CN101932605B - 用于抑制肿瘤进展的组合物和方法 - Google Patents
用于抑制肿瘤进展的组合物和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101932605B CN101932605B CN200880116661.3A CN200880116661A CN101932605B CN 101932605 B CN101932605 B CN 101932605B CN 200880116661 A CN200880116661 A CN 200880116661A CN 101932605 B CN101932605 B CN 101932605B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- antibody
- gly
- cys
- pro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了用于以丧失REST功能、β2表达、和/或刻缺蛋白活化为特征的肿瘤的分类、诊断、治疗、和预防的组合物和方法。本发明还提供了用于调控细胞过程诸如EMT、细胞迁移、和凋亡的其它组合物和方法。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2007年11月19日提交的美国临时申请No.60/988,874的权益,通过述及将其公开内容完整收入本文。
发明领域
本发明涉及牵涉肿瘤进展和其它细胞过程的基因和多肽。
发明背景
EMT
在肿瘤发生期间,癌细胞经由称作“上皮-间充质转换”或EMT的过程丧失许多它们的正常上皮特征并获得间充质特性。EMT与促进局部侵入和转移至远程部位的细胞粘着和运动中的变化有关。已经记载了一些能够在模型系统中诱导EMT的基因,诸如MMP11和TGFB1。综述参见例如Huber et al.,Curr.Opin.Cell Biol.17:548-558,2005;Lee et al.,J.Cell Biol.172:973-981,2006;Theiry et al.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.7:131-142,2006。然而,本领域需要鉴定更多牵涉在肿瘤细胞中诱导EMT的基因。此类基因及其编码的蛋白质是有用的靶物,例如在癌症的治疗中。本文所述发明满足这种需要并提供其它好处。
β2
由SCN2B基因编码的β2是单次跨膜蛋白质,其胞外结构域含有与那些在细胞粘着蛋白质中所找到的相似的免疫球蛋白折叠(Eubanks et al.,Neuroreport 8:2775-2779,1997;Isom et al.,Cell 83:433-442,1995)。最初表征为钠通道特性和膜表面积的调控物(Eubanks et al.,见上文),β2与β1亚基一起还能够独立于钠通道而作为细胞粘着分子起作用。在果蝇S2细胞中,β1和β2亚基能以反式-嗜同性方式经它们的EGF重复基序与基质蛋白质生腱蛋白C和生腱蛋白R结合,导致对细胞骨架的改变,以及细胞粘着和聚集特性的变化(Malhotra et al.,J.Biol.Chem.275:11383-11388,2000;Xiao et al.,J.Biol.Chem.274:26511-26517,1999)。另外,β2已经被表征为在中国仓鼠卵巢细胞中诱导迁移的γ-分泌酶靶物(Kim et al.,J.Biol.Chem.280:23251-23261,2005)。这些结果提示β2经历由α-分泌酶样蛋白酶介导的胞外域脱落(Kim etal.,见上文)。
刻缺蛋白
刻缺蛋白(Notch)受体家族是一类进化上保守的跨膜受体,它们在多种生物体中(像海胆和人类)传送影响发育的信号。刻缺蛋白受体及其配体家族德耳塔(Delta)和锯齿蛋白(Serrate)(后者在哺乳动物中也称作Jagged)都是具有大胞外结构域(其含有表皮生长因子(EGF)样重复)的跨膜蛋白质。各物种间刻缺蛋白旁系同源物的数目有所不同。例如,哺乳动物中有四种刻缺蛋白受体(刻缺蛋白1-刻缺蛋白4),秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中有两种(LIN-12和GLP-1),而黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中有一种(刻缺蛋白)。刻缺蛋白受体在转运至细胞表面期间被弗林蛋白酶样蛋白酶在跨膜结构域以外的位点S1处蛋白水解加工,产生胞外刻缺蛋白(ECN)亚基和刻缺蛋白跨膜亚基(NTM)。这两个亚基仍然非共价结合并构成成熟异二聚体细胞表面受体。刻缺蛋白1ECN亚基含有36个N端EGF样重复,接着是三个串联重复的Lin 12/刻缺蛋白重复(LNR)模块,之后是S1位点。每个LNR模块含有三个二硫键和一组保守的酸性和极性残基,预测这些残基与钙离子配位。在EGF重复区内有供活化性配体结合的位点。包含刻缺蛋白受体的一个独特结构域的LNR模块参与配体诱导的活化之前处于静息构象的刻缺蛋白的维持。刻缺蛋白1NTM包含胞外区(其包含S2切割位点)、跨膜区段(其包含S3切割位点)、和大的胞内部分(其包含RAM域、锚蛋白重复、反式激活域和羧基末端PEST序列)。ECN与NTM亚基的稳定结合依赖于包含ECN的羧基末端(称作HD-C)和NTM的胞外氨基末端(称作HD-N)的异二聚化结构域(HD)。刻缺蛋白配体对ECN亚基的结合启动经由受调节的膜内蛋白水解发生的两步连续蛋白水解切割。金属蛋白酶在位点S2处的第一步切割使得刻缺蛋白跨膜亚基对接近质膜内小叶的位点S3处的第二步切割易感。由含有早老蛋白和呆蛋白的多蛋白质复合物催化的位点S3切割释放刻缺蛋白跨膜亚基的胞内部分,容许它易位至细胞核并激活靶基因的转录。
已经在人类中鉴定出锯齿蛋白类和德耳塔样类的五种刻缺蛋白配体,即锯齿蛋白1(Jagged1或Serrate1)、锯齿蛋白2(Jagged2或Serrate2)、德耳塔样1(Delta-like1或DLL1)、德耳塔样3(Delta-like3或DLL3)、和德耳塔样4(Delta-like4或DLL4)。每种配体是单次跨膜蛋白质,具有对结合刻缺蛋白而言至关重要的保守的N端德耳塔、锯齿蛋白、LAG-2(DSL)基序。位于DSL基序C端的一系列EGF样模块位于跨膜区段之前。与刻缺蛋白受体不同,这些配体在C端具有70-215个氨基酸的短的胞质尾。另外,已经报告了其它类型的配体(例如DNER、NB3、和F3/接触蛋白)。
刻缺蛋白途径在多种发育和生理过程期间发挥功能,包括那些在蝇和脊椎动物中影响神经发生的发育和生理过程。一般而言,刻缺蛋白信号传导涉及各群细胞间的侧抑制、谱系决定和、边界确立(参见例如Bray,Molecular CellBiology 7:678-679,2006)。多种人类疾病(包括癌症和神经变性性病症)已经显示出源自编码刻缺蛋白受体或其配体的基因中的突变(参见例如Nam etal.,Curr.Opin.Chem.Biol.6:501-509,2002)。当在一个人类急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)子集中鉴定到创建人刻缺蛋白1的一种截短的、组成性有活性的变体的频发(recurrent)t(7;9)(q34;q34.3)染色体易位时候,首次认识到不受限制的刻缺蛋白信号传导与恶性肿瘤之间的联系。在小鼠模型中,刻缺蛋白1信号传导已经显示出对于T细胞发育而言是至关重要的,而且刻缺蛋白1介导的信号以B细胞发育为代价而促进T细胞发育。而且,在小鼠模型中,发育期间过量的刻缺蛋白信号传导导致T细胞瘤形成。
此外,刻缺蛋白受体在极其多种人类癌症和肿瘤衍生细胞系中表达,而且在人胚胎干细胞中促进神经命运。例如,刻缺蛋白在人宫颈癌细胞和人肾细胞癌细胞中的新生物病变处高度表达。鉴于刻缺蛋白信号传导涉及极其多种人类疾病,清楚的是仍然需要能调节刻缺蛋白信号传导、具有最适于开发成治疗剂的临床属性的药剂。本文所述发明满足这种需求并提供其它好处。
REST
REST(也称作NRSF)是非神经元组织中神经元基因表达的转录阻抑物(Westbrook et al.,Cell:121:837-848,2005)。REST已经被表征为肿瘤阻抑物。REST基因被鉴定为结肠直肠癌中频繁的删除靶物。另外,已经鉴定出能够转化上皮细胞的一种显性阴性形式的REST。本领域需要鉴定牵涉REST肿瘤阻抑的基因。此类基因及其编码的蛋白质是有用的靶物,例如在癌症的治疗中。本文所述发明满足这种需要并提供其它好处。
发明概述
本发明部分基于如下的发现,在肿瘤中,丧失转录阻抑物REST导致β2表达,其继而活化刻缺蛋白信号传导。本发明进一步部分基于β2作为刻缺蛋白的新配体的鉴定,由此β2通过结合刻缺蛋白和活化刻缺蛋白信号传导而诱导EMT。这些发现指示REST/β2/刻缺蛋白途径促进肿瘤进展和/或转移。
一方面,提供了用于以丧失REST功能、β2表达、和/或刻缺蛋白活化为特征的肿瘤的分类、诊断、治疗、和预防的组合物和方法。
另一方面,提供了一种单克隆抗体,其结合β2并阻断β2结合刻缺蛋白。在一个实施方案中,所述单克隆抗体:(a)是由选自ATCC编号PTA-8404、PTA-8405和PTA-8406的杂交瘤生成的;(b)是(a)的抗体的人源化形式;(c)与(a)的抗体结合相同表位;或(d)与(a)的抗体竞争对β2的结合。
另一方面,提供了一种分离的可溶性多肽,其包含特异性结合β2的刻缺蛋白片段。
另一方面,提供了一种抑制肿瘤进展的方法,该方法包括使肿瘤暴露于β2的拮抗剂。在一个实施方案中,其中所述β2拮抗剂是对SCN2B特异性的反义核酸。在一个此类实施方案中,所述反义核酸是能够RNAi的调节性RNA。在另一个实施方案中,所述β2拮抗剂是结合β2并阻断β2结合刻缺蛋白的抗体。在一个此类实施方案中,所述抗体:(a)是由选自ATCC编号PTA-8404、PTA-8405和PTA-8406的杂交瘤生成的;(b)是(a)的抗体的人源化形式;(c)与(a)的抗体结合相同表位;或(d)与(a)的抗体竞争对β2的结合。在另一个实施方案中,所述β2拮抗剂是结合刻缺蛋白并阻断刻缺蛋白结合β2的抗体。在一个此类实施方案中,所述抗体在刻缺蛋白1中包含EGF重复10-21的区域内结合。在另一个实施方案中,所述β2拮抗剂包括包含特异性结合β2的刻缺蛋白片段的可溶性多肽。在另一个实施方案中,所述肿瘤是转移性的。在另一个实施方案中,所述肿瘤是对化疗有抗性的肿瘤。在另一个实施方案中,所述肿瘤是结肠肿瘤。在另一个实施方案中,所述肿瘤具有降低的REST活性或升高的β2活性。
另一方面,提供了一种抑制细胞中的EMT的方法,该方法包括使细胞暴露于β2的拮抗剂。在一个实施方案中,所述β2拮抗剂是对SCN2B特异性的反义核酸。在一个此类实施方案中,所述反义核酸是能够RNAi的调节性RNA。在另一个实施方案中,所述β2拮抗剂是结合β2并阻断β2结合刻缺蛋白的抗体。在一个此类实施方案中,所述抗体:(a)是由选自ATCC编号PTA-8404、PTA-8405和PTA-8406的杂交瘤生成的;(b)是(a)的抗体的人源化形式;(c)与(a)的抗体结合相同表位;或(d)与(a)的抗体竞争对β2的结合。在另一个实施方案中,所述β2拮抗剂是结合刻缺蛋白并阻断刻缺蛋白结合β2的抗体。在一个此类实施方案中,所述抗体在刻缺蛋白1中包含EGF重复10-21的区域内结合。在另一个实施方案中,所述β2拮抗剂包括包含特异性结合β2的刻缺蛋白片段的可溶性多肽。在另一个实施方案中,所述细胞是肿瘤细胞。在另一个实施方案中,所述肿瘤细胞来自转移性肿瘤。在另一个实施方案中,所述肿瘤细胞是自对化疗有抗性的肿瘤衍生的。在另一个实施方案中,所述肿瘤细胞是结肠肿瘤细胞。在另一个实施方案中,所述细胞在体外。在另一个实施方案中,所述细胞在体内。
另一方面,提供了一种确定肿瘤是否会响应β2的拮抗剂或刻缺蛋白的拮抗剂的方法,该方法包括检测肿瘤中降低的REST活性或升高的β2活性,其中肿瘤中降低的REST活性或升高的β2活性指示该肿瘤会响应β2的拮抗剂或刻缺蛋白的拮抗剂。在一个实施方案中,所述方法包括检测降低的REST活性。在另一个实施方案中,所述方法包括检测升高的β2活性。在另一个实施方案中,所述肿瘤是转移性的。在另一个实施方案中,所述肿瘤对化疗有抗性。在另一个实施方案中,所述肿瘤是结肠肿瘤。
下文描述中提供了上述实施方案和其它实施方案。
附图简述
图1A
正常结肠上皮(第1-5道)和结肠肿瘤上皮(第6-13道)中的SCN2B表达。在激光捕捉显微解剖后分离RNA,并通过微阵列分析来测量SCN2B表达。数值代表相对表达水平,即SCN2B转录物对通用参照RNA(自肿瘤细胞系集合衍生)的比。第7道中样品的数值33被截断,以条标示。
图1B
结肠肿瘤和正常结肠中β2蛋白质表达的例子,使用抗β2单克隆抗体(3D1)。
图2A
用对照条件培养基(C-CM)或条件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理或用全长β2转染(FL:β2)的细胞系(名称在左边)的肌动蛋白细胞骨架的显现。使用相同设置收集实验组的图像。用鬼笔环肽对肌动蛋白细胞骨架染色,而用DAPI对细胞核染色。左下角显示了15μm比例尺。
图2B
用针对豚草(RW,左部小图)或β2(右部小图)的抗体处理的、用β2转染的CHO(上部2幅小图)或用β2转染的SW620(下部2幅小图)细胞中由β2诱导的表型变化的抗体阻断。用鬼笔环肽对肌动蛋白细胞骨架染色,而用DAPI对细胞核染色。使用相同设置收集实验组的所有图像。比例尺:15μm。
图2C
β2ECD消减测定法:用对照(C-CM)或经受过模拟β2消减或部分或完全β2消减的β2条件培养基(β2-CM)处理NCI-H226细胞。通过抗β2免疫印迹上的道来显示相应的蛋白质回收。第1道含有自条件培养基分离的β2,作为阳性对照。用鬼笔环肽对肌动蛋白细胞骨架染色,而用DAPI对细胞核染色。使用相同设置收集所有图像。比例尺:15μm。
图3A
用载体转染的SW620对照细胞(Vec)或用β2转染的SW620(FL:β2)细胞、或用对照条件培养基(C-CM)或条件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理的SW620细胞在0.1%胎牛血清(FBS)中的迁移。在血清缺失(0%FBS)的情况中没有观察到迁移。荧光强度是使用YO-PRO-1染色的迁移细胞的荧光强度。误差条代表均值的平均偏差,来源于一式三份的实验。对用β2转染的或用β2-ECD处理的SW620细胞都观察到统计学显着升高的迁移(p分别为0.03和0.0009)。
图3B
用抗豚草抗体(RW)或2种不同抗β2抗体(3D1或12A9)处理的SW480细胞的迁移。荧光强度是用YO-PRO-1染色的迁移细胞的。误差条代表均值的平均偏差,自一式三份推导。在存在两种抗β2抗体的情况中都观察到迁移的统计学显著降低(每一个的p为0.001)。
图3C
饥饿测定法:用载体转染的SW620对照细胞(Vec)或用β2转染的SW620细胞(FL:β2)的细胞死亡,作为饥饿后相对于细胞总数的百分比。实验是一式三份实施的,误差条代表均值的平均偏差。对用β2转染的SW620细胞观察到细胞死亡的统计学显著降低(p为0.002)。
图3D
SW620细胞中的多柔比星抗性:在存在多柔比星(μg/ml,X轴)的情况中用仅仅是载体(Vec)或全长β2(FL:β2)转染的细胞的细胞存活力(Y轴)。实验点是一式三份实施的,误差条代表均值的平均偏差。
图3E
CHO细胞中的甲氨喋呤抗性:用对照条件培养基(C-CM)或条件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理的细胞的细胞死亡,作为相对于总数的百分比。实验是一式三份实施的,误差条代表均值的平均偏差。对用β2ECD处理的CHO细胞观察到细胞死亡的统计学显著降低(p为0.01)。
图4A
SW620用对照处理的细胞(C-CM)或用β2蛋白质转染(FL:β2)或用条件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理的细胞的E-钙粘着蛋白染色。用DAPI对细胞核染色。使用相同设置收集所有图像。比例尺:15μm。
图4B
SW620(i)用载体(Vec)或全长β2(FL:β2)转染的细胞或(ii)用对照条件培养基(C-CM)或条件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理的细胞的E-钙粘着蛋白染色的FACS分析。将中值比值绘图。误差条代表一式两份的标准偏差。
图4C
SW620用对照处理的细胞(C-CM)或用β2蛋白质转染(FL:β2)或用条件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理的细胞的波形蛋白(vimentin)染色。用DAPI对细胞核染色。使用相同设置收集所有图像。比例尺:15μm。
图4D
Twist1消减:使用非靶向对照序列(siNT)或靶向Twist1的siRNA(siTwist1)进行siRNA敲低后用条件培养基中的β2ECD处理的SW620细胞(β2-CM)的肌动蛋白细胞骨架(鬼笔环肽,上部小图)和E-钙粘着蛋白(下部小图)染色。在用对照条件培养基(C-CM)处理的siNT或siTwist1细胞中没有观察到表型或E-钙粘着蛋白染色的变化。使用相同设置收集实验组的图像。用DAPI对细胞核染色。比例尺:15μm。
图4E
E-钙粘着蛋白水平:用对照条件培养基(C-CM)或β2条件培养基(β2-CM)处理的SW620细胞的Twist1消减实验中E-钙粘着蛋白染色的定量分析。统计分析指示用β2-ECD处理的、消减了Twist1的细胞(siTwist1和siTwist1(3))的E-钙粘着蛋白水平与用β2-ECD处理的、用非靶向对照转染的细胞(siNT)相比有显著不同(p为0.001和0.009)。最后一组柱(siTwist1(3))代表靶向Twist1的3种别的独立siRNA序列的数据的组合分析。使用细胞的至少5个独立视野来进行定量分析,其如所描述的那样使用Metamorph。误差条代表标准误差。
图5A
SW620和SW480细胞(顶部2幅小图)和结肠肿瘤和正常结肠(底部2幅小图)中的β2(左栏)和REST(右栏)染色。使用相同设置收集实验组的所有图像。比例尺:15μm。
图5B
与非靶向对照(siNT)相比,siRNA敲低REST(siREST)后SW620中的REST(上部小图)和β2(下部小图)的免疫印迹分析。分子量(KDa)标示着左边。对印迹探查β-微管蛋白(中部小图),作为加载对照。
图5C
使用siRNA敲低REST后REST蛋白质(REST)的相对降低和β2(β2)的相对升高,相对于非靶向siRNA对照(siNT,设成100%)标准化。自5B中免疫印迹的Licor强度读出测定数值,减去背景,并相对于β-微管蛋白标准化。
图5D
REST消减:使用siRNA(siREST)或非靶向对照(siNT)敲低REST后和在存在抗豚草(siREST,α-RW)或抗β2(siREST,α-β2)抗体的情况SW620细胞的肌动蛋白细胞骨架(鬼笔环肽,上部小图)、E-钙粘着蛋白(中部小图)和波形蛋白(下部小图)染色。使用相同设置收集所有实验组的图像。用DAPI对细胞核染色。比例尺:15μm。
图5E
E-钙粘着蛋白水平:图5D中SW620细胞实验分组的siREST消减中的E-钙粘着蛋白染色定量分析。用对REST特异性siRNA(siREST)转染的细胞的E-钙粘着蛋白水平与在用非靶向对照(siNT)转染对细胞中检测到的水平相比有显著降低(p为0.001)。在存在抗β2抗体3D1(siREST:3D1)和2E3(siREST:2E3)的情况中消减REST导致野生型水平的E-钙粘着蛋白染色,其与消减了REST的细胞(siREST)或用抗豚草抗体处理、消减了REST的细胞(siREST:α-RW)相比有显著升高(p为0.02和0.01)。使用细胞的至少5个独立视野进行定量分析,其如所描述的那样使用Metamorph。误差条代表标准误差。
图6A
刻缺蛋白1消减:使用非靶向对照序列(siNT)或靶向刻缺蛋白1的siRNA(siNotch1)进行siRNA敲低后用条件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理的SW620细胞的肌动蛋白细胞骨架(鬼笔环肽,上部小图)和E-钙粘着蛋白(下部小图)染色。在用对照条件培养基(C-CM)处理的siNT或siNotch1细胞中没有检测到表型或E-钙粘着蛋白染色变化。使用相同设置收集实验组的图像。用DAPI对细胞核染色。比例尺:15μm。
图6B
对刻缺蛋白信号传导的化学抑制:添加DMSO或DMSO中的DAPT(DAPT)后用条件培养基中(β2-CM)的β2ECD处理的SW620的E-钙粘着蛋白染色。在用DMSO中的对照条件培养基(C-CM)处理的细胞中没有检测到E-钙粘着蛋白染色变化。使用相同设置收集实验组的图像。用DAPI对细胞核染色。比例尺:15μm。
图6C
E-钙粘着蛋白水平:用对照条件培养基(C-CM)或β2条件培养基(β2-CM)处理的、用siNotch1消减和用DAPT处理的SW620细胞中的E-钙粘着蛋白染色的定量分析。统计分析指示用β2-ECD处理的、消减了刻缺蛋白1(siNotch1和siNotch1(3))的细胞的E-钙粘着蛋白水平与用β2-ECD处理的、用非靶向对照(siNT)转染的细胞相比有显著不同(p为0.03和0.03)。标示siNotch1(3)的柱代表靶向刻缺蛋白1的3种别的独立siRNA序列的数据的组合分析。用β2-ECD处理的(β2-CM)、用DAPT处理的(DAPT)细胞的E-钙粘着蛋白水平与DMSO(DMSO)中用β2-ECD处理的细胞相比也有显著不同(p为0.00001)。使用细胞的至少5个独立视野来进行定量分析,其如所描述的那样使用Metamorph。误差条代表标准误差。
图7A
用仅仅是载体(Vec:第1-3道)或用β2(FL:β2:第4-6道)转染的SW620细胞中使用抗β2抗体(β2:第2、3、5、6道)或抗豚草抗体(RW:第1、4道)对SW620细胞中内源刻缺蛋白1的免疫共沉淀。用刻缺蛋白1多克隆抗体(G20)探查免疫印迹,并在该抗体的预期大小(约120kDa,标示在左边)处检测到条带。内源刻缺蛋白1的水平和双重带样式显示于第7道,其含有SW620细胞溶胞物(25μg总蛋白质)。
图7B
刻缺蛋白1和β2ECD的结合。第1和3道含有来自CHO细胞的β2条件培养基(含有带His(8)标签的β2ECD),而第2和4道含有来自CHO细胞的对照条件培养基(含有无关的带His(8)标签的蛋白质(Gli-1))。如所描述的那样将带Flag标签的刻缺蛋白1ECD蛋白质添加至第1-4道。第5道含有100ng纯化的刻缺蛋白1ECD,第6道含有50ng(自大肠杆菌表达和纯化的)β2ECD。使用抗Flag抗体对印迹探查刻缺蛋白1(经标记的刻缺蛋白1,免疫印迹的上部切片),然后剥下,并使用抗β2单克隆抗体(3D1)再探查β2(经标记的β2,免疫印迹的下部切片)。分子量(KDa)标示在左边。
图7C
含有EGF重复区10-21的刻缺蛋白1ECD片段和β2ECD的结合。第1和3道含有来自CHO细胞的β2条件培养基(含有带His(8)标签的β2ECD),而第2和4道含有来自CHO细胞的对照条件培养基(含有无关的带His(8)标签的蛋白质)。将带Flag标签的刻缺蛋白1ECD EGF重复区添加至第1和2道(EGF10-21)及第3和4道(EGF 22-33)。第5和6道含有75ng纯化的刻缺蛋白1ECD,分别为EGF10-21或EGF22-33。使用抗Flag抗体对印迹探查刻缺蛋白ECD。分子量(KDa)标示在左边。
图7D
刻缺蛋白1NICD响应β2而易位至细胞核。用仅仅是载体(Vec)或全长β2蛋白质(FL:β2)转染的SW620细胞中的刻缺蛋白1NICD染色显示在左部2幅小图,而用对照条件培养基(C-CM)或条件培养基中的β2ECD(β2-CM)处理的SW620细胞的NICD染色显示在右部2幅小图。用DAPI对细胞核染色。比例尺:15μm。下部一系列小图含有自上部小图影像放大的区域。
图8
源自REST丧失、β2表达、和刻缺蛋白途径信号传导激活的EMT诱导的建议途径的概览。CDH1=E-钙粘着蛋白。
图9
肿瘤细胞系中REST和β2的反相关:肿瘤细胞系关于REST和β2表达的免疫荧光分析的汇总。染色的半定量评估标示为+。
图10A
来自新鲜的、冷冻的结肠肿瘤切片的LCM策略,例子有分化良好的原发性结肠肿瘤(HF3766,上部小图)和分化不良的侵入性原发性结肠肿瘤(HF3546,下部小图)。在左部小图中描画捕捉到的细胞。
图10B
来自用于LCM和微阵列分析的样品的切片中的β2转录物表达的RT-PCR分析,相对于β-肌动蛋白表达标准化。
图10C
与用于LCM的切片(新鲜的、冷冻的切片)匹配的结肠肿瘤切片上β2转录物的非同位素原位杂交(ISH)。在匹配的切片上运行有义对照,并在下部小图中显示每一幅图像的有义对照。
图10D
在用仅仅是载体(VEC:第2道)或用全长β2(β2:第3道)转染的SW620中使用抗β2单克隆抗体(3D1)检测免疫印迹上的β2蛋白质。在第2和3道中加载25μg总细胞蛋白质。在第1道中加载4ng纯化的β2ECD(经标记的ECD)。分子量(KDa)标示在右边。
图10E
使用抗β2单克隆抗体(3D1)通过免疫印迹分析检测人肿瘤的β2(上部小图)。所有样品都是肿瘤样品,而且组织起源列于上方。还对印迹探查β-微管蛋白,作为加载对照(下部小图)。分子量(KDa)标示在左边。
图11A
用条件培养基中的β2ECD(β2-CM,右部小图)或用对照条件培养基(C-CM,左部小图)处理的多种细胞系的肌动蛋白细胞骨架(鬼笔环肽)染色。细胞系(名称列于左边):SW480,PC3,HUVEC,MDCK,HEK293。用DAPI对细胞核染色。
图11B
β2响应性肿瘤细胞系SW620、SW480、NCI-H226、PC-3、和内皮细胞系HUVEC中的刻缺蛋白1转录物表达。根据Affymetrix微阵列数据将MAS5强度值绘制在Y轴上。
图11C
β2响应性肿瘤细胞系SW620、SW480、NCI-H226、PC-3、和内皮细胞系HUVEC中的刻缺蛋白2转录物表达。根据Affymetrix微阵列数据将MAS5强度值绘制在Y轴上。
图11D
SW620中的其它刻缺蛋白配体和受体的表达:锯齿蛋白1,锯齿蛋白2,刻缺蛋白3,刻缺蛋白4。根据Affymetrix微阵列数据将MAS5强度值绘制在Y轴上。
图12A
用条件培养基中的β2ECD处理的SW620细胞中0-72小时的HES1和Twist1转录物表达。于0、6、18、24、48、和72小时时间点自细胞提取RNA,并在Agilent完整人类基因组微阵列上与通用参照RNA相比实施微阵列分析。将对数比(log ratio)(Y轴)对时间(以小时计)(X轴)绘图。显示了2种独立HES1寡核苷酸探针序列和Twist1的转录物数据。
图12B
用β2ECD处理的SW620细胞中0、6、和18小时时间点时Twist1转录物表达的RT-PCR分析。将Twist1表达相对于持家基因RPL19标准化。
图13A
REST消减:用对REST特异性的siRNA(siREST)或非靶向对照(siNT)转染的SW620细胞中的REST(i)和β2(ii)转录物表达的RT-PCR分析。将转录物水平相对于持家基因RPL19标准化。
图13B
REST消减:用对REST特异性的siRNA(siREST:右部小图)或非靶向对照(siNT:左部小图)转染的SW620细胞中的REST(上部小图)和β2(下部小图)的免疫荧光分析。用DAPI对细胞核染色。使用相同设置对所有实验组成像。比例尺:15μm
图13C
刻缺蛋白1消减:用对刻缺蛋白1特异性的siRNA(siNotch1)或非靶向对照(siNT)转染的SW620细胞中的刻缺蛋白1转录物表达的RT-PCR分析。将转录物水平相对于持家基因RPL19标准化。
图14
抗体阻断实验。用5种不同抗β2抗体进行竞争性结合测定法。
发明详述
本发明部分基于β2作为刻缺蛋白的新配体的鉴定,其联系REST丧失与刻缺蛋白信号传导活化,由此限定β2、REST和刻缺蛋白在肿瘤进展和转移中的作用。
I.定义
术语“β2”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然钠通道β2亚基,除非另有说明。该术语涵盖“全长”、未加工的β2以及源自细胞中的加工的任何形式的β2。该术语还涵盖β2的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。
如本文中所使用的,术语“刻缺蛋白”或“刻缺蛋白受体”指任何属于单次异二聚体跨膜受体之刻缺蛋白家族的蛋白质。该术语涵盖来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的天然刻缺蛋白,除非另有说明。该术语涵盖哺乳动物刻缺蛋白受体(刻缺蛋白1、刻缺蛋白2、刻缺蛋白3、和刻缺蛋白4)。该术语涵盖“全长”、未加工的刻缺蛋白以及源自细胞中的加工的任何形式的刻缺蛋白。该术语还涵盖刻缺蛋白的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。
如本文中所使用的,术语“锯齿蛋白”(Jagged)指任何属于刻缺蛋白配体之锯齿蛋白(Jagged或Serrate)家族的蛋白质。该术语涵盖来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的天然锯齿蛋白,除非另有说明。该术语涵盖称作锯齿蛋白1(Jagged1或Serrate1)和锯齿蛋白2(Jagged2或Serrate2)的哺乳动物锯齿蛋白家族成员。该术语涵盖“全长”、未加工的锯齿蛋白以及源自细胞中的加工的任何形式的锯齿蛋白。该术语还涵盖锯齿蛋白的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。
如本文中所使用的,术语“DLL”指任何属于刻缺蛋白配体之德耳塔样家族(Delta-like family)的蛋白质。该术语涵盖来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的天然DLL,除非另有说明。该术语涵盖称作德耳塔样1(DLL1)、德耳塔样3(DLL3)、和德耳塔样4(DLL4)的哺乳动物DLL家族成员。该术语涵盖“全长”、未加工的DLL以及源自细胞中的加工的任何形式的DLL。该术语还涵盖DLL的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。
如本文中所使用的,术语“REST”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然阻抑物元件1沉默转录(repressor element silencing transcription,REST)因子,除非另有说明。该术语涵盖“全长”、未加工的REST以及源自细胞中的加工的任何形式的REST。该术语还涵盖REST的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。
术语“PRO”一般指本文中所描述的任何蛋白质,包括但不限于β2、刻缺蛋白、锯齿蛋白、DLL、和REST中任一项。
“β2的拮抗剂”指抑制β2或编码β2的核酸(例如SCN2B核酸)生成;抑制β2加工(例如自β2释放ECD);或直接与β2或与刻缺蛋白相互作用以抑制β2结合刻缺蛋白的药剂。
“病症”指将会从使用本发明的组合物或方法进行的处理(治疗)中获益的任何疾患或疾病。这包括慢性和急性病症,包括那些使哺乳动物趋向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗病症的非限制性例子包括诸如癌症(例如结肠癌)(包括顽固性或转移性癌症)等疾患。
在用于本文时,“治疗”(及变化形式,诸如“处理”或“处置”)指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预,可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中,本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发生/发展,或用于减缓疾病或病症的进展。
“个体”、“受试者”、或“患者”指脊椎动物。在某些实施方案中,脊椎动物指哺乳动物。哺乳动物包括,但不限于,牲畜(诸如牛)、运动用动物、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中,哺乳动物指人。
术语“药物配制剂”指其形式容许活性成分的生物学活性是有效的,且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的制备物。此类配制剂可以是无菌的。
“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。
本发明物质/分子的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还涵盖该物质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然,由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的,因此预防有效量将低于治疗有效量。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。该术语意图包括:放射性同位素,例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素;化疗剂,例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂;酶及其片段,诸如溶核酶;抗生素;和毒素,诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素,包括其片段和/或变体;及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。
“毒素”指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的任何物质。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents),诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates),诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶类(aziridines),诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),);β-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素类(colchicines);白桦脂酸(betulinicacid);喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan),)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱);苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物);鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinic acid);替尼泊苷(teniposide);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物,KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海绵抑素(spongistatin);氮芥类(nitrogen mustards),诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard);亚硝脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类,诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou et al.,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994));CDP323,一种口服α-4整联蛋白抑制剂;蒽环类抗生素(dynemicin),包括dynemicin A;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂脂质体多柔比星TLC D-99PEG化脂质体多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类,诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)替加氟(tegafur)卡培他滨(capecitabine)埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物,诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物,诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素类,诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类,诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂,诸如亚叶酸(folinic acid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋铵(elliptinium acetate);epothilone;依托格鲁(etoglucid);硝酸镓;羟脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物碱类(maytansinoids),诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol);二胺硝吖啶(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);多糖复合物(JHS NaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲兰(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone);2,2′,2″-三氯三乙胺;单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine)( );达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”);塞替派(thiotepa);类紫杉醇(taxoids),例如帕利他塞(paclitaxel)清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)苯丁酸氮芥(chlorambucil);6-硫鸟嘌呤(thioguanine);巯基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);铂类似物,诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如)和卡铂(carboplatin);长春药类(vincas),其阻止微管蛋白聚合形成微管,包括长春碱(vinblastine)长春新碱(vincristine)长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);亚叶酸(leucovorin);能灭瘤(novantrone);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊本膦酸盐(ibandronate);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类维A酸(retinoids),诸如维A酸(retinoic acid),包括贝沙罗汀(bexarotene)二膦酸盐类(bisphosphonates),诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)、依替膦酸钠(etidronate)NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)阿伦膦酸盐(alendronate)帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸,特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸,诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗,诸如疫苗和基因疗法疫苗,例如疫苗、疫苗和疫苗;拓扑异构酶1抑制剂(例如);rmRH(例如);BAY439006(sorafenib;Bayer);SU-11248(sunitinib,Pfizer);哌立福辛(perifosine),COX-2抑制剂(如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib)),蛋白体抑制剂(例如PS341);bortezomibCCI-779;tipifarnib(R11577);orafenib,ABT510;Bcl-2抑制剂,诸如oblimersensodiumpixantrone;EGFR抑制剂(见下文定义);酪氨酸激酶抑制剂(见下文定义);丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂,诸如雷帕霉素(rapamycin)(sirolimus,);法尼基转移酶抑制剂,诸如lonafarnib(SCH 6636,SARASARTM);及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物;以及两种或更多种上述各项的组合,诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
如本文中所定义的,化疗剂包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”类。它们自身可以是激素,包括但不限于:具有混合的激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素类,包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX)、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene),和选择性雌激素受体调节剂类(SERM),诸如SERM3;没有激动剂特性的纯的抗雌激素类,诸如氟维司群(fulvestrant)和EM800(此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转、和/或遏制ER水平);芳香酶抑制剂类,包括类固醇芳香酶抑制剂类,诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)和非类固醇芳香酶抑制剂类,诸如阿那曲唑(anastrozole)来曲唑(letrozole)和氨鲁米特(aminoglutethimide),和其它芳香酶抑制剂类,包括伏氯唑(vorozole)醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑;促黄体生成激素释放激素激动剂类,包括亮丙瑞林(leuprolide)(和)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin);性类固醇类(sex steroids),包括妊娠素类(progestine),诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate),雌激素类,诸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin),和雄激素类/类视黄酸类,诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸(transretionic acid)和芬维A胺(fenretinide);奥那司酮(onapristone);抗孕酮类;雌激素受体下调剂类(ERD);抗雄激素类,诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物;以及两种或多种上述物质的组合。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此,生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂,诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞,例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见Mendelsohn和Israel编,《The Molecular Basis of Cancer》,第1章,题为“Cell cycle regulation,oncogenes,and antieioplastic drugs”,Murakaini等人,WB Saunders,Philadelphia,1995,例如第13页。紫杉烷类(帕利他塞(paclitaxel)和多西他塞(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他塞Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他塞促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定,导致对细胞中有丝分裂的抑制。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤(例如何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴增生性病症、及各种类型的头和颈癌。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中,细胞增殖性病症指癌症。
“抑制细胞生长或增殖”意味着将细胞的生长或增殖降低了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或100%,而且包括诱导细胞死亡。
“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“结肠直肠肿瘤”或“结肠直肠癌”指大肠(包括结肠(自盲肠至直肠的大肠)和直肠)的任何肿瘤或癌症。
“结肠直肠癌细胞”指结肠癌细胞或直肠癌细胞,或是在体内或是在体外,而且涵盖自结肠直肠癌细胞衍生的细胞系。
术语“结肠肿瘤”或“结肠癌”指结肠的任何肿瘤或癌症。
“结肠癌细胞”指结肠癌细胞,或是在体内或是在体外,而且涵盖自结肠癌细胞衍生的细胞系。
术语“新生物(neoplasm)”或“新生物细胞”指比相应的正常组织或细胞增殖更快且在启动生长的刺激消除后继续生长的异常组织或细胞。
术语“上皮-间充质转换(epithelial-mesenchymal transition)”或“EMT”指细胞丧失上皮特征并获得间充质特性的过程,包括但不限于在肿瘤细胞的情况中促进局部侵入和/或转移的细胞粘着丧失和迁移增强。
术语“肿瘤进展”指肿瘤的所有阶段,包括肿瘤发生、肿瘤生长和增殖、侵入、和转移。
术语“抑制肿瘤进展”意味着抑制肿瘤的发生、生长、增殖、或扩散,包括但不限于下列效果:(1)肿瘤生长受到一定程度的抑制,包括减缓或完全的生长阻滞;(2)肿瘤细胞数目减少;(3)肿瘤尺寸缩小;(4)肿瘤细胞进入附近外周器官和/或组织的浸润受到抑制(即降低、减缓或完全终止);(5)转移受到抑制(即降低、减缓或完全终止);(6)肿瘤治疗后患者或患者群的存活时间长度延长;和/或(7)肿瘤治疗后给定时间点时患者或患者群的死亡率降低。
若肿瘤进展受到抑制,如上文所定义的,则肿瘤“响应”特定药剂。
术语“反义核酸”指降低与其部分或完全互补的靶多核苷酸表达的核酸。若反义核酸(a)选择性结合靶多核苷酸或其编码的mRNA并(b)将靶多核苷酸的表达降低至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%,则它对靶多核苷酸是“特异性”的。
术语“RNAi”或RNA干扰”指通过由RNA介导的机制,例如通过由双链RNA介导的机制来部分或完全抑制基因表达。术语“敲低”指此类对基因表达的部分或完全抑制。
术语“调节性RNA”或“调节性RNA分子”指能够调节基因表达的RNA,例如通过调节相应mRNA的表达。此类调节性RNA包括但不限于能够进行RNAi的RNA。若在表达靶多核苷酸的细胞中表达调节性RNA时,调节性RNA(a)选择性结合靶多核苷酸或其编码的mRNA并(b)将靶多核苷酸的表达降低至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%,则它对靶多核苷酸是“特异性”的。
术语“siRNA”或“短干扰RNA”指当在与靶多核苷酸相同的细胞中表达siRNA时,有能力降低靶多核苷酸表达的双链RNA。形成双链RNA的siRNA的互补链通常具有实质性的或完全的同一性。在一个实施方案中,siRNA指如下的双链RNA,其中一条链(也称作“反义”链)与靶mRNA的至少一部分具有实质性的或完全的同一性。在某些实施方案中,siRNA的长度为约15-50个核苷酸、长度为约20-30个核苷酸、长度为约20-25个核苷酸、或长度为24-29个核苷酸,包括上述范围内的整数的任何长度。还可参见PCT/US03/07237,公布号WO03076592,通过述及完整收入本文。若在表达所述靶多核苷酸的细胞中表达所述siRNA时,siRNA分子(a)选择性结合靶多核苷酸或其编码的mRNA并(b)将靶多核苷酸的表达降低至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%,则它对靶多核苷酸是“特异性”的。
术语“siRNA”涵盖能够形成发夹结构的RNA,例如微小RNA前体(pre-miRNA)和短发夹RNA(shRNA)。参见例如Brummelkamp et al.(2002)Science 550-553。pre-miRNA或shRNA是自我互补的RNA分子,其具有有义区、反义区、和环区,且能够形成发夹结构。在某些实施方案中,有义和反义区各自的长度是约15-50个核苷酸、长度是约20-30个核苷酸、长度是约20-25个核苷酸、或长度是约24-29个核苷酸,包括上述范围内的整数的任何长度;而且环部分的长度是约2-15个核苷酸或长度是约6-9个核苷酸,包括上述范围内的整数的任何长度。
术语“胞外结构域”或“ECD”指跨膜蛋白质中本质上排除所有跨膜和胞质结构域外的区域。
术语“可溶性多肽”指非膜结合的多肽。
“顽固性/不应性”(refractory)肿瘤指相关领域熟练临床医师会推断对治疗性处理有显著抗性和/或是(或预期是)显著不响应的肿瘤(例如肿瘤体积、癌性细胞数目、和/或癌症扩散有增加,即使给予治疗性处理)。在此语境中,此类治疗性处理包括但不限于化疗、放射、干细胞移植、和手术处理,排除用REST的激动剂、β2的拮抗剂、或刻缺蛋白的拮抗剂进行的处理。短语“对化疗有抗性”指相关领域熟练临床医师会推断对化疗有显著抗性和/或是(或预期是)显著不响应的肿瘤,排除用REST的激动剂、β2的拮抗剂、或刻缺蛋白的拮抗剂进行的化疗。
“复发性”指在治疗性处理后患者的病在消退后基本上回到其从前的患病状态,尤其是在响应治疗性处理而发生的表观恢复(apparent recovery)或部分恢复(partial recovery)(例如消退)后症状(例如癌细胞)的回复。在此语境中,此类治疗性处理包括但不限于化疗、放射、干细胞移植、和手术处理,排除用REST的激动剂、β2的拮抗剂、或刻缺蛋白的拮抗剂进行的处理。
术语“抗体”在本文中以最广义使用,明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段,只要它们展现出期望的生物学活性。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质,可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中,将抗体纯化至(1)根据例如Lowry法的测定,抗体重量超过95%,而在有些实施方案中,重量超过99%,(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度,或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色,达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在,那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而,分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接,而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(VH),接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL),而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起,而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。
术语“抗PRO抗体”或“结合PRO的抗体”指能够以足够亲和力结合PRO使得该抗体作为靶向PRO中的诊断剂和/或治疗剂有用的抗体。优选的是,抗PRO抗体结合无关、非PRO蛋白质的程度低于该抗体对PRO的结合的约10%,如例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量的。在某些实施方案中,结合PRO的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中,抗PRO抗体结合在来自不同物种的PRO间保守的PRO表位。
抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而,变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区,它们大多采取β-折叠片构象,通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起,并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应器功能,诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性中抗体的参与。
根据其恒定域的氨基酸序列,来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据其重链恒定域的氨基酸序列,抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可进一步分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的,一般性描述于例如Abbas et al.,Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用,指基本上完整形式的抗体而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。
“裸抗体(裸露的抗体)”为本发明目的指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段;双抗体(diabody);线性抗体;单链抗体分子;及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,各自具有一个抗原结合位点,及一个剩余的“Fc”片段,其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段,它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中,双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中,一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接,使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中,每个可变域的三个HVR相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,只是亲和力低于完整结合位点。
Fab片段包含重链和轻链可变域,而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言,scFv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头,其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Plückthun,于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,1994,第269-315页。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段,该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对,迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对,从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097;WO1993/01161;Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即构成群体的各个抗体相同,除了可能以极小量存在的可能的突变,例如天然存在的突变。如此,修饰语“单克隆”表明抗体不是不同的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中,此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体,其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如,选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解,所选择的靶物结合序列可进一步改变,例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等,而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外,单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征,不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如,将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成,包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein,Nature,256:495-97(1975);Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第2版1988);Hammerling et al.,于:Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893;WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO1991/10741;Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993);Bruggemann et al.,Year inImmuno.7:33(1993);美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;和5,661,016;Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-813(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996);Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体,其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现出期望的生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体,其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中,人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的HVR残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔、或非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中,将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能。一般而言,人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域,其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环,且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma & Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995);Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994);及美国专利No.6,982,321和7,087,409。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成,包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法:Cole et al.,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如6,075,181和6,150,584,关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006),关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常,抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1、H2、H3),三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中,H3和L3展示这六个HVR的最大多样性,而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.Immunity 13:37-45(2000);Johnson and Wu于:Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,2003)。事实上,仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.Nature363:446-448(1993);Sheriffet al.Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
“框架”或“FR”残基指可变域中除HVR残基外的那些残基。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案,亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可使用本领域已知的某些规程来生成。例如,Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。例如,以下文献记载了HVR和/或框架残基的随机诱变:Barbas et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier et al.,Gene 169:147-155(1995);Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制其所结合的抗原的生物学活性的抗体。阻断性抗体或拮抗性抗体可实质或完全抑制抗原的生物学活性。
“激动性抗体”在用于本文时指部分或完全模拟目的多肽的至少一项功能性活性的抗体。
“生长抑制性”抗体指那些阻止或降低表达抗体所结合之抗原的细胞增殖的抗体。例如,抗体可以在体外和/或在体内阻止或降低癌细胞增殖。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC);Fc受体结合;抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用;细胞表面受体(例如B细胞受体)下调;和B细胞活化。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区,包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化,但是人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447,依照EU编号系统)可以消除,例如在生产或纯化抗体的过程中,或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程。相应的,完整抗体组合物可包括消除了所有K447残基的抗体群、没有消除K447残基的抗体群、或者混合了有和没有K447残基的抗体的抗体群。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合、CDC、Fc受体结合、ADCC、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体;BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合域(例如抗体可变域)联合,而且可使用多种测定法来评估,例如本文定义中所公开的。
“天然序列Fc区”包含与自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)、天然序列人IgG2Fc区、天然序列人IgG3Fc区、及天然序列人IgG4Fc区,及其天然存在变体。
“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰,优选一处或多处氨基酸替代而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是,变异Fc区具有与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比至少一处氨基酸替代,例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代,优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中将优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80%的同源性,最优选至少约90%的同源性,更优选至少约95%的同源性。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中,FcR是天然人FcR。在有些实施方案中,FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体),包括属于FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体,包括那些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),它们具有相似的氨基酸序列,区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的综述参见例如Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991);Capel etal.,Immunomethods 4:25-34(1994);及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR,包括那些未来将会鉴定的。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体,FcRn,它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))并调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997,Hinton 2004)。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie and Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997);Ghetie etal.,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997);Hinton et al.,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004);WO 2004/92219(Hinton et al.))。
可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期,例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中,或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO 00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。还可参见例如Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中,该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离,例如血液。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞,随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性,可进行体外ADCC测定法,诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者/另外,可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如Clynes et al.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合抗体(适宜亚类的)起始的,该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活,可进行CDC测定法,例如如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如美国专利No.6,194,551B1和WO1999/51642。还可参见例如Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
“含Fc区的抗体”指包含Fc区的抗体。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以消除,例如在纯化抗体的过程中或者通过重组改造编码抗体的核酸。因此,依照本发明包含具有Fc区的抗体的组合物可包含具有K447的抗体、消除了所有K447的抗体、或具有与没有K447残基的抗体的混合物。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明,在用于本文时,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量,包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离,而高亲和力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法,其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的示例性和例示性实施方案。
在一个实施方案中,依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的:通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下,用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab,然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen,et al.,J Mol Biol 293:865-881(1999))。为了确定测定条件,用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被多孔板(Thermo Scientific)过夜,随后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中,将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的目的Fab混合(例如与Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体,Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab保温过夜;不过,保温可持续更长时间(例如约65个小时)以保证达到平衡。此后,将混合物转移至捕捉板以进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液,并用含0.1%Tween-20TM的PBS洗板8次。平板干燥后,加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM,Packard),然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一实施方案,Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIACORETM-2000或BIACORETM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之,依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM),然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后,注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量,在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05%TWEEN-20TM表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen et al.,J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法,结合速率超过106M-1s-1,那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定,即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的条件下,测量PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发=295nm;发射=340nm,16nm带通)的升高或降低。
依照本发明的“结合速率”(on-rate,rate of association,association rate)或“kon”也可如上所述使用或系统(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)来测定。
短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值(例如,一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的相似程度,以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较值的函数,所述两个数值之间的差异例如小于约50%,小于约40%,小于约30%,小于约20%,和/或小于约10%。
短语“实质性不同”在用于本文时表示两个数值(通常一个与某分子有关而另一个与参照/比较分子有关)之间足够高的差异程度,以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较分子该数值的函数,所述两个数值之间的差异例如大于约10%,大于约20%,大于约30%,大于约40%,和/或大于约50%。
“纯化的”意味着分子以至少95%(以重量计)、或至少98%(以包含它的样品的重量计)的浓度存在于样品中。
“分离的”核酸分子指与例如该核酸分子的天然来源中通常与之关联的至少一种其它核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子进一步包括包含在通常表达该核酸分子的细胞中的核酸分子,但是所述核酸分子是以染色体外形式存在的或在染色体上的定位不同于它其天然染色体定位。
术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”,指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体,其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中,由此随着宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常,在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可互换使用,因为质粒是载体的最常用形式。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用,指任何长度的核苷酸聚合物,包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物,或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸,诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话,对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后包含修饰,诸如偶联至标记物。其它类型的修饰包括例如
“帽”,将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代,核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰,含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外,通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换,用标准保护基团保护,或活化以制备与别的核苷酸的别的连接,或者可偶联至固体或半固体支持物。5′和3′末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式,包括例如2′-氧-甲基-、2′-氧-烯丙基-、2′-氟-或2′-叠氮-核糖,碳环糖类似物,α-端基异构糖,差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖,无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案,其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代,其中R或R′各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1-20个C),任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸,包括RNA和DNA。
“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸,一般是单链,一般是合成的,长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。
II.本发明的实施方案
在各种实施方案中,提供了用于以丧失REST功能、β2表达、和/或刻缺蛋白活化为特征的肿瘤的分类、诊断、治疗、和预防的组合物和方法。在其它实施方案中,提供了用于调控细胞过程诸如EMT、细胞迁移、和凋亡的组合物和方法。本发明的这些和其它实施方案基于如下的发现,即在肿瘤中转录阻抑物REST的丧失导致β2表达,其继而结合并活化刻缺蛋白信号传导。
A.组合物
提供了用于肿瘤(包括顽固性肿瘤)的治疗或预防的组合物。此类组合物可单独地或是组合地包含REST激动剂、β2拮抗剂、和刻缺蛋白拮抗剂。
一方面,β2拮抗剂是结合β2的阻断性抗体。在一个实施方案中,这样的抗体阻断(或是部分地或是完全地)β2结合刻缺蛋白。在一个实施方案中,阻断性抗体结合β2的ECD。本文中描述了某些结合β2的抗体,而且命名为3D1.4.1(“3D1”)、12A9.22.1(“12A9”)、2E3.1.1(“2E3”)、12E3、或3G5。本文中还提供了与3D1、12A9、2E3、12E3、或3G5中任一项结合相同表位的抗体,以及与3D1、12A9、2E3、12E3、或3G5中任一项竞争对β2的结合的抗体。在一个实施方案中,阻断性抗体选自3D1、12A9、2E3、或3G5。在一个实施方案中,阻断性抗体与3D1、12A9、2E3、或3G5结合相同表位。在一个实施方案中,阻断性抗体与3D1、12A9、2E3、或3G5中任一项竞争对β2的结合。
在某些实施方案中,本文中所提供的抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中,抗体是抗体片段,例如Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、或(Fab’)2片段,或单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA;参见例如US Pat.No.6,248,516B1)。在某些实施方案中,抗体是双特异性抗体(参见例如WO94/04690和Suresh etal.(1986)Methods in Enzymology 121:210)。在某些实施方案中,抗体是嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体。例如,本文中提供了3D1、12A9、2E3、12E3、或3G5中任一项的人源化形式。
另一方面,β2拮抗剂是降低SCN2B表达的核酸。在一个实施方案中,所述核酸是对SCN2B特异性的反义核酸。在一个此类实施方案中,所述核酸是调节性RNA。在一个此类实施方案中,所述核酸通过RNAi降低SCN2B表达。在一个此类实施方案中,所述核酸是siRNA。本领域中知道某些SCN2B特异性siRNA。例如,某些SCN2B特异性shRNA是商品化的(例如Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。本领域中可找到某些其它β2拮抗剂。例如,TAPI-1(α-分泌酶的一种小分子抑制剂)可用于抑制自β2脱落胞外域(参见Kim et al.,J.Biol.Chem.280:23251-23261,2005)。
另一方面,β2拮抗剂是分离的多肽,优选可溶性多肽,其包含结合β2的刻缺蛋白片段。结合β2的刻缺蛋白片段预期会与内源刻缺蛋白竞争对β2的结合。在某些实施方案中,这样的片段基本上不能够实现刻缺蛋白信号传导。在一个实施方案中,多肽包括包含EGF重复10-21或14-21的哺乳动物刻缺蛋白1片段,或刻缺蛋白家族成员(例如刻缺蛋白2、刻缺蛋白3、或刻缺蛋白4)的功能等同片段。这样的功能等同片段可以例行确认,例如通过比对刻缺蛋白1的氨基酸序列与第二刻缺蛋白家族成员的多肽序列以鉴定后者中的相应片段,对如此鉴定出的片段测试β2结合。人刻缺蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1。EGF重复10-21大致位于SEQ ID NO:1中的下列位置:
EGF重复 | 氨基酸 |
10 | 372-410 |
11 | 412-450 |
12 | 452-488 |
13 | 490-526 |
14 | 528-564 |
15 | 566-601 |
16 | 603-639 |
17 | 641-676 |
18 | 678-714 |
19 | 716-751 |
20 | 753-789 |
21 | 791-827 |
在另一个实施方案中,分离的多肽包含特异性结合β2的刻缺蛋白片段,其中“特异性结合”在此语境中意味着该片段基本上不结合任何其它刻缺蛋白配体。在另一个实施方案中,分离的多肽包含结合β2但不结合锯齿蛋白和/或DLL的刻缺蛋白片段。在另一个实施方案中,分离的多肽包含结合β2且长度小于或等于500、450、400、350、300、250、200、150、或100个氨基酸的刻缺蛋白片段。
另一方面,β2拮抗剂是与刻缺蛋白中结合β2的区域结合的抗体。在一个实施方案中,所述区域是哺乳动物刻缺蛋白1中包含EGF重复10-21或14-21的区域,或刻缺蛋白家族成员(例如刻缺蛋白2、刻缺蛋白3、或刻缺蛋白4)的功能等同区域。这样的功能等同区域可以例行确认,例如通过比对刻缺蛋白1的多肽序列与第二刻缺蛋白家族成员的多肽序列以鉴定后者中的响应区域,并任选对如此鉴定出的区域测试β2结合。在某些实施方案中,与刻缺蛋白中结合β2的区域结合的抗体特异性阻断β2结合刻缺蛋白,其中“特异性阻断”在此语境中意味着该抗体不阻断任何其它刻缺蛋白配体结合刻缺蛋白。在某些实施方案中,与刻缺蛋白中结合β2的区域结合的抗体不结合锯齿蛋白和/或DLL。
另一方面,组合物包含REST激动剂。在一个实施方案中,REST激动剂是REST,包括全长REST的片段或变体,其保留REST的生物学活性(例如肿瘤阻抑物活性)。在另一个实施方案中,REST激动剂是编码上述任一项的核酸。
另一方面,组合物包含刻缺蛋白拮抗剂。刻缺蛋白活性可以通过各种选择性办法(例如反义、单克隆抗体、和RNAi)和非选择性办法(例如可溶性形式的刻缺蛋白或刻缺蛋白诱饵(decoy)、γ-分泌酶抑制剂、胞内MAML1诱饵、和Ras信号传导抑制剂)来拮抗,而且本领域知道多种刻缺蛋白拮抗剂。例如,已知多种γ-分泌酶抑制剂抑制刻缺蛋白信号传导活性。参见Zayzafoon et al.,J.Biol.Chem.279:3662-3670,2004(记载肽模拟物L-685,458的刻缺蛋白抑制效果);及Curry et al.,Oncogene 24:6333-6344,2005(记载γ-分泌酶的肽模拟物抑制剂(LY-411,575)和三肽醛抑制剂的刻缺蛋白抑制效果)。当前正在临床试验中测试MK-0752(γ-分泌酶的小分子抑制剂和刻缺蛋白信号传导活性的抑制剂)。参见J.Clin.Oncol.,2006ASCO Annual MeetingProceedings Part I.Vol 24,No.18S(June 20 Supplement),2006:6585。
本文中还提供了用于促进EMT、细胞迁移、和/或对凋亡的抗性的组合物。此类组合物在治疗性背景中会是有用的,例如其中提高细胞存活力和/或细胞迁移(例如在伤口愈合中)是所希望的。此类组合物在研究背景中也会是有用的。此类组合物可单独地或是组合地包含β2激动剂、REST拮抗剂、或刻缺蛋白激动剂。
一方面,例示性的β2激动剂包含β2,包括全长β2的片段或变体,其保留β2的生物学活性(例如结合刻缺蛋白和/或活化刻缺蛋白信号传导的能力)。β2激动剂可包含例如β2的ECD或其片段或变体,其保留结合刻缺蛋白和/或活化刻缺蛋白信号传导的能力。在另一个实施方案中,β2激动剂是编码上述任一项的核酸。人β2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:2。提供了下列特征的大致位置:信号肽为氨基酸1-29;ECD为氨基酸30-159;跨膜结构域为氨基酸160-180;胞质结构域为氨基酸181-215;而Ig样结构域为氨基酸32-154。
另一方面,例示性的刻缺蛋白激动剂包含刻缺蛋白,包括全长刻缺蛋白的片段或变体,其保留刻缺蛋白的生物学活性(例如激活靶基因表达的能力)。例如,缺少胞外亚基的刻缺蛋白受体是组成性活化的,而且在体外和在动物模型中具有转化活性。参见Nickoloff et al.,Oncogene 22:6598-6608。在另一个实施方案中,刻缺蛋白激动剂是结合刻缺蛋白的激动性抗体。
另一方面,例示性的REST拮抗剂包括REST的删除突变体和其它突变体形式,其具有降低的REST活性(例如降低的肿瘤阻抑物活性)。参见例如Westbrook et al.,Cell 121:837-848,2005。
B.方法
一方面,本文中提供了用于肿瘤进展(包括顽固性肿瘤)的治疗或预防的方法。在某些实施方案中,提供了用于抑制肿瘤进展的方法,该方法包括使肿瘤暴露于一种或多种选自β2拮抗剂、刻缺蛋白拮抗剂、和REST激动剂的药剂。上文中讨论了某些β2拮抗剂、刻缺蛋白拮抗剂、和REST激动剂,而且可以在本文所述方法中使用。在一个实施方案中,所述药剂是β2的拮抗剂。
在另一个实施方案中,所述肿瘤具有降低的REST活性。“降低的REST活性”指由于例如REST基因中的突变,包括但不限于REST基因整个或部分的删除、或导致REST生物学活性(例如转录阻抑物活性和/或肿瘤阻抑物活性)降低的任何其它事件,REST水平有显著降低或REST功能有显著丧失(REST功能的完全或部分丧失)。肿瘤中降低的REST活性可以通过例如比较肿瘤中的REST水平或活性与同肿瘤相同组织类型的正常组织中的REST水平或活性来检测。
在另一个实施方案中,所述肿瘤具有升高的β2活性。“升高的β2活性”指β2水平或活性(例如结合刻缺蛋白的能力;诱导EMT的能力;诱导细胞迁移的能力;或阻断凋亡的能力)有显著升高。升高的β2活性可以通过例如比较肿瘤中的β2水平或活性与同肿瘤相同组织类型的正常组织中的β2水平或活性来检测。
在另一个实施方案中,所述肿瘤具有升高的刻缺蛋白活性。“升高的刻缺蛋白活性”指刻缺蛋白水平或活性(例如提高一种或多种靶基因(例如HES家族基因、细胞周期调节基因(例如p21cip1/waf1、细胞周期蛋白D1)、NF-κB家族基因、或PPAR家族基因)表达的能力)有显著升高。升高的刻缺蛋白活性可以通过例如比较肿瘤中的刻缺蛋白水平或活性与同肿瘤相同组织类型的正常组织中的刻缺蛋白水平或活性来检测。
在另一个实施方案中,所述肿瘤是顽固性肿瘤。在一个此类实施方案中,所述肿瘤对化疗有抗性。在另一个实施方案中,所述肿瘤是转移性的。在另一个实施方案中,所述肿瘤是结肠肿瘤或选自图10E所示肿瘤类型的肿瘤。在另一个实施方案中,所述肿瘤在复发性患者中发生。
另一方面,提供了抑制细胞中的EMT的方法,该方法包括使细胞暴露于一种或多种选自β2拮抗剂、REST激动剂、和刻缺蛋白拮抗剂的药剂。上文中讨论了某些β2拮抗剂、刻缺蛋白拮抗剂、和REST激动剂,而且可以在本文所述方法中使用。在一个实施方案中,所述药剂是β2的拮抗剂。在另一个实施方案中,所述细胞具有降低的REST活性,如上文所定义的。在另一个实施方案中,所述细胞具有升高的β2活性,如上文所定义的。在另一个实施方案中,所述细胞具有升高的刻缺蛋白活性,如上文所定义的。在另一个实施方案中,所述细胞在体外。在另一个实施方案中,所述细胞在体内。在另一个实施方案中,所述细胞是肿瘤细胞。在一个此类实施方案中,所述肿瘤细胞来自顽固性肿瘤。在一个此类实施方案中,所述肿瘤对化疗有抗性。在另一个实施方案中,所述肿瘤细胞来自转移性肿瘤。在另一个实施方案中,所述肿瘤细胞是结肠肿瘤细胞或选自图10E的肿瘤细胞类型。在另一个实施方案中,所述肿瘤细胞来自复发性患者。
另一方面,提供了抑制细胞迁移的方法,该方法包括使细胞暴露于一种或多种选自β2拮抗剂、REST激动剂、和刻缺蛋白拮抗剂的药剂。上文中讨论了某些β2拮抗剂、刻缺蛋白拮抗剂、和REST激动剂,而且可以在本文所述方法中使用。在一个实施方案中,所述药剂是β2的拮抗剂。在另一个实施方案中,所述细胞具有降低的REST活性,如上文所定义的。在另一个实施方案中,所述细胞具有升高的β2活性,如上文所定义的。在另一个实施方案中,所述细胞具有升高的刻缺蛋白活性,如上文所定义的。在另一个实施方案中,所述细胞在体外。在另一个实施方案中,所述细胞在体内。在另一个实施方案中,所述细胞是肿瘤细胞。在一个此类实施方案中,所述肿瘤细胞来自顽固性肿瘤。在一个此类实施方案中,所述肿瘤对化疗有抗性。在另一个实施方案中,所述肿瘤细胞来自转移性肿瘤。在另一个实施方案中,所述肿瘤细胞是结肠肿瘤细胞或选自图10E的肿瘤细胞类型。在另一个实施方案中,所述肿瘤细胞来自复发性患者。
另一方面,提供了促进细胞中的凋亡的方法,该方法包括使细胞暴露于一种或多种选自β2拮抗剂、REST激动剂、和刻缺蛋白拮抗剂的药剂。上文中讨论了某些β2拮抗剂、刻缺蛋白拮抗剂、和REST激动剂,而且可以在本文所述方法中使用。在一个实施方案中,所述药剂是β2的拮抗剂。在另一个实施方案中,所述细胞具有降低的REST活性,如上文所定义的。在另一个实施方案中,所述细胞具有升高的β2活性,如上文所定义的。在另一个实施方案中,所述细胞具有升高的刻缺蛋白活性,如上文所定义的。在另一个实施方案中,所述细胞在体外。在另一个实施方案中,所述细胞在体内。在另一个实施方案中,所述细胞是肿瘤细胞。在一个此类实施方案中,所述肿瘤细胞来自顽固性肿瘤。在一个此类实施方案中,所述肿瘤对化疗有抗性。在另一个实施方案中,所述肿瘤细胞来自转移性肿瘤。在另一个实施方案中,所述肿瘤细胞是结肠肿瘤细胞或选自图10E的肿瘤细胞类型。在另一个实施方案中,所述肿瘤细胞来自复发性患者。
另一方面,提供了促进细胞中的EMT的方法,该方法包括使细胞暴露于一种或多种选自β2激动剂、REST拮抗剂、和刻缺蛋白激动剂的药剂。上文中讨论了某些β2激动剂、刻缺蛋白激动剂、和REST拮抗剂,而且可以在本文所述方法中使用。在一个实施方案中,所述药剂是β2的激动剂。在另一个实施方案中,所述细胞在体外。在另一个实施方案中,所述细胞在体内。
另一方面,提供了促进细胞迁移的方法,该方法包括使细胞暴露于一种或多种选自β2激动剂、REST拮抗剂、和刻缺蛋白激动剂的药剂。上文中讨论了某些β2激动剂、刻缺蛋白激动剂、和REST拮抗剂,而且可以在本文所述方法中使用。在一个实施方案中,所述药剂是β2的激动剂。在另一个实施方案中,所述细胞在体外。在另一个实施方案中,所述细胞在体内。
另一方面,提供了阻断凋亡的方法,该方法包括使细胞暴露于一种或多种选自β2激动剂、REST拮抗剂、和刻缺蛋白激动剂的药剂。上文中讨论了某些β2激动剂、刻缺蛋白激动剂、和REST拮抗剂,而且可以在本文所述方法中使用。在一个实施方案中,所述药剂是β2的激动剂。在另一个实施方案中,所述细胞在体外。在另一个实施方案中,所述细胞在体内。
另一方面,提供了确定肿瘤是否会响应β2拮抗剂或刻缺蛋白拮抗剂的方法,该方法包括检测肿瘤中降低的REST活性或升高的β2活性,其中所述肿瘤中降低的REST活性或升高的β2活性指示该肿瘤会响应β2拮抗剂或刻缺蛋白拮抗剂。在一个实施方案中,所述方法包括检测肿瘤中降低的REST活性。在一个此类实施方案中,所述方法包括检测REST基因中导致REST活性降低的突变。在一个此类实施方案中,所述方法包括检测REST基因中的删除。在另一个实施方案中,所述方法包括检测肿瘤中升高的β2活性。在一个此类实施方案中,所述方法包括检测升高的SCN2B mRNA水平。在另一个此类实施方案中,所述方法包括检测升高的β2蛋白质水平。在一个此类实施方案中,所述方法包括检测胞外环境中升高的β2ECD水平。在另一个实施方案中,所述肿瘤是顽固性肿瘤。在一个此类实施方案中,所述肿瘤对化疗有抗性。在另一个实施方案中,所述肿瘤是转移性的。在另一个实施方案中,所述肿瘤是结肠肿瘤或选自图10E所示肿瘤类型的肿瘤。在另一个实施方案中,所述肿瘤来自复发性患者。
另一方面,提供了评估肿瘤预后的方法,该方法包括检测肿瘤中降低的REST活性或升高的β2活性,其中降低的REST活性或升高的β2活性指示该肿瘤具有不良预后。“不良预后”意味着有实质性的可能性(>50%机会),肿瘤是或会是顽固性和/或转移性的。在一个实施方案中,所述方法包括检测肿瘤中降低的REST活性。在一个此类实施方案中,所述方法包括检测REST基因中导致REST活性降低的突变。在一个此类实施方案中,所述方法包括检测REST基因中的删除。在另一个实施方案中,所述方法包括检测肿瘤中升高的β2活性。在一个此类实施方案中,所述方法包括检测升高的SCNB2mRNA水平。在另一个此类实施方案中,所述方法包括检测升高的β2蛋白质水平。在一个此类实施方案中,所述方法包括检测胞外环境中升高的β2ECD水平。在另一个实施方案中,所述肿瘤是结肠肿瘤或选自图10E所示肿瘤类型的肿瘤。
另一方面,提供了将肿瘤分类为其中刻缺蛋白信号传导被激活的肿瘤的方法,该方法包括检测肿瘤中降低的REST活性或升高的β2活性,其中降低的REST活性或升高的β2活性指示该肿瘤是其中刻缺蛋白信号传导被激活的肿瘤。在一个实施方案中,所述方法包括检测肿瘤中降低的REST活性。在一个此类实施方案中,所述方法包括检测REST基因中导致REST活性降低的突变。在一个此类实施方案中,所述方法包括检测REST基因中的删除。在另一个实施方案中,所述方法包括检测肿瘤中升高的β2活性。在一个此类实施方案中,所述方法包括检测升高的SCNB2mRNA水平。在另一个此类实施方案中,所述方法包括检测升高的β2蛋白质水平。在一个此类实施方案中,所述方法包括检测胞外环境中升高的β2ECD水平。在另一个实施方案中,所述肿瘤是结肠肿瘤或选自图10E所示肿瘤类型的肿瘤。在另一个实施方案中,所述肿瘤是顽固性肿瘤。在一个此类实施方案中,所述肿瘤对化疗有抗性。在另一个实施方案中,所述肿瘤是转移性的。在另一个实施方案中,所述肿瘤来自复发性患者。
C.药物配制剂和施用
包含药剂(例如上文II.A部分中所提供的抗体、蛋白质或核酸)的药物配制剂可以依照暴露于普遍知道的方法来制备。通过将具有期望纯度的药剂与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s PharmaceuticalSciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))混合来制备此类配制剂,以水溶液或冻干或其它干燥剂型的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者一般是低毒性的,而且包括缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵;氯化己烷双胺;苯扎氯铵、苯索氯铵;酚、丁醇或苯甲醇;对羟基苯甲酸烃基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖类,诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐相反离子,诸如钠;金属复合物(如Zn-蛋白质复合物);和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。用于体内施用的药物配制剂一般是无菌的。这可容易地通过经无菌滤膜过滤来实现。
药剂还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington′s PharmaceuticalSciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有活性药剂的固体疏水性聚合物半透性基质,该基质以定型产品的形式存在,例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)、及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上,但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化药剂在体内长时间维持时,它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集,导致生物学活性损失和(对于抗体而言)免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如,如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换而形成分子间S-S键,那么可通过修饰巯基残基、自酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
另一方面,提供了为治疗或预防而施用药剂(例如上文II.A部分中所提供的抗体、蛋白质或核酸)的方法。在某些实施方案中,所述药剂与至少一种别的治疗剂和/或佐剂组合施用。在某些实施方案中,别的治疗剂是细胞毒剂、化疗剂、或生长抑制剂。在一个此类实施方案中,化疗剂是结肠癌治疗中所使用的药剂或药剂组合。此类药剂包括但不限于单独的或与亚叶酸(leucovorin)或左旋咪唑(levamisole)组合的氟尿嘧啶(5FU);edrocolomab;伊立替康(irinotecan);奥沙利铂(oxaliplatin);雷替曲塞(raltitrexed);和氟嘧啶(fluoropyrimidines)。
上文所述此类联合疗法涵盖联合施药(其中相同或分开配制剂中包含两种或更多种治疗剂)和分开施药,在后一种情况中,本发明药剂的施用可发生在别的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时、和/或之后。所述药剂也可以与放射疗法联合使用。
可通过任何合适手段来施用本发明的药剂(和任何别的治疗剂或佐剂),包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内,及损伤内(如果希望局部治疗的话)施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。另外,可通过脉冲输注来施用药剂,特别是剂量衰减的药剂。可通过任何合适路径服药,例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射,这部分取决于施药是短期的还是长期的。
例如,可以使用基因疗法来将本文所述任何核酸投递至体内细胞。依照一个实施方案,使用靶向剂将含有核酸的媒介引导至期望组织。
当前一般有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入哺乳动物的细胞,即体内(in vivo)和回体(ex vivo)。对于体内投递,通常在需要核酸和(如果可行的化)所编码的多肽的部位将核酸直接注射入哺乳动物。对于回体治疗,取出哺乳动物的细胞,将核酸导入这些分离的细胞,并将经过修饰的细胞或是直接施用于哺乳动物,或是例如装入多孔膜内并植入哺乳动物(参见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187)。
有多种技术可用于将核酸导入可存活细胞。这些技术根据是将核酸转移入体外培养细胞还是体内转移入感兴趣宿主的细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。转导牵涉复制缺陷型重组病毒(包括但不限于逆转录病毒)颗粒与细胞受体的结合,接着颗粒所包含的核酸导入细胞。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。
常用的体内核酸转移技术包括用病毒或非病毒载体(诸如腺病毒、慢病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒(AAV))和基于脂质的系统(可用于脂质介导的核酸转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol;参见例如Tonkinson et al.,Cancer Investigation,14(1):54-65(1996))进行的转染。此类载体用于合成可用作投递药剂(诸如本发明的拮抗剂和核酸分子)的媒介的病毒。基因疗法中最常用的载体是病毒,例如腺病毒、AAV、慢病毒或逆转录病毒。在一个实施方案中,病毒载体(诸如逆转录病毒载体)包含至少一种转录启动子/增强子或基因座限定元件(locus-defining element)、或通过其它手段(诸如可变剪接、核RNA输出、或信使的翻译后修饰)控制基因表达的其它元件。另外,病毒载体(诸如逆转录病毒载体)可包含与感兴趣核酸可操作连接且充当翻译起始序列的核酸分子。此类载体构建物还可包含包装信号、长末端重复(LTR)或其部分、及适于所用病毒的正链和负链引物结合位点(如果病毒载体中原先没有这些的话)。另外,此类载体构建物可包含信号序列,供所编码多肽自它所在宿主细胞分泌。任选的是,载体构建物还可包含指导多腺苷酸化的信号,以及一种或多种限制性位点和翻译终止序列。举例而言,载体通常会包含5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二条DNA链合成的起点、和3′LTR或其部分。可使用的其它载体有非病毒的,诸如阳离子脂质、聚赖氨酸和树状聚体。
在有些情况中,将用于投递核酸或其它分子的媒介与使媒介靶向特定细胞群的靶向剂结合。希望与靶向靶细胞的药剂一起提供核酸源。在一个实施方案中,所述靶向剂是对靶细胞上细胞表面膜蛋白特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体的情况中,与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入。受体介导的胞吞技术记载于例如Wu etal.,J.Biol.Chem.,262:4429-4432(1987);及Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3410-3414(1990)。
关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述参见Anderson et al.,Science,256:808-813(1992)。还可参见WO93/25673及其引用的参考文献。合适的基因疗法和制备逆转录病毒颗粒和结构蛋白的方法可参见例如美国专利No.5,681,746。
本发明的抗体会以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。不是必需而是任选将抗体与目前用于预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的本发明抗体的量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些一般是以与上文所用相同剂量和施用路径使用,或是本文所述剂量的大约1-99%,或者凭经验/临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径。
对于疾病的预防或治疗,本发明抗体的适宜剂量(在单独地或与一种或多种其它别的治疗剂组合地使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体是出于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对抗体的响应、及主治医师的判断。合适的是,一次性或通过一系列治疗将抗体施用于患者。根据疾病的类型和严重程度,施用于患者的初始候选剂量可以约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗体,例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素,典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药,根据状况,持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。抗体的例示剂量的范围可以是约0.05mg/kg至约10mg/kg。如此,可对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一剂或多剂。这些剂量可间歇施用,例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂,或例如约6剂抗体)。可施用一剂较高的初始加载剂量,后续一剂或多剂较低剂量。例示性剂量给药方案包括施用一剂约4mg/kg抗体的初始加载剂量,后续每周一剂约2mg/kg抗体的维持剂量。然而,其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。
实施例
A.材料和方法
1.肿瘤组织中β2的检测
在载玻片上将新鲜的、冷冻的结肠肿瘤组织切片成5-10mm。使用Arcturus PixCell系统实施LCM。使用15或30mm激光像素大小,自H&E染色的切片解剖肿瘤细胞或正常上皮;每份样品收集等量的100-3000个细胞。分离RNA,生成探针,并在cDNA微阵列上杂交。使用来自Biocare Medical(Concord,CA)的MACH 3家兔探针HRP聚合物试剂盒或MACH 3小鼠探针HRP聚合物试剂盒遵循制造商的指导实施免疫组织化学(IHC)。抗REST多克隆抗体(Upstate,Lake Placid,NY)或抗β2单克隆抗体(3D1,Genentech,Inc.)与人结肠腺癌(III级)和结肠转移癌组织阵列(Cybrdi,Gaithersburg,MD)一起使用。
2.SCN2B(β2)质粒构建和转染
SCN2B.ECD.HIS构建物:将编码C端带多组氨酸标签(HIS8)的SCN2BECD的核酸克隆入pSVI7载体(DHFR)中并使用Fugene 6(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)转染入DP12 CHO细胞中。在含有200nM甲氨蝶呤的培养基中选择克隆。使用Ni-NTA珠(Qiagen,Valencia,CA)自经转染DP12细胞培养液纯化β2蛋白质,用于表型研究、单克隆抗体生成、和刻缺蛋白1结合研究。SCN2B.FL.GFP:将全长SCN2B构建物克隆入pSVIPD.IRES.GFP载体(嘌呤霉素抗性标记)中并转染入CHO或SW620细胞中,用于抗体筛选和表型测定。
3.细胞培养
在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的RPMI1640或F12∶DMEM50∶50培养基中维持人肿瘤细胞系。在补充有10%FBS、GHT、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的F12∶DMEM50∶50培养基维持CHO细胞。在补充有EGM-2(Cambrex,Valkersville,MD)的EBM-2培养基中维持HUVEC细胞。
4.免疫印迹分析
在溶解缓冲液(100mM NaH2PO4,10mM Tris-HCL,8M尿素和0.05%tween-20,pH 8.0)中以超声处理来裂解细胞,并将溶胞物(通常是25μg总蛋白质)加载到4-12%Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)上。将蛋白质转移到PVDF膜(Invitrogen,Carlsbad,CA)或Nictrocellulose膜(Invitrogen)上。将免疫印迹在含2%BSA,5%奶粉的PBS中于4℃封闭过夜。使用下列抗体:小鼠抗β2单克隆或家兔抗β2多克隆(Genentech,Inc.)、抗REST多克隆抗体(Upstate,LakePlacid,NY)、抗刻缺蛋白1(G20)多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,SantaCruz,CA)、抗FLAG抗体(Sigma)。使用偶联有IRDye680的山羊抗小鼠IgG或偶联有IRDye680的驴抗家兔IgG(Roekland Inc.,Gilbertsville,PA)来实施二次检测。通过用Odyssey红外线成像系统(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)扫描印迹来检测和分析免疫反应性条带。或者,使用ECL抗小鼠IgG HRP(Amersham)来实施二次检测,并使用Chemiglow West(Alpha Innotech)来检测。
5.β2抗体的生成
用Ribi佐剂(Ribi Immunochem Research,Inc.,Hamilton,MO)中来自CHO细胞的重组带多组氨酸标签(HIS8)的人β2ECD(Genentech,Inc.,South SanFrancisco,CA)超免疫五只Balb/c小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)。使用与先前所述(Kohler和Milstein,Nature 256:495-497,1975;Hongo etal.,Hybridoma 14:253-260,1995)类似的改良方案将来自这些小鼠(都展现出高抗β2抗体滴度(根据直接ELISA)和对CHO细胞上表达的β2的特异性结合(根据FACS))的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653;ATCC,Rockville,MD)融合。10-12天后,收获上清液,并通过直接ELISA和FACS来筛选抗体生成。扩展并培养在第二轮亚克隆后显示最高免疫结合的克隆。使用与先前所述(Hongo et al.,见上文)类似的改良方案通过亲和层析(Pharmacia快速蛋白质液体层析[FPLC];Pharmacia,Uppsala,Sweden)纯化自每种杂交瘤谱系收获的上清液。然后将纯化的抗体制备物无菌过滤(0.2μm孔径;Nalgene,Rochester NY)并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中保存于4℃。
6.免疫荧光
波形蛋白和肌动蛋白细胞骨架(罗丹明-鬼笔环肽):将细胞在4%低聚甲醛中于室温固定20分钟,并用0.05%皂苷于室温透化5分钟。对于β2、REST、经切割的刻缺蛋白1NICD和E-钙粘着蛋白染色:将细胞在甲醇中于4℃固定2分钟。一抗温育于室温进行1小时(用于波形蛋白染色)或15分钟(用于罗丹明-鬼笔环肽染色)或于37℃进行1小时(用于β2、REST、经切割的刻缺蛋白1NICD和E-钙粘着蛋白染色)。二抗温育于室温进行30分钟。所使用的抗体如下:抗锚蛋白单克隆抗体(Chemincon International,Temecula,CA);抗波形蛋白单克隆抗体(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO);罗丹明-鬼笔环肽(Molecular Probes,Eugene,OR),抗REST多克隆抗体(Upstate,Lake Placid,NY),抗E-钙粘着蛋白单克隆抗体(Invitrogen,Carlsbad,CA),抗刻缺蛋白1(Val1744肽,检测完整的和经切割的刻缺蛋白1NICD)(Cell Signaling,Danvers,MA)或抗β2单克隆抗体(Genentech,Inc.)。二抗如下:偶联有Cy3的家兔抗小鼠IgG或偶联有Cy3的驴抗家兔IgG(Jackson Lab,Bar Harbor,Maine)。用Vectashield封固介质及DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)(Vector Lab,Burlingame,CA)封固载玻片。在配备有照相机的显微镜上使用60X放大倍数获取图像。使用Adobe Photoshop软件生成图像覆盖。为了完整的或经切割的刻缺蛋白1NICD染色,在二抗温育后,将载玻片与Hoechst 44257一起于室温温育20分钟以对细胞核染色,并用Prolong Gold抗褪色试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)封固。使用LSM510激光扫描共焦显微镜(Carl Zeiss MicroImaging,Inc.,Thornwood,NY)获取图像。使用Chameleon激光(Coherent,SantaClara,CA)的二光子激发来进行DAPI显现,其具有完全打开的针孔。使用HeNe(543nm)激光来进行荧光激发,针孔设置成一个Airy单位。保存TIFF格式的图像并在Photoshop中装配。
7.β2和β2-ECD诱导表型测定法
培养表达β2ECD的CHO细胞至80%汇合,并收集和离心培养基以除去任何细胞碎片。使用此条件培养基来处理细胞系,供所描述的分析用。使用自经载体转染的CHO细胞收集的培养基作为对照。为了鬼笔环肽、波形蛋白和E-钙粘着蛋白染色,将用条件培养基处理的细胞用抗体染色48或72小时。
8.抗体阻断测定法
将经SCN2B和载体转染的CHO细胞和SW620细胞以25%汇合接种到1孔腔式玻璃载玻片(Nalge Nunc International,Rochester,New York)上。将抗β2单克隆抗体以100ng/ml添加至细胞培养液。72小时后,将细胞用罗丹明鬼笔环肽染色。
9.β2消减测定法
使用Seize Primary免疫沉淀试剂盒(Pierce,Rockford,IL)遵循制造商的指令制备偶联有抗β2单克隆抗体的凝胶。将自DP12/SCN2B.ECD.HIS细胞收集的细胞培养液与偶联有抗β2单克隆抗体的凝胶一起温育2小时以除去β2。将流出液添加至细胞,供表型分析用。使用相同的规程用偶联有PBS的凝胶进行模拟β2消减。还使用Ni-NTA珠(Qiagen)来消减β2。
10.迁移测定法
使用8mm孔径的HTS FluoroBlock多孔插入系统(BD Biosciences,Bedford,MA)实施迁移测定法。将105个细胞/孔接种到上部孔中,并将FBS添加至底部孔。18小时后,将迁移至穿孔膜另一侧的细胞在10um YO-PRO-1碘化物(Invitrogen,Eugene,OR)中染色,并使用荧光读板仪Spectra Max GeminiEM(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)定量。
11.细胞死亡和药物抗性
对饥饿的抗性:将SW620细胞在完全培养基中以25%汇合接种到6孔板中过夜。次日上午用缺少FBS的培养基更换此培养基。为了测定,将细胞用胰蛋白酶脱离,清洗,并在0.4%台盼蓝(Invitrogen,Carlsbad,CA)中染色。使用血球计对总细胞和死亡细胞计数。一式三份实施测定。多柔比星抗性:在具有盐酸多柔比星(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)连续稀释度的96孔透明底黑色板(Corning Inc.,Corning,NY)中接种2x104个SW620细胞并温育5天。使用Cell Titer Glo发光细胞存活力试剂盒(Promega,Madison,WI)来测量细胞存活力。使用Envision 2103多标记阅读仪(PerkinElmer,Finland)对荧光定量。甲氨蝶呤抗性:在具有条件培养基中的β2ECD或对照条件培养基(二者含有200nm甲氨蝶呤(Genentech Inc.))的6孔板中接种5x105个CHO细胞。使细胞脱离板并用台盼蓝0.4%(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色,如所描述的。
12.siRNA敲低
使用60nm siRNA及DharmaFECT 2作为转染子实施SW620细胞中REST、Twist1或刻缺蛋白1的siRNA敲低。使用一种非靶向siRNA序列(Dharmacon,Lafayette,CO)作为阴性对照。siREST转染后4天实施免疫荧光染色和RT-PCR分析。对于Twist1和刻缺蛋白1敲低,转染后24-48小时用条件培养基中的β2ECD处理细胞,接着在又温育24-48小时后进行免疫荧光染色或RT-PCR分析。对于siREST实验,转染后12小时添加抗β2抗体。由Dharmacon(Lafayette,CO)设计和合成siRNA双链体。主要靶序列如下:
siREST:5’-CAACGAAUCUACCCAUAUUUU-3’(SEQ ID NO:3)。
siTwist1:5’-GCGACGAGCUGGACUCCAAUU-3’(SEQ ID NO:4)。
siNotch1:5’-GCGACAAGGUGUUGACGUUUU-3’(SEQ ID NO:5)。
别的siRNA序列:
siTWIST1:5’-CUGCAGACGCAGCGGGUCAUU-3’(SEQ ID NO:6),
5’-GGAGUCCGCAGUCUUACGAUU-3’(SEQ ID NO:7),
5’-GAGCAAGAUUCAGACCCUCUU-3’(SEQ ID NO:8);
SiNotch1:5’-GAUGCGAGAUCGACGUCAAUU-3’(SEQ ID NO:9),
5’-GAACGGGGCUAACAAAGAUUU-3’(SEQ ID NO:10),
5’-GCAAGGACCACUUCAGCGAUU-3’(SEQ ID NO:11)。
13.用于E-钙粘着蛋白强度计算的图像加工
在Photoshop CS2(9.0.2版,Adobe;San Jose,CA)中将图像自Photoshop格式转换成Tif。在Metamorph(7.0r4版,Molecular Devices;Sunnyvale,CA)中打开图像,并进行自动化分析例行程序。简言之,为每组图像应用一阈值(最大像素值的大约10-15%)以除去背景。使用标准消蚀功能来进一步降低背景和平滑剩余区域的边缘。将每个区域的面积和强度测量直接输出至Excel(Microsoft,Redmond,WA)。一个图像小子集具有高出背景但低于阈值的特殊染色。对此子集,手工创建感兴趣区域以获得面积和强度测量。典型的是,为每次分析分析和组合5个独立区域。
14.统计分析
一式三份(或更多)地实施分析,并在Microsoft Excel中使用Student氏T检验(方差相等,单尾分布)来分析。
15.结合测定法
免疫沉淀:使用5mm EDTA自培养板除去细胞,并在含有0.5%NP-40、无EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)和1mm PMSF的TBS中裂解。将溶胞物与预饱和的蛋白G-琼脂糖(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)一起于4℃温育1.5小时,接着与抗β2单克隆抗体一起于4℃温育2小时。然后将此溶胞物和抗体混合物与预先饱和的蛋白G-琼脂糖一起于4℃温育过夜。收集琼脂糖并在Tris-甘氨酸凝胶加载缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)中洗脱蛋白质,供免疫印迹分析用。直接结合:如上所述收集条件培养基,与15ml中带FLAG标签的刻缺蛋白1ECD:6-36(5μg)一起在摇动中于室温温育2小时。添加50μl Ni-NTA琼脂糖珠浆(Qiagen),并在摇动中于室温温育2小时。通过离心来收集Ni-NTA珠,并用PBS清洗3次。或者,用Ni-NTA珠处理条件培养基以富集β2,并将所得浆与1ml PBS中的刻缺蛋白1ECD:6-36(5μg)一起温育,清洗,如所描述的。将样品洗脱入2X加载缓冲液中。
16.微阵列分析
通过使用机械点样仪(Norgren Systems,Mountain View,California)将自cDNA克隆(Invitrogen,Carlsbad,California和Genentech,Inc.)衍生的PCR产物印到经3-氨丙基三乙氧基硅烷(Aldrich,Milwaukee WI)和1,4-亚苯基二异硫氰酸盐(Aldrich,Milwaukee,WI)包被的玻璃载玻片上,生成代表9031种基因的微阵列。通过CsCl分步梯度(Kingston RE,于Current Protocols in MolecularBiology,Vol.1(Ausubel FM,et al.编)4.2.5-4.2.6(John Wiley和Sons,Inc.,USA,1998))实现了自LCM材料分离RNA。如下,通过保守扩增和后续标记,生成供阵列分析用的探针:使用单轮改良体外转录方案(MEGASCript T7,Ambion,Austin,Texas)扩增自总RNA(Invitrogen,Carlsbad,CA)的寡dT引发生成的双链DNA。使用所得cRNA作为模板来生成有义DNA探针,其中使用随机引物(9聚物,0.15mg/ml)、Alexa 488dUTP或Alexa 546dUTP(分别为40μM和6μM,Molecular Probes,Eugene,Oregon)并使用自MMLV衍生的逆转录酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)。自来自通用参照RNA(Strategene,La Jolla,CA)的0.1μg总RNA生成用于反映一般上皮细胞表达的参照探针。在50%甲酰胺/5X SSC中于37℃将探针杂交至阵列过夜,并在次日在2X SSC,0.2%SDS中接着在0.2X SSC,0.2%SDS中清洗。使用配备有Xenon光源和适于每一种染料的光学过滤器的基于CCD-照相机的成像系统(Norgren Systems,MountainView,California)收集阵列图像。收集完整动力学范围图像(Autograb,Genentech Inc)并使用在Matlab(the Math Works,Natick,Massachusetts)平台上构建的自动化网格和数据提取软件(gImage,Genentech,Inc.)提取强度和比率。
17.微阵列数据分析
通过将对数比率(log ratio)对N强度绘图和通过拟合每个强度水平处的正态分布,将比值为每次实验内不同强度值处的实验散布标准化。为每次实验中的每种转录物推导零均值附近的标准偏差(Z值)的度量,而且在数据挖掘(data mining)中使用此数值。具体而言,对于每个微阵列,我们通过计算Z值来标准化数据,Z值是自测试与参照数据的比率的对数对测试与参照数据的最小值的对数的散点图获得的。通过将LOESS算法应用于散点图,作为强度的函数,我们评估比率的中值。我们如下评估标准误差,即将LOESS应用于绝对残差(absolute residual)的平方根,将结果平方以获得绝对中位差(median absolute deviation,MAD),并进行乘法修正以自MAD转换成标准误差。为每项比率确定Z得分,即将其距中值LOESS曲线的垂直距离除以该强度处的标准误差。使用Rosetta Resolver中的统计检验(Student氏T检验,方差相等,双尾分布)鉴定在肿瘤与正常上皮之间差异表达的基因。
B.结果
1.β2在肿瘤中表达
经由对激光捕捉显微解剖材料的微阵列表达序型分析,这种技术已证明能自复杂组织和疾病状态诸如肿瘤分离离散细胞群,容许鉴定先前没有与这些细胞联系起来的基因表达(Buckanovich et al.,Cancer Biol.Ther.5:635-642,2006;Espina et al.,Methods Mol.Biol.319:213-229,2006),我们发现了结肠肿瘤细胞中的β2表达。
对新鲜的、冷冻的结肠肿瘤切片实施了激光捕捉显微解剖(LCM)和转录物序型分析。样品收集偏向于肿瘤-基质边界附近的肿瘤细胞。使用LCM还分离了五组正常结肠上皮。在比较样品群的Student氏T检验中,与正常上皮相比,β2转录物被鉴定为在肿瘤上皮中过表达(p值=0.0014,图1A;图10A)。使用对自邻近肿瘤切片子集分离的RNA的RT-PCR确认了β2转录物的检测(图10B)。作为另一项确认,对一些邻近肿瘤切片实施了非同位素原位杂交(图10C),确认了肿瘤细胞表达。
通过使用抗β2单克隆抗体进行的免疫组织化学和组织微阵列对结肠肿瘤中β2表达的更广泛分析,揭示了来自41名患者中22名(54%)的III级原发性肿瘤和转移性肿瘤(通常是淋巴结)的肿瘤细胞中和62份正常结肠样品中5份(8%)中的表达。肿瘤染色是异质的,而且常常本质上是点状的,显示了肿瘤上皮间强度和分布的变化(图1B)。虽然LCM分析偏向于肿瘤-基质边界,但是这不排除别处的表达,而且在肿瘤边缘以及不是明显被基质束缚的肿瘤上皮其它区域检测到β2。在5份β2阳性正常结肠中观察到的染色是弱至中等的,而且仅存在于周围细胞中,上皮隐窝细胞中没有。总之,这些数据指示β2转录物和蛋白质二者在超过50%的结肠肿瘤中表达,与正常结肠上皮中非常有限的表达形成对比。对自肿瘤组织分离的蛋白质的免疫印迹分析指示β2在其它肿瘤类型中也表达(图10E)。
2.β2诱导细胞形态转化
EMT是一种转分化过程,其中上皮细胞获得更加运动性、侵入性细胞的许多属性,包括更加纺锤状、成纤维细胞形态的形成。β2全长蛋白质的表达或用含有仅仅β2胞外结构域(ECD)的条件培养基处理细胞诱导显著的细胞伸长和扩大以及肌动蛋白细胞骨架的重建(图2A)。在众多细胞系中观察到这些变化,包括肿瘤细胞系,诸如NCI-H226和SW620,以及CHO细胞(中国仓鼠卵巢;图2A)。确认这些变化源自β2蛋白质的表达后,使用对β2的ECD特异性的单克隆抗体可以阻断这些效果(图2B):许多新近分裂的细胞恢复至更加正常、圆形的外观。用无关对照抗体(抗豚草抗体)处理的细胞保留β2诱导的形态变化。
β2含有约129个氨基酸的预测成熟ECD(主要由Ig结构域组成)以及跨膜区和短(约35个氨基酸)胞内结构域。通过表达设计成自CHO细胞分泌的C端带his(8)标签的ECD构建物,我们调查了单独的ECD是否能诱导形态变化。当放置在多种不同细胞类型上时(未处理的CHO细胞、MDCK细胞、HUVEC(内皮)、或肿瘤细胞系NCI-H226、SW620、SW480、和PC-3;图2A、图11A),48-72小时后含有β2ECD的条件培养基能够诱导与上文所述那些相似的表型变化。为了确认这些效果是由于β2ECD的存在,自培养基消减β2蛋白质,然后添加至未处理的NCI-H226细胞。使用罗丹明-鬼笔环肽染色评估了肌动蛋白细胞骨架的变化,而且通过对β2蛋白质的免疫印迹分析了每份样品(图2C)。经模拟消减的含有β2蛋白质的条件培养基诱导完全的表型变化。基本上消减了(>90%)β2的条件培养基不产生可检测的表现变化,而部分消减了β2的条件培养基产生中间表型,其中细胞扩大且伸长但程度低于经模拟处理的细胞。这些数据指示在β2ECD条件培养基中观察到的表型变化依赖于β2ECD并反映β2蛋白质水平。
3.β2促进迁移并赋予针对细胞死亡的保护
与经历EMT的细胞密切相关的一项物理特性是运动升高。通过比较用β2和载体转染的SW620细胞或用β2ECD处理的细胞穿过Transwell膜迁移至含有胎牛血清(0.1%)的培养基的能力,调查了β2对肿瘤细胞迁移的影响。转染效率为约75%,其中用SCN2B转染的池中约40%的细胞展示典型的由β2诱导的表型变化。18小时后,对用β2转染的细胞和用条件培养基中的β2ECD处理的细胞都观察到显著的迁移升高(图3A;p分别为0.03和0.0009)。相反,用2种独立的抗β2抗体处理内源表达β2的SW480细胞(见图5A)导致迁移降低(图3B,每种抗体的p为0.001),进一步支持β2在促进细胞迁移中的作用。
EMT的另一项特性是对细胞死亡的抗性升高(Lee et al.,2006)。在经受饥饿和化疗药物处理二者的SW620细胞中调查了β2影响此特性的能力。使用β2或载体转染的对照细胞在缺少血清的培养基中经受为期2周的饥饿,并使用台盼蓝排除测定法与用载体转染的对照细胞比较细胞存活力。β2显著提高细胞存活力,与用载体转染的对照细胞的35%相比只有少于10%的细胞死亡(p为0.002,图3C)。β2还提升在暴露于化疗药物多柔比星后对细胞死亡的抗性(图3D)。在10倍的药物浓度范围里,用β2转染的SW620细胞展示与用载体转染的对照细胞相比显著升高的存活力,如通过定量细胞存活力测定法(CellTiter Glo,Promega,Madison,WI)所测定的。最后,我们观察到CHO细胞的β2表达提高它们对化疗药物甲氨喋呤的抗性,其中甲氨喋呤用于选择用全长β2转染的CHO细胞。为了独立评估这一点,将来自表达仅β2ECD的CHO细胞的条件培养基添加至未处理CHO细胞,并与用对照条件培养基处理的细胞比较。在200nM甲氨喋呤存在48小时的情况中,60%用对照处理的细胞死亡,而大多数用β2-ECD处理的细胞仍然存活(图3E,p为0.01),其中只有10%的细胞死亡。这些数据指示单独的β2ECD赋予对化疗药物的抗性。
4.β2诱导E-钙粘着蛋白丧失和波形蛋白获得且此过程依赖于EMT相差转录因子Twist1
E-钙粘着蛋白充当上皮表型看护(caretaker)之一,而且其丧失与肿瘤引发和进展二者有关(Thiery和Sleeman,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.7:131-142,2006)。E-钙粘着蛋白的丧失还与经历EMT的细胞强烈有关。SW620细胞表达E-钙粘着蛋白(图4A),而且用β2转化或用条件培养基中的β2ECD处理48小时大大降低E-钙粘着蛋白蛋白质水平,如通过免疫荧光(图4A)和FACS分析(图4B)所证明的。所诱导的间充质中间丝蛋白波形蛋白表达是经历EMT的上皮细胞的另一项特性(Huber et al.,Curr.Opin.Cell Biol.17:548-558,2005;Lee etal.,J.Cell Biol.172:973-981,2006;Thiery和Sleeman,见上文)。表达全长β2或用条件培养基中的β2ECD及抗波形蛋白抗体处理的SW620细胞的免疫荧光染色揭示了相对于其它方式情况下波形蛋白不可检测的水平而言,波形蛋白蛋白质表达有实质性升高(图4C)。
考虑到全长β2和β2ECD二者诱导E-钙粘着蛋白丧失和形态转化的能力,调查了能够介导EMT的转录因子的表达。为了便于检测可能展示瞬时表达或经受反馈调节的转录物,用条件培养基中的β2ECD处理SW620细胞,并在不同时间点分离RNA。微阵列分析揭示了用β2ECD处理后6小时对Twist1转录物的诱导,在后续时间点有振荡表达样式(图12A)。RT-PCR分析确认了Twist1的表达(图12B),而且没有对其它已表征EMT转录因子诸如Snail和Slug/Snail2的转录物的诱导的显著或强烈证据(未显示)。已经为多种转录因诸如HES1(其介导它们自己的负调节)(Hirata et al.,Science 298:840-843,2002)报告了振荡调节样式(oscillating pattern of regulation),而且我们对Twist1的观察结果提示它受到类似调节或由以此方式振荡的转录因子诱导的可能性。因为Twist1是对E-钙粘着蛋白启动子中E盒序列起作用的转录阻抑物,且能够在上皮细胞中诱导EMT(Batlle et al.,Nat.Cell Biol.2:84-89,2000;Boloset al.,J.Cell Sci.116:499-511,2003;Cano et al.,Nat.Cell Biol.2:76-83,2000;Conacci-Sorrell et al.,J.Cell Biol.163:847-857,2003;Yang et al.,Cell117:927-939,2004),所以这些数据提示暴露于β2后对Twist1表达的诱导可能在所观察到的形态转化中发挥重大作用。
为了进一步调查Twist1在由β2诱导的EMT样形态转化中的作用,使用siRNA敲低自SW620细胞消减Twist1。然后用条件培养基中的β2ECD处理细胞(图4D),并评估肌动蛋白细胞骨架和E-钙粘着蛋白染色。在用非靶向siRNA处理的对照细胞中,β2处理诱导肌动蛋白细胞骨架重建和E-钙粘着蛋白丧失,而对照条件培养基对细胞没有效果。然而,在存在对Twist1特异性的siRNA的情况中,β2不再能够诱导EMT;E-钙粘着蛋白染色仍然呈阳性且细胞形态是正常的(图4D)。对来自细胞的多个独立视野的E-钙粘着蛋白染色的定量分析揭示了消减了Twist1的用β2ECD处理的细胞与对照细胞相比的统计学显著差异(图4E,p为0.001和0.009)。这些数据指示SW620中由β2诱导的EMT依赖于Twist1的存在。发育中EMT相关转录因子间的对话和合作已有记载(Aybar et al.,Development 130:483-494,2003;Ganguly et al.,Development 132:3419-3429,2005),而且虽然在此研究中没有强烈检测到它们的转录物,但是可能的是转录因子诸如Snail和Slug也能在β2诱导的EMT中发挥作用,或是在这些细胞中或是在不同的细胞类型中。总之,考虑到β2ECD处理对Twist1的诱导和由β2诱导的形态转化对Twist1(一种已表征的诱导EMT的转录因子)的依赖性二者,这些结果强烈支持我们的发现β2确实诱导EMT的表型数据。
5.在肿瘤细胞中敲低REST导致由β2介导的EMT样形态转化
REST(一种在非神经组织中限制神经元基因表达的负转录调节物)最近表征为结肠和可能其它癌症中的肿瘤阻抑物(Westbrook et al.,Cell121:837-848,2005)。II型电压依赖性钠通道及相关蛋白质在神经元中和在发育中表达,而SCN2A是已鉴定的第一批受REST调节的基因之一。对SCN2B基因组区(编码β2)的分析揭示了第一内含子中的一簇4个共有REST结合位点,提示REST可能调节β2表达。我们使用结肠肿瘤细胞系进一步调查了肿瘤细胞中的β2表达与REST失调之间的可能联系。将细胞系对REST和β2蛋白质染色,揭示了交互的表达(reciprocal expression):结肠细胞系SW480、记载为REST阴性的SW1417(Westbrook et al.,见上文)、及SW1116是β2阳性的,而在REST阳性系SW620中没有检测到β2(图9、图5A)。DLD-1表达缺少阻抑物结构域的突变型REST蛋白质(Westbrook et al.,见上文)且β2染色呈阳性(图9)。这些数据与β2受到REST的转录抑制(直接地或间接地)一致。通过免疫组织化学对结肠肿瘤中REST和β2蛋白质表达的分析揭示了这种联系持续存在:我们发现了较早描述的III级腺癌和转移性结肠肿瘤样品中REST和β染色的交互样式(reciprocal pattern)。在来自41名患者中18名的肿瘤中观察到点状REST染色(44%;图5A),而且只在一份肿瘤中有REST和β2染色交叠(在41例中22例中检测到β2表达)。在62份正常结肠样品中40份中检测到REST染色(65%),无一β2呈阳性。这些结果指示表达中的反相关不仅仅是细胞系现象,而且对于肿瘤组织也如此,支持如下的假设,即人类肿瘤细胞中REST的丧失会促成β2的表达。
我们进一步调查了REST肿瘤阻抑物和β2之间的生物学相关功能联系的可能性。为了确定在肿瘤细胞背景中REST的丧失是否能导致β2表达和EMT诱导,使用RNAi消减了SW620中的REST。SW620显示与SW480相反的REST和β2染色样式(图5A),但来自于同一个体的肿瘤。用REST特异性siRNA转染后5天,免疫印迹分析确认了与用非靶向对照siRNA转染的细胞相比,REST的实质性降低和β2蛋白质的实质性升高(图5B、C;图13A、B)。在REST敲低细胞中,与由β2诱导的EMT一致的细胞形态变化(如使用肌动蛋白细胞骨架的罗丹明-鬼笔环肽染色所显现的)、E-钙粘着蛋白的实质性降低、和对波形蛋白的诱导是明显的(图5D)。对来自细胞的多个独立视野的E-钙粘着蛋白染色的定量分析揭示了与用非靶向对照siRNA转染的细胞相比,用REST特异性siRNA转染的细胞有统计学显著降低(图5E;p为0.001)。总之,这些数据指示在肿瘤细胞背景中REST的丧失的一个后果是β2的表达和对与EMT一致的形态变化的诱导。
在证明敲低REST诱导与EMT一致的形态变化和标志物表达后,我们使用功能阻断性β2单克隆抗体来确定源自REST丧失的EMT的诱导是否主要由β2表达介导。使用siRNA消减SW620细胞中的REST,并在存在针对β2或无关靶物(豚草)的抗体的情况中让细胞生长4天。然后将细胞用鬼笔环肽染色以显现肌动蛋白细胞骨架,或者用抗E-钙粘着蛋白或抗波形蛋白抗体染色。用抗豚草抗体处理的细胞经历对于由β2诱导的EMT和REST敲低而言典型的形态变化和E-钙粘着蛋白丧失。然而,消减了REST的、用β2特异性阻断性单克隆抗体3D1和2E3处理的细胞具有正常形态、强E-钙粘着蛋白表达、和少或无波形蛋白表达,与对非靶向siRNA对照观察到的相似(图5D)。对来自细胞的多个独立视野的E-钙粘着蛋白染色的定量分析揭示了与未处理的siREST或用抗豚草处理的siREST细胞相比,用独立的β2功能阻断性抗体3D1和2E3每一项处理的siREST细胞中的E-钙粘着蛋白水平有统计学显著升高(图5E,p分别为0.02和0.01)。这些结果与由REST丧失诱导的、由β2介导的且确实需要β2胞外表达的EMT样形态转化一致。
6.β2对EMT样形态转化的诱导依赖于刻缺蛋白1
刻缺蛋白信号传导是一种古老的且保守的系统,其在发育中和在成体自我更新细胞中调节细胞命运(Artavanis-Tsakonas et al.,Science 284:770-776,1999)。HES1是刻缺蛋白途径信号传导的一种已表征靶物(Jarriault et al.,Nature 377:355-358,1995),其由于自我介导的负调节而经历转录物表达的振荡周期(Hirata et al.,Science 298:840-843,2002)。来自β2ECD处理的SW620细胞的转录物表达数据中早期时间点(6-24小时)的振荡HES1表达(图12A)提示刻缺蛋白信号传导在由β2诱导的EMT中的作用。转录物分析指示刻缺蛋白1是在SW620细胞上以显著水平表达的唯一刻缺蛋白家族受体(图11B、C、D)。为了确定刻缺蛋白1是否是β2ECD在SW620细胞中诱导EMT所需要的,将细胞用对刻缺蛋白1特异性的siRNA或非靶向对照siRNA处理,用条件培养基中的β2ECD处理,并分析E-钙粘着蛋白的丧失,作为Twist1活性和EMT的首要标志。与用对照培养基处理的细胞相比,用非靶向siRNA转染并用β2ECD处理的细胞展现E-钙粘着蛋白染色丧失,但是刻缺蛋白1消减阻断此形态转化并导致E-钙粘着蛋白呈阳性的、具有正常肌动蛋白细胞骨架的细胞(图6A、C)。这些数据指示刻缺蛋白1是β2诱导EMT样形态转化所必需的。
刻缺蛋白信号传导的激活需要ADAM蛋白酶和γ-分泌酶二者切割受体以释放刻缺蛋白胞内结构域(NICD)。因此我们提问阻止刻缺蛋白信号传导的γ-分泌酶抑制剂(De Strooper et al.,Nature 398:518-522,1999)是否也会抑制由β2诱导的EMT。将SW620细胞与DMSO(媒介对照)或DMSO中的500nM特异性γ-分泌酶抑制剂DAPT(N-[N-(3,5-二氟苯基乙酰基-L-丙氨酸)]-S-苯甘氨酸叔丁酯)混合,用条件培养基中的β2ECD处理,并分析E-钙粘着蛋白丧失。与全长β2不同,β2ECD构建物不含已表征的γ-分泌酶切割位点(Kim et al.,J.Biol.Chem.280:23251-23261,2005),且因此不是DAPT加工的抑制的靶物。与用对照条件培养基处理的细胞相比,在存在DMSO的情况中用β2ECD处理的细胞显示典型的E-钙粘着蛋白丧失。然而,在存在DAPT的情况中用β2ECD处理的细胞仍然E-钙粘着蛋白呈阳性,提示刻缺蛋白1信号传导是β2诱导EMT所需要的(图6B、C)。siRNA敲低和γ-分泌酶抑制实验二者中对E-钙粘着蛋白的定量分析确认了刻缺蛋白1遭到消减或刻缺蛋白1信号传导遭到抑制的、用β2ECD处理的细胞中E-钙粘着蛋白水平的统计学显著差异(图6C)。
SW620细胞表达刻缺蛋白配体锯齿蛋白1和锯齿蛋白2(图11D),然而不经历EMT。考虑到刻缺蛋白信号传导在由β2诱导的EMT中的明显作用,我们调查了来自锯齿蛋白或德耳塔样家族的刻缺蛋白配体是否诱导EMT。通过外源添加各种形式的配体锯齿蛋白1或DLL1,包括反式即与表达配体的细胞共培养或使用板结合的配体,刺激细胞,但是在任何所使用的条件下没有观察到EMT的证据(数据未显示)。作为阳性对照,表达刻缺蛋白配体的细胞与用刻缺蛋白1转染的3T3细胞的共培养产生了刻缺蛋白途径信号传导的证据,如通过来自CSL结合启动子构建物的萤光素酶报告物测定法所测定的(数据未显示)。然而,在与表达锯齿蛋白1或DLL1的细胞进行的类似共培养测定法中对SW620的处理未能发生由报告物构建物诱导的EMT样形态变化或显著活性(数据未显示)。可能的是报告物构建物的灵敏度不足以检测SW620中的内源刻缺蛋白信号传导,但是尽管有这种考虑,没有证据证明锯齿蛋白1或DLL1诱导EMT或相关形态变化,提示这些已表征刻缺蛋白配体的表达和存在在反式情况中在这些细胞中不足以诱导EMT。
7.β2结合刻缺蛋白1并诱导刻缺蛋白胞内结构域(NICD)的核定位
用β2ECD处理细胞在不内源表达β2的细胞(例如SW620)中诱导表型变化,指示β2经由其起作用的受体不是β2自身。在确立由β2诱导的EMT依赖于刻缺蛋白1和刻缺蛋白途径信号传导,且观察到早在表型变化出现(24-72小时)前在6小时时间点对HES1转录物的诱导(图12A)后,我们调查了β2可能是刻缺蛋白1的配体或结合配偶的可能性。β2(一种Ig结构域蛋白质)不分享经典刻缺蛋白配体诸如锯齿蛋白-1或2和DLL1的序列特性。然而,两种其它Ig结构域蛋白质(接触蛋白/F3和NB3)被描述为促成在神经元前体中决定细胞命运的新的刻缺蛋白配体(Cui et al.,J.Biol.Chem.279:25858-25865,2004;Hu et al.,Cell 115:163-175,2003)。在考虑刻缺蛋白1作为β2的候选受体时,预期响应β2ECD而经历形态变化的细胞中会有刻缺蛋白1(或可能的刻缺蛋白2)表达。转录物分析揭示了β2响应性肿瘤细胞系表达刻缺蛋白1(且经常还有刻缺蛋白2,图11B、C中的例子)。内皮HUVEC细胞表达刻缺蛋白1且也响应β2,而不响应β2显示表型变化(图11A)的HEK293细胞不表达刻缺蛋白1(Hicks et al.,Nat.Cell Biol.2:515-520,2000;Ray et al.,J.Biol.Chem.274:36801-36807,1999)。这些观察结果与刻缺蛋白1是β2的效应器或受体是一致的。
为了确定刻缺蛋白1和β2是否能物理结合,我们实施了免疫共沉淀和对用全长β2转染的SW620细胞的免疫印迹分析,在免疫沉淀中使用抗β2单克隆抗体或无关对照抗体(抗豚草)。用刻缺蛋白1特异性单克隆抗体进行的免疫沉淀揭示了抗β2抗体与来自用β2转染的细胞溶胞物的内源刻缺蛋白1共沉淀。此共沉淀表现为特异性的,因为我们使用对照抗体或使用抗β2抗体及来自不表达β2的细胞的对照溶胞物没有观察到刻缺蛋白1沉淀(图7A)。
使用C端带组氨酸标签的β2ECD和纯化的含有大部分EGF重复区(重复6-36)及C端FLAG标签的刻缺蛋白1ECD区调查了β2能直接结合刻缺蛋白1的可能性。将刻缺蛋白1ECD(0.33μg/ml)与条件培养基中的β2ECD(β2估算为0.4μg/ml)一起温育,然后使用Ni-NTA珠收集β2蛋白质。或者,使用Ni-NTA珠自条件培养基富集β2,随后与PBS中的带标签的刻缺蛋白1ECD(3.3μg/ml)一起温育。与含有无关的带组氨酸标签的蛋白质的对照条件培养基相比,这两种办法都产生β2对带标签的刻缺蛋白1的回收(图7B)。值得注意的是,β2-刻缺蛋白1结合甚至在这两种蛋白质都为低浓度(大约1nM刻缺蛋白1ECD和20nM β2ECD,图7B第1道)时和在存在血清、其它由CHO生成的蛋白质、和条件培养基中存在的降解性酶的情况中也发生。纯化的刻缺蛋白1ECD作为双重带迁移,可能是由于糖基化或其它修饰(图7B)。然而,结合β2导致带标签的刻缺蛋白1ECD的单一、清楚限定的带,提示与结合有关的特异性,或可能的修饰。总之,这些结果支持β2作为刻缺蛋白1的结合配偶的作用。与其它刻缺蛋白配体相似,我们预计β2也会结合在一些β2响应性细胞系上高度表达的刻缺蛋白2密切同系物。
为了进一步表征β2和刻缺蛋白1的结合,如上所述将含有带标签的β2ECD的条件培养基与纯化的含有EGF重复10-21或22-33的刻缺蛋白1ECD片段一起温育。(锯齿蛋白-1结合刻缺蛋白1的EGF重复11-13,而果蝇德耳塔和锯齿蛋白结合刻缺蛋白的EGF重复11-12。)这些刻缺蛋白1ECD片段每一项含有C端FLAG标签以容许用抗FLAG抗体在免疫印迹上检测。β2ECD特异性结合含有EGF重复10-21的刻缺蛋白1ECD片段,对含有EGF重复22-33的ECD片段没有可检测的结合(图7C)。这些数据指示β2和刻缺蛋白1的结合是特异性的,而非经由EGF重复结构的非特异性结合。
配体对刻缺蛋白1的激活导致切割以释放NICD,其移位至核,并与其它蛋白质协作来直接调节刻缺蛋白靶基因转录。我们分析了是否能响应β2在细胞中检测到核NICD。因为NICD在历史上难以检测,所以我们在存在蛋白酶体抑制剂(100um乳胞素)的情况中培养细胞以帮助蛋白质稳定,并使用高分辨率共聚焦显微术来成像。与用载体转染的对照(其中除1个细胞外,只观察到细胞质或膜染色)相比,在大多数用β2转染的细胞中检测到核NICD(图7D)。类似地,用条件培养基中的β2ECD处理后6小时在SW620细胞中检测到核NICD(图7D),与6小时时在这些细胞中观察到的升高的HES1转录物一致。这些数据指示β2诱导对刻缺蛋白信号传导途径的激活。
综上所述,我们的数据指示,在作为附属蛋白质或粘着分子的作为之外,β2能诱导与EMT一致的形态转化。此神经元蛋白质在肿瘤中的表达可源自REST(非神经元组织中神经元基因表达的转录阻抑物)的丧失。此外,由β2诱导的形态转化依赖于刻缺蛋白(发育、分化和细胞命运的进化保守的主调节物)(Artavanis-Tsakonas et al.,Science 284:770-776,1999)。在经一种新的刻缺蛋白结合配偶β2联系REST丧失和刻缺蛋白途径信号传导时,我们描述了所有三项在肿瘤进展和转移中的作用。
8.抗体交叉阻断实验提示三种不同表位
实施了抗体交叉阻断实验来确定下列抗β2单克隆抗体是结合相同还是不同表位:3D1、12A9、12E3、2E3、和3G5。在那些实验中,在存在无标记的“竞争者”抗体的情况中评估了生物素化抗体对β2抗原的结合,如图14所描绘的。结果指示抗体3D1和12A9结合第一表位(“表位A”);抗体12E3结合第二表位(“表位B”);而抗体2E3和3G5结合第三表位(“表位C”)。
这些保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty)及其(布达佩斯条约)实施细则的规定进行的。这保证了自保藏之日起30年和最近一次请求提供保藏物样品后至少5年保存保藏的存活培养物。保藏物可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得,并服从Genentech公司与ATCC之间的协议,它保证了在有关美国专利授权后,保藏人对公众获取所保藏材料施加的所有限制将不可撤回的取消;保证了在有关美国专利授权后或者在任何美国或外国专利申请向公众公开后,以两者中居先者为准,公众可永久且不受限制的获得保藏培养物的后代;而且保证了依据35U.S.C.§122及依照它的管理章程(包括37C.F.R.§1.14,特别要提及886OG 638)由美国专利和商标局长批准的个人将有资格获得保藏培养物的后代。
本申请的受让人已同意,若保藏的培养物在合适条件下培养时死亡、丢失或遭到破坏,则他将在接到通知后迅速用同一培养物的存活样本更换。所保藏细胞系的可用性并不解释为对违反任何政府的机构依据其专利法所授予的权利实践本发明的许可。
尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细地描述了上述发明,说明书和实施例不应解释为限制发明范围。在此通过述及而明确收录本文中引用的所有专利和科学文献的完整公开内容。
序列表
<110>健泰科生物技术公司(GENENTECH,INC.)
Hongo,Jo-Anne S.
Li,Jing
Smith,Victoria
<120>用于抑制肿瘤进展的组合物和方法
<130>P2478R1
<150>US 60/988,874
<151>2007-11-19
<160>11
<210>1
<211>2556
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Met Pro Pro Leu Leu Ala Pro Leu Leu Cys Leu Ala Leu Leu Pro
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Arg Gly Pro Arg Cys Ser Gln Pro Gly Glu Thr
20 25 30
Cys Leu Asn Gly Gly Lys Cys Glu Ala Ala Asn Gly Thr Glu Ala
35 40 45
Cys Val Cys Gly Gly Ala Phe Val Gly Pro Arg Cys Gln Asp Pro
50 55 60
Asn Pro Cys Leu Ser Thr Pro Cys Lys Asn Ala Gly Thr Cys His
65 70 75
Val Val Asp Arg Arg Gly Val Ala Asp Tyr Ala Cys Ser Cys Ala
80 85 90
Leu Gly Phe Ser Gly Pro Leu Cys Leu Thr Pro Leu Asp Asn Ala
95 100 105
Cys Leu Thr Asn Pro Cys Arg Asn Gly Gly Thr Cys Asp Leu Leu
110 115 120
Thr Leu Thr Glu Tyr Lys Cys Arg Cys Pro Pro Gly Trp Ser Gly
125 130 135
Lys Ser Cys Gln Gln Ala Asp Pro Cys Ala Ser Asn Pro Cys Ala
140 145 150
Asn Gly Gly Gln Cys Leu Pro Phe Glu Ala Ser Tyr Ile Cys His
155 160 165
Cys Pro Pro Ser Phe His Gly Pro Thr Cys Arg Gln Asp Val Asn
170 175 180
Glu Cys Gly Gln Lys Pro Arg Leu Cys Arg His Gly Gly Thr Cys
185 190 195
His Asn Glu Val Gly Ser Tyr Arg Cys Val Cys Arg Ala Thr His
200 205 210
Thr Gly Pro Asn Cys Glu Arg Pro Tyr Val Pro Cys Ser Pro Ser
215 220 225
Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Arg Pro Thr Gly Asp Val Thr
230 235 240
His Glu Cys Ala Cys Leu Pro Gly Phe Thr Gly Gln Asn Cys Glu
245 250 255
Glu Asn Ile Asp Asp Cys Pro Gly Asn Asn Cys Lys Asn Gly Gly
260 265 270
Ala Cys Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Pro Cys Pro Pro
275 280 285
Glu Trp Thr Gly Gln Tyr Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Gln
290 295 300
Leu Met Pro Asn Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys His Asn Thr
305 310 315
His Gly Gly Tyr Asn Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Thr Gly Glu
320 325 330
Asp Cys Ser Glu Asn Ile Asp Asp Cy s Ala Ser Ala Ala Cys Phe
335 340 345
His Gly Ala Thr Cys His Asp Arg Val Ala Ser Phe Tyr Cys Glu
350 355 360
Cys Pro His Gly Arg Thr Gly Leu Leu Cys His Leu Asn Asp Ala
365 370 375
Cys Ile Ser Asn Pro Cys Asn Glu Gly Ser Asn Cys Asp Thr Asn
380 385 390
Pro Val Asn Gly Lys Ala Ile Cys Thr Cys Pro Ser Gly Tyr Thr
395 400 405
Gly Pro Ala Cys Ser Gln Asp Val Asp Glu Cys Ser Leu Gly Ala
410 415 420
Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys Cys Ile Asn Thr Leu Gly Ser
425 430 435
Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu
440 445 450
Ile Asp Val Asn Glu Cys Val Ser Asn Pro Cys Gln Asn Asp Ala
455 460 465
Thr Cys Leu Asp Gln Ile Gly Glu Phe Gln Cys Met Cys Met Pro
470 475 480
Gly Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Val Asn Thr Asp Glu Cys Ala
485 490 495
Ser Ser Pro Cys Leu His Asn Gly Arg Cys Leu Asp Lys Ile Asn
500 505 510
Glu Phe Gln Cys Glu Cys Pro Thr Gly Phe Thr Gly His Leu Cys
515 520 525
Gln Tyr Asp Val Asp Glu Cys Ala Ser Thr Pro Cys Lys Asn Gly
530 535 540
Ala Lys Cys Leu Asp Gly Pro Asn Thr Tyr Thr Cys Val Cys Thr
545 550 555
Glu Gly Tyr Thr Gly Thr His Cys Glu Val Asp Ile Asp Glu Cys
560 565 570
Asp Pro Asp Pro Cys His Tyr Gly Ser Cys Lys Asp Gly Val Ala
575 580 585
Thr Phe Thr Cys Leu Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly His His Cys
590 595 600
Glu Thr Asn Ile Asn Glu Cys Ser Ser Gln Pro Cys Arg Leu Arg
605 610 615
Gly Thr Cys Gln Asp Pro Asp Asn Ala Tyr Leu Cys Phe Cys Leu
620 625 630
Lys Gly Thr Thr Gly Pro Asn Cy s Glu Ile Asn Leu Asp Asp Cys
635 640 645
Ala Ser Ser Pro Cys Asp Ser Gly Thr Cys Leu Asp Lys Ile Asp
650 655 660
Gly Tyr Glu Cys Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Thr Gly Ser Met Cys
665 670 675
Asn Ser Asn Ile Asp Glu Cys Ala Gly Asn Pro Cys His Asn Gly
680 685 690
Gly Thr Cys Glu Asp Gly Ile Asn Gly Phe Thr Cys Arg Cys Pro
695 700 705
Glu Gly Tyr His Asp Pro Thr Cys Leu Ser Glu Val Asn Glu Cys
710 715 720
Asn Ser Asn Pro Cys Val His Gly Ala Cys Arg Asp Ser Leu Asn
725 730 735
Gly Tyr Lys Cys Asp Cys Asp Pro Gly Trp Ser Gly Thr Asn Cys
740 745 750
Asp Ile Asn Asn Asn Glu Cys Glu Ser Asn Pro Cys Val Asn Gly
755 760 765
Gly Thr Cys Lys Asp Met Thr Ser Gly Ile Val Cys Thr Cys Arg
770 775 780
Glu Gly Phe Ser Gly Pro Asn Cys Gln Thr Asn Ile Asn Glu Cys
785 790 795
Ala Ser Asn Pro Cys Leu Asn Lys Gly Thr Cys Ile Asp Asp Val
800 805 810
Ala Gly Tyr Lys Cys Asn Cys Leu Leu Pro Tyr Thr Gly Ala Thr
815 820 825
Cys Glu Val Val Leu Ala Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Arg Asn
830 835 840
Gly Gly Glu Cys Arg Gln Ser Glu Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Cys
845 850 855
Val Cys Pro Thr Ala Gly Ala Lys Gly Gln Thr Cys Glu Val Asp
860 865 870
Ile Asn Glu Cys Val Leu Ser Pro Cys Arg His Gly Ala Ser Cys
875 880 885
Gln Asn Thr His Gly Gly Tyr Arg Cys His Cys Gln Ala Gly Tyr
890 895 900
Ser Gly Arg Asn Cys Glu Thr Asp Ile Asp Asp Cys Arg Pro Asn
905 910 915
Pro Cys His Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Gly Ile Asn Thr Ala
920 925 930
Phe Cys Asp Cys Leu Pro Gly Phe Arg Gly Thr Phe Cys Glu Glu
935 940 945
Asp Ile Asn Glu Cys Ala Ser Asp Pro Cys Arg Asn Gly Ala Asn
950 955 960
Cys Thr Asp Cys Val Asp Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Pro Ala Gly
965 970 975
Phe Ser Gly Ile His Cys Glu Asn Asn Thr Pro Asp Cys Thr Glu
980 985 990
Ser Ser Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser
995 1000 1005
Phe Thr Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Ser Tyr Cys Gln
1010 1015 1020
His Val Val Asn Glu Cys Asp Ser Arg Pro Cys Leu Leu Gly Gly
1025 1030 1035
Thr Cys Gln Asp Gly Arg Gly Leu His Arg Cys Thr Cys Pro Gln
1040 1045 1050
Gly Tyr Thr Gly Pro Asn Cys Gln Asn Leu Val His Trp Cys Asp
1055 1060 1065
Ser Ser Pro Cys Lys Asn Gly Gly Lys Cys Trp Gln Thr His Thr
1070 1075 1080
Gln Tyr Arg Cys Glu Cys Pro Ser Gly Trp Thr Gly Leu Tyr Cys
1085 1090 1095
Asp Val Pro Ser Val Ser Cys Glu Val Ala Ala Gln Arg Gln Gly
1100 1105 1110
Val Asp Val Ala Arg Leu Cys Gln His Gly Gly Leu Cys Val Asp
1115 1120 1125
Ala Gly Asn Thr His His Cys Arg Cys Gln Ala Gly Tyr Thr Gly
1130 1135 1140
Ser Tyr Cys Glu Asp Leu Val Asp Glu Cys Ser Pro Ser Pro Cys
1145 1150 1155
Gln Asn Gly Ala Thr Cys Thr Asp Tyr Leu Gly Gly Tyr Ser Cys
1160 1165 1170
Lys Cys Val Ala Gly Tyr His Gly Val Asn Cys Ser Glu Glu Ile
1175 1180 1185
Asp Glu Cys Leu Ser His Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu
1190 1195 1200
Asp Leu Pro Asn Thr Tyr Lys Cys Ser Cys Pro Arg Gly Thr Gln
1205 1210 1215
Gly Val His Cys Glu Ile Asn Val Asp Asp Cys Asn Pro Pro Val
1220 1225 1230
Asp Pro Val Ser Arg Ser Pro Lys Cys Phe Asn Asn Gly Thr Cys
1235 1240 1245
Val Asp Gln Val Gly Gly Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe
1250 1255 1260
Val Gly Glu Arg Cys Glu Gly Asp Val Asn Glu Cys Leu Ser Asn
1265 1270 1275
Pro Cys Asp Ala Arg Gly Thr Gln Asn Cys Val Gln Arg Val Asn
1280 1285 1290
Asp Phe His Cys Glu Cys Arg Ala Gly His Thr Gly Arg Arg Cys
1295 1300 1305
Glu Ser Val Ile Asn Gly Cys Lys Gly Lys Pro Cys Lys Asn Gly
1310 1315 1320
Gly Thr Cys Ala Val Ala Ser Asn Thr Ala Arg Gly Phe Ile Cys
1325 1330 1335
Lys Cys Pro Ala Gly Phe Glu Gly Ala Thr Cys Glu Asn Asp Ala
1340 1345 1350
Arg Thr Cys Gly Ser Leu Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ile
1355 1360 1365
Ser Gly Pro Arg Ser Pro Thr Cys Leu Cys Leu Gly Pro Phe Thr
1370 1375 1380
Gly Pro Glu Cys Gln Phe Pro Ala Ser Ser Pro Cys Leu Gly Gly
1385 1390 1395
Asn Pro Cys Tyr Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro Thr Ser Glu Ser
1400 1405 1410
Pro Phe Tyr Arg Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn Gly Leu Leu
1415 1420 1425
Cys His Ile Leu Asp Tyr Ser Phe Gly Gly Gly Ala Gly Arg Asp
1430 1435 1440
Ile Pro Pro Pro Leu Ile Gl u Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys
1445 1450 1455
Gln Glu Asp Ala Gly Asn Lys Val Cys Ser Leu Gln Cys Asn Asn
1460 1465 1470
His Ala Cys Gly Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn
1475 1480 1485
Asp Pro Trp Lys Asn Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr
1490 1495 1500
Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys
1505 1510 1515
Leu Phe Asp Gly Phe Asp Cys Gln Arg Ala Glu Gly Gln Cys Asn
1520 1525 1530
Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Gly His
1535 1540 1545
Cys Asp Gln Gly Cys Asn Ser Ala Glu Cys Glu Trp Asp Gly Leu
1550 1555 1560
Asp Cys Ala Glu His Val Pro Glu Arg Leu Ala Ala Gly Thr Leu
1565 1570 1575
Val Val Val Val Leu Met Pro Pro Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser
1580 1585 1590
Phe His Phe Leu Arg Glu Leu Ser Arg Val Leu His Thr Asn Val
1595 1600 1605
Val Phe Lys Arg Asp Ala His Gly Gln Gln Met Ile Phe Pro Tyr
1610 1615 1620
Tyr Gly Arg Glu Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys Arg Ala
1625 1630 1635
Ala Glu Gly Trp Ala Ala Pro Asp Ala Leu Leu Gly Gln Val Lys
1640 1645 1650
Ala Ser Leu Leu Pro Gly Gly Ser Glu Gly Gly Arg Arg Arg Arg
1655 1660 1665
Glu Leu Asp Pro Met Asp Val Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu Glu
1670 1675 1680
Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Ala Ser Ser Gln Cys Phe Gln
1685 1690 1695
Ser Ala Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser Leu
1700 1705 1710
Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Gln Ser Glu
1715 1720 1725
Thr Val Glu Pro Pro Pro Pro Ala Gln Leu His Phe Met Tyr Val
1730 1735 1740
Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val
1745 1750 1755
Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Gln His Gly Gln Leu Trp Phe
1760 1765 1770
Pro Glu Gly Phe Lys Val Ser Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg Arg
1775 1780 1785
Glu Pro Leu Gly Glu Asp Ser Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys Asn
1790 1795 1800
Ala Ser Asp Gly Ala Leu Met Asp Asp Asn Gln Asn Glu Trp Gly
1805 1810 1815
Asp Glu Asp Leu Glu Thr Lys Lys Phe Arg Phe Glu Glu Pro Val
1820 1825 1830
Val Leu Pro Asp Leu Asp Asp Gln Thr Asp His Arg Gln Trp Thr
1835 1840 1845
Gln Gln His Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Met Ser Ala Met Ala
1850 1855 1860
Pro Thr Pro Pro Gln Gly Glu Val Asp Ala Asp Cys Met Asp Val
1865 1870 1875
Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met Ile Ala Ser
1880 1885 1890
Cys Ser Gly Gly Gly Leu Glu Thr Gly Asn Ser Glu Glu Glu Glu
1895 1900 1905
Asp Ala Pro Ala Val Ile Ser Asp Phe Ile Tyr Gln Gly Ala Ser
1910 1915 1920
Leu His Asn Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His Leu
1925 1930 1935
Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Glu
1940 1945 1950
Ala Ser Ala Asp Ala Asn Ile Gln Asp Asn Met Gly Arg Thr Pro
1955 1960 1965
Leu His Ala Ala Val Ser Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln Ile
1970 1975 1980
Leu Ile Arg Asn Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His Asp
1985 1990 1995
Gly Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly
2000 2005 2010
Met Leu Glu Asp Leu Ile Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val
2015 2020 2025
Asp Asp Leu Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn
2030 2035 2040
Asn Val Asp Ala Ala Val Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn Lys
2045 2050 2055
Asp Met Gln Asn Asn Arg Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala
2060 2065 2070
Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Thr Ala Lys Val Leu Leu Asp His Phe
2075 2080 2085
Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp
2090 2095 2100
Ile Ala Gln Glu Arg Met His His Asp Ile Val Arg Leu Leu Asp
2105 2110 2115
Glu Tyr Asn Leu Val Arg Ser Pro Gln Leu His Gly Ala Pro Leu
2120 2125 2130
Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ser Pro Pro Leu Cys Ser Pro Asn Gly
2135 2140 2145
Tyr Leu Gly Ser Leu Lys Pro Gly Val Gln Gly Lys Lys Val Arg
2150 2155 2160
Lys Pro Ser Ser Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys Glu Ala Lys
2165 2170 2175
Asp Leu Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gln Asp Gly Lys Gly Cys
2180 2185 2190
Leu Leu Asp Ser Ser Gly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu
2195 2200 2205
Ser Pro His Gly Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu
2210 2215 2220
Pro Ser Pro Phe Gln Gln Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu
2225 2230 2235
Pro Gly Met Pro Asp Thr His Leu Gly Ile Gly His Leu Asn Val
2240 2245 2250
Ala Ala Lys Pro Glu Met Ala Ala Leu Gly Gly Gly Gly Arg Leu
2255 2260 2265
Ala Phe Glu Thr Gly Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Pro Val Ala
2270 2275 2280
Ser Gly Thr Ser Thr Val Leu Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ala Leu
2285 2290 2295
Asn Phe Thr Val Gly Gly Ser Thr Ser Leu Asn Gly Gln Cys Glu
2300 2305 2310
Trp Leu Ser Arg Leu Gln Ser Gly Met Val Pro Asn Gln Tyr Asn
2315 2320 2325
Pro Leu Arg Gly Ser Val Ala Pro Gly Pro Leu Ser Thr Gln Ala
2330 2335 2340
Pro Ser Leu Gln His Gly Met Val Gly Pro Leu His Ser Ser Leu
2345 2350 2355
Ala Ala Ser Ala Leu Ser Gln Met Met Ser Tyr Gln Gly Leu Pro
2360 2365 2370
Ser Thr Arg Leu Ala Thr Gln Pro His Leu Val Gln Thr Gln Gln
2375 2380 2385
Val Gln Pro Gln Asn Leu Gln Met Gln Gln Gln Asn Leu Gln Pro
2390 2395 2400
Ala Asn Ile Gln Gln Gln Gln Ser Leu Gln Pro Pro Pro Pro Pro
2405 2410 2415
Pro Gln Pro His Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Gly His Leu
2420 2425 2430
Gly Arg Ser Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val Gln
2435 2440 2445
Pro Leu Gly Pro Ser Ser Leu Ala Val His Thr Ile Leu Pro Gln
2450 2455 2460
Glu Ser Pro Ala Leu Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro
2465 2470 2475
Pro Val Thr Ala Ala Gln Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gln His Ser
2480 2485 2490
Tyr Ser Ser Pro Val Asp Asn Thr Pro Ser His Gln Leu Gln Val
2495 2500 2505
Pro Glu His Pro Phe Leu Thr Pro Ser Pro Glu Ser Pro Asp Gln
2510 2515 2520
Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Asn Val Ser Asp Trp Ser Glu
2525 2530 2535
Gly Val Ser Ser Pro Pro Thr Ser Met Gln Ser Gln Ile Ala Arg
2540 2545 2550
Ile Pro Glu Ala Phe Lys
2555
<210>2
<211>215
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met His Arg Asp Ala Trp Leu Pro Arg Pro Ala Phe Ser Leu Thr
1 5 10 15
Gly Leu Ser Leu Phe Phe Ser Leu Val Pro Pro Gly Arg Ser Met
20 25 30
Glu Val Thr Val Pro Ala Thr Leu Asn Val Leu Asn Gly Ser Asp
35 40 45
Ala Arg Leu Pro Cys Thr Phe Asn Ser Cys Tyr Thr Val Asn His
50 55 60
Lys Gln Phe Ser Leu Asn Trp Thr Tyr Gln Glu Cys Asn Asn Cys
65 70 75
Ser Glu Glu Met Phe Leu Gln Phe Arg Met Lys Ile Ile Asn Leu
80 85 90
Lys Leu Glu Arg Phe Gln Asp Arg Val Glu Phe Ser Gly Asn Pro
95 100 105
Ser Lys Tyr Asp Val Ser Val Met Leu Arg Asn Val Gln Pro Glu
110 115 120
Asp Glu Gly Ile Tyr Asn Cys Tyr Ile Met Asn Pro Pro Asp Arg
125 130 135
His Arg Gly His Gly Lys Ile His Leu Gln Val Leu Met Glu Glu
140 145 150
Pro Pro Glu Arg Asp Ser Thr Val Ala Val Ile Val Gly Ala Ser
155 160 165
Val Gly Gly Phe Leu Ala Val Val Ile Leu Val Leu Met Val Val
170 175 180
Lys Cys Val Arg Arg Lys Lys Glu Gln Lys Leu Ser Thr Asp Asp
185 190 195
Leu Lys Thr Glu Glu Glu Gly Lys Thr Asp Gly Glu Gly Asn Pro
200 205 210
Asp Asp Gly Ala Lys
215
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>3
caacgaaucu acccauauuu u 21
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>4
gcgacgagcu ggacuccaau u 21
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>5
gcgacaaggu guugacguuu u 21
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>6
cugcagacgc agcgggucau u 21
<210>7
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>7
ggaguccgca gucuuacgau u 21
<210>8
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>8
gagcaagauu cagacccucu u 21
<210>9
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>9
gaugcgagau cgacgucaau u 21
<210>10
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>10
gaacggggcu aacaaagauu u 21
<210>11
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>11
gcaaggacca cuucagcgau u 21
Claims (13)
1.一种单克隆抗体,其结合β2并阻断β2结合刻缺蛋白,其中所述单克隆抗体:
(a)是由选自ATCC编号PTA-8404、PTA-8405和PTA-8406的杂交瘤生成的;或
(b)是(a)的抗体的人源化形式。
2.β2的拮抗剂在制备用于抑制表达β2的肿瘤进展的药物中的用途,其中所述抑制包括使肿瘤暴露于β2的拮抗剂,其中所述β2拮抗剂是权利要求1的抗体。
3.权利要求2的用途,其中所述肿瘤是转移性的。
4.权利要求2的用途,其中所述肿瘤对化疗有抗性。
5.权利要求2的用途,其中所述肿瘤是结肠肿瘤。
6.权利要求2的用途,其中所述肿瘤具有降低的REST活性或升高的β2活性。
7.β2的拮抗剂在制备用于抑制表达β2的细胞中的EMT的药物中的用途,其中所述抑制包括使细胞暴露于β2的拮抗剂,其中所述β2拮抗剂是权利要求1的抗体。
8.权利要求7的用途,其中所述细胞是肿瘤细胞。
9.权利要求8的用途,其中所述肿瘤细胞是自转移性肿瘤衍生的。
10.权利要求8的用途,其中所述肿瘤细胞是自对化疗有抗性的肿瘤衍生的。
11.权利要求8的用途,其中所述肿瘤细胞是结肠肿瘤细胞。
12.权利要求7的用途,其中所述细胞在体外。
13.权利要求7的用途,其中所述细胞在体内。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US98887407P | 2007-11-19 | 2007-11-19 | |
US60/988,874 | 2007-11-19 | ||
PCT/US2008/083865 WO2009067429A1 (en) | 2007-11-19 | 2008-11-18 | Compositions and methods for inhibiting tumor progression |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101932605A CN101932605A (zh) | 2010-12-29 |
CN101932605B true CN101932605B (zh) | 2014-06-11 |
Family
ID=40336462
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200880116661.3A Active CN101932605B (zh) | 2007-11-19 | 2008-11-18 | 用于抑制肿瘤进展的组合物和方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8563695B2 (zh) |
EP (1) | EP2220123A1 (zh) |
JP (2) | JP5745272B2 (zh) |
KR (1) | KR20100087330A (zh) |
CN (1) | CN101932605B (zh) |
AU (1) | AU2008326497B2 (zh) |
BR (1) | BRPI0817393A2 (zh) |
CA (1) | CA2702462A1 (zh) |
IL (1) | IL204945A0 (zh) |
MX (1) | MX2010005324A (zh) |
WO (1) | WO2009067429A1 (zh) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2008326497B2 (en) * | 2007-11-19 | 2014-02-13 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for inhibiting tumor progression |
ES2690829T3 (es) | 2012-09-17 | 2018-11-22 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Uso de e-cadherina y vimentina para la selección de pacientes que responden al tratamiento |
MX369691B (es) | 2012-11-21 | 2019-11-19 | Agios Pharmaceuticals Inc | Inhibidores de glutaminasa y métodos de empleo. |
US9029531B2 (en) | 2012-11-22 | 2015-05-12 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and their methods of use |
WO2014079011A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic compounds for inhibiting glutaminase and their methods of use |
AU2015231053B2 (en) | 2014-03-21 | 2019-04-11 | Les Laboratoires Servier | Compounds and their methods of use |
US20180148789A1 (en) * | 2014-12-01 | 2018-05-31 | University Of Southern California | Methods for treating and assessing tumor invasion and metastasis |
CN106749617A (zh) * | 2016-12-01 | 2017-05-31 | 南方医科大学 | 一种人notch1 nicd蛋白抗原、抗体及其制备方法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002018637A2 (en) * | 2000-09-02 | 2002-03-07 | Imperial College Innovations Limited | Diagnosis and treatment of prostate cancer |
WO2002083945A2 (en) * | 2001-04-12 | 2002-10-24 | Imperial College Innovations Limited | Diagnosis and treatment of cancer: i |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
DE68913658T3 (de) | 1988-11-11 | 2005-07-21 | Stratagene, La Jolla | Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen |
EP0656064B1 (en) | 1992-08-17 | 1997-03-05 | Genentech, Inc. | Bispecific immunoadhesins |
EP1590673B1 (en) * | 2003-02-04 | 2009-04-15 | EVOTEC Neurosciences GmbH | Diagnostic use of scn2b for alzheimer's disease |
WO2006068822A1 (en) * | 2004-12-20 | 2006-06-29 | Genentech, Inc. | Notch receptor agonists and uses |
US20090293137A1 (en) * | 2005-11-21 | 2009-11-26 | Genentech, Inc. | Novel Gene Disruptions, Compositions and Methods Relating Thereto |
AU2008326497B2 (en) * | 2007-11-19 | 2014-02-13 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for inhibiting tumor progression |
-
2008
- 2008-11-18 AU AU2008326497A patent/AU2008326497B2/en not_active Ceased
- 2008-11-18 BR BRPI0817393 patent/BRPI0817393A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-11-18 CN CN200880116661.3A patent/CN101932605B/zh active Active
- 2008-11-18 CA CA2702462A patent/CA2702462A1/en not_active Abandoned
- 2008-11-18 EP EP08851991A patent/EP2220123A1/en not_active Withdrawn
- 2008-11-18 US US12/743,516 patent/US8563695B2/en active Active
- 2008-11-18 JP JP2010535024A patent/JP5745272B2/ja active Active
- 2008-11-18 MX MX2010005324A patent/MX2010005324A/es active IP Right Grant
- 2008-11-18 WO PCT/US2008/083865 patent/WO2009067429A1/en active Application Filing
- 2008-11-18 KR KR1020107010840A patent/KR20100087330A/ko not_active Application Discontinuation
-
2010
- 2010-04-08 IL IL204945A patent/IL204945A0/en unknown
-
2014
- 2014-11-05 JP JP2014225327A patent/JP2015096502A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002018637A2 (en) * | 2000-09-02 | 2002-03-07 | Imperial College Innovations Limited | Diagnosis and treatment of prostate cancer |
WO2002083945A2 (en) * | 2001-04-12 | 2002-10-24 | Imperial College Innovations Limited | Diagnosis and treatment of cancer: i |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101932605A (zh) | 2010-12-29 |
JP2015096502A (ja) | 2015-05-21 |
IL204945A0 (en) | 2010-11-30 |
KR20100087330A (ko) | 2010-08-04 |
MX2010005324A (es) | 2010-06-01 |
AU2008326497B2 (en) | 2014-02-13 |
EP2220123A1 (en) | 2010-08-25 |
US20110182886A1 (en) | 2011-07-28 |
JP5745272B2 (ja) | 2015-07-08 |
WO2009067429A1 (en) | 2009-05-28 |
JP2011504503A (ja) | 2011-02-10 |
CA2702462A1 (en) | 2009-05-28 |
AU2008326497A1 (en) | 2009-05-28 |
BRPI0817393A2 (pt) | 2015-03-31 |
US8563695B2 (en) | 2013-10-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101932605B (zh) | 用于抑制肿瘤进展的组合物和方法 | |
CN101680897B (zh) | 基于低her3表达预测对her二聚化抑制剂的响应 | |
CN104487087A (zh) | 治疗fgfr3相关疾患的方法 | |
CN107206088A (zh) | 使用pd‑1轴拮抗剂和hpk1拮抗剂用于治疗癌症的方法和组合物 | |
CN109844536B (zh) | 预测对pd-1轴抑制剂的响应 | |
CN101495142A (zh) | 延长EGF或TGF-α水平升高的癌症患者的存活 | |
CN102498129B (zh) | 使用bv8拮抗剂或g-csf拮抗剂抑制肿瘤转移 | |
CN104203268A (zh) | 用于识别适于用vegf拮抗剂治疗的患者的生物标记物 | |
CN104730243A (zh) | 鉴定响应抗癌疗法的可能性升高的患者的方法 | |
CN101115836A (zh) | 用基质金属蛋白酶拮抗剂抑制her2脱落 | |
CN104994879A (zh) | 治疗癌症和预防药物抗性的方法 | |
CN104271157A (zh) | 用于治疗癌症的诊断方法和组合物 | |
CN104220457A (zh) | 涉及her3抑制剂的诊断和治疗 | |
CN105611940A (zh) | 诊断方法和用于治疗成胶质细胞瘤的组合物 | |
CN102612566B (zh) | 用于癌症患者中诊断学用途的方法和组合物 | |
CN109312408A (zh) | 用于诊断和供免疫疗法中使用的基质基因签名 | |
CN104519899A (zh) | 包含e-钙粘蛋白的细胞外结构域的抑制剂的组合疗法 | |
CN104569395A (zh) | 鉴定响应抗癌疗法的可能性升高的患者的方法 | |
CN103476430A (zh) | 抗egfl7抗体用于治疗的给药 | |
EP2207805B1 (en) | Nlrr-1 antagonists and uses thereof | |
JP2010540653A5 (zh) | ||
CN101790539A (zh) | 细胞应激应答的缓解 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |