KR20240082388A - 프리필드 시린지 제제의 조제 방법 - Google Patents

프리필드 시린지 제제의 조제 방법 Download PDF

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KR20240082388A
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추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 단백질을 포함하는 용액이 용기에 충전된 주사용 제제에 있어서, 목시에 의해 검출 가능한 입자의 형성을 저감하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 의해, 입자의 형성 리스크가 높은 단백질을 판정하는 방법이 제공된다.

Description

프리필드 시린지 제제의 조제 방법
본 발명은, 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는, 용기에 충전된 의약 제제에 관한 것이다.
근년, 여러 가지 항체 제제가 개발되어 실용에 제공되고 있지만, 많은 항체 제제는 정맥 주사용 제제로서 이용되고 있다. 한편, 의료 현장의 요구에 의해, 항체 함유 제제를 자기 주사 가능한 피하 주사용 제제로서 개발하는 요망이 높아지고 있다. 특히, 프리필드 시린지에 봉입된 용액 제제가, 그의 편리성 때문에 그 개발의 요망이 높다.
피하 주사용의 항체 함유 제제를 설계함에 있어서는, 1회당의 항체 투여량이 대량이 되는 한편으로(80∼200mg 정도), 피하 주사에서는 일반적으로 주사액량의 제한이 있기 때문에, 투여액 중의 항체의 고농도화가 필수가 되고 있다.
근년, 자기 주사용의 프리필드 시린지 제제로서, 내부에 약제가 충전된 통형상의 주사기 본체와, 상기 주사기 본체의 선단에 장착된 주사침과, 착탈 가능하게 장착된 주사침을 덮는 시린지 캡과, 상기 주사기 본체 내에 삽입되어, 해당 주사기 본체의 축심 방향으로 슬라이드 이동 가능한 플런저를 구비한 프리필드 시린지가 의료 현장에서 사용되게 되어 왔다.
프리필드 시린지를 사용할 때에는, 시린지 캡을 제거하고, 투여 부위에 침을 삽입 후, 플런저 로드로 플런저를 전방으로 이동시킴으로써, 약액을 배출·투여한다. 일반적으로, 본 플런저의 접동성을 확보하기 위해서, 프리필드 시린지의 내벽 및 플런저에 윤활제인 실리콘 오일 등을 도포하는 것이 행해지고 있다.
항체 함유 제제에 있어서는, 수용액 중에서의 입자의 형성이 문제가 된다. 형성되는 입자로서는, 이량체나 삼량체와 같은 다량체보다도 큰 응집체이지만, 일반적으로 눈으로 보는 것은 곤란하다고 여겨지는, 1.5μm∼50μm 미만까지의 입경의 미립자인 서브비저블 입자(sub-visible particle, SVP)나, 표준 조도(2,000-3,000lx 정도)에서 목시(目視)에 의해 검출 가능한 가시 입자(visible particle: VP, 100μm보다 크다)가 알려져 있다. 한편, 의약 제제에 있어서의 가시 입자의 목시에 의한 검출률은 실시자에 의한 간차(間差)가 크지만, 일본 약국방에 규정되어 있는 표준 조도(2,000-3,000lx 정도)에 있어서는 100μm의 입경의 입자의 검출 감도가 40% 정도, 150μm의 입경의 입자의 검출 감도가 70% 정도, 200μm의 입경의 입자의 검출 감도가 거의 100%가 되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 또한, 의약 제제를 관찰하는 조도를 올리거나, 관찰 시간을 길게 하거나 함으로써, 실제로는 최소 40μm 정도의 더 작은 입경의 입자까지 목시로 검출하는 것도 가능하다. 본 명세서에서는, 특히 이와 같은 40μm∼100μm의 입자를 고조도에서만 목시에 의해 검출 가능한 입자라고 부른다. 또한, 40μm 이상의 입경을 갖는 입자는, 고조도에서 목시에 의해 검출 가능한 입자이며, 목시에 의해 검출 가능한 입자라고 칭한다.
일반적으로 항체는 기액 계면이나 고액 계면과 같은 계면에 흡착되어, 응집하는 성질을 갖고 있다. 이들 계면의 존재가 상기 목시에 의해 검출 가능한 입자의 형성에 기여하고 있을 가능성이 있다. 항체 용액을 충전한 시린지에 메커니컬 스트레스를 줌으로써, 계면의 존재에 기인하는 미립자의 현저한 증가가 보고되어 있다(비특허문헌 2). 시린지에 충전된 항체 용액은, 기포가 존재함으로써 기액 계면을 형성하고, 플런저 및 시린지 배럴과 접촉함으로써, 고액 계면을 형성한다. 또한, 프리필드 시린지의 플런저 및 배럴이 실리콘 도포되어 있는 경우, 항체 용액은 고상 표면의 실리콘과 접촉하여, 새로운 고액 계면을 형성한다. 또한, 고액 계면에 흡착되어, 응집한 단백질은 프리필드 시린지 중의 공기의 이동에 의해, 액 중에 박락되어, 가시 입자로서 나타나는 것도 보고되어 있다(비특허문헌 3).
각종 계면에서 받는 스트레스를 저감하는 방법으로서, 프리필드 시린지 내의 기포의 양을 줄이는 것을 들 수 있다. 기포의 양을 줄임으로써, 프리필드 시린지 중을 이동하는 공기의 양을 줄일 수 있고, 그 결과로서, 기액 계면이나 고액 계면에 대한 흡착이나 응집체의 탈착을 억제할 수 있다고 생각된다.
지금까지, 특정한 항체를 포함하는 프리필드 시린지에 대하여, 용액 중의 기포의 양을 줄임으로써, 계면활성제가 포함되어 있지 않은 용액 중의 눈으로는 보이지 않는 입자나 가시 입자의 양을 저감할 수 있는 것이 보고되어 있지만, 모두 분자 각론적인 결과이고 또한 극히 불안정한 조건에서의 평가 결과이다(특허문헌 1, 2).
단백질의 구성 요소인 아미노산 잔기는 측쇄에 포함되는 작용기의 차이에 의해 잔기마다 물성이 상이하다. 측쇄의 물성의 특징으로서는, 측쇄에 전하를 갖는 작용기를 가지고 있는가, 및 측쇄가 얼마나 소수적인가 하는 점에서, 크게 2종류로 분류 가능하다.
계산 화학 소프트웨어를 이용하여, 아미노산 서열 정보를 입력하면 당해 단백질의 입체 구조 모델을 계산기 중에 구축할 수 있는 것은 당업자에게는 주지이다.
아미노산 잔기의 물성 중, 전하에 대해서는 분자력장으로 불리는 파라미터를 이용하여 원자 레벨에서의 부분 전하가 계산 가능하다. 계산 화학 소프트웨어로서 이용되는 Molecular Operating Environment(MOE; Chemical Computing Group Inc.(CCG))에서는 Amber10:EHT라고 하는 분자력장이 채용되고 있으며, 단백질의 아미노산을 구성하는 각 원자의 부분 전하에 대해서는 1995년에 발표된 이래 계속적으로 개량되고 있는 Amber역장(비특허문헌 4)의 버전 ff10에 의해 할당된다. 아미노산 잔기의 소수도의 지표로서는, 실험적으로 측정 가능한 물 옥탄올 분배 계수 logP와 상관하는 소수도의 지표가 1990년대에 확립되어 있고, MOE에서는 Crippen 등이 개발한 지표가 채용되고 있다(비특허문헌 5).
이상과 같은 개별의 아미노산 잔기의 전하, 소수도의 지표를 기준으로, 단백질의 입체 구조상에서의 유전하·소수적인 아미노산 잔기의 일정 이상의 국재(패치)를 검출하는 방법이 1990년대에 제안되어 있고(비특허문헌 6), 각각, 전하 패치·소수성 패치로서 전술한 계산 화학 소프트웨어 MOE로 검출 가능하고, 창약에 있어서의 실험 데이터와 어느 정도 상관하는 것이 2018년에 보고되어 있다(비특허문헌 7).
또한, 계산 화학 소프트웨어 MOE의 제제 개발에 대한 적용예로서, MOE로 계산한 항체의 소수성 패치의 면적과 가시 입자의 발생률이 어느 정도 상관하는 것은 보고되어 있다(비특허문헌 8).
일본 특허공개 2015-042638호 공보 국제 공개 제2017/184880호
James A. Melchore, AAPS PharmSciTech; 2011; 12(1): 215-221. Torisu et al., J. Pharm. Sci. 106 (2017) 2966-2978. Gerhardt et al., J. Pharm. Sci. 103 (2014) 1601-1612. Cornell et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 5179-5197. Wildman et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1999, 39, 868-873. Jones et al., J. Mol. Biol. 1997 272, 133-143. Jetha et al., MABS 2018, 10, 6, 890-900. Grapentin et al., J. Pharm. Sci. 109 (2020) 2393-2404.
입체 구조 모델의 계산 결과에 기초하는 소수성 패치 이외의 파라미터와, 프리필드 시린지 제제에 포함되는 용액 중에서 형성되는 목시에 의해 검출 가능한 입자 발생 리스크의 상관에 대하여 전혀 알려져 있지 않았다. 또한, 입자 발생을 억제하기 위한 보다 좋은 방법이 요구되고 있다.
본 발명자들은, 특히 분자 중에 많은 개변이 실시되어, 소수성이나 전하의 편향이 증가한 바이오 의약품에 대하여, 적절한 양의 계면활성제 첨가 후에 있어서도, 목시에 의해 검출 가능한 입자의 형성을 완전히 억제하는 것은 곤란한 것을 발견했다.
그래서, 본 발명자들은, 소수성 패치의 면적 및 전하 패치의 면적으로부터 산출되는 수치가 일정 이상인 항체에 대하여, 기포 용량을 저감함으로써, 계면활성제 첨가 후에 있어서도 완전히 억제할 수 없었던 프리필드 시린지 제제 중의 목시에 의해 검출 가능한 입자의 형성을 크게 억제할 수 있는 것을 발견했다. 본 명세서는 이하의 발명의 개시를 포함한다.
[1-1] 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 방법으로서,
호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 것,
얻어진 모델의 표면 중, 소수성 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분, 및 전하를 갖는 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분을 각각 소수성 패치 및 전하 패치로서 특정하여, 각각의 면적을 산출하는 것,
면적의 크기에 따른 랭킹으로 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합(X(Å2)), 및 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 것, 및
X+Y×1.5가 1700 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 것을 포함하고,
입자가 40μm 이상의 입경을 갖는, 상기 방법.
[1-2] 전하가 양전하인, [1-1]에 기재된 방법.
[1-3] 전하가 음전하인, [1-1]에 기재된 방법.
[1-4] X+Y×1.5가 2000 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는, [1-1]∼[1-3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[1-5] 호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 있어서, 분자력장으로서 Amber10:EHT를 이용하는, [1-1]∼[1-4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[1-6] 입자가 100μm보다 높은 입경을 갖는, [1-1]∼[1-5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[1-7] 용액이 수용액인, [1-1]∼[1-6] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[1-8] 단백질이 모노클로날 항체, 융합 단백질, 호르몬, 사이토카인, 효소, 백신인, [1-1]∼[1-7] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[1-9] 단백질이 모노클로날 항체인, [1-1]∼[1-8] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[1-10] 모노클로날 항체가 모노스페시픽 항체, 또는 바이스페시픽 항체 중 어느 것인, [1-9]에 기재된 방법.
[1-11] 모노클로날 항체가 IgG1, IgG2 및 IgG4 중 어느 하나인, [1-9]에 기재된 방법.
[1-12] 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 것이, 항체 모델링에 의해 행해지는, [1-1]∼[1-11] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[1-13] 호몰로지 모델링 또는 항체 모델링이, Molecular Operating Environment(MOE) 소프트웨어를 이용하여 행해지는, [1-1]∼[1-12] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[2-1] 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 방법으로서,
호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 것,
얻어진 모델의 표면의 전하를 갖는 잔기의 클러스터에 대응하는 부분을 전하 패치로서 특정하여, 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 것, 및
Y가 600 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 것을 포함하고,
입자가 40μm 이상의 입경을 갖는, 상기 방법.
[2-2] 전하가 양전하인, [2-1]에 기재된 방법.
[2-3] 전하가 음전하인, [2-1]에 기재된 방법.
[2-4] Y가 700 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는, [2-1]∼[2-3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[2-5] 호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 있어서, 분자력장으로서 Amber10:EHT를 이용하는, [2-1]∼[2-4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[2-6] 입자가 100μm보다 높은 입경을 갖는, [2-1]∼[2-5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[2-7] 용액이 수용액인, [2-1]∼[2-6] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[2-8] 단백질이 모노클로날 항체, 융합 단백질, 호르몬, 사이토카인, 효소, 백신인, [2-1]∼[2-7] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[2-9] 단백질이 모노클로날 항체인, [2-1]∼[2-8] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[2-10] 모노클로날 항체가 모노스페시픽 항체, 또는 바이스페시픽 항체 중 어느 것인, [2-9]에 기재된 방법.
[2-11] 모노클로날 항체가 IgG1, IgG2 및 IgG4 중 어느 하나인, [2-9]에 기재된 방법.
[2-12] 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 것이, 항체 모델링에 의해 행해지는, [2-1]∼[2-11] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[2-13] 호몰로지 모델링 또는 항체 모델링이, Molecular Operating Environment(MOE) 소프트웨어를 이용하여 행해지는, [2-1]∼[2-12] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[3-1] 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 용액이 용기에 충전된 주사용 제제에 있어서, 용액 중에서의 입자의 발생을 저감시키는 방법으로서,
용기 내의 기포의 용량을 40μL 이하로 하는 것을 포함하고,
용기가 시린지 또는 카트리지이며,
단백질이, [1-1]∼[1-13] 및 [2-1]∼[2-13] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높다고 판정되는 단백질인, 방법.
[3-2] 용기 내의 기포의 용량을 10μL 이하로 하는 것을 포함하는, [3-1]에 기재된 방법.
[3-3] 용기가 시린지인, [3-1] 또는 [3-2]에 기재된 방법.
[3-4] 진공 스토퍼 배치법 또는 기계적 스토퍼 배치법에 의해 시린지의 마개를 하는, [3-3]에 기재된 방법.
[3-5] 입자가 100μm 이상의 입경을 갖는, [3-1]∼[3-4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[3-6] 용액이 수용액인, [3-1]∼[3-5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[3-7] 단백질이 모노클로날 항체, 융합 단백질, 호르몬, 사이토카인, 효소, 백신인, [3-1]∼[3-6] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[3-8] 단백질이 모노클로날 항체인, [3-1]∼[3-7] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[3-9] 모노클로날 항체가 모노스페시픽 항체, 또는 바이스페시픽 항체 중 어느 것인, [3-8]에 기재된 방법.
[3-10] 모노클로날 항체가 IgG1, IgG2 및 IgG4 중 어느 하나인, [3-8]에 기재된 방법.
[3-11] 모노클로날 항체가 서열 번호 3 및 4의 H쇄와 서열 번호 5의 L쇄를 갖는 항체, 또는 서열 번호 6의 H쇄와 서열 번호 7의 L쇄를 갖는 항체로부터 선택되는, [3-8]에 기재된 방법.
[3-12] 모노클로날 항체가 서열 번호 8의 H쇄와 서열 번호 9의 L쇄의 조합 및 서열 번호 11의 H쇄와 서열 번호 10의 L쇄의 조합을 갖는 항체인, [3-8]에 기재된 방법.
[4-1] 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 용액이 용기에 충전된 주사용 제제를 조제하는 방법으로서,
얻어지는 주사용 제제에 있어서 용기 내의 기포의 용량이 40μL 이하가 되도록, 용기 내에 용액을 충전하는 것을 포함하고,
용기가 시린지 또는 카트리지이며,
단백질이, [1-1]∼[1-13] 및 [2-1]∼[2-13] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높다고 판정되는 단백질인, 방법.
[4-2] 얻어지는 주사용 제제에 있어서 용기 내의 기포의 용량이 10μL 이하가 되도록, 용기 내에 용액을 충전하는 것을 포함하는, [4-1]에 기재된 방법.
[4-3] 용기가 시린지인, [4-1] 또는 [4-2]에 기재된 방법.
[4-4] 용기 내로의 용액의 충전에 있어서, 진공 스토퍼 배치법 또는 기계적 스토퍼 배치법에 의해 용기의 마개를 하는, [4-3]에 기재된 방법.
[4-5] 입자가 100μm 이상의 입경을 갖는, [4-1]∼[4-4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[4-6] 용액이 수용액인, [4-1]∼[4-5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[4-7] 단백질이 모노클로날 항체인, [4-1]∼[4-6] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[4-8] 모노클로날 항체가 모노스페시픽 항체, 또는 바이스페시픽 항체 중 어느 것인, [4-7]에 기재된 방법.
[4-9] 모노클로날 항체가 IgG1, IgG2 및 IgG4 중 어느 하나인, [4-7]에 기재된 방법.
[4-10] 모노클로날 항체가 서열 번호 3 및 4의 H쇄와 서열 번호 5의 L쇄를 갖는 항체, 또는 서열 번호 6의 H쇄와 서열 번호 7의 L쇄를 갖는 항체로부터 선택되는, [4-7]에 기재된 방법.
[4-11] 모노클로날 항체가 서열 번호 8의 H쇄와 서열 번호 9의 L쇄의 조합 및 서열 번호 11의 H쇄와 서열 번호 10의 L쇄의 조합을 갖는 항체인, [4-7]에 기재된 방법.
[5-1] 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 용액이 용기에 충전된 주사용 제제로서,
단백질이, [1-1]∼[1-13] 및 [2-1]∼[2-13] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높다고 판정되는 단백질이고,
용기가 시린지 또는 카트리지이며,
용기 내의 기포의 용량이 40μL 이하인, 주사용 제제.
[5-2] 용기 내의 기포의 용량이 10μL 이하인, [5-1]에 기재된 주사용 제제.
[5-3] 용기가 시린지인, [5-1] 또는 [5-2]에 기재된 주사용 제제.
[5-4] 용액 중의 단백질의 농도가 0.1mg/mL 이상인, [5-1]∼[5-3] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-5] 용액 중의 단백질의 농도가 0.1∼300mg/mL의 범위인, [5-1]∼[5-4] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-6] 용액 중의 단백질의 농도가 1∼200mg/mL의 범위인, [5-1]∼[5-5] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-7] 1mL 시린지 내에 포함되는 용액이 0.1∼1.2mL의 범위이거나, 또는 2.25mL 시린지 내에 포함되는 용액이 0.1∼2.5mL의 범위인, [5-1]∼[5-6] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-8] 1mL 시린지 내에 포함되는 용액이 0.2∼1.1mL의 범위이거나, 또는 2.25mL 시린지 내에 포함되는 용액이 0.3∼2.3mL의 범위인, [5-1]∼[5-7] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-9] 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 용액이 용기에 충전된 주사용 제제가, 내부에 의약 제제를 함유하는 시린지 또는 카트리지와 스토퍼를 포함하고, 시린지 또는 카트리지가 유리 또는 사이클로올레핀계의 수지제인, [5-1]∼[5-8] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-10] 사이클로올레핀계의 수지가 사이클로올레핀 폴리머(COP) 또는 사이클로올레핀 코폴리머(COC)인, [5-9]에 기재된 주사용 제제.
[5-11] 입자가 100μm 이상의 입경을 갖는, [5-1]∼[5-10] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-12] 용액이 수용액인, [5-1]∼[5-11] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5-13] 단백질이 모노클로날 항체인, [5-1]∼[5-12] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-14] 모노클로날 항체가 모노스페시픽 항체, 또는 바이스페시픽 항체 중 어느 것인, [5-13]에 기재된 주사용 제제.
[5-15] 모노클로날 항체가 IgG1, IgG2 및 IgG4 중 어느 하나인, [5-13]에 기재된 주사용 제제.
[5-16] 모노클로날 항체가 서열 번호 3 및 4의 H쇄와 서열 번호 5의 L쇄를 갖는 항체, 또는 서열 번호 6의 H쇄와 서열 번호 7의 L쇄를 갖는 항체로부터 선택되는, [5-13]에 기재된 주사용 제제.
[5-17] 용액이, 당, 당 알코올, 완충제, 보존제, 담체, 산화 방지제, 킬레이트제, 천연 폴리머, 합성 폴리머, 동결 보호제, 계면활성제, 증량제, 안정화제 또는 이들의 조합을 포함하는, 1종 또는 복수의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, [5-1]∼[5-16] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-18] 계면활성제가 폴리소르베이트, 폴록사머 188, 라우릴 황산 나트륨, 폴리올, 폴리(에틸렌 글라이콜), 글리세롤, 프로필렌 글라이콜 또는 폴리(바이닐 알코올)인, [5-17]에 기재된 주사용 제제.
[5-19] 계면활성제가 폴리소르베이트 혹은 폴록사머 188인, [5-17] 또는 [5-18]에 기재된 주사용 제제.
[5-20] 용액 중의 계면활성제의 농도가 0.01mg/mL 이상인, [5-17]∼[5-19] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-21] 용액 중의 계면활성제의 농도가 0.01∼5mg/mL의 범위인, [5-17]∼[5-20] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-22] 용액 중의 계면활성제의 농도가 0.25∼0.75mg/mL의 범위인, [5-17]∼[5-21] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-23] 용액의 pH가 4.5∼7.5의 범위인, [5-1]∼[5-22] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-24] 용액의 pH가 5.0∼7.0의 범위인, [5-1]∼[5-23] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-25] 용액의 pH가 5.5∼6.5의 범위인, [5-1]∼[5-24] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-26] 25℃에서 보관 중에 낙하 스트레스가 주어진 주사용 제제의 3개월 보관 후에 있어서의 평균의 입자수가, 주사용 제제 내의 기포의 용량이 120μL인 조건의 경우에 비해 감소하는, [5-1]∼[5-25] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-27] 0.01mg/mL의 계면활성제를 포함하는 주사용 제제의 5℃에서 1일 보관 후에 있어서의 평균의 입자수가, 주사용 제제 내의 기포의 용량이 120μL인 조건의 경우에 비해 감소하는, [5-1]∼[5-25] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[5-28] 모노클로날 항체가 서열 번호 8의 H쇄와 서열 번호 9의 L쇄의 조합 및 서열 번호 11의 H쇄와 서열 번호 10의 L쇄의 조합을 갖는 항체인, [5-13], [5-14], 또는 [5-17]∼[5-26] 중 어느 하나에 기재된 주사용 제제.
[6-1] 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 시스템으로서,
호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 수단,
얻어진 모델의 표면 중, 소수성 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분, 및 전하를 갖는 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분을 각각 소수성 패치 및 전하 패치로서 특정하여, 각각의 면적을 산출하는 수단,
면적의 크기에 따른 랭킹으로 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합(X(Å2)), 및 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 수단, 및
X+Y×1.5가 1700 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 수단을 포함하고,
입자가 40μm 이상의 입경을 갖는, 상기 시스템.
[6-2] 전하가 양전하인, [6-1]에 기재된 시스템.
[6-3] 전하가 음전하인, [6-1]에 기재된 시스템.
[6-4] X+Y×1.5가 2000 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는, [6-1]∼[6-3] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[6-5] 호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 있어서, 분자력장으로서 Amber10:EHT를 이용하는, [6-1]∼[6-4] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[6-6] 입자가 100μm보다 높은 입경을 갖는, [6-1]∼[6-5] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[6-7] 용액이 수용액인, [6-1]∼[6-6] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[6-8] 단백질이 모노클로날 항체, 융합 단백질, 호르몬, 사이토카인, 효소, 백신인, [6-1]∼[6-7] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[6-9] 단백질이 모노클로날 항체인, [6-1]∼[6-8] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[6-10] 모노클로날 항체가 모노스페시픽 항체, 또는 바이스페시픽 항체 중 어느 것인, [6-9]에 기재된 시스템.
[6-11] 모노클로날 항체가 IgG1, IgG2 및 IgG4 중 어느 하나인, [6-9]에 기재된 시스템.
[6-12] 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 것이, 항체 모델링에 의해 행해지는, [6-1]∼[6-11] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[6-13] [6-1]∼[6-12] 중 어느 하나에 기재된 시스템에 있어서의 각 수단을 컴퓨터에 작동시키는 것을 특징으로 하는 프로그램.
[6-14] [6-13]에 기재된 프로그램을 기억한 것을 특징으로 하는 기억 매체.
[6-15] [6-13]에 기재된 프로그램이 인스톨된, 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치.
[7-1] 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 시스템으로서,
호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 수단,
얻어진 모델의 표면의 전하를 갖는 잔기의 클러스터에 대응하는 부분을 전하 패치로서 특정하여, 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 수단, 및
Y가 600 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 수단을 포함하고,
입자가 40μm 이상의 입경을 갖는, 상기 시스템.
[7-2] 전하가 양전하인, [7-1]에 기재된 시스템.
[7-3] 전하가 음전하인, [7-1]에 기재된 시스템.
[7-4] Y가 700 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는, [7-1]∼[7-3] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[7-5] 호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 있어서, 분자력장으로서 Amber10:EHT를 이용하는, [7-1]∼[7-4] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[7-6] 입자가 100μm보다 높은 입경을 갖는, [7-1]∼[7-5] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[7-7] 용액이 수용액인, [7-1]∼[7-6] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[7-8] 단백질이 모노클로날 항체, 융합 단백질, 호르몬, 사이토카인, 효소, 백신인, [7-1]∼[7-7] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[7-9] 단백질이 모노클로날 항체인, [7-1]∼[7-8] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[7-10] 모노클로날 항체가 모노스페시픽 항체, 또는 바이스페시픽 항체 중 어느 것인, [7-9]에 기재된 시스템.
[7-11] 모노클로날 항체가 IgG1, IgG2 및 IgG4 중 어느 하나인, [7-9]에 기재된 시스템.
[7-12] 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 것이, 항체 모델링에 의해 행해지는, [7-1]∼[7-11] 중 어느 하나에 기재된 시스템.
[7-13] [7-1]∼[7-12] 중 어느 하나에 기재된 시스템에 있어서의 각 수단을 컴퓨터에 작동시키는 것을 특징으로 하는 프로그램.
[7-14] [7-13]에 기재된 프로그램을 기억한 것을 특징으로 하는 기억 매체.
[7-15] [7-13]에 기재된 프로그램이 인스톨된, 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치.
본 발명의 하나의 측면에 의하면, 프리필드 시린지 제제의 용액 중에 있어서 목시에 의해 검출 가능한 입자의 형성 리스크가 높은 단백질을 판정할 수 있다. 본 발명의 다른 측면에 의하면, 목시에 의해 검출 가능한 입자의 형성을 최대한 억제한 프리필드 시린지 제제를 제공할 수 있다.
도 1은, 시린지 중의 기포가 (a) 120μL, (b) 40μL, (c) 10μL일 때의 사진이다.
도 2는, 낙하 시험에 이용하는 골판지 상자의 개략도이다.
도 3은, 시린지의 구성도의 일례이다.
도 4는, 실시예 3에서 동정한 단백성의 목시에 의해 검출 가능한 입자의 사이즈의 히스토그램이다.
도 5는, 소수성 패치 및 전하 패치에 기초하여, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치용의 프로그램을 실행했을 때의 처리의 플로를 나타낸다.
도 6은, 전하 패치에 기초하여, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치용의 프로그램을 실행했을 때의 처리의 플로를 나타낸다.
도 7은, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치의 개략 구성도를 나타낸다.
(1) 목시에 의해 검출 가능한 입자를 형성할 리스크의 판정
본 명세서에 있어서, 목시에 의해 검출 가능한 입자란, 고조도에서 목시에 의해 검출 가능한 입자이며, 40μm 이상의 입경을 갖는다. 이 중, 일본 약국방에 규정되어 있는 표준 조도(2,000-3,000lx 정도)에서 목시에 의해 검출 가능한 입자를 「가시 입자」 또는 「불용성 가시성 입자」라고 부른다. 가시 입자는 일반적으로 100μm보다 큰 입경을 갖는다(비특허문헌 1). 가시 입자보다도 작은 사이즈이고, 일본 약국방에 규정되어 있는 표준 조도(2,000-3,000lx 정도)에서는 눈에 보이지 않지만 조도를 올리거나, 관찰 시간을 길게 하거나 함으로써 목시에 의해 검출 가능한 입자는 「고조도에서만 목시에 의해 검출 가능한 입자」이며, 40μm∼100μm의 입경을 갖는다. 가시 입자는, 조명하, 표준 조도(2,000-3,000lx 정도)에 있어서, 흑색 배경 또는 백색 배경 앞에서 용기를 완만하게 선회 또는 전도시켜 5초 이상, 육안으로 목시 검사하는 것에 의해 확인된다. 고조도에서만 목시에 의해 검출 가능한 입자는, 조명하, 고조도(6,000lx 이상)에 있어서, 흑색 배경 앞에서 용기를 완만하게 선회 또는 전도시켜 30초 이상, 육안으로 목시 검사하는 것에 의해 확인된다. 고조도에 있어서의 검사에서는 가시 입자도 확인 가능하다. 용액 중의 단백질 분자 이외로부터 생긴 입자는, 사이즈에 관계없이 「목시에 의해 검출 가능한 입자」로서 고려하지 않는다. 목시에 의해 검출 가능한 입자가 단백질 분자에 의한 것인 것은, 현미 라만 분광 측정에 의해 확인할 수 있다. 용액 중에 단백질로서 포함되는 것은 의약 유효 성분(API)만이며, 목시에 의해 검출 가능한 입자는 API로부터 생긴 것이다. 목시에 의해 검출 가능한 입자의 입경이나 수는, 광차폐 입자 계수법, 현미경 입자 계수법, 플로 사이토 입자 화상 해석법, 목시 검사, 입자를 단리한 후에 현미 적외 분광(infrared spectroscopy; IR) 측정이나 현미 라만 분광 측정함으로써 측정 가능하고, 바람직하게는 목시 검사와 현미 적외 분광 또는 현미 라만 분광 측정의 조합에 의해 측정된다.
본 명세서에 있어서, 의약 제제의 용액 중에서 「입자를 형성할 리스크가 높은」이란, 용액 중의 단백질 분자가 응집하여 목시에 의해 검출 가능한 입자를 형성하기 쉬운 것을 가리킨다. 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질의 예로서, 적절한 양의 계면활성제 첨가 후에 있어서도, 목시에 의해 검출 가능한 입자가 형성되는 단백질을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「기포」란, 용기 내의 액체와 용기의 벽면 사이 또는 액체 내의 기체의 공간을 가리킨다. 그것은 육안 또는 광학 현미경 검사에 의해 볼 수 있는 사이즈의 것이다. 「용기 내」란, 예를 들면 침 부착 프리필드 시린지의 경우, 리지드 니들 실드(RNS) 및 스토퍼로 시전(施栓)된 공간 전체를 포함하고, 구체적으로는 침 내부, 및 배럴 내부의 공간을 가리킨다. 용기가 수직위(垂直位)에 있을 때에 용기의 직경 전체에는 미치지 않고, 액체의 전부는 아니지만 일부가 용기의 덮개부(예를 들면, 스토퍼)의 저면과 접촉하고 있다. 어떤 태양에 있어서, 기포는 구형이다. 어떤 태양에 있어서, 기포는 구형은 아니다. 그와 같은 어떤 태양에 있어서, 기포는 난형(卵形)이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 기포의 용량은, 120μL 이하, 110μL 이하, 100μL 이하, 90μL 이하, 80μL 이하, 70μL 이하, 60μL 이하, 50μL 이하, 40μL 이하, 30μL 이하, 20μL 이하, 10μL 이하여도 된다. 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 기포의 용량은, 용기에 포함되는 기포의 전부가 일체화되었을 때의 기포의 용량으로서 측정된다. 기포의 용량은, 「이미 용액이 포함되는 피펫 등의 적당한 눈금 있는 용기에 침 끝으로부터 기체, 용액의 순서로 배출하여 기포의 용량을 실측한다」, 「화상을 취득하여, 기포 부분의 면적으로부터 기포의 용량을 산출한다」, 「기지의 배럴 내경 정보를 토대로, 기포 부분의 높이로부터 기포의 용량을 산출한다」 등의 수법에 의해 측정하는 것이 가능하다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하기 위해서 「호몰로지 모델링」이 사용된다. 「호몰로지 모델링」이란, 특정한 서열을 갖는 단백질에 대하여, 기지의 삼차원 구조를 갖는 1 이상의 단백질과의 서열의 유사성에 기초하여 삼차원 구조를 추정하는 방법이다. 특정한 아미노산 서열에 대한 호몰로지 모델링은 통상, 이하의 공정을 포함한다. 1) Protein Data Bank 중의 기지의 구조의 호몰로그를 특정한다, 2) 대상의 서열을 템플레이트 구조에 대응시켜 배치한다, 3) 그 얼라인먼트에 기초하여 모델을 구축한다, 4) 모델의 평가 및 정치화를 행한다(Xiang, Curr Protein Pept Sci. 2006 June; 7(3):217-227). 호몰로지 모델링 기능을 탑재한 삼차원 구조 추정을 행하는 소프트웨어로서, Molecular Operating Environment(MOE; Chemical Computing Group Inc. (CCG)(캐나다), Web Antibody Modelling(WAM; http://antibody.bath.ac.uk), Rosetta(https://www.rosettacommons.org/software), Prime(Schrodinger), MODELLER(Eswar, et al., Comparative Protein Structure Modeling With MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., Supplement 15, 5.6.1-5.6.30, 200.), SEGMOD/ENCAD(Levitt M. J Mol Biol 1992; 226:507-533), SWISS-MODEL(Schwede T, Kopp J, Guex N, Peitsch M C. Nucleic Acids Research 2003; 31:3381-3385.), 3D-JIGSAW(Bates et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, Suppl 2001; 5:39-46), NEST(Xiang, Curr Protein Pept Sci. 2006 June; 7(3): 217-227), 및 BUILDER(Koehl and Delarue, Curr Opin Struct Biol 1996; 6(2): 222-226) 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 바람직한 소프트웨어로서 MOE를 들 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「항체 모델링」이란, 모노클로날 항체에 특화된 삼차원 구조 추정 기능 및 데이터베이스이다. 항체 모델링에 있어서, 단편의 구조에 기초하여 전체의 구조를 조립할 수 있다. 예를 들면, 항체 Fab 프래그먼트를 Fc 프래그먼트 결정 구조에 추가하거나, Fab 프래그먼트를 추정 단백질 구조로서 형성하여 Fc 프래그먼트 결정 구조에 추가하거나 할 수 있다. 예를 들면, MOE에 탑재된 기능을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「패치」란 단백질 또는 항체의 삼차원 구조에 있어서 특정한 물리화학적 특성을 나타내는 잔기 클러스터의 표면 영역을 가리킨다. 패치로서 소수성 패치 및 전하 패치를 들 수 있다. 소수성 패치는 소수성 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분의 표면 영역이다. 소수성 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분은 소수성 잔기 이외의 잔기도 포함할 수 있다. 전하 패치는 전하를 갖는 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분의 표면 영역이다. 전하를 갖는 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분은 전하를 갖지 않는 잔기도 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, MOE의 Protein properties 기능으로 단백질의 패치 면적에 관한 특징량을 계산 가능하고, 특정한 단백질 표면의 패치의 면적에 관해서, 소수성 패치의 면적에 따른 랭킹으로 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합을 X(Å2), 전하 패치 총면적을 Y(Å2)로 했을 때, X+Y×1.5에 기초하여 단백질의 입자 형성 리스크가 판단된다. 하나의 태양에 있어서, X+Y×1.5의 값이 1700 이상인 단백질이 입자 형성 리스크가 높은 단백질로 판정된다. 다른 태양에 있어서, X+Y×1.5의 값이 2000 이상, 2500 이상, 3000 이상, 3500 이상, 또는 4000 이상인 단백질이 입자 형성 리스크가 높은 단백질로 판정된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, MOE의 Protein properties 기능으로 단백질의 패치 면적에 관한 특징량을 계산 가능하고, 특정의 단백질 표면의 패치의 면적에 관해서, 전하 패치 총면적 Y(Å2)에 기초하여 단백질의 입자 형성 리스크가 판단된다. 하나의 태양에 있어서, Y의 값이 600 이상인 단백질이 입자 형성 리스크가 높은 단백질로 판정된다. 다른 태양에 있어서, Y의 값이 700 이상, 800 이상, 900 이상, 1000 이상, 1500 이상, 2000 이상, 2500 이상, 3000 이상, 또는 4000 이상인 단백질이 입자 형성 리스크가 높은 단백질로 판정된다.
여기에서, 소수성 패치의 면적에 따른 랭킹이란, 단백질 표면에 인정되는 소수성 패치를 면적의 순서로 나열한 리스트이며, 각 소수성 패치는 단백질 표면에 독립적으로 존재하는 일정한 크기의 소수성 잔기 클러스터로 이루어지는 소수성 패치를 의미한다. 랭킹의 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적(Å2)의 합을 X로서 산출한다. 여기에서, 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합이란, 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합계값을 가리킨다. 단, 분자 중의 소수성 패치가 4개 이하인 경우에는 실재하는 모든 소수성 패치의 면적의 합계값을 가리킨다.
전하 패치 총면적이란, 단백질 표면에 존재하는 양 또는 음으로 하전된 전하 패치 모두의 면적(Å2)의 합을 의미한다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「분자력장」이란 분자 중에 존재하는 각 원자가, 어떠한 힘을 받고 있는지를 함수로서 파라미터화한 것이다. 분자력장에 기초하는 분자 역학 계산이나 분자 동력학 계산에서는, 원자 사이에 작용하는 힘을, 원자 사이의 결합을 나타내는 파라미터(결합 거리나 결합각 등)를 변수로 하여, 원자의 종류나 결합 양식에 의해 정해지는 포텐셜 함수로 수치로서 나타낸다. 분자력장에 기초하는 분자 역학 계산이나 분자 동력학 계산에서는, 원자 사이에 작용하는 힘을, 원자 사이의 결합을 나타내는 파라미터(결합 거리나 결합각 등)를 변수로 하여, 원자의 종류나 결합 양식에 의해 정해지는 포텐셜 함수로 수치로서 나타낸다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 이용할 수 있는 분자력장은, 특별히 제한 없이, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있고, 예를 들면, Amber계의 분자력장, CHARMm계의 분자력장, OPLS계의 분자력장 등을 들 수 있다. Amber계의 분자력장으로서는, 예를 들면, Amber10/14:EHT, Amber ff99SB-ILDN, Amber 12SB 등을 들 수 있다. CHARMm계의 분자력장으로서는, 예를 들면, CHARMm36 등을 들 수 있다. 이들 중, MOE를 이용하는 경우는 Amber10:EHT가 바람직하다.
(2) 입자의 형성의 저감
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「입자의 형성을 저감시키는」이란, 소정의 조건에 있어서 목시에 의해 검출 가능한 입자가 형성되는 의약 제제의 용액에 있어서, 기포의 용량을 조정하는 것에 의해 목시에 의해 검출 가능한 입자가 형성되지 않게 하거나, 또는 형성되는 입자수를 감소시키는 것을 가리킨다. 목시에 의해 검출 가능한 입자의 형성이 저감된 것은, 기포의 용량의 조정의 전후에 입자수를 계수하는 것에 의해 확인할 수 있다. 입자의 사이즈나 수는, 광차폐 입자 계수법, 현미경 입자 계수법, 플로 사이토 입자 화상 해석법, 목시 검사, 입자를 단리한 후에 현미 적외 분광(infrared spectroscopy; IR) 측정이나 현미 라만 분광 측정함으로써 측정 가능하고, 바람직하게는 목시 검사와 현미 적외 분광 또는 현미 라만 분광 측정의 조합으로 측정한다.
(3) 의약 제제
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 의약 제제는, 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 용액이다. 의약 제제는, 주사용 제제여도 된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 주사용 제제란, 주사에 의해 투여되기 위해서 주사용의 용기에 충전된, 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「얻어지는 주사용 제제」란, 기포 용량을 조정한 후에 최종 제품으로서 얻어지는 주사용 제제를 가리킨다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 의약 제제는, 용기 내의 용액을 동결시키지 않고서 -30℃∼25℃, 바람직하게는 용액의 동결점∼25℃, 보다 바람직하게는 1℃∼10℃, 보다 바람직하게는 2℃∼8℃, 더 바람직하게는 5℃에서 보존된다. 보존은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 31시간, 32시간, 33시간, 34시간, 35시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 96시간 행해진다. 보존은, 적어도 24시간, 적어도 2일간, 적어도 3일간, 적어도 4일간, 적어도 10일, 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월 행해진다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 용액 제제에서 사용하는 단백질은, 항체, 융합 단백질, 효소, 호르몬, 사이토카인, 백신을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 보다 구체적으로는, 모노클로날 항체, 과립상 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립상 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 에리트로포이에틴(EPO), 인터페론, IL-1이나 IL-6 등의 인터류킨, 조직 플라스미노겐 활성화 인자(TPA), 트롬보포이에틴, 유로키나아제, 혈청 알부민, 혈액 응고 제 VIII 인자, 렙틴, 줄기세포 성장 인자(SCF) 등을 포함한다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 의약 제제에 사용하는 단백질은, 포유동물, 특히 인간의 생리 활성 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 것이고, 천연 유래의 것, 및 유전자 재조합법에 의해 얻어진 것을 포함한다. 유전자 재조합법에 의해 얻어지는 단백질에는 천연 단백질과 아미노산 서열이 동일한 것, 혹은 해당 아미노산 서열의 1 또는 복수를 결실, 치환, 부가한 것으로 상기 생물학적 활성을 갖는 것을 포함한다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 용액 중의 단백질의 농도는, 0.1mg/mL 이상, 0.1∼300mg/mL의 범위, 1∼200mg/mL의 범위여도 된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 사용되는 항체는, 원하는 항원과 결합하는 한 특별히 제한은 없고, 폴리클로날 항체여도 모노클로날 항체여도 되지만, 균질한 항체를 안정적으로 생산할 수 있는 점에서 모노클로날 항체가 바람직하다. 또한, 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 사용되는 항체는, 모노스페시픽 항체여도 바이스페시픽 항체여도, 또는 분자 내에 3개 이상의 항원 인식 부위를 갖는 다중특이성을 갖는 항체여도 된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 사용되는 모노클로날 항체로서는, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 양, 낙타, 원숭이 등의 동물 유래의 모노클로날 항체뿐만 아니라, 키메라 항체, 인간화 항체, 바이스페시픽 항체 등 인위적으로 개변한 유전자 조작형 항체도 포함된다. 또, 혈중 체류성이나 체내 동태의 개선을 목적으로 한 항체 분자의 물성의 개변(구체적으로는, 등전점(p1) 개변, Fc 수용체의 친화성 개변 등)을 행하기 위해서 항체의 정상 영역 등을 인위적으로 개변한 유전자 조작형 항체도 포함된다.
또한, 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 사용되는 항체의 면역글로불린 클래스는 특별히 한정되는 것은 아니고, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 등 어느 클래스여도 되지만, IgG가 바람직하고, IgG1, IgG2 및 IgG4가 특히 바람직하다.
또 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 사용되는 항체에는, 정상 영역과 가변 영역을 갖는 항체(전장 항체)뿐만 아니라, Fv, Fab, F(ab)2 등의 항체 단편이나, 항체의 가변 영역을 펩타이드 링커 등의 링커로 결합시킨 1가 또는 2가 이상의 1본쇄 Fv(scFv, sc(Fv)2)나 scFv 다이머 등의 이중특이성 항체 등의 저분자화 항체 등도 포함되지만, 전장 항체가 바람직하다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 사용되는 항체는, 공지된 방법에 의해 제작할 수 있다. 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마는, 기본적으로는 공지 기술을 사용하여, 이하와 같이 하여 제작할 수 있다. 즉, 원하는 항원이나 원하는 항원을 발현하는 세포를 감작 항원으로서 사용하여, 이것을 통상의 면역 방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지된 친세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해, 모노클로날인 항체 산생 세포(하이브리도마)를 스크리닝하는 것에 의해 제작할 수 있다. 하이브리도마의 제작은, 예를 들어, 밀스테인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮은 경우에는, 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대 분자와 결합시켜, 면역을 행하면 된다.
또한, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡터에 짜 넣어, 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 산생시킨 유전자 재조합형 항체를 이용할 수 있다(예를 들면, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 구체적으로는, 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체의 가변 영역(V 영역)의 cDNA를 합성한다. 목적으로 하는 항체의 V 영역을 코드하는 DNA를 얻으면, 이것을 원하는 항체 정상 영역(C 영역)을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 짜 넣는다. 또는, 항체의 V 영역을 코드하는 DNA를, 항체 C 영역의 DNA를 포함하는 발현 벡터에 짜 넣어도 된다. 발현 제어 영역, 예를 들면, 인핸서, 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 짜 넣는다. 다음으로, 이 발현 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환하여, 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에서는, 인간에 대한 이종항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 해서 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면, 키메라 항체, 인간화 항체 등을 사용할 수 있다. 이들 개변 항체는, 기지의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 키메라 항체는, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면, 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변 영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상 영역으로 이루어지는 항체이며, 마우스 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA를 인간 항체의 정상 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 짜 넣어 숙주에 도입하여 산생시키는 것에 의해 얻을 수 있다.
인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해지고, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정 영역(CDR; complementarity determining region)을 인간 항체의 상보성 결정 영역에 이식한 것이며, 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 오버랩되는 부분을 갖도록 제작한 수 개의 올리고뉴클레오타이드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 짜 넣어, 이것을 숙주에 도입하여 산생시키는 것에 의해 얻어진다(유럽 특허출원 공개 제239400호, WO 96/02576 참조). CDR을 개재시켜 연결되는 인간 항체의 FR은, 상보성 결정 영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 된다(Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
항체의 활성, 물성, 약물 동태, 안전성 등을 개선하기 위해서 항체의 아미노산을 치환하는 기술로서는, 예를 들면 이하에 기술하는 기술도 알려져 있고, 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 사용되는 항체에는, 이와 같은 아미노산의 치환(결손이나 부가도 포함한다)이 실시된 항체도 포함된다.
IgG 항체의 가변 영역에 아미노산 치환을 실시하는 기술은, 인간화(Tsurushita N, Hinton PR, Kumar S., Design of humanized antibodies: from anti-Tac to Zenapax., Methods. 2005 May;36(1):69-83.)를 비롯해서, 결합 활성을 증강시키기 위한 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 치환에 의한 affinity maturation(Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71.), 프레임워크(FR)의 아미노산 치환에 의한 물리화학적 안정성의 향상(Ewert S, Honegger A, Pluckthun A., Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering., Methods. 2004 Oct;34(2):184-99. Review)이 보고되어 있다. 또한, IgG 항체의 Fc 영역의 아미노산 치환을 실시하는 기술로서, 항체 의존성 세포 장애 활성(ADCC)이나 보체 의존성 세포 장애 활성(CDC)을 증강시키는 기술이 알려져 있다(Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review.). 또, 이와 같은 이펙터 기능을 증강시킬 뿐만 아니라, 항체의 혈중 반감기를 향상시키는 Fc의 아미노산 치환의 기술이 보고되어 있다(Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56., Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40.). 더욱이 항체의 물성 개선을 목적으로 한 정상 영역의 여러 가지 아미노산 치환 기술도 알려져 있다(WO 09/41613).
또한, 인간 항체의 취득 방법도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 림프구를 in vitro에서 원하는 항원 또는 원하는 항원을 발현하는 세포로 감작하고, 감작 림프구를 인간 미엘로마 세포, 예를 들면 U266과 융합시켜, 항원에 대한 결합 활성을 갖는 원하는 인간 항체를 얻을 수도 있다(일본 특허공고 평1-59878호 공보 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 트랜스제닉 동물을 항원으로 면역함으로써 원하는 인간 항체를 취득할 수 있다(WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조). 또, 인간 항체 라이브러리를 이용하여, 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 가변 영역을 1본쇄 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 밝혀지면, 당해 서열을 포함하는 적당한 발현 벡터를 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 이미 주지이며, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388을 참고로 할 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 사용되는 항체에는, 이와 같은 인간 항체도 포함된다.
항체 유전자를 일단 단리하고, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제작하는 경우에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진균 세포를 이용할 수 있다. 동물 세포로서는, (1) 포유류 세포, 예를 들면, CHO, COS, 미엘로마, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero, (2) 양서류 세포, 예를 들면, 아프리카발톱개구리 난모 세포, 혹은 (3) 곤충 세포, 예를 들면, sf9, sf21, Tn5 등이 알려져 있다. 식물 세포로서는, 니코티아나(Nicotiana)속, 예를 들면 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 알려져 있고, 이것을 캘러스 배양하면 된다. 진균 세포로서는, 효모, 예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 예를 들면 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces serevisiae), 사상균, 예를 들면, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 예를 들면 아스퍼질러스 니제르(Aspergillus niger) 등이 알려져 있다. 원핵 세포를 사용하는 경우, 세균 세포를 이용하는 산생계가 있다. 세균 세포로서는, 대장균(E. coli), 고초균이 알려져 있다. 이들 세포에, 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro에서 배양하는 것에 의해 항체가 얻어진다.
또, 의약 제제에 있어서 사용되는 항체에는, 항체 수식물이 포함된다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)이나 세포 장애성 약제 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다(Farmaco. 1999 Aug 30;54(8): 497-516., Cancer J. 2008 May-Jun;14(3):154-69). 이와 같은 항체 수식물은, 항체에 화학적인 수식을 실시하는 것에 의해 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.
본 발명의 하나의 측면에서는, 본 개시에 있어서의 항체는 키메라 항체여도 된다. 키메라 항체는, 예를 들면 US Patent No. 4,816,567이나 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)에 기재되어 있다. 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예를 들면, 원숭이와 같은 비인간 영장류, 또는 마우스, 래트, 햄스터, 혹은 토끼 등에서 유래하는 가변 영역)과 인간의 정상 영역을 포함해도 된다.
본 발명의 하나의 측면에서는, 본 개시에 있어서의 항체는 인간화 항체여도 된다. 전형적으로는, 비인간 항체는, 친의 비인간 항체의 특이성과 친화성을 유지하면서, 인간에서의 면역원성을 감소시키기 위해서 인간화된다. 전형적으로는, 인간화 항체는 1개 이상의 가변 영역을 포함하고, 그 중에는 HVR, 예를 들면 비인간 항체에서 유래하는 CDR(또는 그 일부)과, 인간 항체 서열에서 유래하는 FR(또는 그 일부)이 존재한다. 인간화 항체는, 임의로, 인간 정상 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일 실시태양에 있어서, 인간화 항체 내의 FR의 아미노산 잔기는, 예를 들면, 항체의 특이성이나 친화성을 유지 또는 개선시키기 위해서, 비인간 항체(예를 들면 HVR 잔기의 유래가 된 항체)의 대응하는 아미노산 잔기로 치환되어 있어도 된다.
인간화 항체 및 그 제작 방법은, 예를 들면 이하에서 총설되어 있고(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)), 또 예를 들면 이하에 기재되어 있다: Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, and 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (describing specificity determining region (SDR) grafting); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)(describing "resurfacing"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)(describing "FR shuffling"); and Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(describing the "guided selection" approach to FR shuffling).
본 발명의 하나의 측면에서는, 인간화에 사용될 인간 프레임워크는, 예를 들면, 「베스트 피트」법(Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993))을 이용하여 선택된 프레임워크, 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역의 어떤 특정한 서브그룹의 인간 항체의 컨센서스 서열에서 유래하는 프레임워크(Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) and Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)), FR 라이브러리의 스크리닝에서 유래하는 프레임워크 영역을 포함하고 있어도 된다(Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)과 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618(1996)).
본 발명의 하나의 측면에서는, 본 개시에 있어서의 항체는 인간 항체여도 된다. 인간 항체는 다양한 기술로 제작할 수 있다. 인간 항체는 예를 들면 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-374 (2001)이나 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 개설된다. 인간 항체는 항원에 응답하여 완전 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 수반하는 완전 항체를 산생하도록 개변된 트랜스제닉 동물에 면역원을 투여하는 것에 의해 조제되어도 된다. 그와 같은 동물은, 전형적으로는 인간 면역글로불린 유전자 자리의 전부 혹은 일부분을 포함하고, 인간 면역글로불린 유전자 자리의 전부 혹은 일부분은, 내인성의 면역글로불린 유전자 자리를 치환하거나, 또는 염색체 외에 혹은 당해 동물의 염색체 내에 랜덤하게 도입된 상태로 존재한다. 그와 같은 트랜스제닉 마우스에 있어서, 내인성의 면역글로불린 유전자 자리는, 통상 불활성화되어 있다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 얻는 방법의 총설로서, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조. 또한, 예를 들면, XENOMOUSE(상표) 기술을 기재한 US Patent No. 6,075,181, 6,150,584호; HUMAB(등록상표) 기술을 기재한 US Patent No. 5,770,429; K-M MOUSE(등록상표) 기술을 기재한 US Patent No. 7,041,870; 및, VELOCIMOUSE(등록상표) 기술을 기재한 US2007/0061900을 참조. 이와 같은 동물에 의해 생성되는 완전 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들면, 상이한 인간 정상 영역과 조합하는 등으로, 더 수식되어도 된다.
본 발명의 다른 측면에서는, 인간 항체는 하이브리도마에 기초한 방법으로도 제작할 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 산생을 위한, 인간 미엘로마 세포 및 마우스-인간 헤테로미엘로마 세포주는 이하에 기술된다(예를 들면, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 생성되는 인간 항체는 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에 기술된다. 그 밖의 방법으로서는, 예를 들면 US Patent No. 7,189,826(하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기재), 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(인간-인간 하이브리도마를 기재)이 예시되어도 된다. 인간 하이브리도마 기술(트라이오마 기술)은, Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 기재된다.
본 발명의 다른 측면에서는, 인간 항체는, 인간 유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택되는 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하는 것으로도 생성할 수 있다. 이와 같은 가변 영역 서열은, 다음으로 원하는 인간 정상 영역과 조합할 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 수법은 이하를 참조.
본 발명의 하나의 측면에서는, 본 개시에 있어서의 항체는, 원하는 1개 또는 복수의 활성을 갖는 항체에 대하여 콤비나토리얼 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 단리해도 된다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리의 제작 방법이나, 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 그와 같은 라이브러리를 스크리닝하는 방법 등이 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있다. 그와 같은 방법은, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 총설되어 있고, 또 예를 들면, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에 기재된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서의 특정한 파지 디스플레이법에 있어서, VH 및 VL의 레퍼토리는, 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의해 따로따로 클로닝될 수 있고, 무작위로 파지 라이브러리 중에서 재결합되고, 당해 파지 라이브러리는, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에서 기재되는 바와 같이 하여, 항원 결합 파지에 대하여 스크리닝되어도 된다. 파지는, 예를 들면 scFv나 Fab와 같은 항체 단편을 제시한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는, 하이브리도마를 구축하는 것을 필요로 하지 않고서 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공할 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 기재되는 바와 같이, 면역화하는 일 없이, 나이브 레퍼토리를 (예를 들면, 인간으로부터) 클로닝하고, 광범위한 비자기 또는 자기 항원에 대한 단일 유래의 항체를 제공할 수도 있다. 추가적인 다른 실시태양에 있어서, 나이브 라이브러리는, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 기재되는 바와 같이, 줄기세포로부터 재편성 전의 V-유전자 세그먼트를 클로닝하고, 초가변 영역 CDR3을 코드하고 또한 in vitro에서 재구성을 달성하기 위한 무작위 서열을 포함한 PCR 프라이머를 이용하는 것에 의해, 합성적으로 만들 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재한 특허문헌은, 예를 들면 US Patent No. 5,750,373, US2005/0079574, US2005/0119455, US2005/0266000, US2007/0117126, US2007/0160598, US2007/0237764, US2007/0292936, US2009/0002360을 들 수 있다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리되는 항체 또는 항체 단편은, 본 명세서에 있어서 인간 항체 또는 인간 항체 단편이라고 간주한다.
본 발명의 하나의 측면에서는, 본 개시에 있어서의 항체는, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체)이다. 다중특이성 항체는, 적어도 2개의 상이한 부위에 결합 특이성을 갖는 항체(예를 들면 모노클로날 항체)이다. 일 실시태양에 있어서, 결합 특이성의 하나는 항원에 대한 것이고, 나머지는 그 이외의 항원에 대한 것이다. 다른 실시태양에 있어서, 이중특이성 항체는, 항원의 상이한 2개의 에피토프에 결합해도 된다. 이중특이성 항체는, 항원을 발현하는 세포에 세포상해제를 국재화하기 위해서 사용되어도 된다. 이중특이성 항체는, 전장 항체로서 또는 항체 단편으로서 조제되어도 된다.
다중특이성 항체의 제작 수법으로서는, 한정은 되지 않지만, 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 페어의 재조합 공발현(예를 들면 Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), 및 knob-in-hole 기술(예를 들면 US Patent No. 5,731,168)을 들 수 있다. 다중특이성 항체는, Fc 헤테로이량체 분자를 제작하기 위해서 정전 스티어링 효과(electrostatic steering effects)를 조작하는 것(예를 들면 WO2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 항체 단편을 가교하는 것(예를 들면 US Patent No. 4,676,980 및 Brennan et al., Science, 229: 81(1985)); 류신 지퍼를 이용하여 2개의 특이성을 갖는 항체를 작성하는 것(예를 들면 Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); 「다이아보디」 기술을 이용하여 이중특이성 항체 단편을 제작하는 것(예를 들면 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); scFv 다이머를 이용하는 것(예를 들면 Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); 삼중특이성 항체를 조제하는 것(예를 들면 Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991))에 의해 제작해도 된다. 또, 「옥토퍼스 항체」를 포함하는, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖도록 조작된 항체여도 된다(예를 들면 US2006/0025576).
본 발명의 하나의 측면에서는, 본 개시에 있어서의 항체 또는 그것의 항체 단편은, 항원과 다른 상이한 항원에 결합하는 1개의 항원 결합 부위를 포함하는, 「듀얼 액팅 Fab」 또는 「DAF」여도 된다(예를 들면 US2008/0069820).
본 발명의 하나의 측면에서는, 본 개시에 있어서의 항체의 아미노산 서열의 개변체(변이체)는, 항체의 분자를 코드하는 핵산에 적당한 수식을 도입하거나, 또는 펩타이드를 합성함으로써 조제할 수 있다. 이와 같은 수식은, 아미노산 서열 중에의, 임의의 아미노산(잔기)의 임의의 결실, 삽입, 치환을 하나 또는 복수, 적절히 조합하여 행해도 된다. 최종 구축물이 원하는 특징(예를 들면, 항원 결합성)을 갖는 한, 결실, 삽입, 치환의 임의의 조합을 이용할 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에서는, 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 행한 항체 개변체(변이체)가 제공되는 경우에는, 치환적 변이 도입의 목적 부위는, HVR 및 FR을 포함할 수 있다.
의약 제제에 있어서 사용되는 항체로서는, 항조직 인자 항체, 항IL-6 리셉터 항체, 항IL-6 항체, 항글리피칸-3 항체, 항CD3 항체, 항CD20 항체, 항GPIIb/IIIa 항체, 항TNF 항체, 항CD25 항체, 항EGFR 항체, 항Her2/neu 항체, 항RSV 항체, 항CD33 항체, 항CD52 항체, 항IgE 항체, 항CD11a 항체, 항VEGF 항체, 항VLA4 항체, 항HM1.24 항원 항체, 항부갑상선 호르몬 관련 펩타이드 항체(항PTHrP 항체), 항강글리오사이드 GM3 항체, 항TPO 수용체 아고니스트 항체, 응고 제 VIII 인자 대체 항체, 항IL31 리셉터 항체, 항HLA 항체, 항AXL 항체, 항CXCR4 항체, 항NR10 항체, 팩터 IX와 팩터 X의 바이스페시픽 항체 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
의약 제제에 있어서 사용하는 바람직한 재구성 인간화 항체로서는, 인간화 항인터류킨 6(IL-6) 리셉터 항체(토실리주맙, hPM-1 혹은 MRA, WO92/19759 참조), 인간화 항HM1.24 항원 모노클로날 항체(WO98/14580 참조), 인간화 항부갑상선 호르몬 관련 펩타이드 항체(항PTHrP 항체)(WO98/13388을 참조), 인간화 항조직 인자 항체(WO99/51743 참조), 항글리피칸-3 인간화 IgG1κ 항체(codrituzumab, GC33, WO2006/006693 참조), 항NR10 인간화 항체(WO2009/072604 참조), 팩터 IX와 팩터 X의 바이스페시픽 인간화 항체(ACE910, WO2012/067176을 참조) 등을 들 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 의약 제제는, 필요에 따라서, 적당한 약학적으로 허용되는 담체, 매체 등과 혼화해서 조제하여, 용액 제제로 할 수 있다. 용액 제제의 용매는, 물 또는 약학적으로 허용되는 유기 용매이다. 그와 같은 유기 용매로서는, 예를 들면, 프로필렌 글라이콜(1,2-프로페인다이올), 폴리에틸렌 글라이콜 300, 폴리에틸렌 글라이콜 400, 에탄올, 글리세롤, 아세트산 등을 들 수 있다. 적당한 약학적으로 허용되는 담체, 매체로서는, 예를 들면, 멸균수나 생리 식염수, 안정화제, 산화 방지제(아스코르브산 등), 완충제(인산, 시트르산, 히스티딘, 다른 유기산 등), 방부제, 계면활성제(PEG, Tween 등), 킬레이트제(EDTA 등), 결합제 등을 들 수 있다. 또한, 그 밖의 저분자량의 폴리펩타이드, 혈청 알부민, 젤라틴이나 면역글로불린 등의 단백질, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 글루탐산, 아스파르트산, 메싸이오닌, 아르기닌 및 라이신 등의 아미노산, 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물, 만니톨이나 소르비톨 등의 당 알코올을 포함하고 있어도 된다. 주사용의 용액으로 하는 경우에는, 예를 들면 생리 식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약을 포함하는 등장액, 예를 들면, D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌 글라이콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 188, HCO-50) 등과 병용해도 된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 용액 제제에 있어서 사용하는 완충제는, 용액의 pH를 유지하기 위한 물질을 사용하여 조제한다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 고농도 항체 함유 용액 제제에 있어서는, 용액의 pH가 4.5∼7.5인 것이 바람직하고, 5.0∼7.0인 것이 보다 바람직하며, 5.5∼6.5인 것이 더 바람직하다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 사용 가능한 완충제는, 이 범위의 pH를 조정할 수 있고, 또한 의약적으로 허용 가능한 것이다. 이와 같은 완충제는 용액 제제의 분야에서 당업자에게 공지이며, 예를 들면, 인산염(나트륨 또는 칼륨), 탄산수소 나트륨 등의 무기염; 시트르산염(나트륨 또는 칼륨), 아세트산 나트륨, 석신산 나트륨 등의 유기산염; 또는, 인산, 탄산, 시트르산, 석신산, 말산, 글루콘산 등의 산류를 사용할 수 있다. 더욱이, Tris류 및 MES, MOPS, HEPES와 같은 굿(Good) 완충제, 히스티딘(예를 들면 히스티딘 염산염), 글라이신 등을 사용해도 된다.
완충제의 농도는, 일반적으로는 1∼500mmol/L이고, 바람직하게는 5∼100mmol/L이며, 더 바람직하게는 10∼20mmol/L이다. 히스티딘 완충제를 사용하는 경우, 완충제는 바람직하게는 5∼25mmol/L의 히스티딘, 더 바람직하게는 10∼20mmol/L의 히스티딘을 함유한다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 고농도 항체 함유 용액 제제는, 유효 성분인 항체에 있어 적절한 안정화제를 첨가하는 것에 의해, 안정화되는 것이 바람직하다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「안정한」 고농도 항체 함유 용액 제제는, 냉장 온도(2∼8℃)에서 적어도 12개월, 바람직하게는 2년간, 더 바람직하게는 3년간; 또는 실온(22∼28℃)에서 적어도 3개월, 바람직하게는 6개월, 더 바람직하게는 1년간, 유의한 변화가 관찰되지 않는다. 예를 들면, 5℃에서 2년간 보존 후의 이량체량 및 분해물량의 합계가 5.0% 이하, 바람직하게는 2% 이하, 더 바람직하게는 1.5% 이하, 혹은 25℃에서 6개월 보존 후의 이량체량 및 분해물량의 합계가 5.0% 이하, 바람직하게는 2% 이하, 더 바람직하게는 1.5% 이하이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 계면활성제로서는, 비이온 계면활성제, 예를 들면 소르비탄 모노카프릴레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트 등의 소르비탄 지방산 에스터; 글리세린 모노카프릴레이트, 글리세린 모노미리스테이트, 글리세린 모노스테아레이트 등의 글리세린 지방산 에스터; 데카글리세릴 모노스테아레이트, 데카글리세릴 다이스테아레이트, 데카글리세릴 모노리놀레이트 등의 폴리글리세린 지방산 에스터; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트라이올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트라이스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터; 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라올레에이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비트 지방산 에스터; 폴리옥시에틸렌 글리세릴 모노스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스터; 폴리에틸렌 글라이콜 다이스테아레이트 등의 폴리에틸렌 글라이콜 지방산 에스터; 폴리옥시에틸렌 라우릴 에터 등의 폴리옥시에틸렌 알킬 에터; 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글라이콜 에터, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 프로필 에터, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 세틸 에터 등의 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에터; 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에터 등의 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에터; 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(폴리옥시에틸렌 수소 피마자유) 등의 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유; 폴리옥시에틸렌 소르비트 밀랍 등의 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체; 폴리옥시에틸렌 라놀린 등의 폴리옥시에틸렌 라놀린 유도체; 폴리옥시에틸렌 스테아르산 아마이드 등의 폴리옥시에틸렌 지방산 아마이드 등의 HLB6∼18을 갖는 것; 음이온 계면활성제, 예를 들면 세틸 황산 나트륨, 라우릴 황산 나트륨, 올레일 황산 나트륨 등의 탄소 원자수 10∼18의 알킬기를 갖는 알킬 황산염; 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산 나트륨 등의, 에틸렌 옥사이드의 평균 부가 몰수가 2∼4이고 알킬기의 탄소 원자수가 10∼18인 폴리옥시에틸렌 알킬 에터 황산염; 라우릴 설포석신산 에스터 나트륨 등의, 알킬기의 탄소 원자수가 8∼18인 알킬 설포석신산 에스터염; 천연계의 계면활성제, 예를 들면 레시틴, 글리세로인지질; 스핑고미엘린 등의 스핑고인지질; 탄소 원자수 12∼18의 지방산의 자당 지방산 에스터 등을 전형적 예로서 들 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 제제에는, 이들 계면활성제의 1종 또는 2종 이상을 조합하여 첨가할 수 있다.
바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에터이고, 특히 바람직한 것은 폴리소르베이트 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81, 85 및 플루로닉(등록상표)형 계면활성제이며, 가장 바람직한 것은 폴리소르베이트 20, 80 및 플루로닉(등록상표) F-68(폴록사머 188)이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 항체 제제에 첨가하는 계면활성제의 첨가량은, 일반적으로는 0.0001∼10%(mg/mL)이고, 바람직하게는 0.001∼5%이며, 더 바람직하게는 0.005∼3%이다.
또한 본 발명의 제제에는, 필요에 따라서, 동결 보호제, 현탁제, 용해 보조제, 등장화제, 보존제, 흡착 방지제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 함황 환원제, 산화 방지제 등을 적절히 첨가할 수 있다.
동결 보호제로서 예를 들면, 트레할로스, 자당, 소르비톨 등의 당류를 들 수 있다.
용액 보조제로서 예를 들면, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리소르베이트 80, 니코틴산 아마이드, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 마크로골, 피마자유 지방산 에틸 에스터 등을 들 수 있다.
등장화제로서 예를 들면, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 등을 들 수 있다.
보존제로서 예를 들면, 파라옥시벤조산 메틸, 파라옥시벤조산 에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸 등을 들 수 있다.
흡착 방지제로서 예를 들면, 인간 혈청 알부민, 레시틴, 덱스트란, 에틸렌 옥사이드·프로필렌 옥사이드 공중합체, 하이드록시프로필 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리에틸렌 글라이콜 등을 들 수 있다.
함황 환원제로서 예를 들면, N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 싸이옥트산, 싸이오다이글라이콜, 싸이오에탄올아민, 싸이오글리세롤, 싸이오소르비톨, 싸이오글라이콜산 및 그의 염, 싸이오황산 나트륨, 글루타티온, 탄소 원자수 1∼7의 싸이오알칸산 등의 설프하이드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.
산화 방지제로서 예를 들면, 에리소르브산, 다이뷰틸하이드록시톨루엔, 뷰틸하이드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산 토코페롤, L-아스코르브산 및 그의 염, L-아스코르브산 팔미테이트, L-아스코르브산 스테아레이트, 아황산수소 나트륨, 아황산 나트륨, 갈산 트라이아밀, 갈산 프로필 혹은 에틸렌다이아민 사아세트산 이나트륨(EDTA), 피로인산 나트륨, 메타인산 나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 의약 제제는, 자기면역 질환, 면역 질환, 감염증, 염증성 질환, 신경계 질환, 및 암을 포함하는 종양 질환 및 신생물 질환의 치료용이다. 특정한 실시형태에서는, 의약의 사용은, 울혈성 심부전(CHF), 허혈 유발성 중증 부정맥, 고콜레스테롤혈증, 맥관염, 주사비(rosacea), 여드름, 습진, 심근염 및 심근의 다른 상태, 가와사키병, 전신성 에리테마토서스, 당뇨병, 척추증, 활막 섬유아세포, 및 골수 간질; 골량 감소; 파제트병, 골거세포종; 유방암; 폐용성 골감소; 영양실조, 치주 질환, 고셰병, 랑게르한스 세포 조직구증식증, 척수 손상, 급성 화농성 관절염, 골연화증, 쿠싱 증후군, 단골성 섬유성 골이형성, 다골성 섬유성 골이형성, 치근막 재구축, 및 골절; 사르코이도시스; 흑색종, 전립선암, 췌장암, 용골성 골암, 유방암, 폐암, 위암, 신암, 및 직장암; 골전이, 골통 관리, 및 체액성 악성 고칼슘혈증, 강직성 척추염, 및 다른 척추 관절증; 이식 거절 반응, 바이러스 감염증, 혈액 신생물, 및 신생물양(樣)의 상태, 예를 들면 호지킨 림프종; 비호지킨 림프종(버킷 림프종, 소림프구성 림프종/만성 림프성 백혈병, 균상 식육종, 맨틀 세포 림프종, 여포성 림프종, 미만성 대세포형 B 세포 림프종, 변연층 림프종, 헤어리 세포 백혈병, 및 림프 형질 세포성 백혈병), B 세포 급성 림프아구성 백혈병/림프종 및 T 세포 급성 림프아구성 백혈병/림프종을 포함하는, 림프구 전구 세포의 종양, 흉선종, 말초 T 세포 백혈병, 성인 T 세포 백혈병/T 세포 림프종, 및 대과립 림프구성 백혈병을 포함하는, 성숙 T 세포 및 성숙 NK 세포의 종양, 랑게르한스 세포 조직구증가증, 성숙을 수반하는 AML, 분화를 수반하지 않는 AML, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단구성 백혈병, 및 급성 단구성 백혈병을 포함하는 급성 골수성 백혈병, 골수 이형성 증후군, 및 만성 골수성 백혈병을 포함하는 만성 골수 증식성 질환 등과 같은 골수 신생물, 중추 신경계의 종양, 예를 들면 뇌종양(신경교종, 신경아세포종, 성상세포종, 골아세포종, 뇌실상의종, 및 망막아세포종), 고형 종양(비인강암, 기저세포암, 췌암, 담관암, 카포지 육종, 정소암, 자궁암, 질암, 혹은 자궁경암, 난소암, 원발성 간암, 또는 자궁내막암, 및 혈관계의 종양(혈관 육종 및 혈관 외피 세포종), 골다공증, 간염, HIV, AIDS, 척추 관절염, 관절 류머티즘, 염증성 장질환(IBD), 패혈증 및 패혈증성 쇼크, 크론병, 건선, 강피증, 이식편대숙주병(GVHD), 동종이계 섬이식편 거절, 다발성 골수종(MM), 골수 이형성 증후군(MDS), 및 급성 골수성 백혈병(AML) 등과 같은 혈액 악성 질환, 종양과 관련되는 염증, 말초 신경 손상, 또는 탈수초 질환의 치료용이다. 특정한 실시형태에서는, 의약의 사용은, 심상성 건선, 췌장염, 궤양성 대장염, 비호지킨 림프종, 유방암, 결장 직장암, 중피종, 연부 육종, 약년성 특발성 관절염, 황반 변성, 호흡기 합포체 바이러스, 크론병, 관절 류머티즘, 건선성 관절염, 캐슬만병, 강직성 척추염, 골다공증, 치료 유발성의 골량 감소, 골전이, 다발성 골수종, 알츠하이머병, 녹내장, 쇼그렌병, 스틸병, 다발성 경화증, 고면역글로불린혈증, 빈혈, 메산지움 증식성 신염, 및 천식의 치료용이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 항체가 특이적 결합성을 갖는 항원은, 막 관통 분자(예를 들면, 수용체) 또는 증식 인자 등의 리간드일 수 있다. 예시적인 항원으로서는, 분자, 예를 들면 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 리포단백질; α-1-항트립신; 인슐린 A쇄; 인슐린 B쇄; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자(TF) 및 폰 빌레브란트 인자 등의 응고 인자; 프로테인 C 등의 항응고 인자; 심방성 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 유로키나아제 또는 인간뇨 또는 조직형 플라스미노겐 활성화 인자(t-PA) 등의 플라스미노겐 활성화 인자; 봄베신; 트롬빈; 조혈성 증식 인자; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나아제; RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); 인간 매크로파지 염증성 단백질(MIP-1-α); 인간 혈청 알부민 등의 혈청 알부민; 뮬러관 저해 물질; 릴랙신 A쇄; 릴랙신 B쇄; 프로릴랙신; 마우스 성선 자극 호르몬 관련 펩타이드; β 락타마아제 등의 미생물 단백질; DNAse; IgE; CTLA-4 등의 세포상해성 T-림프구 관련 항원(CTLA); 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF); 호르몬 또는 증식 인자의 수용체; 프로테인 A 또는 D; 류머티즘 인자; 신경 영양 인자, 예를 들면 골유래 신경 영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 증식 인자, 예를 들면 NGF-b; 혈소판 유래 증식 인자(PDGF); aFGF 및 bFGF 등의 섬유아세포 증식 인자; 상피 증식 인자(EGF); TGF-α 및 TGF-b1, TGF-b2, TGF-b3, TGF-b4, 또는 TGF-b5를 포함하는 TGF-β 등의 트랜스포밍 증식 인자(TGF); TNF-α 또는 TNF-β 등의 종양 괴사 인자(TNF); 인슐린양 증식 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린양 증식 인자 결합 단백질; CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22 및 CD40 등의 CD 단백질; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 항독소; 골형성 단백질(BMP); 인터페론-α, -β 및 -γ 등의 인터페론; 예를 들면, M-CSF, GM-CSF, G-CSF 등의 콜로니 자극 인자(CSF); 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 및 IL-10 등의 인터류킨(IL); 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제; T 세포 수용체; 표면 막단백질; 붕괴 촉진 인자; 예를 들면, AIDS 엔벨로프의 일부 등의 바이러스 항원; 수송 단백질; 호밍 수용체; 어드레신; 제어 단백질; CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM 등의 인테그린; HER2, HER3 또는 HER4 수용체 등의 종양 관련 항원; 및 상기 열거된 폴리펩타이드의 어느 단편을 들 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 포함되는 항체의 예시적인 분자 표적으로서는, CD 단백질, 예를 들면 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34 및 CD40; EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체 등의 ErbB 수용체 패밀리의 멤버; B 세포 표면 항원, 예를 들면 CD20 또는 BR3; DR5를 포함하는 종양 괴사 수용체 슈퍼패밀리의 멤버; 전립선 줄기세포 항원(PSCA); LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, α4/β7 인테그린, 및 그의 α 또는 β 서브유닛의 어느 하나를 포함하는 αv/β3 인테그린(예를 들면, 항CD11a, 항CD18 또는 항CD11b 항체) 등의 세포 접착 분자; 증식 인자, 예를 들면 VEGF 및 그의 수용체; 조직 인자(TF); 종양 괴사 인자(TNF), 예를 들면 TNF-α 또는 TNF-β, α 인터페론(α-IFN); IL-8 등의 인터류킨; IgE; 혈액형 항원; flk2/flk3 수용체; 비만(OB) 수용체; mp1 수용체; CTLA-4; 프로테인 C 등을 들 수 있다.
(4) 용기
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 의약 제제가 충전되는 용기로서 시린지 및 카트리지를 들 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「프리필드 시린지」란, 용기로서의 시린지에, 액체 조성물이 충전되어 있는 시린지를 의미한다. 어떤 태양에 있어서, 프리필드 시린지는, 환자에게 투여하기 위한 의약 조성물이 시린지 내에 충전되어 있다. 여기에서, 시린지는 시린지 클로저, 예를 들면, 한정은 되지 않지만 스토퍼에 의해 덮개가 되어 있어도 된다. 어떤 태양에 있어서, 조성물은 제조용 충전 시설에 있어서 시린지 내에 충전된다. 어떤 태양에 있어서, 시린지는, 시린지 내에 조성물이 충전되기 전에 멸균된다. 어떤 태양에 있어서, 프리필드 시린지는, 환자에 대한 조성물의 투여 전에, 1일, 또는 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 또는 적어도 1개월, 또는 적어도 6개월, 또는 적어도 1년, 또는 적어도 2년의 보존 기간을 갖는다. 어떤 태양에 있어서, 프리필드 시린지는 저장 및/또는 수송의 조건에 노출된다.
본 발명의 하나의 태양에 있어서, 프리필드 시린지는 메커니컬 스트레스에 노출된다. 메커니컬 스트레스로서는, 낙하 스트레스, 진동 스트레스, 및 회전 스트레스를 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 프리필드 시린지는, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 15회, 16회, 17회, 18회, 19회, 20회, 21회, 22회, 23회, 24회, 25회, 25회 이상, 30회 이상, 또는 40회 이상의 낙하 스트레스에 노출된다. 낙하 시에 프리필드 시린지에 가해지는 스트레스는, 낙하 횟수 이외에 높이, 방향 등에 따라 변화한다. 낙하 높이는, 예를 들면 American Society for Testing and Materials(ASTM) D4169에 기재되어 있는 38.1cm이지만, 이것으로 한정되지 않는다. 또한, 재현성 좋게 동일한 정도의 낙하 스트레스를 주는 것을 목적으로 하여, 프리필드 시린지의 방향이 낙하 중에 변화하지 않도록, 적절한 곤포를 하는 경우도 있다. 곤포는 예를 들면, 「트레이에 넣고, 트레이를 겹쳐 쌓는다」, 「도 2와 같이 넘버링한 골판지에, 겹친 트레이를 프리필드 시린지의 침 끝이 면(2)을 향하도록 해서 골판지로 곤포한다」 등이 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 낙하의 높이, 방향에 관해서는, 낙하 시에 하측이 되는 면을 면(1), 면(2), 면(3), 면(4)의 순으로 바꾸면서 높이 38.1cm로부터 낙하시킨다. 이것을 1세트로 하고 1회의 낙하 스트레스로 2세트의 낙하를 실시한다.
프리필드 시린지는, 도 3에 나타내는 바와 같이, 약제를 투여하기 위한 시린지를 구비한다. 또한, 프리필드 시린지는, 시린지에 삽입되는 스토퍼를 구비한다. 또, 프리필드 시린지는, 시린지에 접속되는 주사침을 구비한다. 프리필드 시린지는, 주사침을 캡하는 캡을 구비한다. 약제는, 액상의 약제이고, 예를 들면, 단백질 제제이다.
시린지는, 선단부 및 기단부를 갖는 통형상으로 형성된 배럴을 구비한다. 또한, 시린지는, 대략 통형상이다.
배럴은, 내부에 약제를 수용하는 부재이다. 본 실시형태의 배럴은, 선단부 및 기단부에 더하여, 선단부와 기단부를 접속하는 통형상부를 구비한다(도 3 참조). 또한, 배럴은, 통형상부의 통축 방향에 있어서의 타단의 외주 전체 둘레로부터 바깥쪽(통형상부의 직경 바깥 방향)을 향해 연장 돌출되는 플랜지부를 갖는다.
배럴은, 예를 들면, 투명하고, 또한 약제를 투여할 때에 걸리는 내압에 견딜 수 있는 재질로 형성된다. 구체적으로, 배럴의 재질은, 노보넨 등의 환상 올레핀을 반복하여 단순히 포함하는 수지이다. 보다 구체적으로 설명하면, 배럴의 재질은, 환상 올레핀에 의한 단독중합체인 COP(사이클로올레핀 폴리머)나 환상 올레핀과 에틸렌 등의 공중합체인 COC(사이클로올레핀 코폴리머) 등의 투명한 수지이다. 한편, 배럴은, PP(폴리프로필렌)나 유리여도 된다.
한편, 배럴의 내표면(예를 들면, 통형상부의 내표면)에는, 배럴의 내표면에 대한 피스톤의 접동 저항을 억제하기 위해서, 윤활제로서의 실리콘 오일이 도포되어 있어도 된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 실리콘 오일은 폴리다이메틸실록세인이다. 몇 개의 예시적인 폴리다이메틸실록세인에는, 예를 들면, 점도가 350센티스토크인 Dow Corning(등록상표) 360 Medical Fluid, 점도가 1000센티스토크인 Dow Corning(등록상표) 360 Medical Fluid, 점도가 12,500센티스토크인 Dow Corning(등록상표) 360 Medical Fluid, 및 Dow Corning(등록상표) MDX4-4159 fluid를 비한정적으로 포함하는, Dow Corning(등록상표) 360 Medical Fluid가 비한정적으로 포함된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 시린지의 용량의 사이즈(규격)는 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 용량이 0.5mL∼5.0mL, 바람직하게는 1mL와 같은 용량이 작은 사이즈의 시린지인 경우에 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 유리한 효과가 현저하다. 또한, 1mL 규격의 시린지 내에 포함되는 용액의 용량은, 0.1∼1.2mL의 범위, 바람직하게는 0.2∼1.1mL의 범위이다. 2.5mL 규격의 시린지 내에 포함되는 용액의 용량은, 0.1∼2.5mL의 범위, 바람직하게는 0.3∼2.3mL의 범위이다. 또한 의약 제제가 수용액을 포함하는 경우, 1mL 규격의 시린지 내에 포함되는 수용액의 용량은, 0.1∼1.2mL의 범위, 바람직하게는 0.2∼1.1mL의 범위이다. 2.5mL 규격의 시린지 내에 포함되는 수용액의 용량은, 0.1∼2.5mL의 범위, 바람직하게는 0.3∼2.3mL의 범위이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 카트리지 용량의 사이즈(규격)는 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 용량이 0.5mL∼20.0mL여도 되고, 예를 들면(1).0mL, 1.5mL, 1.8mL, 2.0mL, 2.2mL, 3.0mL, 5.0mL, 10.0mL, 15.0mL, 20.0mL여도 되지만, 이들 양으로 한정되지 않는다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 사용되는 카트리지는, 플라스틱제 또는 유리제의 표준적인 주사 카트리지이다. 유리제의 주사 카트리지의 치수 및 공차는, 국제 규격의 ISO13926-1에서 정해져 있다. 스토퍼 및 봉지(캡이나 디스크)에 대해서는, 표준적인 국제 규격의 ISO13926-2 및 3에 기재되어 있다. 충전 준비가 완료된 시린지 또는 프리필드 시린지의 치수 및 공차는, 국제 규격의 ISO11040-4에서 정해져 있다. 하나의 태양에 있어서, 사용되는 카트리지는, 상기 국제 규격의 1 이상을 만족시키는 플라스틱제 또는 유리제의 주사 카트리지이다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 사용되는 카트리지는, ISO 등의 국제 규격에는 합치하지 않는 플라스틱제 또는 유리제의 주사 카트리지이다.
(5) 시스템
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 시스템을 제공한다. 당해 시스템은, 호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 수단과, 얻어진 모델의 표면 중, 소수성 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분, 및 전하를 갖는 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분을 각각 소수성 패치 및 전하 패치로서 특정하여, 각각의 면적을 산출하는 수단과, 면적의 크기에 따른 랭킹으로 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합(X(Å2)), 및 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 수단과, X+Y×1.5가 1700 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 수단을 포함한다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 상기 시스템은, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 방법을 실시하기 위한 시스템이며, 이하에 기재된 프로그램을, 판정을 위한 장치, 컴퓨터 등에 인스톨하는 것에 의해 실시할 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 프로그램은, 상기 시스템에 있어서 각 수단을 컴퓨터에 작동시키는 프로그램이며, 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치가 범용 장치이더라도, 그 범용 장치에 인스톨하는 것에 의해 상기 판정 장치로서 사용 가능하게 하는 컴퓨터 프로그램이다. 또한, 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 컴퓨터 프로그램은 반드시 상기 판정 장치에 인스톨되어 있는 것을 필요로 하는 것은 아니고, 예를 들면, 기록 매체에 기억시켜 제공할 수도 있다. 여기에서, 「기록 매체」란, 그 자신으로는 공간을 점유할 수 없는 프로그램을 담지할 수 있는 매체이며, 예를 들면, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, CD-R, CD-RW, MO(광자기 디스크), DVD-R, DVD-RW, 플래시 메모리 등이 포함된다. 또한, 컴퓨터 프로그램은, 당해 컴퓨터 프로그램을 격납한 컴퓨터로부터, 통신 회선을 통해서 다른 컴퓨터 또는 장치에 전송하는 것도 가능하다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 컴퓨터 프로그램은, 이와 같은 컴퓨터에 격납된 컴퓨터 프로그램, 및 전송 중의 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
(소수성 패치 및 전하 패치에 기초하여 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치용의 프로그램)
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 본 발명은, 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 소수성 패치 및 전하 패치에 기초하여, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치에 있어서 또는 기록 매체에 기억시켜 이용되는 프로그램에 관한 것이다.
당해 프로그램은, 호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 수단과, 얻어진 모델의 표면 중, 소수성 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분, 및 전하를 갖는 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분을 각각 소수성 패치 및 전하 패치로서 특정하여, 각각의 면적을 산출하는 수단과, 면적의 크기에 따른 랭킹으로 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합(X(Å2)), 및 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 수단과, X+Y×1.5가 1700 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 수단을, 상기 장치 또는 컴퓨터에 실행시킨다.
도 7의 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치(10)의 구성도에 있어서, 전술한 모델을 작성하는 수단은, 입력부(11)로부터 입력된 아미노산 서열에 기초하여, 모델 작성부(12)에 의해 실행된다. 소수성 패치 및 전하 패치를 특정하여, 각각의 면적을 산출하고, 면적의 크기에 따른 랭킹으로 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합(X(Å2)), 및 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 수단은 산출부(13)에서 실시된다. X+Y×1.5가 1700 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 수단은 판정부(14)에서 실시된다. 판정 결과는 출력부(15)로부터 출력된다. 이들 각 수단은, 예를 들면, CPU가 HDD 내에 격납된 컴퓨터 프로그램을 읽어들여 실행된다.
이 컴퓨터 프로그램은, 단독으로는 공간을 점유할 수 없는 것이지만, 정보 기록 매체에 격납되어 유통할 수 있는 것이다. 여기에서, 「정보 기록 매체」란, 예를 들면, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, CD-ROM, CD-R, CD-RW, MO(광자기 디스크), MD, DVD-R, DVD-RW, 플래시 메모리, IC 카드 등이다. 이들 정보 기록 매체를 상기 장치의 데이터 입출력부에 접속하여, 컴퓨터 프로그램을 상기 장치 내의 HDD 등의 메모리에 인스톨할 수 있다. 또한, 이 컴퓨터 프로그램을 격납한 다른 컴퓨터로부터, 통신 회선을 통해서 상기 장치에 당해 컴퓨터 프로그램을 전송하여, 그 내부의 HDD 등의 메모리에 인스톨하는 것도 가능하다.
도 5는, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치용의 컴퓨터 프로그램을 실행했을 때의 상기 장치가 행하는 처리의 플로를 나타낸다. 상기 장치의 CPU는, 동 장치의 HDD 등의 메모리 내에 격납된 상기 장치용의 컴퓨터 프로그램을 읽어들여, 호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성한다. 다음으로, 상기 CPU는, 상기 컴퓨터 프로그램을 읽어들여, 작성된 모델로부터 소수성 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분, 및 전하를 갖는 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분을 각각 소수성 패치 및 전하 패치로서 특정하여, 각각의 면적을 산출하고, 면적의 크기에 따른 랭킹으로 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합(X(Å2)), 및 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출한다. 다음으로, CPU는, 상기 컴퓨터 프로그램을 읽어들여, X+Y×1.5가 1700 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정한다.
(전하 패치에 기초하여 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치용의 프로그램)
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 본 발명은, 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 전하 패치에 기초하여, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치에 있어서 또는 기록 매체에 기억시켜 이용되는 프로그램에 관한 것이다.
당해 프로그램은, 호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 수단과, 얻어진 모델의 표면 중, 전하를 갖는 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분을 전하 패치로서 특정하여, 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 수단과, Y가 600 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 수단을, 상기 장치 또는 컴퓨터에 실행시킨다.
전술한 모델을 작성하는 수단은, 모델 작성부에 의해 실행된다. 전하 패치를 특정하여 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 수단은, 산출부에서 실시된다. Y가 600 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 수단은 판정부에서 실시된다. 이들 각 수순은, 예를 들면, CPU가 HDD 내에 격납된 컴퓨터 프로그램을 읽어들여 실행된다.
이 컴퓨터 프로그램은, 단독으로는 공간을 점유할 수 없는 것이지만, 정보 기록 매체에 격납되어 유통할 수 있는 것이다. 여기에서, 「정보 기록 매체」란, 예를 들면, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, CD-ROM, CD-R, CD-RW, MO(광자기 디스크), MD, DVD-R, DVD-RW, 플래시 메모리, IC 카드 등이다. 이들 정보 기록 매체를 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치의 데이터 입출력부에 접속하여, 컴퓨터 프로그램을 상기 장치 내의 HDD 등의 메모리에 인스톨할 수 있다. 또한, 이 컴퓨터 프로그램을 격납한 다른 컴퓨터로부터, 통신 회선을 통해서 상기 장치에 당해 컴퓨터 프로그램을 전송하여, 그 내부의 HDD 등의 메모리에 인스톨하는 것도 가능하다.
도 6은, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 장치용의 컴퓨터 프로그램을 실행했을 때의 상기 장치가 행하는 처리의 플로를 나타낸다. 상기 장치의 CPU는, 동 장치의 HDD 등의 메모리 내에 격납된 상기 장치용의 컴퓨터 프로그램을 읽어들여, 호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성한다. 다음으로, 상기 CPU는, 상기 컴퓨터 프로그램을 읽어들여, 작성된 모델로부터 전하를 갖는 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분을 전하 패치로서 특정하여, 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출한다. 다음으로, Y가 600 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정한다.
실시예
실시예 1 목시에 의해 검출 가능한 입자의 계수
mAb1(H쇄/서열 번호: 1, L쇄/서열 번호: 2; 토실리주맙), mAb2(H쇄/서열 번호 3과 4: 공통 L쇄: 서열 번호 5), mAb3(H쇄/서열 번호: 6, L쇄/서열 번호: 7) 및 mAb4(혈액 응고 제 VIII 인자(FVIII) 보인자 기능 대체 활성을 갖는 인간화 이중특이성 항체), mAb5(항잠재형 마이오스타틴 스위핑 인간화 항체), mAb6(H쇄/서열 번호 8과 L쇄/서열 번호 9의 조합, 및 H쇄/서열 번호 11과 L쇄/서열 번호 10의 조합; 항HLA-DQ2.5 인간화 이중특이성 항체)의 6종류의 항체에 관해서, 항체 함유 용액(mAb1-6: 50mg/mL, 완충제: 20mmol/L 히스티딘, 안정화제: 150mmol/L 아르기닌 및 162mmol/L 아스파르트산, 계면활성제: 0.01mg/mL 폴록사머 188, pH 6.0)을 조제하여 0.22μm 필터로 여과한 후, 방사선(25kGy) 멸균한 27G 침 부착 COP제 시린지(1mL 규격) 내에, 1.0mL의 용액을 충전하고 스토퍼로 타전했다. 충전·타전한 샘플에 대하여, 타전 직후에 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1을 실시하고, 시린지 내에 목시에 의해 검출 가능한 입자를 포함하고 있다고 판단한 샘플을 제외했다. 항체마다 10개의 샘플을 시험에 제공했지만, mAb-6은 다른 항체와 비교하여 불안정도가 높고, 충전 직후의 목시에 의해 검출 가능한 입자 발생 빈도가 극히 높았기 때문에, 각 3개를 시험에 제공했다. 하기의 기포 용량 측정·설정 방법으로 작성한 검량선에 기초하여, 시린지의 스토퍼 위치를 조정하고, 기포 용량이 120μL 및 10μL인 샘플을 준비했다. 각 기포 용량의 샘플에 대하여, 5℃에서 1일 보관한 후에 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 2를 실시했다.
[목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1]
샘플의 시린지 용기의 외표면을 청정하게 하고, 백색 광원의 직하의 약 10000lx의 밝기의 위치에서, 흑색의 배경 앞에서 시린지를 완만하게 선회 또는 전도시켜, 육안으로 약 30초 목시 검사를 실시하는 것에 의해 시린지에 충전된 용액 중의 목시에 의해 검출 가능한 입자의 유무를 조사했다.
[기포 용량 측정·설정 방법]
1.0mL의 항체 함유 용액을 충전하고 스토퍼로 타전한 항체 용액 함유 시린지 샘플의 27G 침 부착 COP제 시린지(1mL 규격)를 침이 위가 되는 방향을 향하게 하고, 기포를 침의 기부(基部)까지 상승시켜 침 끝으로부터 공기를 압출함으로써, 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리가 11mm가 되도록 스토퍼의 위치를 조정했다. 내경 0.5mm의 튜브에, 시린지에 포함되는 용액 및 모든 공기를 주입했다. 튜브 내의 공기층의 길이를 측정함으로써, 시린지의 기포 용량을 산출했다. 이 측정을 4회 반복한 결과, 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리가 11mm인 경우, 평균 기포 용량은 120μL였다. 다음으로 시린지의 침 끝으로부터 가능한 한 공기를 뺀 샘플을 3개 작성하고, 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리를 측정했다. 플랜지로부터 스토퍼까지의 평균 거리는 15.1mm였다. 또한, 그 실제의 기포 용량은 3μL였다. 이들 측정 결과로부터, 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리와 기포 용량의 검량선을 작성하고, 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리에 기초하여 기포 용량을 설정했다. 설정한 기포 용량의 조건은 이하의 표 1과 같다.
[목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 2]
샘플의 시린지 용기의 외표면을 청정하게 하고, 백색 광원의 직하의 약 8000lx의 밝기의 위치에서, 흑색의 배경 앞에서 시린지를 완만하게 선회 또는 전도시켜, 약 30초 목시 검사를 실시함으로써 시린지에 충전된 용액 중의 목시에 의해 검출 가능한 입자의 유무를 조사했다. 목시에 의해 검출 가능한 입자의 존재가 인정된 샘플에 대해서는, 백색 광원의 직하의 약 8000lx의 밝기의 위치에서, 흑색의 배경 앞에서 완만하게 선회 또는 전도시켜, 육안으로 시린지 내의 목시에 의해 검출 가능한 입자수를 계수했다.
[평가 결과]
샘플을 5℃에서 1일 보관 후의 시린지 내의 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 2의 결과를 이하의 표 2에 나타낸다.
실시예 2 입자를 형성할 리스크가 높은 조건의 결정
1. 항체의 3차원 구조 모델의 작성
Molecular Operating Environment(MOE), 2019.01(Chemical Computing Group ULC)의 Antibody modeling 기능에 있어서, 6종류의 항체(mAb1-6)의 아미노산 서열을 입력으로 해서, 상보성 결정 영역(CDR)마다 개별의 주형과 매칭시키고, 그들을 조합하는 것에 의해 각 항체의 3차원 구조 모델을 IgG 전장의 범위에서 작성했다. 계산 조건으로서, 모노스페시픽 항체에 대해서는 Chains: VL, VH 옵션을, 일부의 바이스페시픽 항체에 대해서는 Chains: bispecific 옵션을, Model type에 대해서는, Ig Immunoglobulin을 이용하고 있다. 어느 항체에 대해서도, 프레임워크 영역과 상보성 결정 영역의 주형 구조는 Antibody modeling 기능으로 최적이라고 평가된 결정 구조 정보를 이용했다. 구조의 에너지 최소화에 관한 수속의 구배값의 역치(Gradient limit)로서 0.1kcal/mol/Å2를 적용했다. 그 밖의 파라미터는 규정값을 이용했다. 역장에 대해서도, MOE 2019.01의 표준인 Amber10:EHT를 이용하고 있다.
mAb2, mAb3의 각 항체 서열에 포함되지 않음에도 불구하고 MOE로 자동적으로 보완되어 버리는 잔기에 대해서는 삭제하고, 삭제한 주변 잔기에 대하여 에너지 최소화를 실시했다. mAb1에 대해서는, 특별히 잔기 삭제를 실시하고 있지 않다.
2. 항체의 3차원 구조 모델의 물성 계산
1.에서 작성된 6종류의 항체(mAb1-6)의 3차원 구조 모델을 입력으로 해서, MOE 2019.01의 Protein properties 기능으로 망라적으로 각 항체의 특징량을 계산했다. Target pH를 6으로 변경한 것 이외에는 다른 파라미터는 기정값을 이용했다. 출력된 특징량은 MDB 파일로서 보존했다.
각 항체에 관해서, 산출한 특징량 중 패치에 관한 4종류의 특징량, 구체적으로는, 모든 소수성 패치 중 면적순으로 상위 5개의 면적의 합계값(Patch_hyd_5), 모든 소수성 패치의 면적의 합계값(Patch_hyd), 모든 전하 패치 중 면적순으로 상위 5개의 면적의 합계값(Patch_ion_5), 모든 전하 패치의 면적의 합계값(Patch_ion)을 MDB 파일로부터 추출하고, 실험값과의 상관성을 검토했다. 그때, 종류의 특징량의 조합에 대해서도 실험값과의 상관성을 검토했다. 상관성의 검토에는, 각 특징량을 1변수, 실시예 1의 표 2에 나타낸 기포 용량 120μL의 샘플의 1시린지당의 목시에 의해 검출 가능한 입자수의 평균을 1변수로 한 경우의 피어슨 적률 상관계수 및 스피어만의 순위 상관계수를 이용했다. 어느 특징량도 면적을 나타내는 단위는 Å2이다.
이상의 MOE를 이용한 모든 계산에 있어서, 분자력장에 대해서는, MOE 2019.01의 표준인 Amber10:EHT를 이용했다.
6종류의 항체(mAb1-6)인 Patch_hyd_5, Patch_hyd, Patch_ion_5, Patch_ion, 그 조합값(단위는 모두 Å2), 및 실시예 1의 표 2에 나타낸 기포 용량 120μL의 샘플의 1시린지당 목시에 의해 검출 가능한 입자수의 평균과의 피어슨의 적률 상관계수, 스피어만의 순위 상관계수를 표 3에 나타낸다.
그 결과, Patch_ion의 값과 기포 용량 120μL의 샘플의 1시린지당의 목시에 의해 검출 가능한 입자수의 평균과 상관이 높은 것을 발견했다(적률 상관계수: 0.91). 더욱이, "Patch_hyd_5"와 "(Patch_ion*1.5)"의 합이 기포 용량 120μL의 샘플의 1시린지당의 목시에 의해 검출 가능한 입자수의 평균과 상관이 가장 높은 것을 발견했다(적률 상관계수: 0.92).
실시예 1의 표 2에 나타낸 기포 용량 120μL의 샘플의 1시린지당의 목시에 의해 검출 가능한 입자수의 평균과 "Patch_hyd_5+(Patch_ion*1.5)"의 관계성을 이하의 표 4에 나타낸다. 실시예 1에서 얻어진 기포 용량 120μL 및 10μL에서의 목시에 의해 검출 가능한 입자수를 비교함으로써, 목시에 의해 검출 가능한 입자수의 평균의 감소의 정도(목시에 의해 검출 가능한 입자 저감률)가 나타났다.
실시예 3 mAb2의 목시에 의해 검출 가능한 입자 형성 확인 시험
mAb2 함유 용액(mAb2: 150mg/mL, 완충제: 20mmol/L 히스티딘, 안정화제: 150mmol/L 아르기닌, 및 약 162mmol/L 아스파르트산, 계면활성제: 0.5mg/mL 폴록사머 188, pH 6.0)을 0.22μm 필터로 여과한 후, 방사선(25kGy) 멸균한 27G 침 부착 COP제 시린지(1mL 규격) 내에, 1.0mL의 용액을 충전하고 스토퍼로 타전했다. 충전·타전한 샘플에 대하여, 타전 직후에 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1을 실시하고, 시린지 내에 목시에 의해 검출 가능한 입자를 포함하고 있다고 판단한 샘플을 제외했다. 실시예 1에서 얻어진 검량선에 기초하여, 시린지의 스토퍼 위치를 조정하여, 표 5에서 나타낸 목적하는 기포 용량으로 조정했다. 각 기포 용량의 샘플에 대하여, 5℃에서 약 7개월 보관 후에 25℃에서의 보관으로 변경한 후, 25℃에서 6주간 보관했다. 25℃에서의 보관 기간 중에 이하에서 설명하는 메커니컬 스트레스를 3회 부가하고, 6주간이 경과한 후에 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 2를 실시했다. 목시에 의해 검출 가능한 입자의 존재가 인정된 샘플에 대하여, Raman Imaging Microscope(DXR2xi)를 이용한 라만 스펙트럼 측정에 의해, 목시에 의해 검출 가능한 입자의 동정을 실시하여 입자가 mAb2 유래인 것을 확인했다.
[목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1]
백색 광원의 직하의 밝기가 약 8000lx인 것 이외에는 실시예 1의 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1과 마찬가지로 하여, 시린지에 충전된 용액 중의 목시에 의해 검출 가능한 입자의 유무를 조사했다.
[메커니컬 스트레스]
ASTM D4169를 참조하여, 이하의 낙하 시험과 진동 시험을, 낙하 시험, 진동 시험, 낙하 시험의 순번으로 조합한 스트레스를 가했다.
[낙하 시험]
프리필드 시린지를 트레이에 넣고, 트레이를 합계 3매 겹쳤다. 트레이는 위로부터 빈 트레이, 샘플 트레이, 빈 트레이의 순으로 겹쳤다. 골판지에 대한 넘버링은 도 2와 같이 행했다. 겹친 트레이는 프리필드 시린지의 침 끝이 면(2)을 향하도록 하여 골판지로 곤포했다. 골판지로 곤포한 샘플에 대하여, 낙하 시에 하측이 되는 면을 면(1), 면(2), 면(3), 면(4)의 순으로 바꾸면서 높이 38.1cm로부터 낙하시켰다. 이것을 1세트로 하고 1회의 낙하 시험으로 2세트의 낙하를 실시했다.
[진동 시험]
시린지 샘플을 트레이에 넣은 후, 트레이를 골판지로 곤포하고, 시린지의 배럴이 지면과 평행이 되도록 골판지를 배치했다. 강도를 각각 Truck Low 40min, Truck Middle 15min, Truck High 5min, Air level I 120min으로 하여 골판지에 진동 스트레스를 가했다.
[목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 2]
백색 광원의 직하의 밝기가 약 6000lx인 것 이외에는 실시예 1의 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1과 마찬가지로 하여, 시린지에 충전된 용액 중의 목시에 의해 검출 가능한 입자의 유무를 조사했다.
[목시에 의해 검출 가능한 입자 동정 방법]
메커니컬 스트레스 부가 후의 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 2에서 목시에 의해 검출 가능한 입자의 존재가 인정된 전체 샘플에 대하여, 용액의 전량을 공경 3μm의 니켈 필터로 흡인 여과했다. 필터 상에 포집된 입자 중, 사이즈가 가장 큰 이물에 대하여 라만 스펙트럼을 취득하고, 동정을 실시하여 입자가 mAb2 유래인 것을 확인했다.
[평가 결과]
메커니컬 스트레스 부가 후의 목시에 의해 검출 가능한 입자 동정의 결과를 이하의 표 6에 나타낸다. 이하와 같이, 적량의 계면활성제를 함유한 상태여도, 통상 기포 용량인 기포 용량 120μL에서는 복수의 샘플에서 단백성 목시에 의해 검출 가능한 입자가 인정되었다. 이 기포 용량을 69μL 이하로 함으로써, 계면활성제 첨가로도 억제할 수 없었던 단백성 목시에 의해 검출 가능한 입자의 수를 저감 가능한 것을 알 수 있었다.
동정한 단백성의 목시에 의해 검출 가능한 입자의 사이즈의 히스토그램을 도 4에 나타낸다. 단백성의 목시에 의해 검출 가능한 입자의 사이즈 범위는 46.0∼279μm였다.
실시예 4 mAb3의 가시 입자 형성 확인 시험
mAb3 함유 용액(mAb3: 120mg/mL, 완충제: 20mmol/L 히스티딘, 안정화제: 150mmol/L 아르기닌, 및 약 162mmol/L 아스파르트산, 계면활성제: 0.5mg/mL 폴록사머 188, pH 6.0)을 0.22μm 필터로 여과한 후, 방사선(25kGy) 멸균한 27G 침 부착 COP제 시린지(1mL 규격) 내에, 1.0mL를 충전하고, 스토퍼로 타전했다. 충전·타전한 샘플에 대하여, 타전 직후에 가시 입자 평가 1을 실시하고, 시린지 내에 가시 입자를 포함하고 있다고 판단한 샘플을 제외했다. 실시예 1에서 얻어진 검량선에 기초하여, 시린지의 스토퍼 위치를 조정함으로써, 표 7에서 나타낸 목적하는 기포 용량으로 조정했다. 각 기포 용량의 샘플에 대하여, 시험 개시 시에 메커니컬 스트레스를 부가한 후에 40℃에서 60일 보관 후에 본 실시예의 가시 입자 평가 1과 마찬가지의 조건에서 가시 입자 평가 2를 실시했다.
[가시 입자 평가 1]
실시예 1의 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1과 마찬가지의 방법으로, 밝기를 3000-3750lx로 하고, 흑색 배경 앞에서 11초 이상, 백색 배경 앞에서 5초 이상 시린지를 완만하게 선회 또는 전도시켜 관찰하고, 시린지에 충전된 용액 중의 가시 입자의 유무를 조사했다.
[메커니컬 스트레스]
ASTM D4169를 참조하여, 이하의 조건에서 진동 스트레스를 가했다. 그 후 이하의 조건에서 회전 스트레스를 200회 가했다.
[진동 스트레스]
시린지 샘플을 탭에 넣고, 시린지의 배럴이 지면과 수직이 되도록 탭을 배치했다. Truck Low 40min, Truck Middle 15min, Truck High 5min, Air level II 120min의 강도로 탭에 진동 스트레스를 주었다.
[회전 스트레스]
시린지 샘플을 탭에 넣고, 시린지의 배럴이 지면과 수직이 되도록 배치했다. 수동으로, 시린지 내의 공기가 충분히 움직이는 속도로 회전시켰다.
[평가 결과]
40℃에서 60일 보관 후의 가시 입자 평가 2의 결과를 이하의 표 8에 나타낸다. 실시예 3의 표 6과 동일하게, 적량의 계면활성제를 함유한 상태여도, 기포 용량 120μL에서는 복수의 샘플에서 가시 입자가 인정되었다. 이 기포 용량을 42μL 이하로 함으로써, 계면활성제 첨가로도 억제할 수 없었던 가시 입자의 수를 저감 가능한 것을 알 수 있었다.
실시예 5 mAb3의 목시에 의해 검출 가능한 입자 형성 확인 시험
mAb3 함유 용액(mAb3: 120mg/mL, 완충제: 20mmol/L 히스티딘, 안정화제: 150mmol/L 아르기닌, 및 162mmol/L 아스파르트산, 계면활성제: 0.5mg/mL 폴록사머 188, pH 6.0)을 0.22μm 필터로 여과한 후, 방사선(25kGy) 멸균한 27G 침 부착 COP제 시린지(2.25mL 규격) 내에, 2.0mL의 용액을 충전하고 스토퍼로 타전했다. 충전·타전한 샘플에 대하여, 타전 직후에, 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1을 실시하고, 시린지 내에 목시에 의해 검출 가능한 입자를 포함하고 있다고 판단한 샘플을 제외했다. 하기의 기포 용량 측정·설정 방법으로 작성한 검량선에 기초하여, 시린지의 스토퍼 위치를 조정함으로써, 표 9에 나타내는 목적하는 기포 용량으로 조정했다. 각 기포 용량의 샘플에 대하여, 25℃에서 약 3개월 보관한 후에 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 2를 실시했다. 보관 중에 보관 개시 시, 보관 개시 2주간 후, 및 보관 개시 3주간 후의 합계 3회, 메커니컬 스트레스를 부가했다.
[목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1]
백색 광원의 직하의 밝기가 약 8000lx인 것 이외에는 실시예 1의 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1과 마찬가지로 하여, 시린지에 충전된 용액 중의 목시에 의해 검출 가능한 입자의 유무를 조사했다.
[기포 용량 측정·설정 방법]
2.0mL의 항체 함유 용액을 충전하고 스토퍼로 타전한 항체 용액 함유 시린지 샘플의 27G 침 부착 COP제 시린지(2.25mL 규격)를 침이 위가 되는 방향을 향하게 하고, 기포를 침의 기부까지 상승시켜 침 끝으로부터 공기를 압출함으로써, 가능한 한 공기를 뺀 샘플을 작성했다. 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리는 14.2mm였다.
가능한 한 공기를 뺀 샘플에 대하여, 다른 시린지를 이용하여 샘플의 고무 마개측으로부터 침을 찔러, 120μL의 공기를 주입했다. 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리는 12mm였다.
이상의 측정 결과로부터, 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리와 기포 용량의 검량선을 작성하고, 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리로 기포 용량을 설정했다. 설정한 기포 용량의 조건은 이하의 표 9와 같다.
[메커니컬 스트레스]
ASTM D4169를 참조하여, 보관 개시 시에 이하의 낙하 시험과 진동 시험을, 낙하 시험, 진동 시험, 낙하 시험의 순번으로 조합한 스트레스를 가했다. 보관 개시 2주간 후, 및 보관 개시 3주간 후의 2회에 대해서는, 낙하 시험만의 스트레스를, 낙하 시험을 2세트 반복함으로써, 가했다. 낙하 시험 및 진동 시험은 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 행했다.
[목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 2]
백색 광원의 직하의 밝기가 약 6000lx인 것 이외에는 실시예 1의 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1과 마찬가지로 하여, 시린지에 충전된 용액 중의 목시에 의해 검출 가능한 입자의 유무를 조사했다.
[평가 결과]
25℃에서 약 3개월 보관 후의 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가의 결과를 이하의 표 8에 나타낸다. 실시예 3의 표 6과 동일하게, 적량의 계면활성제를 함유한 상태여도, 기포 용량 120μL에서는 복수의 샘플에서 목시에 의해 검출 가능한 입자가 인정되었다.
이 기포 용량을 10μL 이하로 함으로써, 계면활성제 첨가로도 억제할 수 없었던 목시에 의해 검출 가능한 입자의 수를 저감 가능한 것을 알 수 있었다.
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Claims (17)

  1. 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 방법으로서,
    호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 것,
    얻어진 모델의 표면의 소수성 잔기의 클러스터 및 전하를 갖는 잔기의 클러스터에 대응하는 부분을 각각 소수성 패치 및 전하 패치로서 특정하여, 각각의 면적을 산출하는 것,
    면적의 크기에 따른 랭킹으로 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합(X(Å2)), 및 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 것, 및
    X+Y×1.5가 1700 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 것을 포함하고,
    입자가 40μm 이상의 입경을 갖는, 상기 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    X+Y×1.5가 2000 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 방법으로서,
    호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 것,
    얻어진 모델의 표면의 전하를 갖는 잔기의 클러스터에 대응하는 부분을 전하 패치로서 특정하여, 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 것, 및
    Y가 600 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 것을 포함하고,
    입자가 40μm 이상의 입경을 갖는, 상기 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    용액이 수용액인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단백질이 모노클로날 항체인, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    모노클로날 항체가 모노스페시픽 항체, 또는 바이스페시픽 항체 중 어느 것인, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    호몰로지 모델링 또는 항체 모델링이, Molecular Operating Environment(MOE) 소프트웨어를 이용하여 행해지는, 방법.
  8. 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 용액이 용기에 충전된 주사용 제제에 있어서, 용액 중에서의 입자의 발생을 저감시키는 방법으로서,
    용기 내의 기포의 용량을 40μL 이하로 하는 것을 포함하고,
    용기가 시린지 또는 카트리지이며,
    단백질이, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높다고 판정되는 단백질인, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    용기 내의 기포의 용량을 10μL 이하로 하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 용액이 용기에 충전된 주사용 제제를 조제하는 방법으로서,
    얻어지는 주사용 제제에 있어서 용기 내의 기포의 용량이 40μL 이하가 되도록, 용기 내에 용액을 충전하는 것을 포함하고,
    용기가 시린지 또는 카트리지이며,
    단백질이, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높다고 판정되는 단백질인, 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    얻어지는 주사용 제제에 있어서 용기 내의 기포의 용량이 10μL 이하가 되도록, 용기 내에 용액을 충전하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    용액이 수용액인, 방법.
  13. 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 용액이 용기에 충전된 주사용 제제로서,
    단백질이, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높다고 판정되는 단백질이고,
    용기가 시린지 또는 카트리지이며,
    용기 내의 기포의 용량이 40μL 이하인, 주사용 제제.
  14. 제 13 항에 있어서,
    용기 내의 기포의 용량이 10μL 이하인, 주사용 제제.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    용액이 수용액인, 주사용 제제.
  16. 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 시스템으로서,
    호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 수단,
    얻어진 모델의 표면 중, 소수성 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분, 및 전하를 갖는 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분을 각각 소수성 패치 및 전하 패치로서 특정하여, 각각의 면적을 산출하는 수단,
    면적의 크기에 따른 랭킹으로 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합(X(Å2)), 및 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 수단, 및
    X+Y×1.5가 1700 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 수단을 포함하고,
    입자가 40μm 이상의 입경을 갖는, 상기 시스템.
  17. 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하는 시스템으로서,
    호몰로지 모델링 또는 항체 모델링에 의해 단백질의 아미노산 서열로부터 단백질의 입체 구조 모델을 작성하는 수단,
    얻어진 모델의 표면의 전하를 갖는 잔기의 클러스터에 대응하는 부분을 전하 패치로서 특정하여, 전하 패치 총면적(Y(Å2))을 산출하는 수단, 및
    Y가 600 이상이 되는 단백질을 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질로 판정하는 수단을 포함하고,
    입자가 40μm 이상의 입경을 갖는, 상기 시스템.
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