TWI227242B - Peptide composition for prevention and treatment of HIV infection and immune disorders - Google Patents

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1227242 A7 __B7_ 五、發明說明（1 ) 發明領域 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明針對作為免疫原之胜肽組合物之用途，包含於其 中之每一胜肽包括可辨識對HIV的寄主細胞受體/共受體複 合物之抗體的目標抗原部位。該複合物由化學增活素受體 (chemokine receptor)區域之CD4分子組成。目標抗原部位係 製成環狀形式，共價聯結到（1)經由化學偶合之載體蛋白質 ，或較佳以線狀並列方式，或較佳聯結至（2)化學偶合或較 佳為直接合成製成的胜肽輔助T細胞抗原表位及其他免疫 刺激胜肽序列。較特別地，本發明係關於此種胜肽組合物 作為免疫原，以在健康的哺乳動物（包含人類）引發高效價 抗体之產生，此抗体具有對抗得自HIV型1 ( HIV- 1 )及HIV型 2 ( HIV- 2 )之所有初級分離的廣效性中和能力。本發明亦關 於使用該胜肽組合物作為免疫原以預防及治療免疫缺陷病 毒感染以及治療如移植排斥、及自体免疫性疾病（例如：風 溼性關節炎、全身性紅斑性狼瘡及乾癬）之不欲免疫反應之 方法。 發明背景 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 自從HIV之發現及特徵化，儘管在14年中密集的研究疫 苗，主要的障礙仍存於HIV疫苗及免疫治療之發展。此等 困難包括HIV- 1之變異性、對於病毒結構之缺乏瞭解、及 對預防HIV感染之免疫反應缺乏暸解（見D. Burton及J· Moore ，Nature Medicine，1998，4:495-48)。美國政府之 AIDS疫苗研 究委員會之首長在1998年2月1日陳述用以預防AIDS之安全 性疫苗，距測試仍需多於10年之久，因對身体免疫系統運 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 B7 五、發明說明（2 ) 作仍有太多未知（http://cnn.com/HEALTH/9802/01/aids· vaccine search) 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 早期樂觀地認為有效之重組HIV- 1外膜次單元疫苗（例如 :gpl20及gpl60疫苗產物）提供取自數個臨床試驗之疫苗血 清可在體外中和HIV- 1之實驗室分離株（Belshe等人，J. Am. Med. Assoc·，1994，272 : 475 ; Keefer等人，AIDS Res. Hum Retroviruses，1994，10:1713)。但此樂觀因發現疫苗血清對 中和HIV- 1初級之病人分離株非常無效而動搖（Hanson， AIDS Res. Hum Retroviruses，1994，10 : 645 ; Mascola 等人，J Infect Dis.，1996，173 : 340)。此等失望的發現，造成國家衛 生院NIH)在1994年6月決定暫緩以重組外膜蛋白質為主之 HIV次單元疫苗之具成本且大規模的有效性試驗。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 目前HIV疫苗之研究集中於較一般實驗上所用之實驗室 菌株更接近於作為人類感染之類似HIV菌株的初級分離株 (Sawyer等人，J Virol，1994，68 : 1342 ; Wrin 等人，J Virol, 1995，69 : 39)。HIV- 1之初級分離株係藉含未感染之pbmCs 之病人PBMCs或血漿之限制培養而得到。初級病毒可藉下 列所討論者自T細胞株適應（TCLA)之病毒（例如：mb/LAI， SF2，及MN，其已在人類T _淋巴的細胞株存在一段時間且 已成為適應良好的生長於此等T細胞株）之表型而區別： (1) 不同於TCLA病毒，大多數初級分離株在T細胞株上並不 易於生長； (2) 不同於皆為合胞體謗導之TCLA病毒，初級分離株包含 在PBMC培養中謗導合胞體形成之合胞體誘導分離株（SI) -5· 尺度適用中國國家標ί (CNS)A4規格（210 X 297公釐） ' 1227242 A7 B7 五、發明說明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 及非合胞體謗導分離株（NSI)二者。在SI初級分離株之間 ，大多數可在特別的HIV-敏感τ細胞株MT2中複製，但 少部份可在常用於TLCA分離株培養之較少的允許T細胞 株如CEM或H9中複製。非合胞體謗導（NSI)之初級分離株 只在初離T細胞中複製。 (3) 初級分離株對於藉病毒受體蛋白質CD4( rsCD4)之重組可 溶型式在體外的中和能力具有高度抗性，它在中和反應 中較丁(^八菌株需要200-2700倍之1^€〇4分子才能被中和 (Daar等人，PNAS USA，1990, 87:6574-6578)。 (4) 初級分離對於中和藉使用gpl20(外膜）疫苗所引發之抗体 具有抗性。相反的，TCLA菌株則對於病毒外膜具有專 一性之抗体的中和能力具敏感性（Sawyer等人，J Virol， 1994，68 : 1342 ;及 Mascola等人，1996)。 初級分離株之表型特性係由於仍不甚暸解的HIV結構特 徵，特別是關於抗外膜抗體之病毒外膜之不易獲得的性質 (D· Burton及J· Moore，Nature Medicine，1998，4 : 495-498) 〇 病 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 毒之變異性，一種表型特徵，亦仍是發展廣效性HIV疫苗 之障礙（Mascola等人，1996)。此等因素一起說明針病毒性 AI D S疫苗（其係被發展用以對抗迅速生長之TCLA同型株） 之未預期的失敗。HIV疫苗發展之另一種方法可藉寄主細 胞在HIV受體上之交互作用，因此藉預防HIV避免結合至或 與敏感細胞融合而阻止感染。細胞導向之方法提供克服 HI V外膜之高變異性及表型歧異性的方法。 用於保護以免除HIV感染之細胞導向之方法係藉在SIV恆 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 B7 五、發明說明（4 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 河彌猴（rhesus macaque)模型，其顯示抗細胞抗體對保護以 免除感染具很大的貢獻之主動及被動免疫接種研究而被建 議。（Stott，Nature，1991，353 : 393)。此外，針對對抗 CD4 的單株抗体，用於MHC類II分子及用於HIV結合之初級受體 之T細胞受體，長久已知可在HIV- 1中和分析中抑制感染， 以相關於CD4抗原表位而並非相關於病毒株之方式（Sattentau 等人，Science，1986 ; 234 ·· 1120)。對免疫預防之特別相關之 細胞導向方法，抗-CD4單株抗體可藉初級分離株而有效的 阻礙細胞感染（Daar等人，Proc· Natl· Acad. Sci· USA，1990 ; 87 : 6574 ;及Hasunuma等人，J Immunol·，1992 ; 148 : 1841) o 其他有潛力且有效之細胞導向方法可用以針對目標化學增 活素受體CXCR4，CCR5，CCR2b及最近被辨識可作為HIV共 受體之 CCR3( Feng等人，Science，1996 ; 272 : 872 ;及Doranz 等人，1996 ; 85 : 1149)。此等共受體與CD4—起作用以引發 病毒外膜醣蛋白與寄主細胞膜之結合交互作用及逆轉錄複 製之進入後步驟（Chackerian等人，J Viro卜 1997 ; 71 : 3932)。 對於有效於HIV結合及融合之CD4及共受體之要求建議此等 分子之一或二者可為用於細胞導向策略以抑制感染之良好 目標。針對寄主細胞CD4/共受體複合物之抗体已顯示可影 響mV感染之結合及結合後步驟（Wang, WO 97/46697)。此等 抗体中和HIV之合胞體謗導（SI)及非-SI(NSI)菌株之病毒對 -細胞或細胞-對細胞之傳遞。可結合到CCR5之化學增活 素拮抗劑亦已顯示其有效於預防藉SI及NSI病毒之感染 (Simmons 等人，Science，1997 ; 276 : 276)。NSI 分離株之中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 B7 五、發明說明（5 ) (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 和作用係特別顯著的’因為NSI菌株相信係作為大部份HIV 傳遞及通常抵抗可中和TCLA分離株之抗HIV抗體。（Fauci ’ 1996)。針對HIV之細胞受體之試劑避免面對歧異性表型及 病毒外膜之高度變異性之需要，並另外提供對抗HIV_ 2及 SFV之潛在中和性活性（chen等人，J viro卜1997 ; 71 : 2705 ; Pleskoff等人，JViro卜 1997 ; 71 : 3259 ; WO 97/46697) 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 包括CD4及位於寄主T細胞表面之化學增活劑共受體的寄 主細胞受體/共受體複合物可促進病毒結合且進入寄主τ細 胞中，係在一共審查專利申請案（US S/N 08/657J49亦如W0 97/46697所公告者）中報導為用於中和抗體之有效目標。在 該申請案中，本發明人說明除了針對對抗細胞表面抗原複 合物之抗体株外，沒有其他抗細胞抗體引起對位於中和 HIV_ 1初級分離株之HPB_ ALL細胞的細胞表面抗原之反應 。具如述於該申請案之所欲性質之抗體可以抑制猴子被SIV 感染、重組於老鼠体内之人類免疫系統之在體内HIV_ 1之 感染、人類細胞被歧異性表型及基因型之HIV· 1初級分離 株之在體外感染及抑制人類細胞被HIV· 2之感染。包括與 化學增活劑共受體結合之CD4受體（CD4/共受體複合物）作 為用於保護性抗細胞抗體之標的。 對CD4/共受體複合物之抗細胞抗体較針對病毒外膜的抗 病毒抗体顯示對抗相關HIV菌株之中和作用具有效型式。 如共審查申請案（W0 97/46697)所示，針對HPB-ALL而製造 的單株抗体（Mab B4)具有對抗重組可溶性CD4( rsCD4)蛋白 質之中度反應性及強力結合至HPB- ALL細胞（即對CD4/共受 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（6 ) 體細胞表面複合物具專一性），被發現高度有效於中和HIV-1之初級分離株，但較無效於中和TCLA菌株。相反地，抗外 膜抗体顯示對TCLA菌株之較佳中和作用之可逆型式。 頃發現在體外之微溶菌斑分析（在小於10微克/毫升之濃 度）顯示MAb B4可中和HIV-1初級分離株。相反的，對於重 組體可溶CD4( r s CD4)具有高效價（> 5Log1G)專一性之多株抗 体則對於Η I V - 1初級分離株不顯示任何中和活性，儘管它 們具強Τ細胞結合活性。因此，與具純CD4專一性之抗體比 較，對於和細胞表面CD4/共受體抗原複合物具專一性之抗 体出現較佳的敏感性。藉抗-CD4/共受體複合物抗體之HIV 中和作用之廣泛特徵包括MAb Β4和其類似物MAb M2及 MAb B13之(WO 97/46697)。 因為細胞表面複合物於中介HIV感染之歧異性角色，抗 体對於CD4/共受體複合物之廣泛性中和活性之機制尚不明 瞭，如彼等抗體影響HIV感染之結合及結合後步騾之能力 所示（Wang，WO 97/46697)。CD4/共受體細胞表面複合物在 中介HIV感染及致病作用上扮演雙重角色：（1)對HIV結合， 細胞融合及被HIV進入作為T細胞表面受體；或（2)作為HIV 壓抑因子。 然而作為HIV感染之抑制之有效試劑，上述細胞導向拮 抗劑或抗體，包括對寄主細胞CD4/共受體複合物具專一性 之高度中和性抗体，不能作為預防性疫苗。它們是用於被 動免疫接種的試劑。為了有效用，此等試劑必須經常投藥 以維持足以完全佔據受體之血清之濃度。藉主動免疫謗導 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） J---1----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 ___B7_______ 五、發明說明（7 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對抗CD4/共受體複合物之主動抗自體抗體反應而作用之疫 苗對保護性免疫為較佳的。若可發展此種疫苗，將可藉少 量免疫原之不經常及便利的投藥以提供有效及長期之保護 ，免於感染。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 為有效性，此種疫苗的免疫原性成分必須真實地模擬位 於寄主細胞受體/共受體複合物上的相關部位，而足以引發 交互抑制性抗体，並能維持足以避免不利的免疫抑制之部 位專一性。藉合成抗原用於模擬之此類部位之辯識尚未被 藉中和HIV(包括具中和活性之抗CD4抗體）之可利用性抗細 胞抗體而揭示。例如，報導指出抗CD4單株抗体具有中和 能力（Burkly等人，J Immunol，1992 ; 149 : 1779)，以及 Wang (WO 97M6697 )報導具廣效性中和抗CD4/共受體之單株抗体 可辨認位於不易於複製之CD4上之不連續構形部位。此外 ，作為長重組體免疫原之部份之有利寄主細胞抗原目標部 位之複製不易於應用作為避免易受傷部位之精確知識的需 要的方法。大部份以CD4免疫接種而提而之抗體缺乏有用 之專一性（Davis等人，Nature，1992 ; 358 : 76)。例如：針對 rsCD4之高效價超免疫抗血清缺乏對HIV之初級分離株之中 和能力（WO 97/46697)。此外，用於T細胞抗原之廣泛區域 具廣泛反應性之抗体係預期為過度免疫抑制（相對於部位專 一性抗體（Reimann等人，AIDS Res· Hum Retroviruses，1997 ; 13 : 933)。此外，雖然CD4之廣泛圖譜研究已得到分子之結 構功能圖譜（Sattentau等人，Science，1986，234 : 1120 ; Peterson及 Seed，Cell，1988，54 : 65 ; Jameson等人；Science， -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（8 ) 1988，240 : 1355 ; Sattentau等人，J Exp. Med.，1989· 170 : 1319 ; Hasunuma等人，J Immunol，1992，148 : 1841 ; Burkly等 人，J Immuno卜 1992，149 : 1779 ; Davis等人，Natur，1992， 358 : 76)，此圖譜並不提供足夠準確之結構模型，用以預 期可複製作為合成性胜肽之易受傷的作用子邵位。用於 CD4之可利用模型並未揭示有用的以CD4為主之免疫原。 進一步，用於抑制HIV感染之有效試劑，先前討論的細 胞導向拮抗劑或抗體，如對寄主細胞受體/共受體複合物具 專一性之高度中和抗體，不是免疫原且不能作為預防性疫 苗。藉主動免疫謗導對抗受體/共受體複合物之主動抗自體 抗體反應而作用之疫苗，其經由少量免疫原之非經常且便 利之投藥而提供有效且長期保護而免於感染，係為較佳的 〇 為功效，此種免疫原組合物之免疫原成份必須包括B細 胞抗原表位，其真實的模擬位於寄主細胞受體/共受體複 合物之相關部位，或，若模擬的胜肽抗原表位不能辨識時 ，鄰近足以引發交叉抑制抗體（保留足以避免不利的免疫抑 制之部位專一性）。 由於先前報告之廣泛中和抗受體/共受體之單株抗体辨識 位於CD4上之不易於複製之不連續構形部位（WO 97/46697) 。而且，作為長重組體免疫原部份之有用的寄主細胞抗原 目標邵位之複製不易於應用作為避免對易受傷部位之精確 知識之需要的方法。例如：針對rsCi)4之南效價超免疫抗血 清係缺乏中和HIV初級分離株的活性（WO 97/46697)。用於 -11 - 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） ------------—----訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（9 ) CD4之可利用 3D模型（如http://www.pdb.bnl.gov /pdb.bin pdbids所 不者）並未揭示對寄主細胞表面CD4/共受體複合物之有用免 疫原。因此，目前依然需要具有效且安全的部位特異性之 CD4/共受體免疫原。 除了適當的部位專一性外，有效mv疫苗之受體/共受體 免疫原必須為高度免疫刺激性者，以引發保護的抗体反應 。此等免疫原也必須設計為能克服對自我分子所呈現之強 耐受性。因此，依然需要有足夠免疫效力之免疫原。 本發明之一目的為提供具有所欲部位專一性及免疫效力 ，可作為預防HIV感染之免疫原之胜肽組合物。 本發明之有用合成胜肽免疫原之經改良之免疫原性及適 當專一性係已經由用於合成胜肽免疫原的辨識及設計之眾 多万法之合併而完成。此等方法包括：（1)用於辨識有效之 高親和力目標抗原表位的有效程序；（2)以導人環狀限制的 方式來穩定在合成胜肽上的目標部位之構形特徵，而能與 天然分子產生最大之交互反應性；(3)增加Β細胞目標抗原 表位之免疫原性的方法，係將其與具廣反應性之濫交丁助 手細胞（Th)抗原表位結合；及（4)利用組合胜肽化學擴大τ 細胞抗原表位之類型之方法，且藉此進一步解決遺傳差異 性大之族群中之變異性免疫反應性。 合成性胜肽已被用於抗原表位圖譜以鑑定在蛋白質表面 之免疫顯性決定因子或抗原表位’而用於發展新疫苗及診 斷。抗原表位圖譜是使用一系列對應於有興趣蛋白質區域 的重疊胜肽，來定出參與抗體-免疫原之決定子交互作用的 12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） J -, --------^---------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（1〇 ) 部位。通常，抗原表位圖譜利用相當短之長度的胜肽以精 確地定出線性決定子。已知如’’ PEPSCANni抗原表位圖譜 之快速方法係基於上百個長8到14個胺基酸之重疊胜肽之 同時合成，並偶合至固體支持物。經偶合胜肽乃用來測試 其結合抗体之能力。此PEPSCAN方法在定位線性決定子是 有效的，但不能用於鑑定不連續作用子部位，如HIV受體/ 共受體結合部位，之模擬所需之抗原表位（Meloen等人，Ann Biol Clin, 1991;49:231-242)。一可選擇的方法是根據多個長度 範圍約15到60個殘基之一組相互套疊且重疊之胜肽。此等 較長胜肽可為確實的，藉一系列獨立的固相胜肽合成酶而 費力合成，而不是藉快速且同時的PEPSCAN合成法。所得 相互套疊及重疊之胜肽組可接著用於系統中之抗體結合分 析，如實驗免疫接種及自然感染，以定出最佳免疫顯性決 定子之長胜肽，包含簡單但不連續性的抗原表位。此方法 以 Wang對於 HTLVI/II(US 5,476,765)及 HCV(US 5，106,726)之免 疫顯性部位之圖譜研究例示，且它可用於篩選HI V中和性 抗原表位在gp 120序列上之精確位置（Wang等人，Science， 1991 ; 254 : 285-288 ) ° 胜肽免疫原一般較蛋白質具有彈性，所以不能維持固定 結構。因此，以環狀限制之導入穩定胜肽免疫原是有用的 。正確的環狀胜肽免疫原可模擬目標抗原表位的構形，並 藉此引發抗體對位於真實分子之部位的交互反應性。例如 ，位於真實抗原表位之迴圈結構可藉具優點位置的半胱胺 酸殘基之加入，接著藉經由硫氫基之環化作用而在合成胜 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） J.------------^衣--------訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 五、發明說明（11 ) 肽上較準確的複製（Moore，Synthetic Peptides之第2章：A User’s Guide，Grant，WH Freeman and Company 出版：New York ，1992，第pp 63-67頁）。 另一影響衍生自受體/共受體複合物胜肽免疫原之免疫原 性的重要因子為藉與寄主的輔助T細胞受體及類II MHC分 子反應之輔助T細胞抗原表位將該胜肽抗原表位呈現至免 疫系統（Babbitt等人，Nature，1985 ; 317 ·· 359-361)。由於製 造良好的胜肽·載體結合物有困難、多數抗體錯誤的對載體 蛋白質產生反應、以及載體謗導之抗原表位抑制作用，辅 助T抗原表位（Th)通常由伴隨缺點之載體蛋白質提供（Cease ，Intern Rev Immunol.，1990 ; 7 : 85-107 ; Schutze 等人，J immunol·，1985 ; 135 : 2319-2322)。或者，T 細胞輔助可藉包 含Th部位的合成胜肽刺激。因此，類II Th抗原表位稱為濫 交Th可引發足夠之T細胞輔助且可與本身無法產生有效力 胜肽免疫原的合成性B細胞抗原表位結合（US 5,759,551)。 設計優良之濫交Th/ B細胞抗原表位嵌合胜肽可在表現歧異 性MHC單元型之遺傳歧異性族群中的大部份成員中引發Th 反應且導致針對B細胞部位之抗體反應。濫交Th可藉衍生 自有效外來抗原，例如，麻疹病毒F蛋白質，B型肝炎病毒 表面抗原、及砂眼披衣菌主要外膜蛋白質（MOMP)，之特定 序列而提供。很多已知的監交Th已顯示在增強對應於一、 二、三…十胜肽荷爾蒙之弱免疫原性胜肽為有效的（US 5,759,551)。 濫交Th抗原表位的大小範圍由長度約15至40個胺基酸殘 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^----------------訂---------線· (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7 五、發明說明（12 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 基（US 5,759,551)且通常分享共同的結構特徵及含有特定目 標序列。例如，一共同特徵是兩性螺旋型，其為螺旋一面 具有疏水性胺基酸及周圍面具帶電荷及極性殘基之阿法 (alpha)-螺旋結構（Cease等人，Proc Natl Acad Sci USA，1987 ;84 : 4249-4253)。抗原表位通常包含額外的一級胺基酸型 式如Gly或帶電荷殘基加上2 - 3個疏水性殘基，其後再接上 一帶電荷或極性殘基。這種型式被稱為羅士拔（R〇thbard)序 列。而且，T h抗原表位通常遵守1，4，5，8規則，亦即 一個正價殘基後之第4，5及8位置接著疏水性殘基，此與 具有1，4，5，8位置位於同一面之兩性螺旋一致。因為所 有此等結構由一般疏水性、帶電荷及極性胺基酸組成，每 個結構可同時存在於一單獨T h抗原表位内（p a r t i d 〇 s等人 ，J Gen Vin>卜 991 ; 72 : 1293-1299)。大多數，並非全部的 ’>監叉T細胞抗原表位含有至少符合上述之一者。此等特 徵可併入理想之人工Th部位之設計。 衍生自外來致病原之濫交Th抗原表位包括，但不限於， 如貫例之B型肝炎病毒表面及核心抗原之輔助τ細胞抗原表 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 位（HBs Th and HBc Th)，百日咳毒素之輔助τ細胞抗原表位 (PT Th) ’破傷風毒素之輔助τ細胞抗原表位（TT Th)，麻療 病毒F蛋白質之辅助τ細胞抗原表位（Mvf Th)，砂眼披衣菌 主要外膜蛋白質之辅助T細胞抗原表位（ct Th),白喉毒素 之輔助T細胞抗原表位（DT Th)，鐮狀瘧原蟲環孢子體之輔 助τ細胞抗原表位（PF Th)，曼森氏住血吸虫三醣磷酸鹽異 構酶之辅助T細胞抗原表位（SM Th)及大腸桿菌TraT之輔助τ -15-

1227242 A7 B7 五、發明說明（14 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 可變性是為提供具結合至廣範圍Μ H C限制要素之能力之外 觀。SSAL特徵的淨作用是擴大人工Th之免疫反應性範圍 (WO 95/11998)。 以如上討論之胜肽技術和胜肽設計要素，即，精確之抗 原表位圖譜、環狀限制、及濫交Th抗原表位或理想化濫交 Th、以及理想化SSAL Th抗原表位之併入，而設計之胜肽 免疫原為本發明之對HIV之有效合成性受體/共受體複合物 疫苗的基礎。此類胜肽係較佳於適合目標及安全性，其由 於藉最適化定位及環化作用之HIV受體/共受體結合部位部 份之有效呈現，及較佳於免疫效力，其由於廣泛反應之Th 反應性。 發明概述 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之胜肽組合物包含一或多個以如上討論之胜肽技 術及胜肽設計要素而設計的胜肽免疫原。如此，胜肽組合 物為用於有效預防和治療HI V感染及免疫疾病之疫苗的基 礎。本發明之胜肽成份係較佳用於它們呈現中和自CD4之 CDR2-類似區域而來的受體/共受體作用子部位。此等胜肽 藉下列方式引發有效之抗体反應：（1)它們的最適部位專一 性，經由CDR2_類似區域之精確抗原表定位圖譜及對經由 環化作用之天然構形及限制構形之考慮，而得及（2)它們的 廣泛反應之T h反應性。 根據本發明，各自包含對應於位於CD4之CDR2區域之作 用子部位之二個胜肽序列之一的一或多個胜肽，或其免疫 功能同系物，係提供作為胜肽組合物。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（15) 此外，本發明胜肽之目標部位係經由化學偶合共價連接 到載體蛋白質而賦與更多免疫原性，或較佳經化學偶合或 較佳經直接胜肽合成而共價連接到合成的免疫刺激要素（如 濫交Th抗原表位）。已提供載體蛋白質和免疫刺激要素的 特殊實例，如鎖孔貝血藍蛋白（KLH)載體蛋白質、經修飾 的百日咳腸毒素A (PEA)、Th抗原表位（SEQ ID N0:6)及一般 的免疫刺激胜肽（如耶爾森氏菌之侵染素（Inv)胜肽（SEQ ID N0:7))。 本發明之完整合成胜肽可藉公式表示：

(A)n -(B)0 -(CD4-CDR2抗原胜肽）-X 或

(A)n -(CD4-CDR2抗原胜肽）-(B)〇 - (Th)m -X 或

(CD4-CDR2抗原胜肽）·(Β) 〇 -(Th)m (A)n - X 或

(Th)m -(B)〇 -(CD4-CDR2抗原胜肽）-(A)〇 - X 其中z 每個A各自為胺基酸或一般免疫刺激性胜肽； 每個B各自為胺基酸或其他化學聯結物； X是胺基酸a - COOH或a - CONH2 ; T h是輔助T細胞抗原表位或免疫增強同系物或其片段； ” CD4- CDR2抗原胜肽”為引發可與CD4表面複合物反應之 抗體之胜肽抗原； η是由1到約10 ; -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------------訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7 五、發明說明（16) m是由1到約4 ;及 〇是由0到約10 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的胜肽組合物包含自約30到約115胺基酸殘基的胜 肽免疫原，較佳為約40到約90個胺基酸殘基及更佳為約50 到約80個胺基酸殘基。 本發明之組合物視需要進一步包括佐劑及/或遞送賦形劑 和其他慣常併入疫苗調配物中的成分。本發明提供劑量指 示使得能產生針對目標CD4- CDR2作用子部位之免疫治療性 抗体。 本發明為第一次提供可在哺乳動物可以引發抗体之合成 性胜肽，其藉得自多類型之HIV初級分離株而預防性對抗 感染。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 對本發明之胜肽組合物的抗体反應藉由下列提供宿主對 抗HIV感染的預防及治療：（1)阻斷HIV結合至CD4-表現細胞 ;(2)阻斷CD4-表現細胞間之HIV謗導之合胞體形成；（3)藉 得自HIV型1及HIV型2之所有類型之初級分離株在体外有效 地中和CD4正細胞之感染；及（4)當寄主經投藥包含本發明 之胜肽組合物的疫苗調配物，可預防由HIV之初級分離株 之感染。 胜肽組合物係有效用於預防及治療由HIV- 1之所有類型 之初級分離株及HIV- 2第二型HIV之初級分離株之HIV感染 以及用於治療不欲之C D 4細胞中介之免疫反應如移殖排斥 ，及自體免疫疾病如風溼性關節炎、全身性紅斑性狼瘡及 乾癬。 -19 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 B7 五、發明說明（18) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 用病毒株是對具有病毒外膜專一性之抗体的中和作用敏感 ，但初級分離株則具抵抗性（Sawyer等人，JVirol，1994，68 : 1342 ; Mascola等人，J Infect Dis，1996，173 : 340)。 如此中所使用者，CD4是指被天然存在的CD4基因編碼的 任何CD4蛋白質。CD4最先敘述為輔助T淋巴球之細胞表面 標記。之後CD4被發現可分散表現於單核球、蘭格罕士氏 細胞、小神經膠質細胞及部份B細胞。CD4分子也被發現透 過其作為MHC類II分子上之受體之功能而直接參與抗原-專 一性輔助T細胞之活化作用。在1984年，人類CD4被發現可 作為 HIV病毒之受體（Dalgleish等人，Nature，I984，312 : 763)。HIV外膜_蛋白質gP120結合到CD4代表病毒進入目標 細胞之起始步驟。由Madd〇n等人（Cell ’ 1985 ; 42 : 93 ;及 Littman等人，1988 ; 55 : 541)所發表之人類CD4分子胺基酸 序列合併於此中且顯示於表1及SEQ ID : 1。 如此中所使用者”重組可溶性CD4"或” rsCD4’’是一個藉重 組微生物或包含人類CD4分子（圖1 ’ SEQ ID NO : 1)之A A !-AA375的細胞而表現的多胜肽。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如此中所使用者，π表面CD4複合物’’或’’包含CD4之表面 複合物’，是指出現於哺乳動物細胞表面之自然組成環境中 之完整性天然CD4蛋白質’它可與任何在一起的細胞膜蛋 白質結合在一起或形成複合物。 如此中所使用者’用語”免疫原’’係關於胜肽組合物’當 投藥到寄主，可謗導產生對抗呈現於CD4( SEQ ID N0S:2及 3 )上之CDR2區域的目標作用子部位之抗体’造成對抗得自 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） 1227242 A7 B7 五、發明說明（19) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) HIV型1 (HIV- 1 )及型2 ( HIV- 2 )之所有類型的初級分離株具 中和能力的高效價抗体。CDR2- CD4目標部位是劃線示於圖 1且如SEQ ID NOS: 2及3所列示者。 根據本發明，” CD4- CDR2抗原胜肽，，是指長度介於約25到 約50 ’較佳為約3〇到46之間胺基酸且包含藉插入28到40個胺 基酸殘基而分隔之兩個半胱胺酸胺基酸。插入序列可為以 SEQ ID NO: 1之殘基27到66所代表之任何連續部份序列， 或可為SEQ ID ΝΟ:1之殘基27到66之免疫原上功能同系物。 如此中所使用者，胜肽結合物是指包含CD4_ CDR2抗原月生 肽’以任意方法除了分子之直接胜肽合成，共價聯結到一 個Th輔助抗原表位胜肽之分子。CD4- CDR2抗原胜肽與Th抗 原表位胜肽共價偶合以形成胜肽結合物之實物為巯基-鹵乙 酸胺偶合，黢基_順丁烯二醯亞胺偶合，鐃基-鐃基鏈間雙 硫键形成及其類似物。 如此中所使用者”胜肽免疫原，，是指胜肽或胜肽結合物， 包含CD4_ CDR2抗原胜肽共價聯結到Th抗原表位胜肽，視需 要進一步包含一般免疫刺激性胜肽、聯結子及此中進一步 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 描述之間隔區；及具有引發抗CD4- CDR2抗原胜肽之抗体的 能力。 如此中所使用者，”同系物”是指實質上具有相同胺基酸 序列之胜肽’其保留性取代最高至約1〇%的胺基酸。保留 性取代為彼等其中一個胺基酸被另一個胺基酸所取代，較 佳自同一類（例如：疏水性、極性、帶電荷等），而不顯著 改變胜肤之性質。同系物也可具有胺基酸的插入或缺失， -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227242 A7 ___B7 五、發明說明（2〇 ) 但不顯著改變胜肽之免疫原性特性。同系物可由人工化得 到，或是在此所述之胜肽序列之天然存在的變異種。 免疫原上功能性同系物是指實質上謗導自免疫系統之相 同反應之同系物，例如：T -細胞反應性、B -細胞反應性， 或對抗所提供抗原之抗體的謗導。 本發明係針對作為免疫原之新穎胜肽組合物的使用途。 免疫原係藉主動免疫接種用於產生針對對抗位於哺乳動物（ 包含人類）CD4上之CDR2區域的作用子部位（SEQ ID N0S:2 及3 )之高效價抗体，可用於預防及治療免疫缺乏病毒感染 及用於治療不欲之CD4+細胞-中介之免疫反應如移植排斥 ’及自体免疫性疾病如風溼性關節炎、全身性紅斑性狼瘡 及乾癬。 經由使用專一性之CD4-反應抗体來預防及治療HIV感染 及免疫疾病之此類插入，亦即一種免疫治療，可被動地達 成，經由以針對位於CD4之CDR2類似區域部位之專一性 ” 針對部位n ( n site- directed’’）之抗体之預防治療。較佳的，如 此中所述，治療可經由主動免疫接種達成，係藉以包含本 發明之一或多個胜肽免疫原之組合物接種寄主。此等免疫 原引發寄主產生針對部位CD4- CDR2之反應性抗体，其具有 對抗得自HIV型1 (HIV-1)及型2 (HIV-2)之所有類型之初級分 離株之廣泛中和活性。一般相信主動免疫接種較被動免疫 接種提供較有效及長久持續之保護性。 位於人類CD4 (SEQ ID N0S:2及3 )的CDR2類似區域上之目 標部位是藉加入半胱胺酸殘基到N端及c端（SEQ ID N0S:4及 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） J---------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7 五、發明說明（21 ) 5 )而限制成環狀構型。此種目標部位也可包括 N0S:4及5之免疫原性同系物，其包含取自SEQ m n〇s:2及 3之一端點而來的丨到5個額外胺基酸，排除保留單一雙硫 鍵環型結構（SEQ ID NOS: 10及11)。 它們係藉化學偶合至載體蛋白質而進一步修飾成免疫原 f生CD4 CDR2抗原胜肽，例如：鎖孔貝血藍蛋白及經 修飾之百日咳腸毒素A ( pEA)。此種"CD4- CDR2抗原胜肽_ 載體蛋白質”為基礎之疫苗的缺點是（1)目標抗原部位之弱 免疫原性，此乃幾乎所有的自體抗原之固有的問題；（2)大 部份為針對對抗載體蛋白質之沒有功能的抗体；（3)載體謗 導之抗原表位壓抑之可能性。 因此，較佳的藉化學上定義之濫交Th及/或免疫刺激序 列，經由化學偶合或較佳經由直接胜肽合成，以給與胜肽 免疫原性。本發明之較佳免疫原使不相關抗體之產生最小 化以引發對”目標序列”之較集中之反應。所欲抗体具有對 P4表面複合物之反應性，而不會產生可對預防及治療my 感染及免疫疾病之免疫療法複雜化的不欲副作用。而且， 針對所欲部位之專一性抗体可藉濫交Th之使用而在遺傳歧 異性之寄主族群中較廣泛地產生。此等抗体反應導致高效 ^抗体’其具有對抗得自HIV型1 ( HIV- 1 )及型2 ( HIV- 2 )中 所有類型之初級分離株的廣泛中和活性。 本餐明亦針對使作為免疫原之胜肽組合物之方法以預防 及治療免疫缺乏病毒感染及治療不欲之CD4細胞一中介的 免疫反應如移植排斥及自体免疫性疾病如風溼性關節炎、 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線j 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 社 印 製

1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（22) 全身性紅斑性狼瘡及乾癬。 對包含CD4之寄主細胞表面受體/共受體複合物具專一性 之抗体，可與對rsCD4分子具專一性之抗体區別，可與免疫 系統以下列方法交互作用： 第一，它們可阻礙表現CD4之T細胞及其他活化之T細胞 、B細胞或單核細胞之間的交互作用，因為CD4與第二型 MHC分子間的作用會被阻斷； 第二，它們可傳遞訊息給T細胞，因此抑制正常CD4+T細 胞中介之免疫調節性功能； 第三，當藉T細胞受體分子之同時作用而推動時，它們 可謗導CD4表現細胞以自發性衰亡（apoptosis)的方式之細胞 死亡； 第四，它們阻礙CD4與HIV病毒間的交互作用，其抑制 HIV中介之免疫病理性。 針對包含CD4之表面複合物之抗体為預防及治療HIV感染 及HIV相關性疾病（包含AIDS)之良好候選者。一般而言， 針對表面CD4複合物之抗体可用於預防或治療由表現CD4之 T細胞中介之不欲之免疫反應，如移植排斥、及自体免疫 性疾病如風歷性關節炎、全身性紅斑性狼瘡及乾癬。 由本發明之胜肽組合物所產生之抗体性質係根據實例1 -3所得結果而摘錄於此： 1. 在ELISA分析中可結合到rsCD4 ; 2. 在免疫螢光分析中可結合到表現CD4之細胞； 3. 在體外之微溶菌斑分析中，可中和中和作用一抗性之 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） π--------------------訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（23 ) HIV初級分離株。 具此等特徵之抗体係特別有用於在人類預防及治療由初 級目標為CD4-正細胞之感染劑引起之疾病。因此，本發明 提供作為免疫原之胜肽組合物有用於預防及治療在人類由 初級目標為CD4正細胞之感染劑引起之疾病，尤其包含 AIDS的所有階段之HIV-相關性疾病。本發明也提供使用此 等抗体組合物的方法。 本發明之胜肽組合物包含併入對應於CD4之CDR2-類似區 域之目標作用子部位之二個胜肽序列之一（SEQ ID N0S:2及 3 )的胜肽免疫原，或其免疫上功能同系物。免疫原係藉對 抗得自CD4之CDR2區域上的CD4/共受體作用子部位之中和 性抗体之引發而特徵化。免疫原藉經由下列得到的最適部 位專一性廣泛性作用之Th反應之功效：（1)精確之抗原表性 圖譜；（2)考慮天然構形及經環化作用之經限制之構形；及 藉它們的廣泛反應性Th反應而引發保護性抗體反應。 更具體而言，目標部位係取自天然人類CD4序列之 C D R 2類似區域。人類CD4之胺基酸序列是得自Maddon等人 (Cell，1985 ; 42 : 93 ;及 Littman等人，1988 ; 55 : 541)且併入 此中並示於圖1及SEQ ID N0:1。CD4-CDR2目標部位是以劃 底線示於圖1且列於SEQ ID N0S:2及3。本發明之胜肽組合 物係較佳製成包含目標部位（SEQ ID N0S:2及3 )之合成性胜 肽，其中目標已藉自天然序列中位於或靠近其N端及C端插 入半胱胺酸殘基，而促進環狀胜肽的形成（SEQ ID N0S:4及5) 〇 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 5----1----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 _B7_ 五、發明說明（24 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之胜肽組合物也包括SEQ ID N0S:4及5之免疫原同 系物，其可包含取自SEQ ID N0S:2及3(SEQ ID NOS:10及11) 端點之一的1到5個額外之胺基酸，排除單一雙硫環型結構 係經保留。目標部位也可包括免疫原上功能同系物，其包 含範圍自約25到約50個胺基酸之環狀胜肽，具有衍生自SEQ ID NOS:2及3之連續胺基酸序列。環狀結構是本發明之必要 要素，包含目標部位之線狀部份之胜肽不引發對抗HIV之 初級分離株具中和活性之抗體。 此外，本發明胜肽之目標部位被賦予免疫原性係經由共 價聯結（經由化學偶合）到載體蛋白，或較佳經由化學胜肽 合成聯結到合成性免疫刺激要素，例如衍生自致病病毒和 細菌之濫交Th抗原表位、人工之濫交Th抗原表位及一般免 疫刺激性胜肽。以下提供數個載體蛋白質和免疫刺激要素 之特殊實例，例如：鎖孔貝血藍蛋白（KLH)載體蛋白質、 經修飾之白日咳腸毒素A (PEA)載體蛋白質、得自B型肝炎 表面抗原（SEQ IDNO:8)之T h、人工Th(如SEQ ID NO:6)及得 自耶爾森氏菌的一般免疫刺激性侵染素胜肽（Inv)(SEQ ID NO:7)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之完整合成性胜肽可以下式表示：

(A) n - (Th)m - (B)。- (CD4-CDR2 抗原胜肽）-X 或

(A)n - (CD4-CDR2 抗原胜肽） (B)〇 - (Th)m - X 或

(CD4-CDR2 抗原胜肽）-(B)。- (Th)m - (A)n X -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（25 ) 或

(Th)m · (B)。- (CD4-CDR2 抗原胜肽）-(A)G - X 其中 每個A各自為胺基酸，α _ NH2，或一般免疫刺激性胜 肽； 每個B各自選自下列胺基酸所組成之群： -NHCH(X)CH2SCH2CO-， -NHCH(X)CH2SCH2CO( ε -N)Lys-， -NHCH(X)CH2S 琥珀醯亞胺基（ε -N)Lys -，及 _NHCH(X)CH2S -(琥珀醯亞胺基）-; X是一個胺基酸a - COOH或a - CONH 2 ;

Th是輔助Τ細胞抗原表位或免疫增強同系物或其片段； 之” CD4-CDR2抗原胜肽”係如上所定義者，及較佳為 SEQ ID N04或SEQ ID N0:5，或其交叉反應性及免疫原上功 能同系物； η是由1到約10 ; m是由1到約4 ;及 〇是由0到約1 0 本發明的胜肽組合物包含約30到115個胺基酸殘基的胜 肽免疫原，較佳為約40到約90個胺基酸殘基及更佳為50到 80個胺基酸殘基。 當A是一個胺基酸，其可為任何天然存在或非天然存在 的胺基酸。非天然存在的胺基酸包含，但不限於，D -胺基 酸，冷-丙胺酸，ornithine，norleucine，norvaline，罗呈基脯胺酸， -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） T----1----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（28 胜肽的Th區域具有約10到約50個胺基酸，及較佳為自約1〇 到約30個胺基酸。當存在多個Th抗原表位（即m^2 )時，每 個Th抗原表位係各自為相同或不同。Th片段是Th抗原表位 的連續性部份，它足以增強或刺激針對CD4-CDR2抗原胜月大 (SEQ ID NO : 4及5 )及/或其免疫原上功能類似物的免疫反 應。 本發明的抗原表位包括彼等衍生自外來病原並提供作 為實例，但不限於，B型肝炎病毒表面及核心抗原輔助τ細 胞的抗原表位（HBs Th和HBcTh)、百日咳毒素輔助τ細胞抗 原表位（PT Th)、破傷風毒素辅助T細胞抗原表位（TT Th)、 麻疹病毒F蛋白質輔助T細胞抗原表位（MVF Th)、砂眼披衣 菌主要外膜蛋白質辅助T細胞抗原表位（CT Th)、白喉毒素 輔助T細胞抗原表位（DT Th)、肺氏黴漿菌環孢子體輔助τ 細胞抗原表位（PF Th)、曼森血吸虫三磷酸同型羑輔助τ細 胞抗原表位（SM Th)、及大腸桿菌Tra輔助TT細胞抗原表位 (Tra T Th)。以下所列之病原衍生之Th抗原表位係併入此中 參考：美國專利（us 5,759,551)中的 SEQ ID NOS:2-9 和 SEQ ID NOS · 42-52 ;披衣菌助手部位 pi 1 ( Stagg 等人，Immunology, 1993;79:1-9);以及HBc胜肽 50-69 (Ferrari 等人，J Clin Invest， 1991; 88:214-222)。

Th抗原表位進一步包含人工理想化的Th (如SEQ ID NO :6)，及其免疫原上功能同系物。功能上Th同系物包括免 疫增強性同系物，交叉反應性同系物、及此等Th抗原表位 上之任何片段。功能上Th同系物進一步在Th抗原表位上自 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） T I 衣--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（29 ) 1至約10個胺基酸殘基之保留型取代，增加、缺失及插入 ，其並不實質上改變Th抗原表位之Th刺激功能。 本發明之較佳胜肽免疫原是包含CD4-CDR2抗原胜肽（如 SEQ ID NO:4或5或其免疫原上功能同系物）及Th抗原表位之 胜肽，及視需要可包含一般免疫刺激性部位如Inv(SEQ ID NO:7)。在較佳具體實例中，Th抗原表位為衍生自外來病 原之 HBs Th、HBc Th、MVF Th、PT Th、TT Th、CT Th、或 HIV Th或理想化人工Th，或其功能上免疫原同系物。視需 要的，A是一般免疫刺激性胜肽，如Inv(SEQ ID NO:7)，較 佳經由Gly-Gly間隔區連接。 經修飾部位之結構係基於取自人類CD4之CDR2 —類似 區域之胜肽序列（SEQIDNO:l之27-66胺基酸），或取自另一 物種之同系序列，此CD4_CDR2目標部位係經下列修飾作用 (1 )在近N端加入或插入一個半胱胺酸殘基。 (2 )在近C端加入或插入一個半胱胺酸殘基，較佳為在或接 近位置66或同系位置，及 (3 )在經保留的半胱胺酸間形成一雙硫鍵以產生環狀結構 〇 胜肽結構也可包括取自CD4之27-66或39-66片段之一端 點之1 - 5個額外胺基酸，排除單個雙硫環狀結構係經保留 (SEQ ID NOS:10及11)。較佳的，在天然序列中不進行環化 作用之任何插入的半胱胺酸將以例如絲胺酸進行保留刑取 代。 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） ----------------衣--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 ____B7五、發明說明（30 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 例如，人類CD4-CDR2目標部位（SEQ ID NOS:2及3)係藉 由在或靠近N端或C端二者加入半胱胺酸（SEQ ID NOS:4及5) ，或經由在N -端加入c半胱胺酸及靠近C -端之半胱胺酸取 代而形成環狀（例如，在位置67以Cys取代Phe可得到SEQ ID NOS: 10及11)。具下列序列之經修飾，環化，及重疊之CD4- CDR2抗原胜肽係經實例提供： Cys His Trp Lys Asn Trp Asn Gin lie Lys lie Leu Gly Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Cys (SEQ ID NO. :4)

Cys Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Cys (SEQ ID NO.:5)

Cys His Trp Lys Asn Trp Asn Gin lie Lys lie Leu Gly Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin

Gly Asn Cys Pro Leu lie lie (SEQ ID NO.:10) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 及

Cys Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Cys Pro Leu lie lie (SEQ ID NO.: 10) 在此等實例中，經修飾之位置以黑体字來表示。 藉包含本發明之CD4-CDR2抗原胜肽之胜肽免疫原引發 之抗原係與包含CD4之寄主細胞表面受體/共受體複合物具 有交叉反應性，及可中和HIV之初級分離株。其他物種之 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1227242 A7 B7 五、發明說明（31 ) 表面CD4之對應目標抗原部位同樣可衍生自相關物種之同 系片段。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (SEQ ID N0:4，5，10及11)之交叉反應性及免疫抗原上功 能同系物CD4-CDR2胜肽抗原排除可引發與CD4-CDR2可進 一步包含保留性取代、增加、缺失或插入自一至約四個胺 基酸殘基，胜肽同型物針對胜肽（SEQ ID NOS:2，3，4及5)交 叉反應之免疫反應及具有對抗HIV初級分離株之中和活性 。保留性取代、增加及插入為彼等技術人士所熟知者，且 可以定義於此中之天然或非天然胺基酸而易於完成。 本發明較佳的胜肽免疫原為含有（1)環狀修飾之CD4-CDR2部位，在此稱為CD4-CDR2抗原胜肽（例如：SEQ ID N0:4, 5, 10及11)或其免疫原性同系物及（2) Th抗原表位胜肽 之胜肽。較佳胜肽免疫原為彼等含有下列之構築體：環狀 的CD4-CDR2抗原胜肽（SEQ ID NO:4, 5, 10及11)或其具交叉 反應和免疫原上功能同系物；間隔物（例如：Gly-Gly);選 自下列所組成之群之Th抗原表位：HBs Th、HBc Th、MVF Th、PT Th、TT Th、人工化的Th (如SEQ ID NO:6 )或其同系 物；及，視需要的，Inv區域（SEQ ID NO:7)或其類似物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明的胜肽免疫原可經由化學合成法（其為一般技藝 人士所熟知者）製造。見，例如Fields等人，Synthetic Peptides 中第三章：A User's Guild, Grant, W.H.Freeman & Co.出版， New York，NY，1992, 77頁）。因此，胜肽可使用以t_B〇c或 Fmoc化學之一保護α -NH2之自動化美利弗（Merrifieid)固相 合成技術，及使用商業可獲得之側鏈保護的胺基酸而合成 -34- 本I氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) -- 1227242 A7 B7 五、發明說明（32 ) 〇胜肽之適合儀器之實例為Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A or 431 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 完全組合所欲之胜肽免疫原後，依據標準程序處理樹 脂以自樹脂切斷胜肽及去保護位於胺基酸側鏈之官能基。 游離胜肽以HPLC純化及生化上特徵化，例如藉胺基酸分析 ，質譜儀及/或定序。胜肽純化及特徵化之方法是彼等技 藝人士所熟知者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 產生本發明之含有CD4及Th部位之胜肽構築體之其它 化學方法包括透過酼醚連接的形成而連接齒乙醯化及半胱 胺酸化的胜肽。例如，可添加半胱胺酸到包含Th胜肽的C 端，且半胱胺酸的銃基可用於共價鍵結至共價键連接於 CD4-CDR2抗原胜肽N端的親電子基（例如，N-(氯乙醯基） 或順丁烯二醯亞胺衍生之離胺酸殘基之α -或ε -NH2基）。 以此方法，可得到包含Th-(B)G-(CD4-CDR2區域抗原）或其可 逆物（CD4-CDR2區域抗原）-(B)〇 - Th胜肽，含或不含一般性 免疫刺激序列之胜肽結合物組合物，其中連接 子，Έ” 之一為-NHCH(X)CH2SCH2CO-，-NHCH(X)CH2SCH2CO( ε -N)Lys-，-NHCH(X)CH2S-琥珀醯亞胺基（ε -N)Lys-，或-NHCH(X)CH2S -(琥珀醯亞胺基）-。 本免疫原也可經聚合化。聚合作用可藉免疫原與交互 聯結劑反應而完成，例如，利用一般的方法來進行戊二醛 和離胺酸的-nh2基之間的反應。

由另一方法，合成胜肽免疫原可藉利用添加一額外的 半胱胺酸至免疫原N端而聚合化或共聚合化。半胱胺酸N -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（33 ) 、的銃基可被用於與離胺酸殘基（其連接至分支的聚一離胺 醯基核心分子之N端（例如K2K，K4K2K或K8K4K2K)的_乙酿 基一修飾的或順丁烯二醯亞胺衍生的α -或ε •胺基形成硫 _鍵。藉以和此免疫原亦可經由直接在分支的聚一離胺醯 基核心樹脂上合成所欲胜肽構築體而聚合成分支結構 (Wang等人，Science，1991 ; 254 : 285-288)。 或者，較長的合成胜肽免疫原可藉熟知的重組DNA技 術來合成。在DNA技術的許多標準手冊提供詳細流程以製 造本發明之胜肽。建構編碼本發明胜肽之基因，胺基酸序 列係逆轉錄成核酸序列，較佳使用用於基因將被表現之生 物之最佳化密碼。接著，合成基因典型地係藉合成編碼胜 肽及任何調節要素之重疊寡核苷酸而製得。合成基因係被 插入適合的轉殖載體並得到及特徵化重組體。胜肽接著在 適合於所選擇表現系統及宿主之適合條件下表現。胜肽藉 標準方法純化及特徵化。 如上所述之核酸其本身可用於作為稱為” Dna疫苗，，之 成份。在本發明之較佳具體實施例，本發明免疫原胜肽之 表現係#導於病患本身之細胞，藉導入編碼胜肽之核酸於 彼等細胞’較佳使用在人類細胞可最佳表現之DNA疫苗。 製備及使用DNA疫苗之方法係揭示於美國專利第 ，5,589,466 及 5,703,055 號，亦見於 97/02840 及 W. McDonnell 及 F. As kari，New Engl. J· Med.，1996，334 : 2-45， 其所有皆併入此中作為參考。此等製造及使用本發明胜肽 及胜肽結合物之方法係包涵於本發明之範圍内。 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） ! t --------^---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227242 A7

本發明胜肽組合物之功效之建立係藉注射動物，例如 ’天竺鼠，接著藉監測對CD4-CDR2抗原胜肽之體液免疫反 應作為中和HIV初級分離株之免疫血清之能力（如詳述於實 例者）。 本發明之另一觀點提供包括免疫上有效量之一或多種 本發明胜肽免疫原於醫藥上可接受遞送系統之胜肽組合物 。此等免疫原性組合物可用於預防及治療免疫缺乏之病毒 感染及治療不欲之由CD4-表現T細胞中介之免疫反應如移 殖排斥，及自體免疫疾病如風溼性關節炎，全身性紅斑性 狼瘡及乾癖。 因此，本發明胜肽組合物可使用佐劑、乳劑、醫藥上 可接受載劑或其它例行用於疫苗組合物之成份而調配成免 疫原性組合物。可用於本發明之佐劑或乳劑包括明礬、不 完全弗羅依特氏佐劑、力波息（lip〇syn)、皂角苷、鯊烯、 L121、依馬氏吉（emusigen)、單磷醯基脂質a(mpl)、qS2i 、ISA 206及ISA 720，及其它已知有效的佐劑及乳劑。此等 調配物可由一般技藝人士輕易決定及亦包括立即釋出及/ 或持續釋出之調配物，及用於全身性免疫之謗導及/或局 部粘膜性免疫之誘導，其可藉，例如，免疫原包埋或藉與 械粒子共同投藥而達成。本發明可藉任何方便之途徑，包 括皮下、口服、肌内或其它非經腸或腸途徑投藥。相似地 ’免疫原可以單劑或多劑投藥。免疫接種時程可由一般技 藝人士輕易決定。 本發明之免疫原組合物包含有效量之一或多個本發明 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐）

訂---------線在 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7 五、發明說明（35 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 之胜肽免疫原及醫藥上可接受之載劑。適當劑量單位形式 之該組合物含有每公斤體重約0_5微克到1毫克的免疫原。 當以多次劑量遞送時，可以方便地將每單位劑量分成適當 量。例如，起始劑量，如0·2_2·5毫克；較佳為以注射投藥（ 較佳為肌内）1毫克的本發明之胜肽組合物免疫原，接著再 用重覆（追加）劑量。劑量係與年紀，體重及病患之一般健 康狀況相關，為疫苗及治療技藝人士所熟知者。 包含二或多個Th抗原表位之本胜肽免疫原之疫苗可對 廣泛族群增強免疫功效及因此提供對CD4-CDR2抗原胜肽 (SEQ ID N0S:4及5)之經改良免疫反應。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 對本發明之合成性CD4-CDR2免疫原之免疫反應可藉如 述於O’Hagan (Vaccine，1991;9:768-771)所發表的用具生物分解 性的微粒子加以包裹來遞送，以改良其免疫反應。此免疫 原可加以或不加以佐劑而由生物分解性微粒子包裹，來引 發免疫反應，其中包含局部性黏膜免疫反應，特別是黏膜 邵位之過敏反應，此微粒子遞送方式也對於口服及局部之 服藥方式提供定時釋放以造成持續性或周期性免疫反應 (0 Hagan et al.9 1991; Eldridge et al.9 Molec. Immunol., 1991; 28:287-294)。 為了使本發明更容易了解，以下有四個例子。在這些 例子中，只用以敘述此發明，並非解釋此發明使用之範圍 限制。 實例 此等實例之目標抗原胜肽係藉概述於實例1之固相方法 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（36 ) 合成。每一胜肽可藉下式表示：（A)n(Th)m-(B)()-(CD4 CDR2 抗原 胜肽） 或 （A)n - ( CD4-CDR2 抗 原胜肽 ） - (B)。 - (Th)m ， 但其他前文所述之式也包含於本發明中。CD4目標抗原性 部位是由SEQ ID NOS:4, 5, 10及11例示的環狀胜肽，但包含 範圍自約25到約50個胺基酸之環狀胜肽，具有衍生自SEQ ID NOS:2或3之連續性胺基酸序列，及至多額外5個胺基酸 序列聯結到狀結構之N -端或C -端之一者的功能性免疫抗 原同系物係在本發明之範圍内。 用於此等實例之每一胜肽在Th及經修飾的CD4-CDR2目 標部位免疫原性要素之間具有作為（B)區隔區之Gly-Gly， 及一些併入包含Inv-Gly-Gly (其中Inv(SEQ ID NO:7)係偶合至 抗原胜肽（例如SEQ ID NOs:32-35 )之視需要的（A)3要素，但 本I明胜肤亦可具有其他間隔區（例如SEQ ID NO:9 )或不且 間隔區。如例示於表8之Th抗原表面包括衍生自外來病原 如B型肝炎病毒表面及核心抗原及麻療病毒ρ蛋白質（sEq ID NOS:8, 95-47, 38及39)之濫交輔助部位，及如示於表8之 其他Th抗原表位（SEQ ID NOS:13, 40-44，及48-58)及示於表9 义人工化Th(SEQ ID NOS:6, 12及36)。此例子中的胜肽也包 含視需要之一般免疫刺激性部位（SEq ID N〇:7)。而且，本 發明並不限於以lnv當作額外之免疫刺激性要素。 範例1 位於表面CD4 /共受體複合物的可能作用子部位之確認 Α·ΐϋ太設計： 人類CD4之所有4個區域内的部位與代表化學增活素受 本紙張尺度itlTf關家鮮（CNS)A4規格⑽； Ϊ---------------I----t--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -39- 1227242 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（37 ) 體之4個外接區域的共受體部位包括：CC-CKR1、CC-CKR2b 、CC-CKR3、CCKR5、及LESTR係經篩選以模擬胜肽的。如 藉MAb B4 (W0 97/46697)辨認的抗原表位為天然之構形，雖 然MAb B4與rsCD4的反應係在衍生自如示於W0 97/46697之 化學增活素共受體區域之特殊胜肽存在下而顯著增強，衍 生自上述受體/共受體之線性胜肽中沒有一個能夠與MAb B4強烈反應。 雖然MAb B4與任何單一 CD4或化學增活素共受體衍生 之胜肽缺乏強反應性，對衍生自CD4之各種區域胜肽认八^ A2〇，AA81_92，AA60_AA1〇9，AA118-AA165，AA235-251，AA297-AA351，〇r AA361-AA375)之弱MAb B4反應性係已檢測出。這提示了一個 不同的方法，其有助於設計能引發高度親合性抗體之合成 胜肽，與MAb B4辨認結構的臨近構形有反應，用於抑制目 標細胞之HIV感染。 此類散佈於CD4之4個區域及各種化學增活素共受體之 外接區域上之可能部位之序列係因此經設計並合成為目 標胜肽且藉由建構胜肽（其中衍生自HBsAg (SEQ ID N〇:8) 與Inv (SEQ ID ΝΟ··7)之濫交Th聯結到目標胜肽）而成為免疫 原（如表1與表2所示）。此等區域内之專一性CD4部位係經 篩選用以環化作用，其基於Brookhaven 3-維模型對於表面 暴露 之環狀 的人類 CD4 的 預 測 (http:www.pdb_bnl.gov/pdb.bin/pdbids)。特殊的環狀拘束加入 此等胜肽以最大化目標抗原部位與天然CD4分子間的交叉 反應。 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227242 A7 _____ B7 五、發明說明（38 ) 因此，表1及2中之數種合成構築體係以導入未存於天 然序列中半胱胺酸而合成，以產生雙硫鍵迴圈來模擬由 Brookhaven 3-維模型所預測的環狀結構。在某些情況下， 天然存在的半胱胺酸乃被絲胺酸取代，以避免不合模型 的構形形成。對化學增活素共受體衍生的胜肽，外接區 域2和3之胜肽（如表2右邊所示）間的交叉連結係經由透過 相對區域上天然存在的半胱胺酸殘基而製造以模擬它們 的自然結構。 在表1的說明攔中有星號標記的部位是專為環狀化所設 計。其它的胜肤為線狀。在表1及2中的格式欄中標記為 ”a”者只代表CD4或CCKR目標抗原部位。此等係用於 ELISAs中當作胜肽的受質抗原。而標記”b”的胜肽是與 HBs Th部位（SEQ ID NO: 8)而合成如縱列方式的目標抗原 部位。標記為ncn是nbn構築體的變異體，是如示於表i及 表2中的Inv區域免疫刺激胜肽（Seq id NO: 7)以縱列方式 合成的。命名為ndn的胜肽為b構築體的變異體，是呈縱列 方式與弟一 Th胜月大’ CT P11 Th (SEQ ID NO: 13)經由Gly_ Gly連接子連結到N端而合成。標記為”e”之胜肽係合成為 •’b”型的翻轉，Th部位位於C端及目標抗原部位在構築體 的N端。標兄為f’gn的胜肽代表分支的四聚體胜肽，直接 在聚離胺醯基核心樹脂上合成。標記為”x”的胜肽代表包 含組成為2個鏈結構，經由在相對鏈上自然存在的光胱胺 酸殘基產生的内部雙硫鍵而連結。 其它用於示於表1及2的實驗中的Th部位（此處未顯示） -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） -----i-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227242 A7 _B7 五、發明說明（39 ) ，使用人工的 Th 部位 nl，4,9 PALINDROMIC”（SEQ ID NO:6) 與 nSyn Th(l，2,4)n(SEQ ID NO:12)。含有位於 C 端的 Inv 位置 及位於N端（CD4-CDR2抗原胜肽-GG_Th-GG-Inv)之胜肽亦經 製得，但未沒有顯示出。 用於表1及表2研究中的nbn、’V’、Mdn、V’、πχ”及”其它 ’’ Th免疫原胜肽也是用Gly-Gly間隔區自Th部位分開目標 抗原部位，及自Inv或自第二Th免疫刺激序列分離Th。所 得胜肽免疫原係經篩選以其引發具下列性質之經免疫接 種的寄主抗體而作為候選的目標抗原部位： 1 .在ELISA分析中，與目標抗原部位結合； 2 .在ELISA分析中，與rsCD4結合，例如：CD4衍生的抗 原胜肽； 3 .在免疫螢光分析中，與表現細胞表面受體/共受體複 合物（包含CD4 )的T細胞結合；及

4 .在體外微溶菌斑分析中，中和中和作用-抵抗之HIV 初級分離株。 B .篩選候選的目標抗原胜肽： 1 . CD4 -與化學增活素受體衍生之目標抗原胜肽之合成： 在表1及表2列出的胜肽，代表’’a”、’’b”、”c”、’’d”、"en或 ’’xn型，以美利弗德（Merrified)固相合成技術個別合成，使 用生物系統自動胜肽合成儀（型式430，431，433A)與Fmoc 化學。用於人工T細胞抗原表位n(l，4,9 PALINDROMIC)Thn (SEQ ID NO:6)之包含結構合成抗原庫（SSAL)之胜肽免疫原 的製備係藉提供在所給之可變位置用以偶合之可選擇性的 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^L-----------------訂·--------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 ------------- 五、發明說明（40 ) 胺基酸混合物，在適當比例作為SEQ ID N〇:6之特殊設計而 元成。具有用於B細胞目標抗原部位或其它ssal Th部位庫 設計之SSAL胜肽可以類似方式合成。完成所欲胜肽之組合 後，依照標準程序使用三氟醋酸處理樹脂以切斷樹脂上的 胜肽’及去除位於胺基酸側鏈上之保護基。針對環狀的胜 肽，切下的胜肽置於15% DMSO於水中48小時，以助於半 胱胺酸間之鏈内雙硫鍵之形成。經切下，萃取及清洗之胜 肽係藉HPLC純化及藉質譜儀與逆相HPLC特徵化。 2 _里於功能的效果與許估之CD4及化輋受體衍峰夕 目標抗原位置之春一性免疫血清的產峰： 胜肽組合物之免疫原功效係藉概述於下之實驗免疫接 種，接著藉抗體反應之血清學分析而評估。 標準實驗設計： 抗原：（1)個別的胜肽免疫原·，或（2)包含在每一流程中 界定之相等莫耳比例之胜肽免疫原之混合物。 劑量：除非另有特別規定，每次免疫接種為1〇()亳克於 0_5毫升。 ' 路徑··肌肉注射（除非有特別規定）。 佐劑：（1)弗羅依德氏（Freund’s)完全佐劑（CFA) /不完全 佐劑（IFA)。 (2) 0.4%明礬（氫氧化鋁）；或 (3) 其它特定的佐劑。每組每免疫原配一佐劑。 藥劑時程：0，2，與4週；或0，3，與6週；或是其它 特定週數。CFA/IFA組於第0週接受CFA及隨後的幾週接受 -43- !-------------- —訂--------- 線_ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227242 A7 _B7_ 五、發明說明（41 ) IFA。明礬或其它特定佐劑的群組對所有劑量獲得相同調 配物。 抽血時程：第0，3，6，與8週或其它特定的週數。 實驗品種：Duncan Hartley天竺鼠。 群組大小：3隻天竺鼠/組。 分析：特定的ELISAs用於每一免疫血清的抗胜肽活性。 固相的受質為對應之目標抗原胜肽之nan型（例如：，CD4目 標抗原胜肽，化學增活素受體衍生的胜肽，等等）。 收集血液並處理成血清，及藉含目標抗原胜肽之ELISA 滴定前貯存之。 3.血清與抗體： 下列血清試劑，衍生自天竺鼠、鼠科或人類化單株抗 體的免疫血清係用於數種血清試驗中的評估。所有針對對 抗rsCD4，CD4與化學增活素共受體衍生的目標抗原部位的 天竺鼠血清例如上述接種免疫後在不同時間點取得。其他 血清試劑則得自先前的研究或如前所述的外來資源。此等 可併入作為比較目的。 例如，gp抗-gpl20 V3 MN (抗-V3 MN)為取自經對應於 HIV-1 MN之gpl20的高可變性的V3區域之合成胜肽抗原進 行免疫接種的天竺鼠的混合血清（Wang等人，Slience，1991， 254:285-288)。Gp抗-gpl20 V3庫血清為取自以代表將近1013 種可能的HIV-1 V3序列的SSAL (抗-V3 SSAL )之胜肽之複合 混合物免疫接種的三隻天竺鼠之混合血清。用於天竺鼠免 疫接種的V3 MN及V3 SSAL免疫原是多分支V3合成的胜肽 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----L------------I----訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7 五、發明說明（42 ) 免疫原，其係用於產生具有對數種HI V-1之實驗室病毒株之 中和活性之多株抗體，如述於Walfield等人。（J/A? (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 之第 18 章，出版：Koff 等人 Marcel Dekker: New York ，1993，第 345-360 頁.） 另一抗-gpl2〇抗體是命名為IgGl bl2對CD4之gpl20結合 部位具專一性的重組人類單株抗體（抗-gpl20 CD4-BS)(Burton 等人，，1994，266:1024-1027). IgGl bl2 係 經產生如製備自長期無症狀之HIV_ 1正血清患者之骨髓之抗 體-噬菌體顯示庫的Fab片段及藉轉殖重組DNA IgGl表現載 體而轉變成全人類抗體。因此’它被視為用於中和歧異性 HIV初級分離株之抗體的π黃金標準’’。（Burto等人，supra) 〇 4.抗胜肽的ELISA分析： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 抗胜肽抗體的活性係藉ELISAs (酵素結合免疫吸附分析 )使用已塗覆作為免疫吸附之對應的”an型目標抗原部位胜 肽塗覆之96孔平底微量滴定盤測定。定量（100微升）的目標 抗原胜肽溶液（濃度5微克/毫升）在37°C下培養1小時。平 盤在37°C以3%明膠/ PBS溶液之另一培養1小時中止反應 。中止反應之平盤接著晾乾並用於分析。定量（100微升）的 待測免疫血清，起始以1:100稀釋度於樣品稀釋緩衝液及10 倍連續稀釋，添加至胜肽塗覆之平盤。平盤在37°C下培養1 小時。 用0.05% PBS/TWEEN緩衝液沖洗平盤6次。添加以結合 物稀釋緩衝液（含〇·5 M NaCl及正常山羊血清之磷酸緩衝液） _ 45 - ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） " 1227242 A7 B7 五、發明說明（43 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在適當稀釋度之100微升以山羊-抗一種專一性抗體標記之 辣根過氧化酶。平盤在上述沖洗前在37°c培養1小時。接著 添加定量（100微升）的鄰一伸苯基二胺受質溶液。藉添加50 微升2N H2S04中止酵素性顏色反應前，允許顏色發展5-15 分鐘。以平盤讀取儀讀取每孔中内容物之A492值。ELISA效 價，如稀釋比例倒數的Log1G所示，根據吸收度之線性回歸 分析計算（A492的臨界值設定在0.5)。臨界值為精確的如用 於每回試驗之經稀釋正常天竺鼠控制樣本之值不低於0.15 〇 5 .測定和rsCD4及CD4-表現細胞作用之抗体的反應性： 5.1以rsCD4 ELISA測定抗CD4的反應性： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 純化的重組可溶性CD4(rsCD4)係得自商業來源（American Bio-technologies，Inc· Cambridge，ΜΑ)及 NIH (USA) AIDS Research and Reference Reagent Program o rsCD4 ELISAs 係藉 0.25微克/毫升之rsCD4 (每孔（含10毫莫耳濃度NaHC03緩 衝液，pH 9.5 )使用100微升）塗覆96孔微滴定盤在40°C培養 過夜而進行。塗覆rsCD4的微孔以250微升的3%以重量計之 明膠於PBS在37°C下培養1小時以抑制非專一性蛋白質結合 部位，以PBS (含0.05%以體積計之TWEEN 20)沖洗3次並接 著乾燥。

除非另有指明，免疫血清或單株抗體係以含20%以體 積計之正常山羊血清，1%以重量計之明膠及0.05以體積計 之TWEEN 20之PBS在1 : 20體積對體積之稀釋度連續稀釋。 每孔添加100微升的以山羊抗-鼠IgG或山羊抗-天竺鼠IgG -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 ________Β7 五、發明說明（44 ) 標記之辣根過氧化酶（1 : 1000稀釋於1 %以體積計之正常山

羊血清，0_05%以體積計之TWEEN20(於PBS中））並在37。C (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 下培養15分鐘。孔以〇·〇5%以體積計之TWEEN 20 (於PBS中 )清洗6次以去除未結合之經標記抗體結合物及以1〇()微升 之含有0.04%以重量計之鄰伸苯基二胺（〇pD)及〇 12%以體 積計之過氧化氫（溶於擰檬酸鈉緩衝液，pH 5.0 )反應15分 鐘。反應藉添加100微升1.0莫耳濃度之H2S04終止並測定在 492 nm(A492)之吸收度。倒數之L〇g1G抗體效價係經計算表示 每一受測樣品之終點反應性，以線性迴歸之插入法，如述 於抗胜肽ELISA者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5·2以間接免疫螢光染色法測定CD4表現細胞之反應性： 每孔含0·5χ106個CD4表現細胞（例如：HPB-ALL，MT2或 SUP-ΤΙ細胞株）先以含1% BSA之PBS沖洗2次，然後以經設 計的免疫血清或單株抗體，在如每一實驗測得之最適濃度 下’於室溫下培養45分鐘。細胞以一級染色抗體培養後， 細胞以相同的沖洗緩衝液額外沖洗2次並以二級螢光異硫 氰酸鹽（FITC)-結合的山羊抗-鼠igG或（FITC)-結合的山羊抗 -物種專一性IgG試劑，在適當稀釋度（Cappel，malvern PA)， ^ 於室溫下另外培養45分鐘。經染色細胞以相同的沖洗緩衝 液再洗一次及細胞經處理藉細胞螢光圖譜及/或免疫螢光 顯微鏡進行螢光分析用於測定經染色細胞之百分比及染色 強度。 5 * 3 ;接免疫螢光抑制分柄: 對於應用間接免疫螢光染色技術來測定競爭性”生物素 -47- 本紙張尺錢中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1227242 A7 B7 五、發明說明（45 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 化的單株抗體B4-T細胞π結合抑制，細胞首先以干擾劑或 適當的稀釋免疫血清培養及添加生物素化之單株抗體Β4之 前以相同沖洗緩衝液沖洗2次。完成CD4_表現Τ細胞之染色 係藉以適當稀釋之FITC-抗生物素蛋白之隨後培養，在藉細 胞螢光圖譜或高解析度螢光顯微鏡分析前接著藉額外的三 次清洗。 6 .以抗體中和病毒之測定 · 6.1. 細胞·· 人類T細胞株MT-2(ATCC 237)是培養在補充如前所述之 15% 胎牛血清之 Du becco’s modified Eagle 培養液，（Hanson 等 人，J Clin Microbio卜 1990，28: 2030-2034)。取自 HIV-1 負血 清型供者的周圍血液單核細胞（PBMCs)，是以Ficoll-Hypaque 梯度分離法而分離自新鮮的血沈棕黃層（Organon Teknika Corp.，Durham，NC)。所得 PBMCs 以 0.5% PHAP(Difco Laboratories，Detroit，MI)刺激。3 至 4 天後，移除含 PHA-P 的 培養液及細胞培養在含15%胎牛血清，900微克/毫升麩胺 酸，抗生素與 5% 干擾素-2(Cellular Products，Inc.，Buffalo， NY)之RPMI培養液。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6.2. 病毒·· HIV-1 MN是可利用的TCLA株及當作一持續感染的H9細 胞培養，它來自 National Institutes of Health，Bethesda MD(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog no. 402)， 其係製備自無細胞的濃縮液。HIV-1的初級分離株係製備自 藉由PBMC共培養之病患的PBMCs。初級分離株的保存培養 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 B7 五、發明說明（46 ) (請先閱讀背面之注音心事項再填寫本頁) 係製備自不超過PBMCs 3-5次的世代，而且由離心分別。 (Sawyer 等人，J Virol，1994，68:1342-1349)·它們是由 Carl Hanson of the California Department of Health Services, Berkeley CA提供的。 6.3 . MT-2微溶菌斑的中和作用分析： HIV-中和抗體效價之測定使用含固定量HIV之連續稀釋 血清或抗體預培養，接著藉HIV-敏感MT-2細胞感染及形成 顯示HIV-謗導之微溶菌斑之細胞單層。分析僅適合於SI分 離株，不管是TCLA或初級分離株，因為微溶菌斑代表由 MT-2細胞與HIV感染細胞點融合成的巨大合胞體。分析適 合於評估病毒-至-細胞或細胞-至·細胞間傳遞之抑制，因 為合胞體之抑制是起因於抗體對HIV顆粒或HIV感染細胞的 作用；即，該分析測定病毒-至-細胞HIV謗導融合或細胞_ 至-細胞HIV-謗導融合二者之抑制。接著藉由微溶菌斑的減 少一週後的propidium iodide染色的蚀斑的計數得知觀祭中 和作用（參見 Hanson 等人，J Clin Mivrobiol，1990，28: 2030- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2034)。在此分析中，病毒及血清或抗體係稀釋成在50%的 混合，去纖維化的正常以使人類血漿任何非專一性的增強 或抑制效應無效。 結果= 用於免疫原性及先前功能上研究之候選的CD4-或化學 增活素共受體衍生之目標抗原部位及胜肽係描述於表1及 表2。除了表3與表4特別提及外，天竺鼠係如上所述以目 標抗原邵位的’’b’’與’’c’’形式來免疫接種，以述於實驗步驟 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（47 ) 中的抗胜肽ELISA及rsCD4 ELISA分析收集於起始免疫接種 後第6或8週之免疫血清。 如表3及表4所示，大部分的CD4-及化學增活素共受體 衍生的胜肽免疫原具高度免疫原性，如它們引發具2_5至75 Log1G效價範圍之抗胜肽抗體，胜肽pl590b，pl699b，pl699c 及 pl700b除外。含有CD4 受體之（如pl612c，pl678b，pl678c ，pl686b，pl697b，pl817b，pl889b 與 1901b)長片段的 CD4 衍 生之抗原部位與一些環狀的目標部位能與rsCD4具高交叉反 應性，如其在抗rsCD4 ELISA中>3.5 log10效價（見表3，A2列 )。RsCD4與每一胜肽構築體的交叉反應性並不是可預知的 。再者，此種rsCD4交叉反應性不會擴大至對應的宿主表面 CD4分子（在彼等具有高rsCD4交叉反應性之胜肽構築體間 ，藉間接免疫螢光染色HPB-ALL或MT2細胞株時，只有 pl697b及pl901b被發現與CD4表現T細胞具有強反應性（表3 ，B 列）。 相反地，衍生自具環狀結構的CD4目標抗原部位胜肽（ 如 pl472b，pl472c)或衍生自 CDR2 區域（如 pl403b，pl471c) 的血清係A與CD4表現T細胞具高度反應，雖然它們與 rsCD4具低交叉反應性（表3，Β列）。對化學增活素共受體 而言，發現衍生自胜肽構築體pl990，pl999，p2028，p2047， p2048，p2049，p2087與p2089 (大部份具有得自共受體之區域 1、3及4)的血清與表面受體/共受體複合物（表4，B列） 會有反應。 以上的結果顯示，與rsCD4或表面受體/共受體複合物 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------衣--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 五、發明說明（48 的交叉反雜是複雜且未預期的現象，會受到構形的影響 ，其只能從實驗的觀察去推斷。 請 線 得自上述胜肽構築體的免疫血清（在免疫接種後第6或8 週）係由如上所述之微斑中和作用分析而㈣對抗⑽B之 ΗΠΜ原始分離株VL135具中和活性者。雖然在—些免疫血 清中，存有與rSCD4或”表面CD4/共受體複合物，^胃_ 交叉反應性之抗體，但此類中和抗體均未顯示顯著濃度（表 3及4，C列）。與CD4_表現T細胞具明亮免疫榮光染色模式 的免疫血清係進一步評估其抑制或阻礙MAbB4結合至cd4_ 表現T細胞之能力以找出藉祕則辨識之接近構形抗原表 位之不連續部位的可能作用子部位。從此等實驗結果可提 供新穎胜肽免疫原之有效設計的線索。抑制藉牵涉”祕 B4_T細胞”結合之免疫勞光染色的實驗而完成評估。CD4+ 目標T細胞（例如：MT2T細胞）係以適當稀釋（如1:1〇)的免疫 血清預培養，接著以生物素化的MAb B4與FITC•結合的抗 生物素蛋白培養，步驟如前所述。 智 局 員 工 消 費 合 作 社 印 在所有被評估的免疫血清中，只有透過以衍生自CD4_ CDR2區域之胜肽pl471c的免疫種種的血清被發現具MAb 的結合抑制性（表5)。在與化學增活素共受器衍生的胜肽 的免疫作用裡，無一能干擾” MAb B4-T細胞，，的結合。 MAb B4_T細胞”的結合抑制的缺乏係部份關於對可能作用 子部位之抗體低於最適的親和力，及可能不僅限於以目標 抗原部位代表之部位與由MAb B4辨識之部位間的空間距離 I__ -51 - 張尺度適_ _準（CNS)A4規格⑽χ挪公爱 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（49 ) 在所有血清裡，有一直接對抗受體及共受體胜肽的超免 疫血清無法抑制MAb B4結合到T細胞，且沒有任何顯示對 HIV初級分離株之中和活性。基於CD4序列上pl471的位置 ，藉’’ MAb B4-T細胞結合f’抑制研究所提供的線索，進一步 試圖設計目的是要捕獲座落在表面CD4分子上的有效位置 的新胜肽構築體。 更特別地，重新考量包含圍繞在CD4-CDR2區域之自20 至75之胺基酸殘基（根據SEQ ID ΝΟ:1之計數系統）之胜肽及 覆蓋此區域之額外胜肽構築體係藉在衍生自CDR2區域之胜 肽（具30至45胺基酸大小範圍之環）的N及C端插入半胱胺 酸殘基而重新設計成特別強調保存此區域之3D結構者。衍 生自此區域的代表性胜肽構築體的胺基酸序列係示於表6 〇 在起始免疫接種後第6或8週收集的免疫血清也是以相 似於前述之篩選而評估。在經評估的41個目標抗原部位間 ，p2057，p2189，p2190 與 p2240(SEQ ID NOS:4, 11，10,與 5)， 如'V’構築體（SEQ ID NOS:32-35)，被發現引發直接對抗HIV· 1分離株之中和抗體（表6 )。單離的VL 135 (表6 ) (Sawyer等 人，J. Virol.，1994, 68:1342-1349)為代表性的抗中和作用之 初級分離株。它並不是一非典型的用以提供明顯但誤解為 正的中和作用-敏感的初級分離株（D· Burton及J· Moore， Nature Medicine, 1998，4:495-48)。因此，此處觀察到的病毒 中和作用不是一容易被中和化的病毒之去活性，但為藉 HIV之廣泛分離物攻擊之保護性免疫之證據。在過去的 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1--L-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（50 ) AIDS研究領域，並沒有明確的一免疫原能夠引發具標準 HIV中和作用功能之抗體。儘管缺乏MAb B4與任一 CD4-CDR2區域部位胜肽的結合活性（如示於共審查中的專利申 請案（公告於W0 97/46697 ))，此處已說明CD4-CDR2目標部 位鄰近這些散置不連續的抗原表位，其組成用於中和單株 抗體B4的辨識部位。此辨識部位含有得自CD4的所有四個 區域的胜肽部位，可能由於f’包含CD4之表面受體/共受體 複合物π之彎曲性質，藉MAb B4辨識。此”表面CD4 ”可與 已知擴大的rsCD4的3維模型區分。值得注意的是只有衍生 自CD4-CDR2區域的特殊目標抗原部位，即彼等延伸較廣大 區域並呈現如環狀胜肽者（如p2057c，p2189c，p2190c與 p2240c，SEQ ID NOS:32_35 )，引發此等中和抗體。 實例2 由胜肽p2057c與p2240c產生的超免疫血清說明 對抗多種初級HI V之廣反應性中和抗體 如表7所示，衍生自以胜肽免疫原p2057c與p2240c (SEQ ID NOS: 32與35)起始免疫接種後第15與12週所得血液之超 免疫血清，二者說明對抗多種HIV初級分離株之顯著90% 中和抗體效價（以對應於藉MAb B4說明之模式）。中和抗體 效價範圍為增加的級數，對於D，A，B (DH12)，E到B (VL 135)與C (是針對p2057c的免疫血清，SEQ ID NO:32)係自 1:20 到 1:185 ;對於亞型D，B(DH12)，A，E到 B(VL 135)(是 針對p2240c的免疫血清，SEQ ID NO:35)係自1:20到1:324。 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） „—^-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（51 ) 為測定當量值之目的，要中和D，A，E，C，B (DH12)到B ( 初級分離株VL 135 )的HIV-1初級分離株的MAb B4的範圍是 從25.6微克/毫升到1.54微克/毫升。比較之下，針對N端 gpl20 V3區域的天竺鼠血清及針對HIV-l MN (MAb 50.1) gpl20N端的V3區域或較少變異構形的gpl20 CD4結合位置 (MAb IgGl bl2)的單株抗體無法中和任何此等抗中和作用之 HIV初級分離株。如說明於表7者，抗p2057c與抗p2240c免 疫血清（針對HIV A到E型的初級分離株可提供90%的中和 作用）的1:20到1:300稀釋度為近似MAb B4在約300微克/毫 升之未稀釋血清濃度（數值得自當量中和活性的血清稀釋濃 度與MAb B4濃度之計算（即，MAb B4的平均濃度（微克/毫 升）X用於對抗每一對應分離物之中和活性的免疫血清稀 釋係數）。 實例3 在具有保護恆河彌猴對抗SIV mac251感染功效的血清中， 中和抗體效價的相互關係 在共審查專利申請案WO 97/46697中，藉MAb B4對抗以 SIV實驗性感染恒河彌猴之攻擊試驗評估MAb B4之保護功 效及其在體内對中和抗體之相互關係，這也是針對人類 AIDS常用的實驗動物模型。 在該研究中，以MAb B4灌注恆河彌猴並在前處理，攻 擊前，及攻擊後1小時之時間點收集血清用於評估。MAb B4抗體之血清濃度，藉對預校正之MAb B4曲線之rsCD4免 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ；-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（52) 疫分析，發現對所有獲得5毫克/公斤體重之劑量之動物 MAb B4抗體之血清濃度係在30-45微克/毫升之範圍。在 一年期間之監測中，3 / 4接受MAb B4的動物可被保護而對 抗SIVmac251。存於被攻擊動物體内血清MAb B4的濃度（即 ，30-45微克/毫升）遠低於抗-(CD4-CDR2抗原胜肽）抗體 的預估濃度（約300微克/毫升），其為已由一含p2057c或 p2240c (SEQ ID NOS:32與35)的免疫原成分免疫化宿主後， 存在宿主體内免疫血清的抗體。 因此，以本發明之包含SEQ ID NOS: 4, 5, 10與11或其同 系物之胜肽組合物免疫接種的宿主可預期具有免疫性而免 於由於多種HIV分離株之HIV感染。 包含、濫交人工合成Th抗原表位之免疫原胜肽組合物 依照（SEQ ID NO:6)-Gly-Gly-(SEQ ID NO:5)的設計，合成 一人工Th/CD4-CDR2抗原胜肽，並命名為SEQ ID NO:60。 SEQ ID NO:60 胜肽係調配於 ISA 206/DDA。ISA 206/DDA 為油/水乳劑，其中二甲基十八基溴化按（DDA)係分散於 MONTANIDE™ ISA 206 (30 毫克 / 毫升）。（MONTANIDE™ ISA 206是由SEPPIC Inc. of Fairfield，NJ提供之油性可代謝溶 液）。油性懸浮液接著以1 :1體積比乳化於水性的胜肽溶液 ，其已調節胜肽含量以提供所欲胜肽組合物在最終製備物 中為0.5毫升。 在上述調配物中，SEQ ID NO:60之免疫原性係建立於在 弟0、3及6週獲得1 〇〇微克/劑量之天竺氣中。免疫原性係 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） ---------------------訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7

五、發明說明（53 ) 藉如述於實例1，使用SEQ ID N0:5作為環化目標抗原部位 胜肽用於固相受質之抗胜肽EUSA測定。6隻天竺鼠全都成 功地血清轉變成ELISA反應性。 顯著地，SEQ ID NO:60在大型動物中也具高度免疫原性 與功能活性。包含SEQ ID NO:60之免疫原組合物係調配於 不完全弗羅依特氏佐劑（IFA)中，300微克/劑量，並在第〇 、3及6週以肌肉内注射而投藥於豬隻。經血清轉變的豬及 取自第8週的血清係藉MT_2微溶菌斑中和作用分析（實例j ) 測試對抗初級分離株HIV-1 VL 135之中和作用活性。褚隻 血清樣品在1:249之稀釋度注入病毒會提供5〇%中和作用， 及在1:97稀釋度則提供90%中和作用。因此，以本發明胜 肽組合物之免疫接種給予動物寄主免疫反應，其包括抗體 對包含CD4及對HIV中和活性之寄主細胞受體之反應。將 豬隻血清依1:249稀釋，會提供50%中和作用；若以1:97稀 釋’則提供90%中和作用。於是，以研發之組成胜肽的接 種，給予大型動物宿主一個免疫反應，這個反應包括抗體 到宿主細胞受器與中和HIV之活性。 ----L-----------------訂-------.！線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -56- 本紙張尺錢中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱）_ 1227242 A7B7 五、發明說明（54 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

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X 了 〆 L·： Cl 〆 - -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------------訂---------線, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7B7 五、發明說明（57 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1D L/» 〇〇 〇 oo cr oc o o Xi oo On cr "O OC •J、 o "Ο OO cr T3 OC o "O Ui CO cr *T3 rj o T3 cr o T： •U cr Ό 〇 cr -U 〇 -U Ο zr ~o g *^5 -U g -D -U 〇 n σ Cr τ: Xu Ά η A •彡· cr -U n cr o UJ cr η Ό Μ -U -U u J Xu Lj UJ •U u J •U Lj -U 。J -L. 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On OC U-> 〇 ·〇 On DC UJ cr X5 o CO IO o o oo IO cr On OO o *〇 ON oo cr ON OO Ο ο "D Ον g cr T： Os 〇 2 cr X3 On OO o XJ On cr On !0 iO CT On JO 〇 m Μ > > ΙΟ ο UJ oc L·) Lj V w. -U Lj L-> 〇 V V •w/· V K^\ 〇 V V V L/、 -C^ to V» to IO bo 办 •J, to ΪΟ 0, ΪΟ o to to 1 o IO L/i On bo IO IO 〇 On oo IO IO -o On oc ΙΟ f^l to 〇 o IO JU Vi 二 一 + + + + 4 + 斗 + ; 4- + -4 4 -(- 4 •r .Ί -i 4 -Γ Η •Ί + H. • -t -i • • Λ A Λ Λ Λ Λ /、 Λ Λ r、 Λ A Λ Λ /、 Λ Λ Λ /v Λ Λ 八 Λ Λ Λ o o o s Ο 5 5 〇 〇 o o o o 5 o 5 o o 〇 Ο Ξ 5 o o 〇 Ο 〇 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^^-----------------訂---------線(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（58 ) 共：Pi460—BSAS:^:參 / A1 : Logl0ELISA^Im^^^;;:p^^^0s:i£f A2 : LoglGELISA^-rscD4#ji»~^i5 B : IFA(T>恥翁拎漭眯决淞&今茸) f C :翔宋私 Qade B HiV-1 VL 135 ~ MT-2 t^^迸今50i~Jk 砵#«>! g ·· 今is羧ft淙瘁 NT : „m------------------------------ --------------- II p!769 b 1 II p!768 b I 1 pi 767 b 1 1 pi 766 b 1 | ,)1765 x | II ρ 1703 b 1 1 ΡΠ6 丨 1) 1 1 pinole ι II p!7〇lb 1 II pnooc | 1 pl700 b ] II pl699 c 1 1 ρ!699 b 1 1 [)1698 c 1 ρΙ698 b I 1 ρ 1697c j 1 pl697 c I ρΙ697 b 1 pl6%c 1 ρ 1696 b I Ρ 1695 c I ρ1695 b 1 ρΙ694 c 1 ρ!694 b 1 ρ!693 c J ρΙ692 b I p!690 c 6 V V W oc 、'i' V^J 0. - V ··/、 10 ，少 ν· Ο. 1 ^ Ο i/， V. ν· V. 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Fusin (LESTR) CC-CKR5 CC-CKR3 CC-CKR2 CC-CKKI 化學增 活素受體 的種類i ρΙ987 ρ2045 ,ρ2079 ρ2086 ρ 1999 1密碼 一 I 代表現所相對之化學增活素受體區域之胜肽抗原 V > - - • — •十 4 α: Λ έ Λ Ο Λ Ο Λ Λ Ο Ο ρ204 1 b ρ2(^6 b ρ2080 b p2087b ρ2004 密碼 ΙΟ ί： •w-) Ο ,ν > • - • + Η- - Λ A Λ Λ 5 Λ Ο Ο Ο Ο 5 ρΙ990 1 p2047 ρ2081 ρ2088 ρ2027 密碼 u) ΙΟ Lr» Οι to > 十十 - • • CD Λ Λ 5 Λ Ξ Λ Ο Λ Ο Ο ρ!991 ρ2048 ρ2082 ρ2089 ρ2028 ί 密碼 -U L/t 〇〇 ΙΟ L/· Xu -tX Lj > 丨十十十十 q + 十十 w Λ Ο Λ Ο <1:10 Λ Ο Λ Ο η 'ρΙ996 ρ2049 ρ208^ ρ2091 ρ2006 ί m ΙΟ '0、 -£^ 〇-> 匕J U·) L/· V > • 4· 4· - • • Λ Ο ο Λ Ξ <1:10 <1:10 η -62- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 B7 五、發明說明（60 ) + IFA##.J、^JP> * 駟洳2淳痒场扇绛屎八鲜涩++、;0碑添參_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 S CT cc oc SO cr OC (> 〇〇 J- OC OO CT 〇 CC n -U 1 J n 二 n o * ^ Ο σ 淼 :痒 .穿. V o 〇· V o V s〇 V·/· V 心 V V sS V s〇 ^/. T1 Η 〇 〇 § C®5 :¾ 3 — *{ Η i 4 i * f < 十 十 十 十 4 十 •1 十 十 < 1 + 1 i 十 V s〇 〇· y >〇 v/. V v〇 w. V Ό V o· 〇 V N〇 u· t旖 2 1 1—k 卜· 十 i 十 •i i 1 1 i i < i -1丨 o Γ i f X "Π g: g: g： g: g： 2： g: < O :^ ：f Ο ο 1 呤*l· > ,CT n σ 1 J g 、i cr o o 1 J -2 oc cr C ^ 〇 cr 1 J 〇 c-o cr \D Ό n Ό 〇 $ •j :瘁' ； ▲ > m • 么 么 w. v^. 〇· KJ% V Η 〇 6 Ρ 〇 OQ ' ο ♦ ；H-^ ： • •j •1 *< f < i 1 » 1 i j I i 1 ♦ i i 1 〇· o V Ο v>. V sD 〇· V \〇 V kD X V o o* r % ί 03 > X > ♦ "TJ Η η -冷 >—*· | o •1 i 1 1 I i i .1 i 1 \ \ 1 ·< g： 2： g: -z. 2： -Z. "Z. 7. c ± >5 耖冷漭皆砵犛MAB B4蔣命尨MT2 Τ ί& (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

· I I I I -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7B7 6 ___V 明說 明發五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Τ3 L·/、 〇〇 Χ3 Ο. οο ζ -ο Ί3 «〇 Ο "Ό 〇Ν Ο 〇Ν ΟΟ Ο -U. S M穿 ΓΠ 〇 5 ·〇 io ο α 犬 u·» α> -L ΓΤ3 Ο σ 之 ο io ο Ό g 1 LO ΓΠ Ο α 之 ο Ο D β ο Ον -Ο LO ΓΤ) Ο 5 2： C CC ο α K>J -Ο -k αν 拳 LO m Ο 5 之 ο ·<〇 ο α ο L· Os ΓΠ Ο D 2： Ο 5 η Ό έ 6\ OJ ΓΠ Ο Ό 之 Ο ο α 芒 οο Ί?) m 〇 a 之 p o D UJ v!/. w 舞s ο ο ο 〇〇 Η π Ο ✓—^ ·' ο 5 5& σ <⑺ Ο 广⑺ Η广 > ^ 彐ο 之 r* rn Ό in α Η < Ο m < m σ .，: 2： Ο ϋ〇 Ρ Η 厂、 Ο r、 广 2： Ο > • D α〇 η ξ Ο Ο 之 "Ή /—•V η F ο ζ ο ιη -η 广 η Ζ Ο ιη "Τί Γ Η ο r、 .η Ζ α > D ιη Ρ〇 ιη 厂 δ 2： Ο in pj —j 7i 〇 H 7： 〇 穴 r· 2： D ? m 1¾ 郭 丨瘁 〇 cr Ο cr Ο CT ο CT ο cr η cr Ο cr O cr 么 ί: L-> L, υ 二 -u UJ 办 Lj ί ί: to > 〇> oj 〇-> ΙΟ to be S ΙΟ Ον ΙΟ ΙΟ Ον Λ to to On J > ΙΟ • • • • - • - - • - - + + - - + + CD Λ Λ έ Λ ο Λ Λ Ο Λ Λ Ο Λ Ο Λ Ο Λ . Ο Λ Ο Λ Ο Λ Ο Λ o Λ 〇 ο >•6 -If I I ,^ri i^i ϋ ϋ ϋ an Βϋ ϋ 1 1_1 n an ·ϋ ι_1 ϋ 一口、I ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線♦- 64 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 Α7_Β7 五、發明說明（62 ) Έ.618 cs (5 755)0)* (SEO 5 20:30) (C)LNTRA(C) pl6l7 cs(52i)(cr (smolD I) (C)NTR(C) PE6 cs(4CM3)(cr (SEO ID NP28) (COGSF(C) p 16 1: cs(39.t)(cr (sfolf) N0.J7) (C)NQGSFLO)

pl6 M CD4(3M5)(CT (SIoiD N〇：26} (c)g2:ogsflt(o} pi 580 P15OC8 P15007 ρ1586 β将|5 cs(79-%1 (S£Q ID NP25) (ojsD-rJYlornvrr-JDoKEEVoLl^c) (seq5no:2± CD4{46.55)* (o)KGPSKr-NDRA(c) c2(44-56* (SEOID NP23) (c)广 TKGPSKr-2:DllAD(0) (SEQ1DNP22) c04(42-59)* (C)SFLTKGPSKLNDRADSKR(C) >6(雜淼) I-------------------訂---------線(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

V

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Cj > ο ο 5 〇 Ξ Ο Ο ο ο ο 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -65 1227242 Δ7Α7_Β7 五、發明說明（63 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A1 : ss ^B : IFA, A2 : Logi〇 ELISA^丨 rsCD4 #择~涔^/ 0 :扒 Clade B HIV-1 VL s ~ MT—2 tis 案卜£ 50產蠢~卜$#綷 * :锔斧薛萍 p2240 {c)OD4(39-66)(cr (C)NQGSFLTKGPSKL 之 DilADSpolRSLWDoGN(n) c >4vw ++4-一iooo〕 -(SEQ52:〇：5) P2i p2 189 |〕2057 pl6j9 0β o)cs(27-71)· i「67 io一 (SEO1DNP10) (c)HWK2:sz;QlKlLG2:QGSFLHKGPSKr-NDRADSiu々SL\VDoGN(c)pul V5 -66- (c)CD4(39-7i)*?1nj (smolDNpll) ooD4(27-66)(cr (SEOID Moi CD4(4S-52)(C)· (SEQ ID 之P30

(c)zoGSFr-TKGPSKr-NDRADS 刃 KSr-WDoGN(c)plJI (c)HWKMS2:QlKlr-G2:oGSI*Jr-TKGPSKLMTR>DS?3RSr-\VDoG2:(c) (C)PSKLN(C) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂----- 秦- £ >5 >5 V4 A1 >5 A2 +4--4- N，*—; :165

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MT <1」0 <1:10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1227242 A7 B7 五、發明說明（64 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 牝：3-味^鸯阼聆雋怂呤择泠嫁溆琢你茸塱^:濰宋《mv-lt^今## MAb 50.1 a gp 120 (N-terminal V3) Ig G1 bl2 MAb a gp!20 a N-terminal V3MN MAb B4 a p2240c (SEQ ID NO:35) (12 vvpi) a p2057c (SEQ ID NO:32) (15 vvpi) 抗體的種類 >50 Mg/ml 38.5 Mg/ml >100 Mg/ml 6.76 pg/ml Ιό o o § UG029# (Clade A) >50 Mg/ml 41.7 pg/ml >100 Mg/mi 1.54 Mg/ml Ei to o § VL 135 (Clade B) >50 Mg/ml 、>50 、]tg/ml >100 、μ咖丨 ! 2.82 yg/ml Z H oo ZIM 748# (Clade C) (/Ξ V 1¾ >50 yg/ml >100 Mg/ml 丨 25.6 μ咖l io o ro o § UG266# (Clade D) >50 Mg/ml >50 ^tg/ml 二 V =L 〇 1- 3.32 μ^/ml •一 s OO § η h sr工 CL 〇 rD u ^ CTN S ^ >50 Mg/ml >100 μα/ml 2.1 pg/ml Lj On i i> o § DH12# (Clade B) ^驷条^:鷂綷冷漭陡砵摩cladsA - B - C 4 D>5LE~HIV-1 岔资今#參 ~t^^s(MT-2 ps^ ^ t ίψ3 -67- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •衣

* I I I I 秦_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 B7 五、發明說明（65 ) 表8 由外來致病原衍生之Th抗原表位之胺基酸序列 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Th的敘述 SEQ ID NO: 胺基酸序列 丨:285?.川2 "Th 38 LSEIKGVIVHRLEGV MVn58-277 丁h 39 GILESRGIKARITHVDTESY 1「R'n-R.u ]丨1 40 KKQYIKANSKHGITEL 厂 丁 “ 41 KKFNNFTVSFWLRVPKVSASIIL P丁 NQ.I76 Th * 夕 、 42 KKLRRLLYMIYMSGLAVRVHVSKEEQYYDY 丁丁⑽ Th 43 YDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIK u 44 GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL HBs.n.,, Th 8 FFLL 丁 R1LT1PQSLD 1 丨4<，Ίh '4-s VSrGV\VmTrTAYRPPNAI)lL HBc21,n Th 4(3 SDFFPSVRDLLDTASALYRE 47 PHHTALRQAILCWGELMTLA 丁丁 6⑽丨丁 H 48 WVRDIIDDFTNESSQKT HIV gp41 ΤΙν,(Ν-) 49 RAGRAILHIPTRIRQGLER IIIVgp4l T1V,(C-) 50 avaegtdrvievlqragrail CTA8 隊 51 ALNIWDRFDVFTLGATSGYLKGNS 'CTP,,Th 13 TINKPKGYVGKE DT, Th 52 DSETADNL[£KTVAALSILPG1IG DL Th 53 eeivaqsialsslmvaqaiplvgelvdigfaatnfvesc PFTh 54 DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS SM Th 55 KWrKTNAPNGVDBKlRI TrnT| Th 56 GLQGKIADAVKAKG I'raT, Th 57 GLAAGLVGMAAiMMVRDVN 丁Th 58 STl£TGNQ)l 1Π Y〇 丁RVVSNANK -68- (請先閱讀背面乏注意事項再填寫本頁) •V J 1 ϋ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 B7 五、發明說明（66 ) 表9 人造Th抗雇表位之胺基酸序列

Th的敘述 〜 SHQ ID NO: 胺基酸序列 1,4,9 PAUNDROMIC 6 ISEIKGVIVHKIEGI MT RT TRM TM L L V SynTh (1.2,4) 12 KKKIITITRIITIITTID iS(l A9 PAL[NDR〇M1C)LF simplified * 36 ， - ISISEIKGVIVHKIEGILF T RT TR T IS(1，4,9 PALINDR〇MIC)LF 59 ISISEIKGVIVHKIEGILF MT RT TRM TM L L V (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------參 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（67 ) 序列表 (1) 一般資料： (i) 申請人：王長怡 (ii) 發明標題：用於預防及治療HIV病毒感染和免疫缺失疾 病之特殊胜肽組成物 (iii) 序列號碼：60 (iv) 代表人住址： (A) 地址：Morgan & Finnegan (B) 街道：345 Park Avenue (C) 城市：紐約市 (D) 州：紐約州 (E) 國家：美國 (F) ZIP ： 10154-0054 (v) 電腦可讀之型式： (A) 媒體型式：軟式磁碟片 (B) 電腦：IBM可相容之個人電腦 (C) 操作系統：MS WINDOWS 95 或 98 (D) 軟體：Patentin Release #1·0，版本#1.25 (vi) 目前應用資料：

(A) 應用編號：US (B) 完成日期： (C) 種類： (v i i i ) 代理人/代理商資料 (A) 姓名： (B) 登記號碼： (C) 參考/標籤號碼：1151-4154 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） “—』-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 ΚΙ ___Β7_五、發明說明（68 ) (ix)電話聯絡資料： (A) 電話：212-758-4800 (B) 傳真：212-751-6849 (2) SEQ ID NO : 1 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：433個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (C) 表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 1 : 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

y s y L va val

Gl s Ly s Ly wv Gl u Le

GlGl25Le er

LelAsrGll85vaLelprc er ^ ^ ^ ^ ^ ® LeupheGlyLys50TrpLeuvalpheGlnllopro g 1U Arva sp s y pnnn φ υ ο n r ^ n TrpG140ASGlIleASLeloGlseLyGl

In

LysGlyASPGly65GluGln

Ly5GlrThr45serLel Gln20AsnLeulpro ererhevla5he s s p A 5 p anr Q&n AlA30seArA erJllJ s G A Φ- ^ a AsLV90A1 Φ u r AS80G1se

hralsp05hrlnbsp ThV AloThG G A u d yon LevaGl14Gl ThrsserGinLeu LeuproIleGlu erer25VSIl.eu s s 1 A L PS s g Γ Π ASloLyIleLyArIle70TyGl rey g US u seLY35G1ArIleIleLe95HiGl rghrly AThG I >30-yser L c 1 L s valIleIleproser60LyscysLeuLeuser120serLeu '—^---------———訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 W 伽1pe^gLysPJ.Q』 lAsnLys^ -^5360-1^1sys^Jy^rpfeysysJ $lys.Q挪 w35m.QJI95ys^ ^ I 伽 sys^J 細 Igly印 II wyseulysl I 160.1 咖.QIII J I.QWII 他 伽 Kyr.Qlyl i 二 h 細 J 伽Q5ly™ys^eu恤JyP: SJ ❿ I 服 lQlysys恤盅ys^^ys^30J ^lyly·! _I I ❿sllyl 細.Q45I 吻 *1051^^1^651 I" v^/ 69 /V 明 說 明 發 五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ΊΓοί Tlelra ο ^Φs ylroetu r ^ aolnIral^rg Th16IlesephThAl22LyASHiGlThr28MGlseLyAl34GlThvaGlAr cysLysserGlu195LeuArgLeuGlnLeu255AlaLysvalcysLeu315serGluserproIle375IleHis伽 wys^SP伽加加他|〇0他應|加|5〇-咖~ fpsus⑽=他pw J =伽 JISSSII I 她u§ ----L-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（70 ) 400 405

Gin lie Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys 410 415 420

Gin Cys Pro His Arg Phe Gin Lys Thr Cys Ser Pro 425 430 lie (2) SEQ ID NO : 2 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：40個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 2 :

His Trp Lys Asn Tip Asn Gin lie Lys lie Leu Gly 1 5 10

Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys 15 20

Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp 25 30 35

Asn Gin Gly Asn 40 (2) SEQ ID NO : 3 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：28個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 3 :

Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys 1 5 10 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -—一---------—I—訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 ΚΙ _Β7五、發明說明（71 ) Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp 15 20 Asp Gin Gly Asn 25 (2) SEQ ID NO : 4 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：42個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 4 : 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 pnmn TrpGlbASGl issneu Hal cyslGlyLys25Trp

p sA

TrppheAla30cys vsnervrgJ A 5 s A A ^ y Φ y LYG1ASG140

InGl nAs

Io e 2S p sA

5 e y IlL

leroer5 π p S3s; I ser (2) SEQ ID NO : 5 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：30個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：胜肽 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 5 : Cys Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser 1 5 10 Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu 15 20 -74- .—_-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（72 )

Trp Asp Gin Gly Asn Cys 25 30 (2) SEQ ID NO : 6 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (ix)特性： (A) 名稱/關鍵：修飾部位 (B) 位置：1 (D)其他資料：/註= ’’Ile，Met or Leu” (ix)特性： (A) 名稱/關鍵：修飾部位 (B) 位置：2 (D)其他資料：/註= nSer or Thrn (ix)特性： (A) 名稱/關鍵：修飾部位 (B) 位置：4 (D)其他資料：/註= ’’Ile or Arg” (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：5 (D)其他資料：/註= ’’Lys or Arg’· (ix)特性： (A)名稱/關鍵：修飾部位 -75- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .—一-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（73 ) (B)位置：10 (D)其他資料：/註= ’'His or Thr’’ (ix)特性： (A) 名稱/關鍵：修飾部位 (B) 位置：11 (D)其他資料：/註= f’Lys or Arg” (ix)特性： (A) 名稱/關鍵：修飾部位 (B) 位置：12 (D)其他資料：/註= nIle，Met or Leu1’ (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾邵位 (B) 位置：14 (D)其他資料：/註= nGly or Thrn (ix)特性： (A) 名稱/關鍵·修飾部位 (B) 位置：15 (D)其他資料：/註= ’’Ile，Met or Val” (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 6 :

Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Gly Val lie Val Xaa Xaa Xaa 1 5 10

Glu Xaa Xaa 15 (2) SEQ ID NO : 7 的資料： (i)序列特性： (A)長度：16個胺基酸 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---U-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（74 ) (B)種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ϋ) 分子種類： 胜肽 (xi)序列敘述： SEQ ID NO ： 7 ： Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro 5 Ser Tyr Thr Ala 10 Thr Tyr Gin Phe 15 (2) SEQ ID NO : 8 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 8 :

Phe Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr lie Pro Gin 1 5 10

Ser Leu Asp 15 (2) SEQ ID NO : 9 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：6個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 9 :

Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro -77- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） *— j-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7 五、發明說明（75 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5 (2) SEQ ID NO : 10 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：46個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 10 :

Cys His Trp Lys Asn Trp Asn Gin lie Lys lie Leu 1 5 10

Gly Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser 15 20

Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu 25 30 35

Trp Asp Gin Gly Asn Cys Pro Leu lie lie 40 45 (2) SEQ ID NO : 11 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：34個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 11 :

Cys Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser 1 5 10

Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu 15 20

Trp Asp Gin Gly Asn Cys Pro Leu lie lie 25 30 -78- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） *— ^-----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7_ 五、發明說明（76 ) (2) SEQ ID NO : 12 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：18個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 12 :

Lys Lys Lys lie lie Thr lie 5 Thr Arg lie 10 lie Thr lie lie Thr Thr 15 lie Asp (2) SEQ ID NO ： 13的資料： (i) 序列特性： (A)長度： 12個胺基酸 (B)種類： 胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ϋ) 分子種類： 胜肽 (xi)序列敘述： SEQ ID NO ： 13 : Thr lie Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Lys Glu 1 5 10 (2) SEQ ID NO ·· 14 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：13個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽― -79- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ▲— *-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（77 ) (xi)序列敘述：SEQIDNO : 14 ··

Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 1 5 10 (2) SEQ ID NO : 15 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：12個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 15 :

Cys Gly Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Cys 1 5 10 (2) SEQ ID NO : 16 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：18個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 16 :

Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg 1 5 10

Arg Ser Leu Trp Asp Gin 15 (2) SEQ ID NO : 17 的資料： (i)序列特性： (A)長度：7個胺基酸 -80- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） ‘—·-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 _B7_五、發明說明（78 ) (B)種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii)分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 17 : 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

(2) SEQ ID NO : 18 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：12個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 18 : Cys lie Leu Gly Asn Gin Gly Ser 1 5 (2) SEQ ID NO : 19 的資料： ,(i)序列特性： (A) 長度：29個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii)分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 19

Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr 1 5 Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser 15 Asp Gin Gly Asn Phe -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Phe Leu Thr Cys 10

Lys Gly Pro Ser Lys 10 Arg Arg Ser Leu Trp 20 】—-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7 五、發明說明（79 ) 25 (2) SEQ ID NO : 20 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：61個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 20

Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser 1 5 10 Leu Trp Asp Gin Gly Asn Phe Pro Leu lie lie Lys 15 20 Asn Leu Lys lie Glu Asp Ser Asp Thr Tyr lie Cys 25 30 35 Glu Val Glu Asp Gin Lys Glu Glu Val Gin Leu Leu 40 45 Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu 50 55 60 Leu 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) SEQ ID NO : 21 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：14個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 21 : lie Leu Gly Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys

Gly Cys ‘---^-----------------訂---------^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 10 -82- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（80 ) (2) SEQ ID NO : 22 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：20個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 22 :

Cys Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn 1 5 10

Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Cys 15 20 (2) SEQ ID NO : 23 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 23 :

Cys Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg 1 5 10

Ala Asp Cys 15 (2) SEQ ID NO : 24 的資料： (i)序列特性： (A) 長度：12個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 -83- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ‘—.-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 _B7_五、發明說明（81 ) (ii)分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 24 : 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ly Gl s Ly er s 5 y a § Arlo p s A n As cy (2) SEQ ID NO : 25 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：20個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 25

Cys Ser Asp Thr Tyr 1 5 Lys lie Cys Glu Val Glu Asp Gin 10 Glu Glu Val Gin Leu Leu Cys 15 20 (2) SEQ ID NO : 26 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：10個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 26 : Gly Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Cys 5 10 (2) SEQ ID NO ·· 27 的資料 (i)序列特性： -84- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —„-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7 五、發明說明（82 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (A) 長度：8個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii)分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 27 : Cys Asn Gin Gly Ser Phe Leu Cys 1 5 (2) SEQ ID NO : 28 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：6個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 28 : Cys Gin Gly Ser Phe Cys 1 5 (2) SEQ ID NO : 29 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：5個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 29 ··

Cys Asn Thr Arg 1

Cys (2) SEQ ID NO : 30 的資料： -85- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） •—.-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（83 ) (i) 序列特性： (A) 長度：70個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 30 :

Cys Leu Asn Thr Arg Ala Cys 1 5 (2) SEQ ID NO : 31 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：7個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 31 :

Cys Pro Ser Lys Leu Asn Cys 1 5 (2) SEQ ID NO : 32 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：77個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 32 :

Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala 1 5 10 -86- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -—„-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 B7 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 五、發明說明（84 )

Thr Tyr Gin Phe Gly Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg 15 20 lie Leu Thr lie Pro Gin Ser Leu Asp Gly Gly Cys 25 30 35

His Trp Lys Asn Trp Asn Gin lie Lys lie Leu Gly 40 45

Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys 50 55 60

Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp 65 70

Asp Gin Gly Asn Cys 75 (2) SEQ ID NO : 33 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：69個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 33 :

Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala 1 5 10

Thr Tyr Gin Phe Gly Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg 15 20 lie Leu Thr lie Pro Gin Ser Leu Asp Gly Gly Cys 25 30 35

Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys 40 45

Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp 50 55 60

Asp Gin Gly Asn Cys Pro Leu lie lie 65 (2) SEQ ID NO : 34 的資料： (i)序列特性： (A)長度：81個胺基酸 -87- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .—“-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7_ 五、發明說明（85 ) (B)種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii)分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 34 :

Thr Ala Lys Ser Lys 5 Lys Phe Pro Ser Tyr 10 Thr Ala Thr Tyr Gin Phe Gly Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg 15 20 lie Leu Thr lie Pro Gin Ser Leu Asp Gly Gly Cys 25 30 35 His Trp Lys Asn Trp Asn Gin lie Lys lie Leu Gly 40 45 Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys 50 55 60 Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp 65 70 Asp Gin Gly Asn Cys Pro Leu lie lie 75 80 (2) SEQ ID NO ： 35的資料： (i) 序列特性： (A)長度： 65個胺基酸 (B)種類： 胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ϋ) 分子種類： 胜肽 (xi)序列敘述： SEQ ID NO ： 35 : Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala 1 5 10 Thr Tyr Gin Phe Gly Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg 15 20 lie Leu Thr lie Pro Gin Ser Leu Asp Gly Gly Cys 25 30 35 Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys 40 45 -88- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） •— *-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（86 )

Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp 50 55 60

Asn Gin Gly Cys 65 (2) SEQ ID NO : 36 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (ix)特性： (A) 名稱/關鍵：修飾部位 (B) 位置：2 (D)其他資料：/註= ’’Ser or Thr” (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：5 (D)其他資料：/註= ’’Lys or ArgM (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：6 (D)其他資料：/註=，’Gly or Thr” (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾邵位 (B) 位置：10 (D)其他資料：/註= nHis or Thr” (ix)特性： -89- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） •—.-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 A7 _B7_ 五、發明說明（87 ) (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：11 (D)其他資料：/註= f’Lys or Arg’’ (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：14 (D)其他資料：/註= nGly or Thr” (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 36 : lie Xaa Glu lie Xaa Xaa Val lie Val Xaa Xaa lie 1 5 10

Glu Xaa He 15 (2) SEQ ID NO ·· 37 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：50個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 37 ： (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) ---------訂---------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

grss p ArcyLyTrpelry Γiu ThGl20seLe leilyroer Π G p s hrspbGrg ThAG30A s g eeyLr I15I1L Aehrhrero π T T s 4 sLrup LyThrbLeAS s eae LyIlephAlcy50 s Γ § Π y e e 5 ^ ^ L· 111s 2 A A -90- lie 10 Asn Leu Asp

Ile Thr Gin Gly Asn Asp 35 Gin Gly 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（88 ) (2) SEQ ID NO : 38 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 38 :

Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His Arg Leu 1 5 10

Glu Gly Val 15 (2) SEQ ID NO : 39 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：20個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 39 :

Gly 1 lie Leu Glu Ser 5 Arg Gly lie Lys Ala Arg lie 10 Thr His Val 15 Asp Thr Glu Ser Tyr 20 (2) SEQ ID NO : 40 的資料： (i)序列特性： (A) 長度：17個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 -91 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） •---·-----------------訂---------^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_ 五、發明說明（89 ) (ii)分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 40 :

Lys Lys Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie 1 5 10 Gly lie Thr Glu 15 Leu (2) SEQ ID NO ： 41的資料： (i) 序列特性： (A)長度： 22個胺基酸 (B)種類： 胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類： 胜肽 (xi)序列敘述： SEQ ID NO ： 41 : Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu 1 5 10 Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu 15 20 (2) SEQ ID NO ： 42的資料： (i) 序列特性： (A)長度： 30個胺基酸 (B)種類： 胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類： 胜肽 (xi)序列敘述： SEQ ID NO ： 42 : Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met lie Tyr Met 1 5 10 Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu 15 20 -92- 4—^-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 B7 五、發明說明（9〇 ) Glu Gin Tyr Tyr Asp Tyr 25 30 (2) SEQ ID NO : 43 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：27個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 43 : Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys 1 5 10 Asp Arg Phe Leu Gin Thr Met Val Lys Leu Phe Asn 15 20 Arg lie Lys 25 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -φ^----- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) SEQ ID NO : 44 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：24個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 44

Gly

Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala 5 10 Leu Thr Val Ala Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu 15 20 (2) SEQ ID NO : 45 的資料： (i)序列特性： -93- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 訂----- 1227242

Val Ser Phe Gly Val Trp lie Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro 5 Asn Ala Pro lie Leu 10 15 20

Ser 1 Asp Phe Phe Pro 5 Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 10 Thr Ala Ser 15 Ala Leu Tyr Arg Glu 20 A7 _B7_ 五、發明說明（91 ) (A) 長度：21個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii)分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 45 : (2) SEQ ID NO : 46 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：20個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 46 : (2) SEQ ID NO : 47 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：20個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 47 : -94- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） *-------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227242 A7 B7 五、發明說明（92 )

Pro His His Thr Ala Leu Arg Gin Ala lie 1 5 10 Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala 15 20

Leu Cys (2) SEQ ID NO : 48 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：17個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 48 :

Trp

Val Arg Asp lie lie Asp Asp Phe Thr Asn Glu

Ser Ser Gin Lys Thr 15 10 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) SEQ ID NO : 49 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 49 : Arg Ala Gly Arg Ala lie Leu His lie 1 5 lie Arg Gin Gly Leu Glu Arg 15 (2) SEQ ID NO : 50 的資料： (i)序列特性： -95- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） *— *-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Pro Thr Arg 10 1227242

Ala 1 Val Ala Glu Gly 5 Thr Asp Arg Val lie Glu Val 10 Leu Gin Arg 15 Aal Gly Arg Ala lie 20 Leu

Ala Thr Leu Leu Asn Gly lie Ala Trp Thr Aap Ser Arg Gly Phe Tyr Asp Leu Val 10 Lys Phe Gly Ser Asn 15 20 Ser 25 A7 _B7_ 五、發明說明（93 ) (A) 長度：21個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii)分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 50 : (2) SEQ ID NO : 51 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：25個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 51 : (2) SEQ ID NO : 52 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：22個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 -96 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .—.--------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227242 A7 B7 五、發明說明（94 ) (xi)序列敘述：SEQ ID NO ·· 52 : Asp 1 Ser Glu Thr Ala 5 Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val 10 Ala Ala Leu 15 Ser lie Leu Pro Gly 20 His Gly (2) SEQ ID NO : 53 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：39個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 53 :

Glu 1 Glu lie Val Ala 5 Gin Ser lie Ala Leu 10 Ser Ser Leu Met Val 15 Ala Gin Ala lie Pro 20 Leu Val Gly Glu Leu Val Asp lie Gly Phe Ala Ala Thr Asn Phe Val 25 30 35 Glu Ser Cys (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -.— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) SEQ ID NO : 54 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：21個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 54 : Asp lie Glu Lys Lys lie Ala Lys Met Glu Lys Ala 1 5 10 Ser Ser Val Phe Asn Val Val Asn Ser -97- s'. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 A7 B7 五、發明說明（95 ) 15

Arg lie 20 (2) SEQ ID NO : 55 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：17個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 55 :

Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp 1 5 10

Glu Lys lie 15 (2) SEQ ID NO : 56 的資料： (i)序列特性： (A) 長度：14個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 .(ii)分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO ·· 56 :

Gly Leu Gin Gly Lys lie Ala Asp Ala Val Lys Ala 1 5 10

Lys Gly (2) SEQ ID NO : 57 的資料： (i)序列特性： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 -98- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） *---'---------^^衣--------訂---------^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227242 A7 _B7 五、發明說明（96 ) (D)表面結構：線狀 (ii)分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQ ID NO ·· 57 :

Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp 10 Ala Met Val Glu Asp Val Asn 15 (2) SEQ ID NO : 58 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：20個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (xi)序列敘述：SEQIDNO : 58 :

hral Thv r¾ eLr s 1 A

Gluval15

GlyL

IA1J a

s ^ H1LV20 lnsn G A s Hi

Tylo

In G1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----- 11111 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) SEQ ID NO : 59 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 (ii) 分子種類：胜肽 (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：3 -99- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（97 ) (D)其他資料：/註二’’lie，Met or Leun (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：4 (D)其他資料：/註= ’’Ser or Thr” (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾邵位 (B) 位置：7 (D)其他資料·· /註= ’’Lys or Argn (ix)特性： (A) 名稱/關鍵：修飾部位 (B) 位置：8 (D)其他資料：/註= ’’Gly or Thrn (ix)特性： (A) 名稱/關鍵：修飾部位 (B) 位置：12 (D)其他資料：/註= ’’His or Thrn (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：13 (D)其他資料：/註二’’Lys or Arg” (ix)特性： (A) 名稱/關键·修飾部位 (B) 位置：14 (D)其他資料·· /註= ’’Ile，Met or Leu” (ix)特性： -100- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .—.-----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（98 ) (A) 名稱/關鍵：修飾部位 (B) 位置：16 (D)其他資料：/註= MGly or Thrn (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾邵位 (B) 位置：17 (D)其他資料：/註= ’’Ile，Met or Val·’ (xi)序列敘述·· SEQ ID NO : 59 : lie Ser Xaa Xaa Glu lie Xaa Xaa Val lie Val Xaa 1 5 10

Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Leu Phe 15 (2) SEQ ID NO : 60 的資料： (i)序列特性： (A) 長度：47個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)表面結構：線狀 ,(ii)分子種類：胜肽 (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：1 (D)其他資料：/註= ”Ile, Met or Leu” (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：2 (D)其他資料：/註= f’Ser or Thr'’ -101 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 」-------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227242 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（99 ) (ix)特性： (A) 名稱/關鍵：修飾部位 (B) 位置：4 (D)其他資料：/註= ’’Ile or Argn (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：5 (D)其他資料：/註= ”Lys or Thr” (ix)特性： (A) 名稱/關鍵：修飾部位 (B) 位置：10 (D)其他資料：/註= f’His or Thrn (ix)特性： (A) 名稱/關鍵：修飾部位 (B) 位置：11 (D)其他資料：/註= f’Lys or Arg'1 (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：12 (D)其他資料：/註= ’’Ile，Met or Leu” (ix)特性： (A) 名稱/關键：修飾部位 (B) 位置：14 (D)其他資料：/註= f’Gly or Thrn (ix)特性： (A)名稱/關键·修飾部位 -102- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _—«----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1227242 _B7 五、發明說明（100 ) (B)位置：15 (D)其他資料：/註= nIle，Met or Val (xi)序列敘述：SEQ ID NO : 60 ·· -—·----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -103-

Xaa 1 Xaa Glu Xaa Xaa 5 Gly Val lie Val Xaa 10 Xaa Xaa Glu Xaa Xaa 15 Gly Gly Cys Asn Gin 20 Gly Ser Phe Leu Thr 25 Lys Gly Pro Ser Lys 30 Leu Asn Asp Arg Ala 35 Asp Ser Arg Arg Ser 40 Leu Trp Asp Gin Gly 45 Asn Cys 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1227^4^106132號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(93年10月) A B c D

i.j先 修補 7曰 ο 申請專利範圍 公告本 1. 一種CD4-CDR2抗原胜肽，其中該抗原胜肽為長度約30 至約46之間之胺基酸；其中該CD4-CDR2抗原胜肽含有2 個半胱胺酸殘基，藉28至40個胺基酸殘基的插入序列分 開，且其中該插入序列為SEQ ID ΝΟ:1之殘基27至66序 列之連續部份，或為SEQ ID NO:2、3、4、5、10或11。 2. 根據申請專利範圍第1項之CD4-CDR2抗原胜肽，其中該 抗原胜肽係選自 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10及SEQIDNO:ll所組成之群。 3. —種長度約50至約80個胺基酸之合成胜肽，其包括： (a)輔助Τ細胞（Th)之抗原表位、（b)根據申請專利範圍第 1項之CD4-CDR2抗原胜肽；及（c)免疫刺激性之侵染素區 域。 4. 一種長度約50至約80個胺基酸之合成胜肽，其包括： (a)輔助丁細胞（Th)之抗原表位、（b)根據申請專利範圍第 2項之CD4-CDR2抗原胜肽；及（c)免疫刺激性之侵染素區 域。 5· 一種胜肽或胜肽結合物，包括輔助T細胞（Th)抗原表 位’共價連接於根據申請專利範圍第1項之CD4-CDR2抗 原胜肽。 6· —種胜肽或胜肽結合物，包括輔助τ細胞（Th)抗原表 位’共價連接於根據申請專利範圍第2項之CD4-CDR2抗 原胜肽。 7. —種如下式之胜肽或胜肽結合物： (A)n - (CD4-CDR2 抗原胜肽）-(B)。- (Th)m - X 56443-931007.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 8 8 8 8 A B c D 1227242 六、申請專利範圍 或（A)n - (Th)m - (B)。- (CD4-CDR2 抗原胜肽）-X， 其中 每一 A各自為胺基酸或SEQ ID Ν0··7之一般的免疫刺激性序 列； 每一 Β係選自下列所組成之群： 胺基酸， -NHCH(X)CH2SCH2CO-，-NHCH(X)CH2SCH2C〇U-N)Lys-， -NHCH(X)CH2S-琥珀醯亞胺基 U -N)Lys-，及 -NHCH(X)CH2S-(琥珀醯亞胺基）_ ; 每一 Th係選自下列所組成之群：SEQ ID N0S:6、8、12、 13、36及38-59及其免疫增加類似物，其中SEQ ID N0S:6、 8、12、13、36及38-59係根據羅士拔（Rothbard)序列及 1，4，5，8規貝丨J修飾； CD4-CDR2抗原胜肽代表根據申請專利範圍第1項之抗原胜 肽之序列； X是胺基酸a -COOH或a -C0NH2 ; η是從0到10 ; m是從1到4 ;及 〇是從0到10。 8. —種如下式之胜肽或胜肽結合物： (CD4-CDR2 抗原胜肽）-(B)0 - (Th)m - (A)n - X 或（Th)m - (Β)。- (CD4-CDR2 抗原胜肽）-(Α)η - X， 其中 每一 Α各自為胺基酸或SEQ ID Ν0:7之一般的免疫刺激性序 56443-931007.DOC ~ 2 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規輅(210Χ 297公釐）.

8 8 8 8 A BCD 々、申請專利範圍 列； 每一 B是係選自由下列所組成之群·· 胺基酸， -NHCH(X)CH2SCH2CO-，-NHCH(X)CH2SCH2CO( ε -N)Lys-， -NHCH(X)CH2S-琥珀醯亞胺基（ε -N)Lys-，及 -NHCH(X)CH2S-(琥珀醯亞胺基）-; 每一 Th係選自下列所組成之群：SEQ ID N0S:6、8、12、 13、36及38-59及其免疫增加類似物，其中SEQ ID N0S:6、 8、12、13、36及38-59係根據羅士拔（Rothbard)序歹ij 及 1，4，5，8規則修飾； CD4-CDR2抗原胜肽代表根據申請專利範圍第1項之抗原胜 肽之序列； X是胺基酸a -COOH或a -CONH2 ; η是從0到10 ; m是從1到4， 〇是從0到10。 9. 一種如下式之胜肽或胜肽結合物： (A)n - (CD4-CDR2 抗原胜肽）-(B)。- (Th)m - X 或是（A)n - (Th)m - (B)。- (CD4-CDR2 抗原胜肽）-X， 其中 每一 A各自為胺基酸或SEQ ID N0:7之一般的免疫刺激性序 列； 每一 B係選自下列所組成之群： 胺基酸， 56443-931007.DOC ~ 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

8 8 8 8 A B c D 1227242 々、申請專利範圍 -NHCH(X)CH2SCH2CO-，-NHCH(X)CH2SCH2CO( ε -N)Lys-， -NHCH(X)CH2S-琥珀醯亞胺基（ε -N)Lys_，及 -NHCH(X)CH2S-(琥珀醯亞胺基）-; 每一 Th係選自下列所組成之群：SEQ ID N0S:6、8、12、 13、36及38-59及其免疫增加類似物，其中SEQ ID N0S:6、 8、12、13、36及38-59係根據羅士拔（Rothbard)序列及 1，4，5，8規則修飾； CD4-CDR2抗原胜肽代表根據申請專利範圍第2項之抗原胜 肽之序列； X是胺基酸a -COOH或a -CONH2 ; η是從0到10 ; m是從1到4 ;及 〇是從0到10。 10. —種如下式之胜肽或胜肽結合物： (CD4-CDR2 抗原胜肽）-(Β)0· (Th)m - (A)n - X 或（Th)m - (B)。- (CD4_CDR2 抗原胜肽）-(A)n _ X， 其中 每一 A各自為胺基酸或SEQ ID N0:7之一般的免疫刺激性序 列； 每一 B係選自下列所組成之群： 胺基酸， -NHCH(X)CH2SCH2C〇-，-NHCH(X)CH2SCH2CO( ε -N)Lys-， -NHCH(X)CH2S-琥珀醯亞胺基（ε -N)Lys-，及 -NHCH(X)CH2S-(琥珀醯亞胺基）-; 56443-931007.DOC ~ 4 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1227242

每一 Th係選自下列所組成之群· SEq ID n〇s:6、8、12、 13、36及38-59及其免疫增加類似物，其中SEQ m n〇s:6、 8、12、13、36及38-59係根據羅士拔（R〇thbard)序列及 1，4，5，8規則修飾； CD4-CDR2抗原胜肽代表根據申請專利範圍第2項之抗原胜 肽之序列； X是胺基酸a -COOH或α _C0NH2 ; η是從0到l〇 ; m是從1到4， 〇是從0到10。 11·根據申請專利範圍第3 _ 1〇項中任一項之胜肽或胜肽結合 物，其中該Th具有選自SEq ID n〇S:6, 8, 12, 13, 36,及瓜 59所組成之群之胺基酸序列。 12·根據申請專利範圍第丨丨項之胜肽或胜肽結合物，其中該 Th具有選自SEQ ID N0:6，及SEQ ID N0:8所組成之群之 胺基酸序列。 13·根據申請專利範圍第3 _ 1〇項中任一項之胜肽或胜肽結合 物’其中η為3及（A)3為（侵染素區域卜Gly_G1y。 14·根據申請專利範圍第丨丨項之胜肽或胜肽結合物，其中至 少一部份A是侵染素區域。 15·根據申請專利範圍第12項之胜肽或胜肽結合物，其中至 )一邵份A是侵染素區域。 16.根據申請專利範圍第3 _ 10項中任一項之胜肽或胜肽結合 物’其中該CD4-CDR2抗原胜肽係選自SEQ ID NOS: 4, 5, 56443-9310Q7.doc C

ABC D 1227242 六、申請專利範圍 1〇,及11所組成之群。 17·根據申請專利範圍第11項之胜肤或胜肤結合物，其中該 CD4-CDR2抗原胜肽係選自SEQ ID NOS: 4, 5, 10,及11所組 成之群。 18.根據申請專利範圍第12項之胜肽或胜肽結合物，其中該 CD4-CDR2抗原胜肽係選自SEQ ID NOS: 4, 5, 10,及11所組 成之群。 19· 一種胜肽，係選自SEQ ID NOS..32, 33, 34, 35,及60所組成 之群。 20. —種於哺乳動物謗發對c D 4表面複合物之抗體之醫藥組 合物，其包括免疫有效量之根據申請專利範圍第3 _ 1〇或 19項中任一項之胜肽或胜肽結合物，進一步包括醫藥上 可接受之載劑。 21·根據申請專利範圍第20項之醫藥組合物，其中該免疫有 效量之該胜肽或胜肽結合物係每次劑量每公斤體重約 〇.5微克至約1亳克。 22. —種在哺乳動物中抑制HIV結合至CD4+細胞之醫藥組合 物，其包括免疫有效量之根據申請專利範圍第3 _ 1〇或19 項中任一項之胜肽或胜肽結合物，進一步包括醫藥上可 接受之載劑。 23. 根據申請專利範圍第2 2項之醫藥组合物，其中該免疫有 效里之遠胜肤或胜肤結合物係每次劑量每公斤體重約 〇·5微克至約1亳克。 56443-931007.DOC - β - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210^297公 -~