HUP0202702A2 - Alegységoptimalizált fúziós fehérjék és alkalmazásai - Google Patents

Alegységoptimalizált fúziós fehérjék és alkalmazásai Download PDF

Info

Publication number
HUP0202702A2
HUP0202702A2 HU0202702A HUP0202702A HUP0202702A2 HU P0202702 A2 HUP0202702 A2 HU P0202702A2 HU 0202702 A HU0202702 A HU 0202702A HU P0202702 A HUP0202702 A HU P0202702A HU P0202702 A2 HUP0202702 A2 HU P0202702A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
fusion protein
sequence
protein
milk
transgenic
Prior art date
Application number
HU0202702A
Other languages
English (en)
Inventor
Klaus Bosslet
Harry M. Meade
Dan Pollock
Original Assignee
Genzyme Transgenics Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genzyme Transgenics Corporation filed Critical Genzyme Transgenics Corporation
Publication of HUP0202702A2 publication Critical patent/HUP0202702A2/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás fúziós fehérje előállítására, amely fúziósfehérjében első tag második taggal van fuzionáltatva, azzaljellemezve, hogy az előállítás tartalmazza a következő lépéseket: úgyválasztanak első tagot és második tagot, hogy az első tag, vagy afúziós fehérje komplexet képezve szerelődik össze, ahol az alegységekszáma olyan, amely optimalizálja a második tag multimer formájánakaktivitását; a fúziós fehérjét előállítják; és lehetővé teszik afúziós fehérje olyan komplex formában való összekacsolódását, ahol azalegységek száma optimalizálja a második tag multimer formájánakaktivitását. Nukleinsav-konstrukció, amely a fúziós fehérjét kódolja.A fent ismertetett fúziós fehérje. Gazdasejt ill. szervezet, amely afúziós fehérjét kódoló nukleinsavat tartalmazza. A találmányalkalmazható diagnosztikában és humán gyógyászatban, példáulrendellenes vagy kóros, a felszínén célantigént expresszáló sejt,például sejtfelszíni antigént expresszáló ráksejt elpusztításáraszolgáló eljárásban. Ó

Description

ΡΟΖ 00 2 7 0 2
Képviselő : Danubia
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY λ „
Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
Budapest
Alegységoptimalizált fúziós fehérjék és alkalmazásai
A találmány tárgyát képezi olyan fúziós fehérje, amely rendelkezik egy első és egy második taggal, ahol a fúziós fehérje második tagja multimerré szerelődik össze, és a másik tagot úgy választjuk meg, vagy úgy módosítjuk, hogy az elősegíti a második tag előre kiválasztott vagy optimális számú alegységekből történő összekapcsolódását.
A szabadalmi bejelentés kitanításának részét képezi a 60/101083. sz. ideiglenes szabadalmi bejelentés, amelyet 1998. szeptember 18-án nyújtottunk be.
A fúziós fehérjék különböző fehérjék hasznos tulajdonságait egyesíthetik. Fúziós fehérje egyesítheti például antitest-molekula célba juttató (targeting) tulajdonságait toxin citotoxikus hatásával.
Aktaszámunk: 96519-2444/SG
Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmány lényegét .
Általánosságban a találmány tárgyát képezi olyan fúziós fehérje előállítása, amely tartalmaz: egy első tagot, azaz célba juttató {targeting) molekularészt, például immunglobulin-alegységet (például immunglobulin-nehézláncot vagy immunglobulin-könnyűláncot, vagy azok bármelyike fragmensét) egy másik taggal, például enzimmel vagy toxinnal (pl. enzim- vagy toxinalegységgel) fuzionáltatva. Az első és a második tagot úgy választjuk meg, hogy a fúziós fehérje olyan komplex formában szerelődik össze, amely a második tag multimer formájának aktivitását optimalizáló számú alegységből áll. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag, vagy a fúziós fehérje olyan formában szerelődik össze, amely a második tag aktív, például natív formájában jelen levő számú alegységet tartalmaz. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag, vagy a fúziós fehérje olyan formában szerelődik össze, amely a második tag aktív, például natív formájában jelen levő számú alegységnél kevesebb alegységet tartalmaz
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérje komplex formában szerelődik össze, például dimerré, trimerré, tetramerré, vagy nagyobb tagszámú komplex formában. Előnyösen a fúziós fehérje dimerré vagy tetramerré szerelődik össze.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérje enzimaktivitással rendelkező komplex formájában szerelődik össze.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint az első tag monomer, például olyan monomerfajta, amely normális körülmények között monomer, vagy amely módosítva van, például mutációval, olyan helyen, amely alegységmultimer kialakulását vagy fennmaradását modulálja. A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint a monomerforma alkalmazható, mivel ez nem akadályozza meg a második tag multimerformájának kialakulását.
A találmány más előnyös megvalósítási módja szerint az első tag dimert képez, például heterodimert vagy homodimert. Ez például olyan tagféle, amely normális körülmények között dimer, vagy amely módosítva van, például olyan helyen, amely alegységmultimer dimerforma kialakulását vagy fennmaradását modulálja. A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint a dimerforma alkalmazható, mivel ez nem akadályozza meg a második tag multimerformájának kialakulását.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fehérje a következő képlettel írható le: R1-L-R2; R2-L-R1; R2-R1 vagy R1-R2, ahol RÍ első tag, például immunglobulinalegység, L peptidkapcsoló és R2 második tag, például enzimalegység. Előnyösen RÍ és R2 kovalens módon vannak kapcsolva, például közvetlenül fuzionáltatva vagy peptidkapcsolóval kötve.
A találmány más előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérje első vagy második, vagy mindkét tagja módosítva van, például az aminosav-szekvencia egy része szubsztitúciója vagy deléciója által. A fúziós fehérje kü lönösen előnyös megvalósítási módja szerint tartalmaz Igszupercsaládba tartozó tagot, előnyösen Ig-alegységet, amely módosítva van multimerforma, például tetramerforma kialakulásának gátlása céljából. Előnyösen a módosítás, amely lehet egy vagy több aminosav cseréje, inszerciója vagy deléciója, olyan alegységet eredményez, amely nem képez multimert, vagy amely a normális körülmények között kialakuló multimernél alacsonyabbrendű multimert képez, például hajlamos tetramerképzés helyett dimerképzésre.
Előnyösen a multimer szerkezetkialakítását vagy fenntartását közvetítő régiót módosítunk, és ezáltal teljes mértékben vagy részben inaktiváljuk azt. Például immunglobulin-alegység részét, például nehézláncot, például a csuklórégiót (hinge) módosítjuk, például deletáljuk. A találmány ilyen megvalósítási módjai szerint, ahol az immunglobulin csuklórégióját módosítjuk, például eltávolítjuk, a módosított immunglobulin monovalens.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag módosítása gátolja az első tag vagy a fúziós fehérje multimerré való összekapcsolódását, ez például monomer, vagy például dimer termelődését eredményezi, ahol a magasabb rendű multimert másképp alakítjuk ki.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag célba juttató {targeting) hatóanyag, például a céltárgyhoz nagy affinitással rendelkező polipeptid, például antitest, ligandum vagy enzim.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag immunglobulin vagy annak fragmense, például antigénkötő fragmense. Előnyösen az immunglobulin monoklonális antitest, például humán, patkányféle („murine) (pl. egéreredetű) eredetű monoklonális antitest, vagy rekombináns monoklonális antitest. Előnyösen a monoklonális antitest humán eredetű antitest. A találmány más megvalósítási módjai szerint a monoklonális antitest rekombináns antitest, például kiméraantitest vagy humanizált antitest (pl. rendelkezik variábilis régióval, vagy legalább komplementaritást meghatározó régióval, azaz CDR-rel, amely nem humán eredetű, pl. patkányféle-eredetű, a fennmaradó rész vagy részek humán eredetűek); vagy transzgenikus úton előállított humán eredetű antitest (pl. hibridóma, többek között transzgenikus, nem humán, állati, például transzgenikus egérből származó B-sejt által termelt antitest, ahol az egér genomja tartalmaz immortalizált sejtbe fuzionált, humán eredetű nehézlánc-transzgént és könnyűlánctranszgént).
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag teljes hosszúságú antitest, (pl. IgGl- vagy IgG4antitest), vagy csak antigénkötő-részt (pl. Fab-t, F(ab')2-t, Fv-t vagy egyláncú Fv-fragmenst) foglal magában.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag immunglobulin-alegység, amely IgG (pl. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), vagy IgM, vagy IgAl, vagy IgA-alosztályok, vagy IgD, vagy IgE alegysége. Előnyösen az immunglobulinalegység IgG-izotípusú, például IgG3.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag monomer, például egyláncú antitest; vagy dimert képez, például immunglobulin-nehézlánc és -könnyűlánc dimerj ét.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag monovalens antitest (pl. többek között magában foglal egy pár nehéz- és könnyűláncot, vagy antigénkötő részeit) . A találmány más megvalósítási módjai szerint az első tag bivalens antitest (pl. többek között két pár nehézés könnyűlánc, vagy ezek antigénkötő részei).
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag magában foglal immunglobulin-nehézláncot vagy annak fragmensét, például antigénkötő fragmensét. Előnyösen az immunglobulin-nehézlánc vagy fragmense (pl. antigénkötő fragmense) enzimhez van fuzionálhatva peptidkapcsolóval vagy direkt módon kapcsolva. Előnyösen az immunglobulinnehézlánc-enzim-fúziósfehérje képes enzimaktivitással rendelkező funkcionális komplex, például dimer-, trimer-, tetramer- vagy multimerkomplex formában való összekapcsolódásra. A legelőnyösebb forma a dimerforma.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag magában foglal immunglobulin-nehézláncot vagy annak fragmensét (például antigénkötő fragmensét), és könnyűláncot vagy fragmensét (pl. antigénkötő fragmesét). Előnyösen az immunglobulin-nehézlánc enzimhez van fuzionáltatva peptidkapcsolóval vagy direkt módon kapcsolva. Előnyösen a fuzionált immunglobulin-nehézlánc-enzim-fúziósfehérje képes könnyűlánccal összekapcsolódni, például en zimaktivitással rendelkező funkcionális komplex, például dimer-, trimer-, tetramer- vagy multimerkomplex kialakítása céljából. A legelőnyösebb forma a dimerforma.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag immunglobulin, amely kölcsönhatásba lép (vagy ki— kötődik) sejtfelszíni antigénnel célsejten, például ráksejten. Például az immunglobulin tumorsejt-antigénhez köt, például többek között karcinoembriotikus antigénhez (CEA), TAG-72-höz, her-2/neu-hoz, epidermális növekedési faktor receptorához, transzferrinreceptorhoz.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag célsejt, például ráksejt közelében lokalizálódik, például növeli a fúziós fehérje koncentrációját.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a második tag enzim, például egy vagy több alegységgel (pl. katalitikus alegységgel) rendelkező enzim alegysége. Előnyösen az enzim magában foglal egy, előnyösebben kettő, még előnyösebben három, a legelőnyösebben négy alegységet. Az enzim előnyösen béta—glükuronidáz, például humán eredetű béta-glükuronidáz. Az enzim lehet homogén vagy heterogén multimer. Ha az enzim heteromultimer, két (vagy több) fúziós fehérje szükséges az aktív termék kialakításához.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a második tag alkalmas prekurzor hatóanyag, például prodrog toxikus droggá (hatóanyaggá) való átalakítására.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag immunglobulin-G (IgG) nehéz- és könnyűlánca, és a második tag humán eredetű béta-glükuronidáz-fúziósfehérje.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag könnyűlánca aminosav-szekvenciája az IB-ábrán bemutatott aminosav-szekvencia (2. azonosítószámú szekvencia, ezentúl 2. a. sz.); az első tag könnyűlánca aminosavszekvenciája az IB-ábrán bemutatott aminosav-szekvenciával (2. a. sz.) legalább 60%-os, 70%-os, 75%-os, előnyösen 85%os, előnyösebben 90%-os, még előnyösebben 95%-os, a legelőnyösebben 98%-os, 99%-os szekvenciaazonosságot vagy szekvenciahomológiát mutat.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag könnyűlánca aminosav-szekvenciáját az IB-ábrán (1. a. sz.) vagy a 2. ábrán (37. a. sz.) bemutatott nukleotidszekvencia kódolja; az első tag könnyűlánca aminosavszekvenciáját kódoló nukleotidszekvencia az IB-ábrán (2., 3. vagy 4. a. sz.) vagy a 2. ábrán (37. a. sz.) bemutatott nukleotidszekvenciával legalább 60%-os, 70%-os, 75%-os, előnyösen 85%—os, előnyösebben 90%—os, még előnyösebben 95%-os, a legelőnyösebben 98%-os, 99%-os szekvenciaazonosságot vagy szekvenciahomológiát mutat, az első tag könnyűlánca aminosav-szekvenciáját kódoló nukleotidszekvencia „szigorú {„stringent) körülmények között képes az IB-ábrán bemutatott nukleotidszekvenciával való hibridizálásra.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag nehézlánca aminosav-szekvenciáját a 4B-ábrán (6., 7., 8., 9. vagy 10, és/vagy 11. a. az.), vagy az 5. ábrán (13., 14., 15. és/vagy 16. a. sz.) mutatjuk be; az első tag nehézlánca aminosav-szekvenciája a 4B-ábrán (6., 7., 8., 9.
vagy 10, és/vagy 11. a. az.), vagy az 5. ábrán (13., 14., 15. és/vagy 16. a. sz.) bemutatott aminosav-szekvenciával legalább 60%-os, 70%-os, 75%-os, előnyösen 85%-os, előnyösebben 90%-os, még előnyösebben 95%-os, a legelőnyösebben 98%-os, 99%-os szekvenciaazonosságot vagy szekvenciahomológiát mutat.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag nehézlánca aminosav-szekvenciáját a 4B-ábrán (5. a. sz.), vagy az 5. ábrán (12. a. sz.) bemutatott nukleotid-szekvencia kódolja; az első tag nehézlánca amino— sav-szekvenciáját kódoló aminosav a 4B-ábrán (5. a. sz.), vagy az 5. ábrán (12. a. sz.) bemutatott nukleotidszekvenciával legalább 60%-os, 70%-os, 75%-os, előnyösen 85%-os, előnyösebben 90%-os, még előnyösebben 95%-os, a legelőnyösebben 98%-os, 99%-os szekvenciaazonosságot vagy szekvenciahomológiát mutat; az első tag nehézlánca aminosav-szekvenciáj át kódoló nukleotidszekvencia „szigorú {„stringent) körülmények között képes az 1B. vagy az 5. ábrán bemutatott nukleotidszekvenciával való hibridizálásra.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a fúziós fehérje tartalmaz peptidkapcsolót, és a peptidkapcsoló rendelkezik a következő jellemzők közül eggyel vagy többel: a) lehetővé teszi az első és a második tag egymáshoz viszonyított rotációját; b) ellenálló a proteázokkal való emésztéssel szemben; c) nem lép kölcsönhatásba az első vagy a második taggal; d) lehetővé teszi a fúziós fehérje komplexképzését (pl. dimer-, trimer-, tetramer- vagy multimer komplex), ahol a komplex megtartja enzimaktivitasát, e) elősegíti a fúziós fehérje aktív komplex formában való hajtogatódását (folding) és/vagy összekapcsolódását.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a fúziós peptid tartalmaz peptidkapcsolót, és a peptidkapcsoló hossza 5-60, előnyösen 10-30 aminosav; a peptidkapcsolót alkotó mindegyik aminosav Gly, Ser, Asn, Thr vagy Alá lehet; a peptidkapcsolót tartalmaz Gly-Ser-elemet.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a fúziós peptid tartalmaz peptidkapcsolót, és a peptidkapcsoló tartalmaz a (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly) y-képlettel leírható szekvenciát, ahol y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 vagy 8. Előnyösen a peptidkapcsoló tartalmaz a (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-képlettel leírható szekvenciát. Előnyösen a peptidkapcsoló tartalmaz a ( (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly) 3-Ser-Pro)-képlettel leírható szekvenciát .
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérjét rekombináns úton állítjuk elő, például gazdasejtben (például tenyésztett sejtben) vagy transzgenikus állatban, például transzgenikus emlősállatban (pl. kecskében, szarvasmarhában vagy rágcsálóban, pl. egérben) termeltetjük.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérjét transzgenikus emlősállatban (kecskében, szarvasmarhában, vagy rágcsálóban, pl. egérben) állítjuk elő. így az eljárás továbbá magában foglalja olyan transzgenikus állat előállítását, amely tartalmaz a leírásban ismertetett fúziós fehérje expresszióját biztosító transz gént; a transzgén expresszálásának lehetővé tételét; és, előnyösen, a fúziós fehérje transzgenikus állat tejéből való kinyerését.
A találmány olyan megvalósítási módjai szerint, ahol a fúziós fehérjét transzgenikus úton állítjuk elő, a fúziós fehérje tartalmazhat továbbá:
- szignálszekvenciát, amely a fúziós fehérje szekrécióját vezérli, például szekretálódó fehérje szignálját (pl. tejbe szekretálódó fehérje szignálját; vagy immunglobulin szekréciós szignálját); és
- (adott esetben) szekretálódó fehérje, például tejbe szekretálódó fehérje, vagy immunglobulin amino-terminális régiójának ahhoz elegendő részét kódoló szekvenciáját, hogy elősegítse a fúziós fehérje szekrécióját, például a transzgenikus állat tejébe történő szekrécióját.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérjét a transzgenikus emlősállat, például kérődző, például kecske vagy szarvasmarha emlőmirigyében állítjuk elő.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérje a transzgenikus emlősállat, például kérődző, például tejelő állat, például kecske vagy szarvasmarha tejébe szekretálódik. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérje a transzgenikus emlős tejébe legalább körülbelül 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml 5 mg/ml vagy nagyobb koncentrációban szekretálódik.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérjét emlőmirigy-specifikus promoter, például tejspecifikus promoter, például tejsavófehérje, vagy kazeinpromóter szabályozása alatt állítjuk elő. A tejspecifikus promoter lehet kazeinpromóter, béta-laktoglobulin-promóter, savas tej savófehérje- vagy laktalbuminpromóter. Előnyösen a promoter kecskeeredetű β-kazeinpromóter.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérjét kódoló transzgén olyan nukleinsav, amely tartalmaz:
a) adott esetben szigetelőszekvenciát („insulator);
b) promótert, például emlőhámszövet-specifikus promoter!, például tej fehérje-promótert;
c) olyan nukleotidszekvenciát, amely alkalmas a fúziós fehérje szekréciójának, például tejspecifikus fehérjéből vagy immunglobulinból származó szignálszekvencia szekréciójának vezérlésére;
d) adott esetben olyan nukleotid-szekvenciát, amely szekretálódó fehérje, például tejbe szekretálódó fehérje vagy immunglobulin amino-terminális régiójának ahhoz elegendő részét kódolja, amely lehetővé teszi a fúziós fehérje szekrécióját, például transzgenikus emlősállat tejébe történő szekrécióját
e) egy vagy több nukleotidszekvenciát, amely fúziós fehérjét, például a leírásban ismertetett immunglobulin enzim fúziós fehérjét kódolja; és
f) (adott esetben) emlősgén-eredetű, például emlőhámszövet-specifikus gén (pl. tejfehérjegén3'-irányú nem transzlálódó régióját.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén a-eleme (ha jelen van), a b-, c-, d-elemei (ha jelen vannak), és az f-elem ugyanabból a génből származik; a transzgén a-eleme (ha jelen van), a b-, c-, d-elemei (ha jelen vannak), és az f-elem két vagy több génből származik. Például a szignálszekvencia, a promóter-szekvencia és a 3'irányú nem transzlálódó szekvencia származhat emlőhámszövet-specifikus génből, például tej savófehérjéből vagy kazeingénből (pl. β-kazein-génből). Előnyösen a szignálszekvencia, a promóter-szekvencia és a 3'-irányú nem transzlálódó szekvencia kecskeeredetű β-kazein-génből származik.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén promótere emlőhámszövet-specifikus promoter, például tej savófehérje-promóter vagy kazeinpromóter (pl. β— kazein-promóter). A tejspecifikus promoter lehet kazeinpromóter, béta-laktoglobulin-promóter, savas tejsavófehérje-promóter, vagy laktalbumin-promóter. Előnyösen a promoter kecskeeredetű β—kazein-promóter.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén által kódolt szignálszekvencia amino-terminális szekvencia, amely a fehérje expresszióját a sejten kívülre, vagy a sejtmembránba irányítja. A szignálszekvenciát nyerhetjük például immunglobulin-fehérjéből. Előnyösen a szig nálszekvenciát olyan fehérjéből származik, amely a tejbe, például a transzgenikus állat tejébe szekretálódik.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérjét kódoló egy vagy több nukleotidszekvencia tartalmaz a következőkből egyet vagy többet: egy második taggal, például enzimmel működőképesen kapcsolt első tagot, például immunglobulin-nehézláncot (vagy annak antigénkötő részét) kódoló nukleotidszekvenciát; (adott esetben) immunglobulin-könnyűláncot (vagy annak antigénkötő részét) kódoló nukleotidszekvenciát, vagy mindkettőt. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a nehézlánc-fúzióstagot és a könnyűláncot kódoló nukleotidszekvenciák egyetlen konstrukcióban, például egy kozmidban vannak működőképesen vannak kapcsolva. A találmány más megvalósítási módja szerint a nehézlánc-fúzióstagot és a könnyűláncot kódoló nukleotidszekvenciákat külön konstrukciókban visszük be a transzgenikus állatba. Előnyösen a nukleotidszekvenciák, ha kapcsolva vannak, a következőképpen vannak elrendezve:
5'-Nl-3' kapcsolva az 5'-N2-3'-vei; vagy 5'-N2-3' kapcsolva az 5'-N1-3'-vei, ahol NI első tag, például immunglobulin-nehézlánc (vagy annak antigénkötő része), második taggal, például enzimmel működőképesen kapcsolva; és N2 immunglobulin- könnyűlánc (vagy annak antigénkötő része). A nukleotidszekvenciák egymáshoz viszonyítva lehetnek bármilyen, például szenz/szenz, reverz/reverz, szenz/reverz vagy reverz/szenz orientációban.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén 3'-irányú nem transzlálódó régiója magában foglal poli-adenilációs szignált, és azt emlőseredetű génből, például emlőhámszövet-specifikus génből, például tej savófehér j e-génből vagy kazeingénből nyerjük. A 3'-irányú nem transzlálódó régiót nyerhetjük kazeingénből (pl. β-kazeingénből), béta-laktoglobulin-génből, savas tej savófehérjegénből vagy laktalbumin-génből. Előnyösen a 3'-irányú nem transzlálódó régiót kecskeeredetű β-kazein-génből nyerjük.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén, például a leírásban ismertetett transzgén a transzgenikus állat csírasejtjében és/vagy szomatikus sejtjében van integrálva.
A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi transzgenikus úton előállított fúziós fehérje, például a leírásban ismertetett fúziós fehérje transzgenikus állat tejében történő előállítására szolgáló eljárás. Ez eljárás magában foglalja a transzgenikus állattól tej nyerését, amely tej tartalmazza a fúziós fehérjét kódoló transzgént, például azt, amelyet az állat csíravonalába juttattunk, például a leírásban ismertetett nukleinsav-konstrukciót, amely a fúziós fehérje fehérjekódoló szekvenciájának emlőhámszövet-sejtjeiben történő expresszióját, ezáltal a fúziós fehérjének az emlős tejében történő szekretálását eredményezi.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgenikus állat birka, vagy egér, vagy sertés, vagy szarvasmarha, vagy kecske. A transzgenikus állat előnyösen kecske.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérje transzgenikus állat tejében legalább körülbelül 0.1 mg/ml-es, 0.5 mg/ml-es, 1.0 mg/ml-es, 1.5 mg/mles, 2 mg/ml-es, 3 mg/ml-es, 5 mg/ml-es, vagy nagyobb koncentrációban szekretálódik.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az immunglobulin-enzim-fúziósfehérjét kódoló transzgén olyan nukleinsav-konstrukció, amely tartalmaz:
a) adott esetben szigetelőszekvenciát;
b) promótert, például emlőhámszövet-specifikus promótert, például tej fehérje-promótert;
c) nukleotidszekvenciát, amely alkalmas a fúziós fehérje szekréciójának, például tejspecifikus fehérjéből, vagy immunglobulinból származó szignálszekvencia szekréciójának vezérlésére;
d) adott esetben nukleotidszekvenciát, amely szekretálódó fehérje, például tejbe szekretálódó fehérje vagy immunglobulin amino-terminális régiójának ahhoz elegendő részét kódolja, amely lehetővé teszi a nem szekretálódó fehérje szekrécióját, például transzgenikus emlősállat tejébe történő szekrécióját;
e) egy vagy több nukleotidszekvenciát, amely fúziós fehérjét például a leírásban ismertetett fúziós fehérjét kódolja, és
f) adott esetben emlősgén-eredetű, például emlőhámszövet-specifikus gén (pl. tejfehérjegén) 3’-irányú nem transzlálódó régióját.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén a-eleme (ha jelen van), a b-, c-, d-elemei (ha jelen vannak), és az f-elem ugyanabból a génből származik; a transzgén a-eleme (ha jelen van), a b~, c-, d-elemei (ha jelen vannak), és az f-elem két vagy több génből származik. Például a szignálszekvencia, a promóter-szekvencia és a 3'irányú nem transzlálódó szekvencia származhat emlőhámszövet-specifikus génből, például tej savófehérjéből vagy kazeingénből (pl. β-kazein-génből) . Előnyösen a szignálszekvencia, a promóter-szekvencia és a 3'-irányú nem transzlálódó szekvencia kecskeeredetű β-kazein-génből származik .
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén promótere emlőhámszövet-specifikus promoter, például tejsavófehérje-promóter vagy kazeinpromóter (pl. β— kazein-promóter) . A tej specifikus promoter lehet kazeinpromóter, béta-laktoglobulin-promóter, savas tej savófehér je-promóter, vagy laktalbumin-promóter. Előnyösen a promoter kecskeeredetű β-kazein-promóter.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén által kódolt szignálszekvencia amino-terminális szekvencia, amely a fehérje expresszióját a sejten kívülre, vagy a sejtmembránba irányítja. Előnyösen a szignálszekvenciát olyan fehérjéből nyerjük, amely a tejbe, például a transzgenikus állat tejébe szekretálódik.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérjét kódoló egy vagy több nukleotidszekvencia tartalmaz a következőkből egyet vagy többet: enzimmel fuzionált immunglobulin-nehézláncot (vagy annak antigénkötő részét) kódoló nukleotidszekvenciát; immunglobulin-könnyűláncot (vagy annak antigénkötő részét) kódoló nukleotidszekvenciát, vagy mindkettőt. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a nehézlánc-fúzióstagot és a könnyűláncot kódoló nukleotidszekvenciák egyetlen konstrukcióban, például egy kozmádban vannak működőképesen vannak kapcsolva. A találmány más megvalósítási módja szerint a nehézlánc-fúzióstagot és a könnyűláncot kódoló nukleotidszekvenciákat külön konstrukciókban visszük be a transzgenikus állatba. Előnyösen a nukleotidszekvenciák, ha kapcsolva vannak, a következőképpen vannak elrendezve:
5'-Nl-3' kapcsolva az 5'-N2-3'-vei; vagy 5'-N2-3' kapcsolva az 5'-Nl-3'-vei, ahol NI immunglobulin-nehézlánc (vagy annak antigénkötő része), második taggal, például enzimmel kapcsolva; és N2 immunglobulin-könnyűlánc (vagy annak antigénkötő része). A nukleotidszekvenciák egymáshoz viszonyítva lehetnek bármilyen, például szenz/szenz, reverz/reverz, szenz/reverz vagy reverz/szenz orientációban .
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén 3'-irányú nem transzlálódó régiója magában foglal poli-adenilációs szignált, és azt emlőseredetű génből, például emlőhámszövet-specifikus génből (pl. tejsavófehérjegénből vagy kazeingénből) nyerjük. A 3'-irányú nem transzlálódó régiót nyerhetjük kazeingénből (pl. β-kazeingénből), béta-laktoglobulin-génből, savas tej savófehérjegénből vagy laktalbumin-génből. Előnyösen a 3'-irányú nem transzlálódó régiót kecskeeredetű β-kazein-génből nyerjük.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén, például a leírásban ismertetett transzgén a transzgenikus állat csírasejtjében és/vagy szomatikus sejtjében integrálódik.
A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi transzgén, például nukleinsav-konstrukció, előnyösen izolált nukleinsav-konstrukció, amely tartalmaz:
a) adott esetben szigetelőszekvenciát;
b) promótert, például emlőhámszövet-specifikus promótert, például tejfehérje-promótert;
c) nukleotidszekvenciát, amely alkalmas a fúziós fehérje szekréciójának, például tejspecifikus fehérjéből, vagy immunglobulinból származó szignálszekvencia szekréciójának vezérlésére;
d) adott esetben nukleotidszekvenciát, amely szekretálódó fehérje, például tejbe szekretálódó fehérje vagy immunglobulin amino-terminális régiójának ahhoz elegendő részét kódolja, amely lehetővé teszi a nem szekretálódó fehérje szekrécióját, például transzgenikus emlősállat tejébe történő szekrécióját;
e) egy vagy több nukleotidszekvenciát, amely fúziós fehérjét, például a leírásban ismertetett fúziós fehérjét kódolja; és
f) adott esetben emlősgén-eredetű, például emlőhámszövet-specifikus gén (pl. tejfehérjegén) 3'-irányú nem transzlálódó régióját.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén a-eleme (ha jelen van), a b-, c-, d-elemei (ha jelen vannak), és az f-elem ugyanabból a génből származik; a transzgén a-eleme (ha jelen van), a b-, c-, d-elemei (ha jelen vannak), és az f-elem két vagy több génből származik. Például a szignálszekvencia, a promóter-szekvencia és a 3'irányú nem transzlálódó szekvencia származhat emlőhámszö— vet-specifikus génből, például tej savófehérjéből vagy kazeingénből (pl. β—kazein-génből). Előnyösen a szignálszekvencia, a promóter-szekvencia és a 3'-irányú nem transzlálódó szekvencia kecskeeredetű β-kazein-génből származik.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén promótere emlőhámszövet-specifikus promoter, például tej savófehérje-promóter vagy kazeinpromóter (pl. β— kazein-promóter). A tejspecifikus promoter lehet kazeinpromóter, béta-laktoglobulin-promóter, savas tejsavófehérje-promóter, vagy laktalbumin-promóter. Előnyösen a promoter kecskeeredetű β-kazein-promóter.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén által kódolt szignálszekvencia amino-terminális szekvencia, amely a fehérje expresszióját a sejten kívülre, vagy a sejtmembránba irányítja. Előnyösen a szignálszekvencia tejspecifikus fehérjéből, vagy immunglobulinból származik. Előnyösen a szignálszekvencia a kódolt fúziós fehérje szekrécióját a transzgenikus állat, előnyösen transzgenikus emlősállat tejébe irányítja.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a fúziós fehérjét kódoló egy vagy több nukleotidszekvencia tartalmaz a következőkből egyet vagy többet: enzimmel fuzionált immunglobulin-nehézláncot (vagy annak antigénkötő részét) kódoló nukleotidszekvenciát; immunglobulin-könnyűláncot (vagy annak antigénkötő részét) kódoló nukleotidszekvenciát, vagy mindkettőt. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a nehézlánc-fúzióstag és a könnyűláncot kódoló nukleotidszekvenciák egyetlen konstrukcióban, például egy kozmádban vannak működőképesen vannak kapcsolva. A találmány más megvalósítási módja szerint a nehézláncfúzióstagot és a könnyűláncot kódoló nukleotidszekvenciákat külön konstrukciókban visszük be a transzgenikus állatba. Előnyösen a nukleotidszekvenciák, ha kapcsolva vannak, a következőképpen vannak elrendezve:
5'-Nl-3' kapcsolva az 5'-N2-3'-hoz; vagy 5'-N2-3' kapcsolva az 5'-Nl-3'-hoz, ahol NI immunglobulin-nehézlánc (vagy annak antigénkötő része) , második taggal, például enzimmel kapcsolva; és N2 immunglobulin-könnyűlánc (vagy annak antigénkötő része). A nukleotidszekvenciák egymáshoz viszonyítva lehetnek bármilyen, például szenz/szenz, reverz/reverz, szenz/reverz vagy reverz/szenz orientációban .
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgén 3'-irányú nem transzlálódó régiója magában foglal poli-adenilációs szignált, és azt emlőseredetű génből, pél dául emlőhámszövet-specifikus génből (pl. tejsavófehérjegénből vagy kazeingénből) nyerjük. A 3'-irányú nem transzlálódó régiót nyerhetjük kazeingénből (pl. β-kazeingénből), béta-laktoglobulin-génből, savas tej savófehérjegénből vagy laktalbumin-génből. Előnyösen a 3'-irányú nem transzlálódó régiót kecskeeredetű β-kazein-génből nyerjük.
A találmány más szempontja szerint a találmány tárgyát képezi fúziós fehérjét, például a leírásban ismertetett fúziós fehérjét kódoló nukleinsav-molekula.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a nukleinsav nukleotidszekvenciája az IB-ábrán (1. a. sz.), a 2. ábrán (37. a. sz.), a 4B-ábrán (5. a. sz.), vagy az 5. ábrán (12. a. sz.) bemutatott nukleotidszekvenciával írható le; a nukleinsav nukleotidszekvenciája legalább 60%-os, 70%-os, 75%-os, előnyösen 85%-os, előnyösebben 90%-os, még előnyösebben 95%-os, a legelőnyösebben 98%-os, 99%-os szekvenciaazonosságot vagy szekvenciahomológiát mutat az IB-ábrán (1. a. sz.), a 2. ábrán (37. a. sz.), a 4B-ábrán (5. a. sz.), vagy az 5. ábrán (12. a. sz.) bemutatott nukleotidszekvenciával; a nukleinsav nukleotidszekvenciája olyan, amely képes az IB, a 2., a 4B vagy az 5. ábrán bemutatott nukleotidszekvenciával való hibridizálásra „szigorú („stringent) körülmények között.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a nukleinsav nukleotidszekvenciája az 1A (2, 3 és 4. a. sz.), a 4B (6, 7, 8, 9, 10, 11. a. sz.), vagy az 5. (13, 14, 15, és 16. a. sz.) ábrán bemutatott aminosav-szekvenciát kódolja; a nukleinsav nukleotidszekvenciája legalább 60%-os,
70%-os, 75%-os, előnyösen 85%-os, előnyösebben 90%-os, még előnyösebben 95%-os, a legelőnyösebben 98%-os, 99%-os szekvenciaazonosságot vagy szekvenciahomológiát mutat az 1A (2, 3 és 4. a. sz.), a 4B (6, 7, 8, 9, 10, 11. a. sz.), vagy az 5. (13, 14, 15, és 16. a. sz.) ábrán bemutatott aminosav-szekvenciával.
A találmány más szempontja szerint a találmány tárgyát képezi gazdasejt, például izolált gazdasejt (pl. tenyésztett sejt), amely magában foglalja a találmány szerinti nukleinsavat (pl. a leírásban ismertetett nukleinsavat, vagy transzgént, pl. nukleinsav-konstrukciót).
A találmány más szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a leírásban ismertetett fúziós fehérje, vagy annak tisztított preparátuma.
A találmány más szempontja szerint a találmány tárgyát képezi gyógyászati vagy táplálékkiegészítő („nutraceutical) készítmény, amely fúziós fehérje, például a leírásban ismertetett fúziós fehérje terápiásán hatásos mennyiségét tartalmazza, valamint tartalmaz gyógyászatilag elfogadott hordozót.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a készítmény magában foglal tartalmaz tejet.
A találmány más szempontja szerint a találmány tárgyát képezi transzgenikus állat, amely tartalmaz fúziós fehérjét kódoló transzgént, például a leírásban ismertetett fúziós fehérjét kódoló transzgént.
Előnyös transzgenikus állatok lehetnek többek között: emlősök; madarak; hüllők; erszényesek és kétéltűek. Alkal mas emlősállatok többek között: kérődzők; patások; háziasított emlősök; és tejelő állatok. Különösen előnyös állatok többek között: egér, kecske, juh, teve, nyúl, szarvasmarha, sertés, ló, ökör és láma. Alkalmas madarak többek között: csirke, liba és pulyka. Ha a transzgenikus fehérje a transzgenikus állat tejébe szekretálódik, akkor szükséges, hogy az állat alkalmas legyen legalább évente 1, előnyösen legalább 10, vagy 100 liter tej termelésére. Előnyösen a transzgenikus állat kérődző, például kecske, szarvasmarha vagy juh. A legelőnyösebben a transzgenikus állat kecske.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgenikus állat csírasejtjei és szomatikus sejtjei tartalmazzák a fúziós fehérjét kódoló transzgént, például a leírásban ismertetett fúziós fehérjét kódoló transzgént.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgenikus állatban expresszált fúziós fehérje emlőhámszövet-specifikus promoter, például tej specifikus promoter, például tej savófehérje vagy kazein promótere szabályozása alatt expresszálódik. A tejspecifikus promoter lehet kazeinpormóter, béta—laktalbumin-promóter, savas tej savófehér je-promóter, vagy laktalbumin-promóter. Előnyösen a promoter kecskeeredetű β-kazein-promóter.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgenikus állat emlősállat, és a fúziós fehérje a transzgenikus emlősállat tejében legalább körülbelül 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml 5 mg/ml vagy nagyobb koncentrációban szekretálódik.
A találmány más szempontja szerint a találmány tárgyát képezi fúziós fehérje transzgénjét hordozó transzgenikus szervezet előállítására szolgáló eljárás. Az eljárás magában foglalja fúziós fehérjének a szervezet sejtjében történő biztosítását vagy kialakítását, például olyan transzgén kialakítását, amely a leírásban ismertetett fúziós fehérjét kódolja; és magában foglalja a sejtből, vagy a sejt utódjából transzgenikus szervezet kialakulásának lehetővé tételét.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a transzgenikus szervezet transzgenikus növény vagy állat. Alkalmas transzgenikus állatok többek között: emlősök; madarak; hüllők; erszényesek és kétéltűek. Alkalmas emlősállatok többek között: kérődzők; patások; háziasított emlősállatok; és tejelő állatok. Különösen előnyös állatok többek között: egér, kecske, juh, teve, nyúl, szarvasmarha, sertés, ló, ökör és láma. Alkalmas madarak többek között: csirke, liba és pulyka. Ha a transzgenikus fehérje a transzgenikus állat tejébe szekretálódik, akkor szükséges, hogy az állat alkalmas legyen legalább évente 1, előnyösen legalább 10, vagy 100 liter tej termelésére.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgenikus állatban expresszált fúziós fehérje emlőhámszövet-specifikus promoter, például tej specifikus promoter, például tejsavófehérje vagy kazein promótere szabályozása alatt expresszálódik. A tejspecifikus promoter lehet kazeinpormóter, béta-laktalbumin-promóter, savas tej savó fehérje-promóter, vagy laktalbumin-promóter. Előnyösen a promoter kecskeeredetű β-kazein-promóter.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a transzgenikus állat emlősállat, és a fúziós fehérje a transzgenikus emlősállat tejébe legalább körülbelül 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml 5 mg/ml vagy nagyobb koncentrációban szekretálódik.
A találmány más szempontja szerint a találmány tárgyát képezi rendellenes vagy kóros, a felszínén célantigént expresszáló sejt, például sejtfelszíni antigént expresszáló ráksejt elpusztítására szolgáló eljárás. Az eljárás magában foglal:
a rendellenes vagy kóros sejtnek fúziós fehérje, például a leírásban ismertetett fúziós fehérje hatásos mennyiségével való érintkeztetését, ahol a fúziós fehérje első, második tagja közül bármelyik felismeri a célantigént, ezáltal a sejt szelektív elpusztítása megtörténik.
A találmány szerinti eljárás alkalmazható tenyésztett sejtek esetében, például in vitro, és az érintkeztetési lépést megvalósíthatjuk a találmány tárgyát képező fúziós fehérje tenyészközeghez történő hozzáadásával. Például sejteket tenyészthetünk in vivo tápközegben, és az érintkeztetési lépést végrehajthatjuk a fúziós fehérje tápközeghez való hozzáadásával. Alternatív módon az eljárás végrehajtható betegben jelen lévő sejteken (pl. ráksejteken), például in vivo (pl. terápiás vagy megelőző) élőárat részeként.
A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi rendellenes vagy kóros, a felszínén célantigént expresszáló sejt, például sejtfelszíni antigént expresszáló ráksejt elpusztítására szolgáló eljárás. Az eljárás magában foglal:
a rendellenes vagy kóros sejtbe fúziós fehérje, például a leírásban ismertetett fúziós fehérjét kódoló nukleinsav bevitelét, ahol a fúziós fehérje első, második tagja közül bármelyik felismeri a célantigént, ezáltal a sejt szelektív elpusztítása megtörténik.
A találmány szerinti eljárás alkalmazható tenyésztett sejtek esetében, például in vivo vagy ex vivo ( pl. ráksejteket tartalmazó tenyészetekben). Például sejteket tenyészthetünk tápközegben in vitro, és a találmány tárgyát képező nukleinsavat a tenyészközeghez adhatjuk. Alternatív módon az eljárás végrehajtható egyénben jelen lévő sejteken (pl. ráksejteken), például in vivo (pl. terápiás vagy megelőző) génterápiás előirat részeként.
A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi beteg kezelésére, betegség kezelésére szolgáló eljárás, ahol a betegséget sejt, a felszínén célantigént expresszáló sejt, például sejtfelszíni antigént expresszáló ráksejt rendellenes növekedése vagy rendellenes aktivitása jellemzi. Az eljárás magában foglalja fúziós fehérje, vagy fúziós fehérjét (pl. a leírásban ismertetett fúziós fehérjét) kódoló nukleinsav hatásos mennyisége betegnek történő beadását, ahol a fúziós fehérje első, máso dik tagja közül bármelyik felismeri a célantigént.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a betegséget sejt, például ráksejt, immunsejt rendellenes növekedése vagy rendellenes aktivitása jellemzi.
A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi eljárás célantigén jelenlétének mintában történő, in vitro vagy in vivo azonosítása, például betegség diagnózisa céljából. Az eljárás magában foglalja 1) mintának vagy kontrollmintának jelölt fúziós fehérjével, például a leírásban ismertetett fúziós fehérjével a kölcsönhatást lehetővé tévő körülmények között történő érintkeztetését, és 2) komplex kialakulásának detektálását. A fúziósfehérje-antitest és a célantigén között kialakult komplex kontrollmintához viszonyított, statisztikailag szignifikáns változása a mintában célantigén jelenlétét j elzi.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a második tag enzim, például tormaperoxidáz.
A találmány tárgyát képezi fúziós fehérje, ahol a fúziós fehérje első tagja multimerképző képességét úgy választjuk meg, hogy a második tag egyik jellemzőjét, például aktivitását vagy oldhatóságát optimalizáljuk.
A „peptidek, „fehérjék és „polipeptidek kifejezéseket a leírásban felcserélhető módon alkalmazzuk.
Polipeptid vagy izolált polipeptid tisztított készítménye, alapvetően tiszta készítménye olyan polipeptidet jelent, amelyet legalább egy, az azt expresszáló sejtben vele együtt előforduló más fehérjétől, lipidtől vagy nukleinsavtól elválasztottuk, például a transzgenikus állatban vagy folyadékban, például tejben vagy más, a transzgenikus állat által termelt anyagban, például tojásban található fehérjétől, lipidtől vagy nukleinsavtól. A polipeptidet előnyösen elválasztjuk az olyan anyagoktól, például antitestektől vagy gélmátrixtól·, például poli-akrilamidtól, amelyeket tisztítására alkalmaztunk. A polipeptid a tisztított készítmény szárazanyag-tartalmának előnyösen legalább 10, 20, 50, 70, 80 vagy 95%-át alkotja. Előnyösen a készítmény tartalmaz: fehérjeszekvenáláshoz elegendő polipeptidet; 1, 10 vagy 100 pg polipeptidet; legalább 1, 10 vagy 100 mg polipeptidet.
Alapvetően tiszta nukleinsav az olyan nukleinsav, amely a következő feltételek egyikének vagy mindkettőnek eleget tesz: nem közvetlenül szomszédos azzal az egyik vagy akár mindkét szekvenciával, például kódoló szekvenciákkal, amelyekkel közvetlenül szomszédos a szervezet (amelyből a nukleinsav származik) természetes körülmények között előforduló genomjában (pl. az 5'-végen és a 3'-végen); vagy amely alapvetően mentes olyan nukleinsav-szekvenciától, amelyekkel együtt fordul elő abban a szervezetben, amelyből a nukleinsav származik. A kifejezés magában foglal például rekombináns DNS-t, amely vektorba, például autonóm módon replikálódó plazmidba vagy vírusba, vagy prokarióta vagy eukarióta (szervezet) genomi DNS-ébe van beépítve, vagy amely más DNS-szekvenciáktól független, különálló molekulaként létezik (pl. PCR-reakcióban vagy restrikciós endonukleázzal történő kezeléssel előállított cDNS vagy genomi DNS) . Az „alapvetően tiszta DNS kifejezés magában foglal olyan rekombináns DNS-t, amely további fúziósfehérjeszekvenciákat kódoló hibrid gén része.
A „homológia vagy „szekvenciaazonosság kifejezés alatt két polipeptid-molekula vagy két nukleinsav-molekula közötti szekvenciahasonlóságot értünk. Ha az első szekvencia egy pozícióját ugyanaz az aminosav vagy nukleotid foglalja el, mint amelyik a második szekvencia megfelelő pozíciójában van, akkor a molekulák abban a pozícióban homológok (pl. ebben az értelemben az „aminosav-homológia v. „nukleinsav-homológia egyenértékű az „aminosav-azonossággal vagy „nukleinsav-azonossággal). A két szekvencia közötti százalékos homológia a két szekvenciában az azonos pozíciók számának függvénye (pl. %-os homológia = azonos pozíciók száma/összes pozíció száma x 100).
Például ha két szekvenciában 10 pozíció közül 6 illeszkedik vagy homológ, akkor a két szekvencia 60%-ban homológ vagy 60%-os szekvenciaazonosságot mutat. Példaként említve az ATTGCC- és a TATGGC-szekvenciák 50%-ban homológok vagy szekvenciájuk 50%-ban azonos. Általánosságban öszszehasonlítást végzünk, amikor két szekvenciát rendezünk egymáshoz maximális homológia vagy szekvenciaazonosság elérése céljából.
A szekvenciák összehasonlítása és két szekvencia közötti százalékos homológia meghatározása végrehajtható matematikai algoritmus alkalmazásával. A szekvenciák összehasonlításában alkalmazott, előnyös matematikai algoritmusokra nem korlátozó példa Kariin és Atschul algoritmusa [Kariin és Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2264-68 (1990)], Karlin és Altschul által módosítva [Kariin és Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77 (1993)]. Ilyen algoritmus van beépítve Altschul és munkatársai NBLAST- és az XBLAST-programjaiba (2.0 verzió) [Altschul és mtsai., J. Mól. Bioi. 215. 403-10 (1990)]. BLASTnukleotidkeresések hajthatók végre az NBLAST-programmal (score = 100, wordlength = 12) a találmány tárgyár képező TTABY-nukleinsav-molekulával homológ nukleotidszekvenciák keresése céljából. Összehasonlítás célját szolgáló „hézagos (gapped) illesztések céljából alkalmazható a GAPPED BLAST Altschul és munkatársai leírása szerint [Altschul és mtsai., Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402 (1997)]. A BLAST- és GAPPED BBAST-programok alkalmazásakor a megfelelő programok (pl. az XBLAST és az NBLAST) alapértelmezési paraméterei alkalmazhatóak (lásd:
http//:www.ncbi.nlm.nih.gov). Szekvenciák összehasonlításában alkalmazott matematikai algoritmusokra egy másik, nem korlátozó jellegű példa Myers és Miller CABIOS algoritmusa (1989). Ilyen algoritmus van beépítve az AúTGN-programba (2.0-verzió), amely a „GCG szekvenciaillesztő softwarecsomag része. Aminosav-szekvenciák összehasonlítása céljából AATGN-program alkalmazásakor alkalmazható a PAM120súlyozási táblázat („weight residue table), 12-es „hézaghosszúság-büntetés („gap length penalty) és 4-es „hézagszámbüntetés („gap penalty) alkalmazható.
A „transzgén kifejezés alatt a leírásban olyan nukleinsav-szekvenciát (pl. egy vagy több fúziósfehérjepolipeptidet kódoló nukleinsav-szekvenciát) értünk, amelyet transzgenikus szervezet genomjába vittünk be. A transzgén tartalmazhat egy vagy több transzkripciós szabályozó szekvenciát és más nukleinsavat, mint például intronokat, amelyek szükségesek lehetnek a fúziós fehérjét kódoló nukleinsav optimális expressziójához és szekréciójához. A transzgén tartalmazhat erősítő {enhancer) szekvenciákat. Fúziósfehér j e-szekvencia lehet működőképesen kapcsolva szövetspecifikus promóterrel, például emlőhámszövet-specifikus promóterrel, amely a fehérje transzgenikus állat tejébe történő szekretálódását eredményezi; vizeletspecifikus promóterrel, vagy tojásspecifikus promóterrel.
A „transzgenikus sejt kifejezés alatt transzgént tartalmazó sejtet értünk.
A „transzgenikus szervezet kifejezés alatt transzgenikus állatot vagy növényt értünk.
A „transzgenikus állat kifejezésen nem humán jellegű állati szervezetet értünk, amelyben az állat sejtjei közül egy vagy több, és előnyösen alapvetően minden sejt tartalmaz emberi beavatkozás, mint például a technikában ismert transzgenikus eljárások által bevitt transzgént. A transzgént bejuttathatjuk a sejtbe direkt vagy indirekt módon a sejt prekurzorába való bejuttatással, szándékos genetikai művelettel, mint például mikroinjekcióval vagy rekombináns vírussal történő fertőzéssel.
Az „emlős kifejezés alatt olyan állatokat értünk, az embert kivéve, amelyek rendelkeznek emlőmiriggyel és tejet termelnek.
„Tejelő állat alatt tejtermelő, rágcsálónál nagyobb, nem humán jellegű állatot értünk. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a tejelő állat bőséges mennyiségű tejet termel és tejelési időszaka hosszú, mint például a szarvasmarha vagy kecske.
A „beteg kifejezés alatt embert és állatot értünk. A leírásban a „nem humán jellegű állat kifejezésen értünk gerinceseket, például emlősöket és nem emlősöket, mint például főemlős az emberen kívül, kérődzőket, madarakat, kétéltűeket, hüllőket és rágcsálókat, például egereket és patkányokat. A kifejezés magában foglal nyulakat is.
A „transzgenikus növény kifejezésen értünk olyan növényeket, előnyösen többsejtű vagy magasabb rendű növényeket, amelyekben a növény sejtjei egy vagy több, és előnyösen alapvetően minden sejt tartalmaz emberi beavatkozás, mint például a technikában ismert transzgén eljárások által bevitt transzgént.
A „növény kifejezésen értünk teljes növényt, növényi részt, növényi sejtet vagy növényi sejtek csoportját. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható növények csoportja olyan tág, mint a transzformálásnak alávethető magasabb rendű növények osztálya, amely magában foglalja az egyszikűeket és a kétszikűeket is; magában foglal különböző ploiditási szintű növényeket, többek között poliploidokat, diploidokat és haploidokat.
Az „immunglobulin és „antitest kifejezések alatt olyan glikoproteineket értünk, amelyek tartalmaznak legalább két nehézláncot (H) és két könnyűláncot (L), amelye két diszulfidhidak kapcsolnak össze. Minden nehézlánc nehézlánc-vatiábilisrégióból (rövidítése: HCRV vagy VH) és nehézlánc-konstansrégióból áll. A nehézlánc-konstansrégió három doménből áll: CHI, CH2 és CH3. Minden könnyűlánc könnyűlánc-vatiábilisrégióból (rövidítése: LCRV vagy VL) és könnyűlánc-konstansrégióból áll. A könnyűlánc-konstansrégió egy doménből, a CL-ből áll. A VH- és a VL-régiók tovább oszthatók hipervariabilis régiókra, melyeket komplementaritást meghatározó régióknak nevezünk (CDR), amelyeket közé konzerváltabb, vázszerkezet-régiónak nevezett régiók (FR) ékelődnek. Minden VH és VL három CDR-ből és négy FR-ből áll, amelyek elrendeződése az N-terminális végtől a Cterminális végig: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 . A nehézlánc és a könnyűlánc variábilis régiói tartalmaznak kötődomént, amely kölcsönhatásba lép antigénnel. Az antitestek konstans régiói közvetíthetik az immnuglobulin gazdaszövetekhez vagy faktorokhoz, többek között az immunrendszer különböző sejtjeihez (pl. effektorsejtekhez) és a klasszikus komplement-rendszer első komponenséhez (Clq) való kötődését.
Az antitest „antigénkötő része (vagy egyszerűen antitest része) kifejezés alatt antitest egy vagy több olyan fragmensét értjük, amely megtartja az antigénhez (pl. célantigénhez) való specifikus kötődés tulajdonságát. Kimutatták, hogy antigén antigénkötő funkciója megvalósítható teljes hosszúságú antitest fragmenseivel. Az antitest „antigénkötő része kifejezés által leírt kötőfragmensekre példák többek között 1) Fab-fragmens, amely VL-, VH-, CL és CHl-doménekből felépülő monovalens fragmens; 2) Fab2fragmens, amely a csuklórégiójában diszulfidhiddal összekapcsolt két Fab-fragmenst tartalmazó bivalens fragmens; 3) a VH- és a CHl-doménekből álló Fd-fragmens; 4) antitest egyik karja VL- és VH-doménjeiből álló Fv-fragmens; 5) VHdoménből álló dAb-fragmens [Ward és mtsai., Nature 341: 544-546 (1989)], és 6) izolált komplementaritást meghatározó régió (CDR). Ráadásul, noha az Fv-fragmens két doménjét, a VL- és a VH-régiót külön gének kódolják, ezek összekapcsolhatóak rekombináns eljárások alkalmazásával, szintetikus kapcsolóval, amely lehetővé teszi egy fehérjeként történő előállításukat, amely fehérjében a VL- és VH-régiók párt alkotnak monovalens molekulák kialakítására [egyláncú Fv-ként ismert, lásd Bird és mtsai., Science 242: 423-426 (1988), és Huston és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)]. Az ilyen egyláncú antitestek szintén az antitest „antigénkötő része fogalmába értendőek. Ezeket az antitestfragmenseket a szakember számára ismert hagyományos eljárásokkal állítják elő, és a fragmenseket alkalmazás céljára ugyanúgy szűrik (szkrínelik) , mint a teljes antitesteket .
A „monoklonális antitest kifejezés alatt egyféle molekuláris összetételű antitest-molekulát értünk. Monoklonális antitestelegy adott epitópra egyféle kötési specifitást és affinitást mutat. Ennek megfelelően a „humán eredetű monoklonális antitest kifejezés alatt egyféle kötési specifitást és affinitást mutató antitesteket értünk, amelyek humán csírasejtből származó immunglobulin-szek venciákból származó variábilis és konstans régiókkal rendelkeznek. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a humán eredetű monoklonális antitesteket olyan hibridómával állítjuk elő, amely olyan transzgenikus, nem humán jellegű állatból, például transzgenikus egérből származó B-sejteket tartalmaz, amely humán eredetű nehézlánc-transzgént és könnyűlánc-transzgént tartalmaz, immortalizált sejttel fuzionáltatva.
A „rekombináns, humán eredetű antitest kifejezés alatt értünk minden, rekombináns módon előállított, expresszált, emberi tevékenység által létrehozott, vagy humán eredetű immunglobulin-génre nézve transzgén állatból (pl. egérből) izolált humán eredetű antitestet; gazdasejtbe transzfektált rekombináns vektor alkalmazásával expresszált antitesteket; rekombináns, kombinatorikus humán antitestkönyvtárból izolált antitesteket, vagy olyan antitesteket, amelyeket bármely más módon, humán immunglobulin-génszekvenciák más DNS-szekvenciákhoz történő illesztését tartalmazó eljárásban állítottak elő, hoztak létre vagy izoláltak. Az ilyen rekombináns humán eredetű antitestek humán csíravonalból származó variábilis és konstans régiókkal rendelkeznek. A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint azonban az ilyen rekombináns humán antitesteket in vitro mutagenezisnek (vagy humán eredetű Ig-szekvenciákra nézve transzgén állat alkalmazása esetében in vivo szomatikus mutagenezisnek) vetjük alá, és így a rekombináns antitestek VH- és VL-régiói aminosav-szekvenciái olyan szekvenciák, amelyek nem létezhetnek in vivo a humán csíravonal antitestkészletében, noha humán eredetű VH- és VL-szekvenciákból származnak, és azzal rokonságot mutatnak.
Nukleinsav „működőképesen van kapcsolva, ha más nukleinsav-szekvenciákkal funkcionális kapcsolatban van. Például promoter vagy erősítő („enhancer) működőképesen van kapcsolva kódoló szekvenciával, ha hatással van a szekvencia transzkripciójára. A transzkripciós szabályozó szekvenciák esetében a „működőképesen kapcsolva kifejezés azt jelenti, hogy a DNS-szekvenciák kapcsoltak és szomszédosak, és ahol két fehérje kódoló régiójának összekapcsolása szükséges, szomszédosak és azonos leolvasási keretben vannak.
A „vektor vagy „konstrukció kifejezés alatt olyan nukleinsav-molekulát értünk, amely alkalmas más, hozzá kapcsolt nukleinsav átvitelére. A vektor egy típusa a „plazmád, amely cirkuláris, kettős láncú DNS-hurok, amelybe további DNS-szegmenseket illeszthetünk ligálási reakcióval. A vektor másik típusa virális vektor, amelybe további DNS-szegmenseket ligálhatunk a vírusgenomba. Bizonyos vektorok képesek olyan gazdasejtben történő autonóm replikálódásra, amelybe bejuttatták ezeket (pl. bakteriális replikációs kiindulóponttal rendelkező bakteriális vektorok és episzómális emlősvektorok). Más vektorok (pl. nem episzómális emlősvektorok) integrálódhatnak gazdasejt genomjában gazdasejtbe történő bejuttatásuk során, és ezáltal a gazdasejttel együtt replikálódnak. Ráadásul bizonyos vektorok alkalmasak a velük működőképesen kapcsolt gének expressziója vezérlésére. Az ilyen vektorokat „rekombináns expressziós vektoroknak (vagy egyszerűen „expressziós vek toroknak) nevezzük. Általánosságban a rekombináns DNStechnológiákban gyakran alkalmazott expressziós vektorok plazmidok. A leírás során a „plazmid és „vektor kifejezéseket felcserélhető módon alkalmazhatjuk, mivel a legáltalánosabban alkalmazott vektorforma a plazmid. A találmány szerinti megoldásban alkalmazhatóak azonban az expressziós vektorok más, ilyen formái is, mint a virális vektorok (pl. replikációs képességükben hiányos retrovírusok, adenovírusok és adeno-asszociált vírusok).
A „rekombináns gazdasejt („vagy egyszerűen „gazdasejt) kifejezésen olyan sejtet értünk, amelybe rekombináns expressziós vektort vittünk be. Magától értetődik, hogy az ilyen kifejezéseken nem csak a konkrét célsejtet értjük, hanem az ilyen sejtek leszármazottjait is. Mivel mutációk miatt, vagy akár környezeti hatások miatt a következő generációkban bizonyos mutációk felléphetnek, az ilyen leszármazott ténylegesen lehet az őssejttel azonos vagy nem azonos, azonban akkor is a „gazdasejt kifejezés vonatkozik azokra.
A találmány más jellegzetességei és előnyei az itt következő részletes leírás és az igénypontok alapján nyilvánvalóak .
Az alábbiakban a találmány részletes leírását adjuk Először röviden ismertetjük az ábrákat.
Az 1A. ábra a 431-es humanizált carcinoembriotikus antigén elleni antitest könnyűlánca (LC) genomi szekvenciáját tartalmazó konstrukció vázlatos ábrája. A szignálpeptid-szekvencia (s) és a könnyűlánc variábilis (Vk) és Ck-régiói helyzetét szintén jelöltük. A restrikciós enzim (enzimek) (hasító) helyét szintén jeleztük.
Az 1B. ábrán a 431-es humanizált carcinoembriotikus antigén elleni antitest könnyűlánca nukleotid- és aminosavszekvenciáját tüntettük fel. A restrikciós enzim (enzimek) (hasító) helyeit jeleztük.
A 2. ábrán a 431-es humanizált carcinoembriotikus antigén elleni antitest könnyűlánca kódoló szekvenciáit tartalmazó Sál I-insert (beillesztett szekvencia) nukleotidszekvenciáját ábrázolja.
A 3. ábra a 431-es humanizált carcinoembriotikus antigén elleni antitest könnyűlánca kódoló szekvenciáját tartalmazó, Sál I-insert-et tartalmazó Bc-458-as konstrukció vázlatos ábrája. Az ábrán jelöltük a β-kazein 5'-irányú nem transzlálódó „némító („silencer) régióját, a könnyűlánc kódoló régióját, és a β-kazein 3'-irányú nem transzlálódó régiój át.
A 4A. ábra a β-glükuronidáz-szekvenciához kapcsolt 431-es humanizált carcinoembriotikus antigén elleni antitest nehézlánca (HC) genomi szekvenciáját tartalmazó konstrukció vázlatos ábrája. A szignálpeptid-szekvencia (s) és a nehézlánc variábilis (Vh) szekvenciáját és CHl-szekvenciáját szintén jelöltük.
A 4B. ábra a 431-es humanizált carcinoembriotikus antigén elleni antitest nehézlánca nukleotid- és aminosavszekvenciáját ábrázolja. A restrikciós enzim (enzimek) (hasító) helyét jeleztük.
Az 5. ábrán a 431-es humanizált carcinoembriotikus untigén elleni antitest mutáns nehézlánca nukleotid— és aminosav-szekvenciáját tüntettük fel. A mutáns nehézláncból hiányzik a csuklórégió. A restrikciós enzim (enzimek) (hasító) helyét jeleztük.
A 6. ábra a β-glükuronidáz-szekvenciához kapcsolt 431-es humanizált carcinoembriotikus antigén elleni antitest mutáns nehézláncát tartalmazó konstrukció (Bc-454-es) vázlatos ábrája. Az ábrán jelöltük a β-kazein 5'-irányú nem transzlálódó „némító („silencer) régióját, a könnyűlánc kódoló régióját, és a β-kazein 3'-irányú nem transzlálódó régióját. A restrikciós enzim (enzimek) (hasító) helyét jeleztük.
A 7. ábra a nehézláncmutánsok konstrukciója összefoglaló ábrája.
A 8. ábra a β-glükuronidáz mutációja felnagyított ábrája.
A találmány tárgyát képezi, legalábbis részben transzgenikus úton előállított fúziós fehérje, ahol a fúziós fehérje egyik tagja multimerré kapcsolódik össze, és a másik tagot úgy választjuk meg, vagy úgy módosítjuk, hogy az elősegítse optimális számú alegység összekapcsolódását. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a fúziós fehérje tartalmaz immunglobulin-alegységet (pl. immunglobulin nehézláncot vagy —könnyűláncot) toxinnal (pl. enzimal— egységgel) fuzionáltatva. A leírásban ismertetett, immun globulin-enzim-fúziósfehérje citotoxikus hatóanyag (pl. az enzim) nemkívánatos sejthez, például tumorsejthez történő célba juttatására szolgál. Például az alább következő Példákban leírt fúziós fehérjék (pl. karcinoembriotikus antigén elleni antitest, azaz CEA enzimmel, pl. glükuronidázzal fuzionáltatva) alkalmazhatóak tumorsejthez való célba juttatásra. Az immunglobulin-enzim-fúziósfehérjét a tumoros helyen elegendő ideig hagyjuk lokalizálódul, ezután nem toxikus prodrogot adhatunk be. Ez a prodrog a tumoros helyen lokalizálódott, célba juttatott enzim hatására erősen citotoxikus droggá alakul át, ami lehetővé teszi a drog terápiás szintjének elérését a beteg számára elfogadhatatlan toxicitás nélkül.
Immunglobulinok előállítása
Sejten található célantigén, például sejtfelszíni fehérje (pl. receptor) elleni monoklonális antitest előállítható eljárások széles választékával, többek között hagyományos monoklonális antitest-metodikával, például Kohler és Milstein standard szomatikus sejthibridizációs technikájával [Kohler és Milstein, Nature 256: 496 (1975)]. Előnyösek a szomatikus sejthibridizációs eljárások, azonban általában alkalmazhatóak más, monoklonális antitest előállítására szolgáló eljárások, például a B-limfociták virális vagy onkogén transzformációja.
Hibridómák előállítására szolgáló előnyös, állati eredetű rendszer az egéreredetű rendszer. Az egérben történő hibridómatermelés nagyon jól megalapozott eljárás. Immunizálási előiratok és fúziós célokra immunizált splenociták izolálására szolgáló eljárások jól ismertek a technika állása szerint. Fúziós partnerek (pl. egérmielóma lása szerint. Fúziós partnerek (pl. egérmielóma-sejtek) és fúziós eljárások szintén ismertek.
Humán eredetű fehérjék elleni humán monoklonális antitestek (mAb-k) létrehozhatóak az egér (immun-) rendszere helyett a teljes humán immunrendszert hordozó transzgenikus egerek alkalmazásával. A konkrét antigénnel immunizált transzgenikus egérből származó splenocitákat alkalmazzuk humán fehérje epitópjaira specifikus affinitással rendelkező humán mAB-kat szekretáló hibridómák előállításához [lásd pl. Wood és mtsai., WO 91/00906. sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés; Kucherlapati és mtsai., WO 91/10741. sz. nemzetközi közzétételi irat; Lonberg és mtsai., WO 92/03918. sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés; Kay és mtsai., 92/03917. sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés; Lonberg és mtsai., Nature 368: 856-859 (1994); Green, L.L. és mtsai., Nature Genet. Ί_: 13-21 (1994); Morisson, S.L. és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1994); Bruggeman és mtsai., Year Immunoi. 7_: 33-40 (1993); Tuaillon és mtsai., PNAS 90: 3720-3724 (1993); Bruggeman és mtsai., Eur. J. Immunoi. 21: 1323-1326].
Monoklonális antitestek előállíthatóak a rekombináns DNS-technológiában jártas szakember számára ismert más eljárásokkal is. A „kombinatorikus antitest-bemutatás {„display} néven ismert alternatív eljárást fejlesztettek ki adott antigén-specifitással rendelkező antitestfragmensek azonosítására és izolálására, és ez alkalmazható monoklonális antitestek előállítására [a kombinatorikus antitest-bemutatás leírását lásd a következő közleményekben:
Sastry és mtsai. , PNAS 8 6 : 5728 (1989); Huse és mtsai., Science 246: 1275 (1989); Orlandi és mtsai., PNAS 86 : 3833 (1989)]. A fent leírtak szerint állat immunogénnel történő immunizálása után az eredményül kapott B-sejt-készlet (pool) antitest-repertoárját klónozzuk. Általánosságban ismertek az immunglobulin-molekulák változatos populációjának variábilis régiója DNS-szekvenciájának oligomer láncindítók és PCR alkalmazásával történő előállítására szolgáló eljárások. Például az 5'-irányú leader-szekvenciákhoz (szignálpeptidekhez) és/vagy az 1. vázszekvenciákhoz (FR1) tartozó kevert oligonukleotid- láncindítók, valamint a konzervált 3'-irányú konstans régió láncindítója alkalmazható számos egéreredetű antitest nehézlánca és könnyűlánca variábilis régiói PCR-amplifikálása céljából [Larrick és mtsai., Biotechniques 11: 152-156 (1991)]. Hasonló stratégia alkalmazható humán eredetű antitestek nehézlánca és könnyűlánca variábilis régiói amplifikálása céljából [Larrick és mtsai., Methods: Companion to Methods in Enzymology 2j 106-110 (1991)].
A találmány egy illusztrálásként szolgáló megvalósítási módja szerint RNS-t izolálunk B-limfocitákból, például perifériás vérsejtekből, csontvelőből vagy lép-preparátumokból standard élőáratok alkalmazásával [lásd például a 4683202. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot, Orlandi és mtsai., PNAS 86: 5728-5732 (1989), és Huse és mtsai., Science 246: 1275-1281 (1989)]. Az első cDNSláncot a nehézlánc (nehézláncok) és a k- és a λkönnyűláncok konstans régiójára specifikus láncindítók, va lamint a szignálszekvencia láncindítója alkalmazásával szintetizáljuk. Variábilisrégió PCR-láncindítót alkalmazva mindkét nehézlánc és könnyűlánc variábilis régióit amplifikáljuk, mindegyiket önmagában vagy kombinációban, és a bemutatási („display) „csomagok előállításában további műveletek céljára alkalmas vektorokba ligáijuk. Az amplifikálási előiratokban alkalmazható oligonukleotid-láncindítók lehetnek unikálisak (unique) vagy degeneráltak, vagy a degenerált pozíciókban beépítve tartalmazhatnak inozitot. A láncindítókba beépíthetünk restrikciós endonukleázok számára felismerési szekvenciákat, annak lehetővé tételére, hogy az amplifikált fragmenst expresszió céljából előre meghatározott leolvasási keretben vektorba klónozzuk.
Az immunizálásból származó antitest-repertoárból klónozott V-gén-könyvtár expresszálható antitestbemutatásikönyvtár („phage display library) létrehozása céljából bemutatási („display) csomagok populációjának alkalmazásával, amelyek előnyösen filamentózus fágból származnak. Ideális esetben a bemutatási („display) csomag tartalmaz olyan rendszert, amely lehetővé teszi nagyon nagy, változatos antitest-bemutatási-könyvtárakból való mintavételt, minden affinitási elválasztási kör után gyors osztályozást, és a tisztított bemutatási csomagokból az antitestgén könynyű izolálását. A bemutatási fágkönyvtárak előállítására szolgáló, kereskedelmi forgalomban kapható reagenskészleteken kívül [pl. a Pharmacia Recombinant Phage Antibody System nevű terméke, 27-9400-01. katalógusszámmal, és a Stratagene SurfZAP™ fágbemutatási („phage display) reagenskészlete 240612. katalógusszámmal] változatos antitest-bemutatási könyvtár előállításárában különösen jól alkalmazható eljárásokra és reagensekre példaként említhetjük a következőket: Ladner és mtsai., 5223409. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Kang és mtsai., 92/18619. sz. nemzetközi közzétételi irat; Dower és mtsai., WO 91/17271. sz. nemzetközi közzétételi irat; Markland és mtsai., WO 92/15679. sz. nemzetközi közzétételi irat; Breitling és mtsai., WO 93/01288. sz. nemzetközi közzétételi irat; McCafferty és mtsai., WO 92/01047. sz. nemzetközi közzétételi irat; Garrard és mtsai., WO 92/09690. sz. nemzetközi közzétételi irat; Ladner és mtsai., WO 90/02809. sz. nemzetközi közzétételi irat; Fuchs és mtsai., Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay és mtsai., Hum
Antibod Hybridomas 3: 81-85 (1992); Huse és mtsai., Science 246: 1275-1281 (1989); Griffths és mtsai., EMBO J 12: 725734 (1993); Hawkins és mtsai., J, Mól. Bioi. 226:889-896 (1992); Clackson és mtsai., Nature 352: 624-628 (1991);
Garrad és mtsai., Bio/Technology 9: 1373-1377 (1991);
Hoogenboom és mtsai., Nuc Acid Res 19 : 4133-4137 (1991), és Barbas és mtsai., PNAS 88 : 7978-7982 (1991).
A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint nehézlánc és könnyűlánc V-régió-doménjai expresszálhatóak ugyanazon a polipeptiden, flexibilis kapcsolóval kapcsolva egyláncú Fv-fragmens kialakításával, és az scFV-gént ezután a kívánt expressziós vektorba vagy fággenomba klónozva. Amint az általánosságban le van írva McCafferty és munkatársai közleményében [McCafferty és mtsai., Nature 348;
552-554 (1990)], antitestek teljes, flexibilis (Gly4-Ser)3kapcsolóval kapcsolt VH- és VL-doménjai alkalmazhatóak olyan egyláncú antitest előállításában, amely a bemutatási csomagot antigén-affinitási alapon elválaszthatóvá teszi. Az antigénnel immunreaktivitást mutató izolált scFVantitestek ezt követően a találmány tárgyát képező eljárásban alkalmazható gyógyászati készítményben formulázható.
A „bemutatási csomag (display package) felszínén megjelenített antitest-könyvtárt a célantigénnel vagy peptidfragmenseivel szkrínelik, a célantigénhez specifitással rendelkező antitestet expresszáló „csomagok azonosítása és izolálása céljából. A kiválasztott antitestet kódoló nukleinsav a bemutatási csomagból (pl. a fággenomból) kinyerhető és standard rekombináns DNS-eljárásokkal más expressziós vektorokba szubklónozható.
Felszíni fehérjéhez nagy affinitást mutató specifikus antitest-molekulákat állíthatunk elő a technikában ismert eljárásoknak megfelelően, többek között könyvtárak szkrínelésével [Ladner, R.C. és mtsai., 5233409. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Ladner, R.C. és mtsai., 5403484. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat]. Ráadásul az ilyen könyvtárakat alkalmazó eljárások alkalmazhatóak olyan kötődeterminánsok keresését szolgáló szkrínelésekben, amelyek antitestek szerkezeti determinánsainak mimetikumai.
Közelebbről adott antitest Fv-kötőfelszíne kölcsönha tásba lép a célligandum a fehérje-fehérje kölcsönhatások elvei szerint, ezáltal a VH és VL (az utóbbi lehet k- vagy λ-lánctipusú) szekvenciaadatai a szakember számára ismert fehérjekonstrukciós {protein engineering) technikák alapjai lehetnek. A kötődeterminánsokat tartalmazó fehérjefelszín részletes adatait antitest-szekvencia információkból nyerhetjük, más antitestek NMR-vizsgálataiból vagy krisztallográfiai adatokból nyert, korábban meghatározott háromdimenziós szerkezeteit alkalmazó modellezési eljárással, [lásd pl. Bajorath, J. és Sheriff, S., Proteins: Struct., Funct. and Genet. 24(2): 152-157 (1996); Webster, D.M. és Rees, A.R., „Molecular modelling of antibody-combining sites, Methods in Molecular Biol. 51., Antibody Engineering Protocols, 17-49, szerk.: Paul, S., kiad: Human Press, Totowa, NJ], és Johnson, G., Wu, T.T. és Kábát, E.A., „Seqhunt: A program to screen aligned nucleotide and amino acids sequences, Methods in Molecular Biol.51: id. mű 1-15 (1995)].
A találmány egyik megvalósítási módja szerint változatos peptidkönyvtárt expresszálunk bemutatási csomagok populációjával bemutatási peptidkönyvtár {„peptide display library) kialakítása céljából. Ideális esetben a bemutatási csomag tartalmaz olyan rendszert, amely lehetővé teszi nagyon nagy, változatos bemutatási peptidkönyvtárakból való mintavételt, minden affinitási elválasztási kör után gyors osztályozást, és a tisztított bemutatási csomagokból az antitestet kódoló gén könnyű izolálását. A bemutatási peptidkönyvtárak lehetnek olyan prokarióta eredetű szervezetben és vírusokban, amelyek gyorsan amplifikálhatóak, és viszonylag könnyű azokkal műveleteket végrehajtani (manipu lálni), és amely lehetővé teszi nagyszámú klón előállítását. Az előnyös bemutatási csomagok tartalmaznak például vegetatív baktériumsejteket, baktériumspórákat és legelőnyösebben bakteriális vírusokat (különösen DNS-vírusokat). A találmány tárgyát képezi azonban eukariótaeredetű sejtek, többek között élesztő és spórái potenciális bemutatási csomagként való alkalmazása is. A bemutatási fágkönyvtárak leírása megtalálható fent.
Más technika többek között az alkalmas „receptorral, például célantigénnel való affinitási kromatográfia, amelyet az izolált kötőanyagok vagy ligandumok hagyományos technikákkal (pl. tömegspektrometriával és NMR-rel) történő azonosítása követ. Előnyösen az oldható receptor olyan jelöléssel (pl. fluorofórokkal, kolorimetriás enzimekkel, radioizotópokkal vagy lumineszcens vegyületekkel) van konjugálva, amely detektálható a ligandkötés jelzése céljából. Alternatív módon immobilizált vegyületek szabadulhatnak fel szelektív módon, és lehetővé tehetjük membránon keresztül történő diffundálásukat receptorral történő kölcsönhatásuk célj ából.
Kombinatorikus vegyületkönyvtárak szintetizálhatóak a könyvtár mindegyik elemének azonosítására szolgáló toldalékkal (tag) [lásd W.C. Still és mtsai., WO 94/08051. sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés]. Általánosságban az eljárásra jellemző az olyan inert, de könnyen detektálható toldalékok alkalmazása, amelyek a szilárd hordozóhoz vagy a vegyületekhez vannak kapcsolva. Ha aktív vegyületet detektálunk, a vegyület azonosítását az egyedi kísérőtoldalék azonosítása határozza meg. Ez a toldalékillesztési („tagging) eljárás lehetővé teszi nagy vegyületkönyvtárak szintézisét, ahol a vegyületek a könyvtár teljes vegyületkészlete jelenlétében, nagyon alacsony szinteken azonosíthatóak .
A módosított antitest kifejezés magában foglal olyan antitesteket is, például monoklonális antitesteket, kiméraantitesteket és humanizált antitesteket, amelyek módosítva vannak például az antitest részeinek deletálásával, hozzáadásával vagy helyettesítésével. Antitest módosítható például a csuklórégió deletálásával, ezáltal monovalens antitestet előállítva. Minden módosítás a találmány oltalmi körébe tartozik mindaddig, amíg az antitest legalább egy specifikus antigénkötő-régióval rendelkezik.
Monoklonális, kiméra egér-humán antitestek (azaz kiméraantitestek) előállíthatóak a technikában állása szerint ismert rekombináns DNS-technikákkal. Például egéreredetű (vagy más fajból származó) monoklonális antitestmolekula Fc-konstansrégióját kódoló gént restrikciós enzimekkel emésztjük az egéreredetű Fc-t kódoló régió eltávolítása céljából, és humán eredetű Fc-konstansrégiót kódoló gén egyenértékű részével helyettesítjük [lásd Robinson és mtsai., PCT/US86/02269. sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés; Akira és mtsai., 184187. sz. európai szabadalmi bejelentés; Taniguchi, M., 171496. sz. európai szabadalmi bejelentés; Morrison és mtsai., 173494. sz. európai szabadalmi bejelentés; Neuberger és mtsai., WO 86/01533. sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés; Cabilly és mtsai., 48165567. sz.
amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Cabilly és mtsai., 125023. sz. európai szabadalmi bejelentés; Better és mtsai., Science 240: 1041-1043 (1988); Liu és mtsai., PNAS 84: 3439-3443 (1987); Liu és mtsai., J. Immunoi. 139: 3521-3526 (1987); Sun és mtsai., PNAS 84: 214-218 (1987); Nishimura és mtsai., Cane. Rés. 47: 999-1005 (1987); Wood és mtsai., Nature 314: 446-449 (1985), és Shaw és mtsai., J. Natl. Cancer Inst. 80 : 1553-1559 (1988)].
A kiméraantitest tovább humanizálható az antigénkötésben nem közvetlenül szerepet játszó Fvvariábilisrégiónak humán eredetű Fv-variábilisrégió egyenértékű szekvenciáival történő helyettesítésével. Humanizált kiméraantitestek általános összefoglalói: Morrison, S.L., Science 229: 1202-1207 (1985) és Oi és mtsai., BioTechniques _4: 214 (1986) . Az eljárás magában foglalja az immunglobulin nehézlánca vagy könnyűlánca közül legalább az egyikből származó Fv-variábilisrégiót vagy részét kódoló nukleinsav-szekvencia izolálását, azon műveletek végrehajtását (manipulálását) és expresszálását. Az ilyen nukleinsav forrásai a szakember számára jól ismertek, és (a nukleinsav) nyerhető például 7K3-ból, amely GPIIbIIIa -elleni antitestet termelő hibridóma. A kiméraantitestet vagy fragmensét kódoló rekombináns DNS ezután alkalmas expressziós vektorba klónozható. Alkalmas humanizált antitestek alternatív módon előáll!thatóak CDR-helyettes!téssel [5225539. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Jones és mtsai., Nature 321:552-525 (1986); Verhoeyan és mtsai., Science 239: 1534 (1988) és Beidler és mtsai., J. Immunoi. 141 : 4053-4060 (1988)].
Adott, humán eredetű antitest CDR-jei helyettesithetőek nem humán eredetű CDR legalább egy részével, vagy a CDR-ek egy része helyettesíthető nem humán eredetű CDRekkel. Csak az szükséges, hogy a humanizált antitest Fcreceptorhoz való kötéséhez szükséges számú CDR-eket helyettesítsük .
Antitest humanizálható bármely eljárással, amely alkalmas humán antitest legalább egy részének nem humán eredetű antitestből származó CDR-rel történő helyettesítésére. Winter olyan eljárást ír le, amely alkalmazható a találmány tárgyát képező humanizált antitestek előállítására [GB 2188638A. sz. egyesült királyságbeli szabadalmi bejelentés, 1987. március 26-án benyújtva], és amely közlemény tartalmára úgy hivatkozunk, mintha teljes terjedelmében a leíráshoz csatoltuk volna, és a kitanítás részét képezi. A humán eredetű CDR-ek helyettesíthetőek nem humán eredetű CDRekkel oligonukleotid alkalmazásával történő helyspecifikus mutagenezissel.
A találmány oltalmi körébe tartoznak az olyan kiméraantitestek és humanizált antitestek is, amelyekben specifikus antitestek vannak helyettesítve, deletálva vagy hozzáadva. Közelebbről az előnyös humanizált antitestek a vázszerkezet-régióban olyan aminosav-helyettesítéseket tartalmaznak, amelyek javítják az antigénkötést. Például egéreredetű CDR-ekkel rendelkező humanizált antitestben a humán eredetű vázszerkezet-régióban elhelyezkedő aminosavak he lyettesíthetőek az egéreredetű antitest megfelelő pozícióiban elhelyezkedő aminosavakkal. Az ilyen helyettesítések köztudott módon bizonyos esetekben javítják a humanizált antitest antigénhez való kötődését. Módosított vagy megváltoztatott antitesteknek nevezzük azokat az antitesteket, amelyek esetében aminosavakat adtunk, deletáltunk vagy helyettesítettünk .
Célantigének
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti a fúziós fehérje első tagja célba juttató hatóanyag, például céltárgyhoz nagy affinitással rendelkező polipeptid, például antitest, ligandum vagy enzim. Ennek megfelelően a találmány szerinti fúziós fehérje szelektív módon alkalmazható arra, hogy a fúziós fehérje második tagját nemkívánatos sejt közelébe irányítsa (lokalizálja).
Például az első tag lehet immunglobulin, amely kölcsönhatásba lép (pl. kötődik) célantigénnel. A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint a célantigén sejt felszínén, például rendellenes sejt, mint például hiperproliferatív sejt (pl. ráksejt) felszínén helyezkedik el. Példaként említhető célantigén többek között a karcinoembrionikus antigén (CEA), a TAG-72, a her-2/neu, az epidermális növekedési faktor receptora, a transzferrinreceptor.
A „célsejt betegben (pl. emberben vagy állatban) lehet bármely nemkívánatos sejt, amely a találmány tárgyát képező fúziós fehérje céltárgyának tekinthető. Példaként említhető célsejt többek között a tumorsejtek, mint például a karcinóma- vagy adenokarcinóma-eredetű sejtek (pl. bél·-, emlő- prosztata-, ovárium- és méhnyálkahártya-ráksejtek) [Thor, A. és mtsai., Cancer Res 46: 3118 (1997) ; Soisson, A.P. és mtsai., Am. J. Obstet. Gynecol.: 1258-63 (1989)]. A „karcinóma kifejezés a technikában elfogadott kifejezés és epitélszövetek vagy endokrin szövetek rosszindulatú elváltozásait jelöli, többek között a légzőszervi, gasztrointesztinális, a nemi szervek és a húgyutak, a herék, az emlők, a petefészkek, a prosztata, az endokrin rendszer karcinómáit és a melanómákat jelöli. Példaként említhető karcinómák többek között azok, amelyek a méhnyak, a tüdő, a prosztata, a fej és nyak, a bél és a petefészek szövetéből alakulnak ki. A kifejezés magában foglal többek között karcinoszarkómákat, például többek között karcinóma- és szarkómaszövetekből felépülő rosszindulatú tumorokat. Az „adenokarcinóma kifejezésen mirigyszövetből származó karcinómát, vagy olyan karcinómát értünk, amelyben a tumorsejtek felismerhető módon mirigyszerkezetet alakítanak ki. A „szarkóma kifejezés a technikában elfogadott kifejezés, és mezenchima-eredetű rosszindulatú tumorokat jelöl.
Fúziós fehérjék előállítása
A fúziós fehérje első és második tagja lehet egymással összekapcsolva kapcsolóval, előnyösen kapcsolószekvenciával. A kapcsolószekvenciának a fúziós fehérje első és második tagját olyan távolságban tartva kell elválasztania, hogy biztosítsa mindkét tag megfelelő módon öszszehajtogatódva („fold) felvegye másodlagos és harmadlagos szerkezetét. Az előnyös kapcsolószekvenciák tulajdonságai:
1) flexibilis, kinyújtott konformációt kell felvenniük, 2) nem lehet hajlamuk olyan, rendezett másodlagos szerkezet felvételére, amely kölcsönhatásba léphet a funkcionális első és második taggal, és 3) minimális olyan hidrofobicitási vagy töltési tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek elősegíthetik a funkcionális fehérjedoménekkel való kölcsönhatást. A flexibilis fehérjerégió tipikus felszíni aminosavai többek között a Gly, Asn és Ser. A Gly-t, Asn-t és Ser-t tartalmazó aminosav-szekvenciák permutációi várhatóan kielégítik a kapcsolószekvenciákkal szemben támasztott fenti ismérveket. Más, közel semleges aminosavak, mint a Thr és Alá, szintén alkalmazhatóak a kapcsolószekvenciában.
aminosavból álló kapcsolószekvencia alkalmazható a funkcionális fehérjedomének megfelelő elválasztása biztosítására, azonban szintén alkalmazhatóak hosszabb vagy rövidebb kapcsolószekvenciák. Az első és a második tagot elválasztó kapcsolószekvencia hossza lehet 5-500 aminosav, vagy előnyösen 5-100 aminosav. Előnyösen a kapcsolószekvencia körülbelül 5-30 aminosav hosszúságú. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a kapcsolószekvencia körülbelül 5-20 aminosav hosszúságú, és előnyösen 10-20 aminosav hosszúságú. Az első es második tag kapcsolójaként alkalmaz ható aminosav-szekvenciák többek között, de nem kizárólagosan leírhatóak a (SerGly4)y képlettel, ahol y 8 vagy nagyobb, vagy leírhatóak a Gly4SerGly5Ser képlettel. Az elő nyös kapcsolószekvencia a (SerGly4)4 képlettel írható le. Egy másik, előnyös kapcsoló a (Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)3 szek venciával rendelkezik.
Az első és második tag lehet fuzionáltatva közvetlenül, kapcsolószekvencia nélkül. Szükségtelenek a kapcsolószekvenciák, ha a fuzionálhatott fehérjék rendelkeznek olyan, nem esszenciális N- vagy C-terminális aminosavrégiókkal, amelyek alkalmazhatóak a funkcionális domének elválasztására, és megakadályozzák a szférikus interferenciát. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az első tag C-terminálisa közvetlenül fuzionáltatható a második tag N-terminálisával, vagy megfordítva.
Rekombináns módon történő előállítás
A találmány szerinti fúziós fehérje előállítható standard rekombináns DNS-technikákkal a fúziós fehérjét kódoló nukleinsav-molekula alkalmazásával. Fúziós fehérjét kódoló nukleotidszekvencia szintetizálható standard DNSszintézis eljárásokkal.
Fúziós fehérjét kódoló nukleinsav bejuttatható gazdasejtbe, például elsődleges vagy immortalizált sejtvonal sejtjébe. A rekombináns sejt alkalmazható a fúziós fehérje előállításában. Fúziós fehérjét kódoló nukleinsav bejuttatható gazdasejtbe például homológ rekombinációval. A legtöbb esetben a fúziós fehérjét kódoló nukleinsav rekombináns expressziós vektorban van beépítve.
A fúziós fehérjét kódoló nukleotidszekvencia lehet működőképesen kapcsolva egy vagy több, az expresszióban alkalmazandó gazdasejt alapján kiválasztott szabályozószekvenciával. A „működőképesen kapcsolva kifejezésen azt értjük, hogy a fúziósfehérje-összetevő (vegyületet, compound) szabályozószekvenciához (szekvenciákhoz) van kapcsolva olyan módon, amely lehetővé teszi a fúziós fehérje expresszióját. A „szabályozószekvencia kifejezésen promótereket, erősítőket (enhancer) és más expressziós kontrollelemeket értünk (pl. poliadenilációs szignált). Ilyen szabályozószekvenciák leírását találhatjuk meg a következő közleményben: Goeddel, „Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185., kiad.: Academic Press, San Diego, CA (1990), amely közlemény tartalmára úgy hivatkozunk, mintha teljes terjedelmében a leíráshoz csatoltuk volna, és a kitanítás részét képezi. Szabályozószekvenciák többek között azok, amelyek nukleotidszekvenciák konstitutív expresszióját vezérlik gazdasejtek sok típusában, amelyek csak bizonyos gazdasejtekben vezérlik nukleotidszekvenciák expresszióját (pl. szövetspecifikus szabályozószekvenciák) és azok, amelyek szabályozható módon vezérlik nukleotidszekvenciák expresszióját (pl. csak indukáló hatású anyag jelenlétében). A szakember számára nyilvánvaló, hogy expressziós vektor tervezése olyan faktoroktól függ, mint a transzformálandó gazdasejt megválasztása, a kívánt fúziós fehérje expressziós szintje és ehhez hasonlók. A fúziós fehérje expressziós vektora gazdasejtbe juttatható, a nukleinsavak által kódolt fúziós fehérjék előállítása céljából.
Rekombináns expressziós vektorokat tervezhetünk fúziós fehérjék prokarióta vagy eukarióta eredetű sejtekben történő expressziója céljából. Például fúziós fehérjék expresszálhatóak baktériumsejtekben, mint az E. coli, rovarsejtekben (pl. bakulovírus-alapú expressziós rendszer57 ben), élesztősejtekben vagy emlőseredetű sejtekben. Néhány alkalmas gazdasejt további leírása megtalálható a következő közleményben: Goeddel, „Gene Expression Technology,
Methods in Enzymology 185., kiad.: Academic Press, San Diego, CA (1990). A S. cerevisiae élesztőben történő expresszió célját szolgáló vektorokra példa többek között a pYepSecl [Baldari és mtsai., EMBO J. 6‘. 229-234 (1987)], a pMFa [Kurjan és Herskowitz, Cell 30: 933-943 (1982)], a pJRY88 [Schultz és mtsai., Gene 54 : 113-123 (1987)], és a pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Fúziós fehérjék tenyésztett rovarsejtekben (pl. Sf9-sejtekben) történő expressziója céljából hozzáférhető bakulovírus-alapú vektorok többek között a pAc-sorozat [Smith és mtsai., Mól. Cell. Bioi. 3: 2156-2165 (1983)], és a pVl-sorozat [Luckow, V.A. és Summers, M.D., Virology 170; 31-39 (1989)].
Emlőseredetű (sejtekben alkalmazható) expressziós vektorok például többek között a pCDM8 [Seed, B., Nature 329: 840 (1987)] és a pMT2PC [Kaufman és mtsai., EMBO J. 6: 487-195 (1987)]. Emlőseredetű sejtekben történő alkalmazás esetén az expressziós vektor kontrollfunkcióit gyakran virális szabályozóelemek biztosítják. Például a rendszerint alkalmazásra kerülő promóterek poliómavírusból, 2-es adenovírusból, citomegalovírusból és a 40-es majomvírusvól (Simian Virus 40) származnak.
A fent ismertetett szabályozó kontrollszekvenciákon kívül a rekombináns expressziós vektor tartalmazhat további nukleotidszekvenciákat. Például a rekombináns expressziós vektor kódolhat szelekciós jelzőgént a vektort befogadó gazdasejt azonosítása céljából. Ráadásul a fúziós fehérje gazdasejtből történ ő szekréciójának lehetővé tétele céljából adott, emlőseredetű gazdasejt esetében a rekombináns expressziós vektor kódolhat a fúziós fehérje aminoterminálisát kódoló szekvenciákkal működőképesen kapcsolt szignálszekvenciát, úgy, hogy az expresszió során a fúziós fehérje az amino-terminális végéhez fuzionáltatott szignálszekvenciával szintetizálódik. A szignálszekvencia a fúziós fehérjét a sejt szekréciós reakcióútjára vezérli, majd lehasad, lehetővé téve az érett fúziós fehérje (azaz a szignálszekvencia nélküli fúziós fehérje) gazdasejtből történő kiáramlását. Szignálszekvencia alkalmazása fehérjék vagy peptidek emlőseredetű sejtből történő szekréciójának lehetővé tétele céljából a technikában ismert eljárás.
Vektor-DNS juttatható be prokarióta vagy eukarióta eredetű sejtekbe hagyományos transzformációs vagy transzfekciós technikák alkalmazásával. A „transzformáció és a „transzfekció kifejezésen számos, a technikában elfogadott eljárást értünk, amely idegen nukleinsav (pl. DNS) gazdasejtbe történő bejuttatására szolgál, többek között kalcium-foszfáttal vagy kalcium-kloriddal történő koprecipitáció, DEAE-dextrán által közvetített transzfekció, lipofekció, elektroporáció, mikroinjekció és vírus által közvetített transzfekció. Gazdasejt transzformálására vagy transzfekciójára alkalmas eljárások találhatóak Sambrook kiadványában [Sambrook és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989)], és más laboratóriumi kézikönyvekben .
Az emlőseredetű sejteknek gyakran csak egy kis frakciója integrálja genomjában az idegen DNS-t. Az ilyen integránsok azonosítása és elválasztása céljából szelekciós jelző (pl. antibiotikum-rezisztencia) génjét juttathatjuk be gazdasejtbe a fúziós fehérjét kódoló génnel együtt. Előnyös szelekciós jelzők többek között azok, amelyek droggal szembeni rezisztenciát, mint például G418-cal, higromicinnel és metotrexáttal szembeni rezisztenciát kölcsönöznek. Szelekciós jelzőt kódoló nukleinsav gazdasejtbe juttatható a fúziós fehérjét kódoló vektorral vagy bejuttatható más vektorral. A bevitt nukleinsavval stabilan transzfektált drogszelekcióval (pl. a szelektálható jelzőgént beépítő sejtek túlélők, más sejtek elpusztulnak).
Rekombináns expresziós vektor transzkripciója és transzlációja megvalósítható ín vitro, például a T7promóter szabályozó szekvenciái és a T7-polimeráz alkalmazásával .
Transzgenikus állatok
A következőkben nem humán jellegű transzgenikus állatok előállítására szolgáló eljárásokat írunk le. DNSkonstrukciók bejuttathatóak emlősállat csíravonalába transzgenikus emlősállat előállítása céljából. Például a konstrukció egy vagy néhány kópiája beépíthető emlősállat embriója genomjába standard transzgenikus eljárások alkalmazásával .
Gyakran szükséges, hogy a transzgenikus fehérje az emlősállat tejében expresszálódjon. Előnyösek azok az emlősállatok, amelyek nagy mennyiségű tejet termelnek, és laktációs periódusuk hosszú. Előnyös emlősállatok a kérődzők, például a szarvasmarha, juh, teve vagy kecske, például Svájcból származó kecskék, például Alpine, Saanen és Toggenburg fajtájú kecskék. Más előnyös állatok többek között az ökör, a nyúl és a sertés.
A találmány példaként említhető megvalósítási módja szerint transzgenikus, nem humán jellegű állatot állítunk elő transzgén nem humán jellegű állat csíravonalába történő bejuttatásával. Embrionális célsejtekbe transzgén bejuttatható különböző fejlődési stádiumokban. Az embrionális célsejt fejlődési stádiumától függően különböző eljárásokat alkalmaznak. Bármely állat esetében az alkalmazott specifikus sejt (sejtvonal·) megválasztásakor lehetőség szerint az általános jó egészségi állapotot, a jó embrióhozamot, az embrióban a pronukleusz jó láthatóságát és a jó reprodukciós képességet.
A fúziósfehérje-transzgén embrióba történő bejuttatása megvalósítható a technikában ismert változatos eljárások bármelyikével, mint például mikroinjektálással, elektroporációval vagy lipofekcióval. Fúziósfehérje-transzgén emlősállatba juttatható például a konstrukciónak a megtermékenyített emlősállat petesejtje (petesejtjei) pronukleuszába történő mikroinjektálással úgy, hogy a konstrukció egy vagy több kópiája a fejlődő emlősállat (emlősállatok) sejtjeiben fennmaradjon. A transzgénkonstrukció megterméke nyített petesejtbe történő bejuttatását követően a petesejt különböző időtartamokig inkubálható in vitro vagy visszaültethető „helyettes gazdába, vagy mindkettőt megtehetjük. Az embriók in vitro inkubálásának egyik hagyományos eljárása az embriók 1-7 napig történő inkubálás, a fajtól függően, és azután a „helyettes gazdába történő visszaültetésük.
A transzgenikus műveleteknek alávetett embriók utódai tesztelhetőek a konstrukció jelenlétére szövetmetszeten végzett Southern-blott analízis végrehajtásával. Exogén módon klónozott konstrukció egy vagy több kópiáját genomjában stabilan beépítve tartalmazó embrió alkalmazható a transzgenikusan hozzáadott konstrukciót hordozó állandó, emlőseredetű alapítására.
Transzgenikusan megváltoztatott emlősállatok utódai születésük után vizsgálhatóak arra nézve, hogy a konstrukció beépült-e a leszármazottak genomjába. Ez végrehajtható úgy, hogy a fúziós fehérjét vagy szegmensét kódoló DNSszekvenciának megfelelő próbát az utód kromoszómaanyagával hibridizáltatjuk. Megállapítottuk, hogy az emlősállatok utódai, amelyek genomjukban a konstrukció legalább egy kópiáját tartalmazzák, érett állapotig felnőnek.
Az utódok közül a nőstények a kívánt fehérjét a tejükben vagy azzal együtt. A transzgenikus emlősállatok tenyészthetőek más, olyan utódok létrehozása céljából, amelyek a kívánt fehérjéket a tejükben termelik.
A transzgenikus nőstények tesztelhetőek a tejbe történő fehérjeszekrécióra, a technikában ismert vizsgálati eljárások, például JVestern-blott vagy enzimatikus mérési eljárás alkalmazásával.
Más transzgenikus állatok
Fúziós fehérje expresszálható sokféle transzgenikus állatban. Transzgenikus sertés előállítására szolgáló előirat található a következő közleményekben: White és Yannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology, 88-94; 5523223. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; 5573933. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; WO93/25071. sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés, és a WO95/04744. sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés. Transzgenikus egér előállítására szolgáló előirat található az 5530177. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban. Transzgenikus patkány előállítására szolgáló előirat található a következő közleményben: Bader és Ganten: Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 3. mell.: S81-S87 (1996).
Transzgenikus szarvasmarha előállítására szolgáló előirat található a következő közleményben: Transgenic Animal Technology, A Handbook, szerk.: Carl A. Pinkert, kiad.: Academic Press, Inc. Transzgenikus nyúl előállítására szolgáló előirat található a következő közleményekben: Hammer és mtsai., Nature 315: 680-683 (1985) és Taylor és Fan, Frontiers in Bioscience, 2: 298-308 (1997).
Transzgenikus fehérje transzgenikus állat tejében történő előállítása
Tej specifikus promóterek
Azok az alkalmas transzkripciós promóterek, amelyek elsődlegesen emlőhámsejtekben aktiválódnak, többek között azok a promóterek, amelyek tejfehérjéket, többek között kazeineket, béta-laktoglobulint [Clark és mtsai., Bio/Technology 2: 487-492 (1989)], savas tejsavófehérje [Gorton és mtsai., Bio/Technology 5: 1183-1187 (1987)] és laktalbumint [Soulier és mtsai., FEBS Letts. 297: 13 (1992)] kódoló géneket szabályoznak. Bármely fajból származó alfa-, béta-, gamma- vagy kappa-kazein-gén promótere alkalmazható emlőben történő expresszió biztosítására; előnyös promoter a kecskeeredetű béta-kazein-gén promótere [DiTullio, Bio/Technology 10: 74-77 (1992)]. Tej specifikus fehérjepromóter vagy promóterek, amelyek specifikusan emlőhámszövetben aktiválódnak, izolálhatóak cDNS-ből vagy genomi szekvenciákból. Előnyösen ezek genomi eredetűek.
DNS-szekvencia-információk hozzáférhetőek az alábbiakban felsorolt emlőmirigy-specifikus gének esetében, legalább egy, de gyakran több szervezet esetében. Lásd például: patkányeredetű α-laktalbumin: [Richards és mtsai., J. Biol. Chem. 256: 526-532 (1981)]; patkányeredetű WAP: [Campbell és mtsai., Nucleic Acids Res. 12 : 8685-8697 (1984)]; patkányeredetű β-kazein [Jones és mtsai., J. Bioi. Chem. 260: 7042-7050 (1985)]; patkányeredetű γ-kazein: [YuLee és Rosen. J. Bioi. Chem. 258: 10794-10804 (12983)]; humán eredetű α-laktalbumin: [Hall, Biochem. J. 242: 735-742 (1987)]; marhaeredetű asl- és κ-kazein-cDNS-ek: [Stewart, Nucleic Acids Res. 12 : 389 (1984)]; marhaeredetű β-kazein: [Gorodetsky és mtsai., Gene 66 : 87-96 (1988)]; marhaeredetű κ-kazein: [Alexander és mtsai., Eur. J. Biochem. 178: 395401 (1988)]; marhaeredetű aS2-kazein: [Brignon és mtsai., FEBS Lett. 188: 48-55 (1977)]; marhaeredetű β-laktoglobulin [Ivanov és mtsai., Biol. Chern. Hoppe-Seyler 369: 425-429 (1988), Alexander és mtsai., Nucleic Acids Res. 17: 6739 (1989)]; marhaeredetű α-laktalbumin [Vilotte és mtsai., Biochimie 69: 609-620 (1987)]. A különböző tejfehérjegének szerkezete és funkciója összefoglalóját lásd: Mercier és Vilotte, J. Dairy Sci. 7 6: 3079-3098 (1993), amely közlemény tartalmára úgy hivatkozunk, mintha teljes terjedelmében a leíráshoz csatoltuk volna, és a kitanítás részét képezi. Ha további szegélyezőszekvenciák (flanking) alkalmazhatóak az expresszió optimalizálásában, az ilyen szekvenciák klónozhatóak a meglevő szekvenciák próbaként való alkalmazásával. Különböző szervezetekből származó emlőmirigyspecifikus szabályozószekvenciákat úgy kaphatunk, ha az ilyen szervezetekből származó könyvtárakat szkrínelünk ismert, közös nukleotidszekvenciákkal vagy antitestekkel.
Szignálszekvenciák
Alkalmazható szignálszekvenciák a tejspecifikus szekvenciák vagy más szignálszekvenciák, amelyek eukariótavagy prokarióta eredetű fehérjék szekrécióját eredményezik. Előnyösen a szignálszekvencia tejspecifikus szignálszekvencia, például olyan gén szignálszekvenciája, amely tejbe szekretálódó terméket kódol. A legelőnyösebben a tejspecifikus szignálszekvencia a találmány tárgyát képező expressziós rendszerben alkalmazott tej specifikus promóterrel rokon. A szignálszekvencia mérete a találmány szempontjából nem kritikus. Csak az fontos, hogy a szekvencia ahhoz elegendő méretű legyen, hogy a kívánt rekombináns fehérje szekrécióját például az emlőszövetben megvalósítsa. Például kazeineket, például alfa-, béta-, gamma- vagy kappa-kazeineket, béta-laktoglobulint, savas tej savófehérjét és laktalbumint kódoló gének szignálszekvenciái alkalmazhatóak a találmány megvalósításában. Előnyös szignálszekvencia a kecskeeredetű β-kazein szignálszekvenciáj a.
Más, szekretálódó fehérjék, például immunglobulinok vagy máj sejtek, vesesejtek vagy hasnyálsejtek által szekretált fehérjék szignálszekvenciái szintén alkalmazhatóak .
Szigetelőszekvenciák
A találmány szerinti DNS-konstrukció ráadásul tartalmaz legalább egy szigetelőszekvenciát. A „szigetelő, „szigetelőszekvencia és „szigetelőelem kifejezéseket felcserélhető módon alkalmazzuk. A szigetelőelem olyan kontrollelem, amely szigeteli a hatókörébe helyezett gének transzkripcióját, azonban nem gyakorol sem pozitív, sem negatív hatást a génexpresszióra. Előnyösen a szigetelőszekvencia a transzkripcióra kerülő DNS-szekvencia bármelyik oldalára beilleszthető. Például a szigetelő pozícionálható a promótertől 5'-irányban körülbelül 200 bp-tól 1 kb-ig, és az adott gén végétől 3'-irányban a promótertől legalább körülbelül 1 kb-tól 5 kb-ig. A szakember számára a szigetelőszekvencia promótertől és az adott gén 3'-végétől való távolsága meghatározható az adott gén és a konstrukcióban alkalmazott promoter és erősítő („enhancer) relatív méretétől függően. Ráadásul a promótertől 5'-irányban és a transzgén 3'-végén két vagy több szigetelőszekvencia pozícionálható. A szigetelő- vagy szigetelők a transzgén 3' végén pozícionálható az adott gén 3'-végén vagy a 3'-irányú szabályozószekvencia 3'-végén, például 3'-irányú nem transzlálódó régió (UTR) vagy 3'-irányú szegélyező (flanking) szekvencia végén.
Előnyös szigetelő az olyan DNS-szegmens, amely a csirkeeredetű β-globin-lókusz 5'-végét övezi, és a csirkeeredetű 5'-irányú konstitutív hiperszenzitív helynek felel meg, amint az a 94/23046. sz. nemzetközi szabadalmi iratban van leírva, amely közlemény tartalmára úgy hivatkozunk, mintha teljes terjedelmében a leíráshoz csatoltuk volna, és a kitanítás részét képezi.
DNS-konstrukciók
Fúziós fehérje expresszálható olyan konstrukció által, amely magában foglal emlőhámszövet-specifikus promótert, például kazeinpromótert, például kecskeeredetű béta-kazein-promótert, tej specifikus szignálszekvenciát, például kazein-szignálszekvenciát, például β-kazeinszignálszekvenciát, és fúziós fehérjét kódoló DNS-t.
A konstrukció tartalmazhat a nem szekretálódó fehérjét kódoló DNS-től 3'-irányban (downstream) 3'-irányú nem transzlálódó régiót is. Az ilyen régiók stabilizálhatják az expressziós rendszer RNS-átiratát, és így növelik a kívánt fehérje hozamát az expressziós rendszerben. A találmány szerinti konstrukcióban alkalmazható, 3'-irányú nem transzlálódó régiók között vannak olyan szekvenciák, amelyek poli-A-szignált biztosítanak. Az ilyen szekvenciák származhatnak például az SV40 kis t-antigénjéből, a kazein 3'-irányú nem transzlálódó régiójából vagy a technikában ismert más, 3'-irányú nem transzlálódó régióból. Előnyösen a 3'-irányú nem transzlálódó régió tejspecifikus fehérjéből származik. A 3'-irányú nem transzlálódó régió hossza nem kritikus, azonban a poli-A-átirata stabilizáló hatása fontosnak látszik az expressziós szekvencia RNS-e stabilizálásában.
Konstrukció tartalmazhat 5'-irányú nem transzlálódó régiót a promoter és a szignálszekvenciát kódoló DNS között. Az ilyen nem transzlálódó régiók származhatnak ugyanabból a kontrollrégióból, mint a promoter, vagy származhat különböző génből, például származhatnak más szintetikus, félszintetikus vagy természetes forrásból. Specifikus hoszszuk itt sem kritikus, azonban hasznosnak látszanak az expresszió szintjének javításában.
Konstrukció tartalmazhat az emlőseredetű hámszövetben elsődlegesen expresszálódó gén N-terminális kódoló régiójának 10%-át, 20%-át, 30%-át vagy nagyobb részét is. Például az N-terminális kódoló régió megegyezhet az alkalmazott promoter, például kecskeeredetű β-kazein N-terminális kódoló régiójával.
A technika állása szerinti eljárások magukban foglalhatják konstrukció elkészítését és tesztelését termék tenyésztett sejtekben történő termelése szempontjából, a konstrukció transzgenikus állatba történő bevitele előtt. Meglepő módon arra a megállapításra jutottunk, hogy ilyen előirat nem rendelkezik előrejelző értékkel arról, hogy normális körülmények között nem szekretálódó fehérje szekretálható-e például transzgenikus állat tejében. így szükséges lehet a konstrukció direkt tesztelése transzgenikus állatban, például transzgenikus egérben, mivel bizonyos konstrukciók, amelyek nem szekretálódnak CHOsejtekben, szekretálódnak transzgenikus állatok tejében.
Tejből történő tisztítás
A transzgenikus fúziós fehérje viszonylag nagy koncentrációban és nagy térfogatban előállítható tejben, normális módon processzált peptid folyamatos, magas szintű termelését biztosítva, ahol a peptid könnyen kinyerhető megújuló forrásból. A technikában ismert néhány különböző eljárás a fehérjék tejből történő izolálására.
A tejfehérjéket rendszerint kombinált eljárások alkalmazásával izolálják. A nyers tejet először frakciónálják a zsírok eltávolítása céljából, például fölözéssel, centrifugálással, ülepítéssel [Swaisgood, H.E., „Chemistry of Milk Protein, Developments in Dairy Chemistry, I. kiad.: Applied Science Publishers, NY (1982)], savas kicsapással [4644056. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat] vagy rennin vagy kimotripszin alkalmazásával történő enzimes koagulálással [Swaisgood, u.o.]. Ezután a fő tejfehérjék frakcionálhatók akár tiszta oldatba hérjék frakcionálhatók akár tiszta oldatba vagy tömeges csapadékba, amelyből az adott, specifikus fehérje könnyen tisztítható.
Az USSN 08/648235 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés oldható tejösszetevő, mint például peptid teljes tejből vagy tejfrakcióból tangenciális áramlási (flow) szűréssel történő izolálására szolgáló eljárást tár fel. A korábbi izolálási eljárásoktól eltérően ez kiküszöböli a teljes tej első, zsír- és kazeinmicellák eltávolítását szolgáló frakcionálását, ezáltal egyszerűsíti az eljárást és elkerüli a kitermelési és a bioaktivitási veszteséget. Ez az eljárás alkalmazható további tisztítási lépesekkel kombinálva szennyezők további eltávolítására és az adott összetevő tisztítására.
Transzgenikus fehérje termelése transzgenikus állat toj ásában
Fúziós fehérje előállítható szövetekben, váladékokban vagy a transzgenikus állat más termékeiben, például tojásban. Például fúziós fehérje termelhető transzgenikus állat, előnyösen pulyka, kacsa, liba, strucc, gyöngytyúk, páva, fogoly, fácán, galamb tojásaiban, és előnyösen transzgenikus csirke tojásaiban, a technikában ismert eljárások alkalmazásával [Sang és mtsai., Trends Biotechnology 12: 415-20 (1994)]. Specifikusan tojásban expresszálódó fehérjéket kódoló gének, mint a tojássárga-fehérje-gének és az albuminfehérje-gének módosíthatóak a fúziós fehérje direkt expressziója céljából.
ΊΟ
Tojásspecifkus promóterek
Alkalmazható transzkripcionális promóterek azok a promóterek, amelyek elsődlegesen tojásban aktiválódnak, többek között azok a promóterek, amelyek a tojás fehérjéit, például az ovalbumint, a lizozimot és az avidint kódoló géneket szabályozzák. Előnyösek a csirkeeredetű ovalbumin, lizozim vagy avidin génjéből származó promóterek. A tojásspecifikus fehérje promóterei vagy a tojásszövetben specifikusan aktiválódó promóterek származhatnak cDNS-ből vagy genomi szekvenciákból. Előnyösen a tojásspecifikus promóterek genomi eredetűek.
A tojásspecifikus gének DNS-szekvenciái a technikában jól ismertek [lásd pl. Burley és mtsai., „The Avian Egg, kiad.: John Wiley and Sons, 472 (1989), amely közlemény tartalmára úgy hivatkozunk, mintha teljes terjedelmében a leíráshoz csatoltuk volna, és a kitanítás részét képezi]. Ha további szegélyezőszekvenciák (flanking) alkalmazhatók az expresszió optimalizálásában, az ilyen szekvenciák klónozhatok a meglevő szekvenciák próbaként való alkalmazásával. Különböző szervezetekből származó tojásspecifikus szabályozószekvenciákat úgy kaphatunk, ha az ilyen szervezetekből származó könyvtárakat szkrínelünk ismert, közös nukleotidszekvenciákkal vagy antitestekkel.
Transzgenikus növények
Fúziós fehérje expresszálható transzgenikus szervezetben, például transzgenikus növényben, például olyan transzgenikus növényben, amelyben a transzgén-DNS-t nukleáris- vagy plasztidgenomba illesztettük. A növények transz71 formációja a technikában jól ismert, lásd általában a következő közleményeket: „Recombinant DNA Part D, Methods in Enzymology 153: kiad.: Academic Press, és az EP 693554. sz. európai szabadalmi bejelentés.
Idegen nukleinsav növényi sejtbe vagy protoplasztba juttatható néhány eljárás alkalmazásával. Például nukleinsav mechanikusan átvihető növényi sejtbe mikroinjektálással direkt módon a mikropipetták alkalmazásával. Idegen nukleinsav növényi sejtbe juttatható poli-etilénglikol alkalmazásával, amely a genetikai anyaggal precipitációs komplexet képez, amelyet a sejt felvesz [Paszkowski és mtsai., EMBO J. 3: 2712-22 (1984)]. Idegen nukleinsav növényi sejtbe juttatható elektroporációval [Fromm és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824 (1985)]. Ezzel az eljárással növényi protoplasztokat elektroporációnak vetnek alá a releváns genetikai konstrukciót tartalmazó plazmidok vagy nukleinsavak jelenlétében. Nagy térerősségű elektromos impulzusok reverzibilisen átjárhatóvá teszik a biológiai membránokat plazmidok bejuttatását lehetővé téve. Az elektroporációnak alávetett növényi protoplasztok a sejtfalat újra kialakítják, osztódnak, és növényi kalluszt képeznek. A transzformált génnel transzformált növényi sejtek szelekciója végrehajtható fenotípusos jelzők (marker) alkalmazásával.
Karfiol-mozaikvírus (CaMV) alkalmazható vektorként idegen nukleinsavak növényi sejtekbe történő bejutatására [Hohn és mtsai., Molecular Biology of Plant Tumors, kiad.: Academic Press, New York 549-560 (1982); Howell, 4407956.
amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat]. A virális CaMV-DNS-genomot a „szülői (parent) bakteriális plazmidba helyezzük, olyan rekombináns DNS-molekulát alkotva, amely baktériumokban szaporítható. A rekombináns plazmid további módosításoknak vethető alá a kívánt DNSszekvencia bevitelével. A rekombináns plazmid módosított virális részét ezután kivágjuk a szülői bakteriális plazmidból, és a növényi sejtek vagy növények beoltásában alkalmazzuk.
Kis részecskék nagy sebességű ballisztikus penetrációját alkalmazhatjuk idegen nukleinsavak növényi sejtekbe történő bejuttatására. Nukleinsavakat helyezünk el kis gyöngyök vagy részecskék mátrixában vagy felszínén [Klein és mtsai., Nature 327: 70-73 (1987)]. Jellemző módon az új nukleinsav-szegmens egyetlen alkalommal történő bevitele szükséges, azonban az eljárás többszöri bevitelt is lehetővé tesz.
Nukleinsav növényi sejtbe juttatható a növényi sejtnek, explantátumnak, merisztémának vagy magnak a nukleinsavval transzformált Agrobacterium tumefaciens-sel történő fertőzésével. Alkalmas körülmények között a transzformált növényi sejteket hajtások, gyökerek formálása céljából növesztjük, és tovább fejlesztjük növényekké. A nukleinsavak növényi sejtbe juttathatóak például az Agrobacterium tumefaciens Ti-plazmidja által. A Ti-plazmid a növényi sejtekbe jut át Agrobacterium tumefaciens-sel történő fertőzéskor, és stabilan integrálódik a növényi sejt genomjában [Horsch és mtsai., „Inheritance of Functional Foreign Genes
- 73 in Plants, Science 233: 496-498 (1984); Fraley és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 0 : 4803 (1983) ] .
Az olyan növények, amelyekből protoplasztokat izolálhatunk és tenyészhetünk teljes, regenerált növények elérésére, transzformálhatóak úgy, hogy az átvitt idegen gént tartalmazó, teljes növény visszanyerhető. Alkalmas növények többek között például a Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Hyiosciamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciohorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhium, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Sorghum és Datura nemzetségekből származó fajok.
Növények tenyésztett protoplasztokból történő regenerálásának leírását találjuk a következő közleményekben: Evans és mtsai., „Protoplast Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Cultures jL: 124-176, kiad. : MacMillan Publishing Co., New York (1983); Davey, M.R., „Recent Development in the Culture and Regeneration of Plant Protopasts, Protoplast - Lecture Proceedings, 12-29, kiad.: Birkhauser, Basel (1983); Dale, P.J., „Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops, Protoplast - Lecture Proceedings, 3141 kiad.: Birkhauser, Basel (1983), és Binding, H.,
- 74 „Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, 21-73, kiad.: CRC Press, Boca Raton (1985).
A protoplasztból történő regenerálás fajról fajra változik, azonban általában először az exogén szekvenciát tartalmazó transzformált protoplaszt-szuszpenziót állítjuk elő. Bizonyos fajokban a protoplaszt-szuszpenzióból embrió kialakulása indukálható, a természetes embriókhoz hasonlóan az érés stádiumáig. A tápközeg tartalmazhat különböző aminosavakat és hormonokat, mint például auxinokat és citokinineket. Előnyös lehet, ha a tápközeghez glutaminsavat és prolint adunk, különösen az olyan fajoknál, mint a kukorica és a lucerna. A hajtások és a gyökerek normális körülmények között egyidejűleg fejlődnek ki. A hatékony regenerálódás a tápközegtől, a genotípustól és a tenyészet múltjától függ. Ha ezeket a változókat szabályozzuk, a regenerálódás teljes mértékben reprodukálható és megismételhető .
Vegetatív módon szaporított állomány esetében az érett transzgenikus növényeket szaporíthatjuk dugványok vételével vagy szövettenyésztési eljárásokkal több, azonos növény kísérletek céljára történő előállítására, például termelési jellemzőkre történő tesztelésre. A kívánt transzgenikus növény kiválasztása így történik, és így új változatokat kapunk, amelyeket kereskedelemi forgalomban történő eladás céljából vegetatív módon szaporítjuk. Magról szaporított állományok esetében az érett, transzgenikus növényeket önmegporzásnak vetjük alá (önkeresztezés, „self cross) homozigóta, beltenyésztett növények létrehozása céljából. A beltenyésztett növények olyan magokat hoznak, amelyek tartalmazzák az újonnan bevitt idegen génaktivitási szintet kódoló gént. Ezek a magok esiráztathatóak és felnöveszthetőek a kiválasztott fenotipussal rendelkező növények előállítása céljából. A találmány szerinti beltenyésztett példányok alkalmazhatóak új hibridek kifejlesztésére. Ebben az eljárásban kiválasztott beltenyésztett vonalat keresztezünk más beltenyésztett vonallal a hibrid előállítása céljából .
A transzgenikus növényből nyert részek, mint a virágok, magok, levelek, ágak, gyümölcsök, és ehhez hasonlóak a szintén a találmány tárgyát képezik, feltéve, hogy ezek a részek magukban foglalnak ilyen módon transzformált sejteket. A regenerált növények leszármazottjai és változatai szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak, feltéve, hogy ezek a részek tartalmazzák a bevitt DNS-szekvenciákat. A regenerált növények leszármazottjai és változatai szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.
Transzgenikus növények vagy növényi sejtek kiválasztása alapulhat vizuális megfigyelésen, mint például a színváltozások megfigyelése (pl. fehér virág, változó pigmenttermelés, és egyforma színmintázat vagy szabálytalan mintázatok), azonban az enzimaktivitás biokémiai mérési eljárásai vagy a termésmennyiség meghatározása is szerepet játszhat. A transzgenikus növényeket vagy növényi sejteket a lényeges növényi részt hordozó növényekké növesztjük, és a génaktivitásokat, megfigyeljük, például vizuális megfigyeléssel (flavonoidgénekre) vagy biokémiai mérési eljárá sokkal (Northern-blottok, Western-blottok, enzimes mérési eljárások és flavonoidösszetevők vizsgálata, többek között spektroszkópia) [lásd: The Flavonoids, 1. és 2.., szerk.: Harborne és mtsai., kiad.: Academic Press.] Az alkalmas növényeket kiválasztjuk és további értékelésnek vetjük alá. Genetikai műveleteknek alávetett növények előállítására szolgáló eljárások további leírásához lásd: 5283184. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, az 5482852. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, és az EP 693554. sz. európai szabadalmi bejelentés, amely közlemények tartalmára úgy hivatkozunk, mintha teljes terjedelmében a leíráshoz csatoltuk volna, és a kitanítás részét képezik.
Az alábbi példák a találmány szerinti megoldás további illusztrálását szolgálják, de nem szűkítik az oltalmi kört. Minden hivatkozást (többek között az irodalmi hivatkozásokat, a megadott szabadalmak leírásait, a közzétett szabadalmi bejelentéseket és az egyidejűleg függőben levő szabadalmi bejelentéseket) a szabadalmi iraton belül úgy idézünk, mintha teljes terjedelmében a leíráshoz csatoltuk volna, és azok a kitanítás részét képezik.
Az alább leírt 1. és 2. példák két konstrukció: egy könnyűlánc-konstrukció és egy nehézlánc/p-glükuronidáz fúziós konstrukció előállítását írják le. Két konstrukciót a Behringwerke AG-tól kaptunk: az egyik antitest-nehézlánc/humán eredetű β-glükuronidáz fúziós fehérjét, a másik kappa-könnyűlánc-szekvenciát tartalmazott.
1. Példa
A könnyűlánc-konstrukció (LC) szerkesztése
Az 1. példa leírja a könnyűlánc-nukleinsavkonstrukció létrehozását, amelyet emlőspecifikus expressziós vektorba {Bcl63) és kereskedelmi forgalomban kapható, emlőseredetű expressziós vektorba {pcDNA3) szubklónozott, 431-es számú karcinoembriotikus antigén elleni humanizált monoklonális antitestből származó könnyűlánc-nukleotidszekvencia alkalmazásával állítottunk elő.
Röviden: a könnyűláncot tartalmazó Hind III - Eco RIfragmenst pGEM3z-be klónoztuk a további műveletek lehetővé tétele céljából. Két mutációt készítettünk:
a) Sal-I, Xho-I és Kozak-konszenzusszekvenciák létrehozása céljából a kódoló régió elején; és
b) Sal-Z-hely létrehozása céljából közvetlenül a terminációs kodon után.
Az eredeti konstrukció megközelítőleg 1300 bázis méretű ismeretlen szekvenciát tartalmazott. Az ismeretlen szekvenciák eltávolítása céljából a „gapped heterduplex eljárást alkalmaztuk a SaZ-Z-hely létrehozására közvetlenül a terminációs hely után. A közvetlenül a terminációs kodon előtti Sac-Z-helyeket és az Eco RZ-helyet alkalmaztuk a hézag {gap) kialakítására, amely hézagot Kienow-ΐragmens, dezoxi-nukleotidok, T4-DNS-ligáz és a következő oligonukleotid alkalmazásával töltöttünk fel:
TGT TAG AGG TCG ACG CCC CAC (21. a. sz.) term Sal I
A hézag-régiót (a terminációs kodonontól az új Sal Ihelyig) ezután szekvenálásnak vetettük alá annak megerősítése céljából, hogy a szekvenciában nem történt változás.
Egy második Nco-J-helyet találtunk az ismeretlen szekvenciában, amelyet eltávolítottunk az alábbiakban leírásra kerülő, következő lépés céljából. A hely eltávolítása céljából az új Sál-T-helyet tartalmazó konstrukciót EcoRT-gyel emésztettük, a végeket Klenow-fragmenssel és dezoxi-nukleotidokkal feltöltöttük, és Sál-I-kapcsolóhoz (New England Biolabs) kapcsoltuk ligálással, rutinszerű kísérleti eljárásokat követve. A két Sal-J-helyet tartalmazó konstrukciót ezután Sal-T-gyel emésztettük és ligálással újra összekapcsoltuk, ezáltal a második Nco-I-helyet tartalmazó ismeretlen szekvenciát eltávolítva.
Ezután Sal-J-helyet és Kozak-konszenzus-szekvenciát illesztettünk közvetlenül a kezdő metioninkodon elé (ahelyett, hogy egyszerűen megváltoztattuk volna a Hind-IIIhelyet), mivel a megfelelő startkodon előtt volt néhány ATG-szekvencia, amelyek lehetséges alternatív starthelyekként alkalmazhatóak voltak. Ezek az ATG-szekvenciák nem jelentettek problémát szövettenyészetekben, a legbiztonságosabb eljárás volt e régiók eltávolítása. Eltávolítottuk ezeket az ATG-szekvenciákat a Hind-III - Nco T-helyek kivágásával és a Sal-I, Xho-I- és Kozak-konszenzusszekvenciákat tartalmazó adapterrel helyettesítésével. A helyettesített régiót szekvenálással történő ellenőrzéssel is megerősítettük .
A szekvenciaváltozások a következők voltak:
Az eredeti 5'-kiindulási régió nukleotidszekvenciája a következő volt (az ATG-szekvenciákat nagy betűkkel, az kiindulási metioninhoz tartozó ATG-t félkövér betűkkel jelöltük):
aagctt ATG aat caaatcctgctc ATG aat ATG caaatcctctga atctac ATG gtaaatataggtttgtctataccacaaacagaaaaac ATG agat cacagttctctctacagttactgagcacacaggacctcacc ATG (22. a. sz.)
Az eredeti szekvenciát a következő, helyettesítési szekvenciával helyettesítettük:
Hind-III Sal-I Xho-I
AAGCTT
GTCGAC CTCGAG CCACCATG
Kozak-konszekzusszekvencia (23. a. sz.)
A könnyűlánc teljes kódoló régióját tartalmazó Sal-Ifragmenst az emlőspecifikus Bel 63 expressziós vektor és a kereskedelmi forgalomban beszerezhető, emlőseredetű rendszerben alkalmazható pcDNA3 Xho-I-helyére szubklónoztuk. Az orientációt restrikciós enzimmel történő analízissel és/vagy szekvenálással határoztuk meg. Az ΙΑ-ábra a könnyűlánc-konstrukció vázlatos ábrája (431A). A nukleotid- és aminosav-szekvenciákat az IB-ábrán mutatjuk be. A 2. ábra humanizált, karcinoembriotikus antitest-elleni 431-es antitest könnyűlánca kódoló szekvenciáját tartalmazó Sal-Iinszert („insert) nukleotidszekvenciáját mutatja be. A 3. ábrán bemutatott vázlatos ábra a Bc458-as konstrukció vázlatos ábrája, amely a humanizált karcinoembriotikus antitest-elleni 431-es antitest könnyűlánca kódoló szekvenciáját tartalmazó Sal-J-inszertet („insert) tartalmazza. Jelzi a β-kazein némitó („silencer) 5'-irányú nem transzlálódó régiója elhelyezkedését, a könnyűlánc kódoló régióját, és a β-kazein 3'-irányú nem transzlálódó régiója elhelyezkedését is.
2. Példa
A nehéz1ánc/β—glükuronidáz—fúziós konstrukció szerkesztése
A 2. példa a nehézlánc^-glükuronidáz-fúziós konstrukció létrehozását írja le, amelyet az emlőspecifikus Bcl63-as expressziós vektorba és a pcDNA3-as, kereskedelmi forgalomban beszerezhető, emlőspecifikus expressziós vektorba szubklónozott, humanizált karcinoembriotikus antitest-elleni 431-es antitest nehézlánca alkalmazásával készítettünk el.
A nehézlánc^-glükuronidáz-fúziós szekvenciát pGEM3zbe klónoztuk további műveletek lehetővé tétele céljából. Három mutációt helyeztünk el a nehézlánc^-glükuronidázfúziós konstrukció kódoló régiójában:
a) a kódoló régió elején Sal-I, XHO-I és Kozakkonszenzusszekvencia létrehozására;
b) a belső Sal-T-helynél a szekvencia megváltoztatására, a helyes szekvencia megtartásával;
c) a terminális kodon után közvetlenül Sal-I—hely létrehozására.
A könnyűlánc esetében alkalmazott szignálszekvenciát alkalmaztuk a nehézláncnál is. A Hind-III és az Nco-Ihelyeket újra eltávolítottuk, és a könnyűláncnál alkalmazott oligonukleotidokkal helyettesítettük Sal-I- és Kozakkonszenzusszekvencia létrehozása céljából közvetlenül a kiindulási metioninkodon előtt (lásd fent).
A belső Sal-I—helyet meg kellett változtatnunk a fragmens β-kazein-expressziósvetorba történő szubklónozása céljából.
Asn Gly Val Asp Thr Leu (24. a. s z
eredeti szekvencia AAT GGG GTC GAC ACG CTA (25. a. sz
új szekvencia GTG GAT (26. a. sz
Val Asp
A 3'-irányú szegélyező szekvencia két poliadenilációs szignált és a transzlációs stopkodon és az XbaT-hely között 16 adeninból álló „füzért tartalmazott. Ezek eltávolítása céljából Sál-J-helyet építettünk be közvetlenül a stopkodon után.
Phe Thr ***
eredeti szekvencia TTT ACT TGA GCA AGA CTG 27. a. sz
új szekvencia TTT ACT TGA GGT CGA CTG 28. a. sz
Sal-I
A gapped heteroduplex-eljárást alkalmaztuk a fenti változtatások végrehajtására. Az eredeti tervünk az volt, hogy az Not-T- és az Xba-T-helyek között a DNS-ben hézagot képezünk, és egyidejűleg megváltoztatjuk a belső Sal-Ihelyet és a 3-inditó (prime) Sal-T-helyet adunk hozzá. Ennek végrehajtása bonyolultnak mutatkozott, így először a 3indító (prime) Sal-T-helyet adtuk hozzá, és új hézagot képeztünk a két Sgl-TT-hely között a belső Sal-T-hely cseréje céljából. A hézaggal ellátott régiókat ezután teljes szekvenálásnak vetettük alá annak megerősítésére, hogy a szekvenciában nem történt változás. Csak egy változást találtunk a negyedik intronban, a kezdő ATG-tól 1673 bázis távolságra. Citozint találtunk adenin helyett az eredeti és a mutált plazmidban is, amint az a fenti, nyomtatott szekvenciában látható. A nehézlánc-glükuronidáz-fúziósfehérje teljes kódoló régióját tartalmazó Sál -T-fragmenst ezután a Bcl63-as, emlőspecifikus expressziós vektorba, és pcDNA3ba, egy kereskedelmi forgalomban beszerezhető, emlősrendszerekben alkalmazható expressziós vektorba szubklónoztuk. Az orientációt restrikciós enzimekkel történ ő analízissel és/vagy szekvenálással határoztuk meg.
A 4A-ábra a nehézlánc-konstrukció (431A) vázlatos ábrája. A nukleotidszekvenciákat és az aminosav-szekvenciákat a 4B-ábrán mutatjuk be.
3. Példa
Kapcsolt konstrukciók létrehozása
Ebben a példában olyan konstrukció létrehozását írjuk le, amely tartalmazza a nehézlánc/p-glükuronidáz-fúziósfehérjét, a megfelelő 3'-irányú (upstream) és 5'-irányú (downstream) béta-kazein-szekvenciákat, ligálással egyetlen kozmidban összekapcsolva.
Mindkét láncot, a megfelelő 3'-irányú (upstream) és 5'-irányú (downstream) béta-kazein-szekvenciákkal egyetlen kozmáddá kapcsoltuk össze ligálással, annak elkerülésére, hogy a koinjektálással egérbe vagy más fajú állatba juttatott kétláncú fehérje esetében (mint amilyen az antitest) csak egy lánc integrálódjon.
Ennek elérésére ezt a supercos-l-et (Stratagene) módosítottuk úgy, hogy a következő oligonukleotidokat a BamBT-helyekre beillesztettük:
Pvu-I Pvu-I
T3... GAT CAC CGA TCG TCG ACC TCG AGC GAT CGA ...T7 29. a. sz.
TG GCT AGC AGC TGG GCG AGC TCG CTA GCT ACT AG 30. a. sz.
Sal-I Xho-I
Ezek a módosítások új supercos-plazmidot hoznak létre, amelyet supercos-224-nek neveztünk el, és amely egyedi Sal-I- és Xho-J-helyekkel rendelkezik. Pvu-I, Not-I és EcoBT-helyek szegélyezik ezeket a helyeket, és a Bam-KT-hely megsemmisült.
A Bel 74-ből vagy Bel 75-ből származó Sál-T-fragmenseket, amelyek a módosított nehézlánc/p-glükuronidáz kódoló régióját tartalmazza a béta-kazein 5-prime- és 3prime-szegélyező szekvenciák között, az supercos-334 Xho-Ihelyére illesztettük. Három kiónt izoláltunk és tisztítással előállítottunk. Az orientációt restrikciós enzimmel történő analízissel határoztuk meg.
klón név inszert („insert) orientáció
1 LC14 LC reverz
2 LC13 LC szenz
11 HC9 HC reverz
A Bel 74-ből és a Bel 75-ből származó (fent alkalmazott) komplementer Sal-T-fragmenseket ezután a fenti konstrukciók Sál-T-helyére kapcsoltuk ligálással (A nehézláncfragmenst az LC13-ba és BC14-be, a könnyűláncf ragmenst a BC9-be). Az eredményül kapott, ligáit molekula eléggé nagy volt ahhoz, hogy ín vitro lambdafág-részecskékbe pakoljuk (Amersham reagenskészlet, 334. sz.) és E. coli XL-Bue fertőzésében alkalmaztuk. Három változatot állítottunk elő és mindegyik klónból egyet izoláltunk és előállítottunk:
klón név inszert („insert) orientáció
1 Bcl80 HC/LC reverz/szenz
9 BC181 HC/LC szenz/szenz
20 Bcl82 LC/HC reverz/reverz
A Bel 81 és a Bel 82 alapvetően ugyanazt a inszertet tartalmazza a vektorból kivágva, noha két különböző reakciósorral állítottuk elő. Szenz orientációban nézve mindkettő tartalmazza a nehézlánc/p-glükuronidáz Sal-I-kazettát, melyet a könnyűlánc Sál-T-kazetta követ, és ezek kapcsoltak. Mindegyik Sál-T-kazetta tartalmazza a béta-kazein 5-primepromóter-régióját, az antitestet kódoló régiót és a bétakazein szegélyező 3-príme-régióját.
Alapvetően kétféle konstrukciót készítettünk el: a könnyűlánckazetta-nehézlánckazetta és a nehézlánckazettakönnyűlánckazetta változatokat.
4. Példa
A könnyűlánckazetta-és nehéz lánckazetta/βglükuronidáz-konstrukciók jellenzése
A genetikai műveleteknek alávetett DNS-fragmenseket szövettenyészetekben teszteltük a fent leírt pcDNA3konstrukció alkalmazásával, amellyel Cos-7-sejteket fertőztünk, a Lipofectamine-ra és az OPTI-MEM-re (Gibco-BRL) vonatkozó standard előiratok alkalmazásával. A kondicionált tápközeget (DMEM+10% FBS) 48 óra elteltével távolítottuk el, és 10-20%-os SDS-PAGE-géleken megfuttattuk Westernblott analízis céljából.
A Western-blott analíziseket standard eljárások alkalmazásával hajtottuk végre. Röviden a nehézlánc/bétaglükuronidáz esetében a mintákat háromszorosan megfuttattuk redukáló körülmények között, és elektroblottolással nitrocellulózra vittük. A nitrocellulózt ezután három rész re vágtuk, és ezeket egy éjszakán át a következő monoklonális antitestekkel inkubáltuk: Mab 2149/80, Mab 2156/94 és Mab 2156/215. A detektálásban alkalmazott másodlagos antitest (Cappel, kát. sz.:55570) affinitási tisztításnak alávetett, tormaeredetű peroxidázzal konjugált, kecskeeredetű, egérelleni IgG. A detektálást az Amersnamtól beszerzett ECL-reagenskészlettel hajtottuk végre. Western-blotton csak az Mab 2149/80 antitest adott jelet.
A könnyűlánc esetében a mintákat szintén redukáló körülmények között futtattuk meg és nitrocellulózra vittük elektroblottolással. A nitrocellulózt ezután egy éjszakán át inkubáltuk tormaeredetű peroxidázzal konjugált, kecskeeredetű, humán-elleni Kappa-lánc-antitesttel (Cappel, kát. sz. :55233). A detektálást az Amersham-tól beszerzett ECLreagenskészlettel hajtottuk végre.
5. Példa
Transzgenikus állatok előállítása
Mikroinjekciós célokra fragmenseket állítottunk elő a Bcl74-es (könnyűlánc) és Bcl75-ös (nehézlánc) béta-kazeinkonstrukciók Sal-T-gyel történő hasításával a bakteriális szekvenciák felszabadítása céljából. A fragmenseket gélben tisztítottuk, azután a Promega Wrzard-rendszere alkalmazásával koncentráltuk és a puffért lecseréltük.
Az eredeti nukleotidszekvenciák mikroinjekciós mintáit egér-modellrendszerben teszteltük a kecskeeredetű bétakazeint 3'-irányban (upstream) és a kódoló szekvenciát tartalmazó expressziós rendszer alkalmazásával. Két külön konstrukciót készítettünk és koinjektáltuk egérembriókba, amelyekből alapító sejtvonalakat azonosítottunk és további vizsgálatoknak vetettünk alá. Az eredeti DNS-szekvenciákat koinjektáltuk szigetelőszekvenciákkal is, amelyek lehetővé teszik jobban termelő állati eredetű sejtvonalakban történő, nagyobb százalékos termelés elérését. Például a szigetelő nélkül általában három vonal közül egy lenne viszonylag jó termelő. A szigetelővel sok esetben szinte mindegyik, előállított sejtvonal magas szinten termelő sejtvonal .
Két injektálási sorozatot hajtottunk végre a következők szerint:
Az első sorozat céljára 1249 embriót injektáltunk, amelyek közül 838 életben maradt, és 737-et álvemhes nőstényekbe vittünk át. A nőstények 80 élő kölyköt világra hoztak, amelyek közül 8 transzgenikus volt, és 7 mindkét láncot hordozta.
A második injektálási sorozatban 508 embriót injektáltunk, amelyek közül 435 életben maradt, és 426-ot álvemhes nőstényekbe vittünk át. A nőstények 44 élő kölyköt világra hoztak, amelyek közül 2 volt transzgenikus, és mindkettő hordozta mindkét láncot.
Bcl81-et injektáltunk három napon át. Ebben a sorozatban 840 embriót injektáltunk, amelyek közül 641 életben maradt, és 618-at álvemhes nőstényekbe vittünk át. A nőstények 39 élő kölyköt világra hoztak, amelyek közül 5 volt transzgenikus, és 3 közülük mindkét láncot hordozta. Úgy tűnik, hogy a béta-kazein-szekvenciák szegélyező régiói repetíciója következtében bizonyos esetekben az egyik vagy másik lánc delécióját okozó rekombináció lép fel.
Bcl81-et injektáltunk a némító („silencer) szekvenciákkal együtt négy napon át. Ebben az esetben 1495 kecskeembriót injektáltunk, amelyek közül 1183 életben maradt, és 1073-at vittünk át álvemhes nőstényekbe. Ezek közül a nőstények 111-et élve hoztak világra, 10 volt közülük transzgenikus. és 6 mindkét hordozta, a némitófragmenst és mindkét antitestláncot.
5. Példa
A nehézlánc/p-glükuronidáz-fúziősfehérje mutánsai előállítása
Az aktív molekulák expressziója növelése céljából a nehézlánc-fúziós fehérje két mutációját készítettük el. Az első mutáció a konstrukció csuklórégiója eltávolítása volt. A második mutáció esetében eltávolítottuk a csukló- és a kapocsszekvenciákat (ala-ala-ala-ala-val) (31. a. sz.) a βglükuronidáz kódoló szekvenciája elején, a CH2-részt így a β-glükuronidázzal fuzionáltatva.
Ennek megvalósítására újra a gapped heteroduplex mutagenezist alkalmaztuk. A Behring HC5-konstrukciót (amely tartalmazza a pGem3Z-ben a fúziós fehérjét, mindkét végén módosítva, és a belső Sal-T-helyet eltávolítva) linearizáltuk Xba-T-gyel. A konstrukció egy kisebb részét BstE2-vel és Not-T-gyel felvágtuk. Együtt forralva és lehűtve ezeket mindkét lánc közül néhány annelál, egyláncú hézagot tartalmazó heteroduplexet kialakítva, ebben az esetben a BstE2 és a Not-I-helyek között. Két új konstrukciót készítettünk, amelyeket a hézagot képező részen szekvenáltunk, annak biztosítására, hogy nem okoztunk véletlen mutációkat.
GTC#403: A „Behr hinge-alternate (kapocshelyettesítő) (alább félkövér betűkkel) alkalmazásával eltávolítottuk a kapocsrégiót és a közvetlenül előtte és utána található intronok egy részét is.
ccaaactctctactcACTCAGCTCA CGCATCCACCtccatcccagatccccgt 32. a.sz. intron intron
GTC#406: A „Behr hinge/linker (csukló/kapocs) (alább félkövér betűkkel) oligonukleotid alkalmazásával eltávolítottuk a csuklórégiót és az ala-ala-ala-ala-val-kapcsolót, a CH2-t és a β-glükuronidázt kódoló régiók fuzionáltatásával.
agcaacaccaaggtgGACAAGAGAGTT CAGGGCGGGATGctgtacccccaggag 33. a.sz. CH2-t kódoló szekvencia β-glükuronidáz
A mutációnak alávetett fúziós fehérjét kódoló szekvenciát kivághatjuk Sal-I alkalmazásával és alkalmas expressziós vektorba szubklónozhatjuk.
A kódolt fehérje magas szintű expresszióját kaptuk némítófragmenst („silencer) (vagy szigetelőiragmenst, insulator) tartalmazó vektorral, amelyet a kecskeeredetű béta-kazein-promóter, DNS-inszert („insert) és kecskeere detű béta-kazein 3-prime nem transzlálódó régiója követ. Mindkét mutáns nehézláncot és könnyűláncot ilyen vektorba, a Bc450-be szubklónoztuk, amelyet a Sal-T-helyek szegélyeznek, és amelyből a teljes, injekciós célú fragmenst szabadítható fel.
Bc454: Bc450 a 403-as (minus hinge, csukló nélküli) nehézláncmutánssal
Bc456: Bc450 a 406-os (minus hinge/linker, csukló/kapocs nélküli) nehézláncmutánssal
Bc458: Bc450 a könnyűlánccal
Az 5. ábra a 431-es, karcinoembriotikus antigén elleni, csuklórégió nélküli humanizált antitest mutáns nehézlánca aminosav- és nukleotidszekvenciáját mutatja be.
A 6. ábra a 431-es, karcinoembriotikus antigén elleni, csuklórégió nélküli humanizált antitest mutáns nehézláncát β-glükuronidáz-szekvenciához kapcsolva tartalmazó konstrukció (Be 454) vázlatos ábrája. A némító („silencer), a β-kazein 5'-irányú nem transzlálódó régiója, a nehézlánc/^-glükuronidáz-fúziósfehérjét kódoló régió és a β-kazein 3'-írányú nem transzlálódó régiója elhelyezkedését is feltüntettük.
6. Példa
Transzgenikus állatok jellemzése
Az előző példák az eredeti fúziós fehérje és két nehézláncmutáns tejben történő expresszióval jellemezhető expressziós rendszerben történő tesztelését írja le. Az eredeti fúziós fehérjék közül mindkettőt a szigetelőszekvencia nélkül teszteltük, és különálló szigetelőfragmenssel együtt injektáltuk. Másrészt a nehézláncmutánst a konstrukcióba integrált szigetelővel együtt teszteltük.
Kezdetben a tejben termelt fúziós fehérje koncentrációját úgy becsültük meg, hogy JVestern-blotton a minták által adott jelet standarddal összehasonlítottuk. Később kísérletileg meghatározott aktivitást alkalmaztunk Westernblott-alapú koncentrációk helyett. Az aktivitásmérések pontosabbak voltak.
Az első konstrukciók (Bel 74 és Bcl75) kivételével a fehérjekoncentráció íVestern-blott alkalmazásával történő meghatározása durva becslés. Általában úgy tűnik, hogy a vonalak az 1-2 mg/ml-es tartományban expresszálnak.
Az expressziós adatokat az alábbiakban foglaljuk öszsze, minden, csatolt konstrukció esetében részletesebb adatokkal .
Konstrukció DNS Szigetelő Western (HC) pg/ml becsült Maximális aktivitás pg/ml
BC174/BC175 Eredeti nincs -800 20
BclBl eredeti, kapcsolt nincs 1000-2000 Na
Bcl81+sziget elő eredeti, kapcsolt koinjektált fragmens -1000 100
Bc456/Bc458 csuk- ló/kapocs nélküli csukló nélküli van 1000-2000 8
Bc454/Bc458 van 1000-2000 800
Az itt bemutatott eredmények azt jelzik, hogy magas szintű fehérjetermelés valósítható meg tejben, azonban a fehérjék nagy része inaktív. Az ilyen inaktivitás folding (hajtogatódási) vagy a tetramer összekapcsolódásában mutatkozó problémákra vezethető vissza. A csuklórégió és a kapocsrégió eltávolítása kis aktivitású fehérjét eredményezett. Ezzel szemben jelentős mennyiségű enzimaktivitást értünk el csak a csuklórégió eltávolításával.
Megközelítőleg 8 mg fehérje termelődött egerekben. Az izolált fehérje jelenleg is tart in vivo vizsgálatokban („humán eredetű CEA-pozitív vastagbélrák-metasztázismodell).
Az alábbiakban az előállított egerekre és a vizsgálatokra vonatkozó adatokat foglaljuk össze táblázatos formában .
A. Bel 74/175-alapítók
Eredeti DNS szigetelő nélkül
Vonal 2. gén. Nem PCR Kópia Western pg/ml Aktivitás pg/ml*
LC HC LC HC HC
2 F 4- + 10 10 — 0.14
4 F + + 1 1 — <0.1
10 F + + 10 10 -800 18
12 F + + -800
22 F + + 10 10 <0.1
154 F + + -800
23 F + + 50 10 -400 4
200 F + + 0.0
40 M + + 100 100 — <0.1
62 F + + + + — <0.1
81 M + -- — -- n. a.
85 F + + 25 25 ---n. a. .3
116 M + + 5 5
216 F + + -800
221 F + + -800 1
n. a.: nem vizsgáltuk (a vonal csak az egyik láncot hordozza)
B. Bei81-alapitők
Az eredeti DNS szigetelő nélkül, a Bcl74-es és Bcl75ös injektálási célú fragmens fúziója
PCR Kópia Western pg/ml (kb. ) Aktivitás pg/ml*
Vonal FI Nem LC HC LC HC HC
6 M + + 12 12
49 F 0.0
50 F 0.0
52 F >1000 39
60 F >1000 41
25 F + + 15 15 0.0
29 F — + n. a. n. a. 0.0
33 M — + n. a. n. a. n. a.
36 F + + 100 100 0.0
n. a.: nem vizsgáltuk
C. Bcl81 +szigetelő alapítók
Eredeti DNS (a Bcl74 és a Bcl75 injektálási célú fragmensek fúziója) szigetelővel ko-injektálva
PCR Kópia Western pg/ml (kb. ) Aktivi- tás pg/ml*
vonal 2 . gén nem LC HC sil. LC HC sil. HC
9 M + n. a. 0 1 — n. a.
13 M + — n. a. 2 0 -- n. a.
15 F + — n. a. 3 0 — n. a.
33 F + + n. a. 3 3 — -800
40 M -- + n. a. 0 2 — n. a.
58 M + + n. a. 2 10 __
2-139 F + + — -800 43
2-140 F + + — -800 31
66 F + + n. a. 1 1 +
78 F + + n. a. 1 1 — 0.0
81 M + + n. a. 1 1 — nem pass.
90 M + + n. a. 20 20 +
2-123 F + + + -1000 -100
2-124 F + + + -1000 60
2-126 F + + -- ala- csony 15
n. a.: nem vizsgáltuk
D. Bc456+Bc458 alapítók
A csukló- és a kapocsrégióban hiányos mutánsok:
1. generáció 2. generáció nem Western-HC aktivitás pg/ml
6 F nincs 0
8 F 0
13 F nincs 0
18 F 0
24 F nincs 0
57 F jó 2
65 F jó 8
66 F alacsony 0
138 M
175 F
152 F nincs 0
- 97 E. Bc454+Bc458
Csak a csuklórégió eltávolításával előállított mutációk:
1. generá- ció 2. gene- ráció 3. gene- ráció nem Western-HC aktivitás pg/ml
162 elpusz- tult c-metszet F —
4 F magas 66
180 F jó 177
11 F 133
12 F 185
182 M —
15 F jó 83
187 M nincs génát- vitel
193 M —
27 F magas
57 F 838
58 F 829
59 F 742
60 F 944
61 F 574
62 F 752
201 F jó 534
215 F 416
219 M — (elpusztult)
F
220 M --
F
7. Példa
Transzgenikus kecskék előállítása és jellemzése
Az alábbiakban ismertetésre kerülő részben röviden leírjuk a transzgenikus kecskék előállításának főbb lépéseit .
Kecskefajok és fajták
Svájci eredetű kecskék, például az alpesi, a Saanen és a Toggenburg fajták előnyösek a transzgenikus kecskék előállításában.
Kecske-szuperovuláció
A donorok nemi ciklusának időzítését a 0. napon 6 mg szubkután módon alkalmazott norgrestomet-fülimplantátum (syncromate-B, CEVA Laboratories, Inc., Overland Park, KS) beadásával történő szinkronizálással valósítottuk meg. Prosztaglandint adtunk be az első 7-9 nap után, az endogén progeszteron-szintézis leállítása céljából. Az implantátum behelyezése utáni 13. napon kezdve, összesen 18 mg follikulus-stimuláló hormont (FSH-Schering Corp., Kenilworth, NK) adtunk be intramuszkulárisan három napon át, napi két injekcióban. Az implantátumot a 14. napon távolítottuk el. Az implantátum eltávolítása után 24 órával a donorállatokat nemzőképes hímekkel fedeztettük néhány alkalommal két napon át [Selgrath és mtsai., Theriogenology, 1195-1205 (1990)].
Embriógyűj tés
Az embriógyűjtést szolgáló sebészeti beavatkozást a pároztatás utáni második napon (vagy 72 órával az implantátum eltávolítása után) végeztük el. A szuper ovulácónak kitett nőstényektől 36 órával a sebészeti beavatkozás előtt az ételt és az italt megvontuk. A nőstényeknek 0.8 mg/kg Diazepam-ot (Valium®), IV, majd azonnal 5.0 mg/kg Ketamin-t (Keteset) , IV, Halothane-t (2.5%) adtunk be a sebészeti beavatkozás alatt 2 1/perc oxigénben, endotrachealis csőben. A reproduktív szerveket exteriorizáltuk középvonali laparotomiás bemetszéssel. A corpora lutea-t, a meg nem repedt, 6 mm-nél nagyobb follikulusokat és az ovarium cisztáit megszámláltuk a szuperovulációs eredmények becslése céljából és az oviductum-ból mosással eltávolítandó embriók számának jóslása céljából. Kanült helyeztünk az oviductum nyílásába, és ott tartottuk ideiglenes 0.3-as Prolene érlekötéssel. 20-as méretű tűt helyeztünk a méhbe a méh-méhkürt elágazástól kb. 0.5 cm-re. 10-20 ml steril, foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatot (PBS) áramoltattunk a kanüllel ellátott oviduct-on át és Petricsészékben összegyűjtöttük. Az eljárást megismételtük az ellenkező oldalon és azután a reproduktív szerveket visszahelyeztük a hasüregbe. A lezárás előtt 10-20 ml steril, sós glicerinoldatot öntöttünk a hasüregbe az adhézió megelőzése céljából. A linea alba-t egyszerű, megszakított Polydioxanone-2. 0 vagy Supramid öltésekkel lezártuk és a bőrt steril sebkapcsokkal lezártuk.
A megtermékenyített, kecskeeredetű petesejteket oviduct PBS-öblítőfolyadékból összegyűjtöttük sztereomikroszkóp alatt, és 10% magzati borjúszérumot (FBS, Sigma) tartalmazó Ham-féle tápközegben (Sigma, St. Louis, MO) mostuk. Azokban az esetekben, ahol a pronukleusz látható volt,
- 100 az embriókat azonnal mikroinjekciónak vetettük alá. Ahol a pronukleusz nem volt látható, az embriókat 10% magzati borjúszérumot tartalmazó Ham-féle tápközegben rövid idejű tenyészetbe vihettük 37°C-on, 5% CO2-t tartalmazó levegőt tartalmazó, párásított gázkamrában, míg a pronukleuszok láthatóvá válnak [Selgrath ás mtsai., Theriogenology, 11951205 (1990)].
Mikroinjektálási eljárás
Egysejtű kecskeembriókat helyeztünk olaj alatt tápközeg-mikrocseppbe, mélyedést tartalmazó („depression) tárgylemezre. Két látható pronukleusszal rendelkező, megtermékenyített petesejteket helyeztünk lánggal simított („flame polished) tartó mikropipettára Zeiss márkájú álló, fix állványzatú mikroszkóp alatt Normanski optika alkalmazásával. Pronukleuszt injektáltunk az adott DNS-konstrukcióval, például a kecskeeredetű béta-kazein-gén szabályozóelemeivel működőképesen kapcsolt fúziósfehérje—gént tartalmazó Bc355-vektorral injektálási pufferben (Tris-EDTA) fine üveg mikrotű alkalmazásával [Selgrath és mtsai., 1195-1205 (1990) ] .
Embriófejlesztés
A mikroinjekció végrehajtása után az életben maradt embriókat 10% magzati borjúszérumot tartalmazó Ham-féle tápközegben 37°C-on, 5% CO2-t tartalmazó levegőt tartalmazó, párásított gázkamrában tenyészetbe helyeztük [Selgrath ás mtsai., Theriogenology, 1195-1205 (1990)].
- 101 A recipiensek előkészítése
A recipiens állatokban a nemi ciklus szinkronizálását 6 mg norgestomet-fülimplantátummal (Syncr ornate—B) indukáltuk. Az implantátum behelyezése utáni 13. napon az állatoknak egyszeri, szuperovulációt nem indukáló, vemhes kancából származó gonadotropin-injekciót (PMSG, 400 I.U., Sigma) adtunk be. A recipiens nőstényeket vazektómiának alávetett hímekkel pároztattuk a nemi ciklus szinkronizálása biztosítása céljából [Selgrath ás mtsai., Theriogenology, 11951205 (1990)].
Embriótranszfer
Az egy donortól származó összes embriót együtt tartottuk és egyetlen recipiensbe vittük, ha ez lehetséges volt. A sebészeti beavatkozás az embriógyűjtésnél leírtakkal azonos volt, kivéve azt, hogy az oviduct-ba. nem helyeztünk kanült, és az embriókat minimális térfogatú, 10% magzati borjúszérumot tartalmazó, Ham-féle tápközegben átvittük az oviduct üregébe a fimbria-n át, üveg anyagú mikropipetta alkalmazásával. Azokat az állatokat, amelyekben több, mint 6-8 ovulációs pont volt az ováriumban, recipiensként való alkalmazásra alkalmatlannak ítéltük. A bemetszés lezárása és az operációt követő gondozás ugyanúgy történt, mint a donorállatok esetében [lásd Selgrath ás mtsai., Theriogenology, 1195-1205 (1990)].
A vemhesség és az ellés megfigyelése
A vemhességet a nemi ciklus felfüggesztése után 45 nappal határoztuk meg ultrahang alkalmazásával. A 110. napon második ultrahangos vizsgálatot végeztünk el a vemhes
- 102 ség megerősítése és a magzati stressz megállapítása céljából. A 130. napon a vemhes nőstényeket tetanusztoxinnal és Clostridium C&D-vel vakcináztuk. Szelént és E-vitamint (BoSe) adtunk intravénásán, és Ivermecin-t szubkután módon. A nőstényeket a 145. napon tiszta istállóállásokban helyeztük el és ehhez a környezethez akklimatizálódni engedtük a körülbelül a 147. napon indukálandó ellésig. Az ellést a 147. napon indukáltuk 40 mg PGF2a-val (Lutalyse®, Upjohn Company, Kalamazoo Michigan). Az injekciót intravénásán adtuk be két dózisban, 20 mg-os dózisban, majd 4 óra múlva 20 mg-os dózisban. A 147. napon napközben és este a nőstényeket periodikus megfigyelés alatt tartottuk az első Lutalyse®-injekciót követően. A második napon reggeltől kezdve a megfigyelések gyakoriságát megnöveltük: 30 percenként figyeltük meg az állatokat. Az ellés az első injekció után 30-40 órával következett be. Az ellés után a nőstényeket megfejték a kolosztrum gyűjtése céljából, és a placenta eltávozásáról is megbizonyosodtunk.
Az Fp-állatok transzgenikus természetének ellenőrzése Transzgenikus F0-állatok szkrínelésére genomi DNS-t izoláltunk két különböző sejtvonalból abból a célból, hogy ne veszítsünk el mozaikosan transzgenikus állatot. Mozaikosan transzgenikus állatként definiáljuk azokat a kecskéket, amelyek nem rendelkeznek legalább az egyik kópia transzgénnel minden sejtben. Ezért fülszövetmintát (mezoderma) és vérmintát vettünk minden kétnapos Fp-állatból genomi DNS izolálása céljából [Lacy és mtsai., A Laboratory Manual, kiad.: Cold Spring Harbor, NY (1986); és Hermann és
- 103 Frischauf, Methods Enzymology 152: 180-183 (1987)]. A DNSmintákat a fúziós fehérje-génre specifikus láncindítókkal, polimeráz-láncreakció alkalmazásával [Gould és mtsai., Proc. Natl Acad. Sci., 86: 1934-1398 (1989)], és random primed (random módon indított) elsőtag- vagy másodiktagcDNS-próba alkalmazásával, Southern-blott-analízissel [Feinberg és Vogelstein, Anal. Bioc. 132: 6-13 (1983)] vizsgáltuk. A mérési eljárás becslés szerint egy kópia transzgén detektálása a szomatikus sejtek 10%-ában.
A termelőnyáj kifejlesztése és szelekciója
A fent leírt eljárások alkalmazhatóak transzgenikus alapítókecskék (Fo) , valamint más, transzgenikus állatok előállítására. A transzgenikus F0-alapítókecskékek tenyésztjük például: a nőstényeket tejtermelés céljából, vagy a bakokat transzgenikus nőstényutódok előállítása céljából. A transzgenikus alapítóbakot pároztathatjuk nem transzgenikus nőstényekkel transzgenikus nőstény utód létrehozása célj ából.
A transzgén átvitele és tulajdonságai
Az adott transzgénnek a kecskevonalban történő átvitelét fülszövetben és vérben vizsgáltuk PCR-rel és Southern-blott-analízissel. Például az alapító bak és a három transzgenikus utód Southern-blott-analízise azt mutatja, hogy a generációk között nem történt átrendeződés vagy a kópiaszám változása. A Southern-blottokat az immunglobulin-enzim-fúziósfehérje cDNS-próbájával vizsgáltuk. A biottokat Beta scope-603-mal vizsgáltuk és a kópiaszámot
- 104 meghatároztuk úgy, hogy a transzgént a kecskeeredetű endogén béta-kazein-génnel összehasonlítottuk.
Az expressziós szint becslése
A transzgenikus fehérje expressziós szintjét a transzgenikus állatok tejében enzimatikus mérési eljárásokkal vagy IVestern-blottok alkalmazásával határoztuk meg.
A találmány más megvalósítási módjait megtalálhatóak a következő igénypontokban.

Claims (19)

  1. - 105 SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás fúziós fehérje előállítására, amely fúziós fehérjében első tag második taggal van fuzionáltatva, azzal jellemezve, hogy az előállítás tartalmazza a következő lépéseket :
    - úgy választunk első tagot és második tagot, hogy az első tag, vagy a fúziós fehérje komplexet képezve szerelő- » dik össze, ahol az alegységek száma olyan, amely optimalizálja a második tag multimer formájának aktivitását;
    - a fúziós fehérjét előállítjuk; és
    - lehetővé tesszük a fúziós fehérje olyan komplex formában való összekacsolódását, ahol az alegységek száma optimalizálja a második tag multimer formájának aktivitását .
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első tagként olyan tagot választunk, hogy az első tag, vagy a fúziós fehérje olyan formában kapcsolódik össze, amely ugyanolyan számú alegységgel rendelkezik, mint amely számú alegység a második tag aktív formájában jelen van.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első tagként olyan tagot választunk, amely tartalmaz Ig-alegységet.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második tagot úgy választjuk meg, hogy az nem Ig-alegység.
    - 106 -
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első tagot olyan helyen módosítjuk, amely modulálja az alegységek multimerje kialakulását vagy fenntartását .
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első tagként olyan tagot választunk, amely dimert képez.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első tagként olyan tagot választunk, amely tartalmaz Ig-alegységet, amelyet multimerforma kialakulása gátlása céljából módosítottunk.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy módosításként egy vagy több aminosav változtatását, beillesztését vagy delécióját választjuk, és ahol a módosítás olyan alegységet eredményez, amely nem képez multimert, vagy amely a normális esetben kialakuló multimernél alacsonyabb rendű multimert képez.
  9. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immunglobulin kapocsrégióját módosítjuk.
  10. 10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dimer Ig-szerkezetet eredményező módosítást alkalmazunk.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nehézlánc-fúzióstagot és könnyűlánc-fúzióstagot tartalmazó dimert eredményező módosítást alkalmazunk.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második tagként béta glükuronidázt tartalmazó tagot alkalmazunk.
    - 107 -
  13. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első tagként immunglobulin-nehézláncot (lg), és második tagként béta-glükuronidázt tartalmazó tagot alkal mázunk.
  14. 14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós fehérjét transzgenikus emlősállatban állítjuk elő.
  15. 15. Eljárás az 1. igénypontban említett fúziós fehérje transzgenikus úton történő előállítására, azzal jellemezve, hogy tejet nyerünk ki olyan transzgenikus állattól, amely tartalmaz olyan fúziósfehérje—transzgént kódoló gént, amely a fúziós fehérjét kódoló szekvencia emlőmirigyhámsejtekben történő expresszióját eredményezi, ezáltal a fúziós fehérje az emlős tejében expresszálódik.
  16. 16. Nukleinsav-konstrukció, amely tartalmaz:
    a) adott esetben szigetelőszekvenciát („insulator);
    b) promótert, például emlőhám—specifikus promótert, például tej fehérje-promótert;
    c) nukleotidszekvenciát, amely a fúziósfehérje szekrécióját vezérelheti, például tej specifikus fehérjéből származó, vagy immunglobulinból származó szignálszekvenci át;
    d) adott esetben szekretálódó fehérje, például tejbe szekretálódó feherje, vagy immunglobulin amino terminális régiójának ahhoz elegendő részét kódoló nukleotidszekvenciáját, hogy lehetővé tegye a fúziós fehérje szekréció ját, például a transzgenikus állat tejébe történő szekrécióját;
    - 108 -
    e) egy vagy több nukleotidszekvenciát, amely fúziós fehérjét, például a leírásban, ismertetett fúziós fehérjét kódol, és
    f) adott esetben emlőhám-specifikus gén, például tejfehérjegén 3’-irányú nem transzlálódó régióját.
  17. 17. Nukleinsav-konstrukció, ahol a nukleinsavmolekula az 1. igénypont szerinti fúziós fehérjét kódolja.
  18. 18. Az 1. igénypontban leírt fúziós fehérje.
  19. 19. Transzgenikus állat, amely tartalmaz az 1. igénypont szerinti fúziós fehérjét kódoló transzgént.
    A meghatalmazott:
    DANUBIA
    Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
    Dr. Svingor Ádám szabadalmi ügyvivő
HU0202702A 1999-09-17 2000-09-18 Alegységoptimalizált fúziós fehérjék és alkalmazásai HUP0202702A2 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39907999A 1999-09-17 1999-09-17
PCT/US2000/025558 WO2001019842A1 (en) 1999-09-17 2000-09-18 Subunit optimized fusion proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUP0202702A2 true HUP0202702A2 (hu) 2002-12-28

Family

ID=23578058

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0202702A HUP0202702A2 (hu) 1999-09-17 2000-09-18 Alegységoptimalizált fúziós fehérjék és alkalmazásai

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP1237900A4 (hu)
JP (1) JP2003509038A (hu)
KR (1) KR20020039346A (hu)
CN (1) CN1379782A (hu)
AU (1) AU781462B2 (hu)
BR (1) BR0014524A (hu)
CA (1) CA2384766A1 (hu)
HU (1) HUP0202702A2 (hu)
IL (1) IL148549A0 (hu)
MX (1) MXPA02002768A (hu)
NO (1) NO20021244L (hu)
NZ (1) NZ517774A (hu)
RU (1) RU2002110116A (hu)
WO (1) WO2001019842A1 (hu)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030035798A1 (en) 2000-08-16 2003-02-20 Fang Fang Humanized antibodies
CA2454358A1 (en) 2001-07-19 2003-07-31 Perlan Therapeutics, Inc. Multimeric proteins and methods of making and using same
WO2015077071A1 (en) * 2013-11-19 2015-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL111748A0 (en) * 1993-12-03 1995-01-24 Zeneca Ltd Proteins
GB9406974D0 (en) * 1994-04-08 1994-06-01 Pharmaceutical Proteins Ltd Transgenic production
US5959171A (en) * 1994-08-17 1999-09-28 Pharming B.V. Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's
US5635363A (en) * 1995-02-28 1997-06-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for the detection, quantitation and purification of antigen-specific T cells
AU6184298A (en) * 1997-02-25 1998-09-09 Genzyme Transgenics Corporation Transgenically produced non-secreted proteins
GB9708918D0 (en) * 1997-05-01 1997-06-25 Ppl Therapeutics Scotland Ltd Methods
CA2330527A1 (en) * 1998-06-15 1999-12-23 Genzyme Transgenics Corporation Erythropoietin analog-human serum albumin fusion

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001019842A1 (en) 2001-03-22
CN1379782A (zh) 2002-11-13
NO20021244L (no) 2002-05-13
RU2002110116A (ru) 2004-03-10
CA2384766A1 (en) 2001-03-22
NO20021244D0 (no) 2002-03-13
AU3883101A (en) 2001-04-17
EP1237900A1 (en) 2002-09-11
WO2001019842A9 (en) 2002-11-14
IL148549A0 (en) 2002-09-12
KR20020039346A (ko) 2002-05-25
BR0014524A (pt) 2002-06-11
AU781462B2 (en) 2005-05-26
NZ517774A (en) 2005-01-28
JP2003509038A (ja) 2003-03-11
EP1237900A4 (en) 2005-08-03
MXPA02002768A (es) 2002-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4087563B2 (ja) エリスロポエチン類似体−ヒト血清アルブミン融合物
US5639457A (en) Process for the production of antibodies
US20090246194A1 (en) ERYTHROPOIETIN ANALOG-IgG FUSION PROTEINS
JP2006507839A (ja) 乳中に安定して産生される改変抗体およびその製造方法
US20060026695A1 (en) Transgenically produced fusion proteins
US6545198B1 (en) Transgenically produced prolactin
AU782840B2 (en) Transgenically produced fusion proteins
US20050160483A1 (en) Transgenically produced decorin
AU2001259465A1 (en) Transgenically produced decorin
AU781462B2 (en) Subunit optimized fusion proteins
EP1012233A1 (en) Transgenically produced prolactin
HK1036475B (en) Erythropoietin analog-human serum albumin fusion protein