CN103930781A - 促进分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过抑制USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)促进细胞命运变化，特别是肿瘤细胞分化的方法。

Description

促进分化的方法

对相关申请的交叉引用

本申请依据35USC§119要求2011年9月15日提交的美国临时申请号61/535,336的优先权，通过提及将其内容完整收录。

序列表

本申请含有序列表，其已经经由EFS-Web以ASCII形式提交，并且在此通过提及完整收录。所述ASCII拷贝(在2012年9月14日创建)命名为P4745R1WO.txt，并且大小为49,096字节。

发明领域

本文中提供了通过抑制USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)来促进细胞命运变化，特别是肿瘤细胞分化的方法。

发明背景

碱性-螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子构成人基因组中第三大公认的转录因子家族(Tupler等,2001)，并且是经由称作E框的结合DNA元件进行发育和分化的必需调节物(Massari和Murre,2000)。I类bHLH同二聚体广泛表达，并且促进抗增殖基因诸如CDKN1A、CDKN2A、和CDKN2B的表达(Yokota和Mori,2002)。II类bHLH蛋白显示更受限的表达，并且与I类蛋白形成异二聚体以驱动组织特异性基因诸如IGH和SP7/OSTERIX(Lassar等,1991；Weintraub等,1994)。经由组织特异性和抗增殖基因的组合诱导，bHLH转录因子充当谱系定型的整合物。

bHLH蛋白的DNA结合受限于与DNA结合蛋白抑制剂，或ID的异二聚化。ID家族由具有重叠的空间和时间表达概况的四个成员，即ID1、ID2、ID3、和ID4组成(Lasorella等,2001)。所有四种ID以类似的亲和力结合各种bHLH蛋白以调节基因表达(Prabhu等,1997)。ID在转录上由众多生长因子，包括骨形态发生蛋白、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子，以及由T细胞受体配体诱导(Yokota和Mori,2002)。ID1、ID2、和ID3，而非ID4受到K48关联的多泛素化(polyubiquitination)及随后26S蛋白酶体的降解。因此，ID在大多数组织中是短寿命的(Bounpheng等,1999)。泛在表达的APC/Cdh1复合物是一种决定ID稳定性和丰度的E3泛素连接酶(Lasorella等,2006)，但是ID蛋白在一些背景中是稳定的。

ID对于哺乳动物发育是至关重要的；两种或更多种ID基因的破坏导致胚胎致死性(Lyden等,1999)。比较而言，转基因小鼠中ID蛋白的过表达产生胚胎恶性(Kim等,1999)。类似地，在范围为胰腺癌至成神经细胞瘤的一大批脱分化的原发性人恶性中观察到升高的ID蛋白水平(Perk等,2005)。报告了工程化ID抑制性HLH蛋白使成神经细胞瘤肿瘤分化(Ciarapica等,2009)。虽然ID蛋白在正常成年分化组织中是缺乏的，但是它们在增殖组织，包括胚胎和成年干细胞群体中是充足的，这提示了ID可以维持“干性(stemness)”(Yokota和Mori,2002)。需要更多工作来阐明ID基因在癌症干细胞生物学中的作用。

发明概述

本文中提供了USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂(例如ID1、ID2、和/或ID3)的筛选和/或鉴定方法及使用USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂(例如ID1、ID2、和/或ID3)来促进细胞命运变化和/或细胞周期停滞的方法。

本文中提供了筛选和/或鉴定促进细胞命运变化的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂的方法，所述方法包括：比较(i)参照细胞命运与(ii)候选细胞命运，其中所述参照细胞命运是参照细胞的细胞命运，其中所述候选细胞命运是在存在USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或ID候选拮抗剂的情况中所述参照细胞的细胞命运，其中所述USP1候选拮抗剂结合USP1，其中所述UAF1候选拮抗剂结合UAF1，和/或所述ID候选拮抗剂结合ID，由此所述参照细胞命运和所述候选细胞命运之间的细胞命运差异将所述USP1候选拮抗剂和/或所述ID候选拮抗剂鉴定为促进细胞命运变化。

本文中还提供了筛选和/或鉴定诱导细胞周期停滞的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂的方法，所述方法包括：(i)在存在USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或ID候选拮抗剂的情况中接触参照细胞，其中所述USP1候选拮抗剂结合USP1，其中所述UAF1候选拮抗剂结合UAF1，和/或所述ID候选拮抗剂结合ID，由此细胞周期停滞将所述USP1候选拮抗剂和/或ID候选拮抗剂鉴定为诱导细胞周期停滞。

在任何筛选方法的一些实施方案中，所述USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或所述ID候选拮抗剂是USP1候选拮抗剂。在任何筛选方法的一些实施方案中，所述USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或所述ID候选拮抗剂是ID候选拮抗剂。在一些实施方案中，所述ID候选拮抗剂是ID1候选拮抗剂、ID2候选拮抗剂、和/或ID3候选拮抗剂。在任何筛选方法的一些实施方案中，所述USP1候选拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或所述ID候选拮抗剂是UAF1候选拮抗剂。

在任何筛选方法的一些实施方案中，所述参照细胞命运是干细胞命运。在一些实施方案中，所述干细胞命运是间充质干细胞命运。在任何筛选方法的一些实施方案中，所述候选细胞命运是成骨细胞细胞命运、软骨细胞细胞命运、或脂肪细胞细胞命运。在一些实施方案中，所述候选细胞命运是成骨细胞细胞命运。

在任何筛选方法的一些实施方案中，所述USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或所述ID候选拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子、或多核苷酸。

本文中进一步提供了促进细胞的细胞命运变化的方法，其包括使所述细胞与有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂接触。本文中还提供了诱导细胞周期停滞的方法，其包括使所述细胞与有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂接触。在一些实施方案中，所述细胞是具有干细胞命运(例如间充质干细胞命运)的细胞。

本文中提供了治疗疾病或病症的方法，其包括对个体施用有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂。

在一些实施方案中，基于一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平选择所述个体进行治疗：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如与内部参照(例如CD144)相比)或基于一种或多种选自下组的基因的低表达水平，不选择所述个体进行治疗：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如与内部参照(例如CD144)相比)。在一些实施方案中，基于一种或多种选自下组的基因的低表达水平，选择所述个体进行治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与内部参照(例如CD144)相比)或基于一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平，不选择所述个体进行治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与内部参照(例如CD144)相比)。

在一些实施方案中，基于一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平，所述个体可能响应治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与内部参照(例如CD144)相比)(例如从治疗开始时、期间、或之前的时间点至后来的时间点)或者基于一种或多种选自下组的基因的降低的或无显著变化的表达水平，所述个体可能不响应治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与内部参照(例如CD144)相比)(例如从治疗开始时、期间、或之前的时间点至后来的时间点)。

在任何方法的一些实施方案中，USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂诱导细胞周期停滞。在任何方法的一些实施方案中，USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂能够促进细胞命运变化。

在任何方法的一些实施方案中，促进细胞命运变化以一种或多种选自下组的基因的降低的表达水平指示：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如与内部参照(例如CD144)相比)。在任何方法的一些实施方案中，促进细胞命运变化以一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平指示：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)。在一些实施方案中，与内部参照(例如CD144)相比，一种或多种基因的表达水平是升高的。

在任何方法的一些实施方案中，疾病或病症包括具有干细胞命运(例如间充质干细胞命运)的细胞。在任何方法的一些实施方案中，细胞表达一种或多种选自下组的基因：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)。在一些实施方案中，与内部参照(例如CD144)相比，一种或多种基因的表达水平是升高的。在任何方法的一些实施方案中，细胞没有显著表达(例如不表达或与内部参照(例如CD144)相比以低水平表达)一种或多种选自下组的基因：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)。

在任何方法的一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是骨肉瘤。在一些实施方案中，所述癌症表达一种或多种选自下组的基因：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)。在一些实施方案中，与内部参照(例如CD144)相比，一种或多种基因的表达水平是升高的。

在任何方法的一些实施方案中，所述USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或所述ID拮抗剂是USP1拮抗剂。在任何方法的一些实施方案中，所述USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或所述ID拮抗剂是ID拮抗剂。在一些实施方案中，其中所述ID拮抗剂是ID1拮抗剂、ID2拮抗剂、和/或ID3拮抗剂。在任何方法的一些实施方案中，所述USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或所述ID拮抗剂是UAF1拮抗剂。

在任何方法的一些实施方案中，所述USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或所述ID拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子、或多核苷酸。在一些实施方案中，所述USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或所述ID拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段，且抗体片段结合USP1、UAF、和/或ID。

附图简述

本专利或申请文件含有至少一幅以彩色制成的图。具有彩图的本专利或专利申请公开文本的拷贝会在请求并支付必要费用后由该局提供。

图1：USP1使ID蛋白脱泛素化(deubiquitinate)及稳定化。(A)仅用载体(CTL)、野生型USP1(WT)、或无催化活性USP1C90S转染的293T细胞的Western印迹(WB)分析。将细胞用25mg/ml环己酰亚胺(CHX)处理指定的时间(左侧小图)。通过密度测定法量化ID2(右侧小图)。(B)用有Flag标签的ID1、ID2、ID3、或IkBa，和空载体(CTL)、野生型USP1、或USP1C90S共转染293T细胞。在指示的情况中，将细胞用10mM MG-132处理4小时。(C)用有HA标签的泛素共转染的293T细胞中USP1或USP1C90S和WDR48对ID2-Flag的脱泛素化。(D)将USP1-Flag、USP1C90S-Flag、WDR48-Flag、和泛素化的ID2-Flag从293T提取物分开亲和纯化，然后，在体外脱泛素化测定法中组合在一起6小时。NEM，N-乙基马来酰亚胺。

图2：USP1作为ID2脱泛素化酶的鉴定和USP1-ID2结合界面的定位。(A)用有Flag标签的脱泛素酶(DUB)或空载体(-)转染的293T的Western印迹(WB)分析。在指示的情况中，将细胞用10mM MG-132处理4小时。(B)将有Flag标签的DUB从用ID2共转染并用10mM MG-132处理6小时的293T细胞免疫沉淀(IP)。(C)将293T细胞中表达的USP1突变体免疫沉淀，并且针对共表达的ID2进行印迹。(D)用野生型(WT)或突变体USP1转染的293T细胞中的内源ID2的Western印迹分析。

图3：USP1在骨肉瘤中过表达，并且与ID2蛋白表达相关联。(A)来自正常的和患病的组织的原代人骨活组织检查中的USP1mRNA表达的盒须图。(B)原代人成骨细胞和骨肉瘤肿瘤样品中USP1和ID2蛋白表达的Western印迹(WB)分析。(C和D)(B)的样品中USP1(C)和ID2(D)表达的RT-PCR量化。棒表示一式三份观察结果的均值±SD。(E和F)在用ID2表达载体(顶部小图)或ID2shRNA(底部小图)转染的293T细胞中(E)或在原代人骨肉瘤活组织检查中(F)ID2的免疫组织化学检测。(G)在来自原代骨肉瘤组织的连续切片中USP1和ID2的免疫组织化学染色。用同种型对照抗体进行对照染色。

图4：USP1在物理上衔接及稳定化骨肉瘤中的ID蛋白。(A)用USP1或对照(CTL)shRNA及空载体(CTL)或shRNA抗性USP1(野生型[WT]或USP1突变体C90S)共转染的U2-OS细胞的Western印迹(WB)分析。(B)如在(A)中一样处理并且用E框驱动的萤光素酶报告物共转染的U2-OS细胞的萤光素酶活性。棒表示一式三份观察结果的均值±SD。(C)将U2-OS细胞用shRNA转染，并在指示的情况中用10mM MG-132处理4小时。(D)将U2-OS细胞用ID2-Flag、HA-泛素、和CTL或USP1shRNA任一共转染。在指示的情况中，将细胞用10mM MG-132处理4小时。自SDS/热变性的细胞裂解物免疫沉淀ID2-Flag。(E和F)自U2-OS细胞免疫沉淀USP1(E)或ID2(F)。用非特异性IgG进行对照免疫沉淀。星号(*)表示一条由抗ID2抗体识别的、未知身份的带。

图5：USP1调节多发性骨肉瘤细胞系中的ID蛋白。(A)培养的原代人成骨细胞和人骨肉瘤细胞系的Western印迹(WB)分析。(B)将骨肉瘤细胞系用10mM MG-132处理4小时。(C)用对照(CTL)或USP1shRNA转染骨肉瘤细胞系。(D)将骨肉瘤细胞用空载体或WDR48转染，或者用10mM MG-132处理4小时。(E)自HOS细胞免疫沉淀USP1。用非特异性IgG进行对照免疫沉淀。(F)对USP1^+/+(WT)和USP1^-/-DT40细胞的分析。(G)WT和USP1^-/-DT40细胞中USP1mRNA的实时RT-PCR量化。棒代表一式三份观察结果的均值±s.d.。(H)将WT和USP1^-/-DT40细胞用10mM MG-132处理2小时。(I)将USP1^-/-DT40细胞用空载体(CTL)、USP1野生型(WT)、或USP1C90S转染，并且与USP1^-/-DT40细胞比较。Un，未转染。

图6：USP1在骨肉瘤中经由ID蛋白调节细胞周期。(A)如在图4A中一样处理的U2-OS细胞的Western印迹(WB)分析。(B)在培养5天后计数如在(A)中一样处理的U2-OS细胞的长出。(C)经碘化丙啶染色的、如在(A)中一样处理的U2-OS细胞的细胞周期状态。(D)用指定的shRNA和对照或CDKN1A/p21siRNA转染的U2-OS细胞。(E)如在(D)中一样处理的细胞中S期细胞的量化。(F)用指定的shRNA和shRNA抗性USP1(shRes USP1)、ID1、ID2、和ID3，或对照表达载体转染的U2-OS细胞。(G)如在(F)中一样处理的U2-OS细胞中S期细胞的量化。棒代表一式三份观察结果的均值±SD。

图7：USP1经由ID蛋白调节增殖和细胞周期停滞。(A)将U2-OS细胞用对照(CTL)或USP1shRNA转染3天，以等同密度分配，并在后续几天计数活细胞。(B)用shRNA和(在指示的情况中)shRNA抗性USP1(野生型或突变体)共转染的U2-OS细胞。(C)(B)中处于细胞周期S期的细胞的百分比。(D)将骨肉瘤细胞用shRNA转染，并且在第8天时计数细胞。(E)如在(A)中一样处理并且用碘化丙啶(PI)染色的U2-OS细胞的DNA含量。(F)将U2-OS细胞用指定的shRNA及用对照或p21siRNA转染。(G)将(F)中的细胞用碘化丙啶染色，并通过流式细胞术分析。棒代表S期的细胞的均值百分比。(H)将U2-OS细胞用指定的shRNA转染。(I-K)通过实时RT-PCR(I)和PI染色后的流式细胞术(J，K)评估(H)中的细胞。(L)将U2-OS细胞用shRNA和对照或p53siRNA转染。在指示的情况中，将细胞用10mM依托泊苷处理1小时。棒代表一式三份观察结果的均值±s.d.。

图8：USP1在骨肉瘤中促进干细胞身份的保留。(A)用CTL或USP1shRNA转染的U2-OS细胞的Western印迹(WB)分析。(B)将(A)中的细胞染色，并通过荧光显微术分析。(C)在具有多西环素(doxycycline,DOX)诱导性shUSP1的143B细胞的异种移植物中针对USP1或ID2的免疫组织化学染色。(D)如(C)中所描述的143B异种移植物的肿瘤体积的量化。棒代表10个异种移植物的均值±SD。(E和F)来自(C)中的143B异种移植物的USP1、ID2、骨粘连蛋白(ON)、RUNX2(RX2)、OSTERIX(OSX)、和骨桥蛋白(OP)mRNA水平(E)和ALP活性(F)的RT-PCR量化。棒代表一式三份观察结果的均值±SD。(G)用苏木精和伊红(H&E)或三色染料对来自(C)的代表性异种移植物肿瘤染色。比例尺棒，100mm。

图9：在骨肉瘤细胞系中消减USP1诱导干标志物的损失并且启动成骨程序。(A)将骨肉瘤细胞用对照(CTL)、USP1、或ID shRNA连续转染。在11天后通过流式细胞术测定指定的间充质干细胞标志物的表面表达。(B)通过实时RT-PCR对(A)中的细胞分析RUNX2、OSTERIX(OSX)、和骨粘连蛋白基因表达。(C)通过对硝基酚磷酸(pNPP)切割对(A)中的细胞评估碱性磷酸酶活性。(D)用多西环素诱导性CTL或USP1shRNA转导的143B细胞的Western印迹(WB)分析。在指示的情况中，将细胞用3mg/ml多西环素(DOX)处理4天。(E)在多西环素处理5天后143B shUSP1异种移植物肿瘤的切片中通过原位杂交得到的骨钙蛋白基因表达的明视野和暗视野显微术。比例尺棒，100mm。(F)对照和含有USP1shRNA的143B异种移植物肿瘤中USP1基因表达的实时RT-PCR分析。棒代表一式三份观察结果的均值±s.d.。

图10：USP1和ID调节间充质干细胞分化。(A)在成骨分化培养基(ODM)中，或在非分化培养基(Un)中培养的hMSC的Western印迹(WB)分析。(B)将hMSC用ID2、USP1野生型(WT)、USP1C90S、或空载体(CTL)转导，并在ODM中培养9天。(C和D)对(B)中的hMSC评估ALP活性(C)和骨粘连蛋白、RUNX2、和OSTERIX mRNA(D)。棒代表一式三份观察结果的均值±SD。(E)用茜素红对(B)中的hMSC染色以显现钙沉积。比例尺棒，100mm。(F)培养指定的天数后对(B)中的hMSC计数。棒代表一式三份观察结果的均值±SD。

图11：USP1诱导ID依赖性NIH3T3细胞转化。(A)用ID2、USP1野生型(WT)、USP1C90S、或空对照载体转导的NIH3T3细胞的Western印迹(WB)分析。(B)将(A)中的细胞在软琼脂中培养，并且计数集落。棒代表一式三份观察结果的均值±s.d.。(C)由用对照(CTL)、ID2、USP1野生型(WT)、或USP1C90S转导的NIH3T3细胞形成的代表性集落。比例尺棒，100mm。(D)将(A)中的NIH3T3细胞在C.B-17SCID.bg小鼠(顶部小图)或NCr裸鼠(底部小图)中皮下植入，并且监测肿瘤体积。数据点代表10只小鼠的均值±s.d.。(E)在研究结束时来自(A)的C.B-17SCID.bg(顶部小图)和NCr裸鼠(底部小图)。(F)将空载体(CTL)或USP1转导的NIH3T3细胞用对照(CTL)或ID shRNA序贯转导。(G)将(F)中的细胞在软琼脂中培养，并且计数集落。棒代表一式三份观察结果的均值±s.d.。

图12：USP1是正常骨骼发生需要的。(A)12天龄USP1^+/+(WT)和USP1^-/-小鼠(顶部)和股骨(底部)的微计算机断层摄影术。(B和C)(A)中小鼠的均值骨矿化密度(BMD)(B)和矿化骨体积(Minz.Vol.)(C)。棒代表每种基因型的四份股骨的均值±SD。(D)来自E18.5USP1^+/+(WT)和USP1^-/-小鼠的股骨干骺端的Western印迹(WB)分析。(E)E18.5USP1^+/+(WT)和USP1^-/-胚胎的血清中的BALP。棒代表每种基因型的4份胚胎的均值±SD。

图13：USP1是正常小鼠骨骼发生需要的。(A)删除外显子3的USP1靶向策略，所述外显子3编码USP1的催化性半胱氨酸。黄色框代表外显子。(B)E18.5USP1^+/+(WT)和USP1^-/-胚胎的微计算机断层摄影术。(C)(b)中的小鼠的矿化骨体积(Minz.Vol.)。棒代表每种基因型的3只小鼠的均值±s.d.。(D)P12USP1^+/+(WT)和USP1^-/-股骨的苏木精和伊红(H&E)染色切片。比例尺棒，100mm。(E)P12USP1^+/+(WT)和USP1^-/-股骨中每个骨针长度的类骨质区。棒代表每种基因型的3只小鼠的均值±s.d.。(F)P12USP1^+/+(WT)和USP1^-/-股骨干骺端的H&E，三色染料，和冯科萨(Von Kossa)染色。比例尺棒，100mm。(G)P12USP1^+/+(WT)和USP1^-/-股骨中驻留破骨细胞的TRAP标记。比例尺棒，100mm。(H)P12USP1^+/+(WT)和USP1^-/-股骨切片中TRAP阳性细胞的计数。(I)E18.5羊水中相对于肌酸酐标准化的脱氧吡啶诺林(deoxypyridinoline,DPD)水平。(J)P12USP1^+/+(WT)和USP1^-/-股骨干骺端中的USP1和ID2表达。比例尺棒，100mm。

发明详述

I.定义

术语“泛素特异性肽酶1”、“脱泛素化酶1”、和“USP1”在本文中指天然序列USP1多肽、多肽变体及天然序列多肽和多肽变体的片段(其在本文中进一步定义)。本文中描述的USP多肽可以是自多种来源，诸如自人组织类型或自另一种来源分离，或者通过重组或合成方法制备的USP多肽。

“天然序列USP1多肽”包括与从自然界衍生的相应USP1多肽具有相同氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，天然序列USP1多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。

“USP1多肽变体”或其变型意指与如本文中公开的任何天然序列USP1多肽序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的USP1多肽，一般为活性USP1多肽，如本文中定义的。例如，此类USP1多肽变体包括如下的USP1多肽，其中一个或多个氨基酸残基在天然氨基酸序列的N或C端是添加或删除的。通常，USP1多肽变体与如本文中公开的天然序列USP1多肽序列会具有至少约80％氨基酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性。通常，USP1变体多肽的长度是至少约10个氨基酸，或者长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸，或更多个。任选地，与天然USP1多肽序列相比，USP1变体多肽会具有不超过1处保守氨基酸替代，或者与天然USP1多肽序列相比不超过2、3、4、5、6、7、8、9、或10处保守氨基酸替代。

如本文中定义的，术语“USP1拮抗剂”指部分或完全阻断、抑制、或中和由天然序列USP1介导的生物学活性的任何分子。在某些实施方案中，此类拮抗剂结合USP1。依照一个实施方案，拮抗剂是多肽。依照另一个实施方案，拮抗剂是抗USP1抗体。依照另一个实施方案，拮抗剂是小分子拮抗剂。依照另一个实施方案，拮抗剂是多核苷酸拮抗剂。

术语“WD重复域48”、“USP1关联因子1”、和“UAF1”在本文中指天然序列UAF1多肽、多肽变体和天然序列多肽和多肽变体的片段(其在本文中进一步定义)。本文中描述的UAF1多肽可以是自多种来源，诸如自人组织类型或自另一种来源分离，或者通过重组或合成方法制备的UAF1多肽。

“天然序列UAF1多肽”包括与从自然界衍生的相应UAF1多肽具有相同氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，天然序列UAF1多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:40。

“UAF1多肽变体”或其变型意指与如本文中公开的任何天然序列UAF1多肽序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的UAF1多肽，一般为活性UAF1多肽，如本文中定义的。例如，此类UAF1多肽变体包括如下的UAF1多肽，其中一个或多个氨基酸残基在天然氨基酸序列的N或C端是添加或删除的。通常，UAF1多肽变体与如本文中公开的天然序列UAF1多肽序列会具有至少约80％氨基酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性。通常，UAF1变体多肽的长度是至少约10个氨基酸，或者长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸，或更多个。任选地，与天然UAF1多肽序列相比，UAF1变体多肽会具有不超过1处保守氨基酸替代，或者与天然UAF1多肽序列相比不超过2、3、4、5、6、7、8、9、或10处保守氨基酸替代。在任何ID多肽变体的一些实施方案中，ID多肽变体包含ID1多肽变体。在任何ID多肽变体的一些实施方案中，ID多肽变体包含ID2多肽变体。在任何ID多肽变体的一些实施方案中，ID多肽变体包含ID3多肽变体。

如本文中定义的，术语“UAF1拮抗剂”指部分或完全阻断、抑制、或中和由天然序列UAF1介导的生物学活性的任何分子。在某些实施方案中，此类拮抗剂结合UAF1。依照一个实施方案，拮抗剂是多肽。依照另一个实施方案，拮抗剂是抗UAF1抗体。依照另一个实施方案，拮抗剂是小分子拮抗剂。依照另一个实施方案，拮抗剂是多核苷酸拮抗剂。

术语“DNA结合抑制剂”和“ID”在本文中指天然序列ID多肽、多肽变体和天然序列多肽和多肽变体的片段(其在本文中进一步定义)。本文中描述的ID多肽可以是自多种来源，诸如自人组织类型或自另一种来源分离，或者通过重组或合成方法制备的ID多肽。

“天然序列ID多肽”包括与从自然界衍生的相应ID多肽具有相同氨基酸序列的多肽。在任何天然序列ID多肽的一些实施方案中，天然序列ID多肽包含天然序列ID1同等型多肽SEQ ID NO:2。在任何天然序列ID多肽的一些实施方案中，天然序列ID多肽包含天然序列ID1同等型b多肽SEQ ID NO:3。在任何天然序列ID多肽的一些实施方案中，天然序列ID多肽包含天然序列ID2多肽SEQ ID NO:4。在任何天然序列ID多肽的一些实施方案中，天然序列ID多肽包含天然序列ID3多肽SEQ ID NO:5。

“ID多肽变体”或其变型意指与如本文中公开的任何天然序列ID多肽序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的ID多肽，一般为活性ID多肽，如本文中定义的。例如，此类ID多肽变体包括如下的ID多肽，其中一个或多个氨基酸残基在天然氨基酸序列的N或C端是添加或删除的。通常，ID多肽变体与如本文中公开的天然序列ID多肽序列会具有至少约80％氨基酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性。通常，ID变体多肽的长度是至少约10个氨基酸，或者长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸，或更多个。任选地，与天然ID多肽序列相比，ID变体多肽会具有不超过1处保守氨基酸替代，或者与天然ID多肽序列相比不超过2、3、4、5、6、7、8、9、或10处保守氨基酸替代。

如本文中定义的，术语“ID拮抗剂”指部分或完全阻断、抑制、或中和由天然序列ID介导的生物学活性的任何分子。在某些实施方案中，此类拮抗剂结合ID。依照一个实施方案，拮抗剂是多肽。依照另一个实施方案，拮抗剂是抗ID抗体。依照另一个实施方案，拮抗剂是小分子拮抗剂。依照另一个实施方案，拮抗剂是多核苷酸拮抗剂。在任何ID拮抗剂的一些实施方案中，ID拮抗剂是ID1拮抗剂。在任何ID拮抗剂的一些实施方案中，ID拮抗剂是ID2拮抗剂。在任何ID拮抗剂的一些实施方案中，所述ID拮抗剂是ID3拮抗剂。

“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶，或者通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。若存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物缀合。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代5’和3’末端OH。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸也可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2’-氧-甲基、2’-氧-烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R’各自独立为H或者取代或未取代的烃基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烃基、环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

如本文中所使用的，“寡核苷酸”一般指短的、一般为单链的、一般为合成的多核苷酸，其一般地，但不是必须在长度上小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样且完全可适用于寡核苷酸。

术语“小分子”指具有约2000道尔顿或更小，优选约500道尔顿或更小的分子量的任何分子。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。

如本文中使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。

“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。

本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。

术语“抗USP1抗体”和“结合USP1的抗体”指能够以足够亲和力结合USP1，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向USP1的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗USP1抗体结合无关的、非USP1的蛋白质的程度小于该抗体对USP1的结合的约10％。在某些实施方案中，抗USP1抗体结合在来自不同物种的USP1中保守的USP1表位。

术语“抗ID抗体”和“结合ID的抗体”指能够以足够亲和力结合ID，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向ID的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗ID抗体结合无关的、非ID的蛋白质的程度小于该抗体对ID的结合的约10％。在某些实施方案中，抗ID抗体结合在来自不同物种的ID中保守的ID表位。在任何抗ID抗体的一些实施方案中，ID抗体是抗ID1抗体。在任何抗ID抗体的一些实施方案中，ID抗体是抗ID2抗体。在任何抗ID抗体的一些实施方案中，ID抗体是抗ID3抗体。

“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体实质性或完全抑制抗原的生物学活性。

“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。

“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。

术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。

抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、和IgA₂。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。

术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。

如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。

“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。

“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。

关于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于对比序列的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyright Office,Washington D.C.,20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可自Genentech公司(South San Francisco,California)得到ALIGN-2程序，或者可以自源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

“有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。

本发明物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害效果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的预防结果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。

术语“药物配制剂”指其形式容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的制剂。

“药学可接受载体”指药物配制剂中除了活性成分外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。

如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。

术语“抗癌疗法”指在治疗癌症中有用的疗法。抗癌治疗剂的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的药剂，抗CD20抗体、血小板衍生生长因子抑制剂(例如Gleevec^TM(Imatinib Mesylate))、COX-2抑制剂(例如celecoxib)、干扰素、细胞因子、结合一种或多种以下靶物的拮抗剂(例如中和性抗体)(PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA受体、TRAIL/Apo2)、和其它生物活性和有机化学剂，等。本发明还包括它们的组合。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)、化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂、酶及其片段、诸如溶核酶、抗生素、和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)()；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)()、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou等,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂()、脂质体多柔比星TLC D-99()、PEG化脂质体多柔比星()、和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)()、替加氟(tegafur)()、卡培他滨(capecitabine)()、埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS NaturalProducts,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2’’-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)( )；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoid)，例如帕利他塞(paclitaxel)()、清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(ABRAXANE^TM)和多西他塞(doxetaxel)()；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂剂，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如)和卡铂(carboplatin)；长春药类(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)()、长春新碱(vincristine)()、长春地辛(vindesine)()、和长春瑞滨(vinorelbine)()；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)()；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)、依替膦酸钠(etidronate)()、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)()、阿伦膦酸盐(alendronate)()、帕米膦酸盐(pamidronate)()、替鲁膦酸盐(tiludronate)()或利塞膦酸盐(risedronate)()；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如)；rmRH(例如)；BAY439006(sorafenib；Bayer)；SU-11248(sunitinib,Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂(如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如PS341)；bortezomib()；CCI-779；tipifarnib(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersensodium()；pixantrone；EGFR抑制剂(见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(见下文定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)(sirolimus,)；法尼基转移酶抑制剂，诸如lonafarnib(SCH6636,SARASAR^TM)；及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATIN^TM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。

如本文中定义的化疗剂包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”类。它们自身可以是激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素类，包括他莫昔芬(tamoxifen)()、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)()、艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)()、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)，和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，诸如SERM3；没有激动剂特性的纯的抗雌激素类，诸如氟维司群(fulvestrant)()和EM800(此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转、和/或遏制ER水平)；芳香酶抑制剂类，包括类固醇芳香酶抑制剂类，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)()，和非类固醇芳香酶抑制剂类，诸如阿那曲唑(anastrazole)()、来曲唑(letrozole)()和氨鲁米特(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制剂类，包括伏氯唑(vorozole)()、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)()、法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂类，包括亮丙瑞林(leuprolide)(和)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(tripterelin)；性类固醇类(sex steroids)，包括妊娠素类(progestine)，诸如醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)，雌激素类，诸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin)，和雄激素类/类视黄酸类，诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸(transretionic acid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合。

术语“前药”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体或衍生物形式。参见例如Wilman,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”,Biochemical Society Transactions,14,pp.375-382,615th Meeting Belfast(1986)和Stella等,“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”,Directed Drug Delivery,Borchardt等,(ed.),pp.247-267,Humana Press(1985)。本发明的前药包括但不限于含磷酸盐/酯前药、含硫代磷酸盐/酯前药、含硫酸盐/酯前药、含肽前药、D-氨基酸修饰前药、糖基化前药、含β-内酰胺前药、含任选取代苯氧基乙酰胺的前药或含任选取代苯乙酰胺的前药、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药。可衍生为本发明使用的前药形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。

“生长抑制剂”在用于本文时指抑制细胞(例如在体外或在体内其生长依赖于USP1表达的细胞)生长的化合物或组合物。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见TheMolecular Basis of Cancer，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycleregulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”，Murakami等，(W.B.Saunders:Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。

“放射疗法”指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足够损伤，以限制细胞正常发挥功能或全然破坏细胞的能力。应当领会，本领域知道许多方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予，而典型的剂量范围为每天10-200个单位(戈瑞(Gray))。

“个体”或“受试者”指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛、绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如人和非人灵长类诸如猴)、兔、和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

术语“并行”在本文中用于指施用两种或更多种治疗剂，其中至少部分施用在时间上交叠。因而，并行施用包括如下的剂量给药方案，一种或多种药剂的施用中断后继续施用一种或多种其它药剂。

“降低或抑制”指引起20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或更大的总体降低的能力。降低或抑制可以指所治疗的病症的症状、转移的存在或大小、或原发性肿瘤的大小。

术语“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品的商业包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。

应当理解，本文中描述的本发明方面和实施方案包括由和/或基本上由各方面和实施方案“组成”。如本文中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数提及物，除非另外指示。

II.方法和用途

本文中提供了利用USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂的方法。例如，本文中提供了促进细胞的细胞命运变化的方法，其包括使细胞与有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂接触。本文中还提供了诱导细胞周期停滞的方法，其包括使细胞与有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂接触。在一些实施方案中，细胞是具有干细胞命运(例如间充质干细胞命运)的细胞。

本文中提供了治疗疾病或病症的方法，其包括对个体施用有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂。

本文中提供了诱导骨生长的方法，其包括对个体施用有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂。

本文中提供了使个体对化疗剂增敏和/或再增敏的方法，其包括对个体施用有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂。

本文中提供了诱导和/或促进EMT的方法，其包括对个体施用有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂。

本文中提供了治疗对化疗剂有抗性的癌症的方法，其包括对个体施用有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂。

在一些实施方案中，基于一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平，选择个体进行治疗：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如与参照数值和/或内部参照(例如CD144)相比)或者基于一种或多种选自下组的基因的低表达水平，不选择个体进行治疗：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如与参照数值和/或内部参照(例如CD144)相比)。在一些实施方案中，基于一种或多种选自下组的基因的低表达水平，选择个体进行治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与参照数值和/或内部参照(例如CD144)相比)或者基于一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平，不选择个体进行治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与参照数值和/或内部参照(例如CD144)相比)。

在一些实施方案中，基于一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平，个体可能响应治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与参照数值和/或内部参照(例如CD144)相比)(例如从治疗开始时、期间、或之前的时间点至后来的时间点)或者基于一种或多种选自下组的基因的降低的或无显著变化的表达水平，所述个体可能不响应治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与参照数值和/或内部参照(例如CD144)相比)(例如从治疗开始时、期间、或之前的时间点至后来的时间点)。

在任何方法的一些实施方案中，USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂诱导细胞周期停滞。在任何方法的一些实施方案中，USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂能够促进细胞命运的变化。在任何方法的一些实施方案中，USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂能够促进和/或诱导EMT。

在任何方法的一些实施方案中，促进细胞命运变化以一种或多种选自下组的基因的降低的表达水平指示：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如与参照数值和/或内部参照(例如CD144)相比)。在任何方法的一些实施方案中，促进细胞命运变化以一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平指示：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)。在一些实施方案中，与内部参照(例如CD144)相比，一种或多种基因的表达水平是升高的。

在任何方法的一些实施方案中，疾病或病症包含具有干细胞命运(例如间充质干细胞命运)的细胞。在任何方法的一些实施方案中，细胞表达一种或多种选自下组的基因：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)。在一些实施方案中，与内部参照(例如CD144)相比，一种或多种基因的表达水平是升高的。在任何方法的一些实施方案中，细胞不显著表达(例如不表达或与内部参照(例如CD144)相比以低水平表达)一种或多种选自下组的基因：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)。

在任何方法的一些实施方案中，疾病或病症是癌症。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤(blastoma)(包括髓母细胞瘤(medulloblastoma)和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma))、肉瘤(sarcoma)(包括脂肪肉瘤(liposarcoma)和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤、胃泌素瘤(gastrinoma)、和胰岛细胞癌)、间皮瘤(mesothelioma)、神经鞘瘤(schwannoma)(包括听神经瘤(acoustic neuroma))、脑膜瘤(meningioma)、腺癌(adenocarcinoma)、黑素瘤、和白血病或淋巴样恶性(lymphoid malignancies)。此类癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌(squamous cell cancer)(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌和鳞状肺癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、宫颈癌(cervical cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、肝癌(liver cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、肝癌(hepatoma)、乳腺癌(breast cancer)(包括转移性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤，以及头和颈癌。在一些实施方案中，癌症是骨肉瘤。在一些实施方案中，癌症不是尤因(Ewing)氏肉瘤。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症不是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症表达(已经显示为表达)一种或多种选自下组的基因：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)。在一些实施方案中，与内部参照(例如CD144)相比，一种或多种基因的表达水平是升高的。在一些实施方案中，癌症是用一种或多种化疗剂的治疗难治的。在一些实施方案中，先前已经用化疗剂治疗癌症。

在任何方法的一些实施方案中，USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或所述ID拮抗剂是USP1拮抗剂。在任何方法的一些实施方案中，USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或所述ID拮抗剂是ID拮抗剂。在一些实施方案中，其中ID拮抗剂是ID1拮抗剂、ID2拮抗剂、和/或ID3拮抗剂。在任何方法的一些实施方案中，USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或所述ID拮抗剂是UAF1拮抗剂。

在任何方法的一些实施方案中，USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或所述ID拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子、或多核苷酸。在一些实施方案中，USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或所述ID拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是人的、人源化的、或嵌合的抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段，且抗体片段结合USP1、UAF、和/或ID。

依照上述任何实施方案的“个体”可以是人。

在别的方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对具有此类癌症的个体施用有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或ID拮抗剂。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，如下文描述的。依照上述任何实施方案的“个体”可以是人。

在别的方面，本发明提供了用于在个体中诱导和/或促进EMT，促进骨生长，抑制细胞增殖，促进细胞周期停滞或促进细胞命运变化的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对个体施用有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或ID拮抗剂以诱导和/或促进EMT，促进骨生长，抑制细胞增殖，促进细胞周期停滞或者促进细胞命运变化。在一个实施方案中，“个体”是人。在一些实施方案中，个体具有癌症。在一些实施方案中，癌症是用化疗剂治疗难治或对其有抗性的。

在别的方面，本发明提供了包含本文中提供的任何USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或ID拮抗剂的药物配制剂，例如供在任何上述治疗方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或ID拮抗剂和药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或ID拮抗剂和至少一种别的治疗剂，例如如下文描述的。

可以单独或与疗法中的其它药剂组合使用本发明的拮抗剂。例如，可以与至少一种别的治疗剂共施用本发明的抗体。在某些实施方案中，别的治疗剂是化疗剂。

上文记录的此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或不同配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或佐剂之前、同时、和/或之后发生本发明的拮抗剂的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明的拮抗剂。

可以通过任何合适的手段，包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的拮抗剂(例如抗体)(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用、和脉冲输注。

本发明的拮抗剂(例如抗体)应当以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状态、病因、药物递送部位、给药方法、服药日程以及其它为开业医生所知的因素。抗体无需但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的拮抗剂的量、病症或治疗的类型、以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以相同的剂量使用并具有本文中所描述的给药途径，或以约1-99％的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验确定的/经临床测定合适的。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂联合使用时)的合适剂量应取决于所要治疗的疾病的类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、所给予抗体的预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次单独的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一个典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗应通常持续直至出现病症得到期望的抑制为止。一种例示性的抗体剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周给予一次(如使得患者得到约2-约20个，或例如约6个剂量的抗体)。可给予初始较高的负荷剂量，接着给予一个或多个较低的剂量。例示性的剂量给药方案包括施用。然而，可使用其它给药方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。

应当理解，可以作为USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂的替换或补充使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法。

III.治疗性组合物

本文中提供了可用于本文中描述的方法的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂(例如ID1、ID2、和/或ID3)。在一些实施方案中，USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂(例如ID1、ID2、和/或ID3)是抗体、结合多肽、结合小分子、或多核苷酸。

A.抗体

在一个方面，本文中提供了结合USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、或ID3)的分离的抗体。在上述任何实施方案中，抗体是人源化的。

在一些实施方案中，抗体是USP1拮抗剂。在一些实施方案中，抗体是UAF1拮抗剂。在一些实施方案中，抗体是ID1拮抗剂。在一些实施方案中，抗体是ID2拮抗剂。在一些实施方案中，抗体是ID3拮抗剂。在一些实施方案中，抗体能够抑制超过一种ID(例如两种ID、三种ID、或四种ID)。在一些实施方案中，抗体抑制USP1与UAF1的相互作用。在一些实施方案中，抗体阻断ID的脱泛素化。在一些实施方案中，抗体抑制ID与bHLH的相互作用。

在一些实施方案中，抗体是USP1拮抗剂，且USP1拮抗剂是美国专利公开文本No.2010/0330599(通过提及将其内容完整收入本文)中披露的抗体。在一些实施方案中，抗体是ID1拮抗剂，且ID1拮抗剂是美国专利No.7,517,663(通过提及将其内容完整收入本文)中披露的抗体。在一些实施方案中，抗体是ID3拮抗剂，且ID3拮抗剂是美国专利No.7,629,131(通过提及将其内容完整收入本文)中披露的抗体。

在一些实施方案中，抗ID3抗体包含可变轻链序列和/或可变重链序列，所述可变轻链序列包含：QVLTQTPSPVSAAVGGTVTINCQASQSIYNDNDLAWFQQKPGQPPKLLIYDASTLTSGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLDCDDAATYYCAARYSGNIYGF(SEQ ID NO:41)，所述可变重链序列包含：QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVIFPSNNVYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCASMGAFDSWGPGTLVTVSSG(SEQ ID NO:42)。在一些实施方案中，抗ID3抗体包含可变轻链序列和/或可变重链序列，所述可变轻链序列包含：AVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQSVWNNNWLSWFQQKPGQPPKLLIYETSKLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGGYWTTSDNNVFGGGTEVVVK(SEQ ID NO:43)，所述可变重链序列包含：QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNVYIHWVRQAPGKGLEWIGYISDGDTARYATWAKGRFTISKTSSTTVNLKMTSLTTEDTATYFCARQGFNIWGPGTLVTVSL(SEQ ID NO:44)。在一些实施方案中，抗ID3抗体包含可变轻链序列和/或可变重链序列，所述可变轻链序列包含：AVLTQTPSPVSAAVGGTVTSCQSSQSVYNNNWLSWFQQKSGQPPKLLIYETSKLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTIIDVQCDDAATYYCLGGYWTTSDNNIFGGGTEVVVK(SEQ ID NO:45)，所述可变重链序列包含：QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSSYYIHWVRQAPGKALEWIGYISDGGTTYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARQGFNIWGPGTLVTVSL(SEQ ID NO:46)。在一些实施方案中，抗ID3抗体包含可变轻链序列和/或可变重链序列，所述可变轻链序列包含：AVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQSVWNNNWLSWFQQKPGQPPKLLIYETSKLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGGYWTTSDNNVFGGGTEVVVK(SEQ ID NO:47)，所述可变重链序列包含：QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNVYIHWVRQAPGKGLEWIGYISDGDTARYATWAKGRFTISKTSSTTVNLKMTSLTTEDTATYFCARQGFNIWGPGTLVTVSL(SEQ ID NO:48)。在一些实施方案中，抗ID3抗体包含可变轻链序列和/或可变重链序列，所述可变轻链序列包含：AVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSQSVYNNNWLSWFQQKSGQPPKLLIYETSKLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTIIDVQCDDAATYYCLGGYWSTSDNNIFGGGTEVVVK(SEQ ID NO:49)，所述可变重链序列包含：QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSSYYIHWVRQAPGKALEWIGYISDGGTTYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARQGFNIWGPGTLVTVSL(SEQ ID NO:50)。

在本发明的又一方面，依照上述任何实施方案的抗USP1抗体、抗UAF1抗体和/或抗ID抗体是单克隆抗体，包括嵌合的、人源化的或人的抗体。在一个实施方案中，抗USP1抗体、抗UAF1抗体和/或抗ID抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体、或F(ab’)₂片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1”抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。

在又一方面，依照上述任何实施方案的抗USP1抗体、抗UAF1抗体和/或抗ID抗体可以单独或组合掺入任何特征，如下述部分中描述的：

1.抗体亲和力

在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM的解离常数。在一个实施方案中，Kd是通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(¹²⁵I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM¹²⁵I-抗原与连续稀释的感兴趣Fab(例如与Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20()洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20^TM；Packard)，然后在TOPCOUNT ^TM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。

依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1S^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还可见WO93/16185；及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)₂片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。

单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利No.6,248,516B1)。

可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。

3.嵌合的和人源化的抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等,Methods36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。

可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

4.人抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。

可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSE^TM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。

也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。

也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。

5.文库衍生的抗体

可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature348:552-554；Clackson等,Nature352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。

在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373、和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。

认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。

6.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对USP1或ID(例如ID1、ID2、或ID3)，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合USP1或ID(例如ID1、ID2、或ID3)的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达USP1和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)，的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。

用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983))、WO93/08829、和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))、和“突起-入-空穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。

本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US2006/0025576A1)。

本文中的抗体或片段还包括包含结合USP1或ID(例如ID1、ID2、或ID3)及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US2008/0069820)。

7.抗体变体

a)糖基化变体

在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。

在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。

在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No US2003/0157108A1,Presta,L；及WO2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。

进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)。

b)Fc区变体

在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。

描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO2004/056312，及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298、333、和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551、WO99/51642、及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。

具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。还可见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。

c)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体

在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。

B.免疫缀合物

本发明还提供包含本文中抗USP1抗体和/或抗ID抗体(例如抗ID1抗体、抗ID2抗体、或抗ID3抗体)的免疫缀合物，该抗体与一种或多种细胞毒剂诸如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段)、或放射性同位素偶联。

在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物偶联物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物偶联，包括但不限于美登木生物碱(maytansinoid)(参见美国专利No.5,208,020、No.5,416,064和欧洲专利EP0425235B1)；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利No.5,635,483和No.5,780,588，及No.7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利No.5,712,374、No.5,714,586、No.5,739,116、No.5,767,285、No.5,770,701、No.5,770,710、No.5,773,001、和No.5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.53:3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz等人，Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他赛(paclitaxel)、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel；单端孢菌素(trichothecene)；和CC1065。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与酶活性毒素或其片段偶联，包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与放射性原子偶联以形成放射偶联物。多种放射性同位素可用于生成放射偶联物。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。在将放射偶联物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc^99m或I¹²³，或自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的此类偶联物，包括但不限于：商品化(如购自Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL,U.S.A)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。

C.结合多肽

结合多肽是如下的多肽，其结合，优选特异性结合如本文所述的USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)。结合多肽可以使用已知的多肽合成方法学化学合成，或者可使用重组技术制备和纯化。结合多肽的长度通常是至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更长，其中此类结合多肽能够结合，优选特异性结合本文所述的靶物，即USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)。结合多肽无需过多试验就可使用公知技术来鉴定。在这点上，注意到用于对多肽文库筛选能够特异性结合多肽靶物的结合多肽的技术是本领域公知的(参见例如美国专利5,556,762,5,750,373,4,708,871,4,833,092,5,223,409,5,403,484,5,571,689,5,663,143；PCT公开号WO84/03506和WO84/03564；Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3998-4002(1984)；Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:178-182(1985)；Geysen等,in Synthetic Peptides asAntigens,130-149(1986)；Geysen等,J.Immunol.Meth.102:259-274(1987)；Schoofs等,J.Immunol.140:611-616(1988)；Cwirla,S.E.等,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378；Lowman,H.B.等,(1991)Biochemistry30:10832；Clackson,T.等,(1991)Nature352:624；Marks,J.D.等,(1991),J.Mol.Biol.222:581；Kang,A.S.等,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8363；Smith,G.P.,(1991)Current Opin.Biotechnol.2:668)。

在这点上，噬菌体展示是一种可以筛选大型多肽文库来鉴定那些文库中能够特异性结合靶多肽，即USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)的成员的公知技术。噬菌体展示是将变体多肽作为与外壳蛋白的融合蛋白展示在噬菌体颗粒表面的一种技术(Scott,J.K.and Smith,G.P.(1990)Science249:386)。噬菌体展示的效用在于，可以对选择性随机化蛋白质变体(或随机克隆cDNA)的大型文库迅速且有效地分选那些以高亲和力结合靶分子的序列。在噬菌体上展示肽(Cwirla,S.E.等,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378)或蛋白质(Lowman,H.B.等,(1991)Biochemistry30:10832；Clackson,T.等,(1991)Nature352:624；Marks,J.D.等,(1991)J.MoI.Biol.222:581；Kang,A.S.等,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8363)文库已经用于对数百万多肽或寡肽筛选具有特异结合特性的那些多肽或寡肽(Smith,G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.2:668)。分选随机突变体的噬菌体文库需要构建和扩充大量变体的策略，使用靶受体进行亲和纯化的流程，及评估结合富集的结果的手段。参见美国专利5,223,409,5,403,484,5,571,689和5,663,143。

尽管大多数噬菌体展示方法已经使用丝状噬菌体，λ类(lambdoid)噬菌体展示系统(WO95/34683；US5,627,024)、T4噬菌体展示系统(Ren等,Gene215:439(1998)；Zhu等,Cancer Research58(15):3209-3214(1998)；Jiang等,Infection&Immunity65(11):4770-4777(1997)；Ren等,Gene195(2):303-311(1997)；Ren,Protein Sci.5:1833(1996)；Efimov等,Virus Genes10:173(1995))和T7噬菌体展示系统(Smith and Scott,Methods in Enzymology217:228-257(1993)；US5,766,905)也是已知的。

别的改进增强了展示系统对肽文库筛选与选定靶分子的结合及展示功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋白质具有对这些蛋白质筛选期望特性的潜力。已经开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(WO98/14277)，而且噬菌体展示文库已经用于分析和控制生物分子相互作用(WO98/20169；WO98/20159)和受约束(constrained)螺旋肽的特性(WO98/20036)。WO97/35196描述了分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展示文库接触第一种溶液和第二种溶液以选择性分离结合的配体，在第一种溶液中配体将结合靶分子，而在第二种溶液中亲和配体将不会结合靶分子。WO97/46251描述了这样一种方法，即用亲和纯化的抗体生物淘选随机噬菌体展示库，然后分离结合的噬菌体，随后使用微量板的孔进行淘选过程以分离高亲和力结合的噬菌体。已经报道了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A作为亲和标签的使用(Li等,(1998)Mol.Biotech.9:187)。WO97/47314描述了底物扣除文库用于区别酶特异性的用途，其中使用可以是噬菌体展示库的组合文库。WO97/09446描述了使用噬菌体展示选择适用于洗涤剂的酶的方法。美国专利5,498,538,5,432,018和WO98/15833中描述了选择特异性结合的蛋白质的其它方法。

产生肽文库和筛选这些文库的方法还公开于美国专利5,723,286,5,432,018,5,580,717,5,427,908,5,498,530,5,770,434,5,734,018,5,698,426,5,763,192,和5,723,323。

在一些实施方案中，结合多肽是USP1拮抗剂。在一些实施方案中，结合多肽是UAF1拮抗剂。在一些实施方案中，结合多肽是ID1拮抗剂。在一些实施方案中，结合多肽是ID2拮抗剂。在一些实施方案中，结合多肽是ID3拮抗剂。在一些实施方案中，结合多肽能够抑制超过一种ID(例如两种ID、三种ID、或四种ID)。在一些实施方案中，结合多肽抑制USP1与UAF1的相互作用。在一些实施方案中，结合多肽阻断ID的脱泛素化。在一些实施方案中，结合多肽抑制ID与bHLH的相互作用。在一些实施方案中，结合多肽抑制对USP1的切割。

在一些实施方案中，结合多肽是ID拮抗剂，且ID拮抗剂是抑制ID蛋白转运到胞质的多肽。在一些实施方案中，结合多肽是ID拮抗剂，且ID拮抗剂是在胞质中隔离ID蛋白的多肽。在一些实施方案中，结合多肽是ID拮抗剂，且ID拮抗剂是包含至少一个LIM域的蛋白质。LIM域是富含半胱氨酸的双重锌指基序，其介导蛋白质-蛋白质相互作用。在一些实施方案中，结合多肽是ID拮抗剂，且ID拮抗剂是包含至少一种LIM-PDZ蛋白的蛋白质。“LIM-PDZ蛋白质家族”成员，或“LIM-PDZ”蛋白指天然存在的一组蛋白质(及其同系物、突变体、变体)，所述蛋白质在其PDZ和LIM蛋白质域上共享高度氨基酸相似性(多至70％序列相似性)。所述家族现在含有7种蛋白质，每种所述蛋白质含有一个N端PDZ域，接着是一个c端LIM域(ALP亚家族；ALP、RIL、CLP-36/hCliml/Elfin、Mystique)或三个C端LIM域(Enigma亚家族；Enigma/LMP一1、ENH、ZASP/Cypherl)(Xia等，J.Cell Bi01.，271：15934—15941，1997)。在一些实施方案中，结合多肽是ID拮抗剂，且ID拮抗剂是Enigma同系物(ENH)蛋白质或其片段。见例如美国专利公开文本No.2007/0041944，通过提及将其内容完整收录。在一些实施方案中，结合多肽是ID2拮抗剂，且ID2拮抗剂是其ENH蛋白。在一些实施方案中，ENH蛋白包含氨基酸序列(SEQ ID NO：51)：

1MSNYSVSLVG PAPWGFRLQG GKDFNMPLTI SSLKDGGKAA QANVRIGDVV LSIDGINAQG

61MTHLEAQNKI KGCTGSLNMT LQRASAAPKP EPVPVQKGEP KEVVKPVPIT SPAVSKVTST

121NNMAYNKAPR PFGSVSSPKV TSIPSPSSAF TPAHATTSSH ASPSPVAAVT PPLFAASGLH

181ANANLSADQS PSALSAGKTA VNVPRQPTVT SVCSETSQEL AEGQRRGSQG DSKQQNGPPR

241KHIVERYTEF YHVPTHSDAS KKRLIEDTED WRPRTGTTQS RSFRILAQIT GTEHLKESEA

301DNTKKANNSQ EPSPQLASSV ASTRSMPESL DSPTSGRPGV TSLTTAAAFK PVGSTGVIKS

361PSWQRPNQGV PSTGRISNSA TYSGEVAPAN SALGQTQPSD QDTLVQRAEH IPAGKRTPMC

421AHCNQVIRGP FLVALGKSWH PEEFNCAHCK NTMAYIGFVE EKGALYCELC YEKFFAPECG

481RCQRKILGEV INALKQTWHV SCFVCVACGK PIRNNVFHLE DGEPYCETDY YALFGTICHG

541CEFPIEAGDM FLEALGYTWH DTCFVCSVCC ESLEGQTFFS KKDKPLCKKH AHSVNF

在一些实施方案中，ENH蛋白包含氨基酸序列(SEQ ID NO：52)：

1MSNYSVSLVG PAPWGFRLQG GKDFNMPLTI SSLKDGGKAA QANVRIGDVV LSIDGINAQG

61MTHLEAQNKI KGCTGSLNMT LQRASAAPKP EPVPVQKPTV TSVCSETSQE LAEGQRRGSQ

121GDSKQQNGPP RKHIVERYTE FYHVPTHSDA SKKRLIEDTE DWRPRTGTTQ SRSFRILAQI

181TGTEHLKESE ADNTKKANNS QEPSPQLASS VASTRSMPES LDSPTSGRPG VTSLTTAAAF

241KPVGSTGVIK SPSWQRPNQG VPSTGRISNS ATYSGSVAPA NSALGQTQPS DQDTLVQRAE

301HIPAGKRTPM CAHCNQVIRG PFLVALGKSW HPEEFNCAHC KNTMAYIGFV EEKGALYCEL

361CYEKFFAPEC GRCQRKILGE VINALKQTWH VSCFVCVACG KPIRNNVFHL EDGEPYCETD

421YYALFGTICH GCEFPIEAGD MFLEALGYTW HDTCFVCSVC CESLEGQTFF SKKDKPLCKK

481HAHSVNF

在一些实施方案中，结合多肽是UAF1拮抗剂，且UAF1拮抗剂是结合USF1WD40重复，例如WD40重复2-4、WD40重复2、WD40重复3、WD40重复4、WD40重复8的多肽。

D.结合小分子

本文中提供了作为USP1拮抗剂、UAF1和/或ID拮抗剂(例如ID1拮抗剂、ID2拮抗剂、和/或ID3拮抗剂)使用的结合小分子。

优选地，结合小分子指本文所定义的结合多肽或抗体以外，结合、优选特异性结合本文所述USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)的有机分子。结合有机小分子可以使用已知方法学来鉴定和化学合成(参见例如PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。结合有机小分子的大小通常小于约2000道尔顿，或者其大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中此类能够结合、优选特异性结合本文所述多肽的有机小分子无需过多实验就可使用公知技术来鉴定。在这点上，注意到用于对有机小分子文库筛选能够结合多肽靶物的分子的技术是本领域公知的(参见例如PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。结合有机小分子可以是例如醛、酮、肟、腙、缩氨基脲(semicarbazone)、卡巴肼(carbazide)、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯(carbamate)、碳酸酯(carbonate)、缩酮、硫缩酮(thioketal)、缩醛、硫缩醛、芳基卤、芳基磺酸酯(aryl sulfonate)、烃基卤、烃基磺酸酯(alkyl sulfonate)、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、口恶唑烷、口恶唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺(sulfonamide)、环氧化物、吖丙啶(aziridine)、异氰酸酯(isocyanate)、磺酰氯、重氮化合物、酰基氯(acid chloride)等。

在一些实施方案中，结合小分子是USP1拮抗剂。在一些实施方案中，结合小分子是UAF1拮抗剂。在一些实施方案中，结合小分子是ID1拮抗剂.在一些实施方案中，结合小分子是ID2拮抗剂。在一些实施方案中，结合小分子是ID3拮抗剂。在一些实施方案中，结合小分子能够抑制超过一种ID(例如两种ID、三种ID、或四种ID)。在一些实施方案中，结合小分子抑制USP1与UAF1的相互作用。在一些实施方案中，结合小分子阻断ID的脱泛素化。在一些实施方案中，结合小分子抑制ID与bHLH的相互作用。在一些实施方案中，结合小分子抑制对USP1的切割。

在一些实施方案中，结合小分子是USP1拮抗剂，且USP1拮抗剂是泛素醛。在此情况中，认为USP1拮抗剂通过与USP1酶形成紧密的复合物来起作用，如记载于Hershko等(Ubiquitin-aldehyde:a general inhibitor ofubiquitin-recycling processes.Proc Natl Acad Sci1987April；84(7):1829-33)的，其通过提及收入本文。泛素醛可获自例如Enzo Life Sciences。在一些实施方案中，结合小分子是USP1拮抗剂，且USP1拮抗剂是喜树碱。认为喜树碱抑制USP1和UAF1复合物的形成。见例如Mura等Mol Cell Biol(2011)31:2462。在一些实施方案中，结合小分子是USP1拮抗剂，且USP1拮抗剂NSC632839盐酸盐(3,5-二[(4-甲基苯基)亚甲基]-4-哌啶酮盐酸盐；CAS No.157654-67-6)(Tocris)。

在一些实施方案中，结合小分子是ID拮抗剂，且ID拮抗剂能够抑制超过一种ID(例如两种ID、三种ID、或四种ID)。在一些实施方案中，结合小分子是ID拮抗剂，且ID拮抗剂能够抑制ID1和ID3。在一些实施方案中，能够抑制ID1和ID3的ID拮抗剂是四环素。美国专利公开文本No.2003/0022871描述了四环素作为Id1和Id3拮抗剂的用途，通过提及将其内容完整收录。“四环素”指具有元素式C₂₂H₂₄N₂O₈和名称[4S-(4I,5aI,5aI,6J,12aI)]-4-(二甲基氨基)-1,4,4a,5,5a,6-11,12a-八氢-3,6,10,12,12a-五羟基(peiztaiydroxy)-6-甲基-1,11-二氧-2-并四苯甲酰胺(naphthacenecarboxamide)的化合物。下文列出了四环素结构：

或者，化合物包含四环素的类似物或衍生物。四环素的许多类似物和衍生物在本文中描述的方法中具有应用。在一个具体的实施方案中，在本文中具有应用的四环素类似物或衍生物具有通式结构，该通式结构包含：

其中R₁、R₂、R₃、R₄、和R₅可以是相同或不同的，且包含H、低级烃基(C1-C4)、C1-C4烷氧基、环烷基、芳基、或杂环的环结构。

在本文中具有应用的四环素类似物或衍生物的其它例子在美国专利No.5,589,470；5,064,821；5,811,412；4,089,900；4,960,913；4,066,694；4,060,605；3,911,111；和3,951,962(在此通过提及将其内容完整收入本文)中列出。

E.拮抗剂多核苷酸

本文中提供了多核苷酸拮抗剂。多核苷酸可以是反义核酸和/或核酶。反义核酸包含至少与USP1基因、和UAF1基因和/或ID基因(例如ID1、ID2和/或ID3)的RNA转录物的一部分互补的序列。然而，尽管优选绝对互补性，但是其不是必要的。本文中提及的“至少与RNA的一部分互补的”序列意指具有足够的互补性以能够与RNA杂交，形成稳定的双链体的序列；在双链USP1、UAF1和/或ID反义核酸的情况中，如此可以测试双链体DNA的单链，或者可以测定三链体形成。杂交能力会取决于互补性程度和反义核酸的长度两者。一般地，杂交的核酸越大，与USP1、UAF1和/或ID RNA的碱基错配越多，它可以含有且仍形成稳定的双链体(或三链体，情况也可以如此)。本领域技术人员可以通过使用标准规程测定杂交复合物的熔点来确认可容许的错配程度。

与信息5’端(例如5’非翻译序列直至AUG起始密码子且包括AUG起始密码子)互补的多核苷酸在抑制翻译方面应当最有效起作用。然而，已经显示了与mRNA的3’非翻译序列互补的序列也有效抑制mRNA的翻译。一般见Wagner,R.,1994,Nature372:333-335。如此，与USP1、UAF1和/或ID基因的5’-或3’-非翻译、非编码区互补的寡核苷酸可以在反义方法中使用以抑制内源XmRNA的翻译。与mRNA的5’非翻译区互补的多核苷酸应当包括AUG起始密码子的互补物。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸是不太有效的翻译抑制剂，但是可以依照本发明使用。不论设计为与USp1、UAF1和/或ID mRNA的5’、3’或编码区杂交，反义核酸的长度应当是至少6个核苷酸，并且优选是长度范围为6至约50个核苷酸的寡核苷酸。在具体的方面，寡核苷酸是至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的USP1、UAF1和/或ID反义核酸通过自外源序列转录在细胞内生成。例如，转录载体或其部分，生成USP1、UAF1和/或ID基因的反义核酸(RNA)。此类载体会含有编码USP1、UAF1和/或ID反义核酸的序列。此类载体可以仍然是附加体的或者变为染色体整合的，只要它可以被转录以生成期望的反义RNA。可以通过本领域中标准的重组DNA技术方法构建此类载体。载体可以是用于在脊椎动物细胞中复制和表达的质粒、病毒、或本领域中已知的其它载体。可以通过本领域中已知在脊椎动物(优选人细胞)中起作用的任何启动子表达编码USP1、UAF1和/或ID或其片段的序列。此类启动子可以是诱导型或组成性的。此类启动子包括但不限于SV40早期启动子区(Bernoist and Chambon,Nature29:304-310(1981)、劳氏肉瘤病毒的3’长末端重复中含有的启动子(Yamamoto等,Cell22:787-797(1980)、疱疹胸苷启动子(Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445(1981)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等,Nature296:39-42(1982))，等等。

本文中公开并例示了拮抗性多核苷酸。

在一些实施方案中，拮抗剂多核苷酸是USP1拮抗剂，且USP1拮抗剂是5’-TTGGCAAGTTATGAATTGATA-3’(SEQ ID NO:53)和/或5’-TCGGCAATACTTGCTATCTTA-3’(SEQ ID NO:54)。在一个实施方案中，拮抗剂多核苷酸是USP1拮抗剂，且USP1拮抗剂是5’-ACAGTTCGCTTCTACACAA-3’(SEQ ID NO:55)。见例如美国专利公开文本No.2010/0330599，在此通过提及将其内容完整收入本文。

在一些实施方案中，拮抗剂多核苷酸是ID2拮抗剂，且ID2拮抗剂是5’-gcggtgttcatgatttctt-3’(SEQ ID NO:56)和/或5’-caaagcactgtgtgtgggctga-3’(SEQID NO:57)。在一些实施方案中，拮抗剂多核苷酸是ID2拮抗剂，且ID2拮抗剂披露于WO1997/005283WO2009/059201和WO1997/005283，，在此通过提及将其内容完整收入本文。

在一些实施方案中，拮抗剂多核苷酸是ID1、ID2、ID3和/或ID4拮抗剂，且ID1、ID2、ID3和/或ID4拮抗剂披露于WO2001/066116，在此通过提及将其内容完整收录。

在一些实施方案中，拮抗剂多核苷酸是UAF1拮抗剂，且UAF1拮抗剂是5’-CCGGTCGAGACTCTATCATAA-3’(SEQ ID NO:58)和/或5’-CACAAGCAAGATCCATATATA-3’(SEQ ID NO:59)。在一些实施方案中，拮抗剂多核苷酸是UAF1拮抗剂，且UAF1拮抗剂是5’-CAAGCAAGATCCATATATA-3’(SEQ ID NO:60)。

F.抗体和结合多肽变体

在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体和/或结合多肽的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，靶物结合。

在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体和/或结合多肽变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。

表1

依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；

(3)酸性的：Asp,Glu；

(4)碱性的：His,Lys,Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly,Pro；

(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。

一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。

可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)中的任何方法将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、插入、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或是未改变的，或是含有不超过1、2或3处氨基酸替代。

一种可用于鉴定抗体和/或结合多肽中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys、和glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。

氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。

G.抗体和结合多肽衍生物

在某些实施方案中，可进一步修饰本文中提供的抗体和/或结合多肽以包含本领域中已知的且容易获得的别的非蛋白质性质模块。适合于抗体和/或结合多肽衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷(dextran)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环戊烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(或是同聚物或是随机共聚物)，右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇(propropylene glycol)同聚物、聚环氧丙烷(prolypropylene oxide)/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而有利于制备。聚合物可以是任何分子量的，且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目是变化的，且若附着超过一个聚合物，则它们可以是相同的或不同的分子。通常，可基于以下考虑确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，所述考虑包括但不限于，待改进之抗体和/或结合多肽的具体特性或功能，抗体衍生物和/或结合多肽衍生物是否会在限定条件下用于治疗，等等。

在另一个实施方案中，提供了抗体和/或结合多肽与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的偶联物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，且包括但不限于不会伤害普通细胞但将非蛋白质性质模块加热至邻近抗体-非蛋白质性质模块的细胞被杀死的温度的波长。

H.重组方法和组合物

可以使用重组方法和组合物来生成抗体和/或结合多肽，例如，如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，分离的核酸编码抗USP1抗体、抗USP1抗体或抗ID抗体(例如抗ID1抗体、抗ID2抗体、或抗ID3抗体)。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)，所述核酸编码抗体和/或结合多肽。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下列载体转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了生成抗体诸如抗USP1抗体、抗UAF1抗体和/或抗ID抗体(例如抗ID1抗体、抗ID2抗体、或抗ID3抗体)和/或结合多肽的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体和/或结合多肽的条件下培养包含编码抗体和/或结合多肽的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体和/或多肽。

对于抗体诸如抗USP1抗体、抗UAF1抗体和/或抗ID抗体(例如抗ID1抗体、抗ID2抗体、或抗ID3抗体)和/或结合多肽的重组生成，将编码抗体和/或结合多肽的核酸(例如如上文所描述的)分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。

适合于克隆或表达载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No.5,648,237,5,789,199和5,840,523(还可见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli.)中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离，并可以进一步纯化。

在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。

适合于表达糖基化抗体和/或糖基化结合多肽的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。

也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)的)；幼年仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。

虽然描述主要涉及通过培养用含有抗体和结合多肽编码核酸的载体转化或转染的细胞来生成抗体和/或结合多肽。当然涵盖了可采用本领域公知的备选方法来制备抗体和/或结合多肽。例如，可使用固相技术通过直接肽合成来生成适宜的氨基酸序列或其部分[见例如Stewart等,Solid-Phase PeptideSynthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,CA(1969)；Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154(1963)]。体外蛋白质合成可使用手工技术或通过自动化来进行。自动化合成可例如使用Applied Biosystems肽合成仪(Foster City,CA)使用制造商的说明书来完成。抗体或结合多肽的多个部分可分开化学合成，并使用化学或酶促方法组合以生成期望的抗体或结合多肽。

可以从培养液或从宿主细胞裂解物中回收各种形式的抗体和结合多肽。如果是膜结合的，那么可使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X100)或通过酶促裂解使其从膜释放。抗体和结合多肽表达中所采用的细胞可通过多种物理或化学手段破裂，诸如冻融循环、超声处理、机械破裂、或细胞溶解剂。

可能期望从重组细胞蛋白质或多肽纯化抗体和结合多肽。下面的流程是合适纯化流程的例示：在离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白A Sepharose柱以除去污染物诸如IgG；及结合抗体和结合多肽的表位标记形式的金属螯合柱。可采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，并描述于例如Deutscher,Methods in Enzymology,182(1990)；Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,Springer-Verlag,New York(1982)。纯化步骤的选择将取决于例如所用生成方法的性质和所产生的具体抗体或结合多肽。

在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤清除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等,Bio/Technology10:163-167,1992描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的流程。简单地说，在存在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可以通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。

可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等,EMBO J.5:1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。对于包含CH3结构域的抗体而言，可使用Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。

在任何初步的纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可以使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)进行低pH疏水相互作用层析。

III.筛选和/或鉴定具有期望功能的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或Id拮抗剂的方法

上文已经描述了用于生成抗体、结合多肽、和/或小分子的技术。可以进一步选择抗体，诸如本文中提供的抗USP1抗体、抗UAF1抗体和/或抗ID抗体(例如抗ID1抗体、抗ID2抗体、或抗ID3抗体)、结合多肽、和/或结合小分子，可以通过本领域中已知的多种测定法对其鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。

可通过本领域公知的方法，例如使用内源性或在用相应基因转染后表达USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)的细胞，来评估本发明的抗体、结合多肽或结合小分子的生长抑制效果。例如，可将适宜的肿瘤细胞系和USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)多肽转染细胞用不同浓度的本发明的单克隆抗体、结合多肽或其它小分子处理几天(例如2-7天)，并用结晶紫或MTT染色，或者通过一些其它比色测定法来分析。测量增殖的另一种方法是通过比较在存在或缺乏本发明的抗体、结合多肽或结合小分子时所处理细胞的3H-胸苷摄取。处理后，收获细胞并在闪烁计数器中对掺入DNA的放射性的量进行测量。适宜的阳性对照包括用已知抑制所选细胞系生长的生长抑制性抗体处理该细胞系。可以本领域知道的多种方法来测定体内肿瘤细胞的生长抑制。肿瘤细胞可以是过表达USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)多肽的细胞。与未处理的肿瘤细胞相比，抗体、结合多肽、和/或结合小分子将在体外或在体内抑制USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)表达肿瘤细胞的细胞增殖达约25-100％，更优选约30-100％，甚至更优选约50-100％或约70-100％，在一个实施方案中，抗体浓度为约0.5-30μg/ml。可在细胞培养物中在抗体浓度为约0.5-约30μg/ml或约0.5nM至约200nM时测量生长抑制，其中在使肿瘤细胞暴露于抗体后1-10天测量生长抑制。如果以约1μg/kg至约100mg/kg体重施用抗体导致在自首次施用抗体起约5天至3个月内、优选约5至30天内肿瘤体积缩小或肿瘤细胞增殖降低，那么该抗体是体内生长抑制性的。

为了选择抑制脱泛素化的抗体、结合多肽、和/或结合小分子，可以依照US2010/0330599和US2007/0061907(在此通过提及将其内容完整收录)中披露的方法测量USP1和/或UAF1的脱泛素酶活性。

为了选择诱导细胞死亡的抗体、结合多肽和/或结合小分子，可相对于对照评估膜完整性的丧失，这由例如碘化丙啶(PI)、锥虫蓝或7AAD摄取来指示。PI摄取测定法可在缺乏补体和免疫效应细胞时进行。将表达USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)多肽的肿瘤细胞与单独的培养基或含有适宜的抗体(例如约10μg/ml)、结合多肽或结合小分子的培养基一起温育。将细胞温育3天的时间段。每次处理后，清洗细胞并等分(aliquot)到35mm带滤盖的(strainer-capped)的12x75试管中(每支试管1ml，每个处理组3支试管)用于去除细胞团块。然后向试管加入PI(10μg/ml)。使用流式细胞仪和CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。可选择那些通过PI摄取确定为诱导统计学显著水平的细胞死亡的抗体、结合多肽或结合小分子作为诱导细胞死亡的抗体、结合多肽或结合小分子。

为了筛选结合多肽上目的抗体所结合的表位的抗体、结合多肽和/或结合小分子，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中所描述的。此测定法可用于确定测试抗体、结合多肽或结合小分子是否与已知抗体结合相同的位点或表位。或者/另外，可通过本领域已知的方法进行表位作图(mapping)。例如，可通过诸如丙氨酸扫描来诱变抗体序列以鉴定接触残基。首先对突变体抗体测试与多克隆抗体的结合以确保正确折叠。在不同的方法中，可在竞争测定法中使用对应于多肽不同区的肽，使用几种测试抗体或者一种测试抗体和具有已表征或已知表位的抗体。

本文中提供了筛选和/或鉴定促进细胞命运变化的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂的方法，所述方法包括：比较(i)参照细胞命运，其中所述参照细胞命运是参照细胞的细胞命运与(ii)候选细胞命运，其中所述候选细胞命运是在存在USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或ID候选拮抗剂的情况中所述参照细胞的细胞命运，其中所述USP1候选拮抗剂结合USP1，其中所述UAF1候选拮抗剂结合UAF1，和/或所述ID候选拮抗剂结合ID，由此所述参照细胞命运和所述候选细胞命运之间的细胞命运差异将所述USP1候选拮抗剂和/或所述ID候选拮抗剂鉴定为促进细胞命运的变化。

本文中还提供了筛选和/或鉴定诱导细胞周期停滞的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂的方法，所述方法包括：比较(i)在存在USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或ID候选拮抗剂的情况中接触参照细胞，其中所述USP1候选拮抗剂结合USP1，其中所述UAF1候选拮抗剂结合UAF1，和/或所述ID候选拮抗剂结合ID，由此细胞周期停滞将所述USP1候选拮抗剂和/或ID候选拮抗剂鉴定为诱导细胞周期停滞。

在任何筛选方法的一些实施方案中，USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或ID候选拮抗剂是USP1候选拮抗剂。在任何筛选方法的一些实施方案中，USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或ID候选拮抗剂是ID候选拮抗剂。在一些实施方案中，ID候选拮抗剂是ID1候选拮抗剂、ID2候选拮抗剂、和/或ID3候选拮抗剂。在任何筛选方法的一些实施方案中，USP1候选拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID候选拮抗剂是UAF1候选拮抗剂。

在任何筛选方法的一些实施方案中，参照细胞命运是干细胞命运。在一些实施方案中，干细胞命运是间充质干细胞命运。在任何筛选方法的一些实施方案中，候选细胞命运是成骨细胞细胞命运、软骨细胞细胞命运、或脂肪细胞细胞命运。在一些实施方案中，候选细胞命运是成骨细胞细胞命运。

在任何筛选方法的一些实施方案中，USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或ID候选拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子、或多核苷酸。

1.结合测定法和其它测定法

在一个方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法，诸如ELISA、Western印迹等进行。

J.用于诊断学和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗USP1抗体、抗UAF1抗体、和/或抗ID抗体(例如ID1、ID2、和/或ID3)可用于检测生物学样品中USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)的存在。在某些实施方案中，本文中提供的任何抗USP1结合多肽、抗UAF1结合多肽、和/或抗ID结合多肽(例如ID1、ID2、和/或ID3)可用于检测生物学样品中USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)的存在。如本文中使用的，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织，诸如骨。

在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗USP1抗体、抗UAF1抗体、和/或抗ID抗体(例如ID1、ID2、和/或ID3)。在又一方面，提供了检测生物学样品中USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)的存在的方法。在又一方面，提供了将个体鉴定为适合于用USP1、UAF1和/或ID拮抗剂治疗的方法，其包括测定一种或多种选自下组的基因的表达(例如表达水平)：USP1、UAF1和/或ID(例如ID1、ID3和/或ID3)。在又一方面，提供了将个体鉴定为适合于用USP1、UAF1和/或ID拮抗剂治疗的方法，其包括测定一种或多种选自下组的基因的表达(例如表达水平)：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如与参照数值和/或内部参照(例如CD144)比较)。在一些实施方案中，基于一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平，选择个体进行治疗：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如与参照数值和/或内部参照(例如CD144)比较)。在一些实施方案中，基于一种或多种选自下组的基因的低表达水平，不选择个体进行治疗：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如与参照数值和/或内部参照(例如CD144)比较)。在一些实施方案中，基于一种或多种选自下组的基因的低表达水平，选择个体进行治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与参照数值和/或内部参照(例如CD144)比较)。在一些实施方案中，基于一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平，不选择个体进行治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与参照数值和/或内部参照(例如CD144)比较)。

在某些实施方案中，表达是蛋白质表达。在某些实施方案中，表达是多核苷酸表达。在某些实施方案中，多核苷酸是DNA。在某些实施方案中，多核苷酸是RNA。

用于测定mRNA、蛋白质的表达或基因扩增的各种方法包括但不限于基因表达序型分析、聚合酶链式反应(PCR)，包括定量实时PCR(qRT-PCR)、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达连续分析(SAGE)、MassARRAY、蛋白质组学、免疫组织化学(IHC)，等等。在一些实施方案中，量化蛋白质表达。例如，可以对患者肿瘤样品使用IHC实施此类蛋白质分析。

在一方面，使用方法测定生物标志物的水平，所述方法包括：(a)对样品(诸如患者癌症样品)实施基因表达序型分析、PCR(诸如rtPCR)、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、或FISH；并b)测定样品中生物标志物的表达。在一方面，使用方法测定生物标志物的水平，所述方法包括：(a)用抗体对样品(诸如患者癌症样品)实施IHC分析；并b)测定样品中的生物标志物表达。在一些实施方案中，相对于参照数值测定IHC染色强度。

在某些实施方案中，所述方法包括在容许抗USP1抗体结合USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)的条件下使生物学样品与如本文中描述的抗USP1抗体、抗UAF1抗体、和/或抗ID抗体(例如ID1、ID2、和/或ID3)接触，并检测抗USP1抗体、抗UAF1抗体、和/或抗ID抗体(例如ID1、ID2、和/或ID3)和USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)之间是否形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗USP1抗体选择适合于用抗USP1抗体、抗UAF1抗体、和/或抗ID抗体(例如ID1、ID2、和/或ID3)治疗的受试者，例如其中USP1、UAF1、和/或ID(例如ID1、ID2、和/或ID3)是用于选择患者的生物标志物。

在某些实施方案中，提供了经标记的抗USP1抗体、抗UAF1抗体、和/或抗ID抗体(例如ID1、ID2、和/或ID3)。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光、和放射性标记物)、及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、和¹³¹I、荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶、生物素/亲合素、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基、等等。

K.药物配制剂

通过将具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或ID拮抗剂(例如ID1拮抗剂、ID2拮抗剂、或ID3拮抗剂)的药物配制剂。在一些实施方案中，USP1拮抗剂和/或ID拮抗剂(例如ID1拮抗剂、ID2拮抗剂、或ID3拮抗剂)是结合小分子、抗体、结合多肽、或多核苷酸。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。

例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。

本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的组分。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。

活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington’s PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980)。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。

用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。

L.制品

在本发明的另一个方面，提供了含有上文所述可用于治疗、预防和/或诊断病症的材料的制品。所述制品包括容器和所述容器上或与所述容器相连的标签或包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器、IV溶液袋、等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有独自或与另一组合物组合有效治疗、预防和/或诊断所述疾患的组合物，而且可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或带有皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶)。所述组合物中的至少一种活性药剂是本发明的抗体。所述标签或包装插页指明该组合物用于治疗选择的疾患。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包括USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂和/或ID拮抗剂(例如ID1拮抗剂、ID2拮抗剂、或ID3拮抗剂)；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包括别的细胞毒剂或其它治疗剂。本发明此实施方案中的制品还可包括指示所述组合物可用于治疗特定疾患的包装插页。或者/另外，所述制品可进一步包括第二(或第三)容器，其中装有药学可接受的缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、和注射器。

要理解，任何上述制品可包括本发明的免疫偶联物代替或补充抗USP1抗体、抗UAF1抗体、和/或抗ID抗体(例如抗ID1抗体、抗ID2抗体、或抗ID3抗体)。

实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。

用于实施例的材料和方法

细胞系和培养条件

将人细胞系143B、293T、HOS、MG-63、SAOS-2、SJSA、和U2-OS(ATCC)在具有10％FBS(Sigma)、10U/ml青霉素、和10μg/ml链霉素(Gibco)的DMEM中维持。将原代人成骨细胞(PromoCell)在原代成骨细胞培养基(PromoCell)中扩充，并且在如上文那样补充的DMEM中传代培养。将自正常骨髓衍生的原代人间充质干细胞(Lonza)在间充质干细胞生长培养基(Lonza)中传代培养。对于成骨分化研究，将hMSC在补充有100ng/mL BMP-9(R&D Systems)的成骨分化培养基(Lonza)中培养。原代(primary)人骨肉瘤获自CytoMix,LLC，及Cooperative Human Tissue Network。将原代成骨细胞以第2-3代使用，并且通过碱性磷酸酶的表达、茜素红反应性、和成骨细胞特异性转录物Osterix和骨粘连蛋白(如通过RT-PCR评估)确认。将鼠NIH-3T3(ATCC)在补充了的DMEM中培养。野生型和USP1-/-DT-40细胞是来自K.Patel的馈赠，并且将其在具有7％FBS和3％鸡血清(Gibco)的RPMI中培养。以10μM使用MG-132(Calbiochem)。以25μg/ml使用环己酰亚胺(Sigma)。

表达载体

将人脱泛素酶(包括USP1和突变体USP1C90S)的cDNA合成(Blue HeronBiotechnology)，并在具有或没有符合读码框的C端Flag表位的情况中克隆入pRK2001中。经由保留密码子的定点诱变生成shRNA抗性USP1。将ID1、ID2、和ID3从Jurkat衍生的cDNA扩增，并且以符合C端Flag表位读码框的方式克隆入pRK2001中。将WDR48从表达载体(Origene)扩增，并亚克隆入pRK2001中。已经描述了编码HA-泛素的质粒(Wertz,等,Nature430,694,2004)。pMACS(一种截短的鼠MHC I类H-2Kk表达载体)获自Miltenyi Biotec。对于病毒表达研究，将ID2和USP1变体克隆入逆转录病毒载体pQCXIP(Clontech)或慢病毒载体pHUSH.Lenti.Puro(David Davis,Genentech,BMC Biotechnol.2007Sep26；7:61)中。

pRS表达载体中靶向USP1(A-TI333874(SEQ ID NO:6)5’-TGGTGGACTTTCCAAGATCAACACTCCTT-3’)或(B-TI333876(SEQ IDNO:7)5’-CAAGGAATCCAGTGACCAAACAGGCATTA-3’)、ID1(TI315979(SEQ ID NO:8)5’-GAGATTCTCCAGCACGTCATCGACTACAT-3’)、ID2(TI349048(SEQ ID NO:9)5’-CCTTCTGAGTTAATGTCAAATGACAGCAA-3’)、ID3(TI375157(SEQ IDNO:10)5’-TGGTCTCCTTGGAGAAAGGTTCTGTTGCC-3’)的shRNA载体或非靶向对照序列(pRS30003(SEQ ID NO:11)5’-TGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGC-3’)获自Origene。除非另有指示，在USP1敲低实验中使用shUSP1-B。

pTRIPZ表达载体中靶向人USP1(5’-AGGCAATACTTGCTATCTTAAT-3’(SEQ ID NO:12))、鼠ID1(5’-CGCAGCACGTCATCGACTACAT-3’(SEQ IDNO:13))、鼠ID2(5’-CGCAAAGTACTCTGTGGCTAAA-3’(SEQ ID NO:14))、(5’-CGCAGCACGTCATCGATTACAT-3’(SEQ ID NO:15))、(5’-CTGACTGCTACTCCAAGCTCAA-3’(SEQ ID NO:16))、鼠ID3(5’-CGCCCTGATTATGAACTCTATA-3’(SEQ ID NO:17))、(5’-ACCTGATTATGAACTCTATAAT-3’(SEQ ID NO:18))、(5’-CGCCCTCTTCACTTACCCTGAA-3’(SEQ ID NO:19))的多西环素诱导型shRNA构建体或非靶向对照获自Open Biosystems。

转染、细胞分选、RNA、和蛋白质提取

将U2-OS、HOS、SJSA、SAOS、或MG-63细胞培养至10-25％汇合，并且使用FuGENE6(Sigma)与标志物质粒pMACS组合用指定质粒转染。用MACS-选择H-2Kk微珠(Miltenyi Biotec)分选经转染的细胞。用Qiagen RNeasy迷你试剂盒从培养的或分选的经转染细胞提取RNA。经由在补充有蛋白酶抑制剂混合物I和磷酸酶抑制剂混合物1和2(Calbiochem)的NP-40缓冲液(1％NP-40，120mM NaCl，50mM Tris，pH＝7.4，1mM EDTA)中裂解从分选的或培养的细胞提取蛋白质。通过以15,000xG离心10分钟使裂解物澄清，之后进行分析。通过BCA蛋白质测定法(Thermo Scientific)标准化蛋白质含量。对于双重shRNA/siRNA实验，将细胞经由Fugene用DNA表达载体转染，随后在核转染溶液V(Lonza)中以程序X-001经由核转染用对照siRNA(有义-5’-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO:20))或靶向p21的siRNA(5’-CGATGGAACTTCGACTTTGTT-3’(SEQ ID NO:21))转染。通过在核转染溶液T(Lonza)中以程序B-023的核转染转染DT-40细胞。

抗体、Western印迹、和免疫沉淀

针对人USP1或WDR48的C端100个氨基酸制备大鼠单克隆抗体，以生成单克隆USP1抗体5E10和WDR48抗体9F10。识别ID1、ID2、ID3、E47、和p53(Santa Cruz Biotechnology)、GAPDH(Assay Designs)、Flag、HA、微管蛋白、和肌动蛋白(Sigma)、p21WAF1/CIP1(Cell Signaling)、E-钙粘着蛋白和N-钙粘着蛋白(BD Transduction Labs)、和纤连蛋白(Calbiochem)的抗体获自商业来源。在存在10μM MG-132的情况中用指定抗体和蛋白A/G琼脂糖珠(Pierce)实施免疫沉淀。将蛋白质提取物在Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上分开，并转移至0.2μM硝酸纤维素膜(Invitrogen)以进行免疫印迹分析。

RNA分析

使用Qiagen RNEasy RNA分离试剂盒提取RNA。使用QuantiTect SYBRGreen RT-PCR系统(Qiagen)，使用靶向USP1(5’：5’-GCCACTCAGCCAAGGCGACTG-3’(SEQ ID NO:22)；3’：5’-CAGAATGCCTCATACTGTCCATCTCTATGC-3’(SEQ ID NO:23))、ID1(5’:5’-GAGCTGGTGCCCACCCTGC-3’(SEQ ID NO:24)；3’：5’-GATCGTCCGCAGGAACGCAT-3’(SEQ ID NO:25))、ID2(5’：5’-CAAGAAGGTGAGCAAGATGGAAATCCT-3’(SEQ ID NO:26)；3’：5’-ACAGTGCTTTGCTGTCATTTGACATTAACTC-3’(SEQ ID NO:27))、ID3(5’:5’-GAGCCGCTGAGCTTGCTGGA-3’(SEQ ID NO:28)；3’：5’-ATGACAAGTTCCGGAGTGAGCTCG-3’(SEQ ID NO:29))、p21(5’：5’-CTTGGCCTGCCCAAGCTCTACCTTCCCACG-3’(SEQ ID NO:30)；3’：5’-GGGCTTCCTCTTGGAGAAGATCAGCCGGCG-3’(SEQ ID NO:31))、Runx2(5’：5’-ATGGGACTGTGGTTACTGTCATGGCGGG-3’(SEQ ID NO:32)；3’：5’-CTGGGTTCCCGAGGTCCATCTACTGTAACTTTAATTGC-3’(SEQ IDNO:33))、Osterix(5’:5’-CTCTCCATCTGCCTGGCTCCTTGGGAC-3’(SEQ IDNO:34)；3’：5’-CCTCAGGCTATGCTAATGATTACCCTCCCTTTTCCC-3’(SEQ ID NO:35))、骨粘连蛋白(5’：5’-GCACCATGAGGGCCTGGATCTTCTTTCTCC-3’(SEQ ID NO:36)；3’：5’-GGTTCTGGCAGGGATTTTCCGCCACC-3’(SEQ ID NO:37))或β-肌动蛋白(5’：5’-GTCGACAACGGCTCCGGC-3’(SEQ ID NO:38)；3’：5’-GGTGTGGTGCCAGATTTTCT-3’(SEQ ID NO:39))的DNA寡核苷酸引物从每种相应的基因扩增mRNA，并且用ABI7500实时PCR系统(AppliedBiosystems)热循环。用序列检测软件v1.4(Applied Biosystems)分析数据。使用β-肌动蛋白mRNA水平来标准化USP1和ID mRNA水平以校正加载和样品误差。

使用表达探针208937_s_at(ID1)、213931_at(ID2)、207826_s_at(ID3)、202412_s_at(USP1)、202284_s_at(p21)、219534_x_at(p57)、236313_at(p15)、和207039_at(p16)自指定人骨样品中RNA表达水平的GeneLogic微阵列分析(Ocimum Biosolutions)获得原代(primary)肿瘤RNA数据。将样品与HGU133PAffymetrix芯片杂交。

免疫组织化学

将经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片封固在载玻片上，脱石蜡化，并用dH2O再水合。为了恢复抗原，将样品在靶物修复溶液(Dako)中于99℃温育20分钟，并且冷却至74℃达20分钟。通过在亲合素/生物素封闭试剂盒缓冲液(Vector Labs)中温育，接着在3％BSA中于RT温育30分钟淬灭内源过氧化物酶、亲合素、生物素和免疫球蛋白。在淬灭后，将样品于RT在一抗中温育60分钟，在Dako清洗缓冲液中漂洗两次，并且在Vectastain试剂盒(Vector Labs)缓冲液中温育30分钟。通过在过氧化物酶底物缓冲液(Pierce)中温育显现染色。用迈尔(Mayer)氏苏木精对样品复染色，并用盖玻片封固，之后成像。RT＝室温。

流式细胞术

通过用缀合有FITC的H-2Kk抗体(Miltenyi Biotec)染色，接着是70％乙醇固定和用具有RNA酶A(Sigma)的碘化丙啶(Sigma)进行DNA标记对经转染的细胞实施细胞周期分析(Krishan,等,J.Cell Biol.66:188,1975)。使用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)评估FITC+细胞的DNA含量。用FlowJo v8.7.3软件(Tree Star,Inc.)分析数据。用FlowJo细胞周期平台量化细胞周期百分位数。

通过用缀合有PE的对CD90(Chemicon)、CD105(R&D Systems)、CD106(SouthernBiotech)、和CD144(eBioscience)特异性的抗体、或同种型对照(R&DSystems)染色对骨肉瘤细胞系和hMSC评估hMSC标志物表达。使用FACSCalibur流式细胞仪定量标志物的几何均值表达。

免疫荧光测定法

将如描述的那样用载体稳定转导的U2-OS细胞在室式载玻片上培养至汇合，并用3μg/ml多西环素(Clontech)处理14天，在PBS中的1％PFA中固定，并用E-钙粘着蛋白-FITC、N-钙粘着蛋白(BD transduction laboratories)、或纤连蛋白(Calbiochem)探查。用山羊抗小鼠FITC(Southern Biotech Associates)检测未连接的抗体。用ProLong Gold封固剂(Invitrogen)封固盖玻片。

体内脱泛素化测定法

如描述的那样转染293T细胞，并用10μM MG-132处理30分钟，之后在补充有10μM MG-132和10mM N-乙基马来酰亚胺(Sigma)的NP-40缓冲液中裂解。将澄清的裂解物用1％SDS解离，并于95℃煮沸5分钟，然后在裂解缓冲液中以1:20稀释，之后用M2-琼脂糖抗Flag珠(Sigma)进行免疫沉淀。通过用HA抗体的免疫印迹评估泛素水平。

体外脱泛素化测定法

在不同批次中用USP1-Flag、USP1-C90S-Flag或ID2-Flag和HA-泛素转染293T细胞。自SDS煮沸的裂解物免疫沉淀泛素化的ID2-Flag，如上文描述的。在NP-40裂解缓冲液中裂解后，用Flag M2-琼脂糖珠免疫沉淀USP1和USP1C90S。用500μg/ml3xFlag肽(Sigma)自珠洗脱所有样品。将样品在脱泛素化缓冲液(20mM HEPES,20mM NaCl,100μg/ml BSA,500μM EDTA,1mM DTT,pH＝8.3)中再组合，并于室温温育指定的时间。通过用HA抗体的免疫印迹评估泛素水平。

骨肉瘤分化测定法

如下用pRS shUSP1或shCTL将U2-OS、HOS、或SAOS细胞转染三次：最初，将细胞用shUSP1或shCTL转染，培养2天，并用嘌呤霉素选择3天。将细胞用pMACS和shUSP1或shCTL再转染，培养2天，通过抗H-2Kk珠分选(Miltenyi)分选，培养1天，并用shUSP1或shCTL连续再转染。将细胞再培养3天，并通过流式细胞术、实时RT-PCR、和ALP测定法评估成骨细胞和hMSC标志物。用基于pTRIPZ的诱导型USP1或对照shRNA载体转导143B细胞，并将嘌呤霉素抗性细胞传代培养。

对硝基酚磷酸酯切割测定法

用具有蛋白酶体抑制剂，但没有磷酸酶抑制剂的NP-40缓冲液生成细胞裂解物，并且在蛋白质含量方面标准化。将裂解物添加至透明底部96孔板中的对硝基苯基磷酸酯酶底物系统溶液(Sigma)，并于室温温育0.5-20小时。使用已知量的4-硝基酚(Sigma)的稀释系列作为参照。通过用SpectraMax190分光光度计(Molecular Devices)以405nm进行OD吸光度测量定量活性，并用SoftMax Pro v5.3软件(MDS Analytical Technologies)分析。在蛋白质输入和反应时间方面标准化数据。

茜素红染色

将在8孔室式载玻片上分配的分化hMSC用冰冷的70％乙醇固定30分钟，用去离子水清洗，并在0.2％茜素红染料(Ricca Chemical)，pH6.4中温育30分钟。染色后，将细胞在去离子水中漂洗两次，并获得图像。

3T3转化测定法

将鼠3T3成纤维细胞用USP1-Flag、USP1-C90S-Flag、ID2-Flag、或空对照表达载体转导，并且表达2天后，在1％琼脂床上在具有FBS和青霉素/链霉素且具有0.5％低熔点琼脂的DMEM中铺板。将细胞温育21天，并且通过视觉检查对8或更多个细胞集落评分。将来自经USP1转化的样品的经转化的集落从琼脂回收，传代，并且在软琼脂中再接种以确认转化。在所有传代样品中观察到强集落生长(数据未显示)。

对于ID1、ID2、ID3敲低研究，将经USP1转导的3T3细胞用基于pTRIPZ的ID1、ID2、和ID3诱导型shRNA表达载体或对照shRNA载体转导，并用3μg/ml多西环素(Clontech)处理72小时，之后进行琼脂包埋。在1％和0.5％琼脂两者中都包含3μg/ml多西环素。

体内研究

给8周龄雌性NCr裸鼠(Taconic Laboratories,Hudson,NY)或C.B-17SCID.bg小鼠(Charles Rivers Laboratories,Hollister,CA)在右后体侧中皮下注射在100μl体积的HBSS中1x106个细胞鼠3T3成纤维细胞(USP1、USP1-C90S、ID-2、或载体对照转导)。对小鼠监测肿瘤建立和生长及体重变化。在给定组中的小鼠达到均值肿瘤体积2000mm3和/或达到接种后40天时，对小鼠实施安乐死并解剖以确认肿瘤形成的存在或缺乏。

给8周龄雌性NCr裸鼠在右后体侧中皮下注射100μl体积的HBSS+基质胶中2.5x10⁶个143B shUSP1细胞。给经多西环素处理的小鼠喂养5％蔗糖水中的1mg/mL多西环素溶液。对小鼠监测肿瘤建立和生长及体重变化。在给定组中的小鼠达到均值肿瘤体积2000mm³和/或达到接种后78天时，对小鼠实施安乐死并解剖以确认肿瘤形成的存在或缺乏。

USP1^-/-小鼠的生成

USP1基因靶向C57BL/6鼠ES细胞获自敲除小鼠项目(Knockout MouseProject)(KOMP)保藏所(Davis,CA)。通过用Cre重组酶进行电穿孔在ES细胞中删除条件等位基因，之后进行胚泡注射。

微计算机断层摄影术

用μCT40(SCANCO Medical,Basserdorf,Switzerland)x-射线微计算机断层摄影术系统用下列参数对d12.5小鼠幼畜、受孕后18.5天的胚胎、或其切开的股骨成像：x-射线管能量水平＝70kV(对于股骨)或者45kV(对于整个小鼠)，或者x-射线管能量水平＝45kV，电流＝177μA，积分时间＝300msec，1000次投射(对于股骨)。以各向同性分辨率12μm(对于股骨分析)或30μm(对于胎畜/幼畜)获得轴向图像。使用羟磷灰石(HA)幻图来校正骨矿物密度(BMD)的x-射线吸收。用Analyze(AnalyzeDirect Inc.,Lenexa,KS,USA)分析微计算机断层摄影术扫描。为每个样品创建矢面中的最大强度投影和3D表面描绘。基于扫描设置，应用阈值，接着应用侵蚀-膨胀以分割矿化骨骼与软组织。

破骨细胞的原位TRAP染色

将经载玻片封固的来自经福尔马林固定的、经石蜡包埋的P12鼠股骨的5μm切片制备，并用387A酸性磷酸酶，白细胞(TRAP)试剂盒依照制造商的说明书进行TRAP染色(SIGMA)。对于计数研究，在10个视野中对TRAP阳性破骨细胞计数。

脱氧吡啶诺林和肌酸酐量化

自E18.5小鼠收集羊水，通过ELISA(TSZ ELISA)检测脱氧吡啶诺林，并通过比色化学测定法(R&D Systems)按照制造商的方案检测肌酸酐。

USP1使ID蛋白脱泛素化和稳定化

为了鉴定稳定化ID蛋白的脱泛素酶(DUB)，将94种具有C端Flag表位的人DUB在293T细胞中过表达，并且通过Western印迹评估内源ID2丰度(见在线可获得的表S1)。293T细胞以蛋白酶体依赖性方式降解ID2，因为ID2在用蛋白酶体抑制剂MG-132处理后积累(图2A)。提高内源ID2的DUB是USP36、USP33、SENP3、SENP5、USP37、OTUD5、USP9Y、USP45、和USP1(图2A)。为了排除提高ID2表达的间接机制，聚焦于ID2相互作用性DUB USP1和USP33(图2B)。然而，与USP1不同，USP33缺乏针对ID2的脱泛素化活性(数据未显示)。

为了测定USP1是否延长ID2的半衰期，将293T细胞用USP1转染，并在用翻译抑制剂环己酰亚胺处理后监测ID2丰度。在缺乏新蛋白质合成的情况中，ID2从用对照载体转染的细胞快速清除，半衰期是约2分钟(图1A)。过表达的USP1将ID2的半衰期延长到超过80分钟。USP1的蛋白水解活性是ID2积累必需的，因为无催化活性的点突变体USP1C90S(Nijman等,2005)既不延长ID2的半衰期(图1A)，也不改变ID2稳态丰度(图1B)。用ID1和ID3获得类似的结果。USP1表现为特异性靶向ID，因为它不增强不稳定性IkBa的表达(Palombella等,1994)。

接着，评估USP1对ID2泛素化的影响。野生型USP1而非USP1C90S降低用有HA标签的泛素修饰的ID2的量(图1C)。通过过表达USP1辅因子WDR48增强基础的和USP1诱导的ID2脱泛素化两者(Cohn等,2007)(图1C)。为了解决USP1是否直接使ID2脱泛素化，将自293T细胞纯化的泛素化的ID2在体外与分开从293T细胞纯化的野生型USP1或USP1C90S一起温育。野生型USP1而非USP1C90S降低泛素化的ID2(图1D)，指示脱泛素化不大可能是共洗脱的蛋白酶的结果。ID2泛素化的降低对N-乙基马来酰亚胺也是敏感的，确认涉及半胱氨酸蛋白酶(图1D)。与泛素化的ID2为USP1底物一致，缺失突变体USP1D260–300与ID2相互作用较差(图2C)，并且不提高ID2丰度(图2D)。

USP1和ID2在原代骨肉瘤肿瘤亚组中相应过表达

为了鉴定USP1使ID蛋白脱泛素化的生物学背景，分析USP1表达样式。对健康的和患病的人组织的微阵列分析揭示了骨肉瘤肿瘤比健康的或骨关节炎的骨活组织检查表达更多USP1mRNA(图3A)。另一组原代(primary)人骨肉瘤活组织检查的Western印迹发现了在与3份正常原代人成骨细胞样品比较时，USP1在14份骨肉瘤中的7份中是升高的(图3B)。惊人地，这些原代人肿瘤样品中的ID2蛋白丰度与USP1丰度较好地相关联。一份异常的样品含有丰富的USP1但很少的ID2(图3B，第6道)，可能是由于USP1辅因子WDR48的较差表达所致。另一份样品含有丰富的ID2和很少的USP1(图3B，第16道)，其可以反映降低的ID2泛素化或其它DUB是有活性的。

原代骨肉瘤中的USP1蛋白的量在很大程度上与USP1mRNA丰度相关联(图3C)，这提示了骨肉瘤中升高的USP1是由于转录上调所致。比较而言，ID2蛋白和mRNA水平关联较差(图3D)。通过免疫组织化学确认原代骨肉瘤中USP1和ID2的同时过表达(图3E-3G)。这些结果强烈提示了USP1在骨肉瘤中在翻译后修饰ID蛋白。

USP1在骨肉瘤中使ID蛋白稳定化

还评估了人骨肉瘤细胞系和原代成骨细胞中的USP1丰度和ID2稳定性(图5A)。在U2-OS骨肉瘤细胞中，USP1是升高的，并且正常情况下不稳定的ID2是稳定的(图5A和5B)。用两种独特的USP1shRNA敲低USP1引起ID1、ID2、和ID3的降低，但是对ID4没有影响(图4A)。ID1、ID2、和ID3mRNA不是降低的，这排除降低的转录为ID蛋白丰度下降的原因(图7I)。用shRNA抗性USP1确认USP1敲低特异性，其将ID1、ID2、和ID3恢复至基础水平。USP1催化活性对于ID稳定性是至关重要的，因为shRNA抗性USP1C90S没有恢复ID蛋白水平。在骨肉瘤细胞系HOS、SAOS、和SJSA中观察到类似的结果(图5C)。USP1敲低不影响MG-63骨肉瘤细胞中的ID2丰度，这可能是因为这些细胞表达非常少的WDR48(图5C)。与WDR48缺陷限制MG-63细胞中的USP1活性一致，异位WDR48增加ID2(图5D)。

为了测定USP1敲低和ID1-3降低是否调控bHLH转录活性，用E框驱动的萤光素酶报告基因转染U2-OS细胞。相对于对照shRNA，USP1shRNA将此报告物的表达增强7至10倍，这与ID蛋白降低时bHLH蛋白的活化一致(图4B)。shRNA抗性野生型USP1，而非USP1C90S抑制由USP1敲低引起的、E框驱动的报告物活性，这确认了USP1催化活性是bHLH依赖性转录及ID蛋白稳定化需要的。

在内源USP1的敲低后ID1-3的急剧丧失提示了经由蛋白酶体介导的降解实现的ID蛋白脱稳定化。如预期的，蛋白酶体抑制剂MG-132没有单独改变U2-OS细胞中的ID蛋白丰度，这提示了ID在高度表达USP1的细胞中本质是稳定的(图4C)。然而，MG-132处理在USP1敲低后确实恢复ID表达，这指示了ID蛋白在USP1删除后受到蛋白酶体介导的清除。与此情况一致，经MG-132处理的U2-OS细胞中的USP1敲低增加泛素化ID2的量(图4D)。

接着，在骨肉瘤细胞中确认内源USP1与内源ID联合。ID2与来自U2-OS细胞的内源USP1共免疫沉淀(图4E)，尽管不是以1:1化学计量，但是这对于短暂的酶-底物相互作用应当是预期的。在HOS细胞中获得类似的结果(图5E)。USP1也与ID2共免疫沉淀(图4F)。这些结果共同提示了USP1是骨肉瘤中ID1、ID2、和ID3的有力DUB和稳定化因子。

USP1的ID2稳定化不限于骨肉瘤的背景。USP1-/-DT40鸡B细胞(Oestergaard等,2007)比其野生型对应物表达更少的ID2蛋白(图5F)，尽管表达类似水平的ID2mRNA(图5G)。与USP1使ID2脱泛素化和稳定化一致，用MG-132的蛋白酶体抑制在USP1-/-，而非野生型DT40细胞中增加ID2(图5H)。另外，用野生型USP1，而非USP1C90S重建的USP1-/-DT40细胞与野生型DT40细胞含有等同的ID2(图5I)。

USP1抑制骨肉瘤中p21介导的细胞周期停滞

骨肉瘤细胞中USP1缺陷和bHLH转录活性升高的一项潜在后果是对bHLH调节的CDKI p21的诱导。实际上，相对于用对照shRNA转染的细胞，p21在用USP1shRNA转染的U2-OS细胞中是升高的(图6A)。shRNA抗性野生型USP1，而非USP1C90S将p21降低至在对照细胞中观察到的水平，这确认了此背景中的敲低特异性。USP1敲低没有增加肿瘤抑制基因p53(一种公知的CDKN1A诱导物)，这提示了增加的p21是不依赖于p53的。

p21是一种有力的细胞周期行进抑制剂(Polyak等,1996)，因此评估USP1敲低后U2-OS细胞的增殖能力。与增加的p21一致，USP1敲低降低U2-OS细胞增殖(图6B和图7A)。shRNA抗性野生型USP1(而既不是USP1C90S也不是USP1D260-300)恢复细胞增殖(图7B和7C)，这指示了需要USP1催化活性和ID底物识别两者来维持U2-OS细胞增殖。类似地，USP1敲低降低HOS、SAOS、和SJSA，而非MG-63骨肉瘤细胞的增殖(图7D)。USP1敲低后对U2-OS细胞中DNA含量的流式细胞术分析揭示了细胞周期的G1和G2期的细胞的中等增加及S期的细胞的明显减少(图6C和图7E)。USP1敲低后的凋亡诱导是不显著的；观察到少数具有亚二倍体DNA含量的细胞，用膜联蛋白V染色的细胞没有增加，并且没有检测到升高的胱天蛋白酶-3加工(图7E；数据未显示)。惊人地，CDKN1A siRNA在USP1缺陷型U2-OS细胞中恢复S期进入(图7F和7G)，这指示了p21对于通过USP1敲低诱导的细胞周期停滞是必需的。

USP1经由ID蛋白调节骨肉瘤中的p21表达和细胞周期停滞

若在缺乏USP1的情况中的ID降解引起p21诱导，则ID蛋白的敲低应当为USP1敲低的拟表型。ID1-3的个别shRNA敲低不改变p21水平，但是组合敲低ID1、ID2、和ID3增加p21，这与USP1敲低类似(图7H)。ID和USP1缺陷型细胞也表达相当水平的CDKN1A mRNA(图7I)。与这些观察一致，ID缺陷与USP1缺陷类似地引起细胞周期停滞(图S3J和S3K)，并且这通过p21敲低挽救(图6D和6E)。

许多转录因子(包括p53)(其响应DNA损伤而活化)调节CDKN1A(Kastan等,1991)。p53敲低在U2-OS细胞中抑制依托泊苷诱导的p21，但是不阻断USP1敲低后看到的p21蛋白增加(图7L)，这支持不依赖于p53的p21诱导机制。由于报告了USP1在DNA修复期间靶向PCNA和FANCD2(Nijman等,2005；Huang等,2006)，测定由于USP1敲低所致的DNA损伤的产生。与DNA损伤有关的H2AX磷酸化(Rogakou等,1999)在依托泊苷处理而非USP1敲低后升高(数据未显示)。与USP1shRNA停滞p53缺陷型SAOS细胞的能力(图7D)组合，这些观察结果排除一般的DNA损伤及特别是p53为USP1敲低后p21诱导的中间体。

确认USP1经由ID调节p21表达和细胞循环，其通过用ID1、ID2、和ID3的异位表达挽救U2-OS细胞中的USP1敲低效果进行。USP1删除的细胞中的ID表达抑制p21表达(图6F)，并且阻断细胞周期停滞(图6G)。总之，结果证明了USP1在骨肉瘤中经由ID蛋白稳定化和对bHLH转录活性的抑制来抑制p21。

USP1和ID蛋白限制骨肉瘤中的成骨定型

骨肉瘤是异质肿瘤，其由成骨细胞、软骨细胞、和脂肪细胞的无构造块构成。认为这些肿瘤自可以引起所有三种谱系的间充质干细胞群体形成(Tang等,2008)。因而，骨肉瘤细胞系不能表达经典成骨细胞标志物，诸如RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(Luo等,2008)。骨肉瘤细胞系也表达间充质干细胞特征性的表面标志物，包括CD90、CD105、和CD106(Di Fiore等,2009)。鉴于ID在干细胞维持和分化调节中发挥的作用，调查骨肉瘤中通过USP1或ID敲低来触发成骨细胞分化。相对于对照细胞，用USP1或ID shRNA转染的U2-OS细胞表达更少的CD105、CD106、和CD90，而所有细胞表达等同量的无关表面标志物CD144(图9A)。用HOS、SJSA、和SAOS细胞系观察到类似的结果。USP1或ID敲低也提高成骨细胞性RUNX2、OSTERIX、和骨粘连蛋白的表达(图9B)，并且提高ALP活性(图9C)。U2-OS细胞中USP1敲低后升高的E-钙粘着蛋白表达和降低的N-钙粘着蛋白和纤连蛋白指示伴随骨肉瘤恶性状态的上皮至间充质转变的反转(图8A和8B)(Thiery等,2009)。这些数据共同提示了骨肉瘤中由USP1实现的ID蛋白稳定化阻断正常的成骨分化程序。

在143B骨肉瘤异种移植物模型中调查了USP1抑制作为肿瘤分化策略的潜力。多西环素诱导的USP1shRNA在异种移植物中抑制USP1表达，并且减少ID1和ID2(图8C和图9D)。ID3在此背景中检测不到(数据未显示)。USP1敲低还降低143B肿瘤生长(图8D)，促进骨粘连蛋白、RUNX2、SPP1/骨桥蛋白、OSTERIX、和BGLAP/骨钙蛋白表达(图8E和图9E)，而且增强ALP活性(图8F)。显著地，10个USP1缺陷型异种移植物肿瘤中的4个实现原位分化和淤滞，展现明显改变的细胞形态学和无细胞胶原块积累，这与光骨化一致(图8G)。继续增殖的肿瘤显示逃脱敲低的证据，这推测起来是由于shRNA的丧失或沉默所致(图9F)。这些数据指示降低USP1足以在骨肉瘤中启动成骨分化程序。

调节异常的USP1表达抑制hMSC分化

接着，测定USP1对ID的稳定化是否促成正常的间充质干细胞维持。USP1在原代hMSC中表达，但是在细胞在促进成骨细胞分化的条件中培养时稳定下降(图10A)。与先前的研究(Peng等,2003)一致，ID1和ID2被瞬时诱导，然后也下降。没有检出ID3(数据未显示)。与显示错误调节的ID表达抑制成骨分化的研究(Peng等,2004)一起，这些数据提示关于USP1过表达是否破坏hMSC分化的调查。过表达USP1并且在成骨分化培养基中培养的hMSC表达高得异常的ID1和ID2水平(图10B)，展现出较低的ALP活性(图10C)，显示最小程度的RUNX2、OSTERIX、和骨粘连蛋白诱导(图10D)，并且用茜素红染色较差，茜素红揭示矿物沉积，作为成骨细胞活性的经典标志物(图10E)。这些数据暗示过表达USP1的hMSC不能分化。在过表达ID2的hMSC中观察到类似的分化缺陷，而过表达USP1C90S的hMSC与对照细胞类似地分化。如此，USP1的催化活性是必需的，并且ID稳定化足以抑制成骨分化。

与其明显不能分化一致，过表达USP1或ID2的hMSC在存在过多成骨分化因子的情况中显著增殖(图10F)。比较而言，对照hMSC或那些表达USP1C90S的hMSC的增殖在其在培养物中分化时减慢。这些观察结果共同提示了USP1或ID2的过表达足以阻断成骨细胞分化，促进干样特征的保留，并且使细胞对分化引发物有抗性。

USP1促进转化和肿瘤形成

USP1抑制间充质干细胞分化及维持骨肉瘤细胞系增殖的能力提示了USP1可以促进细胞转化。用空载体、ID2、USP1、或USP1C90S稳定转导NIH3T3细胞。野生型USP1提高ID1-3的表达(图11A)，并且在软琼脂中引起不依赖于锚定的细胞增殖(图11B)，其是致癌转化的一项经典标志(Hanahan和Weinberg,2000)。比较而言，用空载体或USP1C90S转导的细胞在软琼脂中没有良好生长(图11B和11C)。令人感兴趣地，USP1比ID2产生更大的且更多的集落(图11C)，提示了多种ID蛋白的稳定化比仅ID2过表达可以是更为转化性的。

在将NIH3T3细胞在皮下植入C.B-17SCID.bg小鼠中时，在体内重演体外观察结果。对照细胞和表达USP1C90S的细胞不能产生可测量的肿瘤，而过表达USP1或ID2的细胞在植入后早到7天产生可测量的肿瘤(图11D)。在研究终点时的肿瘤总体视觉检查确认过表达USP1或ID2的细胞生成攻击性恶性(图11E)。在NCr裸鼠中观察到类似的结果。

用Id1、Id2、和Id3shRNA了解ID对NIH3T3细胞的USP1转化的贡献。对ID1-3的抑制(图11F)阻断软琼脂中的集落形成(图11G)，这指示了ID对于NIH3T3细胞的USP1转化是至关重要的。

USP1调节骨发育

由于USP1过表达损害间充质前体的成骨分化，而USP1丧失引起骨肉瘤细胞的成骨分化，用USP1基因靶向性小鼠评估USP1在调节正常骨发育中的作用。P12USP1-/-小鼠是骨质减少的，在颅骨和长骨的骨化中具有缺陷(图12A)。发育不全的胸肋可能促成USP1-/-幼畜中的致命性发绀呼吸衰竭(Kim等,2009)。USP1-/-新生儿和E18.5胚胎中的骨矿物密度和体积比在野生型同窝出生仔畜中小得多(图12B和12C及图13B和13C)。FANCD2或PCNA缺陷型小鼠都不展现出围产期致死性(Parmar等,2010；Roa等,2008)，这排除这些USP1底物的脱稳定化为与USP1缺陷有关的围产期致死性的主要原因。

USP1-/-和USP1+/+股骨含有类似数目的静息的、移行的、增殖的、和肥大的软骨细胞，但是出现的骨针上类骨质的沉积是降低的，这提示了类骨质沉积性成骨细胞的降低活性(图13D–13F)。与成骨细胞功能缺陷一致，骨碱性磷酸酶(BALP)(系统性成骨细胞活性的一种标志物)的血清水平在USP1-/-E18.5胚胎中降低(图12E)。USP1缺陷不改变破骨细胞丰度或活性(图13G–13I)，这排除USP1-/-小鼠中升高的骨吸收。显著地，且与骨肉瘤和间充质干细胞培养物中产生的观察结果一致，USP1-/-股骨干骺端比其野生型对应物含有更少的ID1和ID2(图12D和图13J)。这些数据指示调节骨肉瘤分化的USP1-ID轴在正常骨骼发育中重演。

讨论

这些实验显示了USP1使ID1、ID2、和ID3脱泛素化并稳定化，导致其升高的丰度。显著地，原代(primary)骨肉瘤肿瘤子集中升高的USP1蛋白和mRNA与升高的ID蛋白水平相关联。骨肉瘤细胞中的USP1敲低引起ID蛋白脱稳定化、编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI)p21的CDKN1A的不依赖于p53的诱导、和细胞周期停滞。另外，间充质干细胞标志物的表达是降低的，并且恢复成骨分化。这些数据提示了与急性前髓细胞性白血病一样，骨肉瘤可以适合于分化疗法(Soignet等,1998)。与USP1敲低形成对比，原代人间充质干细胞(hMSC)中的USP1过表达引起ID蛋白积累，并且干扰正常分化。实际上，USP1促进间充质细胞系的转化。最终，基因靶向性小鼠中USP1的丧失引起重度骨质减少，这与USP1在间充质谱系中的作用一致。这些结果强烈提示了USP1具有成骨潜力，并且经由破坏正常间充质干细胞定型和分化促进肿瘤发生。

特别地，在此研究中，显示了USP1对ID的稳定化维持显著分数的人骨肉瘤。USP1在原代骨肉瘤和骨肉瘤细胞系中通常过表达(图3)，并且通过使ID蛋白脱泛素化(图1和4)，抑制bHLH依赖性CDKI p21表达(图6)，导致未检查的细胞增殖(图8)。USP1过表达不仅是几种骨肉瘤细胞系的增殖必需的，它还足以阻止正常间充质细胞分化，这捕捉细胞处于干样状态(图10)。相反，骨肉瘤细胞系中的USP1敲低降低间充质干细胞标志物的表达，并且启动成骨发育程序(图8)。小鼠中的USP1缺陷损害正常的骨发生，并且导致明显的骨质减少(图12)。因此，假定过表达的USP1干扰间充质干细胞分化，并且由此促进恶性间充质细胞群体的形成。

USP1是骨肉瘤中过表达的ID DUB

能够使ID2稳定化的DUB的筛选(图2)鉴定出USP1和USP33两者，尽管USP33不能使ID2脱泛素化(数据未显示)。结合ID2的USP33可能阻止蛋白酶体对ID2的识别，并且阻止其降解。在筛选中增强ID2表达的其它DUB没有表现为与ID2相互作用，并且必然间接影响ID2丰度。这些DUB可以上调ID基因表达，干扰泛素缀合机制，或者以其它方式损害蛋白酶体功能。例如，USP9X可以通过使转录因子SMAD4脱泛素化及稳定化来上调ID2基因表达(Dupont等,2009)。

不清楚造成骨肉瘤子集中USP1过表达的机制(图3)。USP1mRNA和蛋白质水平强烈相关联，这暗示了转录上调。值得注意的是，最近的CGH分析发现了USP1基因座1p31.3在26％-57％骨肉瘤肿瘤中扩增(Ozaki等,2003；Stock等,2000)。

USP1经由ID介导的对CDKI p21的抑制来促进增殖

显示了USP1对ID蛋白的稳定化破坏骨肉瘤中的bHLH依赖性p21表达(图4和图S3)。如此，USP1过表达扰乱正常的成骨细胞分化，其特征在于多种CDKI的不依赖于p53的上调(Funato等,2001；Kenner等,2004；Matsumoto等,1998；Yan等,1997；Zhang等,1997)。CDKI功能在骨肉瘤中经常受到损害；CDKN2A/p16INK4a和CDKN2B/p15INK4b基因删除是常见的(Miller等,1996；Nielsen等,1998)，就像启动子甲基化所致的基因失活(Oh等,2006)。比较而言，CDK4(CDKI的一种靶物)由于基因扩增而通常在骨肉瘤中过表达(Ozaki等,2003)。ID介导的对p21的转录阻抑代表骨肉瘤中的另一种致癌机制。

已经在多种人癌症中观察到ID蛋白过表达，但是其在很大程度上归因于升高的ID转录(Perk等,2005)。例如，ID2在尤因氏肉瘤中通过EWS-Ets易位而转录上调(Nishimori等,2002)，尤因氏肉瘤是与骨肉瘤带有强烈相似性的类骨质肿瘤。具有遭到破坏的RB1基因拷贝的患者对骨肉瘤形成强烈敏感(Friend等,1986)，RB能够使ID2隔离并失活(Iavarone等,1994；Lasorella等,2000)。研究揭示了ID蛋白且继而是CDKI在骨肉瘤中可以为调节异常的另一种机制。

ID蛋白调控间充质前体的成骨发育

这些数据还暗示正常成骨发育中的ID蛋白。间充质干细胞中的ID2或USP1过表达抑制成骨分化，并且促进间充质干细胞特征的保留(图10)。这些发现支持一项最近的研究，该研究描述了ID蛋白在间充质分化中的作用(Peng等,2004)。引起兴趣的是，Id1/Id3化合物杂合突变体小鼠展现出颅盖缺陷和降低的成骨细胞长出(Maeda等,2004)，这提示了间充质增殖缺陷。不知道别的Id2缺陷是否会由于早期致死性而加剧此表型。将Id基因删除限于间充质谱系可以证明是有有信息价值的。

USP1^-/-小鼠中发生的骨质减少与通过骨肉瘤中的USP1敲低和原代hMSC中的USP1过表达预测的表型一致(图12和图13)。在每种背景中，这些数据提示了USP1-ID轴抑制谱系定型。一种独立的USP1缺陷型小鼠品系也表明发育不全和围产期致死性(Kim等,2009)。缺乏多种Id基因的小鼠在胚胎发生早期死亡(Lyden等,1999)，这会指示别的DUB在早期发育中调节ID蛋白稳定性，或者其它DUB可以补偿USP1的缺乏。

最近的研究提示了骨发生期间受到ID1-3抑制的bHLH蛋白可以属于Hey/Hes家族。Hey1过表达促进成骨分化，而Hey1敲低抑制成骨分化(Sharff等,2009)。类似地，Hes1过表达促进骨定型(Suh等,2008)。有可能的是，多种bHLH转录因子平行起作用以促进成骨细胞发育。USP1和ID蛋白会定位为广泛抑制间充质干细胞分化期间参与的bHLH驱动的定型信号。基于这些研究，提出USP1属于通过颠覆正常干(拉丁文为“caulo”)细胞生物学促进肿瘤发生的新兴的一组干-癌基因。

这些发现的一项结果(具有有意义的治疗性分支的)是对USP1蛋白酶活性的抑制应当制定恶性骨肉瘤中的分化程序，导致增殖能力的急剧下降和经转化变性的潜在反转。预期靶向USPl会影响所有USPl底物，包括FANCD2，但是这可以是有益的，因为缺乏正常p53检查点的肿瘤细胞中有缺陷的DNA修复预测为使它们对交联化疗剂或PARP抑制剂敏感(D'Andrea，2010)。如根据砷作为急性前髓细胞性白血病的分化疗法的巨大成功证明的，癌症的分化治疗提供了一种用于有效治疗先前致死性癌症的令人兴奋的选项。靶向USPl可以为成骨性肉瘤提供此类机会。

序列

USPl(SEQ ID NO：1)

mpgvipsesn glsrgspskk nrlslkffqk kctkraldft dsqeneekas eyraseidqv vpaaqsspin cekrcnllpf vglnnlgntcylnsilqvly fcpgfksgvk hlfniisrkk ealkdeanqk dkgnckedsl asyelicslq sliisveqlq asfilnpeky tdelatqprrllntlrelnp myegylqhda qevlqcilgn iqetcqllkk eevknvaclp tkvcciphpk ecmnginsie mdsmrhsedfkeklpkgngkrksdtefgnm kkkvklskch qsleenqrqt rskrkatsdt lesppkiipk yisenesprp sqkksrvkin wlksatkqps ilskfcslgkittnqgvkgq skenecdpee dlgkccsdnt tngcglespg ntvtpvnvnc vkpinkgeeq igfelveklf qgqlvlrtrc leceslterredfqdisvpv qedelskvee sseispepkt emktlrwais qfasverivg edkyfcench hyteaersll fdkmpeviti hlkcfaasglefdcygggls kintplltpl klsleewstk ptndsyglfa vvmhsgitis sghytasvkv tdlnsleldk gnfvvdqmce igkpeplneeeargvvenyn deevsirvgg ntqpskvlnk knveaigllg gqkskadyel ynkasnpdkv astafaenrn setsdttgth esdmkessdqtginisgfe nkisyvvqsl keyegkwllf ddsevkvtee kdflnslsps tsptstpyll fykkl

UAF(SEQ ID NO:40)

maahhrqnta grrkvqvsyv irdevckynr ngvnalqldp alnrlfiagr dsiiriwsvn qhkqdpyias mehhtdwvnd ivlccngktlisassdttvk vwnahkgfcm stlrthkdyv kalayakdke lvasagldrq iflwdvntlt altasnntvt tsslsgnkds iyslanmqlgtiivsgstek vlrvwdprtc akhnklkght dnvkalllnr dgtqclsgss dgtirlwslg qqrciatyrv hdegvwalqv ndafthvysggrdrkiyctd lrnpdirvli ceekapvlkn eldrsadppp aiwvattkst vnkwtlkgih nfrasgdydn dctnpitplc tqpdqvikggasiiqchiln dkrhiltkdt nnnvaywdvl kackvedlgk vdfedeikkr fkmvyvpnwf swdlktgmlt itldesdcfa awvsakdagfsspdgsdpkl nlgglllqal leywprthvn pmdeeenevn hvngeqenrv qkgngyfqvp phtpvifgea ggrtlfrllc rdsggetesmllnetvpqwv iditvdknmp kfnkipfylq phassgaktl kkdrlsasdm lqvrkvmehv yckiinldne sqttsssnne kpgeqekeediavlaeekie llcqdqvldp nmdlrtvkhf iwksggdltl hyrqkst

ID1同等型a(sEQ ID NO：2)

mkvasgstat aaagpscalk agktasgage vvrclseqsv aisrcaggag arlpalldeq qvnvllydmn gcysrlkclv ptlpqnrkvskveilqhvid yirdlqleln sesevgtpgg rglpvrapls tlngcisalt acaacvpadd rilcr

ID1同等型b(SEQ ID NO：3)

mkvasgstat aaagpscalk agktasgage vvrclseqsv aisrcaggag arlpalldeq qvnvllydnm gcysrlkelv ptlpqnrkvskvcilqhvid yirdlqlcln sesevgtpgg rglpvrapls tlngeisalt aevrsrsdh

ID2(SEQ ID NO：4)

mkafspvrsv rknslsdhsl gisrsktpvd dpmsllynmn dcysklkclv psipqnkkvs kmeilqhvid yildlqiald shptivslhhqrp gqnqasr tplttlntdi silslqasef psclmsndsk alcg

ID3(SEQ ID NO：5)

mkalspvrgc yeavcclser slaiargrgk gpaaeeplsl lddnmhcysr lrelvpgvpr gtqlsqveil qrvidyildl qvvlaepapgppdgphlpiq taeltpelvi sndkrsfch

参考文献的部分列表

Bounpheng,M.A.et al.(1999).FASEB J.13,2257-2264.

Ciarapica,R.et al.(2009).Oncogene28,1881-1891.

Cohn,M.A.et al.(2007).Mol.Cell28,786-797.

D'Andrea,A.D.(2010).N.Engl.J.Med.362,1909-1919.

Di Fiore,R.et al.(2009).J.Cell.Physiol.219,301-313.

Dupont,S.et al.(2009).Cell136,123-135.

Friend,S.H.et al.(1986).Nature323,643-646.

Funato,N.et al.(2001).Mol.Cell.Biol.21,7416-7428.

Hanahan,D.,and Weinberg,R.A.(2000).Cell100,57-70.

Huang,T.T.et al.(2006).Nat.Cell Biol.8,339-347.

Iavarone,A.et al.(1994).Genes Dev.8,1270-1284.

Kastan,M.B.et al.(1991).Cancer Res.51,6304-6311.

Kenner,L.et al.(2004).J.Cell Biol.164,613-623.

Kim,D.et al.(1999).Mol.Cell.Biol.19,8240-8253.

Kim,J.M.et al.(2009).Dev.Cell16,314-320.

Lasorella,A.et al.(2000).Nature407,592-598.

Lasorella,A.et al.(2001).Oncogene20,8326-8333.

Lasorella,A.et al.(2006).Nature442,471-474.

Lassar,A.B.et al.(1991).Cell66,305-315.

Luo,X.et al.(2008).Lab.Invest.88,1264-1277.

Lyden,D.et al.(1999).Nature401,670-677.

Maeda,Y.et al..(2004).J.Cell.Biochem.93,337-344.

Massari,M.E.,and Murre,C.(2000).Mol.Cell.Biol.20,429-440.

Matsumoto,T.et al.(1998).Cancer Lett.129,61-68.

Miller,C.W.et al.(1996).Cancer Genet.Cytogenet.86,136-142.

Nielsen,G.P.et al.(1998).Am.J.Pathol.153,159–163.

Nijman,S.M.et al.(2005).Mol.Cell17,331–339.

Nishimori,H.et al.(2002).Oncogene21,8302–8309.

Oestergaard,V.H.et al.(2007).Mol.Cell28,798–809.

Oh,J.H.et al.(2006).Clin.Orthop.Relat.Res.442,216–222.

Ozaki,T.et al.(2003).Cancer Genet.Cytogenet.140,145–152.

Palombella,V.J.et al.(1994).Cell78,773–785.

Parmar,K.et al.(2010).Stem Cells28,1186–1195.

Peng,Y.et al.(2003).J.Cell.Biochem.90,1149–1165.

Peng,Y.et al.(2004).J.Biol.Chem.279,32941–32949.

Perk,J.et al.(2005).Nat.Rev.Cancer5,603–614.

Polyak,K.et al.(1996).Genes Dev.10,1945–1952.

Prabhu,S.et al.(1997).Mol.Cell.Biol.17,5888–5896.

Roa,S.et al.(2008).Proc.Natl.Acad.Sci.USA105,16248–16253.

Rogakou,E.P.et al.(1999).J.Cell Biol.146,905–916.

Sharff,K.A.et al.(2009).J.Biol.Chem.284,649–659.

Soignet,S.L.et al.(1998).N.Engl.J.Med.339,1341–1348.

Stock,C.et al.(2000).Genes Chromosomes Cancer28,329–336.

Suh,J.H.et al.(2008).Biochem.Biophys.Res.Commun.367,97–102.

Tang,N.et al.(2008).Clin.Orthop.Relat.Res.466,2114–2130.

Thiery,J.P.et al.(2009).Cell139,871–890.

Tupler,R.et al.(2001).Nature409,832–833.

Weintraub,H.et al.(1994).Genes Dev.8,2203–2211.

Yan,Y.et al.(1997).Genes Dev.11,973–983.

Yokota,Y.,and Mori,S.(2002).J.Cell.Physiol.190,21–28.

Zhang,P.et al.(1997).Nature387,151–158.

尽管为了理解清楚的目的，上述发明已经通过例示和实施例相当详细地描述，描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及明确将本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收入本文。

Claims (39)

1.一种筛选和/或鉴定促进细胞命运变化的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂的方法，所述方法包括：比较(i)参照细胞命运与(ii)候选细胞命运，其中所述参照细胞命运是参照细胞的细胞命运，其中所述候选细胞命运是在存在USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或ID候选拮抗剂的情况中所述参照细胞的细胞命运，其中所述USP1候选拮抗剂结合USP1，其中所述UAF1候选拮抗剂结合UAF1，和/或所述ID候选拮抗剂结合ID，由此所述参照细胞命运和所述候选细胞命运之间的细胞命运差异将所述USP1候选拮抗剂和/或所述ID候选拮抗剂鉴定为促进细胞命运的变化。

2.权利要求1的方法，其中所述USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或所述ID候选拮抗剂是USP1候选拮抗剂。

3.权利要求1的方法，其中所述USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或所述ID候选拮抗剂是ID候选拮抗剂。

4.权利要求3的方法，其中所述ID候选拮抗剂是ID1候选拮抗剂、ID2候选拮抗剂、和/或ID3候选拮抗剂。

5.权利要求1的方法，其中所述USP1候选拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或所述ID候选拮抗剂是UAF1候选拮抗剂。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述参照细胞命运是干细胞命运。

7.权利要求6的方法，其中所述干细胞命运是间充质干细胞命运。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述候选细胞命运是成骨细胞细胞命运、软骨细胞细胞命运、或脂肪细胞细胞命运。

9.权利要求8的方法，其中所述候选细胞命运是成骨细胞细胞命运。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述USP1候选拮抗剂、UAF1候选拮抗剂、和/或所述ID候选拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子、或多核苷酸。

11.一种促进细胞的细胞命运变化的方法，其包括使所述细胞与有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂接触。

12.一种诱导细胞周期停滞的方法，其包括使所述细胞与有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂接触。

13.权利要求11-12中任一项的方法，其中所述细胞是具有干细胞命运(例如间充质干细胞命运)的细胞。

14.一种治疗疾病或病症的方法，其包括对个体施用有效量的USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂。

15.权利要求14的方法，其中基于一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平选择所述个体进行治疗：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如与内部参照(例如CD144)相比)或者基于一种或多种选自下组的基因的低表达水平不选择所述个体进行治疗：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如与内部参照(例如CD144)相比)。

16.权利要求14-15中任一项的方法，其中基于一种或多种选自下组的基因的低表达水平选择所述个体进行治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与内部参照(例如CD144)相比)或基于一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平不选择所述个体进行治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与内部参照(例如CD144)相比)。

17.权利要求14-16中任一项的方法，其中基于一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平，所述个体可能响应治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与内部参照(例如CD144)相比)(例如从治疗开始时、期间、或之前的时间点至后来的时间点)或者基于一种或多种选自下组的基因的降低的或无显著变化的表达水平，所述个体可能不响应治疗：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)(例如与内部参照(例如CD144)相比)(例如从治疗开始时、期间、或之前的时间点至后来的时间点)。

18.权利要求14-17中任一项的方法，其中所述USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂诱导细胞周期停滞。

19.权利要求14-18中任一项的方法，其中所述USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或ID拮抗剂能够促进细胞命运变化。

20.权利要求11-13和19中任一项的方法，其中促进细胞命运变化以一种或多种选自下组的基因的降低的表达水平指示：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)(例如与内部参照(例如CD144)相比)。

21.权利要求11-13和19-20中任一项的方法，其中促进细胞命运变化以一种或多种选自下组的基因的升高的表达水平指示：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)。

22.权利要求21的方法，其中与内部参照(例如CD144)相比，一种或多种基因的表达水平是升高的。

23.权利要求14-22中任一项的方法，其中所述疾病或病症包含具有干细胞命运(例如间充质干细胞命运)的细胞。

24.权利要求11-13和23中任一项的方法，其中所述细胞表达一种或多种选自下组的基因：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)。

25.权利要求19的方法，其中与内部参照(例如CD144)相比，一种或多种基因的表达水平是升高的。

26.权利要求11-13和23-25中任一项的方法，其中所述细胞没有显著表达(例如不表达或与内部参照(例如CD144)相比以低水平表达)一种或多种选自下组的基因：p21、RUNX2、OSTERIX、SPARC/骨粘连蛋白、SPP1/骨桥蛋白、BGLAP/骨钙蛋白、和碱性磷酸酶(ALP)。

27.权利要求14-26中任一项的方法，其中所述疾病或病症是癌症。

28.权利要求27的方法，其中所述癌症是骨肉瘤。

29.权利要求27-28的方法，其中所述癌症表达一种或多种选自下组的基因：CD90、CD105、CD106、USP1、UAF1、和ID(例如ID1、ID2、或ID3)。

30.权利要求29的方法，其中与内部参照(例如CD144)相比，一种或多种基因的表达水平是升高的。

31.权利要求1的方法，其中所述USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或所述ID拮抗剂是USP1拮抗剂。

32.权利要求1的方法，其中所述USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或所述ID拮抗剂是ID拮抗剂。

33.权利要求3的方法，其中所述ID拮抗剂是ID1候选拮抗剂、ID2候选拮抗剂、和/或ID3拮抗剂。

34.权利要求1的方法，其中所述USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或所述ID拮抗剂是UAF1拮抗剂。

35.权利要求11-34中任一项的方法，其中所述USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或所述ID拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子、或多核苷酸。

36.权利要求35的方法，其中所述USP1拮抗剂、UAF1拮抗剂、和/或所述ID拮抗剂是抗体。

37.权利要求36的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

38.权利要求1的方法，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。

39.权利要求1的方法，其中所述抗体是抗体片段，且所述抗体结合USP1、UAF、和/或ID。