KR20010074895A - 신규 종양 항원 단백질 ｓａｒｔ-3 및 그의 종양 항원펩티드 - Google Patents

신규 종양 항원 단백질 ｓａｒｔ-3 및 그의 종양 항원펩티드 Download PDF

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Abstract

신규 종양 항원 단백질; 그의 유전자; 종양 항원 단백질 유래의 종양 항원 펩티드; 이들 물질의 유도체; 및 이들 물질을 생체내 또는 생체외로 이용한 종양의 치료제, 예방제, 또는 진단제.

Description

신규 종양 항원 단백질 ＳＡＲＴ-3 및 그의 종양 항원 펩티드{NOVEL TUMOR ANTIGEN PROTEIN SART-3 AND TUMOR ANTIGEN PEPTIDE THEREOF}
생체에 의한 종양의 제거에는 면역계, 특히 T 세포가 중요한 역할을 하고 있음이 알려져 있다. 실제, 인간 종양 국소에는 종양세포에 대해 세포독성 효과를 나타내는 임파구의 침윤이 관찰되고 (Arch. Surg., 126:200, 1990), 흑색종(melanomas)으로부터는 자가 종양세포를 인식하는 세포독성 T 세포 (CTL) 가 비교적 용이하게 분리되어 있다 (예를 들면,Immunol. Today, 8:385, 1987,J.Immunol., 138:989, 1987,Int.J.Cancer, 52:52, 1992 등). 또, 상기 CTL 의 이식에 의한 흑색종 치료의 임상결과로부터도 종양 제거에서의 T 세포의 중요성이 시사되어 있다 (J. Natl. Cancer. Inst., 86:1159, 1994).
자신의 종양세포를 공격하는 CTL 이 표적으로 하는 분자에 대해서는 오랫 동안 불명확하였지만, 최근 면역학 또는 분자생물학의 진보에 의해 점차 명확해졌다. 구체적으로, CTL 은 T 세포 수용체 (TCRs) 를 사용하여 종양항원 펩티드라고 불리우는 펩티드와 주요 조직적합 유전자 복합체 클래스 Ⅰ 항원 (MHC 클래스 Ⅰ 항원, 사람의 경우는 HLA 항원이라 불리움) 의 복합체를 인식함으로써, 자신의 종양세포를 공격하고 있음이 명확해졌다.
종양항원 펩티드는 종양에 특이적인 단백질, 즉 종양항원 단백질이 세포내에서 합성된 후, 프로테아솜에 의해 세포내에서 분해됨으로써 생성된다. 이렇게 생성된 종양항원 펩티드는 소포체내에서 MHC 클래스 Ⅰ 항원 (HLA 항원) 과 결합하여 복합체를 형성하고, 이 복합체는세포표면으로 운반되어 항원으로서 제시된다.
이 항원으로서 제시된 복합체를 종양특이적인 CTL 이 인식하고, 세포독성 작용이나 림포카인의 생산을 통하여 항종양효과를 나타낸다. 이와 같은 일련의 작용의 해명에 따라, 종양항원 단백질 또는 종양항원 펩티드를 소위 암백신으로 이용함으로써, 종양환자의 체내의 종양특이적 CTL 을 증강시키는 치료법이 가능해졌다.
종양항원 단백질로서는, 1991 년에 T. Boon 등이 처음 MAGE 로 명명한 단백질을 인간 흑색종 세포로부터 동정하였다 (Science, 254:1643, 1991). 그 후, 몇개의 종양항원 단백질이 주로 흑색종 세포로부터 동정되어 있다. 동정된 흑색종 항원의 예로서는, 멜라노사이트 조직 특이적 단백질인 gp 100 (J. Exp. Med., 179:1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994), 티로시나아제 (J.Exp.Med., 178:489, 1993) 등의 멜라노솜 단백질; 흑색종 뿐만 아니라 각종 암세포와 정상 고환 세포에 발현하는 MAGE 관련 단백질군(J. Exp. Med.,179:921, 1994); 종양특이적인 아미노산 변이를 지닌 β-카테닌 (J. Exp. Med., 183:1185, 1996); CDK4 (Science, 269:1281, 1995) 등이 있다. 또, 흑색종 이외의 종양항원 단백질로서는, HER 2-neu (J. Exp. Med., 181:2109, 1995) 및 p 53 (변이형) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:14704, 1996) 과 같은 암유전자 산물; CEA (J. Natl. Cancer. Inst., 87:982, 1995) 및 PSA (J. Natl. Cancer. Inst., 89:293, 1997) 등의 종양마커; 및 HPV (J. Immunol., 154:5934, 1995), EBV (Int. Immunol., 7:653, 1995) 등의 바이러스 단백질 등이 동정되어 있다. 이물질들에 대해서는 총설 (예를 들면,Immunol. Today, 18:267, 1997;J. Exp. Med., 183:725, 1996; 및Curr. Opin. Immunol., 8:628, 1996 등) 에 상세히 기재되어 있다.
종양항원 단밸질이나 종양항원 펩티드를 종양의 치료나 진단에 응용하기 위해서는, 흑색종에 비해 발생빈도가 압도적으로 높은, 식도암 및 폐암과 같은 편형상피암에 폭넓게 적응 가능한 종양항원의 동정이 중요하다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 식도암 유래의 편평상피암세포에서 종양항원 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝을 수행하였고, 흑색종 이외에 HLA 타입이 HLA-A24 또는 HLA-A26 인 HLA 항원에 결합하여 제시되는 몇가지 종양 항원 펩티드를 최초로 동정하였다 (J. Exp. Med., 187:277, 1998; 국제특허출원 WO 97/46676).
이러한 종양 항원 펩티드가 임상적으로 실제로 사용되는 경우, 하나의 펩티드를 사용하는 것 보다 둘 이상의 상이한 종양 항원 펩티드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 즉, 모든 암세포가 통상 동일한 종양 항원을 발현시키지 않는다는사실 및 둘 이상의 상이한 종양 항원 펩티드가 단일 암세포상에 제시된다는 사실을 고려하면, 둘 이상의 상이한 종양 항원 펩티드를 사용하는 치료가 더욱 효과적이라 여겨진다. 사실, 흑색종의 경우, 종양 항원으로부터 유래되는 단일 펩티드가 적당한 효과를 나타내지 못하였기 때문에, 둘 이상의 펩티드를 함유하는 칵테일 제형의 개발이 시도되어왔다 (Int. J. Cancer, 66:162, 1996; 및Int. J. Cancer, 67:54, 1996). 이와같은 상황하에서, 발생빈도가 높은 편평상피암에 폭넓게 응용할 수 있는 신규 종양 항원 단백질 및 종양 항원 펩티드를 동정하는 것이 요구되고 있다.
본 발명은 신규 종양 항원 단백질, 및 그의 종양 항원 펩티드에 관한 것이다. 더욱 특히, 신규 종양 항원 단백질 및 그의 유전자, 종양 항원 단백질 유래의 종양 항원 펩티드, 및 이들 물질의 유도체 뿐만 아니라, 상기 종양 항원 단백질, 유전자, 종양 항원 펩티드, 또는 그의 유도체를 생체내 또는 생체외로 이용한 종양의 치료제, 예방제, 또는 진단제에 관한 것이다.
본 발명은 신규 종양 항원 단백질 및 종양 항원 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 신규 종양 항원 단백질 및 그의 유전자, 종양 항원 단백질로부터 유래되는 종양 항원 펩티드, 및 이들 물질의 유도체 뿐만 아니라, 상기 종양 항원 단백질, 유전자, 종양 항원 펩티드, 또는 그의 유도체를 생체내 또는 생체외로 이용한 종양의 치료제, 예방제, 또는 진단제을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 종양 항원 펩티드는 일본인의 약 60 % 가 보유하고 있는 HLA 항원인 HLA-A24 에 결합하여 제시되는 종양항원 펩티드 및 일본인과 백인의 약 40 % 가 보유하고 있는 HLA-A2 에 결합하여 제시되는 종양항원 펩티드를 포함하며, 그러므로 많은 환자에 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 종양 항원 펩티드는 사람의 암에서 가장 많이 관찰되는 편형상피암 등에 응용할 수있는 것이므로, 신규 항종양제로서의 유용성이 기대된다. 편평상피암 중 식도암 또는 폐암에서의 평편상피암은,현재의 화학요법이나 방사선요법에 비교적 내성을 나타냄이 알려져 있다. 그 점으로부터도, 본 발명의 종양항원 펩티드의 개발이 기대된다.
신규 종양 항원 단백질 및 종양 항원 펩티드를 수득하기 위해, 본 발명자들은 하기의 시도를 수행하였다.
우선, 본 발명자들은 식도암 세포주 KE-4(FERM BP-5955) 및 이중 전달감염된 (transfected) 섬유아세포 세포주 VA13 (리켄 세포 은행, 이화학 연구소) 로부터의 cDNA 라이브러리를, 라이브러리의 재조합 플라스미드 및 HLA-A2402(HLA-A24의 한 타입)의 cDNA 를 포함하는 재조합 플라스미드를 사용하여 제조하였다. 생성된 전달감염체(transfectants)를 KE-4에 대응하는 KE-4CTL(FERM BP-5954)로 처리하고, 생성된 IFN-γ의 양을 측정하여 KE-4CTL이 활성화되었는지의 여부를 결정하였다. 상기 반복 수행된 확장 스크리닝의 결과로서, 본 발명자들은 스크리닝이 신규의 유용한 종양 항원 단백질의 수득을 초래하는 지에 대해 확신하지 않았지만, 종양 항원 단백질을 코딩하는 하나의 유전자를 클로닝하는 데에 결국 성공하였다. 본 발명자들은 상기 유전자에 의해 코딩되는 종양 항원 단백질을 "SART-3"로 명명하였다. 공지 서열과 SART-3의 염기서열을 비교하여 상기 SART-3의 염기서열이 기능이 설명되지 않은 단일 염기의 면에서 유전자은행 데이타베이스에서 승인번호 D63879로 등록된 KIAA0156 유전자와 상이한 신규 염기 서열임을 밝혀내었다.
또한, 본 발명자들은 HLA-A24 및 HLA-A2에 결합하여 제시되는 SART-3의 아미노산 서열에 존재하는 종양 항원 펩티드 부분을 동정하였고, 상기 펩티드가 종양 항원 펩티드로서 활성을 가짐을 설명하였다.
본 발명은 상기 발견을 기초로하여 완성되었다.
그러므로, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
(1) 서열번호:1에 나타낸 아미노산 서열로 구성되는 단백질, 또는 서열번호:1의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 구성되는 단백질 변이형을 코딩하는 DNA, 단, 단백질 및 단백질 변이형이 HLA 항원에 결합할 수 있고, 세포독성 T 임파구에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드를 발생시킨다;
(2) 서열번호:2 에 나타낸 염기서열로 구성되는 DNA, 또는 엄격한 조건하에 상기 DNA에 잡종화(hybridize)되는 DNA 변이형, 단, DNA 또는 DNA 변이형에 의해 생성되고 발현되는 단백질은 HLA 항원에 결합할 수 있고, 세포독성 T 임파구에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드를 발생시킨다;
(3) 상기 (1) 또는 (2)의 DNA를 포함하는 발현 플라스미드;
(4) 상기 (3)의 발현 플라스미드로 형질전환된 형질전환체;
(5) 상기 (4)의 형질전환체를 배양하고, 발현된 재조합 단백질을 회수하는 것을 포함하는 재조합 단백질의 제조 방법;
(6) 상기 (1) 또는 (2)의 DNA에 의해 코딩되거나, 또는 상기 (5) 의 방법에 의해 제조되는 종양 항원 단백질;
(7) 유효성분으로서, 상기 (1) 또는 (2)의 DNA, 또는 상기 (6)의 단백질을 함유하는 약제 조성물;
(8) 유효성분으로서, 상기 (1) 또는 (2)의 DNA, 또는 상기 (6)의 단백질을함유하는 종양 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물;
(9) 상기 (6)의 단백질 유래의 펩티드로서, HLA 항원에 결합할 수 있고, 세포독성 T 임파구에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드, 또는 동일한 기능성을 갖는 그의 유도체;
(10) HLA 항원이 HLA-A24 또는 HLA-A2인 상기 (9)의 종양 항원 펩티드, 또는 동일한 기능성을 갖는 그의 유도체;
(11) 서열번호:3 내지 52 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 상기 (10)의 종양 항원 펩티드, 또는 동일한 기능성을 갖는 그의 유도체;
(12) 서열번호: 3 내지 9 및 25 내지 29 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 상기 (11)의 종양 항원 펩티드, 또는 동일한 기능성을 갖는 그의 유도체;
(13) 서열번호: 3 내지 52 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 2 위치 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 또다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 상기 (11)의 종양 항원 펩티드 유도체;
(14) 서열번호: 3 내지 9 및 25 내지 29 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 2 위치 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 또다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 상기 (13)의 종양 항원 펩티드 유도체;
(15) 서열번호: 3 내지 24 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 2 위치의 아미노산 잔기가 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 상기 (13)의 종양 항원 펩티드 유도체;
(16) 서열번호: 25 내지 52 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 2 위치의 아미노산 잔기가 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 또는 글루타민으로 치환되고, 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 발린 또는 류신으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 상기 (13)의 종양 항원 펩티드 유도체;
(17) 서열번호: 53 내지 64 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 상기 (14)의 종양 항원 펩티드 유도체;
(18) 상기 (9) 내지 (17) 중 어느 하나에 따른 종양 항원 펩티드 및 그의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 유효성분으로서 함유하는 종양 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물;
(19) 상기 (9) 내지 (17) 중 어느 하나에 따른 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체를 코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하는 재조합 DNA;
(20) 상기 (19)의 재조합 DNA를 발현시킴으로써 수득될 수 있는 재조합 폴리펩티드;
(21) 상기 (19)의 재조합 DNA 또는 상기 (20)의 재조합 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 종양 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물;
(22) 상기 (6)의 종양 항원 단백질, 및 상기 (9) 내지 (17)중 어느 하나에 따른 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 중의 어느 하나에 특이적으로 결합하는 항체;
(23) 종양환자로부터 단리된 항원-제시능을 갖는 세포의 표면에, HLA 항원 및 상기 (9) 내지 (17) 중의 어느 하나에 따른 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 간의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포;
(24) HLA 항원 및 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 간의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포, 상기 항원-제시 세포는 종양환자로부터 단리된 항원-제시능을 갖는 세포를 상기 (1) 또는 (2)의 DNA, 상기 (6)의 종양 항원 단백질, 상기 (19)의 재조합 DNA, 또는 상기 (20)의 재조합 폴리펩티드로 이입시킴으로써 수득될 수 있다;
(25) 상기 (23) 또는 (24)의 항원-제시 세포를 유효성분으로서 함유하는 종양 치료를 위한 약제 조성물;
(26) HLA 항원 및 상기 (9) 내지 (17) 중의 어느 하나에 따른 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 임파구;
(27) 상기 (23) 또는 (24)의 항원-제시 세포 상에 제시되는, HLA 항원 및 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 임파구;
(28) 상기 (26) 또는 (27)의 세포독성 T 임파구를 유효성분으로서 함유하는종양 치료를 위한 약제 조성물;
(29) 상기 (9) 내지 (17) 중 어느 하나에 따른 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체, 상기 (6)의 단백질, 또는 상기 (20)의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 종양 진단제;
(30) 기탁번호 FERM-6818인 세포독성 T 임파구 OK-CTL; 및
(31) 상기 (30)의 OK-CTL를 사용하는 것을 포함하는 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드를 동정하는 방법.
본 발명의 DNA는 신규 종양 항원 단백질을 코딩하고, DNA의 구체예는 서열번호:1에 나타낸 아미노산 서열로 구성되는 SART-3 단백질, 또는 SART-3의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 구성되는 단백질 변이형을 코딩하는 DNA (단, 단백질 및 단백질 변이형은 HLA 항원에 결합할 수 있고, 세포독성 T 임파구에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드를 발생시키고); 또는 서열번호:2에 나타낸 염기서열로 구성되는 SART-3의 DNA, 또는 엄격한 조건하에 SART-3의 DNA에 잡종화되는 DNA 변이형을 포함하고, 단, 상기 DNA 및 DNA 변이형에 의해 생성되고 발현되는 단백질은 HLA 항원에 결합할 수 있고, 세포독성 T 임파구에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드를 발생시킨다. 본 발명의 DNA는 또한 상기 성립된 순서에 따라 하기에 기재된다.
1) SART-3을 코딩하는 DNA
상기 기재된 DNA 중에서 "서열번호:1에 나타낸 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 코딩하는 DNA" 및 "서열번호:2에 나타낸 염기서열로 구성되는 DNA"는 본 발명의 종양 항원 단백질 SART-3을 코딩하는 DNA를 언급한다. 이 DNA는 하기 실시예에 기재된 방법에 따라 클로닝될 수 있다. 또한, 상기 DNA의 클로닝은 예를 들면, 잡종화를 위한 프로브 또는 PCR 프라이머로서 유전자은행 승인번호 D63879 로 개시된 또는 본 명세서에서 서열번호:2에 나타낸 염기서열의 적당한 부분을 사용하여 식도암 세포주 KE-4(FERM BP-5955)와 같은 세포주로부터 유래되는 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 분자 클로닝 (Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 따르면 상기 클로닝을 달성할 수 있는 당업자에게 용이할 것이다.
2) SART-3 의 변형 단백질 또는 그의 대립 변이형을 코딩하는 DNA
상기 기재된 DNA 중에서 "SART-3의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 구성되는 단백질 변이형을 코딩하는 DNA"는 인공적으로 제조된 소위 변형 단백질, 또는 생체내 존재하는 대립 변이형과 같은 단백질을 코딩하는 DNA을 의미한다. 상기 단백질 변이형을 코딩하는 DNA는 부위-대응 돌연변이유발 및 PCR 기술(Molecular cloning:A Laboratory Manual 2nd Edt. vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)과 같은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 치환, 결실 및/또는 부가되는 아미노산 잔기의 수는 상기 나타낸 바와 같이 부위-대응 돌연변이유발과 같은 공지의 방법에 따라 치환, 결실 및/또는 부가를 가능하게 하는 범위내이다.
3) 엄격한 조건하에 SART-3의 DNA에 잡종화되는 DNA
상기 기재된 DNA 중에서 "엄격한 조건하에 SART-3의 DNA에 잡종화되는 DNA변이형"은 래트 및 마우스와 같은 모든 척추동물 유래의 SART-3 DNA 및 SART-3의 부분적인 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하여, 엄격한 조건하에 서열번호:2에 나타낸 염기서열로 구성되는 인간 SART-3 cDNA에 잡종화되는 DNA를 의미한다.
용어 "엄격한 조건"은 잡종화가 42 ℃에서 6xSSC(20xSSC는 333mM 시트르산나트륨, 333mM NACl을 나타냄), 0.5 % SDS 및 50 %의 포름아미드를 포함하는 용액중에서 수행된 후, 잡종화된 생성물이 68 ℃에서 0.1xSSC, 0.5 % SDS의 용액 중에서 세척되는 조건, 또는 나카야마 등(Bio-Jikken-Illustrated, vol.2, "A Basis for Gene Anaysis", pp. 148-151, Shujunsha, 1995)에 기재된 조건을 의미한다.
DNA 변이형은 서열번호:2에 나타낸 DNA에 대한 잡종화와 같은 다양한 방법에 의해 클로닝된다. cDNA 라이브러리의 제조, 잡종화, 양성 콜로니의 선별, 및 염기서열의 결정과 같은 방법에 대한 특별한 공정이 공지되어 있고, 상기 나타낸 분자 클로닝을 참고로 하여 수행될 수 있다. 잡종화에 유용한 프로브는 서열번호:2에 기재된 염기서열을 포함한 DNA를 포함한다.
상기 1) 내지 3)에 기재된 DNA 중에서, HLA 항원에 결합할 수 있고, CTL에 의해 인식될 수 있으며, 세포내 분해를 통한 DNA의 발현에 의해 생성되는 단백질 유래의 종양 항원 펩티드를 생성시키는 능력을 갖는 DNA는 본 발명의 종양 항원 단백질을 코딩하는 DNA, 즉, 본 발명의 DNA를 구성한다. 특히, 본 발명의 DNA는 상기 DNA의 발현에 의해 생산되는 단백질의 아미노산서열의 부분으로 구성되는 부분적인 펩티드와 같은 상기 펩티드 단편을 발생시키는 것들이고, 이 펩티드는 HLA 항원에 결합할 수 있으며, 이 펩티드 및 세포 표면에 제시되는 복합체에 결합하는HLA 항원간의 복합체에 특이적인 CTL로부터 세포독성 작용 및 사이토카인의 생성을 유도할 수 있다.
후보 DNA가 종양 항원 단백질을 코딩할 수 있는지의 여부의 결정은 예를 들면 하기 방법에 의해 달성될 수 있다.
후보 DNA를 포함하는 발현 플라스미드 및 HLA 항원을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 플라스미드는 섬유아세포 VA-13(리켄 세포 은행, 이화학 연구소) 또는 아프리카 녹색 원숭이 신장 유래의 COS-7(ATCC CRL 1651)으로 이중으로 전달감염된다. 전달감염(trasfection)은 예를 들면, 리포펙트아민 시약(GIBCO BRL)을 사용하는 리포펙틴법에 의해 달성될 수 있다. 이어서, 사용되는 특별한 HLA 항원에 제한되는 종양 주화성 CTL이 첨가되어 전달감염체에 작용을 한 후, 전달감염체에 반응하여 상기 CTL에 의해 생산되는 다양한 사이토카인(예를 들면, IFN-γ)의 양은, 예를 들어, ELISA에 의해 측정하여 후보 DNA가 본 발명의 DNA인지의 여부를 결정한다. 이러한 상황에서, SART-3가 HLA-A24- 또는 HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드 부분을 포함하기 때문에, HLA-A24 cDNA(Cancer Res.,55:4248-4252(1995); 유전자은행 승인 번호 M64740) 및 HLA-A2 cDNA(진뱅크 승인 번호 M84379)가 HLA 항원을 코딩하는 상기 DNA로서 사용될 수 있고, 반면 KE-4CTL(FERM BP-5954)와 같은 HLA-A24-제한적인 CTL과 같은 인간말초혈액 임파구로부터 제조되는 CTL 또는 OK-CTL(FERM BP-6818)과 같은 HLA-A2-제한 CTL이 상기 CTL로서 사용될 수 있다.
상기 기재된 본 발명의 DNA는 유효성분으로서 치료제 또는 약제 조성물 중에 사용될 수 있다. 유효성분으로서, 본 발명의 DNA를 함유하는 "약제 조성물"에 따라, 종양 환자에게 본 발명의 DNA를 투여하는 것은 종양 치료 또는 예방을 가능하게 한다.
하기 방법에 따라 종양 환자에게 발현 벡터로 이입된 본 발명의 DNA를 투여함으로써, 종양 항원 단백질이 항원-제시 세포에서 고발현된다. 이어서, 세포내 분해에 의해 발생되는 종양 항원 펩티드는 HLA 항원에 결합하여 복합체를 형성하고, 이 복합체는 항원-제시 세포 표면상에 밀집하여 제시된다. 결과로서, 종양에 특이적인 CTL은 효율적으로 신체내 증식하고, 종양 세포를 파괴한다. 이러한 방식으로, 종양의 치료 또는 예방이 달성된다.
본 발명의 DNA의 세포로의 투여 및 도입은 바이러스 벡터를 사용하여 또는 다른 공정(닛케이사이언스, April, 1994, pp. 20-45; 월간약사, 36(1), 23-48(1994); 실험의학증간, 12(15), 1994, 및 이들의 인용문헌 등) 중 어느 하나에 따라 달성될 수 있다.
바이러스 벡터에 의한 방법으로서는, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스 또는 신드비스 바이러스와 같은 DNA 또는 RNA 바이러스에 본 발명의 DNA 를 이입하여 세포로 도입하는 방법을 들 수 있다. 이 중에서, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 또는 백시니아 바이러스를 사용하는 방법이 특히 바람직하다.
그 외의 방법으로서는, 발현 플라스미드를 직접 근육내로 투여하는 방법 (DNA 백신법), 리포좀법, 리포팩틴법, 마이크로주입법, 인산칼슘법, 전기천공법 등을 들 수 있고, 특히 DNA 백신법, 리포좀법이 바람직하다.
본 발명의 재조합 DNA 를 실제로 치료제로서 작용시키기 위해, 해당 DNA 를 직접 체내로 도입하는 체내(in vivo) 법, 및 사람에게서 어떤 종류의 세포를 채집하여 체외에서 DNA 를 상기 세포로 도입하여 그 세포를 체내로 되돌리는 체외(ex vivo) 법이 있다 (닛케이사이언스, 1994 년 4 월호, 20 - 45 페이지, 월간약사, 36 (1), 23 - 48 (1994), 실험의학증간, 12 (15), (1994) 및 이들의 인용문헌 등). 체내법이 보다 바람직하다.
체내법에 따라 투여할 경우, 치료될 질환, 증상 및 다른 요인에 따른 적당한 투여경로에 따라 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥내, 동맥내, 피하, 피내, 근육내 등으로 투여할 수 있다. 체내법의 경우, 조성물은 예를 들면, 용액과 같은 제형으로 투여될 수 있고, 일반적으로 유효성분으로서 본 발명의 DNA 를 함유하는 주사제의 형태로 제형화되고, 필요에 따라 통상적인 담체가 첨가될 수 있다. 또, 본 발명의 재조합 DNA 를 함유하는 리포좀 또는 막융합 리포좀(센다이 바이러스(HVJ)-리포좀 등) 에서는 현탁제, 동결제, 원심분리 농축동결제 등의 리포좀 제제의 형태로 할 수 있다.
상기 제형 중 본 발명의 재조합 DNA 의 함량은 치료될 질환, 환자의 연령, 체중 등에 따라 다양할 수 있지만, 통상 0.0001 ㎎ 내지 100 ㎎, 바람직하게는 0.001 ㎎ 내지 10 ㎎ 의 본 발명의 재조합 DNA 를 수일 내지 수개월에 1 회 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 용어 "단백질"은 상기 기재된 본 발명의 다양한 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 의미하고, 이는 HLA 항원에 결합할 수 있고, CTL에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드를 세포내 분해를 통해 발생시키는 종양 항원 단백질로서의 능력을 가진다. 단백질의 구체예는 서열번호:1에 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 SART-3 포함한다. 본 발명의 단백질은 상기 기재된 본 발명의 DNA를 사용하여 대규모로 생산될 수 있다.
본 발명의 DNA를 발현시킴으로써 종양 항원 단백질의 생산을, 많은 출원 및 상기 언급된 "분자 클로닝"과 같은 참고문헌에 따라 달성될 수 있다. 특히, 숙주세포에서 복제되고 기능을 하는 발현벡터는, 적당한 발현 벡터로 본 발명의 DNA를 이입시킴으로써 제조된다(예를 들면, pSV-SPORT1, pCR3). 이어서, 발현 플라스미드를 적당한 숙주 세포로 도입시켜 형질전환체를 수득한다. 숙주세포의 예로는 에스케리키아 콜라이와 같은 원핵생물, 효모와 같은 단세포 진핵생물, 및 곤충 또는 동물과 같은 다세포 진핵생물 유래의 세포를 포함한다. 숙주세포로의 유전자 전달은 인산칼슘법, DEAE-덱스트란법, 전기펄스법, 리포펙틴법 등과 같은 통상적인 방법에 의해 달성될 수 있다. 목적 단백질은 적당한 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 생산된다. 이렇게 수득되는 종양 항원 단백질은 표준 생화학 공정에 따라 단리되고 정제될 수 있다.
본 발명의 종양 항원 단백질이 특정 활성을 가지는 지의 여부는, 상기 기재된 세포내에서 본 발명의 DNA를 발현시켜 본 발명의 단백질을 생산하게 하고, 상기 단백질의 세포내 분해에 의해 발생되는 펩티드의 단편이 종양 항원 펩티드로서의 활성을 갖는지를 결정함으로써 설명될 수 있다. 종양 항원 단백질을 그대로 사용하는 경우, 활성에 대한 측정은 마크로파지와 같은 파고사이트로 단백질을 이입시켜 세포내 펩티드 단편을 발생시킨 후, 펩티드 단편 및 HLA 항원 간의 복합체에 CTL을 접촉시키고, 복합체에 반응하여 CTL에 의해 생산되는 다양한 사이토카인(예를 들면, IFN-γ)의 양을 결정함으로써 달성될 수 있다.
또한, 상기 기재된 본 발명의 단백질은 치료제 또는 약제 조성물에 유효성분으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 단백질을 유효성분으로서 함유하는 "약제 조성물"에 따라, 본 발명의 단백질을 투여하는 것은, 예를 들면, 종양의 치료 또는 예방을 가능하게 한다. 종양 환자에 투여시, 본 발명의 단백질은 항원-제시 세포로 도입된다. 세포내 분해에 의해 발생되는 종양 항원 펩티드는 HLA 항원에 결합하여 복합체를 형성하고, 복합체는 세포 표면상에 제시된다. 복합체에 특이적인 CTL은 효율적으로 체내에서 증식하고 종양 세포를 파괴한다. 이러한 방식으로, 종양의 치료 또는 예방이 달성된다.
본 발명의 종양 항원 단백질을 함유하는 약제 조성물은 세포성 면역을 효과적으로 확립하기 위해 보강제와 함께 투여될 수 있거나, 또는 미립자 제형으로 투여될 수 있다. 상기 목적으로, 문헌(Clin. Microbiol.Rev.,7:277-289, 1994)에 기재된 보강제가 사용가능하다. 덧붙여, 성분이 수 ㎛의 직경을 갖는 비드에 결합된 리포좀 제제, 입상 제제, 또는 성분이 지질에 부착된 제제가 또한 가능하다. 투여는 예를 들면, 피내, 피하, 또는 정맥내 주사로 달성될 수 있다. 상기와 같은 제형에서의 본 발명의 종양 항원 단백질의 양은 치료될 질환, 환자의 연령 및 체중 등에 따라 다양할 수 있고, 0.0001 mg 내지 1000 mg, 바람직하게는 0.001 mg내지 100 mg, 더욱 바람직하게는 0.01 mg 내지 10 mg의 본 발명의 종양 항원 단백질을 수일 내지 수개월에 1 회 투여하는 것이 일반적이다.
본 발명에서, 용어 "종양 항원 펩티드"는 HLA 항원에 결합할 수 있고, CTL에 의해 인식될 수 있는, 본 발명의 종양 항원 단백질의 부분으로 구성되는 부분적인 펩티드를 의미한다. 따라서, 그의 길이 또는 본 발명의 단백질의 아미노산 서열에서의 위치에 상관없이,펩티드가 본 발명의 단백질의 아미노산 서열의 부분으로 구성되고, 상기 펩티드 및 HLA 항원의 복합체가 CTL에 의해 인식될 수 있는 한, 어떠한 펩티드도 본 발명의 종양 항원 펩티드의 범위내에 해당한다. 상기와 같은 본 발명의 종양 항원 펩티드는 본 발명의 종양 항원 단백질의 부분을 구성하는 후보 펩티드를 합성하고, 후보 펩티드 및 HLA 항원 간의 복합체가 CTL에 의해 인식되는 지의 여부, 즉 후보 펩티드가 종양 항원 펩티드로서의 활성을 갖는지의 여부를 결정하기 위한 분석을 수행함으로써 동정될 수 있다.
이와 관련하여, 펩티드의 합성은 펩티드 화학에서 통상 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있을 것이다. 상기 방법의 예로는 하기의 문헌들에 기재된 것들이다: "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966; "The Proteins", Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; "펩티드합성", 마루젠 (주), 1975; 펩티드합성의 기초와 실험, 마루젠 (주), 1985; 의약품의 개발 속 제 14 권·펩티드합성, 히로가와서점, 1991.
다음, 본 발명의 종양 항원 펩티드를 동정하는 방법이 하기에 더 기재된다.
하기 HLA 타입에 결합하고 제시되는 항원 펩티드의 각각 서열 규칙(모티프)이 공지되어 있다; HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, Cw0401, 및 -Cw0602(참조, 예를 들면, Immunogenetics, 41:178, 1995). HLA-A24에 대한 모티프를 고려하여, 예를 들면, 8 내지 11 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드의 서열에서, 2 위치의 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판이고, C-말단의 아미노산이 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌인 것이 공지되어 있다 (J.Immunol.,152:4307, 1994;Immunogenetics, 41:178, 1995;J.Immunol., 155: 4307, 1994). 이와같이, HLA-A2 에 관해서는 이하의 표 1 에 나타낸 모티프가 알려져 있다(Immunogenetics, 41:178, 1995; J.Immunol.,155:4749, 1995).
HLA-A2 타입 N-말단에서 두번째 위치의 아미노산 C-말단의 아미노산
HLA-A0201 L,M V,L
HLA-A0204 L L
HLA-A0205 V,L,I,M L
HLA-A0206 V,Q V,L
HLA-A0207 L L
(펩티드는 8 내지 11 아미노산 길이임)
덧붙여, HLA 항원에 결합할 수 있는 것으로 추정되는 펩티드 서열은 NIH BIMAS의 소프트웨어를 사용하여 인터넷 상에서 검색될 수 있다 (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/).
다양한 HLA 분자에 결합된 항원 펩티드를 분석함으로써, 비록 HLA-DR, -DP, 및 -DQ 에서 14 개 이상의 아미노산 길이의 항원 펩티드가 관찰되기는 하지만 펩티드의 길이는 통상적으로 약 8 내지 14 개의 아미노산 길이라는 것이 밝혀졌다(Immunogenetics, 41:178, 1995).
본 발명의 아미노산 서열로부터 상기와 같은 모티프에 관여하는 펩티드 부위를 선택하는 것은 용이하다. 상기 모티프 구조에 관여하는 펩티드 부위는 종양 항원 단백질 SART-3의 아미노산 서열(서열번호:1)을 조사함으로써 용이하게 선택할 수 있는 것이다. 또한, 상기 나타낸 바와 같이 인터넷 상에서의 검색에 의해 HLA에 결합할 수 있는 것으로 추정되는 어떠한 서열도 선택되는 것이 용이하다. 본 발명의 종양 항원 펩티드는 상기에 기술된 방법에 따라 선택된 후보 펩티드를 합성하고, 후보 펩티드 및 HLA 항원 간의 복합체가 CTL 에 의해 인식되는지 여부를, 다시 말하면, 후보 펩티드가 종양 항원 펩티드로써의 활성을 갖는지 여부를 확인하는 분석을 수행함으로써 발견될 수 있다.
본 발명의 종양 항원 펩티드를 발견하는 방법의 특정한 예로는 문헌(J. Immunol.,154:2257, 1995)에 기재된 방법이 있다. 구체적으로, 후보 펩티드를 제시할 것으로 추정되는 HLA 항원 타입에 양성인 인간으로부터 말초 혈액 임파구를 단리하고, 시험관 내에서 후보 펩티드를 첨가하여 자극하였다. 만약 후보물이 후보 펩티드로 펄스된 HLA-항원-제시 세포를 특이적으로 인식하는 CTL 을 유도한다면, 후보 펩티드는 종양 항원 펩티드로 기능할 수 있을 것임을 나타낸다. 이와 관련하여, CTL 유도의 존재 또는 부재는, 예를 들어, 항원 펩티드-제시 세포에 반응하는 CTL 에 의해 생산된 다양한 사이토카인 (예를 들면, IFN-γ) 의 양을, 예를 들어, ELISA 방법을 사용하여 측정함으로써 검출될 수 있다. 이와는 달리,51Cr 으로 표지된 항원 펩티드-제시 세포에 대한 CTL 의 세포독성을 측정하는 방법도 상기의 검출을 위해 이용할 수 있다(51Cr 방출 분석법,Int. J. Cancer,58:317, 1994).
또한, 상기 검출은 또한 하기와 같이 달성될 수 있다. 후보 펩티드를 제시할 것으로 추정되는 타입의 HLA 항원 cDNA 를 발현하는 발현 플라스미드를, 예를 들어, COS-7 세포 (ATCC 번호. CRL1651) 또는 VA-13 세포 (리켄 세포 은행, 이화학 연구소) 에 이입하고, 생성된 세포를 후보 펩티드로 펄스를 준다. 세포를 이어서 상기에 기술한 바와 같이 후보 펩티드를 제시할 것으로 추정되는 HLA 항원의 타입에 제한된 CTL 로 처리하고, 이 CTL 에 의해 생산된 다양한 사이토카인 (예를 들면, IFN-γ) 의 양을 측정한다(J. Exp. Med.,187:277, 1998).
SART-3 는 HLA-A24- 또는 HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드 부위를 포함한다. HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드를 발견하기 위해서는, HLA 항원을 코딩하는 cDNA 로서, HLA-A24 cDNA (Cancer Res.,55:4248-4252, 유전자은행 승인번호 M64740) 가 사용될 수 있고, 인간 말초 혈액 임파구의 펩티드-자극에 의해 제조된 CTL 뿐만 아니라 KE-4CTL (FERM BP-5954)과 같은 CTL이 상기 기재된 CTL로서 사용될 수 있다. 마찬가지로, HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드에 대해서는, 상기 종양 항원 펩티드의 동정은, HLA-A2 cDNA (유전자은행 승인번호 M84379) 를 사용하여, 그리고 상기 기재된 CTL로서 인간 말초 혈액 임파구의 펩티드-자극에 의해 제조되는 CTL 뿐만 아니라, OK-CTL(FERM BP-6818)과 같은 CTL을 사용하여 달성될 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 다양한 분석의 구체예는 하기 실시예 4, 6, 및 8에 설명되어 있다.
HLA-A26 과 같이 연관된 펩티드 모티프가 밝혀지지 않은 경우, 본 발명의 종양 항원 펩티드는, 예를 들어, WO 97/46676 에 기재된 방법에 따라, 동정될 수 있고, 이 방법은 서열 규칙(모티프)이 밝혀진 상기의 경우와 상이하며, 단, HLA-A26 과 종양 항원 펩티드 간의 복합체를 인식하는 CTL 세포주가 허용가능하다.
상기에서 기술한 바와 같은 종양 항원 펩티드의 발견 방법은 이후 총체적으로 "종양 항원 펩티드의 분석 방법" 으로 언급될 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이, HLA-A24 에 결합하고 제시되는 종양 항원 펩티드의 서열은 특정 규칙 (모티프) 을 따르며, 특히, 상기 모티프는, 8 내지 11 개의 아미노산으로 구성된 펩티드 서열에서, 2 위치의 아미노산 잔기가 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판이며, C-말단의 아미노산 잔기는 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이라는 것이 공지되어 있다(J. Immunol.,152, p.3913, 1994;Immunogenetics,41, p.178, 1995;J. Immunol.,155, p.4307, 1994). 마찬가지로, HLA-A2 에 결합하고 제시되는 종양 항원 펩티드의 서열에서도 비슷한 규칙 (모티프) 을 발견할 수 있으며, 특히, 상기 표 1 에서 보여진 모티프가 공지되어 있다(Immunogenetics,41, p.178, 1995;J. Immunol.,155, p.4749, 1995). 상기 나타낸 바와 같이, HLA 항원에 결합할 수 있을 것으로 추정되는 서열이 NIH BIMAS 소프트웨어를 사용하여 인터넷상에서 더 검색될 수 있다 (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/).
따라서, 본 발명의 종양 항원 펩티드 중에서, HLA-A24- 및 HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드는, 상기 모티프 구조, 또는 서열번호:1에 나타낸 SART-3의 아미노산 서열에서 HLA 에 결합할 수 있는 것으로 추정되는 구조에 관여하는 부분적인 펩티드이며, 각각의 HLA 항원에 결합할 수 있고, CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드에 의해 예시되었다.
상기에 기재된 HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드의 특정한 예로는 서열번호:3 내지 24 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고 HLA-A24 항원에 결합할 수 있으며 CTL 에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드가 있다. 마찬가지로, HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드의 특정한 예로는 서열번호:25 내지 52 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고 HLA-A2 항원에 결합할 수 있으며 CTL 에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드가 있다.
구체적으로, 본 발명의 종양 항원 펩티드의 예로는 하기가 포함된다:
1) 서열번호: 3 내지 52 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 펩티드, 및
2) 서열번호: 3 내지 52 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전체 길이를 포함하고, 상기 아미노산 서열과 비교하여 N-말단 및/또는 C-말단 방향으로 연장된 펩티드, 또는 서열번호: 3 내지 52 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 연속된 부위로 구성되는 펩티드,
상기 펩티드는 각각의 HLA 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식된다. 상기 2) 의 펩티드는 각 HLA 항원에 결합하고 제시된다는 점에서 약 8 내지 11 개의 아미노산 길이일 수 있다.
본 발명의 HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드의 적합한 예로는 서열번호: 3 내지 9 중 어느 하나에 나타낸 아미노산의 전부 또는 일부로 구성되며, HLA-A24 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드들이 포함된다. 구체적으로, 예는 하기와 같다:
1) 서열번호: 3 내지 9 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 펩티드, 및
2) 서열번호: 3 내지 9 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전체 길이를 포함하고 상기 아미노산 서열의 N-말단 및/또는 C-말단 방향이 연장된 펩티드, 또는 서열번호: 3 내지 9 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 연속된 부위로 구성되는 펩티드,
상기 펩티드는 HLA-A24 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식된다. 이와 관련해서, 상기 2) 의 펩티드는 HLA-A24 항원에 결합하고 제시된다는 점에서 약 8 내지 11 개의 아미노산 길이일 수 있다.
본 발명의 HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드의 적합한 예로는 서열번호: 25 내지 29 중 어느 하나에 나타낸 아미노산의 전부 또는 일부로 구성되며, HLA-A2 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드들이 포함된다. 구체적으로, 예는 하기와 같다:
1) 서열번호: 25 내지 29 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 펩티드, 및
2) 서열번호: 25 내지 29 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전체 길이를 포함하고 상기 아미노산 서열의 N-말단 및/또는 C-말단 방향이 연장된 펩티드, 또는 서열번호: 25 내지 29 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 연속된 부위로 구성되는 펩티드,
상기 펩티드는 HLA-A2 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식된다. 상기 2) 의 펩티드는 HLA-A2 항원에 결합하고 제시된다는 점에서 약 8 내지 11 개의 아미노산 길이일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "종양 항원 펩티드와 동일한 기능성을 갖는 유도체"(이하 종양 항원 펩티드 유도체로 약칭함)는 본 발명의 종양 항원 펩티드의 아미노산 서열에서 하나 이상, 바람직하게는 하나 내지 수개의 아미노산 잔기가 변화되고, HLA 항원에 결합할 수 있으며 CTL 에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드로서의 성질을 갖는, 변화된 펩티드를 의미한다. 따라서, 본 발명의 종양 항원 펩티드의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기의 변화를 포함하고, 종양 항원 펩티드의 성질을 갖는, 즉 HLA 항원에 결합할 수 있고 CTL 에 의해 인식되는 한, 모든 변화된 펩티드는 본 발명의 종양 항원 펩티드의 범위에 속한다.
본 명세서에서, 아미노산 잔기의 "변화(alternation)" 는 아미노산 잔기의 치환, 결실 및/또는 부가 (펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단으로의 아미노산 부가를 포함)를 의미하며, 아미노산 잔기의 치환이 바람직하다. 아미노산 잔기의 치환에 연관된 변화는, 종양 항원 펩티드로써의 활성이 유지되는 한, 치환할 아미노산 잔기의 수와 위치를 임의로 결정할 수 있으나, 상기에 기술한 바와 같이 종양 항원펩티드가 통상적으로 약 8 내지 14 개의 아미노산 길이이므로 한개 내지 수개의 아미노산이 치환되는 것이 바람직하다.
본 발명의 종양 항원 펩티드 유도체의 바람직한 길이는 상기에 기술된 종양 항원 펩티드의 경우와 마찬가지로 약 8 내지 14 개의 아미노산이나, HLA-DR, -DP, 및 -DQ 를 위해서는 14 개 이상의 아미노산 길이인 유도체도 가능하다.
본 발명의 상기 종양 항원 펩티드 유도체는 펩티드의 상기 제조방법에 따라 본 발명의 종양 항원 펩티드의 일부 변화를 포함하는 변화된 펩티드를 합성하고, 종양 항원 펩티드를 위한 상기 분석법을 수행함으로써 발견될 수 있다.
상기에 기술한 바와 같이, HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, 및 -Cw0602 와 같은 HLA 타입에 결합하고 제시되는 펩티드의 서열 규칙 (모티프) 은 밝혀져 있다. 상기에 나타낸 바와 같이, HLA 항원에 결합할 수 있을 것으로 추정되는 서열이 NIH BIMAS 소프트웨어를 사용하여 인터넷상에서 더 검색될 수 있다 (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/). 결과적으로, 본 발명의 종양 항원 펩티드에서 하나 이상의 아미노산 변화를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체들은 상기 모티프에 근거하여 제조될 수 있다.
예를 들면, HLA-A24 에 결합하고 제시되는 항원 펩티드의 모티프에 관해서는, 상기에 기술한 바와 같이 8 내지 11 개의 아미노산으로 구성된 펩티드 서열에서, 2 위치의 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판이고, C-말단의 아미노산이 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이라는 것이 공지되어 있다 (J. Immunol.,152:3913, 1994;Immunogenetics,41:178, 1995;J. Immunol.,155:4307, 1994). 마찬가지로, 상기 표 1 에서 보이는 모티프들은 HLA-A2 에 대해 공지된 것이다. 덧붙여, HLA 항원에 결합할 수 있는 것으로 추정되는 펩티드 서열이 인터넷 상에 공개되어 있고 (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/), 모티프에 따르는 아미노산과 유사한 성질을 갖는 아미노산 잔기도 허용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 종양 항원 펩티드 유도체의 예로는 모티프에 따라 치환이 허용될 수 있는 어떠한 위치 (HLA-A24 및 HLA-A2 는 2 위치 및 C-말단) 에 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산(바람직하게는, 상기 인터넷에 따른 항원에 결합할 수 있는 것으로 추정되는 아미노산)으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 구성된 펩티드 유도체가 포함되며, 상기 유도체는 HLA 항원에 결합하고 활성을 가지며 CTL 에 의해 인식된다. 이러한 종양 항원 펩티드 유도체의 바람직한 예로는 아미노산 잔기의 치환이 상기 모티프에 따른 위치에서의 아미노산 잔기의 치환으로부터 선택된 아미노산 서열의 전체 또는 부분을 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며, 이 유도체는 상기 활성을 갖는다. 아미노산 서열의 "전부 또는 일부" 의 바람직한 길이는 HLA-DR, -DP, 및 -DQ 를 위해서는 14 개 이상의 아미노산 길이도 가능하지만, 약 8 내지 14 개의 아미노산이다.
HLA-A24- 또는 HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드 유도체의 예로는 HLA-A24- 또는 HLA-A2- 에 대한 결합 모티프를 갖는 SART-3의 아미노산 서열로부터 유래되는 펩티드에서, 상기 모티프에 의거하여 치환이 허용되는 위치, 특히, 2 위치 및/또는C-말단의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산(바람직하게는, 상기 인터넷에 따른 항원에 결합할 수 있는 것으로 추정되는 아미노산)으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 구성된 펩티드 유도체가 포함되며, 본 유도체는 상기 활성을 갖는다. 바람직한 예로는 2 위치 및/또는 C-말단의 아미노산이 상기 모티프에 따른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며, 본 유도체는 상기 활성을 갖는다. 이러한 HLA-A24- 또는 HLA-A2- 제한적인 종양 항원 펩티드 유도체에서, 아미노산 서열의 "전부 또는 일부" 의 바람직한 길이는 약 8 내지 11 개의 아미노산이다.
특히, 예로는 서열번호: 3 내지 52 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 2 위치 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 다른 아미노산(바람직하게는, 상기 인터넷에 따른 항원에 결합할 수 있는 것으로 추정되는 아미노산)으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며, 이 유도체는 상기 활성을 지닌다. 바람직한 예로는 서열번호: 3 내지 52 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 2 위치 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 상기 모티프에 따른 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며, 본 유도체는 상기 활성을 지닌다. 구체적으로, HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드 유도체의 예로는 서열번호: 3 내지 24 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 2 위치의 아미노산 잔기가 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 아미노산 서열의 전부또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며, 이 유도체는 상기 활성을 지닌다. 마찬가지로, HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드 유도체의 예로는 서열번호: 25 내지 52 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 2 위치 의 아미노산 잔기가 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 또는 글루타민으로 치환되고, 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 발린 또는 류신으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며 본 유도체는 상기 활성을 지닌다.
본 발명의 HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드 유도체의 적당한 예로는 서열번호: 3 내지 9 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 2 위치 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며 본 유도체는 상기 활성을 지닌다. 더욱 바람직한 예로는 서열번호: 3 내지 9 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 2 위치의 아미노산 잔기가 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며, 이 유도체는 상기 활성을 지닌다. 상기 종양 항원 펩티드 유도체의 적당한 예를 서열번호: 53 내지 59에 나타내었다.
본 발명의 HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드 유도체의 적당한 예로는 서열번호: 25 내지 29 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 2 위치 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며 본 유도체는 상기 활성을 지닌다. 더욱 바람직한 예로는 서열번호: 25 내지 29 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 2 위치의 아미노산 잔기가 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 또는 글루타민으로 치환되고, 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 발린 또는 류신으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체가 있으며, 이 유도체는 상기 활성을 지닌다. 상기 종양 항원 펩티드 유도체의 적당한 예를 서열번호: 60 내지 64에 나타내었다.
본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체는 종양 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물로서, 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 것들과 함께 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 유효성분으로서 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체를 함유하는, 종양 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물을 제공한다. 종양의 치료 또는 예방을 위해 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 SART-3-양성 환자에 투여시에는, 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체가 HLA 항원과 함께 항원-제시 세포에 제시되며, 그러므로, 제시된 HLA 항원 복합체에 특이적인 CTL 이 증식하여 종양 세포를 파괴한다. 그 결과, 환자의 종양이 치료될 수 있거나, 또는 종양의 증식 또는 전이가 예방될 수 있다. SART-3는 식도암과 같은 편형상피암에 광범위하게 발현되므로, 본 발명에 따른 종양의 치료 또는 예방을 위한 조성물은 광범위한 적용의 면에서 유리하다. 편형상피암은 종종 화학요법 및 방사선요법에 내성을 나타내고, 그러므로, 본 발명의 종양을 치료하기위한 조성물은 또한 그의 조합하여 사용함으로써 상승된 치료효과를 달성할 수 있다.
본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는, 종양 치료 또는 예방을 위한 조성물은 세포성 면역을 효과적으로 확립하기 위해 보강제와 함께 투여하거나, 또는 미립자 제형으로 투여될 수 있다. 상기의 목적을 위해, 문헌 (Clin. Microbio. Rev.,7:277-289, 1994) 에 기재된 보강제를 이용할 수 있다. 또한, 리포좀 제제, 지름이 수 ㎛ 인 비드에 성분을 결합시킨 미립자 제제, 또는 지질에 성분을 결합시킨 제제가 또한 가능하다. 투여는 예를 들어, 피내, 피하, 또는 정맥 주사를 통해 수행할 수 있다. 투여될 제형 중의 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체의 양은, 예를 들어 치료될 질환, 특정 환자의 연령 및 체중 등에 따라 적절하게 조절될 수 있지만, 수일 내지 수개월에 1회로 일반적으로 0.0001 mg 내지 1000 mg, 바람직하게는 0.001 mg 내지 1000 mg, 및 더 바람직하게는 0.1 mg 내지 10 mg 을 투여한다.
또한, 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체를 코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하는 재조합 DNA, 또는 상기 재조합 DNA의 발현에 의해 수득할 수 있는 재조합 폴리펩티드는, 하기 상세하게 기재되는 본 발명에 따른 종양 치료 또는 예방을 위한 조성물 중에 유효성분으로서 함유될 수 있다.
이와 관련하여, 용어 "재조합 DNA"는 본 발명의 종양 항원 단백질의 부분으로 구성되는 부분적인 폴리펩티드, 부분적인 펩티드, 그의 유도체, 상기 펩티드를 조합시킨 폴리토프 등을 코딩하는 모든 DNA를 의미한다. 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체를 코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하는 모든 DNA가 본 발명의 재조합 DNA의 범위에 해당한다. 상기 재조합 DNA는 적당한 발현 벡터로 이입되어 종양 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물 중에 함유되는 유효성분으로 제조될 수 있다.
용어 "폴리토프"는 많은 CTL 에피토프를 조합시킨 펩티드를 의미하며, 상기 폴리토프를 코딩하는 DNA가 최근 DNA 백신법에 사용되어 왔다 (예컨대,Journal of Immunology, 160, p 1717, 1998 등 참조). 본 발명의 폴리토프를 코딩하는 DNA는 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체를 코딩하는 하나 이상의 DNA를 서로 결합시킴으로써, 또한 원한다면, 다른 종양항원 펩티드(들)를 코딩하는 DNA 도 결합시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 재조합 DNA는 용이하게는 일반적인 DNA 합성 및 유전자공학적 방법, 예를 들면, "분자 클로닝"(2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)과 같은 표준 문헌의 기재에 따라 제조될 수 있다. 발현 벡터로 상기 재조합 DNA의 이입은 또한 표준 문헌 등에 따라 수행될 수 있다.
상기 제조된 본 발명의 재조합 DNA가 HLA 항원에 결합할 수 있고, CTL에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드를 발생시킬 수 있는 지의 여부에 대한 결정은 예를 들면, 본 발명의 DNA의 활성을 결정하기 위해 상기 언급된 방법에 따라, 성취될 수 있다. 이와 같이, 본 재조합 DNA를 치료제 또는 예방제로서 사용하는 방법이 본 발명의 DNA에 대한 방법에 따를 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 재조합 DNA의 발현에 의해 수득될 수 있는 "재조합 폴리펩티드" 는 또한 종양 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물에 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 폴리펩티드는 상기 기재된 본 발명의 단백질에 대한 것과 유사한 방법으로 제조될 수 있다. 이와 같이, 상기 제조된 본 발명의 재조합 폴리펩티드가 특정 활성을 가질 수 있는 지의 여부의 결정은 본 발명의 단백질에 대한 것과 유사한 방법에 따라 달성될 수 있다. 또한, 본 재조합 폴리펩티드를 치료제 또는 예방제로서 사용하는 방법은 본 발명의 단백질 또는 펩티드에 대한 상기 방법에 따를 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질, 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기 항체들은 예를 들어, 문헌 ("Antibodies: A Laboratory Manual, Lane, H. D.et al.eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989)에 기재된 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체를 인식하는 항체 및 나아가 상기물의 활성을 중화시키는 항체는 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체를 통상적인 방법으로 동물에서 적절하게 면역화시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 상기 항체들은 친화성 크로마토그래피, 면역학적 진단법 등에 사용될 수 있다. 면역 진단법은 면역블롯팅, 방사면역측정법(RIA), 효소 면역측정법(ELISA), 형광 또는 발광 분석법 등으로부터 유용하게 선택될 수 있다.
본 발명의 종양 항원 펩티드, 그의 유도체, 종양 항원 단백질, 그의 유전자, 또는 본 발명의 재조합 DNA 또는 재조합 폴리펩티드는 종양 환자의 치료를 위해 시험관 내에서 하기와 같이 사용될 수 있다.
종양 항원 펩티드, 그의 유도체, 종양 항원 단백질, 그들의 유전자를 종양의치료에 사용시, 환자의 체내에 특이적인 CTL 을 효율적으로 유도하는 투여 방법을 확립하는 것이 중요하다. 이를 위한 한가지 방법으로, 본 발명은 HLA 항원 및 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 간의 복합체가 종양 환자에서 분리된 항원-제시능을 갖는 세포의 표면에 제시되는, 항원-제시 세포를 제공하며, 또한 종양의 치료를 위해 상기 항원-제시 세포를 유효성분으로 함유하는 약제 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, "항원-제시능을 갖는 세포" 는 그것이 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체를 제시할 수 있도록 하는 HLA 항원을 세포 표면에 발현하는 세포인 한 특별히 제한되지 않으며, 특별히 높은 항원-제시능을 갖는다고 보고된 수상세포가 바람직하다.
항원 제시능을 갖는 상기 언급된 세포로부터 본 발명의 항원-제시 세포를 제조하기 위해 첨가해야 할 물질로는 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 뿐만 아니라, 본 발명의 DNA, 단백질, 재조합 DNA 또는 재조합 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 단백질 또는 DNA 의 형태로 사용할 때에는 세포내로 주입하는 것이 필요하다.
본 발명의 항원-제시 세포를 제조하기 위해서는, 항원-제시능이 있는 세포를 종양 환자로부터 단리하고, HLA 항원 및 상기 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체간의 복합체를 제시하도록 본 발명의 종양 항원 펩티드, 그의 유도체, 종양 항원 단백질, 또는 재조합 폴리펩티드로 생체 밖에서 펄스를 준다 (Cancer Immunol. Immunother.,46:82, 1998;J. Immunol.158:p1796, 1997;Cancer Res.,59:1184,1999). 수상 세포의 사용시, 본 발명의 항원-제시 세포는 예를 들어, Ficoll 방법을 이용하여 종양 환자의 말초 혈액에서 임파구를 단리하고, 비유착성 세포를 제거하고, 수상 세포를 유도하기 위해 유착성 세포를 GM-CSF 및 IL-4 존재하에서 배양하고, 본 발명의 종양 항원 펩티드, 종양 항원 단백질 등으로 상기 수상세포를 배양, 펄스 자극하는 등에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 항원-제시 세포를 본 발명의 DNA 또는 재조합 DNA 를 항원-제시능을 갖는 상기 언급된 세포내로 이입하여 제조한 경우, 상기 유전자는 DNA 또는 RNA 의 형태일 수 있다. 특히, DNA 는 예를 들어, 문헌(Cancer Res.,56:5672, 1996 또는J. Immunol.,161:p5607, 1998)를 참고하여, 및 RNA 는 예를 들어, 문헌(J. Exp. Med.,184:p465, 1996)을 참고하여 사용할 수 있다.
상기 항원-제시 세포를 유효성분으로 함유하는, 종양의 치료를 위한 약제 조성물은 항원 제시 세포를 안정적으로 유지하기 위해 바람직하게는 생리식염수, 인산염 완충식염수 (PBS), 배지 등을 포함한다. 이는, 예를 들어, 정맥 내, 피하, 또는 피내 투여될 수 있다. 종양의 치료를 위해 항원-제시 세포를 유효성분으로 함유하는 상기 조성물을 환자의 체내로 재주입함으로써, 종양의 치료를 달성하기 위한 특이적인 CTL 이 SART-3-양성 환자에서효율적으로 유도된다. 환자 및 사용할 펩티드 간의 HLA 타입이 호환성이어야 함은, 예컨대, HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체는 HLA-A24-양성 종양 환자에게 사용되어야 함은 당연하다.
또한, 하기 입양 면역요법에서 본 발명에 따른 종양 항원 펩티드, 그의 유도체, 종양 항원 단백질, 그들을 위한 DNA, 재조합 DNA 또는 재조합 폴리펩티드의 시험관 내 용도는 그들 용도의 또 다른 예로 제공될 수 있다.
흑색종의 경우, 환자 자신에서 수득한 종양 침윤 T 세포를 생체 밖에서 대량 배양하고, 이어서 환자에게 회귀시키는 입양 면역 요법이 치료 효과를 달성한다는 것이 관찰된다(J. Natl. Cancer. Inst.,86:1159, 1994). 마찬가지로, 마우스 흑색종에서, 종양 항원 펩티드 TRP-2 로 비장세포를 시험관 내에서 자극하여, 종양 항원 펩티드에 특이적인 CTL 을 증식시키고, 상기 CTL 을 흑색종이 이식된 마우스에 투여함으로써 전이가 억제됨이 관찰된다 (J. Exp. Med.,185:453, 1997). 이는 항원-제시 세포의 HLA 항원과 종양 항원 펩티드 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 CTL 이 시험관 내에서 증식했기 때문이다. 따라서, 종양-특이적 CTL 을 증식시키기 위해 본 발명의 종양 항원 펩티드, 그의 유도체, 종양 항원 단백질, 또는 이들의 DNA 를 이용하여 환자의 말초 혈액 임파구를 시험관 내에서 자극하고, 이어서 CTL 을 환자에 회귀시키는 것을 내용으로 하는 종양 치료를 위한 방법은 유용할 것으로 추정된다.
따라서, 본 발명은 HLA 항원 및 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 CTL 을 제시하며, 또한 상기 CTL 을 유효성분으로 함유하는 종양의 치료를 위한 약제 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 CTL 을 안정적으로 유지하기 위해, 바람직하게는 생리식염수, 인산염 완충식염수 (PBS), 배지 등을 포함한다. 이는 예를 들어, 정맥 내, 피하 또는 피내로 투여될 수 있다. 종양의 치료를 위해 CTL 을 유효성분으로 함유하는 상기 조성물을 환자의 체내로재주입함으로써, SART-3-양성 환자에서 종양 세포에 대한 CTL 의 독성 효과가 향상되며, 따라서 종양 세포를 파괴함으로써 종양의 치료를 달성한다.
본 발명에 따른 종양 항원 펩티드, 그의 유도체, 종양 항원 단백질, 또는 그의 재조합 폴리펩티드를 또한 종양의 진단을 위한 진단제의 유효성분으로서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 종양의 보유가 의심되는 환자에게서 수득한 표본 (피 또는 종양 조직과 같은 것) 내 항체의 존재를 검출하기 위해 본 발명의 종양 항원 펩티드, 또는 그의 유도체 자체를 진단제로 사용함으로써, 종양의 조기 검출 및 재발과 전이의 진단이 가능하다. 동일 공정을 예를 들어, 본 발명의 종양 항원 펩티드를 유효성분으로 함유하는 약물이 적용 가능한 종양 환자의 선별을 위해 이용할 수 있다. 특히, 상기 진단을 면역블롯팅, 방사면역측정법 (RIA), 효소 면역측정법 (ELISA), 형광 또는 발광 분석법으로 수행할 수 있다.
또한, 최근 몇년간, 항원 펩티드 및 HLA 항원 간의 복합체를 이용한 항원-특이적 CTL 검출을 위한 새로운 검출 방법들이 확립되고 있다 (Science,274:94, 1996). 종양의 조기 검출 및 재발 또는 전이의 진단은 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 및 HLA 항원 간의 복합체를 상기 검출 방법에 적용시키고, 따라서 종양 항원-특이적 CTL 을 검출함으로써 가능하다. 동일 공정을 예를 들어, 본 발명의 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드를 활성 성분으로 함유하는 치료제가 적용 가능한 종양 환자의 선택을 위해, 또는 상기 치료제의 치료 효과를 측정하기 위해 이용할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 본 발명의 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체를 활성 성분의 일부로 함유하는 종양 진단제를 제공한다.
특히, 상기와 같은 진단은 하기에서와 같이 수행될 수 있다: 문헌 (Science,274:94, 1996) 에서 기재된 방법에 따라 형광 표지된 HLA 항원 및 종양 항원 펩티드 간의 4량체를 제조하고, 유식 세포측정기를 이용하여 종양의 보유가 의심되는 환자의 말초 혈액 임파구로부터 항원 펩티드-특이적 CTL 을 정량적으로 측정하는데 사용된다.
본 발명은 또한 결장암 유래의 종양-침윤 임파구로부터 확립된 CTL인 OK-CTL(기탁번호 FERM BP-6818)를 제공한다. OK-CTL은 HLA-A2-제한적임이 확인되었다. 따라서, 종양 항원 단백질 및 HLA-A2-제한적인 종양 항원 펩티드는 신규하게 OK-CTL을 사용함으로써 발견될 수 있다. 상세하게는, 하기 실시예 8을 참고한다.
본 발명을 실시하는 최량의 형태
본 발명은 하기 예에 의해 더욱 설명되지만, 어떤 식으로든 이들로써 한정되는 것은 아니다.
참조예 1
식도암 세포계에 대한 세포독성 T 임파구 (CTL) 세포계의 구축
[Nakao 등, Cancer Res.,55:4248-4252 (1995)] 의 명세서에 따라, 조직 형태를 기준으로 분류할 경우 편평세포암종에 속하는 식도암 세포계 KE-4 에 대한 CTL 을 환자의 말초 혈액 단핵 세포로부터 구축하고, KE-4CTL 이라 칭하고, 하기 실험에 사용하였다. 식도암 세포계 KE-4 및 KE-2CTL 는 1997 년 5 월 23 일, 각각 국제 수탁 번호 FERM BP-5955 및 FERM BP-5954 로 국립 생명과학 및 인간공학의 연구소에 수탁되었다. 또한, KE-4 의 HLA 유형 Ⅰ 분자의 분류가 상기 언급된 Nakao 등의 명세서에 따라 수행되어, HLA-A2402, -A2601, -B54, -B60, -Cw1, 및 -Cw3 이 있다는 것을 발견해냈다.
참조예 2
HLA-A2402 cDNA 의 제조
[Nakao 등, Cancer Res.,55:4248-4252 (1995)] 의 명세서에 따라, HLA-A2402 에 대한 cDNA (Genbank 승인 번호 M64740) 를 발현 벡터 pCR3 (INVITROGEN) 에 이입함으로써 KE-4 로부터 제조하였다.
참조예 3
KE-4 유래의 cDNA 라이브러리의 제조
HT-1376 으로부터, 제조자의 프로토콜에 따라 전체 RNA 분획을 분리하고 mRNA 정제 체계 (파마시아 바이오텍) 를 이용하여, 올리고 (dT) 칼럼으로 정제하여 KE-4 로부터 폴리 (A)+mRNA 를 첫번째로 제조하였다. mRNA 로부터, 각 말단에NotI 어댑터 및ScaI 어댑터가 부착된 cDNA 를 제조자의 프로토콜에 따라 수퍼스크립트 플라스미드 시스템 (SuperScriptTMPlasmid system, Gibco BRL) 을 이용하여 제조하고, 이어서 발현용 벡터, 플라스미드 pSV-SPORT1 (Gibco BRL) 의 제한 부위NotI 및ScaI 에 결찰하여 재조합 플라스미드를 얻었다. 25 μF 및 2.5 kV 의 조건 하에서 재조합 플라스미드를, 유전자 펄스기 (Gene Pulser, BioRad) 내의 전기적 펄스를 이용하여 대장균 ElectroMAX DH10BTM세포 (Gibco BRL) 에 도입하였다. 재조합 플라스미드가 도입된 형질전환체를 암피실린 (50 ㎍/㎖) 을 포함하는 LB 배지 (박토-트립톤 1%, 효모 용출물 0.5%, 염화나트륨 0.5%, 산도 7.3) 에서 선별하였다.
실시예 1
신규한 종양 항원 단백질 유전자 선별
참조예 3 에 기재된 약 100 개의 형질전환체 군으로부터 재조합 플라스미드 DNA 를 하기 방식에 따라 회수한다. 백여개의 형질전환체들을 암피실린 (50 ㎍/㎖) 이 첨가된 LB 배지가 들어있는, 96-웰 U형-바닥 마이크로플레이트의 각 웰에 넣고 배양하였다. 배양액의 일부는 이어서 TYGPN 배지 (F.M. Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons,Inc.) 가 0.25 ㎖ 씩 들어있는, 또 다른 96-웰 U형-바닥 마이크로플레이트로 옮기고 37℃ 에서 48 시간동안 배양하였다. 마이크로플레이트의 LB 배지 내에 남아있는 배양액을 냉동 보관하였다. TYGPN 배지에서 배양된 형질전환체의 재조합 플라스미드 DNA 의 제조는 알칼린 용해 방법 (F.M. Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc.) 에 의해 마이크로플레이트 상에서 수행되었다. 이소프로판올 침전법에 의해 회수한 재조합 플라스미드 DNA 는 RNase 20 ng/㎖ 을 포함하는 트리스 10mM, EDTA 1mM, pH 7.4 인 용액의 50 ㎕ 에 현탁시켰다.
하기의 리포펙틴 방법을 이용하여 KE-4 cDNA 의 재조합 플라스미드 및 HLA-A2402 cDNA 의 재조합 플라스미드를 섬유아세포 세포계 VA-13 세포 (리켄 세포 은행, 이화학연구소; Ann. Med. Exp. Biol. Fenn.,44:242-254, 1966) 에 이중 전달감염시켰다. 7 천개씩의 VA-13 세포를 96-웰 편평-바닥 마이크로플레이트의 각 웰에 넣어주고, FCS 10% 를 함유하는 RPMI1640 배지 100 ㎕ 에서 이틀동안 배양하였다. 리포펙틴 시약 (Gibco BRL) 을 이용하여, 100 여개 형질전환체에 상응하는 KE-4 cDNA 의 재조합 플라스미드 25 ㎕, 참조예 2 에 기술된 HLA-A2402 cDNA 의 재조합 플라스미드 10 ㎕ (200 ng), 및 35 배 가량 희석된 리포펙틴 시약 35 ㎕ 로 구성된 70-㎕ 혼합액 중 30 ㎕ 을 이중 전달감염을 위해 VA-13 세포에 첨가하였다. 상기 전달감염체는 두배씩 제작되었다. 5 시간 뒤, FCS 10% 를 함유하는 배양 배지 200 ㎕ 을 전달감염체에 첨가하고, 37℃ 에서 72 시간 더 배양하였다. 배양 배지를 제거한 뒤, KG-CTL를 10,000 KE-4CTL 세포/웰씩 첨가하고, FCS 10% 및 IL-2 25 U/㎖ 를 함유하는 배양 배지 100 ㎕ 로 37℃ 에서 24 시간 배양하였다. 배양 배지를 회수하여 하기에 기술되는 ELISA 방법에 의해 IFN-γ의 양을 측정하였다.
구체적으로는, 항-인간 IFN-γ마우스 단일클론성 항체를 고체상 항체로서 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 흡착시키고, 소 혈청 알부민과의 비특이성 결합을 블로킹시킨 후 항체가 상기 기재된 샘플 중 IFN-γ 에 결합하도록 하였다. 그 후 검출 항체로서 항-인간 IFN-γ 토끼 다클론성 항체를 결합시키고, 알칼리 포스파타제로 표지된 항-토끼 면역글로불린 염소 항체에 결합시킨 후, 유색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트와 반응시켰다. 동일한 부피의 1 N NaOH 를 첨가하여 반응물을 켄칭한 후, 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 표준 IFN-γ 로 수득한 것과 흡광도를 비교하여 샘플 중 IFN-γ의 양을 결정하였다.
IFN-γ고생산성을 나타낸 군에 대해서는, KE-4 cDNA 의 재조합 플라스미드를 포함하는 100 여개 형질전환체에 해당하는 동결-보관된 군을 하기 선별에 사용하였다. 형질전환체 군을 암피실린 (50 ㎍/㎖) 을 포함하는 LB 한천 배지에 평판 배양하여 콜로니를 수득하였다. 각 군에서, 각각의 웰에 단일 종류의 형질전환체가 들어가도록 200 콜로니를 상기 기술한 바와 같이 배양하고, KE-4 cDNA 의 재조합 플라스미드 DNA 를 제조하였다. 그 후, KE-4 cDNA 의 재조합 플라스미드 및 HLA-A2402 cDNA 의 재조합 플라스미드로 VA-13 세포를 이중 전달감염시키고, KE-4CTL 와 공동 배양한 뒤, KE-4CTL 반응에 의해 생성되는 IFN-γ의 양을 정량적으로 측정하여 양성 플라스미드를 선별하였다. 이러한 절차에 따라, KE-4 cDNA 재조합 플라스미드 클론이 선별되었으며, 상기 클론은 클론 13 으로 명명되었다. 나아가, KE-4CTL 에 의해 생성되는 IFN-γ의 양을 측정하는 상기와 같은 유사 과정을 클론 13 으로 반복하였다. 그 결과는 하기 표 2 에서 보여진다.
표적 세포 KE-4CTL 에 의해 생성된 IFN-γ의 양 (pg/ml)
VA-13 + HLA-A2402 326
VA-13 + HLA-A2402 + 클론 13 775
HLA-A2402 만 전달감염된 VA-13 세포에 비해, KE-4CTL 은 HLA-A2402 및 클론 13 이 이중 전달감염된 VA-13 세포에 대해 더욱 강력히 반응했으며 더 많은 IFN-γ를 생성하였다. 본 결과는 클론 13 에 의해 코딩되는 단백질이 종양 항원 단백질임을 나타낸다.
실시예 2
종양 항원 단백질을 코딩하는 전체 길이의 cDNA 클론의 클로닝
실시예 1 에서 수득한 클론 13 에 이입된 전체 길이의 cDNA 유전자의 길이를 결정하기 위하여, 하기 개시된 바와 같이 Northern 잡종화를 수행하였다.
먼저, RNAzol B (TEL-TEST, Inc.) 를 사용하여 식도암 세포계 KE-4 로부터 RNA 를 제조하였다. RNA 5 μg 을 포름아미드 및 포름알데히드의 존재 하에 변성시키고, 아가로스 상에서 전기영동한 후 Hybond-N+ 나일론 막 (Amersham) 에 옮기고 고정시켰다. 클론 13 의 삽입 서열 부위를 다중프라임 DNA 표지 시스템 (Amersham) 을 사용하여32P 로 표지해서 DNA 프로브를 제조하였다. 공지된 방법에 따라 [Nakayama 등, Bio-Jikken-Illustrated, vol. 2, "Idenshi-Kaiseki-No-Kiso (A Basis for Gene Analysis)", pp. 148-151, Shujunsha, 1995], 상기 프로브를 막 상의 RNA 로 잡종화시키고, 자가방사선술하여 클론 13 에 이입된 cDNA 의 mRNA 를 검출하여, mRNA 의 전체 길이가 약 3.8 kb 임을 나타내었다. 그 후, 상기 제조된 바와 같은 클론 13 을 포함하는 전체 길이의 cDNA 클론을 클로닝하였다. 참조예 3 에 기재된 KE-4 유도된 cDNA 라이브러리를 암피실린 (50 μg/ml) 을 포함하는 LB 한천 매질 상에 플레이팅하여 콜로니를 수득하였다. 그 후 제조자의 프로토콜에 따라 Hybond-N+ 나일론 막 (Amersham) 상에 콜로니를 옮겨서 고정시켰다. 클론 13 의 삽입 서열을32P 로 표지한 DNA 프로브를 상기 언급된 것과 유사한 조건하에서 잡종화하고 자가방사선술하여 양성 형질전환주를 나타내는 콜로니를 선별하였다. 그 후 선택된 많은 콜로니들로부터 재조합 플라스미드를 회수하고, 제한 효소 Not Ⅰ 및 Sal Ⅰ 으로 처리한 후, 아가로스 상에서 전기영동하여 이입된 cDNA 의 길이를 결정하였다. 약 3.8 kb 의 cDNA 가 이입된 재조합 플라스미드를 선택하고 클론 K 라 명명하였다. 그 후 상기 개시된 바와 같이 HLA-A2402 의 cDNA 를 포함하는 또 다른 재조합 플라스미드 및 종양 항원 단백질 유전자의 cDNA 가 이입된 재조합 플라스미드 클론 K 로 VA-13 세포를 이중 전달감염시키고, 세포를 표적 세포로서 사용하였다. KE-4CTL 의 반응에 의해 생성된 IFN-γ의 양을 상기 기재된 방법에 따라 결정하였다. 결과를 표 3 에 나타내었다.
표적 세포 KE-4 CTL 에 의해 생성된 IFN-γ 의 양 (pg/ml)
VA-13 + HLA-A2402 342
VA-13 + HLA-A2402 + 클론 K 627
단지 HLA-A2402 로 전달감염된 VA-13 과 비교하여, KE-4CTL 은 HLA-A2402 및 클론 K 로 이중 전달감염된 VA-13 에 더욱 강하게 반응하여 더 많은 IFN-γ 를 생성하였다. 상기 결과는 클론 K 에 의해 코딩된 단백질이 종양 항원 단백질이라는 것을 가리킨다. 클론 K 에 의해 코딩된 종양 항원 단백질을 SART-3 이라 명명하였다 (T 세포-3 에 의해 인식되는 편평세포암종 항원).
실시예 3
종양 항원 단백질 유전자의 기본 서열 결정
실시예 2 에서 수득한, 종양 항원 단백질 SART-3 의 DNA 의 염기서열을 색소디옥시 종료 주기 서열분석 키트 (DyeDeoxy Terminator Cycle sequencing kit, Perkin-Elmer) 를 이용하여 결정하였다. 이에따라 결정된 염기 서열을 서열 번호:2 로 나타낸다. cDNA 의 전체 길이는 3798 bp 였다. 서열 번호: 2 의 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 (963 개 아미노산) 을 서열 번호: 1 로 나타낸다. GenBank 데이터 베이스를 사용하여 공지된 서열과 서열 번호: 2 로 나타내는 염기 서열을 비교한 결과 종양 항원 단백질 SART-3 의 염기 서열이, 그 기능이 증명되지 않은, 단일 염기로 나타낸 GenBank 에 등록된 승인 번호 D63879 하의 유전자 KIAA0156 (KIAA0156 의 위치 108) 과는 상이한 신규한 염기 서열을 갖는다.
실시예 4
후보 펩티드의 선택
HLA 항원에 결합하고 제시되는 항원 펩티드의 서열에는 특정한 규칙 (모티프) 이 있다. HLA-A24 의 모티프에 관해서는, 8 내지 11 개의 아미노산으로 구성된 펩티드 서열 중, 위치 2 의 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판이고, C-말단의 아미노산이 페닐알라닌, 트립토판, 류신, 이소류신, 또는 메티오닌인 것이 공지되어 있다 (Immunogenetics,41:178, 1995;J. Immunol.,152:3913, 1994;J. Immunol.,155:4307, 1994). 상기의 모티프에 근거하여, 서열 번호: 1 중 종양 항원 단백질 SART-3 의 아미노산 서열로부터 상기 모티프를 갖는 8 내지 11 개의 펩티드로 구성된 펩티드 부위를 선택하였다. 선택된 펩티드는 서열 번호: 3-24 에서 보여진다. 상기 펩티드들은 Fmoc 방법에 의해 Biologica Co. 에서 합성되었다.
이어서, 1.8 ×104의 VA-13 세포에 HLA-A2402 cDNA 의 재조합 플라스미드를 리포펙틴 방법으로 전달감염하여 HLA-A2402 를 문헌 (J. Exp. Med.,187:277, 1998) 에 따라 발현시켰다. 이들 세포에, 앞서 합성한 HLA-A24 에 대한 결합 모티프를 갖는, 다양한 펩티드를 10 μM 씩 2 시간동안 첨가하여 세포에 펄스를 주었다. 세포를 이어서 2x104의 KE-4CTL 세포와 18 시간동안 배양하고, KE-4CTL 에 의해 생산된 배양상청액 내 IFN-γ의 양을 ELISA 방법으로 측정한다. 상기 측정의 결과를 표 4 에 나타내었는데, 이는 종양 항원 단백질 SART-3 의 아미노산 서열 중 7 개의 펩티드, 즉, 위치 109 내지 위치 118 의 서열을 포함하는 펩티드 "109-118" (서열 번호: 3), 위치 172 내지 위치 181 의 서열을 포함하는 펩티드 "172-181" (서열 번호: 4), 위치 284 내지 위치 292 의 서열을 포함하는 펩티드 "284-292" (서열 번호: 5), 위치 315 내지 위치 323 의 서열을 포함하는 펩티드 "315-323" (서열 번호:6), 위치 416 내지 위치 425 의 서열을 포함하는 펩티드 "416-425" (서열 번호: 7), 위치 426 내지 위치 434 의 서열을 포함하는 펩티드 "426-434" (서열 번호: 8), 위치 448 내지 위치 456 의 서열을 포함하는 펩티드 "448-456" (서열 번호: 9) 상에서 수행된다.
펩티드 상층액 중 IFN-γ(pg/ml)
"109-118" 928
"172-181" 830
"284-292" 794
"315-323" 880
"416-425" 731
"426-434" 833
"448-456" 754
처리 안함 677
펩티드로 펄스하지 않은 세포와 비교하여, KE-4CTL 은 펩티드로 펄스한 세포와 더욱 강하게 반응하여 더 많은 IFN-γ를 생성하였다. 상기 결과는 7 개의 펩티드가 종양 항원 펩티드로서 기능함을 가리킨다.
실시예 5
종양 항원 펩티드의 합성
상기 기재된 7 개의 펩티드를 하기와 같은 고체상 방법에 의해 합성하였다.
(1) SART-3 "109"118" Val-Tyr-Asp-Tyr-Asn-Cys-His-Val-Asp-Leu (서열 번호: 3) 의 합성
수지로서 Fmoc-Leu-Alko 수지 (0.55 mmol/g, 100-200 메쉬) 를 사용하였다. 상기 수지의 100 mg 을 사용하여, 다음의 잔기를 순서대로 연결하기 위해 하기에 기술된 일정 1 에 따라 합성을 시작하였다: Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-His(Boc)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH,, Fmoc-Tyr(tBu)-OH 및 Fmoc-Val-OH. 연결을 마친 뒤, 일정 1 의 단계 3 까지의 절차를 수행하여 펩티드 수지를 얻었다.
상기 펩티드 수지에, 시약 K (페놀 5%, 티오아니졸 5%, 물 5%, 및 TFA 내의 에탄디티올 2.5% 용액) 2 ㎖ 을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2.5 시간 반응시킨다. 얼음에서 냉각시키면서, 디에틸 에테르 10 ㎖ 을 반응물에 첨가하고, 혼합액을 10 분간 교반하고, 여과하여, 디에틸 에테르 10 ㎖ 로 세척한다. 여과 덩어리에 수성 아세트산 10 ㎖ 를 첨가하고, 혼합액을 30 분간 교반한다. 이어서 수지를 여과하고, 수성 아세트산 4 ㎖ 로 세척한다. 여과액과 세척액을 동결탈수시킨 뒤,수득한 미정제 펩티드는 수성 아세트산에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA 로 사전평형시킨 역상 충전물 YMC-PACK ODS-A 칼럼 (30φx 250mm) 에 주입시킨다. 칼럼은 0.1 % 수성 TFA 로 세척하고, 이어서 180 분에 걸쳐 아세토니트릴의 농도를 25% 까지 증가시켜 나가면서 7 ㎖/분의 유속으로 용출한다. 용출물을 흡광도 220 ㎚ 로 모니터하였다. 의도하는 생성물을 포함하는 분획을 함께 수합하고 동결건조하여 Val-Tyr-Asp-Tyr-Asn-Cys-His-Val-Asp-Leu 31.0 mg 을 얻었다.
수득한 펩티드, Val-Tyr-Asp-Tyr-Asn-Cys-His-Val-Asp-Leu 은 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 농도 16 내지 46 % 의 직선 농도구배로 용출되는 역상 충전물 YMC-PACK ODS-AM 칼럼 (4.6φx 250mm) 을 이용한 분석에서 19.3 분의 정체 시간을 가지며, 생성물의 아미노산 분석 (Cys 는 검출되지 않음) 및 분자량 분광법 결과가 이론적인 수치와 일치하였다.
아미노산 분석
가수 분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 8 시간;
분석 방법: 닌히드린 방법;
*기준 아미노산; 괄호내에 이론적 수치가 표시됨.
Asx: 2.77 (3)
Val: 1.70 (2)
*Leu: 1.00 (1)
Tyr: 1.98 (2)
His: 0.91 (1)
분자량 분광법 (FAB)
[M+H]+: 1241
일정 1
단계 시간(분) x 처리횟수
1. (세척) DMF 1.2 ㎖ 1 x 2
2. (탈보호) 50% 피페리딘/DMF 12 x 1
3. (세척) DMF 1.2 ㎖ 1 x 7
4. (결합) 각 아미노-보호된 아미노산 (5 당량)/NMP 용액 0.9 ㎖, DIC (5 당량)/NMP 용액 0.3 ㎖ 30 x 1
5. (세척) DMF 1.2 ㎖ 1 x 2
6. (결합) 각 아미노-보호된 아미노산 (5 당량)/NMP 용액 0.9 ㎖, DIC (5 당량)/NMP 용액 0.3 ㎖ 30 x 1
7. (세척) DMF 1.2 ㎖ 1 x 4
(2) SART-3 "172-181" Leu-Phe-Glu-Lys-Ala-Val-Lys-Asp-Tyr-Ile (서열 번호: 4) 의 합성
상기 (1) 과 동일한 방식으로, Fmoc-Ile-Alko 수지 (1.41 mmol/g, 100-200 메쉬), Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Phe-OH 및 Fmoc-Leu-OH 를 100 mg 씩 사용하여 순서대로 결합시키고, 생성물의 보호기를 제거하였다. 수득한 미정제 펩티드를 수성 아세트산에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA 로 사전평형시킨 역상 충전물 YMC-PACK ODS-A 칼럼 (30φx 250mm) 에 주입시킨다. 칼럼은 0.1 % 수성 TFA 로 세척하고, 이어서 300 분간 아세토니트릴의 농도를 30% 까지 증가시켜 나가면서 생성물을 7 ㎖/분의 유속으로 용출한다. 용출물은 흡광도 220 ㎚ 로 모니터하였다. 의도하는 생성물을 포함하는 분획을 함께 수합하고 동결건조하여Leu-Phe-Glu-Lys-Ala-Val-Lys-Asp-Tyr-Ile 66.3 mg 을 얻었다.
수득한 펩티드, Leu-Phe-Glu-Lys-Ala-Val-Lys-Asp-Tyr-Ile 은, 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 농도 12 내지 42 % 의 직선 농도구배로 용출되는 역상 충전물 YMC-PACK ODS-AM 칼럼 (4.6φx 250mm) 을 이용한 분석에서 23.8 분의 정체 시간을 가지며, 생성물의 아미노산 분석 및 분자량 분광법 결과가 이론적인 수치와 일치하였다.
아미노산 분석
가수 분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 12 시간;
분석 방법: 닌히드린 방법;
*기준 아미노산; 괄호내에 이론적 수치가 표시됨.
Asx: 0.94 (1)
Glx: 1.03 (1)
Ala: 1.00 (1)
Ile" 0.92 (1)
*Leu: 1.00 (1)
Tyr: 0.96 (1)
Phe: 0.97 (1)
Lys: 1.45 (2)
분자량 분광법 (FAB):
[M+H]+: 1225
(3) SART-3 "284-292" Asn-Tyr-Asn-Lys-Ala-Leu-Gln-Gln-Leu 의 합성 (서열 번호: 5)
상기 (1) 과 동일한 방식으로, Fmoc-Leu-Alko 수지, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, 및 Fmoc-Asn-OH 를 100 mg 씩 사용하여 순서대로 결합시키고, 이어서 생성물의 보호기를 제거하였다. 수득한 미정제 펩티드를 수성 아세트산에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA 로 사전평형시킨 역상 충전물 YMC-PACK ODS-A 칼럼 (30φx 250mm) 에 주입시킨다. 칼럼은 0.1 % 수성 TFA 로 세척하고, 이어서 300 분간 아세토니트릴의 농도를 30 % 까지 증가시켜 나가면서 생성물을 7 ㎖/분의 유속으로 용출한다. 용출물은 흡광도 220 ㎚ 로 모니터하였다. 의도하는 생성물을 포함하는 분획을 함께 수합하고 동결건조하여 Asn-Tyr-Asn-Lys-Ala-Leu-Gln-Gln-Leu 25.0 mg 을 얻었다.
수득한 펩티드, Asn-Tyr-Asn-Lys-Ala-Leu-Gln-Gln-Leu 은, 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 농도 12 내지 42 % 의 직선 농도구배로 용출되는 역상 충전물 YMC-PACK ODS-AM 칼럼 (4.6φx 250mm) 을 이용한 분석에서 19.0 분의 정체 시간을 가지며, 생성물의 아미노산 분석 및 분자량 분광법 결과가 이론적인 수치와 일치하였다.
아미노산 분석
가수 분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 12 시간;
분석 방법: 닌히드린 방법;
*기준 아미노산; 괄호내에 이론적 수치가 표시됨.
Asx: 1.87 (2)
Glx: 2.03 (2)
Ala: 0.98 (1)
*Leu: 2.00 (2)
Tyr: 0.99 (1)
Lys: 0.97 (1)
분자량 분광법 (FAB):
[M+H]+: 1091
(4) SART-3 "315-323" Ala-Tyr-Ile-Asp-Phe-Glu-Met-Lys-Ile 의 합성 (서열 번호: 6)
상기 (1) 에서 기술된 것과 동일한 방식으로, Fmoc-Ile-Alko 수지 (0.62 mmol/g, 100-200 메쉬), Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, 및 Fmoc-Ala-OH 를 100 mg 씩 사용하여 순서대로 결합시키고, 이어서 생성물의 보호기를 제거하였다. 수득한 미정제 펩티드를 수성 아세트산에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA 로 사전평형시킨 역상 충전물 YMC-PACK ODS-A 칼럼 (30φx 250mm) 에 주입시킨다. 칼럼은 0.1 % 수성 TFA 로 세척하고, 이어서 180 분간 아세토니트릴의 농도를 40 % 까지 증가시켜 나가면서 생성물을 7 ㎖/분의 유속으로 용출한다. 용출물은 흡광도 220 ㎚ 로 모니터하였다. 의도하는 생성물을 포함하는 분획을 함께 수합하고 동결건조하여 Ala-Tyr-Ile-Asp-Phe-Glu-Met-Lys-Ile 15.4 mg 을 얻었다.
수득한 펩티드, Ala-Tyr-Ile-Asp-Phe-Glu-Met-Lys-Ile 은, 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 농도 21 내지 51 % 의 직선 농도구배로 용출되는 역상 충전물 YMC-PACK ODS-AM 칼럼 (4.6φx 250mm) 을 이용한 분석에서 19.6 분의 정체 시간을 가지며, 생성물의 아미노산 분석 (Met은 검출되지 않음) 및 분자량 분광법 결과가 이론적인 수치와 일치하였다.
아미노산 분석
가수 분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 12 시간;
분석 방법: 닌히드린 방법;
*기준 아미노산; 괄호내에 이론적 수치가 표시됨.
Asx: 1.91 (1)
Glx: 1.06 (1)
Ala: 1.06 (1)
Ile: 1.69 (2)
Tyr: 0.81 (1)
*Phe: 1.00 (1)
Lys: 0.87 (1)
분자량 분광법 (FAB):
[M+H]+: 1130
(5) SART-3 "416-425" Asp-Tyr-Val-Glu-Ile-Trp-Gln-Ala-Tyr-Leu 의 합성 (서열 번호: 7)
상기 (1) 에서 기술된 것과 동일한 방식으로, Fmoc-Leu-Alko 수지, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH 및 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 를 100 mg 씩 사용하여 순서대로 결합시키고, 이어서 생성물의 보호기를 제거하였다. 수득한 미정제 펩티드를 수성 아세트산에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA 로 사전평형시킨 역상 충전물 YMC-PACK ODS-A 칼럼 (30φx 250mm) 에 주입시킨다. 칼럼은 0.1 % 수성 TFA 로 세척하고, 이어서 180 분간 아세토니트릴의 농도를 35 % 까지 증가시켜 나가면서 생성물을 7 ㎖/분의 유속으로 용출한다. 용출물은 흡광도 220 ㎚ 로 모니터하였다. 의도하는 생성물을 포함하는 분획을 함께 수합하고 동결건조하여 Asp-Tyr-Val-Glu-Ile-Trp-Gln-Ala-Tyr-Leu 18.9 mg 을 얻었다.
수득한 펩티드, Asp-Tyr-Val-Glu-Ile-Trp-Gln-Ala-Tyr-Leu 은, 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 농도 25 내지 55 % 의 직선 농도구배로 용출되는 역상 충전물 YMC-PACK ODS-AM 칼럼 (4.6φx 250mm) 을 이용한 분석에서 20.5 분의 정체 시간을 가지며, 생성물의 아미노산 분석 (Trp 은 검출되지 않음) 및 분자량 분광법 결과가 이론적인 수치와 일치하였다.
아미노산 분석
가수 분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 10 시간;
분석 방법: 닌히드린 방법;
*기준 아미노산; 괄호내에 이론적 수치가 표시됨.
Asx: 1.00 (1)
Glx: 2.09 (2)
Ala: 1.04 (1)
Val: 0.89 (1)
Ile: 0.86 (1)
*Leu: 1.00 (1)
Tyr: 1.95 (2)
분자량 분광법 (FAB):
[M+H]+: 1300
(6) SART-3 "426-434" Asp-Tyr-Leu-Arg-Arg-Val-Asp-Phe 의 합성 (서열 번호: 8)
상기 (1) 에서 기술된 것과 동일한 방식으로, Fmoc-Phe-Alko 수지 (0.72 mmol/g, 100-200 메쉬), Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH 및 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 를 100 mg 씩 사용하여 순서대로 결합시키고, 이어서 생성물의 보호기를 제거하였다. 수득한 미정제 펩티드를 수성 아세트산에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA 로 사전평형시킨 역상 충전물 YMC-PACK ODS-A 칼럼 (30φx 250mm) 에 주입시킨다. 칼럼은 0.1 % 수성 TFA 로 세척하고, 이어서 240 분간 아세토니트릴의 농도를 25 % 까지 증가시켜 나가면서 생성물을 7 ㎖/분의 유속으로 용출한다. 용출물은 흡광도 220 ㎚ 로 모니터하였다. 의도하는 생성물을 포함하는 분획을 함께 수합하고 동결건조하여 Asp-Tyr-Leu-Arg-Arg-Val-Asp-Phe 34.0 mg 을 얻었다.
수득한 펩티드, Asp-Tyr-Leu-Arg-Arg-Val-Asp-Phe 은, 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 농도 12 내지 42 % 의 직선 농도구배로 용출되는 역상 충전물 YMC-PACK ODS-AM 칼럼 (4.6φx 250mm) 을 이용한 분석에서 20.1 분의 정체 시간을 가지며, 생성물의 아미노산 분석 및 분자량 분광법 결과가 이론적인 수치와 일치하였다.
아미노산 분석
가수 분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 12 시간;
분석 방법: 닌히드린 방법;
*기준 아미노산; 괄호내에 이론적 수치가 표시됨.
Asx: 1.90 (2)
Val: 0.95 (1)
*Leu: 1.00 (1)
Tyr: 1.00 (1)
Phe: 0.99 (1)
Arg: 2.93 (3)
분자량 분광법 (FAB):
[M+H]+: 1239
(7) SART-3 "448-456" Ala-Phe-Thr-Arg-Ala-Leu-Glu-Tyr-Leu 의 합성 (서열 번호: 9)
상기 (1) 에서 기술된 것과 동일한 방식으로, Fmoc-Leu-Alko 수지, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH 및 Fmoc-Ala-OH 를 100 mg 씩 사용하여 순서대로 결합시키고, 이어서 생성물의 보호기를 제거하였다. 수득한 미정제 펩티드를 수성 아세트산에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA 로 사전평형시킨 역상 충전물 YMC-PACK ODS-A 칼럼 (30φx 250mm) 에 주입시킨다. 칼럼은 0.1 % 수성 TFA 로 세척하고, 이어서 240 분간 아세토니트릴의 농도를 30 % 까지 증가시켜 나가면서 생성물을 7 ㎖/분의 유속으로 용출한다. 용출물은 흡광도 220 ㎚ 로 모니터하였다. 의도하는 생성물을 포함하는 분획을 함께 수합하고 동결건조하여 Ala-Phe-Thr-Arg-Ala-Leu-Glu-Tyr-Leu 22.8 mg 을 얻었다.
수득한 펩티드, Ala-Phe-Thr-Arg-Ala-Leu-Glu-Tyr-Leu 은, 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 농도 20 내지 50 % 의 직선 농도구배로 용출되는 역상 충전물YMC-PACK ODS-AM 칼럼 (4.6φx 250mm) 을 이용한 분석에서 18.1 분의 정체 시간을 가지며, 생성물의 아미노산 분석 및 분자량 분광법 결과가 이론적인 수치와 일치하였다.
아미노산 분석
가수 분해: 1% 페놀/ 6N 수성 염산, 110℃, 12 시간;
분석 방법: 닌히드린 방법;
*기준 아미노산; 괄호내에 이론적 수치가 표시됨.
Thr: 0.91 (1)
Glx: 1.03 (1)
A;a: 1.91 (2)
*Leu: 2.00 (2)
Tyr: 1.00 (1)
Phe: 0.97 (1)
Arg: 0.97 (1)
분자량 분광법 (FAB):
[M+H]+: 1083
실시예 6
종양 항원 펩티드 및 이들의 유도체에 의한 말초 혈액 임파구로부터 CTL 의 유도
실시예 5 에서 합성된 펩티드 "109-118" (서열 번호: 3) 및 "315-323" (서열 번호: 6) 를 이용하여 말초 혈액 임파구로부터 항원-특이적 CTL 이 유도될 수 있는지 여부를 조사하였다.
임파구는 Ficoll 방법을 이용하여 HLA-A 유전자좌의 A24 가 이종접합인 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 분리되었다 (각각 HD1 및 HD2 로서 언급됨). 임파구는 2x106세포/웰씩 24 웰 플레이트에 놓여지고, 임파구 배지에서 배양되었다. 상기 종양 항원 펩티드를 10μ몰농도로 배양배지에 첨가하여 말초 혈액 임파구를 자극하였다. 일주일 후, 두번째 자극을 위해 X-레이 (50 Gy) 조사된 말초 혈액 임파구 2x105세포와 함께 상기 종양 항원 펩티드를 10μ몰농도로 첨가하였다. 다시 일주일 후, 세번째 자극을 유사한 방식으로 수행하였다. 배양된 임파구를 세번째 자극의 일주일 후, 수확하였다. SART-3 을 발현하는 HLA-A2402-양성 백혈병 T 세포계인 MT-2 및, SART-3 을 발현하는 HLA-A2402-음성 백혈병 T 세포계인 RPMI8402 을 표적 세포 (1x104) 로 사용하여, 표적 세포에 대한 반응으로 상기 임파구 (8x104세포) 가 생산하는 배양 배지 내 IFN-γ의 양을 실시예 1 에서와 유사한 ELISA 에 의해 측정한다. 결과는 표 6 에서 보여진다.
상층액 중 IFN-γ(pg/ml)
HD1 HD2
항원 펩티드 MT-2 RPMI8402 MT-2 RPMI8402
"109-118" 1771 159 2078 28
"315-323" 2041 26 974 40
처리안함 552 154 413 69
"109-118" 및 "315-323" 펩티드로 자극한 말초 혈액 임파구는 RPMI8402 (HLA-A24-음성) 이 아닌 MT-2 (HLA-A24-양성) 에 반응하는데, 이는 HLA-A24-제한적인 종양 항원 펩티드-특이적 CTL 의 유도임을 시사한다.
마찬가지로, HLA-A24 cDNA 발현용 플라스미드를 이입하고 상기 펩티드로 펄스를 준 COS-7 세포 (ATCC 번호. CRL1651) 또는 VA-13 세포 (리켄 세포 은행, 이화학 연구소) 가 상기 실험에서의 MT-2 대신 쓰이는 유사한 실험을 수행하였다 (J. Exp. Med.,187:277, 1998).
실시예 7
결장암 유래의 종양-침윤 임파구 (TILs) 로부터의 세포독성 T 임파구 (CTL) 의 구축
S 상 결장암 (HLA-A0207-양성) 을 앓는 환자로부터 취한 외과적인 샘플로부터의 TIL 을, 45 % RPMI, 45 % AIM-V (GIBCO BRL), 및 0.1 mM NEAA (GIBCO BRL) 및 100 U/ml 인터루킨-2 가 추가된 10 % FCS 로 이루어진 배양 매질 (이하에서 임파구 매질로서 언급됨) 중 24-웰 플레이트에서 배양하였다. 배양 후 처음 이틀 동안, 항-CD3 항체 NUT3 (Nichirei Corporation) 을 1 μg/ml 로 배양 매질에 첨가하였다. 30 일을 초과하여 계속 배양하고, HLA-A2 에 한정된 CTL 계를 구축하고, CTL 계를 OK-CTL 로 명명하였다. OK-CTL 은 산업 과학기술처, 국립 생명과학 인간기술 연구소 (The National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology)(1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) 에 수탁되었다 (미생물 명칭: OK-CTL; 수탁일: 1999, 8, 3; 수탁번호: FERM BP-6818).
[Nakao 등, Cancer Res., 55:4248-4252 (1995)] 의 명세서에 따르면, 재조합 플라스미드는, HLA-A0201 (GenBank 승인 번호 M84379) 의 cDNA 를 발현 벡터 pCR3 (INVITROGEN) 에 이입시킨 SW620 세포 (ATCC 번호 CCL-227) 로부터 제조된다. 표적 세포로서, 실시예 1 과 유사한 리포펙틴법을 사용하여 HLA-A0201 cDNA 가 이입된 재조합 플라스미드, 및 SART-3 유전자 cDNA 가 이입된 재조합 플라스미드 클론 K 으로 아프리카산 녹색 원숭이 신장으로부터 유래된 세포계 COS-7 (ATCC 번호 CRL 1651) 을 이중 전달감염시켜서 제조된 형질전환주를 사용하여, 표적 세포에 반응하여 5 ×104OK-CTL 에 의해 생성되는 IFN-γ의 양을 ELISA 에 의해 측정하였다. 대조군으로서, 플라스미드를 전달감염되지 않은 비처리군, 및 재조합 플라스미드 클론 K 및 HLA-A2402 cDNA 가 이입된 재조합 플라스미드를 이중 전달이입된 군을 고안하였다. 결과를 하기 표 7 에 나타낸다.
표적 세포 OK-CTL 에 의해 생성된 IFN-γ의 양 (pg/ml)
COS-7 653
COS-7 + HLA-A0201 + K 2401
COS-7 + HLA-A2402 + K 600
OK-CTL 은 SART-3 유전자 cDNA 가 이입된 재조합 플라스미드 클론 K 및 HLA-A0201 cDNA 가 이입된 재조합 플라스미드로 이중 전달감염된 표적 세포와 더욱 강하게 반응하여, 다른 표적 세포군과 비교하여 더 많은 IFN-γ 를 생산해냈다. 상기 결과는 종양 항원 단백질 SART-3 의 항원 펩티드가 HLA-A0201 상에 제시되어 있고, OK-CTL 이 그것을 인식하고, SART-3 이 HLA-A2-한정된 종양 항원 펩티드를 포함한다는 것을 가리킨다.
실시예 8
HLA-A2-한정된 종양 항원 펩티드의 확인
서열 번호: 1 에 나타낸 종양 항원 단백질 SART-3 의 아미노산 서열을 토대로, HLA-A-0201 에 결합할 수 있는 것으로 기대되는 9 또는 10 개의 아미노산 잔기로 구성된 펩티드 서열을, 인터넷 상에서 소프트웨어 NIH BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/) 를 사용하여 찾았다. 찾은 펩티드의 예를 서열 번호: 25-52 에 나타냈다. 상기 펩티드를 Biologica Co. 에서 Fmoc 방법에 의해 합성하였다.
그 후, HLA-A0201 양성이고 내인성 펩티드를 제시할 능력이 결여된 T-B 히브리도마 세포계, 1 ×104개 T2 세포를, 10 μM 에서 2 시간에 걸쳐 미리 합성된 HLA-A0201 에 결합할 수 있을 것으로 기대되는 각각의 펩티드로 펄스하였다. 그 후 세포를 6 ×104개 OK-CTL 과 18 시간 동안 배양시키고, 배양액 상층액 중 OK-CTL 에 의해 생성되는 IFN-γ의 양을 ELISA 로 측정하였다. 상기 측정 결과를 표 8 에 나타내었는데, 이는 종양 항원 단백질 SART-3 의 아미노산 서열 중 5 개의 펩티드, 즉, 위치 152 내지 위치 160 의 서열을 포함하는 펩티드 "152-160" (서열 번호: 25), 위치 249 내지 위치 257 의 서열을 포함하는 펩티드 "249-257" (서열 번호: 26), 위치 302 내지 위치 310 의 서열을 포함하는 펩티드 "302-310" (서열 번호: 27), 위치 309 내지 위치 317 의 서열을 포함하는 펩티드 "309-317" (서열 번호: 28), 위치 386 내지 위치 394 의 서열을 포함하는 펩티드 "386-394" (서열 번호: 29) 상에서 수행되었다.
펩티드 상층액 중 IFN-γ(pg/ml)*
"152-160" 162
"249-257" 209
"302-310" 190
"309-317" 231
"386-394" 122
*) 상기 값은 펩티드로 펄스되지 않은 T2 세포에 의해 생성된 IFN-γ의 양을 뺀 값이다.
KE-4CTL 이 펩티드로 펄스된 세포와 더욱 강하게 반응하여, 펩티드로 펄스되지 않은 세포와 비교하여 더 많은 IFN-γ 를 생성하였다. 상기 결과는 5 개의 펩티드가 HLA-A2-한정된 종양 항원 펩티드로서 기능한다는 것을 가리킨다.
마찬가지로, HLA-A0201 cDNA 의 발현용 플라스미드가 도입된 COS-7 세포 (ATCC 번호. CRL1651) 또는 VA-13 세포 (리켄 세포 은행, 이화학 연구소) 가 상기 실험에서의 T2 대신 사용된 유사한 실험을 수행하였다 (J. Exp. Med., 187:277, 1998).
서열 목록 프리 텍스트
서열번호: 53 에 나타낸 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판이며, 및 10 번째 아미노산은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이다.
서열번호: 54 에 나타낸 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 페닐알라닌,티로신, 메티오닌, 또는 트립토판이며, 및 10 번째 아미노산은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이다.
서열번호: 55 에 나타낸 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판이며, 및 9 번째 아미노산은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이다.
서열번호: 56 에 나타낸 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판이며, 및 9 번째 아미노산은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이다.
서열번호: 57 에 나타낸 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판이며, 및 10 번째 아미노산은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이다.
서열번호: 58 에 나타낸 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판이며, 및 9 번째 아미노산은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이다.
서열번호: 59 에 나타낸 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 또는 트립토판이며, 및 9 번째 아미노산은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌이다.
서열번호: 60 에 나타낸 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 또는 글루타민이며, 및 9 번째 아미노산은 발린 또는 류신이다.
서열번호: 61 에 나타낸 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 또는 글루타민이며, 및 9 번째 아미노산은 발린 또는 류신이다.
서열번호: 62 에 나타낸 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 또는 글루타민이며, 및 9 번째 아미노산은 발린 또는 류신이다.
서열번호: 63 에 나타낸 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 또는 글루타민이며, 및 9 번째 아미노산은 발린 또는 류신이다.
서열번호: 64 에 나타낸 아미노산 서열에서, 두번째 아미노산은 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 또는 글루타민이며, 및 9 번째 아미노산은 발린 또는 류신이다.
본 발명에 따라, 신규 종양 항원 단백질 및 그의 유전자, 상기 종양 항원 단백질 유래의 종양 항원 펩티드 및 그의 유도체, 뿐만 아니라 상기 종양 항원 단백질, 유전자, 종양 항원 펩티드, 또는 그의 유도체를 생체 내 또는 시험관 내에서 이용하는 치료제, 예방제 또는 진단제가 제공될 수 있다.

Claims (31)

  1. 서열번호:1에 나타낸 아미노산 서열로 구성되는 단백질, 또는 서열번호:1의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 구성되는 단백질 변이형 (단, 상기 단백질 및 단백질 변이형이 HLA 항원에 결합할 수 있고, 세포독성 T 임파구에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드를 발생시킴)을 코딩하는 DNA.
  2. 서열번호:2 에 나타낸 염기서열로 구성되는 DNA, 또는 엄격한 조건하에 상기 DNA에 잡종화(hybridize)되는 DNA 변이형 (단, DNA 또는 DNA 변이형에 의해 생성되고 발현되는 단백질은 HLA 항원에 결합할 수 있고, 세포독성 T 임파구에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드를 발생시킴).
  3. 제 1 항 또는 제 2 항의 DNA를 포함하는 발현 플라스미드.
  4. 제 3 항의 발현 플라스미드로 형질전환된 형질전환체.
  5. 제 4 항의 형질전환체를 배양하고, 발현된 재조합 단백질을 회수하는 것을 포함하는 재조합 단백질의 제조 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항의 DNA에 의해 코딩되거나, 또는 제 5 항의 방법에 의해 제조되는 종양 항원 단백질.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항의 DNA, 또는 제 6 항의 단백질을 유효성분으로서 함유하는 약제 조성물.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항의 DNA, 또는 제 6 항의 단백질을 유효성분으로서 함유하는 종양 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물.
  9. 제 6 항의 단백질 유래의 부분적인 펩티드이고, HLA 항원에 결합할 수 있고, 세포독성 T 임파구에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드, 또는 동일한 기능성을 갖는 그의 유도체.
  10. 제 9 항에 있어서, HLA 항원이 HLA-A24 또는 HLA-A2인 종양 항원 펩티드, 또는 동일한 기능성을 갖는 그의 유도체.
  11. 제 10 항에 있어서, 서열번호:3 내지 52 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 종양 항원 펩티드, 또는 동일한 기능성을 갖는 그의 유도체.
  12. 제 11 항에 있어서, 서열번호: 3 내지 9 및 25 내지 29 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 종양 항원 펩티드, 또는 동일한 기능성을 갖는 그의 유도체.
  13. 제 11 항에 있어서, 서열번호: 3 내지 52 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 2 위치 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 또다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체.
  14. 제 13 항에 있어서, 서열번호: 3 내지 9 및 25 내지 29 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 2 위치 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 또다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체.
  15. 제 13 항에 있어서, 서열번호: 3 내지 24 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 2 위치의 아미노산 잔기가 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체.
  16. 제 13 항에 있어서, 서열번호: 25 내지 52 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열에서 2 위치의 아미노산 잔기가 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 또는 글루타민으로 치환되고, 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가 발린 또는 류신으로 치환된 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체.
  17. 제 14 항에 있어서, 서열번호: 53 내지 64 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부로부터 선택되는 서열을 포함하는 종양 항원 펩티드 유도체.
  18. 제 9 항 내지 제 17 항 중 어느 하나에 따른 종양 항원 펩티드 및 그의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 유효성분으로서 함유하는 종양 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물.
  19. 제 9 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체를 코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하는 재조합 DNA.
  20. 제 19 항의 재조합 DNA를 발현시킴으로써 수득될 수 있는 재조합 폴리펩티드.
  21. 제 19 항의 재조합 DNA 또는 제 20 항의 재조합 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 종양 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물.
  22. 제 6 항의 종양 항원 단백질, 및 제 9 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 중의 어느 하나에 특이적으로 결합하는 항체.
  23. 종양환자로부터 단리된, 항원-제시능을 갖는 세포의 표면에, HLA 항원 및 제 9 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 간의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포.
  24. HLA 항원 및 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 간의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포로서, 상기 항원-제시 세포는 종양환자로부터 단리된, 항원-제시능을 갖는 세포를 제 1 항 또는 제 2 항의 DNA, 제 6 항의 종양 항원 단백질, 제 19 항의 재조합 DNA, 또는 제 20 항의 재조합 폴리펩티드로 이입시킴으로써 수득될 수 있는 항원-제시 세포.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항의 항원-제시 세포를 유효성분으로서 함유하는 종양 치료를 위한 약제 조성물.
  26. HLA 항원 및 상기 제 9 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 임파구.
  27. 제 23 항 또는 제 24 항의 항원-제시 세포 상에 제시되는, HLA 항원 및 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체 간의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 임파구.
  28. 제 26 항 또는 제 27 항의 세포독성 T 임파구를 유효성분으로서 함유하는 종양 치료를 위한 약제 조성물.
  29. 제 9 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 종양 항원 펩티드 또는 그의 유도체, 제 6 항의 단백질, 또는 제 20 항의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 종양 진단제.
  30. 기탁번호 FERM-6818인 세포독성 T 임파구 OK-CTL.
  31. 제 30 항의 OK-CTL를 사용하는 것을 포함하는, 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드를 동정하는 방법.
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