JP2023112046A - 粒子の形成を低減する方法及びそれにより形成される組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】粒子の形成を低減する方法及びそれにより形成される組成物を提供すること。【解決手段】本明細書に開示するバイオ医薬組成物及び医薬品は、眼に見えない粒子の形成量の低減を示す。本明細書に開示する組成物及び医薬品は、タンパク質と、高パーセンテージ量（例えば、少なくとも９７％）の長鎖脂肪酸エステルを含む界面活性剤または安定剤とを含む。かかる組成物及び医薬品の調製方法ならびに保管方法もまた本明細書に開示する。【選択図】 図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月１９日に出願された、米国仮出願第６２／５６０，３６５号の優先権の利益を主張する。当該仮出願の全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。

本開示は、保管時の眼に見えない粒子の形成量の低減を示すバイオ医薬製剤及び医薬品、ならびにそれらの調製方法及び保管方法に関する。具体的には、本開示は、タンパク質と、高パーセンテージ量の長鎖モノ不飽和脂肪酸エステルを含む界面活性剤または安定剤とを含む製剤及び医薬品、ならびにそれらの調製方法及び保管方法に関する。

ポリソルベートは従来、活性成分としてタンパク質を含む医薬品（「ＤＰ」とも呼ばれる）に使用されており、製造、保管、取り扱い、及び投与の過程で表面に誘起される（気／液または固／液）不安定性からタンパク質を保護する。目的のタンパク質（ＰＯＩ）と共精製されたリパーゼは、ポリソルベートとともに製剤に含まれる場合、ポリソルベートの脂肪酸エステルを遊離の脂肪酸に加水分解し得ることがわかった。ポリソルベートの脂肪酸エステルの非酵素的加水分解もまた、製剤中でより遅い速度で起こり得る。加水分解の結果生じる遊離脂肪酸は凝集し、かかる製剤を含む医薬品中で時間とともに微粒子を形成し得る。微粒子（眼に見えるもの及び眼に見えないものの両方）は、製品の安定性に影響を与える可能性があり、公定粒子状物質仕様（例えば、米国ＦＤＡ仕様）を満たさないために医薬品の保存可能期間を短縮し、臨床的な影響、例えば、投与時に免疫原性の反応をもたらし得る。

ＰＯＩの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）またはアフィニティークロマトグラフィーは、ＰＯＩと共精製されるリパーゼを低減または除去し、ひいては脂肪酸エステルの加水分解を減少させ得る。しかしながら、タンパク質製剤の調製にＨＩＣまたはアフィニティークロマトグラフィーのステップを追加するには、製造方法に、例えば、機器、材料、調製、プロトコル、及びプロトコル検証を追加する必要があり、結果として時間と費用が追加される。さらに、酵素を除去するためのＨＩＣまたはアフィニティークロマトグラフィーのステップは、製剤中の脂肪酸エステルの非酵素的加水分解の防止には役立たない。タンパク質組成物において、例えば、追加のＨＩＣやアフィニティークロマトグラフィーのステップを使用することなく、眼に見えない及び眼に見える微粒子の形成を低減または防止する方法がそれ故望まれる。

ポリソルベート８０の主要な脂肪酸エステルであるポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートの化学構造の図である。 各種ポリソルベート８０を含むタンパク質医薬品における、膜顕微鏡粒子濃度法で測定した眼に見えない微粒子（≧１０μｍ）数を示すグラフである。 各種ポリソルベート８０を含むタンパク質医薬品における、マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）で測定した眼に見えない微粒子（≧１０μｍ）数を示すグラフである。 各種ポリソルベート８０を含むタンパク質医薬品における、遊離脂肪酸の測定濃度を示すグラフである。

本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、様々な例示的な実施形態を示し、その記述とともに、本開示の実施形態の原理を説明するのに役立つ。本明細書に記載の実施形態または実施例の任意の特徴（例えば、組成物、製剤、方法等）は、任意の他の実施形態または実施例と組み合わせてもよく、本開示に包含される。

本明細書で使用される、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」またはその任意の他の変形は、非排他的な包含を対象とすることを意図しており、要素のリストを含むプロセス、方法、項目、または装置は、それらの要素のみを含むのではなく、かかるプロセス、方法、項目、または装置に明示的に記載されていない、またはこれに固有ではない他の要素も含み得る。「例示的」という用語は、「理想的」ではなく、「例」という意味で使用される。用語「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」及び「例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）」ならびにその文法的均等物に関しては、特に明記しない限り、「及びこれに限定されない」という表現が続くと理解される。

本明細書で使用される、「約」という用語は、実験誤差に起因する変動を説明することを意図している。本明細書に報告されるすべての測定値は、特に明記しない限り、該用語が明示的に使用されているか否かにかかわらず、「約」という用語で修飾されると理解される。本明細書で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他を示す場合を除き、複数の指示対象を含む。

本明細書に開示するすべての数値（すべての開示する値、制限、及び範囲を含む）は、開示する数値から＋／－１０％の変動（異なる変動が指定されない限り）を有し得る。さらに、特許請求の範囲では、値、制限、及び／または範囲は、当該値、制限、及び／または範囲＋／－１０％を意味する。

本開示は、本明細書に開示する特定の組成物、製剤、材料製造業者、医薬品、方法、または実験条件に限定されず、当業者の専門内で多くの変形が可能である。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図しない。

特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、特定の方法及び材料をここに説明する。言及されるすべての出版物は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される、「タンパク質」という用語は、アミド結合を介して共有結合した約２０個を超えるアミノ酸を有する任意のアミノ酸ポリマーを指す。タンパク質は、当技術分野で一般に「ポリペプチド」として知られる１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。従って、ポリペプチドはタンパク質の場合があり、また、タンパク質は複数のポリペプチドを含んで単一のコンフォメーションの単一の機能的生体分子を形成する場合がある。ジスルフィド架橋（例えば、システイン残基間でシスチンを形成する）が一部のタンパク質に含まれる場合がある。例えば、ジスルフィド架橋は、インスリン、免疫グロブリン、プロタミン等の適切な構造及び機能に不可欠である。

ジスルフィド結合の形成に加えて、タンパク質は他の翻訳後修飾を受ける場合がある。これらの修飾としては、脂質化（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、ファルネソイル化、ゲラニルゲラニル化、及びグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー形成）、アルキル化（例えば、メチル化）、アシル化、アミド化、グリコシル化（例えば、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、スレオニン、チロシン、及び／またはトリプトファンでのグリコシル基の付加）、ならびにリン酸化（すなわち、セリン、スレオニン、チロシン、及び／またはヒスチジンへのリン酸基の付加）が挙げられる。

本明細書で使用される、「タンパク質」という用語には、バイオ医薬タンパク質、研究または治療に使用される組み換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のＦｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体断片、抗体様分子、ナノボディ、組み換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン等が含まれる。タンパク質は、組み換え細胞系の産生系、例えば、昆虫のバキュロウイルス系、酵母系（例えば、Ｐｉｃｈｉａ種）、哺乳類系（例えば、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）を用いて産生され得る。

本明細書で使用される、「抗体」という用語には、４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖がジスルフィド結合によって相互に連結されて構成される免疫グロブリンが含まれる。通常、本開示の抗体は、分子量１００ｋＤａ超、例えば、１３０ｋＤａ～２００ｋＤａ、例えば、約１４０ｋＤａ、１４５ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１５５ｋＤａ、または１６０ｋＤａを有する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略す）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略す）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分され得、これには、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在し得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と略される場合があり、軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と略される場合がある。

例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と呼ばれるクラスの免疫グロブリンは、ヒト血清で共通して見られ、４本のペプチド鎖、すなわち、２本の軽鎖及び２本の重鎖を含む。各軽鎖は、シスチンのジスルフィド結合を介して１本の重鎖に連結され、２本の重鎖は２つのシスチンのジスルフィド結合を介して互いに結合されている。他のクラスのヒト免疫グロブリンとしては、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥが挙げられる。ＩｇＧの場合、４つのサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が存在する。各サブクラスは定常領域が異なり、結果として、異なるエフェクター機能を有し得る。

本明細書で使用される、「抗体」という用語には、完全な抗体分子の抗原結合断片も含まれる。本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」等の用語には、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の天然に存在する、酵素的に得られる、合成、もしくは遺伝子組み換えポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体の可変ドメイン及び任意に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作ならびに発現を含めた、タンパク質分解または組換え遺伝子工学技術等の任意の適切な標準技術を使用して、完全な抗体分子から得る場合もある。かかるＤＮＡは既知であり、及び／または、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、または合成され得る。該ＤＮＡをシーケンシングし、化学的に、または分子生物学手法を用いて操作し、例えば、１つ以上の可変ドメイン及び／または定常ドメインを適切な配置にアレンジすること、コドンを導入すること、システイン残基を作り出すこと、アミノ酸を修飾、追加もしくは削除すること等が可能である。

本明細書で使用される、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ及び特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される、「ヒト抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図しない。

「Ｆｃ含有タンパク質」という語句には、抗体、二重特異性抗体、イムノアドヘシン、ならびに免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも機能的部分を含む他の結合タンパク質が含まれる。「機能的部分」とは、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ、またはＦｃＲｎ、すなわち、新生児Ｆｃ受容体）に結合することができる、及び／または補体の活性化に関与し得るＣＨ２及びＣＨ３領域を指す。ＣＨ２及びＣＨ３領域がいかなるＦｃ受容体とも結合することができず、補体を活性化することもできないようにする削除、置換、及び／または挿入またはその他の修飾がＣＨ２及びＣＨ３領域に含まれる場合、当該ＣＨ２及びＣＨ３領域は機能的ではない。

Ｆｃ含有タンパク質は、当該修飾が当該結合タンパク質の１つ以上のエフェクター機能に影響を及ぼす場合を含む免疫グロブリンドメインの修飾（例えば、ＦｃγＲ結合、ＦｃＲｎ結合、ひいては半減期、及び／またはＣＤＣ活性に影響を及ぼす修飾）を含むことができる。かかる修飾としては、免疫グロブリン定常領域のＥＵナンバリングに準拠して、以下の修飾及びその組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない：２３８、２３９、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１５、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３４２、３４４、３５６、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３３、４３４、４３５、４３７、４３８、及び４３９。

例えば、限定する目的ではないが、該結合タンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質でよく、血清半減期の延長（列挙された修飾（複数可）を含まない同じＦｃ含有タンパク質と比較して）を示す場合があり、位置２５０（例えば、ＥもしくはＱ）、２５０及び４２８（例えば、ＬもしくはＦ）、２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４（例えば、ＳもしくはＴ）、及び２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）での修飾、または４２８及び／または４３３（例えば、Ｌ／Ｒ／ＳＩ／Ｐ／ＱもしくはＫ）及び／または４３４（例えば、Ｈ／ＦもしくはＹ）での修飾、または２５０及び／または４２８での修飾、または３０７もしくは３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４での修飾を有し得る。別の例では、該修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、ならびに３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾、２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の修飾、２５０Ｑ及び４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）、または３０７及び／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆもしくは３０８Ｐ）を含むことができる。

「細胞」という用語には、組み換え核酸配列を発現するのに適切な任意の細胞が含まれる。細胞には、原核生物及び真核生物の細胞（単細胞または多細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種の株等）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ等）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ等）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合、例えば、ハイブリドーマまたはクアドローマが含まれる。いくつかの実施形態では、該細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウスの細胞である。いくつかの実施形態では、該細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞株。いくつかの実施形態では、該細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子を含み、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）である。

「脂肪酸エステル」という用語は、エステル結合を介して頭部基に連結した脂肪酸鎖を含む任意の有機化合物を意味する。エステル結合は、ヒドロキシル基（例えば、アルコールまたはカルボン酸）がアルコキシ基で置換された場合に生じる。本明細書で使用される、ヒドロキシル基は、カルボン酸、より具体的には脂肪酸、及び／またはアルコール、例えば、グリセロール、ソルビトール、ソルビタン、イソソルビド等の部分であり得る。該アルコール基は、本明細書では一般に頭部基と呼ばれる。

脂肪酸エステルの例としては、一般に、リン脂質、脂質（例えば、その頭部基はグリセロールであり、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドを含む）、ならびに、例えば、非イオン性界面活性剤であるポリソルベート２０、ポリソルベート６０、及びポリソルベート８０のようなポリソルベートを含めた界面活性剤及び乳化剤が挙げられる。界面活性剤及び乳化剤は、共溶媒及び安定剤として有用である。それらは、親水性表面及び親油性表面の両方と会合することにより、タンパク質のような含有物の分散及び構造安定性を維持する働きをする。界面活性剤は主に、機械的応力、例えば、気／液界面に誘起される、及び固／液界面に誘起される部分アンフォールディングならびに自己会合に対するタンパク質の安定性を高めるためにタンパク質製剤に添加される。界面活性剤なしでは、タンパク質は場合によっては溶液中で構造的に不安定になり、多量体の凝集体を形成し、これが最終的に眼に見えない粒子になり得る。

「脂肪酸」または「脂肪酸鎖」という用語は、脂肪族尾部を有するカルボン酸を意味する。脂肪族尾部とは単に、炭素及び水素、場合によっては酸素、硫黄、窒素、及び／または塩素の置換を含む炭化水素鎖である。脂肪族尾部は、飽和（飽和脂肪酸等の場合）、すなわち、すべての炭素－炭素結合が単結合（すなわち、アルカン）の場合がある。脂肪族尾部は不飽和（不飽和脂肪酸等の場合）の場合があり、ここでは、１つ以上の炭素－炭素結合が二重結合（アルケン）または三重結合（アルキン）である。

脂肪酸は、一般に、脂肪族尾部に６個未満の炭素を有する短鎖脂肪酸、６～１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸、１３～２１個の炭素を有する長鎖脂肪酸、及び２２個以上の炭素の脂肪族尾部を有する超長鎖脂肪酸として設計される。上記のように、脂肪酸は、スチフネス及び融点に相関する飽和度によっても分類される。一般的な脂肪酸としては、カプリル酸（８炭素：０二重結合、８：０）、カプリン酸（１０：０）、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）、ミリストレイン酸（１４：１）、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、サピエン酸（１６：１）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、エライジン酸（１８：１）、バクセン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、リノエラエジン酸（ｌｉｎｅｌａｅｄｉｃ ａｃｉｄ）（１８：２）、アルファ－リノレン酸（１８：３）、アラキジン酸（２０：０）、アラキドン酸（２０：４）、エイコサペンタエン酸（２０：５）、ベヘン酸（２２：０）、エルカ酸（２２：１）、ドコサヘキサエン酸（２２：６）、リグノセリン酸（２４：０）、及びセロチン酸（２６：０）が挙げられる。

上記のように、ポリソルベートは、非イオン性界面活性剤及びタンパク質安定剤として有用な脂肪酸エステルである。ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、及びポリソルベート８０は、医薬品、化粧品、及び食品業界で安定剤及び乳化剤として広く使用されている。ポリソルベート２０は、主にポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノラウリン酸エステルを含む。ポリソルベート４０は、主にポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノパルミチン酸エステルを含む。ポリソルベート６０は、主にポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノステアリン酸エステルを含む。ポリソルベート８０は、主にポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノオレイン酸エステルを含む（図１に示す）。

市販グレードのポリソルベートの品質は、供給業者によって異なる。ポリソルベートはそれ故、多くの場合様々な化学物質の混合物であり、大部分がポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノエステル（上記の通り）からなり、場合によってはイソソルビドエステル混入物質を含む。それらはまた、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、中間体構造、及び脂肪酸反応物質も含み得る。頭部基（この場合はポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）は、そのアルコール基のうちの３つが、３つのポリオキシエチレン基とエーテル結合を形成するように置換されたソルビタン（１，４－アンヒドロソルビトール、１，５－アンヒドロソルビトール、及び１，４，３，６－ジアンヒドロソルビトールを含む脱水ソルビトールの混合物）を含む。４番目のアルコール基は、脂肪酸で置換され、脂肪酸エステルを形成する。

いくつかの市販のポリソルベートのバッチでは、ポリソルベートはイソソルビドのモノエステルを含む。イソソルビドは、グルコースのヘテロ環誘導体であり、ソルビトールの脱水でも調製される。それはジオールであり、すなわち、１つまたは２つのエステル結合の形成に関与することができる２つのアルコール基を有する。従って、例えば、一部のロットのポリソルベート８０は、かなりの量のイソソルビドのオレイン酸モノエステル及びジエステルを含み得る。

頭部基の変動に加えて、ポリソルベートの調製物は、可変量の他の脂肪酸エステルを含む。例えば、ポリソルベート８０のある特定の供給源の分析では、＜５％ミリスチン酸、＜１６％パルミチン酸、＞５８％オレイン酸、＜６％ステアリン酸、及び＜１８％リノール酸を示した。ポリソルベート８０の別の供給源の分析では、約７０％のオレイン酸と、残りが他の脂肪酸エステル及び不純物であることを示した。ポリソルベート８０のさらに別の供給源の分析では、約８６～８７％のオレイン酸を示した。ポリソルベート８０のさらに最近開発された供給源の分析では、≧９９％オレイン酸を示した。

ポリソルベート２０またはポリソルベート８０のような非イオン性界面活性剤は、抗体及び他のタンパク質のような大きな分子の安定化を助け、オリゴマー複合体や他の凝集体の形成を防ぐのに役立つ。凝集体は、ナノ粒子または１０～１００ミクロン（１０～１００μｍ）の範囲もしくは２～１００ミクロン（２～１００μｍ）の範囲の眼に見えない粒子になる可能性があり、医薬品の安定性及び保存可能期間を妨げ、免疫原性を誘発し得る。従って、タンパク質製剤の安定性は、場合によっては、非イオン性界面活性剤の添加剤の安定性に依存する。しかしながら、本明細書でさらに論じるように、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０は、場合によっては、凝集体、ナノ粒子、及び眼に見えない粒子の形成に寄与し得る。

本開示による「眼に見えない（ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ）粒子」（ＳＶＰ）及び「眼に見えない微粒子」という語句は、特に液体中で肉眼では見えない粒子を指す。換言すれば、眼に見える粒子ではなくＳＶＰを含む溶液または他の液体は、濁っては見えない。ＳＶＰは一般に、直径１００ミクロン（１００μｍ）以下の粒子を含むが、場合によっては１５０ミクロン（１５０μｍ）未満の粒子を含む（Ｎａｒｈｉ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ ａｎｄ ｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，”Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １０（４）：３７３－３８１（２００９））。ＳＶＰは、異物の混入、タンパク質の凝集、またはＤＰの他の成分の凝集の結果である可能性がある。ＳＶＰは、とりわけ、シリコーン油滴（油滴）、遊離脂肪酸（非晶質粒子及び／または油滴）、凝集タンパク質（非晶質粒子）、及び／またはタンパク質／脂肪酸複合体（非晶質粒子）を含み得る。

ＳＶＰは、様々な方法のいずれか１つ以上で検出することができる。ＵＳＰ規格は、光遮蔽及び光学顕微鏡プロトコルを指定している。他の方法としては、マイクロフローイメージ（ＭＦＩ）分析、コールターカウント、及びサブミクロン粒子追跡法が挙げられる。ＳＶＰのいくつかの測定及び特性評価法（例えば、光遮蔽、フロー顕微鏡法、電気検出ゾーン法、及びフローサイトメトリー）は、例えば、Ｎａｒｈｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ（２－１００μｍ） Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｐａｒｔ １，Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｙ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．１０４：１８９９－１９０８（２０１５）に論じられている。

光遮蔽は、タンパク質凝集体及び他の非晶質構造を過小評価しているとして批判されている。フロー画像分析、例えば、マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）（Ｂｒｉｇｈｔｗｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｔｔａｗａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）は、不規則形状の脆い透明なタンパク性ＳＶＰを検出する、ならびにこれらの種類の粒子をシリコーンの微液滴、気泡、及び他の異物と区別する感度のより高い方法である（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏ－ｆｌｏｗ ｉｍａｇｉｎｇ：Ｆｌｏｗ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｕｂ－ｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”ＡＡＰＳ Ｊ．１２（３）：４５５－４６４（２０１０））。一般に、光遮蔽分析によるＳＶＰ測定及び特性評価はＭＦＩより感度が低いため、ＭＦＩによって検出される粒子数は、光遮蔽分析によって検出される粒子数より多くなる傾向がある。簡潔には、ＭＦＩは、連続した明視野像をリアルタイムで取得して分析するフロー顕微鏡法である。画像分析アルゴリズムを当該画像に適用し、気泡、シリコーン油滴、及びタンパク性凝集体を識別する。体積約２５０マイクロリットルから数十ミリリットルまでを分析することができる。使用するシステムに応じて、２～３００ミクロン（２～３００μｍ）、または１～７０ミクロン（１～７０μｍ）の範囲の粒子を検出することができる（同上）。

ＦＤＡ及び他の政府の規制機関は、非経口製剤で許容されるＳＶＰ量に制限を設けている。主要な明確な懸案事項は、当該薬物を投与された患者における潜在的な免疫原性及び下流の悪影響を取り巻く不確実性である（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａ ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．９９（８）：３３０２－２１（２０１０））。少量の非経口薬剤（例えば、１００ｍＬ以下）に対して、薬局方は、光遮蔽分析で測定した場合、１０ミクロン（１０μｍ）以上のＳＶＰを容器当たり６，０００ＳＶＰ未満に、及び２５ミクロン（２５μｍ）以上のＳＶＰを容器当たり６００未満に制限し、膜顕微鏡粒子濃度試験で測定した場合、１０ミクロン（１０μｍ）以上のＳＶＰを容器当たり３，０００ＳＶＰ未満に、及び２５ミクロン（２５μｍ）以上のＳＶＰを容器当たり３００未満に制限している（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ａｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ ４０－ＮＦ ２８）、＜７８７＞ Ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）。眼薬に対しては、ＳＶＰの制限は、１０ミクロン（１０μｍ）以上が１ｍＬ当たり５０個、２５ミクロン（２５μｍ）以上が１ｍＬ当たり５個、及び５０ミクロン（５０μｍ）以上が１ｍＬ当たり２個である（同上、＜７８９＞ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）。規制機関は、製造業者が２ミクロン（２μｍ）以上のＳＶＰに対する仕様を確立することをますます期待しつつある（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａ ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９９（８）：３３０２－２１（２０１０）参照）。

「エステラーゼ」という用語は、エステル結合の加水分解に触媒作用を及ぼし、酸及びアルコールを生じる酵素を意味する。エステラーゼは、アセチルエステラーゼ（例えば、アセチルコリンエステラーゼ）、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、チオールエステラーゼ、リパーゼ、及び他のカルボキシルエステルヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１）を含めた酵素の多様なカテゴリーである。その名称はカルボキシルエステルヒドロラーゼ（別名カルボキシルエステラーゼ、カルボン酸エステルヒドロラーゼ、及びＥＣ ３．１．１．１）という意味を含むため、水を使用してカルボン酸エステルをアルコール及びカルボン酸に加水分解する。リパーゼは、カルボキシルエステルヒドロラーゼであり、トリグリセリド、脂肪及び油を含めた脂質の、脂肪酸及びアルコール頭部基への加水分解に触媒作用を及ぼす。例えば、トリグリセリドは、膵リパーゼのようなリパーゼによって加水分解され、モノアシルグリセロール及び２つの脂肪酸鎖を生じる。

ホスホリパーゼは、リン脂質を脂肪酸及び他の産物に加水分解するリパーゼである。ホスホリパーゼは、４つの広いカテゴリーに分類される：ホスホリパーゼＡ（ホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＡ２を含む）、ホスホリパーゼＢ、ならびにホスホジエステラーゼであるホスホジエステラーゼＣ及びホスホジエステラーゼＤ。標準的なホスホリパーゼに加え、リソソーム内腔に存在するホスホリパーゼＢ様酵素は脂質触媒作用に関与していると考えられている。例えば、ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）は、配列相同性と細胞内局在に基づいてエステラーゼ活性を有すると仮定されている（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｎｎｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐ７６，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４０２：４４９－４５８（２００７））。

ポリソルベート（ポリソルベート２０及びポリソルベート８０を含む）の不安定化に関連する酵素活性が発見された。その活性は、表１のアミノ酸配列を含むポリペプチド等のエステラーゼに関連することがわかった。これらのペプチド配列のＢＬＡＳＴ検索により、推定ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）との同一性が明らかになった。ＰＬＢＬ２は、ハムスター、ラット、マウス、ヒト、及びウシで高度に保存されている。本出願人らは、哺乳動物細胞株で製造された一部のクラスの目的のタンパク質（ＰＯＩ）と特定のプロセスで共精製するＰＬＢＬ２が、ポリソルベート２０及び８０の加水分解に関与するエステラーゼ活性を有することを想定している。出願人らは、ＰＬＢＬ２がその例である他のエステラーゼ種が、特定の目的のタンパク質及び／または宿主細胞の遺伝的な／エピジェネティックな背景に応じて、ポリソルベートの不安定性に寄与し得ることを想定している。

ポリソルベート８０のエステル加水分解が最近報告された（Ｌａｂｒｅｎｚ，Ｓ．Ｒ．，“Ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０ ｉｎ ｍＡｂ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｉｎ ｓｕｐｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｚｅｄ ｒｉｓｋ ａｆｔｅｒ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｉｎ ｍＡｂ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．１０３（８）：２２６８－７７（２０１４）参照）。その論文は、ＩｇＧを含む製剤中での眼に見える粒子の形成を報告した。著者は、コロイド状のＩｇＧ粒子がポリソルベート８０のオレイン酸エステルの酵素的加水分解で生じると仮定した。エステラーゼは直接特定されなかったが、著者は、リパーゼまたはツイーナーゼ（ｔｗｅｅｎａｓｅ）がＩｇＧと共精製し、これがポリソルベート８０の分解の原因となったと推測した（同上、７）。その論文に述べられている通り、ポリソルベート８０の存在による粒子の形成は、懸念材料であり、かかる粒子は、ＩｇＧ医薬品の安定性及び有効性に影響を与えかねない。

本明細書で使用される、「脂肪酸エステル加水分解パーセント」という語句は、加水分解された脂肪酸エステルのモル比を意味する。脂肪酸エステルの加水分解で遊離脂肪酸が放出されるため、脂肪酸エステルの加水分解パーセントは、サンプル中の遊離脂肪酸を測定することにより特定することができる。従って、脂肪酸エステルの加水分解パーセントは、遊離脂肪酸のモル数に脂肪酸エステルのモル数を加えた合計で除した遊離脂肪酸のモル数を計算することで特定され得る。ポリソルベート８０またはポリソルベート２０の加水分解パーセントの場合、その数は、遊離脂肪酸のモル数を計算し、残りのポリソルベートの合計モル数プラス遊離脂肪酸のモル数で除することで特定され得る。

「エステラーゼ阻害剤」という用語は、エステラーゼの活性を低減する、阻害する、または遮断する任意の化学物質を意味する。本出願者らは、脂肪酸エステル界面活性剤を含むタンパク質製剤にエステラーゼ阻害剤を含めることが、タンパク質の安定性を維持するのに役立ち、また、ＳＶＰ形成を減少させるのに役立ち得ると想定している。当技術分野で既知の一般的なエステラーゼ阻害剤としては、オルリスタット（テトラヒドロリピスタチン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｌｉｐｉｓｔａｔｉｎ）、カルボキシルエステラーゼ２及びリポタンパク質リパーゼの阻害剤）、リン酸ジエチルウンベリフェリル（コレステロールエステラーゼ［リパーゼＡ］阻害剤）、ＵＲＢ６０２（［１－１’－ビフェニル］－３－ｔｌ－カルバミン酸シクロヘキシルエステル、モノアシルグリセロールリパーゼ阻害剤）、ならびに２－ブトキシフェニルボロン酸（ホルモン感受性リパーゼの阻害剤）が挙げられる。目的のタンパク質の精製中または最終製剤にエステラーゼ阻害剤を含めることで、ポリソルベート８０のような非イオン性界面活性剤の加水分解が防止または遅延される可能性があり、これが眼に見えない粒子の形成を防止または減少すると期待される。しかしながら、エステラーゼ阻害剤を含めることはまた、最終製剤中の活性成分または他の成分の機能に悪影響を与え得る。

「バッファー」という用語は、溶液のｐＨを安定化させる緩衝液または緩衝剤を意味する。バッファーは一般に、弱酸とその共役塩基、または弱塩基とその共役酸を含む。タンパク質溶液を最適ｐＨでまたは最適ｐＨ付近にバッファリングすることで、適切なタンパク質のフォールディング及び機能が得られる。最適バッファーは、例えば、加速貯蔵／インキュベーション後に様々なｐＨでのタンパク質（例えば、抗体）溶液の熱力学的安定性（ＤＳＣ）、ならびに高分子量変異体（ＳＥＣ）及び電荷変異体（ＣＥＸ）を測定することで特定することができる。様々なｐＨでのタンパク質（例えば、抗体）溶液の円二色性を測定することもまた、バッファーの特定に役立ち得る。円二色性（ＣＤ）は、タンパク質の構造変化（アンフォールディング）を特定するために使用される１つの方法である（Ｓ．Ｂｅｙｃｈｏｋ，“Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ １５４（３７５４）：１２８８－９９（１９６６）、Ｋｅｍｍｅｒ ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ，“Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｌｅａｓｔ－ｓｑｕａｒｅｓ ｄａｔａ ｆｉｔｔｉｎｇ ｉｎ Ｅｘｃｅｌ ｓｐｒｅａｄｓｈｅｅｔｓ，”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．５（２）：２６７－８１（２０１０））。一部のタンパク質は、バッファーとして機能する（すなわち、いわゆる「自己バッファリング」）能力を有するため、安定ｐＨを維持するために外因性バッファーを添加する必要がない場合がある（Ｇｏｋａｒｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｌｆ－ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（８）：３０５１－６６（２００８））。一般に使用されるバッファーの例を表２に記載する。生体液のバッファーのより完全な考察に関しては、Ｉｒｗｉｎ Ｈ．Ｓｅｇｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２ｎｄ ｅｄ．１９７６）、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２４４（Ｐａｕｌ Ｂｅｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２１ｓｔ ｅｄ．２００６）を参照されたい。

「熱安定剤」という用語は、タンパク質を熱分解、変性、及び生物活性の崩壊から保護するためにバイオ医薬製剤に含まれる賦形剤または他の添加剤を意味する。一般に、熱安定剤は、タンパク質（例えば、抗体）をその天然のコンフォメーションに維持し、熱応力条件下での凝集を防ぐのに役立つ。熱応力は、凍結融解サイクル、高温曝露、または長期の保管から生じ得る。熱安定剤には、糖及び他の炭水化物、糖アルコール及びポリエチレングリコールのようなポリオール、ならびにグリシンのようなアミノ酸が含まれる。熱安定剤として有用な糖または糖アルコールの例としては、スクロース、トレハロース及びマンニトールが挙げられる。

「疎水性相互作用媒体」という用語は、支持構造と疎水性部分の組み合わせを意味し、該疎水性部分は該支持構造に固定されている。該媒体は、クロマトグラフィー媒体、例えば、充填床カラム形式で保持されるビーズまたは他の粒子の形態、膜の形態、または目的のタンパク質及び混入物質を含む液体を収容することができる任意の形式であり得る。従って、支持構造には、アガロースビーズ（例えば、セファロース）、シリカビーズ、セルロース系膜、セルロース系ビーズ、親水性ポリマービーズ等が含まれる。該疎水性部分は、疎水性分子及びタンパク質の疎水性表面に結合する。該媒体の疎水性度は、該疎水性部分を選択することで制御することができる。疎水性相互作用媒体は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）として知られるプロセスで使用され、目的のタンパク質を生成物及びプロセス関連の混入物質から分離するために使用される。目的のタンパク質が宿主細胞で製造され、及び／または宿主細胞から精製される場合、該生成物及びプロセス関連の混入物質は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）と呼ばれる。一般的なバイオ医薬品製造の宿主細胞であるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来のＨＣＰは、ＣＨＯＰ（チャイニーズハムスター卵巣タンパク質）と呼ばれ得る。場合によっては、目的のタンパク質（ＰＯＩ）及びＨＣＰを含む混合物は、該ＰＯＩの疎水性基の当該ＨＩＣ媒体の疎水性部分への結合を促進するように設計されたバッファー中で、該ＨＩＣ媒体に適用される。該ＰＯＩは、当該疎水性部分に結合することでＨＩＣ媒体に固着し、一部のＨＣＰは結合せずに洗浄バッファーに出てくる。該ＰＯＩは次いで、該ＨＩＣの疎水性部分からの該ＰＯＩの解離を促進するバッファーを用いて溶出され、それによって該ＰＯＩが不要なＨＣＰから分離される。

場合によっては、該ＨＩＣの疎水性部分は、ＨＣＰ等の一部の混入物質に結合し、該ＰＯＩは、該ＨＩＣのフロースルーから回収される。
場合によっては、親油性特性を有する特定のタンパク質に結合するように設計されたアフィニティークロマトグラフィーが、ＨＩＣの代わりに、またはＨＩＣと組み合わせて使用される。一部のエステラーゼ、例えば、一般的にはリパーゼ、または具体的にはホスホリパーゼは、トリグリセリドまたはリン脂質に結合するため、それら脂質を模倣する分子を用いてエステラーゼを捕捉してもよい。例えば、「ミリストイル化ＡＤＰリボシル化因子１」（別名「ｍｙｒＡＲＦ１」）を用いてリパーゼを捕捉し、ＰＯＩを未結合のままにしてフロースルーにすることができる。

本明細書で使用される、「容器」という用語は、一次包装構成要素、例えば、シリンジ（プレフィルドシリンジ等の場合）、バイアル（例えば、バイオ医薬製剤の保管用の２．５ｍＬのガラスバイアル）、または固体、液体、もしくは気体状物質を含むための任意の器もしくは手段を含むことを意味する。ここで、「容器」という用語は、とりわけ、その用語をＦＤＡ及びＵＳＰが、眼に見えない粒子の制限に関するガイダンス中で使用しているため、バイオ医薬製剤を含む器を指すために使用される（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ａｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ ４０－ＮＦ ２８），＜７８７＞Ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）。

本開示で使用される、「組成物」、「製剤」、及び「製剤化された製剤原料」（ＦＤＳ）という用語は、医薬品に含めるための２つ以上の薬剤成分の組み合わせを指す。組成物、製剤、またはＦＤＳは、例えば、活性薬剤成分、例えば、抗体、及び賦形剤、例えば、安定剤もしくは界面活性剤を含む液体組成物であり得る。組成物、製剤、またはＦＤＳは、複数の賦形剤を含み得る。組成物、製剤、またはＦＤＳはまた、他の構成要素、例えば、抗体と共精製されるタンパク質も含み得る。

本開示で使用される、「医薬品」（ＤＰ）という用語は、包装、出荷、または投与のための量のＦＤＳを含む剤形を指す。例えば、医薬品は、患者への投与量のＦＤＳを保持するプレフィルドシリンジであり得る。

上記の通り、一部のＰＯＩと共精製するＰＬＢＬ２等のＨＣＰは、それらのＰＯＩを含む製剤及び医薬品に使用されるポリソルベートの脂肪酸エステルに対してエステラーゼ様活性を示すことが仮定される。このエステラーゼ様の挙動は、その後凝集してＳＶＰを生じ得る遊離脂肪酸の形成をもたらすと考えられる。ＨＩＣ及び／またはアフィニティークロマトグラフィーは、ＰＯＩを精製し、医薬品または製剤からＨＣＰを除去し、ひいては脂肪酸エステルに対するエステラーゼ様の挙動を低減するために使用され得る一方、ＨＩＣまたはアフィニティークロマトグラフィーのステップの追加は、医薬品の製造プロセスに機器（例えば、疎水性相互作用媒体）、材料、調製、プロトコル、及びプロトコル検証の追加を必要とし、時間、資源、実験、及び費用の追加を意味する。従って、ＰＯＩ、ポリソルベート、及び共精製ＨＣＰを含む製剤ならびに医薬品におけるＳＶＰ形成を減少させる別の方法を有することが望まれる。

ＰＯＩ及び高パーセンテージ（例えば、＞９８％）のオレイン酸エステル含量を有するポリソルベート８０を含むＦＤＳならびに医薬品は、例えば、比較的低パーセンテージ（例えば、７０％または８６～８７％）のオレイン酸エステル含量を有するポリソルベート８０を含むＦＤＳならびに医薬品より、測定可能なＳＶＰの経時的形成が低いことが分かっている。これは、ＰＯＩが、脂肪酸エステルに対するエステラーゼ様の挙動を有するＨＣＰを除去するためのＨＩＣまたはアフィニティークロマトグラフィーに供されない場合であっても同様である。

本開示の実施形態は、ＰＯＩ（例えば、抗体）及びオレイン酸エステル含量が＞９８％のポリソルベート８０を含むＦＤＳならびに医薬品に関し、ここでは、該ＰＯＩは、エステラーゼ様の挙動を有するＨＣＰを除去するためのＨＩＣまたはアフィニティークロマトグラフィーのステップに供されていない。本開示のいくつかの実施形態では、ＦＤＳ及び医薬品は、例えば、５℃の温度で少なくとも６ヶ月間容器に保管された場合、直径１０μｍ以上を有する粒子の３，０００個未満の形成を示す。いくつかの実施形態では、ＦＤＳ及び医薬品は、例えば、５℃の温度で少なくとも６ヶ月間容器に保管された場合、直径１０μｍ以上を有する粒子の２，０００、１，５００、１，０００、８００、６００、５００、４００、３００、２９０、２７５、２７０、または２５０個未満の形成を示す。いくつかの態様では、本開示の実施形態は、かかるＦＤＳ及び医薬品の調製方法に関する。

本開示の実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品はＰＯＩを含む。いくつかの実施形態では、該ＰＯＩは抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、該ＰＯＩは、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧである。いくつかの実施形態では、該タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。いくつかの実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品は、２つ以上のＰＯＩを含む（例えば、該ＦＤＳまたは医薬品は、２つ以上のＰＯＩの共製剤を含む）。

本開示の実施形態では、該ＰＯＩは、当技術分野で既知の精製ステップで精製されていてもよい。例えば、該ＰＯＩが免疫グロブリンの場合、プロテインＡまたはプロテインＧのアフィニティー精製ステップを用いて精製されていてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＣＰまたは他の不純物は、この精製ステップの過程で当該ＰＯＩと共精製されていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品は、当該ＰＯＩと共精製されたエステラーゼを含む。いくつかの実施形態では、該エステラーゼは、ホスホリパーゼＢ様タンパク質、例えば、ＰＬＢＬ２である。

本開示の実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品中のＰＯＩ濃度は、約４０ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬの範囲、例えば、約５０ｍｇ／ｍＬ～約１６０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～１６０ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ～１５５ｍｇ／ｍＬでよい。

実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品は、ある量の界面活性剤または安定剤を含む。いくつかの実施形態では、該界面活性剤または安定剤は、脂肪酸エステルの混合物を含むポリソルベート８０であり、オレイン酸エステル含量が少なくとも９７％、９８％、または９９％である。いくつかの実施形態では、該界面活性剤または安定剤は、脂肪酸エステルの混合物を含むポリソルベート８０であり、オレイン酸エステル含量が＞９８％である。さらなる実施形態では、該界面活性剤または安定剤は、脂肪酸エステルの混合物を含むポリソルベート８０であり、オレイン酸エステル含量が≧９９％である。実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品中の該界面活性剤または安定剤の濃度は、０．００５％～１．００％（ｗ／ｖ）、例えば、０．５％（ｗ／ｖ）である。

いくつかの実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品の体積は、約０．２５ｍＬ～３ｍＬ、例えば、０．２５ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、１．５ｍＬ、２ｍＬ、２．２５ｍＬ、２．５ｍＬ、または３ｍＬである。いくつかの実施形態では、該医薬品は、容器に包装されたある体積の該ＦＤＳを含む。

いくつかの実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品は、さらなる賦形剤、例えば、バッファー、熱安定剤、またはエステラーゼ阻害剤を含む。
いくつかの実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品は、温度約２～８℃で少なくとも６ヶ月保管される。他の実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品は、例えば、約５℃、１５℃、２２℃、２４℃、または３０～５０℃、例えば、約３５℃、４０℃、４５℃、もしくは５０℃の温度で保管される。

いくつかの実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品は、最大で例えば、２～４週間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、１８ヶ月間、２４ヶ月間、または３６ヶ月間保管される。例えば、いくつかの実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品は、温度約５℃で最大２４ヶ月間保管される。他の実施形態では、該ＦＤＳまたは医薬品は、温度約３０～５０℃で最大５ヶ月間保管される。

実施例１
共精製された宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）リパーゼによるポリソルベートの分解に起因する遊離脂肪酸系の眼に見えない微粒子を生じやすいＩｇＧ４抗体医薬品の保存安定性を異なるＤＰサンプルで評価した。各ＤＰサンプルは、体積２．１３６ｍＬであり、同濃度のＩｇＧ４抗体（１５０ｍｇ／ｍＬ）、及びいくつかのロットのＰＳ８０のうちの１つを０．２％（ｗ／ｖ）含んでいた。ＰＳ８０ロットの各ロットは、オレイン酸エステル含量の３つの異なる含量パーセンテージ（７０％、８７％、及び≧９９％）のうちの１つを有した。以下の表は、各ＦＤＳサンプル中のＰＳ８０のオレイン酸エステル含量パーセンテージを要約している。

ＤＰサンプルを２～８℃でガラス製プレフィルドシリンジに２４ヶ月まで保管した。微粒子を各ＤＰサンプルで６ヶ月ごとに合計２４ヶ月間、顕微鏡粒子濃度法及びマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）の両方で測定した。

図２は、顕微鏡粒子濃度法で測定した直径≧１０μｍを有する容器当たりのＳＶＰ数をグラフ形式で示す。図３は、ＭＦＩで測定した直径≧１０μｍを有する容器当たりのＳＶＰ数をグラフ形式で示す。図２及び３に示すように、ＤＰ Ｂ及びＤＰ Ｃ（この２つのＤＰサンプルは、オレイン酸エステル含量が≧９９％のＰＳ８０を含む）は、顕微鏡法（図２）及びＭＦＩ（図３）の両方で測定して、２４ヶ月の全期間にわたり、最も低いＳＶＰ数を示した。オレイン酸エステル含量が８７％のＰＳ８０を含むＤＰ Ａは、２４ヶ月の期間にわたって次に低い眼に見えない微粒子数を示した（具体的には、２４ヶ月で８００～１２００個の粒子を示した）。ＤＰ Ｄ、Ｅ、及びＦはすべて、少なくとも１８ヶ月の時点で容器当たり３０００個をはるかに上回る粒子（両方法で測定して）を示した。

ＤＰ Ａ、Ｂ、及びＣにおいて粒子数が少ない（ＤＰ Ｄ、Ｅ、及びＦにおける、より多数の粒子と比較して）ことは、オレイン酸（または長鎖脂肪酸）エステル含量パーセンテージがより高いＰＳ８０を使用した結果であると仮定された。オレイン酸は、１つの不飽和結合を有する長鎖脂肪酸である（図１参照）。従って、それは周囲温度以下の融解温度約１３℃を有する。眼に見えない及び眼に見える遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の微粒子形成に先行するものは、個々のＦＦＡ鎖の凝集体への凝集作用であり、それらがその後粒子の形態で沈殿する。オレイン酸は、その製剤の５℃での保存中に、例えば、ポリソルベート８０の脂肪酸エステルの酵素的加水分解によって生じ得る。このオレイン酸はＳＶＰを形成する場合もあるが、その低融解温度のため、かかる粒子は、分析が行われる室温（約２２℃）ではタンパク質製剤中で油性液体として存在する可能性が高く、それ故、室温では眼に見えない微粒子として存在しない。対照的に、製剤中の非オレイン酸エステル含量が高いと、加水分解で対応するＦＦＡが形成され、それらの高融解温度のため、形成された眼に見えない及び眼に見える非晶質微粒子が分析中の周囲温度で存在する。

さらに、オレイン酸エステルは、それらの（オレイン酸エステルの）高疎水性に起因して、より短鎖の脂肪酸のエステルよりも優れた可溶化／安定剤であり、この高疎水性のため、オレイン酸エステルは遊離の脂肪酸及びタンパク質の微粒子を可溶化することができ、それにより製品の安定性を維持する。従って、オレイン酸エステル含量が高い（＞９８％）ポリソルベート８０は、オレイン酸エステル含量が低いポリソルベート８０と比較して、タンパク質製剤及び医薬品の安定性の向上をもたらすことができる。

実施例２
各サンプルＤＰ（ＤＰ Ａ～Ｆ）における各種の遊離脂肪酸の濃度（マイクログラム／ｍＬ）を、サンプルを５℃で１８ヶ月間保存した後に評価した。サンプルＤＰ Ａ～Ｆを実施例１に記載の通りに調製した。遊離脂肪酸濃度を１８ヶ月でＬＣ－ＭＳにより測定した。図４は、結果をグラフ形式で示す。示されるように、ＤＰ Ｂ及びＣ（この２つのＤＰサンプルは、オレイン酸エステル含量が≧９９％のＰＳ８０を含む）は、最も高いオレイン酸濃度及び最も低い他のＦＦＡ濃度を示した。これは、ＤＰ Ｂ及びＣにおけるＦＦＡ（すなわち、オレイン酸）の均一性を示している。

実施例２
各サンプルＤＰ（ＤＰ Ａ～Ｆ）における各種の遊離脂肪酸の濃度（マイクログラム／ｍＬ）を、サンプルを５℃で１８ヶ月間保存した後に評価した。サンプルＤＰ Ａ～Ｆを実施例１に記載の通りに調製した。遊離脂肪酸濃度を１８ヶ月でＬＣ－ＭＳにより測定した。図４は、結果をグラフ形式で示す。示されるように、ＤＰ Ｂ及びＣ（この２つのＤＰサンプルは、オレイン酸エステル含量が≧９９％のＰＳ８０を含む）は、最も高いオレイン酸濃度及び最も低い他のＦＦＡ濃度を示した。これは、ＤＰ Ｂ及びＣにおけるＦＦＡ（すなわち、オレイン酸）の均一性を示している。
以下に、上記実施形態から把握できる技術思想を付記として記載する。
［付記１］医薬品において肉眼では見えない及び眼に見える粒子の形成を低減する方法であって、
前記医薬品に少なくとも１００ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ抗体を含めることと、
前記医薬品にポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの混合物を含めることと、を含み、
前記混合物中のオレイン酸エステル含量は、前記混合物中の全脂肪酸エステルの９８％を超える、前記方法。
［付記２］前記医薬品を温度３０℃～５０℃で１～５ヶ月間保管することをさらに含み、
前記保管の後、フローイメージング顕微鏡法または膜顕微鏡法のうちの１つで検出して、直径１０ミクロン以上を有する３０００個未満の粒子が前記医薬品中で検出可能である、付記１に記載の方法。
［付記３］前記医薬品を温度２℃～８℃で１８～３６ヶ月間保管することをさらに含み、
前記保管の後、フローイメージング顕微鏡法または膜顕微鏡法のうちの１つで検出して、直径１０ミクロン以上を有する３０００個未満の粒子が前記医薬品中で検出可能である、付記１に記載の方法。
［付記４］粘度を低減する薬剤を前記医薬品に添加することをさらに含む、付記１に記載の方法。
［付記５］前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ４抗体である、付記１に記載の方法。
［付記６］前記ＩｇＧ抗体が、リパーゼと共精製することが可能であり、前記医薬品が前記リパーゼを含む、付記１に記載の方法。
［付記７］前記ＩｇＧ抗体が、前記医薬品への包含の前にアフィニティー精製のステップを用いて精製されている、付記１に記載の方法。
［付記８］前記医薬品に少なくとも１００ｍｇ／ｍＬの前記ＩｇＧ抗体を含める前記ステップが、前記医薬品に少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬの前記ＩｇＧ抗体を含めることを含む、付記１に記載の方法。
［付記９］前記ＩｇＧ抗体が、前記医薬品への包含の前に疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製されていない、付記１に記載の方法。
［付記１０］前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ４抗体であり、前記医薬品がホスホリパーゼＢ様２タンパク質を含む、付記１に記載の方法。
［付記１１］前記医薬品に前記ＩｇＧ抗体を含める前に、プロテインＡ精製ステップを用いて前記ＩｇＧ抗体を精製することをさらに含む、付記１に記載の方法。
［付記１２］前記混合物中の前記オレイン酸エステル含量が、前記混合物中の全脂肪酸エステルの少なくとも９９％である、付記１に記載の方法。
［付記１３］前記医薬品が、さらにエステラーゼを含む、付記１に記載の方法。
［付記１４］付記１に記載の方法に従って調製される、医薬品。
［付記１５］前記混合物中の前記オレイン酸エステル含量が、ガス液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、比色分析、または蛍光分析のうちの１つによって特定される、付記１に記載の方法。
［付記１６］前記医薬品が、非経口投与用に構成される、付記１に記載の方法。
［付記１７］ＩｇＧ抗体及びエステラーゼを含む医薬品において微粒子の形成を低減する方法であって、
前記医薬品にポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの混合物を含めることであって、前記混合物中のオレイン酸エステル含量は、前記混合物中の全脂肪酸エステルの９８％を超える、前記医薬品に前記ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの混合物を含めることを備え、
疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて前記ＩｇＧ抗体を精製することを含まない、前記方法。
［付記１８］前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ４抗体であり、前記エステラーゼがホスホリパーゼＢ様２タンパク質である、付記１７に記載の方法。
［付記１９］少なくとも１００ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ抗体と、
脂肪酸エステルの混合物と、を含む製剤であって、
前記混合物中のオレイン酸エステル含量が、前記混合物中の全脂肪酸エステルの９８％を超える、前記製剤。
［付記２０］少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬの前記ＩｇＧ抗体を含む、付記１９に記載の製剤。
［付記２１］前記脂肪酸エステルの混合物がポリソルベート８０である、付記１９に記載の製剤。
［付記２２］前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ４抗体であり、前記製剤がホスホリパーゼＢ様２タンパク質を含む、付記１９に記載の製剤。
［付記２３］付記１９に記載の製剤を含む、医薬品。
［付記２４］前記医薬品が温度３０℃～５０℃で１～５ヶ月間保管された後、フローイメージング顕微鏡法または膜顕微鏡法のうちの１つによって、直径１０ミクロン以上を有する３０００個未満の粒子が前記医薬品中で検出可能である、付記２３に記載の医薬品。
［付記２５］前記医薬品が温度２℃～８℃で１８～３６ヶ月間保管された後、フローイメージング顕微鏡法または膜顕微鏡法のうちの１つによって、直径１０ミクロン以上を有する３０００個未満の粒子が前記医薬品中で検出可能である、付記２３に記載の医薬品。

Claims (25)

1. 医薬品において肉眼では見えない及び眼に見える粒子の形成を低減する方法であって、
   前記医薬品に少なくとも１００ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ抗体を含めることと、
   前記医薬品にポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの混合物を含めることと、を含み、
   前記混合物中のオレイン酸エステル含量は、前記混合物中の全脂肪酸エステルの９８％を超える、前記方法。
2. 前記医薬品を温度３０℃～５０℃で１～５ヶ月間保管することをさらに含み、
   前記保管の後、フローイメージング顕微鏡法または膜顕微鏡法のうちの１つで検出して、直径１０ミクロン以上を有する３０００個未満の粒子が前記医薬品中で検出可能である、請求項１に記載の方法。
3. 前記医薬品を温度２℃～８℃で１８～３６ヶ月間保管することをさらに含み、
   前記保管の後、フローイメージング顕微鏡法または膜顕微鏡法のうちの１つで検出して、直径１０ミクロン以上を有する３０００個未満の粒子が前記医薬品中で検出可能である、請求項１に記載の方法。
4. 粘度を低減する薬剤を前記医薬品に添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ４抗体である、請求項１に記載の方法。
6. 前記ＩｇＧ抗体が、リパーゼと共精製することが可能であり、前記医薬品が前記リパーゼを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記ＩｇＧ抗体が、前記医薬品への包含の前にアフィニティー精製のステップを用いて精製されている、請求項１に記載の方法。
8. 前記医薬品に少なくとも１００ｍｇ／ｍＬの前記ＩｇＧ抗体を含める前記ステップが、前記医薬品に少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬの前記ＩｇＧ抗体を含めることを含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記ＩｇＧ抗体が、前記医薬品への包含の前に疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製されていない、請求項１に記載の方法。
10. 前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ４抗体であり、前記医薬品がホスホリパーゼＢ様２タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記医薬品に前記ＩｇＧ抗体を含める前に、プロテインＡ精製ステップを用いて前記ＩｇＧ抗体を精製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記混合物中の前記オレイン酸エステル含量が、前記混合物中の全脂肪酸エステルの少なくとも９９％である、請求項１に記載の方法。
13. 前記医薬品が、さらにエステラーゼを含む、請求項１に記載の方法。
14. 請求項１に記載の方法に従って調製される、医薬品。
15. 前記混合物中の前記オレイン酸エステル含量が、ガス液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、比色分析、または蛍光分析のうちの１つによって特定される、請求項１に記載の方法。
16. 前記医薬品が、非経口投与用に構成される、請求項１に記載の方法。
17. ＩｇＧ抗体及びエステラーゼを含む医薬品において微粒子の形成を低減する方法であって、
    前記医薬品にポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの混合物を含めることであって、前記混合物中のオレイン酸エステル含量は、前記混合物中の全脂肪酸エステルの９８％を超える、前記医薬品に前記ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの混合物を含めることを備え、
    疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて前記ＩｇＧ抗体を精製することを含まない、前記方法。
18. 前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ４抗体であり、前記エステラーゼがホスホリパーゼＢ様２タンパク質である、請求項１７に記載の方法。
19. 少なくとも１００ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ抗体と、
    脂肪酸エステルの混合物と、を含む製剤であって、
    前記混合物中のオレイン酸エステル含量が、前記混合物中の全脂肪酸エステルの９８％を超える、前記製剤。
20. 少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬの前記ＩｇＧ抗体を含む、請求項１９に記載の製剤。
21. 前記脂肪酸エステルの混合物がポリソルベート８０である、請求項１９に記載の製剤。
22. 前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ４抗体であり、前記製剤がホスホリパーゼＢ様２タンパク質を含む、請求項１９に記載の製剤。
23. 請求項１９に記載の製剤を含む、医薬品。
24. 前記医薬品が温度３０℃～５０℃で１～５ヶ月間保管された後、フローイメージング顕微鏡法または膜顕微鏡法のうちの１つによって、直径１０ミクロン以上を有する３０００個未満の粒子が前記医薬品中で検出可能である、請求項２３に記載の医薬品。
25. 前記医薬品が温度２℃～８℃で１８～３６ヶ月間保管された後、フローイメージング顕微鏡法または膜顕微鏡法のうちの１つによって、直径１０ミクロン以上を有する３０００個未満の粒子が前記医薬品中で検出可能である、請求項２３に記載の医薬品。