WO2020173431A2

WO2020173431A2 - 包含抗cd47抗体的制剂及其制备方法和用途

Info

Publication number: WO2020173431A2
Application number: PCT/CN2020/076611
Authority: WO
Inventors: 谢瑞霞; 马丽强; 汪音爵; 周凯松
Original assignee: 信达生物制药(苏州)有限公司
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2020-02-25
Publication date: 2020-09-03
Also published as: EP3932426A4; AU2020227770A1; TWI764097B; JP2022521624A; CN113453719A; US20220143180A1; CA3131307A1; WO2020173431A3; KR20210134926A; TW202045136A; EP3932426A2

Abstract

本发明涉及包含抗CD47抗体的制剂，尤其涉及包含抗体、缓冲剂、稳定剂和表面活性剂的药物制剂。此外，本发明还涉及这些制剂的疾病治疗或预防用途。

Description

包含抗 CD47抗体的制剂及其制备方法和用途技禾领域

本发明涉及抗体制剂领域。更具体而言，本发明涉及包含重组全人源抗分化抗原簇 47（CD47）单克隆抗体的药物制剂，尤其是稳定的高浓度抗体液体制剂，以及用于制备所述药物制剂的方法，以及所述药物制剂的治疗和 /或预防用途。背景技术

分化抗原簇 47 （CD47），也被称为整联蛋白相关蛋白（IAP），是免疫球蛋白超家族成员。不同的研究表明，几乎所有的肿瘤细胞和组织都高表达 CD47。目前已经报道了多个抗 CD47抗体被开发用于各种肿瘤和 /或癌症的治疗中。

在 CN201710759828.9的中国申请（2017年 8月 29递交）中，公开了一系列重组全人源抗分化抗原簇 47（CD47）单克隆抗体。这些抗体能够改善巨噬细胞的呑噬作用，并具有显著的抗肿瘤活性，能够显著抑制肿瘤的生长，甚至能使得肿瘤完全消失。此外，这些抗体还表现出显著降低的血细胞凝集作用，因此在临床治疗中将具有显著降低的副作用。

单克隆抗体对 I巴标具有高度的特异性，并且一般而言比小分子药物更为有效。然而，基于单克隆抗体的药品开发具有其自身的挑战性。单克隆抗体比传统的有机和无机药物更为复杂，并且通常具有与其它蛋白质类生物药相似的降解模式。广义上，抗体蛋白的降解可以分为两种主要的类型：物理不稳定性（:涉及蛋白质高级结构的改变；）和化学不稳定性（:涉及蛋白质的各种化学修饰）。化学不稳定性可以由脱酰胺、外消旋、水解、氧化、 P-消除或二硫键交换等引起，其中最常见的是片段化、脱酰胺和氧化。物理不稳定性可以因变性、聚集、沉淀或吸附等引起。

单克隆抗体的降解可以发生在各个阶段，包括抗体制剂的配制、存储和递送过程中。而基于单克隆抗体的药品的生物学活性与其结构、构象和化学稳定性密切相关。因此，抗体制剂的开发是抗体产品开发的一个重要方面，并常常是成功临床生产的一个关键步骤。抗体药品的稳定性是保证药品有效性和安全性的一个重要指标。获得赋予抗体药品良好稳定性的制剂处方是药品在货架期内保持其有效性和安全性的关键条件。因此，抗体制剂必须以不仅使抗体适于施用给受试者的方式调配，还要以在储存以及后续使用期间维持其稳定性的方式来调配。如果抗体没有适当地在液体中得以调配，则液体溶液中的该抗体倾向于分解、聚集或发生不希望的化学修饰等。

目前，单克隆抗体正在以增高的剂量被开发用于各种适应症的治疗。例如 cetuximab 以 250-400mg/m²的剂量施用； efalizumab以大约 lmg/kg的剂量的施用。此外，考虑施用的方便性和患者依从性，对皮下注射抗体制剂的需求也日益增多。因此，开发高浓度的稳定单克隆抗体液体制剂是本领域的一个方向，其中蛋白质浓度需要达到 100mg/ml或更高。

除了满足稳定性和纯度等质量要求外，抗体制剂的灵活性也是生物医药领域考虑的一个因素。有利地是，制剂形式满足在宽范围的剂量水平上（典型地，取决于目标适应症，单克隆抗体的用量可以为 0.1-20mg/kg）以及在多种施用途径上（典型地是皮下和静脉内）给药的灵活性。

因此，在本领域中对于含有抗 CD47 抗体的足够稳定新药物制剂存在需要，尤其是对适用于抗体高浓度（如大约 100mg/ml）的稳定液体制剂存在需要。发明概述

为了开发重组全人源抗 CD47 单克隆抗体的长期稳定储存的制剂处方，确保产品在有效期内（例如，至少 24个月）的质量可控，本申请发明人设计了处方前和处方筛选两个阶段的试验，考察了不同 pH、表面活性剂、稳定剂以及抗氧化剂对抗 CD47抗体制剂稳定性的影响。通过该深入的研究，本发明人提供了含有重组全人源抗分化抗原簇 47(CD47)单克隆抗体的药物制剂，尤其是稳定的高浓度抗体液体制剂。

在一个方面，本发明提供了一种液体抗体制剂，其包含 (i) 重组全人源抗 CD47单克隆抗体 (以下也简称“抗 CD47抗体”)； (ii) 缓冲剂， (iii) 稳定剂，和 (iv) 表面活性剂。

i一个实施方案中，抗 CD47抗体为在中国申请 CN201710759828.9 (2017年 8月 29递交) 中公开的重组全人源抗分化抗原簇 47(CD47)单克隆抗体。为本申请的目的，该中国申请的全部内容特此并入本文作为参考。在一个实施方案中，抗 CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含 SEQ ID NO: 1的序列或与其具有至少 90%同一性的序列，且轻链可变区包含 SEQIDNO: 2的序列或与其具有至少 90%同一性的序列：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVT ISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSS (SEQIDNO: 1) :

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIK (SEQIDNO: 2) 。

在一个实施方案中，所述抗 CD47抗体包含：

-GSISSYYWS (SEQIDNO: 3) 或 SYYWS (SEQIDNO: 11) 的重链 VHCDR1; -YIYYSGSTNYNPSLKS (SEQIDNO: 4) 的重链 VHCDR2;

-ARGKTGSAA (SEQIDNO: 5) 或 GKTGSAA (SEQIDNO: 12) 的重链 VHCDR3; -RASQGISRWLA (SEQIDNO: 6) 的轻链 VLCDR1;

-AASSLQS (SEQIDNO: 7) 的轻链 VLCDR2; 和

-QQTVSFPIT (SEQIDNO: 8) 的轻链 VLCDR3。

在一个实施方案中，所述抗 CD47抗体是包含重链和轻链的 IgG4抗体，其中所述重链包含 SEQ ID NO: 9的序列或与其具有至少 90%同一性的序列，且其中所述轻链包含 SEQ ID NO:10的序列或与其具有至少 90%同一性的序列：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVT

ISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST

SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKT

YTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV

VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK

CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE

SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS

LSLG (SEQID NO: 9)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 10)。

优选地，所述抗 CD47抗体是中国申请 CN201710759828.9 (于 2017年 8月 29递交) 中公开的抗 CD47单克隆抗体 ADI-26630, 该抗体由 SEQ ID NO: 9的重链序列和 SEQ ID NO: 10 的轻链序列组成。在移植人源伯基特氏淋巴瘤细胞的小鼠肿瘤模型中，该抗体表现出显著的抗肿瘤活性，例如腹腔注射 5 mg/kg，两天一次连续两周，该抗体可以导致肿瘤生长抑制率达到约 100%或更高；且肿瘤消失比例可以达到 60%以上。在一个实施方案中，液体抗体制剂中的抗 CD47 抗体的浓度为约 1-150 mg/mL, 例如 20mg/ml以上，尤其是 50mg/ml以上，优选 100mg/ml或 120mg/ml。例如，液体抗体制剂中的抗 CD47抗体的浓度可以是约 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 70、 75、 80、 85mg/ml、或 90mg/mL以上，例如， 90, 95, 100, 105, 110，或 120mg/ml。

在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂具有 pH5.0-6.0，例如 pH5.2±0.2, pH5.5±0.2, pH5.7±0.2, 优选 pH5.5。

在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含约 5-100mM的缓冲剂。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的缓冲剂的浓度为约 10mM， 20mM, 30mM, 40mM, 或 50mM。在一个实施方案中，所述缓冲剂为组氨酸缓冲剂。在一个优选实施方案中，本发明液体抗体制剂包含约 10-20mM，尤其是 10mM组氨酸缓冲剂。在再一实施方案中，组氨酸缓冲剂由组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系构成。在再一优选实施方案中，本发明液体抗体制剂包含 0.4mg/ml 组氨酸和 1.5mg/ml盐酸组氨酸。

在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含稳定剂，优选地所述稳定剂选自山梨醇、蔗糖、海藻糖、精氨酸及其组合，更优选为山梨醇或山梨醇和精氨酸的组合。在一个优选实施方案中，本发明液体制剂包含山梨醇作为稳定剂，优选地山梨醇的浓度为约 l-10%w/v，例如， 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%， 5.5% 或 6%w/v，或者以约 10-60mg/ml，例如约 15mg/ml, 20mg/ml, 25mg/ml, 30mg/ml, 35mg/ml, 40mg/ml, 45mg/ml, 50mg/ml, 55mg/ml的量存在，优选约 40mg/ml_o 在再一优选实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含山梨醇和精氨酸的稳定剂组合。优选地，在所述组合中，山梨醇的量为约 10-30mg/ml，尤其是 15mg/ml, 精氨酸的量为 80-1 10mM，尤其是约 lOOmM。在再一优选实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含约 15 mg/ml山梨醇和约 21.1mg/ml盐酸精氨酸的稳定剂组合。

在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含表面活性剂，优选地，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，所述表面活性剂选自聚山梨酯类表面活性剂，优选为聚山梨酯 -20。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含约 0.1-1 mg/ml , 例如 0.1-0.5mg/ml聚山梨酯 -20。在一个优选的实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含约 0.1-0. 4 mg/ml 的聚山梨酯 -20。在再一优选实施方案中，本发明的液体抗体制剂中聚山梨酯 -20 的量为约 0.3mg/ml。

在一个实施方案中，本发明液体制剂还包含抗氧化剂。在再一实施方案中，本发明液体制剂不包含抗氧化剂。在一个实施方案中，抗氧化剂是依地酸 (EDTA)或其盐，例如 EDTA-2Na 在一个实施方案中，所述液体制剂为稳定的液体药物制剂，优选为注射剂。在一个实施方案中，本发明的药物制剂用于皮下、皮内、肌内、或静脉注射。在一个优选的实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：

(i) 约 10-150 mg/mL的抗 CD47抗体；

(ii) 约 5-50mM的组氨酸缓冲剂；

(iii) 约 l-10%w/v山梨醇，或约 l-5%w/v山梨醇和约 80-1 10mM精氨酸的稳定剂组合，和

(iv) 约 0.01-0.1% w/v的聚山梨酯 -20 ;

其中所述液体制剂的 pH为约 5.0— 6.0，优选地 pH5.5±0.2_c

在一个优选的实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含

(i ) 90-1 50 mg/mL, 尤其是 90-120mg/ml的抗 CD47抗体；

(ii) 约 10-20mM组氨酸缓冲剂；

(iii) 约 20-60mg/ml (例如， 40-50mg/ml)山梨醇，或约 5-40 mg/ml (例如， 10-20 mg/ml) 山梨醇和约 80-1 10mM (例如约 100mM)精氨酸的组合，和

(iv) 约 0.1-0.4 mg/ml的聚山梨酯 -20 ;

其中所述液体制剂的 pH为约 5.0— 6.0，优选地 pH5.5±0.2_c

在一个优选的实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：

(i) 约 100 mg/mL的抗 CD47抗体； (ii) 约 0.4mg/ml组氨酸和约 1.5mg/ml盐酸组氨酸；

(iii) 约 15.0 mg/ml山梨醇和 21. lmg/ml盐酸精氨酸，和

(iv) 约 0.3mg/ml的聚山梨酿 -20 ;

其中所述液体制剂的 pH为约 5.5。另一方面，本发明提供了一种固体抗体制剂，其是通过将本发明的液体抗体制剂经固化处理而获得的。所述固化处理是通过例如结晶法、喷雾干燥法、冷冻干燥法实施的。在一个优选的实施方案中，所述固体抗体制剂例如是冻干制剂，例如冻干粉针剂形式。固体抗体制剂可在使用前，通过重构于适当的溶媒中，形成本发明的重构制剂。所述重构制剂也是一种本发明的液体抗体制剂。在一个实施方案中，所述适当的溶媒选自注射用水、注射用有机溶剂，包括但不限于注射用油、乙醇、丙二醇等，或其组合。本发明的液体制剂可以长期稳定储存，尤其是以高浓度 (例如 50mg/ml 以上，优选 90-150mg/ml, 例如 100mg/ml或 120mg/ml ) 稳定储存，例如至少 24个月或更长时间。在一个实施方案中，本发明的液体制剂可以在约 -80°C至约 45°C，例如 -80°C、约 -30°C、约 -20°C、约 0°C、约 5°C、约 25°C、约 35°C、约 38°C、约 40°C、约 42°C或约 45°C的条件下，储存至少 10天、至少 20天、至少 1个月、至少 2个月、至少 3个月、至少 4个月、至少 5个月、至少 6个月、至少 7个月、至少 8个月、至少 9个月、至少 10个月、至少 1 1个月、至少 12 个月、至少 18个月、至少 24个月，至少 36个月，或更长时间，是稳定的。

在一个实施方案中，本发明的液体制剂可以稳定储存至少 24个月。在再一实施方案中，本发明的液体制剂在至少 40°C是稳定的。在再一实施方案中，本发明的液体制剂在约 2°C-8°C 保持稳定至少 12个月，优选至少 24个月。在一个实施方案中，本发明的液体制剂在室温或例如约 25°C保持稳定至少 3个月，优选至少 6个月。在再一实施方案中，本发明的液体制剂在约 40°C保持稳定至少 1个月。在再一实施方案中，本发明的液体制剂在约 5°C至 40°C的温度，例如在 25°C的温度，在振荡下可以保持稳定至少 1天，例如 3天或 5天。

在一个实施方案中，可以通过检测制剂的外观、可见异物、蛋白含量、纯度、和 /或电荷变异体的变化，来指示储存后制剂的稳定性。在一个实施方案中，可以在高温加速试验中，例如在 40°C±2°C储存至少 1周、 2周或优选地 1个月后，或在 25°C±2°C储存至少 1个月或 2 个月后，检测本发明液体制剂的稳定性。在一个实施方案中，通过振荡试验检测本发明液体制剂的振荡稳定性。

在一个实施方案中，在储存后，通过目视检查本发明液体制剂的稳定性，其中本发明液体制剂在外观上保持为澄明、无色或微黄色的液体，无异物、无絮状物及沉淀。在一个实施方案中，在自然光下目视检查，制剂中无可见异物存在。在一个实施方案中，在储存后，通过测定蛋白含量变化，检查本发明液体制剂的稳定性，其中例如通过紫外分光光度 (UV)法，相对于储存第 0天的初始值，蛋白含量变化率不超过 20%，优选不超过 10%，例如 7-8%，优选不超过 5%。在一个实施方案中，在储存后，通过测定本发明液体制剂的浊度变化，检查本发明液体制剂的稳定性，其中例如通过 OD350mm法检测，相对于储存第 0天的初始值，变化值不超过 0.04，更优选地不超过 0.03，更优选地不超过 0.02。在一个实施方案中，在储存后，通过测定本发明液体制剂的纯度变化，检查本发明液体制剂的稳定性，其中通过尺寸排阻高效液相色谱法 (SEC-HPLC)，相对于储存第 0天的初始值，主峰纯度的变化值不超过 10%, 例如不超过 5%、 4%、 3%、例如 1-2%，优选不超过 1%，且优选地，聚体的增幅不超过 2%，优选地不超过 1%、 0.5%或 0.1%。在一个实施方案中，在储存后，通过测定本发明液体制剂的纯度变化，检查本发明液体制剂的稳定性，其中通过非还原型十二烷基硫酸钠毛细管电泳 (CE-SDS)法，主峰纯度的变化值下降不超过 10%, 例如不超过 5%、 4%、 3%、优选不超过 2%、 1%、0.5%或 0.1%。在一个实施方案中，在储存后，通过成像毛细管等电聚焦电泳 (iCIEF ) 检测本发明液体制剂的稳定性，其中相对于储存第 0天的初始值，抗体的电荷变异体 (主成分、酸性组分或碱性组分) 的变化值不超过 30%，优选地不超过 20%、或不超过 10%，例如不超过 5%、 4%、 3%、或 2%, 例如，在一个实施方案中，主成分或酸性组分的变化值不超过 20%, 且碱性组分的变化值不超过 3%。

在一个实施方案中，制剂在储存后，例如在 2-8°C储存至少 24个月后，或在室温储存至少 3个月后，或在 40°C±2°C储存 1个月后，是稳定的，优选地具有如下特征之一或多项：

(i) 通过 SEC测量，制剂中抗体单体的百分数大于 90%，优选大于 95%，且优选地聚体增幅不超过 2% ;

(ii) 通过非还原型 CE-SDS测量，制剂具有大于 90%的纯度，优选大于 95%的纯度；

(iii) 通过 iCIEF测量，相对于储存第 0天的初始值，制剂中抗 CD47抗体的至少 50%，优选至少 55%是非碱性及非酸性形式，且优选地抗体的酸性组分电荷变异体的增加不超过 20%。

在再一实施方案中，制剂在储存后，例如在 2-8°C储存至少 24个月后，或在室温储存至少 3个月后，或在 40°C±2°C储存 1个月后，是稳定的，优选地具有以下特征之一或多项：

(i) 外观澄明，无可见异物；

(ii) 用紫外分光光度 (UV)法检测，相对于储存第 0天的初始值，蛋白含量变化率不超过

10%;

(iii) 用 OD350mm法检测，相对于储存第 0天的初始值，浊度变化值不超过 0.04，优选地不超过 0.02 ;

(iv) 用 SEC-HPLC检测，相对于储存第 0天的初始值，主峰纯度的变化值不超过 5%、优选不超过 1% ;

(v) 用非还原型 CE-SDS检测，相对于储存第 0天的初始值，主峰纯度的变化值下降不超过 5%、优选不超过 3% ;

(vi) 用 iCIEF检测，相对于储存第 0天的初始值，制剂中抗 CD47抗体的至少 50%，优选至少 55%是非碱性及非酸性形式，且优选地抗体的酸性组分电荷变异体的增加不超过 20%。在一个方面，本发明提供了一种递送装置，其包含本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂。在一个实施方案中，本发明的递送装置以包含本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂的预填装注射器形式提供，例如用于静脉内、皮下、皮内或者肌内注射。

在再一方面，本发明提供向受试者，例如哺乳动物递送抗 CD47抗体的方法，包括给予所述受试者本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂的步骤，所述递送是例如通过使用预填装注射器的递送装置实施的。

在再一方面，本发明提供本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂的用途，用于制备在受试者中治疗 CD47相关疾病的递送装置 (如，预填装注射器) 或药物，特别地用于治疗 CD47 相关癌症，例如各种血液肿瘤，如淋巴瘤，例如伯基特氏淋巴瘤。

本发明的其它实施方案将通过参阅此后的详细说明而清楚明了。附图简述

结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图 1显示，在实施例所述的 pH筛选试验中，将不同 pH (pH5.0, 5.5, 6.0和 6.5) 的抗体制剂在 40°C±2°C的温度条件下储存 0天、 1周、 2周和 1个月后，用 OD350nm法测定的制剂浊度随时间的变化图。图 2显示，在实施例所述的 pH筛选试验中，将不同 pH （pH5.0, 5.5, 6.0和 6.5）的抗体制剂在 40°C±2°C的温度条件下储存 0天、 1周、 2周和 1个月后，用 SEC-HPLC法测定的制剂主峰纯度随时间的变化图。

图 3显示，在实施例所述的 pH筛选试验中，将 pH6.5的抗体制剂在 40°C±2°C储存 1个月后，通过 SEC-HPLC法测定的抗体制剂纯度图谱。

图 4显示，在实施例所述的稳定剂筛选试验中，将具有不同稳定剂的抗体制剂（处方 1-4）置于 40°C±2°C储存 0天、 1周、 2周、和 1月后，通过 SEC-HPLC法测定的主峰纯度随时间的变化图。

图 5显示，在实施例所述的稳定剂筛选试验中，将具有不同稳定剂的抗体制剂（处方 1-4）置于 40°C±2°C储存 0天、 1周、 2周、和 1月后，通过非还原型 CE-SDS法测定的主峰纯度随时间的变化图。

图 6显示，在实施例所述的稳定剂筛选试验中，将具有不同稳定剂的抗体制剂（处方 1-4）置于 40°C±2°C储存 0天、 1周、 2周、和 1月后，通过 iCIEF法测定的电荷变异体主成分随时间的变化图。

图 7显示，在实施例所述的稳定剂筛选试验中，将具有不同稳定剂的抗体制剂（处方 1-4）置于 40°C±2°C储存 0天、 1周、 2周、和 1月后，通过 iCIEF法测定的电荷变异体酸性组分随时间的变化图。

图 8显示，在实施例所述的抗氧化剂筛选试验中，将添加或不添加 EDTA的抗体制剂（处方 A和 B）置于 40°C±2°C储存 0天、 1周、 2周、和 1月后，通过 OD350nm法测定的浊度随时间的变化图。

图 9显示，在实施例所述的抗氧化剂筛选试验中，将添加或不添加 EDTA的抗体制剂（处方 A和 B）置于 40°C±2°C储存 0天、 1周、 2周、和 1月后，通过 iCIEF法测定的电荷变异体（主成分、酸性组分和碱性组分）随时间的变化图。发明详述

在详细描述本发明前，应了解，本发明不受限于所述的特定方法及实验条件，因为所述方法以及条件是可以改变的。另外，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用，而不意欲为限制性的。定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小 5%的下限和比指定数字数值大 5%的上限的范围内的数字数值。

术语“和 /或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项的任意两项或多项。

如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。在本文中，术语“抗体”是指包含轻链和重链免疫球蛋白可变区的多肽，所述免疫球蛋白可变区特异性识别并结合抗原。优选地，本发明的抗体是全长抗体，由两条重链和两条轻链组成，其中每条重链由重链可变区（本文中缩写为 VH）和重链恒定区组成，每条轻链由轻链可变区 (本文中缩写为 VL)和轻链恒定区组成。在一些实施方案中，本发明的抗体也可以指抗体的抗原结合片段。术语“抗体制剂”指一种制备物，所述制备物处于允许作为活性成分的抗体的生物活性可以有效发挥的形式，并且不含有对于待施用该制剂的受试者而言具有不可接受毒性的其它组分。这类抗体制剂通常是无菌的。通常，抗体制剂中包含可药用赋形剂。 “可药用”赋形剂是可以合理地施用至受试哺乳动物以便制剂中所用活性成分的有效剂量可以递送至受试者的试剂。赋形剂的浓度与施用模式相适应，例如可以是注射可接受的。

术语“抗 CD47抗体制剂”，在本文中也简称为“本发明的抗体制剂”，意指包含抗 CD47抗体作为活性成分和可药用赋形剂的制备物。经所述组合后，作为活性成分的抗 CD47抗体适于治疗性或预防性施与人类或非人类动物。本发明的抗体制剂可以例如制备成水性形式的液体制剂，例如，即用式预填装注射器，或者制备成冻干制剂，在即将使用前通过溶解和 /或悬浮于生理可接受的溶液中进行重构 (即，复溶) 。在一些实施方案中，抗 CD47抗体制剂是液体制剂形式。

“稳定”抗体制剂是制剂中的抗体在储存于特定条件下之后保有可接受程度的物理稳定性和 /或化学稳定性。尽管抗体制剂中所含的抗体在储存特定时间之后可能不会 100%维持其化学结构，但通常在储存特定时间之后维持约 90%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%或约 99%的抗体结构或功能，则认为抗体制剂是“稳定的”。在一些具体的实施方案中，本发明的抗 CD47抗体制剂在制造、制备、运输和长期储存过程中表现出低至检测不到的抗体聚集或降解或化学修饰，从而极少或甚至是没有抗 CD47抗体的生物活性损失，表现出高度稳定性。在一些实施方案中，本发明的抗 CD47抗体制剂在储存后，基本上保留其物理和化学稳定性。优选地，本发明液体制剂可以在室温或在 40°C稳定至少 1 个月，和 /或在 2-8°C稳定至少 24 个月。

本领域已知多种分析技术可以用于测定蛋白质的稳定性，参见例如 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)。可以在选定的温度和选定的储存时间测量稳定性。例如，可以基于预期的制剂货架期来选择储存时间。或者可以使用加速稳定性试验。在一些实施方案中，通过对抗体制剂进行各种胁迫测试来进行稳定性测试。这些测试可以代表调配的抗体制剂在制造、储存或运输期间可能遭遇到的极端条件，也可以代表在非制造、储存或运输期间可能使抗体制剂中的抗体的不稳定性加速的条件。例如，可以将经调配的抗 CD47抗体制剂充填至 5 mL玻璃瓶中用于振荡胁迫以检测抗体的振荡 /剪切稳定性；或者可以将经调配的抗 CD47抗体制剂充填至玻璃小瓶中以检验在高温胁迫下的抗体稳定性。经一段储存时间后，制剂不显示聚集、沉淀、混浊和 /或变性；或显示非常少的聚集、沉淀、混浊和 /或变性，则可以认为抗体在制剂中“保持其物理稳定性”。由于制剂中抗体的聚集可以潜在地导致患者增加的免疫反应，从而导致安全性问题。因此，需要使在制剂中的抗体聚集最小化或防止聚集。光散射法可以用于测定制剂中的可见聚集物。 S EC可以用于测定制剂中的可溶性聚集物。此外，可以通过目视检查制剂的外观、颜色和 /或澄清度、或者通过 OD350nm法检测制剂的浊度、或者通过非还原型 CE-SDS法测定制剂的纯度，来指示制剂的稳定性。在一个实施方案中，通过测定在特定温度下储存特定时间之后制剂中的抗体单体的百分比来测量制剂的稳定性，其中制剂中的抗体单体的百分比越高，则制剂的稳定性越高。

“可接受程度的” 物理稳定性可以表示于特定温度下储存特定时间之后，在制剂中检测到至少约 92%的抗 CD47抗体单体。在一些实施方案中，在特定温度储存至少 2周、至少 28天、至少 1个月、至少 2个月、至少 3个月、至少 4个月、至少 5个月、至少 6个月、至少 7个月、至少 8个月、至少 9个月、至少 10个月、至少 1 1个月、至少 12个月、至少 18 个月、至少 24个月或更久后，可接受程度的物理稳定性表示至少约 92%、 93 %、 94%、 95 %、 96%、 97%、 98 %、 99%的抗 CD47抗体单体。当评估物理稳定性时，药物制剂储存的特定温度可为约 -80°C至约 45°C的任一温度，例如储存于约 -80°C、约 -30°C、约 -20°C、约 0°C、约 4°C-8°C、约 5°C、约 25°C、约 35°C、约 37°C、约 40°C、约 42°C或约 45°C。例如，若储存于约 40°C±2°C 1个月之后，检测到至少约 92%、 93 %、 94%、 95 %、 96%、 97%、 98 %、 99%的抗 CD47抗体单体，则药物制剂视为是稳定的。若储存于约 25°C 2个月之后，检测到至少约 92%、 93 %、 94%、 95 %、 96%、 97%、 98 %、 99%的抗 CD47抗体单体，则药物制剂视为是稳定的。若储存于约 5°C 9个月之后，检测到至少约 92%、 93 %、 94%、 95 %、 96 %、 97%、 98 %、 99%的抗 CD47抗体单体，则药物制剂视为是稳定的。经一段储存时间后，如果制剂中的抗体不显示显著的化学改变，则可以认为抗体在制剂中“保持其化学稳定性”。大多数化学不稳定性源自于形成了抗体的共价修饰形式（例如，抗体的电荷变异体）。例如由天冬氨酸异构化、 N和 C末端修饰，可以形成碱性变异体；由脱酰胺化、唾液酸化和糖化，可以产生酸性变异体。化学稳定性可以通过检测和 /或定量抗体的化学改变形式来评估。例如，可以通过阳离子交换色谱（CEX）或成像毛细管等电聚焦电泳（icIEF）检测制剂中抗体的电荷变异体。在一个实施方案中，通过测定在特定温度下储存特定时间之后制剂中抗体的电荷变异体百分比变化值来测量制剂的稳定性，其中该变化值越小，则制剂的稳定性越高。

“可接受程度”的化学稳定性可以表示于特定温度下储存特定时间之后制剂中电荷变异体（例如主成分或酸性组分或碱性组分）的百分比变化值不超过 30%，例如 20%。在一些实施方案中，在特定温度储存至少 2周、至少 28天、至少 1个月、至少 2个月、至少 3个月、至少 4 个月、至少 5个月、至少 6个月、至少 7个月、至少 8个月、至少 9个月、至少 10个月、至少 1 1 个月、至少 12个月、至少 18个月、至少 24个月或更久后，可接受程度的化学稳定性可以表现为酸性组分电荷变异体的百分比变化值不超过约 25%、 20%、 15%、 10%、 5%、 4%、 3%、 2%、或 1%。当评估化学稳定性时，储存药物制剂的温度可为约 -80°C至约 45°C的任一温度，例如储存于约 -80°C、约 -30°C、约 -20°C、约 0°C、约 4°C-8°C、约 5°C、约 25°C或约 45°C。例如，若在储存于 5°C 24个月之后，酸性组分电荷变异体的百分比变化值少于约 25%、 24%、 23%、 22%、 21%、 20%、 19%、 18%、 17%、 16%、 15%、 14%、 13%、 12%、 10%、 9%、 8%、 7%、 6%、 5%、 4%、 3%、 2%、 1%、 0.5%或 0.1%，则药物制剂可被视为是稳定的。若在储存于 25°C 2 个月后，酸性组分电荷变异体的百分比变化值少于约 20%、 19%、 18%、 17%、 16%、 15%、 14%、 13%、 12%、 10%、 9%、 8%、 7%、 6%、 5%、 4%、 3%、 2%、 1%、 0.5%或 0.1%，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于 40°C 1个月之后，酸性组分电荷变异体的百分比变化值少于约 25%、 24%、 23%、 22%、 21%、 20%、 19%、 18%、 17%、 16%、 15%、 14%、 13%、 12%、 10%、 9%、 8%、 7%、 6%、 5%、 4%、 3%、 2%、 1%、 0.5%或 0.1%，则药物制剂亦可被视为是稳定的。术语“冻干制剂”是指通过液体制剂的冷冻干燥处理得到或能够得到的组合物。优选地，其为具有少于 5%、优选少于 3%水含量的固体组合物。

术语“重构制剂”是指将固体制剂（例如冻干制剂）溶解和 /或悬浮于生理可接受的溶液中得到的液体制剂。

文中使用的术语“室温”是指 15°C至 30°C、优选 20°C至 27°C、更优选 25°C的温度。

“胁迫条件”是指在化学和 /或物理上不利于抗体蛋白的环境，所述环境可以导致不可接受的抗体蛋白失稳定。“高温胁迫”是指，将抗体制剂置于室温或甚至于更高温度（:例如 40°C±2°C）储存一段时间。通过高温胁迫加速试验，可以检查抗体制剂的稳定性。

如本文所使用，术语“肠胃外施用”意指肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射或输注方式，并且包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下（subcuticular）、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射以及输注。在一些实施方案中，本发明的稳定抗 CD47抗体制剂肠胃外施用于受试者。在一个实施方案中，本发明的抗 CD47抗体制剂以皮下、皮内、肌内或静脉内注射方式施用于受试者。

I. 抗体制剂

本发明提供稳定的液体抗体制剂，其包含（i）重组全人源抗 CD47单克隆抗体；（ii）缓冲剂，（iii）稳定剂，和（iv）表面活性剂，所述抗体制剂的 pH为约 5.0-6.0。在一个优选方案中，本发明的液体抗体制剂是注射制剂形式。

（i）抗 CD47抗体

“抗 CD47抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合 CD47分子，以致所述抗体可以用作靶向 CD47分子的治疗剂和 /或预防剂。

本发明的抗体是重组全人源抗体。术语“全人源抗体”或“人抗体”在本文中可以互换使用，指该抗体包括其中构架区和 CDR区二者均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区，而且如果抗体含有恒定区，恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸（例如，通过体外随机或点特异诱变或体内体细胞突变引入的突变）。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不意欲包括其中的 CDR序列衍生自其他哺乳动物物种（如，小鼠）的种系而移植入人构架序列的抗体。如本文所用，术语“重组人抗体”包括所有通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体。这些重组人抗体具有构架区和 CDR区源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，可以对重组人抗体进行体外诱变（或使用人 Ig序列转基因动物时为体内体细胞诱变），由此得到的重组抗体的 VH和 VL 区的氨基酸序列，尽管源自人种系 VH和 VL序列并与之相关、但是并不天然存在于体内的人抗体种系库中。

在一些实施方案中，如通过生物光干涉法测量，所述抗 CD47抗体能够以高的亲和力，例如以 10-⁷M或更小、优选地以 10_⁹ M至 10_^1Q M的 K_D特异性结合人 CD47，并由此介导对 CD47及其配体结合的高效阻断作用。

在一些实施方案中，本发明抗体 CD47抗体包含： SEQ ID NO: 1或与之具有至少 90%同一性的重链可变区（VH）;和 SEQ ID NO: 2或与之具有至少 90%同一性的轻链可变区（VL）。“可变区”或“可变结构域”是抗体的重链或轻链中参与抗体与其抗原的结合的结构域。一般，重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）可以进一步再划分为高变区（HVR，又称作互补决定区（CDR）），其间插有较保守的区域（即，构架区（FR））。每个 VH和 VL由三个 CDR和 4个 FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列： FR1 , CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4。

在一些实施方案中，本发明的抗 CD47抗体包含 SEQ ID NO: 1的重链可变区的 HCDR1、

2和 3序列和 SEQ ID NO : 2的轻链可变区的 LCDR1、 2和 3序列。 “互补决定区”或“CDR 区”或“CDR” （在本文中与超变区“HVR”可以互换使用），是抗体可变区中主要负责与抗原表位结合的氨基酸区域。重链和轻链的 CDR通常被称作 CDR1、 CDR2和 CDR3，从 N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的 CDR被称作 HCDR1、 HCDR2和 HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的 CDR被称作 LCDR1、 LCDR2和 LCDR3。本领域公知多种用于在一个给定的 VH或 VL氨基酸序列中确定其 CDR序列的方案。例如， Kabat互补决定区（CDR）是基于序列变异性确定的并且是最常用的（Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.（1991））。而 Chothia指的是结构环的位置（Chothia和 Lesk， J. Mol. Biol. 196:901-917（1987））。 AbM HVR 是 Kabat HVR和 Chothia结构环之间的折中，并且由 Oxford Molecular的 AbM抗体建模软件使用。“接触性”（Contact） HVR基于对可获得的复杂晶体结构的分析。 HVR也可以基于与参考 CDR序列（例如本文公开的示例性 CDR）具有相同的 Kabat编号位置而确定。

在一个实施方案中，本发明抗体的 CDR通过 Kabat规则确定边界，例如下文表 A（l）所

TF

在一个实施方案中，本发明抗体的 CDR通过结合 Kabat、 AbM、 Chothia及经验性等综合因素确定边界。例如下文表 A（2）所示： HCDR1是在 kabat编号系统中位置 H27-H35的序列， HCDR3是在 kabat编号系统中位置 H93 -H102的序列，以及 HCDR2和 LCDR1、 LCDR2 和 LCDR3通过 Kabat规则确定。

然而，应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的 CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的 CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体 CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体 CDR序列，但是由于应用了不同的方案（例如不同的指派系统规则或组合）而导致其所声称的 CDR边界与本发明所定义的具体 CDR边界不同。

具有不同特异性（即，针对不同抗原的不同结合位点）的抗体具有不同的 CDR。然而，尽管 CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是 CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用 Kabat, Chothia, AbM、 Contact和 North方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是 CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定 CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何 CDR的变体。例如，在一个 CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据 Kabat或 Chothia定义的其余 CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。

表 A

在一些实施方案中，本发明的抗 CD47抗体可以包含与 SEQ ID NO: 1具有至少 90%, 95% 或 98%或更高同一性的重链可变区（VH）; 和 /或与 SEQ ID NO: 2具有至少 90%、 95%或 98% 或更高同一性的轻链可变区（VL）。在本文中， “序列同一性”是指在比较窗中以逐个核苷酸或逐个氨基酸为基础的序列相同的程度。可以通过以下方式计算“序列同一性百分比”：将两条最佳比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基（例如， A、 T、 C、 G、 I）或相同氨基酸残基（例如， Ala、 Pro、 Ser、 Thr、 Gly、 Val、 Leu、 lie、 Phe、 Tyr、 Trp、 Lys、 Arg、 His、 Asp、 Glu、 Asn、 Gin、 Cys 和 Met）的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数（即，窗大小），并且将结果乘以 100，以产生序列同一性百分比。为了确定序列同一性百分数而进行的最佳比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如 BLAST、 BLAST-2、 ALIGN 或 Megalign （DNASTAR）软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。

在一些实施方案中，本发明抗体的 VH序列与 SEQ ID NO : 1相比具有不超过 10个，优选地不超过 5个、 4个或 3个不同残基，优选地所述不同残基为保守氨基酸替代。在一些实施方案中，本发明抗体的 VL序列与 SEQ ID NO: 2相比具有不超过 10个，优选地不超过 5 个、 4个或 3个不同残基，优选地所述不同残基为保守氨基酸替代。“保守性取代”是指导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸的氨基酸改变。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。在本发明任一实施方案中，在一个优选的方面，保守取代残基来自以下的保守替代表 X，优选地为表 X中所示优选置换残基。

表 X

在一些实施方案中，本发明的抗体是 IgG4形式的抗体。 “IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属于的 IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如， IgG4形式的抗体是指其重链恒定区 Ig结构域为 IgG4的 Ig结构域。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗 CD47抗体是中国申请 CN201710759828.9 （2017 年 8月 29）中公开的抗 CD47单克隆抗体 ADI-26630, 其具有 SEQ ID NO:9的重链和 SEQ ID NO: 10的轻链。在一个实施方案中，该抗 CD47抗体是由 CHO细胞重组表达产生并经纯化的 IgG4型抗体。优选地，在本发明液体制剂中所述抗体表现出显著的抗肿瘤活性。例如，在移植人源伯基特氏淋巴瘤细胞的小鼠肿瘤模型中，例如腹腔注射 5 mg/kg，两天一次连续两周，该抗体可以导致肿瘤生长抑制率达到约 50%或更高，例如 100% ; 和 /或肿瘤消失率达到 60% 以上。本发明的抗体制剂中所包含的抗体或其抗原结合片段的量可随着制剂的特定目的特性、特定环境、和使用制剂的特定目的而改变。在一些实施方案中，抗体制剂为液体制剂，其可含有约 1-150 mg/mL, 优选地为约 10-100 mg/mL, 例如，约 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60 mg/mL抗 CD47抗体。在一个实施方案中，本发明涉及具有高浓度的抗 CD47抗体的制剂，例如，含有 50-150 mg/mL的抗 CD47抗体。本领域已知这样的高浓度抗体制剂可以在注射前进行稀释，例如，如果特定的治疗性或预防性干预需要较低的抗体浓度或者当治疗包括儿童的较小体重患者时。适合的浓度可以是 25 mg/mL或 10 mg/mL。备选地，可以以这样的低浓度生产原始制剂。

(ii) 缓冲剂

缓冲剂是可以将溶液的 pH维持在可接受范围的试剂。在一些实施方案中，用于本发明制剂中的缓冲剂可以将本发明制剂的 pH控制在大约 5.0-6.0的 pH范围，例如约 5.2-5.8的 pH，优选地 5.3-5.7的 pH。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体制剂具有约 5.0、 5.2、 5.4、 5.5， 5.6， 5.7, 5.8, 5.9或 6.0的 pH，优选地约 5.5的 pH。优选地，用于本发明的缓冲剂是组氨酸缓冲剂，例如由组氨酸和盐酸组氨酸组成的缓冲体系。

在一个实施方案中，本发明的抗体制剂中缓冲剂的浓度为约 5-100mM，优选地为约 10-50mM，例如，约 10-20 mM。优选地，缓冲剂为约 10-20mM的组氨酸缓冲剂。

(iii) . 稳定剂

用于本发明的合适的稳定剂可以选自糖、多元醇和氨基酸及其组合。对于作为稳定剂的糖包括但不限于蔗糖和海藻糖。对于作为稳定剂的多元醇包括但不限于山梨醇。对于作为稳定剂的氨基酸包括但不限于精氨酸。

在一个实施方案中，本发明液体制剂包含蔗糖作为稳定剂。蔗糖在本发明液体制剂中的量可以是约 50-100mg/ml, 优选地 70-90mg/ml, 例如 80mg/ml。

在一个实施方案中，本发明液体制剂包含海藻糖作为稳定剂。海藻糖在本发明液体制剂中的量可以是约 50-100mg/ml, 优选地 70-90mg/ml, 例如 80mg/ml。

在一个实施方案中，本发明液体制剂包含精氨酸作为稳定剂。精氨酸在本发明液体制剂中的量可以是约 80-1 10mM，尤其是约 100mM，例如约 21.1 mg/ml盐酸精氨酸。

在一个实施方案中，本发明液体制剂包含山梨醇作为稳定剂。山梨醇在本发明液体制剂中的量可以是约 10-100mg/ml，优选地 20-70mg/ml, 例如 30-60mg/ml。例如，山梨醇可以以约 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65或 70mg/ml的量存在，优选地以约 40mg/ml的量存在。

在一个实施方案中，本发明液体制剂包含山梨醇和精氨酸的组合作为稳定剂。该组合中，山梨醇可以以约 5-60mg/ml，优选地 10-30mg/ml, 例如 10-20mg/ml 的量存在，例如可以为 5, 10, 12, 15, 17, 20, 22, 25mg/ml。在该组合中，精氨酸可以以约 80-1 10mM, 尤其是约 lOOmM 的量存在。优选地，本发明液体制剂包含约 10-20mg/ml的山梨醇和约 10-30mg/ml的盐酸精氨酸。更优选地，本发明液体制剂包含约 15mg/ml的山梨醇和约 21.1mg/ml的盐酸精氨酸。

(iv) . 表面活性剂

如本文所使用的，术语“表面活性剂”是指具有两亲结构的有机物质；即，它们由相反的溶解性倾向的基团所组成，通常是油溶性的经链和水溶性的离子基团。在一个实施方案中，本发明的液体制剂中的表面活性剂是非离子型表面活性剂，例如，烷基聚（环氧乙烯）。可包括在本发明制剂中的特定非离子型表面活性剂包括，例如聚山梨酯，诸如聚山梨酯 -20、聚山梨酯 -80、聚山梨酯 -60、或聚山梨酯 -40 ; 普洛尼克等。在一个优选实施方案中，本发明的液体制剂中包含聚山梨酯 -20作为表面活性剂。

本发明抗体制剂中所含的表面活性剂的量可随制剂的特定目的特性、特定环境、和使用制剂的特定目的而改变。在优选的一些实施方案中，制剂可含有约 0.01-5 mg/ml, 优选地为约 0.1-2 mg/ml，例如约 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1.0 mg/ml的聚山梨酯 -20，优选地约 0.3mg/ml的聚山梨酯 -20。

Cv）其它赋形剂

本发明的抗体液体制剂中可以包含或不包含其它赋形剂。在一个实施方案中，本发明的抗体液体制剂包含 EDTA或其盐。在另一实施方案中，本发明的抗体液体制剂不包含 EDTA 或其盐。在一个实施方案中，添加 EDTA或其盐的本发明抗体液体制剂，与不添加 EDTA或其盐的相应制剂相比，具有相当的稳定性。

出于其他考虑，也可在本发明制剂中使用其它的赋形剂。所述赋形剂包括，例如，调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗静电剂、抗氧化剂、明股等等。这些和另外已知的药物赋形剂和 /或适用于本发明制剂的添加剂是本领域公知的，例如，列出于“The Handbook of Pharmaceutical Excipients，第 4版， Rowe等人编， American Pharmaceuticals Association（2003）；和 Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 第 21版， Gennaro编， Lippincott Williams & Wilkins（2005）’’。

II. 制剂的制备

本发明提供包含抗体的稳定制剂。在本发明制剂中使用的抗体可以使用本领域已知的用于生产抗体的技术进行制备。例如，可以重组制备抗体。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体在 CHO细胞中重组制备。

抗体作为药物的活性成分的应用现在已经很广泛。用于将治疗性抗体纯化至药用级的技术是本领域公口的。例 4 Tugcu 等（Maximizing productivity of chromatography steps for purification of monoclonal antibodies, Biotechnology and Bioengineering 99（2008） 599-613.）描述在蛋白 A捕获步骤后使用离子交换色谱（阴离子 IEX和 /或阳离子 CEX色谱）的单克隆抗体三柱纯化方法。 Kelley 等（Weak partitioning chromatography for anion exchange purification of monoclonal antibodies, Biotechnology and Bioengineering 101 （2008） 553-566）描述了两柱纯化法，其中在蛋白 A亲和色谱后使用弱分配阴离子交换树脂。

一般，重组产生的单克隆抗体可以利用常规的纯化方法纯化，以提供具有足够的可重复性和适度纯度的药物物质用于抗体制剂的配制。例如，在抗体从重组表达细胞分泌至培养基中后，可以使用商业可得的蛋白浓缩过滤器例如 Amicon 的超滤装置，浓缩来自该表达系统的上清液。之后，可以使用例如色谱、透析和亲和纯化等方式进行抗体的纯化。蛋白 A适应于作为亲和配体用于纯化 IgGl,IgG2和 IgG4型抗体。也可以使用其它抗体纯化方法，例如离子交换色谱。在获得足够纯度的抗体后，可以按照本领域已知的方法，制备包含抗体的制剂。

例如，可以采用如下步骤进行制备：（ 1）在发酵结束后将发酵液离心澄清去除细胞等杂质以获得上清;（2）使用亲和层析（例如对 IgGl, IgG2和 IgG4型抗体具有特异亲和力的蛋白 A柱）捕获抗体；（3）进行病毒灭活；（4）精制纯化（一般可以采用 CEX 阳离子交换层析），以去除蛋白中的杂质；（4）病毒过滤（使病毒滴度降低例如 4 1ogl0以上）；（5）超滤 /渗滤（可以用于将蛋白置换于利于其稳定的制剂缓冲液中并浓缩至合适的浓度供注射用）。参见例如， B. Minow, P. Rogge, K. Thompson, BioProcess International, Vol. 10, No. 6, 2012, pp. 48-57。 III. 制剂的分析方法

在抗体制剂的储存过程中，抗体可能会发生聚集、降解或化学修饰，导致抗体异质性 (包括大小异质性和电荷异质性) 以及聚集物和片段等，从而影响抗体制剂的质量。因此，有必要进行抗体制剂稳定性的监测。在本领域中已知多种方法可以用于检测抗体制剂的稳定性。例如，可以通过非还原型 CE-SDS和 SEC-HPLC等方法，分析抗体制剂的纯度和评估抗体的聚集水平；可以通过毛细管等电聚焦电泳 (cIEF)、成像毛细管等电聚焦电泳 (iCIEF)和离子交换色谱 (IEX) 等，分析抗体制剂中的电荷变异体。此外，可以通过目视检测制剂外观，快速地判断制剂的稳定性。也可以使用 OD350nm 法检测制剂的浊度改变，该方法可以给出有关可溶性和不溶性聚集物量的信息。此外，可以使用紫外分光光度法 (UV法)检测制剂中的蛋白质含量变化。

非还原型 CE-SDS 法是一种以毛细管为分离通道进行的单克隆抗体纯度测定方法。在 CE-SDS中，蛋白迁移由 SDS结合引起的表面电荷来驱动，而该表面电荷与蛋白质的分子量成正比。由于所有的 SDS-蛋白质复合物都具有相似的质量-电荷比，故可以在毛细管的分子筛凝胶基质中，实现基于分子的大小或流体动力学半径的电泳分离。该方法已经被广泛地用于监测变性的完整抗体的纯度。一般，在非还原 CE-SDS法中，供试样品与 SDS样品缓冲液和碘乙酰胺混合。之后，混合物可以于 68-72°C孵育约 10-15分钟，冷却至室温后离心的上清液用于分析。采用紫外检测器检测蛋白的迁移，获得电泳谱图。抗体制剂纯度可以计算为 IgG 主峰的峰面积占所有峰面积之和的百分比。关于 CE-SDS 法的进一步描述，可以参见例如 Richard R.等， Application of CE SDS gel in development of biopharmaceutical antibody-based products, Electrophoresis, 2008, 29, 3612-3620。

尺寸排阻高效液相色谱法，即 SEC-HPLC法，是用于单克隆抗体标准和质控的另一重要方法。该方法主要依据分子的尺寸大小或流体动力学半径差异来进行分子的分离。通过 SEC-HPLC,抗体可以分离出三种主要形式：高分子量形式 (HMMS)、主峰 (主要是抗体单体)、和低分子量形式 (LMMS ) 。抗体纯度可以计算为色谱图上主峰面积占所有峰面积之和的百分比。通过 SEC-HPLC法，可以测量制剂产品中抗体单体的百分数，给出可溶性聚集物和剪切物的含量信息。关于 SEC-HPLC 法的进一步描述，可以参见例如， J. Pharm. Scien., 83 : 1645-1650, (1994); Pharm. Res., 1 1 :485 (1994); J. Pharm. Bio. Anal., 15 : 1928 (1997); J. Pharm. Bio. Anal., 14: 1 133-1 140 (I⁹⁸⁶)。此外，也可以 4见例如， R. Yang等， High resolution separation of recombinant monoclonal antibodies by size exclusion ultra-high performance liquid chromatography (SE-UHPLC), Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (2015), http://dx.doi.Org/10.1016/i .ipba.2015.02.032 : 和 Alexandre Goyon 等， Protocols for the analytical characterization of therapeutic monoclonal antibodies. I- Non-denaturing chromatographic techniques, Journal of Chromatography ， http://dx.doi.Org/10.1016/j .jchromb.2017.05.010。

成像毛细管等电聚焦电泳 (iCIEF)可以用于分析单克隆抗体的电荷异质性。该方法可以提供电荷变异体的定量分布情况。 iCIEF基于分子在 pH梯度中的电荷差异 (表观 pi值)来实现分子分离的目的。在 iCIEF中，分离柱通常是短毛细管 (例如， 5cm长 , 100pm内径的二氧化硅毛细管)，蛋白质在高电压下在毛细管柱中聚焦，并通过在 280nM 操作的全柱成像检测系统对聚焦进行实时在线监测。该技术的一个优点是，可以通过该全柱检测系统同时记录抗体样品的各种电荷变异体。一般而言，在 icIEF中，将样品与尿素和 icIEF缓冲液混合，其中所述缓冲液含有甲基纤维素、 pi分子量标准和 ampholytes _c 然后，可以在 iCIEF分析仪例如 iCE280 分析仪 (Protein Simple, Santa Clara, CA)上，使用 iCIEF柱例如 ProtionSimple组装的 iCIEF柱，在样品聚焦一定时间后，测定 280nm的吸光度，获得聚焦 mAb电荷变异体的谱图。在 iCEIF 谱图中，在主峰 (即主成分)之前洗脱的蛋白相关峰被分类为酸性组分；相对地，在主峰之后洗脱的蛋白相关峰被分类为碱性组分。主成分、酸性组分和碱性组分的相对量可以表示为占总峰面积的百分数。关于 iCIEF的进一步描述，可以参见例如， Salas-Solano 0等, Robustness of iCIEF methodology for the analysis of monoclonal antibodies: an interlaboratory study, J Sep Sci. 2012 Nov;35（22）:3124-9. doi: 10.1002/jssc.201200633. Epub 2012 Oct 15;和 Dada 00 等， Characterization of acidic and basic variants of IgGl therapeutic monoclonal antibodies based on non-denaturing IEF fractionation, Electrophoresis. 2015 Nov;36（21-22）:2695-2702. doi:

10.1002/elps.201500219. Epub 2015 Sep 18.

也可以通过阳离子交换高效液相色谱法（CEX-HPLC）测定抗体制剂中抗体的电荷变异体。在该测定法中，以比主峰的保留时间更早从 CEX-HPLC柱洗脱出的峰被标记为“酸性峰”，而那些以比主峰的保留时间更晚从 CEX-HPLC柱洗脱出的峰被标记为“碱性峰”。

加速稳定性研究可以用于检查产品的稳定性性质，有利于筛选稳定药物制剂形式。例如，可以将制剂样品放置于升高的温度，例如约 40°C±2°C_^ 25°C±2°C条件下进行加速稳定性研究。检测指标可以包括外观、可见异物、蛋白含量、浊度、纯度（SEC-HPLC法、非还原型 CE-SDS 法）和电荷变异体（iCIEF法）。

可以进行振荡试验，考察制剂的振荡 /剪切稳定性。例如，将制剂样品分装至西林瓶，加塞轧盖后放样，进行振荡试验，例如 650 r/min振荡 3-5天，之后检测制剂的外观、蛋白含量、

；虫度和纯度。

此外，可以检测抗体的功效或生物活性。例如，可以检测制剂中抗体与其抗原的结合能力。本领域技术人员已知多种方法可以用于定量抗体与抗原的特异性结合，例如免疫测定试验， ELISA等。

本发明的抗 CD47抗体制剂是稳定的。在一个实施方案中，于约 25°C、 37°C、 40°C、或 45°C储存至少 1个月或 2个月后，例如，在 40°C±2°C储存 1个月后，本发明的抗体制剂中的抗 CD47抗体纯度是至少 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、或 99% 以上，如通过尺寸排阻色谱法或通过非还原型 CS-SDS所测定。在一个实施方案中，于约 25°C、 n°C、 40°C、或 45°C储存至少 1个月或 2个月后，例如，在 40°C±2°C储存 1个月后，本发明的抗体制剂中抗 CD47抗体的至少 50%, 优选至少 55%是非碱性及非酸性形式（亦即，主峰或主要电荷形式），如通过成像毛细管聚焦电泳法所测定。

IV. 制剂的用途

本发明的包含抗 CD47 抗体的本发明的抗体制剂可以用于治疗、改善或预防多种 CD47 相关疾病或病症。“CD47相关疾病或病症”在本文中指可以用本发明抗 CD47抗体进行治疗（例如改善）或预防的疾病或病症。任何可以得益于本发明抗体治疗的疾病或病症都适用于本发明。

CD47是一个多能分子，在肿瘤细胞逃避免疫监视过程中扮演重要角色。阻断 CD47信号通路能够有效激发巨噬细胞对肿瘤细胞的呑噬作用，从而用于肿瘤免疫治疗。因此，包含抗 CD47抗体的本发明制剂尤其可用于治疗、改善或预防 CD47相关癌症。所述癌症包括例如但不限于：各种血液肿瘤和实体瘤，例如白血病，包括急性籁样白血病， B 淋巴细胞慢性白血病和急性淋巴细胞白血病；非霍奇金淋巴瘤；骨籁瘤；平滑肌肉瘤；星形细胞瘤；乳腺癌；卵巢癌；胶质母细胞瘤。参见例如，国际肿瘤学杂志， 2013年 11月 40卷第 11期， 817-819 页。在一些实施方案中，本发明的抗体制剂用于治疗、改善或预防与 CD47相关的淋巴瘤，例如伯基特淋巴瘤。

本发明也提供本发明的制剂在制备药物中的用途，其中所述药物用于向哺乳动物递送抗 CD47抗体，或用于治疗、预防或改善上述疾病和病症中的一种或多种。优选地，哺乳动物是人。

可以以多种途径将本发明的抗体制剂施用于受试者或患者。例如，施用可以通过输注或通过注射器进行。因此，在一个方面，本发明提供了一种递送装置（例如注射器），其包括本发明的抗体制剂（例如，预填装注射器）。患者将接受有效量的抗 CD47抗体作为主要活性成分，即足以治疗、改善或预防目的疾病或病症的量。

治疗效果可包括减少生理症状。用于任何特定受试者的抗体的最佳有效量和浓度将取决于多种因素，包括患者的年龄、体重、健康状况和 /或性别、疾病的性质和程度、特定抗体的活性，身体对其清除率，并且也包括与所述抗体制剂组合施用的任何可能的其它治疗。对于具体的情况，所递送的有效量可以在临床医师的判断范围内来确定。取决于待治疗的适应症，有效剂量可为约 0.005 mg/kg体重至约 50 mg/kg体重，或约 0.1 mg/kg体重至约 20 mg/kg体重。在这方面，已知的基于抗体的药物的应用可以提供一定的指导。剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。实施例

为了开发出重组全人源抗分化抗原簇 47（CD47）单克隆抗体注射液长期稳定储存的制剂处方，确保产品在有效期内（至少 24个月）的质量可控，设计了处方前和处方筛选两个阶段的试验。试验所用材料和方法如下：材料和方法

1.1.制剂研究中使用的化学品

名称级别产地及品牌货号符合标准

组氨酸药用级德国 Merck 1.04352.1000 Ph Eur、 JP、 USP

盐酸组氨酸药用级德国 Merck 1.04354.0500 Ph Eur、 BP、 JP

盐酸精氨酸药用级德国 Merck 1.01544.1000 Ph Eur、 BP、 JP、 USP

山梨醇药用级法国罗盖特 H20110265 Ch.P、 Ph Eur、 USP

海藻糖药用级美国 Pfanstiehl T-104-4 USP/NF、 EP、 JP

蔗糖药用级德国 Merck 1.00892.9050 Ph Eur、 USP

聚山梨酯 20 药用级德国 Merck 8.17072.1000 Ph Eur、 JPE、 NF

盐酸药用级德国 Merck 1.00314.2508 Ph Eur、 BP, JP, NF

1 2 使用的仪器设备

设备名称产地及品牌型号

多通道微量分光光度计美国 Thermo Nanodrop 8000

澄明度检测仪天津天大天发 YB-2

紫外分光光度计曰本岛津 UV-1800

SEC-HPLC分析仪美国 Waters 2695

非还原型 CE-SDS分析仪美国 Caliper Labchip GX Touch HT

icIEF分析仪美国 Protein simple Maurice

1.3 . 制剂稳定性的检测项目和检测方法

对抗体制剂检测了以下项目：（1）检测外观以及是否存在可见异物；（2）通过紫外法（UV法）测定制剂中的蛋白质含量；（3）通过 OD350nm法检测制剂的浊度；（4）通过尺寸排阻高效液相色谱法（SEC-HPLC）测定抗体制剂的纯度，表示为主峰的面积占所有峰面积之和的百分数；（5）通过非还原型十二烷基硫酸钠毛细管电泳（非还原型 CE-SDS）测定抗体制剂的纯度，表示为主峰的面积占所有峰面积之和的百分数；（6）通过成像毛细管等电聚焦电泳法（icIEF法；）测定抗体制剂中电荷变异体，表示为主成分、酸性组分和碱性组分的百分数。蛋白含量测定

使用紫外分光光度计（日本岛津生产，型号 UV- 1800）测定样品中的蛋白质含量。

浊度测定

使用多通道微量分光光度计（美国 Thermo生产，型号 Nanodrop8000）,测定样品在 350nm 的吸光度，确定样品浊度。

可见异物检测

按照国家药典委员会，中华人民共和国药典（2015年版，四部通则 0904“可见异物检查法”） .北京:中国医药科技出版社. 2015中所记载的方法，采用澄明度检测仪（天津天大天发生产，型号 YB-2），检查样品中的可见异物。

尺寸排阻高效液相色谱法（SEC-HPLC）法

在用于分析抗体制剂的 SEC-HPLC法中，可以使用以下参数：

色谱柱： TSK-gel SuperSW mAb HR （7.8x300 mm, 4（j,m）型分析柱， TSK-gel SuperSW （6.0x40 mm, 4（j,m）保护柱

流动相： 20 mmol/L磷酸缓冲液 + 200 mmol/L NaCl, pH6.8

流速： 0.5 ml/min

柱温度： 25°C

检测波长： 280 nm

进样体积： 50 [j]

进样盘温度：约 10°C

运行时间： 30分钟

上样浓度： 2.0 mg/mL

非还原型十二烷基硫酸钠毛细管电泳（CE-SDS）法

可以按如下进行非还原型 CE-SDS测定：将大约的样品（蛋白含量： lmg/ml）加入 14 ul 非还原型样品 Buffer （包括取 700 ul pH 6.5样品缓冲液，加入 31.3 ul 250mM NEM（N-乙基顺丁烯二酰亚胺）），再加 28 ul超纯水，混匀，之后在 70°C孵育 10分钟。孵育后，样品冷却至室温，然后转移至 96孔板中。 CE-SDS分离在 LabChip GXIITouch（PerkinElmer）上进行，使用 Protein芯片。分析方法选择 HT Antibody Analysis 200，样品盘类型选择 BioRad 96 HSP-96xx （Sip 4 mm）通过焚光监测蛋白迁移。

成像毛细管等电聚焦电泳法（icIEF法）

可以如下进行 icIEF检测：将抗体样品稀释（或脱盐）至大约 lmg/ml。取 20（J样品加入 780 icIEF缓冲液，所述缓冲液含有尿素、精氨酸（Protein Simple）、 pi marker标准（Protein Simple, Santa Clara, CA）和 Pharmalytes（GE Healthcare Bio-Science, Pittsburgh, PA）。在 Maurice C.分析仪（Protein Simple, Santa Clara, CA）上，使用 FC涂层 iCIEF柱，产生成像毛细管等电聚焦谱图。样品聚焦总共 8分钟，使用 Empower 版本 3软件（Waters, Milford, MA），对 280nm聚焦蛋白的吸光度进行积分。实施例 1. 制备和纯化抗 CD47抗体

根据 CN201710759828.9所述制备和纯化了抗 CD47抗体 ADI-26630。该抗体由 SEQ ID NO : 9的重链序列和 SEQ ID NO: 10的轻链序列组成，为 IgG4型抗体。简言之，抗体在 CHO 细胞中重组表达并进行纯化。对于用于处方前试验的样品，通过 CEX（阳离子交换色谱）纯化，样品具有 12.2mg/ml的蛋白含量。对于用于处方筛选试验的样品，通过 CEX（阳离子交换色谱）纯化获得 15.7mg/ml的蛋白含量后，通过渗滤浓缩至 100mg/ml。实施例 2. 处方前试验

2.1. pH影响试验

2.1.1 pH影响试验步骤

配制 10 mM组氨酸， 5%山梨醇缓冲液，分别将 pH调节为 5.0、 5.5、 6.0和 6.5。用配制完成的各个 pH缓冲液分别对小试样品进行超滤置换。置换完成后，将各样品的浓度稀释至 20 mg/ml _c 过滤分装至西林瓶，加塞轧盖后放样，进行 40°C加速稳定性试验。具体试验方案见表 1。

_ 表 1. pH影响试验具体方案 _

样品名称批号试验条件取样点检测项目

pH5.0 20170527-01 外观、蛋白含量、浊度 pH5.5 20170527-02 0天、 1周、 2周、和纯度（SEC-HPLC pH

6.0 20170527-05 1月取样非还原型 CE-SDS pH6.5 20170527-06

注：上述时间点取样后均先放入超低温冰箱中冻存待检，按需要化冻送检。

2.1.2 判断标准

根据对产品的认识以及仪器和方法的精密度，设定了样品检测指标数值与初始值相比质量未发生变化的判定标准，用以判断样品是否发生了变化，具体见表 2。

_ 表 2. 产品质量未发生变化的判断标准 _

检测项目未发生变化的判定标准

外观澄明、无色或微黄色液体，无异物，无絮状物及沉淀蛋白含量（UV法）变化率 $10%

油度（ OD35Q nm法）变化率 $10%

纯度（SEC-HPLC法）主峰纯度变化值％

纯度（非还原型 CE-SDS法）主峰纯度变化值

2.1.3 pH影响试验结果

（1）外观

在 40°C±2°C的条件下放置 1月，各组样品外观均合格。

（2）蛋白含量

在 40°C±2°C条件下，各组样品的蛋白含量均未发生变化（见表 3）。

表 3. pH影响试验蛋白含量结果（UV法， mg/ml）

40°C±2°C

样品名称 0天

1周 2周 1月

pH5.0 18.8 18.5 18.8 18.7 pH5.5 20.4 20.6 21.0 20.9 pH6.0 21.4 21.3 21.3 21.3 pH6.5 _ 209 _ 207 21.1 21.1

(3 ) 浊度

在 40°C±2°C条件下，各组样品的浊度均升高，且 pH越高，变化速率越快（见表 4、图 1）。表 4. pH影响试验浊度结果（OD_350nm法） 40°C±2°C

样品名称 0天

1周 2周 1月

pH5.0 0.043 0.043 0.047 0.052 pH5.5 0.056 0.061 0.067 0.077 pH6.0 0.065 0.073 0.078 0.101 pH6.5 0.063 0.075 0.088 0.102

（4）纯度

纯度（SEC-HPLC法）： 40°C±2°C条件下加速 1个月， pH5.0、 pH5.5、 pH6.0各样品的纯度均未发生明显变化， pH6.5条件下，样品纯度下降，变化原因主要是在加速后发生聚集。且随着 pH升高，样品初始纯度有降低趋势。（见表 5、图 2〜图 3）。

表 5. pH影响试验纯度结果（ SEC-HPLC法）

40°C±2°C

样品名称 0天

1周 2周 1月 pH5.0 99.0 99.1 99.0 98.6 pH5.5 98.7 98.9 98.6 98.3 pH6.0 98.5 98.4 98.0 97.9 pH6.5 98.3 97.8 97.4 96.9 纯度（非还原型 CE-SDS法）： 40°C±2°C条件下加速 1个月，各 pH条件下样品的纯度均未发生明显变化。（见表 6）。

表 6. pH影响试验纯度结果（非还原型 CE-SDS法）

40°C±2°C

样品名称 0天

1周 2周 1月 pH5.0 98.8 N/A N/A 98.6 pH5.5 99.0 N/A N/A 98.1 pH6.0 99.0 N/A N/A 98.5 pH6.5 98.9 N/A N/A 97.7 注： N/A表示未检测或不适用，下同。

pH影响试验结果表明随着 pH升高，样品浊度变化速率越快； pH6.5时，样品纯度降低，发生聚集。综合以上结果， pH 5.0〜 6.0间产品稳定性良好。

2.2. 表面活性剂影响试验

2.2.1 表面活性剂影响试验步骤

配制 10 mM组氨酸， 5%山梨醇， pH6.0缓冲液，超滤置换小试样品，浓度稀释至 20 mg/ml 后，分别不添加聚山梨酯 20以及加入终浓度为 0.3 mg/ml聚山梨酯 20。过滤分装至西林瓶，加塞轧盖后放样，进行振荡试验。检测项目包括外观、蛋白含量、浊度和纯度（SEC-HPLC 法、非还原型 CE-SDS法）。具体试验方案见表 7。

_ 表 7. 表面活性剂筛选试验方案 _

样品名称批号试验条件及取样点

不添加聚山梨酿 20170527-03 振荡试验： 25°C、 650 r/min、避光，于第 0、 3、 5天添加聚山梨酯 20 20170619 取样

2.2.2 判断标准

见 2 1.2节。

2.2.3 表面活性剂影响试验结果

650 r/min振荡 3天，不添加聚山梨酯 20的样品发生混浊，其他检测项目均不再进行检测；添加 0.3 mg/ml聚山梨酯 20样品振荡 5天各检测结果均无变化，表明聚山梨酯 20能够保证制剂具有良好的振荡稳定性。具体结果见表 8。

表 8. 表面活性剂影响试验检测结果

检测项不添加聚山梨酯 20 添加聚山梨酯 20

0天 3天 5天 0天 3天 5天外观合格混油混油合格合格合格可见异物合格 N/A N/A 合格合格合格蛋白含量（UV法， mg/ml） N/A N/A N/A 20.8 21.1 20.8 浊度（OD350 nm 法） N/A N/A N/A 0.062 0.066 0.067 纯度（SEC-HPLC , %） N/A N/A N/A 98.2 98.3 98.3 纯度（非还原型 CE-SDS法，％） N/A N/A N/A 99.4 N/A 99.4

综合处方前研究结果，将制剂处方定为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系，选定 pH为 5.5 , 表面活性剂为聚山梨酿 20，在此基础上进行接下来的处方筛选试验。

实施例 3. 处方筛选试验

3.1 稳定剂筛选试验

3.1.1 稳定剂筛选试验步骤

共设计了 4个处方，详细处方信息见表 9。按照表 9配制各个处方的缓冲液，将抗体蛋白超滤置换到各自的处方溶液中。置换完成后，将各处方蛋白浓度稀释至约 120 mg/ml，并加入聚山梨酯 20,使终浓度为 0.3 mg/ml。过滤分装至西林瓶，加塞轧盖后在 40^oC±2°C_^ 25^oC±2°C 条件下进行加速稳定性考察。检测指标为外观、可见异物、蛋白含量、浊度、纯度（SEC-HPLC 法、非还原型 CE-SDS法）和电荷变异体（iCIEF法）。

表 9. 稳定剂筛选试验备选处方信息表

序号处方信息

处方 1 0.4 mg/ml组氨酸， 1.5 mg/ml盐酸组氨酸， 40 mg/ml山梨醇， 0.3 mg/ml聚山梨醋 20, pH5.5 处方 2 0.4 mg/ml组氨酸， 1.5 mg/ml盐酸组氨酸， 80 mg/ml蔑糖， 0.3 mg/ml聚山梨醋 20, pH5.5 处方 3 0.4 mg/ml组氨酸， 1.5 mg/ml盐酸组氨酸， 80 mg/ml海藻糖， 0.3 mg/ml聚山梨 S旨 20, pH5.5 处方 4 0.4 mg/ml组氨酸， 1.5 mg/ml盐酸组氨酸， 21.1 mg/ml盐酸精氨酸， 0.3 mg/ml聚山梨醋 20, pH5.5 详细试验条件及取样计划见表 10。

_ 表 10 试验条件及取样表 _

试验名称试验方案及取样点

40°C加速试验 ^~~ 40°C±2°C条件下放置，于 0天、 1周、 2周和 1个月取样

25°C加速试验 25°C±2°C条件下放置，于 0天、 1个月和 2个月取样

3.1.2 判定标准

根据对产品的认识以及仪器和方法的精密度，设定了样品检测指标数值与初始值相比质量未发生变化的判定标准，用以判断样品是否发生了变化，具体见表 1 1。

表 1 1. 质量未发生变化的判定标准

检测指标未发生变化的标准

外观澄明、无色或微黄色液体，无异物，无絮状物及沉淀可见异物符合《中华人民共和国药典》（2015年版，四部）通则 0904 蛋白含量（UV法）变化率 $10%

油度（ OD35G nm法）变化值 $0.02 检测指标未发生变化的标准

纯度（SEC-HPLC法）主峰纯度变化值 $1%

纯度（非还原型 CE-SDS法）主峰纯度变化值 $2%

电荷变异体（iCIEF法）各组分（即主成分、酸性组分及碱性组分）变化值 $2%

3.1.3 稳定剂筛选试验结果

（1）外观、可见异物

在 40°C±2°C的条件下观察至 1个月， 25°C±2°C条件下观察至 2个月，四组处方外观、可见异物均合格。

（2）蛋白含量

在 40°C±2°C和 25°C±2°C条件下， 4组处方的蛋白含量均未发生变化（见表 12）。

表 12. 稳定剂筛选试验蛋白含量结果（UV法， mg/ml）

40°C±2°C 25°C±2°C 样品名称 0天

1周 2周 1月 1月 2月处方 1 120.0 120.0 123.9 123.4 126.0 1 17.1 处方 2 120.8 124.4 1 19.7 1 18.1 1 19.4 1 15.8 处方 3 120.5 125.5 121.3 126.0 126.0 1 18.4 处方 4 120.2 125.0 125.7 127.8 125.7 120.8

（3）纯度

纯度（SEC-HPL C法）： 40°C±2°C条件下 1个月，处方 1 （山梨醇）纯度未发生明显变化，其余处方均超出了拟定的判断标准，主要表现为聚体增多，但增长幅度均 < 2% ; 在 25°C±2°C条件下，各处方纯度没有发生明显变化。详见表 13、图 4。

表 13. 稳定剂筛选试验纯度结果（SEC-HPLC法，％）

40°C±2°C 25°C±2°C 样品名称 0天

1周 2周 1月 1 n_ ₂ n 处方 1 98.0 97.8 97.8 97.9 97.8 97.7 处方 2 98.2 98.1 98.0 97.1 97.7 98.0 处方 3 98.3 97.7 97.8 97.2 97.7 97.9 处方 4 98.4 98.3 98.4 96.8 98.2 98.2 纯度（非还原型 CE-SDS法）： 40°C±2°C条件下，各处方纯度均有下降趋势，处方间无差异； 25°C±2°C条件下，各处方纯度没有发生明显变化。详见表 14、图 5。

表 14. 稳定剂筛选试验纯度结果（非还原型 CE-SDS法，％）

40°C±2°C 25°C±2°C 样品名称 0天

1周 _ ₂ M _ _\_ n_ 1月 2月处方 1 98.9 N/A 98.0 97.4 99.1 98.7 处方 2 98.9 N/A 98.2 97.1 99.1 98.9 处方 3 99.1 N/A 98.2 97.4 99.1 98.9 处方 4 99.2 N/A 98.2 97.1 99.1 98.9

（4）电荷变异体

40°C±2°C和 25°C±2°C条件下，各处方电荷变异体-酸性组分和主成分均发生明显变化，碱性组分变化较小，各处方间趋势一致，无明显差异，且变化幅度均可接受。（见表 15、图 6~7）表 15. 稳定剂筛选试验电荷变异体结果（iCIEF法，％）

40°C±2°C 25°C±2°C 组分样品名称 0天

1周 2周_ 1 ^ 1月 2月处方 1 29.8 N/A 37.9 42.8 32.1 34.4 处方 2 30.3 N/A 36.9 46.2 30.3 33.7 酸性组分

处方 3 30.0 N/A 36.3 44.8 31.5 32.9 处方 4 29.2 N/A 36.0 46.3 30.8 32.1 处方 1 68.0 N/A 58.3 52.8 65.0 62.5 处方 2 67.5 N/A 59.3 49.7 66.7 63.2 主成分

处方 3 67.7 N/A 60.0 51.3 65.8 64.2 处方 4 68.4 N/A 60.2 50.1 66.4 65.0 处方 1 2.3 N/A 3.8 4.3 2.9 3.1 处方 2 2.3 N/A 3.7 4.1 2.9 3.1 碱性组分

处方 3 2.4 N/A 3.7 3.9 2.7 2.9 处方 4 2.4 N/A 3.8 3.7 2.8 2.9 从纯度（SEC-HPLC法）的检测结果看，山梨醇有优势，能够更有效抑制蛋白在 40°C高温下聚体的产生，其他检测项无明显差别；考虑到有文献报道精氨酸能降低高浓度蛋白产品 6勺枯度（Borwankar A U, Dear B J, Twu A, et al. Viscosity reduction of a concentrated monoclonal antibody with arginine HC1 and arginine glutamate [J]. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2016, 55（43）: 11225-11234.），故选取山梨醇和精氨酸的稳定剂组合处方用于下一轮抗氧化剂的考察。

3.2 抗氧化剂试验

3.2.1 抗氧化剂试验步骤

将样品分为两份，一份加入 EDTA-2Na使终浓度为 0.01 mg/ml ;另一份不添加 EDTA-2Na。各处方蛋白浓度为约 100 mg/ml。过滤分装至西林瓶，加塞轧盖后在 40°C士 2°C条件下进行加速稳定性考察，于 1周、 2周和 1 月取样检测。检测指标为外观、可见异物、蛋白含量、浊度、纯度（SEC-HPLC法、非还原型 CE-SDS法）和电荷变异体（iCIEF法）。表 16. 抗氧化剂筛选试验处方信息

序号处方信息

0.4 mg/ml组氨酸， 1.5 mg/ml盐酸组氨酸， 15.0 mg/ml山梨醇， 21.1 mg/ml精氨酸， 0.3 mg/ml 处方 A

聚山梨醋 20， 0.01 mg/ml依地酸二納， pH5.5

0.4 mg/ml组氨酸， 1.5 mg/ml盐酸组氨酸， 15.0 mg/ml山梨醇， 21.1 mg/ml精氨酸， 0.3 mg/ml 处方 B

聚山梨酯 20， pH5.5

3.2.2 判定标准

见 3.1.2节。

3.2.3 抗氧化剂试验结果

在 40°C士 2°C条件下考察 1 个月，两个处方样品的外观、可见异物、蛋白含量、纯度（SEC-HPLC法）均未发生变化；两个处方样品的浊度均升高，变化速率保持一致；纯度（非还原型 CE-SDS法） 1个月均降低 2.1% ; 电荷变异体-主成分降低，酸性组分升高，变化速率保持一致。具体见表 17、图 8和图 9。

各检测指标数据表明两个处方均有良好的稳定性，且处方间无差异，即是否添加 EDTA-2Na对产品稳定影响不大。从处方简单化和安全化出发，最终选定处方 B作为抗体制剂的最终处方。

表 17. 抗氧化剂筛选试验检测结果（40°C±2°C）

处方 A (添加 EDTA-2Na) 处方 B (无 EDTA-2Na) 检测项目

0天 1周 2周 1月 0天 1周 2周 1月外观合格合格合格合格合格合格合格合格可见异物合格合格合格合格合格合格合格合格蛋白含量（UV法， mg/ml） 99.3 97.4 99.0 95.6 102.9 100.6 101.6 95.4 油度（OD35_{Q nm}法） 0.212 0.224 0.227 0.246 0.222 0.223 0.224 0.245 电荷变异体酸性组分 24.2 27.6 32.6 40.8 24.3 28.3 32.9 40.7

（iCIEF ;i, %）主成分 73.7 69.7 64.0 55.0 73.7 69.0 63.6 55.1 碱性组分 2.0 2.7 3.4 4.2 1.9 2.7 3.4 4.2 纯度（SEC-HPLC ，％） 99.4 99.1 99.1 98.8 99.3 99.1 99.1 98.8 纯度（非还原型 CE-SDS，％）法， 99.2 98.9 98.4 97.1 99.1 98.5 98.2 97.0 结论

综合上述各个试验结果，抗体蛋白在 pH 5.0〜 6.0时表现稳定；表面活性剂聚山梨酯 20能够保证产品具有良好的振荡稳定性；稳定剂中山梨醇效果较好，能更有效抑制蛋白在 40°C高温下聚体的产生；高温抗氧化试验发现处方中无需添加 EDTA-2Na ; 另外，加入适量精氨酸能降低高浓度蛋白产品的粘度。由此，确定优选的制剂方案为： 100 mg/ml重组全人源抗分化抗原簇 47 （CD47）单克隆抗体、 0.4 mg/ml 组氨酸、 1.5 mg/ml 盐酸组氨酸、 15.0 mg/ml 山梨醇、 21.1 mg/ml盐酸精氨酸、 0.3 mg/ml聚山梨酯 20， pH 5.5。以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。

Claims

权利要求书

1. 一种具有 pH约为 5.06.0的液体抗体制剂，例如， pH约为 5.5的液体抗体制剂，包含

(i) 抗 CD47抗体；

(ii) 缓冲剂，

(iii) 稳定剂，和

(iv) 表面活性剂，

其中，所述抗 CD47抗体包含：

-GSISSYYWS (SEQIDNO: 3) 或 SYYWS (SEQIDNO: 11) 的重链 VHCDR1;

-YIYYSGSTNYNPSLKS (SEQIDNO: 4) 的重链 VHCDR2;

-ARGKTGSAA (SEQIDNO: 5) 或 GKTGSAA (SEQIDNO: 12) 的重链 VHCDR3;

-RASQGISRWLA (SEQIDNO: 6) 的轻链 VLCDR1;

-AASSLQS (SEQIDNO: 7) 的轻链 VLCDR2; 和

-QQTVSFPIT (SEQIDNO: 8) 的轻链 VLCDR3。

2. 权利要求 1的液体抗体制剂，特征在于所述液体抗体制剂中的抗 CD47抗体的浓度为约 1-150 mg/mL, 优选地为约 10-120mg/mL, 例如 20mg/ml，更优选地为约 50-120mg/mL, 例如，约 100 或 120mg/mL。

3. 根据权利要求 1或 2所述的液体抗体制剂，特征在于所述液体抗体制剂中的缓冲剂为组氨酸缓冲剂，优选地，所述缓冲剂的浓度为约 5-100mM，优选地为约 10-50mM，例如，约 10或 20mM。

4. 根据权利要求 1-3 中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述稳定剂选自山梨醇、蔗糖、海藻糖、精氨酸及其组合。

5. 根据权利要求 1-4中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述液体抗体制剂包含山梨醇作为稳定剂，优选地山梨醇以约 10-80mg/ml，优选地约 30-50mg/ml，如 40mg/ml的量存在。

6. 根据权利要求 1-4中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于液体抗体制剂包含山梨醇和精氨酸的稳定剂组合，优选地山梨醇的量为约 10-30mg/ml，尤其是 15mg/ml, 精氨酸的的量为 80-110mM, 尤其是约 lOOmM。

I 根据权利要求 1-6中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述液体抗体制剂中的表面活性剂选自聚山梨酯类表面活性剂，优选为聚山梨酯 -20。

8. 根据权利要求 1-7中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述表面活性剂的浓度为约 0.1-1 mg/ml，优选地为约 0.1-0.5mg/ml，例如约 0.2、 0.3、 0.4、 0.5mg/ml。

9. 根据权利要求 1-8中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述液体制剂不包含依地酸 (EDTA)或其盐。

10. 根据权利要求 1-9所述的液体抗体制剂，特征在于所述抗 CD47抗体包含重链可变区 VH和轻链可变区 VL，其中重链可变区包含 SEQ ID NO: 1的序列或与其具有至少 90%, 95%, 98%或 99%同一性的序列，且轻链可变区包含 SEQ ID NO: 2的序列或与其具有至少 90%, 95%, 98%或 99%同一性的序列。

II. 根据权利要求 1-10所述的液体抗体制剂，特征在于所述抗 CD47抗体是 IgG4型抗体，优选地包含 SEQ ID NO : 9或与之具有至少 90%, 95%, 98%或 99%同一性的重链序列以及 SEQ ID NO: 10或与之具有至少 90%, 95%, 98%或 99%同一性的轻链序列。

12. 根据权利要求 1-11所述的液体抗体制剂，特征在于所述抗 CD47抗体在 CHO细胞中重组表达。

13. 根据权利要求 1-12所述的液体抗体制剂，特征在于所述液体制剂为注射剂，优选用于皮下或静脉注射。

14. 根据权利要求 1所述的液体抗体制剂，包含： (i) 90-150 mg/mL, 尤其是 90-120mg/ml的抗 CD47抗体；

(ii) 约 10-20mM组氨酸缓冲剂；

(iv) 约 0.1-0.4 mg/ml (例如，约 0.3mg/ml)的聚山梨酿 -20 ;

其中所述液体制剂的 pH为 pH5.5±0.2，优选地约 5.5。

15. 根据权利要求 1所述的液体抗体制剂，其包含：

(i) 约 100 mg/mL的抗 CD47抗体；

(ii) 约 0.4mg/ml组氨酸和约 1.5mg/ml盐酸组氨酸；

(iii) 约 15.0 mg/ml山梨醇和约 21.1 mg/ml盐酸精氨酸，和

(iv) 约 0.3mg/ml的聚山梨酿 -20 ;

其中所述液体制剂的 pH为约 5.5±0.2，优选地约 5.5。

16. 根据权利要求 1 - 1 5中任何一项所述的液体抗体制剂，其特征在于，该制剂在储存后，例如在 2-8°C储存至少 24个月后，或在室温储存至少 3个月后，或在 40°C±2°C 储存 1个月后，是稳定的，优选地具有如下特征之一或多项：

17. 一种固体抗体制剂，其通过固化权利要求 1-16中任何一项所述的液体抗体制剂而获得，所述固体抗体制剂例如是冻干制剂，更优选地是冻干粉针剂形式。

18. 递送装置，其包含权利要求 1-16中任何一项的液体抗体制剂或权利要求 17的固体抗体制剂。

19. 预填装注射器，其包含权利要求 1-16中任何一项的液体抗体制剂或权利要求 17的固体抗体制剂，用于静脉内注射或者肌内注射。

20. 根据权利要求 1-16中任何一项的液体抗体制剂或权利要求 17的固体抗体制剂的用途，用于制备在受试者中诱导抗肿瘤活性或抗癌症活性的药物，优选地所述肿瘤或癌症选自血液肿瘤和实体瘤，例如急性骨髓性白血病 (AML) 、慢性骨髓性白血病 (CML) 、急性淋巴细胞白血病 (ALL) 、慢性淋巴细跑性白血病 (CLL) 、非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 、多发性骨髓瘤

(MM) 、淋巴瘤、乳腺癌、头颈癌、胃癌、肺癌、食管癌、肠癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、神经胶质瘤、黑素瘤和其他实体瘤，其中所述肿瘤或癌症更优选是淋巴瘤，如伯基特淋巴瘤。