CN102459322B - 用于免疫治疗的hla-b*0702共有表位的鉴定、优化与应用 - Google Patents

用于免疫治疗的hla-b*0702共有表位的鉴定、优化与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了基于代表肿瘤抗原共有表位的肽有效治疗具有HLA-B*0702表型的患者的新方法和物质。特别地，本发明涉及鉴定可引发针对来自单个多基因家族的数种抗原的细胞毒性应答的HLA-B*0702限制性肽的方法，并涉及数种这样的表位。

Description

用于免疫治疗的HLA-B*0702共有表位的鉴定、优化与应用
本发明涉及肽的免疫治疗领域。特别地，本发明提供了基于代表肿瘤抗原共有表位的肽有效治疗具有HLA-B*0702表型的患者的新方法和物质。
肽免疫接种或免疫治疗是目前在癌症预防和治疗领域受到极大关注的治疗方法。这种治疗方法的原理基于利用可再生肿瘤抗原T表位的肽进行免疫接种，所述肿瘤抗原可以被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别，而细胞毒性T淋巴细胞对于表面表达有这些抗原的肿瘤细胞的清除具有重要作用。
应该理解，CTL识别的不是完整的蛋白抗原，而是由表达于不同细胞表面的主要组织相容性复合物(MHC)分子提呈的完整蛋白抗原的肽片段。这些肽片段构成了T表位。由I型主要组织相容性复合物(MHCI)分子提呈的肽通常具有8-11个氨基酸，并被代表细胞毒性应答的主要组分的CD8+T细胞识别。在抗原加工过程中发生肽选择，这种选择导致肽提呈的层级(hierarchy)。被MHCI分子优先提呈的肽被称为免疫显性肽，而被MHCI分子较弱提呈的肽则被称为隐蔽肽。免疫显性肽表现对MHCI的高亲和性且是免疫原性的，而隐蔽肽则表现对MHCI的低亲和性且是非免疫原性的。
肿瘤特异性表位的鉴定，特别是由较常见的MHCI等位基因提呈的那些肿瘤特异性表位(考虑到CD8+应答在细胞毒性中的重要作用)的鉴定，构成了抗肿瘤免疫治疗组合物开发的重要步骤。目前已知许多肿瘤抗原，已经鉴定出这些抗原的一些T表位，并且在许多案例中已经显示基于再生这些T表位的肽的疫苗的有效性(Menez-Jamet和Kosmatopoulos，2009)。
然而，大部分肿瘤抗原的表达都受限于肿瘤的某些组织学类型，从而限制了它们的临床使用。随着功能对维持致癌表型至关重要的抗原的鉴定，对广泛表达的“通用(universal)”肿瘤抗原的研究得以加强，并且正努力鉴定出由大部分患者表达的表位。
肽免疫治疗的另一主要限制来自某些患者中出现的肿瘤变体(逃逸变体)，所述变体不再表达由细胞毒性T淋巴细胞识别的抗原。
某些肿瘤抗原属于多基因家族：在相同家族中具有序列同源性，这可导致相同家族中的两个或多个成员存在共有表位。
通常，相同抗原家族的不同成员在不同的肿瘤类型中表达；这些抗原的共有表位的使用使具有广谱活性的抗肿瘤疫苗的获得成为可能。
另外，在许多情况中，相同家族的数种抗原在同一肿瘤系中共表达；由于所有这些抗原表达均丧失的概率极低，使用这些抗原的共有表位可避免逃逸变体的出现。
在已知属于多基因家族的肿瘤抗原中，特别要提及MAGE-A、HER、BAGE或GAGE家族的抗原。
MAGE-A是由位于X染色体的q28区的12个同源基因(MAGE-A1至A12)构成的多基因家族(DePlaenetal.，1994)。在该家族的成员中，MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10以及MAGE-A12由肿瘤而非正常组织(除了睾丸和胎盘以外)强表达。
MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10以及MAGE-A12抗原存在于组织学来源变化非常大的大量(广谱)肿瘤中，例如黑素瘤、肺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤以及肉瘤、骨髓瘤等。
基于MAGE的癌疫苗，例如MAGE-A3抗原特异性癌免疫治疗剂(ASCI)(GlaxoSmithKline)当前处于开发后期，并且结果令人振奋。例如，该疫苗是基于与GSK专有佐剂系统联合作为重组蛋白提呈至患者免疫系统的肿瘤抗原，并且已经成功地完成了在黑素瘤和非小细胞肺癌中的两个临床试验。
各MAGE-A抗原的表达可随肿瘤不同而不同，但总体上，大部分肿瘤至少表达一种MAGE-A抗原。
尽管使用共有T表位具有潜在的优点，但该方法极少使用，原因是在抗原之间完全相同的合适大小(对于MHCI提呈的肽为至少8个氨基酸)的区域极少。
发明人先前描述了一种用于鉴定由HLAI类分子提呈且由同一多基因家族的数种抗原共有的肽表位的方法，该方法的特征在于如下步骤(EP1485719)：
a)比对所述抗原的序列，以在各抗原上鉴定出具有8至10个氨基酸的序列，该序列包含至少一个共有的五肽(pentapeptide)序列，在五肽序列之前有3个氨基酸位于N末端，且任选五肽序列之后有1个或2个氨基酸位于C末端；实际上，作者发现限定由所述肽的P4位延伸至P8位的5个氨基酸序列相同是足够的。
b)制备与所鉴定出的序列对应的肽并测定各个肽与所关注的HLAI类分子的结合亲和性，并使用人类CMH-I转基因小鼠测定其免疫原性。
c)如果所选择的肽是隐蔽肽且因此为非免疫原性，则该方法进一步包括提高其免疫原性的步骤。
使用该方法，发明人描述了由序列YLEYRQVPV(SEQIDNo：1)所定义的免疫原性肽，该免疫原性肽由MAGE-A家族的抗原MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10以及MAGE-A12共同的HLA-A*0201提呈，能够诱导识别所有MAGE-A抗原的CTL和裂解表达MAGE-A家族的至少一种抗原的肿瘤细胞。
处于临床前和临床研究的肿瘤疫苗广泛靶向免疫显性肽，但结果令人失望(Grossetal.，2004)。实际上，肿瘤抗原常常是由肿瘤过表达而在正常细胞和组织中水平表达较低的自身蛋白。由于自身耐受过程，免疫系统不能针对所述自身抗原应答。自身耐受主要涉及免疫显性肽，从而解释了所述肽在诱导肿瘤免疫上的无能。
隐蔽肽较少参与自身耐受过程(Grossetal.，2004)并因而在免疫原性得到增强的前提下能够诱导有效的肿瘤免疫，。
增强隐蔽肽免疫原性的常用策略在于通过氨基酸取代提高其与MHCI分子的亲和性，所述隐蔽肽由于其低MHCI亲和性而是非免疫原性的。肽与MHCI分子的亲和性主要依赖于在明确定义的位置存在所谓“主要锚定残基”的残基(主要锚定位置)。所述残基具有MHCI等位基因特异性。主要锚定残基的存在尽管通常都是必需的，但却不足以确保高MHCI亲和性。已表明，位于主要锚定位置之外的残基(次级锚定残基)可对肽与MHCI的亲和性产生有利或不利影响。这些次级锚定残基的存在使得能够解释在具有主要锚定基序的肽之间结合亲和性存在大的变化(Ruppertetal.，1993)。
另外，旨在增强对MHCI分子的亲和性的氨基酸取代必须保留所述优化肽的抗原性。事实上，所产生的针对优化肽的CTL必须与相应的天然存在于肿瘤细胞表面的天然肽交叉反应。
发明人先前已经描述了用于选择肿瘤抗原中的隐蔽肽及优化其诱导对于HLA-A*0201患者(Tourdotetal.，2000)，EP1309860)和HLA-B*0702患者(WO2008/010098)的特异性免疫应答的方法。最近，发明人也在尚未公开的专利申请中描述了用于选择HLA-A*2402限制性隐蔽表位的方法。简言之，该方法在于在抗原中选择在第2位具有酪氨酸的8至12个氨基酸的肽，前提是所述肽不同时在第1位具有带正电的氨基酸(赖氨酸或精氨酸)和在C末端位置具有亮氨酸或异亮氨酸或苯丙氨酸。然后，可通过使用精氨酸或赖氨酸取代其N末端残基和/或通过使用亮氨酸(或异亮氨酸或苯丙氨酸)取代其C末端残基而优化此种隐蔽肽。
HLA-B*0702是广泛表达的分子(在25％的人群中有表达)。因此，有必要对HLA-B*0702限制性肿瘤肽进行鉴定和优化以开发出有效的癌疫苗用于表达HLA-B*0702的患者。
为了鉴定出用于表达HLA-B*0702的患者的广谱肿瘤疫苗，发明人对MAGE-A抗原序列进行了比对并搜寻如下所述的肽：所述肽具有第2和3位锚定(分别为脯氨酸和精氨酸或组氨酸或蛋氨酸或赖氨酸)并且在所述肽从P4位延伸至P8位的区域的序列相同。在保守的MAGE-A区中未发现相应序列。
然后，选择在抗原性区域(9个残基时为P4至P3位，10个残基时为P4至P9位)仅具有一个修饰的序列，并如WO2008/010098所述的经优化的非抗原性表位。令人惊讶地，发明人已经证明，经修饰抗原性增强的对应于HLA-B*0702隐蔽表位的肽不仅可引发针对天然肽的细胞毒性应答而且还引发针对存在于其他MAGE-A抗原上的同源表位的细胞毒性应答。
因此，本发明的第一方面是一种用于鉴定可引发针对来自单个多基因家族的至少两种抗原的细胞毒性应答的HLA-B*0702限制性肽的方法，所述方法至少包括下述步骤：
(i)在所述多基因家族的基因中鉴定在第2位为P和在第3位为选自R、K、H和M的氨基酸的9或10个氨基酸的肽；
(ii)比对步骤(i)中获得的序列；
(iii)在步骤(i)获得的所述肽中鉴定出具有至少两种肽的组，其中至少一种肽其抗原性区域至多有一个残基不同于该组其他肽，其中所述抗原性区域在具有9个氨基酸的肽中为从第4位延伸至第8位，在具有10个氨基酸的肽中为从第4位延伸至第9位。
步骤(iii)所鉴定的其抗原性区域至多有一个残基不同于所述组的其他肽的肽在下文被称为“基本共有肽”。这种肽引发针对来自所述多基因家族的至少两种抗原的细胞毒性应答。
根据所述方法的优选实施方式，所述方法能够鉴定出可引发针对所述多基因家族的至少三种、四种、五种、六种、七种或更多种抗原的细胞毒性应答的HLA-B*0702限制性肽。当步骤(iii)中所选择的肽组(具有肽的组)分别包含来自所述多基因家族的至少三个、四个、五个、六个、七个或更多个基因的肽时，即是如此。
在上述方法的具体实施方式中，步骤(iii)中所选择的肽组包含具有不同抗原性区域的至少两种肽。在该情况中，如下文实施例中所例示的，这些肽中的至少两种肽在其抗原性区域具有一个且仅一个差异。
在优选的实施方式中，所述方法还包括测定所选择的基本共有肽的免疫原性的步骤(iv)。该步骤优选在合适的模型中体内进行，所述模型即预测所述肽在表达HLA-B*0702的个体中的免疫原性的模型。此类合适模型的实例描述于实验部分并由HLA-B*0702转基因小鼠构成。在该模型中，通过接种小鼠并使用表达HLA-B*0702且荷载有所述肽的人细胞作为靶细胞测试是否已产生特异性CTL，从而检验所选择的肽的免疫原性。在下文中，如果接种的小鼠中无一发生针对所检测的肽的免疫应答，则认为该肽是非免疫原性表位。如果一些小鼠(但并非所有小鼠)发生了针对所检测的肽的特异性免疫应答，则认为该肽具有免疫原性，但进一步改进其免疫原性可能是有利的。
如果所选择的基本共有肽为非免疫原性或如果其免疫原性必须提高，则该方法还包括通过如WO2008/010098中所描述的方法增强其免疫原性的步骤。特别地，如果所选择的基本共有肽为非免疫原性且在其N末端具有除P以外的任何氨基酸(尤其是如果所述隐蔽表位的前三个残基是APR或APK或APH或APM)，则步骤(v)由使用亮氨酸取代所述表位的C末端残基构成。如果所选择的基本共有肽为非免疫原性且在其C末端具有选自L、A、I、V、M、C或T(尤其是L、A、I、V或M)的氨基酸，则可以通过使用丙氨酸取代所述表位的N末端残基而实施步骤(v)。当然，在该方法中，术语“取代”应理解为所得序列是通过所述取代从所述HLA-B*0702限制性隐蔽表位的序列衍生而得的肽，而无论获得所述肽的技术方法如何。例如，可通过人工肽合成或通过重组表达而生成所述肽。
根据本发明的方法可用于鉴定可引发针对任何已知多基因家族(例如MAGE-A、HER、BAGE或GAGE家族)的数个成员的免疫原性应答的表位。在优选的实施方式中，如下文实验部分中所例示的，所述多基因家族是MAGE-A家族。
本发明的另一方面是通过如上所述方法鉴定出的分离肽，其中所述选择的肽选自：MPKTGFLII(SEQIDNo：2)，MPKTGLLII(SEQIDNo：3)，FPKTGLLII(SEQIDNo：4)，VPKTGLLII(SEQIDNo：5)，MPKAGLLII(SEQIDNo：6)，MPKTGILIL(SEQIDNo：7)，MPKTGFLIIV(SEQIDNo：8)，MPKTGFLIII(SEQIDNo：9)，MPKTGLLIIV(SEQIDNo：10)，FPKTGLLIIV(SEQIDNo：11)，VPKTGLLIIV(SEQIDNo：12)，MPKAGLLIIV(SEQIDNo：13)，MPKTGILILI(SEQIDNo：14)，GPRALAETS(SEQIDNo：15)，GPRALIETS(SEQIDNo：16)，GPRALVETS(SEQIDNo：17)，GPRALAETSY(SEQIDNo：18)，GPRALIETSY(SEQIDNo：19)，GPRALVETSY(SEQIDNo：20)，EPRKLLTQD(SEQIDNo：21)，HPRKLLTQD(SEQIDNo：22)，DPKKLLTQH(SEQIDNo：23)，DPKKLLTQY(SEQIDNo：24)，HPKKLLMQD(SEQIDNo：25)，EPRKLLTQDL(SEQIDNo：26)，EPRKLLTQDW(SEQIDNo：27)，HPRKLLTQDL(SEQIDNo：28)，HPKKLLMQDL(SEQIDNo：29)，DPKKLLTQHF(SEQIDNo：30)，DPKKLLTQYF(SEQIDNo：31)。
当然，在本发明中，术语“分离肽”不应狭义理解。相反，该术语不仅表示其中的氨基酸残基通过肽键(-CO-NH-)连接的分子，还表示其中的肽键被修饰(特别是所述修饰使该肽对蛋白水解的抗性更强)且这种修饰不会破坏该肽的免疫原性的合成假肽或肽模拟物。
衍生自上述表位的免疫原性优化肽也是本发明的一部分。下文中，表述“优化肽”(经优化的肽)或“优化的免疫原性HLA-B*0702限制性表位”将指通过上文和WO2008/010098中所描述的方法衍生自HLA-B*0702限制性表位的免疫原性肽(称为其“同系天然肽”(cognatenativepeptide)。本发明的优化肽为SEQIDNo：32-67的肽，示于下表1中。
表1：MAGE-A抗原(抗原性序列突出显示)中具有高同源性的HLA-B7限制性天然肽和对应的优化肽
多特异性肿瘤接种相比单特异性接种提供了对肿瘤细胞更为广泛的控制，从而降低了出现免疫逃逸变体的风险。在大多数情况下，靶向数个表位相比靶向仅一个表位的免疫治疗更有效，前提是已知所述肿瘤表达所有靶标抗原。发明人之前已描述称作Vx-006的多肽，所述多肽由衍生自三种不同的通用肿瘤抗原(TERT988Y、HER-2/neu402Y和MAGE-A248V9)的HLA-A*0201限制性优化隐蔽肽组成(WO2007/073768)。Vx-006能够在HLA-A*0201转基因HHD小鼠中体内诱导和在人类体外诱导多特异性CD8细胞应答，然而TERT988Y、HER-2/neu402Y和MAGE-A248V9肽的混合物不能诱导三特异性反应。因而，包含数个表位的嵌合多肽相比于相同表位的单纯混合物可以更为有效地引发针对多于一个表位的应答。依照该情况，包含单个表位的重复的嵌合多肽相比于由所述表位构成的肽也可以针对所述表位引发更强的应答。实际上，多肽结构(不论是具有数个不同表位的多肽结构或还是具有单个表位的重复的多肽结构)可以产生能够优化一个或多个靶标肽的特异性免疫应答的新的接合表位(junctionalepitope)，尤其是CD4限制性表位。此外，当皮下注射游离肽时，肽直接与存在于注射部位的每个细胞的MHC分子结合。因为多肽需要被加工，用多肽接种更有效地将抗原性肽靶向专职抗原提呈细胞(APC，即树突细胞)。
本发明的另一方面因而是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含一个、两个、三个或更多个如上所述的HLA-B*0702限制性表位。特别地，根据本发明的嵌合多肽可包含一个、两个、三个或更多个如上所述的天然HLA-B*0702限制性表位，或一个、两个、三个或更多个选自SEQIDNo：32-67的具有免疫原性的优化的HLA-B*0702限制性表位。当然，在嵌合多肽中，优化的HLA-B*0702限制性表位还可与已经鉴定为免疫原性表位的天然HLA-B*0702限制性表位组合。在本发明的嵌合多肽中，所述表位可以彼此不同，和/或相同表位可以重复数次。
需要注意的是，当特异于同一HLA分子的数个表位以混合物或嵌合多肽一起使用时，所述表位竞争结合相应的HLA分子。相反地，通过使用不同HLA限制性表位(HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-B*0702或其他)的混合物或包含同样的不同HLA限制性表位的嵌合多肽，将不存在对HLA结合的竞争，并且将确实地获得多特异性应答，前提是所有HLA分子在接种个体中均被表达。
在本发明的嵌合多肽中，上述HLA-B*0702限制性隐蔽表位或免疫原性表位(天然的或优化的)因而可以有利地与前述HLA-A*0201(WO02/02716)和/或HLA-B*0702肽(WO2008/010010和WO2008/010098)相连和/或与下表2中所示的HLA-A*2402肽相连和/或与衍生自先前所述的肿瘤相关抗原的免疫原性表位相连，所述肿瘤相关抗原包括CEA、PRAME、酪氨酸酶、TRAG-3、NY-Eso-1、P53、Muc-1、PSA/PSMA、存活素、Melan-A/MART-1、TRP-1、TRP-2、WT1、EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、G250/MN/CAIX、STEAP、甲胎蛋白、RAGE-1、PAGE-1。当然，多等位基因肽混合物也是本发明的一部分，所述混合物至少包含本发明的肽和一种不同的HLA限制性表位(HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-B*0702或其他)。
能够有利地结合(以混合物或嵌合多肽形式)HLA-B*0702限制性MAGE-A表位的表位的实例以及能够有利地结合(天然的或优化的)免疫原性HLA-B*0702限制性MAGE-A表位的优化的免疫原性表位的实例描述于下表2。当然，所述列举并非限制性的。
表2：可以以本发明的嵌合多肽结合HLA-B*0702限制性MAGE-A表位的HLA-A2、HLA-B7以及HLA-A24表位
本领域技术人员可以选择任意已知技术来产生此类多肽。例如，可通过化学合成或使用遗传工程技术获得所述多肽(Velderseta1.，2001)。
本发明的另一目的是分离的核酸分子，所述核酸分子被设计成引起如上所述的隐蔽的HLA-B*0702限制性MAGE-A表位、或免疫原性HLA-B*0702限制性MAGE-A表位(天然的或优化的)或嵌合多肽的表达。“被设计成引起……肽的表达”在本文中表示，当核酸被导入合适细胞时，所述肽被表达，以与从中选择所述肽序列的全抗原相分离(并在合适情况下按照如上所述被优化)。编码所述表位或嵌合多肽的区域通常位于处于合适启动子控制下的多核苷酸中。细菌启动子将优选用于在细菌中的表达，其可体外产生或在特定情况下体内产生多肽。可用在体内直接产生本发明的肽或多肽的细菌实例是单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，该菌是通过主动吞噬作用进入专职抗原提呈细胞的兼性胞内细菌(Paterson和Maciag，2005)。可选地，可以使用合适载体直接施用本发明的核酸。在这种情况下，可以使用组织特异性、强组成型或内源性启动子控制所述肽表达。合适的载体系统包括裸DNA质粒、增强递送的脂质体组合物和引起瞬时表达的病毒载体。病毒载体的实例是腺病毒或痘苗病毒载体以及疱疹科的载体(尤其是非复制形式)。
本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物至少包含作为活性成分的如上所述的HLA-B*0702限制性MAGE-A隐蔽表位，或如上所述的免疫原性(优化的或天然的)HLA-B*0702限制性MAGE-A表位或本发明的嵌合多肽，或编码它们中任一者的核酸，和/或携带所述核酸的载体。药物组合物的配制将依照当代标准和技术。旨在人类施用的药物将在充分无菌的条件下制备，在该条件下一种或多种活性成分与等渗溶液或适于所推荐的治疗用途的其他药物载体组合。合适的制剂和技术一般性地描述于最新版的Remington药物科学(MaackPublishingCo，EastonPA)。
特别地，本发明的HLA-B*0702限制性MAGE-A表位或嵌合多肽或核酸可用以制备用于预防性或治疗性抗癌免疫治疗的组合物。肽GPRALVETL(SEQIDNo：54)和包含其的嵌合多肽尤其适用于该目的。
在具体实施方式中，本发明的药物组合物是疫苗。在这后一情况下，上述组分可以与加强免疫应答佐剂组合。经典的佐剂包括诸如不完全弗氏佐剂或Montanide的油性乳剂，以及诸如明矾的粘附性表面。尤其有用的是特别经TLR(例如细菌DNA或源自细菌膜蛋白)募集和活化树突细胞的佐剂或辅助引发细胞毒性T细胞的佐剂。所述组合物还可以包含另外地增强免疫应答或促进癌细胞的凋亡或清除的其他因子，例如IL-2或IL-12细胞因子或GM-CSF。
多剂量和/或不同组合的本发明的免疫原性组合物可以被分别或一同包装用以分配。每一组合物或每组组合物(诸如下述试剂盒)可以配上关于组合物或组合引发免疫反应和/或治疗癌症的用途的书面说明。
在此前的专利申请(WO2006/120038)中，申请人已描述能起始并维持靶向亚显性/隐蔽表位的T细胞应答的接种方案。WO2006/120038所报道的结果证明，注射对应于亚显性/隐蔽表位的天然肽(此前用其同系优化肽接种)可以维持由所述优化肽起始的免疫反应。
根据本发明，HLA-B*0702限制性MAGE-A隐蔽表位可因此用以制备用于维持由其同系优化肽起始的CTL免疫应答的药物组合物。还可以使用具有衍生自HLA-B*0702限制性MAGE-A隐蔽表位的优化的免疫原性HLA-B*0702限制性MAGE-A表位序列的免疫原性肽，用以制备用于起始不仅针对所述HLA-B*0702限制性MAGE-A隐蔽表位而且针对上述方法步骤(iii)中所选择的所述组的所有表位的CTL免疫应答的医药组合物。当然，来自步骤(iii)中所选择的所述组的肽的混合物也可用于维持由基本共有肽起始的CTL免疫应答。例如，肽SEQIDNo：15-17的混合物可用于维持由肽SEQIDNo：54起始的CTL免疫应答。
本发明还包括针对肿瘤抗原或病毒抗原接种患者的方法，其中所述方法包括用与天然HLA-B*0702限制性MAGE-A隐蔽表位或步骤(iii)中所选择的组的表位同系的优化免疫原性肽接种的第一步骤，之后为使用所述天然肽或所述组的肽混合物接种的第二步骤。
在此类方法中，可以通过使用嵌合多肽而非单表位肽进行所述第一步骤和/或所述第二步骤，所述嵌合多肽包含一个、二个、三个或更多个如上所述的优化肽或隐蔽肽。特别地，在其抗原性区域包含具有至多一个变异位置的数个隐蔽表位的嵌合多肽可用于维持由与一个所述隐蔽表位同系的优化肽起始的CTL免疫应答。例如，包含序列SEQIDNo：15-17的嵌合多肽可用于维持由肽SEQIDNo：54起始的CTL免疫应答。应注意，由于MAGE-A抗原的表达趋向性，如果证明如上所述的HLA-B*0702限制性表位是免疫原性的，则相同的天然免疫原性表位可用于所述两个接种步骤。特别地，天然免疫原性MAGE-A表位可有利地与第一嵌合多肽或单表位肽混合物中的天然隐蔽表位组合，与第二嵌合多肽或单表位肽混合物中的优化表位组合。
本发明还涉及试剂盒，所述试剂盒以分离的制剂或在分别的容器(瓶、管等)中包含：(i)第一肽，所述第一肽包含HLA-B*0702限制性MAGE-A天然表位(优选隐蔽表位)的序列，和
(ii)第二肽，所述第二肽包含与(i)所述天然表位同系的优化免疫原性表位的序列。
能够作为本发明试剂盒的部件的肽的实例为可构成第一肽的SEQIDNo：2-31的肽，第二肽随后通过上文和WO2008/010098中所述的提高其免疫原性的方法而衍生自所述第一肽。本发明的优选试剂盒包含SEQIDNo：54的肽和在另一容器中的SEQIDNo：17或15或16的肽，优选SEQIDNo：17的肽。在该试剂盒的变体中，所述试剂盒还包含SEQIDNo：16和/或15的肽，其与SEQIDNo：17在同一容器中或在一个或数个单独的容器中。
本发明的其他试剂盒包含至少一种嵌合多肽。在该实施方式中，所述试剂盒至少还包含与嵌合多肽中所包含的表位之一同系的肽，其中所述同系肽是分离的或包含在另一嵌合多肽中。
本发明涉及此类试剂盒的数个优选变体：在第一实施方式中，所述试剂盒以分离的制剂包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包含一个、两个、三个或更多个HLA-B*0702限制性MAGE-A隐蔽表位，所述第二嵌合多肽对应于其同系HLA-B*0702限制性MAGE-A免疫原性嵌合多肽(这意味着它包含与所述第一嵌合多肽中所包含的隐蔽表位同系的优化的HLA-B*0702限制性MAGE-A免疫原性表位)。在第二实施方式中，所述试剂盒包含一个、两个、三个或更多个与不同HLA-B*0702限制性MAGE-A隐蔽表位相对应的肽(其中所述肽混合在单个制剂中或分离为数个制剂)，以及以分离的制剂包含嵌合多肽，所述嵌合多肽包含与所述隐蔽肽同系的优化的HLA-B*0702限制性MAGE-A免疫原性表位。
如上所述，可以有利地进行多等位基因刺激(即，使用特异于不同HLA分子的表位)来获得多特异性应答。因此，本发明的试剂盒的优选实施方式在分别分离的容器中包含：
(i)多等位基因肽混合物或多等位基因嵌合多肽，其包含至少如上所述的HLA-B*0702限制性MAGE-A天然(优选隐蔽)表位和至少一种不同的HLA限制性天然(优选隐蔽)表位(来自MAGE-A家族的抗原或来自另一抗原)，和
(ii)多等位基因肽混合物或多等位基因嵌合多肽，其至少包含与(i)中所述的HLA-B*0702限制性MAGE-A天然表位同系的HLA-B*0702限制性MAGE-A免疫原性表位，以及至少另一与(i)中所述的另一天然表位同系的免疫原性表位。
可选择地，本发明的试剂盒可以不包含至少部分肽或嵌合多肽，而包含编码所述肽或嵌合多肽的核酸。在此情况下，所述核酸如上所述。
在对本发明的一些特定试剂盒的如下描述中，将仅提及其中包含的肽(天然的或优化的)；应理解的是，所述试剂盒可包含一种或多种嵌合多肽(其包含天然隐蔽表位或优化表位)而不包含单表位的肽，并且除了包含至少部分所述肽或嵌合外多肽外还可以包含一种或多种核酸，或包含一种或多种核酸而不包含至少部分所述肽或嵌合多肽。
在本发明的具体实施方式中，所述试剂盒是接种试剂盒，其中所述第一(天然)肽和第二(同系优化)肽为单独的接种剂量。在优选实施方式中，所述接种试剂盒包含2剂量或3剂量的优化肽以及3剂量、4剂量、5剂量或6剂量的天然肽。本发明的特定接种试剂盒适于6次注射的第一接种顺序，包含2剂量或3剂量的优化肽以及4剂量或3剂量的天然肽。在久病情况下，优选的是，通过定期回忆(regularrecall)维持该首次接种后获得的免疫水平。这可以通过例如每1-6个月进行注射而完成。因此，包含至少2剂量且达40或50剂量的天然肽的补充性试剂盒(complementarykit)也是本发明的一部分。可选地，所述接种试剂盒可以包含2-3剂量的优化肽和3至40或达50剂量的天然肽。当然，所述试剂盒中存在的所述天然肽和优化肽如上所述。
每一剂量包含0.1-10mg、优选1-5mg的肽或者1-20mg的多肽。在优选实施方式中，配制各剂量以用于皮下注射。例如，将每一剂量配制成利用用作佐剂的MontanideISA51乳化的0.3-1.5ml含水溶液的乳剂。本领域技术人员可以选择一种或多种任何其他佐剂来代替MontanideISA51，或者除MontanideISA51外还可以选择一种或多种任何其他佐剂。在特别的实施方式中，所述制剂是含水溶液的形式。可选地，所述制剂可以是冻干肽的形式，用于现制待注射的液体溶液。所述试剂盒的其他可能组分是施用前加入至所述肽组合物中的一种或数种佐剂以及描述如何使用所述试剂盒的说明书。
以下通过如下附图和实施例进一步阐述本发明。
附图说明
图1：MAGE-A多基因家族序列。为了鉴定出由不同MAGE-A抗原所共有且由HLA-B*0702分子提呈的一个或多个表位，对MAGE-A抗原的序列进行了比对，并基于其在这些抗原之间的同源性选择具有至少5个氨基酸的区域(黑色实线框出)。来自MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12和/或MAGE-A10的完全相同的氨基酸以灰色标注。
图2：HLA-B*0702限制性优化隐蔽肽的免疫原性。按照所述方案用所述优化肽接种HLA-B*0702转基因小鼠，并如图所示，针对荷载有优化肽和两种相应天然肽的T2-B7靶标测试所生成的CTL。A：使用SEQIDNo：171的MAGE-AA1L9肽接种；B：使用SEQIDNo：54的单修饰的MAGEAL9肽接种。
实施例
已使用以下材料和方法进行实施例。
转基因小鼠：HLA-B7H-2I型敲除小鼠如先前所述(Rohrlichetal.，2003)。
细胞：转染HLA-B*0702的人T2-B7细胞如先前所述(Rohrlichetal.，2003)。
肽和质粒：通过Epytop(法国)合成肽。HLA-B*0702质粒由Lemonnier博士(InstitutPasteur，法国巴黎)(Rohrlichetal.，2003)提供。
测量肽对HLA-B*0702的相对亲和性：所使用的方法如先前所述(Rohrlichetal.，2003)。简言之，将T2-B7细胞和浓度在100μM至0.1μM范围内的肽一起在37℃孵育16小时，然后用ME-1单克隆抗体(mAb)染色以对HLA-B*0702的表面表达进行定量。对于各个肽浓度，以用100μM参考肽CMV265-274(R10V；RPHERNGFTV，SEQIDNO：172)获得的染色的百分数来计算HLA-B*0702特异性染色。相对亲和性(RA)的测定：RA＝(诱导20％HLA-B*0702表达的各肽的浓度)/(诱导20％HLA-B*0702表达的参考肽的浓度)。
在HLA-B*0702转基因小鼠中体内诱导CTL：用乳化在具有150μgI-Ab限制性HBV核心蛋白128(HBVcore128)T辅助表位(TPPAYRPPNAPIL，SEQIDNO：173)的不完全弗氏佐剂(IFA)中的100μg肽皮下注射小鼠。11天后，用肽(10μM)在体外刺激5×107个脾细胞。在培养的第6天，检测大量(bulk)应答群体的特异性细胞毒性。
细胞毒性检测：用100μCiCr51标记靶标60分钟，将其铺在96孔V底平板中(每孔100μLRPMI1640培养基中含3×103个细胞)，如果需要，用肽(1μM)在37℃刺激2小时。然后向孔中加入效应物并在37℃孵育4小时。特异性裂解的百分数计算为：裂解百分数＝(试验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)×100。
实施例1：鉴定MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12和/或MAGE-A10抗原共有的由HLA-B * 0702分子提呈的隐蔽表位，并测定它们与所述HLA分子的亲和性
为了鉴定不同MAGE-A抗原共有并由HLA-B*0702分子提呈的一个或多个表位，比对MAGE-A抗原的序列(图1)，并基于其在MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12和/或MAGE-A10抗原之间的同源性搜寻9至10个氨基酸的区域(以灰色标注的序列，图1)。由于MAGE-A10序列与MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12的同源性较低，如果在MAGE-A10中未发现等同物，也不排除为共有序列(图1)。
在下文的描述中，参考其第一氨基酸在MAGE-A1序列中的位置表示具有9至10个氨基酸的这些区。仅鉴定出至少9个氨基酸的两个区(第181位和第270位)。如先前所述，由于存在的同源性序列很少，作者描述了一种鉴定8至10个氨基酸的序列的方法，所述序列包含至少一个共有的五肽序列，五肽序列之前有3个氨基酸在N末端，且任选五肽序列之后有1个或2个氨基酸在C末端，实际上，作者发现限定所述肽从P4位延伸至P8位的5个氨基酸的序列相同是足够的。图1中框出了至少5个共有氨基酸的序列。使用该选择方法，鉴定出了另外4个区域(第21位、第65位、第132位、第256位)。
然后，鉴定出对应于HLA-B*0702限制性肽在第2位为P和在第3位为选自R、K、H和M的氨基酸的9或10个氨基酸的肽。如图1所示，未发现完全相同的序列。
为了扩大候选肽的选择，根据所述方法进行第二次搜索，以选择在P4和P8位之间表现出完全相同的序列的区域。再次未鉴定到序列。最后，进行第三次搜索，以选择在P4和P8位之间仅具有一个错配的序列。所鉴定出的序列示于上表1中，并在图1中以虚线框出。
由于仅三个不同的序列可识别所有的MAGE-A基因，选择MAGE-A269(9mer)组(接受MAGE-A10)。该组包含如下三个肽：MAGE-AA，SEQIDNo15(MAGE-A1，MAGE-A4)；MAGE-AI，SEQIDNo16(MAGE-A2，MAGE-A6)以及MAGE-AV，SEQIDNo17(MAGE-A3，MAGE-A12)，它们在其P6位不同。在MAGE-A10中未发现相应的序列。
检测各肽结合HLA-B*0702的能力(表3)。
表3：所选择的隐蔽肽与HLA-B*0702的亲和性。
RA＝相对亲和性＝RA＝(诱导20％HLA-B*0702表达的各肽的浓度)/(诱导20％HLA-B*0702表达的参考肽的浓度)，(-)表示RA＞10，(+/-)表示1＜RA＜10，(+)表示5＜RA＜10，(++)表示RA＜1
尽管这些肽含基本的P2R3锚定位置这一事实，但三个天然肽无一显示结合HLA-B*0702分子，表明它们是隐蔽肽。该研究的目的是发现能够诱导能识别细胞(不论MAGE-A基因是否表达)的特异性免疫应答的免疫原性肽。更确切地，通过使用经验证的肽接种诱导的CTL必须能够识别表达或提呈MAGE-AA、MAGE-AI以及MAGE-AV隐蔽天然肽(天然肽交叉识别)的细胞。然后修饰所选择的肽以提高其免疫原性。
实施例2：增强所选择的肽的免疫原性
为增强这些低亲和性肽的HLA-B*0702亲和性并由此增强其免疫原性，有必要鉴定出不利的次级锚定基序并用有利基序取代它们。选择天然肽以具有P2R3基本锚定位置，然后将兴趣集中于第二锚定位置1和9。
所检测的第一优化肽基于MAGE-AV序列，其在两个位置分别通过使用丙氨酸(A)取代P1和使用亮氨酸(L)取代P9而被修饰，已知丙氨酸和亮氨酸是有利于HLA-B*0702结合的氨基酸。
所述肽MAGE-AA1L9具有序列APRALVETL(SEQIDNO171)，并且能够结合至MHC(表4)，这证明所述修饰增强了其对HLA-B*0702分子的亲和性。然后，使用所述经修饰的肽接种HLA-B*0702转基因小鼠，并在11天后使用所述肽体外刺激其脾细胞。如图2A和表4所示，所述经修饰的肽具有免疫原性，但所诱导的MAGE-AA1L9特异性CTL不能交叉识别所述天然肽。
然而，所述取代应保持与TCR相互作用的所述肽片段构象，以保持所述肽的特异性。由于两种修饰可能对所述肽构象进行显著修饰，检测了仅在第9位修饰的新的优化肽。实际上，第1位上的G被描述为中性的，且不利于肽与MHC的亲和性。
由于所有接种的小鼠均发生了针对MAGE-AL9的特异性免疫应答，显示MAGE-AL9(SEQIDNo：54)具有强免疫原性。更重要的是，MAGE-AL9肽诱导的CTL能够识别荷载有各个天然隐蔽肽的靶细胞(图2B和表4)。
表4：优化肽的亲和性和免疫原性。
RA＝相对亲和性＝RA＝(诱导20％HLA-B*0702表达的各肽的浓度)/(诱导20％HLA-B*0702表达的参考肽的浓度)，(-)表示RA＞10，(+/-)表示1＜RA＜10，(+)表示5＜RA＜10，(++)表示RA＜1；(X/Y)表示所有接种的Y小鼠中发生特异性应答的X小鼠。
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Claims (10)

1.一种用于鉴定HLA-B*0702限制性肽的方法，所述HLA-B*0702限制性肽可引发针对来自MAGE-A家族的至少两种抗原的细胞毒性应答，所述方法至少包括下述步骤：
(i)在所述MAGE-A家族的基因中鉴定在第2位为P和在第3位为R的9个氨基酸的肽；
(ii)比对步骤(i)中获得的序列；
(iii)在步骤(i)中获得的所述肽中鉴定具有至少两种肽的组，其中至少一种肽是“基本共有肽”，即，其抗原性区域至多有一个残基不同于所述组的其他肽，其中所述抗原性区域从第4位延伸至第8位；
(iv)测定基本共有肽的免疫原性；和
(v)提高基本共有肽的免疫原性；
其中在步骤(iii)选择的基本共有肽具有任意氨基酸但是在其N-末端为P，并且其中步骤(v)由用亮氨酸取代所述基本共有肽的C-末端残基组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其用于获得可引发针对来自所述MAGE-A家族的至少三种抗原的细胞毒性应答的HLA-B*0702限制性肽，其中，步骤(iii)中选出的具有肽的组包含来自所述MAGE-A家族的至少三个基因的肽。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(iii)中选出的具有肽的组包含至少两种具有不同抗原性区域的肽。
4.通过权利要求1至3任一项所述的方法鉴定出的分离肽，其中，所述分离肽选自SEQIDNO:52-54。
5.一种药物组合物，其至少包含作为活性成分的权利要求4所述的分离肽。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其为疫苗。
7.一种试剂盒，所述试剂盒在分别的容器中包含：
(i)第一肽，所述第一肽包含选自SEQIDNo:15-17的HLA-B*0702限制性表位的序列，和
(ii)第二肽，所述第二肽包含选自SEQIDNo:52-54的HLA-A*2402限制性表位构成的序列。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述第一肽是选自SEQIDNo:15-17的分离表位，所述第二肽是其同系优化表位。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的试剂盒，其中，所述第一肽包含选自GPRALAETS(SEQIDNo:15)、GPRALIETS(SEQIDNo:16)和GPRALVETS(SEQIDNo:17)的序列，所述第二肽包含序列GPRALVETL(SEQIDNo:54)。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其是接种试剂盒，其中所述第一肽和第二肽的接种剂量相互独立。
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