ES2296778T3 - Procedimiento de seleccion de peptidos utilizables en inmunoterapia. - Google Patents

Procedimiento de seleccion de peptidos utilizables en inmunoterapia. Download PDF

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Abstract

Procedimiento de identificación de epítopos subdominantes/crípticos presentados por la molécula HLA A2.1 de clase I, caracterizado porque comprende al menos las siguientes etapas:

Description

Procedimiento de selección de péptidos utilizables en inmunoterapia.
La vacunación o inmunoterapia peptídica es un enfoque terapéutico que actualmente es objeto de un gran interés en el marco de la prevención o del tratamiento de las patologías virales o cancerosas. Su principio se basa en la inmunización mediante péptidos que producen epítopos T de antígenos virales o tumorales reconocidos por las células T citotóxicas (CTL), en general de tipo CD8^{+}, que juegan un papel principal en la eliminación de las células que expresan estos antígenos en su superficie.
Se recordará que las CTL no reconocen los antígenos proteicos completos, sino fragmentos peptídicos de estos últimos, que comprenden generalmente de 8 a 10 aminoácidos, presentados por las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de la clase I (CMH I) expresadas en la superficie de diferentes células. La presentación de estos péptidos es el resultado de un proceso complejo, denominado "preparación del antígeno", que implica tres etapas principales:
- la degradación citosólica de las proteínas antigénicas mediante un complejo multienzimático denominado proteosoma;
- la translocación de los péptidos obtenidos de esta degradación en el retículo endoplasmático (RE) mediante los transportadores TAP;
- la asociación de estos péptidos con las dos cadenas del CMH I para formar complejos estables péptido/CMH I, que se transportarán a la superficie celular.
Los complejos péptidos/CMH I interactúan con los receptores del antígeno (TCR) correspondientes de los linfocitos T. Esta interacción induce la estimulación de estos linfocitos y su división celular (proliferación clonal) que desemboca en la generación de linfocitos efectores que tienen el mismo TCR, que asegurarán la eliminación del agresor contra cuyos antígenos se ha inducido la respuesta inmune.
Durante el proceso de preparación, se realiza una selección de los péptidos, que desemboca en una jerarquía de presentación por el CMH I en la superficie de la célula. La representación de los epítopos en la superficie celular dependerá particularmente de la estabilidad de la proteína antigénica en el citosol, de los sitios y de la frecuencia de los cortes efectuados por el proteosoma, de la eficacia de la translocación en el RE por los transportadores TAP y sobre todo de la capacidad de los péptidos para fijarse a las diferentes moléculas de CMH I y para formar complejos péptido/CMH I estables.
Los péptidos presentados preferiblemente por el CMH como resultado del proceso de preparación constituyen epítopos inmunodominantes, que son los participantes principales en la respuesta de CTL a los antígenos nativos de los que se obtienen. Por el contrario, los péptidos que se presentan solamente de forma reducida constituyen epítopos subdominantes/crípticos que no participan o participan muy poco en esta respuesta.
Se ha propuesto la utilización de péptidos correspondientes a los presentados por el CMH I para inducir una respuesta protectora, particularmente contra antígenos virales o tumorales.
De este modo se ha demostrado que las vacunas basadas en péptidos inmunodominantes, generalmente seleccionados en base a su gran afinidad por las moléculas de CMH I, permitirían asegurar una protección antiviral o antitumoral en numerosos modelos experimentales de ratones y, más recientemente, en seres humanos [SCHULTZ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 991 (1991); KAST et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2283, (1991); MARCHAND et al., Int. J. Cancer, 80, 219, (1999); ROSENBERG et al., Nature Med., 4, 321, (1998)].
Sin embargo, también se ha demostrado recientemente que la vacunación con péptidos inmunodominantes podría, en ciertos casos, mostrarse ineficaz. De este modo, durante la infección crónica con un virus cuyo índice de mutación sea elevado, como el HIV o el VHB, la presión de selección impuesta por la respuesta CTL antiviral natural favorece la supervivencia de variantes que hayan mutado en la secuencia de sus péptidos inmunodominantes. Estas variantes ya no son reconocidas por las CTL específicas de epítopos inmunodominantes [KLENERMAN et al., Nature, 369, 403, (1994); BERTOLETTI et al., Nature, 369, 407, (1994); MOSKOPHIDIS y ZINKERNAGEL, J. Virol., 69, 2187, (1995); BORROW et al., Nat. Med., 3, 205, (1997); GOULDER et al., Nat. Med., 3, 212, (1997)].
También, en el caso de tumores que expresan con índices elevados las proteínas que también se expresan en tejidos normales, y que constituyen "antígenos de sí mismos", puede desarrollarse un fenómeno de tolerancia. Esta tolerancia se refiere principalmente a los epítopos inmunodominantes con gran afinidad por MHC. La estimulación del repertorio CTL específico de estos epítopos no parece por lo tanto ser la mejor vía para obtener una protección antitumoral eficaz.
Por lo tanto, se ha propuesto la utilización de epítopos subdominantes/crípticos, de afinidad reducida por el CMH. En el caso de la vacunación antiviral, estos epítopos, que no se someten a una presión de selección similar a la de los epítopos inmunodominantes, pueden representar dianas útiles para eliminar estos virus de tipo silvestre así como sus variantes. En el caso de la vacunación antitumoral, los epítopos de afinidad reducida solamente participan muy poco o no participan en el establecimiento de la tolerancia, y el repertorio de CTL antitumorales específicas de estos epítopos, podría seguir estando disponible para un reclutamiento in vivo.
En los trabajos anteriores, los inventores han demostrado [OUKKA et al., J. Immunol., 157, 3039, (1996)] que era posible utilizar péptidos subdominantes/crípticos en la vacunación antiviral. También han observado que la eficacia de la protección inducida por epítopos subdominantes/crípticos era inferior a la obtenida con la vacunación mediante el péptido dominante, pero que podía aumentarse haciendo a estos péptidos más inmunógenos mediante el aumento de su afinidad por el CMH I [TOURDOT et al., J. Immunol., 159, 2391, (1997)].
La estrategia habitual para aumentar la inmunogenicidad de estos epítopos virales o tumorales, consiste en aumentar su afinidad por el CMH I y/o la estabilidad del complejo péptido/CMH I mediante sustituciones de aminoácidos. Se ha observado en efecto que los péptidos capaces de formar un complejo con un alelo de CMH dado tienen en común la presencia, en algunas posiciones, de restos de aminoácidos conservados. Se ha definido de este modo para cada alelo del CMH I un motivo de anclaje específico que implica aminoácidos denominados "restos de anclaje primarios". También se ha demostrado que los restos situados fuera de los sitios de anclaje (restos de anclaje secundarios) podían ejercer un efecto favorable o desfavorable sobre la afinidad del péptido por el CMH; la presencia de estos restos de anclaje secundarios permite explicar que existe, dentro de los péptidos que poseen el mismo motivo de anclaje específico para un CMH I dado, una gran variabilidad en la afinidad de fijación y que los péptidos que no tienen el motivo de anclaje primario completo pueden ser presentados por moléculas de CMH I y poseer una gran afinidad por estas moléculas.
De este modo han aparecido numerosos equipos para aumentar la inmunogenicidad de péptidos identificados como inmunógenos virales o tumorales potenciales, aumentando su afinidad por el CMH I. Por ejemplo, en ratones, LIPFORD et al., [Vaccine, 13, 313, (1995)] han demostrado que la sustitución de D por I en posición 2 del péptido en el epítopo 50-57 de Ag E6.1 del papilomavirus presentado por la molécula K^{b} aumentaba la estabilidad de los complejos formados con la molécula K^{b}, y hacía al epítopo inmunógeno in vivo, reconociendo los CTL inducidos las células transformadas por el papilomavirus. BRISTOL et al., [J. Immunol., 160, 2433, (1998)] también han demostrado que la sustitución del resto V en posición C-terminal del epítopo 4-12 del oncogén Ras p21 mutado, por I o L, que son aminoácidos de anclaje en posición 9 específicos de la molécula K^{d}, permitía la inducción de una respuesta de CTL específica en el ratón BALB/c. HUDRISIER et al., [Mol. Immunol., 32, 895, (1995)] han identificado los restos del péptido SMIENLEYM (SEC ID Nº 1) que intervienen en la unión a la molécula D^{b}, y han producido una serie de péptidos de gran afinidad, obtenidos de la secuencia X^{1}AIX^{4}NAEAL (SEC ID Nº 2) en la que X^{1} = Y o K y X^{4} =
E o K.
En el ser humano, POGUE et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 8166, (1995)] han sustituido aminoácidos en diferentes posiciones del epítopo inmunógeno 767-484 de la transcriptasa inversa del virus HIV-1, presentado por la molécula HLA A2.1 con una gran afinidad y han demostrado que la sustitución por Y o F del resto en posición 1 aumentaba la ya gran afinidad del péptido y su capacidad para inducir CTL a partir de PBL de donantes seropositivos que poseían el alelo HLA A2.1. PARKHURST et al., [J. Immunol., 157, 2539, (1996)] han realizado sustituciones únicas en las posiciones 1, 2, 3, o dobles en las posiciones 1 y 2 ó 2 y 3, en epítopos inmunógenos gp100 209, gp100 280 y gp100 154 del Ag gp100 asociado al melanoma y han demostrado que los epítopos modificados gp100 209 2M, y gp200 280 9V tenían una mayor afinidad que el epítopo no modificado. BAKKER et al., [Int. J. Cancer, 70, 302, (1997)] han obtenido mediante sustitución en una de las posiciones de anclaje (posición 2) o fuera de las posiciones de anclaje (posición 8), variantes del epítopo gp100 154, que poseen una mayor afinidad que el epítopo nativo. SAROBE et al., [J. Clin. Invest., 102, 1239, (1998)] han obtenido una variante inmunógena del epítopo C7A de la proteína núcleo del virus HCV presentado por HLA A2.1. VALMORI et al., [J. Immunol., 160, 1750, (1998)] han obtenido un derivado con gran afinidad del epítopo 26-35 del antígeno de melanoma MART-1 presentado por HLA A2.1. MICHELETTI et al., [Eur. J. Immunol. 1999, 29, 2579] han efectuado sustituciones sencillas o dobles en las posiciones 1 y/o 3 del péptido CLG que procede de la proteína LMP-2 del virus EBV. En su forma nativa, este péptido tiene gran afinidad por la molécula de CMH y es inmunógeno. Los autores han observado que las variantes A3 e Y1-A3 obtenidas del péptido CLG tienen mayor afinidad que el péptido nativo y estimulan una respuesta inmunológica más fuerte.
Por lo tanto parecería posible aumentar la inmunogenicidad de los epítopos subdominantes/crípticos para utilizarlos en inmunoterapia. Sin embargo, esto necesita la identificación previa de estos epítopos. Ahora bien, esto sigue siendo problemático, debido precisamente a su reducida inmunogenicidad.
Con el fin de resolver este problema, los inventores investigaron si era posible definir reglas generales de sustitución de los aminoácidos que permitieran aumentar la afinidad y por lo tanto la inmunogenicidad de la mayoría de los epítopos tumorales presentados por el CMH (por las moléculas HLA A2.1) y, de forma general independientemente de su secuencia de origen, la de los que poseen o no los aminoácidos de anclaje específicos de esta molécula.
De este modo los inventores han observado que la única sustitución del aminoácido N-terminal por un resto tirosina aumentaba, fuera cual fuera la secuencia de péptido nativo, la afinidad de este péptido por las moléculas HLA de clase I y particularmente la molécula HLA A2.1 y la estabilidad del complejo péptido/CMH I formado, y esto en una proporción tanto mayor cuanto más reducida era la afinidad del péptido nativo. Han observado además que los péptidos modificados de esta manera conservaban la especificidad antigénica de los péptidos naturales y se volvían inmunógenos y capaces de reclutar in vivo un repertorio de CTL específico del péptido nativo correspondiente.
La presente invención se refiere a un procedimiento de identificación de epítopos subdominantes/crípticos presentados por la molécula HLA A2.1 de clase I, caracterizado porque comprende al menos las siguientes etapas:
a) la selección, a partir de la secuencia de una proteína contra la que se desea inducir una respuesta citotóxica T, de al menos una secuencia peptídica de 8 a 11 aminoácidos que posee todo o parte del motivo de anclaje primario de la molécula HLA A2.1 y tal que el complejo de este péptido con la molécula HLA A2.1 posea una DC50 inferior a 2 horas;
b) la preparación, para cada secuencia seleccionada, de un péptido variante obtenido a partir de dicha secuencia mediante sustitución del aminoácido N-terminal por un resto tirosina;
c) la determinación de la inmunogenicidad de cada péptido variante obtenido en la etapa b) mediante la selección, entre estos, de cada péptido inmunógeno que genera una respuesta CTL específica contra células diana que expresan la proteína de la que se ha obtenido la secuencia peptídica seleccionada en la etapa a) y la identificación de la secuencia peptídica de la que se obtiene dicho péptido inmunógeno.
En el marco de la exposición de la presente invención, se entiende por "péptido inmunógeno" un péptido capaz de inducir una respuesta CTL específica y por "péptido no inmunógeno" un péptido incapaz de inducir una respuesta CTL específica.
La elección de las secuencias peptídicas que pueden constituir los epítopos presentados por una molécula HLA de clase 1, HLA A2.1 puede realizarse, de forma convencional, mediante el análisis de la secuencia peptídica de la proteína seleccionada, para seleccionar los péptidos que poseen en todo o en parte el motivo de anclaje primario de una molécula HLA A2.1 (L en posición 2 y/o V/L en posición C terminal). Por supuesto se eliminarán los péptidos que se sabe que son inmunógenos. Opcionalmente, podrá realizarse una selección complementaria de los péptidos cuya capacidad de unión potencial a HLA A2.1, predicha mediante el análisis informático, aparecía como la menor. Los algoritmos que pueden utilizarse para este fin se conocen en sí mismos; como ejemplo se mencionarán los descritos por PARKER et al. [J. Immunol., 152, 163, (1994)].
Este análisis podrá completarse ventajosamente mediante la determinación experimental de la afinidad de unión del péptido por HLA A2.1 y de la estabilidad del complejo péptido/HLA 12.1. Los péptidos no inmunógenos presentan generalmente una afinidad reducida por HLA de clase 1 y/o forman con este último un complejo poco estable. Los métodos para determinar la afinidad del péptido por HLA A2.1 y la estabilidad del complejo formado se conocen en sí mismos. Se mencionarán por ejemplo el descrito por FIRAT et al. [Eur. J. Immunol. 29, 3112 (1999)].
La afinidad de un péptido por HLA de clase I, particularmente HLA A2.1 se define generalmente con respecto a la de un péptido de referencia, en forma de afinidad relativa. La afinidad relativa se define como la proporción de la concentración de dicho péptido que permite la formación de cierta cantidad de complejo péptido/HLA de clase I, con respecto a la concentración del péptido de referencia que permite la formación, en las mismas condiciones, de la misma cantidad de complejo péptido/HLA de clase I. En este caso, cuanto mayor sea la afinidad relativa, menor será la afinidad de unión del péptido por HLA de clase I.
Como ejemplo, para un complejo péptido/HLA A2.1, tomando como péptido de referencia el péptido de secuencia IVGAETFYV (SEC ID Nº 3), más del 84% de los péptidos no inmunógenos tendrá habitualmente una afinidad relativa superior a 10.
La estabilidad del complejo péptido/HLA A2.1 se define a menudo mediante el DC50 que representa el tiempo necesario para disociación del 50% de los complejos formados. Generalmente, este periodo de tiempo es inferior a 2 horas para los péptidos no inmunógenos [VAN DER BURG et al., J. Immunol., 156, 3308 (1996)].
De este modo, si un péptido presentado por HLA A2.1, posee una afinidad relativa (con respecto a HIVpol 589) superior a 10 y un DC50 inferior a 2 horas, muy probablemente será no inmunógeno.
La inmunogenicidad de los péptidos retenidos en la etapa c) podrá verificarse fácilmente, por ejemplo mediante métodos convencionales de determinación de la capacidad de este péptido para generar, in vivo, ex vivo o in vitro una respuesta CTL específica contra células diana que expresan la proteína de la que se ha obtenido.
Una vez realizada esta elección, los péptidos variantes, obtenidos a partir de secuencias conservadas mediante sustitución del aminoácido N terminal por un resto tirosina, pueden prepararse muy fácilmente, particularmente mediante síntesis peptídica, de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en sí mismas por el especialista en la técnica.
Antes de la detección de la inmunogenicidad de estos péptidos variantes, realiza en la etapa c) del procedimiento de acuerdo con la invención, dicho procedimiento comprende una preselección de dichos péptidos variantes mediante la determinación de la afinidad relativa del péptido por una molécula HLA A2.1 y/o de la estabilidad del complejo péptido/HLA de clase I formado, y la selección de los péptidos variantes que presentan una afinidad relativa por HLA A2.1 inferior a la de los péptidos nativos de los que se obtienen y/o un DC50 superior a 2 horas.
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Cada péptido que responde a estos criterios puede ensayarse a continuación, para determinar si puede inducir un repertorio CTL específico del péptido nativo no inmunógeno del que se obtiene, y capaz particularmente de conllevar la lisis de las células diana que expresan la proteína nativa de la que se obtiene el péptido no inmunógeno.
Si este ensayo es positivo, puede considerarse que este péptido nativo no inmunógeno representa un epítopo subdominante/críptico, presentado por HLA A2.1, de dicho antígeno.
La realización del procedimiento anterior ha permitido por ejemplo a los inventores identificar nuevos epítopos subdominantes/crípticos presentados por HLA A2.1 del antígeno tumoral HER-2/neu, de la subunidad catalítica de la telomerasa (TERT) y del virus HIV-1.
Estos epítopos subdominantes/crípticos son los siguientes:
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Para HER-2/neu:
el péptido HER-2/neu 650: PLTSIISAV
(SEC ID Nº 4)
el péptido HER-2/neu 466: ALIHHNTHL
(SEC ID Nº 5)
el péptido HER-2/neu 402: TLEEITGYL
(SEC ID Nº 6)
el péptido HER-2/neu 391: PLQPEQLQV
(SEC ID Nº 7)
\vskip1.000000\baselineskip
Para HIV-1:
el péptido gagp24-212: EMMTACQGV
(SEC ID Nº 8)
el péptido pol79: LLDTGADDTV
(SEC ID Nº 9)
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Para la subunidad catalítica de la telomerasa (TERT):
el péptido mhp 572: RLFFYRKSV
(SEC ID Nº 10)
el péptido mhp 988: DLQVNSLQTV
(SEC ID Nº 11).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente memoria descriptiva se refiere también a epítopos peptídicos inmunógenos obtenidos a partir de epítopos subdominantes/crípticos que pueden identificarse mediante la realización del procedimiento de acuerdo con la invención y particularmente epítopos subdominantes/crípticos de HER/neu, del virus HIV-1, y de la subunidad catalítica de la telomerasa (TERT) mencionados anteriormente.
Un epítopo peptídico inmunógeno de acuerdo con la invención puede obtenerse mediante diferentes modificaciones de la secuencia peptídica del epítopo subdominante/críptico del que se obtiene. Muy ventajosamente, estas modificaciones comprenden al menos la sustitución del aminoácido N terminal por un resto de tirosina. Puede tratarse particularmente de un péptido variante seleccionado como resultado de la etapa c) del procedimiento de acuerdo con la invención u opcionalmente de cualquier derivado de éste que comprenda otras modificaciones de la secuencia que permitan aumentar su inmunogenicidad.
La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden al menos un epítopo peptídico inmunógeno de acuerdo con la reivindicación 4.
Los epítopos peptídicos inmunógenos de acuerdo con la invención pueden utilizarse en todos los tratamientos de inmunoterapia para los que se desea inducir una respuesta CTL dirigida contra epítopos subdominante/crípticos y particularmente en el marco de la terapia antiviral o antitumoral.
Ventajosamente, se trata de composiciones multiepitópicas, capaces de generar una respuesta CTL poliespecífica y que, con este fin, comprenden también uno o varios epítopo(s) inmunógeno(s) diferente(s). Puede tratarse de uno o varios epítopo(s) subdominante(s)/críptico(s) diferente(s) y/o de uno o varios epítopo(s) inmunodominante(s). Estos epítopos pueden obtenerse a partir del mismo antígeno o de dos o más antígenos diferentes.
Ventajosamente, las composiciones multiepitópicas de acuerdo con la invención pueden comprender también al menos un epítopo presentado por una molécula de CMH II y capaz de inducir una respuesta T auxiliar. Estas composiciones pueden comprender además, para utilizarlas más ampliamente en una población cuyos individuos tienen alelos HLA diferentes, uno o varios epítopos presentados por moléculas del CMH I diferentes de HLA A2.
De acuerdo con una realización preferida de una composición de acuerdo con la invención, ésta comprende al menos un polipéptido quimérico que comprende una o varias copias de un epítopo peptídico inmunógeno de acuerdo con la invención. En el caso de una composición multiepitópica, dicho polipéptido quimérico comprende además una o varias copias de al menos otro epítopo inmunógeno.
Dicho polipéptido quimérico puede obtenerse fácilmente mediante métodos conocidos en sí mismos y particularmente mediante las técnicas convencionales de ADN recombinante.
La presente invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico de acuerdo con la invención.
La presente invención también se refiere a la utilización de un epítopo peptídico inmunógeno de la reivindicación 4, de una composición o de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención para la obtención de un medicamento, y particularmente de un medicamento para inmunoterapia antiviral o antitumoral.
La presente invención abarca también medicamentos que comprenden, como principio activo, al menos un epítopo peptídico inmunógeno de la reivindicación 4, una composición o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, dichos medicamentos son vacunas.
Los medicamentos de acuerdo con la invención pueden comprender además los excipientes habituales, así como los adyuvantes utilizados habitualmente en inmunoterapia y que permiten por ejemplo favorecer la administración del principio activo, estabilizarlo y aumentar su inmunogenicidad, etc.
La presente invención se entenderá mejor con ayuda del complemento de descripción a continuación, que se refiere a ejemplos no limitantes de identificación de nuevos péptidos y de nuevos antígenos potencialmente utilizables en inmunoterapia, mediante la realización del procedimiento de acuerdo con la invención.
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Ejemplo 1
Relación entre la afinidad, la estabilidad de los complejos HLA A2.1/péptido y la inmunogenicidad de los péptidos virales y tumorales
Se ha ensayado la capacidad de fijar y de estabilizar la molécula HLA A2.1 de treinta y cinco péptidos procedentes de antígenos virales (HBV, HIV, Flu) y de tumores (HER-2/neu, melanoma gp100, Tirosinasa, Mart-1): estos péptidos se presentan en la Tabla I a continuación.
TABLA I
1 
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2
Veintidós de estos péptidos (representados mediante un asterisco en la Tabla I) ya se conocen como epítopos, presentados por HLA A2.1 y que generan una respuesta citotóxica CTL en el ser humano; los otros 13 péptidos que aún no se han descrito como epítopos, se han seleccionado en función de dos criterios: la presencia de motivos de anclaje primarios de HLA A2.1 (L en posición 2 y V/L en posición C terminal) y un valor de unión débil, de acuerdo con una evaluación realizada por el programa BIMAS [PARKER et al., J. Immunol., 152, 163 (1994)].
La afinidad por HLA A2.1 y la estabilidad del complejo péptido/HLA A2.1 se han evaluado mediante citometría de flujo y la inmunogenicidad se ha evaluado mediante la generación de CTL en ratones transgénicos HHD [PASCOLO et al., J. Exp. Med., 185, 2043, (1997)].
Los protocolos utilizados son los siguientes: [FIRAT et al., Eur. J. Immunol., 29, 3112, (1999)];
Afinidad
Células T2 [FIRAT et al., Eur. J. Immunol., 29, 3112, (1999) (3 x 10^{5} células/ml) humanas, que son deficientes en transportadores TAP, se incuban a 37ºC durante 16 horas con diversas concentraciones de cada péptido a ensayar en un medio RPMI 1640 sin suero, suplementado con 100 ng/ml de \beta2-microglobulina humana. A continuación, se lavan dos veces y se marcan con el anticuerpo monoclonal BB7.2 [PARHAM et al., Hum. Immunol., 3, 4, 277-299, (1981)] que es específico para la molécula HLA A2.1 y después con un anticuerpo de cabra anti-Ig de ratón, acoplado a isotiocianato de fluoresceína (FITC).
A continuación se analizan las células mediante citometría de flujo. Para cada concentración de péptido, se calcula la fluorescencia específica de HLA A2.1 como el porcentaje de la fluorescencia obtenida con 100 \muM de un péptido de referencia. (HIVpol 589; IVGAETFYV (SEC ID Nº 3)). La afinidad relativa (RA) se define como la proporción de la concentración de cada péptido que induce el 20% de la fluorescencia obtenida con 100 \muM del péptido de referencia, con respecto a la concentración del péptido de referencia que induce el 20% de la fluorescencia obtenido con 100 \muM de dicho péptido de referencia. Cuanto menor sea la afinidad relativa, más fuertemente se une el péptido a HLA A2.1. La RA media para cada péptido se determina a partir de al menos tres experimentos independientes. En todos los experimentos, se ha obtenido el 20% de la fluorescencia máxima para de 1 a 3 \muM del péptido de referencia.
Estabilidad
Las células T2 (10^{6}/ml) se incuban durante una noche a 37ºC con 100 \muM de cada péptido a ensayar en medio RPMI 1640 sin suero, suplementado con 100 ng/ml de \beta2-microglobulina humana. A continuación, se lavan cuatro veces para eliminar los péptidos libres, sin incuban con Brefeldin A (SIGMA, 10 \mug/ml) durante una hora para evitar la expresión en su superficie de las moléculas HLA A2.1 sintetizadas nuevamente, se lavan y se incuban a 37ºC durante 0, 2, 4, 6 u 8 horas. Para cada periodo de incubación, las células se marcan a continuación como se ha indicado anteriormente, con el anticuerpo BB7.2 y se analizan mediante citometría de flujo para evaluar la cantidad de complejo péptido/HLA A2.1 presente en su superficie. Cada cantidad se evalúa mediante la fórmula: (fluorescencia media de las células T2 preincubadas con el péptido - fluorescencia media de las células T2 tratadas en condiciones similares en ausencia de péptido). El DC50 (complejo de disociación: DC) se define como el periodo de tiempo necesario para la pérdida del 50% de los complejos HLA A2.1/péptidos estabilizados a t = 0.
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Inmunogenicidad
Los ratones HHD utilizados son \beta2m-/-, D^{b}-/- y expresan una cadena sencilla de HLA A2.1 constituida por los dominios \alpha1 y \alpha2 de HLA A2.1 y los dominios \alpha3 y el dominio intracelular de D^{b} unido en su extremo N al extremo C de \beta2-m humano mediante un péptido de 15 aminoácidos.
Los ratones reciben una inyección subcutánea en la base de la cola con 100 \mug de cada péptido a ensayar emulsionado en adyuvante incompleto de Freund en presencia de 140 \mug de un epítopo auxiliar T obtenido del antígeno "núcleo" de HBV (128-140, secuencia TPPAYRPPNAPIL (SEC ID Nº 63)).
Después de 11 días, las células esplénicas extraídas de los ratones (5 x 10^{7} células en 10 ml) se estimulan in vivo con el péptido a ensayar (10 \muM). El sexto día de cultivo, las poblaciones que responden se ensayan para determinar su citotoxidad específica. En algunos casos, las células que responden se reestimulan in vitro a intervalos de una semana con 2 x 10^{6} células esplénicas de HHD irradiadas (3000 rads) y 10 \muM de péptido en presencia de 20 UI/ml de IL2 recombinante.
Las células RMA-HHD y RMAS-HHD se utilizan como dianas para estudiar la citotoxicidad. Estas células se obtienen respectivamente mediante transfección de células RMA de ratón y de células RMAS variantes deficientes en TAP con la construcción HHD como se describe en el documento de PASCOLO et al. [J. Exp. Med., 185, 2043, (1997)]. Estas células se infectan mediante virus que expresan los diferentes antígenos a partir de los que se obtienen los péptidos a ensayar.
Los virus utilizados son los siguientes: el virus recombinante de la viruela que expresa VIHgag VVTG1144 (vacVIHgag) descrito por JOHNSON [J. Immunol., 147, 1512, (1991)]; el virus recombinante de la viruela que expresa HER-2/neu VT39 (vac-neu) (Therion Biologics): el virus de la viruela vac-gp100, descrito por YANG [J. Immunol., 164, 4204, (2000)]; un virus de la viruela de tipo de silvestre (vac-WT) y el virus flu PR8 de la gripe descrito por VIRELIZIER [J. Immunol. 115, 2, 434-439, (1975)]. Para las infecciones víricas, las células RMA-HHD se incuban durante 16 horas con los virus de la viruela (10 PFU/célula), recombinantes o silvestres o con el virus flu PR8 (50 HAU) durante 2 horas.
Las células diana se marcan con 150 \muCi de ^{51}Cr durante 90 minutos y después se lavan tres veces y se siembran en placas de 96 pocillos de fondo redondo (10^{4} células/pocillo en 100 \mul de RPMI 1640 + suero fetal bovino al 3%).
Las células RMA-HHD o RMAS-HHD no infectadas se cargan con 1 \muM de péptido a ensayar, a 37ºC durante 90 minutos.
A continuación, se añaden 100 \mul de células efectoras a diferentes concentraciones a los pocillos y las placas y se incuban a 37ºC durante 4 horas. Después de la incubación, se recogen 100 \mul de sobrenadante y se mide la radioactividad en un contador \gamma.
El porcentaje de lisis específica se calcula mediante la fórmula: [(liberación experimental de ^{51}Cr - liberación espontánea de ^{51}Cr)/(liberación máxima de ^{51}Cr - liberación espontánea de ^{51}Cr)] x 100. En todos los experimentos, la liberación espontánea es inferior al 20% de la liberación máxima inducida por HCl 3 N.
En función de su capacidad para fijar y estabilizar la molécula HLA A2.1 y de su inmunogenicidad, los 34 péptidos se han clasificado en tres grupos diferentes; los resultados de esta clasificación se representan en la Tabla II.
TABLA II
3
4
El primer grupo está constituido por 19 péptidos que tienen una RA \leq de 10 y un DC50 > 2 horas. Estos corresponden a epítopos de antígenos de virus o de tumores (a excepción de HBVpol 765 y HER-2/neu 48) y desencadenan una respuesta CTL en un porcentaje elevado (del 60 al 92%) de los ratones HHD.
El segundo grupo de cinco péptidos con una RA > 10 y un DC50 > 2 horas comprende tres epítopos conocidos y un epítopo potencial (HER-2/neu 661). De entre estos, dos son no inmunógenos (Mart-1 32, HER-2/neu 611), mientras que HER-2/neu 851 y tirosinasa 1 inducen una respuesta en un porcentaje reducido de ratones HHD (el 8 y el 17%, respectivamente).
Diez péptidos con un DC50 < 2 horas y una RA variable pertenecen al tercer grupo. No se corresponden a epítopos conocidos (a excepción de HER-2/neu 971) y no son inmunógenos en ratones HHD, ni siquiera los que tienen una RA elevada, como HBVpol 28, HBVpol 594, HER-2/neu 650 y HER-2/neu 466.
A partir de estos resultados pueden extraerse las siguientes conclusiones: (i) los motivos de anclaje secundarios influyen en gran medida en la unión a HLA A2.1 ya que los péptidos que tienen los restos de anclaje primarios HLA A2.1 óptimos presentan un gran espectro de afinidades, (ii) la afinidad de unión no siempre está en correlación con la capacidad para estabilizar la molécula HLA A2.1. Los péptidos Mart-1 32 y HER-2/neu 851 son de unión reducida, pero forman complejos péptidos/HLA A2.1 estables. Por el contrario, los péptidos HBVpol 28, HBVpol 594, HER-2/neu 650 y HER-2/neu 466 son de unión potente pero forman complejos inestables con la molécula HLA A2.1, (iii) la inmunogenicidad de los péptidos depende principalmente de su capacidad para estabilizar la molécula HLA A2.1. Los péptidos que tienen un DC50 < 2 horas nunca son inmunógenos ni siquiera teniendo una gran afinidad de unión. Sin embargo, la estabilidad de HLA A2.1 inducida por un péptido no es suficiente para asegurar la inmunogenicidad. De hecho, los péptidos que tienen un DC50 > 2 horas pueden ser no inmunógenos (Mart-1 32 y HER-2/neu 661) o muy poco inmunógenos (Tirosinasa 1 y HER-2/neu 851) si presentan una afinidad de unión reducida.
Parece por lo tanto que es necesario mejorar al mismo tiempo la afinidad de unión y la capacidad para estabilizar la molécula HLA A2.1, para que los péptidos generen una respuesta CTL fuerte.
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Ejemplo 2
Efecto de la sustitución del resto en posición P1 por una tirosina sobre la afinidad y la estabilidad del complejo HLA A2.1/péptido
Se han sintetizado variantes de 33 péptidos descritos en el ejemplo 1, que resultan de la sustitución del primer aminoácido N terminal por una tirosina (sustitución P1Y). Se ha ensayado la afinidad por la molécula HLA A2.1 y la capacidad para estabilizar el complejo formado, con estas variantes.
Los resultados se ilustran mediante la Tabla III.
TABLA III
5
Estos resultados demuestran que la sustitución P1Y aumenta la unión de todos los péptidos de afinidad reducida y favorece la estabilización de la molécula HLA A2.1 para todos los péptidos poco estabilizadores (grupos II y III en la Tabla II). El aumento de la afinidad, medido mediante la proporción entre la RA del péptido modificado y la del péptido natural, es como mínimo de 1,5 y llega hasta 55,5, mientras que el aumento de la estabilización de HLA A2.1, medido mediante la diferencia entre los DC50 del péptido modificado y del péptido natural es como mínimo de 2 horas y llega hasta 6 horas. La RA de todos los péptidos modificados, a excepción de uno (HER-2/neu 661Y1) es inferior a 10 y su DC50 es > 4 horas. Para los péptidos Tirosinasa 1 y HER-2/neu 661, la modificación P1Y no genera péptidos que tienen una afinidad muy grande. Esto se debe a la presencia en estos péptidos de restos de anclaje secundarios P3-P8/9 desfavorables para la unión a HLA A2.1.
El efecto de la sustitución P1Y no se limita a los péptidos de afinidad reducida, sino que también se observa con la mayoría de los péptidos de gran afinidad (grupo I de la Tabla II). De dichos nueve péptidos de gran afinidad solamente dos no mejoran ni en afinidad de unión ni en capacidad de estabilización (gp100 154 y HER-2/neu 5). Debe observarse que un aumento de la afinidad es independiente de la naturaleza del resto en posición 1 del péptido nativo y que se observa incluso si el resto sustituido no es un resto desfavorable para la unión con HLA A2.1. Solamente cuatro de los diecinueve péptidos que tienen una proporción RA del péptido natural/RA del péptido modificado superior a 3 tienen un resto desfavorable en P1 (P para HER-2/neu 391, HER-2/neu 650 y HBVpol 594, E para HER-2/neu 971). El aumento de afinidad de estos cuatro péptidos es sin embargo muy grande: está comprendido entre 6 y 55,5.
Sin embargo, la afinidad aumenta incluso cuando Y sustituye a otro resto favorable como F (HBVpol 575 y Tirosinasa 207).
Estos resultados demuestran que una sustitución P1Y aumenta la unión a HLA A2.1 y la capacidad de estabilización del complejo formado por casi todos los péptidos unidos a HLA A2.1. Este efecto es mucho mayor para los péptidos no inmunógenos de afinidad reducida por HLA A2.1.
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Ejemplo 3
Reconocimiento cruzado de los péptidos naturales y de sus variantes P1Y por CTL específicas
El aumento de la afinidad por HLA A2.1 es la primera condición para hacer inmunógenos a los péptidos de afinidad reducida. También es necesario sin embargo que su conformación en el complejo con HLA A2.1 no se modifique y que su especificidad antigénica se conserve. Si éste es el caso, las CTL generadas en ratones HHD vacunados mediante el péptido nativo deben reconocer a este último y a su variante P1Y con la misma eficacia. Además, las variantes P1Y deben ser capaces de reclutar in vivo al repertorio de CTL específicas del péptido natural.
En primer lugar se ha estudiado el reconocimiento de las variantes P1Y por las CTL específicas del péptido natural. En las CTL inducidas en ratones HHD sensibilizados con los péptidos HIVgag 76, HBVpol 575, gp100 154, gp100 457, gp100 476, gp100 570, gp100 177 o HER-2/neu 369 se ha ensayado la capacidad de destruir las dianas RMAS-HHD cargadas con péptidos naturales (WT) o con las variantes P1Y correspondientes (P1Y).
La Figura 1 ilustra los resultados (% de lisis en función de la proporción de células efectoras/células diana) obtenidos con ocho péptidos diferentes.
Células RMAS-HHD cargadas con el péptido natural: \ding{110}
Células RMAS-HHD cargadas con el péptido P1Y: \ding{115}
Células RMAS-HHD no cargadas: \medbullet.
Estos resultados demuestran que las CTL inducidas en ratones HHD sensibilizados con los péptidos HIVgag 76, HBVpol 575, gp100 154, gp100 457, gp100 476, gp100 570, gp100 177 y HER-2/neu 369 destruyen con la misma eficacia las células RMAS-HHD cargadas con el péptido natural o con su variante P1Y.
Las variantes P1Y también son capaces de reclutar las CTL específicas del péptido natural in vivo. En células esplénicas de ratones HHD sensibilizados con las variantes P1Y HIVgag 76Y1, HBVpol 575Y1, gp100 154Y1, gp100 457Y1; gp100 476Y1, gp100 570Y1, gp100 177Y1 y HER-2/neu 369Y1, se ensaya la capacidad de destruir dianas RMAS-HHD cargadas con las variantes P1Y (P1Y) o con los péptidos de tipo silvestre (WT).
Los resultados (% de lisis en función de la proporción de células efectoras/células diana) se ilustran en la Figura 2.
Células RMAS-HHD cargadas con el péptido natural: \ding{110}
Células RMAS-HHD cargadas con el péptido P1Y: \ding{115}
Células RMAS-HHD no cargadas: \medbullet.
Estos resultados demuestran que las variantes P1Y generan CTL que destruye las dianas RMAS-HHD cargadas con el péptido variante o con el péptido natural correspondiente.
Además, todos estos péptidos variantes a excepción de gp100 154Y1, inducen CTL en un porcentaje más elevado de ratones HHD que los péptidos naturales correspondientes. Tres de los ocho ratones HHD se han ensayado para cada péptido y se ha inducido una respuesta CTL en el 100% de los ratones sensibilizados mediante HIVgag 76Y1, HBVpol 575Y1, gp100 476Y1, gp100 570Y1 y HER-2/neu 369Y1 y en el 75% de los ratones sensibilizados mediante gp100 457Y1, gp100 177Y1 y gp100 154Y1.
Además, las CTL inducidas mediante las variantes P1Y reconocen estas variantes y los péptidos naturales correspondientes con avideces comparables.
En las CTL generadas en ratones sensibilizados con las variantes P1Y HER-2/neu 369Y1, HIVgag 76Y1 y gp100 154Y1 se ha ensayado su capacidad para destruir las células RMAS-HHD cargadas con diferentes concentraciones del péptido variante P1Y o del péptido silvestre correspondiente.
Los resultados (% de lisis en función de la proporción de células efectoras/células diana) se ilustran mediante la Figura 3.
Células RMAS-HHD cargadas con el péptido natural: \medbullet.
Células RMAS-HHD cargadas con el péptido P1Y: \ding{110}.
Estos resultados demuestran que las CTL inducidas mediante las variantes P1Y dan una citolisis igual a la mitad de la citolisis máxima para cantidades similares de la variante P1Y y del péptido natural.
Para considerar la utilización de las variantes P1Y en inmunoterapia, es necesario además que las CTL inducidas mediante estas variantes reconozcan a epítopos preparados de forma natural del antígeno a partir del que se obtienen.
Las CTL generadas en ratones sensibilizados mediante HIVgag 76Y1, HER-2/neu 369Y1, HER-2/neu 5Y1, gp100 476Y1 y fluM 58Y1 se ensayan para determinar su capacidad de destruir células RMA-HHD infectadas por los virus recombinantes vac-HIVgag, vac-neu, vac-gp100 o flu PR8 y que expresan de forma endógena los antígenos virales correspondientes, o infectadas con el virus silvestre vac-WT.
Los resultados (% de lisis en función de la proporción de células efectoras/células diana) se ilustran mediante la Figura 4:
Células RMA-HHD infectadas con vac-WT (\medbullet);
Células RMA-HHD infectadas con vac-HIVgag (\ding{110});
Células RMA-HHD infectadas con vac-neu (\ding{115});
Células RMA-HHD infectadas con vac-gp100 (\ding{116});
Células RMA-HHD infectadas con flu PR8 (\ding{169}).
Estos resultados demuestran que las CTL específicas de las variantes P1Y reconocen al epítopo madurado de forma natural ya que destruyen las dianas infectadas con el virus correspondiente pero no las dianas infectadas con vac-WT.
Parece por lo tanto que la sustitución P1Y satisface los dos criterios que son necesarios para la inducción de una respuesta CTL contra cualquier péptido de afinidad reducida por HLA A2.1, cualquiera que sea su secuencia. En primer lugar, aumenta la afinidad de unión y la capacidad de estabilización de los péptidos unidos a HLA A2.1 y en segundo lugar, no interfiere con la interacción péptido/TCR y por lo tanto no modifica su especificidad antigénica.
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Ejemplo 4
Restauración de la inmunogenicidad de péptidos no inmunógenos de afinidad reducida por HLA A2.1 mediante una sustitución P1Y
Se han vacunado ratones con las variantes P1Y de los péptidos HER-2/neu 402, HER-2/neu 466, HER-2/neu 650, HER-2/neu 391, Tirosinasa 207, HBVpol 594, HBVpol 28 y HBVpol 985. Once días después, sus células esplénicas se reestimulan in vitro con el péptido natural correspondiente y las CTL generadas se ensayan contra células diana RMAS-HHD no cargadas o cargadas con el péptido natural.
Los resultados (% de lisis en función de la proporción de células efectoras/células diana) se ilustran mediante la Figura 5:
Células RMAS-HHD cargadas con el péptido natural: \ding{115}
Células RMAS-HHD no cargadas: \medbullet.
Para cada péptido, se indica la cantidad de ratones que responden.
Estos resultados demuestran que los ratones HHD sensibilizados con las variantes P1Y generan CTL específicas del péptido natural. Además, el porcentaje de ratones que producen una respuesta es relativamente alto: está comprendido entre el 33 y el 77%.
Estos datos demuestran que una sustitución P1Y constituye una estrategia general para aumentar la inmunogenicidad de péptidos no inmunógenos de afinidad reducida por HLA A2.1.
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Ejemplo 5
Identificación de epítopos subdominantes/crípticos con ayuda de variantes P1Y
La posibilidad de inducir una respuesta CTL contra los péptidos de afinidad reducida por HLA A2.1 permite identificar epítopos subdominantes/crípticos virales o tumorales, útiles para una inmunoterapia específica.
Esta posibilidad se ilustra a continuación mediante el ejemplo 3 de antígenos diferentes: el antígeno tumoral HER-2/neu, el virus HIV-1 y la subunidad catalítica de la telomerasa (hTERT).
Epítopos HER-2/neu
El péptido HER-2/neu 650 no participa en la respuesta CTL específica de HER-2/neu desarrollada en pacientes que tienen un tumor HER-2/neu^{+}. Son posibles 2 hipótesis: o se trata de un epítopo que no madura de forma natural en células tumorales que expresan HER-2/neu o se trata de un epítopo subdominante/críptico.
Como se ha descrito en el Ejemplo 1 anteriormente, el péptido HER-2/neu 650 forma complejos HLA A2.1/péptido inestables y por lo tanto no es inmunógeno.
1) Para estudiar si el péptido HER-2/neu 650 corresponde a un epítopo subdominante/críptico, se ensaya en las CTL generadas en ratones sensibilizados mediante la variante HER-2/neu 650Y1 su capacidad de destruir las células RMA-HHD infectadas por vac-neu.
Los resultados (% de lisis en función de la proporción de células efectoras/células diana) se ilustran mediante la Figura 6:
Células RMA-HHD infectadas con vac-WT (\medbullet);
Células RMA-HHD infectadas con vac-neu (\ding{115}).
Estos resultados demuestran que las CTL específicas de HER-2/neu 650 destruyen a las células diana infectadas por vac-neu, pero no a las dianas infectadas por vac-WT, lo que demuestra que el péptido HER-2/neu 650 es un epítopo subdominante/críptico de HER-2/neu.
Las variantes P1Y de los péptidos HER-2/neu 466, HER-2/neu 402, HER-2/neu 661 y HER-2/neu 391 se han ensayado de la misma manera, a excepción de la variante P1Y de HER-2/neu 661, los resultados son similares a los observados para HER-2/neu 650.
Los péptidos HER-2/neu 466, HER-2/neu 402 y HER-2/neu 391 constituyen también por lo tanto epítopos subdominantes/crípticos de HER-2/neu.
En lo que respecta a HER-2/neu 661, los resultados obtenidos confirman los relacionados con el débil aumento de la afinidad descritos en el ejemplo 2 anteriormente. Deben realizarse modificaciones suplementarias para considerar la utilización de este péptido en inmunoterapia.
2) La inmunogenicidad de las variantes HER-2/neu 466Y1, HER-2/neu 402Y1, HER-2/neu 650Y1 y HER-2/neu 391Y1 de acuerdo con la invención, con respecto a un péptido inmunodominante también se ha evaluado en células humanas y se ha comparado con la del péptido inmunodominante HER-2/neu 369.
Se han obtenido células mononucleadas de la sangre periférica (PMBC) a partir de donantes sanos HLA A2.1 y se han resuspendido en 2 ml de medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10 nM de glutamina, 250 unidades/ml de penicilina-estreptomicina y albúmina del suero humano AB al 10% inactivada por calor, y se han incubado a 37ºC durante 2 horas. Las células no adherentes se recogen y las células adherentes restantes se cargan con el péptido a ensa-
yar (5 \muM) a 37ºC durante 90 minutos y se irradian a 3000 rads; a continuación se lavan para eliminar el péptido libre.
Se añaden 3 x 10^{6} células no adherentes a un volumen final de 2 ml de medio de cultivo suplementado con 50 UI/ml de IL-2 recombinante. El séptimo día, se recogen, se lavan y se suspenden en medio de cultivo, y se reestimulan con 5 x 10^{6} células autólogas adherentes previamente cargadas con el péptido a ensayar como se ha descrito anteriormente. Al día siguiente, se añaden 150 UI/ml de IL-2 recombinante. El noveno o el décimo día, los cultivos se complementan con 300 UI/ml de IL-2 recombinante. Cuando es necesario, el medio se cambia extrayendo 1 ml de sobrenadante de cultivo y sustituyéndolo por 1 ml del medio de cultivo que contiene 300 UI/ml de IL-2 recombinante. Este procedimiento se repite al menos 3 veces a intervalos de una semana.
Las células T2 cargadas con el péptido nativo (1 \mum de péptido, 37ºC, 90 minutos) correspondiente al péptido P1Y a ensayar se utilizan como dianas para estudiar la citotoxicidad.
Los resultados (% de lisis en función de la proporción de células efectoras/células diana) para cada uno de los péptidos ensayados se ilustran mediante la Figura 7:
Células T2 cargadas con el péptido natural: \ding{110}
Células T2 no cargadas: \medbullet.
Estos resultados demuestran que la sustitución P1Y aumenta también la inmunogenicidad frente a células humanas.
3) Para verificar si los péptidos P1Y inducían CTL humanas específicas de epítopos tumorales preparados de forma natural, también se ha ensayado en CTL generadas, como se ha descrito anteriormente a partir de PBMC humanas, procedentes de 3 donantes diferentes, estimuladas mediante HER-2/neu 369 o mediante los péptidos HER-2/neu 466 Y1, HER-2/neu 402, HER-2/neu 650 Y1 y HER-2/neu 391 Y1, su capacidad de destruir células de tumores humanos HLA A2.1^{+}, que expresan en una cantidad mayor o menor el epítopo HER-2/neu.
Las células tumorales utilizadas como células diana son las siguientes:
- 4 líneas celulares HLA A2.1^{+}/HER-2/neu^{+}: MC F-7 [ZASK, Cancer Res., 58, 4902, (1998)]; PUB/N (línea tumoral humana de cáncer de pulmón "macrocítico" HCT-116 [BROSSART, Cancer Res., 58, 732, (1998)]; LAW (línea tumoral humana de cáncer renal);
- 2 líneas celulares HLA A2.1^{+}/HER-2/neu-: ZR75.1 [OSBORNE et al., Cancer Res., 39, 2422-2428, (1979)]; SUP/M2 [MORGAN et al., Blood, 73, 8, 2155-2164, (1989)];
- como control, la línea K562, sensible a lisis mediante células NK.
La expresión del antígeno tumoral HER-2/neu por estas células, que se evalúa mediante inmunofluorescencia con ayuda de un anticuerpo monoclonal anti-HER-2/neu se ilustra mediante la Tabla IV a continuación.
TABLA IV
7
Los resultados de estos ensayos de citotoxicidad (% de lisis en función de la proporción de células efectoras/células diana; proporciones E/T: 40/1; 20/1) para cada uno de estos péptidos ensayados se ilustran mediante la Figura 8:
Células ZR75.1: \medbullet
Células SUP/M2: 100
Células MCF-7: \ding{110}
Células HCT-116: \ding{116}
Células PUB/N: \ding{115}
Células LAW: \ding{169}.
No se observa ninguna citotoxicidad frente a células K562.
Estos resultados demuestran que las CTL obtenidas a partir de las PMBC de 3 donantes diferentes, estimuladas mediante los péptidos variantes P1Y provocan la lisis de las células HER-2/neu^{+} MCF-7, PUB/N, HCT-116 y LAW pero no de las células HER-2/neu-ZR75.1 y SUP/M2.
Debe observarse que la lisis es igual de eficaz en el caso de las células LAW, que solamente expresan débilmente el antígeno HER-2/neu, que en el caso de las células MCF-7, PUB/N y HCT-116 que lo expresan a un nivel elevado. Esto demuestra que la presentación de los epítopos de afinidad reducida no requiere la expresión del antígeno a un nivel elevado.
Epítopos de HIV 1
La sustitución P1Y se ha utilizado para identificar nuevos epítopos subdominantes/crípticos de HIV 1.
Se han seleccionado 17 péptidos de Gag, Pol, Env y Nef de HIV a partir de la secuencia polipeptídica completa de HIV 1. La lista de estos péptidos se representa en la Tabla V a continuación.
TABLA V
8
9 
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La afinidad relativa de estos péptidos por HLA A2.1 (péptido de referencia I9V) y la estabilidad del complejo péptido/HLA A2.1 se ha determinado como se ha descrito en el ejemplo 1 anteriormente, para el péptido nativo y para su variante que resulta de la sustitución del aminoácido N-terminal por una tirosina.
Los resultados se ilustran en la Tabla VI a continuación:
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TABLA VI 
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10
11 
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Los dos péptidos gagp24-212 (E9V) y po179 (L10V) tienen una afinidad y una capacidad de estabilización reducidas (RA > 5 y DC50 < 2 horas); por el contrario sus variantes P1Y tienen una afinidad y una capacidad de estabilización grandes (RA < 5 y DC50 > 2 horas). La inmunogenicidad de los péptidos E9V y L10V y de sus variantes P1Y también se ha ensayado. Los péptidos nativos no son inmunógenos; por el contrario sus variantes son inmunógenas tanto en ratones HDD como en el ser humano.
Además, las CTL generadas, a partir de PBMC humanas, procedentes de 6 donantes diferentes, estimuladas in vitro con células autólogas cargadas con el péptido variante E9VY, o el péptido variante L10VY, o mediante el péptido nativo inmunodominante S9L también se han ensayado para su capacidad de destruir las células RMA-HHH (células RMA que expresan la molécula HLA A2.1 nativa) infectadas por un virus de la viruela recombinante que expresa la proteína gag o la proteína pol de HIV 1 (aislado LAI) o por un virus de la viruela de control, de tipo silvestre.
Los resultados se ilustran mediante la Figura 9 (en abscisas el % de lisis específicas; en ordenadas la proporción células efectoras/células diana). Estos resultados demuestran que los péptidos E9V y L10V se presentan de forma natural por células que expresan HLA-A2.1 y la proteína viral de la que se obtienen (gag para E9V y pol para L10V).
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Epítopos de la subunidad catalítica de la telomerasa (hTERT)
La sustitución P1Y se ha utilizado para determinar si la subunidad catalítica de la telomerasa (hTERT) poseía epítopos capaces de inducir una respuesta T citotóxica.
Se han seleccionado 8 péptidos a partir de la secuencia polipeptídica de la subunidad catalítica de la telomerasa (hTERT).
La afinidad relativa de estos péptidos por HLA A2.1 y la estabilidad de complejo péptido/HLA A2.1 se ha determinado como se ha descrito en el ejemplo 1 anteriormente (péptido de referencia: HIVpol 589).
Los resultados se ilustran en la Tabla VII a continuación:
TABLA VII
12
Los dos péptidos mhp 572 y mhp 988 tienen una afinidad y una capacidad de estabilización reducidas (RA > 5 y DC50 < 2 horas). Estos 2 péptidos son además comunes a la subunidad catalítica de la telomerasa humana (hTERT) y a la subunidad catalítica de la telomerasa de ratón (mTERT). Se han preparado las variantes P1Y de estos 2 péptidos, que resultan de la sustitución del aminoácido N terminal por una tirosina, y se han determinado su afinidad relativa por HLA A2.1 y la estabilidad del complejo péptido/HLA A2.1.
Los resultados, ilustrados en la Tabla VIII a continuación, demuestran que estas variantes mhp 572Y1 y mhp 988Y1 tienen una afinidad y una capacidad de estabilización grandes (RA < 5 y DC50 > 2 horas).
TABLA VIII
13
Las CTL generadas a partir de PBMC humanas, procedentes de donantes sanos, estimulados in vitro mediante células dendríticas autólogas cargadas con el péptido variante mhp 572Y1 o el péptido variante mhp 988Y1 se han ensayado para su capacidad de destruir células tumorales humanas HLA A2.1+/hTERT+: U266 [VONDERHEIDE, Immunity, 10, 11, (1999)] o HSS HLA A2.1-/hTERT+: [VONDERHEIDE, Immunity, 10, 11, (1999)].
Los resultados (% de lisis en función de la proporción de células efectoras/células diana; proporciones E/T: 40/1; 20/1; 10/1) se ilustran mediante la Figura 10; no se observa lisis para las células tumorales HSS que no expresan HLA A2.1; por el contrario, se observa un gran % de lisis en el caso de las células tumorales U266 que expresan al mismo tiempo la subunidad catalítica de la telomerasa (hTERT) y HLA A2.1.
Estos resultados demuestran que los péptidos mhp 572 y mhp 988 son presentados de forma natural por las células tumorales humanas y que los derivados inmunógenos de estos péptidos pueden utilizarse potencialmente en inmunoterapia anti-tumoral.
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Ejemplo 6
Actividad anti-tumoral de las variantes P1Y I. Derivados del epítopo de la subunidad catalítica de la telomerasa (hTERT)
Las variantes P1Y (mhp 572Y1 y mhp 988Y1), obtenidas como se ha descrito en el ejemplo 2, se ensayan para su capacidad de inducir in vivo una respuesta anti-tumoral protectora con péptidos inmunodominantes (mp 797 y mp 545).
Diez ratones HHD generados tal como se ha descrito en el ejemplo 1 se vacunan, a razón de 2 inyecciones a intervalos de dos semanas, con diferentes péptidos sintetizado mediante Synt:em (Nîmes, Francia).
Siete días después de la última inyección, los ratones vacunados con los péptidos mhp 572Y1, mhp 988Y1, mp 797 y mp 545 se injertan con células tumorales EL-4/HHD [PASCOLO et al., J. Exp. Med., 185, 2043-2051
(1997)].
La eficacia de la protección anti-tumoral se evalúa midiendo el tamaño de los tumores 28 días después de su implante (Figuras 11A_{1} y 11A_{2}: tamaño de los tumores en función de los péptidos utilizados para la vacunación) y mediante la supervivencia de los ratones injertados (Figura 11B: % de supervivencia en función del número de días después del implante de las células tumorales).
Los resultados se ilustran en las Figuras 11A_{1}, 11A_{2} y 11B: se observa que en el día 28, los tumores miden 490 \pm 144 mm^{2} y 653 \pm 148 mm^{2} respectivamente en ratones no tratados (de control) y tratados con el péptido mp 797, 421 \pm 170 mm^{2} y 489 \pm 209 mm^{2} respectivamente en ratones no tratados (de control) y tratados con el péptido mp 545, pero en el lote de ratones vacunados con los péptidos mhp 572Y1 y mhp 988Y1, los tumores miden respectivamente 232 \pm 244 mm^{2} y 190 \pm 207 mm^{2} (Figura 11A_{1}) o 213 \pm 160 mm^{2} (Figura 11A_{2}) y que 4 ratones vacunados con mhp 572Y1 y mhp 988Y1 no presentan tumores en el día 28.
Todos los ratones no vacunados mueren en el día 50 (Figura 11B: \medbullet).
Para los ratones vacunados con los péptidos mp 797 y mp 545 (Figura 11B: \ding{116} y \ding{169}), se observa mortalidad a partir del día 40 y el último ratón muere en el día 50.
La mortalidad se reduce significativamente en el lote de ratones vacunados con mhp 572Y1 y mhp 988Y1 (Figura 11B: \ding{115} y \ding{110}). La mortalidad aparece en el día 40 y 4 ratones (el 40%) aun siguen vivos el día 80 (Figura 11B: \ding{115}, \ding{110}).
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II. Derivados del epítopo HER-2/neu
En las variantes P1Y (HER-2/neu 650Y1, HER-2/neu 402Y1), obtenidas como se ha descrito en el ejemplo 2, se ensaya la capacidad de inducir in vivo una respuesta anti-tumoral protectora con péptidos inmunodominantes (HER-2/neu 369, HER-2/neu 48).
Diez ratones HHD generados como se ha descrito en el ejemplo 1 se vacunan, a razón de dos inyecciones a intervalos de dos semanas, con diferentes péptidos sintetizados por Synt:em (Nîmes, Francia).
Las células HER-2/HHD/neu se obtienen transfectando las células tumorales EL-4/HHD con ADNc que codifica la molécula HER-2/neu.
Siete días después de la última inyección, los ratones vacunados con los péptidos HER-2/neu 650Y1, HER-2/neu 402Y1, HER-2/neu 369 y HER-2/neu 48 se injertan con células tumorales EL-4/HHD/neu.
La eficacia de la protección anti-tumoral se evalúa midiendo el tamaño de los tumores 28 días después de su implante (Figura 12A: tamaño de los tumores en función de los péptidos utilizados para la vacunación) y mediante la supervivencia de los ratones injertados (Figura 12B: % de supervivencia en función del número de días después del implante de las células tumorales).
Los resultados demuestran que en el día 28 los tumores miden 560 \pm 93 mm^{2}, 474 \pm 234 mm^{2} y 564 \pm 174 mm^{2} respectivamente en los ratones no tratados (de control) y tratados con los péptidos HER-2/neu 369 y HER-2/neu 48, pero que en el lote de ratones vacunados con los péptidos HER-2/neu 402Y1 y HER-2/neu 650Y1, los tumores miden 323 \pm 116 mm^{2} y 100 \pm 99 mm^{2} respectivamente y que 4 ratones vacunados con HER-2/neu 650Y1 no presentan tumores en el día 28.
Todos los ratones no vacunados mueren en el día 40 (Figura 12B: \medbullet).
Para los ratones vacunados con los péptidos HER-2/neu 369 y HER-2/neu 48 (Figura 12B:\ding{116} y \ding{169}), la mortalidad aparece en el día 32 y el último ratón muere el día 52.
La mortalidad se reduce significativamente en el lote de ratones vacunados con HER-2/neu 402Y1 y HER-2/neu 650Y1 (Figura 12B: \ding{110} y \ding{115}). Solamente se observa mortalidad a partir del día 46 y 3 ratones (el 30%) aun siguen vivos el día 70 (Figura 12B: \ding{115}).
El conjunto de estos resultados demuestra que solamente las formas sustituidas en P1 con una tirosina, de los péptidos subdominantes/crípticos (HER-2/neu 650Y1, HER-2/neu 402Y1, mhp 572Y1 y mhp 988Y1) son capaces de generar in vivo una respuesta anti-tumoral eficaz. Por lo tanto parece interesante utilizar en inmunoterapia anti-tumoral péptidos subdominantes/crípticos en su forma sustituida en P1 con una tirosina.
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Ejemplo 7
Actividad anti-tumoral inducida mediante vacunas de ADN que codifica múltiples epítopos dominantes y subdominantes/crípticos obtenidos de HER-2/neu
Para evitar los fracasos relativos a ensayos clínicos realizados actualmente por medio de péptidos tumorales, un nuevo enfoque de inmunoterapia anti-tumoral consiste en inducir respuestas multiespecíficas mediante una inmunización genética con una construcción poliepitópica constituida por ocho epítopos dominantes y cuatro subdominantes/crípticos obtenidos de HER-2/neu y limitados a HLA A2.1.
Selección de los epítopos
Los ocho epítopos dominantes (HER-2/neu 799, HER-2/neu 369, HER-2/neu 789, HER-2/neu 689, HER-2/neu 773, HER-2/neu 5, HER-2/neu 48 y Her-2/neu 1023) presentan gran afinidad por HLA A2.1 (RA < 5 y DC_{50} > 4 horas), excepto HER-2/neu 1023 que se considera que tiene una afinidad de unión intermedia (RA > 5, DC_{50} > 4 horas) (véase Tabla II, Ejemplo I).
Los cuatro epítopos subdominantes/crípticos (HER-2/neu 466, HER-2/neu 402, HER-2/neu 391 y HER-2/neu 650) (véase Tabla II, Ejemplo 1) presentan una afinidad de unión muy reducida y son no inmunógenos en los ratones HHD o en el ser humano, mientras que las variantes P1Y (HER-2/neu 466Y, HER-2/neu 402Y1, Her-2/neu 391Y y HER-2/neu 650Y1) obtenidas como se ha descrito en el ejemplo 2, presentan gran afinidad por HLA A2.1 (RA < 4 y DC_{50} > 4 horas). Estas variantes P1Y se representan en la Tabla IX a continuación:
TABLA IX
14
La inmunogenicidad de las variantes P1Y y de los epítopos inmunodominantes se ensaya de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 1:
Los ratones se vacunan por vía subcutánea con cada uno de los doce péptidos mencionados anteriormente en presencia del epítopo Th lab obtenido del antígeno "núcleo" de HBV. Once días después, sus células esplénicas se reestimulan in vitro con el péptido a ensayar (1 \mug) durante seis días, y las CTL generadas se ensayan contra células diana RMAS-HHD cargadas con los péptidos de inmunización o con un péptido de control. Los resultados (% de lisis en función de la proporción de células efectoras/células diana) se ilustran en la Figura 13:
Células RMAS-HHD cargadas con el péptido de inmunización: \ding{110}
Células RMAS-HHD cargadas con un péptido de control: \medbullet.
Como se esperaba todos estos epítopos provocan una respuesta CTL, y las provocadas por las variantes P1Y son específicas para los péptidos naturales correspondientes.
Selección de una construcción poliepitópica
La construcción poliepitópica (pet-neu) comprende una serie continua de los 12 epítopos mencionados anteriormente, es decir:
- los ocho epítopos dominantes (HER-2/neu 799, HER-2/neu 369, HER-2/neu 789, HER-2/neu 689, HER-2/neu 773, HER-2/neu 5, HER-2/neu 48 y HER-2/neu 1023) descritos como dianas de los linfocitos que infiltran tumores (LIT) en cánceres de pulmón, de ovario, de estómago y del RCC, y
- las cuatro variantes P1Y subdominantes/crípticas (HER-2/neu 466Y, HER-2/neu 402Y1, HER-2/neu 391Y y HER-2/neu 650Y1) obtenidas como se ha descrito en el ejemplo 2.
La utilización de la construcción poliepitópica anterior se ha optimizado para la expresión en el ser humano, y cualquier codón de inicio potencial se ha conservado lo más cerca posible al sitio de inicio, en particular si se incorporan secuencias Kosack. Se añade una marca SV5-pk en el extremo 3' de la construcción para permitir la verificación de la expresión de pet-neu en las células COS transfectadas (expresión del anticuerpo anti-PK de 14 aminoácidos).
Se selecciona un plásmido de 3,0 kb, Vax1 (Invitrogen), en el que se han retirado las secuencias no necesarias para la aplicación en E. coli o para la expresión de la proteína recombinante en las células de mamífero, para limitar las secuencias de ADN homólogas al genoma humano y para minimizar la posibilidad de integración en el cromosoma. Este plásmido comprende el gen de resistencia a kanamicina, en lugar de a ampicilina, ya que los aminoglicósidos son menos susceptibles de provocar una respuesta alérgica en el ser humano. La expresión se dirige mediante secuencias promotoras-activadoras del citomegalovirus humano (CMV). Una terminación de la transcripción y una poliadenilación del ARNm eficaces se obtienen utilizando la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento
bovina.
El ADN de pet-neu se sintetiza y se clona en el vector pVax1 (Vax1/pet-neu).
La construcción poliepitópica tal como se ha descrito anteriormente presenta las siguientes propiedades:
a) permite la preparación de cada epítopo en su extremo C terminal, y
b) no crea nuevos péptidos de unión con una afinidad elevada por la molécula HLA A2.1.
La preparación en el extremo C terminal se evalúa mediante dos modelos de predicción de la escisión del proteosoma (netChop1.0, www.cbs.dtu.dk/services/NetChopPAPROC, www.uni-tuebingen.de/uni:bcm/kuttler/links/html). Es necesaria una predicción de la escisión mediante dos modelos para considerar que un epítopo que está preparado. La afinidad de los nuevos péptidos de unión se evalúa como se ha indicado en el ejemplo 1 para el modelo de predicción BIMAS [PARKER et al., J. Immunol., 152, 163 (1994)]. Entre las diferentes disposiciones evaluadas, la disposición de la Figura 14, que corresponde a la SEC ID Nº 70, se ha seleccionado ya que responde mejor a las dos propiedades indicadas anteriormente. Los epítopos HER-2/neu 773, HER-2/neu 1023, HER-2/neu 5, HER-2/neu 466Y, HER-2/neu 391Y, HER-2/neu 650Y1 se consideran preparados y solamente podrían generarse cinco nuevos péptidos de unión con una afinidad elevada por la molécula HLA A2.1 (p67_{9}, p94_{9}, p17_{9}, p91_{10}, p63_{10}); estos péptidos se definen mediante su posición en la secuencia pet-neu (posiciones: 67, 94, 17, 91 y 63) y su longitud (9 ó 10 amino-
ácidos).
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I. Inmunogenicidad de Vax1/pet-neu en ratones transgénicos HHD A. Capacidad de Vax1/pet-neu para inducir CTL específicas in vivo
La inmunogenicidad de Vax1/pet-neu se ensaya como se ha descrito en el ejemplo 1:
Los ratones HHD, generados como se ha descrito en el ejemplo 1, se inmunizan por vía intramuscular a razón de dos inyecciones a intervalos de 15 días con Vax1/pet-neu (150 \mug). Una semana después de la última inmunización, sus células esplénicas se reestimulan in vitro con células B activada mediante LPS y cargadas con cada uno de los doce péptidos.
La citotoxicidad se evalúa con ayuda de células RMAS-HHD (células diana) cargadas con el péptido correspondiente a aquel con el que las células B se han cargado o con un péptido de control.
Los resultados obtenidos a partir de un ratón HHD inmunizado tomado aleatoriamente se presentan en la Figura 14 (% de lisis en función de la proporción de células efectoras/células diana).
Células RMAS-HHD cargadas con el péptido utilizado para las células B: \ding{110}
Células RMAS-HHD cargadas con un péptido de control: \medbullet
Las CTL destruyen a las células RMAS-HHD cargadas con cada uno de los doce péptidos, aunque para las CTL específicas de algunos péptidos, se observa una lisis de las células diana RMAS-HHD cargadas con el péptido de control (lisis no específica).
Las mayores lisis específicas (30% por encima del ruido de fondo) se observan con HER-2/neu 773, HER-2/neu 799, HER-2/neu 369, HER-2/neu 689, HER-2/neu 402Y1 y HER-2/neu 391Y.
B. Capacidad de las CTL para reconocer HER-2/neu endógeno
En las CTL inducidas en ratones HHD vacunados con Vax1/pet-neu, se ensaya la capacidad para reconocer específicamente HER-2/neu endógeno.
Los resultados se presentan en la Figura 15 (% de lisis en función de la proporción de células efectoras (E)/células diana (T)).
Las CTL se inducen como se ha descrito en A anteriormente y se ensayan contra células diana EL-4/HHD (\medbullet) mencionadas en el ejemplo 6 y células diana EL-4/HHD/neu (\ding{110}) obtenidas transfectando las células EL-4/HHD con el ADNc que codifica HER-2/neu.
Las CTL específicas de los doce péptidos de pet-neu reconocen y destruyen las dianas EL-4/HHD/neu que expresan HER-2/neu pero no las dianas EL-4/HHD utilizadas como control negativo.
Para los tres ratones ensayados, se obtiene una lisis específica mayor (> 20% por encima del ruido de fondo), para HER-2/neu 1023, HER-2/neu 789, HER-2/neu 48, HER-2/neu 689, HER-2/neu 466Y, HER-2/neu 402Y1 y HER-2/neu 391Y.
C. Factor implicado en la inducción de las CTL
La inducción de las CTL requiere la sensibilización con Vax1/pet-neu o es el resultado de la repetición de estimulaciones in vitro de las células esplénicas nativas.
La inmunogenicidad de Vax1/pet-neu se ensaya como se ha descrito en el ejemplo 1:
Seis ratones se inmunizan con la construcción Vax1/pet-neu o con el vector Vax1. Sus células esplénicas se estimulan in vitro de forma repetitiva con células B activadas por LPS y cargadas con cada péptido a ensayar (células efectoras).
Las células diana utilizadas para estudiar la especificidad de las CTL frente a HER-2/neu son células RMAS-HHD y células EL-4/HHD/neu obtenidas como se ha descrito en el ejemplo 6.
La citotoxicidad se ensaya después de la tercera estimulación in vitro. Las células RMAS-HHD, cargadas con el péptido correspondiente a aquel con el que se cargaron las células B o con un péptido de control, y las células EL-4/HHD/neu se utilizan como células diana.
Los resultados se presentan en la Figura 16 [% de lisis específica (la lisis de las células diana cargadas con un péptido de control se resta) después de una inmunización con Vax1 (\Box) o Vax1/pet-neu (\ding{110})].
Las células esplénicas sensibilizadas con Vax1/pet-neu conducen a células CTL específicas para los doce péptidos. De forma sorprendente, las CTL contra la mayoría de los péptidos, excepto HER-2/neu 369 y HER-2/neu 789, se generan a partir de células esplénicas sensibilizadas con el vector Vax1. Para algunos péptidos (EIER-2/neu 1023, HER-2/neu 48, HER-2/neu 799, HER-2/neu 773, HER-2/neu 391Y), la citotoxicidad de las CTL inducidas a partir de las células esplénicas sensibilizadas con Vax1 es casi tan elevada como la citotoxicidad de las CTL inducidas a partir de células esplénicas sensibilizadas con Vax1/pet-neu (Figura 16A). Esto demuestra que las estimulaciones in vitro repetitivas son suficientes para desencadenar la inducción de CTL.
Sin embargo, estas CTL aunque eliminan dianas cargadas con péptidos son incapaces de reconocer y de eliminar a las células diana que expresan HER-2/neu endógeno (EL-4/HHD/neu) al contrario que las CTL inducidas a partir de las células esplénicas sensibilizadas con Vax/pet-neu (Figura 16B).
El conjunto de estos resultados demuestra que las CTL específicas de HER-2/neu capaces de eliminar eficazmente a las células tumorales que expresan el antígeno se generan mediante una vacunación con Vax1/pet-neu.
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II. La vacunación con Vax1/pet-neu induce in vivo una inmunidad anti-tumoral
Los resultados obtenidos in vitro conducen a investigar si la vacunación con Vax1/pet-neu induce in vivo inmunidad anti-tumoral protectora
A. Efectos sobre el crecimiento de los tumores y especificidad de la protección anti-tumoral
Un sub-clon de las células EL-4/HHD/neu, generadas como se ha descrito en el ejemplo 6, extremadamente tumorigénico se obtiene después de tres selecciones in vivo en ratones HHD. Este sub-clon expresa HHD y HER-2/neu al mismo nivel que las células parentales.
Los ratones HHD, generados como se ha descrito en el ejemplo 1, se inmunizan a razón de dos inyecciones en un intervalo de dos semanas con la construcción Vax1/pet-neu (Figuras 17A y 17C) o con el vector Vax1 (Figura 17B) o no se inmunizan (Figura 17D).
Una semana después de la última inmunización, a los ratones anteriores se les injertan 2 x 10^{4} células EL-4/HHD/neu (Figuras 17A, 17B y 17D) o células EL-4/HHd/TelAml, obtenidas transfectando las células EL-4/HHD con ADNc que codifica la proteína recombinante Tel-Aml, para ensayar in vivo la especificidad de la inmunidad protectora anti-tumoral.
El crecimiento de los tumores se evalúa cada de 5 a 7 siete días hasta el día 28 cuando todos los ratones no vacunados están muertos y a los ratones de los grupos restantes se les realiza un seguimiento de su mortalidad.
Los resultados se presentan en la Figura 17 (tamaño de los tumores en función del número de días después del implante de la células tumorales).
Todos los ratones de control no vacunados (Figura 17D) o vacunados con Vax1 (Figura 17B) desarrollan tumores que aparecen en día 17 y aumentan de tamaño muy rápidamente. El día 28 tumores miden 772 \pm 268 mm^{2} y 404 \pm 121 mm^{2} en ratones de control y tratados con Vax1 respectivamente (p = 0,04).
Por el contrario, en el lote de ratones vacunados con Vax1/pet-neu (Figura 17A), 2 ratones de 9 no presentan tumores en el día 28, sino que los tumores aparecen en el día 23 y aumentan de tamaño lentamente. El tamaño de los tumores es de 116 \pm 66 mm^{2} (p = 0,0001 en comparación con los ratones no tratados o con los ratones tratados con Vax1).
Esta inmunidad protectora anti-tumoral in vivo es específica de HER-2/neu debido a que los ratones vacunados con Vax1/pet-neu no están protegidos contra el tumor EL-4/HHD/Tel-Aml (Figura 17C). En efecto, todos los ratones desarrollan tumores y su tamaño en el día 28 es de 578 \pm 231 mm^{2}.
B. Efectos sobre la supervivencia de los ratones y especificidad de la protección anti-tumoral
El efecto de la protección anti-tumoral inducida mediante la vacunación con Vax1/pet-neu se confirma examinando la supervivencia de ratones portadores de tumores.
Los ratones HHD se vacunan y se les realizan injertos tal como se ha descrito en A. Se realiza un seguimiento de su mortalidad hasta el día 55.
Los resultados se presentan en la Figura 18 (% de supervivencia en función del número de días después del implante de las células tumorales).
Todos los ratones no vacunados mueren en el día 32 (\ding{116}).
Para los ratones vacunados con Vax1 (\ding{110}), la mortalidad comienza el día 32 y el último ratón muere el día 42 (p = 0,04 en comparación con los ratones no vacunados).
La mortalidad se reduce significativamente en el lote de ratones vacunados con Vax1/pet-neu (\medbullet). Ésta comienza el día 39 y 5 ratones (el 56%) siguen con vida el día 55 (p = 0,0008 en comparación con los ratones no tratados y tratados con Vax1).
Esta inmunidad protectora es específica para HER-2/neu debido a que la mortalidad de los ratones tratados con Vax1/pet-neu e injertados con el tumor EL4/HHD/Tel-Aml (\ding{115}) es similar a la mortalidad de los ratones tratados con Vax1 e injertados con las células tumorales EL-4/HHD/neu (\ding{110}).
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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente Europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citados en la descripción
\bullet FR 0000591
\bullet FR 0102387 W
Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción
\bulletSCHULTZ et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 1991
\bulletSAROBE et al. J. Clin. Invest. 1998, vol. 102, 1239
\bulletKAST et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol 88, 2283
\bulletVALMORI et al. J. Immunol., 1998, vol. 160, 1750
\bulletMARCHAND et al. Int. J. Cancer, 1999, vol. 80, 219.
\bulletMICHELETTI et al. Eur. J. Immunol., 1999, vol. 29, 2579
\bulletROSENBERG et al. Nature Med., 1998, vol. 4, 321
\bulletPARKER et al. J. Immunol., 1994, vol. 152, 163
\bulletKLENERMAN et al. Nature, 1994, vol. 369, 403
\bulletFIRAT et al. Eur. J. Immunol., 1999, vol. 29, 3112
\bulletBERTOLETTI et al. Nature, 1994, vol. 369, 407
\bullet VAN DER BURG et al. J. Immunol., 1996, vol. 156, 3308
\bulletMOSKOPHIDIS; ZINKERNAGEL. J. Virol., 1995, vol. 69, 2187
\bulletPASCOLO et al. J. Exp. Med., 1997, vol. 185, 2043
\bulletBORROW et al. Nat. Med., 1997, vol. 3, 205
\bulletPARHAM et al. Hum. Immunol., 1981, vol. 3 (4), 277-299.
\bulletOUKKA et al. J. Immunol., 1996, vol. 157, 3039
\bulletJOHNSON. J. Immunol., 1991, vol. 147, 1512
\bulletYANG. J. Immunol., 2000, vol. 164, 4204
\bulletTOURDOT et al. J. Immunol., 1997, vol. 159, 2391
\bulletVIRELIZIER. J. Immunol, 1975, vol. 115(2), 434-439
\bulletLIPFORD et al. Vaccine, 1995, vol. 13, 313
\bulletZAKS. Cancer Res., 1998, vol. 58, 4902
\bulletBRISTOL et al. J. Immunol., 1998, vol. 160, 2433
\bulletBROSSART. Cancer Res., 1998, vol. 58, 732
\bulletOSBORNE et al. Cancer Res., 1979, vol. 39, 2422-2428
\bulletHUDRISIER et al. Mol. Immunol., 1995, vol. 32, 895
\bulletMORGAN et al. Blood, 1989, vol. 73 (8), 2155-2164
\bulletPOGUE et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, 8166
\bulletVONDERHEIDE. Immunity, 1999, vol. 10, 11
\bulletPARKHURST et al. J. Immunol., 1996, vol. 157, 2539
\bulletPASCOLO et al. J. Exp. Med., 1997, vol. 185, 2043-2051
\bulletBAKKER et al. Int. J. Cancer, 1997, vol. 70, 302
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> INSERM
\hskip1cm
INSTITUT GUSTAVE ROUSSY 
\hskip1cm
KOSMATOPOULOS, Kostas 
\hskip1cm
TOURDOT, Sophie 
\hskip1cm
SCARDINO, Antonio 
\hskip1cm
GROSS, David, Alexandre 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO DE SELECCIÓN DE PÉPTIDOS UTILIZABLES EN INMUNOTERAPIA
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<130> MJPcb598-40
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<140>
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<141>
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<150> FR 0009591
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<151> 21-07-2000
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<160> 70
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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101 
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<222> (2)
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<223> Xaa(1) = Tyr o Lys y Xaa(4) = Glu o Lys
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102 
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113 
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120 
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121 
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124 
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm
143 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
144 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
145 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
146 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
147 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
148 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
149 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm
150 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm
151 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip1cm
152 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\hskip1cm
153 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\hskip1cm
154 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip1cm
155 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip1cm
156 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm
157 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip1cm
158 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\hskip1cm
159 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\hskip1cm
160 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\hskip1cm
161 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\hskip1cm
162 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip1cm
163 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
164 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm
165 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm
166 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip1cm
167 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
168 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
169 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PÉPTIDOS SINTÉTICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> INSERM
\hskip1cm
INSTITUT GUSTAVE ROUSSY 
\hskip1cm
KOSMATOPOULOS, Kostas 
\hskip1cm
TOURDOT, Sophie 
\hskip1cm
SCARDINO, Antonio 
\hskip1cm
GROSS, David, Alexandre 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO DE SELECCIÓN DE PÉPTIDOS UTILIZABLES EN INMUNOTERAPIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJPcb598-40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/FR01/02387
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 20-07-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 0009591
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 21-07-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
170 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa(1) = Tyr o Lys y Xaa(4) = Glu o Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
171 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
172 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
173 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
174 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
175 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
176 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
177 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
178 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
179 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
180 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
181 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
182 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
183 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
184 
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185 
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189 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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\newpage
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<212> PRT
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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209 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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210 
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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\hskip1cm
211 
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
212 
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
213 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
214 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
215 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
216 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
217 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
218 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm
219 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm
220 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
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<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip1cm
221 
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<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<400> 53
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222 
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<400> 55
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224 
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<211> 10
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<400> 60
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<211> 9
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230 
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<400> 62
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231 
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<211> 13
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<400> 63
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232 
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<210> 64
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<400> 64
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233 
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<210> 65
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<211> 9
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<400> 65
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234 
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<210> 66
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<211> 9
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<400> 66
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235 
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<210> 67
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<211> 9
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236 
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238 
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<400> 70
16

Claims (16)

1. Procedimiento de identificación de epítopos subdominantes/crípticos presentados por la molécula HLA A2.1 de clase I, caracterizado porque comprende al menos las siguientes etapas:
a) la elección, a partir de la secuencia de una proteína contra la que se desea inducir una respuesta citotóxica T, de al menos una secuencia peptídica de 8 a 11 aminoácidos que posee todo o parte del motivo de anclaje primario de la molécula HLA A2.1 y tal que el complejo de este péptido con la molécula HLA A2.1 posea un DC50 inferior a 2 horas;
b) la preparación, para cada secuencia seleccionada, de un péptido variante obtenido a partir de dicha secuencia mediante sustitución del aminoácido N terminal por un resto tirosina;
c) la determinación de la inmunogenicidad de cada péptido variante obtenido en la etapa b) mediante la selección, entre estos, de cada péptido inmunógeno que genera una respuesta CTL específica contra células diana que expresan la proteína de la que se ha obtenido la secuencia peptídica seleccionada en la etapa a) y la identificación de la secuencia peptídica de la que se obtiene dicho péptido inmunógeno.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia peptídica seleccionada en la etapa a) corresponde a un péptido que posee una afinidad relativa por la molécula HLA A2.1 superior a 5, preferiblemente superior a 10 con respecto a HIVpol 589 (SEC ID Nº 3).
3. Procedimiento de determinación de una secuencia de un péptido inmunógeno presentado por la molécula HLA A2.1 de clase I capaz de inducir una respuesta citotóxica T dirigida contra un epítopo no inmunógeno de una proteína diana, estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende al menos las siguientes etapas:
a) la identificación mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, de un epítopo subdominante/críptico de la proteína contra la que se desea inducir una respuesta citotóxica T, y
b) la modificación de la secuencia de dicho epítopo subdominante/críptico, mediante sustitución del aminoácido N terminal por un resto tirosina.
4. Péptido inmunógeno caracterizado porque se obtiene, mediante sustitución del aminoácido N terminal por un resto tirosina, a partir de un epítopo subdominante/críptico presentado por HLA A2.1 seleccionado entre:
el péptido HER-2/neu 650: PLTSIISAV
(SEC ID Nº 4)
el péptido HER-2/neu 466: ALIHHNTHL
(SEC ID Nº 5)
el péptido HER-2/neu 402: TLEEITGYL
(SEC ID Nº 6)
el péptido HER-2/neu 391: PLQPEQLQV
(SEC ID Nº 7)
el péptido gagp24-212: EMMTACQGV
(SEC ID Nº 8)
el péptido pol79: LLDTGADDTV
(SEC ID Nº 9)
el péptido mhp 572: RLFFYRKSV
(SEC ID Nº 10)
el péptido mhp 988: DLQVNSLQTV
(SEC ID Nº 11)
5. Epítopo subdominante/críptico presentado por HLA A2.1, caracterizado porque se trata del péptido mhp 988: DLQVNSLQTV (SEC ID Nº 11).
6. Composición que comprende al menos un epítopo peptídico inmunógeno de acuerdo con la reivindicación 4.
7. Composición de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende además uno o varios epíto-
po(s) inmunógeno(s) diferente(s).
8. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizada porque comprende un polipéptido quimérico que comprende una o varias copias de un epítopo peptídico inmunógeno de acuerdo con la reivindicación 4.
9. Composición de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque dicho polipéptido quimérico comprende además una o varias copias de uno o varios epítopo(s) inmunógeno(s) diferente(s).
\newpage
10. Molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9.
11. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende una secuencia que codifica:
el epítopo HER-2/neu 650Y1: YLTSIISAV
(SEC ID Nº 69)
el epítopo HER-2/neu 466Y: YLIHHNTHL
(SEC ID Nº 66)
el epítopo HER-2/neu 402Y1: YLEEITGYL
(SEC ID Nº 67)
el epítopo HER-2/neu 391Y: YLQPEQLQV
(SEC ID Nº 68)
12. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada porque comprende además una secuencia que codifica:
el epítopo HER-2/neu 799: QLMPYGCLL
(SEC ID Nº 27)
el epítopo HER-2/neu 369: KIFGSLAFL
(SEC ID Nº 28)
el epítopo HER-2/neu 789: CLTSTVQLV
(SEC ID Nº 24)
el epítopo HER-2/neu 689: RLLQETELV
(SEC ID Nº 65)
el epítopo HER-2/neu 773: VMAGVGSPYV
(SEC ID Nº 31)
el epítopo HER-2/neu 5: ALCRWGLLL
(SEC ID Nº 30)
el epítopo HER-2/neu 58: HLYQGCQVV
(SEC ID Nº 25)
el epítopo HER-2/neu 1023: YLVPQQGFFC
(SEC ID Nº 64)
13. Medicamento que comprende, como principio activo, al menos un epítopo peptídico inmunógeno de acuerdo con la reivindicación 4, o al menos una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 o al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 12.
14. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque se destina a inmunoterapia antiviral o antitumoral, preventiva o curativa.
15. Medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque es una vacuna.
16. Utilización de un epítopo peptídico de acuerdo con la reivindicación 4, de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 o de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 12, para la obtención de un medicamento destinado a inmunoterapia antiviral o antitumoral.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5801005A (en) * 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
WO2001056355A2 (en) 2000-02-04 2001-08-09 Duke University Human immunodeficiency virus vaccine
AU2001241533A1 (en) * 2000-02-15 2001-08-27 The Regents Of The University Of California A universal vaccine and method for treating cancer employing telomerase reverse transcriptase
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie
EP1752160A3 (en) * 2001-04-06 2007-05-30 Mannkind Corporation Epitope sequences
WO2003008537A2 (en) * 2001-04-06 2003-01-30 Mannkind Corporation Epitope sequences
CN101171032B (zh) * 2005-05-09 2012-02-29 瓦克松生物技术公司 天然肽及其优化的衍生物作为疫苗的应用
CN101370513B (zh) * 2005-12-23 2013-04-03 瓦克松生物技术公司 由肿瘤抗原衍生的优化隐蔽性肽组成的免疫原性多肽及其用途
EP1887084A1 (en) * 2006-08-10 2008-02-13 International Investment and Patents SA Plasmids with immunological action
US9109007B2 (en) 2010-08-18 2015-08-18 Purdue Pharma L.P. MHC-I restricted epitopes containing non-natural amino acid residues
AU2012258603A1 (en) * 2011-05-26 2014-01-16 Geneius Biotechnology, Inc. Modulated immunodominance therapy
US11421015B2 (en) 2020-12-07 2022-08-23 Think Therapeutics, Inc. Method of compact peptide vaccines using residue optimization
US11161892B1 (en) 2020-12-07 2021-11-02 Think Therapeutics, Inc. Method of compact peptide vaccines using residue optimization
US11058751B1 (en) 2020-11-20 2021-07-13 Think Therapeutics, Inc. Compositions for optimized RAS peptide vaccines
US11464842B1 (en) 2021-04-28 2022-10-11 Think Therapeutics, Inc. Compositions and method for optimized peptide vaccines using residue optimization

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5128319A (en) * 1987-08-28 1992-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Prophylaxis and therapy of acquired immunodeficiency syndrome
AU6359494A (en) * 1993-03-05 1994-09-26 Epimmune, Inc. Hla-a2.1 binding peptides and their uses
US5801005A (en) * 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
WO1995027901A1 (en) * 1994-04-11 1995-10-19 Ixsys, Inc. Class i peptide binding motifs
ATE296444T1 (de) * 1996-03-21 2005-06-15 Circassia Ltd Kryptische peptide und verfahren zu ihrer identifizierung
US7030211B1 (en) * 1998-07-08 2006-04-18 Gemvax As Antigenic peptides derived from telomerase
US7851591B1 (en) * 1998-10-29 2010-12-14 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Cancer immunotherapy and diagnosis using universal tumor associated antigens, including hTERT
AU2001241533A1 (en) * 2000-02-15 2001-08-27 The Regents Of The University Of California A universal vaccine and method for treating cancer employing telomerase reverse transcriptase
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie

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