JP2001095566A - サイトカインの免疫複合体 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】サイトカインの標的細胞への選択的供給のため
の免疫複合体が開示される。 【解決手段】免疫複合体は癌細胞、ビールス感染細胞の
ような標的細胞に対して特異性を有する免疫グロブリン
重鎖とリンフォトキシン、腫瘍壊死因子α、インターロ
イキン−２あるいは顆粒球−マクロファージコロニー刺
激因子のようなサイトカインから成り、免疫グロブリン
のカルボキシＡ末端にサイトカインのアミノＡ末端が結
合してなる。これらの免疫複合体をコードする核酸配列
および遺伝子工学的手法によるその製造方法も開示され
る。
の免疫複合体が開示される。 【解決手段】免疫複合体は癌細胞、ビールス感染細胞の
ような標的細胞に対して特異性を有する免疫グロブリン
重鎖とリンフォトキシン、腫瘍壊死因子α、インターロ
イキン−２あるいは顆粒球−マクロファージコロニー刺
激因子のようなサイトカインから成り、免疫グロブリン
のカルボキシＡ末端にサイトカインのアミノＡ末端が結
合してなる。これらの免疫複合体をコードする核酸配列
および遺伝子工学的手法によるその製造方法も開示され
る。
Description
【０００１】本出願は、１９９０年ｌｌ月９日出願の係
属中出願第６１２，０９９号の部分継続出願であり、そ
の開示はここに言及により挿入される。
属中出願第６１２，０９９号の部分継続出願であり、そ
の開示はここに言及により挿入される。
【０００２】
【発明の属する技術分野】発明の背景 本発明は、一般に、インビボでの細胞を選択的に破壊す
る治療及び種々の癌やビールス感染の処置に有用な組成
物に関する。特に、本発明は感染細胞を標的化でき、細
胞が死滅又は中和化するような局所性炎症応答を誘発で
きる遺伝子操作的手法による抗体融合構成体に関する。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）及びリンフォトキシン（ＬＴ
又はＴＮＦβ）は先ず特定の腫瘍を直接殺すそれ等の能
力に基づいて同定された。しかしながら、他の多くの生
物学的活性が今やサイトカインと密接に関連している。
これ等としては、組織適合性抗原及び付着レセピターの
誘導等様々の細胞型に対する効果、並びにそれ等から結
果する炎症、血管透過性変化及び単核細胞浸潤の効果が
含まれる(Goeddel, D.V.(1986) Symp. Guant. Biol. 5
1:597, Cold Speing Harbor; Beutler, B. and Ruddel
N. G. (1988) Ann. Rev. Immonol. 6:407) 。ＴＮＦα
とＬＴは何れも半減期が極めて短いので、これ等炎症反
応は全身的には起こらず、ＴＮＦ生成細胞の遊離箇所に
おいてのみ起こる。 この局所性炎症応答性は、固形腫
瘍や他の病変組織の治療において用いることができる。
例えば、ＴＮＦα又はＬＴの何れかを腫瘍箇所に特異的
に放出できれば、局所的炎症応答は、天然型キラー細
胞、大きな顆粒状のリンパ球及び好酸球のようなエフェ
クター細胞、即ち抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性
に必要とされる細胞の放出を導くことができる。
る治療及び種々の癌やビールス感染の処置に有用な組成
物に関する。特に、本発明は感染細胞を標的化でき、細
胞が死滅又は中和化するような局所性炎症応答を誘発で
きる遺伝子操作的手法による抗体融合構成体に関する。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）及びリンフォトキシン（ＬＴ
又はＴＮＦβ）は先ず特定の腫瘍を直接殺すそれ等の能
力に基づいて同定された。しかしながら、他の多くの生
物学的活性が今やサイトカインと密接に関連している。
これ等としては、組織適合性抗原及び付着レセピターの
誘導等様々の細胞型に対する効果、並びにそれ等から結
果する炎症、血管透過性変化及び単核細胞浸潤の効果が
含まれる(Goeddel, D.V.(1986) Symp. Guant. Biol. 5
1:597, Cold Speing Harbor; Beutler, B. and Ruddel
N. G. (1988) Ann. Rev. Immonol. 6:407) 。ＴＮＦα
とＬＴは何れも半減期が極めて短いので、これ等炎症反
応は全身的には起こらず、ＴＮＦ生成細胞の遊離箇所に
おいてのみ起こる。 この局所性炎症応答性は、固形腫
瘍や他の病変組織の治療において用いることができる。
例えば、ＴＮＦα又はＬＴの何れかを腫瘍箇所に特異的
に放出できれば、局所的炎症応答は、天然型キラー細
胞、大きな顆粒状のリンパ球及び好酸球のようなエフェ
クター細胞、即ち抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性
に必要とされる細胞の放出を導くことができる。
【０００３】リンフォカインをインビボで特異的部位に
供給する方法は、その特定部位に特有な免疫グロブリン
をリンフォカインと結合することである。しかしなが
ら、タンパク質領域の免疫グロブリン鎖又は断片のカル
ボキシ末端への融合は、融合されるべきタンパク質と免
疫グロブリンの両者に、特に抗原結合、集合及びエフェ
クター機能に関し、予測不能の結果をもたらす。例え
ば、個々のタンパク質の望まれる生物学的機能は最終生
成物では維持されないことがある。
供給する方法は、その特定部位に特有な免疫グロブリン
をリンフォカインと結合することである。しかしなが
ら、タンパク質領域の免疫グロブリン鎖又は断片のカル
ボキシ末端への融合は、融合されるべきタンパク質と免
疫グロブリンの両者に、特に抗原結合、集合及びエフェ
クター機能に関し、予測不能の結果をもたらす。例え
ば、個々のタンパク質の望まれる生物学的機能は最終生
成物では維持されないことがある。
【０００４】他の、免疫グロブリン鎖にたいする融合タ
ンパク質としてのリンフォカインＬＴのようなタンパク
質発現に伴う問題は、天然型分子が三量体として可溶性
状態で存在し、この形態でより効率的にレセプタと結合
していることである。かくして、ＬＴが免疫グロブリン
重（Ｈ）鎖とアミノ末端を介して結合し、二対のＨ鎖融
合ポリペプチドを含む完全なＩｇ分子に集合されるとき
には、三量化は尚、形成されないようである。第二に融
合ＬＴがそのレセプター結合する能力は、もし、遊離ア
ミノ末端がレセプター結合活性に必要とされれば、厳し
く制限される。事実、ＴＮＦαのアミノおよびカルボキ
シル末端は、そして多分、ＬＴも共にレセプター相互作
用に必要とされる構造となっているものと推定されてい
る。
ンパク質としてのリンフォカインＬＴのようなタンパク
質発現に伴う問題は、天然型分子が三量体として可溶性
状態で存在し、この形態でより効率的にレセプタと結合
していることである。かくして、ＬＴが免疫グロブリン
重（Ｈ）鎖とアミノ末端を介して結合し、二対のＨ鎖融
合ポリペプチドを含む完全なＩｇ分子に集合されるとき
には、三量化は尚、形成されないようである。第二に融
合ＬＴがそのレセプター結合する能力は、もし、遊離ア
ミノ末端がレセプター結合活性に必要とされれば、厳し
く制限される。事実、ＴＮＦαのアミノおよびカルボキ
シル末端は、そして多分、ＬＴも共にレセプター相互作
用に必要とされる構造となっているものと推定されてい
る。
【０００５】
【本発明の課題】本発明の目的は、インビボで細胞を選
択的に破壊できる組成物及びこれを達成する為の治療方
法の提供にある。本発明は又、標的細胞を直接破壊する
ため、または標的細胞に致命的な環境を創出することに
よって標的細胞を破壊するために、サイトカインを標的
細胞に選択的に供給する組成物及び治療方法を提供する
ことにある。
択的に破壊できる組成物及びこれを達成する為の治療方
法の提供にある。本発明は又、標的細胞を直接破壊する
ため、または標的細胞に致命的な環境を創出することに
よって標的細胞を破壊するために、サイトカインを標的
細胞に選択的に供給する組成物及び治療方法を提供する
ことにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】発明の要約 本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、典型的には重鎖と
サイトカインを含む免疫複合体であって疾病を処置のた
めの免疫複合体の使用に関する。免疫複合体は、Ｉｇの
抗原結合活性とサイトカインの生物学的活性を保持し、
そしてサイトカインを標的細胞に特異的に供給するのに
用いることができる。用語「サイトカイン」は、ここで
は、細胞によって生成、分泌され、そしてサイトカイン
に対する受容体をもっている細胞中に特異的応答を引き
起こすタンパク質、その類似物、またその断片を指す。
好ましいサイトカインとしては、インターロイキン−２
「ＩＬ−２］のごときインターロイキン、顆粒球マクロ
ファ−ジコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような増
血因子及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）である。
サイトカインを含む免疫複合体であって疾病を処置のた
めの免疫複合体の使用に関する。免疫複合体は、Ｉｇの
抗原結合活性とサイトカインの生物学的活性を保持し、
そしてサイトカインを標的細胞に特異的に供給するのに
用いることができる。用語「サイトカイン」は、ここで
は、細胞によって生成、分泌され、そしてサイトカイン
に対する受容体をもっている細胞中に特異的応答を引き
起こすタンパク質、その類似物、またその断片を指す。
好ましいサイトカインとしては、インターロイキン−２
「ＩＬ−２］のごときインターロイキン、顆粒球マクロ
ファ−ジコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような増
血因子及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）である。
【０００７】用語「リンフォカイン」は、ここでは、活
性化したリンフォサイトによって生成され例えばリンフ
ォトキシンのようなリンフォカインにたいするレセプタ
ーを有する細胞内に特異的応答を誘導する能力を有する
タンパク質、その類似物またはその断片を指す。リンフ
ォカインはサイトカインの典型例である。好ましい実施
例において、免疫複合体は標的抗原にたいして特異的な
可変領域と重鎖のカルボキシ末端でサイトカインにペプ
チド結合によって結合する不変領域とから成るキメラＩ
ｇ鎖から成る。
性化したリンフォサイトによって生成され例えばリンフ
ォトキシンのようなリンフォカインにたいするレセプタ
ーを有する細胞内に特異的応答を誘導する能力を有する
タンパク質、その類似物またはその断片を指す。リンフ
ォカインはサイトカインの典型例である。好ましい実施
例において、免疫複合体は標的抗原にたいして特異的な
可変領域と重鎖のカルボキシ末端でサイトカインにペプ
チド結合によって結合する不変領域とから成るキメラＩ
ｇ鎖から成る。
【０００８】本発明の免疫複合体は、それ等の構造の二
つの観点からみて、キメラと考えて良い。先ず、免疫複
合体は、それが与えられたサイトカインと融合し適切な
抗原結合特異性を保持する免疫グロブリン鎖（通常重鎖
だがそれに限らない）を含むと言う意味でキメラであ
る。第二に本発明の免疫複合体は、それが可変領域と通
常、該可変領域又は他の可変領域に接続する不変領域を
含む、即ちＶ／Ｃキメラ；例えば、異なる天然の抗体分
子または異なる種起原の可変又は不変領域を含むという
意味でキメラとして良い。又、用語「免疫複合体」（”
ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ”)に包括されるの
は、Greg Wibter等、GB2,188,638 より開示されたよう
な枠体領域から成る結合領域と可変領域を有する異なる
種からの構成体（即ち、相補を決定する領域) でもあ
る。好ましくは、免疫複合体のサイトカインは、ＬＴ又
はＴＮＦαのごとき未融合状態で二量体又は多量体を天
然に構成するタンパク質であっても良い。
つの観点からみて、キメラと考えて良い。先ず、免疫複
合体は、それが与えられたサイトカインと融合し適切な
抗原結合特異性を保持する免疫グロブリン鎖（通常重鎖
だがそれに限らない）を含むと言う意味でキメラであ
る。第二に本発明の免疫複合体は、それが可変領域と通
常、該可変領域又は他の可変領域に接続する不変領域を
含む、即ちＶ／Ｃキメラ；例えば、異なる天然の抗体分
子または異なる種起原の可変又は不変領域を含むという
意味でキメラとして良い。又、用語「免疫複合体」（”
ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ”)に包括されるの
は、Greg Wibter等、GB2,188,638 より開示されたよう
な枠体領域から成る結合領域と可変領域を有する異なる
種からの構成体（即ち、相補を決定する領域) でもあ
る。好ましくは、免疫複合体のサイトカインは、ＬＴ又
はＴＮＦαのごとき未融合状態で二量体又は多量体を天
然に構成するタンパク質であっても良い。
【０００９】好ましい実施例では、キメラのＩｇ鎖ＣＨ
ｌ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む重（Ｈ）鎖から成
る。タンパク分解酵素切断部位はＩｇ重鎖とサイトカイ
ンの間に見いだされ複合体が標的細胞に達すると、サイ
トカインは重鎖から切断されるようになる。「タンパク
分解酵素切断部位」は配列の内部又は近接してもつ切断
部位をタンパク分解酵素によって認識されるアミノ酸配
列である。好ましくは、可変領域は、マウスから誘導さ
れ（即ち、そのＤＮＡ配列又はそのアミノ酸配列は、マ
ウス起源のＤＮＡ配列又は同起源のアミノ酸配列に基づ
き、そして不変領域（好ましくは、枠体領域と可変領域
のアミノ酸を含む）は、ヒトから誘導され、重鎖の可変
領域はビールス感染細胞、又は腫瘍付随又はビールス抗
原に特異的なＩｇから誘導される。好ましくは、キメラ
Ｉｇ鎖は、それを適当な対応品（軽、重）と組み合わせ
ることにより、次に標的抗体に特定な二価の免疫複合体
の生成する一価の抗原結合領域を形成し、免疫複合体と
される。本発明は又、上述の免疫複合体をコードするＤ
ＮＡ構成体及び細胞系統、例えば、これ等構成体によっ
て形質転換される骨髄腫類を含む。
ｌ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む重（Ｈ）鎖から成
る。タンパク分解酵素切断部位はＩｇ重鎖とサイトカイ
ンの間に見いだされ複合体が標的細胞に達すると、サイ
トカインは重鎖から切断されるようになる。「タンパク
分解酵素切断部位」は配列の内部又は近接してもつ切断
部位をタンパク分解酵素によって認識されるアミノ酸配
列である。好ましくは、可変領域は、マウスから誘導さ
れ（即ち、そのＤＮＡ配列又はそのアミノ酸配列は、マ
ウス起源のＤＮＡ配列又は同起源のアミノ酸配列に基づ
き、そして不変領域（好ましくは、枠体領域と可変領域
のアミノ酸を含む）は、ヒトから誘導され、重鎖の可変
領域はビールス感染細胞、又は腫瘍付随又はビールス抗
原に特異的なＩｇから誘導される。好ましくは、キメラ
Ｉｇ鎖は、それを適当な対応品（軽、重）と組み合わせ
ることにより、次に標的抗体に特定な二価の免疫複合体
の生成する一価の抗原結合領域を形成し、免疫複合体と
される。本発明は又、上述の免疫複合体をコードするＤ
ＮＡ構成体及び細胞系統、例えば、これ等構成体によっ
て形質転換される骨髄腫類を含む。
【００１０】本発明は選択的にサイトカインを標的細胞
に供給する方法であって、その方法は標的細胞に特異的
な可変領域とカルボキシル末端でペプチド結合によって
サイトカインに結合した不変領域とを有するＩｇ重鎖と
キメラＩｇ重鎖と結合したＩｇ軽鎖を含むキメラＩｇ鎖
とから成り、機能的抗原結合部位を形成し、そして患者
のもつ標的細胞に体して標的細胞に達するのに充分な量
の免疫複合体を投与できるサイトカイン免疫複合体を提
供する。本発明はかくして、抗原結合特異性と抗体活性
が一分子に結合し、サイトカインの生物学的活性も組み
合わされた免疫複合体を提供する。本発明の免疫複合体
は、インビボでの標的細胞にサイトカインを選択的に供
給し得るものであり、シキトンをして局所的炎症応答、
Ｔ細胞の成長と活性化の刺激作用ＡＤＣＣ活性等局部的
生物学的活性を行わしめるものである。かかる複合体
は、本発明の方法に従い、それ等の特異性及び生物学的
活性に依存して、標的化細胞溶解により、ビールス感
染、又は癌等を含む疾病の処置に用いられる。
に供給する方法であって、その方法は標的細胞に特異的
な可変領域とカルボキシル末端でペプチド結合によって
サイトカインに結合した不変領域とを有するＩｇ重鎖と
キメラＩｇ重鎖と結合したＩｇ軽鎖を含むキメラＩｇ鎖
とから成り、機能的抗原結合部位を形成し、そして患者
のもつ標的細胞に体して標的細胞に達するのに充分な量
の免疫複合体を投与できるサイトカイン免疫複合体を提
供する。本発明はかくして、抗原結合特異性と抗体活性
が一分子に結合し、サイトカインの生物学的活性も組み
合わされた免疫複合体を提供する。本発明の免疫複合体
は、インビボでの標的細胞にサイトカインを選択的に供
給し得るものであり、シキトンをして局所的炎症応答、
Ｔ細胞の成長と活性化の刺激作用ＡＤＣＣ活性等局部的
生物学的活性を行わしめるものである。かかる複合体
は、本発明の方法に従い、それ等の特異性及び生物学的
活性に依存して、標的化細胞溶解により、ビールス感
染、又は癌等を含む疾病の処置に用いられる。
【００１１】
【発明の実施形態】本発明は、悪性腫瘍細胞又はビール
ス感染標的細胞を殺すのに有用な免疫複合体に関する。
この免疫複合体は、ビールス感染細胞若しくは悪性腫瘍
細胞上の表面抗原にたいして特異性を有する抗体部を有
する複合体、及びサイトカインを含む。
ス感染標的細胞を殺すのに有用な免疫複合体に関する。
この免疫複合体は、ビールス感染細胞若しくは悪性腫瘍
細胞上の表面抗原にたいして特異性を有する抗体部を有
する複合体、及びサイトカインを含む。
【００１２】図１は代表的な免疫複合体１０の概略図を
しめす。この実施例において、サイトカイン分子２及び
４は、抗体の重鎖ｌ４及び１６のＣＨ３領域１０及び１
２のカルボキシ末端６及び８と結合したペプチドであ
る。ＶL領域２６及び２８には、ＶH１８領域及び２０と
通常のＩｇ形態で対をなし、これによって、免疫複合体
１０のアミノ末端に二つの抗原結合部位３０と３２を、
免疫複合体１０のカルボキシ末端に二つのサイトカイン
・レセプター結合部位４０と４２を提供する・勿論、よ
り広い観点からは、免疫複合体は、図示のように対をな
す必要はない。
しめす。この実施例において、サイトカイン分子２及び
４は、抗体の重鎖ｌ４及び１６のＣＨ３領域１０及び１
２のカルボキシ末端６及び８と結合したペプチドであ
る。ＶL領域２６及び２８には、ＶH１８領域及び２０と
通常のＩｇ形態で対をなし、これによって、免疫複合体
１０のアミノ末端に二つの抗原結合部位３０と３２を、
免疫複合体１０のカルボキシ末端に二つのサイトカイン
・レセプター結合部位４０と４２を提供する・勿論、よ
り広い観点からは、免疫複合体は、図示のように対をな
す必要はない。
【００１３】本発明の免疫複合体は、遺伝子工学の技術
によって、即ちキメラ免疫複合体をコードする核酸構成
体を生成することによって、製造される。好ましくは、
本発明の免疫複合体をコードする遺伝子構成体は、５’
と３’の方向に重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断
片、重鎖の不変領域をコードするＤＮＡ断片及びサイト
カインをコードするＤＮＡから成る。融合される遺伝子
は、それが発現されるところで、適切なレシピエント細
胞の形質転換のため、発現ベクター中に組み込まれるか
挿入される。ハイブリッド鎖は軽鎖（または重鎖）と反
対部分で結合され、一価及び二価の免疫複合体を成す。
サイトカインは、治療上価値のある生物学的機能を有す
るどんなサイトカインでも良いし、又その類似物または
断片でもよい。有用なサイトカインはインターロイキン
及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）及び顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）のごとき増
血因子を含む。マルチメトリック構造が機能することを
要するＬＴ及びＴＮＦαのごときリンフォカインを用い
ることもできる。リンフォカイン又はサイトカインをコ
ードする遺伝子は、デノボにクローンされても良いし、
入手可能な原料から取得しても良いし、又公知のヌクレ
オチド配列から標準のＤＮＡ合成をもちいて合成しても
良い。例えば、ＬＴのＤＮＡ配列はNedwin et al. (198
5) Nucleic Acid Res. 13.6361. 同様に、インターロイ
キン−２の配列はTaniguchi et al. (1983) Nature 30
2:305-318。顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因
子はGassonet al.(1984) Science 266: 1339-1342. 腫
瘍壊死因子アルファはNedwin et al. l. Ibid. 以上、
それぞれ参照できる。
によって、即ちキメラ免疫複合体をコードする核酸構成
体を生成することによって、製造される。好ましくは、
本発明の免疫複合体をコードする遺伝子構成体は、５’
と３’の方向に重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断
片、重鎖の不変領域をコードするＤＮＡ断片及びサイト
カインをコードするＤＮＡから成る。融合される遺伝子
は、それが発現されるところで、適切なレシピエント細
胞の形質転換のため、発現ベクター中に組み込まれるか
挿入される。ハイブリッド鎖は軽鎖（または重鎖）と反
対部分で結合され、一価及び二価の免疫複合体を成す。
サイトカインは、治療上価値のある生物学的機能を有す
るどんなサイトカインでも良いし、又その類似物または
断片でもよい。有用なサイトカインはインターロイキン
及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）及び顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）のごとき増
血因子を含む。マルチメトリック構造が機能することを
要するＬＴ及びＴＮＦαのごときリンフォカインを用い
ることもできる。リンフォカイン又はサイトカインをコ
ードする遺伝子は、デノボにクローンされても良いし、
入手可能な原料から取得しても良いし、又公知のヌクレ
オチド配列から標準のＤＮＡ合成をもちいて合成しても
良い。例えば、ＬＴのＤＮＡ配列はNedwin et al. (198
5) Nucleic Acid Res. 13.6361. 同様に、インターロイ
キン−２の配列はTaniguchi et al. (1983) Nature 30
2:305-318。顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因
子はGassonet al.(1984) Science 266: 1339-1342. 腫
瘍壊死因子アルファはNedwin et al. l. Ibid. 以上、
それぞれ参照できる。
【００１４】複合体にたいする重鎖差不変領域は以下の
五つのアイソタイプのいずれからも選ぶことができる；
アルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ又はミュー。重
鎖又は種々のサブ・クラスの重鎖（Ｉｇサブ・クラスの
ごとき）が利用できる。軽鎖はカッパ又はラムダのいず
れかをもつ。これ等の免疫グロブリン領域にたいするＤ
ＮＡ配列は当業技術分野で良く知られている。（例え
ば、Gillies at al. (1989) J. Immunol. Meth, 125:1
91) 。
五つのアイソタイプのいずれからも選ぶことができる；
アルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ又はミュー。重
鎖又は種々のサブ・クラスの重鎖（Ｉｇサブ・クラスの
ごとき）が利用できる。軽鎖はカッパ又はラムダのいず
れかをもつ。これ等の免疫グロブリン領域にたいするＤ
ＮＡ配列は当業技術分野で良く知られている。（例え
ば、Gillies at al. (1989) J. Immunol. Meth, 125:1
91) 。
【００１５】好ましい実施例に於いて、可変領域は標的
抗原にたいして特異的な抗体から誘導される（癌細胞又
はビールス感染細胞のごとき疾病細に関連す抗原）また
不変領域はＣＨ１，ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
サイトカインをコードする遺伝子は （例えば、適切な
リンカーによって、例えば、ＤＮＡコード （Ｇｌｙ4
−Ｓｅｒ）3によって不変領域（例えば、Ｃｈ３エクソ
ン）をコードする遺伝子の３’末端の枠内で直接或いは
遺伝子間領域を介して結合される。ある種の実施例によ
れば、遺伝子間領域はたんぱく分解酵素切断部位をコー
ドする核酸配列から成る。免疫グロブリンとサイトカイ
ン間のこの位置は、標的位置に於いて、サイトカインの
たんぱく分解性供給をするようにすることができる。例
えば、プラスミンとトリプシンはタンパク質分解しやす
い部位としてリシンとアルギニン残基の後に切断するこ
とは良く知られている。多くの他の部位特異的エンドペ
プチダーゼとそれがアタックするアミノ酸配列は良く知
られている。
抗原にたいして特異的な抗体から誘導される（癌細胞又
はビールス感染細胞のごとき疾病細に関連す抗原）また
不変領域はＣＨ１，ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
サイトカインをコードする遺伝子は （例えば、適切な
リンカーによって、例えば、ＤＮＡコード （Ｇｌｙ4
−Ｓｅｒ）3によって不変領域（例えば、Ｃｈ３エクソ
ン）をコードする遺伝子の３’末端の枠内で直接或いは
遺伝子間領域を介して結合される。ある種の実施例によ
れば、遺伝子間領域はたんぱく分解酵素切断部位をコー
ドする核酸配列から成る。免疫グロブリンとサイトカイ
ン間のこの位置は、標的位置に於いて、サイトカインの
たんぱく分解性供給をするようにすることができる。例
えば、プラスミンとトリプシンはタンパク質分解しやす
い部位としてリシンとアルギニン残基の後に切断するこ
とは良く知られている。多くの他の部位特異的エンドペ
プチダーゼとそれがアタックするアミノ酸配列は良く知
られている。
【００１６】核酸構成体は、キメラ免疫グロブリン鎖の
発現を調節するため、変異領域をコードする遺伝子に対
する内生のプロモータ及びエンハンサを含む。例えば、
可変領域をコードする遺伝子は、リーダーペプチドから
成るＤＮＡ断片として、軽鎖にたいしてはＶＪ遺伝子と
して（機能的に再配置され、接合（Ｊ）部分を有する可
変領域（Ｖ））、重鎖にたいしてはＶＤＪ遺伝子とし
て、そしてこれ等の遺伝子にたいする内生プロモタ及び
エンハンサとして得られる。或いは、可変領域をコード
する遺伝子は内生調節成分とは別個に得られ、これ等の
成分を提供する発現ベクターの中で用いることもでき
る。
発現を調節するため、変異領域をコードする遺伝子に対
する内生のプロモータ及びエンハンサを含む。例えば、
可変領域をコードする遺伝子は、リーダーペプチドから
成るＤＮＡ断片として、軽鎖にたいしてはＶＪ遺伝子と
して（機能的に再配置され、接合（Ｊ）部分を有する可
変領域（Ｖ））、重鎖にたいしてはＶＤＪ遺伝子とし
て、そしてこれ等の遺伝子にたいする内生プロモタ及び
エンハンサとして得られる。或いは、可変領域をコード
する遺伝子は内生調節成分とは別個に得られ、これ等の
成分を提供する発現ベクターの中で用いることもでき
る。
【００１７】可変領域遺伝子は、所望の抗体を生成する
細胞から標準クローニング技術を用いて得られる。特異
的な機能に再構築した可変領域にたいするゲノム・ライ
ブラリーのスクリーニングは、Ｊ領域配列及び下方の配
列を含むＤＮＡ断片のような適切なＤＮＡプローブを用
いることによって達成できる。正確なクローンの特定と
確認は、次にクローン化した遺伝子のＤＮＡシーケンシ
ングとその配列の全長に対応する配列、適切にスプライ
スしたｍＲＮＡと比較することによって達成できる。
細胞から標準クローニング技術を用いて得られる。特異
的な機能に再構築した可変領域にたいするゲノム・ライ
ブラリーのスクリーニングは、Ｊ領域配列及び下方の配
列を含むＤＮＡ断片のような適切なＤＮＡプローブを用
いることによって達成できる。正確なクローンの特定と
確認は、次にクローン化した遺伝子のＤＮＡシーケンシ
ングとその配列の全長に対応する配列、適切にスプライ
スしたｍＲＮＡと比較することによって達成できる。
【００１８】標的抗原は腫瘍細胞、ビールス感染細胞又
は他の疾患の有る細胞の細胞表面抗原である。適切な可
変領域をコードする遺伝子は、一般に、Ｉｇ生成リンパ
球様細胞から得られる。例えば、腫瘍関連抗原またはビ
ールス抗原に特異的なＩｇを生成するハイブリドーマ細
胞系は標準の体細胞ハイブリダイゼーション法によって
生成できる（米国特許第４，９６，２６５号＊参照−ｓ
ｉｃ）。これ等のＩｇ生成細胞系は、機能的に再構築さ
れた形態の可変領域遺伝子源を提供する。この可変領域
の遺伝子は、ネズミ系は広範な所望特異性Ｉｇｓの生成
を可能にするので、通常ネズミをオリジンとする。
は他の疾患の有る細胞の細胞表面抗原である。適切な可
変領域をコードする遺伝子は、一般に、Ｉｇ生成リンパ
球様細胞から得られる。例えば、腫瘍関連抗原またはビ
ールス抗原に特異的なＩｇを生成するハイブリドーマ細
胞系は標準の体細胞ハイブリダイゼーション法によって
生成できる（米国特許第４，９６，２６５号＊参照−ｓ
ｉｃ）。これ等のＩｇ生成細胞系は、機能的に再構築さ
れた形態の可変領域遺伝子源を提供する。この可変領域
の遺伝子は、ネズミ系は広範な所望特異性Ｉｇｓの生成
を可能にするので、通常ネズミをオリジンとする。
【００１９】機能的に再構築された可変領域の遺伝子を
含むＤＮＡ断片は、所望の不変領域（またはその一部）
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片に結合される。Ｉ
ｇ不変領域（重および軽鎖）は、標準の遺伝子クローニ
ング技術によって抗体産生細胞から得られる。ヒトの軽
鎖２種とヒトの重鎖５種がクローンされた。かくして、
ヒト・オリジンの不変領域がこれ等のクローンから容易
に得られる。ハイブリッドＩｇＨ鎖をコードする融合遺
伝子は、レシピエント細胞に導入されるための発現ベク
ターに組み込まれ或いは挿入される。遺伝子構成体のプ
ラスミッドベクターへの導入は標準の遺伝子スプライシ
ング法で達成される。キメラＩｇＨ鎖は同一細胞内で対
応するＬ鎖と共に発現され、完全な免疫グロブリンが同
時に発現、同時に集合される。この目的のため、重軽鎖
構成体は、同一または別のベクター中に置かれても良
い。
含むＤＮＡ断片は、所望の不変領域（またはその一部）
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片に結合される。Ｉ
ｇ不変領域（重および軽鎖）は、標準の遺伝子クローニ
ング技術によって抗体産生細胞から得られる。ヒトの軽
鎖２種とヒトの重鎖５種がクローンされた。かくして、
ヒト・オリジンの不変領域がこれ等のクローンから容易
に得られる。ハイブリッドＩｇＨ鎖をコードする融合遺
伝子は、レシピエント細胞に導入されるための発現ベク
ターに組み込まれ或いは挿入される。遺伝子構成体のプ
ラスミッドベクターへの導入は標準の遺伝子スプライシ
ング法で達成される。キメラＩｇＨ鎖は同一細胞内で対
応するＬ鎖と共に発現され、完全な免疫グロブリンが同
時に発現、同時に集合される。この目的のため、重軽鎖
構成体は、同一または別のベクター中に置かれても良
い。
【００２０】レシピエント細胞系列は一般に、リンパ球
系の細胞である。好ましいレシピエント細胞は骨髄腫
（またはハイブリドーマ）である。骨髄腫は形質転換さ
れた遺伝子によってコードされた免疫グロブリンを合成
し、集合し分泌し、タンパク質をグリコシル化する。特
に好ましいレシピエント細胞は、通常は内生の免疫グロ
ブリンを生じないＳｐ２／０骨髄腫である。形質転換さ
れると、この細胞は形質転換遺伝子構成体によってコー
ドされたＩｇをのみ生成する。形質転換した骨髄腫は培
養液またはマウスの腹腔で成長し得、そこで分泌される
免疫複合体は腹水から回収される。Ｂリンパ球のような
他のリンパ球系の細胞もレシピエント細胞として用いる
ことができる。
系の細胞である。好ましいレシピエント細胞は骨髄腫
（またはハイブリドーマ）である。骨髄腫は形質転換さ
れた遺伝子によってコードされた免疫グロブリンを合成
し、集合し分泌し、タンパク質をグリコシル化する。特
に好ましいレシピエント細胞は、通常は内生の免疫グロ
ブリンを生じないＳｐ２／０骨髄腫である。形質転換さ
れると、この細胞は形質転換遺伝子構成体によってコー
ドされたＩｇをのみ生成する。形質転換した骨髄腫は培
養液またはマウスの腹腔で成長し得、そこで分泌される
免疫複合体は腹水から回収される。Ｂリンパ球のような
他のリンパ球系の細胞もレシピエント細胞として用いる
ことができる。
【００２１】リンパ球系の細胞をキメラＩｇ鎖をコード
する核酸構造体を含むベクターで形質転換するのに、数
種の方法がある。ベクターとリンパ球系細胞に導入する
より好ましい方法は、ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔ融合によ
る(Gillis et al.(1989) Biotechnol. 7:798-804参照)
。他の方法はｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｏｒａｔｉｏｎ及び
燐酸カルシウム沈澱法を含む。
する核酸構造体を含むベクターで形質転換するのに、数
種の方法がある。ベクターとリンパ球系細胞に導入する
より好ましい方法は、ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔ融合によ
る(Gillis et al.(1989) Biotechnol. 7:798-804参照)
。他の方法はｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｏｒａｔｉｏｎ及び
燐酸カルシウム沈澱法を含む。
【００２２】免疫複合体を作る他の有用な方法は、構造
物をコードするＲＮＡ配列を作成し、適切なインビボま
たはインビトロ系でその翻訳をすることである。本発明
の免疫複合体は、サイトカインを体内の標的細胞に選択
的に供給し、サイトカインが局所炎症応答、Ｔ細胞成長
と活性化の刺激及び亜ＤＣＣ活性等の局部的生物学的効
果を及ぼすことである。免疫複合体の治療的有効量が標
的細胞をもつ被検者の循環系に投与される。
物をコードするＲＮＡ配列を作成し、適切なインビボま
たはインビトロ系でその翻訳をすることである。本発明
の免疫複合体は、サイトカインを体内の標的細胞に選択
的に供給し、サイトカインが局所炎症応答、Ｔ細胞成長
と活性化の刺激及び亜ＤＣＣ活性等の局部的生物学的効
果を及ぼすことである。免疫複合体の治療的有効量が標
的細胞をもつ被検者の循環系に投与される。
【００２３】
【実施例】本発明は更に、以下の実施例によってさらに
詳細に説明されるがこれによって発明が限定されるもの
ではない。 １．プラスミッドの構築 以下に記述されるのは、ＰｄＨＬ２の構築、即ち、ヒト
のＣγ１重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子配列を含むプラスミ
ッドとＶ領域ｃＤＮＡカセットの挿入位置である（Gill
ies et al. (1989) J. Immunol, Meth. 125:191 参
照）。このプラスミッドは何れのＩｇＨ鎖サイトカイン
融合を構成するための出発プラスミッドとして用いられ
る。例えば、ＰｄＨＬ２はＩｇ／ＬＴ融合タンパク質の
発現のために用いられる。ＬＴ ｃＤＮＡはλｇｔ１０
にクローンされたヒトの抹消性の血液白血球ライブラリ
ーから分離された。配列はNedwin et al. による文献に
報告されたものと同一であった（Nucleic Acid Res.(19
85)13:6361) 。ｃＤＮＡは、先ず３’未翻訳領域の殆ど
をＢ１３１ヌクレアーゼで除去した後、ＸｈｏＩ断片と
してベクターｐＤＥＭ（Gillies at al., ibid) に挿入
された。その結果、プラスミッド、ｐＤＥＭ−ＬＴ（図
２）は（形質転換された細胞中に）メタロチオネイン
（ＭＴ）プロモータから誘導された５’未翻訳配列と共
に、融合ｍＲＮＡを、そしてＬＴをコードする配列、
３’未翻訳７及びマウスＣｋ遺伝子からのポリＡ追加信
号を発現した。
詳細に説明されるがこれによって発明が限定されるもの
ではない。 １．プラスミッドの構築 以下に記述されるのは、ＰｄＨＬ２の構築、即ち、ヒト
のＣγ１重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子配列を含むプラスミ
ッドとＶ領域ｃＤＮＡカセットの挿入位置である（Gill
ies et al. (1989) J. Immunol, Meth. 125:191 参
照）。このプラスミッドは何れのＩｇＨ鎖サイトカイン
融合を構成するための出発プラスミッドとして用いられ
る。例えば、ＰｄＨＬ２はＩｇ／ＬＴ融合タンパク質の
発現のために用いられる。ＬＴ ｃＤＮＡはλｇｔ１０
にクローンされたヒトの抹消性の血液白血球ライブラリ
ーから分離された。配列はNedwin et al. による文献に
報告されたものと同一であった（Nucleic Acid Res.(19
85)13:6361) 。ｃＤＮＡは、先ず３’未翻訳領域の殆ど
をＢ１３１ヌクレアーゼで除去した後、ＸｈｏＩ断片と
してベクターｐＤＥＭ（Gillies at al., ibid) に挿入
された。その結果、プラスミッド、ｐＤＥＭ−ＬＴ（図
２）は（形質転換された細胞中に）メタロチオネイン
（ＭＴ）プロモータから誘導された５’未翻訳配列と共
に、融合ｍＲＮＡを、そしてＬＴをコードする配列、
３’未翻訳７及びマウスＣｋ遺伝子からのポリＡ追加信
号を発現した。
【００２４】融合タンパク質をコードするベクターは合
成ＤＮＡリンカーを用いてＨｉｎｄIIIとＰｖｕIIで消
化したＰＤＥＭ−ＬＴにＨｉｎｄIIIでＴａｑI（ＣＨ２
−ＬＴ）にあるいはＨｉｎｄIIIでヒトＣγI遺伝子のＮ
ｓｉI断片に結合することによって構築した（図２）。
成ＤＮＡリンカーを用いてＨｉｎｄIIIとＰｖｕIIで消
化したＰＤＥＭ−ＬＴにＨｉｎｄIIIでＴａｑI（ＣＨ２
−ＬＴ）にあるいはＨｉｎｄIIIでヒトＣγI遺伝子のＮ
ｓｉI断片に結合することによって構築した（図２）。
【００２５】これらのリンカー：（５’−ＣＧＡＡＧＡ
ＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡ／ＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧ
ＴＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧ−３’（ＣＨ２
−ＬＴにたいして）；及び５’−ＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧ
ＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣ
ＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＡ／ＣＴＣＣ
ＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧ−
３’）は特異な位置（ＮｓｉＩまたはＴａｑＩ）から重
鎖ドメイン （スラッシュによって示される）の末端ま
での配列をコードするタンパク質を提供し、それ等を成
熟した型のＬＴのアミノ末端に結合する（特異的なＰｖ
ｕII部位の上）。ＣＨ３融合タンパク質に対するリンカ
ーは融合タンパク質をつくるのに将来の使用のため、ド
メインの末端近傍にＳｍａＩ位置を創生する沈黙突然変
異を含む。各構築物の境界にあるＤＮＡ配列が確認さ
れ、ＨｉｎｄIIIからＥｃｏＲＩへの断片はプラスミッ
ドｐｄＨＬＺ−ＶＣγｌｋ（１４，１８）に挿入され
た。このプラスミッドは、ｃｈ１４．１８抗ガンゴリオ
シドＧＤ２抗体のＶカセットを含む（Gikkies et al.,
ibid.)。
ＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡ／ＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧ
ＴＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧ−３’（ＣＨ２
−ＬＴにたいして）；及び５’−ＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧ
ＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣ
ＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＡ／ＣＴＣＣ
ＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧ−
３’）は特異な位置（ＮｓｉＩまたはＴａｑＩ）から重
鎖ドメイン （スラッシュによって示される）の末端ま
での配列をコードするタンパク質を提供し、それ等を成
熟した型のＬＴのアミノ末端に結合する（特異的なＰｖ
ｕII部位の上）。ＣＨ３融合タンパク質に対するリンカ
ーは融合タンパク質をつくるのに将来の使用のため、ド
メインの末端近傍にＳｍａＩ位置を創生する沈黙突然変
異を含む。各構築物の境界にあるＤＮＡ配列が確認さ
れ、ＨｉｎｄIIIからＥｃｏＲＩへの断片はプラスミッ
ドｐｄＨＬＺ−ＶＣγｌｋ（１４，１８）に挿入され
た。このプラスミッドは、ｃｈ１４．１８抗ガンゴリオ
シドＧＤ２抗体のＶカセットを含む（Gikkies et al.,
ibid.)。
【００２６】２．細胞培養と形質転換 Ｓｐ２／0 Ａｇ１４マウス・ハイブリドーマ細胞は、G
illie at al. (BioTechnology(1989) 7:8799)に述べら
れたように維持し、形質転換をおこなった。メトトレキ
セート（ＭＴＸ）中での薬物選択は、形質転換後２４時
間で、等量の０．１μＭＭＴＸを含む培地を加えること
によって開始された。３日の間隔おいて、選択媒体は２
度に亘って供給された。ヒトＩｇ決定要素分泌形質転換
体はELISA を用いて特定され(Gillies et al., 1989, i
bid ）５μＭのＭＴＸを含む培地中での限界希釈によっ
て継代培養された。
illie at al. (BioTechnology(1989) 7:8799)に述べら
れたように維持し、形質転換をおこなった。メトトレキ
セート（ＭＴＸ）中での薬物選択は、形質転換後２４時
間で、等量の０．１μＭＭＴＸを含む培地を加えること
によって開始された。３日の間隔おいて、選択媒体は２
度に亘って供給された。ヒトＩｇ決定要素分泌形質転換
体はELISA を用いて特定され(Gillies et al., 1989, i
bid ）５μＭのＭＴＸを含む培地中での限界希釈によっ
て継代培養された。
【００２７】３．融合タンパク質の精製と特徴 タンパク質は、形質転換された細胞（１ｘ１０6 ／ｍ
Ｌ）を35Ｓ−メチオニン（５０μＣｉ／ｍＬ−Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）を含む成長培地中で１６時間インキュベート
して生合成的に標識した。培地上清は、次にマイクロセ
ントリフュウジ中で遠心分離によって清澄し、標識した
タンパク質はポリクロナール抗ヒトκ鎖抗血清（Jackso
n Immunoresearch, Bar Harbor, Cambridge, ME)とプロ
テインＡセファロース（Repligen, Vorp., Cambridge,
MA) で免疫沈澱せしめた。タンパク質サンプルは２−メ
ルカプトエタノールの存在下または非存在下でゲル・サ
ンプル・バッファー中で５分間煮沸し、７％ポリアクリ
ルアミド・ゲルで分析された。タンパク質は、蛍光間接
撮影法（ＤＭＳＯ中ヂフェニールオクサゾール）とオー
トラジオグラフ法で検出された。
Ｌ）を35Ｓ−メチオニン（５０μＣｉ／ｍＬ−Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）を含む成長培地中で１６時間インキュベート
して生合成的に標識した。培地上清は、次にマイクロセ
ントリフュウジ中で遠心分離によって清澄し、標識した
タンパク質はポリクロナール抗ヒトκ鎖抗血清（Jackso
n Immunoresearch, Bar Harbor, Cambridge, ME)とプロ
テインＡセファロース（Repligen, Vorp., Cambridge,
MA) で免疫沈澱せしめた。タンパク質サンプルは２−メ
ルカプトエタノールの存在下または非存在下でゲル・サ
ンプル・バッファー中で５分間煮沸し、７％ポリアクリ
ルアミド・ゲルで分析された。タンパク質は、蛍光間接
撮影法（ＤＭＳＯ中ヂフェニールオクサゾール）とオー
トラジオグラフ法で検出された。
【００２８】未標識化タンパク質は、鹸濁液状の培養媒
体からＣＨ２−ＬＴに対するモノクロナール抗ヒト抗体
を用い免疫親和性クロマトグラフィ使って、又ＣＨ３−
ＬＴに対しては、プロテインＡセファロースクロマトグ
ラフィを使って精製した。全ての物質は、ＰＢＳへの膜
浸透を用いて濃縮した。Ｃｈ３−ＬＴタンパク質を精製
する方法も開発され、プロテインＡカラムからの溶出中
ＬＴ活性の損失を防いだ。使用済培養液は１０ｍＭ燐酸
ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）の３倍量で希釈
し、室温でＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ａｂｘ（Ｊ．Ｔ．Ｂａ
ｋｅｒ）カラムにいれた。カラムは、吸光度の吸収率が
基線に戻るまで１０ｍＭ燐酸ナトリウムバッファーで洗
浄し、次にｐＨ６．５もＰＢＳ（１５０ｍＭＮａｃｌ、
１０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ６．５）で洗浄した。Ｃ
Ｈ３−ＬＴタンパク質は１５０ｍＭＮａｃｌ、５０ｍＭ
燐酸ナトリウム、ｐＨ６．５で溶離した。
体からＣＨ２−ＬＴに対するモノクロナール抗ヒト抗体
を用い免疫親和性クロマトグラフィ使って、又ＣＨ３−
ＬＴに対しては、プロテインＡセファロースクロマトグ
ラフィを使って精製した。全ての物質は、ＰＢＳへの膜
浸透を用いて濃縮した。Ｃｈ３−ＬＴタンパク質を精製
する方法も開発され、プロテインＡカラムからの溶出中
ＬＴ活性の損失を防いだ。使用済培養液は１０ｍＭ燐酸
ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）の３倍量で希釈
し、室温でＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ａｂｘ（Ｊ．Ｔ．Ｂａ
ｋｅｒ）カラムにいれた。カラムは、吸光度の吸収率が
基線に戻るまで１０ｍＭ燐酸ナトリウムバッファーで洗
浄し、次にｐＨ６．５もＰＢＳ（１５０ｍＭＮａｃｌ、
１０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ６．５）で洗浄した。Ｃ
Ｈ３−ＬＴタンパク質は１５０ｍＭＮａｃｌ、５０ｍＭ
燐酸ナトリウム、ｐＨ６．５で溶離した。
【００２９】４．活性測定 Ｉｇ−ＬＴタンパク質の抗原結合活性はGillies et al.
(J. Immunoi. Meth.(1989) 125:191) に述べられたよ
うに測定され、ＬＴ活性はマウス９２９の１５９１２４
Ｔ２．５サブ・クローン（Dr, F. Schreiber. Universi
ty of Chicagoにより提供）を用いて、細胞溶解または
細胞増殖抑制分析（Kahn et al. (1982)）によって決定
した。細胞は９６−穴にプレートに、 （細胞溶解）或
いは（細胞増殖抑制）マイトミシンＣ（２μｇ／ｍＬ）
を用いて或いは用いずに穴当たり４ｘｌ０4 細胞を蒔種
し、２４時間後１０μＬの試験サンプルがくわえられ
た。細胞は２４時間または４８時間後、クリスタルバイ
オレットで染色され（図の説明参照）穴中に残る染料の
量が未処理の穴のそれ及びＬＴ標準値(Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓ
ｔｅｍ)。同じ分析が、ＧＤ２−保持ヒト黒色腫ライン
Ｍ２１（D. L. Morton, Universityof Californiam Los
Angelesより提供）で行われた。後者の細胞系統は、上
述の通り、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性の測定に用いられ
た。(Gillies etal.(1990) Humann Antibody. Hyvridom
as 1:47)
(J. Immunoi. Meth.(1989) 125:191) に述べられたよ
うに測定され、ＬＴ活性はマウス９２９の１５９１２４
Ｔ２．５サブ・クローン（Dr, F. Schreiber. Universi
ty of Chicagoにより提供）を用いて、細胞溶解または
細胞増殖抑制分析（Kahn et al. (1982)）によって決定
した。細胞は９６−穴にプレートに、 （細胞溶解）或
いは（細胞増殖抑制）マイトミシンＣ（２μｇ／ｍＬ）
を用いて或いは用いずに穴当たり４ｘｌ０4 細胞を蒔種
し、２４時間後１０μＬの試験サンプルがくわえられ
た。細胞は２４時間または４８時間後、クリスタルバイ
オレットで染色され（図の説明参照）穴中に残る染料の
量が未処理の穴のそれ及びＬＴ標準値(Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓ
ｔｅｍ)。同じ分析が、ＧＤ２−保持ヒト黒色腫ライン
Ｍ２１（D. L. Morton, Universityof Californiam Los
Angelesより提供）で行われた。後者の細胞系統は、上
述の通り、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性の測定に用いられ
た。(Gillies etal.(1990) Humann Antibody. Hyvridom
as 1:47)
【００３０】５．Ｉｇ／ＬＴ免疫複合体の発現 Ｉｇ／ＬＴ免疫複合体は、適切な合成リンカーを用い
て、成熟型ＬＴをコードするｃＤＮＡ配列をヒトＣγ１
遺伝子（図２）のＣＨ２又はＣＨ３のエクソンの端部に
融合することによって作られた。この遺伝子の融合は、
次にネズミの抗体１４．１８とヒトＣκ遺伝子のＶ領域
とともにベクターで組み合わせられ、形質転換されたＳ
ｐ２細胞に発現された。これ等の免疫複合体は、抗原結
合活性とＩｇ鎖組立のために発現され、試験された。免
疫複合体は、競合的抗原結合ＥＬＩＳＡ（以下参照）で
測定されたとき、抗原結合を保持し、そして構築され
た。これ等の免疫複合体を発現する細胞は15Ｓ−メチオ
ニンと呼ばれ、分泌されるタンパク質は還元剤の存在下
で又非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。図
３に見られるように、ＣＨ２−ＬＴ免疫複合体は全分子
（約１８０Ｋｄ）と半分子（９０Ｋｄ）の混合物とし
て発現される。ＣＨ３−ＬＴ融合タンパク質は、他方に
於いて、全分子で構築される構造をもつ。この結果は、
ＣＨ３領域はＩｇ鎖構造に深く関わっていることから、
驚くべきことではない。ＣＨ２−ＬＴの構造が何故成り
立つか、即ち、抗体のヒンジ領域の二硫化結合をもつと
いうことは、カルボキシ末端のＬＴ領域の二量化による
ものとみられる。
て、成熟型ＬＴをコードするｃＤＮＡ配列をヒトＣγ１
遺伝子（図２）のＣＨ２又はＣＨ３のエクソンの端部に
融合することによって作られた。この遺伝子の融合は、
次にネズミの抗体１４．１８とヒトＣκ遺伝子のＶ領域
とともにベクターで組み合わせられ、形質転換されたＳ
ｐ２細胞に発現された。これ等の免疫複合体は、抗原結
合活性とＩｇ鎖組立のために発現され、試験された。免
疫複合体は、競合的抗原結合ＥＬＩＳＡ（以下参照）で
測定されたとき、抗原結合を保持し、そして構築され
た。これ等の免疫複合体を発現する細胞は15Ｓ−メチオ
ニンと呼ばれ、分泌されるタンパク質は還元剤の存在下
で又非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。図
３に見られるように、ＣＨ２−ＬＴ免疫複合体は全分子
（約１８０Ｋｄ）と半分子（９０Ｋｄ）の混合物とし
て発現される。ＣＨ３−ＬＴ融合タンパク質は、他方に
於いて、全分子で構築される構造をもつ。この結果は、
ＣＨ３領域はＩｇ鎖構造に深く関わっていることから、
驚くべきことではない。ＣＨ２−ＬＴの構造が何故成り
立つか、即ち、抗体のヒンジ領域の二硫化結合をもつと
いうことは、カルボキシ末端のＬＴ領域の二量化による
ものとみられる。
【００３１】６．Ｉｇ／ＬＴ複合体の生物学的活性 ＣＨ２−ＬＴ及びＣＨ３−ＬＴ複合体のＬＴ活性は、マ
ウス９２９サブ・クローンを用い、標準的な細胞溶解分
析で比較できる（Kahn, A. et al. (1982 ）"Astandard
ized automated computer assisted micro-assay for l
ymphotoxin."In: HumanLymphokines, Biological Resp
onse modified;(Kahn and Hill, eds.)AcademicPress,
New York, p. 23)。この測定法は、免疫複合体のＴＮＦ
／ＬＴレセプタへの結合能力と、この細胞系統における
生細胞死滅プロセスを発動させる能力を測定する。粗原
料の作成と比較すれば（培養液上清）（図４Ａ）、ＣＨ
３−ＬＴはＣＨ２−ＬＴより極めてより活性的（この分
析によれば約１００倍）であることが分かり、ＬＴ標準
と約同じのモル当たりの比活性を示している。このＣＨ
３−ＬＴのより高い活性は充分に構成されたＨ−鎖融合
タンパク質のより多い配分によるとみられる。かくし
て、免疫複合体に於けるＣＨ３エクソンの存在は、Ｈ−
鎖をしてより効率的に関与せしめ、多分ＬＴ領域の二量
体化を許容し、その結果、より大きなＬＴレセプタ結合
の許容するように配置せしめるものと思惟される。
ウス９２９サブ・クローンを用い、標準的な細胞溶解分
析で比較できる（Kahn, A. et al. (1982 ）"Astandard
ized automated computer assisted micro-assay for l
ymphotoxin."In: HumanLymphokines, Biological Resp
onse modified;(Kahn and Hill, eds.)AcademicPress,
New York, p. 23)。この測定法は、免疫複合体のＴＮＦ
／ＬＴレセプタへの結合能力と、この細胞系統における
生細胞死滅プロセスを発動させる能力を測定する。粗原
料の作成と比較すれば（培養液上清）（図４Ａ）、ＣＨ
３−ＬＴはＣＨ２−ＬＴより極めてより活性的（この分
析によれば約１００倍）であることが分かり、ＬＴ標準
と約同じのモル当たりの比活性を示している。このＣＨ
３−ＬＴのより高い活性は充分に構成されたＨ−鎖融合
タンパク質のより多い配分によるとみられる。かくし
て、免疫複合体に於けるＣＨ３エクソンの存在は、Ｈ−
鎖をしてより効率的に関与せしめ、多分ＬＴ領域の二量
体化を許容し、その結果、より大きなＬＴレセプタ結合
の許容するように配置せしめるものと思惟される。
【００３２】精製調製品を比較すると、ＣＨ２−ＬＴと
ＣＨ３−ＬＴの活性の差異は更に明白になるが、複合体
の活性は、特にＣＨ３−ＬＴでは、ＬＴコントロールと
比して大きく減少する(図４Ｂ)。両方のタンパク質が酸
性ｐＨ（即ち、ｐＨ４より小）溶出工程を用いることに
よって精製されたので、培養液上清のｐＨ感受性を調
べ、ＬＴ活性は酸に極めて影響されやすいことがわかっ
た。他の精製様式が、ｐＨを６．５以下にならないよう
に計画された。この様式による材料がプロテインＡのよ
り精製されたもの、出発材料及びＬＴ標準と比較され
た。マイトミシンＣ非存在下の細胞増殖抑制分析の結
果、図５に示す通り、低いｐＨを避けると、精製中、充
分なＬＴ活性が維持されることを示す。この測定は、Ｌ
Ｔ制御により良い投与量応答が得られること、ＣＨ２−
ＬＴとＣＨ３−ＬＴの間の関係は両者の分析システムに
首尾一貫していることを示す。同じ結は、細胞溶解の分
析でも得られた。以上の結果は、（この分析で測定され
るとき）、ＬＴがＩｇＨ鎖に融合すると充分な活性が維
持されることを示している。ＬＴアミノ末端が抗体のカ
ルボキシ末端と共有結合で結合されるという事実は、Ｌ
Ｔレセプタ結合を妨げず、結合工程後、細胞死滅プロセ
スを妨げることはないようである。
ＣＨ３−ＬＴの活性の差異は更に明白になるが、複合体
の活性は、特にＣＨ３−ＬＴでは、ＬＴコントロールと
比して大きく減少する(図４Ｂ)。両方のタンパク質が酸
性ｐＨ（即ち、ｐＨ４より小）溶出工程を用いることに
よって精製されたので、培養液上清のｐＨ感受性を調
べ、ＬＴ活性は酸に極めて影響されやすいことがわかっ
た。他の精製様式が、ｐＨを６．５以下にならないよう
に計画された。この様式による材料がプロテインＡのよ
り精製されたもの、出発材料及びＬＴ標準と比較され
た。マイトミシンＣ非存在下の細胞増殖抑制分析の結
果、図５に示す通り、低いｐＨを避けると、精製中、充
分なＬＴ活性が維持されることを示す。この測定は、Ｌ
Ｔ制御により良い投与量応答が得られること、ＣＨ２−
ＬＴとＣＨ３−ＬＴの間の関係は両者の分析システムに
首尾一貫していることを示す。同じ結は、細胞溶解の分
析でも得られた。以上の結果は、（この分析で測定され
るとき）、ＬＴがＩｇＨ鎖に融合すると充分な活性が維
持されることを示している。ＬＴアミノ末端が抗体のカ
ルボキシ末端と共有結合で結合されるという事実は、Ｌ
Ｔレセプタ結合を妨げず、結合工程後、細胞死滅プロセ
スを妨げることはないようである。
【００３３】７．抗原結合とエフェクターＩｇ／ＬＴ免疫複合体の機能 免疫複合体も抗原結合活性は、抗原で被覆したプレート
上で、直接結合又は拮抗的分析形式で測定される。直接
的結合分析では、抗原結合活性はコントロールｃｈ１
４．１８抗体のそれよりずっと高いことが分かった。Ｇ
Ｄ２抗原源は神経芽細胞腫細胞からの、粗い膜エキスで
あったので、ＴＮＦ／ＬＴレセプタを準備に存在せし
め、ＬＴ領域を通しての複合体の結合はこの増大した活
性に効果があった。抗原結合を拮抗分析で測ったとき、
複合体は標識ＣＨ１４．１８抗体とほぼ同じであり、抗
原は非標識化ｃｈ１４．１８より僅かに有効であるに過
ぎなかった。
上で、直接結合又は拮抗的分析形式で測定される。直接
的結合分析では、抗原結合活性はコントロールｃｈ１
４．１８抗体のそれよりずっと高いことが分かった。Ｇ
Ｄ２抗原源は神経芽細胞腫細胞からの、粗い膜エキスで
あったので、ＴＮＦ／ＬＴレセプタを準備に存在せし
め、ＬＴ領域を通しての複合体の結合はこの増大した活
性に効果があった。抗原結合を拮抗分析で測ったとき、
複合体は標識ＣＨ１４．１８抗体とほぼ同じであり、抗
原は非標識化ｃｈ１４．１８より僅かに有効であるに過
ぎなかった。
【００３４】この結果によれば、抗腫瘍細胞抗体の抗原
結合活性をサイトカインの効力のある生物学的活性と組
み合わせることは可能である。免疫複合体中のＣＨ３エ
クソンの存在は、完全なＨ−鎖の構築を可能にし、その
結果、より高いＬＴとエフェクター活性に至ることにな
る。Ｈ−鎖の組立は、ＬＴの二量体化をもたらすものと
おもわれる。更に、高度に活性のあるＣＨ３−ＬＴ免疫
複合体では、ＬＴ領域のアミノ末端はＩｇＨ鎖にペプチ
ド結合されるので、遊離のアミノ末端はＬＴのそのレセ
プタへの結合には不必要である。
結合活性をサイトカインの効力のある生物学的活性と組
み合わせることは可能である。免疫複合体中のＣＨ３エ
クソンの存在は、完全なＨ−鎖の構築を可能にし、その
結果、より高いＬＴとエフェクター活性に至ることにな
る。Ｈ−鎖の組立は、ＬＴの二量体化をもたらすものと
おもわれる。更に、高度に活性のあるＣＨ３−ＬＴ免疫
複合体では、ＬＴ領域のアミノ末端はＩｇＨ鎖にペプチ
ド結合されるので、遊離のアミノ末端はＬＴのそのレセ
プタへの結合には不必要である。
【００３５】８．Ｉｇ／ＧＭ−ＣＳＦ免疫複合体の構築
と発現 Ｉｇ／ＧＭ−ＣＳＦ複合体はＧＭ−ＣＳＦをコードする
核酸配列をＩｇ重鎖をコードする核酸配列に結合し、そ
れによって、コードされたタンパク質がカルボキシ末端
を介してＧＭ−ＣＳＦに融合された重鎖を含むようにし
た。ＧＭ−ＣＳＦの配列をコードする成熟したタンパク
質は、ＬＹ複合体に付き上述したように、そして当業技
術分野で良く知られているいるように、ＰｄＨＤＬ２及
び適切なオリゴヌクレオチドリンカーを用いて、ヒトＣ
γ１遺伝子に結合される。又、ＬＴ複合体について上記
したように、Ｉｇ重鎖ＧＭ−ＣＳＦ融合遺伝子は１４．
１８抗ＧＤ２重鎖の重鎖Ｖ領域の遺伝子と組み合わさ
れ、ヒトｃｋ遺伝子及び１４．１８抗体のＶ領域遺伝子
と結合された。次に、ＤＮＡのハイブリドーマ細胞への
形質転換、その結果としてのＨ及びＬ遺伝子の発現後、
ＧＭ−ＣＳＦは各Ｈ鎖に接合した完全なｃｈ１４．１８
抗体が生成された。融合タンパク質は、プロテインＡセ
ファロースへの吸着及びそれからの溶出を用い調整した
媒体から精製した。
と発現 Ｉｇ／ＧＭ−ＣＳＦ複合体はＧＭ−ＣＳＦをコードする
核酸配列をＩｇ重鎖をコードする核酸配列に結合し、そ
れによって、コードされたタンパク質がカルボキシ末端
を介してＧＭ−ＣＳＦに融合された重鎖を含むようにし
た。ＧＭ−ＣＳＦの配列をコードする成熟したタンパク
質は、ＬＹ複合体に付き上述したように、そして当業技
術分野で良く知られているいるように、ＰｄＨＤＬ２及
び適切なオリゴヌクレオチドリンカーを用いて、ヒトＣ
γ１遺伝子に結合される。又、ＬＴ複合体について上記
したように、Ｉｇ重鎖ＧＭ−ＣＳＦ融合遺伝子は１４．
１８抗ＧＤ２重鎖の重鎖Ｖ領域の遺伝子と組み合わさ
れ、ヒトｃｋ遺伝子及び１４．１８抗体のＶ領域遺伝子
と結合された。次に、ＤＮＡのハイブリドーマ細胞への
形質転換、その結果としてのＨ及びＬ遺伝子の発現後、
ＧＭ−ＣＳＦは各Ｈ鎖に接合した完全なｃｈ１４．１８
抗体が生成された。融合タンパク質は、プロテインＡセ
ファロースへの吸着及びそれからの溶出を用い調整した
媒体から精製した。
【００３６】融合タンパク質は１０％ＳＤＳ−ポリアク
リルアミッドを用い（図８）、還元（Ｒ）条件で、又は
非還元条件（ＮＲ）で、電気泳動により分析された。タ
ンパク質は、クマジーブルーを用い、染色され視覚化さ
れた。レーンｌはｃｈ１４．１８−ＣＨ３−ＧＭＣＳ
Ｆ；レーン２はｃｈ１４．１８；分子量マーカーは指示
された大きさでｋＤで表示された。レーンｌの融合Ｈ−
鎖の相対的分子量７５ｋＤは、Ｈ−鎖（５０ｋＤ）に融
合されたグリコシル化ＧＭ−ＣＳＦ（〜２５ｋＤ）と一
致する。非還元レーンｌで、融合タンパク質が〜２００
ｋＤの単一高分子量種に成っていることに留意。
リルアミッドを用い（図８）、還元（Ｒ）条件で、又は
非還元条件（ＮＲ）で、電気泳動により分析された。タ
ンパク質は、クマジーブルーを用い、染色され視覚化さ
れた。レーンｌはｃｈ１４．１８−ＣＨ３−ＧＭＣＳ
Ｆ；レーン２はｃｈ１４．１８；分子量マーカーは指示
された大きさでｋＤで表示された。レーンｌの融合Ｈ−
鎖の相対的分子量７５ｋＤは、Ｈ−鎖（５０ｋＤ）に融
合されたグリコシル化ＧＭ−ＣＳＦ（〜２５ｋＤ）と一
致する。非還元レーンｌで、融合タンパク質が〜２００
ｋＤの単一高分子量種に成っていることに留意。
【００３７】９．Ｉｇ／ＧＭ−ＣＳＦ複合体の生物学的
活性 ｃｈ１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質のＧＭ−
ＣＳＦ活性は、ＧＭ−ＣＳＦ依存細胞系統ＡＭＬ−１９
３（ヒト急性骨髄性白血病）を用いて増殖分析で検討さ
れた。細胞は、インシュリンとトランスフェリンを含む
血清のない媒体で２日間培養された（ＧＭ−ＣＳＦのな
い状態で）。そして、ＧＭ−ＣＳＦ即ち、融合サンプル
を薄めて添加された。五日後に、５μＣｉのチミヂンが
加えられ、１６時間後。、細胞は１０％トリクロロ酢酸
の中に回収された。３０分後、氷上に析出物質ＧＦ／Ｃ
フィルターで集められ、乾燥され、液体シンチレーショ
ンで測定された。
活性 ｃｈ１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質のＧＭ−
ＣＳＦ活性は、ＧＭ−ＣＳＦ依存細胞系統ＡＭＬ−１９
３（ヒト急性骨髄性白血病）を用いて増殖分析で検討さ
れた。細胞は、インシュリンとトランスフェリンを含む
血清のない媒体で２日間培養された（ＧＭ−ＣＳＦのな
い状態で）。そして、ＧＭ−ＣＳＦ即ち、融合サンプル
を薄めて添加された。五日後に、５μＣｉのチミヂンが
加えられ、１６時間後。、細胞は１０％トリクロロ酢酸
の中に回収された。３０分後、氷上に析出物質ＧＦ／Ｃ
フィルターで集められ、乾燥され、液体シンチレーショ
ンで測定された。
【００３８】図９において、ＧＭ−ＣＳＦの各種量、分
泌融合蛋白質またはプロテインＡセファロースによって
精製されたｃｈ１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦを含むコンデ
イション培地で得られた増殖が比較された。結果は、一
度分子がＨ−鎖に融合すると、有意のＧＭ−ＣＦＳ活性
が維持されることを示している。だが、活性はｇＧＭ−
ＣＦ標準値（精製された融合タンパク質）の２０％（調
整された媒体の時）か１０％である。最大の取り込みは
精製融合タンパク質（ＧＭ−ＣＳＦ等価値又は全タンパ
ク質の５０ｎｇ）の１０ｎｇ／ｍＬ以下であった。この
僅かな活性の損失はこの融合タンパク質も有用性に影響
するとは思えない。これは、特に大量のｃｈ１４．１８
−ＧＭ−ＣＳＦがＤＧ２抗原を発現する固型腫瘍に集積
するときである。
泌融合蛋白質またはプロテインＡセファロースによって
精製されたｃｈ１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦを含むコンデ
イション培地で得られた増殖が比較された。結果は、一
度分子がＨ−鎖に融合すると、有意のＧＭ−ＣＦＳ活性
が維持されることを示している。だが、活性はｇＧＭ−
ＣＦ標準値（精製された融合タンパク質）の２０％（調
整された媒体の時）か１０％である。最大の取り込みは
精製融合タンパク質（ＧＭ−ＣＳＦ等価値又は全タンパ
ク質の５０ｎｇ）の１０ｎｇ／ｍＬ以下であった。この
僅かな活性の損失はこの融合タンパク質も有用性に影響
するとは思えない。これは、特に大量のｃｈ１４．１８
−ＧＭ−ＣＳＦがＤＧ２抗原を発現する固型腫瘍に集積
するときである。
【００３９】免疫複合体のインビボの半減期は、マウス
にＣＨ１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦＷＯ注射（尾の静脈に
２０μｇ注射）して決定された。血液のサンプルを指定
時間に回収し、血清中の融合タンパク質の量をＥＬＩＳ
Ａにより決定した。捕獲抗体は、ポリクロナールヤギ抗
ヒトＩｇＧ（Ｆｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）で、検出抗体は
ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ヒトＫであった。表１に見
られるように、半減期（２４時間と４日の時間点を取っ
た）はほぼ３日であった。これはヒトの場合の８５分(H
errmann et al. (1989) J. Clin Oncol. 7:159-167) と
比較になる。この長い半減期は、特に腫瘍部分の免疫複
合体の局所濃度は抗体標的によって長くなり得るから、
融合タンパク質の減少した活性の補償するものといえ
る。
にＣＨ１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦＷＯ注射（尾の静脈に
２０μｇ注射）して決定された。血液のサンプルを指定
時間に回収し、血清中の融合タンパク質の量をＥＬＩＳ
Ａにより決定した。捕獲抗体は、ポリクロナールヤギ抗
ヒトＩｇＧ（Ｆｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）で、検出抗体は
ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ヒトＫであった。表１に見
られるように、半減期（２４時間と４日の時間点を取っ
た）はほぼ３日であった。これはヒトの場合の８５分(H
errmann et al. (1989) J. Clin Oncol. 7:159-167) と
比較になる。この長い半減期は、特に腫瘍部分の免疫複
合体の局所濃度は抗体標的によって長くなり得るから、
融合タンパク質の減少した活性の補償するものといえ
る。
【００４０】 * ネズミは尾の静脈部に融合タンパク質ch14.18-CH3-GM
-CSFを20μg 注射された。小さいサンプル(-50μL)が尾
の静脈部から採取され、ヒトの抗体の決定因子のため分
析された。
-CSFを20μg 注射された。小さいサンプル(-50μL)が尾
の静脈部から採取され、ヒトの抗体の決定因子のため分
析された。
【００４１】１０．Ｉｇ／ＴＮＦ免疫複合体の構築、発
現及び活性 Ｉｇ／ＴＮＦ免疫複合体は、ＴＮＦαをコードする核酸
配列と免疫グロブリン重鎖を融合して、それによりＴＮ
Ｆαが重鎖のカルボキシ末端に融合するようにして、作
成された。簡単には、成熟したＴＮＦαをコードする配
列を、オリゴヌクレオチドを用い、ヒトＣγ１ ＣＨ３
エクソンの末端に融合した。再構築された断片は、抗−
ＧＤ２マウス抗体１４．１８からの遺伝子をコードする
重鎖Ｖ領域の下方で結合する。このベクターに更に加わ
るのは、抗−ＧＤ２マウス抗体１４．１８からの軽いＶ
領域をコードするＶ領域遺伝子とＣ領域符合化遺伝子の
両方を含むヒトκ遺伝子である。ハイブリドーマ細胞
は、上述のように、形質転換され、選択される。ヒト抗
体決定因子を分泌するクローンは、拡張され、プロテイ
ンＡセファロースクロマトグラフィーのよってｃｈ１
４．１８−ＣＨ３−ＴＮＦα融合タンパク質の生成と精
製のために用いられる。融合タンパク質の活性は上述の
ようにＣＨ３−ＬＴ融合タンパク質に対してテストされ
た。
現及び活性 Ｉｇ／ＴＮＦ免疫複合体は、ＴＮＦαをコードする核酸
配列と免疫グロブリン重鎖を融合して、それによりＴＮ
Ｆαが重鎖のカルボキシ末端に融合するようにして、作
成された。簡単には、成熟したＴＮＦαをコードする配
列を、オリゴヌクレオチドを用い、ヒトＣγ１ ＣＨ３
エクソンの末端に融合した。再構築された断片は、抗−
ＧＤ２マウス抗体１４．１８からの遺伝子をコードする
重鎖Ｖ領域の下方で結合する。このベクターに更に加わ
るのは、抗−ＧＤ２マウス抗体１４．１８からの軽いＶ
領域をコードするＶ領域遺伝子とＣ領域符合化遺伝子の
両方を含むヒトκ遺伝子である。ハイブリドーマ細胞
は、上述のように、形質転換され、選択される。ヒト抗
体決定因子を分泌するクローンは、拡張され、プロテイ
ンＡセファロースクロマトグラフィーのよってｃｈ１
４．１８−ＣＨ３−ＴＮＦα融合タンパク質の生成と精
製のために用いられる。融合タンパク質の活性は上述の
ようにＣＨ３−ＬＴ融合タンパク質に対してテストされ
た。
【００４２】図１０に示されるように、融合タンパク質
で得られる細胞毒性の量は分析の早期（２０ｈｒ）又は
後期（２４ｈｒ）で天然型のＴＮＦαのそれに達するか
上回るかした。この融合タンパク質は、たとえそれがプ
ロテインＡセファロースを用いて精製されたとしても、
ＴＮＦα活性として充分に機能的である。ＣＨ３−ＬＴ
構造体は同じプロトコルを用いて、酸性のｐＨでは溶出
により部分的に不活性になった。Ｉｇ／ＬＴ、Ｉｇ／Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ及びＩｇ／ＴＮＦα免疫複合体について上述
の結果はの示すところは、抗体は一般に、抗原結合活性
又は抗体の機能を失なわずにサイトカインに融合できる
ということであり、またサイトカインのレセプター結合
活性も生物学的能力も失わずにこれができるということ
である。
で得られる細胞毒性の量は分析の早期（２０ｈｒ）又は
後期（２４ｈｒ）で天然型のＴＮＦαのそれに達するか
上回るかした。この融合タンパク質は、たとえそれがプ
ロテインＡセファロースを用いて精製されたとしても、
ＴＮＦα活性として充分に機能的である。ＣＨ３−ＬＴ
構造体は同じプロトコルを用いて、酸性のｐＨでは溶出
により部分的に不活性になった。Ｉｇ／ＬＴ、Ｉｇ／Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ及びＩｇ／ＴＮＦα免疫複合体について上述
の結果はの示すところは、抗体は一般に、抗原結合活性
又は抗体の機能を失なわずにサイトカインに融合できる
ということであり、またサイトカインのレセプター結合
活性も生物学的能力も失わずにこれができるということ
である。
【００４３】１１．適用量 本発明の免疫複合体は、一日当たりｌ００ｍｇ／ｋｇ体
重比の範囲で治療上有効な適用量で投与できる。免疫複
合体は生理的食塩水で或いは他のどんな生体適合性緩衝
液でも投与できる。この液は全身性に投与できる（例え
ば、静脈又は筋肉注射で）。
重比の範囲で治療上有効な適用量で投与できる。免疫複
合体は生理的食塩水で或いは他のどんな生体適合性緩衝
液でも投与できる。この液は全身性に投与できる（例え
ば、静脈又は筋肉注射で）。
【００４４】他の実施例 本発明は、その精神と本質的特徴から離れることなく、
他の特定形式でも実施できる。本文中の実施例は、従っ
て、あらゆる観点において、例示的とみなされるべき
で、限定的に考えられるべきではない。本発明の範囲
は、以上の記載からではなく、添付する請求項で示され
る。従って、請求項の意味及び等価の範囲に入るあらゆ
る変更はその範囲に包含される。
他の特定形式でも実施できる。本文中の実施例は、従っ
て、あらゆる観点において、例示的とみなされるべき
で、限定的に考えられるべきではない。本発明の範囲
は、以上の記載からではなく、添付する請求項で示され
る。従って、請求項の意味及び等価の範囲に入るあらゆ
る変更はその範囲に包含される。
【００４５】
本発明の以上及び他の目的、及びその種々の特徴は添付
する図面とともに読まれるとき、以下の記載からより充
分に理解されよう。
する図面とともに読まれるとき、以下の記載からより充
分に理解されよう。
【図１】 本発明の免疫複合体の一実施例の概略的説明
図でさる；
図でさる；
【図２】 ＡはＬＴとヒトＩｇ Ｈ鎖間の融合タンパク
質の概略図である；ここで、図２あはプラスミッドｐＢ
Ｒ３２２にクローンされたヒトＣγ１遺伝子断片地図で
ある；図２ＢはＣＨ２領域の末端でＬＴに融合されたＣ
γ１遺伝子を示す；図２ＣはＣＨ３領域の末端でＬＴに
融合されたＣγ１遺伝子を示す；図２Ｄはプロモータ
（矢印）、ＬＴ（空欄）の天然型リーダーペプチド、成
熟タンパク質（＋１）の第一の残基及びマウスのκＬー
鎖およびポリＡ未翻訳配列含む発現ベクターｐＤＥＭに
クローンされたＬＴをコードするｃＤＮＡを示す；空欄
はＡ−ＣにおけＣγ１のタンパク質コード領域を示し、
ブラック・ボックスはタンパク質をコードする配列を結
合するのに用いられる合成リンカー示す；そしてストラ
イプ・ボックスはＬＴコードする配列を示す。
質の概略図である；ここで、図２あはプラスミッドｐＢ
Ｒ３２２にクローンされたヒトＣγ１遺伝子断片地図で
ある；図２ＢはＣＨ２領域の末端でＬＴに融合されたＣ
γ１遺伝子を示す；図２ＣはＣＨ３領域の末端でＬＴに
融合されたＣγ１遺伝子を示す；図２Ｄはプロモータ
（矢印）、ＬＴ（空欄）の天然型リーダーペプチド、成
熟タンパク質（＋１）の第一の残基及びマウスのκＬー
鎖およびポリＡ未翻訳配列含む発現ベクターｐＤＥＭに
クローンされたＬＴをコードするｃＤＮＡを示す；空欄
はＡ−ＣにおけＣγ１のタンパク質コード領域を示し、
ブラック・ボックスはタンパク質をコードする配列を結
合するのに用いられる合成リンカー示す；そしてストラ
イプ・ボックスはＬＴコードする配列を示す。
【図３】 ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲルの写真であ
り、融合タンパク質鎖集合の分析を示す；ここでキメラ
ｃｈ１４．１８抗体はレーン１及び４に示されており、
ＣＨ２−ＬＴはレーン２及び５に示されており、ＣＨ３
−Ｌはレーン３及び６に示されいる。染色マーカータン
パク質の位置とそれ等の見かけ状の分子量が、示されて
いる。乾燥したゲル４時間（レーン１及び４）又は１８
時間、被膜に露光された。細胞は35Ｓ−メチオニンで標
識され、分泌されたタンパク質は抗ヒトκ抗血清とタン
パク質で沈澱せしめ、還元（レーン１−３）又は未還元
の（レーン４−６）ＳＤＳゲルで分析した。
り、融合タンパク質鎖集合の分析を示す；ここでキメラ
ｃｈ１４．１８抗体はレーン１及び４に示されており、
ＣＨ２−ＬＴはレーン２及び５に示されており、ＣＨ３
−Ｌはレーン３及び６に示されいる。染色マーカータン
パク質の位置とそれ等の見かけ状の分子量が、示されて
いる。乾燥したゲル４時間（レーン１及び４）又は１８
時間、被膜に露光された。細胞は35Ｓ−メチオニンで標
識され、分泌されたタンパク質は抗ヒトκ抗血清とタン
パク質で沈澱せしめ、還元（レーン１−３）又は未還元
の（レーン４−６）ＳＤＳゲルで分析した。
【図４】 免疫複合体の天然型ＬＴ（△−−△）、ＣＨ
２−ＬＴ（ｏ−−ｏ）又はＣＨ３−ＬＴ（●−−●）の
ＬＴ細胞溶解の活性を示すグラフである。マウスの繊維
芽細胞の感受性クローンを用い、一日分析でマイトマシ
ンＣを用いて行った。クリスタルバイオレットで染色
し、６３０ｎｍにおける吸収率を測定して相対的細胞生
存率を測定した。図４ＡはＥｌｉｓａによって複合体を
最初に測定後分析され形質転換された細胞の培養上清を
示す。図４Ｂは、プロテインＡセファローズ又は免疫親
和性クロマトグラフィーに引き続いて分析された精製タ
ンパク質を示す。
２−ＬＴ（ｏ−−ｏ）又はＣＨ３−ＬＴ（●−−●）の
ＬＴ細胞溶解の活性を示すグラフである。マウスの繊維
芽細胞の感受性クローンを用い、一日分析でマイトマシ
ンＣを用いて行った。クリスタルバイオレットで染色
し、６３０ｎｍにおける吸収率を測定して相対的細胞生
存率を測定した。図４ＡはＥｌｉｓａによって複合体を
最初に測定後分析され形質転換された細胞の培養上清を
示す。図４Ｂは、プロテインＡセファローズ又は免疫親
和性クロマトグラフィーに引き続いて分析された精製タ
ンパク質を示す。
【図５】 精製中のｐＨのＣＨ３−ＬＴの細胞増殖抑制
活性についての精製過程における影響を示すグラフであ
る。天然のＬＴ（ｏ−−ｏ）、培養上清のＣＨ３−ＬＴ
（△−−△）、プロテインＡセファローズ・クロマトグ
ラフィーで精製したＣＨ３−ＬＴ、ｐＨ６．５（△−−
△）で精製したＣＨ３−ＬＴが、マウス９２９サブクロ
ーンを用いて、細胞増殖抑制分析（マイトマシンＣは使
わず）で比較した。
活性についての精製過程における影響を示すグラフであ
る。天然のＬＴ（ｏ−−ｏ）、培養上清のＣＨ３−ＬＴ
（△−−△）、プロテインＡセファローズ・クロマトグ
ラフィーで精製したＣＨ３−ＬＴ、ｐＨ６．５（△−−
△）で精製したＣＨ３−ＬＴが、マウス９２９サブクロ
ーンを用いて、細胞増殖抑制分析（マイトマシンＣは使
わず）で比較した。
【図６】 ＬＴとＣＨ３−ＬＴ ＧＤ２−陽性Ｍ２１ヒ
ト黒色腫細胞の細胞溶解性及び細胞増殖抑制活性を示す
グラフである。Ｍ２１細胞が、マイトミシンＣの存在下
で（図６Ａ）又は非存在下で（図６Ｂ）９６−穴プレー
トに藩種され、ＬＴ（ｏ−−ｏ）又はＣＨ３−ＬＴ（●
−−●）の希釈溶液が添加された。相対的細胞成長率
が、４８時間後にクリスタルバイオレットで染色し、６
３０ ｎｍにおける吸収率を測り、測定された。
ト黒色腫細胞の細胞溶解性及び細胞増殖抑制活性を示す
グラフである。Ｍ２１細胞が、マイトミシンＣの存在下
で（図６Ａ）又は非存在下で（図６Ｂ）９６−穴プレー
トに藩種され、ＬＴ（ｏ−−ｏ）又はＣＨ３−ＬＴ（●
−−●）の希釈溶液が添加された。相対的細胞成長率
が、４８時間後にクリスタルバイオレットで染色し、６
３０ ｎｍにおける吸収率を測り、測定された。
【図７】 Ｉｇ／ＬＴ免疫複合体の抗原結合活性を示す
グラフである。相対的結合率は、拮抗剤として未標識ｃ
ｈ１４、１８ （○−−○）、ＣＨ２ーＬＴ（●−−
●）又は標識ｃｈ１４、１８（□−−□）のいずれかと
トレーサーとしてＨＲＰを結合したｃｈ１４、１８抗体
をもちい、比較抗原結合分析で測定された。
グラフである。相対的結合率は、拮抗剤として未標識ｃ
ｈ１４、１８ （○−−○）、ＣＨ２ーＬＴ（●−−
●）又は標識ｃｈ１４、１８（□−−□）のいずれかと
トレーサーとしてＨＲＰを結合したｃｈ１４、１８抗体
をもちい、比較抗原結合分析で測定された。
【図８】 融合タンパク質ｃｈ１４．１８−ＣＨ３−Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ（レーンＬ）と未融合のタンパク質ｃｈ１
４．１８（レーン２）の還元状態（Ｒ）または非還元状
態（ＮＲ）でのＳＤＳ−ポリアクリルアニド・ゲルの写
真でａｒｕ．ここで、Ｍは指定された大きさ分子量マー
カーである。
Ｍ−ＣＳＦ（レーンＬ）と未融合のタンパク質ｃｈ１
４．１８（レーン２）の還元状態（Ｒ）または非還元状
態（ＮＲ）でのＳＤＳ−ポリアクリルアニド・ゲルの写
真でａｒｕ．ここで、Ｍは指定された大きさ分子量マー
カーである。
【図９】 ＧＳ−ＣＳＦ標準（ｏ−−ｏ）及びコンデイ
ション培地（△−−△）と比較したＩｇ／ＧＭ−ＣＳＦ
免疫複合体ｃｈ．１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦ（●−−
●）のＧＭ−ＣＳＦ活性を示すグラフである。
ション培地（△−−△）と比較したＩｇ／ＧＭ−ＣＳＦ
免疫複合体ｃｈ．１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦ（●−−
●）のＧＭ−ＣＳＦ活性を示すグラフである。
【図１０】 ＴＮＦ-α（前期）（ｏ−−ｏ）とＴＮＦ-
α（後期）（△−−△）と比較されるＩｇ／ＴＮＦ免疫
複合体ｃｈ１４．１８−ＴＮＦ- α（前期）、ｃｈ１
４．１８−ＴＮＦ- α（後期）（▲−−▲）のＴＮＦα
の活性を示すグラフある。
α（後期）（△−−△）と比較されるＩｇ／ＴＮＦ免疫
複合体ｃｈ１４．１８−ＴＮＦ- α（前期）、ｃｈ１
４．１８−ＴＮＦ- α（後期）（▲−−▲）のＴＮＦα
の活性を示すグラフある。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年８月２４日（２０００．８．２
４）
４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/535 Ｃ０７Ｋ 14/52 14/55 14/525 16/08 14/535 16/30 14/55 19/00 16/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 16/30 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＤ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (45)
- 【請求項１】Ｉｇ重鎖とサイトカインから成るキメラ免
疫グロブリン（Ｉｇ）鎖。 - 【請求項２】Ｉｇ重鎖がそのカルボキシ末端において、
ペプチド結合によりサイトカインのアミノ末端アミノ酸
に結合している請求項１に記載されるキメラＩｇ鎖 - 【請求項３】Ｉｇ重鎖がＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域
から成る請求項１に記載されるキメラＩｇ鎖。 - 【請求項４】 たんぱく分解酵素切断部位がＩｇ重鎖と
サイトカインとの間に位置している請求項ｌに記載され
るキメラＩｇ鎖。 - 【請求項５】 可変領域がマウスから誘導され、不変領
域がヒトの抗体から誘導される請求項１に記載されるキ
メラＩｇ鎖。 - 【請求項６】 Ｉｇ重鎖の可変領域が癌細胞又はビール
ス感染細胞に特異的であるＩｇから誘導される請求項ｌ
に記載されるキメラＩｇ鎖。 - 【請求項７】 可変領域が腫瘍関連抗原又はビールス抗
原のために特異的であるＩｇから誘導される請求項６に
記載される複合体。 - 【請求項８】 サイトカインが腫瘍壊死因子アルファ
(tumor necrosis factor alpha) である請求項ｌに記
載されるキメラＩｇ鎖。 - 【請求項９】 サイトカインがインターロイキン−２で
ある請求項１に記載されるキメラＩｇ鎖。 - 【請求項１０】 サイトカインがリンフォカインである
請求項ｌに記載されるキメラＩｇ鎖。 - 【請求項１１】 リンフォカインがリンフォトキシンで
ある請求項１０に記載されるキメラＩｇ鎖。 - 【請求項１２】 リンフォカインが顆粒球−マクロファ
ージ・コロニー刺激因子である請求項１０に記載される
キメラＩｇ鎖。 - 【請求項１３】 リンフォカインが二量体又は多量体を
形成するタンパク質である請求項１０に記載されるキメ
ラＩｇ鎖。 - 【請求項１４】 標的細胞の抗原に特異的な可変領域及
びＣＨ１，ＣＨ２及びＣＨ３領域を含有する重鎖をもつ
Ｉｇ重鎖を、ペプチド結合を介してサイトカインのアミ
ノ末端アミノ酸と結合した重鎖から成るキメラ免疫グロ
ブリン（Ｉｇ）鎖。 - 【請求項１５】 サイトカインがリンフォトキシン、イ
ンターロイキン−２、腫瘍壊死因子及び顆粒球−マクロ
ファージ・コロニー刺激因子から成る群より選ばれたも
のである請求項１４に記載されるキメラＩｇ鎖。 - 【請求項１６】 （ａ）癌細胞又はビールス感染細胞に
特異的な可変領域を有し、その不変領域のカルボキシル
末端においてサイトカインにペプチド結合により接続す
るＩｇ重鎖を含むキメラ免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖；及
び（ｂ）癌又はビールス感染細胞に特異的である可変領
域を有するＩｇ軽鎖から成り、前記重鎖と軽鎖が機能的
抗原結合部位を形成するサイトカイン免疫複合体。 - 【請求項１７】 キメラ重鎖がＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ
３領域から成る不変領域をもつ請求項１６に記載される
免疫複合体。 - 【請求項１８】 サイトカインがインターロイキン−２
である請求項１６に記載される免疫複合体。 - 【請求項１９】 サイトカインが腫瘍壊死因子αである
請求項１６に記載される免疫複合体。 - 【請求項２０】 サイトカインがリンフォカインである
請求項１６に記載される免疫複合体。 - 【請求項２１】 リンフォカインがリンフォトキシンで
ある請求項２０に記載される免疫複合体。 - 【請求項２２】 リンフォカインが顆粒球−マクロファ
ージ刺激因子である請求項２０に記載される免疫複合
体。 - 【請求項２３】 Ｉｇ重鎖とサイトカインから成るキメ
ラ免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖をコードする核酸。 - 【請求項２４】 ＤＮＡである請求項２３に記載される
核酸。 - 【請求項２５】 Ｉｇ重鎖がＣＨ１，ＣＨ２及びＣＨ３
領域から成る請求項２３に記載される核酸。 - 【請求項２６】 可変領域が癌細胞又はビールス感染に
特異的なＩｇから誘導される請求項２３に記載される核
酸。 - 【請求項２７】 可変領域が腫瘍関連抗原又はビールス
抗原に特異的なＩｇから誘導される請求項２６に記載さ
れる核酸。 - 【請求項２８】 たんぱく分解酵素切断部位がＩｇ重鎖
とサイトカインとの間に位置している請求項２３に記載
される核酸。 - 【請求項２９】 可変領域がマウスの抗体から誘導さ
れ、不変領域がヒトの抗体から誘導される請求項２３に
記載される核酸。 - 【請求項３０】 サイトカインがインターロイキン−２
である請求項２３に記載される核酸。 - 【請求項３１】 サイトカインが腫瘍壊死因子アルファ
である請求項２３に記載される核酸。 - 【請求項３２】 サイトカインがリンフォカインである
請求項２３に記載される核酸。 - 【請求項３３】 リンフォカインが二量体又は多量体構
造を形成するタンパクである請求項３２に記載される核
酸。 - 【請求項３４】 リンフォカインがリンフォトキシンで
ある請求項３２に記載される核酸。 - 【請求項３５】 リンフォカインが顆粒球−マクロファ
ージコロニー刺激因子である請求項３２に記載される核
酸。 - 【請求項３６】 標的細胞の抗原に特異的な可変領域及
びＣＨ１，ＣＨ２及びＣＨ３領域を持つ重鎖よりなるＩ
ｇ重鎖をサイトカインのアミノ末端アミノ酸とペプチド
結合することによって接続させたキメラ免疫グロブリン
（Ｉｇ）鎖をコードするリコンビナントＤＮＡ。 - 【請求項３７】 サイトカインが腫瘍壊死因子アルフ
ァ、インターロイキン−２、リンフォトキシン及び顆粒
球−マクロファージコロニー刺激因子から成る群から選
ばれた請求項３５に記載するリコンビナントＤＮＡ。 - 【請求項３８】 請求項２３の核酸で形質転換したセル
ライン。 - 【請求項３９】 請求項３６の核酸で形質転換したセル
ライン。 - 【請求項４０】 骨髄腫細胞系統（ミエローマセルライ
ン）である請求項２３記載のセルライン。 - 【請求項４１】 骨髄腫細胞系統である請求項３６記載
のセルライン。 - 【請求項４２】 サイトカインを選択的に標的細胞に供
給するのに有用な請求項１に記載されるキメラＩｇ鎖で
あって、（ａ）標的細胞に特異的な可変領域を有し、そ
の不変領域のカルボキシ末端においてペプチド結合によ
ってサイトカインに結合するＩｇ重鎖から成るキメラ免
疫グロブリン（Ｉｇ）を含むサイトカイン免疫複合体；
及び（ｂ）キメラＩｇ重鎖と結合し、機能的抗原結合箇
所を形成するＩｇ軽鎖から成り、 前記サイトカイン免疫複合体は前記標的細胞をもつ被検
者に標的細胞に達するに充分な量投与されうるもの。 - 【請求項４３】 前記標的細胞が癌細胞またはビールス
感染細胞である請求項４２に記載されるキメラＩｇ鎖。 - 【請求項４４】 キメラ重鎖がＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ
３領域からなる不変領域を有する請求項４２に記載され
るキメラＩｇ鎖。 - 【請求項４５】 サイトカインがリンフォトキシン、イ
ンターロイキン−２、腫瘍壊死アルファ及び顆粒球−マ
クロファージコロニー刺激因子から成る群の中から選ば
れる請求項４２に記載されるキメラＩｇ鎖。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61209990A | 1990-11-09 | 1990-11-09 | |
| US612,099 | 1990-11-09 |
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|---|---|---|---|
| JP4501881A Division JPH09506761A (ja) | 1990-11-09 | 1991-11-07 | サイトカインの免疫複合体 |
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|---|---|---|---|
| JP2005227387A Division JP2006006339A (ja) | 1990-11-09 | 2005-08-05 | サイトカインの免疫複合体 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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