ES2316191T3

ES2316191T3 - Nueva proteina antigenica tumoral sart-3 y peptido antigenico tumoral de la misma.

Info

Publication number: ES2316191T3
Application number: ES99940508T
Authority: ES
Inventors: Kyogo Itoh; Masanobu Nakao
Original assignee: Green Peptide Co Ltd
Current assignee: Green Peptide Co Ltd
Priority date: 1998-08-28
Filing date: 1999-08-27
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2019-08-27
Also published as: EP1116791A4; JP4436977B2; CA2340888C; HK1041290B; US8563684B2; KR100660367B1; US20120123090A1; US7968676B2; CN1264980C; EP1116791B1; KR20010074895A; AU762516B2; JP4904384B2; CA2340888A1; AU5444199A; ID29405A; WO2000012701A1; US8097697B2; US20060140968A1; JP2010029194A

Abstract

Un ADN que codifica una proteína que da origen a péptidos antigénicos tumorales que son capaces de unirse a un antígeno HLA y ser reconocidos por linfocitos T citotóxicos, seleccionado del siguiente grupo que consiste en: (a) un ADN que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID Nº: 1; (b) un ADN que consiste en la secuencia codificante que se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 2; y (c) un ADN que hibrida en condiciones rigurosas con un ADN de (b), con la condición de que la secuencia codificante de KIA A0156, como se describe en la entrada D63879 de Genbank como GI número 961449, se excluya de (a) y (c).

Description

Nueva proteína antigénica tumoral SART-3 y péptido antigénico tumoral de la misma.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la nueva proteína antigénica tumoral y a péptidos antigénicos tumorales de la misma. Más particularmente, se refiere a la nueva proteína antigénica tumoral y al gen de la misma, a péptidos antigénicos tumorales derivados de la proteína antigénica tumoral y a derivados de sus sustancias, así como a medicamentos, agentes profilácticos o de diagnóstico para tumores que utilizan in vivo o in vitro dicha proteína antigénica tumoral, genes, péptidos antigénicos tumorales o derivados de los mismos.

Técnica antecedente

Se sabe que el sistema inmune, particularmente las células T, desempeñan un papel importante en la eliminación de tumores por un organismo vivo. De hecho, se ha observado infiltración de linfocitos que presentan efectos citotóxicos sobre células tumorales en focos tumorales humanos (Arch. Surg., 126: 200, 1990) y se han aislado linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen células tumorales autólogas a partir de melanomas sin grandes dificultades (por ejemplo, Immunol. Today, 8: 385, 1987; J. Immunol., 138: 989, 1987; e Int. J. Cancer, 52: 52, 1992). Además, los resultados del tratamiento clínico de melanomas por transferencia de los CTL que reconocen células tumorales autólogas también sugieren la importancia de células T en la eliminación de tumores (J. Natl. Cancer. Inst., 86: 1159,
1994).

Aunque durante mucho tiempo no se ha sabido nada acerca de moléculas diana para CTL que atacan células tumorales autólogas, los recientes avances en inmunología y biología molecular comienzan gradualmente a elucidar dichas moléculas diana. En concreto, se ha descubierto que los CTL, usando los receptores de células T (TCR), reconocen un complejo entre un péptido, denominado péptido antigénico tumoral, y un antígeno del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (antígeno de MHC de clase I y, en el caso de seres humanos, denominado antígeno HLA) y, de este modo, atacan células tumorales autólogas.

Los péptidos antigénicos tumorales se generan por degradación de proteínas antigénicas tumorales, que son proteínas específicas para tumores, en células con proteosomas, sintetizándose las proteínas intracelularmente. Los péptidos antigénicos tumorales generados de este modo se unen a antígenos del MHC de clase I (antígenos HLA) en el retículo endoplásmico para formar complejos y los complejos se transportan a la superficie celular para presentarse como un antígeno. Un CTL específico de tumor reconoce el complejo presentado como un antígeno y presenta efectos antitumorales a través de su acción citotóxica o de la producción de linfoquinas. Como consecuencia de la elucidación de una serie de las acciones, se ha hecho posible tratar tumores mediante el uso de proteínas antigénicas tumorales o péptidos antigénicos tumorales como las denominadas vacunas contra el cáncer para potenciar CTL específicos de tumores en el cuerpo de un paciente con un tumor.

Como una proteína antigénica tumoral, T. Boon et al. identificaron por primera vez en 1991 una proteína denominada MAGE a partir de células de melanoma humano (Science, 254: 1643, 1991). Posteriormente, se han identificado varias proteínas antigénicas tumorales adicionales, principalmente a partir de células de melanoma. Son ejemplos de antígenos de melanoma que se han identificado proteínas melanosomales tales como una proteína específica de tejido melanocítico, gp100 (J. Exp. Med., 179: 1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3515, 1994) y tirosinasa (J. Exp. Med., 178: 489, 1993); proteínas relacionadas con MEGE que no se expresan sólo en melanomas, sino también en diversas células cancerosas y células testiculares normales (J. Exp. Med., 179: 921, 1994); \beta-catenina, que tiene una mutación aminoacídica específica de tumor (J. Exp. Med., 183: 1185, 1996); y CDK4 (Science, 269: 1281, 1995). También se han identificado proteínas antigénicas tumorales distintas de las de melanomas, incluyendo productos de oncogenes tales como HER2-neu (J. Exp. Med., 181: 2109, 1995) y p53 (variante) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93: 14704, 1996); marcadores tumorales tales como CEA (J. Natl. Cancer Inst., 87: 982, 1995) y PSA (J. Natl. Cancer Inst., 89: 293, 1997); y proteínas virales, tales como HPV (J. Immunol., 154: 5934, 1995) y EBV (Int. Immunol., 7: 653, 1995). Pueden encontrarse descripciones detalladas de estas sustancias en revisiones publicadas (por ejemplo, Immunol. Today, 18: 267, 1997, J. Exp. Med., 183: 725,1996 y Curr. Opin. Immunol., 8: 628,
1996).

En aplicaciones de una proteína antigénica tumoral o de un péptido antigénico tumoral para el tratamiento o diagnóstico de tumores, es importante identificar un antígeno tumoral que pueda aplicarse ampliamente a carcinomas de células escamosas, tales como cánceres esofágico y pulmonar, que aparecen con una incidencia mucho mayor en comparación con los melanomas. En este sentido, los presentes inventores realizaron la clonación de un gen que codifica una nueva proteína antigénica tumoral a partir de células de carcinoma de células escamosas procedentes de cáncer esofágico e identificaron por primera vez a partir de células tumorales distintas de melanomas varios péptidos antigénicos tumorales que están unidos a y se presentan sobre antígenos HLA, siendo los tipos de HLA HLA-A24 o HLA-A26 (J. Exp. Med., 187: 277, 1998; Publicación de Patente Internacional WO 97/46676).

Cuando se aplican clínicamente estos péptidos antigénicos tumorales en la práctica, puede ser deseable usar dos o más péptidos antigénicos tumorales diferentes en lugar de usar simplemente un péptido. Es decir, teniendo en cuenta el hecho de que todas las células cancerosas no expresan un antígeno tumoral idéntico en común y que se presentan dos o más péptidos antigénicos tumorales diferentes sobre una única célula cancerosa, se piensa que un tratamiento que use dos o más péptidos antigénicos tumorales diferentes será más eficaz. De hecho, en el caso de melanoma, se ha intentado el desarrollo de formulaciones de combinación que comprenden dos o más péptidos, puesto que un único péptido derivado de un antígeno tumoral no presentaba efectos adecuados (Int. J. Cancer, 66: 162, 1996; e Int. J. Cancer, 67: 54, 1996). En dichas circunstancias, se está haciendo necesario identificar nuevas proteínas antigénicas tumorales y péptidos de antigénicos tumorales que puedan aplicarse ampliamente a carcinomas de células escamosas que aparecen con una incidencia superior.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona una nueva proteína antigénica tumoral y péptidos antigénicos tumorales. En particular, proporciona una nueva proteína antigénica tumoral y el gen de la misma, péptidos antigénicos tumorales derivados de la proteína antigénica tumoral y derivados de sus sustancias, así como medicamentos, agentes profilácticos o de diagnóstico para tumores que utilizan in vivo o in vitro dicha proteína antigénica tumoral, genes, péptidos antigénicos tumorales o derivados de los mismos. Los péptidos antigénicos tumorales de la presente invención incluyen un péptido antigénico tumoral que está unido a y se presenta sobre HLA-A24, que es el antígeno HLA que llevan aproximadamente el 60% de las personas japonesas, y un péptido antigénico tumoral que está unido a y se presenta sobre HLA-A2, que llevan aproximadamente el 40% de los japoneses y caucasianos y, por lo tanto, puede aplicarse a muchos pacientes. Además, los péptidos antigénicos tumorales de la presente invención también pueden aplicarse a carcinomas de células escamosas o similares, que con mayor frecuencia se reconocen como un cáncer etiológico en seres humanos, y se espera que tengan utilidades como nuevos medicamentos antitumorales. Se sabe que el carcinoma de células escamosas en el cáncer esofágico o pulmonar entre los carcinomas de células escamosas tiende a presentar relativamente una resistencia a la quimioterapia y radioterapia actuales. A este respecto, se desea el desarrollo de los péptidos antigénicos tumorales de la presente invención.

Para obtener una nueva proteína antigénica tumoral y péptidos antigénicos tumorales, los presentes inventores realizaron los siguientes intentos.

En primer lugar, los presentes inventores prepararon una genoteca de ADNc a partir de la línea celular de cáncer esofágico KE-4 (FERM BP-5955) y de la línea celular de fibroblastos doblemente transfectada VA-13 (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research) con un plásmido recombinante de la genoteca y un plásmido recombinante que contiene ADNc de HLA-A2402 (un tipo de HLA-A24). Los transfectantes resultantes se trataron con KE-4CTL (FERM BP-5954), que se dirigen a KE-4, y se midió la cantidad de IFN-\gamma producido para determinar si se activaban o no los KE-4CTL. Como resultado de dicha exploración exhaustiva realizada de forma repetida, los presentes inventores finalmente lograron la clonación de un gen que codifica una proteína antigénica tumoral, aunque no aseguran que la exploración diera como resultado una proteína antigénica tumoral nueva y útil. Los inventores denominaron a la proteína antigénica tumoral codificada por el gen "SART-3". La comparación de la secuencia de bases de SART-3 con secuencias conocidas puso de manifiesto que dicha secuencia de bases de SART-3 era una nueva secuencia de bases que es diferente de la del gen KlAA0156 registrado como Nº de acceso D63879 en la base de datos GenBank en términos de una sola base, cuya función no se ha demostrado.

Además, los presentes inventores identificaron porciones de péptidos antigénicos tumorales que residen en la secuencia de aminoácidos de SART-3 que están unidos a y se presentan sobre HLA-A24 y HLA-A2, y demostraron que dichos péptidos tenían actividad como un péptido antigénico tumoral.

La presente invención se ha completado en base a los descubrimientos que se han descrito anteriormente.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a:

(1) Un ADN que codifica una proteína que da origen a péptidos antigénicos tumorales que son capaces de unirse a un antígeno HLA y ser reconocidos por linfocitos T citotóxicos, seleccionado del siguiente grupo que consiste en:

(a): un ADN que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID Nº: 1;

(b): un ADN que consiste en la secuencia codificante que se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 2; y

(c): un ADN que hibrida en condiciones rigurosas con un ADN de (b), con la condición de que la secuencia codificante de KIA A0156, como se describe en la entrada \underline{D63879} de Genbank como GI número 961449, se excluya de (a) y (c).

(2) Un plásmido de expresión que contiene el ADN del punto (1).

(3) Una célula hospedadora transformada que comprende el plásmido de expresión del punto (2).

(4) Un proceso para producir una proteína recombinante, que comprende cultivar la célula hospedadora transformada del punto (3) y recuperar la proteína recombinante expresada.

(5) Una proteína antigénica tumoral que está codificada por el ADN del punto (1) o que se produce por el proceso del punto (4), con la condición de que se excluya la proteína codificada por la secuencia de KIA A0156, como se describe en la entrada D63879 de GenBank como Gl número 961449.

(6) Una composición farmacéutica que comprende como un ingrediente activo el ADN del punto (1) o la proteína del punto (5).

(7) Una composición farmacéutica útil para tratar o prevenir tumores, que comprende como un ingrediente activo el ADN del punto (1) o la proteína del punto (5).

(8) Un péptido antigénico tumoral que es un péptido parcial de una proteína antigénica tumoral que está codificada por el ADN del punto (1) o que se produce por el proceso del punto (4), y que es capaz de unirse a un antígeno HLA y ser reconocido por linfocitos T citotóxicos.

(9) El péptido antigénico tumoral del punto (8), en el que el antígeno HLA es HLA-A24 o HLA-A2.

(10) El péptido antigénico tumoral del punto (9), que comprende una secuencia seleccionada de toda o parte de una secuencia aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-52.

(11) El péptido antigénico tumoral del punto (10), que comprende una secuencia seleccionada de toda o parte de una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-9 y 25-29.

(12) Un derivado de péptido antigénico tumoral, que comprende una secuencia seleccionada de una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-52, en la que el resto aminoacídico en posición 2 y/o el extremo C-terminal en la secuencia aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-52, se sustituye por otro resto aminoacídico, y que es capaz de unirse a un antígeno HLA y ser reconocido por linfocitos T citotóxicos.

(13) El derivado de péptido antigénico tumoral del punto (12), que comprende una secuencia seleccionada de una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-52, en la que el resto aminoacídico en posición 2 y/o el extremo C-terminal en la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-9 y 25-29, se sustituye por otro resto aminoacídico.

(14) El derivado de péptido antigénico tumoral del punto (12), que comprende

(a): una secuencia seleccionada de una secuencia de aminoácidos en la que el resto aminoacídico en posición 2 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de la SEQ ID Nº: 3-24 se sustituye por tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano, y/o el resto aminoacídico en el extremo C-terminal se sustituye por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina; o

(b): una secuencia seleccionada de una secuencia de aminoácidos en la que el resto aminoacídico en posición 2 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 25-52 se sustituye por leucina, metionina, valina, isoleucina o glutamina y/o el resto aminoacídico en el extremo C-terminal se sustituye por valina o leucina.

(15) El péptido antigénico tumoral derivado del punto (13), que comprende una secuencia seleccionada de la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 53-64.

(16) Un ADN recombinante que comprende al menos uno de los ADN que codifican

(a): los péptidos antigénicos tumorales de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (8) a (11), o

(b): los derivados de péptido antigénico tumoral de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (12) a (15),

con la condición de que se excluya la secuencia codificante de KIA A0156 como se describe en la entrada D63879 de Genbank como GI número 961449.

(17) Un polipéptido recombinante que puede obtenerse por expresión del ADN recombinante del punto (16), con la condición de que se excluya la proteína codificada por la secuencia de KIA A0156 como se describe en la entrada D63879 de GenBank como Gl número 961449.

(18) Una composición farmacéutica útil para tratar o prevenir tumores, que comprende como un ingrediente activo al menos una de las sustancias seleccionadas del péptido antigénico tumoral de uno cualquiera de los puntos (8) a (11), el derivado de péptido antigénico tumoral de uno cualquiera de los puntos (12) a (15), el ADN recombinante del punto (16) o el polipéptido recombinante del punto (17).

(19) Un anticuerpo que se une específicamente a una cualquiera de las proteínas antigénicas tumorales del punto (5), el péptido antigénico tumoral de uno cualquiera de los puntos (8) a (11) o el derivado de péptido antigénico tumoral de uno cualquiera de los puntos (12) a (15).

(20) Una célula presentadora de antígenos aislada en la que un complejo entre un antígeno HLA y

(a): el péptido antigénico tumoral de uno cualquiera de los puntos (8) a (11); o

(b): el derivado de péptido antigénico tumoral de uno cualquiera de los puntos (12) a (15), se presenta sobre la superficie de una célula que tiene capacidad de presentación de antígenos.

(21) Una célula presentadora de antígenos aislada sobre la que se presenta un complejo entre un antígeno HLA y un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo, pudiendo obtenerse dicha célula presentadora de antígenos permitiendo que una célula que tiene capacidad de presentación de antígenos aislada de un paciente con un tumor incorpore el ADN del punto (1), la proteína antigénica tumoral del punto (5), el ADN recombinante del punto (16) o el polipéptido recombinante del punto (17).

(22) Un proceso para producir un linfocito T citotóxico que reconozca específicamente un complejo entre un antígeno HLA y

(b): el derivado de péptido antigénico tumoral de uno cualquiera de los puntos (12) a (15), que comprende estimular linfocitos de sangre periférica en una muestra de un paciente con dicho péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo.

(23) Un proceso para producir un linfocito T citotóxico que reconozca específicamente un complejo entre un antígeno HLA y el péptido antigénico tumoral o derivado del mismo, que comprende estimular linfocitos de sangre periférica en una muestra de un paciente con la célula presentadora de antígenos aislada del punto (20) o (21).

(24) Una composición farmacéutica útil para tratar tumores, que comprende la célula presentadora de antígenos del punto (20) o (21).

(25) Un agente de diagnóstico útil para tumores, que comprende la proteína del punto (5), el péptido antigénico tumoral de uno cualquiera de los puntos (8) a (11), el derivado de péptido antigénico tumoral derivado de uno cualquiera de los puntos (12) a (15), o el polipéptido recombinante del punto (17).

(26) Un linfocito T citotóxico OK-CTL, cuyo número de depósito es FERM BP-6818.

(27) Un método para identificar proteínas antigénicas tumorales o péptidos antigénicos tumorales, que comprende usar OK-CTL del punto (26).

Los ADN de la presente invención codifican nuevas proteínas antigénicas tumorales y los ejemplos específicos de los ADN incluyen un ADN que codifica la proteína SART-3, que consiste en una secuencia aminoácidos que se muestra en la SEQ Nº: 1. También se describe en este documento una variante proteica que consiste en una secuencia de aminoácidos que contiene una sustitución, deleción y/o adición de uno o más restos aminoacídicos de la secuencia de aminoácidos de SART-3, con tal de que la proteína mencionada anteriormente y la variante proteica den origen a péptidos antigénicos tumorales que sean capaces de unirse a un antígeno HLA y ser reconocidos por linfocitos T citotóxicos. La presente invención también se refiere a un ADN de SART-3 que consiste en una secuencia de bases que se muestra en la SEQ ID Nº: 2 o una variante de ADN que hibrida con el ADN de SART-3 en condiciones rigurosas, con tal de que una proteína producida y expresada por el ADN y la variante de ADN den origen a péptidos antigénicos tumorales que sean capaces de unirse a un antígeno HLA y ser reconocidos por linfocitos T citotóxicos. El ADN de la presente invención se describe adicionalmente en este documento a continuación, siguiendo el orden establecido anteriormente.

1) ADN que codifica SART-3

Un "ADN que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID Nº: 1" y "un ADN que consiste en una secuencia de bases que se muestra en la SEQ ID Nº: 2", entre los ADN descritos anteriormente, se refieren a un ADN que codifica la proteína antigénica tumoral SART-3 de la presente invención. El ADN puede clonarse de acuerdo con el proceso descrito en los Ejemplos a continuación en este documento. Además, la clonación del ADN también puede realizarse, por ejemplo, por exploración de una genoteca de ADNc procedente de líneas celulares tales como la línea celular de cáncer esofágico KE-4 (FERM BP-5955), usando una porción apropiada de la secuencia de bases descrita en el Nº de acceso D63879 de GenBank, o que se muestra en la SEQ ID Nº: 2 en la presente memoria descriptiva, como una sonda para hibridación o como un cebador de PCR. Será fácil para los especialistas en la técnica conseguir dicha clonación de acuerdo con Molecular Cloning 2ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), por ejemplo.

2) ADN que codifica una proteína de SART-3 modificada o una variante alélica de la misma

Un "ADN que codifica una variante proteica que consiste en una secuencia de aminoácidos que contiene una sustitución, deleción y/o adición de uno o más restos aminoacídicos de la secuencia de aminoácidos de SART-3", entre los ADN descritos anteriormente, se refiere a un ADN que codifica una denominada proteína modificada, que se prepara de forma artificial, o proteínas tales como una variante alélica que existe en un organismo vivo. El ADN que codifica dichas variantes proteicas puede prepararse por diversos métodos tales como mutagénesis dirigida y técnica de PCR, que se describen en Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª Ed. vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). El número de restos aminoacídicos a sustituir, delecionar y/o añadir debería estar en un intervalo que permita la sustitución, deleción y/o adición de acuerdo con los métodos bien conocidos, tales como mutagénesis dirigida, como se han mostrado anteriormente.

3) ADN que hibrida con el ADN de SART-3 en una condición rigurosa

Una "variante de ADN que hibrida con el ADN de SART-3 en una condición rigurosa", entre los ADN descritos en este documento, se refiere a un ADN que hibrida con el ADNc de SART-3 humana que consiste en la secuencia de bases que se muestra en la SEQ ID Nº: 2 en una condición rigurosa, que incluye ADN de SART-3 de todos los vertebrados tales como rata y ratón, y ADN que codifican una proteína parcial de SART-3.

La expresión "condición rigurosa" se refiere a una condición de tal modo que se realiza una hibridación en una solución que contiene SSC 6x (SSC 20x representa citrato de sodio 333 mM, NaCl 333 mM), SDS al 0,5% y formamida al 50% a 42ºC y, después, los productos hibridados se lavan en una solución de SSC 0,1x, SDS al 0,5% a 68ºC, o a las condiciones que se describen en Nakayama, et al., Bio-Jikken-Illustrated, vol. 2, "Idenshi-kaiseki-No-Kiso (A Basis for Gene Analysis)", págs. 148-151, Shujunsha, 1995.

Las variantes de ADN descritas también en este documento se clonan por diversos procesos tales como hibridación con el ADN que se muestra en la SEQ ID Nº: 2. Se conocen bien los procedimientos particulares para los procesos tales como producción de una genoteca de ADNc, hibridación, selección de colonias positivas y determinación de la secuencia de bases, y pueden realizarse consultando el Molecular Cloning, como se ha mostrado anteriormente. Las sondas útiles para la hibridación incluyen un ADN que comprende una secuencia de bases descrita en la SEQ ID Nº: 2.

Entre los ADN que se han descrito anteriormente 1) a 3), un ADN que tiene la capacidad de generar un péptido antigénico tumoral que sea capaz de unirse a un antígeno HLA y ser reconocido por CTL y que proceda de una proteína producida mediante la expresión del ADN a través de degradación intracelular, constituye el ADN que codifica una proteína antigénica tumoral de la presente invención, en concreto, el ADN de la presente invención. En particular, los ADN de la presente invención son los que generan dicho fragmento peptídico como un péptido parcial que consiste en una parte de una secuencia de aminoácidos de una proteína producida por la expresión de dicho ADN, siendo dicho péptido capaz de unirse a un antígeno HLA y de inducir la producción de acciones citotóxicas y citoquinas a partir de CTL específicos para el complejo entre el péptido y el antígeno HLA que se une al complejo que se presenta sobre la superficie celular.

La determinación de si un ADN candidato puede ser o no un ADN que codifique una proteína antigénica tumoral puede lograrse, por ejemplo, mediante el siguiente método.

Un plásmido de expresión que contiene un ADN candidato y un plásmido de expresión que contiene un ADN que codifica un antígeno HLA se transfectan doblemente en fibroblastos VA-13 (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research) o COS-7 (ATCC CRL 1651) procedentes de riñón de mono verde africano. La transfección puede conseguirse, por ejemplo, mediante el método de lipofectina usando reactivo de Lipofectamina (GIBCO BRL). Posteriormente, se añade un CTL sensible a tumores que está restringido al antígeno HLA particular para actuar sobre los transfectantes y, después, puede medirse la cantidad de diversas citoquinas (por ejemplo, IFN-\gamma) producidas por dicho CTL en respuesta a los transfectantes, por ejemplo, mediante ELISA para determinar si el ADN candidato es o no un ADN de la presente invención. En este contexto, puesto que SART-3 contiene porciones de péptido antigénico tumoral restringidas a HLA-A24 o HLA-A2, puede usarse ADNc de HLA-A24 (Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995); Nº de acceso de Genbank M64740) y ADNc de HLA-A2 (Nº de acceso de Genbank M84379) como el ADN anterior que codifica el antígeno HLA, mientras que pueden usarse CTL que se preparan a partir de linfocitos de sangre periférica humana, así como CTL restringidos a HLA-A24 tales como KE-4CTL (FERM BP-5954) o CTL restringidos a HLA-A2 tales como OK-CTL (FERM BP-6818) como el CTL
anterior.

El ADN de la presente invención, como se ha descrito anteriormente, puede usarse como un ingrediente activo en un medicamento o en una composición farmacéutica. De acuerdo con una "composición farmacéutica" que comprende el ADN de la presente invención como un ingrediente activo, la administración del ADN de la presente invención a un paciente con un tumor hace posible el tratamiento o la prevención de tumores.

Mediante la administración de un ADN de la presente invención incorporado en un vector de expresión a un paciente con un tumor de acuerdo con el siguiente método, la proteína antigénica tumoral se expresa en gran cantidad en células presentadoras de antígenos. Los péptidos antigénicos tumorales que se generan posteriormente por degradación intracelular se unen a un antígeno HLA para formar complejos y los complejos se presentan densamente sobre la superficie de la célula presentadora de antígenos. Como resultado, proliferan eficazmente en el cuerpo CTL específicos para tumores y destruyen células tumorales. De esta forma, se logra el tratamiento o la prevención de tumores.

La administración e introducción del ADN de la presente invención en células puede lograrse usando vectores virales o de acuerdo con uno cualquiera de otros procedimientos (Nikkei-Science, Abril, 1994, págs. 20-45; Gekkan-Yakuji, 36 (1), 23-48 (1994); Jikken-Igaku-Zokan, 12 (15), 1994 y referencias citadas en este documento).

Los ejemplos de los métodos que usan vectores virales incluyen métodos en los que el ADN de la presente invención se incorpora en virus de ADN o ARN tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus, virus vaccinia, poxvirus, poliovirus o virus Sindbis y se introduce en células. Entre estos métodos, se prefieren particularmente los que usan retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados o virus vaccinia.

Otros métodos incluyen aquellos en los que los plásmidos de expresión se inyectan directamente por vía intramuscular (vacunación de ADN), método de liposomas, método de lipofectina, microinyección, método de fosfato de calcio y electroporación, y se prefiere particularmente la vacunación de ADN y el método de liposomas.

Para permitir que un ADN de la presente invención actúe como un medicamento en la práctica, existe un método in vivo en el que el ADN se introduce directamente en el cuerpo y un método ex vivo en el que ciertas células se extirpan del ser humano y, después de introducir el ADN en dichas células de forma extracorpórea, las células se reintroducen en el cuerpo (Nikkei-Science, Abril, 1994, págs. 20-45; Gekkan-Yakuji, 36 (1), 23-48 (1994); Jikkenn-Igaku-Zokan, 12 (15), 1994; y referencias citadas en estos documentos). Se prefiere más un método in vivo.

En el caso de métodos in vivo, el ADN se va a administrar por cualquier vía apropiada dependiendo de la enfermedad y síntomas a tratar y de otros factores. Por ejemplo, puede administrarse por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intracutánea, intramuscular o similares. En el caso de métodos in vivo, las composiciones pueden administrarse en diversas formas de dosificación, tales como solución, y se formulan típicamente, por ejemplo, en la forma de una inyección que contiene el ADN de la presente invención como ingrediente activo, a la que también pueden añadirse vehículos convencionales si es necesario. Si un ADN de la presente invención se incluye en liposomas o liposomas fusionados a membranas (tales como liposomas con virus Sendai (HVJ)), las composiciones pueden estar en forma de formulaciones de liposomas tales como suspensión, fármaco congelado, fármaco congelado concentrado por centrifugación o similares.

Aunque la cantidad de un ADN de la presente invención en dichas formulaciones puede variar dependiendo de la enfermedad a tratar, la edad y el peso del paciente y similares, es típico administrar 0,0001 mg-100 mg, preferiblemente 0,001 mg-10 mg de un ADN de la presente invención de cada varios días a cada varios meses.

En la invención, el término "proteína" se refiere a una proteína codificada por los diversos ADN de la presente invención como se han descrito anteriormente, que tiene una capacidad como proteína antigénica tumoral para dar origen a péptidos antigénicos tumorales por degradación intracelular que sean capaces de unirse a un antígeno HLA y ser reconocidos por CTL. Los ejemplos específicos de las proteínas incluyen SART-3, que comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID Nº: 1. Las proteínas de la presente invención pueden producirse a gran escala usando el ADN de la presente invención como se ha descrito anteriormente.

La producción de proteínas antigénicas tumorales por expresión del ADN de la presente invención puede conseguirse de acuerdo con muchas publicaciones y referencias tales como "Molecular cloning", mencionado anteriormente. Particularmente, se construye un plásmido de expresión que se replica y funciona en células hospedadoras por incorporación de un ADN de la presente invención en un vector de expresión apropiado (por ejemplo, PSV-SPORT1, pCR3). Posteriormente, el plásmido de expresión se introduce en células hospedadoras apropiadas para obtener transformantes. Los ejemplos de células hospedadoras incluyen los de procariotas tales como Escherichia coli, eucariotas unicelulares tales como levadura y células procedentes de eucariotas multicelulares tales como insectos o animales. La transferencia de genes a células hospedadoras puede conseguirse por métodos convencionales tales como el método de fosfato de calcio, el método de DEAE-dextrano, el método de pulsos eléctricos, el método de lipofectina o similares. Se producen proteínas deseadas por cultivo de los transformantes en medio apropiado. Las proteínas antigénicas tumorales obtenidas de este modo pueden aislarse y purificarse de acuerdo con procedimientos bioquímicos convencionales.

Puede demostrarse si una proteína antigénica tumoral de la presente invención tiene o no cierta actividad mediante la expresión, como se ha descrito anteriormente, del ADN de la presente invención en el interior de células para producir la proteína de la presente invención y la determinación de si el fragmento peptídico generado por degradación intracelular de dicha proteína tiene la actividad como péptido antigénico tumoral. En el caso de usar la proteína antigénica tumoral como tal, la medición de la actividad puede conseguirse permitiendo que la proteína se incorpore en los fagocitos tales como macrófagos, de tal modo que se generen fragmentos peptídicos en células y, después, contacto de CTL con complejos entre los fragmentos peptídicos y antígenos HLA, seguido de la medición de la cantidad de diversas citoquinas (por ejemplo, IFN-\gamma) producidas por los CTL en respuesta a los complejos.

La proteína de la presente invención, como se ha descrito anteriormente, también puede usarse como un ingrediente activo en un medicamento o en una composición farmacéutica. De acuerdo con una "composición farmacéutica" que comprende la proteína de la presente invención como un ingrediente activo, la administración de la proteína de la presente invención hace posible el tratamiento o la prevención de tumores, por ejemplo. Cuando se administra a un paciente con un tumor, la proteína de la presente invención se introduce en células presentadoras de antígenos. Los péptidos antigénicos tumorales que se generan posteriormente por degradación intracelular se unen a un antígeno HLA para formar complejos y los complejos se presentan sobre la superficie celular. Proliferan de forma eficaz en el cuerpo CTL específicos para el complejo y destruyen células tumorales. De esta forma, se logra el tratamiento o la prevención de tumores.

Pueden administrarse composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína antigénica tumoral de la presente invención junto con un adyuvante para establecer de forma eficaz la inmunidad celular, o pueden administrarse en una forma de dosificación particulada. Para dicho fin, son aplicables los adyuvantes descritos en la bibliografía (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994). Además, también son posibles preparaciones liposomales, preparaciones particuladas en las que el ingrediente está unido a perlas que tienen un diámetro de varios \mum, o preparaciones en las que el ingrediente está unido a lípidos. La administración puede conseguirse, por ejemplo, por vía intradérmica, hipodérmica o mediante inyección intravenosa. Aunque la cantidad de una proteína antigénica tumoral de la presente invención en dichas formulaciones puede variar dependiendo de la enfermedad a tratar, la edad y el peso del paciente y similares, es típico administrar 0,0001 mg-1000 mg, preferiblemente 0,001 mg-100 mg, más preferiblemente 0,01 mg-10 mg de una proteína antigénica tumoral de la presente invención de cada varios días a cada varios meses.

En la presente invención, la expresión "péptido antigénico tumoral" se refiere a un péptido parcial que consiste en una parte de la proteína antigénica tumoral de la presente invención y es capaz de unirse a un antígeno HLA y ser reconocido por CTL. Por consiguiente, cualquier péptido está dentro del alcance del péptido antigénico tumoral de la presente invención, independientemente de su longitud o de su posición en la secuencia de aminoácidos de la presente proteína, siempre que el péptido consista en una parte de la secuencia de aminoácidos de la presente proteína y un complejo entre dicho péptido y un antígeno HLA pueda ser reconocido por CTL. Dichos péptidos antigénicos tumorales de la presente invención pueden identificarse por síntesis de un péptido candidato que consiste en una parte de la proteína antigénica tumoral de la presente invención y realización de un ensayo para determinar si un complejo entre el péptido candidato y un antígeno HLA es reconocido o no por CTL, en otras palabras, si el péptido candidato tiene o no la actividad como péptido antigénico tumoral.

A este respecto, puede realizarse la síntesis de péptidos de acuerdo con un método habitualmente usado en la química de péptidos. Los ejemplos de dichos métodos conocidos son los descritos en la bibliografía incluyendo "Peptide Synthesis", Interscience, Nueva York, 1966; "The Proteins", vol. 2, Academic Press Inc., Nueva York, 1976; "Pepuchido-Gosei", Maruzen Co. Ltd., 1975; "Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn", Maruzen Co. Ltd., 1985; y "lyakuhin-no-Kaihatu, Zoku, vol. 14, Peputido-Gosei", Hirokawa Shoten, 1991.

A continuación, se describen adicionalmente a continuación métodos para identificar péptidos antigénicos tumorales de la presente invención.

Se han descubierto las reglas de secuencia respectivas (motivos) de péptidos antigénicos que se unen a y se presentan sobre los siguientes tipos de HLA; HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401 y -Cw0602 (véase, por ejemplo, Immunogenetics, 41: 178, 1995). Independientemente del motivo para HLA-A24, por ejemplo, se sabe que en la secuencia de péptidos que consiste en de 8 a 11 aminoácidos, el aminoácido en posición 2 es tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano y el aminoácido en el extremo C-terminal es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina (J. Immunol., 152: 3913, 1994; Immunogenetics, 41: 178, 1995, J. Immunol., 155: 4307, 1994). Asimismo, se conocen para HLA-A2 los motivos que se muestran en la siguiente Tabla 1 (Immunogenetics, 41: 178, 1995; J. Immunol., 155: 4749, 1995).

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TABLA 1

1

(los péptidos son de 8-11 aminoácidos de longitud).

Además, cualquier secuencia peptídica que se espera que sea capaz de unirse a antígenos HLA puede buscarse en internet usando un programa informático de NIH BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/).

Mediante el análisis de péptidos antigénicos unidos a diversas moléculas de HLA, se ha demostrado que la longitud de los péptidos es habitualmente de aproximadamente 8 a 14 aminoácidos de longitud, aunque también se han observado péptidos antigénicos de 14 o más aminoácidos de longitud para HLA-DR,-DP y -DQ (Immunogenetics, 41: 178, 1995).

Es fácil seleccionar porciones peptídicas implicadas en dichos motivos a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína de la presente invención. Dichas porciones peptídicas implicadas en las estructuras de motivos anteriores pueden seleccionarse fácilmente por inspección de la secuencia de aminoácidos de la proteína antigénica tumoral SART-3 (SEQ ID Nº: 1). Además, es fácil seleccionar cualquier secuencia que se espera que sea capaz de unirse a antígenos HLA por búsqueda en internet como se ha mostrado anteriormente. Pueden identificarse péptidos antigénicos tumorales de la presente invención por síntesis de péptidos candidatos seleccionados de este modo de acuerdo con el método descrito anteriormente y realización de un ensayo para determinar si un complejo entre el péptido candidato y un antígeno HLA es o no reconocido por CTL, en otras palabras, si un péptido candidato tiene o no una actividad como péptido antigénico tumoral.

Un ejemplo específico de método para identificar péptidos antigénicos tumorales de la presente invención es un método descrito en J. Immunol., 154: 2257,1995. En concreto, se aíslan linfocitos de sangre periférica a partir de un ser humano que es positivo para el tipo de antígeno HLA que se espera que presente el péptido candidato y se estimulan in vitro por adición del péptido candidato. Si el candidato induce CTL que reconocen de forma específica las células presentadoras de antígeno con HLA estimuladas con el péptido candidato, se indica que el péptido candidato particular puede funcionar como péptido antigénico tumoral. A este respecto, la presencia o ausencia de inducción de CTL puede detectarse, por ejemplo, por medición de la cantidad de diversas citoquinas (por ejemplo, IFN-\gamma) producidas por CTL en respuesta a las células presentadoras de péptidos antigénicos usando, por ejemplo, un método de ELISA. Como alternativa, también puede usarse para dicha detección un método en el que se mide la citotoxicidad de CTL contra células presentadoras de péptidos antigénicos marcadas con ^{51}Cr (ensayo de liberación de ^{51}Cr, Int. J. Cancer, 58: 317, 1994).

Además, la detección anterior también puede conseguirse de la forma siguiente. Un plásmido de expresión que expresa un ADNc para el tipo de antígeno HLA que se espera que presente el péptido candidato se incorpora en, por ejemplo, células COS-7 (ATCC Nº CRL1651) o células VA-13 (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research) y las células resultantes se estimulan con los péptidos candidato. Después, las células se hacen reaccionar con los CTL que están restringidos al tipo del antígeno HLA que se espera que presente el péptido candidato como se ha descrito anteriormente, y se mide la cantidad de diversas citoquinas (por ejemplo, IFN-\gamma) producidas por dichos CTL (J. Exp. Med., 187: 277, 1998).

SART-3 contiene porciones de péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A24 o HLA-A2. Para identificar péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A24, puede usarse ADNc de HLA-A24 (Cancer Res., 55: 4248-4252, 1995, Nº de acceso de Genbank M64740) como un ADNc que codifica el antígeno HLA, mientras que pueden usarse los CTL tales como KE-4CTL (FERM BP-5954), así como CTL que se preparan por estimulación con péptido de linfocitos de sangre periférica humana como los CTL descritos anteriormente. Asimismo, para péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A2, la identificación de dichos péptidos antigénicos tumorales puede conseguirse usando ADNc de HLA-A2 (Nº de acceso de Genbank M84379) y usando como los CTL descritos anteriormente los CTL tales como OK-CTL (FERM BP-6818), así como CTL que se preparan por estimulación con péptido de linfocitos de sangre periférica humana.

Se ilustran ejemplos específicos de diversos ensayos como se han descrito anteriormente en los Ejemplos 4, 6 y 8 a continuación en este documento.

En casos como HLA-A26, en los que no se ha elucidado un motivo peptídico relevante, pueden identificarse péptidos antigénicos tumorales de la presente invención, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito en el documento WO 97/46676, siendo el método diferente del de los casos anteriores en los que se habían elucidado las reglas de secuencia (motivos), con tal de que esté disponible una línea de CTL que reconozca un complejo entre HLA-A26 y un péptido antigénico tumoral.

Los métodos para identificar péptidos antigénicos tumorales como se han descrito anteriormente pueden denominarse en conjunto en lo sucesivo como "métodos de ensayo para péptidos antigénicos tumorales".

Como se ha descrito anteriormente, se sabe que las secuencias de péptidos antigénicos tumorales que se unen a y se presentan sobre HLA-A24 obedecen a una regla (motivo) determinada y, en particular, el motivo es que, en una secuencia de un péptido que consiste en de 8 a 11 aminoácidos, el aminoácido en posición 2 es tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano y el aminoácido en el extremo C-terminal es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina (J. Immunol., 152: 3913, 1994; Immunogenetics, 41: pág. 178, 1995; J. Immunol., 155: pág. 4307, 1994). Asimismo, una regla (motivo) similar puede encontrarse en las secuencias de péptidos antigénicos tumorales que se unen a y se presentan sobre HLA-A2 y, en particular, se conocen los motivos que se muestran en la Tabla 1 anterior (lmmunogenetics, 41, pág. 178, 1995; J. Immunol., 155: pág. 4749, 1995). Como se ha mostrado anteriormente, las secuencias que se espera que sean capaces de unirse a antígenos HLA pueden buscarse adicionalmente en internet usando un programa informático de NIH BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/).

Por consiguiente, se ejemplifican péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A24 y HLA-A2 entre los péptidos antigénicos tumorales de la presente invención mediante los péptidos antigénicos tumorales que son péptidos parciales implicados en dichas estructuras de motivos o estructuras que se espera que sean capaces de unirse a los HLA en la secuencia de aminoácidos de SART-3, que se muestra en la SEQ ID Nº: 1, y que sean capaces de unirse a antígenos HLA respectivos y ser reconocidos por CTL.

Los ejemplos particulares de péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A24 descritos anteriormente incluyen los péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-24 y que son capaces de unirse a un antígeno HLA-A24 y ser reconocidos por CTL. Asimismo, los ejemplos particulares de péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A2 incluyen los péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 25-52 y que son capaces de unirse a un antígeno HLA-A2 y ser reconocidos por CTL.

En concreto, los ejemplos de péptidos antigénicos tumorales de la presente invención incluyen:

1) péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-52, y

2) péptidos que comprenden la longitud completa o una porción consecutiva de una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-52 y que se prolongan en la dirección N-terminal y/o C-terminal en comparación con dicha secuencia de aminoácidos, o péptidos que consisten en una porción consecutiva de una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-52,

siendo dichos péptidos capaces de unirse a antígenos HLA respectivos y de ser reconocidos por CTL. Los péptidos en el apartado 2) anterior pueden ser de aproximadamente 8-11 aminoácidos de longitud en vista del hecho de que están unidos a y se presentan por antígenos HLA respectivos.

Los ejemplos adecuados de péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A24 de la presente invención incluyen los péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-9 y que son capaces de unirse a un antígeno HLA-A24 y de ser reconocidos por CTL. En concreto, los ejemplos son:

1) péptidos que consisten en la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-9, y

2) péptidos que comprenden la longitud completa o una porción consecutiva de la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-9 y que se prolongan en la dirección N-terminal y/o C-terminal en comparación con dicha secuencia de amino ácidos, o péptidos que consisten en una porción consecutiva de la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-9,

siendo dichos péptidos capaces de unirse a antígenos HLA-A24 y de ser reconocidos por CTL. Los péptidos en el apartado 2) anterior pueden ser de aproximadamente 8-11 aminoácidos de longitud en vista del hecho de que están unidos a y se presentan sobre antígenos HLA-A24.

Los ejemplos adecuados de péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A2 de la presente invención incluyen los péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 25-29 y que son capaces de unirse a un antígeno HLA-A2 y de ser reconocidos por CTL. En concreto, los ejemplos son:

1) péptidos que consisten en la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 25-29, y

2) péptidos que comprenden la longitud completa o una porción consecutiva de la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 25-29 y que se prolongan en la dirección N-terminal y/o C-terminal en comparación con dicha secuencia de aminoácidos, o péptidos que consisten en una porción consecutiva de la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 25-29,

siendo dichos péptidos capaces de unirse a antígenos HLA-A2 y de ser reconocidos por CTL. Los péptidos en el apartado 2) anterior 2) pueden ser de aproximadamente 8-11 aminoácidos de longitud en vista del hecho de que están unidos a y se presentan sobre antígenos HLA-A2.

Cuando se usa en este documento, la expresión "derivado que tiene propiedades funcionalmente equivalentes a las de un péptido antigénico tumoral" (en lo sucesivo puede denominarse simplemente como derivado de péptido antigénico tumoral) se refiere a un péptido modificado, cuya secuencia de aminoácidos contiene la modificación de uno o más, preferiblemente de uno a varios restos aminoacídicos de una secuencia de aminoácidos de un péptido antigénico tumoral de la presente invención y que tiene las propiedades como un péptido antigénico tumoral, que son ser capaz de unirse a un antígeno HLA y ser reconocidos por CTL. Por consiguiente, se describen en este documento péptidos modificados siempre que contengan la modificación de uno o más restos aminoacídicos de una secuencia de aminoácidos de un péptido antigénico tumoral de la presente invención y que tengan las propiedades como péptidos antigénicos tumorales; es decir, que sean capaces de unirse a antígenos HLA y de ser reconocidos por CTL.

En este contexto, la "modificación" de un resto aminoacídico significa sustitución, deleción y/o adición (incluyendo adición de aminoácidos en el extremo N-terminal y/o el C-terminal del péptido) de un resto aminoacídico, prefiriéndose la sustitución de un resto aminoacídico. Para modificaciones que implican la sustitución de un resto aminoacídico, aunque el número y la posición de los restos aminoacídicos a sustituir puede determinarse de forma arbitraria siempre que se conserve la actividad como un péptido antigénico tumoral, se prefiere que se sustituyan de uno a varios restos a la luz del hecho de que los péptidos antigénicos tumorales son habitualmente de aproximadamente 8 a 14 aminoácidos de longitud, como se ha descrito anteriormente.

Una longitud preferida de derivados de péptidos antigénicos tumorales, como se describen en este documento, es de aproximadamente 8 a 14 aminoácidos, como en el caso del péptido antigénico tumoral descrito anteriormente, aunque también pueden ser posibles derivados de 14 o más aminoácidos de longitud para HLA-DR, -DP y -DQ.

Dichos derivados de péptidos antigénicos tumorales de la presente invención pueden identificarse por síntesis de péptidos modificados que contengan la modificación de una parte de un péptido antigénico tumoral de la presente invención de acuerdo con la preparación de péptido anterior y por realización del ensayo anterior para péptidos antigénicos tumorales.

Como se ha descrito anteriormente, se han elucidado las reglas de secuencia (motivos) para péptidos que se unen a y se presentan sobre tipos de HLA tales como HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401 y -Cw0602. Como se ha mostrado anteriormente, las secuencias peptídicas que se espera que sean capaces de unirse a antígenos HLA pueden buscarse adicionalmente en internet (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/). Por consiguiente, pueden prepararse derivados de péptidos antigénicos tumorales que contienen la modificación de los aminoácidos en un péptido antigénico tumoral de la presente invención en base a dichos motivos.

Por ejemplo, con respecto al motivo para péptidos antigénicos que se unen a y se presentan sobre HLA-A24, se sabe, como se ha descrito anteriormente, que en la secuencia de un péptido que consiste en de 8 a 11 aminoácidos, el aminoácido en posición 2 es tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano, y el aminoácido en el extremo C-terminal es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina (J. Immunol., 152: 3913, 1994; Immunogenetics, 41: 178, 1995; J. Immunol., 155: 4307, 1994). Asimismo, se conocen para HLA-A2los motivos que se muestran en la Tabla 1 anterior. Además, las secuencias peptídicas que se espera que sean capaces de unirse a antígenos HLA están abiertas a inspección pública en internet (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/) y también pueden ser posibles restos aminoacídicos que tengan propiedades similares a los de aminoácidos de acuerdo con los motivos. Por consiguiente, los ejemplos de derivados de péptidos antigénicos tumorales de la presente invención incluyen los derivados de péptidos que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos del péptido antigénico tumoral de la presente invención, en la que uno o más restos aminoacídicos en cualquier posición en la que puede permitirse la sustitución de acuerdo con los motivos (para HLA-A24 y HLA-A2, posición 2 y el extremo C-terminal) se sustituyen por otros aminoácidos (preferiblemente, siendo el aminoácido que se espera que sea capaz de unirse a los antígenos de acuerdo con la dirección de internet anterior) y teniendo los derivados actividad de unión a antígenos HLA y siendo reconocidos por CTL. Son ejemplos preferidos los derivados de péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos en la que los restos aminoacídicos que se van a sustituir se seleccionan de los de dichas posiciones de acuerdo con los motivos anteriores, teniendo los derivados la actividad anterior. Una longitud preferida de "toda o parte" de una secuencia de aminoácidos es de aproximadamente 8 a 14 aminoácidos, aunque puede tener una longitud de 14 o más aminoácidos para HLA-DR, -DP y -DQ.

Los ejemplos de derivados de péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A24 o HLA-A2 incluyen los derivados de péptidos que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos aminoacídicos en posiciones en las que se permite la sustitución de acuerdo con los motivos anteriores, en concreto, en posición 2 y/o el extremo C-terminal de un péptido derivado de la secuencia de aminoácidos de SART-3 que tiene un motivo de unión para HLA-A24 o HLA-A2, se sustituyen por otros restos aminoacídicos (preferiblemente, siendo el aminoácido que se espera que sea capaz de unirse a los antígenos de acuerdo con la dirección de internet anterior) y teniendo los derivados la actividad anterior. Son ejemplos preferidos los derivados de péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos en la que los restos aminoacídicos en posición 2 y/o el extremo C-terminal se sustituyen por los restos aminoacídicos implicados de acuerdo con los motivos anteriores y teniendo los derivados la actividad anterior. En dichos derivados de péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A24 o HLA-A2, una longitud preferida "toda o parte" de la secuencia de aminoácidos es de aproximadamente 8 a 11 aminoácidos.

En particular, son ejemplos los derivados de péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos en la que los restos aminoacídicos en posición 2 y/o el extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3 a 52 se sustituyen por otros restos aminoacídicos (preferiblemente, siendo el aminoácido que se espera que sea capaz de unirse a los antígenos de acuerdo con la dirección de internet que se ha mostrado anteriormente) y teniendo los derivados la actividad anterior. Son ejemplos preferidos los derivados de péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos en la que los restos aminoacídicos en posición 2 y/o el extremos C-terminal de una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3 a 52 se sustituyen por los restos aminoacídicos implicados de acuerdo con los motivos anteriores y teniendo los derivados la actividad anterior. En concreto, son ejemplos de derivados de antígenos tumorales restringidos a HLA-A24 los derivados de péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos en la que el resto aminoacídico en posición 2 de una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3 a 24 se sustituye por tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano y/o el resto aminoacídico en el extremo C-terminal se sustituye por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano, metionina y teniendo los derivados la actividad anterior. Asimismo, son ejemplos de derivados de antígenos tumorales restringidos a HLA-A2 los derivados de péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos en la que el resto aminoacídico en posición 2 de una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 25 a 52 se sustituye por leucina, metionina, valina, isoleucina o glutamina, y/o el resto aminoacídico en el extremo C-terminal se sustituye por valina o leucina y teniendo los derivados la actividad anterior.

Son ejemplos adecuados de derivados de péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A24 de la presente invención los derivados de péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos en la que los restos aminoacídicos en posición 2 y/o el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3 a 9 se sustituyen por otros restos aminoacídicos y teniendo los derivados la actividad anterior. Son ejemplos más preferidos los derivados de péptidos antigénicos tumorales que comprende toda o parte de una secuencia de aminoácidos en la que el resto aminoacídico en posición 2 de una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEC ID Nº: 3 a 9 se sustituye por tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano y/o el resto aminoacídico en el extremo C-terminal se sustituye por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina y teniendo los derivados la actividad anterior. Se muestran ejemplos adecuados de dichos derivados de péptidos antigénicos tumorales en las SEC ID Nº: 53 a 59.

Son ejemplos adecuados de derivados de péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A2 de la presente invención los derivados de péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos en la que los restos aminoacídicos en posición 2 y/o el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEC ID Nº: 25 a 29 se sustituyen por otros restos aminoacídicos y teniendo los derivados la actividad anterior. Son ejemplos más preferidos los derivados de péptidos antigénicos tumorales que comprenden toda o parte de una secuencia de aminoácidos en la que el resto aminoacídico en posición 2 de una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEC ID Nº: 25 a 29 se sustituye por leucina, metionina, valina, isoleucina o glutamina y/o el resto aminoacídico en el extremo C-terminal se sustituye por valina o leucina y teniendo los derivados de la actividad anterior. Se muestran ejemplos adecuados de dichos derivados de péptidos antigénicos tumorales en las SEC ID Nº: 60 a 64.

Un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención puede usarse en solitario o junto con otros uno o más de los mismos como una composición farmacéutica para tratar o prevenir tumores. En concreto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de tumores que comprende los péptidos antigénicos tumorales o derivados de los mismos como un ingrediente activo. Cuando la composición para tratar o prevenir tumores que comprende como un ingrediente activo un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención se administra a un paciente positivo para SART-3, el péptido antigénico tumoral o derivado del mismo se presenta con un antígeno HLA de células presentadoras de antígenos y, por lo tanto, proliferan CTL específicos para el complejo de antígeno HLA presentado y destruyen las células tumorales. Como resultado, el tumor del paciente puede tratarse o puede prevenirse la proliferación o metástasis del tumor. SART-3 se desarrolla ampliamente en el carcinoma de células escamosas, tal como cáncer esofágico, y, por lo tanto, la composición para tratar o prevenir tumores de acuerdo con la presente invención es ventajosa en términos de una amplia aplicabilidad. El carcinoma de células escamosas presenta con frecuencia una resistencia a quimioterapia y radioterapia y, por lo tanto, la composición para tratar tumores de la presente invención también puede conseguir un efecto terapéutico aumentado mediante su uso combinado.

La composición para tratar o prevenir tumores que comprende como un ingrediente activo un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención puede administrarse junto con un adyuvante para establecer eficazmente la inmunidad celular o puede administrarse en una forma de dosificación particulada. Para dicho fin, son aplicables los adyuvantes descritos en la bibliografía (Clin. Microbiol. Rev. 7: 277-289, 1994). Además, también son posibles preparaciones liposomales, preparaciones particuladas en las que el ingrediente se une a perlas que tienen un diámetro de varios \mum o preparaciones en las que el ingrediente se une a lípidos. La administración puede conseguirse, por ejemplo, por vía intradérmica, hipodérmica o mediante inyección intravenosa. Aunque la cantidad de un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención en la formulación que se va a administrar puede ajustarse según sea apropiado dependiendo de, por ejemplo, la enfermedad a tratar, la edad y el peso corporal del paciente particular, es típico administrar de 0,0001 mg a 1000 mg, preferiblemente de 0,001 mg a 100 mg y, más preferiblemente, de 0,01 mg a 10 mg de cada varios días a cada varios meses.

Además, también puede comprenderse como un ingrediente activo en la composición para tratar o prevenir tumores de acuerdo con la presente invención un ADN recombinante que contiene al menos un ADN que codifica un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención, o un polipéptido recombinante que puede obtenerse por expresión de dicho ADN recombinante, proporcionándose los detalles a continuación.

A este respecto, la expresión "ADN recombinante" se refiere a cualquier ADN que codifica un polipéptido parcial, un péptido parcial que consiste en una parte de la proteína antigénica tumoral de la presente invención, derivados del mismo, un polítopo en el que se combinan dichos péptidos o similares. Todos los ADN están dentro del alcance del ADN recombinante de la presente invención siempre que contengan al menos un ADN que codifique el péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención. Dicho ADN recombinante puede incorporarse en un vector de expresión adecuado para componer un ingrediente activo comprendido en la composición farmacéutica para tratar o prevenir tumores.

El término "polítopo" se refiere a un péptido combinado de muchos epítopos de CTL y recientemente se han usado ADN que codifican dichos polítopos para vacunación de ADN. Véase, por ejemplo, J of Immunology, 160 pág. 1717, 1998. Puede prepararse un ADN que codifica el polítopo de la presente invención por ligación de uno o más ADN que codifican el péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención entre sí y, si se desea, ligación de un ADN que codifica otro péptido o péptidos antigénicos tumorales.

Pueden prepararse fácilmente un ADN recombinante de la presente invención de acuerdo con la síntesis de ADN típica y un método de ingeniería genética, por ejemplo, de acuerdo con la descripción de un texto convencional tal como "Molecular Cloning", 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). La incorporación de dicho ADN recombinante en vectores de expresión también puede realizarse de acuerdo con el texto convencional y
similares.

La determinación de si un ADN recombinante de la presente invención preparado como anteriormente puede generar o no péptidos antigénicos tumorales que sean capaces de unirse a antígenos HLA y de ser reconocidos por CTL puede conseguirse de acuerdo con, por ejemplo, el método como se ha mencionado anteriormente para determinar la actividad del ADN de la presente invención. Asimismo, el uso del presente ADN recombinante como medicamento o agente profiláctico puede ser de acuerdo con el método para el ADN de la presente invención.

Como se ha mostrado anteriormente, un "polipéptido recombinante" que puede obtenerse por expresión del ADN recombinante de la invención también puede usarse para una composición farmacéutica para tratar o prevenir tumores.

El polipéptido recombinante de la invención puede prepararse de una forma similar a la de la proteína de la invención, como se describe en este documento. Asimismo, la determinación de si un polipéptido recombinante de la presente invención preparado como anteriormente puede tener o no cierta actividad puede conseguirse de acuerdo con una forma similar a la de la proteína de la presente invención. Además, el uso del presente polipéptido recombinante como medicamento o agente profiláctico puede ser de acuerdo con el método anterior para la proteína o péptido de la presente invención.

La presente invención también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una proteína de la presente invención, un péptido antigénico tumoral de la presente invención o un derivado del mismo. Dichos anticuerpos se preparan fácilmente, por ejemplo, de acuerdo con un método descrito en "Antibodies: A Laboratory Manual" Lane, H. D. et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989. En concreto, pueden prepararse fácilmente anticuerpos que reconozcan un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención y anticuerpos que neutralicen adicionalmente su actividad usando el péptido antigénico tumoral o derivado del mismo para inmunizar de forma apropiada a un animal de la forma habitual. Dichos anticuerpos pueden usarse en una cromatografía de afinidad, diagnóstico inmunológico y similar. Puede seleccionarse un diagnóstico inmunológico apropiado a partir de inmunotransferencia, radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un ensayo fluorescente o luminiscente y similares.

También puede usarse un péptido antigénico tumoral, derivado del mismo, proteína antigénica tumoral, gen para la misma de la presente invención o un ADN recombinante o polipéptido recombinante de la presente invención in vitro para el tratamiento de pacientes con tumores de la forma siguiente.

En el uso de un péptido antigénico tumoral, derivado del mismo, proteína antigénica tumoral o gen para la misma en el tratamiento de tumores es importante establecer un método de administración que pueda inducir eficazmente CTL específicos en el cuerpo de un paciente. Como uno de los medios para lo mismo, la presente invención proporciona una célula presentadora de antígenos en la que se presenta un complejo entre un antígeno HLA y un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención sobre la superficie de una célula que tiene capacidad de presentación de antígenos aislada a partir de un paciente con un tumor, y también proporciona una composición farmacéutica para tratar tumores que comprende dicha célula presentadora de antígenos como un ingrediente activo.

En este contexto, la "célula que tiene capacidad de presentación de antígeno" no se limita a una célula específica siempre que sea una célula que exprese sobre su superficie celular un antígeno HLA permitiendo que se presente un péptido antigénico tumoral o su derivado de la presente invención, y se prefieren células dendríticas, que se ha descrito que tienen especialmente una capacidad de presentación de antígenos elevada.

Las sustancias a añadir para preparar una célula presentadora de antígenos de la presente invención a partir de la célula mencionada anteriormente que tiene una capacidad de presentación de antígenos pueden ser péptidos antigénicos tumorales o sus derivados de la presente invención, así como ADN, proteínas, ADN recombinantes o polipéptidos recombinantes de la presente invención. Cuando se usa en la forma de una proteína o ADN, se introduce necesariamente en células.

Para preparar células presentadoras de antígenos de la presente invención, se aíslan células que tienen una capacidad de presentación de antígenos a partir de un paciente con un tumor y se estimulan ex vivo con un péptido antigénico tumoral, un derivado del mismo, una proteína antigénica tumoral o un polipéptido recombinante de la presente invención para presentar un complejo entre un antígeno HLA y dicho péptido antigénico tumoral o derivado del mismo (Cancer Immunol. Immunother., 46: 82, 1998; J. Immunol. 158: pág. 1796, 1997; Cancer Res., 59: 1184, 1999). Cuando se usan células dendríticas, pueden prepararse células presentadoras de antígenos de la presente invención, por ejemplo, por aislamiento de linfocitos de sangre periférica de un paciente con un tumor usando un método de Ficoll, eliminación de células no adherentes, incubación de las células adherentes en presencia de GM-CSF e IL-4 para inducir células dendríticas e incubación y estimulación de dichas células dendríticas con un péptido antigénico tumoral o proteína antigénica tumoral de la presente invención o similar.

Cuando se preparan células presentadoras de antígenos de la presente invención por introducción de un ADN o de un ADN recombinante de la presente invención en las células mencionadas anteriormente que tienen una capacidad de presentación de antígenos, dicho gen puede estar en forma de ADN o ARN. En particular, puede usarse ADN consultando, por ejemplo, Cancer Res., 56: 5672, 1996 o J. Immunol., 161: pág. 5607, 1998 y puede usarse ARN consultando, por ejemplo, J. Exp. Med., 184: pág. 465, 1996.

Una composición farmacéutica para tratar tumores que comprende las células presentadoras de antígenos anteriores como un ingrediente activo contiene preferiblemente solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS), medio o similar para mantener de forma estable las células presentadoras de antígenos. Puede administrarse, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea o intradérmica. Mediante la reintroducción de dicha composición para tratar tumores que comprende células presentadoras de antígenos como un ingrediente activo en el cuerpo del paciente, se inducen eficazmente CTL específicos en pacientes positivos para SART-3, de tal modo que se consigue el tratamiento del tumor. Debería se indiscutible que los tipos de HLA tienen que ser compatibles entre el paciente y el péptido usado, de tal modo que un péptido antigénico tumoral restringido a HLA-A24 o un derivado del mismo debe usarse con un paciente con un tumor positivo para HLA-A24.

Además, como otro ejemplo de su uso puede proporcionarse el uso in vitro de un péptido antigénico tumoral, un derivado del mismo, una proteína antigénica tumoral, un ADN para la misma, un ADN recombinante o un polipéptido recombinante de acuerdo con la presente invención en la siguiente inmunoterapia adoptiva.

Para melanomas, se ha observado que una inmunoterapia adoptiva en la que células T infiltrantes en tumores tomadas del propio paciente se cultivan ex vivo en grandes cantidades y después se devuelven al paciente consigue un efecto terapéutico (J. Natl. Cancer Inst. 86: 1159, 1994). Asimismo, en el melanoma de ratón, se ha observado la supresión de metástasis mediante la estimulación in vitro de esplenocitos con péptido antigénico tumoral TRP-2, proliferando de este modo CTL específicos para el péptido antigénico tumoral, y la administración de dichos CTL en un ratón al que se le ha injertado un melanoma (J. Exp. Med., 185: 453, 1997). Esto fue el resultado de la proliferación in vitro de CTL que reconocen específicamente el complejo entre un antígeno HLA de células presentadoras de antígenos y el péptido antigénico tumoral. Por consiguiente, se piensa que es útil el tratamiento de tumores mediante la estimulación in vitro de linfocitos de sangre periférica de un paciente usando un péptido antigénico tumoral, un derivado del mismo, una proteína antigénica tumoral o un ADN para la misma de acuerdo con la presente invención para proliferar CTL específicos de tumores y, posteriormente, la devolución de los CTL al paciente.

Por lo tanto, la presente invención proporciona CTL que reconocen específicamente un complejo entre el antígeno HLA y el péptido antigénico tumoral o derivado del mismo y también proporciona una composición farmacéutica para tratar tumores que comprende dichos CTL como un ingrediente activo. Dicha composición contiene preferiblemente solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS), medio o similar para mantener de forma estable CTL. Puede administrarse, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea o intradérmica. Mediante la reintroducción de la composición para tratar tumores que comprende CTL como un ingrediente activo en el cuerpo del paciente, el efecto tóxico de los CTL contra las células tumorales se potencia en pacientes positivos para SART-3 y, por lo tanto, destruye las células tumorales para conseguir el tratamiento del tumor.

También pueden usarse péptidos antigénicos tumorales, derivados de los mismos, proteínas antigénicas tumorales o polipéptidos recombinantes de las mismas de acuerdo con la presente invención como un ingrediente activo de un agente de diagnóstico para diagnosticar tumores. En concreto, mediante el uso de un péptido antigénico tumoral o derivado del mismo de acuerdo con la propia presente invención como un agente de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos en una muestra (tal como sangre o un tejido tumoral) obtenida de un paciente sospechoso de tener un tumor, es posible la detección temprana de tumores y el diagnóstico de reapariciones y metástasis. El mismo procedimiento puede usarse también para la selección de pacientes con tumores a los que pueden aplicarse medicamentos que comprenden como un ingrediente activo, por ejemplo, un péptido antigénico tumoral de la presente invención. En particular, dicho diagnóstico puede realizarse usando inmunotransferencia, RIA, ELISA o un ensayo fluorescente o luminiscente.

Además, en los últimos años, se ha establecido un nuevo método de detección para detectar CTL específicos de antígenos usando un complejo entre el péptido antigénico y un antígeno HLA (Science, 274: 94, 1996). La detección temprana de tumores y el diagnóstico de reapariciones o metástasis es posible por aplicación de un complejo entre un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo de acuerdo con la presente invención y un antígeno HLA al método de detección anterior, y la detección de este modo de CTL específicos de antígenos tumorales. También puede usarse el mismo procedimiento para la selección de pacientes con tumores a los que puede aplicarse una medicina que comprende como un ingrediente activo, por ejemplo, un péptido antigénico tumoral de la presente invención, o para la determinación del efecto terapéutico de dicho tratamiento. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un agente de diagnóstico para tumores que comprende un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo de acuerdo con la presente invención.

En particular, dicho diagnóstico puede realizarse por preparación de un tetrámero de un complejo entre un antígeno HLA marcado fluorescentemente de acuerdo con el método descrito en la bibliografía (Science, 274: 94, 1996) y un péptido antigénico tumoral, y el uso del mismo para determinar cuantitativamente los CTL específicos de péptido antigénico en linfocitos de sangre periférica de un paciente sospechoso de tener un tumor usando un citómetro de flujo.

La presente invención también proporciona OK-CTL (número de depósito FERM BP6818) que son CTL establecidos a partir de linfocitos infiltrantes en tumores derivados de cáncer de colon. Se ha demostrado que los OK-CTL están restringidos a HLA-A2. Por consiguiente, pueden descubrirse nuevas proteínas antigénicas tumorales y péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A2 usando OK-CTL. Para detalles véase el Ejemplo 8 a continuación.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, pero no se limita en ningún sentido por estos ejemplos.

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Referencia 1

Establecimiento de una línea celular de linfocitos T citotóxicos (CTL) contra una línea celular de cáncer esofágico

De acuerdo con la descripción de Nakao et al., Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995), se establecieron CTL contra la línea celular de cáncer esofágico KE-4, que pertenece a carcinomas de células escamosas cuando se clasifica en base al tipo tisular, a partir de células mononucleares de sangre periférica de un paciente, denominados KE-4CTL, y se usaron en los siguientes experimentos. Se han depositados las líneas celulares de cáncer esofágico KE-4 y KE-4CTL en The Nacional Institute of Bioscience and Human Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón) bajo los Nº de Depósito Internacional FERM BP-5955 y FERM BP-5954, respectivamente, ambas el 23 de mayo de 1997. Además, se realizo el tipado de moléculas de HLA de clase I de KE-4 de acuerdo con la descripción mencionada anteriormente de Nakao et al., para descubrir que eran HLA-A2402, -A2601, -B54, -B60, -Cw1 y -Cw3.

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Referencia 2

Preparación de ADNc de HLA-A2402

De acuerdo con la descripción de Nakao et al., Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995), se preparó un plásmido recombinante a partir de KE-4 por incorporación de ADNc para HLA-A2402 (Nº de Acceso de Genbank M64740) en un vector de expresión pCR3 (INVITROGEN).

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Referencia 3

Preparación de una genoteca de ADNc derivada de KE-4

Se preparó ARNm poli (A)^{+} a partir de KE-4 por aislamiento de una fracción de ARN total y purificación sobre una columna de oligo (dT) usando un sistema de purificación de ARNm (Pharmacia Biotech) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se prepararon ADNc que tenían un adaptador Not I y un adaptador Sca I unidos a cada extremo a partir de los ARNm usando el SuperScript Plasmid System (GIBCO BRL) de acuerdo con el protocolo del fabricante y, después, se ligaron en los sitios de restricción Not I y Sal I de un vector de expresión, el plásmido pSV-SPORT1 (GIBCO BRL), para dar plásmidos recombinantes. Los plásmidos recombinantes se introdujeron en células de E. coli ElectroMAX DH10B^{TM} usando pulsos eléctricos en un Gene Pulser (Bio-Rad) en una condición de 25 \muF y 2,5 kV. Se seleccionaron los transformantes en los que se habían introducido los plásmidos recombinantes en medio LB (bacto-triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 0,5%, pH 7,3) que contenía ampicilina (50 \mug/ml).

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Ejemplo 1

Detección de un nuevo gen de proteína antigénica tumoral

Los ADN plasmídicos recombinantes se recuperaron de la forma siguiente, a partir de combinaciones de aproximadamente 100 transformantes descritos en la Referencia 3. Se introdujeron cien transformantes y se cultivaron en cada pocillo de una microplaca de fondo en U de 96 pocillos que contenía medio LB más ampicilina (50 \mug/ml). Después, se transfirió parte del cultivo a otra microplaca de fondo en U de 96 pocillos que contenía 0,25 ml de medio TYGPN por pocillo (F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.) y se cultivó a 37ºC durante 48 horas. Los cultivos restantes en medio LB en la microplaca se almacenaron en congelación. Se llevó a cabo la preparación de ADN plasmídicos recombinantes a partir de transformantes cultivados en medio TYGPN en la microplaca mediante el método de lisis alcalina (F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, Inc.). Los ADN plasmídicos recombinantes recuperados mediante precipitación con isopropanol se suspendieron en 50 \mul de Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 que contenía ARNasa 20 ng/ml.

El plásmido recombinante para ADNc de KE-4 y el plásmido recombinante para ADNc de HLA-A2402 se transfectaron doblemente en células de la línea celular de fibroblastos VA-13 (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research; Ann. Med. Exp. Biol. Fenn., 44: 242-254, 1966) usando el método de lipofectina de la forma siguiente. Se colocaron siete mil células VA-13 en cada pocillo de una microplaca de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron durante 2 días en 100 \mul de medio RPMI 1640 que contenía FCS al 10%. Usando reactivo de Lipofectina (GIBCO BRL), se añadió una porción de 30 \mul de una mezcla de 70 \mul que consiste en 25 \mul del plásmido recombinante para ADNc de KE-4 que se corresponden con aproximadamente 100 transformantes, 10 \mul (200 ng) del plásmido recombinante para ADNc de HLA-A2402 descrito en la Referencia 2 y 35 \mul de reactivo de Lipofectina diluido aproximadamente 35 veces a células VA-13 y se permitió que se transfectaran doblemente. Se prepararon transfectantes por duplicado. Después de 5 horas, se añadieron 200 \mul de medio de cultivo que contenía FCS al 10% a los transfectantes y se incubaron adicionalmente a 37ºC durante 72 horas. Después de retirar el medio de cultivo, se añadieron 10.000 células KE-4CTL a cada pocillo y se cultivaron a 37ºC durante 24 horas en 100 \mul de medio de cultivo que contenía FCS al 10% e IL-2 25 U/ml. El medio de cultivo se recuperó y se midió la cantidad de IFN-\gamma en el cultivo mediante ELISA, como se describe a continuación.

En concreto, se adsorbió un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IFN-\gamma humano sobre pocillos de una microplaca de 96 pocillos como anticuerpo en fase sólida y, después del bloqueo de uniones inespecíficas con albúmina de suero bovino, se permitió que el anticuerpo se uniera a IFN-\gamma en la muestra descrita anteriormente. Después se permitió que se uniera anticuerpo policlonal de conejo anti-IFN-\gamma humano como anticuerpo de detección y, después, de la unión a un anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina de conejo marcado con fosfatasa alcalina, se hizo reaccionar para-nitrofenilfosfato con sustrato cromogénico. Después de interrumpir la reacción por adición de un volumen equivalente de NaOH 1 N, se midió la absorbancia a 405 nm. La absorbancia se comparó con la obtenida con IFN-\gamma patrón para determinar la cantidad de IFN-\gamma en la muestra.

Con respecto a los grupos en los que se observó una alta producción de IFN-\gamma, se usaron las combinaciones almacenadas en congelación correspondientes de aproximadamente 100 transformantes que contenían plásmidos recombinantes para ADNc de KE-4 en la siguiente detección. Las combinaciones de los transformantes se sembraron en placas en medio de agar LB que contenía ampicilina (50 \mug/ml) para obtener colonias. Se cultivaron doscientas colonias por cada grupo, como se ha descrito anteriormente, de tal modo que se incluyera una sola clase de transformante en cada pocillo, preparando de este modo ADN plasmídicos recombinantes para ADNc de KE-4. Después, las células VA-13 se transfectaron doblemente con el plásmido recombinante para ADNc de KE-4 y el plásmido recombinante para ADNc de HLA-A2402, seguido de cocultivo con KE-4CTL, y se determinó cuantitativamente el IFN-\gamma producido debido a la reacción con KE-4CTL, como se ha descrito anteriormente, de tal modo que se seleccionaran los plásmidos positivos. De esta forma, se seleccionó un solo clon de plásmido recombinante de ADNc de KE-4 y se denominó clon 13. Un análisis adicional reveló que el clon 13 incorporaba un ADNc de aproximadamente 1,2 kb. Además, se repitieron procedimientos similares con el clon 13 para determinar la cantidad de IFN-\gamma producido por KE-4CTL de acuerdo con un método similar al descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

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TABLA 2

2

Cuando se comparaban con VA-13 transfectadas solamente con HLA-A2402, los KE-4CTL reaccionaban más intensamente con VA-13 doblemente transfectadas con HLA-A2402 y clon 13 y producían más IFN-\gamma. Este resultado indicaba que la proteína codificada por el clon 13 es una proteína antigénica tumoral.

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Ejemplo 2

Clonación de un clon de ADNc de longitud completa que codifica una proteína antigénica tumoral

Para determinar la longitud del gen de ADNc de longitud completa incorporado en el clon 13 obtenido en el Ejemplo 1, se realizó una hibridación de Northern como se describe a continuación.

En primer lugar, se prepararon ARN a partir de una línea celular de cáncer esofágico KE-4 usando RNAzol B (TEL-TEST, Inc). Se desnaturalizaron cinco \mug de ARN en presencia de formamida y formaldehído, se sometieron a electroforesis sobre agarosa y después se transfirieron y se fijaron sobre una membrana de nylon Hybond-N+ (Amersham). La región de secuencia insertada del clon 13 se marcó con ^{32}P usando un sistema de marcaje de ADN Multiprime (Amersham) para preparar una sonda de ADN. De acuerdo con el método conocido (Nakayama et al., Bio-Jikken-Illustrated, vol. 2, "Idenshi-Kaiseki-No-Kiso (A Basis for Gene Analysis)", págs. 148-151, Shujunsha, 1995), se dejó que esta sonda hibridara con ARN sobre las membranas y se sometió a autorradiografía para detectar ARNm para ADNc incorporado en el clon 13, indicando que el ARNm era de aproximadamente 3,8 kb de longitud completa. Después, se clonó el clon 13 que contenía un clon de ADNc de longitud completa preparado como anteriormente. Una genoteca de ADNc obtenido de KE-4 descrita en la Referencia 3 se sembró en placas en medio de agar LB que contenían ampicilina (50 \mug/ml) para obtener colonias. Después, las colonias se transfirieron a y se fijaron sobre una membrana de nylon Hybond-N+ (Amersham) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se empleó una sonda de ADN en la que la secuencia de inserción del clon 13 se marcó con ^{32}P para la hibridación y autorradiografía en condiciones similares a las mencionadas anteriormente para seleccionar colonias que representen transformantes positivos. Después, se recuperaron plásmidos recombinantes a partir de las muchas colonias seleccionadas, se trataron con las enzimas de restricción Not I y Sal I y, después, se sometieron a electroforesis sobre agarosa para determinar la longitud de los ADNc incorporados. Se seleccionó un plásmido recombinante que incorporaba un ADNc de aproximadamente 3,8 kb y se denominó clon K. Después, se transfectaron doblemente células VA-13 con el clon K de plásmido recombinante que incorporaba ADNc para el gen de proteína antigénica tumoral y otro plásmido recombinante que contenía ADNc para HLA-A2402, como se ha descrito anteriormente, y las células se usaron como células diana. La cantidad de IFN-\gamma producido por la reacción de KE-4CTL se determinó de acuerdo con el método que se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

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TABLA 3

3

Cuando se comparaban con VA-13 transfectadas solamente con HLA-A2402, los KE-4CTL reaccionaban más intensamente con VA-13 doblemente transfectadas con HLA-A2402 y clon K y producían más IFN-\gamma. Este resultado indicaba que la proteína codificada por el clon K es una proteína antigénica tumoral. La proteína antigénica tumoral codificada por el clon K se denomina SART-3

\hbox{(antígenos de carcinoma
de células escamosas reconocidos por células 
T-3).}

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Ejemplo 3

Determinación de la secuencia de bases de un gen de proteína antigénica tumoral

La secuencia de bases del ADN de la proteína antigénica tumoral SART-3 según se obtuvo en el Ejemplo 3 se determinó usando el kit de DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing (Perkin-Elmer). La secuencia de bases determinada de este modo se muestra en la SEC ID Nº: 2. La longitud completa del ADNc era de 3798 pares de bases. La secuencia de aminoácidos (963 aminoácidos) codificada por la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 2 se muestra en la SEC ID Nº: 1. La comparación de la secuencia de bases que se muestra en la SEC ID Nº: 2 con secuencias conocidas usando la base de datos GenBank reveló que la secuencia de bases de la proteína antigénica tumoral SART-3 tiene una nueva secuencia de bases que es diferente del gen KIAA0156 registrado en el GenBank con el Nº de Acceso D63879 en términos de una sola base (en posición 108 de KIA0156) cuya función no se ha demostrado.

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Ejemplo 4

Selección de péptidos candidatos

Existen ciertas reglas (motivos) en las secuencias de péptidos antigénicos que deberían unirse a y presentarse por antígenos HLA. Con respecto al motivo para HLA-A24, se sabe que en la secuencia de péptidos que consisten en 8 a 11 aminoácidos, el aminoácido en posición 2 es tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano y el aminoácido en el extremo C-terminal es fenilalanina, triptófano, leucina, isoleucina o metionina (Immunogenetics, 41: 178, 1995; J. Immunol., 152: 3913, 1994; J. Immunol., 155: 4307, 1994). De acuerdo con los motivos, se seleccionaron porciones de péptidos que consistían en de 8 a 11 péptidos que tienen los motivos anteriores a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína antigénica tumoral SART-3, que se muestra en la SEC ID Nº: 1. Los ejemplos de los péptidos seleccionados se muestran

\hbox{en
las SEC ID Nº: 3-24. Estos péptidos se  sintetizaron
en Biologica Co. mediante el método Fmoc.}

Después, se transfectaron 1,8 x 10^{4} células VA-13 con un plásmido recombinante de ADNc de HLA-A2402 mediante el método de lipofectina para expresar HLA-A2402 de acuerdo con la bibliografía (J. Exp. Med., 187: 227, 1998). A estas células, se añadieron diversos péptidos que tenían un motivo de unión para HLA-A24 que se habían sintetizado previamente, cada uno a 10 \muM, a lo largo de dos horas para estimular las células. Después, las células se cultivaron con 2 x 10^{4} KE-4CTL durante 18 horas y se determinó la cantidad de IFN-\gamma producido por KE-4CTL en el sobrenadante de cultivo mediante el método de ELISA. Los resultados de esta determinación se muestran en la Tabla 4, que se realizó sobre siete péptidos, es decir, un péptido "109-118" que comprende la secuencia desde la posición 109 hasta la posición 118 (SEC ID Nº: 3), un péptido "172-181" que comprende la secuencia desde la posición 172 hasta la posición 181 (SEC ID Nº: 4), un péptido "284-292" que comprende la secuencia desde la posición 284 hasta la posición 292 (SEC ID Nº: 5), un péptido "315-323" que comprende la secuencia desde la posición 315 hasta la posición 323 (SEC ID Nº: 6), un péptido "416-425" que comprende la secuencia desde la posición 416 hasta la posición 425 (SEC ID Nº: 7), un péptido "426-434" que comprende la secuencia desde la posición 426 hasta la posición 434 (SEC ID Nº: 8) y un péptido "448-456" que comprende la secuencia desde la posición 448 hasta la posición 456 (SEC ID Nº: 9), en la secuencia de aminoácidos de la proteína antigénica tumoral SART-3.

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TABLA 4

4

Cuando se comparaban con células estimuladas sin péptido, los KE-4CTL reaccionaban más intensamente con células estimuladas con los péptidos y producían más IFN-\gamma. Este resultado indicaba que los siete péptidos funcionan como péptidos antigénicos tumorales.

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Ejemplo 5

Síntesis de péptidos antigénicos tumorales

Los siete péptidos descritos anteriormente se sintetizaron mediante el método en fase sólida como se muestra a continuación.

(1) Síntesis de SART-3 "109-118" Val-Tyr-Asp-Tyr-Asn-Cys-His-Val-Asp-Leu (SEC ID Nº: 3)

Se usó resina Fmoc-Leu-Alko (0,55 mmol/g, malla de 100-200) como resina. Usando 100 mg de esta resina, la síntesis se comenzó de acuerdo con el Programa 1 descrito a continuación para acoplar los siguientes restos en orden: Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-His(Boc)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc- Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(Ot- Bu)-OH, Fmoc- Tyr(tBu)-OH y Fmoc-Val-OH. Después del acoplamiento, se realizaron los procedimientos hasta la Etapa 3 del Programa 1 para obtener una resina con péptido.

A esta resina con péptido se añadieron 2 ml de Reactivo K (la solución de fenol al 5%, tioanisol al 5%, H_{2}O al 5% y etanoditiol al 2,5% en TFA) y la mezcla se dejó reaccionar durante 2,5 horas a temperatura ambiente. Mientras se enfriaba con hielo, se añadieron 10 ml de éter dietílico a la reacción, la mezcla se agitó durante 10 minutos, se filtró y se lavó con 10 ml de éter dietílico. A la torta del filtro se añadieron 10 ml de ácido acético acuoso y la mezcla se agitó durante 30 minutos. La resina se filtró después y se lavó con 4 ml de ácido acético acuoso. Después de la liofilización del filtrado y del lavado, el péptido bruto obtenido se disolvió en ácido acético acuoso y se inyectó en un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-A (30 \phi x 250 mm) que se había equilibrado previamente con TFA acuoso al 0,1%. La columna se lavó con TFA acuoso al 0,1% y después se realizó la elución a un caudal de 7 ml/min, al tiempo que se aumentaba la concentración de acetonitrilo hasta el 25% durante 180 minutos. El eluido se controló mediante A 220 nm. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron entre sí y se liofilizaron para obtener 31,0 mg de Val-Tyr-Asp-Tyr-Asn-Cys-His-Val-Asp-Leu.

El péptido obtenido, Val-Tyr-Asp-Tyr-Asn-Cys-His-Val-Asp-Leu, tenía un tiempo de retención de 19,3 minutos en un análisis usando un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-AM (4,6 \phi x 250 mm) eluida con un gradiente lineal de concentración de acetonitrilo del 16 al 46% que contenía TFA al 0,1%, y los resultados del análisis de aminoácidos (no se detectaba Cys) y la espectrometría de masas del producto concordaban con los valores teóricos.

Análisis de aminoácidos

Hidrólisis: fenol al 1%/ácido clorhídrico acuoso 6 N, 110ºC, 8 horas;

Método de análisis: el método de ninhidrina;

*Aminoácido de referencia; se indican entre paréntesis los valores teóricos:

: Asx: 2,77 (3)

: Val: 1,70 (2)

: \text{*}Leu: 1,00 (1)

: Tyr: 1,98 (2)

: His: 0,91 (1)

Espectro de masas (FAB)

[M+H]^{+}: 1241

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TABLA 5

6

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(2) Síntesis de SART-3 "172-181" Leu-Phe-Glu-Lys-Ala-Val-Lys-Asp-Tyr-Ile (SEC ID Nº: 4)

De acuerdo con una forma similar a la descrita en el apartado (1) anterior, usando 100 mg de resina Fmoc-Ile-Alko (0,41 mmol/g, malla de 100-200), se acoplaron en orden Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Phe-OH y Fmoc-Leu-OH y después se desprotegió el producto. El péptido bruto obtenido se disolvió en ácido acético acuoso y se inyectó en un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-A (30 \phi x 250 mm) que se había equilibrado previamente con TFA acuoso al 0,1%. La columna se lavó con TFA acuoso al 0,1% y después se realizó la elución a un caudal de 7 ml/min, al tiempo que se aumentaba la concentración de acetonitrilo hasta el 30% durante 300 minutos. El eluido se controló mediante A 220 nm. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron entre sí y se liofilizaron para obtener 66,3 mg de Leu-Phe-Glu-Lys-Ala-Val-Lys-Asp-Tyr-lle.

El péptido obtenido, Leu-Phe-Glu-Lys-Ala-Val-Lys-Asp-Tyr-lle, tenía un tiempo de retención de 23,8 minutos en un análisis usando un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-AM (4,6 \phi x 250 mm) eluida con un gradiente lineal de concentración de acetonitrilo del 12 al 42% que contenía TFA al 0,1%, y los resultados del análisis de aminoácidos y de la espectrometría de masas del producto concordaban con los valores teóricos.

Análisis de aminoácidos

Hidrólisis: fenol al 1%/ácido clorhídrico acuoso 6 N, 110ºC, 12 horas;

Método de análisis: el método de ninhidrina;

*Aminoácido de referencia; se indican entre paréntesis los valores teóricos:

: Asx: 0,94 (1)

: Glx: 1,03 (1)

: Ala: 1,00 (1)

: Val: 0,88 (1)

: Ile: 0,92 (1)

: \text{*}Leu: 1,00 (1)

: Tyr: 0,96 (1)

: Phe: 0,97 (1)

: Lys: 1,45 (1)

Espectro de masas (FAB)

[M+H]^{+}: 1225

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(3) Síntesis de SART-3 "284-292" Asn-Tyr-Asn-Lys-Als-Leu-Gln-Gln-Leu (SEC ID Nº: 5)

De acuerdo con una forma similar a la descrita en el apartado (1) anterior, usando 100 mg de resina Fmoc-Leu-Alko, se acoplaron en orden Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH y Fmoc-Asn-OH y después se desprotegió el producto. El péptido bruto obtenido se disolvió en ácido acético acuoso y se inyectó en un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-A (30 \phi x 250 mm) que se había equilibrado previamente con TFA acuoso al 0,1%. La columna se lavó con TFA acuoso al 0,1% y después se realizó la elución a un caudal de 7 ml/min, al tiempo que se aumentaba la concentración de acetonitrilo hasta el 30% durante 300 minutos. El eluido se controló mediante A 220 nm. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron entre sí y se liofilizaron para obtener 25,0 mg de Asn-Tyr-Asn-Lys-Ala-Leu-Gln-Gln-Leu.

El péptido obtenido, Asn-Tyr-Asn-Lys-Ala-Leu-Gln-Gln-Leu, tenía un tiempo de retención de 19,0 minutos en un análisis usando un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-AM (4,6 \phi x 250 mm) eluida con un gradiente lineal de concentración de acetonitrilo del 12 al 42% que contenía TFA al 0,1%, y los resultados del análisis de aminoácidos y de la espectrometría de masas del producto concordaban con los valores teóricos.

Análisis de aminoácidos

Hidrólisis: fenol al 1%/ácido clorhídrico acuoso 6 N, 110ºC, 12 horas;

Método de análisis: el método de ninhidrina;

*Aminoácido de referencia; se indican entre paréntesis los valores teóricos:

: Asx: 1,87 (2)

: Glx: 2,03 (2)

\global\parskip0.950000\baselineskip

: Ala: 0,98 (1)

: \text{*}Leu: 2,00 (2)

: Tyr: 0,99 (1)

: Lys: 0,97(1)

Espectro de masas (FAB)

[M+H]^{+}: 1091

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(4) Síntesis de SART-3 "315-323" Ala-Tyr-lle-Asp-Phe-Glu-Met-Lys-lle (SEC ID Nº: 6)

De acuerdo con una forma similar a la descrita en el apartado (1) anterior, usando 100 mg de resina Fmoc-lIe-Alko (0,62 mmol/g, malla de 100-200), se acoplaron en orden Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc- Tyr(tBu)-OH y Fmoc-Ala-OH y después se desprotegió el producto. El péptido bruto obtenido se disolvió en ácido acético acuoso y se inyectó en un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-A (30 \phi x 250 mm) que se había equilibrado previamente con TFA acuoso al 0,1%. La columna se lavó con TFA acuoso al 0,1% y después se realizó la elución a un caudal de 7 ml/min, al tiempo que se aumentaba la concentración de acetonitrilo hasta el 40% durante 180 minutos. El eluido se controló mediante A 220 nm. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron entre sí y se liofilizaron para obtener 14,4 mg de Ala-Tyr-lle-Asp-Phe-Glu-Met-Lys-lle.

El péptido obtenido, Ala-Tyr-lle-Asp-Phe-Glu-Met-Lys-lle, tenía un tiempo de retención de 19,6 minutos en un análisis usando un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-AM (4,6 \phi x 250 mm) eluida con un gradiente lineal de concentración de acetonitrilo del 21 al 51% que contenía TFA al 0,1%, y los resultados del análisis de aminoácidos (no se detectaba Met) y de la espectrometría de masas del producto concordaban con los valores teóricos.

Análisis de aminoácidos

Hidrólisis: fenol al 1%/ácido clorhídrico acuoso 6 N, 110ºC, 12 horas;

Método de análisis: el método de ninhidrina;

*Aminoácido de referencia; se indican entre paréntesis los valores teóricos:

: Asx: 0,91 (1)

: Glx: 1,06 (1)

: Ala: 1,06 (1)

: Ile: 1,69 (2)

: Tyr: 0,81 (1)

: \text{*}Phe: 1,00 (1)

: Lys: 0,87(1)

Espectro de masas (FAB)

[M+H]^{+}: 1130

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(5) Síntesis de SART-3 "416-425" Asp-Tyr-Val-Glu-Ile-Trp-Gln-Ala-Tyr-Leu (SEC ID Nº: 7)

De acuerdo con una forma similar a la descrita en el apartado (1) anterior, usando 100 mg de resina Fmoc-Leu-Alko, se acoplaron en orden Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH y Fmoc-Asp(OtBu)-OH y después se desprotegió el producto. El péptido bruto obtenido se disolvió en ácido acético acuoso y se inyectó en un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-A (30 \phi x 250 mm) que se había equilibrado previamente con TFA acuoso al 0,1%. La columna se lavó con TFA acuoso al 0,1% y después se realizó la elución a un caudal de 7 ml/min, al tiempo que se aumentaba la concentración de acetonitrilo hasta el 35% durante 180 minutos. El eluido se controló mediante A 220 nm. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron entre sí y se liofilizaron para obtener 18,9 mg de Asp-Tyr-Val-Glu-Ile-Trp-Gln-Ala-Tyr-Leu.

\global\parskip1.000000\baselineskip

El péptido obtenido, Asp-Tyr-Val-Glu-Ile-Trp-Gln-Ala-Tyr-Leu, tenía un tiempo de retención de 20,5 minutos en un análisis usando un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-AM (4,6 \phi x 250 mm) eluida con un gradiente lineal de concentración de acetonitrilo del 25 al 55% que contenía TFA al 0,1%, y los resultados del análisis de aminoácidos (no se detectaba trp) y de la espectrometría de masas del producto concordaban con los valores teóricos.

Análisis de aminoácidos

Hidrólisis: fenol al 1%/ácido clorhídrico acuoso 6 N, 110ºC, 10 horas;

Método de análisis: el método de ninhidrina;

*Aminoácido de referencia; se indican entre paréntesis los valores teóricos:

: Asx: 1,00 (1)

: Glx: 2,09 (2)

: Ala: 1,04 (1)

: Val: 0,89 (1)

: Ile: 0,86 (1)

: \text{*}Leu: 1,00 (1)

: Tyr: 1,95 (2)

Espectro de masas (FAB)

[M+H]^{+}: 1300

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(6) Síntesis de SART-3 "426-434" Asp-Tyr-Leu-Arg-Arg-Arg-Val-Asp-Phe (SEC ID Nº: 8)

De acuerdo con una forma similar a la descrita en el apartado (1) anterior, usando 100 mg de resina Fmoc-Phe-Alko (0,72 mmol/mg, malla de 100-200), se acoplaron en orden Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH y Fmoc-Asp(OtBu)-OH y después se desprotegió el producto. El péptido bruto obtenido se disolvió en ácido acético acuoso y se inyectó en un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-A (30 \phi x 250 mm) que se había equilibrado previamente con TFA acuoso al 0,1%. La columna se lavó con TFA acuoso al 0,1% y después se realizó la elución a un caudal de 7 ml/min, al tiempo que se aumentaba la concentración de acetonitrilo hasta el 25% durante 240 minutos. El eluido se controló mediante A 220 nm. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron entre sí y se liofilizaron para obtener 34,0 mg de Asp-Tyr-Leu-Arg-Arg-Arg-Val-Asp-Phe.

El péptido obtenido, Asp-Tyr-Leu-Arg-Arg-Arg-Val-Asp-Phe, tenía un tiempo de retención de 20,1 minutos en un análisis usando un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-AM (4,6 \phi x 250 mm) eluida con un gradiente lineal de concentración de acetonitrilo del 12 al 42% que contenía TFA al 0,1% y los resultados del análisis de aminoácidos y de la espectrometría de masas del producto concordaban con los valores teóricos.

Análisis de aminoácidos

Hidrólisis: fenol al 1%/ácido clorhídrico acuoso 6 N, 110ºC, 12 horas; Método de análisis: el método de ninhidrina;

*Aminoácido de referencia; se indican entre paréntesis los valores teóricos:

: Asx: 1,90 (2)

: Val: 0,95 (1)

: \text{*}Leu: 1,00 (1)

: Tyr: 1,00 (1)

: Phe: 0,99 (1)

: Arg: 2,93 (3)

Espectro de masas (FAB)

[M+H]^{+}: 1239

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(7) Síntesis de SART-3 "448-456" Ala-Phe-Thr-Arg-Ala-Leu-Glu-Tyr-Leu (SEC ID Nº: 9)

De acuerdo con una forma similar a la descrita en el apartado (1) anterior, usando 100 mg de resina Fmoc-Leu-Alko, se acoplaron en orden Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH y Fmoc-Ala-OH y después se desprotegió el producto. El péptido bruto obtenido se disolvió en ácido acético acuoso y se inyectó en un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-A (30 \phi x 250 mm) que se había equilibrado previamente con TFA acuoso al 0,1%. La columna se lavó con TFA acuoso al 0,1% y después se realizó la elución a un caudal de 7 ml/min, al tiempo que se aumentaba la concentración de acetonitrilo hasta el 30% durante 240 minutos. El eluido se controló mediante A 220 nm. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron entre sí y se liofilizaron para obtener 22,8 mg de Ala-Phe-Thr-Arg-Ala-Leu-Glu-Tyr-Leu.

El péptido obtenido, Ala-Phe-Thr-Arg-Ala-Leu-Glu-Tyr-Leu, tenía un tiempo de retención de 18,1 minutos en un análisis usando un material de envasado de fase inversa, una columna YMC-PACK ODS-AM (4,6 \phi x 250 mm) eluida con un gradiente lineal de concentración de acetonitrilo del 20 al 50% que contenía TFA al 0,1% y los resultados del análisis de aminoácidos y de la espectrometría de masas del producto concordaban con los valores teóricos.

Análisis de aminoácidos

Hidrólisis: fenol al 1%/ácido clorhídrico acuoso 6 N, 110ºC, 12 horas;

Método de análisis: el método de ninhidrina;

*Aminoácido de referencia; se indican entre paréntesis los valores teóricos:

: Thr: 0,91 (1)

: Glx: 1,03 (1)

: Ala: 1,91 (2)

: \text{*}Leu: 2,00 (2)

: Tyr: 1,00 (1)

: Phe: 0,97 (1)

: Arg: 0,97 (1)

Espectro de masas (FAB)

[M+H]^{+}: 1083

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Ejemplo 6

Inducción de CTL a partir de linfocitos de sangre periférica por péptidos antigénicos tumorales y derivados de los mismos

Los péptidos "109-118" (SEC ID Nº: 3) y "315-323" (SEC ID Nº: 6) sintetizados como se muestra en el Ejemplo 5 se investigaron para determinar su capacidad para inducir CTL específicos de antígeno a partir de linfocitos de sangre periférica.

Usando el método de Ficoll, se separaron linfocitos a partir de sangre periférica de donantes sanos que eran heterocigotos para A24 en el locus de HLA-A (denominados HD1 y HD2, respectivamente). Los linfocitos se colocaron en pocillos de una placa de 24 pocillos a 2 x 10^{6} células/pocillo y se cultivaron en el medio de linfocitos. Los péptidos antigénicos tumorales anteriores se añadieron al medio de cultivo a 10 \muM para estimular los linfocitos de sangre periférica. Después de una semana, se añadió el péptido antigénico tumoral anterior para alcanzar 10 \muM junto con aproximadamente 2 x 10^{5} células de linfocitos de sangre periférica irradiados con rayos X (50 Gy) para la segunda estimulación. Después de una semana adicional, se realizó la tercera estimulación de una forma similar. Los linfocitos cultivados se recogieron una semana después de la tercera estimulación. Usando como células diana (1 x 10^{4} células) MT-2, que es una línea de células T de leucemia positivas para HLA-A2402 que expresa SART-3, y RPMI8402, que es una línea de células T de leucemia negativas para HLA-A2402 que expresa SART-3, se midió la cantidad de IFN-\gamma en el medio de cultivo producido por los linfocitos anteriores (8 x 10^{4} células) en respuesta a las células diana de acuerdo con un método de ELISA similar al del Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

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TABLA 6

7

Los linfocitos de sangre periférica estimulados con los péptidos "109-118" y "315-323" reaccionaban con MT-2 (positivas para HLA-A24) pero no con RPMI8402 (negativas para HLA-A24) indicando que se indujeron CTL específicos para péptido antigénico tumoral de una forma restringida a HLA-A24.

Asimismo, se realizó un experimento similar usando células COS-7 (ATCC Nº CRL 1651) o células VA-13 (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research) en las que se había introducido un plásmido de expresión para ADNc de HLA-A24 y que se habían estimulado con los péptidos anteriores, en lugar de MT-2 usadas en el presente experimento (J. Exp. Med., 187: 277, 1998).

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Ejemplo 7

Establecimiento de una línea celular de linfocitos T citotóxicos (CTL) a partir de linfocitos infiltrantes en tumores (TIL) derivados de cáncer de colon

Se cultivaron TIL a partir de una muestra quirúrgica tomada de un paciente con cáncer de colon sigmoideo (positivo para HLA-A0207) en una placa de 24 pocillos en un medio de cultivo que consistía en RPMI al 45%, AIM-V al 45% (GIBCO BRL) y FCS al 10% suplementado con interleuquina-2 100 U/ml y NEAA 0,1 mM (GIBCO BRL) (en lo sucesivo denominado medio de linfocitos). Durante los primeros dos días de cultivo, se añadió un anticuerpo anti-CD3 NUTT3 (Nichirei Corporation) al medio de cultivo a 1 \mug/ml. El cultivo se continuó durante más de 30 días y se estableció una línea de CTL que estaba restringida a HLA-A2, denominándose la línea de CTL OK-CTL. Los OK-CTL se depositaron en The Nacional Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón) (denominación de microorganismo: OK-CTL; fecha de depósito: 3 de agosto de 1999; número de depósito: FERM BP-6818).

De acuerdo con la descripción en Nakao et al., Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995) se prepararon plásmidos recombinantes a partir de células SW620 (ATCC Nº CCL-227) en las que se incorporaba ADNc para HLA-A0201 (Nº de Acceso de GenBank M84379) en un vector de expresión pCR3 (INVITROGEN). Usando, como células diana, transfectantes que se habían preparado por transfección doble de una línea celular derivada de riñón de mono verde africano, COS-7 (ATCC Nº CRL1651) (1 x 10^{4} células) con clon K de plásmido recombinante que incorporaba el ADNc del gen de SART-3 y con un plásmido recombinante que incorporaba ADNc de HLA-A0201 usando un método de Lipofectina similar al del Ejemplo 1, se midió la cantidad de IFN-\gamma producido por 5 x 10^{4} OK-CTL en respuesta a las células diana mediante ELISA. Como grupos de control, se diseñó un grupo sin tratamiento en el que no se transfectó plásmido y un grupo que se transfectó doblemente con clon K de plásmido recombinante y con el plásmido recombinante que incorporaba ADNc de HLA-A2402. El resultado se muestra en la Tabla 7.

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TABLA 7

8

Los OK-CTL reaccionaban más intensamente con las células diana doblemente transfectadas con clon K de plásmido recombinante que incorporaba el ADNc del gen de SART-3 y con el plásmido recombinante que incorporaba ADNc de HLA-A0201 y producían más IFN-\gamma en comparación con otros grupos de células diana. Este resultado indica que los péptidos antigénicos de la proteína antigénica tumoral SART-3 están presentes en HLA-A0201 y que los OK-CTL los reconocen, sugiriendo que SART-3 contiene péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A2.

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Ejemplo 8

Identificación de péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A2

En base a la secuencia de aminoácidos de la proteína antigénica tumoral SART-3 que se muestra en la SEC ID Nº: 1, se buscaron en Internet secuencias peptídicas que consistían en nueve o diez restos aminoacídicos que se esperaba que fueran capaces de unirse a HLA-A0201 usando un programa informativo de NIH BIMAS (http://bimas.dcrt.hin.gov/
molbio/hla_bind/). Los ejemplos de los péptidos buscados se muestran en las SEC ID Nº: 25-52. Estos péptidos se sintetizaron en Biologica Co. mediante el método Fmoc.

Después, 1 x 10^{4} células T2, una línea celular de hibridoma T-B que es positiva para HLA-A0201 y que carece de la capacidad para presentar péptidos endógenos se estimularon con cada uno de los péptidos que se esperaba que fueran capaces de unirse a HLA-A0201, que se habían sintetizado previamente a 10 \muM durante dos horas. Las células se cultivaron después con 6 x 10^{4} OK-CTL durante 18 horas y se determinó la cantidad de IFN-\gamma producido por OK-CTL en el sobrenadante de cultivo mediante ELISA. Los resultados de esta determinación se muestran en la Tabla 8, que se realizó sobre cinco péptidos, es decir, un péptido "152-160" que comprende la secuencia desde la posición 152 hasta la posición 160 (SEC ID Nº: 25), un péptido "249-257" que comprende la secuencia desde la posición 249 hasta la posición 257 (SEC ID Nº: 26), un péptido "302-310" que comprende la secuencia desde la posición 302 hasta la posición 310 (SEC ID Nº: 27), un péptido "309-317" que comprende la secuencia desde la posición 309 hasta la posición 317 (SEC ID Nº: 28) y un péptido "386-394" que comprende la secuencia desde la posición 386 hasta la posición 394 (SEC ID Nº: 29) en la secuencia de aminoácidos de la proteína antigénica tumoral SART-3.

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TABLA 8

9

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Los KE-4CTL reaccionaban más intensamente con células estimuladas con los péptidos y producían más IFN-\gamma en comparación con células estimuladas sin péptido. El resultado indica que los cinco péptidos funcionan como péptidos antigénicos tumorales restringidos a HLA-A2.

Asimismo, se realizó un experimento similar usando células COS-7 (ATCC Nº CRL1651) o células VA-13 (RIKEN CELL BANK, The Institute of Physical and Chemical Research) en las que se había introducido un plásmido de expresión para ADNc de HLA-A0201 en lugar de las células T2 usadas en el presente experimento (J. Exp. Med., 187: 277, 1998).

Texto libre de la lista de secuencias

En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 53, el segundo aminoácido es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano y el décimo aminoácido es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.

En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 54, el segundo aminoácido es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano y el décimo aminoácido es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.

En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 55, el segundo aminoácido es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano y el noveno aminoácido es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.

En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 56, el segundo aminoácido es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano y el noveno aminoácido es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.

En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 57, el segundo aminoácido es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano y el décimo aminoácido es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.

En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 58, el segundo aminoácido es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano y el noveno aminoácido es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.

En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 59, el segundo aminoácido es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano y el noveno aminoácido es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina. En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 60, el segundo aminoácido es leucina, metionina, valina, isoleucina o glutamina y el noveno aminoácido es valina o leucina.

En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 61, el segundo aminoácido es leucina, metionina, valina, isoleucina o glutamina y el noveno aminoácido es valina o leucina.

En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 62, el segundo aminoácido es leucina, metionina, valina, isoleucina o glutamina y el noveno aminoácido es valina o leucina.

En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 63, el segundo aminoácido es leucina, metionina, valina, isoleucina o glutamina y el noveno aminoácido es valina o leucina.

En la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 64, el segundo aminoácido es leucina, metionina, valina, isoleucina o glutamina y el noveno aminoácido es valina o leucina.

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención, puede proporcionarse una nueva proteína antigénica tumoral y un gen para la misma, péptidos antigénicos tumorales derivados de dicha proteína antigénica tumoral y derivados de los mismos, así como medicamentos, agentes profilácticos o de diagnóstico para tumores usando dicha proteína antigénica tumoral, gen, péptidos antigénicos tumorales o derivados de los mismos in vivo o in vitro.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> ITOH, Kyogo; Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited

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<120> Una nueva proteína antigénica tumoral SART-3 y sus péptidos antigénicos tumorales

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<130> F 1308 EP

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<150> Japón: 98-242660

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<151> 28.08.98

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<160> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 963

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,9cm

11

\hskip0,8cm

12

\hskip0,8cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3798

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

14

\hskip0,7cm

15

\hskip0,7cm

16

\hskip0,7cm

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,6cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,6cm

24

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

38

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,6cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

41

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

42

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

43

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

44

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

45

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

46

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,6cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,6cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Tyr, Met o Trp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Leu, Ile, Trp o Met.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Tyr, Met o Trp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Leu, Ile, Trp o Met.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Tyr, Met o Trp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Leu, Ile, Trp o Met.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Tyr, Met o Trp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Leu, Ile, Trp o Met.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,6cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Tyr, Met o Trp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Leu, Ile, Trp o Met.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Tyr, Met o Trp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Leu, Ile, Trp o Met.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Tyr, Met o Trp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe, Leu, Ile, Trp o Met.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu, Met, Val, Ile o Gln.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Val o Leu.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu, Met, Val, Ile o Gln.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Val o Leu.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu, Met, Val, Ile o Gln.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Val o Leu.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu, Met, Val, Ile o Gln.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Val o Leu.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu, Met, Val, Ile o Gln.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Val o Leu.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

79

Claims

1. Un ADN que codifica una proteína que da origen a péptidos antigénicos tumorales que son capaces de unirse a un antígeno HLA y ser reconocidos por linfocitos T citotóxicos, seleccionado del siguiente grupo que consiste en:

(c): un ADN que hibrida en condiciones rigurosas con un ADN de (b),

con la condición de que la secuencia codificante de KIA A0156, como se describe en la entrada D63879 de Genbank como GI número 961449, se excluya de (a) y (c).

2. Un plásmido de expresión que contiene el ADN de la reivindicación 1.

3. Una célula hospedadora transformada que comprende el plásmido de expresión de la reivindicación 2.

4. Un proceso para producir una proteína recombinante, que comprende cultivar la célula hospedadora transformada de la reivindicación 3 y recuperar la proteína recombinante expresada.

5. Una proteína antigénica tumoral que está codificada por el ADN de la reivindicación 1 o que se produce por el proceso de la reivindicación 4, con la condición de que se excluya la proteína codificada por la secuencia de KIA A0156, como se describe en la entrada D63879 de GenBank como Gl número 961449.

6. Una composición farmacéutica que comprende como un ingrediente activo el ADN de la reivindicación 1 o la proteína de la reivindicación 5.

7. Una composición farmacéutica útil para tratar o prevenir tumores, que comprende como un ingrediente activo el ADN de la reivindicación 1 o la proteína de la reivindicación 5.

8. Un péptido antigénico tumoral que es un péptido parcial de una proteína antigénica tumoral que está codificada por el ADN de la reivindicación 1 o que se produce por el proceso de la reivindicación 4, y que es capaz de unirse a un antígeno HLA y ser reconocido por linfocitos T citotóxicos.

9. El péptido antigénico tumoral de la reivindicación 8, en el que el antígeno HLA es HLA-A24 o HLA-A2.

10. El péptido antigénico tumoral de la reivindicación 9, que comprende una secuencia seleccionada de toda o parte de una secuencia aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-52.

11. El péptido antigénico tumoral de la reivindicación 10, que comprende una secuencia seleccionada de toda o parte de una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-9 y 25-29.

12. Un derivado de péptido antigénico tumoral, que comprende una secuencia seleccionada de una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-52, en la que el resto aminoacídico en posición 2 y/o el extremo C-terminal en la secuencia aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-52, se sustituye por otro resto aminoacídico, y que es capaz de unirse a un antígeno HLA y ser reconocido por linfocitos T citotóxi-
cos.

13. El derivado de péptido antigénico tumoral de la reivindicación 12, que comprende una secuencia seleccionada de una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-52, en la que el resto aminoacídico en posición 2 y/o el extremo C-terminal en la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 3-9 y 25-29, se sustituye por otro resto aminoacídico.

14. El derivado de péptido antigénico tumoral de la reivindicación 12, que comprende

15. El péptido antigénico tumoral derivado de la reivindicación 13, que comprende una secuencia seleccionada de la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID Nº: 53-64.

16. Un ADN recombinante que comprende al menos uno de los ADN que codifican

(a): los péptidos antigénicos tumorales de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, o

(b): los derivados de péptido antigénico tumoral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, con la condición de que se excluya la secuencia codificante de KIA A0156 como se describe en la entrada \underline{D63879} de Genbank como GI número 961449.

17. Un polipéptido recombinante que puede obtenerse por expresión del ADN recombinante de la reivindicación 16, con la condición de que se excluya la proteína codificada por la secuencia de KIA A0156 como se describe en la entrada D63879 de GenBank como Gl número 961449.

18. Una composición farmacéutica útil para tratar o prevenir tumores, que comprende como un ingrediente activo al menos una de las sustancias seleccionadas del péptido antigénico tumoral de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, el derivado de péptido antigénico tumoral de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, el ADN recombinante de la reivindicación 16 o el polipéptido recombinante de la reivindicación 17.

19. Un anticuerpo que se une específicamente a una cualquiera de las proteínas antigénicas tumorales de la reivindicación 5, el péptido antigénico tumoral de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 o el derivado de péptido antigénico tumoral de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.

20. Una célula presentadora de antígenos aislada en la que un complejo entre un antígeno HLA y

(a): el péptido antigénico tumoral de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11; o

(b): el derivado de péptido antigénico tumoral de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, se presenta sobre la superficie de una célula que tiene capacidad de presentación de antígenos.

21. Una célula presentadora de antígenos aislada sobre la que se presenta un complejo entre un antígeno HLA y un péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo, pudiendo obtenerse dicha célula presentadora de antígenos permitiendo que una célula que tiene capacidad de presentación de antígenos aislada de un paciente con un tumor incorpore el ADN de la reivindicación 1, la proteína antigénica tumoral de la reivindicación 5, el ADN recombinante de la reivindicación 16 o el polipéptido recombinante de la reivindicación 17.

22. Un proceso para producir un linfocito T citotóxico que reconozca específicamente un complejo entre un antígeno HLA y

(b): el derivado de péptido antigénico tumoral de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15,

que comprende estimular linfocitos de sangre periférica en una muestra de un paciente con dicho péptido antigénico tumoral o un derivado del mismo.

23. Un proceso para producir un linfocito T citotóxico que reconozca específicamente un complejo entre un antígeno HLA y el péptido antigénico tumoral o derivado del mismo, que comprende estimular linfocitos de sangre periférica en una muestra de un paciente con la célula presentadora de antígenos aislada de la reivindicación 20 ó 21.

24. Una composición farmacéutica útil para tratar tumores, que comprende la célula presentadora de antígenos de la reivindicación 20 ó 21.

25. Un agente de diagnóstico útil para tumores, que comprende la proteína de la reivindicación 5, el péptido antigénico tumoral de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, el derivado de péptido antigénico tumoral derivado de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 o el polipéptido recombinante de la reivindicación 17.

26. Un linfocito T citotóxico OK-CTL, cuyo número de depósito es FERM BP-6818.

27. Un método para identificar proteínas antigénicas tumorales o péptidos antigénicos tumorales, que comprende usar OK-CTL de la reivindicación 26.