KR20210135543A - 제형 내 인간 혈청 알부민 - Google Patents

Abstract

약물 제형에서 지방산 입자의 형성을 제거, 감소 또는 방지하는 약물 제형 및 방법이 제공된다.

Description

제형 내 인간 혈청 알부민

본 발명은 일반적으로 약물 제형에서 지방산 입자의 형성을 제거, 감소 또는 방지하는 방법에 관한 것이다.

원치 않는 부작용을 최소화하면서 제조, 보관, 취급 및 투여 특성을 개선하기 위해 약물 제형을 설계하는데 많은 문제가 있다. 예를 들어, 제형 개발은 안정성을 증가시키고 종종 응집을 초래하는 화학적 또는 물리적 변화의 발생을 줄이는 용액 조건 및 첨가제 또는 부형제를 확인하고, 후속적으로 비-가시적(sub-visible) 또는 가시적(visible) 입자의 증가로 이어질 수 있다.

제형화된 주사용 의약품에서 입자의 형성을 방지하고 줄이는 것은 특히 어려운 일이었으며, 수년 동안 제약 산업 내에서 논쟁과 조사의 초점이었다. 합성 또는 생물학적 물질로 구성되고 다양한 공급원으로부터 기원하는 가시적 또는 심지어 비-가시적인 입자는 환자에서 면역원성의 가능성을 높일 수 있고, 의약품의 품질에 다양한 영향을 미칠 수 있다. 이러한 가능한 불순물 중 하나는 제조, 선적, 보관, 취급 또는 투여 중에 형성되는 지방산 입자일 수 있다. 지방산 입자는 잠재적으로 유해한 면역원성 효과를 유발하고, 저장 수명에 영향을 미칠 수 있다.

단백질 제형에서 지방산 입자의 형성을 감소 또는 방지하기 위한 개선된 방법 및 감소된 수준의 지방산 입자를 갖는 단백질 제형에 대한 필요성이 존재함을 이해할 것이다.

보관 중 뿐만 아니라 제조, 선적, 취급 및 투여 중에도 약물 제형의 안정성을 유지하는 것은 주요 과제이다. 의약품 중에서, 단백질 바이오 치료제는 그 성공과 다용도로 인해 인기를 얻고 있다. 치료 단백질은 가장 빠르게 성장하는 약물의 종류이며, 약물 시장의 약 1/3을 차지한다. 단백질 바이오 치료제 개발의 주요 과제 중 하나는 가시적 및 비-가시적 입자의 존재에 의해 영향을 받을 수 있는 단백질의 제한된 안정성을 극복하는 것이다. 이는 입자 - 단백질 입자 및 비-단백질 입자 모두의 잠재적인 면역원성에 대한 우려가 증가하기 때문이다. 이러한 입자의 형성의 완화는 약물 제형 개발에서 중요한 단계가 될 수 있다. 한 가지 문제의 예는 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 것이다.

본 개시내용은 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법을 제공한다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 유효량의 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형은 폴리소르베이트를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형은 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리소르베이트를 포함한다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형은 약 0.001% w/v 내지 약 1% w/v의 폴리소르베이트를 포함한다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형은 폴리소르베이트 및 적어도 하나의 단백질을 포함한다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형은 폴리소르베이트 및 항체를 포함한다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자는 유리 지방산을 포함한다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자는 유리 지방산을 포함하고, 유리 지방산의 분자 대 인간 혈청 알부민의 분자의 비는 약 6:1 내지 약 1:1일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자는 올레산, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유리 지방산을 포함한다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 제형은 적어도 약 5.5 ㎎/㎖의 인간 혈청 알부민을 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 제형은 비경구 제형일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자는 가시적 또는 비-가시적 입자이다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자는 라만 분광법(Raman spectroscopy)에 의해 검출 가능할 수 있다.

본 개시내용은 적어도 부분적으로 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법을 제공한다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 유효량의 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형은 폴리소르베이트를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형은 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리소르베이트를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형은 약 0.001% w/v 내지 약 1% w/v의 폴리소르베이트를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형은 폴리소르베이트 및 적어도 하나의 단백질을 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형은 폴리소르베이트 및 항체를 포함한다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자는 유리 지방산을 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자는 유리 지방산을 포함할 수 있고, 유리 지방산의 분자 대 인간 혈청 알부민의 분자의 비는 약 6:1 내지 약 1:1일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자는 올레산, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유리 지방산을 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 적어도 약 5.5 ㎎/㎖의 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 제형은 비경구 제형일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자는 가시적 또는 비-가시적 입자이다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법은 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 단계를 포함할 수 있되, 지방산 입자는 라만 분광법에 의해 검출 가능하다.

본 개시내용은 적어도 부분적으로 (i) 활성 약제학적 작용제 및 (ii) 인간 혈청 알부민을 포함하는 제형을 제공한다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 제형은 (i) 활성 약제학적 작용제, (ii) 인간 혈청 알부민 및 (iii) 폴리소르베이트를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 항체, (ii) 인간 혈청 알부민 및 (iii) 폴리소르베이트를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 활성 약제학적 작용제, (ii) 인간 혈청 알부민 및 (iii) 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80 또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리소르베이트를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 항체, (ii) 인간 혈청 알부민 및 (iii) 폴리소르베이트를 포함할 수 있되, 제형은 비경구 경로에 의해 투여될 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 항체, (ii) 인간 혈청 알부민, (iii) 폴리소르베이트 및 (iv) 리페이스(lipase) 효소를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 활성 약제학적 작용제 및 (ii) 적어도 약 5.5 ㎎/㎖의 인간 혈청 알부민을 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 활성 약제학적 작용제, (ii) 적어도 약 5.5 ㎎/㎖의 인간 혈청 알부민 및 (iii) 약 0.001% w/v 내지 약 1% w/v의 폴리소르베이트를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 활성 약제학적 작용제, (ii) 인간 혈청 알부민 및 (iii) 폴리소르베이트를 포함할 수 있되, 제형은 유리 지방산을 갖는 지방산 입자를 더 포함할 수 있고, 유리 지방산의 분자 대 인간 혈청 알부민의 분자의 비는 약 6:1 내지 약 1:1일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 항체, (ii) 인간 혈청 알부민 및 (iii) 폴리소르베이트를 포함할 수 있되, 폴리소르베이트는 분해되어 지방산 입자를 형성한다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 항체, (ii) 인간 혈청 알부민, (iii) 폴리소르베이트 및 (iv) 리페이스 효소를 포함할 수 있되, 리페이스 효소는 폴리소르베이트를 가수분해하여 지방산 입자를 형성할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 항체, (ii) 인간 혈청 알부민 및 (iii) 폴리소르베이트를 포함할 수 있되, 제형은 지방산 입자를 더 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 항체, (ii) 인간 혈청 알부민 및 (iii) 폴리소르베이트를 포함할 수 있되, 제형은 유리 지방산을 포함하는 지방산 입자를 더 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 항체, (ii) 인간 혈청 알부민 및 (iii) 폴리소르베이트를 포함할 수 있되, 제형은 약 6개 내지 약 22개의 탄소를 갖는 지방족 지방산을 포함하는 지방산 입자를 더 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 항체, (ii) 인간 혈청 알부민 및 (iii) 폴리소르베이트를 포함할 수 있되, 제형은 올레산을 포함하는 지방산 입자를 더 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 제형은 (i) 항체, (ii) 인간 혈청 알부민 및 (iii) 폴리소르베이트를 포함할 수 있되, 제형은 올레산, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산 및 이들의 조합물로부터 선택되는 유리 지방산을 포함하는 지방산 입자를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 이러한 양태 및 기타 양태는 다음의 설명 및 첨부 도면과 함께 고려될 때 더 잘 인정되고 이해될 것이다. 다음의 설명은 다양한 실시형태 및 이의 다수의 특정 세부사항을 나타내면서 제한이 아니라 예시로서 제공된다. 많은 치환, 수정, 추가 또는 재배열이 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있다.

도 1은 예시적인 실시형태에 따른 PS80 분해를 촉진함으로써 지방산 입자를 생성하는 크로모박테리움 비스코숨(Chromobacterium viscosum) 리페이스의 능력을 평가하기 위한 리페이스 농도에 대한 시간의 함수로서 450㎚에서의 흡광도의 플롯을 보여준다.
도 2는 예시적인 실시형태에 따라 제조된 지방산에 기인하는 입자의 조성을 확인하기 위해 라만 이동(Raman shift)(1/㎝)의 함수로서 라만 강도(Raman intensity)(a.u.)의 플롯을 보여준다.
도 3은 예시적인 실시형태에 따라 제조된 폴리소르베이트 함유 용액에 첨가된 다양한 FAF-HSA 농도에 대한 시간의 함수로서 450㎚에서의 흡광도의 플롯을 보여준다.
도 4는 예시적인 실시형태에 따라 제조된 폴리소르베이트 함유 용액에 첨가된 다양한 SA-HSA 농도에 대한 시간의 함수로서 450㎚에서의 흡광도의 플롯을 보여준다.
도 5는 HSA의 첨가 없이 다양한 다중클론 IgG 농도에 대한 시간의 함수로서 450㎚에서의 흡광도의 플롯을 보여준다.
도 6은 동결건조되지 않은 단일클론 항체(패널 A) 및 동결건조된 단일클론 항체(패널 B)를 포함하는 제형에 대한 시간의 함수로서 450㎚에서의 흡광도의 플롯을 보여준다.
도 7은 예시적인 실시형태에 따른 다양한 다중클론 IgG 농도에 4.5 ㎎/㎖의 FAF-HSA(패널 A) 및 7.5 ㎎/㎖의 FAF-HSA(패널 B)의 첨가에 대한 시간의 함수로서 450㎚에서의 흡광도의 플롯을 보여준다.
도 8은 예시적인 실시형태에 따라 미리-형성된 지방산 입자에 첨가된 다양한 혈청 농도에 대한 시간의 함수로서 450㎚에서의 흡광도의 플롯을 보여준다.
도 9는 용액 중 인간 혈청 및 미리-형성된 유리 지방산 입자를 포함하는 제형에 대한 시간의 함수로서 450㎚에서의 흡광도의 플롯을 보여준다.

지난 몇 년 동안 단일클론 항체(mAb)를 사용한 임상 시험의 상당한 증가에 의해 입증된 바와 같이, 의약품 중에서, 단백질-기반 바이오 치료제는 높은 수준의 선택성, 효력 및 효능을 제공하는 중요한 클래스의 약물이다. 단백질-기반 바이오치료제를 임상에 도입하는 것은 발견, 공정 및 제형 개발, 분석적 특성화 및 전-임상 독성학과 약리학을 포함하여 다양한 연구 및 개발 분야 전반에 걸쳐 조직화된 노력이 필요한 다년간의 작업이 될 수 있다. 임상적으로 그리고 상업적으로 실행 가능한 바이오치료제의 한 가지 중요한 양태 중 하나는 저장 수명뿐만 아니라 제조 공정의 측면에서 의약품의 안정성이다. 많은 정제된 단백질과 유사하게, mAb의 고유의 구조적 안정성은 전형적으로 대략 20 ㎉/㏖ 내지 25 ㎉/㏖의 정도로 상대적으로 미미하다(문헌[Kristi L. Lazar, Thomas W. Patapoff & Vikas K. Sharma,　Cold denaturation of monoclonal antibodies, 2　mAbs　42-52 (2010)). 이는 종종 고유 안정성이 더 큰 분자의 확인, 단백질 공학 및 제형 개발을 포함하여 제품 품질에 미치는 영향을 최소화하면서 제조 및 보관에 필요한 다양한 용액 조건 및 환경 전반에 걸쳐 mAb의 물리적 및 화학적 안정성을 증가시키는데 도움이 되는 적절한 단계를 필요로 한다. 제형 개발은 mAb 안정성을 증가시키고, 종종 응집을 초래하여 결과적으로 비-가시적 또는 가시적 입자의 증가를 초래할 수 있는 화학적 또는 물리적 변화의 발생을 줄이는 용액 조건 및 첨가제 또는 부형제를 확인하고자 하는 것이다.

특히 제형화된 의약품에서 가시적 및 비-가시적 입자는 수년 동안 제약 산업 내에서 논쟁과 조사의 초점이 되어 왔으며, 품질 문제를 제기할 수 있다. 합성 또는 생물학적 물질로 구성되며 다양한 공급원으로부터 생성되는 입자는 환자에서 면역원성 효과를 일으킬 가능성을 높이고(문헌[S. Bukofzer et al.,　Industry Perspective on the Medical Risk of Visible Particles in Injectable Drug Products, 69　PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology　123-139 (2015); S. E. Langille,　Particulate Matter in Injectable Drug Products, 67　PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology　186-200 (2013)]), 의약품에 상이한 영향을 미칠 수 있다. 단백질 입자 및 비-단백질 입자를 포함할 수 있는 제형에서 가시적 및 비-가시적 입자의 형성에 대한 몇 가지 원인이 있을 수 있다. 이러한 입자는 잠재적인 면역원성에 대한 우려를 증가시킬 수 있다. 미국 약전(United States Pharmacopeia: USP) 및 유럽 약전(European Pharmacopoeia: Ph. Eur.)은 현재 10㎛보다 큰 입자에 대해서만 비경구 용액의 농도 한계를 정의하고 있지만, 규제 당국은 개발 단계의 초기 단계에서 이미 1㎛ 내지 10㎛의 미크론 입자의 정량적 특성화 및 100㎚ 내지 1000㎚의 서브미크론 입자의 정성적 특성화를 점점 더 기대하고 있다(문헌[USP <788>. In: The United States Pharmacopoeia, National Formulary. 2009; Ph.Eur. 2.9.19]).

약물 제형에서 가시적 및 비-가시적 입자는 유리 지방산 함량 및 후속 지방산 입자 형성과 관련될 수 있다. 유리 지방산 및 관련 지방산 입자 형성은 폴리소르베이트를 포함하는 단백질 제형에서 발생할 수 있다. 시판되는 단일클론 항체 치료제의 70% 이상이 흡착 및 응집과 같은 계면 응력으로부터 단백질을 보호하기 위해 0.001% 내지 0.1%의 폴리소르베이트를 함유한다. 많은 폴리소르베이트 제제는 다양한 지방산 사슬의 혼합물을 함유하며; 예를 들어, 폴리소르베이트 80은 올레산, 팔미트산, 미리스트산 및 스테아르산 지방산을 함유하고, 모노올레이트 분획은 다분산 혼합물의 대략 58%를 구성한다(문헌[Nitin Dixit et al.,　Residual Host Cell Protein Promotes Polysorbate 20 Degradation in a Sulfatase Drug Product Leading to Free Fatty Acid Particles, 105　Journal of Pharmaceutical Sciences1657-1666 (2016)]). 폴리소르베이트는 pH-의존적 및 온도-의존적 방식으로 자가-산화(auto-oxidation)되기 쉬우며, 또한 UV 광선에 노출되면 또한 불안정성이 발생하여(문헌[Ravuri S.k. Kishore et al.,　Degradation of Polysorbates 20 and 80: Studies on Thermal Autoxidation and Hydrolysis, 100　Journal of Pharmaceutical Sciences　721-731 (2011)]), 소르비탄 헤드 그룹과 함께 용액에 유리 지방산을 생성한다. 따라서, 폴리소르베이트는 자가-산화 및 가수분해로 인해 입자 형성에 기여할 수 있으며, 이는 유리 지방산 및 후속 지방산 입자 형성을 초래한다. 포스포리페이스 B-유사 2(phospholipase B-like 2: PLBL2) 및 리포단백질 리페이스와 같은 다양한 숙주 세포 단백질에 의한 폴리소르베이트의 가수분해(문헌[Josephine Chiu et al.,　Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations, 114　Biotechnology and Bioengineering　1006-1015 (2016)])는 소정의 조건하에서 유리 지방산을 생성할 수 있다(문헌[Nitin Dixit et al.,　Residual Host Cell Protein Promotes Polysorbate 20 Degradation in a Sulfatase Drug Product Leading to Free Fatty Acid Particles, 105　Journal of Pharmaceutical Sciences1657-1666 (2016)]). 이러한 유리 지방산 및 유사하게는 장쇄 지방산(특히, 스테아레이트, 올레이트, 팔미테이트)은 낮은 용해도로 인해 PS20 침전물의 분해로 인해 발생하며(문헌[Nidhi Doshi,

Demeule & Sandeep Yadav,　Understanding Particle Formation: Solubility of Free Fatty Acids as Polysorbate 20 Degradation Byproducts in Therapeutic Monoclonal Antibody Formulations, 12　Molecular Pharmaceutics　3792-3804 (2015); Steven R. Labrenz,　Ester Hydrolysis of Polysorbate 80 in mAb Drug Product: Evidence in Support of the Hypothesized Risk After the Observation of Visible Particulate in mAb Formulations, 103　Journal of Pharmaceutical Sciences　2268-2277 (2014)]), 이는 현재의 모델에서 잠재적으로 약물에서 지방산 입자 형성을 유발할 수 있다.

몇몇 보고서는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 함유하는 의약품에서 가시적 및 비-가시적 입자의 존재에 대해 상세하게 기술하고 있다(문헌[Xiaolin Cao et al.,　Free Fatty Acid Particles in Protein Formulations, Part 1: Microspectroscopic Identification, 104　Journal of Pharmaceutical Sciences　433-446 (2015); Christine C. Siska et al.,　Free Fatty Acid Particles in Protein Formulations, Part 2: Contribution of Polysorbate Raw Material, 104　Journal of Pharmaceutical Sciences　447-456 (2015); Nidhi Doshi,

Demeule & Sandeep Yadav,　Understanding Particle Formation: Solubility of Free Fatty Acids as Polysorbate 20 Degradation Byproducts in Therapeutic Monoclonal Antibody Formulations, 12　Molecular Pharmaceutics　3792-3804 (2015); Nitin Dixit et al.,　Residual Host Cell Protein Promotes Polysorbate 20 Degradation in a Sulfatase Drug Product Leading to Free Fatty Acid Particles, 105　Journal of Pharmaceutical Sciences1657-1666 (2016); Anthony Tomlinson et al., Polysorbate 20 Degradation in Biopharmaceutical Formulations: Quantification of Free Fatty Acids, Characterization of Particulates, and Insights into the Degradation Mechanism, 12 Molecular Pharmaceutics 3805-3815 (2015); Troii Hall et al., Polysorbates 20 and 80 Degradation by Group XV Lysosomal Phospholipase A 2 Isomer X1 in Monoclonal Antibody Formulations, 105 Journal of Pharmaceutical Sciences 1633-1642 (2016)]). 입자는 분광법에 의해 특성화되고, 지방산(문헌[Nidhi Doshi,

Demeule & Sandeep Yadav,　Understanding Particle Formation: Solubility of Free Fatty Acids as Polysorbate 20 Degradation Byproducts in Therapeutic Monoclonal Antibody Formulations, 12　Molecular Pharmaceutics　3792-3804 (2015); Anthony Tomlinson et al., Polysorbate 20 Degradation in Biopharmaceutical Formulations: Quantification of Free Fatty Acids, Characterization of Particulates, and Insights into the Degradation Mechanism, 12 Molecular Pharmaceutics 3805-3815 (2015)]), 순수한 단백질(문헌[Xiaolin Cao et al.,　Free Fatty Acid Particles in Protein Formulations, Part 1: Microspectroscopic Identification, 104　Journal of Pharmaceutical Sciences　433-446 (2015)]) 또는 지방산과 단백질의 혼합물로 구성되는 것으로 나타났으며, 이는 폴리소르베이트 가수분해가 제형화된 의약품의 입자 출현에 직접적으로 기여할 수 있음을 시사한다. 숙주 세포 단백질, 특히 리페이스가 가능한 근본 원인으로 인용된다(문헌[Nitin Dixit et al.,　Residual Host Cell Protein Promotes Polysorbate 20 Degradation in a Sulfatase Drug Product Leading to Free Fatty Acid Particles, 105　Journal of Pharmaceutical Sciences1657-1666 (2016)]). 따라서, 잔류 숙주 세포 단백질에 대한 현재의 미국 약전(USP)하에서의 표준은 100ppm 미만이지만(문헌[Catalin Doneanu et al.,　Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry, 4　mAbs　24-44 (2012)]), 미량 수준의 숙주 세포 리페이스의 존재는 폴리소르베이트 가수분해를 유도하여 유리 장쇄 지방산의 방출을 초래할 수 있다. 또한, USP에 의해 제시된 입자 함량의 기준은 크기가 10μM를 초과하는 6000개 입자/용기 및 크기가 25μM를 초과하는 600개 입자/용기로 제한을 설정하며(USP 일반 챕터 788, 주사제 내 미립자 물질), 이는 숙주 세포 리페이스가 잠재적으로 저장 수명에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다([문헌[S. Bukofzer et al.,　Industry Perspective on the Medical Risk of Visible Particles in Injectable Drug Products, 69　PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology　123-139 (2015)]).

폴리소르베이트 제제의 전반적인 균질성뿐만 아니라 폴리소르베이트의 고유의 장기 안정성은 유리 지방산 함량과 관련된 문제를 발생시킬 수 있다. 지방산 입자를 함유하는 의약품의 안전성 및 효능이 완전히 평가되지는 않았지만, 품질 문제의 가능성을 피하는 것이 분명히 유리하다. 지방산 입자가 환자에게 면역원성 반응을 일으키는지 여부는 명확하지 않지만, 일반적으로 의약품의 미립자는 바람직하지 않은 것으로 간주된다.

지방산 입자의 형성을 완화하거나 또는 미리-형성된 입자를 신속하고 완전하게 가용화하는 공지된 방법의 부재하에, 효과적이고 효율적인 방법 및 제형이 본 명세서에 개시된 바와 같이 개발되었다. 지방산 입자를 신속하게 생성하기 위한 실험 시스템 및 바이오치료제 제형의 맥락에서 인간 혈청 알부민에 대한 신규한 용도가 또한 개시되어 있다.

달리 기재되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 이제 특정 방법 및 재료가 설명된다. 언급된 모든 간행물은 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.

용어 단수 형태는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하며; 용어 "약" 및 "대략"은 당업자에 의해 이해될 수 있는 표준 오차를 허용하는 것으로 이해되어야 하며; 범위가 제공되는 경우, 종점이 포함된다.

바이오 치료제에서 지방산 입자의 존재는 기업에서 규제 기관, 공급자 및 환자에 이르기까지의 업계 전반에 걸쳐 상당한 우려가 될 수 있기 때문에, 이러한 지방산-입자의 형성을 방지 및/또는 감소시키는 방법 및 이러한 지방산 입자의 수준이 감소될 수 있고/있거나 이러한 지방산 입자의 형성을 방지할 수 있는 제형이 의약품 개발에 중요하다.

일부 예시적인 실시형태에서, 본 개시내용은 활성 약제학적 작용제를 포함하는, 지방산 입자의 수준이 감소되고/되거나 이러한 지방산 입자의 형성을 방지할 수 있는 제형을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "제형"은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 비히클과 함께 제형화되는 활성 약제학적 작용제를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "활성 약제학적 작용제"는 의약품의 생물학적으로 활성인 성분을 포함할 수 있다. 활성 약제학적 작용제는 약리학적 활성을 제공하거나, 또는 그렇지 않으면 질환의 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방에 직접적인 영향을 미치거나, 또는 동물에서 생리학적 기능을 회복, 수정 또는 변경하는데 직접적인 영향을 미치도록 의도되는, 의약품에 사용되는 임의의 물질 또는 물질의 조합을 지칭할 수 있다. 활성 약제학적 작용제를 제조하기 위한 비제한적인 방법은 발효 공정, 재조합 DNA, 천연 자원으로부터의 단리 및 회수, 화학적 합성 또는 이들의 조합을 사용하는 것을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 활성 약제학적 작용제는 단백질일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질"은 공유적으로 연결된 아마이드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. 단백질은 당업계에서 일반적으로 "폴리펩타이드"로 알려진 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 포함한다. "폴리펩타이드"는 아미노산 잔기, 펩타이드 결합을 통해 연결된 관련된 자연 발생적인 구조적 변이체와 이의 합성 비-자연 발생적인 유사체, 관련된 자연 발생적인 구조적 변이체와 이의 합성 비-자연 발생적인 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. "합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드"는 비-자연 발생적인 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 예를 들어, 자동화된 폴리펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 고상 펩타이드 합성 방법이 당업계에 공지되어 있다. 단백질은 기능하는 단일 생체 분자를 형성하기 위해 하나 또는 여러 개의 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 단백질은 임의의 바이오-치료 단백질, 연구 또는 요법에 사용되는 재조합 단백질, 트랩 단백질 및 기타 키메라 수용체 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 인간 항체 및 이중특이성 항체를 포함할 수 있다. 다른 예시적인 양태에서, 단백질은 항체 단편, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 사이토카인, 케모카인, 펩타이드 호르몬 등을 포함할 수 있다. 단백질은 재조합 세포-기반 생산 시스템, 예컨대 곤충 배큘로바이러스 시스템, 효모 시스템(예를 들어, 피키아 종(Pichia sp.)), 포유동물 시스템(예를 들어, CHO 세포 및 CHO-K1 세포와 같은 CHO 파생물)을 사용하여 생산될 수 있다. 바이오치료제 단백질 및 이의 생산에 대한 최근의 검토는 문헌[Ghaderi et al., "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation," (Darius Ghaderi et al.,　Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation, 28　Biotechnology and Genetic Engineering Reviews147-176 (2012)] 참조. 일부 실시형태에서, 단백질은 변형, 부가물 및 기타 공유적으로 연결된 모이어티를 포함한다. 이러한 변형, 부가물 및 모이어티는 예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 글리칸(예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 뉴라민산, N-아세틸글루코사민, 푸코스, 만노스 및 기타 단당류), PEG, 폴리히스티딘, FLAGtag, 말토스 결합 단백질(maltose binding protein: MBP), 키틴 결합 단백질(chitin binding protein: CBP), 글루타티온-S-트랜스퍼레이스(glutathione-S-transferase: GST) myc-에피토프, 형광 표지 및 기타 염료 등을 포함한다. 단백질은 조성 및 용해도에 기초하여 분류될 수 있으므로, 단순 단백질, 예컨대 구상 단백질 및 섬유상 단백질; 접합 단백질, 예컨대 핵단백질, 당단백질, 점액단백질, 발색단백질, 인단백질, 금속단백질 및 리포단백질; 및 파생 단백질, 예컨대 1차 파생 단백질 및 2차 파생 단백질을 포함한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 단백질은 항체, 이중특이성 항체, 다중특이성 항체, 항체 단편, 단일클론 항체 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 면역글로불린 분자뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 HCVR 또는 V_H로도 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 LCVR 또는 V_L로도 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(C_L1)을 포함한다. V_H 및 V_L 영역은 프레임워크 영역(framework region: FR)이라고도 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)이라고 하는 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 본 발명의 상이한 실시형태에서, 항-big-ET-1 항체(또는 이의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식세포계열 서열과 동일할 수 있거나, 또는 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스 서열은 2개 이상의 CDR의 병렬 분석에 기초하여 정의될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 또한 완전한 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는, 임의의 자연 발생적, 효소적으로 수득 가능한, 합성 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 임의의 적합한 표준 기법, 예컨대 항체 가변 도메인 및 선택적으로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 단백질 가수분해성 소화 또는 재조합 유전 공학 기법을 사용하여 예를 들어, 완전한 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 또는, 예를 들어, 상업적인 공급원, DNA 라이브러리(예를 들어, 파지-항체 라이브러리를 포함)로부터 쉽게 입수 가능하거나 또는 합성될 수 있다. DNA는 시퀀싱되고, 예를 들어, 하나 이상의 가변 도메인 및/또는 불변 도메인을 적합한 배열로 배열하거나 또는 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 생성하고, 아미노산 등을 변형, 추가 또는 결실하기 위해 화학적으로 또는 분자 생물학 기법을 사용하여 조작될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체 단편"은 예를 들어, 항체의 항원-결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 부분을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 다이어바디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)뿐만 아니라 트라이어바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Fv 단편은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 조합이고, ScFv 단백질은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩타이드 링커에 의해 연결되는 재조합 단일 사슬 폴리펩타이드 분자이다. 일부 예시적인 실시형태에서, 항체 단편은 모 항체와 동일한 항원에 결합하는 단편인 모 항체의 충분한 아미노산 서열을 함유하고; 일부 예시적인 실시형태에서, 단편은 모 항체의 것과 유사한 친화도로 항원에 결합하고/하거나 항원에 대한 결합에 대해 모 항체와 경쟁한다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생성될 수 있고/있거나 부분 항체 서열을 암호화하는 유전자로부터 재조합적으로 생성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생성될 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 단일 사슬 항체 단편을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은 예를 들어, 이황화 연결에 의해 함께 연결된 다중 사슬을 포함할 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 다중-분자 복합체를 포함할 수 있다. 기능적 항체 단편은 전형적으로 적어도 약 50개의 아미노산을 포함하고, 보다 전형적으로 적어도 약 200개의 아미노산을 포함한다.

어구 "이중특이성 항체"는 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이성 항체는 일반적으로 2개의 상이한 중쇄를 포함하며, 각각의 중쇄는 구체적으로 상이한 에피토프 ― 2개의 상이한 분자(예를 들어, 항원) 또는 동일한 분자(예를 들어, 동일한 항원)에 결합한다. 이중특이성 항체가 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도는 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도보다 적어도 1배 내지 2배 또는 3배 내지 4배 더 낮을 것이며, 그 반대도 마찬가지이다. 이중특이성 항체에 의해 인식되는 에피토프는 동일하거나 또는 상이한 표적(예를 들어, 동일한 또는 상이한 단백질) 상에 있을 수 있다. 이중특이성 항체는 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄를 결합하여 만들 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 암호화하는 핵산 서열은 상이한 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다.

전형적인 이중특이성 항체는 각각의 3개의 중쇄 CDR을 갖는 2개의 중쇄, 이어서 C_H1 도메인, 힌지, C_H2 도메인 및 C_H3 도메인, 항원-결합 특이성을 부여하지 않지만 각각의 중쇄와 회합할 수 있거나 또는 각각의 중쇄와 회합할 수 있고 중쇄 항원-결합 영역에 결합된 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있거나 또는 각각의 중쇄와 회합될 수 있고 중쇄 중 하나 또는 두 개 모두가 하나 또는 두 개의 에피토프에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄를 갖는다. BsAb는 Fc 영역(IgG-유사)을 보유하는 것과 Fc 영역이 결여되어 있는 것의 두 가지 주요 클래스로 나뉠 수 있으며, 후자는 일반적으로 Fc를 포함하는 IgG 및 IgG-유사 이중특이성 분자보다 작다. IgG-유사 bsAb는 트라이오맙(triomab), 놉 인투 홀 IgG(knob into hole IgG: kih IgG), 크로스Mab(crossMab), 오소-Fab IgG(orth-Fab IgG), 이중-가변 도메인 Ig(Dual-variable domains Ig: DVD-Ig), 투-인-원 또는 이중 작용 Fab(dual action Fab: DAF), IgG-단일-쇄 Fv(IgG-single-chain Fv: IgG-scFv) 또는 κλ-바디와 같지만 이들로 제한되지 않는 상이한 형식을 가질 수 있다. 비-IgG-유사 상이한 형식은 탠덤 scFv, 다이어바디 형식, 단일-쇄 다이어바디, 탠덤 다이어바디(TandAb), 이중-친화성 표적변경 분자(Dual-affinity retargeting molecule: DART), DART-Fc, 나노바디 또는 독-앤드-락(dock-and-lock: DNL) 방법에 의해 생성된 항체를 포함한다(문헌[Gaowei Fan, Zujian Wang & Mingju Hao,　Bispecific antibodies and their applications, 8　Journal of Hematology & Oncology 130; Dafne Muller & Roland E. Kontermann,　Bispecific Antibodies,　Handbook of Therapeutic Antibodies265-310 (2014)]).

BsAb를 생산하는 방법은 2개의 상이한 하이브리도마 세포주의 체세포 융합, 화학적 가교-링커를 포함하는 화학적 접합 및 재조합 DNA 기술을 이용한 유전적 접근에 기반한 쿼드로마(quadroma) 기술에 제한되지 않는다. bsAb의 예는 하기의 특허 출원에 개시된 것들을 포함하며, 이들은 참조에 의해 본 명세서에 원용된다: 2010년 6월 25일자로 출원된 미국 출원 제12/823838호; 2012년 6월 5일자로 출원된 미국 출원 제13/488628호; 2013년 9월 19일자로 출원된 미국 출원 제14/031075호; 2015년 7월 24일자로 출원된 미국 출원 제14/808171호; 2017년 9월 22일자로 출원된 미국 출원 제15/713574호; 2017년 9월 22일자로 출원된 미국 출원 제15/713569호; 2016년 12월 21일자로 출원된 미국 출원 제15/386453호; 2016년 12월 21일자로 출원된 미국 출원 제15/386443호; 2016년 7월 29일자로 출원된 미국 출원 제15/22343호; 및 2017년 11월 15일자로 출원된 미국 특허 제15814095호. 낮은 수준의 동종이량체 불순물이 이중특이성 항체의 제조 동안 여러 단계에 존재할 수 있다. 이러한 동종이량체 불순물의 검출은 동종이량체 불순물의 양이 적고, 일반 액체 크로마토그래피 방법을 사용하여 수행될 때, 주요 종과 이러한 불순물의 동시-용리로 인해 온전한 질량 분석을 사용하여 수행할 때 어려울 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "다중특이성 항체" 또는 "Mab"는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 분자는 일반적으로 2개의 항원(즉, 이중특이성 항체, BsAb)에만 결합할 것이지만, 삼중특이성 항체 및 KIH 삼중특이성과 같은 추가적인 특이성을 갖는 항체도 또한 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법에 의해 처리될 수도 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산되는 항체에 제한되지 않는다. 단일클론 항체는 당업계에서 이용 가능하거나 또는 공지된 임의의 수단에 의해 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용에 유용한 단일클론 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술 또는 이들의 조합의 사용을 포함하여 당업계에 공지된 매우 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 활성 약제학적 작용제를 포함할 수 있되, 활성 약제학적 작용제는 소분자일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "소분자"는 1500kDa 미만의 분자량을 갖는 저분자 화학물을 지칭할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 단백질 제형일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질 제형"은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 비히클과 함께 제형화될 수 있는 치료적 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료적 단백질은 치료적 양생법에서 투여하기에 적절한 단위 투여량으로 존재할 수 있다.

일부 다른 실시형태에서, 제형은 완충제, 증량제, 등장성 개질제, 계면활성제, 가용화제 및 보존제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 부형제를 더 포함할 수 있다. 다른 추가적인 부형제는 또한 기능에 기초하여 선택될 수 있으며, 제형과의 상용성은 예를 들어, 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, (Easton, Pa.: Mack Publishing Co 1975); Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms (New York, N.Y.: Marcel Decker 1980); 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed (Lippincott Williams & Wilkins 1999)]에서 찾을 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 안정할 수 있다.

제형의 안정성은 활성 약제학적 작용제의 화학적 안정성, 물리적 안정성 또는 기능적 안정성을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 제형은 전형적으로 활성 약제학적 작용제의 높은 수준의 안정성을 나타낸다.

단백질 제형의 측면에서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "안정한"은 제형 내의 단백질이 본 명세서에 정의된 예시적인 조건하에서 보관 후 허용되는 정도의 화학적 구조 또는 생물학적 기능을 유지할 수 있음을 지칭한다. 제형은 그 안에 포함된 단백질이 정의된 시간 동안 보관 후 화학적 구조 또는 생물학적 기능을 100% 유지하지 못하더라도 안정할 수 있다. 소정의 상황에서, 정의된 시간 동안 보관 후 단백질의 구조 또는 기능의 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 유지는 "안정한" 것으로 간주될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선을 위해 사용될 수 있다. 예시적인, 본 발명의 약제학적 제형의 투여에 의해 치료 및/또는 예방될 수 있는 비제한적인 질환 및 장애는 감염; 호흡기 질환; 신경성 통증(neurogenic pain), 신경병성 통증(neuropathic pain) 또는 침해성 통증(nociceptic pain)과 관련된 임의의 병태로 인한 통증; 유전적 장애; 선천성 장애; 암; 포진(herpetiformis); 만성 특발성 두드러기(chronic idiopathic urticarial); 경피증(scleroderma), 비후성 흉터(hypertrophic scarring); 휘플병(Whipple's Disease); 양성 전립선 비대증(benign prostate hyperplasia); 경증, 중등도 또는 중증 천식(asthma), 알레르기 반응과 같은 폐 장애; 가와사키병(Kawasaki disease), 겸상적혈구병(sickle cell disease); 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome); 그레이브스병(Grave's disease); 전자간증(pre-eclampsia); 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome); 자가면역 림프증식성 증후군(autoimmune lymphoproliferative syndrome); 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia); 바렛 식도(Barrett's esophagus); 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis); 결핵(tuberculosis); 신증(nephrosis); 만성 류마티스성 관절염(chronic rheumatoid arthritis)을 포함하는 관절염; 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)을 포함하는 염증성 장질환(inflammatory bowel disease); 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus); 염증성 질환; HIV 감염; AIDS; LDL 성분채집(LDL apheresis); PCSK9-활성화 돌연변이(기능 돌연변이의 획득(gain of function mutation), "GOF")로 인한 장애, 이형접합 가족성 고콜레스테롤혈증(heterozygous Familial Hypercholesterolemia: heFH)으로 인한 장애; 원발성 고콜레스테롤혈증(primary hypercholesterolemia); 이상지질혈증(dyslipidemia); 담즙정체 간 질환(cholestatic liver disease); 신증후군(nephrotic syndrome); 갑상선 기능 저하증(hypothyroidism); 비만(obesity); 죽상 동맥 경화증(atherosclerosis); 심혈관 질환(cardiovascular disease); 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease); 신생아 발병 다기관 염증성(neonatal Onset Multisystem Inflammatory Disorder: NOM ID/CINCA); 머클-웰스 증후군(Muckle-Wells Syndrome: MWS); 가족성 감기 자가염증성 증후군(Familial Cold Autoinflammatory Syndrome: FCAS); 가족성 지중해열(familial mediterranean fever: FMF); 종양 괴사 인자 수용체-관련 주기적 발열 증후군(tumor necrosis factor receptor-associated periodic fever syndrome: TRAPS); 전신성 발병 청소년 특발성 관절염(systemic onset juvenile idiopathic arthritis)(스틸병(Still's Disease)); 1형 당뇨병(diabetes mellitus type 1) 및 2형 당뇨병(diabetes mellitus type 2); 자가면역 질환(auto-immune disease); 운동 신경 질환(motor neuron disease); 안질환(eye disease); 성병(sexually transmitted disease); 결핵(tuberculosis); VEGF 길항제에 의해 개선, 저해 또는 감소되는 질환 또는 병태; PD-1 저해제에 의해 개선, 저해 또는 감소되는 질환 또는 병태; 인터류킨 항체에 의해 개선, 저해 또는 감소되는 질환 또는 병태; NGF 항체에 의해 개선, 저해 또는 감소되는 질환 또는 병태; PCSK9 항체에 의해 개선, 저해 또는 감소되는 질환 또는 병태; ANGPTL 항체에 의해 개선, 저해 또는 감소되는 질환 또는 병태; 액티빈 항체에 의해 개선, 저해 또는 감소되는 질환 또는 병태; GDF 항체에 의해 개선, 저해 또는 감소되는 질환 또는 병태; Fel d 1 항체에 의해 개선, 저해 또는 감소되는 질환 또는 병태; CD 항체에 의해 개선, 저해 또는 감소되는 질환 또는 병태; C5 항체에 의해 개선, 저해 또는 감소되는 질환 또는 병태 또는 이들의 조합을 포함한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 임의의 경로를 통할 수 있다. 투여의 비제한적인 경로는 경구, 국부 또는 비경구를 포함한다. 소정의 비경구 경로를 통한 투여는 멸균 주사기 또는 연속 주입 시스템과 같은 일부 다른 기계적 장치에 의해 추진되는 바늘 또는 카테터를 통해 본 발명의 제형을 환자의 신체에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 제형은 주사기, 주입기, 펌프 또는 비경구 투여를 위해 당업계에서 인정되는 임의의 다른 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 제형은 또한 폐 또는 비강에서의 흡수를 위한 에어로졸로서 투여될 수 있다. 제형은 또한　협측 투여에서와 같이 점막을 통한 흡수를 위해 투여될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 인간 혈청 알부민은 지방산 입자의 형성을 방지할 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 인간 혈청 알부민은 미리-형성된 지방산 입자를 가용화할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인간 혈청 알부민" 또는 "HSA"는 간에서 합성된 단량체성 단백질을 포함할 수 있다. 이는 농도가 최대 50 g/ℓ인 혈청의 주요 거대분자 구성 성분일 수 있으며, 혈관내 및 혈관외 공간 사이에서 일정하게 흐른다(문헌[Angelica M. Merlot, Danuta S. Kalinowski & Des R. Richardson,　Unraveling the mysteries of serum

more than just a serum protein, 5　Frontiers in Physiology　(2014)]). 다양한 생물학적 활성 중에서, HSA는 지방산을 포함하여 저용해성 분자를 전신으로 수송할 수 있다(문헌[Maja Thim Larsen et al.,　Albumin-based drug delivery: harnessing nature to cure disease, 4　Molecular and Cellular Therapies　(2016)]). HSA는 3개의 높은 친화성 부위, 1개의 중간 친화성 부위 및 5개의 낮은 친화성 부위인 9개의 별개의 지방산 결합 부위를 함유할 수 있다(문헌[Eileen S. Krenzel, Zhongjing Chen & James A. Hamilton,　Correction to Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study, 52　Biochemistry　2382-2382 (2013)]).

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 폴리소르베이트를 더 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "폴리소르베이트"는 교반, 동결-해동 공정 및 공기/물 계면과 같은 다양한 물리적 스트레스에 대해 항체를 보호하기 위해 제형 개발에 사용되는 일반적인 부형제를 지칭한다(문헌[Emily Ha, Wei Wang & Y. John Wang,　Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability, 91　Journal of Pharmaceutical Sciences　2252-2264 (2002); Bruce A. Kerwin,　Polysorbates 20 and 80 Used in the Formulation of Protein Biotherapeutics: Structure and Degradation Pathways, 97　Journal of Pharmaceutical Sciences　2924-2935 (2008); Hanns-Christian Mahler et al., Adsorption Behavior of a Surfactant and a Monoclonal Antibody to Sterilizing-Grade Filters, 99 Journal of Pharmaceutical Sciences 2620-2627 (2010)]). 폴리소르베이트는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 헤드 그룹 및 포화 모노라우레이트 측쇄(폴리소르베이트 20; PS20) 또는 불포화 모노올레이트 측쇄(폴리소르베이트 80; PS80)와 같은 폴리옥시에틸렌-소르비탄의 지방산 에스터로 구성된 비-이온성의, 양친매성 계면활성제를 포함할 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 폴리소르베이트는 0.001% 내지 1%(중량/부피) 범위로 제형에 존재할 수 있다. 폴리소르베이트는 또한 다양한 지방산 사슬의 혼합물을 함유할 수 있으며; 예를 들어, 폴리소르베이트 80은 올레산, 팔미트산, 미리스트산 및 스테아르산 지방산을 함유하며, 모노올레이트 분획은 다분산 혼합물의 대략 58%를 구성한다(문헌[Nitin Dixit et al.,　Residual Host Cell Protein Promotes Polysorbate 20 Degradation in a Sulfatase Drug Product Leading to Free Fatty Acid Particles, 105　Journal of Pharmaceutical Sciences1657-1666 (2016)]). 폴리소르베이트의 비제한적인 예는 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-65 및 폴리소르베이트-80을 포함한다.

폴리소르베이트는 pH-의존적 및 온도-의존적 방식으로 자가-산화되기 쉬울 수 있으며, 추가적으로, UV 광선에 대한 노출은 또한 불안정성을 유발하여(문헌[Ravuri S.k. Kishore et al.,　Degradation of Polysorbates 20 and 80: Studies on Thermal Autoxidation and Hydrolysis, 100　Journal of Pharmaceutical Sciences　721-731 (2011)]), 소르비탄 헤드 그룹과 함께 용액에서 유리 지방산을 생성할 수 있다. 폴리소르베이트로부터 생성된 유리 지방산은 6개 내지 20개의 탄소를 갖는 임의의 지방족 지방산을 포함할 수 있다. 유리 지방산의 비제한적인 예는 올레산, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산 또는 이들의 조합물을 포함한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 지방산 입자는 크기가 적어도 5㎛일 수 있다. 또한, 이러한 지방산 입자는 크기에 따라 가시적(100㎛ 초과), 비-가시적(100㎛ 미만, 이는 미크론(1㎛ 내지 100㎛) 및 서브미크론(100㎚ 내지 1000㎚)으로 세분화될 수 있음) 및 나노미터 입자(100㎚ 미만)로 분류될 수 있다(문헌[Linda Narhi, Jeremy Schmit & Deepak Sharma,　Classification of protein aggregates, 101　Journal of Pharmaceutical Sciences　493-498]).

일부 예시적인 실시형태에서, 지방산 입자는 가시적 입자일 수 있다. 가시적 입자는 육안 검사에 의해 결정될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 지방산 입자는 비-가시적 입자일 수 있다. 비가시적 입자는 미국 약전(USP)에 따른 차광법에 의해 모니터링될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 지방산 입자는 폴리소르베이트로부터 형성될 수 있다. 일부 특정 예시적인 실시형태에서, 지방산 입자는 리페이스 효소의 존재하에 폴리소르베이트로부터 형성될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "리페이스"는 지방의 가수분해를 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 리페이스는 동물에서 식물 내지 미생물에 이르기까지 본질적으로 모든 형태의 생명체에서 발견될 수 있다. 포유동물 리페이스 슈퍼패밀리는 위치 및 기질 특이성에 의해 차별화된 7개의 상이한 클래스로 구성될 수 있다. CHO-K1 mRNA의 분석은 변이체를 포함하여 137개의 리페이스 및 포스포리페이스를 발견하였다(문헌[Benjamin G. Kremkow et al.,　CHOgenome.org 2.0: Genome resources and website updates, 10　Biotechnology Journal　931-938 (2015)]). 정제된 바이오치료제 의약품에서 폴리소르베이트 분해를 특별히 담당하는 리페이스는 확인되지 않았고, 몇 가지가 발견될 가능성이 있으며 이는 제조 공정과 바이오치료제 자체의 영향을 암시한다. 여러 상이한 리페이스가 상업적인 공급원으로부터 입수할 수 있는 포유동물, 진균 및 세균 기원으로부터 스크리닝될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 지방산 입자는 라만 분광법에 의해 검출될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "라만 분광법"은 라만 산란 방법에 기초한 분광법을 지칭한다. 라만 분광법은 핑거프린트 영역(2000 cm^-1 내지 400 cm^-1)에서 밴드의 존재 및 위치를 확인할 수 있어, 라만 스펙트럼 데이터베이스와 비교하여 분석된 물질의 화학적 식별을 가능하게 하는 라만 스펙트럼을 제공할 수 있다(문헌[C. V. Raman & K. S. Krishnan,　A New Type of Secondary Radiation, 121　Nature　501-502 (1928); Zai-Qing Wen,　Raman spectroscopy of protein pharmaceuticals, 96　Journal of Pharmaceutical Sciences　2861-2878 (2007)]).

예시적인 실시형태

본 명세서에 개시된 실시형태는 샘플에서 단백질의 신속한 특성화를 위한 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하다(include)", "포함하다(includes)" 및 "포함하는(including)"은 비제한적인 의미를 가지며, 각각 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"을 의미하는 것으로 이해된다.

일부 예시적인 실시형태에서, 본 개시내용은 유효량의 인간 혈청 알부민을 제형에 첨가하는 단계를 포함하는, 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법을 제공한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 본 개시내용은 유효량의 인간 혈청 알부민을 제형에 첨가하는 단계를 포함하는, 제형에서 지방산 입자를 가용화하는 방법을 제공한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 활성 약제학적 작용제 및 (ii) 인간 혈청 알부민을 포함하는 제형을 제공한다.

일부 특정 예시적인 실시형태에서, 활성 약제학적 성분은 소분자일 수 있다. 일부 다른 특정 예시적인 실시형태에서, 활성 약제학적 성분은 단백질일 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 활성 약제학적 성분은 치료적 단백질일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 항체를 포함할 수 있다. 일부 특정 예시적인 실시형태에서, 제형은 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편, 이중특이성 항체, 다중특이성 항체 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 적어도 하나의 활성 약제학적 작용제를 포함할 수 있다. 일부 특정 예시적인 실시형태에서, 제형은 2개의 활성 약제학적 작용제를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 질환 또는 장애의 예방에 사용될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 환자에게 투여될 수 있다.

일부 특정 예시적인 실시형태에서, 제형은 환자에게 경구로 투여될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 비경구 경로를 통해 환자에게 투여될 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 제형은 정맥내 경로를 통해 환자에게 투여될 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 제형은 피하 경로를 통해 환자에게 투여될 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 제형은 근육내 경로를 통해 환자에게 투여될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 액체 제형일 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 제형에서 활성 약제학적 작용제의 양은 약 0.01 ㎎/㎖ 내지 약 600 ㎎/㎖의 범위일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 제형에서 활성 약제학적 작용제의 양은 약 0.01 ㎎/㎖, 약 0.02 ㎎/㎖, 약 0.03 ㎎/㎖, 약 0.04 ㎎/㎖, 약 0.05 ㎎/㎖, 약 0.06 ㎎/㎖, 약 0.07 ㎎/㎖, 약 0.08 ㎎/㎖, 약 0.09 ㎎/㎖, 약 0.1 ㎎/㎖, 약 0.2 ㎎/㎖, 약 0.3 ㎎/㎖, 약 0.4 ㎎/㎖, 약 0.5 ㎎/㎖, 약 0.6 ㎎/㎖, 약 0.7 ㎎/㎖, 약 0.8 ㎎/㎖, 약 0.9 ㎎/㎖, 약 1 ㎎/㎖, 약 2 ㎎/㎖, 약 3 ㎎/㎖, 약 4 ㎎/㎖, 약 5 ㎎/㎖, 약 6 ㎎/㎖, 약 7 ㎎/㎖, 약 8 ㎎/㎖, 약 9 ㎎/㎖, 약 10 ㎎/㎖, 약 15 ㎎/㎖, 약 20 ㎎/㎖, 약 25 ㎎/㎖, 약 30 ㎎/㎖, 약 35 ㎎/㎖, 약 40 ㎎/㎖, 약 45 ㎎/㎖, 약 50 ㎎/㎖, 약 55 ㎎/㎖, 약 60 ㎎/㎖, 약 65 ㎎/㎖, 약 70 ㎎/㎖, 약 5 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖, 약 85 ㎎/㎖, 약 90 ㎎/㎖, 약 100 ㎎/㎖, 약 110 ㎎/㎖, 약 120 ㎎/㎖, 약 130 ㎎/㎖, 약 140 ㎎/㎖, 약 150 ㎎/㎖, 약 160 ㎎/㎖, 약 170 ㎎/㎖, 약 180 ㎎/㎖, 약 190 ㎎/㎖, 약 200 ㎎/㎖, 약 225 ㎎/㎖, 약 250 ㎎/㎖, 약 275 ㎎/㎖, 약 300 ㎎/㎖, 약 325 ㎎/㎖, 약 350 ㎎/㎖, 약 375 ㎎/㎖, 약 400 ㎎/㎖, 약 425 ㎎/㎖, 약 450 ㎎/㎖, 약 475 ㎎/㎖, 약 500 ㎎/㎖, 약 525 ㎎/㎖, 약 550 ㎎/㎖, 약 575 ㎎/㎖ 또는 약 600 ㎎/㎖일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 지방산 입자를 형성할 수 있다. 일부 특정 예시적인 실시형태에서, 지방산 입자는 유리 지방산을 포함할 수 있다. 일부 다른 특정 예시적인 실시형태에서, 유리 지방산의 분자 대 인간 혈청 알부민의 분자의 비는 약 6:1 내지 약 1:1이다. 일부 특정 예시적인 실시형태에서, 유리 지방산의 분자 대 인간 혈청 알부민의 분자의 비는 약 0.5:1, 약 0.6:1, 약 0.7:1, 약 0.8:2, 약 0.9:1, 약 1:1, 약 2:1, 약 2:1, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1 또는 약 10:1이다. 일부 특정 예시적인 실시형태에서, 지방산 입자는 올레산을 포함할 수 있다.

일부 특정 예시적인 실시형태에서, 지방산 입자는 포화된 직쇄 지방족 산을 포함할 수 있다. 일부 다른 특정 예시적인 실시형태에서, 지방산 입자는 최대 20개의 탄소 원자를 갖는 포화된 직쇄 지방족 산을 포함할 수 있다. 일부 다른 특정 예시적인 실시형태에서, 유리 지방산은 에탄산, 프로판산, 뷰탄산, 펜탄산, 헥산산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산, 트라이데칸산, 테트라데칸산, 펜타데칸산, 헥사데칸산, 헵타데칸산, 옥타데칸산, 노나데칸산, 에이코산산 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 적어도 하나의 지방산을 포함할 수 있다.

일부 특정 예시적인 실시형태에서, 지방산 입자는 불포화된 직쇄 지방족 산을 포함할 수 있다. 일부 특정 예시적인 실시형태에서, 지방산 입자는 최대 20개의 탄소 원자를 갖는 불포화된 직쇄 지방족 산을 포함할 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 유리 지방산 입자는 스테아리돈산, 리놀레라이드산, 팔미톨레산, 박센산, 파울린산, 엘라드산, 곤도산, 올레산, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산, 아라키드산, 팔미톨레산, 리놀레산, 아라키돈산 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형에서 인간 혈청 알부민의 농도는 적어도 약 2.5 ㎎/㎖일 수 있다. 일부 특정 예시적인 실시형태에서, 제형에서 인간 혈청 알부민의 농도는 적어도 약 2.5 ㎎/㎖, 적어도 약 2.6 ㎎/㎖, 적어도 약 2.7 ㎎/㎖, 적어도 약 2.8 ㎎/㎖, 적어도 약 2.9 ㎎/㎖, 적어도 약 3.0 ㎎/㎖, 적어도 약 3.1 ㎎/㎖, 적어도 약 3.2 ㎎/㎖, 적어도 약 3.3 ㎎/㎖, 적어도 약 3.4 ㎎/㎖, 적어도 약 3.5 ㎎/㎖, 3.6 ㎎/㎖, 적어도 약 3.7 ㎎/㎖, 적어도 약 3.8 ㎎/㎖, 적어도 약 3.9 ㎎/㎖, 적어도 약 4.0 ㎎/㎖, 적어도 약 4.1 ㎎/㎖, 적어도 약 4.2 ㎎/㎖, 적어도 약 4.3 ㎎/㎖, 적어도 약 4.4 ㎎/㎖, 적어도 약 4.5 ㎎/㎖, 4.6 ㎎/㎖, 적어도 약 4.7 ㎎/㎖, 적어도 약 4.8 ㎎/㎖, 적어도 약 4.9 ㎎/㎖, 적어도 약 5.0 ㎎/㎖, 적어도 약 5.1 ㎎/㎖, 적어도 약 5.2 ㎎/㎖, 적어도 약 5.3 ㎎/㎖, 적어도 약 5.4 ㎎/㎖, 적어도 약 5.5 ㎎/㎖, 5.6 ㎎/㎖, 적어도 약 5.7 ㎎/㎖, 적어도 약 5.8 ㎎/㎖, 적어도 약 5.9 ㎎/㎖, 적어도 약 6.0 ㎎/㎖, 적어도 약 6.1 ㎎/㎖, 적어도 약 6.2 ㎎/㎖, 적어도 약 6.3 ㎎/㎖, 적어도 약 6.4 ㎎/㎖, 적어도 약 6.5 ㎎/㎖, 6.6 ㎎/㎖, 적어도 약 6.7 ㎎/㎖, 적어도 약 6.8 ㎎/㎖, 적어도 약 6.9 ㎎/㎖, 적어도 약 7.0 ㎎/㎖, 적어도 약 7.1 ㎎/㎖, 적어도 약 7.2 ㎎/㎖, 적어도 약 7.3 ㎎/㎖, 적어도 약 7.4 ㎎/㎖ 또는 적어도 약 7.5 ㎎/㎖일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형 내 인간 혈청 알부민은 제형에서 지방산 입자의 형성을 감소시킬 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형 내 인간 혈청 알부민은 제형에서 지방산 입자를 가용화할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형 내 인간 혈청 알부민은 폴리소르베이트 분해에 의해 생성된 유리 지방산을 결합하고 격리하여, 용액의 유효 농도를 임계 미셀 농도 미만의 수준으로 낮출 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형 내 인간 혈청 알부민은 지방산 싱크(sink)로 작용할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형 내 인간 혈청 알부민은 가시적/비-가시적 지방산 입자의 출현을 제거할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형 내 인간 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민이 없는 제형보다 제형의 저장 수명을 연장할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 폴리소르베이트를 더 포함할 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80 및 이들의 조합물로부터 선택될 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 제형 내 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001%w/v 내지 약 1% w/v일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001%w/v, 약 0.002%w/v, 약 0.003%w/v, 약 0.004%w/v, 약 0.005%w/v, 약 0.006%w/v, 약 0.007%w/v, 약 0.008%w/v, 약 0.009%w/v, 약 0.01%w/v, 약 0.011%w/v, 약 0.012%w/v, 약 0.013%w/v, 약 0.014%w/v, 약 0.015%w/v, 약 0.016%w/v, 약 0.017%w/v, 약 0.018%w/v, 약 0.019%w/v, 약 0.02%w/v, 약 0.021%w/v, 약 0.022%w/v, 약 0.023%w/v, 약 0.024%w/v, 약 0.025%w/v, 약 0.026%w/v, 약 0.027%w/v, 약 0.028%w/v, 약 0.029%w/v, 약 0.03%w/v, 약 0.031%w/v, 약 0.031%w/v, 약 0.032%w/v, 약 0.033%w/v, 약 0.034%w/v, 약 0.035%w/v, 약 0.036%w/v, 약 0.037%w/v, 약 0.038%w/v, 약 0.039%w/v, 약 0.04%w/v, 약 0.041%w/v, 약 0.042%w/v, 약 0.043%w/v, 약 0.044%w/v, 약 0.045%w/v, 약 0.046%w/v, 약 0.047%w/v, 약 0.048%w/v, 약 0.049%w/v, 약 0.05%w/v, 약 0.051%w/v, 약 0.052%w/v, 약 0.053%w/v, 약 0.054%w/v, 약 0.055%w/v, 약 0.056%w/v, 약 0.057%w/v, 약 0.058%w/v, 약 0.059%w/v, 약 0.06%w/v, 약 0.061%w/v, 약 0.062%w/v, 약 0.063%w/v, 약 0.064%w/v, 약 0.065%w/v, 약 0.066%w/v, 약 0.067%w/v, 약 0.068%w/v, 약 0.069%w/v, 약 0.07%w/v, 약 0.071%w/v, 약 0.072%w/v, 약 0.073%w/v, 약 0.074%w/v, 약 0.075%w/v, 약 0.076%w/v, 약 0.077%w/v, 약 0.078%w/v, 약 0.079%w/v, 약 0.08%w/v, 약 0.081%w/v, 약 0.082%w/v, 약 0.083%w/v, 약 0.084%w/v, 약 0.085%w/v, 약 0.086%w/v, 약 0.087%w/v, 약 0.088%w/v, 약 0.089%w/v, 약 0.09%w/v, 약 0.091%w/v, 약 0.092%w/v, 약 0.093%w/v, 약 0.094%w/v, 약 0.095%w/v, 약 0.096%w/v, 약 0.097%w/v, 약 0.098%w/v, 약 0.099%w/v, 약 0.1%w/v, 약 0.11%w/v, 약 0.12%w/v, 약 0.13%w/v, 약 0.14%w/v, 약 0.15%w/v, 약 0.16%w/v, 약 0.17%w/v, 약 0.18%w/v, 약 0.19%w/v, 약 0.2%w/v, 약 0.21%w/v, 약 0.22%w/v, 약 0.23%w/v, 약 0.24%w/v, 약 0.25%w/v, 약 0.26%w/v, 약 0.27%w/v, 약 0.28%w/v, 약 0.29%w/v, 약 0.3%w/v, 약 0.31%w/v, 약 0. 4%w/v, 약 0.41%w/v, 약 0.42%w/v, 약 0.43%w/v, 약 0.44%w/v, 약 0.45%w/v, 약 0.46%w/v, 약 0.47%w/v, 약 0.48%w/v, 약 0.49%w/v, 약 0.5%w/v, 약 0.51%w/v, 약 0.52%w/v, 약 0.53%w/v, 약 0.54%w/v, 약 0.55%w/v, 약 0.56%w/v, 약 0.57%w/v, 약 0.58%w/v, 약 0.59%w/v, 약 0.6%w/v, 약 0.61%w/v, 약 0.62%w/v, 약 0.63%w/v, 약 0.64%w/v, 약 0.65%w/v, 약 0.66%w/v, 약 0.67%w/v, 약 0.68%w/v, 약 0.69%w/v, 약 0.7%w/v, 약 0.71%w/v, 약 0.72%w/v, 약 0.73%w/v, 약 0.74%w/v, 약 0.75%w/v, 약 0.76%w/v, 약 0.77%w/v, 약 0.78%w/v, 약 0.79%w/v, 약 0.8%w/v, 약 0.81%w/v, 약 0.82%w/v, 약 0.83%w/v, 약 0.84%w/v, 약 0.85%w/v, 약 0.86%w/v, 약 0.87%w/v, 약 0.88%w/v, 약 0.89%w/v, 약 0.9%w/v, 약 0.91%w/v, 약 0.92%w/v, 약 0.93%w/v, 약 0.94%w/v, 약 0.95%w/v, 약 0.96%w/v, 약 0.97%w/v, 약 0.98%w/v, 약 0.99%w/v 또는 약 1%w/v일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 리페이스 효소를 더 포함할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 제형은 폴리소르베이트 및 리페이스 효소를 더 포함할 수 있되, 리페이스 효소는 폴리소르베이트를 가수분해하여 지방산 입자를 형성할 수 있다.

특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 등록 번호, 기술 기사 및 학술 기사를 포함하는 다양한 간행물이 명세서 전체에 인용된다. 이러한 인용된 참고 문헌 각각은 그 전문이 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

재료 및 시약 준비. 모든 반응은 달리 나타내지 않는 한 25mM Tris(pH 7.5), 100mM KCl, 20mM CaCl₂(TKC 완충액)을 함유하는 수성 완충 용액 중에서 수행하였다. 크로모박테리움 비스코숨 리페이스는 EMD 밀리포어(EMD Millipore, 매사추세츠주 빌레리카 소재)에서 구입하였고; 동결건조된 지방산이 없는 인간 혈청 알부민(fatty acid free Human Serum Albumin: FAF-HSA) 및 인간 혈청은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트루이스 소재)에서 구입하였다. 초정제(super refined) 폴리소르베이트 20(PS20) 및 폴리소르베이트 80(PS80)은 크로다(Croda, 뉴저지주 에디슨 소재)에서 입수하였다. IgG를 사용한 실험을 위해, 시그마-알드리치(미주리주 세인트루이스 소재)에서 구입한 인간 동결건조된 다중클론 IgG를 제조업체의 권장사항에 따라 150mM NaCl 및 35mM Tris(pH 8.0)으로 재구성하고, 25mM Tris, 100mM KCl(pH 7.5)로 평형화된 Zeba 스핀 탈염 칼럼(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에서 탈염하였다.

시약의 정제. 동결건조된 C. 비스코숨 리페이스를 대략 1mℓ의 TKC 반응 완충액에 재구성하고, 동일한 완충액으로 평형화된 Superdex 증가 200 10/300 SEC 칼럼을 통해 정제하였다. 정제된 리페이스 분획을 풀링하고, 0.95의 흡광 계수를 사용하여 UV_λ=280㎚에서 Nanodrop One C 분광광도계로 단백질 농도(4.2 ㎎/㎖)를 결정하였다. 분취량을 -20℃에서 10%(v/v) 글리세롤에 보관하였다. 0.531의 흡광 계수를 사용하여 UV_λ=280㎚에서 Nanodrop OneC로 FAF-HSA 농도를 결정하였다.

탁도 측정에 의한 입자 검출. 플레이트-기반 검정을 사용하여, 시간 경과에 따라(전형적으로, 2시간 내지 4시간) 450㎚에서의 흡광도를 모니터링하여 입자의 존재를 검출하였다. 검정은 광 산란의 기본 원리(탁도의 평가)에 기초하여, 대략 20㎚보다 큰 입자를 검출한다. 정제된 리페이스를 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는 TKC 완충액에 0.4 ㎍/㎖ 내지 5 ㎍/㎖ 범위의 최종 농도로 첨가하였다. 25℃로 유지된 스펙트럼 Max 340 플레이트 판독기에서 간헐적으로 진탕하면서 5분 간격으로 흡광도를 측정하였다. 리페이스를 첨가하지 않은 0.1% 폴리소르베이트 80의 흡광도를 측정하여 기준선 값을 설정하였다. 기기 제어, 데이터 수집 및 분석은 SoftMax Pro 소프트웨어(버전 6.5)를 사용하여 수행하였다.

상업적인 공급원으로부터 유래하는 포유동물, 진균 및 세균으로부터의 여러 상이한 리페이스를 스크리닝하였다. 세균 리페이스의 선별은 주로 빠른 폴리소르베이트 가수분해 및 후속 입자 형성을 기반으로 하였으며, 이는 바이오치료제 의약품 환경에서 수 개월 내지 수년이 걸릴 수 있는 입자 형성을 제어하기 위한 조건을 확인하는데 뚜렷한 이점을 제공한다. 추가적으로, 세균 리페이스는 입자 형성에 강하게 영향을 미치는 광범위한 용액 조건에 적용할 수 있었다. 특히, 산성 헤드 그룹의 정전기적 반발을 중화하는데 도움이 되는 포타슘의 존재는 필수적이다.

실시예 1. 입자 형성에 있어서 크로모박테리움 비스코숨 리페이스에 의한 폴리소르베이트 80의 가수분해.

PS80을 함유하는 용액에서 입자의 형성은 리페이스에 의한 가수분해로 인해 발생할 수 있다(문헌[Nitin Dixit et al.,　Residual Host Cell Protein Promotes Polysorbate 20 Degradation in a Sulfatase Drug Product Leading to Free Fatty Acid Particles, 105　Journal of Pharmaceutical Sciences1657-1666 (2016)]).

입자 형성은 다단계 과정이다: 첫째, 리페이스는 지방산 에스터 결합에서 PS80의 가수분해를 촉매하여 소르비탄 고리와 지방산 사슬을 방출하고; 둘째, 여러 개의 유리 지방산이 모여 입자를 형성한다. 크로모박테리움 비스코숨 리페이스의 활성을 테스트하기 위해, 0.1% PS80을 0.4 ㎍/㎖ 내지 5 ㎍/㎖의 다양한 농도의 리페이스와 함께 인큐베이션하고, 여러 시간에 걸쳐 450㎚에서의 흡광도를 모니터링하였다.

용액에서 입자의 존재를 검출하기 위해, 흡광도 분광법으로 샘플 탁도를 모니터링하였다. 샘플을 25℃에서 인큐베이션하고, 120분 동안 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 0㎍ 내지 1㎍의 상이한 농도의 리페이스를 사용하였다. 리페이스를 함유하지 않은 샘플을 대조군으로 사용하였다.

450㎚에서 신호의 증가는 입자 형성에 기인한 용액 탁도의 증가를 나타낸다. 도 1은 리페이스 농도가 증가하면 최종 탁도가 증가하며 용량-의존적 반응의 초기 증가를 관찰하는데 필요한 시간이 감소한다는 것을 보여준다. 또한, 리페이스를 함유하지 않은 샘플을 대조군(열린 삼각형)으로 사용하였으며, 이는 시간 경과에 따라 탁도가 증가하지 않았고, 기준선 흡광도 수준을 제공하였다.

실시예 2. 형성된 입자의 조성의 확인

2.1 입자의 제조.

2.5 ㎍/㎖의 리페이스를 TKC 완충액 중 PS80과 함께 실온에서 3시간 동안 인큐베이션한 후 원심분리하여 입자를 제조하였다. 상청액을 버리고, 펠릿을 완충액으로 1회 세척하고, 초음파 처리하여 재구성하였다. IgG의 존재하에 입자를 생성하기 위해, 인간 다중클론 IgG를 7.5 ㎎/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 기계적으로 분산된 펠릿을 5㎛ 폴리카보네이트 막 필터(라피드(RapID); 뉴저지주 몬머스 정션 소재)에 증착하였다. 샘플에 특정한 스펙트럼을 생성하기 위해, 50× 대물렌즈에서 100% 강도/10초 노출 시간의 785㎚ 단색 레이저와 함께 RapID 단일 입자 탐색기를 사용하여 입자에서 라만 분광법을 수행하였다.

2.2 라만 분광법.

리페이스를 PS80과 함께 인큐베이션한 후 라만 분광법을 사용하여 입자 구성 성분을 확인하였다. 이 방법은 비탄성 광 산란을 사용하여 각 분자에 고유한 에너지 스펙트럼을 생성한 다음, 다양한 화학 구조의 지문을 포함하는 참조 라이브러리와 비교한다. 200개의 입자 중 156개의 라만 스펙트럼은 올레산의 스펙트럼과 매우 유사한 것으로 확인되었다(도 2). 도 2에 나타나 있는 바와 같은 흑색 트레이스는 내부 참조 올레산이다. 1650 cm^-1의 피크는 선형 탄화수소 사슬의 C=C 결합의 수에 정비례하므로, 불포화된 올레산 탄화수소 사슬의 특징이다. 다른 확인된 종은 라우르산 및 팔미트산이 포함되어 있으며, 둘 다는 폴리소르베이트의 분해 산물이기도 하다.

실시예 3. HSA에 의한 입자 형성의 방지.

HSA는 지방산에 대한 여러 높고 낮은 친화성 결합 부위를 포함하므로, 폴리소르베이트 가수분해시 입자 형성을 저해할 수 있는 지방산 싱크로 작용할 가능성이 있다. 입자 형성을 방지하는 HSA의 효과를 테스트하기 위해, 0.1% PS80을 25℃에서 증가하는 농도의 FAF-HSA의 존재하에 0.5㎍ 리페이스와 함께 인큐베이션하고, 450㎚에서 6시간 동안 흡광도를 측정하여 용액 탁도를 모니터링하였다.

도 3은 다양한 FAF-HSA 농도에 대한 시간의 함수로서 450㎚에서의 흡광도를 나타내는 그래프를 보여준다. FAF-HSA(열린 다이아몬드)가 없는 샘플은 흡광도(대략 0.4㎚)에 대한 상한을 제공한다. 도 3에 나타난 바와 같이, 입자의 출현에 대한 HSA의 효과는 용량 의존적 반응이며, 여기서 오차 막대는 2회 반복으로부터의 표준 오차를 나타낸다. 대조군 샘플은 FAF-HSA를 함유하지 않았고, 6시간 후 대략 0.4 OD의 최종 흡광도를 나타내었다. FAF-HSA의 첨가는 최종 흡광도의 감소(낮은 탁도)뿐만 아니라 농도 의존적 방식으로 탁도 개시의 시간적 지연을 초래하였다. 특히, 7.5 ㎎/㎖의 FAF-HSA를 함유하는 샘플은 이 기간 동안 임의의 눈에 띄는 흡광도를 나타내지 않았다. PS80 대신 PS20에서도 유사한 결과가 얻어졌다(데이터 미도시).

실시예 4. 지방산 결합 부위의 부분 포화는 HSA가 입자 형성을 완화하는 것을 방지한다 .

HSA가 입자 형성을 저해하는 분자 메커니즘을 추가로 정의하기 위해, 3개의 고친화성 결합 부위와 화학량론적 비로 스테아르산과 함께 사전 인큐베이션된 HSA를 함유하는 용액의 탁도 변화의 측정을 수행하였다. 올레산이 더 직접적인 비교가 될 수 있지만, 단일-불포화된 지방산의 용해도는 유리 지방산의 샘플로의 이동을 최소화하는 것을 어렵게 만들었으며; 따라서, 동등한 수의 탄화수소를 갖는 포화 분자인 스테아르산을 비교 가능한 대체물로 선택하였다.

에탄올 중 70mM의 순수한 스테아르산(시그마)을 FAF-HSA에 3:1 몰비로 첨가하고, 실온에서 25℃에서 30분 내지 60분 동안 인큐베이션하여 스테아르산(SA-HSA)이 로딩된 HSA를 제조한 후, 22,000 rcf에서 4분 동안 원심분리하여 비-결합된 스테아르산을 펠릿화한 다음 0.5㎎의 리페이스 및 0.1% PS80을 첨가하고, 450㎚에서의 흡광도를 6시간 동안 모니터링하였다.

도 4의 플롯은 다양한 SA-HSA 농도에 대한 시간의 함수로서 450㎚에서의 흡광도를 나타내며, SA-HSA(열린 원)가 없는 샘플은 흡광도의 상한(대략 0.5)을 제공하는 반면 오차 막대는 3회 반복으로부터의 표준 오차를 나타낸다.

FAF-HSA는 7.5 ㎎/㎖에서 완전한 저해로 탁도의 용량-의존적 감소를 나타낸 반면, SA-HSA를 함유하는 모든 샘플에서 탁도의 증가가 검출되었으며, 이는 입자 형성이 저해되지 않았음을 나타낸다(도 4). 또한, 탁도의 개시에 필요한 시간은 FAF-HSA의 등가량을 함유하는 샘플에 비해 더 짧았다(도 3).

실시예 5. HSA가 없는 항체 제제에서 입자 형성의 완화

입자 형성의 완화는 폴리소르베이트/리페이스 혼합물에 첨가된 HSA의 농도에 정비례하는 것으로 나타났다; 그러나, 임의의 단백질이 비-특이적으로 입자 형성을 방지할 수 있는 가능성은 남아 있었다. 이 효과가 HSA에 특이적인지 또는 임의의 단백질 종의 일반적인 특성일 수 있는지를 결정하기 위해, 두 번째로 가장 풍부한 순환 혈청 단백질인 인간 다중클론 IgG(문헌[N. Leigh Anderson & Norman G. Anderson,　The Human Plasma Proteome: History, Character, and Diagnostic Prospects, 1　Molecular & Cellular Proteomics　845-867 (2002)])를 HSA로 대체하고, 용액의 시간 경과에 따른 탁도를 모니터링하였다.

IgG를 사용한 실험을 위해, 시그마-알드리치(미주리주 세인트루이스 소재)에서 구입한 인간 다중클론 IgG를 150mM NaCl 및 35mM Tris(pH 8.0)로 제조업체의 권장사항에 따라 재구성하고, 25mM Tris, 100mM KCl 및 pH 7.5로 평형화된 Zeba 스핀 탈염 칼럼(써모 피셔 사이언티픽)에서 탈염하였다.

HSA에 대한 지방산 입자 완화의 특이성을 테스트하기 위해, 25℃에서 0.5㎍의 리페이스 및 0.1% PS80을 함유하는 용액에 상이한 농도의 인간 다중클론 IgG를 첨가하고, 450㎚에서의 흡광도를 6시간 동안 모니터링하였다.

리페이스와 PS80을 포함하지만 IgG가 없는 양성 대조군 샘플(도 5, 열린 다이아몬드)을 사용하여 흡광도의 상한(대략 0.5)을 제공하였다. PS80과 10 ㎎/㎖의 IgG를 포함하지만 리페이스는 없는 샘플(적색 삼각형)을 사용하여 450㎚에서 기준선 흡광도를 나타내는 음성 대조군을 제공하였다.

FAF-HSA를 함유하는 샘플에 대해 관찰된 탁도의 감소와 대조적으로, 폴리-IgG를 함유하는 모든 샘플은 흡광도가 빠르게 증가하여 입자 형성을 방지하지 않음을 나타낸다(도 5). 놀랍게도, 탁도의 겉보기 수준은 IgG를 함유하지 않는 양성 대조군과 비교하여 보통의 폴리-IgG 농도-의존적 증가를 나타내었다; 그러나, 흡광도의 증가가 입자의 수의 증가에 의한 것인지 또는 평균 입자 크기의 증가에 의한 것인지 결정하기 어렵다. 응집은 음성 대조군에서 관찰되지 않았다(도 5, 적색 삼각형).

탁도의 증가는 단백질 동결건조에 기인할 수 있다. 탁도의 증가가 단백질이 처리되는 방식(즉, 동결건조)으로 인한 것인지를 결정하기 위해, 두 가지 방식으로 용액-상태의 mAb를 제조하였으며; 하나는 정제된 용액 상태에서 수정되지 않은 것이고, 다른 하나는 폴리 IgG 제조에 사용된 제조업체의 동결건조 공정을 모방한 것이다. 단일클론 항체를 동결건조하고, 반복 처리를 위해 다중클론 IgG 제조업체의 지침에 따라 재구성한 다음, 25℃에서 0.5㎍의 리페이스와 0.1% PS80를 함유하는 용액을 첨가하고, 450㎚에서의 흡광도를 6시간 동안 모니터링하였다. 도 6의 패널 A는 동결건조되지 않은 단일클론 항체를 보여준다. 도 6의 패널 B는 동결건조된 동일한 단일클론 항체를 보여준다. 플롯은 다양한 단일클론 IgG 농도에 대한 시간의 함수로서 450㎚에서의 흡광도를 도시한다. 리페이스와 PS80은 포함하지만 IgG는 없는 양성 대조군 샘플(열린 다이아몬드)은 흡광도에 대한 상한(대략 0.55)을 제공한다. PS80과 10 ㎎/㎖의 IgG를 포함하지만 리페이스가 없는 음성 대조군 샘플(적색 삼각형)은 450㎚에서 기준선 흡광도를 나타낸다. 동결건조된 물질은 폴리-IgG의 것과 유사한 증가(uptick)를 보였으며, 이는 이러한 증가가 동결건조 과정으로 인한 것일 수 있음을 보여준다.

실시예 6. 시험관내 HSA를 사용한 항체 제제에서의 입자 형성의 완화

HSA가 다중클론 IgG의 존재하에 입자 형성을 완화할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 증가하는 농도의 다중클론 IgG를 사용한 검정, HSA, 다중클론 IgG, 리페이스 및 PS80을 이용한 테스트를 수행하였다.

4.5 ㎎/㎖의 FAF-HSA 및 7.5 ㎎/㎖의 FAF-HSA를 25℃에서 다중클론 IgG, 0.5㎍의 리페이스 및 0.1% PS80을 함유하는 샘플에 첨가하고, 450㎚에서의 흡광도를 6시간 동안 모니터링하였다.

도 7은 4.5 ㎎/㎖의 FAF-HSA 및 7.5 ㎎/㎖의 FAF-HSA를 다양한 다중클론 IgG 농도에 첨가하기 위한 시간의 함수로서 450㎚에서의 흡광도에 대한 플롯을 도시한다. 리페이스와 PS80은 포함하지만 IgG는 없는 양성 대조군 샘플(열린 다이아몬드)은 흡광도에 대한 상한(대략 0.5)을 제공하며, 오차 막대는 2회 반복으로부터의 표준오차를 나타낸다.

HSA의 입자 저해 활성은 (도 3)에서 다중클론 IgG의 부재하에 관찰된 것과 유사하였으며, 이는 HSA가 다른 혈청 단백질의 존재하에서도 입자의 형성을 저해함을 나타낸다.

실시예 7. 생체내 HSA를 사용한 항체 제제에서의 입자 형성의 완화

위에 기술된 빠른 리페이스-매개성 입자 형성 및 검출 검정은 HSA가 시험관 내에서 입자 형성을 방지할 수 있음을 보여주었다. 보다 적절한 생체내 환경에 대한 첫 번째 단계로서, HSA가 기존 입자를 가용화할 수 있는지 여부를 평가하였다.

HSA가 용액에서 미리-형성된 입자를 가용화하는 능력을 테스트하기 위해, 입자를 제조하고(물질 및 방법 참조), 대략 0.5 OD의 최대 흡광도를 얻기 위해 희석하였다. 미리-형성된 입자를 FAF-HSA와 함께 인큐베이션하고, 450㎚에서의 흡광도를 도 8에 나타난 바와 같이 6시간 동안 모니터링하였다(2.5시간을 나타내도록 표시된 데이터). 리페이스와 PS80은 포함하지만 HSA는 없는 양성 대조군 샘플(도 8, 닫힌 삼각형)은 흡광도에 대한 상한(대략 0.5)을 제공한다. PS80과 7.5 ㎎/㎖의 HSA는 있지만 리페이스는 없는 음성 대조군 샘플(도 8, 적색 삼각형)은 450㎚에서 기준선 흡광도를 보이며, 오차 막대는 3회 반복으로부터의 표준 오차를 나타낸다.

상승된 수준의 지방산 입자를 함유하는 용액에 FAF-HSA를 첨가하면, 용액 탁도가 빠르게 감소하였지만, 모든 농도의 FAF-HSA가 기준선 수준을 달성한 것은 아니다(도 8). 3.5 ㎎/㎖ 이하의 HSA 농도에서 관찰된 안정기는 미리-형성된 입자가 완전히 용해되지 않았음을 나타낸다. 5.5 ㎎/㎖ 이상의 HSA 농도가 탁도 검정의 한계 내에서 미리-형성된 입자를 완전히 파괴하는데 필요하였다.

실시예 8. 인간 혈청을 사용한 생체내 HSA를 사용한 항체 제제에서의 입자 형성의 완화

실시예 7과 유사한 실험을 또한 생리학적 조건을 보다 밀접하게 나타내는 인간 혈청을 사용하여 수행하였다. 특히, 혈청에 존재하는 알부민은 다양한 저용해도 화합물과 결합한다.

미리-형성된 입자를 정상 인간 혈청과 함께 인큐베이션하고, 450㎚에서의 흡광도를 도 9에 나타낸 바와 같이 6시간 동안 모니터링하였다(2.5시간까지의 데이터는 더 이상의 변화가 관찰되지 않은 것으로 나타남). 리페이스와 PS80은 포함하지만 혈청은 없는 양성 대조군 샘플(열린 삼각형)은 흡광도에 대한 상한(대략 0.6)을 제공한다. PS80과 21% 인간 혈청을 포함하지만 리페이스가 없는 음성 대조군 샘플이 포함되었고(데이터 미도시), 0.25 OD의 흡광도를 얻었으며, 오차 막대는 3회 반복으로부터의 표준 오차를 나타낸다. 인간 혈청의 기준선 흡광도로 인해, 리페이스, PS80 또는 입자 없이 혈청의 각 농도를 또한 분석하였고, 도 9에 나타낸 결과는 배경 감산 신호(background subtracted signal)를 도시한다.

혈청을 함유하는 모든 샘플이 탁도의 감소를 나타내는 반면, 적어도 14% 혈청을 갖는 샘플만이 1.5시간 이내에 본질적으로 입자가 없음을 나타내는 기준선을 얻을 수 있었다. 인간 혈청에서 50 ㎎/㎖의 알부민의 상한을 가정하면, 이는 제로 탁도 기준선을 얻는데 필요한 FAF-HSA의 양과 일치하는 대략 7.5 ㎎/㎖의 알부민에 해당한다.

따라서, 생물제약 산업에서 인간 혈청 알부민에 대한 신규하고 잠재적으로 유익한 용도가 발견되었다. HSA는 지방산 입자 형성을 완화할 수 있으며, HSA를 부형제로 포함하면 소정의 폴리소르베이트-함유 의약품의 저장 수명을 연장하는데 도움이 될 수 있음을 나타낸다. 중요하게는, HSA는 또한 용액에서 기존의 입자를 가용화할 수 있으며, HSA의 생리학적 농도가, 존재하는 경우, 의약품의 투여 후 입자를 효율적이고 효과적으로 제거할 수 있음을 시사한다.

Claims (34)

1. 지방산 입자를 형성할 수 있는 제형에서 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법으로서, 유효량의 인간 혈청 알부민을 상기 제형에 첨가하는 단계를 포함하는, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제형은 폴리소르베이트를 포함하는, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 제형은 하나 이상의 추가적인 단백질을 포함하는, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 지방산 입자는 유리 지방산을 포함하는, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 지방산 입자는 올레산, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유리 지방산을 포함하는, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 제형에서 상기 인간 혈청 알부민의 농도는 적어도 약 5.5 ㎎/㎖인, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 방법은 약 6개 내지 약 22개의 탄소 원자를 갖는 유리 지방산을 포함하는 지방산 입자의 형성을 감소시키는, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 제형은 비경구 제형인, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 방법은 가시적(visible) 또는 비-가시적(sub-visible) 입자를 형성하는 지방산 입자를 감소시키는. 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 1몰의 인간 혈청 알부민은 상기 지방산 입자에 함유된 적어도 0.5몰의 유리 지방산에 결합하는, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 지방산 입자는 크기가 적어도 10㎛인, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 지방산 입자는 라만 분광법에 의해 검출되는, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
13. 제2항에 있어서, 상기 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
14. 제2항에 있어서, 상기 제형에서 상기 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001%w/v 내지 약 1% w/v인, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
15. 제3항에 있어서, 상기 추가적인 단백질은 항체인, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
16. 제3항에 있어서, 상기 추가적인 단백질은 단일클론 항체인, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
17. 제3항에 있어서, 상기 추가적인 단백질은 다중클론 항체인, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
18. 제5항에 있어서, 상기 제형에서 상기 유리 지방산의 분자 대 상기 인간 혈청 알부민의 분자의 비는 약 6:1 내지 약 1:1인, 지방산 입자의 형성을 방지 또는 감소시키는 방법.
19. 제형에서 형성된 지방산 입자를 가용화하는 방법으로서, 유효량의 인간 혈청 알부민을 상기 제형에 첨가하는 단계를 포함하는, 제형에서 형성된 지방산 입자를 가용화하는 방법.
20. 제형으로서,
    활성 약제학적 작용제,
    폴리소르베이트, 및
    인간 혈청 알부민
    을 포함하는, 제형.
21. 제20항에 있어서, 상기 활성 약제학적 작용제는 단일클론 항체를 포함하는, 단백질 제형.
22. 제20항에 있어서, 상기 활성 약제학적 작용제는 다중클론 항체를 포함하는, 단백질 제형.
23. 제20항에 있어서, 상기 활성 약제학적 작용제는 치료적 항체를 포함하는, 단백질 제형.
24. 제20항에 있어서, 상기 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80 또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질 제형.
25. 제20항에 있어서, 상기 제형은 리페이스(lipase) 효소를 더 포함하는, 단백질 제형.
26. 제20항에 있어서, 상기 단백질 제형에서 상기 인간 혈청 알부민의 농도는 적어도 약 5.5 ㎎/㎖인, 단백질 제형.
27. 제20항에 있어서, 상기 제형은 비경구 제형인, 단백질 제형.
28. 제20항에 있어서, 상기 폴리소르베이트는 분해되어 지방산 입자를 형성하는, 단백질 제형.
29. 제28항에 있어서, 상기 지방산 입자는 유리 지방산을 포함하는, 단백질 제형.
30. 제29항에 있어서, 상기 유리 지방산은 약 6개 내 약 22개의 탄소를 갖는 지방족 산인, 단백질 제형.
31. 제29항에 있어서, 상기 유리 지방산은 올레산인, 단백질 제형.
32. 제29항에 있어서, 상기 유리 지방산은 올레산, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질 제형.
33. 제29항에 있어서, 상기 제형에서 상기 유리 지방산의 분자 대 상기 인간 혈청 알부민의 분자의 비는 약 6:1 내지 약 1:1인, 단백질 제형.
34. 제20항에 있어서, 상기 단백질 제형에서 상기 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% w/v 내지 1%w/v인, 단백질 제형.

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