ES2301800T3 - Epitopos peptidicos comunes a los antigenos de una misma familia multigenica. - Google Patents
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Abstract
Péptido inmunógeno que comprende un epítopo presentado por una molécula HLA de clase I y compartido por al menos dos antígenos de una misma familia multigénica, caracterizado porque se selecciona entre los péptidos definidos por la secuencia YLEYRQVPV (SEC ID Nº 3) y por la secuencia YVWELMTFGV (SEC ID Nº 4).
Description
Epítopos peptídicos comunes a los antígenos de
una misma familia multigénica.
La presente invención se refiere a péptidos que
representan epítopos compartidos por antígenos tumorales y a su
utilización en inmunoterapia.
La vacunación o inmunoterapia peptídica es un
enfoque terapéutico que actualmente es objeto de gran interés en el
marco de la prevención o del tratamiento de cánceres. Su principio
se basa en la inmunización con péptidos que reproducen epítopos T
de antígenos tumorales reconocidos por los linfocitos T citotóxicos
(CTL), que juegan un papel principal en la eliminación de las
células cancerosas que expresan estos antígenos en su
superficie.
Se recordará que los CTL no reconocen a los
antígenos proteicos completos, sino a fragmentos peptídicos de
estos, presentados por las moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad (CMH) expresadas en la superficie de diferentes
células. Son estos fragmentos peptídicos los que constituyen los
epítopos T. Los péptidos presentados por el complejo mayor de
histocompatibilidad de clase I (CMH I) tienen generalmente de 8 a 11
aminoácidos y son reconocidos por las células T CD8+ que
representan el componente principal de la respuesta citotóxica. Los
péptidos presentados por el complejo mayor de histocompatibilidad de
clase II (CMH II) tienen generalmente de 13 a 18 aminoácidos y son
reconocidos por las células T CD4+.
La identificación de estos epítopos constituye
por lo tanto una etapa esencial para el desarrollo de composiciones
de inmunoterapia anti-tumoral. Teniendo en cuanta el
papel esencial de la respuesta CD8+ en la citotoxicidad, la
identificación de epítopos presentados por el CMH I es esencial. Sin
embargo, el papel de los linfocitos T CD4+ en la inmunidad
anti-tumoral no es despreciable. Por lo tanto,
varios equipos han investigado los epítopos de antígenos tumorales
presentados por el CMH II. Los documentos WO00/52045 y WO 00/20581
describen péptidos derivados del antígeno MAGE-3 y
presentados por el CMH II.
Actualmente se conocen numerosos antígenos
tumorales; algunos de los epítopos T de estos antígenos se han
identificado y en muchos casos se ha demostrado la eficacia de
vacunas a base de péptidos que reproducen estos epítopos T.
Sin embargo, la expresión de la mayoría de los
antígenos tumorales está restringida a ciertos tipos histológicos
de tumores, lo que limita su utilización clínica.
Una dificultad suplementaria procede del enorme
polimorfismo de las moléculas del CMH, pues la eficacia de unión y
de presentación de un péptido dado no es la misma para diferentes
moléculas del CMH. El documento WO 01/42267 describe epítopos
identificados y, llegado el caso, optimizados para unirse a varias
moléculas del CMH.
Otra limitación importante de la inmunoterapia
peptídica es resultado de la aparición en algunos pacientes de
variantes del tumor (variantes de escape) que ya no expresan el
antígeno reconocido por los linfocitos T citotóxi-
cos.
cos.
Algunos antígenos tumorales pertenecen a
familias multigénicas: dentro de una misma familia existe una
homología de secuencia, que puede traducirse en la existencia de
epítopos compartidos, comunes a dos o más miembros de una misma
familia.
Generalmente, diferentes miembros de una misma
familia de antígenos se expresan en diferentes tipos de tumores; la
utilización de un epítopo compartido por estos antígenos podría
permitir obtener vacunas anti-tumorales de amplio
espectro de actividad.
Por otro lado, en muchos casos, varios antígenos
de la misma familia se co-expresan en una misma
línea tumoral; como la probabilidad de pérdida de la expresión del
conjunto de estos antígenos es extremadamente reducida, la
utilización de un epítopo compartido por estos antígenos puede
permitir evitar la aparición de variantes de escape.
Entre los antígenos tumorales conocidos por
pertenecer a una familia multigénica, se mencionarán particularmente
los antígenos de las familias MAGE-A, HER, BAGE o
GAGE.
MAGE-A es una familia
multigénica constituida por 12 genes homólogos
(MAGE-A1 a A12) situados en la región q28 del
cromosoma X (DE PLAEN et al., immunogenetics. 40, 360, 1994).
Entre los miembros de esta familia, MAGE-A1, -A2,
-A3, -A4, -A6, -A10 y -A12 son expresados fuertemente por los
tumores pero no por los tejidos normales, a excepción de los
testículos y de la placenta.
Los antígenos MAGE-A 1, 2, 3, 4,
6 y 12 están presentes en un amplio espectro de tumores de origen
histológico muy variado como melanomas, cánceres de pulmón,
cánceres de mama, tumores de cabeza y cuello y sarcomas, mielomas,
etc. (BRASSEUR et al., Int. J Cancer, 52, 839, 1992; BRASSEUR
et al., Int. J Cancer, 63, 375, 1995;
PELLAT-DECEUNYNCK et al., Eur. J. Immunol.,
30, 803, 2000; OFUJI et al., Anticancer Res., 18, 3639, 1998;
GIBBS et al., Melanoma Res., 10, 259, 2000; PATARD et
al., Int. J. Cancer, 64, 60, 1995; OTTE et al., Cancer
Res., 61, 6682, 2001; SUDO et al., J. Orthop. Res., 15, 128,
1997; LEE et al., Acta. Otolaryngol., 116, 633, 1996;
HASEGAWA et al., Arch. Pathol. Lab. Med., 122, 551, 1998;
YAMANAKA et al., Int. J. Mol. Med., 2, 57, 1998; GILLESPIE
et al., Br. J. Cancer., 78, 816, 1998; TAHARA et al.,
Cancer, 85, 1234, 1999).
La expresión de cada antígeno
MAGE-A puede variar de un tumor a otro, pero
globalmente, la gran mayoría de los tumores expresan al menos un
antígeno MAGE-A.
Las proteínas de la familia HER también son
expresadas por un gran número de tumores de origen variado tales
como tumores de mama, de ovario, de vejiga, de colon, etc. (J.
Cancer Res. Clin. Oncol. 2000, 126, 205; Clin. Cancer Res. 1999, 5,
4164; Clin. Cancer Res. 1999, 5, 3653; J. Cell Biochem. 1999, 73,
522; Br. J. Cancer 1994, 70, 459; Cancer Res, 2000, 60, 1483; Clin.
Cancer Res. 2001, 7, 1957; Adv. Cancer Res. 1997, 71, 343; Stem
cells, 1997, 15, 1; Science 1987, 235, 177; Cancer Res. 1990, 50,
4087).
A pesar del potencial interés de la utilización
de epítopos T compartidos, este enfoque sólo se ha propuesto muy
raramente. Se mencionarán los resultados de TANZARELLA et
al., (Cancer Res., 59, 2668-74, 1999), que
describen un péptido de secuencia REPVTKAEML (SEC ID Nº 38), que
constituye un epítopo común a varios antígenos de la familia
MAGE-A (MAGE-A 1, 2, 3 y 6) y que se
une al alelo HLA-B*3701 del
CMH-I.
El primer obstáculo para el descubrimiento de
otros péptidos que constituyan epítopos comunes a varios antígenos
tumorales de una misma familia es la rareza de las regiones de
tamaño apropiado (al menos 8 aminoácidos para un péptido presentado
por el CMH I) totalmente idénticas de un antígeno a otro.
Para vencer este obstáculo, los inventores
tuvieron la idea de investigar si los péptidos que presentaran un
porcentaje menor de identidad podrían poseer una especificidad
antigénica común y descubrieron que era suficiente una identidad
limitada a la secuencia de 5 aminoácidos que se extiende entre las
posiciones P4 y P8 del péptido.
En este documento se define como "secuencia
que se extiende entre las posiciones P4 y P8" la secuencia que
comienza por el aminoácido situado en posición 4 contando a partir
del extremo N-terminal del péptido y que termina
por el aminoácido situado en posición 8 contando a partir del
extremo N-terminal del péptido.
La presente descripción divulga un procedimiento
de identificación de epítopos peptídicos presentados por una
molécula HLA de clase I y compartidos por al menos dos antígenos de
una misma familia multigénica, caracterizado porque comprende al
menos las siguientes etapas:
- a)
- el alineamiento de las secuencias de dichos antígenos para identificar en cada uno de ellos una secuencia de 8 a 10 aminoácidos que posea las siguientes características:
- -
- comprenden al menos una secuencia común de cinco péptidos precedida por 3 aminoácidos en el extremo N-terminal y opcionalmente seguida de 1 ó 2 aminoácidos en el extremo C-terminal;
- -
- al menos dos de dichas secuencias difieren entre sí por al menos un aminoácido situado fuera de dicha secuencia de cinco péptidos;
- b)
- la preparación de los péptidos que responden a las secuencias identificadas en la etapa a).
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización preferida del
procedimiento de acuerdo con la invención, éste comprende además
una etapa c) de determinación de la afinidad de unión de cada uno de
los péptidos preparados en la etapa b) por la molécula HLA de clase
I en cuestión y de la estabilidad del complejo péptido/molécula HLA
de clase I.
Esta etapa permite la evaluación de la
inmunogenicidad potencial de los péptidos.
En efecto, los péptidos no inmunógenos presentan
generalmente una afinidad reducida por la molécula HLA de clase I
y/o forman con ésta un complejo poco estable. Los métodos para
determinar la afinidad del péptido por la molécula HLA y la
estabilidad del complejo formado se conocen por sí mismos. Se
mencionará por ejemplo el descrito por FIRAT et al., (Eur.
J. Immunol., 29, 3112, 1999).
La afinidad de un péptido por una molécula HLA
se define generalmente con respecto a la de un péptido de
referencia, por ejemplo IVGAETFYV (SEC ID Nº 1) por
HLA-A*0201 o RPHERNGFTV (SEC ID Nº 2) por
HLA-B*0702), en forma de afinidad relativa. La
afinidad relativa se define como la proporción entre la
concentración del péptido ensayado y la concentración del péptido
de referencia que permite la formación, en las mismas condiciones,
de la misma cantidad de complejo péptido/molécula HLA de clase I.
Cuanto mayor sea la afinidad relativa, menor será la afinidad de
unión del péptido por la molécula HLA de clase I.
La estabilidad del complejo péptido/molécula HLA
de clase I se define a menudo mediante el CD50, que representa el
tiempo necesario para la disociación del 50% de los complejos
formados.
Generalmente, la afinidad relativa es inferior a
5 y el CD_{50} superior a 2 horas en el caso de péptidos
potencialmente inmunógenos.
Si la realización de la etapa c) hace aparecer
uno o más péptidos potencialmente inmunógeno(s), la
inmunogenicidad de estos puede verificarse por ejemplo mediante los
métodos convencionales de determinación de la capacidad de este
péptido para generar, in vivo, ex vivo o in vitro una
respuesta CTL específica frente a células diana cargadas con este
péptido o que expresan el antígeno del que se obtiene u otros
antígenos de la misma familia.
Si no se descubre ningún péptido potencialmente
inmunógeno en la etapa c) el procedimiento de acuerdo con la
invención comprende una etapa suplementaria de preparación de un
péptido variante a partir de los péptidos obtenidos en la etapa b)
mediante sustitución de uno o más de los aminoácidos situados fuera
de la secuencia común de cinco péptidos, por uno o más de los
aminoácidos favorables para la inmunogenicidad, por ejemplo, por
uno de los restos del motivo de anclaje definido por la molécula HLA
de clase I en cuestión. También se puede sustituir el aminoácido
N-terminal por una tirosina, como se describe en la
Solicitud PCT WO 02/08716.
La afinidad de este péptido por la molécula en
cuestión puede determinarse como se ha indicado anteriormente. Su
inmunogenicidad se verificará a continuación determinando su
capacidad para generar una respuesta CTL específica frente al
péptido nativo del que se obtiene, así como al antígeno del que
procede este péptido nativo y otros antígenos de la misma
familia.
De este modo, la realización del procedimiento
descrito en la descripción ha permitido a los inventores identificar
epítopos compartidos por los antígenos de la familia
MAGE-A, así como epítopos compartidos por antígenos
de la familia HER.
Los inventores han obtenido en particular, a
partir de una región común a los antígenos MAGE-A1,
-2, -3, -4. -6, -10 y -12 de la familia MAGE-A, un
péptido inmunógeno presentado por HLA-A*0201 y capaz
de inducir a los linfocitos T citotóxicos que reconocen a todos los
antígenos MAGE-A y de lisar las células tumorales
que expresan al menos un antígeno de la familia
MAGE-A.
Este péptido, que se define por la secuencia
(código de 1 letra): YLEYRQVPV (SEC ID Nº 3), forma parte del
objeto de la presente invención.
Análogamente, los inventores han obtenido, a
partir de una región común a los antígenos HER1, 2, 3 y 4, un
péptido inmunógeno presentado por HLA-A*0201 y capaz
de inducir a los linfocitos T citotóxicos que reconocen a
todos
los antígenos HER1, 2, 3 ó 4 y de lisar las células tumorales que expresan al menos un antígeno de la familia HER.
los antígenos HER1, 2, 3 ó 4 y de lisar las células tumorales que expresan al menos un antígeno de la familia HER.
Este péptido, que se define por la secuencia
(código de 1 letra): YVWELMTFGV (SEC ID Nº 4), también forma parte
del objeto de la presente invención.
Los péptidos YLEYRQVPV (SEC ID Nº 3) e
YVWELMTFGV (SEC ID Nº 4), pueden utilizarse en el marco de la
inmunoterapia anti-tumoral para inducir una
respuesta CTL de amplio espectro, que permita el tratamiento de gran
variedad de tumores. Además, en el caso de péptidos como el péptido
YLEYRQVPV (SEC ID Nº 3), derivados de la familia
MAGE-A cuya expresión, fuera de los testículos y de
la placenta que son tejidos inmunoprivilegiados, se limita
únicamente a tejidos tumorales, el riesgo de reacción autoinmune se
reduce considerablemente.
La presente invención también se refiere a
composiciones que comprenden al menos un péptido inmunógeno de
acuerdo con la invención.
Puede tratarse de composiciones multiepitópicas,
capaces de generar una respuesta CTL poliespecífica y que, con este
fin, comprenden también uno o más epítopo(s)
inmunógeno(s) diferente(s). Estos epítopos pueden
obtenerse del mismo antígeno o de dos o más antígenos
diferentes.
Estas composiciones multiepitópicas de acuerdo
con la invención también pueden comprender al menos un epítopo
presentado por una molécula del CMH II y capaz de inducir una
respuesta T auxiliar. Estas composiciones pueden comprender además,
para poder utilizarlas ampliamente en una población cuyos individuos
portan alelos HLA diferentes, uno o más epítopos presentados por
moléculas del CMH I diferentes de HLA-A*0201.
De acuerdo con una realización preferida de una
composición de acuerdo con la invención, ésta comprende al menos un
polipéptido quimérico que comprende una o más copias de un péptido
inmunógeno de acuerdo con la invención. En el caso de una
composición multiepitópica, dicho polipéptido quimérico comprende
además una o más copias de al menos otro epítopo inmunógeno.
Dicho polipéptido quimérico puede obtenerse
fácilmente mediante métodos conocidos por sí mismos y
particularmente mediante las técnicas convencionales del ADN
recombinante.
La presente invención también se refiere a
moléculas de ácido nucleico que codifican un péptido inmunógeno o
un polipéptido quimérico de acuerdo con la invención.
La presente invención también se refiere a la
utilización de un epítopo peptídico inmunógeno, de una composición
o de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención para
la obtención de un medicamento y particularmente de un medicamento
para inmunoterapia anti-tumoral.
La presente invención también abarca a los
medicamentos que comprenden, como principio activo, al menos un
péptido inmunógeno, una composición o una molécula de ácido nucleico
de acuerdo con la invención.
Los medicamentos de acuerdo con la invención
pueden comprender además los excipientes habituales, así como
adyuvantes utilizados habitualmente en inmunoterapia y que permiten
por ejemplo favorecer la administración del principio activo,
estabilizarlo, aumentar su inmunogenicidad, etc.
La presente invención se entenderá mejor con
ayuda del siguiente complemento de descripción, que se refiere a
ejemplos no limitantes de realización del procedimiento de acuerdo
con la invención para identificar epítopos compartidos en la
familia MAGE-A y en la familia HER.
Para identificar uno o más epítopos compartidos
por los diferentes antígenos MAGE-A y presentados
por la molécula HLA-A*0201, se han alineado las
secuencias de los antígenos MAGE-A y se han
seleccionado regiones de 9 a 10 aminoácidos en base a su homología
entre estos antígenos.
En la siguiente descripción, estas regiones de 9
a 10 aminoácidos se designan en referencia a la posición de su
primer aminoácido en la secuencia MAGE-A1.
Se ha encontrado un solo péptido, p262, idéntico
en todas las secuencias MAGE-A. Se ha encontrado
otro péptido, p174, idéntico en las secuencias
MAGE-A1, -A2, -A3, -A4, -A6 y A12.
Para ampliar la selección de péptidos
candidatos, se ha realizado una segunda búsqueda para seleccionar
regiones que presentan una completa identidad de secuencias entre
las posiciones P4 y P8. Dos regiones respetaban este criterio: 248
y 264. Las secuencias de los grupos de péptidos obtenidos a partir
de estas regiones, así como las de los péptidos p174 y p262 se
representan en la Tabla I
El grupo p248 está constituido por dos péptidos:
p248G9 (MAGE-A2, -A3, -A4, -A6, -A10, -A12) y p248D9
(MAGE-A1) que difieren en su resto
C-terminal (posición P9). El grupo p264 se ha
excluido del resto del estudio, puesto que corresponde a un epítopo
ya conocido de MAGE-A3 (FLWGPRALV (SEC ID Nº 9))
restringido a HLA-A*0201 y también se sabe que las
células tumorales no lo producen eficazmente (MICONNET et
al., J. Biol. Chem., 275, 26892, 2000).
La afinidad de los péptidos seleccionados por
HLA-A*0201 se ha definido por dos parámetros: la
afinidad relativa (AR) que refleja la capacidad de los péptidos de
fijarse a HLA-A*0201 y la velocidad de disociación
de los complejos HLA-A*0201/péptido (CD_{50}) que
demuestra su estabilidad. Los péptidos con afinidad elevada (AR
< 5 y CD_{50} > 2 h) son potencialmente inmunógenos, al
contrario que los péptidos de afinidad reducida (AR > 5 y
CD_{50} < 2 h).
Células T2 humanas (FIRAT et al., Eur. J.
Immunol., 29, 3112, 1999) (3 x 10^{5} células/ml), que son
deficientes en transportadores TAP, se incuban a 37ºC durante 16
horas con diversas concentraciones (100 \muM, 10 \muM, 1
\muM, 0,1 \muM) de cada péptido a ensayar en medio RPMI 1640 sin
suero, suplementado con 100 ng/ml de
\beta2-microglobulina humana. A continuación, las
células se lavan dos veces y se marcan con el anticuerpo monoclonal
BB7.2 (PARHAM et al., Hum. Immunol., 3, 4,
277-299, 1981) que es específico de la molécula
HLA-A*0201 y después con un anticuerpo de cabra
anti-Ig de ratón, acoplado a isotiocianato de
fluoresceína (FITC).
A continuación se analizan las células en
citometría de flujo. Para cada concentración de péptido, se calcula
la fluorescencia específica de HLA-A*0201 como
porcentaje de la fluorescencia obtenida con 100 \muM de un
péptido de referencia (HIVpol 589; IVGAETFYV (SEC ID Nº 1)). La
afinidad relativa (AR) se define como la proporción de la
concentración de cada péptido que induce el 20% de la fluorescencia
obtenida con 100 \muM del péptido de referencia, con la
concentración del péptido de referencia que induce el 20% de la
fluorescencia obtenida con 100 \muM de dicho péptido de
referencia. Cuanto menor sea la afinidad relativa con más fuerza se
une el péptido a HLA-A*0201. La AR media para cada
péptido se determina a partir de al menos tres experimentos
independientes. En todos los experimentos, se ha obtenido el 20% de
la fluorescencia máxima para de 1 a 3 \muM del péptido de
referencia.
Células T2 (10^{6}/ml) se incuban durante una
noche a 37ºC con 100 \muM de cada péptido a ensayar en medio RPMI
1640 sin suero, suplementado con 100 ng/ml de
\beta2-microglobulina humana. A continuación, las
células se lavan cuatro veces para eliminar los péptidos libres, se
incuban con BREFELDIN A (SIGMA; 10 \mug/ml) durante una hora para
evitar la expresión en su superficie de moléculas de
HLA-A*0201 recién sintetizadas, se lavan y se
incuban a 37ºC durante 0, 2, 4, 6 u 8 horas. Para cada periodo de
incubación, las células se marcan a continuación, como se ha
indicado anteriormente, con el anticuerpo BB7.2 y se analizan en
citometría de flujo para evaluar la cantidad de complejo
péptido/HLA-A*0201 presente en su superficie. Esta
cantidad se evalúa mediante la fórmula: (fluorescencia media de las
células T2 preincubadas con el péptido - fluorescencia media de las
células T2 tratadas en condiciones similares en ausencia de
péptido). El CD_{50} (complejo de disociación: CD) se define como
el tiempo necesario para la pérdida del 50% de los complejos
HLA-A*0201/péptido, estabilizados a t = 0.
Los resultados de estos experimentos, que se
presentan en la Tabla II a continuación, demuestran que los péptidos
p174, p262, p248G9 y p248D9 solamente tienen una afinidad reducida
por HLA-A*0201.
Para aumentar esta afinidad, y por consiguiente
su inmunogenicidad, los péptidos p262, p248G9 y p248D9 se han
modificado sustituyendo los restos situados en las posiciones P2 o
C-terminal, por restos de anclaje específicos del
alelo HLA-A*0201, para producir las variantes p262L2
y p248V9. Para el péptido p174, se han producido dos variantes: en
una (p174Y1), el resto en posición P1 se ha sustituido por una
tirosina, en el segundo (P174Y1V10), además se ha sustituido el
resto C-terminal P10 por el resto valina, que puede
permitir un anclaje más fuerte.
La afinidad de estas variantes por
HLA-A*0201 se ha determinado como se ha descrito
anteriormente.
Los resultados, que se resumen en la Tabla II,
demuestran que las variantes p262L2 y p248V9 poseen una gran
afinidad de unión (AR = 0,2 y 1,8 respectivamente) y forman
complejos estables (CD_{50} = 6 h y 4 h respectivamente).
P174Y1V10 posee también una gran afinidad de unión (AR = 2,5) pero
la estabilidad del complejo formado parece insuficiente.
Se ha evaluado la inmunogenicidad de los
péptidos variantes p174Y1V10, p262L2 y p248V9 mediante la generación
de CTL en ratones transgénicos HHD (PASCOLO et al., J. Exp.
Med., 185, 2043, 1997). Estos ratones son \beta2m-/-, D^{b}-/-
y expresan una monocadena de HLA-A*0201 constituida
por los dominios \alpha1 y \alpha2 de HLA-A*0201
y los dominios \alpha3 e intracelular de D^{b}, unido por su
N-terminal al C-terminal de la
\beta2-microglobulina humana mediante un péptido
de 15 aminoácidos.
Los ratones HHD reciben una inyección subcutánea
en la base de la cola con 100 \mug de cada péptido variante a
ensayar emulsionado en adyuvante incompleto de Freund, en presencia
de 140 pg de un epítopo auxiliar T derivado del antígeno
"core" de HBV (128-140, secuencia
TPPAYRPPNAPIL).
Después de 11 días, se estimulan células
esplénicas extraídas de los ratones (5 x 10^{7} células en 10 ml)
in vitro con el péptido a ensayar (10 \muM). El 6º día de
cultivo, las poblaciones que responden se ensayan para determinar
una citotoxicidad específica. Las células que responden se
reestimulan in vitro a intervalos de una semana con 2 x
10^{7} células esplénicas HHD irradiadas (3000 rads) y de 1 a 0,1
\muM de péptido en presencia de 50 Ul/ml de IL2 recombinante
(PROLEUKIN, CHIRON CORP).
Se realizan ensayos de citotoxicidad 6 días
después de la última estimulación.
Se utilizan células RMAS-HHD
como dianas para estudiar la citotoxicidad. Estas células se
obtienen por transfección de células RMAS de ratón con la
construcción HHD como se describe por PASCOLO et al. (J. Exp.
Med., 185, 2043, 1997).
Estas células diana se marcan con 100 \muCi de
^{51}Cr durante 90 minutos y después se lavan tres veces y se
siembran en placas de 96 pocillos de fondo redondo (3 x 10^{3}
células/pocillo en 100 \mul de RPMI 1640 + suero fetal bovino al
3%). Estas células se cargan con diferentes concentraciones de
péptido a ensayar (variante, péptido nativo o péptido de control no
pertinente) a 37ºC durante 90 minutos.
A continuación se añaden 100 \mul de las
células efectoras (proporción de células efectoras/células diana =
40/1) a los pocillos y las placas se incuban a 37ºC durante 4 horas.
Después de la incubación, se recogen 100 \mul de sobrenadante y
se mide la radiactividad en un contador \gamma.
El porcentaje de lisis específica se calcula
mediante la fórmula: [(liberación experimental de ^{51}Cr -
liberación espontánea de ^{51}Cr)/(liberación máxima de ^{51}Cr
- liberación espontánea de ^{51}Cr)] x 100. En todos los
experimentos, la liberación espontánea es inferior al 20% de la
liberación máxima inducida por HCl 3 N.
Los resultados de estos experimentos se ilustran
mediante la Figura 1A.
El péptido p174Y1V10 no es capaz de generar una
respuesta CTL, algo previsible en vista de la reducida estabilidad
de su complejo con HLA-A*0201.
El péptido p262L2 induce CTL capaces de
reconocer a este péptido, pero no al péptido nativo p262.
Por el contrario, el péptido p248V9 induce una
respuesta CTL dirigida no solamente contra esta variante, sino
también contra los dos péptidos nativos p248G9 y p248D9.
Estos resultados demuestran que la variante
p248V9 genera CTL que matan a las dianas RMAS-HHD
cargadas con el péptido variante o con el péptido nativo
correspondiente.
En el caso del péptido p262L2, la no
conservación de la antigenicidad del péptido nativo puede explicarse
por la gran modificación de la estructura, resultante de la
sustitución en posición P2 de un resto glutamato por un resto
leucina, de tamaño y de carga muy diferentes.
Se ha establecido una línea de CTL denominada
CTL248 a partir de células esplénicas de un ratón HDD inmunizado
con el péptido p248V9, mediante repetidas estimulaciones in
vitro con concentraciones decrecientes de p248G9 (10 \muM - 1
\muM). Esta línea se mantiene en cultivo en presencia de 1 \muM
del péptido p248G9.
Para ensayar si las células de la línea CTL248
podían reconocer a antígenos MAGE-A de origen
natural, se han realizado dos tipos de experimentos.
Las células de la línea CTL248 se estimulan,
para cada uno de los antígenos MAGE-A1, -A2, A3,
-A4, -A6, -A10 y -A12, con células COS-7 de mono
co-transfectadas con la construcción HHD (PASCOLO
et al. mencionado anteriormente) y un plásmido que contiene
el ADNc de dicho antígeno. Como controles negativos se utilizan
células COS-7 transfectadas con la construcción HHD
en solitario o con el ADNc del antígeno MAGE-A en
cuestión. La estimulación de los CTL se evalúa midiendo su
secreción de TNF-\alpha. Como control positivo, se
utilizan las células COS-7 transfectadas con la
construcción HHD y cargadas con los péptidos p248D9 y p248G9.
4 días después de la transfección, las células
COS-7 se ponen en contacto con las células CTL248 a
razón de 5 x 10^{4} CTL por 3 x 10^{4} células
COS-7 en RPMI 1640 en presencia de SVF al 10%.
Después de 6 horas de incubación, el
sobrenadante se extrae y se pone en contacto con células de
fibrosarcoma de ratón WEHI164 clon 13 (3 x 10^{4} por pocillo)
que se caracterizan por una gran sensibilidad a la apoptosis
inducida por TNF-\alpha. Para cuantificar el
contenido de TNF de los sobrenadantes de cultivo, se utiliza
paralelamente una gama patrón de TNF-\alpha
(concentraciones de 0 a 10^{4} pg/ml). Después de 16 horas de
incubación a 37ºC, se determina la viabilidad de las células
WEHI-164 clon 13 mediante un ensayo colorimétrico
con MTT (SIGMA) (ESPEVIK y NISSEN MEYER, J. Immunol. Methods., 95,
99, 1986).
Los resultados se ilustran mediante la Figura
2.
Estos resultados demuestran que la línea CTL248
responde a la estimulación con las células COS que coexpresan HHD y
un antígeno MAGE-A. Todos los antígenos
MAGE-A1, -A2, A3, -A4, -A6, -A10 y -A12, son
reconocidos por esta línea.
Por el contrario, no se observa ninguna
respuesta a las células COS transfectadas por separado con la
construcción HHD o con el ADNc de un antígeno
MAGE-A.
Se han utilizado las siguientes líneas tumorales
HLA-A*0201:
- -
- líneas que expresan al menos un antígeno MAGE-A: M44 y M113 (melanoma); OBR (cáncer de vejiga);
- -
- líneas que no expresan antígenos MAGE-A: MCF-7 (cáncer de mama) y Caco-2 (cáncer de colon).
El perfil de expresión de
HLA-A*0201 y MAGE-A de estas líneas
se resume en la Tabla III a continuación.
La línea CTL248 se ha estimulado con cada una de
las líneas tumorales mencionadas anteriormente.
La estimulación se evalúa mediante detección de
la secreción de TNF-\alpha, como se ha descrito
anteriormente.
Los resultados se ilustran mediante la Figura
3A, que muestra que las células CTL248 responden a la estimulación
con células MAGE-A+, sea cual sea el antígeno
MAGE-A expresado, pero no responden a las células
MCF-7 y Caco-2, que no expresan
antígeno MAGE-A.
Para confirmar que el reconocimiento de las
células tumorales está muy restringido por
HLA-A*0201, se han estimulado las células CTL248
con células M44 preincubadas durante una hora con un anticuerpo
monoclonal anti-HLA-A*0201 (BB7.2)
o con un anticuerpo no pertinente (anti-CD 19) y se
ha medido la producción de TNF\alpha como se ha descrito
anteriormente.
Los resultados que se ilustran en la Figura 3B
demuestran que solamente el anticuerpo BB7.2, que bloquea a
HLA-A*0201, inhibe la respuesta de las células
CTL248.
Los resultados de los experimentos 1 y 2
anteriores demuestran que los CTL inducidos por p248V9 reconocen a
un epítopo de origen natural, común a los antígenos
MAGE-A1, -A2, -A3, -A4, -A6, -A10 y -A12.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha ensayado la capacidad de p248V9 para
inducir CTL in vitro a partir de células mononucleares de la
sangre periférica (PMBC) de donantes sanos, de la siguiente
manera.
Las PMBC se obtienen, a partir de extracciones
de sangre por leucoféresis en donantes sanos, después de
centrifugación a 2000 rpm durante 20 minutos en un gradiente de
Ficoll/Hypaque (AMERSHAM). Después de 3 lavados en NaCl al 0,9%,
las PMBC se resuspenden en medio completo (RPMI 1640 suplementado
con suero AB humano al 10% inactivado por calor, 40 \mug/ml de
gentamicina (PANPHARMA) y L-glutamina 2 \muM
(GIBCO)) y se incuban a 37ºC durante 2 horas. Después de la
incubación, se extraen las células no adherentes. Las células
adherentes se diferencian en células dendríticas mediante cultivo
en una bolsa de TEFLON a razón de 3 x 10^{6} células/ml en medio
completo suplementado con 500 UI/ml de GM-CSF (R
& D SYSTEMS) y 500 UI/ml de IL-4 (R & D
SYSTEMS). El séptimo día, se añaden agentes de maduración (100
\mug/ml de polil:C y 2 \mug/ml de anticuerpo
anti-CD40) al cultivo. Después de 24 horas, las
células dendríticas maduras se cargan con el péptido p248V9 mediante
incubación durante 2 horas con 10 \muM de péptido en presencia de
5 \mug/ml de \beta2-microglobulina y después se
irradian a 3500 rads; a continuación se lavan para eliminar el
péptido libre. Las células CD8+ se aíslan a partir de las células
no adherentes con ayuda de microperlas acopladas a un anticuerpo
anti-CD8 (MILTENYI BIOTEC).
Se estimulan 2 x 10^{5} células CD8+ con 2 x
10^{4} células dendríticas cargadas con el péptido, en medio
completo suplementado con 1000 UI/ml de IL-6 y 5
UI/ml de IL-12 en un volumen final de 100
\mul/pocillo en una placa de 96 pocillos. A partir del séptimo
día los cultivos se reestimulan in vitro cada semana, con
las células dendríticas cargadas con el péptido en presencia de 20
UI/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-7.
Después de la tercera reestimulación, las células CD8+ se recogen y
se estimulan con células B alogénicas HLA-A*0201
transformadas con EBV, en una proporción 1/2, en presencia de 10
\muM de péptido durante 16 horas.
Las células CD8+ productoras de
IFN-\gamma se purifican utilizando un kit
comercial (IFN-\gamma secretion
assay-cell enrichment and detection kit, MILTENYI
BIOTECH). Las células purificadas de este modo se cultivan durante
una semana en medio completo suplementado con 20 UI/ml de
IL-2 y 10 ng/ml de IL-7.
La respuesta de estas células CD8+ a células T2
cargadas con uno de los péptidos p248V9, p248G9 o p248D9 o con un
péptido no pertinente (HIVgag76) o a células tumorales
HLA-A*0201+MAGE-A+ (M44 y M113) o
HLA-A*0201+MAGE-A
(Caco-2) se evalúa mediante dosificación de la
producción de IFN\gamma intracelular.
Las células CD8+ se incuban con las células de
la línea tumoral ensayada, en presencia de 20 \mug/ml de
BREFELDINE-A (SIGMA). Después de 6 horas, las
células se lavan, se marcan con un anticuerpo
anti-CD8 conjugado con
r-ficoeritrina (CALTAG LABORATORIES) en PBS durante
25 minutos a 4ºC, se lavan y se fijan con paraformaldehído al 4%. A
continuación se permeabilizan con saponina (SIGMA) al 0,2% en PBS y
se marcan con un anticuerpo monoclonal
anti-IFN\gamma conjugado con 1' aloficocianina
(PHARMINGEN).
A continuación se analizan las células en
citometría de flujo (FACScalibur^{TM} (BECTON DICKINSON) y
programa CellQuest^{TM}).
Los resultados se ilustran mediante la Figura 4:
(% de células productoras de INF\gamma en función del péptido o
de la línea tumoral ensayada).
La Figura 4A muestra una respuesta de la células
CD8+ frente a células T2 cargadas con p248V9, p248G9 o p248D9, pero
no frente a células T2 cargadas con el péptido no pertinente.
La Figura 4B muestra una respuesta de las
células CD8+ frente a las líneas tumorales MAGE-A+
M44 y M113 pero no frente a la línea MAGE-A^{-}
Caco-2. La Figura 4C muestra además que la respuesta
frente a la línea M44 es fuertemente inhibida por el anticuerpo
anti-HLA-A*0201 BB7.2, pero no por
el anticuerpo no pertinente anti-CD 19 Ab.
Estos resultados demuestran que el péptido
p248V9 induce CTL humanos capaces de reconocer también a los
péptidos nativos correspondientes y capaces de reconocer a células
tumorales que expresan antígenos MAGE-A
variados.
El alineamiento de las secuencias de
MAGE-A1, -A2, -A3, -A4, -A6, -A10 y -A12 revela un
grupo de péptidos de 9 monómeros idénticos en las secuencias
MAGE-A1, -A2, -A3 y -A6. El péptido obtenido de
MAGE-A4 que tiene una leucina en posición en P2
puede modificarse en esta posición mediante una sustitución
L\rightarrowP. El péptido obtenido de MAGE-A12
posee una fenilalanina en P3, pero comparte con los péptidos
obtenidos de MAGE-A1, -A2, -A3, -A4 y -A6 la
secuencia TKAEML (posiciones P4-P9). Solamente el
péptido obtenido de MAGE-A10 no contiene secuencia
común de al menos 5 aminoácidos con los péptidos obtenidos de los
otros antígenos MAGE-A.
Los diferentes grupos de péptidos nativos y el
péptido variante se representan en la Tabla IV a continuación. Los
restos a cuyo nivel difieren los péptidos nativos se indican en
negrita.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El alineamiento de las secuencias de las cuatro
proteínas HER se ha realizado como se ha descrito en el ejemplo 1 y
revela 6 grupos de péptidos de 9 monómeros y/o de 10 monómeros que
presentan una homología completa en la región
P3-P8/9. Para cada grupo se ha definido una variante
que debía tener gran afinidad por HLA-A*0201 y ser
capaz de estimular una respuesta citotóxica específica de los
péptidos nativos. Las modificaciones se producen en las posiciones
de anclaje P2 y P9/10 (sustitución del aminoácido original diferente
de L/V/M/I por una L en P2 y por una V en P9/10) y en la posición
P1 (sustitución de aminoácido por una Y).
Los diferentes grupos de péptidos nativos y los
péptidos variantes se representan en la Tabla V a continuación. Los
restos a cuyo nivel difieren los péptidos nativos se indican en
negrita.
La afinidad relativa (AR) de los péptidos
variantes seleccionados por HLA-A*0201 se ha medido
como se ha descrito en el ejemplo 1.
Los resultados se resumen en la Tabla VI y
demuestran que solamente la variante p911Y1V9 presenta una gran
afinidad de unión (AR = 2,03), compatible con un carácter
inmunogénico.
Se han establecido dos líneas de CTL denominadas
1R5 y 2R5 a partir de células esplénicas de ratón HHD inmunizadas
con el péptido variante p911Y1V9, de acuerdo con el mismo protocolo
que se ha descrito en el ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos de citotoxicidad se han realizado
como se describe en el ejemplo 2. Para ello se han incubado células
diana RMAS-HHD cargadas con 10 \muM de los
péptidos a ensayar (variante o péptidos nativos) en presencia de
células de las dos líneas de CTL 1R5 y 2R5.
Los porcentajes de lisis específica observados
en presencia de las líneas 1R5 (\Box) y 2R5 (\sqbullet) y para
los diferentes péptidos ensayados se ilustran en la figura 5.
Las células cargadas con el péptido p911Y1V9 así
como con los péptidos nativos HER1 911, HER2,3 911 o HER4 911
inducen una respuesta CTL.
Estos resultados demuestran por lo tanto que la
variante p911Y1V9 genera CTL que matan a las células diana
RMAS-HHD cargadas con el péptido variante p911Y1V9,
pero también con los péptidos nativos HER1 911, HER2,3 911 o HER4
911.
\vskip1.000000\baselineskip
La respuesta de las células de la línea CTL 1R5
frente a las células RMAS-HHD cargadas con los
diferentes péptidos también se ha evaluado mediante la dosificación
de su producción de IFN\gamma intracelular.
Para ello, las células de la línea CTL 1R5 se
incuban en presencia de células RMAS-HHD cargadas
con el péptido variante p911Y1V9, los péptidos nativos HER1 911,
HER2,3 911 o HER4 911 o un péptido no pertinente y en presencia de
20 \mug/ml de BREFELDINE-A (SIGMA). Después de 6
horas, las células se lavan, se marcan con un anticuerpo
anti-CD8 conjugado con
r-ficoeritrina y se incuban en PBS durante 25
minutos a 4ºC. A continuación se lavan de nuevo antes de fijarse
con una solución de paraformaldehído al 4%. Las células se
permeabilizan a continuación con saponina (SIGMA) al 0,2% en PBS y
se marcan con un anticuerpo monoclonal
anti-IFN\gamma conjugado con aloficocianina
(PHARMINGEN).
A continuación se analizan las células en
citometría de flujo (FACSCalibur^{TM} (BECTON DICKINSON) y
programa CellQuest^{TM}).
Los resultados se ilustran mediante la figura 6:
(% de células productoras de IFN\gamma en presencia de células
RMAS-HHD cargadas con los diferentes péptidos a
ensayar).
La figura 6 muestra, como se ha descrito en la
figura 5, una respuesta de las células CD8+ de la línea CTL1R5
frente a las células RMAS-HHD cargadas con el
péptido variante p911Y1V9, con los péptidos nativos HER1 911,
HER2,3 911 o HER4 911, pero no frente a las células
RMAS-HHD cargadas con el péptido no pertinente.
Estos resultados confirman que el péptido
p911Y1V9 induce CTL capaces de reconocer a este péptido variante
pero también a los péptidos nativos de los que se deriva.
\vskip1.000000\baselineskip
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<110> INSERM
\hskip1.05cmIGR
\hskip1.05cmGRAFF-DUBOIS,
Stéphanie
\hskip1.05cmKOSMATOPOULOS, Kostas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> EPÍTOPOS PEPTÍDICOS COMUNES A LOS
ANTÍGENOS DE UNA MISMA FAMILIA MULTIGÉNICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJPah1534/1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1.05cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1.05cm21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1.05cm22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1.05cm23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1.05cm24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1.05cm25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1.05cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1.05cm27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 9
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\hskip1.05cm28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1.05cm29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1.05cm30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1.05cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1.05cm32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido modificado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1.05cm33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 15
\hskip1.05cm34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 16
\hskip1.05cm35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1.05cm36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 18
\hskip1.05cm37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido modificado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1.05cm38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1.05cm39
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1.05cm40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido modificado
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1.05cm41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1.05cm42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1.05cm43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1.05cm44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1.05cm45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1.05cm46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1.05cm47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1.05cm48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1.05cm49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1.05cm50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1.05cm51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1.05cm52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1.05cm53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1.05cm54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1.05cm55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1.05cm56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1.05cm57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1.05cm58
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1.05cm59
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1.05cm60
Claims (10)
1. Péptido inmunógeno que comprende un epítopo
presentado por una molécula HLA de clase I y compartido por al
menos dos antígenos de una misma familia multigénica,
caracterizado porque se selecciona entre los péptidos
definidos por la secuencia YLEYRQVPV (SEC ID Nº 3) y por la
secuencia YVWELMTFGV (SEC ID Nº 4).
2. Polinucleótido que codifica un péptido de
acuerdo con la reivindicación 1.
3. Composición que comprende al menos un péptido
de acuerdo con la reivindicación 1 o un polinucleótido de acuerdo
con la reivindicación 2.
4. Composición de acuerdo con la reivindicación
3, caracterizada porque se trata de una composición
multiepitópica que comprende además uno o más péptido(s)
inmunógeno(s) diferente(s) o uno o más
polinucleótido(s) que codifica(n) dicho(s)
péptido(s).
5. Composición de acuerdo con la reivindicación
4, caracterizada porque se trata de un polipéptido quimérico
que comprende al menos una copia de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1 y al menos una copia de otro péptido inmunógeno, o
de un polinucleótido que codifica dicho polipéptido quimérico.
6. Utilización de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1, de un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 2 o de una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 3 a 5, para la obtención de un
medicamento.
7. Utilización de acuerdo con la reivindicación
6, caracterizada porque dicho medicamento es para
inmunoterapia anti-tumoral.
8. Utilización de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizada porque dicho medicamento es para
inmunoterapia de tumores que expresan al menos un gen de la familia
MAGE-A.
9. Utilización de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizada porque dicho medicamento es para
inmunoterapia de tumores que expresan al menos un gen de la familia
HER.
10. Utilización de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 9, caracterizada porque dicho
medicamento es para el tratamiento de pacientes
HLA-A*0201.
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