−316もしくは322−336に対応
するペプチドとモノクローナル抗体NM−01との検出され
うる反応性は認められなかったが、アミノ酸312−326の
ペプチドへのこの抗体の結合は明らかである。対照抗体
のマウスIgGはペプチドと結合しなかった。

実施例３ HIV−1_MNgp120のV3ループ領域にモノクローナル抗体N
M−01が結合するという証明は、他のHIV−１分離株との
反応性の程度に関する研究をさらに促進した。HIV−１
分離株III_B、RF、CDC4、NY/5、Z6、Z2およびELIのV3ル
ープ領域に相当するペプチドとの反応性に関してELISA
法によって抗体をスクリーニングした。ペプチドのアミ
ノ酸配列を下記表４、および配列番号:5〜12にそれぞれ
示した。

ペプチド（250ng/0.1Mホウ酸緩衝液、pH8.0、America
n Biotechnologies,Canbridge,MAにより合成）を２枚の
Immulonプレート（Dynatech）にて、４℃で、一晩イン
キュベートした。プレートをPBSで洗浄し、0.1％Tween
（登録商標）/0.1％BSA/PBSで、25℃で、２時間ブロッ
キングし、そしてモノクローナル抗体NM−01と共に、37
℃で、１時間インキュベートした。水道水で洗浄後、プ
レートをHRP−標識ウサギ抗マウス二次抗体で、25℃
で、１時間、次に、ABTS基質（Bio−Rad）で、20分間イ
ンキュベートした。反応性を、650〜405nmの吸光度測定
により決定した。分析結果を図２に示した。

モノクローナル抗体NM−01は、NM（黒塗円）、III
_B（白抜円）、RF（白抜三角）およびCDC4（黒塗三角）
単離物からのループペプチドと反応した。III_B、RFおよ
びCDC4ペプチドへの抗体の結合は、MNペプチドとの結合
と同等であった。またモノクローナル抗体NM−01は、NY
/5ペプチド（星印）とは小さな反応性しか示さなかっ
た。モノクローナル抗体NM−01は、配列番号:13に示し
たRF様ペプチドにも反応するものと推定される。これに
対して、Z6（黒塗四角）、Z2（白抜逆三角）およびELI
（白抜四角）単離物からのループペプチドとは、ほとん
ど反応しなかった。これら結果は、モノクローナル抗体
NM−01が、特に、配列番号:1に示したアミノ酸配列Ｇ−
Ｐ−Ｇ−Ｒを有する複数のHIV−１単離物のgp120のV3ル
ープのエピトープを認識することを示すものである。

モノクローナル抗体F58/H3およびP4/D10も、MN、II
I_B、RF様、CDC4、NY/5、Z2、Z6および、ELIのV₃ループ
ペプチドへの反応性を試験した。NM−01とは対照的に、
モノクローナル抗体F58/H3およびP4/D10双方は、III_Bペ
プチドとしか反応せず、配列番号:14に記載のRF様ペプ
チドとはわずかにしか反応しなかった。

MN様およびIII_B様V₃ループペプチドと反応し、RF様ペ
プチドとは反応しない、他の抗−HIV−1 gp120モノクロ
ーナル抗体、モノクローナル抗体BAT123が、前出のLiou
et al.,に記載されている（前出のLiou et al.,の第39
72頁の図5Aを参照）。これら報告されている反応性は、
先のパラグラフにて記載したモノクローナル抗体NM−01
の反応性とは異なる。抗体NM−01とBAT123の双方共に、
III_Bペプチドには比較的良く結合するが、NM−01と同様
のMNペプチドへの結合を得るためには、BAT123は約50倍
高い濃度が必要とされる。さらに、NM−01は表４および
配列番号:7に示したRFペプチドならびに配列番号:14に
示したRF様ペプチドと反応するが、BAT123は、たとえば
抗体濃度を10,000μg/mlにしても、RF様ペプチドには結
合しない。

拮抗分析において、モノクローナル抗体NM−01、F58/
H3およびP4/D10の結合を、（配列番号:7の一部が）重複
しているIII_Bループペプチド:IRIQRGPG（ペプチド
１）、RIQRGPGR（ペプチド２）、IQRGPGRA（ペプチド
３）、QRGPGRAF（ペプチド４）、RGPGRAFV（ペプチド
５）およびGPGRAFVT（ペプチド６）の各々が存在してい
る条件下で測定した。この分析法は、以下のようにして
行った。100μｌの組換えIII_B gp120（PBS中の0.5μg/m
l）を、Immuno 4プレート（Dynatech社）に被覆し、一
晩、室温にてインキュベートした。そして、このプレー
トを250μｌのブロック用緩衝液（PBS中の５％正常ウサ
ギ血清）で、37℃にて、１時間ブロックした。モノクロ
ーナル抗体NM−01、F58/H3およびP4/D10を、ブロック用
緩衝液で10μg/mlまで希釈し、そして６つのIII_Bループ
ペプチドそれぞれを、ブロック用緩衝液で100μg/mlま
で希釈した。５μg/mlの最終抗体濃度および50μg/mlの
ペプチド濃度となるように、1:1体積比で、それぞれの
抗体を各ペプチドと個別に混合した。抗体とペプチドの
混合物を、室温にて、40分間インキュベートし、そし
て、分析用のブロック処理され、gp120被覆したプレー
トのウェル（100μl/ウェル）に移した。対照のウェル
には、ペプチドは置かずに、５μg/mlの抗体のみを置い
た。これらプレートを、37℃で、40分間インキュベート
し、そして、洗浄用緩衝液（PBS中の0.005％Tween−2
0）で４回洗浄した。

ウサギ抗マウス/HRP結合した抗体（100μl/ウェル）
を、ブロック用緩衝液にて1:1000希釈した二次抗体とし
て用い、そして、37℃で１時間インキュベートした。プ
レートを再度洗浄し、100μl/ウェルTMB（テトラメチル
ベンジジン）を用いて処理した。100μl/ウェル硫酸
（0.36N）で反応を停止してから、プレートを450nm〜65
0nmにて計測した。

拮抗分析の結果を、図３に示した。この分析では、ペ
プチド４が、モノクローナル抗体NM−01の組換えIII_B g
p120への結合の最も強力な阻害物であり、ペプチド３お
よび４が、モノクローナル抗体F58/H3結合の最も強力な
阻害物であり、そして、ペプチド２が、モノクローナル
抗体P4/D10結合の最も強力な阻害物であった。

実施例４逆転写酵素法によって測定した活性HIV−１株MN、III
_BならびにRF、およびp24分析法によって測定した活性HI
V−１株MNならびにIII_BによるH9細胞の感染を中和する
能力に関して、モノクローナル抗体NM−01を試験した。

逆転写酵素およびp24分析モノクローナル抗体NM−01の希釈液を、96ウェルプレ
ートにて、40TCID₅₀のMN生存ウィルスおよび100TCID₅₀
のIII_B活性ウィルスと共に、37℃で、１時間半インキュ
ベートした。HIV−1_IIIBのgp120に結合するモノクロー
ナル抗体0.5β（AIDS Research and Reference Reagent
Program Catalog,National Institute ofAllergy and
Infectious Diseases）を、逆転写酵素法において、陽
性および陰性対照の双方に用いた。H9細胞（2.5×10
⁴個）を各ウェルに添加し、プレートをさらに１時間、3
7℃で、インキュベートした。H9細胞懸濁液をRPMI 1640
/15％FBSで希釈し、24ウェルプレートにて、37℃で、イ
ンキュベートした。ウィルス生成に関して、７日目に、
Poiesz,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,pp.7415−7
419（1980）の記載に従って逆転写酵素法を、また、５
日目にp24分析法を行った（Dupont HIV−1 p24 Core Pr
ofile ELISA）。分析結果を図4Aから4Bおよび図５にそ
れぞれ示した。

モノクローナル抗体NM−01（図4Aの黒塗円）は、10〜
100μg/mlの濃度で、逆転写酵素法によって測定したと
ころ、活性MNウィルスの感染を完全に中和した。さら
に、１μg/ml未満の濃度での抗体の使用では、ウィルス
感染阻害率は50％であった（ID₅₀）。これらの知見は、
感染中和効果が認められなかったモノクローナル抗体0.
5β（図4Aの白抜円）の結果とは対照的である。モノク
ローナル抗体NM−01（図4B）は、約0.1μg/mlの濃度に
おいて感染阻害率50％（ID₅₀）で、III_B生存ウィルスを
中和した。モノクローナル抗体0.5βは、モノクローナ
ル抗体NM−01よりやや効果的にIII_Bウィルスを中和した
（図4B）。同様の結果が、HIV−1 MNおよびIII_Bに関す
るp24分析法において得られた。図５参照。逆転写酵素
分析において、モノクローナル抗体NM−01は、約0.05μ
g/mlのID₅₀で、活性RFウィルスも阻害した（図4C）。

これらのデータは、モノクローナル抗体NM−01が、HI
V−１の少なくとも三つの異種菌株による感染を中和す
ることを示している。

モノクローナル抗体F58/H3およびP4/D10の活性HIV−
１株MNおよびIII_BによるH9細胞の感染を中和する能力
も、上述したモノクローナル抗体NM−01の場合と同様、
逆転写酵素分析およびp24分析によって測定した。分析
の結果を、図6Aから6B、および7Aから7Bに示した。RT分
析にて、モノクローナル抗体NM−01が、10〜100μg/ml
の濃度にて活性MNウィルスの感染力を完全に中和するこ
とが再度認められ、１μg/ml未満の濃度の抗体の使用
が、ウィルス感染の50％阻害（ID₅₀）（図6Aの白抜円を
参照）を示した。これら知見は、モノクローナル抗体F5
8/H3およびP4/D10にて、検出可能な中和が認められなか
ったことと対照的である（図6Aの白抜および黒塗三角を
参照）。活性III_Bウィルスを用いたRT分析において、モ
ノクローナル抗体NM−01は、約0.1μg/mlのID₅₀にてウ
ィルスを中和した（図6Bの白抜円を参照）。モノクロー
ナル抗体F58/H3およびP4/D10は、それぞれ約1.1および
1.2μg/mlのIC₅₀で、モノクローナル抗体NM−01よりも
低効率でIII_Bを中和した（図6B参照）。同様の結果が、
p24分析にて、HIV−1 MNおよびIII_Bを用いた三つのモノ
クローナル抗体について得られた（図7Aおよび7B参
照）。

実施例５逆転写酵素法およびp24分析法により実証された生存H
IV−１感染の中和に関して、生存MNおよびIII_Bウィルス
を用いたMT−２法、および生存MN、III_BおよびRFウィル
スを用いたシンシチウム形成分析法において、さらにモ
ノクローナル抗体NM−01の効果を研究した。

A.MT−２分析法 MT−２分析法は、Richman,AIDS Research and Refere
nce Reagent Program,Courier No.90−01,pp.6−９（19
90）の記載に若干の修正を加えた方法にて行った。活性
MNウィルスおよび活性III_Bウィルスは、モノクローナル
抗体NM−01の希釈液と共に、96ウェルプレートにて、４
℃で、１時間半インキュベートした。MT−２細胞（８×
10⁵）をウェルに添加し、プレートを37℃で、３日間イ
ンキュベートした。各細胞の生死を観るために、Mosman
n,J.Immunol.Meth.,65,pp.55−63（1983）ならびにPaul
wels,et al.,J.Vijol.Meth.,22,pp.309−321（1988）の
記載に従ったMTT色素還元を行った。MT−２分析法の結
果は、逆転写酵素法ならびにp24分析法の結果を確認す
るものであり、その結果を図８に示し、III_B（100 TCID
₅₀）の阻害率を白抜円で、およびMN（40 TCID₅₀）の阻
害率を黒塗円で示した。

モノクローナル抗体NM−01は、活性MN単離物および活
性III_B分離株の感染をそれぞれ2.0μg/mlおよび0.1μg/
mlのID₅₀で中和した。

B.シンシチウム形成分析法結合阻害分析法は、Johnson ＆ Walker,Eds.,Techniq
ues in HIV−1 Research,Stockton Press,New York,NY,
pp.92−97（1990）に記載された方法の修正法によって
行った。すなわち、MNウィルスもしくはIII_Bウィルスの
いずれかによって慢性的に感染させたH9細胞を、モノク
ローナル抗体NM−01の希釈液と共に、37℃で１時間イン
キュベートした。次にC8166細胞を各ウェルに添加し、3
7℃で２時間インキュベートした。三つのリンパ球細胞
の直径より大きなシンシチウムを計測し、抗体欠乏下で
処理した対照感染H9細胞において得られたシンシチウム
と比較した。シンシチウム形成分析法の結果は、逆転写
酵素法およびp24分析法の結果を確認するものであり、
その結果を図9Aに示し、III_B（100 TCID₅₀）の阻害率を
白抜円で、MN（40 TCID₅₀）の阻害率を黒塗円で示し
た。モノクローナル抗体NM−01は、MN感染H9細胞による
シンシチウム形成を２μg/mlのID₅₀で、さらにIII_B感染
H9細胞によるシンシチウム形成を３μg/mlのID₅₀で阻害
した。

モノクローナル抗体BAT123の対応するシンシチウム形
成阻害の結果が、WO88/09181の表IIIに示されている。2
5μｇのモノクローナル抗体NM−01が、MN感染細胞によ
るシンシチウム形成の約85％を阻害するのに対し、BAT1
23の25μｇが、51％を阻害することが報告されており、
さらに、25μｇのモノクローナル抗体NM−01が、III_B感
染細胞によるシンシチウム形成の約85％を阻害するのに
対し、BAT123が、77.8％を阻害することが報告されてい
る。25μｇのBAT123は、RF感染細胞によるシンシチウム
形成を51％阻害することも報告されている。モノクロー
ナル抗体NM−01も、RF感染細胞によるシンシチウム形成
を阻害する（図9B参照）。先のパラグラフにて記した分
析にて、25μｇのNM−01が、RF感染細胞によるシンシチ
ウム形成の約59％を阻害した。モノクローナル抗体NM−
01は、RF感染細胞によるシンシチウム形成を、４μg/ml
のID₅₀にて阻害する。

以上をまとめると、実施例４および５の逆転写酵素、
p24、MT−２およびシンシチウム形成阻害分析法の結果
は、モノクローナル抗体NM−01が、10μg/ml以下の濃度
にあっては、複数のHIV−１株の結合と感染性を中和す
ることを示すものである。

実施例６モノクローナル抗体NM−01が、gp120 V3ループの部位
に結合することによって、HIV−1 MNおよびIII_Bの感染
を阻止することを確認するために、V3ループペプチド
が、この抗体による感染中和能力を無効にする試験に供
した。

モノクローナル抗体NM−01を、100 TCID₅₀の活性III_B
ウィルスを添加する前に、MN、III_BおよびZ6株のV3ルー
プに対応するペプチド（これらペプチドの配列を上記表
４に示した）の濃度を変化させながら、37℃で、30分間
インキュベートした。H9細胞を添加し、１時間後に、実
施例４にて記したように、完全培地にて７日間、細胞を
生育させた後、逆転写酵素活性を測定した。分析結果を
図10に示した。

モノクローナル抗体NM−01は、最も低いペプチド濃度
の場合には、III_B感染を完全に中和したが、この中和能
は、抗体とループ・ペプチドとの前インキュベーション
の際に、MN（黒塗円）ならびにIII_B（白抜円）ループ・
ペプチドの濃度を累進的に増加させると、累進的に抑制
された。モノクローナル抗体NM−01によって認識される
アミノ酸の配列を持たないZ6株（黒塗菱形）のV₃ループ
に対応するペプチドの同様の濃度においては、検出可能
な効果は見られなかった。これら結果は、モノクローナ
ル抗体NM−01がgp120 V₃領域の特定部分と反応すること
により、HIV−１の感染を妨げていることを示唆してい
る。

実施例７モノクローナル抗体NM−01が、補体経路を活性化で
き、さらに、HIV−１ウィルス粒子を破壊できるか否か
を決定するための研究をさらに行った。この場合、ウサ
ギ血清を、補体源として使用した。

モノクローナル抗体NM−01と補体によるHIV−１の溶解 HIV−1 III_B株で感染したH9細胞を、細胞毒性試験培
地（Cedarlane Lab.社）にて洗浄した。細胞を、40μg/
mlのモノクローナル抗体を含有している細胞毒性試験培
地と抗体を含まぬ培地のいずれかに再懸濁した。４℃
で、２時間、インキュベーションした後、ウサギ補体
（low−tox−MA;Cedarlane Lab.社）を、1:6に希釈して
添加した。細胞懸濁液を、４℃で、20分間、そして、37
℃で、45分間、インキュベーションした。細胞を、２％
グルタルアルデヒド/0.1M燐酸緩衝液ならびに１％四酸
化オスミウム/0.1M燐酸緩衝液で二重に固定した。エポ
キシ樹脂に包理した後、薄層部分を切断し、酢酸ウラニ
ルおよび酢酸鉛で二重染色した。図11Aから11B、12Aか
ら12F、および13Aから13Fは、この薄層部分の電子顕微
鏡写真である。

ウサギの血清のみ（図11B）およびモノクローナル抗
体NM−01のみでは、HIV−１の組織に関して検出可能な
効果は認められなかった。HIV−１をモノクローナル抗
体NM−01と補体とで処理することにより、エンベロープ
が粉砕された無数のウィルス粒子の出現および電子密度
の高いコアー部分（図11A）の欠損が観察された。典型
的な実験例では、その大部分が内部コアの欠損を抱えて
いる約90％の溶解したウィルス粒子を示していた。ビリ
オンの残りの10％は、無傷あるいは外皮エンベロープが
部分的に粉砕されたものである。高倍率にすると、図12
Aから12Fおよび13Aから13Fそれぞれの成熟あるいは不完
全ウィルス粒子の溶解の一連の顕微鏡写真に見られる。
このようにHIV−１の直接溶解によって生じた崩壊が認
められる。

実施例８次に、モノクローナル抗体NM−01と補体との組み合わ
せを、そのHIV−１感染に関する効果について決定する
ために分析した。

組織培養感染用量の決定 HIV−1 III_B感染H9細胞を、細胞毒性試験培地（Cedar
lane Lab.社）にて二度洗浄し、２μg/mlのモノクロー
ナル抗体NM−01または対照IgG_2bを含んだ細胞毒性試験
培地に再懸濁した。４℃で、２時間、インキュベーショ
ンした後、試料は等分され、ウサギ補体あるいは熱不活
化ウサギ血清（Cedarlane Lab.社）を、1:6に希釈して
添加した。細胞を、４℃で、20分間、そして、37℃で、
45分間、インキュベーションし、培地で洗浄し、50％FB
S/RPMI 1640に再懸濁し、そして震盪した。上清あるい
はウィルス分離株は、10倍希釈し、その25μｌをH9細胞
（1x10⁵/25μｌ）に添加する前に、引き続き２回希釈し
た。37℃で、３時間、インキュベーションした後、露出
した細胞は、10％FBS/RPMI 1640で希釈され、そして37
℃に維持した。ウィルス感染は、６日後に逆転写酵素分
析法により決定された。H9細胞画分の50％組織培養感染
用量（TCID₅₀）を、50％感染を示した希釈度によって決
定した。その実験の結果を表５に示した。

モノクローナル抗体NM−01のみでも、HIV_IIIBの感染
を中和することができるが、モノクローナル抗体NM−01
と補体による治療では、HIV_IIIBの感染は10倍以下にま
で低下した。ヒト補体（ヒト血清態様の）がモノクロー
ナル抗体NM−01と共に投与された時に、同様の効果が認
められた。これら知見は、モノクローナル抗体NM−01と
補体双方にHIV−１を曝すことは、顕著なウィルス感染
の低下と関連し、さらにHIV−１治療におけるモノクロ
ーナル抗体NM−01による補体依存性ウィルス溶解への役
割を支持するものである。本明細書に参照として組み込
んだ、Nakamura et al.,AIDS RESEARCH AND HUMAN RETR
OVIRUSES，９（７）,pp.619−626（1993）も参照のこ
と。

実施例９モノクローナル抗体NM−01のＨ鎖とＬ鎖の可変領域
を、ハイブリドーマHB 10726細胞質RNAから調製したcDN
Aを鋳型として用いたPCRによってクローニングし、DNA
配列を決定した。可変領域DNAsそれぞれを、M13mp18/mp
19（Pharmacia社、ミルトンキイーンズ、英国）に挿
入して、配列決定を行った。NM−01 H鎖とＬ鎖可変領域
のDNAおよび推定アミノ酸配列を、配列番号:15および1
6、ならびに配列番号:17および18にそれぞれ示した。配
列番号:15のヌクレオチド１−21ならびに334−363は、N
M−01 L鎖配列を増幅するためのPCRプライマーと対応
し、配列番号:17のヌクレオチド１−27ならびに385−40
2は、NM−01 H鎖配列を増幅するためのPCRプライマーと
対応する。

モノクローナル抗体NM−01の可変領域の再度の配列決
定の結果を、それぞれ、Ｈ鎖可変領域のDNAと推定アミ
ノ酸配列およびＬ鎖可変領域のDNAと推定アミノ酸配列
である、配列番号:19および20、ならびに配列番号:21お
よび22に示した。NM−01 L鎖可変領域（VK）アミノ酸配
列を、Kabatマウス・カッパ・サブグループIIIに最も相
同的になるように決定し、NM−01 H鎖可変領域（VH）ア
ミノ酸配列を、KabatマウスＨ鎖サブグループIAの一つ
になるように決定した。

NM−01のＨ鎖（配列番号:20）とＬ鎖（配列番号:22）
可変領域の最初の120個のアミノ酸配列は、図14および1
5にもそれぞれ示し、図中、囲いをしたアミノ酸は、抗
体の結合特異性を決定する抗体の相補性決定領域（CDR
s）である。図14および15に示したCDRsは、Kabat et a
l.,Sequences of Proteins of Immunological Interes
t，第５版、米国保健社会福祉省、米国政府印刷局（199
1）のCDR規定法に適合するように、先の国際出願No.PCT
/US92/07111に明記したCDRsから移動させている。図14
および15において、Ｈ鎖もしくはＬ鎖の各アミノ酸配列
は、前出のLiou et al.,にて報告されたモノクローナル
抗体BAT123の対応する可変領域のＨ鎖およびＬ鎖のアミ
ノ酸配列（配列番号:23および24）と、そして、ECACCか
ら入手したモノクローナル抗体F58/H3およびP4/D10の対
応する可変領域のＨ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列（配列
番号:25および26）と比較した。モノクローナル抗体F58
/H3およびP4/D10の可変領域アミノ酸配列は、同一であ
ることが認められた。

NM−01のＨ鎖可変領域は、BAT123のそれとは、全120
個のアミノ酸の内、44個のアミノ酸において相違してい
る。両抗体のＬ鎖可変領域は、24個のアミノ酸において
相違している。重要なことは、NM−01分子のＨ鎖（Ｖ−
Ｈ）における三つのCDRsが、BAT123のそれと、41から90
％相違しており、一方で、Ｌ鎖（Ｖ−Ｌ）における三つ
のCDRsの配列が、NM−01と比較して約29から47％異なっ
ていることである。

NM−01のＨ鎖可変領域は、F58/H3およびP4/D10のそれ
とは、全120個のアミノ酸の内、103個のアミノ酸におい
て相違し、Ｌ鎖可変領域は、３個のアミノ酸において相
違している。NM−01分子のＨ鎖（Ｖ−Ｈ）における三つ
のCDRsが、F58/H3およびP4/D10のそれと、約86から100
％相違しており、一方で、Ｌ鎖（Ｖ−Ｌ）における三つ
のCDRsの配列が、約13から19％異なっている。

このように、NM−01の一次構造解析と、BAT123、F58/
H3およびP4/D10の一次構造解析の比較から、NM−01の新
規の抗体であることが確認された。

実施例10 配列番号:19および21に記載されたDNA配列情報を基
に、NM−01抗体のヒト型化／新形態化体を調製した。NM
−01のキメラ体を作製するために、Orlandi et al.,Pro
c.Natl．Acad.Sci.USA,86,pp.3833−3837（1989）の方
法を採用した。ヒト型化体は、Tempest et al.,BIO/TEC
HNOLOGY,9,pp.266−271（1991）およびRiechmann et a
l.,Nature,322,pp.323−327（1988）のCDR移植法と同様
の方法によって調製した。

A.キメラ抗体の作製 NM−01可変領域は、マウス可変領域とヒト定常領域を
有するキメラ抗体の作製を許容するよう、二段階を経
て、哺乳類発現ベクターへクローニングされた。まず初
めに、完全に配列決定されたVHもしくはVKを、可変領域
遺伝子の５′および３′末端に特異的なプライマーを用
い、そして、得られた断片のベクターM13VHPCR1もしく
はM13VKPCR1（前出のOrlandi et al.,）への移行を許容
できるように制限部位を導入した実施例９に記載のNM−
01 M13mp18/mp19クローンから増幅した。これにより、
可変領域は、定常領域遺伝子へ正しい位置関係で接合す
るように、プロモーターおよびシグナル・ペプチド遺伝
子の後ろに置かれる。第二段階にて、プロモーター、シ
グナル・ペプチド、および可変領域をコードする配列を
含むM13挿入体が、RF DNAから切り出され、そして、ヒ
トIgG1（ベクターpSV−gpt）あるいはカッパ（ベクター
pSV−hyg）定常領域遺伝子それぞれを適切に含んだ哺乳
類発現ベクターへクローニングされた。

キメラNM−01 L鎖およびＨ鎖をコードするプラスミド
は、YB2/0ラット骨髄細胞（ATCC CRL 1662）へ共形質変
換され、次いで、Ｈ鎖発現ベクターに認められるキサン
チン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（gp
t）の存在に関して選抜した。上清は、ヒトIgGの存在に
関してスクリーニングされ、そして細胞が分泌した抗体
を得た。このキメラ抗体を、NM−01 MuVH/MuVKと命名し
た。

B.ヒト型化抗体の作製 CDR移植は、ヒト可変領域鋳型の特定部位の突然変異
誘発によって行った。NM−01 CDRsのCDR移植のために選
択されたヒト可変領域は、NEWH VH［Saul et al.,J.Bio
l.Chem.，253,pp.585−597（1978）］およびREI VK［Ep
p et al.,Eur.J.Biochem.，45,pp.513−524（1974）］
であった。

マウスCDRsに加えて、図16の27〜30位にある最初のCD
Rに先駆けた４つのマウス・アミノ酸残基および図16の7
3位（Kabatの71位）にあるマウス・アルギニンを、ヒト
型化NM−01 VH（HuVHと称する）に含めた。最初のCDRに
先駆けた４つの残基は、超可変的ではないが、Chothia
et al.,J.Mol.Biol.,196,pp.901−917（1987）による超
可変ループ配座への影響が認められた。Kabatの71位に
ある残基は、CDRs1および２の間を包み込み、そして、C
DR 2の配座の決定において重要であることが認められて
いる［Tramontano et al.,J.Mol.Biol.,215,pp.175−18
2（1990）］。

CDR移植体（HuVK）、および図17の75位でのマウス・
フェニルアラニンを有する変位CDR移植体（HuVKF）を含
めた、NM−01 HuVKの二つの変異体が作製された。この
位置でのアミノ酸の側鎖は、CDR 1の配座に影響を与え
（前出のChothia et al.,）、マウス残基の包含が、他
のヒト型化抗体への結合能力に明確に影響を与えること
が認められている。例えば、Foote et al.,J.Mol.Bio
l.,224,pp.487−499（1992）を参照のこと。

NM−01 HuVH、HuVKおよびHuVKFのDNAおよび推定アミ
ノ酸配列を、配列番号:27および28、29および30、そし
て31および32にそれぞれ示した。NM−01ヒト型化可変領
域を、下記したヒトＨ鎖あるいはＬ鎖可変領域遺伝子を
含んだM13ファージから作製した。

ヒトＨ鎖あるいはＬ鎖可変領域遺伝子を含んだM13フ
ァージを、チミンに代えてウラシルを含んだ一本鎖鋳型
DNAを得るように、E.coli RZ1032（dut^-ung^-）にて生長
させた。0.5μｇの鋳型DNAを、挿入したDNAのM13鋳型の
下流にアニールする1pmolのオリゴヌクレオチドを混合
した。マウス残基をコードする変異用オリゴヌクレオチ
ドを、40mM Tris−HCl pH7.5、20mM MgCl₂、50mM NaCl
の20μｌにて、80℃で、５分間加熱し、そして、室温に
までゆっくりと冷却することで、鋳型にアニールした。

最初のＨ鎖可変領域PCR反応のために用いた変異用オ
リゴヌクレオチドは：であって、前記オリゴヌクレオチドは、アミノ酸VSGFSI
TSSSYCWHWVRQ（配列番号:28のアミノ酸24〜41および図1
6の配列HuVH）をコードするDNAの逆補体であって、下線
を付したアミノ酸は鋳型可変領域配列へ導入したマウス
残基である；であって、前記オリゴヌクレオチドは、アミノ酸LEW
（I/Ｍ）GRICYEGSIDYSPSIKSRVTM（配列番号:28のアミノ
酸47〜71および図16の配列HuVH）をコードするDNAの逆
補体であって、下線を付したアミノ酸は鋳型可変領域配
列へ導入したマウス残基である；およびであって、前記オリゴヌクレオチドは、アミノ酸VYYC
（Ａ/S）ＲENHGTTTSMDYＷ（配列番号:28のアミノ酸94〜
111および図16の配列HuVH）をコードするDNAの逆補体で
あって、下線を付したアミノ酸は鋳型可変領域配列へ導
入したマウス残基である。

Ｌ鎖可変領域突然変異のために用いたヒト鋳型は、RE
Iとは同一ではないが関連性がある枠組領域を実際にコ
ードしており、また、（開示していないオリゴヌクレオ
チドを用いた）突然変異反応はこれら矛盾点ならびにNM
−01 CDRsを解消した。ここで特に検討されるべき唯一
の矛盾点は、REI配列には存在しないフェニルアラニン
残基をコードする鋳型の71位である。この残基は、NM−
01 HuVKF（図17のHuVKFの75位のアミノ酸を参照のこ
と）に保持されているものの、下記する配列を有するオ
リゴヌクレオチドREI Y71を用いたNM−01 HuVF（図17の
HuVFの75位のアミノ酸を参照のこと）におけるREI残基
では変化していた。

であって、前記オリゴヌクレオチドは、アミノ酸GDT
YTFT（配列番号:32のアミノ酸72〜78および図17の配列H
uVK）をコードするDNAの逆補体である。このプライマー
は、NM−01 HuVKFを生成する変異反応には含まれていな
かった。

HuVKおよびHuVKF L鎖可変領域双方のために、マウスN
M−01 CDR 1および鋳型CDR 1は同一であったので、CDR
1の改変は不要であった。マウスと鋳型CDRs2および３の
間には限られた相違しかないため、鋳型CDRs2および３
の間には限られた相違しかないため、鋳型CDRs2および
３の改変が必要とされ、使用した変異用オリゴヌクレオ
チドは：であって、前記オリゴヌクレオチドは、アミノ酸LLIY
V ASN（配列番号:30のアミノ酸50〜57および図17の配列
HuVK）をコードするDNAの逆補体であって、下線を付し
たアミノ酸は鋳型可変領域配列へ導入したマウス残基で
ある；およびであって、前記オリゴヌクレオチドは、アミノ酸YCQQ
N NEDPL TF（配列番号:30のアミノ酸91〜102および図17
の配列HuVK）をコードするDNAの逆補体であって、下線
を付したアミノ酸は鋳型可変領域配列へ導入したマウス
残基である。

NM−01 HuVHを生成するために、VHオリゴCDR1、CDR
2、およびCDR3を、ヒトNEWH鋳型にアニールした。NM−0
1 HuVKを生成するために、VKオリゴREI Y71、VKオリゴC
DR2、およびVKオリゴCDR3を、ヒトNEWH鋳型DNAにアニー
ルした。NM−01 HuVKFを生成するために、VKオリゴCDR
2、およびVKオリゴCDR3をアニールした。そして、同じ
緩衝液中にて、dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを最終濃度
が250μＭとなるように、DTTが7mM、ATPが1mMとなるよ
うに添加し、そして、0.5単位T7 DNAポリメラーゼ（Uni
ted States Biochemical社、クリーブランド、オハイオ
州）および0.5単位T7 DNAリガーゼ（Life Technologies
社、ペイスレイ、英国）を添加した。30μｌの反応液
を、室温にて、１時間インキュベートし、そして、DNA
をエタノールで沈殿させた。親の鋳型鎖にニックを入れ
るために、DNAを60mM Tris−HCl pH8.0、1mM EDTA、1mM
DTT、１単位のウラシルDNAグリコシラーゼ（Boehringe
r Mannheim社、ルイス、サセクッス州、英国）を含む0.
1mg/ml BSAからなる50μｌに溶解し、そして、NaOHが0.
2Mとなるように添加される以前に、37℃で、１時間イン
キュベートし、室温にて、５分間、インキュベーション
を継続した。断片化した起源のDNAを除去するために、
再度、エタノールを沈殿させた。変異DNAは、20μl TE
中に溶解し、正および逆のM13プライマーを用いたPCRに
よって可変領域挿入体を増幅した。PCR反応混合物は、
２μｌ変異DNA、0.5μＭの各プライマー、250μＭのdAT
P、dCTP、dGTPおよびdTTPの各々、10mM Tris−HCl pH8.
3、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、0.01％Tween−20、0.01％
ゼラチン、0.01％NP40、および50μｌ中に２単位のサー
マラーゼ（IBI社、ケンブリッジ、英国）を含んでい
た。増幅は、94℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で１分
間からなるサイクルを15回行い、72℃で５分間置くこと
で反応を終了した。生成DNAsを、Hind III−BamH I断片
であるM13mp19へクローニングし、典型的なクローンの
配列決定を行った。Ｈ鎖に関して、最初に、マウスCDRs
1および３を有する部分的変異のみを取得した。マウスC
DR 2の変異体を得るために、鋳型としての部分的に変異
させたDNAとVHオリゴCDR2を用いて上記した反応を反復
した。得られたDNAsを、Hind III−BamH I断片である。
M13mp19へクローニングし、典型的なクローンの配列決
定を行った。

真正のNM−01 HuVH、HuVKおよびHuVKFをコードするHi
nd III−BamH I断片を、ヒトIgG₁（ベクターpSV−gpt）
あるいはカッパ（ベクターpSV−hyg）定常領域遺伝子を
適切にコードする配列の発現ベクター上流にそれぞれク
ローニングした。得られたベクターは、完全なヒト型化
NM−01抗体（ECACC 93082022として寄託したYB2/0細胞
系が産成したHuVH/HuVK:ECACC 93082019として寄託した
YB2/0細胞系が産成したHuVH/HuVKF）を産生する細胞系
を生成するために、YB2/0あるいはNSO細胞（ECACC 8511
0503）へ共電気泳動、あるいは、鎖の一つがキメラであ
る（例えば、MuVH/MuVKF）混合−適合型抗体を産生する
細胞系を生成するために、上記した適切なNM−01 H鎖お
よびＬ鎖をコードするベクターと共に個々に電気泳動に
適用した。抗体は、プロテインＡアガロース・アフィニ
ティー・クロマトグラフィーによって精製した。

ヒト型化NM−01抗体の４つの他の態様が、上記した方
法によって生成された。最初の（ECACC 93082020 YB2/0
細胞系が産生した）HuVHM/HuVKおよび二番目の（ECACC
93082021 YB2/0細胞系が産生した）HuVHS/HuVKFは、HuV
Hの48位にメチオニンを含んでいた。三番目の（ECACC 9
3082023 YB2/0細胞系が産生した）HuVHS/HuVKおよび四
番目の（ECACC 93082018 YB2/0細胞系が産生した）HuVH
S/HuVKFは、HuVHの93位にセリンを含んでいた。これら
ヒト型化抗体は、保有しているＬ鎖に依存して、NM−01
HuVH/HuVK抗体あるいはNM−01 HuVH/HuVKF抗体の抗原
結合特性と同様の抗原結合特性を有している。NM−01 H
uVH/HuVK抗体ならびにNM−01 HuVH/HuVKF抗体の抗原結
合特性を、以下に記した。

C.キメラおよびヒト型化抗体の活性ヒト型化NM−01のgp120への結合性を、マウスNM−01
の結合性との比較に関して、拮抗分析法で評価した。プ
レートを、組換えgp129（American Biotechnologies
社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）（5ng/ウェ
ル）で被覆し、そして、５％正常ヤギ血清（Life Techn
ologies社）でブロックした。ヒト型化NM−01抗体、キ
メラNM−01抗体、マウスNM−01抗体、あるいはヒト型化
抗体の負の対照の希釈液（10〜1000ng/100μｌ）を各ウ
ェルに添加し、そして、プレートを、37℃で、30分間イ
ンキュベートした。ビオチン化マウスNM−01抗体（ウェ
ル当たり500ng/50μl PBS）を添加し、インキュベーシ
ョンを一時間継続した。プレートをPBS−0.05％Tween20
で洗浄した。HRPO−ストレプトアビジン（ウェル当たり
500ng/50μl PBS:Sera−Lab社、クローリーダウン、サ
セックス州、英国）を添加し、30分間インキュベートし
た。プレートを洗浄し、そして、ｏ−フェニルジアミン
の存在下で５分間、あるいは発色するまでインキュベー
トした。吸光度は、492nmで計測した。

ヒト型化NM−01抗体HuVH/HuVKは、標識付けしたマウ
スNM−01抗体の結合阻害において、マウスNM−01抗体と
同様の効果／反応性を示したが、ヒト型化NM−01抗体Hu
VH/HuVKFは、マウス抗体の約４倍の反応性が認められ
た。キメラNM−01抗体の反応性は、マウスNM−01抗体よ
りも小さかった。

キメラおよびヒト型化NM−01抗体は、RT、p24、およ
びシンシチウム阻害分析法によって、HIV−１中和活性
に関しても評価した。実質的に先の実施例で述べた方法
と同様である、これら分析法は以下のようにして行っ
た。

RT分析法では、15％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培
地に、抗体を連続的に希釈した。抗体の希釈液を、MNあ
るいはIII_Bウィルスの100倍の組織培養50％感染量（TCI
D₅₀）で、96ウェル・プレートにて、４℃で、２時間イ
ンキュベートした。H9細胞（2.5×10⁵細胞）を各ウェル
に添加し、そして、37℃で、さらに１時間インキュベー
トした。H9細胞懸濁液を、2mlのRPMI 1640培地/15％ウ
シ胎児血清に希釈し、そして、24プレートにて37℃でイ
ンキュベートした。ウィルス生成を、７日目に、RT分析
によって決定した。この分析の結果を、図18（MN）およ
び19（III_B）に示した。

p24分析法では、MNあるいはIII_Bウィルス（100×TCID
₅₀）とモノクローナル抗体と共に、H9細胞を６〜８日間
インキュベートした。組織培養上清でのp24抗原の存在
を、製造業者（Du Pont−NEN）の使用説明書に記載の方
法に従って、HIV−1 p24コア断片の酵素結合免疫吸収分
析（ELISA）によって定量した。具体的には、抗原−抗
体複合体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）
接合体でプローブした。最終生成物を、捕獲したHIV−1
p24抗原の量に直接比例している黄色の強度によって定
量した。マイクロプレートELISA計測器を用いて、発色
の程度を450nmにて計測し、その結果を、モノクローナ
ル抗体2990.7を負の対照とした図20（MN）および21（II
I_B）に示した。

最後に、シンシチウム分析法では、MNウィルスで慢性
的に感染したH9細胞を、モノクローナル抗体NM−01の希
釈液で、37℃にて、１時間インキュベートした。指標細
胞系C8166からの細胞を添加し（３×10⁴細胞／ウェ
ル）、プレートを、37℃にて、２〜12時間さらにインキ
ュベートした。白血球細胞直径の３倍以上の大きさのシ
ンシチウムの数を計測し、抗体の欠如に関して、対照感
染H9細胞と比較した。その結果を、モノクローナル抗体
2990.7を負の対照とした図22に示した。

三つの分析結果は、ヒト型化NM−01抗体HuVH/HuVKF
が、HIV−１のMNおよびIII_B単離株の中和において、マ
ウスNM−01モノクローナル抗体と等価あるいはそれ以上
の中和効果を呈することを実証するものである。

本願発明は、好適な実施例に関して記述してきたが、
修正や変更が当業者によってなされるものと考えられ
る。それ故、請求した発明の範疇と等価の発明をすべて
包含する添付した請求の範囲を希求する次第である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/06 - 15/08 C12P 21/08 C12N 5/12 - 5/28 C07K 16/10 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号:1に示したアミノ酸配列を必須的
に含むHIV−1gp120またはgp160のアミノ酸配列に特異的
に結合する能力、および逆転写酵素、p24、MT−２およ
びシンシチウム形成分析において、活性HIV−１株MNお
よびIIIBによるH9細胞の感染をin vitroにて中和する能
力を有するモノクローナル抗体であって、前記モノクロ
ーナル抗体が、A.T.C.C.受託番号HB 10726が付与された
ハイブリドーマ細胞系が産生したモノクローナル抗体NM
01の全ての相補的決定領域のアミノ酸の配列を含むヒト
抗体可変領域を必須的に含む、ことを特徴とするモノク
ローナル抗体。
【請求項２】請求項１に記載のモノクローナル抗体をコ
ードするポリヌクレオチド。
【請求項３】前記モノクローナル抗体の発現を許容する
方法で、請求項２に記載のポリヌクレオチドで安定裏に
形質転換した宿主細胞。
【請求項４】モノクローナル抗体を製造する方法であっ
て、以下の工程、すなわち；（ａ）請求項３に記載の宿主細胞を適切な培地で成長さ
せ、および、（ｂ）前記宿主細胞あるいはその成長培地からモノクロ
ーナル抗体を単離する工程を含み、および前記モノクローナル抗体が、配列番号:1に示したアミノ
酸配列を必須的に含むHIV−1 gp120またはgp160のアミ
ノ酸配列に特異的に結合する能力、および逆転写酵素、
p24、MT−２およびシンシチウム形成分析において、活
性HIV−１株MNおよびIIIBによるH9細胞の感染をin vitr
oにて中和する能力を有し、かつA.T.C.C.受託番号HB 10
726が付与されたハイブリドーマ細胞系が産生したモノ
クローナル抗体NM01の全ての相補的決定領域のアミノ酸
の配列を含むヒト抗体可変領域を必須的に含むモノクロ
ーナル抗体である、ことを特徴とするモノクローナル抗体を製造する方法。