【発明の詳細な説明】
rHIV免疫療法j
背 景
本発明は、一般には、ヒト免疫不全ウィルス(IIIV−1)感染症の予防なら
びに治療に有効な物質および方法に関する。 より具体的には、本発明は、HI
V−1感受性あるいはIIIV−1感染動物、特にヒト、の受動免疫に有用なモ
ノクローナル抗体に関する。
旧V−1は、T−細胞、単球/マクロファージおよびCD4受容体を発現する神
経細胞なとの様々な細胞系に感染する。 体内でのCD4+細胞の大部分は「休
眠状態」あるいは静止状態にあり、特定のシグナルにのみ反応して分裂するので
、IIIV−1による感染は、CD4+細胞か転写の過程では不活性ウィルスを
含むという結果をもたらす。 能動免疫を含む、感染動物の免疫系の刺激は、免
疫系のポリクローナルな活性化、および休眠CD4+細胞の細胞周期の8期への
移行の信号という結果に表れるであろう。 増殖中の細胞は、ウィルス粒子を活
発に産生じ、感染の拡散を誘発する。HIV−1感染動物の免疫系の刺激による
この好ましくない効果を考慮すれば、HIV−1感染の予防あるいは治療の最も
有効な方法は、感受性あるいは感染動物に抗+11V−1抗体を投与するという
、受動免疫にあるといえる。
Jackson eL al、、 Lancet、 2. pp、647−65
2 (1988)は、後天性免疫不全症候群(AIDS、旧V−1感染により進
行性の免疫系欠陥の症候群)を患ったヒト患者へ、血漿の形態で抗+11V−1
抗体を一回投与すると、一時的に、症状の軽減、Tリンパ球の一過性の増加、日
和見感染の頻度減少、および患者の血漿あるいはリンパ球から培養できるIII
V−1の割合の減少という結果か見られに曝ス以前の動物、チンパンジーへのI
IIV−1に特異的に反応する抗体の投与をした結果、ウィルス感染の発症を防
止するとの結果を報告している。 これら研究は、旧V−1中和能力を有する抗
体が、IIIV−1感染の予防/治療において有用であることを示唆するもので
ある。
HIV−1の主要な外被タンパク質であるgl1120は、細胞性CD4受容体
に結合し、ウィルスの細胞内への侵入を促進する。 糖タンパク質のいくつかの
エピトープは、中和抗体の作製と関連付けられてきている。 llo et a
l、、 5cience、 230. pp、 1021−1023 (1!’
)88) ハ、gpt2o (7) 7 ミ/ 酸254−275ハ、IIIV
−1ノ三ツの異なる単離法を含むグループ特異的中和の能力を有するポリクロー
ナル抗血清を導くことを報告している。 Ilaigwood etアミノ酸の
一次構造からは構成されていないエピトープである、立体構造依存性エピトープ
は、ウィルスの種々の株を中和する抗体を誘導しうることを報告している。旧V
−] gp120のいわゆる「主要中和決定基J (PND)は、gp120の
ry、ループJに集中Sci、USA、85. l1lp、4478−4482
(1988);Pa1ker et at、、Proc。
Na11. Acad、 Sci、 USA、 85. Ilp、1932−1
936 (1988); tlolleyet al、、 Proc、 Nat
l、 Acad、 Sci、 USA、 85. pp、6800−6804(
1991)を参照のこと。 ■3ループは、領域両側面に位置するシスティン残
基間のジスルフィド結合により作られた超可変領域からなる。 タトえば、HI
V−1btN(7)Vs小ループ、gp120 ノ302と336の位置の間に
あるシスティン残基間のジスルフィド結合により形成されている。
種々のIIIV−1単離物からのV、ループの一連のアミノ酸残基を含む組換え
および合成タンパク質断片が、単離あるいは種特異性中和抗体をマウスから得ら
れることを、La5ky eL al、。
5cience、 233. pp、 209−212 (1986); Pa
1ker et al、、 5upra;MaLsushita et al、
+ J、 Virol、 62. pp、 2107−2114 (1988)
;およびJavaherian eL at、、 Proc、 Natl、 A
cad、 Sci、 USA、 86゜pp、 6768−6772 (198
9)で報告されている。 さらに最近の研究[Putney et al、、
5upra およびLaRosa et at、、 5cience。
2=49. pp、 932−935 (1990)コテハ、V、/l/−プ(
7) /39− ン構造が、分離株特異性抗体によって部位認識されることか実
証されている。 5cott et al、、 Proc、 Na11. Ac
ad、 Sci、 USA、 87. pp。
8597−8601 (1990)は、PNDも、ヒトにおいて種特異性抗体を
誘導できることを報告している。 PNDの超可変性は、エピトープにより生成
された種特異性中和活性を説明するものであろう。
いくつかの研究か、組み換えgp120に対して調製された抗体、精製gp12
0あるいはV3領域からの合成ペプチI・が、種々の旧V−1分離株を中和する
ことを示唆している。 Javaherian eL at、。
5cience、 250. pp、1590−1593 (1990)、およ
びWeisst et al、。
Nature、 324. pp、 572−575 (1986)それぞれは
、単離MN株のPNDおよび単離llIn株から誘導された組み換えgp120
それぞれにツ1応するペプチドで免疫処置されたウサギからのポリクローナル血
清による、MNおよび単離II+、株双方の中和を記している。
Haynes et alの米国特許第5.019.387号も参照のこと。
Akerblom et al、、 AIDS、 4. flip、 953−
960 (1990)には、 III。
および11個の主要旧V−1単離株を中和するモノクローナル抗体調製物か記載
されている。 1991年8月8日に発行されたWahren et al、、
のPCT出願公開公報No、 WO91/11198も参照のこと。 しかしな
がら、Akerblomの主要単離株の分離株相同性は決定されておらず、11
個の単離株は、III B類似と思われる。
Durda et al、、 AIDS Res、 llum、 Retrov
、、 G、 pp、 1115−1123(1990)には、MN−および11
18−双方に感染した細胞にょるンンシチウム形成を阻害するか、逆転写酵素活
性と相関する結果を得ることか知られている分析法であるrLAV捕獲免疫測定
法」によって検定した結果、MNウィルスの感染を中和しないことを報告してい
る。 1990年12月13日公開の5cotL eL al、、のPCT出願
公開公報No、 Wo 90/15078には、MN株のPNDあるいはrMN
様」単離ウィルス株を発現するワクチニャ・ウィルスで感染した細胞によるンン
シチウム形成を阻害するモノクローナル抗体か記されている。 標準的な逆転写
酵素、p24もしくはMT−2分析法による、活性HV−1の複数の株を中和す
る、「広範に中和する」抗体の存在は全く実証されていない。 1988年12
月1日、1990年11月1日、および1991年7月11日にそれぞれ発行さ
れたタノソクス バイオンステムズ社のPCT出願公開公報No。
WO88109181、WO90/12868 、およびWO91109625
; 1991年12月26日に発行されたニューヨーク大学のPCT出願公開公
報No。
WO91/’19797 、さらにLiou et al、、J、1mmuno
1.、 143 (12)。
pp、3967−3975 (1989) も参照のこと。
前述文献では、現在まで開発された旧V−I PNDとの反応性を有するモノク
ローナル抗体か、様々なグループ反応性を示すことを示唆しておるものの、広範
な中和活性を有しているとは思われない。 これら研究によって示された分離株
およびグループ特異的反応性の異なるパターンは、アミノ酸配列およびgl)1
20のループ領域の立体構造に関連するものと思われる。
いくつかの研究により、CD4受容体のみか、ウィルス感染に原因する細胞性受
容体を意味するものでないことを示唆している。 これらの研究結果は、CD4
+細胞への感染を阻害する前述した抗体の患者への投与では、生体のIIIV−
1感染に対してはCD4+細胞に限定された防御のみを提供する可能性を示して
いる□Cheng−Mayer et al、、Proc、 NaLl、 Ac
ad、 Sci、USA、 84゜pp、 3526−3530 (1988)
は、神経膠細胞CD4分子以外の受容体を含む神経膠細胞の旧V−1感染を報告
している。 さらに、Takeda eL al、、5cience、 242
. pt)、 580−583 (1988)は、抗体/’l1lV−1複合体
か、受容体媒介エンドサイト−シスによって単球を感染でき、またウィルス増殖
を向上させることを示している。 同様の抗体依存性の感染増大か、1Ials
Led eL at。。
過去の研究の結果、特定の動物ウィルスは、補体、特にC1qによって、抗体非
依存型機構を通して不活化されることを示している。 Weiss et al
、、 Eds、、 Co1d Spring Harbour Labora−
画か、l+1V−1の力価や、あるいは末梢血液中の単核細胞に感染する能力に
対しては何等の効果も持たない旨か記載されているものの、5pear et
al、、 J、 Virol、、 64(12)、 pp、 58(i9−58
73(1990)は、補体と旧V−1血清陽性患者から集められた血清の組み合
わせによって処理したIIIV−1の感染力が低減したことを報告している。
つまり、当該技術分野においては、IIIV−1に対して特異的な免疫学的反応
性を有する(例えば、ネズミ由来抗体、ヒト型化抗体、および免疫学的に活11
1な抗体の断片を含む)新規のモノクローナル抗体の開発か必要とされているの
である。 理想的には、かような抗体は、適切なIIIV−1感染宿主細胞とな
る培養細胞(例えば、+19細胞)を用いての標準的な逆転写酵素、p24、M
T−2、およびンンシチウム形成分析法により決定された、複数のIIIV−1
株(例えば、1118およびMN)の効果的な中和能力を有することで特徴付け
られる。 感染あるいは非感染患者の受動免疫での予測された用途を鑑みれば、
かような、モノクローナル抗体は、IIIV−1粒子の補体依存性(すなわち、
介在性)ウィルス感染ならびに111■刊感染紬胞の抗体依存性細胞溶解に有効
に関与する能力を有することか望ましい。
簡単な概要
本発明は、配列番号、1に示したアミノ酸配列、グリシンープロリンーグリシン
ーアルギニン(G−P−G−R)、を含む旧v−i gp120もしくはgr]
1(ioタンパク質部分と特異的に反応し、さらに標準的な逆転写酵素、p2
4、MT−2、およびシンシチウム形成分析法により決定された、活性+11V
−1株MNおよび111Bによる培養液中の119細胞の感染を中和する能力に
より特徴付けられるモノクローナル抗体を産生ずる。 本発明の生成物は、HI
V−1粒子の補体依存性ウィルス溶解および/またはIIIV−1感染細胞の抗
体依存性細胞溶解を誘導する能力によりさらに特徴付けられる。
本発明のモノクローナル抗体は、体液(例えば、血液)中の111V−1の存在
を決定するための診断方法および/またはキットに使用できる。 本発明のモノ
クローナル抗体は、好ましくはIgG抗体であり、殊にIIIV−1感受性もし
くはIIIV−1感染した動物、特にヒトの抗+11V−1治療の目的での使用
に好適である。
免疫学的有効な量のモノクローナル抗体の投与により、HIV−1感染患者もし
くはIIILI感染の危険がある患者に、I(IV−1ウイルス感染に対する受
動免疫を高める効果を有すること、さらには、好ましくは、IIIV−1粒子の
補体依存性ウィルス溶解および/または患者の旧V−1感染細胞の抗体依存性細
胞溶解に効果を高めうることか望ましい。
キメラ体あるいは(CDR−移植した抗体を含む)「ヒト型化」抗体、抗体断片
、および、特に、特許請求したモノクローナル抗体を基にした二価抗体は、本発
明の範−にあるものであり、同様に、原核生物もしくは真咳生物細胞中に生成さ
れた組み換え抗体関連生成物も含むものである。 例えば、FabおよびF(a
b” )2断片のような抗体断片は、本発明の抗体の可変領域に関する構造(配
列)情報が決定され次第、大腸菌、酵母、昆虫および哺乳類細胞なとの宿主細胞
を使用して培養基中で生成可能である。 可変領域に関する配列情報もまた、C
DR−移植した抗体の調製を可能にする。 さらに、キメラ抗体(例えば、マウ
ス/ヒト抗体)は、形質転換したマウスミエローマ細胞あるいはハイブリトーマ
細胞を用いて調製でき、また、二価抗体もハイブリット・ハイブリドーマ細胞に
よって生成される。 特に言回しているのは、配列番号:Iに示した配列を必須
的に含む旧V−1gp120もしくはgp160のアミノ酸の配列に特異的に結
合する能力、および逆転写酵素、p24、MT−2、ならびにシンシチウム形成
分析法での活性HIV−1株MNおよび1118による、+10細胞の感染のi
n vivoでの中和能力によって特徴付けられた抗体の少なくとも一つの相補
的決定領域のアミノ酸の配列を含むヒト抗体可変領域から必須的に構成される抗
体である。 このような抗体をコードするDNA配列、当該抗体を産生ずる宿主
細胞、および当該抗体を産生ずるための組換え方法も意図されている。
本発明の範嗜には、抗HIV−1治療における、本発明の生成物と他の免疫学的
薬剤および/または化学治療薬の組み合わせの使用も含む。 混合投与に適した
薬剤としては、補体、旧V−1タンパクの様々な中和および非中和領域に結合す
る抗体、およびAZTのような化学薬剤を含む。
下記の詳細な説明において述べるように、本発明のモノクローナル抗体は、gp
t2oか本来の立体構造を持つように、活性+11V−1による適当な宿主の免
疫処置によって得られる。
本発明で特に説明を行っているのは、12301パークローンドライブ、ロック
ビル、メリーランドに所在のAmeriCan TypeCulture Co
11ectionに寄託のために、1991年4月9日に受領され、A、 T、
C,C,受託No、 HB 10726か付与されたハイブリト−マ細胞系1
1810726によって産生された(NM−01と称する)マウ7−モノクロー
ナル抗体1円化S Centre for AppliedMicrobiol
ogy & Re5earch 、ボーテン ダウン、ソールズヘリー、英国S
P40JGに所在のEuropean Co11ection of Anim
alCell Cu1tures (ECACC)に寄託のために、1993年
8月20日に受領され、それぞれECACC受託No、 93082022.9
3082019.93082020.93082023.93082018およ
び93082021か付与されたノ\イブリトーマ細胞系によって産生されたN
MOI IIuVII/1luVK 。
NMOI HuVH/HuVFK、NMOI HuVHM/HuVK、NMOI
HuVtlS/1(uVK。
NMOI HuVt(S/HuVFKおよびNMOI HuVHM/HuVFK
と称するNMOlのヒト型化抗体である。
本発明の各種の態様と利点が、下記の詳細な説明での本発明の実施例および実例
の記述、図面に関する説明を考慮すれば明らかになろう。 すなわち、図1は、
本発明のモノクローナル抗体および抗体陽性AIDS患者からの免疫血清を使用
した免疫プロット法により、非感染H9細胞、旧■−1MNおよびIIIV−1
11rnウイルスのタンパク質のオートラジオダラムをまとめたものである。
図2には、本発明の抗体と種々の異なる)IIV−1株のv3ループ領域に対応
するペプチドとの免疫反応性試験の結果をグラフで示している。 図3は、本発
明の抗体およびgrl120に対する他の二つの抗−旧■抗体の、v3ループ領
域に対応するペプチドへの結合に関する効果を示す棒グラフである。 図4Aか
ら4C。
5.6Aから(3B、 7Aから7818および9Aから9Bには、本発明のモ
ノクローナル抗体の生存旧V−1株によるH9細胞の感染中和に関する能力を、
逆転写酵素、p24、MT−2、およびシンシチウム形成分析法のそれぞれて解
析した結果をグラフで示している。
図10は、本発明の抗体でのウィルス感染の中和能に対するペプチド阻害の決定
のための分析法の結果をグラフで示している。
図11AからIIB 、 12Aから12F1および13Aから13Fは、本発
明のモノクローナル抗体と補体との組み合わせで処理されたHIV−1粒子の電
子顕微鏡写真である。 図14および15には、本発明のモノクローナル抗体、
NM−01のL鎖およびI−(鎖それぞれの可変領域のアミノ酸配列、ならびに
三つの異なる抗111V−1モノクローナル抗体のL鎖およびI]鎖のアミノ酸
配列を記している。 図16および17は、マウス・モノクローナル抗体NM−
01の1、鎖およびH鎖それぞれの可変領域のアミノ酸配列と、IIuVtt/
It u V K Fと称する本発明のヒト型化NM−01抗体のL鎖および1
1鎖のアミノ酸配列を相対的に配置しである。 図18.19.20.21およ
び22は、逆転写酵素、p24、MT−2、ならびにシンシチウム形成分析法そ
れぞれによる、本発明のキメラおよびヒト型化抗体の生物学的活性のスクリーニ
ングの結果をグラフで示したものである。
実施例
下記の実施例は、ハイブリドーマ細胞11810726の作製、配列番号:1の
アミノ酸配列G−P−G−Rを含むペプチドならびにHIV−1gp120(も
しくは、ソノ前駆体であルgp160)+、:免疫学的な反応性を有するモノク
ローナル抗体の該細胞からの単離、および該モノクローナル抗体の特性に関する
本発明の実例を示すものである。
より詳細には、実施例1は、ハイブリドーマ細胞HB 10726の産生ならび
に該細胞からのモノクローナル抗体NM−01の単離に関するものである。 実
施例2は、抗体NM−01によって認識されるウィルスエピトープの解明に関す
る。 実施例3には、各種のIIIV−1分離株とモノクローナル抗体との反応
特性か記されている。 実施例4は、逆転写酵素およびp24分析法によって実
証された、様々な活性旧V−1株によるH9細胞の感染を中和する能力について
の抗体NM−01の反応特性に関する。 実施例5は、MT−2およびシンノチ
ウム形成分析法によってさらに実証された、活性+11V−1分離株の感染を中
和する能力についての、抗体のスクリーニングに関する。 実施例6は、モノク
ローナル抗体NM−01の1ilV−1感染中和持性のペプチド阻害に関する。
実施例7ては、モノクローナル抗体NM−01のIIIV−]の補体依存性溶解
を活性化する能力に関する解析がなされている。 実施例8は、モノクローナル
抗体NM−Ofと培養基中での感受性細胞の旧V−1感染に関する補体とを組み
合わせることによる効果の決定に関する。 実施例9には、モノクローナル抗体
NM−01のH鎖およびL鎖可変領域のDNAおよび推定アミノ酸配列が記載さ
れている。 実施例10は、モノクローナル抗体NM−01のキメラおよびヒト
型化体の調製、およびその免疫学的ならびに生物学的活性のための分析に関する
。
実施例1
ハイブリトーマ細胞系11B 10726は、01とHerzenberg。
5elected Methods Ce1l 1mmunology、 pp
、351−372 (1979)およびGodding、 J、1mmuno1
. Meth、、 39. pp、285−308 (1980)なとに記され
たような標準的な免疫学的技法を用いて産生されたものであり、その詳細を以下
に説明する。
A 活性旧V−LNの精製
300m1の旧V”’lvs感染)19細胞培養液を回収し1500rpmで5
分間、4°Cにて遠心分離し、細胞をペレット状にした。 ウィルスを含んだ上
清を分取して保存する一方で、沈澱物は210Orpmで20分間、再度遠心分
離した。 二回目に得られた上清番ま回収して、先に得られた上清と合わせ、こ
の合わせた上清をSW 270−ターを用いて、25000rpmて90分間、
4℃にて超遠心分離し、ウィルス粒子をペレット状にした。 残った上清液は、
廃棄した。 ウィルスペレットは、約]、OmlのTNE緩衝液(100mM
NaCl、10mM Tris−tlcl、 pH7,7、1mM EDTA)
に再懸濁した。 超速Jc1用遠沈管には、下層に10m1の50%シヨ糖TN
E、中層に10m1の25%ンヨ糖TNE、そして上層に10m1のウィルス試
料を含むよ引こし、そして25000rpmて90分間、4℃にて超速JcI分
離した。 ウィルスは、シヨ糖TNE層間に白帯状に沈澱し、バストウールピペ
ットで回収した。 ウィルスに、20m1 TNE/15 mM EDTA (
100mM NaC1,10mM Tris−t(CI、pH7,7,15mM
EDTA)を添加し、ウィルス試料を25000rpmで90分間、4°Cに
て再度遠心分離した。
得られたベレットには、精製された活性++1V−IMNが含まれていtこ。
I3 免疫処置およびハイブリト−マ調製100μgの活性111V−IMNを
、腹腔的注射による3匹の2ヶ月齢Ba1b/cマウスそれぞれを免疫処置する
ために使用した。 各マウスは3遇間後に30μgのウィルスを注射され、さら
に3週間後に1100uのウィルス調製物を注射された。 2回目の注射を終え
て3日後にマウスを犠牲にし、膵臓細胞をP3−X63−Ag8−[1細胞(A
、 T、 C,C,寄託番号CRL 1597)と融合すルコとにより、ハイブ
リドーマ細胞系を調製した。 ハイブリドーマ細胞系は、慢性的に感染したH9
細胞(10匹)、急性的に感染した+19細胞(9匹)、および感染したH9細
胞膜(3匹)で免疫処置したマウスの膵臓からも調製された。 慢性的に感染し
た+19細胞とは、感染後2〜3週間後に逆転写酵素分析法(RT)で100.
000cpm〜150、000cpmの計測値を示す細胞を指し、一方で急性的
に感染した1(9細胞とは、感染後10−12日後にRTて200,000cp
m 〜250、000cpmの計測値を示す細胞を指す。
ハイブリト−マ細胞は、下記の方法によって調製される。
免疫処置したマウスからの膵臓細胞を集めて、800gで5分間、遠心した。
細胞のベレットから上清を吸引し、細胞IO8個当たり1mlの温かい(37°
C)50%PEG−1500をペレソ]・に1分間にわたって添加した(0.2
5m1を添加し、ピペットの先端で15秒間ゆっくりと攪拌し、この操作を繰り
返す)。 この混合物を、さらに数分間にわたって、細胞を壊さないように、同
じピペットの先端で攪拌した。 1mlの[不完全培地J (25mM IIE
P[!S(Sigma Co、)、10,000 U/mlのベニンジン、およ
び10.000mg/mlのストレプトマイシンを捕ったRPMI 1640
(JRII [1iosciences):1を1分間にわたって同様の方法(
15秒毎に、0.25m1ずつ)で添加し、さらに1mlを同し時間にわたって
添加した。 次に、7mlの不完全培地を2〜3分間にわたって(20秒毎に、
1mlずつ)撹拌し、細かい細胞の懸濁液とした。 最終懸濁液を、臨床用遠心
機にて、500gで5分間遠心し、上清を除去した。 沈澱物を、「完全培地」
〔15%ウシ胎児血清(FBS)を補った上記[不完全培地j]中で(攪拌機ま
たはピペットで溶液を吸い上げたり吸い出したりするのではなく)試験管をゆっ
くり反転させることにより、培地1ml当たり細胞が2×1o11個の濃度にな
るまで懸濁する。 次に、96ウエルプレートのlウェル当たりに、この懸濁液
の0.]ml(総細胞数2 X 10’個)を分注した。 プレート板を、37
°C,7%CO2の条件下でインキュベートした。
融合の日を08目とした。
C,HAT選択およびハイブリトーマの最初のスクリーニング融合して24時間
後(18目) 、0.1ml t(AT培地< 10−’Mヒポキサンチン、5
X 10−7Mアミノプテリン、および1.6x 10−’Mチミジン)を各
ウェルに添加した。 2.3.5.8.11.14.17および211回目、各
ウェルから0.1mlの培地を除去し、新鮮な0.1ml IIAT培地と交換
した。 2〜5日目にあっては、ウェルには死んた細胞しか含まれて居ないよう
に見えた。 5〜10日目の間に、ハイブリドーマが出現し始めた。 ハイブリ
ドーマ細胞は、細胞片の中にあって、非常に届先性の細胞のコロニーとして視覚
的に容易に認識できた。
D ハイブリトーマ・スクリーニング
ハイブリト−マ上清のスクリーニングのために、様々な分析法か利用されている
。 IIIV−1との反応性を有する抗体を分泌するハイブリト−マは当初、ハ
イブリドーマ培養物上清を用いたELISAによる、非感染およびMN−感染1
19細胞から調製されたスクリーニング用の膜によって同定されていた。 この
当初のスクリーニングは、ELISAのデータに生存感染細胞への抗体の結合に
関するデータを加味した、蛍光抗体法および放射線免疫検定法に引き継がれた。
ELISA用の細胞膜を、感染あるいは非感染+19細胞から調製した。 細胞
は、1 mM EDTAを含んだ、pH7,4の、250mMシヨ糖/ l0m
M Tris−IICI緩衝液に懸濁した。 懸濁液は、水浴中に置いたDou
nceのホモノエナイサーで、トリパンブルー排除試験にて生存細胞か確認され
なくなるまで、均質化した。 混合物は、50 gにて、2分間、遠心分離した
。 得られたペレツトを、再度均質化および遠心分離した。 二つの上清を合わ
せ、20.000 gにて、20分間、遠心分離した。 ペレソ]・を同じ緩衝
液中で再度均質化し、20分間遠心分離し、そして得られたベレットを7mlの
元の250mMシヨ糖−EDTA緩衝液中で再懸濁した。
この溶液を、l mM EDTAを含んた、2Mンヨ糖/l0mM Tris−
t+cl緩衝液上に重層し、80,000 gにて、1時間、遠心分離した。
その結果得られた不明確な白い界面を回収し、250mMショ糖緩衝液中で再!
l#濁した。 タンパク含量をBCA分析法(Piece Che−mical
Company)で決定した。 懸濁液を等分に分割して、−70°Cて保存
した。
ELISA法のために、400ng/ウェルの濃度の細胞膜を96穴ウエルプレ
ートに添加し、25°Cて、−晩乾燥した。 プレートを0゜506 Trit
on−X(登録商標)/′燐酸緩衝液生理食塩水(PBS)で洗浄し、596ウ
シ胎児血清(FBS)/PBSてブロックし、再度洗浄した。
ハイブリト−マ上清(40μm)を、50μlのPI]Sて希釈し、ウェルに添
加して、4℃で、−晩反応させた。 洗浄後、セイヨウワサヒペルオキシダーゼ
(tlRP) (Zymed)で標識したウサギ抗マウスIgG(ll+L)を
、ウェルに添加し、25℃で、2時間反応した。
ウェルを0.5% Triton−X(登録商標)/PBSで洗浄し、吸光度を
405および650nmて測定する前に、ABTS(Bio−Rad基質キット
)の存在下で、20分間インキュへ一トシた。
ELISAにおいて非感染細胞膜および感染細胞膜双方に陽性としてスクリーニ
ングされた、慢性的に感染した細胞および急性的に感染した細胞で免疫処置され
たマウスの膵臓細胞から生したハイブリトーマの上清は、ハイブリドーマから産
生された抗体か旧V−1特異性でなかったことを示した。 感染細胞膜で免疫処
置したマウスの膵臓細胞から生した1039個のハイブリドーマの内、5個のハ
イブリドーマの上清か、感染細胞膜と強く反応し、非感染細胞膜とはかすかにし
か反応しなかった。 これらハイブリドーマ細胞系からの上清に関してウェスタ
ーンプロット法を実施したところ、産生された三つのモノクローナル抗体の内の
一つか旧V−1pssに結合し、他の一つか旧V−1p55とp24に結合し、
さらに最後の一つかウェスターンプロットにて・\ントを生じないことか判明し
た(データ示さず)。 ELISAの結果を、非感染細胞と感染細胞から得られ
た数値の比率として表1に記した。
1187個のハイブリドーマか、活性量■−IMN株で免疫処置したマウスの膵
臓細胞から生した。 さらにスクリーニングを実施するために、4つの上清中の
抗体が、感染細胞膜と強く反応し、非感染細胞膜とはかずかにしか反応しなかっ
たというELISAの結果を基にして、4つのハイブリドーマ細胞系を選択した
。
4つのハイブリドーマの上清を限界希釈クローニングの試料とし、放射性免疫検
定法(RIA)によってスクリーニングした。
”1(Rol:M IgG−”l)でラベルしたウサギ抗マウスIgGを、5e
phadex G−50カラム(NEN−Dupont)にて精製した。 非感
染!19細胞、あ6 イハHIV−IMN株で感染したH9細胞(150μ+中
ニア、5×105個の細胞)を15m1容量のチューブに入れた。 各バイブ1
月・−マからの50μlの上清を非感染細胞および感染細胞が入っているチュー
ブに加え、混合物を、4℃で、−晩インキュベートした。 細胞を、2mI P
BS150%Tween−20(登録商標)で2度洗浄し、洗浄と洗浄の間に、
攪拌を行った。 PBS/ 5%FBS中ノ50u l (7) R−M Ig
G−五2J (750,000cpm)を加え、混合物を4°Cて、再度−晩イ
ンキユベートした。 インキュベーション後、細胞をPBS150%Tween
−20(登録商標)で3度洗浄した。 細胞を殺菌するために、100ulのP
BS/ 5%Triton−X(登録商標)を加え、シンチレーション容器に標
識物質の移動を助けるために、 100μlの1M水酸化ナトリウムを加えた。
試料は計測され、RIAの結果を下記表1に非感染細胞のcpm値に対する感染
細胞のcpm値との間の比率として示した。
リーニングした。 2mlの非感染H9細胞もしくはHIV−2感染H9細胞(
約lX10°個/ml)を、10ml容量の無菌遠沈管に、lomlのPBS(
Ca”+もしくはMg←含まず)と共に入れた。 細胞をlomlのPBSて遠
沈管を満たし、攪拌し、1100rpで5分間遠心し、約100μIの「乳状の
」細胞懸濁液以外を吸引することにより、一度洗浄した。 層流状態にある間、
51mmの10ウエル・スライド(Cell Line As5ociatio
n)を、細胞懸濁液で各ウェルを溢れさせ、ピペットの先端で溢れた懸濁液を吸
い上げることにより、懸濁液で覆った。 懸濁液で覆われたスライドを風乾し、
常温下で、10分間、メタノール中に固定した。 4つのハイブリドーマのそれ
ぞれからの上清を、非感染細胞および感染細胞のスライド試料の反応性に関して
、非希釈および1:50の濃度(0,02%スキム・ミルクに希釈した上清)に
て試験した。 15μlの非希釈あるいは希釈した上清をスライドの各ウェルに
添加した。
スライドを37℃で、30分間インキュベートし、5分間攪拌しなからPBS中
に浸した。 スライドを迅速に蒸留水ですすぎ、層流風乾した。 0.02%ス
キム・ミルク中で1:80に希釈した、16μIのヤギ抗マウスIgG (H+
L) F (ab) 2断片(Cappel Biomedical)を各ウェ
ルに添加した。 スライドを再度37℃で、30分間インキュベートL、PBS
中に浸した。 スライドをPBS中の0.01%エバンスブルー溶液で5秒間す
すぎ、蒸留水で2度すすいだ。
スライドを蛍光抗体法によって試験し、スクリーニングの結果を表2に示し、表
2において、マウスIgG (MIgG)、5C5抗体(杭用11. )および
(感染細胞膜によって免疫処置されたマウスの膵臓から生したハイブリドーマか
らの)Grp、5上清は、対照抗体である。
表2
ハイブリドーマ細胞系HB 1.0726は、RIAおよび蛍光抗体法のデータ
からして抗体を産生ずる見込みか最もあるとして選択された。 この細胞系は、
ELISAにおいては最も高い結合率を示さなかったか、ELISAか乾燥細胞
膜への結合性を示すのに対し、RIAと蛍光抗体法の結果か生存感染細胞への結
合性を示すことがらRIAのデータか最も重要である。 この細胞系は2回サブ
クローニングされ、この細胞か産生じたモノクローナル抗体をNM−引と命名し
た。 マウスの腹腔にこの細胞を標準手段によって注射し、モノクローナル抗体
NM−01を腹水からプロティン、へアフィニティーカラム精製(Pierce
)によって濃縮した。
抗体NM−01のアイソタイプは、型特異的血清(Bio−Rad)によってI
gGzbと決定された。 この抗体(1,8mg/ml)は、15%FBSてR
PMI 1640培地に希釈され、以下の実施例にて使用された。
実施例2
モノクローナル抗体NM−01によって認識されるウィルスエピトープを特定す
るために、最初にこの抗体を、精製されたMNおよびl1lBウィルス粒子の蛋
白との反応性に関するウェスターンプロット分析法を試み、次に、HIV−1g
p120のv3ループ領域のアミノ酸配列に対応する重複しているペプチドとの
反応性に関するELISA法によりスクリーニングを行った。
A ウェスターンプロット分析
感染1(9細胞の培養上清から精製されたMNおよびIIIBウィルス粒子を、
1.3%SDS/ 3%β−メルカプトエタノール中で可溶化し、0.1%S
O3/10%ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動の試料とした。 ニトロセ
ルロース紙へタンパク質を移シた後、細片をブロッキング緩衝液(0,02M
Tris−IIcI、 pH7,4,0,1M塩化ナトリウム、0.05%標準
ヤギ血清および5%脱脂乾燥乳)中で、4℃で、モノクローナル抗体NM−01
と共に一晩インキュベートし、ptl 7.4ノ0.02M Tris−HCI
、O,1M塩化ナトリウム、および0.3%Tween (登録商標)で洗浄し
た。 細片は、次に、ビオチン化ヤギ抗マウ7+gG(Zymed)と共に1時
間インキュへ−トし、洗浄し、 125I−ストレプトアビジン(Amersb
am、 ArlinArlln lleights、 IL)てさらに1時間、
4°Cで、反応させた。 モノクローナル抗体NM−Ofの反応性は、オートラ
ジオグラフィーによって観察した。
オートラジオグラフィーの結果を図1に示し、図1において、レーンlと3は非
感染H9細胞を含んだゲル、レーン4はHIV−1財感染H9細胞を含み、レー
ン2と5は旧V−1Msウィルスを含み、およびレーン6と7はHIV−1,z
+aウィルスを含む。 抗体NM−01はレーンl、2および6のタンパクと反
応し、HIV−1血清陽性患者の血清はレーン3〜5および7のタンパクと反応
した。
モノクローナル抗体NM−Olは、見がけの分子量約120kDを有するMNな
らびにII+、ウィルス蛋白との反応性を示したが、その他のいかなるウィルス
抗原のバンドとも反応せず、この抗体かgp120のエピトープを認識すること
を示唆した。
比較のために、Wahren et al、、のPCT公開公報No、 91/
11198に記載されたモノクローナル抗体F58/)13およびP4/DIO
を、(受託No、 90011607および90011608それぞれを’)
ECACCから入手し、モノクローナル抗体NM−01でのウェスターン・ブロ
ソI−法に沿って、組換え1111/’IMNgp120 (Agmed社、ベ
ッドフォード、マサチューセソツ州)、組換えtllV−1+ l Ill [
1120(DuPont−NEN、ボストン、マサチューセッツ州)、天然11
1VIMNgp120、オヨび天然111V−1+++a gp120へ(7)
結合性ニ関して試験を行った。 ウェスターン・プロット分析は、ウサギ抗マウ
ス二次抗体を抗体の結合を検出するための比色分析に用いた以外は、上述した手
順と同様にして行った。 モノクローナル抗体NM−01は、天然のMNおよび
l1ltl gp120と共に、MNおよびIIIB由来の組換えgp120双
方と反応した。 しかしながら、モノクローナル抗体F58/+13およびP4
1010は、天然+11V(lI IB gll120オヨびIIIV−] +
ua由来の組換えgl1120 トしか抗体NM−01により認識されるgp1
20の特異的エピトープを同定するために、抗体をgp120のv3ループ領域
に対応する重複しているペプチ)・との反応性に関してELISAによってスク
リーニングした。 Multiple Peptide Systems、 S
an Diego、 CA ニよッテ合成シタベフチ(・ハ、IIIV−IMN
gp120)7 ミ/酸302−316.312−326および322−33
6に対応していた。
3つのペプチド (ウェル当たり、250ng/ 50μI O,IMホウ酸緩
衝液、pH8,0)を2枚の1mmulonプレー1− (Dynatech)
にて、37°Cて、−晩インキュベートした。 プレートをPBSで洗浄し、P
BSlo、 1%TWeen(登録商標)/′O,]%ウソ血清アルブミン(B
SA)で、室温で、1時間かけてブロックした。 ブロッキング剤を除去し、
100μI HAT培地中で希釈した異なる量の抗体NM−01またはマウスI
gG (MIgG)をプレートに添加した。 抗体を、室温で、2時間、反応さ
せた。 プレートを水道水で10回洗浄した。
1:1000に希釈したIIRP接合ウサギ抗マウス第二抗体を、PBSlo、
05%Tween(登録商標)10.5%ll5Aに入れ、ウェル毎にその10
0μmを添加した。 プレートを室温で、1時間インキュベートし、そして水道
水で10回洗浄した。 ABTS基質(Bio−Rad)を添加し、20分間後
に、650nmでプレートの吸光度測定を行った。
配列番号 2〜4にはペプチドのアミノ酸配列が示されており、表3には抗体M
1gGとIIAT培地を陰性対照とした重複したペプチドを用いた分析法の結果
を示した。
YTTKNIIGTIRQAHCO,0420,0290,0300,0280
,030■3ループのアミノ酸302−31.6もしくは322−336に対応
するペプチドとモノクローナル抗体NM−01との検出されつる反応性は認めら
れなかったか、アミノ酸312−326のペプチドへのこの抗体の結合は明らか
である。 対照抗体のマウスIgGはペプチドと結合しなかった。
実施例3
111Vi MN gp120(7)V3ループ領域ニモ)’)0−1−/l、
抗体NM−01か結合するという証明は、他のIIIV−1分離株との反応性の
程度に関する研究をさらに促進した。 IIIV−1分離株ms 、RF。
CDC4、NY15、Z6、Z2およびELI ノV3/l、−プ領域に相当す
るペプチドとの反応性に関してELISA法によって抗体をスクリーニングした
。 ペプチドのアミノ酸配列を下記表4、および配列番号、5〜12にそれぞれ
示した。
入−1
単 離 物 ペプチドアミノ酸配列
ペプチド(250ng10. IMホウ酸緩衝液、pus、o、America
n Bio−technologies、 Canbridge、 MAにより
合成)を2枚のImmulonプレート (Dynatech)にて、48Cで
、−晩インキュへ一トシた。
プレートをPBSて洗浄し、O1%TWeen(登録商標)10.1%BSA/
PBSて、25°Cて、2時間ブロッキングし、そしてモノクローナル抗体N1
1l−01と共に、37℃で、1時間インキュベートした。
水道水で洗浄後、プレートをHRP−標識ウサギ抗マウス二次抗体で、25°C
て、1時間、次に、ABTS基質(Bio−Rad)で、20分間インキュベー
トした。 反応性を、650〜.405nmの吸光度測定により決定した。 分
析結果を図2に示した。
モノクローナル抗体NM−01は、MN (黒塗口)、 l1la (白抜内)
、RF(白抜三角)およびCDC4(黒塗三角)単離物からのループペプチドと
反応した。 Ill、 、 RFおよびCDC4ペプチドへの抗体の結合は、M
Nペプチドとの結合と同等であった。 またモノクローナル抗体NM−01は、
NY15ペプチド(星印)とは小さな反応性しか示さなかった。 モノクローナ
ル抗体NM−01は、配列番号:13に示したRF様ペプチドにも反応するもの
と推定される。 これに対して、Z6 (黒塗四角)、Z2(白抜逆三角)およ
びELI(白抜四角)単離物からのループペプチドとは、はとんと反応しなかっ
た。 これら結果は、モノクローナル抗体NM−Ofか、特に、配列番号、lに
示したアミノ酸配列G−P−G−Rを有する複数の旧■−1単離物のgp 12
0のv3ループのエピトープを認識することを示すものである。
モノクローナル抗体F58/H3およびP41010も、MN、l1lB。
RF様、CDC4、NY15、Z2、Z6オヨびELI (7)VQ小ループペ
プチドへ反応性を試験した。 NM−01とは対照的に、モノクローナル抗体F
58/)13およびP4/1310双方は、Ill、ペプチドとしか反応せず、
配列番号、14に記載のRF様ペプチドとはわずかにしか反応しなかった。
MN様および111B様■3ループペプチドと反応し、RF様ペプチドとは反応
しない、他の抗−HIV−1gp120モノクローナル抗体、モノクローナル抗
体BAT123が、MIffOLiou et at、、に記載されている(前
出のいou et at、、の第3972頁の図5Aを参照)。
これら報告されている反応性は、先のパラグラフにて記載したモノクローナル抗
体NM−01の反応性とは異なる。 抗体NM−01とBATI23の双方共に
、 lll5ペプチドには比較的良く結合するか、NM−01と同様のMNペプ
チドへの結合を得るためには、BAT]、23は約50倍高い濃度が必要とされ
る。 さらに、NM−01は表4および配列番号ニアに示したRFペプチドなら
びに配列番号:14に示したRF様ペプチドと反応するが、BAT123は、た
とえ抗体濃度を10.000μg/mlにしても、RF様ペプチドには結合しな
い。
拮抗分析において、モノクローナル抗体NM−01、F58/+13およびP4
1010の結合を、(配列番号ニアの一部カつ重複している111Bループペプ
チド IRIQRGPG (ペプチドl )、RIQRGPGR(ペプチド2
)、IQRGPGRA (ペプチド3 ) 、QRGPGRAF (ペプチド4
) 、RGPGRAFV (ペプチド5)およびGPGRAFVT (ペプチ
ド6)の各々か存在している条件下で測定した。 この分析法は、以下のように
して行った。 100μlの組換えl1la gp120 (PBS中の0.5
μg/mりを、 Immuno 4プレート (Dynatech社)に被覆し
、−晩、室温にてインキュベートした。 そして、このプレートを250μlの
ブロック用緩衝液(PBS中の5%正常ウサギ血清)で、37℃にて、1時間ブ
ロックした。 モノクローナル抗体NM−01、P58/H3およびP4/DI
Oを、ブロック用緩衝液で10μg/m lまで希釈し、そして6つのIII、
ループペプチドそれぞれを、ブロック用緩衝液でlOOμg/mlまで希釈した
。 5μg/mlの最終抗体濃度および50μg/mlのペプチド濃度となるよ
うに、1.1体積比で、それぞれの抗体を各ペプチドと個別に混合した。 抗体
とペプチドの混合物を、室温にて、40分間インキュベートし、そして、分析用
のブロック処理され、gl)120被覆したプレートのウェル(100μm/ウ
ェル)に移した。 対照のウェルには、ペプチドは置かずに、5μg/mlの抗
体のみを置いた。
これらプレートを、37℃で、40分間インキュベートし、そして、洗浄用緩衝
液(PBS中の0.005%Tween−20)で4回洗浄した。
ウサギ抗マウス/HRP結合した抗体(100μm/ウェル)を、ブロック用緩
衝液にてl : 1000希釈した二次抗体として用い、そして、37℃で、1
時間インキュベートした。 プレートを再度洗浄し、100μm/ウェルTMB
(テトラメチルヘンシジン)を用いて処理した。 100μl/ウエル硫酸(0
,36N)で反応を停止してから、プレートを450μm〜650nmにて計測
した。
拮抗分析の結果を、図3に示した。 この分析では、ペプチド4か、モノクロー
ナル抗体NM−01の組換えlll5 gl)120への結合の最も強力な阻害
物であり、ペプチド3および4が、モノクローナル抗体F58/)+3結合の最
も強力な阻害物であり、そして、ペプチド2が、モノクローナル抗体P4/DI
O結合の最も強力な阻害物であった。
実施例4
逆転写酵素法によって測定した活性旧V−1株MNSIII 、ならびにRF、
およびp24分析法によって測定した活性旧V−1株MNならびにIII Bに
よるH9細胞の感染を中和する能力に関して、モノクローナル抗体NM−01を
試験した。
逆転写酵素およびp24分析
モノクローナル抗体NM−01の希釈液を、96ウエルプレートにて、40TC
IDs。のMN生存ウィルスおよび100TCID5゜の[I[B活性ウィルス
と共に、37℃で、1時間半インキュベートした。
HIVJ r目Bのgl) 120に結合するモノクローナル抗体0.5β(A
IDSResearch and Reference Reagent Pr
ogram Catalog、 NationalInstitute ofA
llergy and Infectious Diseases)を、逆転写
酵素法において、陽性および陰性対照の双方に用いた。 H9細胞(2,5XI
O’個)を各ウェルに添加し、プレートをさらに1時間、:37°Cで、インキ
ュベートした。 H9細胞懸濁液をRPMI 1640/15?−FBSで希釈
し、24ウエルプレートにて、37℃で、インキュベートした。 ウィルス生成
に関して、7日目に、Po1esz、 et行った(Dupont HIV−1
p24 Core Profile ELISA)。 分析結果を図4Aから4
Bおよび図5にそれぞれ示した。
モノクローナル抗体NM−01(図4Aの黒塗口)は、10−100μg/ml
の濃度で、逆転写酵素法によって測定したところ、活性MNウィルスの感染を完
全に中和した。 さらに、1μg/m1未満の濃度での抗体の使用では、ウィル
ス感染阻害率は50%であった(lDso)。 これらの知見は、感染中和効果
が認められなかったモノクローナル抗体0.5β(図4への白抜内)の結果とは
対照的である。 モノクローナル抗体NM−01(図4B)は、約0.1μg/
m1の濃度において感染阻害率50%(ID5o)で、 l1ls生存ウイルス
を中和した。 モノクローナル抗体0.5βは、モノクローナル抗体NM−01
よりやや効果的に111mウィルスを中和した(図4B)。 同様の結果が、旧
V−I MNおよびlll5に関するp24分析法において得られた。 図5参
照。 逆転写酵素分析において、モノクローナル抗体NM−01は、約0.05
u g/mlのID5oで、活性RFウィルスも阻害した(図4C)。
これらのデータは、モノクローナル抗体NM−01か、HIV−1の少なくとも
三つの異種菌株による感染を中和することを示している。
モノクローナル抗体F58/H3およびP4/DIOの活性tllV−1株MN
およびIIIBによるH9細胞の感染を中和する能力も、上述したモノクローナ
ル抗体NM−01の場合と同様、逆転写酵素分析およびp24分析によって測定
した。 分析の結果を、図6八から6B、および7Aから7Bに示した。 RT
分析にて、モノクローナル抗体NM−01か、10〜100μg/’mlの濃度
にて活性MNウィルスの感染力を完全に中和することか再度認められ、1μg7
’m1未満の濃度の抗体の使用か、ウィルス感染の50%阻害(+05.) (
図6への白抜内を参照)を示した。 これら知見は、モノクローナル抗体F58
/)13およびP41010にて、検出可能な中和が認められなかったことと対
照的である(図6Aの白抜および黒塗三角を参照)。
活性IIIBウィルスを用いたRT分析において、モノクローナル抗体NM−0
1は、約0.1μg/m lのID50にてウィルスを中和した(図6Bの白抜
内を参照)。 モノクローナル抗体F58/H3およびP4/DIOは、それぞ
れ約1.1および1.2u g/mlのlc5.で、モノクローナル抗体NM−
01よりも低効率でl1laを中和した(図6B参照)。 同様の結果か、p2
4分析ニテニアIIV−I MNおよびlll5を用いた三つのモノクローナル
抗体について得られた(図7Aおよび7B参照)。
実施例5
逆転写酵素法およびp24分析法により実証された生存器V−1感染の中相に関
して、生存MNおよびIIIBウィルスを用いたMT−2法、および生存MN、
III、およびRFウィルスを用いたシンシチウム形成分析法において、さら
にモノクローナル抗体NM−01の効果を研究した。
A、 MT−2分析法
MT−2分析法は、Richman、 AIDS Re5earch and
ReferenceReagent Program、 Courier No
、90−01. pp、6−9 (1990)の記載に若干の修正を加えた方法
にて行った。 活性MNウィルスおよび活性1118ウイルスは、モノクローナ
ル抗体NM−01の希釈液と共に、96ウエルプレートにて、4°Cで、1時間
半インキュベートした。 MT−2細胞(8X 10’)をウェルに添加し、プ
レートを37°Cて、3日間インキュベートした。 各細胞の生死を観るために
、Mosmann、 J、Immuno1. Meth、、 65. pp、5
5−63 (1983)ならびにPaulwels、 et al、、 J、
Virol、Meth、、 22. pp、309−321(1988)の記載
に従ったMTT色素還元を行った。 MT−2分析法の結果は、逆転写酵素法な
らびにp24分析法の結果を確認するものであり、その結果を図8に示し、 l
ll5 (1,007CIDs。)の阻害率を白抜用で、およびMN (407
CIDso)の阻害率を黒塗用で示した。
モノクローナル抗体NM−01は、活性MN単離物および活性111B分離株の
感染をそれぞれ2.0μg/mlおよび0.1μg/mlのID5゜in 1i
lV−I Re5earch、 5tockton Press、 New Y
ork、 NY、 pp、 92−97 (1990)に記載された方法の修正
法によって行った。 すなわち、MNウィルスもしくはIll、ウィルスのいず
れかによって慢性的に感染させたH9細胞を、モノクローナル抗体NM−Ofの
希釈液と共に、37℃で、1時間インキュベートした。 次にC816G細胞を
各ウェルに添加し、37°Cて、2時間インキュベー1− した。
三つのリンパ球細胞の直径より大きなシンシチウムを計測し、抗体欠乏下で処理
した対照感染119細胞において得られたシンシチウムと比較した。 シンシチ
ウム形成分析法の結果は、逆転写酵素法およびp24分析法の結果を確認するも
のであり、その結果を図9八に示し、 Ill、 (100TCIDso)の阻
害率を白抜用で、MN (407CID、。)の阻害率を黒塗用で示した。 モ
ノクローナル抗体NM−01は、MN感染H9細胞によるシンシチウム形成を2
μg/m1(7)iD、。て、さらにIll、感染H9細胞によるシンシチウム
形成を3μg/m IのID、。で阻害した。
モノクローナル抗体BAT123の対応するシンシチウム形成阻害の結果が、W
O38109181の表■に示されている。 25μgのモノクローナル抗体N
M−01か、MN感染細胞によるシンシチウム形成の約85%を阻害するのに対
し、BAT123の25μgか、51%を阻害することか報告されており、さら
に、25μgのモノクローナル抗体NM−01か、 Ill、感染細胞によるン
ンシチウム形成の約85%を阻害するのに対し、BAT123が、77.8%を
阻害することが報告されている。 25μgのBAT123は、RF感染細胞に
よるシンシチウム形成を51%阻害することも報告されている。 モノクローナ
ル抗体NM−01も、RP感染細胞によるシンシチウム形成を阻害する(図9B
参照)。 先のパラグラフにて記した分析にて、25μgのNM−01か、RF
感染細胞によるシンシチウム形成の約59%を阻害した。 モノクローナル抗体
NM−01は、RF感染細胞によるシンシチウム形成を、4μg/mlのID、
。にて阻害する。
以上をまとめると、実施例4および5の逆転写酵素、p24、MT−2およびシ
ンシチウム形成阻害分析法の結果は、モノクローナル抗体NM−01か、10μ
g/m1以下の濃度にあっては、複数のHIV−1株の結合と感染性を中和する
ことを示すものである。
実施例6
モノクローナル抗体NM−01が、gp 120 V3ループの部位に結合する
ことによって、旧V−I MNおよびIll、の感染を阻止することを確認する
ために、v3ループペプチドが、この抗体による感染中和能力を無効にする試験
に供した。
モノクローナル抗体NM−01を、100 TCID5Gの活性111Bウイル
スを添加する前に、MN、Ill、および26株のV3ループに対応するペプチ
ド(これらペプチドの配列を上記表4に示した)の濃度を変化させなから、37
℃で、30分間インキュベートした。
119細胞を添加し、1時間後に、実施例4にて記したように、完全培地にて7
日間、細胞を生育させた後、逆転写酵素活性を測定した。 分析結果を図1Oに
示した。
モノクローナル抗体NM−Ofは、最も低いペプチド濃度の場合には、 l1l
a感染を完全に中和したが、この中和能は、抗体とループ・ペプチドとの前イン
キュベーションの際に、MN (黒塗用)ならびにIIIB(白抜用)ループ・
ペプチドの濃度を累進的に増加させると、累進的に抑制された。 モノクローナ
ル抗体NM−01によって認識されるアミノ酸の配列を持たない26株(黒塗菱
形)の■3ループに対応するペプチドの同様の濃度においては、検出可能な効果
は見られなかった。 これら結果は、モノクローナル抗体NM−01かgp12
0 V3領域の特定部分と反応することにより、IIIV−1の感染を妨げてい
ることを示唆していモノクローナル抗体NM−01か、補体経路を活性化でき、
さらに、HIV−1ウィルス粒子を破壊できるか否かを決定するための研究をさ
らに行った。 この場合、ウサギ血清を、補体源としHIV−I IIIB株で
感染したH9細胞を、細胞毒性試験培地(Cedar−1ane Lab 社)
にて洗浄した。 細胞を、40μg/m Iのモノクローナル抗体を含有してい
る細胞毒性試験培地と抗体を含まぬ培地のいずれかに再懸濁した。 4℃で、2
時間、インキュベーションした後、ウサギ補体(IOW−LOX−MA; Ce
darlane Lab、社)を、1.6に希釈して添加した。 細胞懸濁液を
、4°Cで、20分間、そして、37°Cて、45分間、インキュベーションし
た。 細胞を、2%グルタルアルデヒド10.1M燐酸緩衝液ならひに1%四酸
化オスミウム10.1M燐酸緩衝液で二重に固定した。 エポキシ樹脂に包埋し
た後、薄層部分を切断し、酢酸ウラニルおよび酢酸鉛で二重染色した。 図11
Aから118 、+2Aから12F、および13Aから13Fは、この薄層部分
の電子顕微鏡写真である。
ウサギ血清のみ(図11B)およびモノクローナル抗体NM−01のみては、H
IV−1の組織に関して検出可能な効果は認められなかった。 HIV−1をモ
ノクローナル抗体NM−01と補体とで処理することにより、エンベロープが粉
砕された無数のウィルス粒子の出現および電子密度の高いコア一部分(図11A
)の欠損が観察された。 典型的な実験例では、その大部分が内部コアの欠損を
抱えている約90%の溶解したウィルス粒子を示していた。
ピリオンの残りの10%は、無傷あるいは外皮エンベロープが部分的に粉砕され
たものである。 高倍率にすると、図12Aから12Fおよび13Aから1.3
Fそれぞれの成熟あるいは不完全ウィルス粒子の溶解の一連の顕微鏡写真に見ら
れる。 このようにHIV−1の直接溶解によって生した崩壊が認められる。
実施例8
次に、モノクローナル抗体NM−01と補体との組み合わせを、その旧v−1感
染に関する効果について決定するために分析した。
組織培養感染用量の決定
HIV(lll5感染H9細胞を、細胞毒性試験培地(Cedarlane L
ab。
社)にて二度洗浄し、2μg/mlのモノクローナル抗体NM−01または対照
1gG2bを含んだ細胞毒性試験培地に再懸濁した。 4℃で、2時間、インキ
ュベーションした後、試料は等分され、ウサギ補体あるいは熱不活化ウサギ血清
(Cedarlane Lab、社)を、に6に希釈して添加した。 細胞を、
4°Cで、20分間、そして、37°Cで、45分間、インキュベーションし、
培地で洗浄し、50%FBS/ RPMI 1640に再懸濁し、そして震盪し
た。 上清あるいはウィルス分離株は、10倍希釈し、その25μIをH9細胞
(lx105/25μm)に添加する前に、引き続き2回希釈した。 37℃で
、3時間、インキュベーションした後、露出した細胞は、10%FBS/RPM
I 1640で希釈され、そして37°Cに維持した。 ウィルス感染は、6日
後に逆転写酵素分析法により決定された。 H9細胞画分の50%組織組織感染
用量(TCID5゜)を、50%感染を示した希釈度によって決定した。 その
実験の結果を表5に示した。
モノクローナル抗体NM−01のみでも、IIIVll、9の感染を中和するこ
とかできるか、モノクローナル抗体NM−01と補体による治療では、旧VII
IBの感染は10倍以下にまで低下した。 ヒト補体(ヒト血清態様の)かモノ
クローナル抗体NM−01と共に投与された時に、同様の効果か認められた。
これら知見は、モノクローナル抗体NM−01と補体双方に旧V−1を曝すこと
は、顕著なウィルス感染の低下と関連し、さらにHIV−1治療におけるモノク
ローナル抗体NM−01による補体依存性ウィルス溶解への役割を支持するもの
である。 本明細書に参照として組み込んだ、Nakamura et al、
、 AIDS RESEARCHAND HUMAN RETROVIRUS
ES。
モノクローナル抗体NM−01のI」鎖とL鎖の可変領域を、ノーイブリトーマ
IB 10726細胞質RNAから調製したcDNAを鋳型とじて用いたPCR
によってクローニングし、DNA配列を決定した。
可変領域DNA5それぞれを、M13mp18/mp19(Pharmacia
社、ミルトン キイーンズ、英国)に挿入して、配列決定を行った。
NM−01H鎖とL鎖可変領域のDNAおよび推定アミノ酸配列を、配列番号
15および16、ならびに配列番号:17および18にそれぞれ示した。 配列
番号:15のヌクレオチド1−21ならびに334−363は、NM−01L鎖
配列を増幅するためのPCRプライマーと対応し、配列番号、17のヌクレオチ
ド1−27ならびに385−402は、NM−01H鎮配列を増幅するためのP
CRプライマーと対応する。
モノクローナル抗体NM−01の可変領域の再度の配列決定の結果を、それぞれ
、H鎖可変領域のDNAと推定アミノ酸配列およびL鎖可変領域のDNAと推定
アミノ酸配列である、配列番号:19および20、ならびに配列番号:21およ
び22に示した。NM−01L鎖可変領域(VK)アミノ酸配列を、Kabat
マウス・カッパ・サブグループI11に最も相同的になるように決定し、NM−
01H鎖可変領域(VH)アミノ酸配列を、KabatマウスH鎮サブグルすプ
IAの一つになるように決定した。
NM−01のH鎖(配列番号:20)とL鎖(配列番号;22)可変領域の最初
の120個のアミノ酸配列は、図14および15にもそれぞれ示し、図中、囲い
をしたアミノ酸は、抗体の結合特異性を決定する抗体の相補性決定領域(CDR
s)である。 図14および15に示したCDR5は、Kabat eL al
、、 5equences of Proteins oflmmunolog
ical Interest、第5版、米国保健社会福祉省、米国政府印刷局(
1991)のCDR規定法に適合するように、先の国際出願No、 PCT/U
S92107111に明記したCDR5から移動させている。
図14および15において、H鎖もしくはL鎖の各アミノ酸配列は、前出のLi
ou et al、、にて報告されたモノクローナル抗体BAT123の対応す
る可変領域のH鎖およびL鎖のアミノ酸配列(配列番号。23および24)と、
そして、ECACCから入手したモノクローナル抗体F58/H3およびP4/
DIOの対応する可変領域のH鎖およびL鎖のアミノ酸配列(配列番号:25お
よび26)と比較した。
モノクローナル抗体F58/+13およびP4/DIOの可変領域アミノ酸配列
は、同一であることか認められた。
NM−01のH鎖可変領域は、(lAT123のそれとは、全120個のアミノ
酸の内、44個のアミノ酸において相違している。 両抗体のL鎖可変領域は、
24個のアミノ酸において相違している。
重要なことは、NM−01分子の■]鎖(V−)1)における三つのCDR5か
、BATI23のそれと、41から90%相違しており、一方で、L鎖(V−L
)における三つのCDR5の配列が、NM−01と比較して約29から47%異
なっていることである。
NM−01のH鎖可変領域は、F58/H3およびP4/D1.0のそれとは、
全120個のアミノ酸の内、 103個のアミノ酸において相違し、L鎖可変領
域は、3個のアミノ酸において相違している。
NM−01分子(7) 811 (V−H) ニオはル三ツノCDR5カ、F5
8/H3およびP、4./DIOのそれと、約86から100%相違しており、
一方て、L鎖(V−L)における三つのCDR5の配列か、約13から19%異
なっている。
このように、NM−01の一次構造解析と、BAT123、F58/H3および
P4/′DIOの一次構造解析の比較から、NM−01か新規の抗体であること
か確認された。
実施例IO
配列番号、19および21に記載されたDNA配列情報を基に、NM−01抗体
のヒト型化/新形態化体を調製した。 NM−01のキメラ体を作製するために
、 0rlandi et al、、 Proc、 Natl。
ヒト型化体は、Tempest et al、、 BIO/TECIINOLO
GY、 9. pp、266−327 (1988)のCDR移植法と同様の方
法によって調製した。
A、キメラ抗体の作製
NM−01可変領域は、マウス可変領域とヒト定常領域を有するキメラ抗体の作
製を許容するよう、二段階を経て、哺乳類発現へクターヘクローニングされた。
まず初めに、完全に配列決定されたVHもしくはVKを、可変領域遺伝子の5
“および3°末端に特異的なプライマーを用い、そして、得られた断片のベクタ
ーM]3VHPCR1もしくはM13VKPCR1(MLI7)Orlandi
et al、、)への移行を許容できるように制限部位を導入した実施例9に
記載のNM−01M13mp18/mp19クローンから増幅した。 これによ
り、可変領域は、定常領域遺伝子へ正しい位置関係で接合するように、プロモー
ターおよびシグナル・ペプチド遺伝子の後ろに置かれる。 第二段階にて、プロ
モーター、シグナル・ペプチド、および可変領域をコードする配列を含むM13
挿入体が、RF DNAから切り出され、そして、l:、 I−1gG1 (ベ
クタ−pSV−gpt)あルイはカッパ(ベクターp3v−hyg)定常領域遺
伝子それぞれを適切に含んた哺乳類発現ベクターへクローニングされた。
キメラNM−01L鎖および[1鎖をコードするプラスミドは、YB270ラツ
ト骨髄細胞(ATCCCRL 1662)へ共形質変換され、次いて、H鎖発現
ベクターに認められるキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
軸pt)の存在に関して選抜した。
上清は、ヒトIgGの存在に関してスクリーニングされ、そして細胞か分泌した
抗体を得た。 このキメラ抗体を、NM−01MuVII/MuVKと命名した
。
B、ヒト型化抗体の作製
CDR移植は、ヒト可変領域鋳型の特定部位の突然変異誘発によって行った。
NM−01CDR5のCDR移植ために選択されたヒト可変領域は、NEW)I
VH[5aul et al、、 J、 Biol、 Chem、、 253
゜pp、 585−597 (1978)]およびREI VK [Epp e
t at、、 Bur、 J。
Biochem、、 45. pp、 513−524 (1974)]であっ
た。
マウスCDR5に加えて、図16の27〜30位にある最初のCDHに先駆けた
4つのマウス・アミノ酸残基および図16の73位(Kabatの71位)にあ
るマウス・アルギニンを、ヒト型化NM−01VH(lluVHと称する)に含
めた。 最初のCDHに先駆けた4つの残基は、超可変的ではないか、Chot
hia et al、、 J、 Mo1. Biol、、 196゜rllll
、 901−917 (1987)による超可変ループ配座への影響が認められ
た。 Kabatの71位にある残基は、CDR5lおよび2の間を包み込み、
そして、CDR2の配座の決定において重要であることか認められている[Tr
amontano et al、、 J、 Mo1. Biol、、 215゜
pp、 175−182 (1990)]。
CDR移植体(IIuVK) 、および図17の75位でのマウス・フェニルア
ラニンを有する変異CDR移植体(lluVKF)を含めた、NM−01flu
VKの二つの変異体か作製された。 この位置でのアミノ酸の側鎖は、CDRl
の配座に影響を与え(Mffl(7) Chothia et al、、)、マ
ウス残基の包含が、他のヒト型化抗体への結合能力に明確に影響を与えることか
認められている。 例えば、Foote et al、。
J、 Mo1. Biol、、 224. pp、 487−499 (199
2)を参照のこと。
NM−0111uVH,1luVKおよびHuVKFのDNAおよび推定アミノ
酸配列を、配列番号・27および28.29および3o、そして31および32
にそれぞれ示した。 NM−01ヒト型化可変領域を、下記したヒ1− H鎖あ
るいはL鎖可変領域遺伝子を含んたMI3ファージから作製した。
ヒトH鎖あるいはL鎖可変領域遺伝子を含んだM13ファージを、チミンに代え
てウラシルを含んだ一本鎮鋳型DNAを得るように、E、 coli RZ10
32 (duじung −)にて生長させた。0.5μgの鋳型DNAを、挿入
したDNAのM13鋳型の下流にアニールするlpmolのオリゴヌクレオチド
を混合した。 マウス残基をコードする変異用オリゴヌクレオチドを、40mM
Tris−HCI pH7,5,20mM MgCl2.50mM NaC1
の20ulにて、80℃で、5分間加熱し、そして、室温にまでゆっくりと冷却
することで、鋳型にアニールした。
最初のH鎖可変領域PCR反応のために用いた変異用オリゴヌクレオチドは:
VHオリゴCDR1(配列番号、33)5°CTGTCTCACCCAGTGC
CAGCAATAACTACTACTTGTGATG GAGAAGCCAG
ACAC3゜であって、前記オリゴヌクレオチドは、アミノ酸VSGFS +T
SSSYCWHWVRQ (配列番号=28のアミノ酸24〜41および図16
の配列HuVl+)をコードするDNAの逆補体であって、下線を付したアミノ
酸は鋳型可変領域配列へ導入したマウス残基である;VHオリゴCDR2(配列
番号:34)5’ CATTGTCACT CTGCTTTTGA TGGAT
GGACT ATAGTCTATTGAACCTTCAT AACATATGC
G TCC(A/C)ATCCACTCAAGA 3゜てあって、前記オリゴヌ
クレオチドは、アミノ酸LEW(+/M)GRICYEGSIDYSPSIKS
RVTM (配列番号:28(7)7ミ/酸47〜71および図16の配列Hu
VH)をコードするDNAの逆補体であって、下線を付したアミノ酸は鋳型可変
領域配列へ導入したマウス残基である;および
VHオリゴCDR3(配列番号;35)5°CCAGTAGTCCATAGAG
GTCG TAGTACCATG GTTTTCTCTTG(C/A)MACA
ATAAT AGAC3’EN11GTTTSMDYW(配列番号・28のアミ
ノ酸94〜111および図16の配列HuVH)をコードするDNAの逆補体で
あって、下線を付したアミノ酸は鋳型可変領域配列へ導入したマウス残基である
。
L鎮可変領域突然変異のために用いたヒト鋳型は、REIとは同一ではないが関
連性かある枠組領域を実際にコードしており、また、(開示していないオリゴヌ
クレオチドを用いた)突然変異反応はこれら矛盾点ならびにNM−01CDR5
を解消した。 ここで特に検討されるべき唯一の矛盾点は、REI配列には存在
しないフェニルアラニン残基をコードする鋳型の71位である。 この残基は、
NM−0111uVKF(図17のtluVKFの75位のアミノ酸を参照のこ
と)に保持されているものの、下記する配列を有するオリゴヌクレオチドREI
Y71を用いたNM−01HuVF (図17のHuVFの75位のアミノ酸
を参照のこと)におけるREI残基ては変化していtこ。
VKtlJゴREI Y71 (配列番号:36)5’ ATGGTGAAGG
TGTAGTCGGT ACCGC3’てあって、前記オリゴヌクレオチドは
、アミノ酸GDT YTPT(配列番号、32のアミノ酸72〜78および図1
7の配列HuVK)をコートするDNAの逆補体である。 このプライマーは、
NM−01HuVKFを生成する変異反応には含まれていなかった。
HuνにおよびHuVKF L鎖可変領域双方のために、マウスNM−01CD
RIおよび鋳型CDRlは同一てあったので、CDR1の改変は不要であった。
マウスと鋳型CDR52および3の間には限られた相違しかないため、鋳型C
DR52および3の改変が必要とされ、使用した変異用オリゴヌクレオチドは:
VKオリゴCDR2(配列番号、37)5’ AGGTTGGATG CAAC
GTAGAT CAGCAG 3’(配列番号:30のアミノ酸50〜57およ
び図17の配列HuVK)をコードするDNAの逆補体であって、下線を付した
アミノ酸は鋳型可変領域配列へ導入したマウス残基である;およびVK、tlJ
ゴCDR2(配列番号;38)5’ CCGAACGTGA GCGGATCT
TCATTATTTTGCTGGCAGTA 3゜であって、前記オリゴヌクレ
オチドは、アミノ酸YCQQN NEDPL TF (配列番号:30(7)7
ミ/酸91〜102および図17ノ配列HuVK)をコードするDNAの逆補体
であって、下線を付したアミノ酸は鋳型可変領域配列へ導入したマウス残基であ
る。
NM−01HuVHを生成すルタめに、VH,tlJゴCDRI、 CDR2、
オヨびCDR3を、ヒトNEWH鋳型iニア ニー /l、した。 NM−01
HuVKを生成すルタめに、VK、t IJ :/REI Y71 、VK、t
IJゴCDR2、オヨヒ■にオリゴCDR3を、ヒトNEWH鋳型DNA !
、ニアニー/I、した。 NM−01HuVKFを生成するために、VKオリゴ
CDR2、およびVKオリゴCDR3をアニールした。 そして、同じ緩衝液中
にて、dATPSdCTP、 dGTPおよびdTTPを最終濃度が250 u
Mとなるように、DTTが7 mM、 ATPか1mMとなるように添加し、
そして、0.5単位T7 DNAポリメラーゼ(United 5tates
Biochemica1社、クリーブランド、オハイオ州)および0.5単位T
7 DNAリガーゼ(Life Technologies社、ペイスレイ、英
国)を添加した。 30μmの反応液を、室温にて、1時間インキュベートし、
そして、DNAをエタノールで沈殿させた。 親の鋳型鎖にニックを入れるため
に、DNAを60mM Tris−HCI pH8,0,1mM EDTA、
1mM DTT 、 1単位のウラシルDNAグリコシラーゼ(Boehrin
ger Mannheim社、ルイス、サセクッス州、英国)を含む0.1mg
/ml BSAからなる50μmに溶解し、そして、NaOHか0.2Mとなる
ように添加される以前に、37°Cて、1時間インキュベートし、室温にて、5
分間、インキュベーションを継続した。 断片化した起源のDNAを除去するた
めに、再度、エタノール沈殿させた。 変異DNAは、20μl TE中に溶解
し正および逆のM13プライマーを用いたPCHによって可変領域挿入体を増幅
した。 PCR反応混合物は、2μm変異DNA XO,5μM ノ各プライマ
ー、250ttM ノdATPSdCTP、 dGTPおよびdTTPの各々、
10mM Tris−41CI pH8,3,50mM KCI、1.5mMM
gCh 、0.01%Tween−20,0,01%ゼラチン、0.01%NP
40.および50u1中に2単位のサーマラーゼ(rBI社、ケンブリッジ、英
国)を含んでいた。 増幅は、94℃で30秒間、50℃で30秒間、72°C
で1分間からなるサイクルを15回行い、72℃で5分間置くことで反応を終了
した。 生成りNAsを、旧nd I I I−BamHl断片であるMI3m
p19へクローニングし、典型的なりローンの配列決定を行った。 H鎖に関し
て、最初に、マウスCDR5lおよび3を有する部分的変異のみを取得した。
マウスCDR2の変異体を得るために、鋳型としての部分的に変異させたDNA
とVHオリゴCDR2を用いて上記した反応を反復した。 得られたDNA3を
、11ind111−BamH1断片であるM13mp19へクローニングし、
典型的なりローンの配列決定を行った。
真正のNM−01HLIVH,HLIVKおよび)IuVKFをコードする旧n
dlll−BamHI断片を、ヒトIgG1 (ベクターpsV−gpt)ある
いはカッパ(ベクターpSV−hyg)定常領域遺伝子を適切にコードする配列
の発現ベクター上流にそれぞれクローニングした。 得られたベクターは、完全
なヒト型化NM−01抗体(ECACC93082022として寄託したYB2
10細胞系か産成したHuVH/HuVK: ECACC93082019とし
て寄託したYB210細胞系が産成したHuVH/HuVKF)を産生ずる細胞
系を生成するために、YB210あるいはNSO細胞(ECACC851105
03)へ共電気泳動、あるいは、鎖の一つかキメラである(例えば、MuVH/
MuVKF)混合−適合型抗体を産生ずる細胞系を生成するために、上記した適
切なNM−Of H鎮およびL鎖をコードするベクターと共に個々に電気泳動に
適用した。 抗体は、プロティンAアガロース・アフィニティー・クロマトグラ
フィーによって精製した。
ヒト型化NM−01抗体の4つの他の態様か、上記した方法によって生成された
。 最初の(ECACC93082020YB210細胞系が産生じた)HuV
HM/HuVKおよび二番目の(ECACC93082021YB210細胞系
か産生じた)t(uVIIs/HuVKFは、FIuVI(の48位にメチオニ
ンを含んでいた。 三番目の(ECACC93082023YB210細胞系が
産生じた) HuVt(S/HuVKおよび四番目の(ECACC930820
18YB210細胞系か産生じた)HuVH3/HuVKFは、HuVHの93
位にセリンを含んでいた。
これらヒト型化抗体は、保有しているし鎖に依存して、NM−01)1uVH/
HuVK抗体あるいはNM−01HuVH/HuVKF抗体の抗原結合特性と同
様の抗原結合特性を有している。 NM−01)1uVH/HuVに抗体ならび
にNM−01t(uVtl/1fuVKF抗体の抗原結合特性を、以下にヒト型
化NM−01のgp120への結合性を、マウスNM−Ofの結合性との比較に
関して、拮抗分析法で評価した。 プレートを、組換えgp120(Ameri
can Biotechnologies社、ケンブリッジ、マサチューセッツ
州)(5ng/ウェル)で被覆し、そして、5%正常ヤギ血清(Life Te
chnologies社)でブロックした。 ヒト型化NM−01抗体、キメラ
NM−01抗体、マウスNM−01抗体、あるいはヒト型化抗体の負の対照の希
釈液(10〜11000n/ 100μl)を各ウェルに添加し、そして、プレ
ートを、37℃で、30分間インキュベートした。 ビオチン化マウスNM〜O
1抗体(ウェル当たり500ng150μI PBS)を添加し、インキュベー
ションを一時間継続した。 プレートをPBS−0,05%Tween20で洗
浄した。 HRPO−ストレプトアビジン(ウェル当たり500ng150μI
PBS:5era−Lab社、フローリーダウン、サセックス州、英国)を添
加し、30分間インキュベートした。 プレートを洗浄し、そして、0−フェニ
ルジアミンの存在下で5分間、あるいは発色するまでインキュベートした。 吸
光度は、492nmて計測した。
ヒト型化NM−01抗体11uVIl/l1uVKは、標識付けしたマウスNM
−01抗体の結合阻害において、マウスNM−01抗体と同様の効果/反応性を
示したが、ヒト型化NM−01抗体11uVH/HuVKPは、マウス抗体の約
4倍の反応性か認められた。 キメラNM−01抗体の反応性は、マウスNM−
01抗体よりも小さかった。
キメラおよびヒト型化NM−01抗体は、RT、 p24 、およびシンシチウ
ム阻害分析法によって、旧V−1中和活性に関しても評価した。 実質的に先の
実施例で述べた方法と同様である、これら分析法は以下のようにして行った。
R7分析法では、15%ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地に、抗体を
連続的に希釈した。 抗体の希釈液を、MNあるいは111aウイルスの100
倍の組織培養50%感染量(TCIDso)で、96ウエル・プレートにて、4
°Cで、2時間インキュベートした。
1]9細胞(2,5x 105細胞)を各ウェルに添加し、そして、37℃で、
さらに]時間インキュへ一トシた。 +19細胞懸濁液を、2mlのRPMl
1640培地/15%ウン胎児血清に希釈し、そして、24プレートにて37℃
でインキュへ一トシた。 ウィルス生成を、7日目に、RT分析によって決定し
た。 この分析の結果を、図18(MN)および19(IIIs )に示した。
p24分析法では、MNあるいはl1laウイルス(100XTCIDs。)と
モノクローナル抗体と共に、H9細胞を6〜8日間インキュベートした。 組織
培養土浦でのp24抗原の存在を、製造業者(Du Pond−NEN)の使用
説明書に記載の方法に従って、HIV−1p24コア断片の酵素結合免疫吸収分
析(ELISA)によって定量した。 具体的には、抗原−抗体複合体を、セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼ()IRP)接合体でプローブした。 最終生成物
を、捕獲したIIIV−1p24コア抗原の量に直接比例している黄色の強度に
よって定量した。 マイクロプレートELrSA計測器を用いて、発色の程度を
450nmにて計測し、その結果を、モノクローナル抗体2990.7を負の対
照とした図20 (MN)および21(Illa ) ニ示した。
最後に、シンシチウム分析法では、MNウィルスで慢性的に感染したH9細胞を
、モノクローナル抗体NM−01の希釈液で、37℃にて、1時間インキュベー
トした。 指標細胞系C8166からの細胞を添加しく3XlO’細胞/ウエル
)、プレートを、37℃にて、2〜12時間さらにインキュベートした。 白血
球細胞直径の3倍以上の大きさのシンシチウムの数を計測し、抗体の欠如に関し
て、対照感染H9細胞と比較した。 その結果を、モノクローナル抗体2990
.7を負の対照とした図22に示した。
三ツノ分析結果は、ヒト型化NM−01抗体11uVH/IIuVKFか、)I
IV−1のMNおよびII+、単離株の中和において、マウスNM−01モノク
ローナル抗体と等価あるいはそれ以上の中和効果を呈することを実証するもので
ある。
本願発明は、好適な実施例に関して記述してきたが、修正や変更か当業者によっ
てなされるものと考えられる。 それ故、請求した発明の範晴と等価の発明をす
べて包含する添付した請求の範囲を希求する次第である。
配 列 表
(1)一般情報
(1)出願人、大野典也
(11)発明の名称:HIV免疫療法
(iii)配列の数;38
(iv)連絡先住所。
(^)名宛人:マーシャル、オドウール、ジエーステイン、マレ−アンドボーラ
ン
(B)番地+ 6300ンアーズ タワー、 233サウス ワソカー ドライ
ブ(C)都市名、シカゴ
(D)州名、イリノイ
(E)国名:米国
(P)郵便番号+ 60606
<v)コンピューター読取形式・
(A)媒体・フロッピー ディスク
(B)コンピューター・ IBM PC互換機(C)操作システム PC−DO
3/MS−DO3(D)ソフトウェア、パテント イン リリース#1.0、バ
ージョン#1.25゜(vi)現出願データ・
(A)出願番号
(B)出願臼、
(C)分類
(ν11)先行出願データ
(A)出願番号。PCT/US921071 II(B)出願臼+ 24−8月
−1992(vii)先行出願データ・
(^)出願番号+ US 081039,457(B)出願臼: 22−4月−
1993(ν111)弁護士/弁理士情報:
(A)氏名二ボーラン、マイケル エフ(B)登録番号: 25.447
(C)参照/事件番号・31629
(IX)通信情報:
(A)電話+ (312) 474−6300(B)ファックス: (312)
474−0448(C)テレックス: 25−3856
(2)配列番号:1の情報
(1)配列特徴・
(A)配列の長さ・4アミノ酸
(B)配列の型、アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(目)配列の種類・ペプチド
(xl)配列:配列番号:1
Gly Pro Gly Arg
(2)配列番号・2の情報
(i)配列特徴:
(A)配列の長さ・15アミノ酸
(B)配列の型、アミノ酸
(D)トポロン−直鎖状
(11)配列の種類、ペプチド
(Xl)配列・配列番号 2
Cys Thr Arg Pro Asn Trp Asn Lys Arg
Lys Arg Ile 1lis Ile Glyl 5 10 15
(2)配列番号、3の情報
(1)配列特徴・
(A)配列の長さ 15アミノ酸
(It)配列の型、アミノ酸
(D)トポロン−直鎖状
(11)配列の種類 ペプチド
(xi)配列 配列番号 3
Arg lle His lle Gly Pro Gly ArgAla I
”he Tyr Thr Thr Lys Asn(2)配列番号 4の情報
(i)配列特徴
(A)配ダ11の長さ 15アミノ酸
(B)配列の型 アミノ酸
(D)トポロン−直鎖状
(i i)配列の種類 ペプチド
(xl)配列 配列番号 4
Tyr Thr Thr L、ys 八sn lle lie Gly Thr
lle 八rg Gln Ala 1lis Cysl 5 to 15
(2)配列番号 5の情報
(1)配列特徴
(A)配列の長さ 15アミノ酸
(B)配列の型;アミノ酸
(D)トポロジー・直鎖状
(11)配列の種類・ペプチド
(Xり配列 配列番号 5
Arg lie 1lis Ile Gly Pro Gly Arg Ala
Phe Tyr Thr Tt+r Lys Asn(2)配列番号 6の情
報
(i)配列特徴:
(A)配列の長さ・14アミノ酸
(B)配列の型・アミノ酸
(D)トポロジー 直鎖状
(ii)配列の種類 ペプチド
(×1)配列、配列番号:6
11e Arg lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe
Val Thr Ile Gly Lysl 5 10
(2)配列番号ニアの情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ:19アミノ酸
(B)配列の型、アミノ酸
(D)l−ボロジー・直鎖状
(i i)配列の種類 ペプチド
(xl)配列 配列番号 7
Cys Asn Thr Arg Lys Ser lie Lys Gly
Pro Gly 八rg Vat Ile Tyr Alal 5 10 15
Thr cly Gln
(2)配列番号、8の情報
(1)配列特徴・
(A)配列の長さ:20アミノ酸
(8)配列の型、アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(11)配列の種類・ペプチド
(xl)配列:配列番号 8
Cys tlis Thr Arg Lys Arg Vat Thr Leu
Gly Pro Gly Arg Val Trp Ty■
l 5 10 15
Thr Thr Gly Glu
(2)配列番号 9の情報
(1)配列特徴・
(^)配列の長さ 20アミノ酸
(B)配列の型・アミノ酸
(D)トポロン−直鎖状
(11)配列の種類・ペプチド
(xl)配列、配列番号・9
Cys Asn Tbr Lys Lys Gly Ile Ala Ile
Gly Pro Gly Arg Thr Leu Tyrl 5 10 15
Ala Arg Glu Lys
(2)配列番号 lOの情報
(1)配列特徴
(A)配列の長さ 23アミノ酸
(B)配列の型 アミノ酸
(D)トポロジー・直鎖状
(11)配列の種類・ペプチド
(xl)配列:配列番号・1O
Cys Asn Thr Arg Gln Set Thr Pro Ile
Gly Leu Gly Gln Ala Leu Tyrl 5 IQ 15
Thr Thr Arg Gly Arg Thr Lys(2)配列番号:1
1の情報
(i)配列特徴・
(A)配列の長さ、22アミノ酸
(B)配列の型、アミノ酸
(D)トポロジー・直鎖状
(ii)配列の種類・ペプチド
(xi)配列:配列番号・11
Cys Asn Ile Arg Gln Arg Thr Ser Ile
Gly Leu Gly Gln Ala Leu Tyrl 5 10 15
Thr Thr Lys Thr Arg Ser(2)配列番号 12の情報
(1)配列特徴
(A)配列の長さ:22アミノ酸
(B)配列の型 アミノ酸
(D)トボロンー:直鎖状
(目)配列の種類 ペプチド
(×1)配列・配列番号 12
Cys Asn Thr Arg Gln Arg Tt+r Pro Ile
Gly Leu Gly Gin Ser Leu Ty■
l 5 10 15
Thr Thr Arg Ser Arg Se+(2)配列番号 13の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ、15アミノ酸
(B)配列の型・アミノ酸
(D)トポロジー・直鎖状
(11)配列の種類・ペプチド
(xl)配列、配列番号、13
Arg lle Thr Lys Gly Pro Gly Arg Val
lle Val Ala Thr Gly G1n(2)配列番号・14の情報
(1)配列特徴
(A)配列の長さ 20アミノ酸
(B)配列の型 アミノ酸
(D)トポロジー 直鎖状
(11)配列の種類 ペプチド
(xl)配列 配列番号 14
Cys Asn Thr ArgLys Ser lle Thr Lys G
ly Pro Gly Arg Val Ile Tyrl 5 10 15
^1a Thr Gly Gln
(2)配列番号・15の情報
(1)配列特徴
(A)配列の長さ 402塩基対
(B)配列の型 核酸
(C)鎖の数 一本鎖
(+1) l−ボロノー、直鎖状
(11)配列の種類 DNA
(1x)配列の特徴。
(八)特徴を表す記号 CD5
(B)存在位置・ 1. 、402
(xi)配列:配列番号:15
GAG GTCCAG CTG CAG GAG TCT GGA CCT G
CT GTCATCAAG CCA TCA CAC48Glu Val Gi
n Leu Gln Glu Ser Gly Pro 八la Val Il
e Lys Pro Ser Gin] 5 10 15
TCA CTG TCT CTCACCTGCATA GTCTCT GGA
TTCTCCATCACA 八GT AGT 96Ser Leu Ser L
eu Thr Cys Ile Vat Ser Gly Phe Ser I
le Thr Ser 5erAGT TAT TGCTGG CACTGG
ATCCGCCAG CCCCCA GGA AAG GGG TTA GAG
144Ser Tyr Cys Trp His Trp Ile Arg
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu GluTGG A
TG GGG CGCATA TGT TAT GAA GGT TCA AT
A GACTAT AGT CCA TCC19Q
Trp Met Gly Arg lie Cys Tyr Glu Gly
Ser lle Asp Tyr Ser Pro 5erATCAAA AG
CCGCAGCACCATCTCCAGA GACACA TCT CTG A
ACAGA TTC24011e Lys Ser Arg Ser Tbr
Ile Ser Arg Asp Thr Ser Leu Asn Arg
円]eTTT ATCCAG CTG AGT TCT GTG ACA AA
T GAG GACACT GCCATG TAT TAC288Phelle
Gln Leu Ser 、Ser Val Thr Asn Glu As
p Thr Ala Met Tyr TyrTGT TCCAGG GAA
、AACGAT GGT ACT ACG ACCTCT ATG GACTA
CTGG GGT 336Cys Ser Arg Glu Asn His
Gly Thr Thr Thr Ser Met Asp Tyr Trp
Glytoo 105 110
CAA GGA ACCTCA GTCACCGTCTCCTCA GCCAA
A ACA 八CA CCCCCA TCA 3B4Gin Gly Thr
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr
Thr Pro Pro 5er115 120 +25
GTCTAT CCA CTG GAA CCT 402Val Tyr Pr
o Leu Glu Pr。
(2)配列番号 16の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ 134アミノ酸
(B)配列の型 アミノ酸
(D)トポロジー・直鎖状
(11)配列の種類・タンパク質
(xl)配列二配列番号 16
Glu Val Gin Leu Gln Glu Ser Gly Pro
Ala Val Ile Lys Pro Ser G1nSer Leu S
er Leu Tl+r Cys Ile Val Ser Gly Phe
Ser Ile Thr Ser 5e■
Ser Tyr Cys Trp His Trp lle Arg Gln
Pro Pro Gly Lys Gly Leu GluTrp Met G
ly Arg Ile Cys Tyr Glu Gly Ser Ile A
sp Tyr Ser Pro 5er1ie Lys Ser Arg Se
r Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Leu As
n Arg PhePhe 、IIe Gln Leu Ser Ser Va
l Thr Asn Glu Asp Thr Ala Meピyr TyrC
ys Ser Arg Glu Asn 1lis Gly Thr Thr
Thr Ser Met Asp Tyr Trp Gl■
loo 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
Ala Lys Thr Thr Pro Pro 5erVal Tyr P
ro Leu Glu Pr。
(2)配列番号、I7の情報
(1)配列特徴。
(A)配列の長さ、363塩基対
(B)配列の型 核酸
(C)鎖の数・一本鎖
(D)トポロジー・直鎖状
(11)配列の種類: DNA
(ix)配列の特徴。
(A)特徴を表す記号・ CD5
CB)存在位置: 1..363
(xl)配列 配列番号+17
GACATT GTG CTG ACCCAA TCT CCA GCT TC
T TTG GCT GTG TCT CTA GGG 4W
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
Ser Leu Ala Vat Ser Leu Glyl 5 10 15
CAG AGG GCCACCATA TCCTGCAGA GCCAGT G
AA AGT GTT GAT AGT TAT 96Gln Arg Ala
Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
Val Asp Ser Tyr20 、 25 30
GGCAAT AGT TTT ATG CACTGG TACCAG CAG
AAA CCA GGA CAG TCA CCC144Gly Asn S
er Phe M[!l 1lis Trp Tyr Gln Gln Lys
Pro Gly Gln Ser P秩B
AAA CTCCTCATCTAT GTT GCA TCCAACCTA G
AA TCT GGG GTCCCT GCC192Lys Leu Leu
Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser
Gly Val Pro Ala八GG TTCAGT GGCAGT GGG
TCT 八GG ACA CACTTCACCCTC八CC八TT GAT
240Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 八rg T
hr Asp Pl+e Thr Leu Thr lle 八5■
CCT GTG GAG GCT GAT GAT GCT GCA ACCT
AT TACTGT CAG CAA AAT AAT 2W8
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr
Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn AsnGAG GAT C
CG CTCGCG TTCGGT ACT GGG ACCAAG CTG
GAG CTG AAA CGG 33U
Glu Asp Pro Leu Ala Phe Gly Thr Gly
Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg+00 105 1
10
GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCCATC36
3、\la Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 1l
e(2)配列番号 I8の情報
(1)配列特徴
(へ)配列の長さ +21アミノ酸
(B)配列の型 アミノ酸
(D)トポロジー・直鎖状
(1り配列の種類 タンパク質
(χ1)配7リ 配列番号 18
Asp lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
Ser Leu Ala V+l Ser l、eu Gl■
l 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys ArgAla S
er Glu Ser Val Asp Ser TyrGly Asn Se
r Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pr
o Gly Gln Ser Pr。
Lys Leu Leu Ile Tyr Val 八la Ser Asn
Leu Glu Ser Gly Val Pro ^1aArg Phe S
er Gly Ser Gly Ser 八rg Thr Asp Phe T
hr Leu Thr lle AspPro Val Glu Ala As
p Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gl
n Asn AsnGlu Asp Pro Leu Ala Phe Gly
Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
loo 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser l1e(
2)配列番号:19の情報
(1)配列特徴・
(A)配列の長さ 363塩基対
(B)配列の型・核酸
(C)鎖の数 一本鎖
(D)トポロジー 直鎖状
(11)配列の種類 DNA
(1x)配列の特徴・
(A)特徴を表す記号・ CD5
(B)存在位置・ 1.363
(xl)配列 配列番号:19
CAG ATT CAG CTT^^G GAG TCT GGA CCT G
CT GTCATC^^G CCA TCA CAG 48Gin Ile G
ln Leu Lys Glu Ser Gly Pro^Ia Vat Il
e 1.ys Pro Ser G1nTCA CTG TCT CTCACC
TGCATA GTCTCT GGA TTCTCCATCAC^^GT AG
T 96Ser Leu Ser Leu Thr Cys lle Val
Ser Gly Phe Ser lle Thr Ser 5er^GT T
AT TGCTGG CACTGG ATCCGCCAG CCCCCA GG
^^^G GGG TTA GAG +44Scr Tyr Cys Trp
His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
Gly Leu GluTGG ATCGGG CGCATA 丁GT TAT
GAA GGT TCA ATA GACTAT ACT CCA TCC1
92Trp Met cly Arg lie Cys Tyr Glu Gl
y Ser Ile Asp Tyr Ser Pro 5er^TC^^A^
GCCGCAGCACCATCTCCAGA CACACA TCT CTG^
^CAGA TTC240!le Lys SerArg Ser Thr l
le Ser^rg Asp Thr Ser Leu Asn Arg r’
heTTT ATCCAG CTG AGT TCT GTG ACA AAT
GAG GACACT GCCATG TAT TAC288Phe ilc
Gln Leu Ser Ser\’al Thr人sn Glu Asp
Thr^la Met Tyr TyrTGT 丁CCAGG GAA AAC
CAT GGT ACT ACG ACCTCT ATG GACTACTGG
GGT 336Cys Ser Arg Glu Asn His Gly
Thr Thr Thr Ser Mel Asp Tyr Trp Gly+
00 105 110
C^^G6^^CCTCA GTCACCGTCTCCTCA 363Gin
Gly Thr Ser Val Thr Vat Ser 5er(2)配列
番号、20の情報
(1)配列特徴
(A)配列の長さ:121アミノ酸
(B)配列の型・アミノ酸
(D)トポロジー 直鎖状
(11ン配列の種類、タンパク質
(xl)配列 配列番号:20
Gin lie Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro^
Ia Val lie Lys Pro Ser Gln+ 5 10 +5
Ser Leu Ser Leu Thr Cys lie Vat Ser
Gly Phe Ser lie Thr Ser 5erSer Tyr C
ys Trp His Trp Ile Arg Gin Pro Pro G
ly Lys Gly Leu GluTrp Met Gly Arg Il
e Cys Tyr Glu Gly Ser Ile Asp 丁yr Se
r Pro 5er11e Lys Ser Arg Scr Tbr lie
Scr /lrg Asp Thr Set Lcu Asn Arg r’
戟{e
Phe lie Gln Leu Ser Ser Val Thr Asn
Glu Asp Thr^la Met Tyr TyrCys Ser Ar
g Glu Asn旧s Gly Thr Thr Thr Ser Met
Asp Tyr Trp Gly+00 105 110
Gln Gly Thr Ser Vat Thr Val Ser 5er(
2)配列番号、21の情報
(i)配列特徴。
(^)配列の長さ 363塩基りj
(B)配列の型 核酸
(C)鎖の数 一本鎮
(D) ト=P oノー・直鎖状
(11)配列の種類 DNA
(ix)配列の特徴
<A)特徴を表す記号二 0口5
(B)存在位置 1363
(xi)配列 配列番号:21
GACへTT GTG CTG ACCCAA TCT CCA GCT TC
T TTG GCT GTG TCT CTA GGG 4W
^sp 1leVat Leu Thr Gln Ser r’ro^la S
er Leu^la Val Ser Leu Gly+ 5 10 15
C^6^GG GCCACCATA TCCTGC^GA GCCAGT G^
^^GT GTT GAT AGT TAT 96Gln^rgAla Thr
Ile Ser Cys Arg^Ia Ser Glu Ser Val
Asp Ser TyrGGCへAT ^6丁 TTT ATG CACTGG
TACCAG CAG AAA CCA 66^ CAG TCA CCC1
44Gly Asn Ser Phe Me[His Trp Tyr Gin
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pr。
^^人 CTCCTCATCTAT GTT GCA TCCAACCTA G
AA TCT GGG GTCCCT GCC192L1s 1.eu Leu
lie TYr Val Aha Ser Asn Leu Glu Ser
Gly Val Pro^1aRO5560
AGG TTCAGT GGCAGT GGG TCT AGG ACA CA
CTTCACCCTCACCATT GAT 240Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser :へrg Thr Asp Phe Thr
Leu Thr lle As■
CCT GTG G、へG GCT CAT 6^T GCT GCA ACC
TAT TACTGT CAG CAA AAT AAT Q88
Pro Vat Glu 、41a へsp Asp Ala Ala Thr
丁yr Tyr Cys Gin Gin Asn As■
GAG GAT CCG CTCACG TTCGGT GCT GGG AC
C^^G CTG GAG CTG AAA CGG 33U
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly
Thr Lys Leu Glu Leu Lys^[gloo 105 11
0
GCT GAT GCT GCA CC^^CT GTA TCCATC363
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile+
15 120
(2)配列番号・22の情報
(1)配列特徴
(^)配列の長さ 121アミノ酸
(B)配列の型二アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(11)配列の種類・タンパク質
(yl)配列 配列番号:22
Asp lle Vat Lea Thr Gln Ser Pro^la S
er Leu^1aνal Ser 1.eu Gly+ 5 10 15
Gln Arg^la Thr lie Ser Cys^[g^la Ser
Glu Ser Vat^sp Ser Tyr61シ^sn Ser Ph
e Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gl
y Gln Ser Pr。
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn
Leu Glu Ser Gly Val Pro^1a^rg Phe Se
r Gly Ser Gly Ser^rg Thr Asp Phe Thr
Leu Thr Ile AspPro Val Glu Ala Asp^
5p^Ia Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin As
n AsnGlu Asp Pro Leu Thr Phe Gly^la
Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Argloo +
05 110
Ala Asp^la Ala Pro Thr Val Ser lle+1
5 120
(2)配列番号:23の情報
(i)配列特徴
(^)配列の長さ +14アミノ酸
(B)配列の型二アミノ酸
(D)トポロジー、直鎖状
(目)配列の種類、タンパク質
(xl)配列 配列番号 23
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro
Gly Leu Val Lys Pro Ser G1nSer Leu S
er Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr S
er Ile Thr Ser AspTyr Ala Trp Asn Tr
p Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Le
u Glu TrpMet Gly Tyr lle Ser Tyr Ser
Gly Ser Thr Thr Tyr 八sn Pro Ser Leu
Lys Ser Arg lie Ser lle Thr Arg Asp
Thr Ser Lys Asn Leu Phe PheLeu Gin L
eu Ser Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr A
la Thr Tyr Tyr CysAla Arg Gly Ser Ph
e Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Va
l Thr Valloo 105 110
Ser Ala
(2)配列番号 24の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ 120アミノ酸
(B)配列の型−アミノ酸
(D)トポロジー・直鎖状
(■)配列の種類・タンパク質
(xi)配列:配列番号:24
Asp lle Vat Leu Thr Gln Ser l’ro^la
Ser Leu Ala Val Ser 1.eu Gl■
l 5 10 15
Gln Arg Ala Tbr Ile Ser Cys Lys Ala
Ser Gln Ser Val Asp Tyr AspGly Asp S
er Tyr MeL Asn Trp Tyr Gln Gln Lys r
’ro Gly Gln Pro PrB
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala^la Ser Asn V
al Glu Ser Gly lle Pro^1a^rg Phe Tyr
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
Asn Thr lle l1i■
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Tl+r
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 1l■
^sp Asp Pro Ser Tbr l’he Gly Gly Gly
Tbr Lys Leu Glu Ile Asp Ar■
loo 105 110
Ala Asp Ala Ala l’ro Tl+r Val 5er(2)
配列番号:25の情報
(1)配列特徴:
(^)配列の長さ、120アミノ酸
(ロ)配列の型二アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(11)配列の種類:タンパク質
(xl)配列:配列番号:25
Gin Ile Gln Leu Gin Gln Ser Gly Ala
Glu Leu Ala Ser Pro Gly Alal 5 10 15
Ser Vat Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ir1■
Ile Met Asn Trp Val Lys Lys Arg Pro
Gly Gin Gly Leu Glu Tr’p l1■
Gly Arg lie Phe Pro Val Ser Gly Glu
Tbr Asn Tyr Asn Gln Lys PheMet Gly L
ys Ala Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser S
er Ser Thr Val 5erMet Val Leu Asn Se
r Leu Tt+r Ser Glu Asp Pro Ala Val T
yr Tyr Cy■
Asp Leu Ile Tyr Tyr Asp Tyr Glu Glu
Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trploo 105 1
10
Gly Gln Gly Thr Thr Lea Thr Va1(2)配列
番号 26の情報
(1)配列特徴
(A)配列の長さ 120アミノ酸
(B)配列の型 アミノ酸
(D)トポロジー 直鎖状
(II)配列の種類・タンパク質
(xi)配列 配列番号:26
Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala
Ser Leu Ala Vat Ser Leu Glyl 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys ArgAla S
er Glu Ser Val Asp Asp TyrGly Ile Se
r Phe Met 1lis Trp Tyr Gln Gln Lys L
、eu Gly Gln I’ro or。
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn
Leu Glu Ser Gly Ile Pro AlaArg Pbe S
er Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe T
hr Leu Thr lle AsnPro Val Glu Thr As
p Asp Vat Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gl
n Ser Asn1、ys Asp Pro Leu Thr Phe Gl
y Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ar
■
loo 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 5er(2)配列
番号、27の情報
(i)配列特徴:
(A)配列の長さ 826塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数、一本鎖
(D)トポロジー 直鎖状
(【i)配列の種類:DNA(ゲノミック)(IX)配列の特徴・
(A)特徴を表す記号 CD5
(B)存在位置+ 261..620
(xi)配列6配列番号=27
AAGCTTATGA ATATGCAAAT CCTCTGAATCTACA
TGGTAA ATATAGGTTT GTCTATACC` 60
CAAACAGAAA AACATGAGAT CACAGTTCTCTCTA
CAGTTA CTGAGCACACAGGACCTCACP20
CATGGGATGG AGCTGTATCA TCCTCTTCTT GGT
AGCAACA GCTACAGGTA AGGGGCTC`C180
AGTAGCAGGCCTGAGGTCTG cAcATArArATGGGT
GACAA TGACATCCACTTTGCCTTTC2S0
TCTCCACAGG TGTCCACTCCCAG GTCCAA CTG
CAG GAG AGCGGT CCA GGC290Gln Vat Gln
Leu Gln Glu Scr Gly Pro Glyl510
CTT GTG AGA CCT AGCCAG ACCCTG AGCCTG
ACCTGCACCGTG TCT GGC338Leu Val Ar’g
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys
Thr Val Ser Gl■
l5 20 25
TTCTCCATCACA AGT AGT AGT TAT TGCTGG
CACTGG GTG AGA CAG CCA 386Phe Ser ll
e Thr Ser Ser Ser Tyr Cys Trp 1lis T
rp Val Arg Gin PrB
CCT GGA CGA GGT CTT GAG TGG ATT GGA
CGCATA TGT TAT GAA GGT TCA S34
Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly
Arg Ile Cys Tyr Glu Gly 5erATA GACTA
T AGT CCA TCCATCAAA AGCAGA GTG ACA A
TG CTG AGA GAC4821ie Asp Tyr Ser Pro
Ser Ile Lys Ser Arg Vat Thr Met Leu
Arg AspACCAGCAAG AACCACTTCAGCCTG AG
A CTCAGCAGCGTG ACA GCCGCC530Thr Ser
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser
Ser Val Thr Ala AlaGACACCGCG GTCTAT
TAT TGT GCA AGA GAA AACCAT GGT ACT A
CG ACC578Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Arg Glu Asn His Gly Thr Thr Thr
TCT ATG GACTACTGG GGCCAA GGG TCCTTG
GTCACCGTCTCC620Ser Met Asp Tyr Trp G
ly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser+1
0 115 120
TCAGGTGAGT CCTTACAACCTCTCTCTTCT ATTC
AGCTTA AATAGATTTT ACTGCATTTf 680
TTGGGGGGGA AATGTGTGTA TCTGAATTTCAGGT
CATGAA GGACTAGGGA CACCTTGGG` 740
GTCAGAAAGG GTCATTGGGA GCCCGGGCTG ATG
CTGACAG ACATCCTCAG CTCCCGGAbT 800
TCATGGCCAG AGATT1’ATAG GGATCC826(2)配
列番号:28の情報
(i)配列特徴・
(A)配列の長さ、120アミノ酸
(B)配列の型・アミノ酸
(D)トポロジー 直鎖状
(11)配列の種類 タンパク質
(xi)配列 配列番号 28
Gln〜at Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro G
ly Leu Val Arg Pro Ser G1nThr Leu Se
r Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Se
r lie Thr Ser 5erSer Tyr Cys Trp 1li
s Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gl
y Leu Gl■
Trp Ile Gly Arg Ile Cys Tyr Glu Gly
Ser lle Asp Tyr Ser Pro 5er11e Lys S
er Arg Vat Thr Met Leu Arg Asp Thr S
er Lys Asn Gin PheSer Leu Arg Leu Se
r Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Va
l Tyr TyrCys Ala Arg Glu Asn His Gly
Thr Thr Thr Ser Met Asp Tyr Trp Gly
loo 105 110
Gin Gly Ser Leu Val Thr Vat 5er(2)配列
番号;29の情報
(i)配列特徴。
(A)配列の長さ 632塩基対
(B)配列の型・核酸
(C)鎖の数 一本鎖
(D)トポロジー 直鎖状
(11)配列の種類 DNA (ゲノミック)(1x)配列の特徴・
(A)特徴を表す記号 CD5
(B)存在位置 261..593
(xl)配列 配列番号、29
AAGCTTATGA ATATGCAAAT CCTCTG八ATCへTAC
ATGGTAA ATATAGGTTT GTCTATACbA 60
CAAACAGAAA AACATGAGACCACAGTTCTCTCTAC
AGTTA CTGAGCACACへGGACCTCへC1Q0
CATGGGATGG AGCTGTATCA TCCTCTTCTT GGT
AGCAACA GCTACAGGTA 八GGGGCTC`C180
AGTAGCAGGCTTGAGGTCTG GACATATATA TGGG
TGACAA TGACATCCACTTTGCCTTTCQ40
TCTCCACAGG TGTCCACTCCGACATCCAG ATG A
CCCAG AGCCCA AGCAGC290Asp Ile Gln Me
t Thr Gln Ser Pro Ser Ser51O
CTG AGCGCCAGCGTG GGT GACAGA GTG ACCA
TCACCTGT AGA GCCAGT 338Leu Ser Ala S
er Val Gly Asp ArgVal Thr Ile Thr Cy
s Arg Ala 5erG八A AGT GTT GAT AGT TAC
GGCAAT AGT TTT ATG CACTGG TACCAG CAG
386Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn
Ser t”he Met 1lis Trp Tyr Gln GPn
へCG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CTG CTG
ATCTACGTT GCA TCCAACCTA 434Thr Pro G
ly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr V
al Ala Ser Asn LeuGAA TCT GGT GTG CC
A AGCAGA TTCAGCGGT AGCGGT AGCGGT ACC
GAC482Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Ph
e Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr AspTAC
ACCTTCACCATCAGCAGCCTCCAG CCA GAG GAC
ATCGCCACCTAC530Tyr Thr Phe Thr lie S
er Ser Leu Gln Pro Glu Asp lle Ala T
hr TyrTACTGCCAG CAA AAT AAT GAA GAT
CCG CTCACG TTCGGCCAA GGG ACC578Tyr C
ys Gin Gln Asn Asn Glu Asp Pro Leu T
hr Phe Gly Gln Gly ThrAAG CTG CAA 八T
CACA CGTG八GTへG八 AへTTAA八CTT へTGCTTCCT
C八 GTTGGATCC6R2
Lys Leu Gin Ile Thr1O
(2)配列番号 30の情報
(1)配列特徴・
(A)配列の長さ・ +11アミノ酸
(B)配列の型二アミノ酸
(D)トポロジー 直鎖状
(■)配列の種類・タンパク質
(xl)配列、配列番号、30
Asp lie Gln MeL Thr Gin Ser Pro Ser
Ser Leu Ser Ala Ser Val Glyl 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
Ser Glu Ser Val Asp Ser TyrGly Asn S
er Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Thr P
ro Gly Lys Ala Pr。
Lys Leu Leu lie Tyr Vat Ala Ser Asn
1.eu Glu Ser Gly Val Pro 5e■
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
Asp Tyr Thr Phe Thr Ile 5erSer Leu G
ln Pro Glu Asp Ile^la Thr Tyr Tyr Cy
s Gln Gln Asn AsnGlu Asp Pro Leu Thr
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin lie
Thrloo 105 110
(2)配列番号:31の情報
(1)配列特徴。
(A)配列の長さ、632塩基対
(B)配列の型、核酸
(C)鎖の数、−重鎖
(D)トポロジー・直鎖状
(11)配列の種類 DNA (ゲノミック)(ix)配列の特徴
(八)特徴を表す記号: CD5
(B)存在位置: 261..593
(xl)配列、配列番号+31
AへGCTTATGA ATATGCAAAT CCTCTGAATCTACA
TGGTAA ATATAGGTTT GTCTATACC` 60
C八AACAGAAA AACATGAGACCACAGTTCTCTCTAC
八GTTへ CTGAGCACACAGGACCTCAC1Q0
CATGGGATGG AGCTGTA丁CA TCCTCTTCTT GGT
AGCAACA GCTACAGGTA AGGGGCTC`C180
AGTAGC八GGCTTGAGGTCTG GACATATATA TGGG
TGACA八 TGACATCCACTTTGCCTTTCQ40
TCTCCACAGG TGTCCACTCCGACATCCAG ATG A
CCCAG AGCCCA AGCAGC290Asp lle Gln Me
t Thr Gln Ser Pro Ser 5erCTG AGCGCCA
GCGTG GGT GACAGA GTG ACCATCACCTGT AG
A GCCAGT 338Leu Ser Ala Ser Val Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
Ser+5 20 25
GAA AGT GTT GAT AGT TACGGCAAT AGT TT
T ATG CACTGG TACCAG CAG 386GIu Ser V
at Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met 1
(ts Trp Tyr Gin G1■
ACG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CTG CTG
ATCTACGTT GCA TCCAACCTA 434Thr Pro G
ly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr V
al Ala Ser Asn LeuGAA TCT GGT GTG CC
A AGCAGA TTCAGCGGT AGCGGT AGCGGT ACC
GAC482Glu Ser Gly Val Pro Ser ArgPhe
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr AspTTCA
CCTTCACCATCAGCAGCCTCCAG CCA GAG GACA
TCGCCACCTAC530Phe Thr Phe Thr lie Se
r Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Th
r TyrTACTGCCAG CAA AAT AAT GAA GAT C
CG CTCACG TTCGGCCAA GGG ACC578Tyr Cy
s Gln Gin Asn Asn Glu Asp Pro Leu Th
r Phe Gly Gln Gly ThrAAG CTG CAA ATC
ACA CGTGAGTAGA ATTTA八ACTへ TGCTTCCTCA
GTTGGATCC63Q
Lys Leu Gin lle Thr(2)配列番号 32の情報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ:111アミノ酸
(B)配列の型、アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(i i)配列の種類 タンパク質
(xl)配列:配列番号:32
Asp Ile Gin Met Thr Gln Ser Pro Ser
Ser Leu Ser Ala Ser Val Glyl 5、、、 10
15
Asp Arg Val Thr lle Thr Cys Arg Ala
Ser Glu Ser Vat Asp Ser TyrGly Asn S
er Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Thr P
ro Gly Lys Ala Pr。
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn
Leu Glu Ser Gly Val Pro 5erArg Phe S
er Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe T
hr Phe Thr lie 5erSer Leu Gin Pro Gl
u Asp lle Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gi
n 八sn 八5nGlu Asp Pro Leu Thr Phe Gly
Gln Gly Thr Lys Leu Gln lle Thrloo
105 110
(2)配列番号 33の情報
(1)配列特徴
(A)配列の長さ、54塩基対
(B)配列の型 核酸
(C)鎖の数 −重鎖
(D)トポロン−直鎖状
(11)配列の種類 DNA
(×1)配列 配列番号 33
CTGTCTCACCCAGTGCCAGCAATAACTACT ACTGT
TGATG GAGAAGCCAG ACAC54(2)配列番号 34の情報
(1)配列特徴
(A)配列の長さ 76塩基対
(B)配列の型 核酸
(C)鎖の数 −重鎖
(D)トポロジー、直鎖状
(目)配列の種類・ DNA
(xl)配列 配列番号:34
CATTGTCACT CTGCTTTTGA TGGATGGACT ATA
GTCTATT GAACCTTCAT AACATATGbG 60
TCCMATCCACTCAAGA 76(2)配列番号、35の情報
(i)配列特徴・
(^)配列の長さ:54塩基対
(B)配列の型 核酸
(C)鎖の数 −重鎖
(D)トボロノー:直鎖状
(i i)配列の種類: DNA
(xl)配列・配列番号・35
CCAGTAGTCCATAGAGGTCG TAGTACCATG GTTT
TCTCTT GMACAATAAT AGAC54(2)配列番号・36の情
報
(i)配列特徴
(A)配列の長さ:25塩基対
(B)配列の型 核酸
(C)鎖の数、−重鎖
(D)トボロンー:直鎖状
(11)配列の種類: DNA
(xl)配列・配列番号 36
ATGGTGAAGG TGTAGTCGGT ACCGC25(2)配列番号
37の情報
(1)配列特徴:
(Aン配列の長さ:26塩基対
(8)配列の型・核酸
(C)鎖の数、−重鎖
(D)トポロアー 直鎮状
(11)配列の種類: DNA
(xl)配列 配列番号 37
AGGTTGG^TG CAACGTAGAT CAGCAG 26(2)配列
番号・38の情報
(1)配列特徴
(A)配列の長さ 38塩基対
(B)配列の型 核酸
(C)鎖の数・−末鎖
(D)トポロジー、直鎖状
(11)配列の種類 DNA
(xl)配列、配列番号、38
CCGAACGTGA GCGG八TCへTCATTATTTTGCTGGCA
GTA 38(N
(g01099)班γ葡
(12NMO1
0F58/H3
0P4/DI0
@ KAb NN−010MAb O,5βモノクローナル抗体(μg/ml)
・MAb NM−010MAb O,5β、001 .01 .1 1 10
モノクローナル抗体(μg/ml)
・ KAb NM−01
、Of l 1 10 100 1000、01 .1 1 10 100
モノクローナル抗体(μg/ml)
モノクローナル抗体(μg/ml)
モノクローナル抗体(μg/mI)
、01 、+ 1 10 100
モノクローナル抗体NM −01(11,g/m l )、1 1 10 10
0 1000
モノクローナル抗体NM−01(μg/ml)、01 .1 1 10 100
1000モノクローナル抗体NM−01(μg/ml)、001.01 .1
1
6MIN □エエより*Z6
、−ぜ軸
寸
区
区
tフ
区
特表千7−502539 (26)
ト
区
、001 .01 .1 1 10
抗体の濃度(μg/ml)
抗体の濃度(μg/ml)
図22
フロントページの続き
(51) Int、 C1,6識別記号 庁内整理番号Cl2P 21108
9161−4B//(C12P 21108
C12R1:91)
(81)指定国 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IE、IT、LU、MC,NL、PT、SE)
、AU、CA、JP、KR,RU、 US
I