JP4643255B2 - 乳癌および膀胱癌において差次的に発現される遺伝子ならびにコードされるポリペプチド - Google Patents
乳癌および膀胱癌において差次的に発現される遺伝子ならびにコードされるポリペプチド Download PDFInfo
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Description
発明の分野
本発明は、ヒト乳房癌腫および膀胱癌腫において示差的に発現する、新規なヒト遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、C35と名付けられた新規なヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、C35ポリペプチド、およびベクター、宿主細胞、C35ポリペプチドを指向する抗体、ならびにこれらを産生するための組換え方法に関する。本発明はさらに、ヒト乳房癌腫および膀胱癌腫を含む癌腫の検出のための診断方法に関する。本発明はさらに、C35遺伝子を発現する標的細胞(例えば、腫瘍細胞)に対する抗体および細胞媒介性免疫を誘導するための、免疫原性組成物またはワクチンにおけるC35遺伝子およびポリペプチドの処方ならびに使用に関する。本発明はさらに、C35活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。
癌は、年々、米国において約120万人を苦しめる。これらの癌の約50%は、手術、放射線療法、および化学療法で治癒可能である。これらの3つの型の処置における著しい技術の進歩にも関わらず、米国単独のみで、年々500,000人よりも多い人々が、癌で死亡する(Jaffee、E.M.,Ann.N.Y.Acad.Sci.886:67〜72(1999))。ほとんどの再発が、遠位の部位(例えば、肝臓、脳、骨および肺)であるので、改善された全身的な治療の緊急の必要性が存在する。
本発明は、新規のポリヌクレオチドであるC35に関し、これはヒト乳房癌腫および膀胱癌腫において示差的に発現され、そしてC35ポリペプチドをコードする。さらに、本発明はC35ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体ならびに組換え方法に関する。本発明はさらに、C35遺伝子産物を発現する標的細胞(例えば、腫瘍細胞)に対する抗体および細胞媒介性免疫を誘導するための、免疫原性組成物中のC35ポリペプチド、特にC35ペプチドエピトープおよびC35ペプチドエピトープアナログ、ならびにポリヌクレオチドの処方ならびに使用に関する。また、C35遺伝子およびポリペプチドに関する障害を検出するための診断方法(癌腫(例えば、ヒト乳房癌腫)のための予後マーカーとしての使用を含む)、およびこのような障害を処置するための治療的方法が提供される。本発明はさらに、C35の結合パートナーを同定するためのスクリーニング方法に関する。
定義
以下の定義は、本明細書全体を通して用いられる特定の用語の理解を容易にするために提供される。
C35の348塩基対断片を、原発性かつ浸潤性の管内乳癌(intraductal mammary carcinoma)を有する同じ患者から得た腫瘍および正常乳腺上皮細胞株由来のポリRNAの差し引きハイブリダイゼーション(subtractive hybridization)により、最初に単離した。Band,V.ら、Cancer Res.50:7351-7357(1990)。次いで、この配列および重複EST配列(登録番号W57569)の配列に基づくプライマーを用いて、全長C35コード配列を含むcDNAを増幅し、BT-20乳房腫瘍細胞株(ATCC,HTB-19)からクローニングした。このC35 cDNAは、配列番号:1として識別されるコード領域全体を含む。C35クローンは、348bpのコード配列に加えて、3’非翻訳領域の167bpを含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチドの1位に位置するN末端メチオニンで始まり、ヌクレオチドの348位の終止コドンで終わる(図1A)。配列番号:1の配列の全てまたは大部分を含む代表的なクローンを、アメリカンタイプカルチャーコレクション(「ATCC」)に2000年8月1日に寄託し、ATCC受託番号PTA-2310を与えられた。ATCCは、10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209,USAに位置する。ATCCへの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って行われた。
「改変体」とは、C35ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その本質的な特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。一般に、改変体は、C35ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに全体として密接に類似しており、そして多くの領域において、C35ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
本発明において、「ポリヌクレオチド断片」は、寄託クローンに含まれる核酸配列また配列番号:1に示される核酸配列を有する短いポリヌクレオチドをいう。短いヌクレオチド断片は、好ましくは、少なくとも約15ヌクレオチド長およびさらに好ましくは少なくとも約20ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約30ヌクレオチド長、およびなお好ましくは少なくとも約40ヌクレオチド長である。例えば、断片「少なくとも20ヌクレオチド長」は、寄託クローンに含まれるcDNA配列または配列番号:1に示されるヌクレオチド配列由来の20個以上の連続塩基を含むことを意図する。これらのヌクレオチド断片は、本明細書中で議論される診断プローブおよびプライマーとして有用である。もちろん、より大きなポリヌクレオチド(例えば、少なくとも50、100、150、200、250、300ヌクレオチド)が、好ましい。
内因的に合成されたタンパク質の分解によって誘導される細胞性ペプチドは、プレゴルジ画分に転座され、ここで、細胞性ペプチドは、細胞表面への移動のためにクラスI MHC分子に結合する。これらのクラスI MHC:ペプチド複合体は、特異的なCD8+細胞傷害性T細胞に対する標的抗原である。全ての内因性タンパク質は、「回転する」ので、任意の細胞質タンパク質または核タンパク質に由来するペプチドは、MHC分子に結合し得、そして細胞表面における提示のために移動され得る。これは、T細胞が、抗体よりも細胞のタンパク質の大きな提示を調査することを可能にする。この抗体は、細胞膜で分泌されるかまたは組み込まれるかのいずれかでこれらのタンパク質のみの立体配座的な決定因子を認識することを制限される。T細胞レセプター抗原結合部位は、ペプチドとMHCの周りの両方の決定因子に相互作用する。従って、T細胞の特異性は、MHC:ペプチド複合体によって規定される。MHC分子に結合するペプチドの特異性は、非常に広く、そして特異的な抗体の抗原結合部位と比較して相対的に低親和性である。クラスI結合ペプチドは、一般に、8〜10残基長である。これは、MHCペプチド結合部位におけるポケットに一致する特定のキー位置における制限された多様性のアミノ酸側鎖に適応する。特定のMHC分子に結合するペプチドのこれらの重要な特徴は、ペプチド結合モチーフを構成する。
M1〜R109;S2〜P110;G3〜P111;E4〜C112;P5〜V113;G6〜I114;Q7〜L115。
M1〜P110;S2〜P111;G3〜C112;E4〜V113;P5〜I114;G6〜L115。
M1〜P111;S2〜C112;G3〜V113;E4〜I114;P5〜L115。
M1〜C112;S2〜V113;G3〜I114;E4〜L115。
M1〜V113;S2〜I114;G3〜L115。
M1〜I114;S2〜L115。
過去10年の間にT細胞が抗原を認識するメカニズムについてかなり解明された。免疫系のこの理解に従い、本発明者らは、種々の当技術分野において認められた様式を介して投与した場合に、ある腫瘍関連抗原に対する治療的または予防的免疫応答を誘導する効果的なペプチドエピトープ組成物を開発した。さらに、本発明のペプチドエピトープを用いることによって、または本明細書中に開示した原理に従ってペプチドエピトープの組合せを用いることによって、非遺伝的に偏った世界的集団のかなりの割合において応答を達成することができる。特許請求する組成物の価値および効率の理解のために、免疫学関連技術の簡単なレビューを掲げる。
従って、クラスIおよびクラスIIの対立遺伝子-特異的HLA結合モチーフ、またはクラスIまたはクラスIIスーパーモチーフの規定は、特定のHLA抗原に結合する予測された能力を有するタンパク質内の領域の同定を可能とする。
1)正常な個体からの一次T細胞培養の評価
この手法は、インビトロにて抗原提示細胞の存在下で、数週間にわたって、正常な対象からの末梢血液リンパ球(PBL)を試験ペプチドで刺激することを含む。前記ペプチドに特異的なT細胞はこの間に活性化されるようになり、例えば、ペプチド感作標的細胞、および/または内因的に抗原を生じさせる標的細胞が関連する51Cr-放出アッセイを用いて検出される。
2)HLAトランスジェニックマウスの免疫化(例えば、Wentworth,P.A.ら、J.Immunol.26:97、1996;Wentworth,P.A.ら、Int.Immunol.8:651、1996;Alexander,J.ら、J.Immunol.159:4753、1997参照);この方法においては、不完全フロイントアジュバント中のペプチドをHLAトランスジェニックマウスに皮下投与する。免疫化から数週間後、脾臓細胞を摘出し、試験ペプチドの存在下でインビトロにてほぼ1週間培養する。例えば、ペプチド感作標的細胞および生成した抗原を内因的に発現する標的細胞が関連する51Cr-放出アッセイを用いてペプチド-特異的T細胞を検出する。
3)効果的に治療され、病気から回復した免疫個体のような病気に暴露された個体、および/または能動的に病気の患者からの想起T細胞応答の証明
この戦略を適用する際には、想起応答は、試験ペプチド+抗原提示細胞(APC)の存在下でインビトロにて1〜2週間対象からのPBLを培養して、「ナイーブ」T細胞と比較して、「記憶」T細胞の活性化を可能とすることによって検出される。培養期間の最後において、ペプチド-感作標的、T細胞増殖、またはリンホカイン放出が関連する51Cr放出を含めたT細胞活性についてのアッセイを用いてT細胞活性を検出する。
本明細書中に示すように、かなりの程度のHLA多形は、ワクチン開発に対するエピトープ-ベースのアプローチで考慮すべき重量な因子である。この因子に取り組むためには、複数のHLA分子に高いまたは中程度の親和性で結合できるペプチドの同定を含めたエピトープ選択が好ましく利用され、最も好ましくは、これらのエピトープは複数の対立遺伝子-特異的HLA分子に高いまたは中程度の親和性で結合する。
一般に、CTLおよびHTL応答は全ての可能なエピトープに対して向けられない。むしろ、それらは少数の「免疫優性」決定基に制限される(Zinkernagelら、Adv.Immunol.27:5159、1979;Benninkら、J.Exp.Med.168:19351939、1988;Rawleら、J.Immunol.146:3977-3984、1991)。免疫優性(Benacerrafら、Science 175:273-279、1972)は、特定のHLAタンパク質に選択的に結合する(決定基選択説)(Vitielloら、J.Immunol.131:1635、1983);Rosenthalら、Nature 267:156-158、1977)、または存在するTCR(T細胞受容体)特異性によって選択的に認識される(レパートリー説)(Klein、J.,IMMUNOLOGY、THE SCIENCE OF SELFNONSELF DISCRIMINATION、John Wiley & Sons、New York、pp.270-310、1982)所与のエピトープのいずれかの能力によって説明することができるのが認識されている。ほとんどがプロセッシング事象に連結したさらなる因子もまた、厳格な免疫原性を超えて、多くの潜在的決定基のいずれが免疫優性として提示されるかを指令する際に鍵となる役割を演じることができることが証明されている(Sercarzら、Annu.Rev.Immunol.11:729-766、1993)。
;配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK77〜Y85(すなわち、KLENGGFPY)については、第9番目のアミノ酸残基におけるチロシンに代えて置換されたバリンを有するアナログ(すなわち、KLENGGFPV);配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜C112(すなわち、KITNSRPPC)については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシンまたはロイシンを有するアナログ(すなわち、KITNSRPPL、KITNSRPPA、KITNSRPPG);配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜V113(すなわち、KITNSRPPCV)については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシン、セリンまたはロイシンを有するアナログ(すなわち、KITNSRPPLV、KITNSRPPAV、KITNSRPPGV、KITNSRPPSV);配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI105〜V113(すなわち、ITNSRPPCV)については、ロイシンまたはメチオニンのいずれかが第2のアミノ酸残基におけるスレオニンに代えて置換されたおよび/またはアラニン、セリンまたはグリシンが第8のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアナログ
、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープN107〜L115(すなわち、NSRPPCVIL)については、第6番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ(すなわち、NSRPPAVIL、NSRPPGVIL)を含むか、あるいはそれからなる。本発明は、さらに、一つまたは複数のC35エピトープアナログを含む、あるいはそれからなるポリペプチドに指向される。好ましい態様において、本発明は、一つまたは複数のC35エピトープアナログおよび、加えて、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含むポリペプチドに指向される。特に好ましい態様において、本発明は、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープG22〜C30(すなわち、GVRIVVEYC)については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ(すなわち、GVRIVVEYAまたはGVRIVVEYG);配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI25〜C33(すなわち、IVVEYCEPC)については、第6番目のアミノ酸残基および/または第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
;配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK77〜Y85(すなわち、KLENGGFPY)については、第9番目のアミノ酸残基におけるチオシンに代えて置換されたバリンを有するアナログ(すなわち、KLENGGFPV);配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜C112(すなわち、KITNSRPPC)については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシンまたはロイシンを有するアナログ(すなわち、KITNSRPPL、KITNSRPPA、KITNSRPPG);配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜V113(すなわち、KITNSRPPCV)については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシン、セリンまたはロイシンを有するアナログ(すなわち、KITNSRPPLV、KITNSRPPAV、KITNSRPPGV、KITNSRPPSV);配列番号:2および図1BのペプチドエトープI105〜V113(すなわち、ITNSRPPCV)については、ロイシンまたはメチオニンのいずれかが第2のアミノ酸残基におけるスレオニンに代えて置換されおよび/またはアラニン、セリンまたはグリシンが第8のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアナログ
、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープN107〜L115(すなわち、NSRPPCVIL)については、第6番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ(すなわち、NSRPPAVIL、NSRPPGVIL)からなる群より選択される少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログ、および:配列番号:2のアミノ酸E4〜P12、配列番号:2のS9〜V17、配列番号:2のS21〜Y29、配列番号:2のG22〜C30、配列番号:2のI25〜C33、配列番号:2のT38〜V46、配列番号:2のG61〜I69、配列番号:2のT62〜N70、配列番号:2のG63〜G71、配列番号:2のF65〜L73、配列番号:2のI67〜F75、配列番号:2のK77〜Y85、配列番号:2のQ72〜E86、配列番号:2のG81〜L89、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のK104〜C112、配列番号:2のK104〜V113、配列番号:2のI105〜V113、および配列番号:2のN107〜L115からなる群より選択される少なくとも1つのC35ペプチドエピトープを含む融合タンパク質に指向される。
、配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドI93〜V113
については、第12番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
;配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドD88〜V113
については、第25番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
;配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドP84〜V113
については、第29番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
;配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドK77〜L115
については、第36番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
;配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドQ72〜L115
については、第41番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンを有するアナログ
;配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドF65〜L115
については、第48番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
;配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドL59〜L115
については、第54番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
を含むか、あるいはそれからなる。
については、S97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ;配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドD88〜V113
については、S97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ;配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドP84〜V113
については、Y85におけるチロシンおよび/またはS97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ;配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドK77〜V113
については、Y85におけるチロシンおよび/またはS97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ;配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドQ72〜V113
については、S76におけるセリンおよび/またはY85におけるチロシンおよび/またはS97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ;配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドF65〜V113
については、S76におけるセリンおよび/またはY85におけるチロシンおよび/またはS97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ;配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドL59〜V113
については、T62におけるスレオニンおよび/またはS76におけるセリンおよび/またはY85におけるチロシンおよび/またはS97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログを含むか、あるいはそれからなる。
本発明によるペプチドエピトープは合成により、組換えDNA技術または化学合成によって、または天然腫瘍または病原性生物のような天然源から調製することができる。ペプチドエピトープは個々に、またはポリエピトープ性ポリペプチドとして(例えば、ホモポリマーまたはヘテロポリマー)合成することができる。ペプチドは好ましくは他の天然に生じる宿主細胞タンパク質およびその断片を実質的に含まないが、いくつかの態様においては、ペプチドは天然断片または粒子に合成によりコンジュゲートさせることができる。
を含めた、腫瘍関連遺伝子およびコードされたタンパク質に由来する。例えば、腫瘍に特徴的な特異的抗原性ペプチドは表Aに列挙したものを含む。
一旦HLA結合ペプチドが同定されれば、それを、T細胞応答を誘発する能力につき試験することができる。調製およびモチーフ担持ペプチドの評価は、例えば、その全内容を参照として本明細書に組み入れられるPCT公開国際公開公報第94/20127号および国際公開公報第94/03205号に記載されている。簡単に述べれば、特定の抗原からのエピトープを含むペプチドを合成し、関連HLAタンパク質に結合するその能力につき試験する。これらのアッセイは、放射性ヨウ素化参照ペプチドの結合に対する精製されたHLAクラスI分子へのペプチド結合の評価を含むことができる。または、空のクラスI分子(すなわち、いずれの結合ペプチドも欠く細胞表面HLA分子)を発現する細胞は、免疫蛍光染色およびフローマイクロフルオリメトリーによってペプチド結合につき評価することができる。ペプチド結合を評価するのに用いることができる他のアッセイはペプチド依存性クラスIアセンブリーアッセイおよび/またはペプチド競合によるCTL認識の阻害を含む。典型的には、500nM以下の親和性でもって、HLAクラスI分子に結合するペプチドは、さらに、感染したまたは免疫化された個体から誘導されるCTLについての標的として働くその能力、ならびに病理学に関連する選択された標的細胞と反応することができるCTL集団を生起させることができる一次インビトロまたはインビボCTL応答を誘導するその能力につき評価される。
本発明の免疫学的有効量の一つまたは複数のC35ペプチドエピトープおよび/またはC35ペプチドエピトープアナログを含有するワクチンは、本発明のさらなる態様である。前記ペプチドは、全て集合的に「ワクチン」組成物という種々の手段または処方によって送達することができる。そのようなワクチン組成物および/または投与の様式は、例えば、カチオン性脂質処方における裸のcDNA;リポペプチド(例えば、Vitiello,A.ら、J.Clin.Invest.95:341,1995)、例えば、ポリ(DL-ラクチド-コ-グリコリド)(「PLG」)ミクロスフェア中にカプセル化された裸のcDNAまたはペプチド(例えば、Eldridgeら、Molec.Immunol.28:287-294,1991:Alonsoら、Vaccine 12:299-306,1994;Jonesら、Vaccine 13:675-681,1995参照);免疫刺激複合体(ISCOMS)に含有されたペプチド組成物(例えば、Takahashiら、Nature 344:873-875,1990;Huら、Clin Exp Immunol.113:235-243,1998参照);複数抗原ペプチド系(MAP)(例えば、Tam,J.P.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5409-5413,1988;Tam,J.P.,J.Immunol Methods 196:17-32,1996参照);ウイルス、細菌または真菌送達ベクター(Perkus,M.E.ら、In:Concepts in vaccine development,Kaufmann,S.H.E.編, p.379,1996;Chakrabarti,S.ら、 Nature 320:535,1986;Hu,S.L.ら、Natuer 320:537,1986;Kieny,M.P.ら、 AIDS Bio/Technology 4:790,1986;Top,F.H.ら、J.Infect.Dis.124:148,1971;Chanda,P.K.ら、Virology 175:535,1990);ウイルスまたは合成起源の粒子(例えば、Kofler,N.ら、J.Immunol.Methods 192:25,1996;Eldridge,J.H.ら、Sem.Hematol.30:16,1993;Falo,L.D.,Jr.ら、Nature Med.7:649,1995);アジュバント(Warren,H.S.,Vogel,F.R.およびChedid,L.A.Annu.Rev.Immunol.4:369,1986;Gupta,R.K.ら、Vaccine 11:293,1993);リポソーム(Reddy,R.ら、J.Immunol.148:1585,1992;Rock,K.L.,Immunol.Today 17:131,1996);または粒子-吸収cDNA(Ulmer,J.B.ら、Science 259:1754,1993;Robinson,H.L.,Hunt,L.A.およびWebstr,R.G.,Vaccine 11:957,1993;Shiver,J.W.ら、In:Concepts in vaccine development,Kaufmann,S.H.E.編,p.423,1996;Cease,K.B.およびBerzofski,J.A.,Annu.Rev.Immunol.12:923,1994およびEldridge,J.H.ら、Sem.Hematol.30:16,1993)などを含む。Avant Immunotherapeutics,Inc.(Needham,Massachusetts)のもののような受容体媒介標的化としても知られた、またはストレスタンパク質に付着したトキシン-標的化送達技術、例えば、HSP 96(Stressgen Biotechnologies Corp.,Victoria, BC,カナダ国)を用いることもできる。
複数エピトープの同時送達を可能にする多数の異なるアプローチが利用できる。複数C35ペプチドエピトープまたはアナログをコードする核酸は本発明の有用な態様である;区別されるエピトープ/アナログまたはポリエピトープ性ポリペプチドをコードすることができる。ミニ遺伝子に含めるべきエピトープまたはアナログは、好ましくは、上記の段落に記載したガイドラインに従って選択される。ミニ遺伝子に含めることができるアミノ酸配列の例は、HLAクラスIエピトープまたはアナログ、HLAクラスIIエピトープまたはアナログ、ユビキチン化シグナル配列、および/または得られるペプチドの小胞体への移動を促進するための小胞体(ER)シグナル配列のような標的化配列を含む。
本発明のCTLペプチドを含むワクチン組成物は、改良された血清半減期、広がった集団網羅または増強された免疫原性のような所望の属性を提供するように修飾することができる。
における破傷風トキソイド、位置378-398
における熱帯熱マラリア原虫CSタンパク質、および位置116
における連鎖球菌18kDタンパク質のような抗原からの配列を含む。他の例はDR1-4-7スーパーモチーフを担うペプチド、またはDR3モチーフのいずれかを含む。
(式中、「X」はシクロヘキシルアラニン、フェニルアラニンまたはチロシンのいずれかであり;「Z」はトリプトファン、チロシン、ヒスチジンまたはアスパラギンのいずれかであり;および「a」はD-アラニンまたはL-アラニンである)を有する汎-DR-結合エピトープペプチドは、多数の対立遺伝子-特異的HLA-DR分子に結合することが判明している。従って、これらの分子が、そのHLAタイプに拘わらず、ほとんどの個体からのTヘルパーリンパ球応答を刺激する。ある種の汎-DR結合エピトープは、全て、「L」天然アミノ酸を含み;これらの分子はペプチドとして、またはペプチドをコードする核酸の形態で提供することができる。
幾つかの態様においては、細胞傷害性Tリンパ球を初回免疫する少なくとも1つの成分を本発明の薬学的組成物に含めるのが望ましいであろう。脂質は、ウイルス抗原に対するインビトロCTL応答をプライミングするのを容易とすることができる剤と特定されてきた。例えば、パルミチン酸残基をリシン残基のε-およびα-アミノ基に付着させ、次いで免疫原生ペプチドに連結させることができる。Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等のような一つまたは複数の連結部位を用いることができる。次いで、脂質化ペプチドをミセルまたは粒子に直接投与し、リポソームに取り込み、またはアジュバント、例えば、不完全フロイントアジュバント中に乳化させることができる。好ましい免疫原性組成物は、免疫原性ペプチドのアミノ末端に付加された連結部位、例えば、Ser-Serを介してLysのε-およびα-アミノ基に付着されたパルミチン酸を含む。
本発明によるワクチン組成物の態様は、患者の血液からのPBMC、またはそれから単離されたDCへ、エピトープ-担持ペプチドのカクテルをエキソビボ投与することを含む。Progenipoietin(商標)(Monsanto,St.Louis,MO)またはGM-CSF/IL-4のような、DCの収穫を促進するための医薬品を用いることができる。ペプチドでDCをパルスした後、患者への再注入に先立ち、DCを洗浄して未結合ペプチドを除去する。この態様においては、ワクチンは、HLA分子におけるパルスペプチドエピトープをその表面に提示するペプチド-パルスDCを含む。
その薬学的およびワクチン組成物を含めた本発明の一つまたは複数のペプチドエピトープを含むポリペプチドは、病気を治療および/または予防するために哺乳動物、特にヒトに投与するのに有用である。1つの態様において、本発明のワクチン組成物(ペプチドまたは核酸)を、一つまたは複数のTAAの発現に関連する悪性疾患を有する患者に、またはTAA関連病に罹患性であり、またはそうでなければ前記病気を発症する危険性がある個人に投与される。投与に際して、TAAに対して免疫応答が誘発され、それにより、患者自身の免疫応答能力を増強させる。治療的適用においては、ペプチドおよび/または核酸組成物を、TAA-発現細胞に対して効果的な免疫応答を誘発し、それにより、兆候および/または合併症を治癒し、阻止し、または遅らせるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適切な量は「治療上有効な用量」と定義される。この用途で効果的な量は、例えば、投与される特定の組成物、投与の方法、治療すべき病気の段階および重傷度、患者の体重および健康の一般的な状態、主治医の判断に依存するであろう。
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重要:Tエピトープを、Cys残基をAlaとして評価するようプログラムした。なぜならば、合成およびアッセイの制限のために、Cysを含むペプチドを系統的に試験することが不可能であったからである。予想配列がCys残基を含む場合は常にCys残基をAla残基と置き換えてしてこれらを合成することを、本発明者らは提案する。
特定のヒトT細胞株を用いるMHCクラスI抗原についてのC35の免疫優性エピトープの同定は、癌ワクチンにおけるそれらの首尾良い使用に対する重要な工程である。MHC結合残基でのアミノ酸置換を含む改変したC35ペプチドエピトープは、免疫機能を増強するために用いられる可能性を有する。このような変化したペプチドリガンド、または不規則変化の(heteroclitic)ペプチドは、本来のペプチドの濃度の100倍低い濃度でさえ、強力なT細胞アゴニストとなり得る(Dressel、A.ら、「Autoantigen recognition by human CD8 T Cell clones:enhanced agonist response induced by altered peptide ligand」、J.Immunol.159:4943-51(1997))。これらの変化したペプチドリガンドは、2つの形態のリガンドであり得る:ペプチドとのT細胞レセプターの接触を増加させる(実験により決定されなければならない)形態の改変、およびアンカー残基を改良することによりペプチドのHLA結合を増大する形態。表4は、好適なアンカー残基を導入することか、または有害な残基を置換することにより、HLAクラスI結合を増大させる改変を明記する。
(他に示さない限り、例は、9アミノ酸残基のペプチドに適用する;10量体について、5位のアミノ酸を無視し、そして得られた9量体を評価する(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/hla_coefficient viewing_page)。以下に列挙する改変を、既存のデータベースにおける現在のデータに基づく例として提供し、そして現在のところ公知および未知の両方の、全ての潜在的HLA分子を結合するペプチドの全ての潜在的変化の排他的リストであることは全く意図しない。)
2位にSまたはTを有する任意の変化したペプチド
3位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
4位にPを有する任意の変化したペプチド
7位にA、F、I、L、M、P、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、K、R、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、R、W、Y
P3:E、K、R、W
P4:K、R
P7:D、E、G、R
P9:D、E、P。
1位にF、I、K、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにI、L、M、Q、またはVを有する任意の変化したペプチド
3位にF、L、M、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にFを有する任意の変化したペプチド
6位の補助アンカーにF、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
7位にFまたはWを有する任意の変化したペプチド
8位にF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:D、E、H、P
P2:C、F、H、K、N、P、R、S、W、Y
P3:D、E、K、R
P7:D、E、G、R
P8:I、V
P9:D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
1位にF、I、K、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにE、I、L、M、Q、またはVを有する任意の変化したペプチド
3位にF、L、M、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にF、Yを有する任意の変化したペプチド
6位の補助アンカーにF、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
7位にFまたはWを有する任意の変化したペプチド
8位にF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:D、E、P
P2:C、D、F、G、H、K、N、P、R、S、W、Y
P3:D、E、K、R
P7:D、E、R
P9:D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
1位にGまたはKを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにI、L、M、Q、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にE、G、またはPを有する任意の変化したペプチド
5位にF、I、P、V、W、Yを有する任意の変化したペプチド
6位にF、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にF、I、L、M、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、K、L、Q、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:D、E、P
P2:D、E、F、G、H、K、N、R、S、W、Y
P7:G、K、R
P9:D、E、G、H、N、P、Q、S、T。
1位にG、K、またはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにI、L、M、Q、T、V、Yを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、M、V、W、Yを有する任意の変化したペプチド
7位にF、I、L、M、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにKまたはRを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:D、E、P
P2:D、E、G、H、K、N、R、S、W
P7:K、R
P9:C、D、E、G、N、P、Q、S、T。
1位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにFまたはYを有する任意の変化したペプチド
3位にE、I、L、M、N、P、Q、またはVを有する任意の変化したペプチド
4位にD、E、またはPを有する任意の変化したペプチド
5位にI、L、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にFを有する任意の変化したペプチド
7位にNまたはQを有する任意の変化したペプチド
8位にEまたはKを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、L、またはMを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E、H、K、R
P9:D、E、G、H、K、P、Q、R。
1位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにF、I、L、M、Q、T、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
6位にF、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にF、I、L、M、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにKまたはRを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:D、E、P
P2:D、E、G、H、K、N、R、S
P7:K、R
P9:C、G、N、P、Q、S、T。
1位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにI、L、M、S、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにRを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:K、P、R
P2:D、E、K、R
P9:D、E、F、G、N、P、W、Y。
1位にAを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、P、またはVを有する任意の変化したペプチド
3位にMまたはRを有する任意の変化したペプチド
5位にPを有する任意の変化したペプチド
6位にRを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E、F、H、K、R、W、Y
P3:D、E
P9:D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
1位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、C、L、またはPを有する任意の変化したペプチド
3位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:K、P、R
P2:D、E、F、G、H、K、Q、R、W、またはY
P3:D、E
P5:D、E
P9:D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
1位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、C、L、またはPを有する任意の変化したペプチド
3位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
8位にI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:K、P、R
P2:D、E、F、G、H、K、Q、R、W、またはY
P3:D、E
P5:D、E
P9:D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
1位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにKまたはRを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、M、P、V、W、Yを有する任意の変化したペプチド
5位にHまたはRを有する任意の変化したペプチド
6位にI、L、M、RまたはVを有する任意の変化したペプチド
7位にTを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E、F、W、またはY
P3:E、R
P5:E、W、Y
P9:D、E、G、H、K、N、P、Q、R。
1位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにE、L、M、N、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
3位にF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、L、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:D、E、P
P2:D、F、G、H、K、W、またはY
P7:K
P9:D、E、G、K、N、P、Q、R、S。
1位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにE、L、M、N、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
3位にF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
8位のアンカーにF、I、K、L、M、R、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:D、E、P
P2:D、F、G、H、K、W、またはY
P7:K
P9:D、E、G、K、N、P、Q、R、S。
1位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、P、またはSを有する任意の変化したペプチド
3位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
8位のアンカーにF、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E、F、H、K、R、W、Y
P3:D、E
P8:D、E、F、G、H、K、P、Q、R。
2位のアンカーにDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にIまたはVを有する任意の変化したペプチド
8位にF、L、またはMを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、L、M、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P9:D、E、G、H、K、P、Q、R。
2位のアンカーにF、H、P、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
3位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
4位にD、E、またはGを有する任意の変化したペプチド
5位にA、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
8位にKまたはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E、K、R
P3:K、R
P9:D、E、G、H、K、P、Q、R。
2位のアンカーにHまたはRを有する任意の変化したペプチド
3位にD、E、F、I、L、M、V、W、またはWを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
6位にI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
8位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E
P3:K、R
P6:D、E、K、R
P8:D、E、G、H、K、P、Q、R。
2位のアンカーにKまたはQを有する任意の変化したペプチド
5位にF、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、L、またはMを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E
P3:K、R
P9:D、E、G、H、K、P、Q、R。
1位にAまたはGを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにDまたはEを有する任意の変化したペプチド
3位にA、F、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にPを有する任意の変化したペプチド
5位にPを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにA、L、M、またはWを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:F、H、I、K、L、M、Q、R、V、W、またはY
P3:D、E、K、R
P9:D、E、G、H、K、N、P、Q、R。
1位にA、D、またはSを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにDまたはEを有する任意の変化したペプチド
3位にA、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
4位にF、I、またはPを有する任意の変化したペプチド
5位にA、K、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にA、L、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にF、K、またはTを有する任意の変化したペプチド
8位にKを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:F、H、I、K、L、M、Q、R、V、W、Y
P9:D、E、G、H、K、N、P、Q、R。
1位にD、E、F、I、L、M、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、G、またはPを有する任意の変化したペプチド
3位にF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にD、E、G、I、K、またはVを有する任意の変化したペプチド
5位にA、G、I、S、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にI、K、L、N、またはQを有する任意の変化したペプチド
7位にD、K、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
8位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:K、P、R
P2:D、E、H、K
P8:D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
1位にFまたはYを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、G、またはPを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にE、G、H、K、L、N、Q、R、またはTを有する任意の変化したペプチド
5位にG、N、Q、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にI、N、Q、またはTを有する任意の変化したペプチド
7位にE、K、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
8位にK、R、T、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E、H、K、R
P3:D、E、K、R
P9:D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
1位にFまたはYを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、G、またはPを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にE、G、H、K、L、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
5位にG、N、Q、T、Vを有する任意の変化したペプチド
6位にI、N、またはQを有する任意の変化したペプチド
7位にQまたはRを有する任意の変化したペプチド
8位にI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E、H、K、R
P3:D、E、K、R
P8:D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
1位にD、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、G、またはPを有する任意の変化したペプチド
3位にD、F、L、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にE、G、L、N、Q、R、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
5位にA、G、M、N、Q、R、K、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にI、K、またはTを有する任意の変化したペプチド
7位にMまたはVを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E、H、K、R
P9:D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
1位にI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにG、P、またはQを有する任意の変化したペプチド
3位にD、F、I、L、P、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にA、E、I、K、L、P、またはVを有する任意の変化したペプチド
5位にA、F、G、I、L、M、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にK、L、N、S、またはTを有する任意の変化したペプチド
7位にE、K、Q、またはYを有する任意の変化したペプチド
8位のアンカーにF、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:H、K、R
P3:R
P8:D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S。
1位にI、K、またはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、S、またはTを有する任意の変化したペプチド
3位にDを有する任意の変化したペプチド
4位にE、K、またはPを有する任意の変化したペプチド
5位にF、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にF、I、L、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にL、M、N、またはYを有する任意の変化したペプチド
8位にK、N、R、またはTを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:D、E、P
P2:D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y
P9:D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S。
2位のアンカーにDまたはEを有する任意の変化したペプチド
3位にA、I、L、M、S、またはVを有する任意の変化したペプチド
5位にL、I、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にI、L、M、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
8位にK、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:F、H、I、K、L、M、Q、R、V、W、Y
P9:D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
1位にGまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにDまたはEを有する任意の変化したペプチド
3位にA、F、I、L、M、T、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
6位にIを有する任意の変化したペプチド
7位にYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにA、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:F、H、I、K、L、M、Q、R、V、W、Y
P9:D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
1位にGまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにDまたはEを有する任意の変化したペプチド
3位にA、F、I、L、M、T、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
6位にIを有する任意の変化したペプチド
7位にYを有する任意の変化したペプチド
8位のアンカーにA、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:F、H、I、K、L、M、Q、R、V、W、Y
P8:D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
1位にIを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにI、L、Qを有する任意の変化したペプチド
3位にG、K、Rを有する任意の変化したペプチド
4位にD、E、G、またはPを有する任意の変化したペプチド
5位にF、G、I、L、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にI、L、T、Vを有する任意の変化したペプチド
7位にT、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、W、Yを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E、F、H、K、N、R、S、W、Y
P3:D、E
P6:D、E、K、R
P9:D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S。
2位のアンカーにAまたはRを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、M、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にE、P、またはRを有する任意の変化したペプチド
5位にNを有する任意の変化したペプチド
6位にF、M、またはYを有する任意の変化したペプチド
7位にK、M、R、またはSを有する任意の変化したペプチド
8位にTを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、L、Mを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P3:D、K、R
P6:D、E、K、R
P9:D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S。
2位のアンカーにF、P、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
3位にDまたはHを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にA、H、M、R、またはTを有する任意の変化したペプチド
6位にI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にAを有する任意の変化したペプチド
8位にH、K、またはSを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、L、M、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P2:D、E、H、K、R
P9:D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S。
1位にF、I、K、またはYを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、P、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
5位にF、I、K、L、またはMを有する任意の変化したペプチド
6位にI、L、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にK、N、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド:
P1:P
P9:D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S。
推定は、SYFPEITHIウェブサイト(wysiwyg://35/http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/EpPredict.htm)に記載され、「MHC Ligands and Peptide Motifs」(Rammensee,H.G.、Bachmann,J. およびS.Stevanovic、Chapman & Hall、New York, 1997)に基づく法則を使用して行った。
*クラスII MHCエピトープはTEPITOPEソフトウェアを用いて推定した。Sturniolo,Tら、1999. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nature Biotechnology 17:555-571。
本発明は、C35抗体、C35抗体断片および抗体結合体ならびにヒト癌細胞、特にヒト乳癌細胞および膀胱癌細胞と反応性の単鎖免疫毒素にさらに関する。
血清学的診断技術は、癌腫を罹患していると考えられる患者の血清または他の生物学的流体中に分泌または「流出」された腫瘍関連抗原の、検出および定量を含む。このような抗原は、放射線免疫アッセイ(RIA)または酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)のような当技術分野で公知の技術を用いて、体液中で検出され得、ここで、「流出」された抗原と反応性の抗体が、流体試料中の抗原の存在を検出するために使用される[例えば、Uotilaら「Two-Site Sandwich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP」J.Immunol.Methods,42:11(1981)およびAllumら、前出、48-51頁を参照のこと]。従ってこれらのアッセイは、本明細書中に開示されるC35抗体を用いて、C35抗体が反応する抗原の生物学的流体中での検出のため、そして故に、患者中のヒト癌腫の検出に使用され得る。従って、上記より、本発明のC35抗体が、抗原-抗体反応を含むほとんどのアッセイにおいて使用され得ることが明らかである。これらのアッセイとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:標準的なRIA技術(液相および固相の両方)、ならびにELISAアッセイ、ELISPOT、免疫蛍光技術、および他の免疫細胞化学アッセイ[例えば、Sikoraら(編)Monoclonal Antibodies,32-52頁(Blackwell Scientific Publications 1984)を参照のこと]。
C35抗体の特性によって、多数のインビボ治療適用が示唆される。
瘍細胞を除去するための使用が挙げられる。この手段に従って、自家骨髄は、抗体を用いた処理によってエキソビボでパージされ得、そしてこの骨髄は患者に注入によって戻され得る[例えば、Ramsayら「Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies」J.Clin.Immunol.,8(2):81-88 (1988)を参照のこと]。
C35エピトープは、組換えDNA方法によって大量に産生され得、そして細胞媒介性免疫応答を促進するアジュバントと共に処方され得る。本発明は、真核生物組み換え発現ベクターまたは原核生物組み換え発現ベクターのいずれかにおける、C35ポリペプチド、またはC35エピトープ(エピトープを誘発する細胞傷害性T細胞またはヘルパーT細胞を含む)の発現;ならびに免疫原性組成物および/または抗原性組成物としてのこれらの処方物を含む。このような組成物は、例えば、米国特許出願番号第08/935,377号(この内容全体は、本明細書中に参考として援用される)に記載される。本発明に従って、組み換え発現されたC35エピトープは、サブユニットワクチンとして発現され、精製され、そして処方され得る。好ましくは、C35エピトープをコードするDNAはまた、ワクチンにおける使用のために、ウイルスベクター(好ましくはポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアルファウイルスベクター)中に構築され得る。この点において、生きた組み換えウイルスワクチン、不活化された組み換えウイルスワクチン、または殺傷された組み換えウイルスワクチンのいずれかが、処方され得る。
本発明は、真核および原核発現ベクターの両方の発現系を含み、これらは、C35エピトープを発現するために使用され得る。このC35エピトープは、短縮形態または全長形態の両方で、特にサブユニットワクチンの形成のために発現され得る。
本発明は、真核および原核発現ベクターの両方の発現系を含み、これらは、C35エピトープを発現するために使用され得る。種々の宿主発現ベクター系が、本発明のC35エピトープ遺伝子を発現するために利用され得る。このような宿主発現系は、ビヒクルを表し、このビヒクルによって、C35コード配列が生成され得、そして引き続いて精製され得るが、C35ヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明のC35エピトープ遺伝子産物を示し得る細胞もまた表す。これらとしては、微生物(例えば、C35エピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌、枯草菌);C35エピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、Saccharomyces,Pichia);C35エピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系;C35エピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染したかまたは組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系;あるいは哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を有する、哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3))が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明は、動物および昆虫の細胞株におけるC35エピトープの発現を含む。本発明の好ましい態様において、C35エピトープは、昆虫細胞株中のバキュロウイルスベクターにおいて発現されて、グリコシル化されていない抗原を生成する。本発明の別の好ましい態様において、C35エピトープは、安定にトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞(例えば、CHO細胞株)において発現されて、グリコシル化抗原を生成する。これらの細胞株によって組換え的に発現されるC35エピトープは、サブユニットワクチンとして処方され得る。本発明はさらに、C35遺伝子産物を過剰発現する宿主細胞に関する。この細胞は、任意の適切なベクター(これは、C35ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む)、ならびにC35遺伝子産物の過剰発現を指向する適切なプロモーターおよびエンハンサー配列で過渡的または安定にトランスフェクトされたかまたは形質転換された宿主細胞であり得る。しかし、この過剰発現細胞はまた、内因性のC35遺伝子の過剰発現を指向する異種のプロモーターまたはエンハンサーの挿入(例えば、相同組換えを介する)の産物であり得る。用語「過剰発現」とは、他の同一の条件下で所定の細胞を代表的に特徴付ける基礎的な発現レベルよりも高い発現レベルをいう。
本発明の別の態様において、C35エピトープを発現する生きている組換えウイルスワクチンまたは不活化組換えウイルスワクチンのいずれかが、操作され得る。生ワクチンが、好ましくあり得る。なぜなら、宿主における増殖が、天然の感染において生じるのと同様の種類および大きさの長期の刺激をもたらし、したがって、実質的な持続性の免疫を付与するからである。このような生きた組換えウイルスワクチン処方物の生成は、細胞培養物またはニワトリ胚の尿膜におけるウイルスの増殖、続く精製を含む従来の方法を使用して、達成され得る。
本発明のC35エピトープは、大量に生成され得るので、従って、生成および精製されたこの抗原は、ワクチン調製物における用途を有する。このC35エピトープは、サブユニットワクチン調製物に処方され得るか、またはウイルスベクターに操作され、そしてワクチン調製物へと処方され得る。あるいは、C35エピトープをコードするDNAは、ワクチン処方物として直接投与され得る。「裸の」プラスミドDNAは、一旦被験体に投与されると、細胞を侵襲し、発現され、ペプチド断片にプロセシングされ、このうちいくつかは、この侵襲された細胞の表面上のMHC分子に結合して示され得、そしてTリンパ球がこのC35エピトープを示す細胞を攻撃するように、細胞の免疫応答を誘発する。このC35エピトープはまた、例えば、被験体由来の体液の試料中の、C35を発現する腫瘍の存在、またはC35を発現する腫瘍によって誘導される抗体またはT細胞の存在を検出または測定するための、そして従って、癌および腫瘍を診断するための、そして/またはワクチン接種に続いて被験体の細胞免疫応答をモニターするための、診断における有用性を有する。
腫瘍発達に影響を与える遺伝子の2つのクラスが存在する。DNAレベルでの変化(例えば、変異)の結果として直接作用する癌の表現型(例えば、BRCA1、BRCA2、およびp53)に影響を及ぼす遺伝子は、1つのクラスの遺伝子である。別のクラスの遺伝子は、発現レベルでの調節によって表現型に影響を与える。乳癌の発症および引く続く悪性進行は、両方のクラスの種々の遺伝子の改変に関係する。悪性乳腺において生じる遺伝子発現の定量的な変化の同定は、十分に特徴付けられる場合、ヒト乳癌の診断および処置において有用であり得る新規な分子マーカーを生じ得る。
任意のC35ポリペプチドは、融合タンパク質を生成するために使用され得る。例えば、このC35ポリペプチドは、第二のタンパク質に融合される場合、抗原性タグとして使用され得る。このC35ポリペプチドに対して惹起される抗体は、C35に結合することによって第二のタンパク質を間接的に検出するために使用され得る。さらに、分泌タンパク質は、輸送シグナルに基づいて細胞位置を標的化するので、このC35ポリペプチドは、一旦他のタンパク質に融合されると、標的化分子として使用され得る。本明細書で使用する「融合タンパク質」という用語は、C35ポリペプチド断片を意味しない。
本発明はまた、C35ポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および組換え技術によるC35ポリペプチドの産生に関する。このベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能(replication competent)であってもよいし、複製不完全性(replication defective)であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補宿主細胞においてのみ起こる。
実施例1
ヒト乳癌におけるC35の差次的発現
本発明者らは、ヒト乳癌およびヒト膀胱癌において差次的に発現される遺伝子であるC35を提示する全長cDNAを特徴付けた(図1A)。C35の348塩基対DNA断片を、腫瘍および一次浸潤性管内乳癌を有する同じ患者由来の正常な乳房上皮細胞株から、ポリA RNAの減法ハイブリダイゼーションによって初めに単離した(Band,V.ら、Cancer Res.50:7351〜7357(1990))。この配列および重複EST配列(登録番号 W57569)の配列に基づくプライマーを用いて、全長C35コード配列を含むcDNAを、次いで、増幅し、そしてSKBR3乳房腫瘍細胞株(ATCC、HTB-19)からクローニングした。このC35 cDNAは、348bpコード配列に加えて、167bpの3’非翻訳領域を含む。
C35特異的CTLは、C35陽性乳房腫瘍細胞に対して細胞溶解性である
遺伝子産物は、C35の倍と同様に、腫瘍細胞において過剰発現され得るが、この遺伝子産物は、この遺伝子産物由来のペプチドが腫瘍細胞のMHC分子と関連して処理および提示され得る場合にのみ、免疫学的に関連する。任意の所定の遺伝子産物について、この腫瘍により発現されるMHC分子に結合するための要件を満たす細胞分解プロセスの間にペプチドが産生されないか、またはたとえこのようなペプチドが生成されても、他の腫瘍ペプチドによるMHC分子の輸送または競合における欠失が、この特定の遺伝子産物由来の任意のペプチドの提示を防止することが考えられる。たとえ関連の腫瘍ペプチドが、腫瘍細胞におけるヒトMHCに関連して処理および提示されても、全ての場合において、これらのペプチドと反応性のヒトT細胞が、レパートリーにおいて十分に示されるか否か、またはT細胞が、おそらくいくつかの他の非相同性正常組織における同一または関連の抗原の発現に起因して、耐性にされ得たか否かが決定されなければならない。従って、これら両方の理由のために、MHC制限されたヒト腫瘍抗原特異的T細胞が、C35によって誘導され得、そしてこの細胞が、ヒト腫瘍細胞において実際に交差反応性であることを確認することが重要である。この点についての関連の情報は、自系抗原提示細胞により提示される組換えC35またはC35ペプチドを用いる、ヒトT細胞応答のインビトロ刺激により得られ得る。
乳癌細胞の膜におけるC35発現
C35ポリペプチド産物が腫瘍細胞の表面で発現されるか否かを決定するために、C35特異的孔血清を調整した。BALB/cマウスを、レトロウイルスコードヒトC35で形質転換した同系株1のマウス腫瘍細胞で免疫した。一連の2回以上の免疫の後に、マウスを出血させた。免疫血清を用いて、ノーザンブロットにおいて、C35転写の高いレベル(21NT)、中程度のレベル(SKBR3)および低いレベル(MDA-MB-231)の発現を示す3つの乳房腫瘍細胞株について、フローサイトメトリーによりC35タンパク質の表面発現を検出した(図4A〜4Cを参照のこと)。1×105の乳房腫瘍細胞を、3.5マイクロリットルのC35特異的抗血清、またはコントロールの予め出血させたBALB/c血清で染色した。30分間のインキュベーションの後、細胞を染色緩衝液(PAB)で2回洗浄し、そしてFITC-ヤギ抗マウスIgG(1μg/試料)と共に30分間インキュベートした。試料を洗浄し、そしてEPICS Eliteフローサイトメーターで分析した。図4A〜4Cに示される結果は、腫瘍株21NTについて高レベル(図4A)、腫瘍株SKBR3について中程度のレベル(図4B)、および腫瘍株MDA-MB-231について検出不能なレベル(図4C)の特定の免疫血清により認識されるC35抗原の膜発現を示す。高レベルのC35転写物を発現する腫瘍細胞の膜に対する抗体の高レベルの反応性は、C35特異的抗体が、この遺伝子産物を過剰発現する多数の乳癌に対して効果的な免疫治療因子として働き得ることを示唆する(図2A〜2Cおよび3を参照のこと)。
調節解除されたリボソームタンパク質L3遺伝子は、共有マウス腫瘍拒絶抗原をコードする
本発明者らは、ポックスウイルスにおいて構築されるcDNAライブラリ由来のCTLエピトープをコードする遺伝子の選択を可能にする、新規の抗原発見技術を開発した。この技術を使用して、本発明者らは、共有マウス腫瘍抗原がリボソームタンパク質L3遺伝子の代替の対立遺伝子によってコードされることを示した。免疫原性L3遺伝子は、胸腺を含む正常な組織において、有意に減少したレベルではあるが発現される。免疫原性L3 cDNAのワクシニア組換え体による免疫は、腫瘍チャレンジに対する保護免疫を誘導する。ハウスキーピング遺伝子の調節解除された対立遺伝子は、免疫予後抗原として働き得、そして胸腺の発現はアップレギュレートされた腫瘍産物の免疫原性を阻止しないことに特に興味が持たれる。これらの知見は、自己タンパク質に対する耐性は絶対的ではないが、発現の定量的レベルに関して規定されなければならないことを強調する。記載されるリボソームタンパク質は、正常組織に対する免疫耐性を損なうことなく、自己タンパク質の調節解除された発現の結果として生じる共有腫瘍抗原のクラスを示し得る。このような抗原は、重要な器官の癌の免疫治療に適切である。
総RNAを、Perfect RNA Total RNA Isolation Kit(5 Prime 3 Prime,Inc.、Boulder、CO)を使用して、BCA 39腫瘍細胞から単離した。ポリA+mRNAを、Dynabead(Dynal、Lake Success、NY)を使用して、この総RNAから単離した。2μgのポリA+mRNAを、Great Lengths cDNA Synthesis Kit(Clontech,Palo Alto、CA)を使用して、二本鎖cDNAに変換した。次いで、この二本鎖cDNAを、ワクシニアウイルスベクターv7.5/tkに挿入した。
;および20μlの最終容量のKlentaq DNA Polymerase Mix(Clontech)を使用するPCRのテンプレートとして使用した。反応条件は、94℃で3分間の最初の変性工程、続いて、94℃で30秒間、60℃で30秒間、68℃で2分間の30回のサイクルを含んだ。これらのPCR産物は、3位と1252位との間にL3の領域を含んだ。PCR産物を、Centricon 100カラム(Amicon、Beverly、MA)を使用して精製し、Sau3AIで消化し、そして3%アガロース/エチジウムブロミドゲルで分離した。
広範に有効な腫瘍ワクチンの開発のための予測は、いくつかの自己タンパク質が、免疫T細胞により腫瘍抗原として認識され得るという証拠により進歩してきた
。このような正常な変異していない遺伝子産物は、異なる個体において生じる特定のタイプの腫瘍における共通の標的抗原として働き得る。このような共有腫瘍抗原でのワクチン化の後の保護免疫性の誘発についての臨床的証拠は、現在非常に限定されている(Marchandら、Int.J.Cancer 80:219(1999);Rosenbergら、Nat.Med.4:321(1998);Overwijkら、Proc.Natl.Acad.Sci.96:2982(1999);Brandleら、Eur.J.Immunol.28:4010(1998))。さらに、これらの自己タンパク質に対するT細胞応答が、免疫学的耐性の驚くべき崩壊を示すか、または腫瘍細胞における自己タンパク質の発現の定性的または定量的な変化の結果であるかは、ほとんど明らかではない。後者の場合、正常組織の耐性は維持され、そして自己タンパク質(この発現は、腫瘍において系統的に変更される)に対するワクチン誘導性免疫性は、重要な器官の癌に対してさらに適用可能であり得る。
示された濃度のVVova(tk−)でスパイクされた野生型vNotl/tk(tk+)から構成されるワクチンカクテルをCML選択に供した(12)。
%VVova=(BudRを含む滴定濃度/BudRを含まない滴定濃度)×100
nd=検出されない
C35腫瘍抗原の発現および免疫原性
新規なC35腫瘍遺伝子のRNA転写は、正常なヒト組織における発現と比較した場合、試験された原発性ヒト乳癌の70%(12/17)において、そして試験された膀胱癌の50%(5/10)において過剰発現する。全長遺伝子は、未知の機能の新規な115個のアミノ酸タンパク質をコードする。フローサイトメトリー分析によって、C35を発現する細胞の表面膜を染色する、モノクローナル抗体(2C3)を選択した。さらに、C35+乳癌および膀胱癌を特異的に溶解する、ヒト細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を、インビトロで産生した。インビトロにおいて、正常なヒトドナー由来のC35特異的CTLを産生するための能力は、過剰に発現したタンパク質に対する寛容性の欠如を示唆する。異なる固体の腫瘍におけるC35の過剰な発現ならびに体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導するための能力は、C35(免疫治療のための有望な候補物)を作製する。
細胞株:
ヒト乳癌細胞株(BT20、BT474、MCF7、MDA-MD231、SKBR3、T47D(ATCCにより供給される))を、10%のウシ胎児血清(Biofluids,Rockville,MD)で補充された、RPMI-1640(BioWhitaker,Walkersville,MD)中で増殖した。正常な胸部の上皮由来の不死化株、H16N2、2種の転移性腫瘍、21-MT1および21-MT2、ならびに全て同一の患者由来で、DFCI培地中で増殖した2種の原発性腫瘍(21-NTおよび21-PT)(Band,V.およびSanger,R.,「Tumor Progression in Breast Cancer」in Neoplastic Transformation in Human Cell Culture,J.S.RhimおよびA.Dritschilo編、The Human Press Inc.,Totowa,NJ.(1991)、第169から78頁)は、Dr.Vimla Band,New England-Tufts Medical Centerによって豊富に提供された。膀胱腫瘍細胞株ppT11A3を、免疫化非腫瘍化細胞株SV-HUCから誘導した。これらの膀胱細胞株は、Dr.Catherine Reznikoff,University of Wisconsin Clinical Cancer Centerによって豊富に提供され、そして500ml中に、1%のFBS、0.025ユニットのインシュリン、1μgのヒドロコルチゾン、5μgのトランスフェリン、2.7gのデキストロース、0.1μMの非必須アミノ酸、2mMのL-グルタミン、100ユニットのペニシリン、および100μgのストレプトマイシンを充填した、F12培地中で増殖した。正常に増殖する胸部上皮細胞(MEC)を、Clonetics(BioWhittaker)から購入し、そして供給者の指示に従って維持した。
細胞株を、約80%のコンフルエンシーでRNA抽出のために収集した。細胞を収集し、そしてQiagen RNAeasyキットのQG緩衝液中に溶解した。総RNAを、製造業者のプロトコールにより抽出し、そしてGITCおよびアルコールと共に沈殿物として−80度で貯蔵した。組織試料を、スナップ凍結試料としてCooperative Human Tissue Networkによって提供され、この試料を、RNAeasyプロトコールでの使用のために溶解緩衝液中でホモジェナイズした。ノーザンブロットのために、mRNAを、Dynal(Lake Success,NY)オリゴdT25磁性ビーズを使用する総RNAから抽出し(30μg 総RNA/ウェル)、そして3%のホルムアルデヒドを含む0.8%のSeaKemLE(FMC Bioproducts)中で電気泳動した。mRNAを、Genescreen Plus(NEN)(10×SSC中)上にキャピラリーブロットによって一晩かけてブロットし、次いで80℃で2時間ベーキングした。膜を、製造業者のプロトコールにより、68℃、106cpm/mlのQuickhyb溶液(Stratagene)で、ランダムにプライム化した32P標識cDNAプローブ(Prime-It,Stratagene,LaJolla,CA)を用いてプローブした。ブロットをX線フィルムおよび/または光現像(phosphorimage)スクリーンに一晩曝した。全てのブロット上での発現を、ハウスキーピング遺伝子(例えば、GAPDHまたはβアクチン)に規格化した。
Lisitsynらによって最初に記載(Lisitsyn,NおよびWigler,N.M.,Science 259:946-51(1993))されたようなRepresentational Difference Analysisに基づく、PCR Select cDNA Subtraction Kit(Clontech,Palo Alto,CA)を、製造業者のプロトコールを使用して、正常な胸部細胞株と比較して、腫瘍で過剰発現した遺伝子に対して富化されたcDNAを産生した。簡潔には、オリゴ-dTプライム化二重鎖cDNAを、腫瘍細胞および正常な細胞由来の、高質のDNase処理したmRNA(2μg)から合成した。アダプターを、短い平滑末端(Rsalで消化した)腫瘍配列に連結して、そして過剰のRsalで消化した正常な断片でハイブリダイズした。32時間のハイブリダイゼーション後に、抑圧(suppression)PCR(Clontech)により、プライマーとしてアダプター配列を使用して、過剰発現した腫瘍配列の優先的な増殖を可能にした。PCR増幅の産物を、pT7Blue3(Novagen,Madison,WI)中にクローニングして、差引きされたライブラリを産生した。クローンを、96ウェルフォーマット中でLB/アンピシリン(100μg/ml)において増殖し、挿入物を、一晩の培養物からPCR増幅し、そしてPCR産物を、BioDotマニホルド(BioRad,Hercules,CA)を使用するGenescreen Plus上にスポットした。次いで、二連のドットプロットを、ランダムにプライム化した腫瘍または正常なcDNAまたは順方向および逆方向の差引きハイブリダイゼーションのPCR産物でプローブした。腫瘍cDNAと順方向cDNAとを差し引いた物(腫瘍-正常)において過剰発現したようであるクローンを、ノーザンブロットによって(上記のように)分析し、ディファレンシャル遺伝子発現を確認した。
オリゴ-dTでプライム化した二重鎖cDNAを、SMART cDNA合成を使用する、SKBR3細胞株(Clontech Laboratories)から産生し、続いて、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールで抽出した。プライマーを合成し
、特にESTホモログ,登録番号W57569から推論されるオープンリーディングフレームに基づいて、C35のコード領域を増幅した。PCR産物を、pT7Blue3(Novagen)中にクローニングした。
C35のクローニング配列を、BamHI/SalI部位において、ライブラリからワクシニアトランスファープラスミド(pVTK0)に、規定された方向にサブクローニングした。組換えウイルスを、NotIおよびApaIで消化したV7.5/TKウイルスDNAと共にpVTK0.C35の、鶏痘ウイルスで感染させたBSC-1細胞へのトランスフェクションによって産生した。他(米国特許出願08/935,377;PCT/US98/24029;標的抗原およびそれに基づくワクチン)に記載される場合、これは、ワクチンウイルス組換え構築のための有効な方法である。このC35遺伝子をまた、レトロウイルスベクターpLXSNにクローニングし、そしてウイルスストックを、偽型のためにpVSVgを用いて293-GP細胞と同時トランスフェクションすることによって産生した。感染ウイルスを含む上清を、48時間後に収集した。
ライン1のマウスの小細胞の肺癌細胞を、C35レトロウイルスで感染し、そして103〜2×104の細胞を、3匹のBALB/cByJマウスに注射した。21日後に、血清を、レトロオービタル(retro-orbital)血液から採取し、そして低いレベルのC35mRNA(MDA-MD-231)または非常に高いレベルのC35mRNA(21NT)を発現することが公知のヒト腫瘍細胞との反応性をチェックした。脾臓をまた、標準的なマウスハイブリドーマ技術を使用するP3黒色腫細胞での脾臓細胞の融合により、ハイブリドーマの産物を採取した。ELISAを使用して、Igの存在について、HAT耐性クローンをスクリーニングした。大量の産物を、アイソタイプ化し、定量し、そしてフローサイトメトリーによってC35+細胞株およびC35-細胞株をスクリーングした。1μgのIgGを含むハイブリドーマクローンの上清を、PAB(PBS、1%のBSA、0.1%のアジド)中の106個の細胞を、氷上で30分間インキュベートし、続いて、PABを用いて3回洗浄し、そしてFITC(Southern Biotechnology,Birmingham,AL)に結合体化したヤギ抗マウスIgGと共に、氷上で30分間インキュベートした。一つのハイブリドーマクローン(2C3)を、免疫血清に見られる表面染色を再利用し(図14Aおよび14B)、そして展開および抗体精製のために選択した(BioExpress,West Lebanon,NY)。
健康な女性ドナー由来の末梢血(HLA A2、11、B35、44)は、赤血球ロゼット陽性画分(全Tリンパ球の供給源)および陰性画分(単球の供給源)に分離した。Tリンパ球は、単球が樹状細胞(DC)を生成するための条件下でインキュベートされる間、後の使用のために凍結保存された。DCの変異は、いくらか改変して、Bhardwajおよび同僚(Bender,A.ら、J.Immunol.Meth.196:121-35(1996);Reddy,A.ら、Blood 90:3640-46(1997);Engelmayer,J.ら、J.Immunology 163:6762-68(1999))によって記載されるように誘導した。hGM-CSFおよびhIL-4(1000U/ml)を一日おきに加えた。7日目に、非粘着性未成熟DCをGM-CSFおよびIL-4の存在下で6時間、C35についてレトロウイルス組換え体とともにインキュベートした。この時点で、レトロウイルス上清を洗浄し、そして未成熟樹状細胞を変異条件(これは、再び、GM-CSF、IL-4ならびに12.5%単球馴化培地(MCM)を含んだ)に供された。4日後、これらの成熟C35発現DCを使用して自己T細胞を14日間、1DC:50 T細胞の比で刺激した。自己DCの新鮮なプールを、T細胞の再刺激のために生成したが、このとき、これらは、C35についてのワクシニアウイルス組換え体とともにMCM中で、48時間の成熟の後に感染した。サイトカインIL-2(20U/ml)、IL-12(20U/ml)およびIL-18(10ng/ml)を加え、そして1:50の比のDC:T細胞を維持した。12日間の培養に続いて、T細胞をさらに7日間、C35組換えレトロウイルスに感染したEBV-B細胞とともに、IL-2(20U/ml)およびIL-7(10ng/ml)を添加して、刺激した。サイトカインをすべてR&D Systems(Minneapolis,MN)から購入した。この時点で、細胞は>90%のCD8+であり、そして標準的な51Cr放出アッセイで活性について試験した。手短には、百万の標的細胞を100μCiの51Crとともにインキュベートし、洗浄し、次いで、RPMI-1640中で4時間、CTLエフェクターとともにインキュベートし、10%ヒトAB血清(BioWittaker)を補充した。CTLの活性は、(CTLによって標識標的の溶解時に上清に放出された51Cr-自発的放出)/(最大放出−自発的放出)として測定された特異的放出の割合として表現された。
C35の特徴付け:
クローンC35の配列は、ヒト乳房腫瘍細胞において差次的に発現され、Genbankにおいていずれの公知配列とも相同ではないが、相同なEST配列(プロトタイプ寄託番号W57569)が同定された。相同なヒトEST断片は、脳、肺および腎臓(A# AA954696)、Soares 卵巣(A# AA285089)および副甲状腺腫瘍(A# W37432)、子宮内膜腫瘍(A#AA337071)、および結腸癌腫(A# AA313422)を含む、NCI CGAP (Cancer Genome Anatomy Project)ライブラリーに存在する。115アミノ酸タンパク質(図10A)をコードするオープンリーディングフレームを同定した。全長遺伝子を、乳房線腫細胞株SKBR3のcDNAライブラリーから単離した。細胞株SKBR3、21MT2-D、およびH16N2由来の全長転写物の配列決定は、cDNAに点変異がないこと;転写物がC35hi細胞株ならびにC35lo細胞株において100%相同であることを確認した。C35遺伝子は、ヒト染色体17q12(A# AC040933)およびマウス染色体11(A# AC064803)に整列する。エキソンは、cDNA EST配列との相同性、ならびにGRAIL予測から推定した。興味深いことに、C35の遺伝子は、Her2/neu発癌遺伝子の1000塩基対以内であり、成長因子レセプター結合タンパク質7(GRB7)(細胞サイクルを活性化することに関与し、そして食道癌腫において過剰発現されるチロシンキナーゼ)についての遺伝子の2000bp以内である(Tanaka,S.ら、J.Clin.Invest.102:821-27(1998))(図10B)。Her2/neuタンパク質過剰発現は、30%乳房腫瘍における遺伝子増幅と相関しており、そして乏しい臨床的予後と関連する(Slamon,D.J.ら、Science 235:177-82(1987))。
腫瘍免疫療法に対する理想的な標的抗原は、複数の独立した癌腫において豊富に発現され、そして正常な増殖する生きた組織において存在しないかまたは最小に発現される。C35の差次的発現は、ノザンブロット分析によって確認された。C35は、7/10ヒト腫瘍細胞株において、正常な不死化乳房上皮細胞株H16N2(図11A)における発現よりも10〜25倍高いレベルで発現する。重要なことに、C35発現は、一次(21NT、21PT)病変および転移性(21MT1、21MT2)病変との両方に由来する株の間で共有され、これは、その発現が腫瘍形質転換のプロセスにおいて初期の事象と関連し得ることを示唆する。さらに、C35の過剰発現は、独立して誘導されるヒト哺乳動物癌腫細胞株(SKBR3、T47D、およびBT474を含む)の間で共有される。興味深いことに、SKBR3、MDA MB231、H16N2および同じ患者由来の腫瘍におけるC35発現パターンは、Her2/neu発現と相関し、これは、2つの遺伝子の密接なゲノム近さおよびHER2/neu遺伝子増幅の発生と関連し得る。
C35によってコードされる遺伝子産物の差次的発現を確認するために、共有される腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体が選択される。ハイブリドーマを、乏しい免疫原性BALB/cByJ腫瘍細胞株(これは、レトロウイルスヒトC35組換え体を用いて形質導入されている)を用いてマウスを免疫することによって産生した。ハイブリドーマクローンを、それらがC35++乳房腫瘍細胞株および膀胱腫瘍細胞株(図13Aおよび13B)を染色する能力についてスクリーニングした。非腫瘍形成性の乳房H16N2上皮細胞株および膀胱SV-HUC上皮細胞株は、アイソタイプコントロールと比較した場合、蛍光強度の有意な移動を示さなかった。対照的に、2C3モノクローナル抗体は、C35+乳房腫瘍、SKBR3および21-NT-D、および膀胱腫瘍ppT11A3を特異的に染色した。染色は、固定も透過もされなかった細胞で行われ、これは、2C3抗体が表面分子を認識することを示す。
抗体は、癌の診断マーカーを検出するための有用なツールであるが、これらはまた、治療的適用についての可能な使用を有し得る。ヒト化Her2/neu特異的抗体(Herceptin)は、いくつかの乳癌の処置のために首尾良く使用されている。Herceptinは、HER2/neuに結合し、そして増殖因子レセプターからの信号伝達を下方調節する。増殖阻害研究は、C35特異的2C3抗体を用いて行われた。21NT-D乳房腫瘍およびH16N2「正常」乳房細胞株は、種々の抗体濃度の存在下でインビトロで増殖した。72時間で細胞増殖を評価するためにXTTアッセイを行った。図14Aおよび14Bに示される結果は、2C3が、1μg/ml程度の低い濃度で約50%、21NT腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。
自己寛容の確立は、自己タンパク質に基づくワクチンの開発に対する主要な障害である。しかし、寛容は、定量的レベルの発現の点で規定されなければならない。高い親和性抗原特異的T細胞が寛容化される場合でさえ、低い濃度の抗原に対する機能的アビディティを有さない低い親和性レセプターを有するT細胞が寛容誘導を逃れることが可能である。しかし、これらの同じT細胞は、引き続いて、標的抗原の過剰発現と関連する顕著な増加したアビディティ-がある場合、機能的に有意になり得る。これらが数が少ない場合でさえ、このようなT細胞は、免疫学的操作、ワクチン接種の大部分の基礎によって増殖され得る。
C35は、乳房癌腫および膀胱癌腫において過剰発現される新規な腫瘍抗原である。この遺伝子は、それを腫瘍免疫療法に対する有望な候補にする性質を有する。この遺伝子は、異なる個体から誘導される有意な数の腫瘍において発現される。生きた正常な組織における発現は、比較的低く、自己免疫反応の危険を減少させ、そして等しく重要であり、免疫細胞が遺伝子産物に対して寛容にされないようにする。C35は、「腫瘍抗原」として特徴付けられる。なぜなら、C35発現樹状細胞が、インビトロで自己腫瘍特異的ヒト細胞傷害性Tリンパ球を誘導するからである。
腫瘍の標的抗原に特異的な細胞傷害性T細胞の誘導
ヒト腫瘍特異的T細胞は、腫瘍溶解物を用いてパルスされた自己腫瘍または自己抗原提示細胞を用いるPBLの刺激によりインビトロで誘導された(van Der Bruggen,P.ら、Science 254:1643-1647(1991);Yasumura,S.ら、Cancer Res.53:1461-68(1993);Yasumura,S.ら、Int.J.Cancer 57:297-305(1994);Simons,J.W.ら、Cancer Res.57:1537-46(1997);Jacob,L.ら、Int.J.Cancer 71:325-332(1997);Chaux,P.ら、J.Immunol.163:2928-2936(1999))。PBLは、腫瘍を用いて、免疫原性を増強するように改変された腫瘍を用いて、または腫瘍抽出物を用いて故意に免疫された患者あるいは先の刺激のみが疾患の自然な過程にある患者のいずれかから誘導された。感染性因子に対する反応性を有するT細胞は、感染性因子に対する曝露の自然な過程の間、インビトロで感染されたか、またはインビボで感染されたかのいずれかである自己細胞を用いてT細胞のインビトロ刺激によって同様に誘導され得る。腫瘍細胞またはウイルス、真菌、もしくはミコバクテリアのいずれかに感染した細胞または自己免疫疾患の標的抗原に特異的なT細胞もしくは抗体のいずれかに特異的なこれらまたは他の条件下で選択されたCD4+およびCD8+T細胞または抗体は、これらの標的抗原をコードし、そして代表的なcDNAライブラリーに組み込まれたcDNAを検出しそして単離するために、本発明の選択およびスクリーニング方法において使用され得る。
C35ペプチドエピトープで刺激された系4T細胞によるGM-CSF分泌の誘導
T細胞株4は、各々、自家樹状細胞(DC)および、次いで、C35組換え体ワクシニアウイルスで感染させた自家単球で12日間正常ドナT細胞を刺激することによって生じさせた。週刺激をアロPBL、およびHLA-A2/Kb(21NT-A2)でトランスフェクトされた21NT腫瘍で継続した。実験の結果を図18に示す。この実験ではT細胞を、インビトロにて、ウェル当たり1ug/mlのC35ペプチドエピトープ9〜17、77〜85、104〜112、または105〜113でパルスした5×104照射(2500ラド)H16N2-A2/Kbで106T細胞にて、およびウェル当たりAIM-V/5%ヒトAB血清中のIL2(20U/ml)およびIL-7(10ng/ml)で105照射アロPBLにて再度刺激した。2回の7日間の刺激の後T細胞を、1ug/mlのペプチドでパルスした、またはパルスしていない、あるいはMOI=1にてvvC35またはvv野生型で感染させた異なるシミュレーターでのインキュベーションに続いてGM-CSF分泌の誘導につき試験した。T細胞(5000)を、三連にて、AIM-V/5%ヒトAB血清中にて25000の種々のスティミュレーター細胞と共に一晩インキュベートした。
ペプチド特異的CD8+T細胞の生成
CD8+T細胞の選択
抗凝集ヒト血液の標準的なFicoll-Hypaque分離を用いてPBMCを収穫した。全血液を50ml遠心管でHBSS(w/o Ca2+/Mg2+)で2:1希釈した。次いで、30mlの血液を12mlのフィコール上に重ねた。血液をブレーキをかけずに18℃、400×gにて30分間遠心した。PBMCを含有する界面層を取り出し、HBSSで2回洗浄した。
PBMCからのDC選択
PBMCを、全てのPBLを含めて、またはCD8+および/またはCD4+細胞選択に続いて平板培養した。Miltenyi Biotec MACS CD4マイクロビーズを用い、CD4+細胞をCD8+細胞(前記)と同様に選択した。PBLの不存在または存在はDC選択に差を生じさせない。次いで、RPMI無血清培地の6ウェルプレート中で5〜7×106細胞/ウェルにて、PBMCを37℃で2時間平板培養した。非接着性細胞を除去し、接着性層をHBSSで3回洗浄した。接着性細胞を、未成熟DCの生成のために、1%ヒトAB血清、1000U/mlのGM-CSFおよび1000UmlのIL-4を含むStemSpan(StemCell Technologies,Vancouver,BC,Canada)中で、37℃、7%CO2にて7日間インキュベートした。培地およびサイトカインを1日おきに補充した。
第7日に、非接着性細胞を収穫することによって未成熟DCを収集した。1%ヒトAB血清、1000U/mlのGM-CSF、1000U/mlのIL-4、10ng/mlのTNFαおよび1μg/mlのCD40Lを含むStemSpan中で、DCを37℃、7%CO2にて24〜48時間インキュベートして成熟させた。
第1の刺激は、ペプチドパルス自家DCを利用して行った。用いたCD8+細胞は新鮮なものであるか、または最小で刺激から24時間前に-80℃から培養に戻したのかいずれかであった。新鮮な成熟したDCをAIM-V培地中の96ウェルU底プレートのウェル当たり1×104細胞にて平板培養した。10μg/mlのペプチドおよび3μg/mlのβ2-ミクログロブリンを37℃、7%CO2の4時間のパルスのために個々のウェルに添加した。
第2番目および第3番目の刺激のためのプロトコルは、以下の例外を除き第1番目の刺激のためのプロトコルと同様であった。培養に戻し、成熟させることによって、凍結されたDCを利用した。DCを1〜10μg/mlペプチド(実験的に依存)で2〜4時間パルスした。DCを2500ラドで照射し、洗浄工程を省略した。従って、いずれの未結合ペプチドも培地に残った。細胞を12または24ウェルプレート中で20:1の比率(CD8:CD)にて維持し、1×106CD8+細胞/ウェルを平板培養した。第3番目の刺激から7〜12日後に、細胞傷害性および/またはサイトカイン放出アッセイを介してT細胞を標的細胞認識についてアッセイした。
種々の細胞型をAPC、すなわち、DC、単球、EBV-Bおよび腫瘍として用いることができる。自家単球を例として掲げる。PBMCを2500ラドで照射し、次いで、RPMI中の12ウェルプレートのウェル当たり4〜6×106細胞にて平板培養し、37℃、7%CO2にて2時間インキュベートした。非接着性細胞を除去し、接着性単球をHBSSで2回洗浄した。
細胞を限界希釈によってクローニングした。96ウェルのU底プレートのウェルに1〜10のCD8+細胞、1×104混合照射同種異型フィーダー細胞(2500ラド)、1000ペプチドパルス自家照射EBV-B細胞(2500ラド)、および5%ヒトAB血清を含むAIM-V培地中の10ng/mlのIL-7を添加した。第1日に、20IU/mlのIL-2を添加した。50%の培地を交換し、新鮮なサイトカインおよび照射されたフィーダーおよびペプチドパルスβ細胞を加えることによって、クローンを毎週リフレッシュした。限界希釈のクローン性を示す<30%増殖を示すプレートから、クローンを、標的細胞認識アッセイ、細胞傷害性および/またはサイトカイン放出、および増殖につき選択した。
このプロトコルは、溶解活性を示すクローンで利用した。(個人的な通信を介してSteven Rosenberg博士(NCI)から頂いたプロトコル)
CD8+細胞を選択された標的細胞に対する活性につきスクリーニングした。APCをペプチドでパルスし、細胞を形質導入して、レトロウイルスまたはワクシニアウイルス、腫瘍、正常対照等を発現させた。フラスコから細胞を15ml円錐管に除去し、12mlのHBSSを添加し、細胞を再懸濁させ、遠心することによって、標的を洗浄した。次いで、上澄みを〜200μl注いだ。これに、100uCi51Cr/1×106細胞を添加した。次いで、標的を37℃、7%CO2にて1時間インキュベートし、次いで、2×12mlのHBSSで洗浄した。
用いたPharmingen(San Diego,CA)キットは、製造業者の指令に従う必要で変化させることができる。一般に、プロトコルは以下の通りであった:
C35ペプチド媒介T細胞溶解
C35ペプチドエピトープでパルスされたEBV細胞に対するT細胞活性を分析した。具体的には、異なるHLA特異性を発現する2つの別々のヒトドナーから得られたT細胞を、C35ペプチドエピトープでパルスされたEBV-B標的細胞と共にインキュベートした。結果を表10に示す
ペプチド17〜31 VEPGSGVRIVVEYAE
ペプチド22〜30 GVRIVVEYA
ペプチド72〜86 QLVFSKLENGGFPYE
ペプチド77〜85 KLENGGFPY
T細胞ドナーLE、HLAハプロタイプ:A3、A66;B8、B41
ペプチド67〜75 IEINGQLVF
ペプチド81〜89 GGFPYEKDL
T細胞ドナーAH、HLAハプロタイプ:A2、A11;B8、B35
ペプチド9〜17(SVAPPPEEV);77〜85(KLENGGFPY);104〜112(KITNSRPPC);105〜113(ITNSRPPCV)で刺激された系4T細胞によるGM-CSF分泌の誘導を参照
C35に特異的なモノクローナル抗体
免疫化プロトコル:
C35に特異的なモノクローナル抗体を生じさせるために、3つの方法のうちの1つを用いて、BALB/cByJマウスを免疫化した。
ELISAアッセイを用いて、C35についての反応性および特異性につき、各融合からの500〜1000のハイブリドーマクローンによって分泌された抗体をスクリーニングした。ELISAプレートをC35タンパク質または陰性対照としてのβガラクトシダーゼでコートした。双方のタンパク質を生じさせ、選択タグの切断を含めて同様に大腸菌から精製した。次いで、ハイブリドーマクローンからの上澄みを、コートしたプレート上でインキュベートし、続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)で標識された抗マウス抗体とでインキュベーションを行い、およびOPD基質で検出した。C35タンパク質と強く反応するが、β-ガラクトシダーゼとは反応しなかったクローンをさらなる特徴付けのために選択した。各選択されたハイブリドーマクローンを数回サブクローンして、安定な抗体産生細胞株を開発した。表11はC35についての確認された特異性を有するクローンを列挙する。いくつかの場合において、抗体の特異性は、後記するようにC35タンパク質ゲルのウェスタンブロットによって、または免疫組織化学染色によって確認した。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖遺伝子をクローニングし、そのうち2つが同一であると判断された3つのC35ペプチドハイブリドーマから配列決定した。
ウェスタンブロット免疫検出は、選択されたハイブリドーマクローンからの上澄みで行った。4ハイブリドーマ(1B3、1F2、3E10、11B10)からの抗体は、このアッセイでhC35タンパク質と特異的に反応した。これらの実験において、100ngの精製された組換えC35タンパク質または対照β-ガラクトシダーゼタンパク質を18%SDSポリアクリルアミドゲルの各レーンに負荷した。ゲルを、当業者によく知られているように、PVDF膜に移した。膜を、Tween-20および5%脱脂乾燥乳を含むトリス緩衝化生理食塩水(TBS)でブロックした。各ブロットを一次抗体としてのハイブリドーマ上澄みの種々の希釈物と共にインキュベートし、続いて、二次抗体、HRPにコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgGと共にインキュベートし、ケミルミネセント基質ECLで検出した。抗体1B3、1F2、および3E10についての結果を図20に示す。同様の結果が11B10で得られた(図示せず)。
ELISAおよびウェスタンブロットデータは、これらのモノクローナル抗体が組換えC35タンパク質と反応することを示す。加えて、モノクローナル抗体1F2は、一次乳癌切片の免疫組織化学染色で利用性を有することが示された。図21は、モノクローナル抗体1F2がヒト乳癌における高レベルの内因性C35発現を検出できることを示し、正常乳房組織はほとんどまたは全く染色されない。抗体は1F2ハイブリドーマ上澄みからアフィニティー精製した。パラフィン包埋スライドをキシレンで脱パラフィンし、グレードアルコールにより再度水和させた。標的の検索は蒸気および高いpH処理を介して達成された。切片を正常血清でブロックし、アフィニティー精製された1F2(5mg/ml)と共にインキュベートし、続いて、ベクターABCユニバーサル検出キットと共にインキュベートし、DAB基質で展開した。スライドをヘマトキシリンで逆染色し、EtOH/キシレンで脱水し、カバーグラスを載せた。
一旦個々のクローンの特異性が確認されれば、ハイブリドーマクローンおよび融合パートナーNS1の細胞ペレットを、可変領域遺伝子の後のクローニングのために-80℃でスナップ凍結させた。RNAを細胞ペレットから抽出し、InvitrogenのGeneracerキットを用いて全長cDNAを生じさせた。簡単に述べれば、RNAの5'末端のキャップを除き、次いで、Generacer5'オリゴに連結する。オリゴ-dTプライマーおよび逆転写酵素を用いて逆ストランドcDNAを生じさせる。前記5'プライマー、およびIgG1定常領域における保存された配列から設計された3'プライマーとして遺伝子レーサーオリゴを用いるPCRによって、二本鎖cDNAを増幅させた。PCR産物をクローニングし、配列決定した。融合パートナーのそれと比較した場合にユニークな配列を有するクローンを同定した。前記配列をNCBIデータベースのIgBLASTに提出して、可変領域フレームワークおよび相補的な決定領域(CDR)をマッピングした。これらのV-遺伝子がC35に特異的であることを確認するために、これらの配列をコードする組換え抗体を生じさせ、インビトロで発現させ、ELISAおよびウェスタンによって分析した(データは示さず)。
正常な乳房上皮細胞についてのオンコジーンであるC35
C35は、本発明者らが、ヒト乳癌および膀胱癌の大きな割合において過剰発現されることを以前に示した未知の機能の遺伝子である。C35に対する抗体はインビトロでC35陽性腫瘍細胞の増殖を阻害する。これは、C35遺伝子産物が腫瘍細胞膜上でシグナル変換で役割を演じることを示唆し、C35がオンコジーンである確率を生起させる。軟寒天におけるコロニーの増殖は足場依存性(正常細胞からの腫瘍トランスフォーメーションを受けた細胞を区別する特性)の認められた尺度である。C35のオンコジーン活性をアッセイするために、不滅化非腫瘍形成性乳房上皮細胞(H16N2)の系列を、全長C35遺伝子についてのpTag.hC35組換え体で、空のpTagベクター単独(pCMV-タグ哺乳動物発現ベクター、Stratagene Corporation,LaJolla,CA)で、または既知のオンコジーンであるrasでトランスフェクトした。トランスフォーメーションを示す軟寒天におけるコロニーの形成を強化し、21-MT1乳房腫瘍細胞と比較した(以下の表12参照)。結果は、C35でのトランスフェクションに続いて形成された軟寒天コロニーの数の10倍増加を示す。これは、rasでのトランスフェクションに続いて形成されたコロニーの頻度、または21-MT1腫瘍系が軟寒天で平板培養された場合の結果に匹敵する。
溶液中でMHC-ペプチド相互作用をモニターするための蛍光偏光
蛍光は1つの波長における入射放射線の吸収のプロセス、引き続いてのもう1つの波長における放射線の発光によって特徴付けられる。この挙動は、まず、蛍光のストークスの法則の形態でG.G.Stokes(1852)によって記載され、そこでは、彼は、蛍光(発光)は、常に、入射(励起)放射線の波長よりも大きな波長で出現すると述べた。
N末端欠失変異体および/またはC末端欠失変異体の構築
以下の一般的アプローチを用いて、N末端欠失またはC末端欠失のC35欠失変異体をクローニングし得る。一般に、約15〜25ヌクレオチドの2つのオリゴヌクレオチドプライマーを、配列番号:1のポリヌクレオチドの所望の5’位および3’位から誘導する。このプライマーの5’および3’位置を、所望のC35ポリヌクレオチド断片に基づいて決定する。開始コドンおよび終止コドンを、必要な場合、それぞれ5’プライマーおよび3’プライマーに付加して、このポリヌクレオチド断片によってコードされた、C35ポリヌクレオチド断片を発現する。好ましいC35ポリヌクレオチド断片は、本明細書の「ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの断片」の節において上記で開示された候補のMHCクラスIおよびMHCクラスII結合ペプチドをコードするポリヌクレオチド断片である。
C35のタンパク質融合
C35ポリペプチドを、好ましくは他のタンパク質に融合する。これらの融合タンパク質を種々の適用に用い得る。例えば、His-タグ、HA-タグ、プロテインA、IgGドメイン、およびマルトース結合タンパク質へのC35ポリペプチドの融合によって精製が容易になる。(実施例5を参照のこと;また、EP A 394,827;Trauneckerら、Nature 331:84〜86(1988)を参照のこと)。同様に、IgG-1、IgG-3およびアルブミンに対する融合によって、インビボでの半減期が延びる。C35ポリペプチドに融合された核局在化シグナルは、このタンパク質を特定の細胞下位置に標的し得るが、共有的異種二量体または同種二量体が、融合タンパク質の活性を増大または減少し得る。融合タンパク質はまた、複数の機能を有するキメラ分子を作製し得る。結局、融合タンパク質は、融合されていないタンパク質に比べて、融合したタンパク質の可溶性および/または安定性を増大し得る。上記のこのタイプの融合タンパク質の全てが、以下のプロトコールを改変することによってなされ得る。以下のプロトコールは、IgG分子へのポリペプチドの融合を概説する。
生物学的試料におけるC35の異常なレベルを検出する方法
C35ポリペプチドは、生物学的試料において検出され得る、そしてC35のレベルの上昇および低下が検出される場合、このポリペプチドは、特定の表現型のマーカーである。検出の方法は多いので、当業者は以下のアッセイを改変して、特定のニーズに適合し得ることが理解される。
ポリペプチドの処方
C35組成物は、個々の患者の臨床状態(特に、C35ポリペプチド単独を用いた処置の副作用)、送達部位、投与の方法、投与の計画、ならびに開業医に公知の他の因子を考慮に入れて、良好な医療実施基準(good medical practice)と一致した様式において、処方および投薬される。従って、本明細書中での目的のための「有効量」は、このような考慮によって、決定される。
C35ペプチド媒介細胞溶解
種々の細胞株に対するT細胞活性を分析した。具体的には、ペプチドパルスDCで刺激した1つのヒトドナーから得られたT細胞を異なる細胞株標的と共にインキュベートした。結果を表13および14に示す。
Claims (30)
- C35に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
(a)配列番号:151でコードされるVH領域および配列番号:150でコードされるVL領域、または、
(b)配列番号:149でコードされるVH領域および配列番号:148でコードされるVL領域を含み、
該抗原結合断片がFab断片、F(ab’)2断片、およびFv断片からなる群より選択される、単離された抗体またはその抗原結合断片。 - 請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項2記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項3記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
- 治療剤をさらに含む、請求項5記載の組成物。
- 治療剤が抗腫瘍薬物、細胞毒素、および放射性因子からなる群より選択される、請求項6記載の組成物。
- 治療剤が細胞毒素である、請求項7記載の組成物。
- 細胞毒素がタキソール、リシン、ドキソルビシン、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エトポシド、テノポシド(tenoposide)、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、1-デヒドロテストステロン、およびグルココルチコイドからなる群より選択される、請求項8記載の組成物。
- 細胞毒素がタキソールである、請求項9記載の組成物。
- 治療剤が抗体または抗原結合断片と結合または複合体を形成する、請求項6記載の組成物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項5〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- C35に関連する癌の治療における使用のための、請求項1に記載の抗体もしくは抗原結合断片または請求項5〜12のいずれか1項に記載の組成物。
- 癌が乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膵臓癌、および結腸癌からなる群より選択される、請求項13記載の抗体もしくは抗原結合断片または組成物。
- 癌が乳癌である、請求項14記載の抗体もしくは抗原結合断片または組成物。
- C35に関連する癌を治療する医薬品の製造における使用のための、請求項1に記載の抗体もしくはその抗原結合断片または請求項5〜12のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 癌が乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膵臓癌、および結腸癌からなる群より選択される、請求項16記載の使用。
- 癌が乳癌である、請求項17記載の使用。
- 該抗体もしくは該抗原結合断片または該組成物が、有効量の治療剤の前、後、または同時にC35発現細胞に投与される、請求項16記載の使用。
- 治療剤が抗腫瘍薬物、細胞毒素、および放射性因子の少なくとも1つからなる群より選択される、請求項19記載の使用。
- 治療剤が細胞毒素である、請求項20記載の使用。
- 細胞毒素がタキソール、リシン、ドキソルビシン、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エトポシド、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、1-デヒドロテストステロン、およびグルココルチコイドからなる群より選択される、請求項21記載の使用。
- 細胞毒素がタキソールである、請求項22記載の使用。
- 治療剤が抗体または抗原結合断片と結合または複合体を形成する、請求項23記載の使用。
- 医薬品がC35に関連する癌に対する癌治療を必要とする哺乳動物のためのものである、請求項16記載の使用。
- C35に関連する癌が、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膵臓癌、および結腸癌からなる群より選択される、請求項25記載の使用。
- 癌がヒトの癌である、請求項26記載の使用。
- 試料中のC35の存在を検出する方法であって、以下を含む方法:
(a)試料を、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片に接触させる工程;および
(b)C35に対する抗体またはその抗原結合断片の結合についてアッセイする工程。 - アッセイする工程が、ELISA、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光技術、および免疫細胞化学アッセイからなる群より選択されるアッセイによって実施される、請求項28記載の方法。
- 試料中のC35の存在を検出するための診断キットであって、以下を含むキット:
(a)請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片;および
(b)C35抗体に対する特異的な結合パートナーおよび検出可能なシグナルを生成し得る標識を含む結合体。
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