JP2003509038A - サブユニット最適化された融合タンパク質 - Google Patents
サブユニット最適化された融合タンパク質Info
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Abstract
(57)【要約】
第2の部分に融合された第1の部分を有する融合タンパク質を作製する方法であって、該融合タンパク質が前記第2の部分の多重結合形態の活性を最適化する多くのサブユニットを有する複合体に組み換わるように前記第1および第2の部分が選択されることを特徴とする融合タンパク質を作製する方法。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、ここに引用される1998年9月18日に先に出願された米国仮特許出願
第60/101,083号の恩恵を主張する。 【０００２】 発明の分野 本発明は、第1および第2の部分(member)を有する融合タンパク質に関し、該融
合タンパク質の第2の部分は多重結合体(multimer)に組み換わり、第2の部分が予
め選択されたまたは最適な数のサブユニットに組み換わることが促進されるよう
に他の部分を選択または修飾する。 【０００３】 発明の背景 融合タンパク質は、別個のタンパク質の有用な特性を合わせ持つことができる
。例えば、融合タンパク質は、抗体分子のターゲティング特性と毒素の細胞毒性
効果を合わせ持つことができる。 【０００４】 発明の概要 概して、本発明は、以下のものを有する融合タンパク質を産生する方法を特徴
とする：第1の部分、例えば、ターゲティング成分、例えば、第2の部分に融合し
た免疫グロブリンサブユニット（例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖、また
はいずれかの断片）、例えば酵素、例えば毒素（例えば酵素または毒素サブユニ
ット）。融合タンパク質が第2の部分の多重結合形態の活性を最適化するサブユ
ニットを多く有する複合体に組み換わるように、第1および第2の部分を選択する
。好ましい実施の形態において、第1の部分または融合タンパク質は、第2の部分
の活性、例えば天然の形態に存在するのと同じ数のサブユニットを有する形態に
組み換わる。好ましい実施の形態において、第1の部分または融合タンパク質は
、第2の部分の活性、例えば天然の形態に存在するよりも少ないサブユニットを
有する形態に組み換わる。 【０００５】 詳細な説明 図面をまず説明する。 【０００６】 図１Aは、ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖(LC)のゲノム配列を含有する
構成体の略図である。シグナルペプチド配列の位置および軽鎖可変(Vk)およびCk
領域も示される。制限酵素部位の位置も示される。 【０００７】 図１Bは、ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖についてのヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す。制限酵素部位の位置が示される。 【０００８】 図２は、ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖についてのコード配列を含有
するSal Iインサートについてのヌクレオチド配列を示す。 【０００９】 図３は、ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖についてのコード配列を含有
するSal Iを含む構成体(Bc458)の略図である。サイレンサー、5’β−カゼイン
非翻訳領域、軽鎖コード領域、および3’β−カゼイン非翻訳領域の位置も示さ
れる。 【００１０】 図４Aは、β−グルクロニダーゼ配列に結合したヒト化抗−癌胎児性抗原抗体4
31の重鎖(HC)のゲノム配列を含有する構成体の略図である。シグナルペプチド配
列の位置および重鎖可変領域(Vh)およびCH1も示される。制限酵素部位の位置も
示される。 【００１１】 図４Bは、ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の重鎖についてのヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す。制限酵素部位の位置が示される。 【００１２】 図５は、ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の突然変異重鎖についてのヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列を示す。突然変異重鎖はヒンジ部を有しない。制限酵素
部位の位置が示される。 【００１３】 図６は、β−グルクロニダーゼ配列に結合したヒト化抗−癌胎児性抗原抗体43
1の突然変異重鎖を含有する構成体(Bc454)の略図である。サイレンサー、5’β
−カゼイン非翻訳領域、重鎖突然変異／β−グルクロニダーゼ融合コード領域、
および3’β−カゼイン非翻訳領域の位置も示される。制限酵素部位の位置も示
される。 【００１４】 図７は、重鎖突然変異体の構成の概観である。 【００１５】 図８は、β−グルクロニダーゼへの突然変異の拡大図である。 【００１６】 本発明は、少なくとも一部、遺伝子導入により産生された融合タンパク質であ
って、該融合タンパク質の一つの部分が多重結合体に組み換わり、最適な数のサ
ブユニットへの組換えが促進されるように他の部分が選択される、または修飾さ
れる融合タンパク質を提供する。一つの実施の形態において、融合タンパク質は
、毒素（例えば酵素のサブユニット）に融合した免疫グロブリンサブユニット（
例えば免疫グロブリン重鎖または軽鎖）を含む。ここに記載される免疫グロブリ
ン−酵素融合タンパク質は、所望でない細胞、例えば腫瘍細胞に細胞毒性作用物
質を方向付ける作用をする。例えば、以下の実施例に記載される融合タンパク質
、（すなわち酵素、例えばグルクロニダーゼに融合した癌胎児性抗原(CEA)に対
する抗体）を使用して、腫瘍細胞に方向付けることができる。免疫グロブリン−
酵素融合が腫瘍部位に集まるのに十分な時間を与えた後、無毒性のプロドラッグ
を投与してもよい。このプロドラッグは、腫瘍部位に局在する標的の酵素の作用
により強い細胞毒性の薬に変わり、患者にとって許容できない毒性を有しない薬
の治療レベルを達成できる。 【００１７】実施例１ ：軽鎖(LC)構成体の構造 この実施例には、乳腺特異的発現ベクター(Bc163)および市販の哺乳類発現ベ
クター(pcDNA3)中にサブクローニングされた癌胎児性抗原(431)に対するヒト化
モノクローナル抗体からの軽鎖ヌクレオチド配列を使用する軽鎖核酸構成体の産
生が記載される。 【００１８】 簡単には、軽鎖配列を含有するHind III-Eco RI断片をpGEM3z中にサブクロー
ニングし、さらに操作を容易にした。二つの突然変異を行った： a)コード領域の開始点においてSal I、Hho I、およびKozakコンセンサス配列
を生成し、 b)終結コドンの直後にSal I部位を生成する。 【図面の簡単な説明】 【図１Ａ】 ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖(LC)のゲノム配列を含有する構成体の
略図 【図１Ｂ】 ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖についてのヌクレオチドおよびアミノ
酸配列を示す図 【図２】 ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖についてのコード配列を含有するSal I
インサートについてのヌクレオチド配列を示す図 【図３】 ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖についてのコード配列を含有するSal I
を含む構成体(Bc458)の略図 【図４Ａ】 β−グルクロニダーゼ配列に結合したヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の重鎖(
HC)のゲノム配列を含有する構成体の略図 【図４Ｂ】 ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の重鎖についてのヌクレオチドおよびアミノ
酸配列を示す図 【図５】 ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の突然変異重鎖についてのヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す図 【図６】 β−グルクロニダーゼ配列に結合したヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の突然
変異重鎖を含有する構成体(Bc454)の略図 【図７】 重鎖突然変異体の構成の概観を示す図 【図８】 β−グルクロニダーゼへの突然変異の拡大図
第60/101,083号の恩恵を主張する。 【０００２】 発明の分野 本発明は、第1および第2の部分(member)を有する融合タンパク質に関し、該融
合タンパク質の第2の部分は多重結合体(multimer)に組み換わり、第2の部分が予
め選択されたまたは最適な数のサブユニットに組み換わることが促進されるよう
に他の部分を選択または修飾する。 【０００３】 発明の背景 融合タンパク質は、別個のタンパク質の有用な特性を合わせ持つことができる
。例えば、融合タンパク質は、抗体分子のターゲティング特性と毒素の細胞毒性
効果を合わせ持つことができる。 【０００４】 発明の概要 概して、本発明は、以下のものを有する融合タンパク質を産生する方法を特徴
とする：第1の部分、例えば、ターゲティング成分、例えば、第2の部分に融合し
た免疫グロブリンサブユニット（例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖、また
はいずれかの断片）、例えば酵素、例えば毒素（例えば酵素または毒素サブユニ
ット）。融合タンパク質が第2の部分の多重結合形態の活性を最適化するサブユ
ニットを多く有する複合体に組み換わるように、第1および第2の部分を選択する
。好ましい実施の形態において、第1の部分または融合タンパク質は、第2の部分
の活性、例えば天然の形態に存在するのと同じ数のサブユニットを有する形態に
組み換わる。好ましい実施の形態において、第1の部分または融合タンパク質は
、第2の部分の活性、例えば天然の形態に存在するよりも少ないサブユニットを
有する形態に組み換わる。 【０００５】 詳細な説明 図面をまず説明する。 【０００６】 図１Aは、ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖(LC)のゲノム配列を含有する
構成体の略図である。シグナルペプチド配列の位置および軽鎖可変(Vk)およびCk
領域も示される。制限酵素部位の位置も示される。 【０００７】 図１Bは、ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖についてのヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す。制限酵素部位の位置が示される。 【０００８】 図２は、ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖についてのコード配列を含有
するSal Iインサートについてのヌクレオチド配列を示す。 【０００９】 図３は、ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖についてのコード配列を含有
するSal Iを含む構成体(Bc458)の略図である。サイレンサー、5’β−カゼイン
非翻訳領域、軽鎖コード領域、および3’β−カゼイン非翻訳領域の位置も示さ
れる。 【００１０】 図４Aは、β−グルクロニダーゼ配列に結合したヒト化抗−癌胎児性抗原抗体4
31の重鎖(HC)のゲノム配列を含有する構成体の略図である。シグナルペプチド配
列の位置および重鎖可変領域(Vh)およびCH1も示される。制限酵素部位の位置も
示される。 【００１１】 図４Bは、ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の重鎖についてのヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す。制限酵素部位の位置が示される。 【００１２】 図５は、ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の突然変異重鎖についてのヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列を示す。突然変異重鎖はヒンジ部を有しない。制限酵素
部位の位置が示される。 【００１３】 図６は、β−グルクロニダーゼ配列に結合したヒト化抗−癌胎児性抗原抗体43
1の突然変異重鎖を含有する構成体(Bc454)の略図である。サイレンサー、5’β
−カゼイン非翻訳領域、重鎖突然変異／β−グルクロニダーゼ融合コード領域、
および3’β−カゼイン非翻訳領域の位置も示される。制限酵素部位の位置も示
される。 【００１４】 図７は、重鎖突然変異体の構成の概観である。 【００１５】 図８は、β−グルクロニダーゼへの突然変異の拡大図である。 【００１６】 本発明は、少なくとも一部、遺伝子導入により産生された融合タンパク質であ
って、該融合タンパク質の一つの部分が多重結合体に組み換わり、最適な数のサ
ブユニットへの組換えが促進されるように他の部分が選択される、または修飾さ
れる融合タンパク質を提供する。一つの実施の形態において、融合タンパク質は
、毒素（例えば酵素のサブユニット）に融合した免疫グロブリンサブユニット（
例えば免疫グロブリン重鎖または軽鎖）を含む。ここに記載される免疫グロブリ
ン−酵素融合タンパク質は、所望でない細胞、例えば腫瘍細胞に細胞毒性作用物
質を方向付ける作用をする。例えば、以下の実施例に記載される融合タンパク質
、（すなわち酵素、例えばグルクロニダーゼに融合した癌胎児性抗原(CEA)に対
する抗体）を使用して、腫瘍細胞に方向付けることができる。免疫グロブリン−
酵素融合が腫瘍部位に集まるのに十分な時間を与えた後、無毒性のプロドラッグ
を投与してもよい。このプロドラッグは、腫瘍部位に局在する標的の酵素の作用
により強い細胞毒性の薬に変わり、患者にとって許容できない毒性を有しない薬
の治療レベルを達成できる。 【００１７】実施例１ ：軽鎖(LC)構成体の構造 この実施例には、乳腺特異的発現ベクター(Bc163)および市販の哺乳類発現ベ
クター(pcDNA3)中にサブクローニングされた癌胎児性抗原(431)に対するヒト化
モノクローナル抗体からの軽鎖ヌクレオチド配列を使用する軽鎖核酸構成体の産
生が記載される。 【００１８】 簡単には、軽鎖配列を含有するHind III-Eco RI断片をpGEM3z中にサブクロー
ニングし、さらに操作を容易にした。二つの突然変異を行った： a)コード領域の開始点においてSal I、Hho I、およびKozakコンセンサス配列
を生成し、 b)終結コドンの直後にSal I部位を生成する。 【図面の簡単な説明】 【図１Ａ】 ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖(LC)のゲノム配列を含有する構成体の
略図 【図１Ｂ】 ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖についてのヌクレオチドおよびアミノ
酸配列を示す図 【図２】 ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖についてのコード配列を含有するSal I
インサートについてのヌクレオチド配列を示す図 【図３】 ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の軽鎖についてのコード配列を含有するSal I
を含む構成体(Bc458)の略図 【図４Ａ】 β−グルクロニダーゼ配列に結合したヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の重鎖(
HC)のゲノム配列を含有する構成体の略図 【図４Ｂ】 ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の重鎖についてのヌクレオチドおよびアミノ
酸配列を示す図 【図５】 ヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の突然変異重鎖についてのヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す図 【図６】 β−グルクロニダーゼ配列に結合したヒト化抗−癌胎児性抗原抗体431の突然
変異重鎖を含有する構成体(Bc454)の略図 【図７】 重鎖突然変異体の構成の概観を示す図 【図８】 β−グルクロニダーゼへの突然変異の拡大図
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ミードー，ハリー エム
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
02458 ニュートン グラスミア ストリ
ート 62
(72)発明者 ボスレット，クラウス
ドイツ連邦共和国 13342 ベルリン シ
ェリング アーゲー
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA03 GA07 GA11
4C084 AA06 BA02 BA08 BA22 BA23
BA41 CA18 CA27 CA53 CA56
DA27 DA32 DA39 DC01 NA05
ZB261 ZC011
4H045 AA20 BA10 BA41 CA40 DA75
DA89 EA28 FA74
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 第2の部分に融合した第1の部分を有する融合タンパク質を作
製する方法であって、該融合タンパク質が前記第2の部分の多重結合形態の活性
を最適化する多くのサブユニットを有する複合体に組み換わるように前記第1お
よび第2の部分が選択されることを特徴とする融合タンパク質を作製する方法。
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