CA2416761C - Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie - Google Patents

Abstract

Procédé d'identification d'épitopes sous-dominants/cryptiques présentés par une molécule HLA de classe I ; ce procédé comprend au moins les étapes suivantes :a) le choix, à partir de la séquence d'une protéine vis-à-vis de laquelle on souhaite induire une réponse cytotoxique T, d'au moins une séquence peptidique de 8 ô 11 acides aminés susceptible de constituer un épitope de ladite protéine présenté par une molécule HLA de classe I, et correspondant ô un peptide ô faible affinité pour ladite molécule HLA de classe I et non-immunogène ;b) la préparation, pour chaque séquence sélectionnée, d'un peptide variant dérivé de ladite séquence par substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine ; c) la détermination de l'immunogénicité de chaque peptide variant obtenu ô l'étape b) par la sélection, parmi ceux-ci, de chaque peptide immunogène, générant une réponse CTL spécifique vis-à-vis de cellules cibles exprimant la protéi ne dont il est issu et l'identification de la séquence peptidique dont dérive ledit peptide immunogène.Applications dudit procédé au criblage de peptides utilisables en immunothérapie.

Description

PROCEDE DE CRIBLAGE DE PEPTIDES UTILISABLES EN IMMUNOTHERAPIE
La vaccination ou immunothérapie peptidique est une approche thérapeutique qui fait actuellement l'objet d'un grand intérêt dans le cadre de la prévention ou du traitement des pathologies virales ou cancéreuses. Son principe repose sur l'immunisation par des peptides reproduisant des épitopes T d'antigènes viraux ou tumoraux reconnus par les cellules T
cytotoxiques (CTL), en général de type CD8+, qui jouent un rôle majeur dans l'élimination des cellules exprimant ces antigènes à leur surface.
On rappellera que les CTL ne reconnaissent pas les antigènes protéiques entiers, mais des fragments peptidiques de ceux-ci, comprenant généralement 8 à 10 acides aminés, présentés par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I) exprimées à la surface de différentes cellules. La présentation de ces peptides résulte d'un processus complexe, dénommé
apprêtement de l'antigène , qui implique 3 étapes principales :
- la dégradation cytosolique des protéines antigéniques par un complexe multienzymatique dénommé
protéasome ;
- la translocation des peptides issus de cette dégradation dans le réticulum endoplasmique (RE) par les transporteurs TAP ;
- l'association de ces peptides avec les 2 chaînes du CMH I pour former des complexes stables peptide/CMH I, qui seront exportés à la surface cellulaire.
Les complexes peptide/CMH I interagissent avec les récepteurs à l'antigène (TCR) correspondants des lymphocytes T. Cette interaction induit la stimulation de ces lymphocytes, et leur division cellulaire (prolifération clonale) qui aboutit à la génération des lymphocytes effecteurs portant le même TCR, qui assureront l'élimination de l'agresseur vis-à-vis des antigènes duquel la réponse immunitaire a été induite.
Au cours du processus d'apprêtement s'opère une sélection des peptides, qui aboutit à une hiérarchie de

2 présentation par le CMH I à la surface de la cellule. La représentation des épitopes à la surface cellulaire dépendra notamment de la stabilité de la protéine antigénique dans le cytosol, des sites et de la fréquence des coupures effectuées par le protéasome, de l'efficacité de la translocation dans le RE par les transporteurs TAP, et surtout de la capacité
des peptides à se fixer aux différentes molécules de CMH I et à former des complexes peptide/CMH I stables.
Les peptides qui sont préférentiellement présentés par le CMH à l'issue du processus d'apprêtement constituent des épitopes immunodominants, qui sont les principaux participants à la réponse CTL aux antigènes natifs dont ils sont issus. En revanche les peptides qui ne sont que faiblement présentés constituent des épitopes sous-dominants/cryptiques, qui ne participent que peu ou pas à
cette réponse.
Il a été proposé d'utiliser des peptides _:Drrespondant à ceux présentés par le CMH I pour induire une réponse protectrice, notamment vis-à-vis d'antigènes viraux ou tumoraux.
Il a ainsi été montré que des vaccins basés sur des peptides immunodominants, généralement sélectionnés sur la base de leur forte affinité pour les molécules de CMH I, permettaient d'assurer une protection antivirale ou antitumorale dans de nombreux modèles expérimentaux murins et plus récemment, chez les humains [SCHULTZ et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88, 991 (1991) ; KAST et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88, 2283, (1991) ; MARCHAND et al., Int. J.
Cancer, 80, 219, (1999) ; ROSENBERG et al., Nature Med., 4, 321, (1998)].
Cependant, il a également été montré récemment que la vaccination avec les peptides immunodominants pourrait, dans certains cas, s'avérer inefficace. Ainsi, lors de l'infection chronique avec un virus dont le taux de mutation est élevé, comme HIV ou HBV, la pression de sélection imposée par la réponse CTL antivirale naturelle favorise la survie de variants ayant muté dans la séquence de leurs peptides immunodominants. Ces variants ne sont plus

3 reconnus par des CTL spécifiques d'épitopes immunodominants [KLENERMAN et a1., Nature, 369, 403, (1994) ; BERTOLETTI et a1., Nature, 369, 407, (1994) ; MOSKOPHIDIS et ZINKERNAGEL, J. Virol., 69, 2187, (1995) ; BORROW et al., Nat. Med., '3, 205, (1997) ; GOULDER et al., Nat. Med., 3, 212, (1997)].
Également, dans le cas de tumeurs exprimant à des taux élevés des protéines qui sont aussi exprimées dans des tissus normaux, et qui constituent des antigènes du soi , un phénomène de tolérance peut se développer. Cette tolérance concerne principalement les épitopes immunodominants à forte affinité pour MHC. La stimulation du répertoire CTL
spécifique de ces épitopes ne parait donc pas être la meilleure voie pour obtenir une protection antitumorale -fficace.
~b L'utilisation d'épitopes sous-dominants/
cryptiques, de faible affinité pour le CMH, a donc été
proposée. Dans le cas de la vaccination antivirale, ces épitopes, qui ne sont pas soumis à une pression de sélection similaire à celle des épitopes immunodominants, peuvent représenter des cibles utiles pour éliminer des virus de type sauvage ainsi que leurs variants. Dans le cas de la vaccination antitumorale, les épitopes de faible affinité ne participant que peu ou pas à l'établissement de la tolérance, le répertoire de CTL anti-tumoraux spécifiques de ces épitopes, pourrait rester disponible pour un recrutement in vivo.
Lors de travaux précédents, l'équipe des Inventeurs a montré [OUKKA et al., J. Immunol., 157, 3039, (1996)] qu'il était possible d'utiliser les peptides sous-dominants/cryptiques en vaccination anti-virale. Ils ont également observé que l'efficacité de protection induite par des épitopes sous-dominants/cryptiques était inférieure à
celle obtenue avec la vaccination par le peptide dominant, mais qu'elle pouvait être augmentée en rendant ces peptides plus immunogènes par l'augmentation de leur affinité pour le CMH I [TOURDOT et a1., J. Immunol., 159, 2391, (1997].
La stratégie habituelle pour augmenter l'immunogénicité des épitopes viraux ou tumoraux, consiste à

4 augmenter leur affinité pour le CMH I et/ou la stabilité du complexe peptide/CMH I par des substitutions d'acides aminés.
Il a en effet été observé que les peptides capables de former un complexe avec un allèle de CMH donné ont en commun la présence, à certaines positions, de résidus d'acides aminés conservés. On a ainsi défini pour chaque allèle du CMH I un motif d'ancrage spécifique, impliquant des acides aminés dénommés résidus d'ancrage primaires . Il a aussi été
montré que des résidus situés en dehors des sites d'ancrage (résidus d'ancrage secondaires) pouvaient exercer un effet favorable ou défavorable sur l'affinité du peptide pour le CMH ; la présence de ces résidus d'ancrage secondaires permet d'expliquer qu'il existe, au sein des peptides possédant le ;ae motif d'ancrage spécifique d'un CMH I donné, une grande ;,ariabilité dans l'affinité de fixation, et que des peptides n'ayant pas le motif d'ancrage primaire complet puissent être présentés par les molécules de CMH I et posséder pour ces molécules une forte affinité.
De nombreuses équipes sont ainsi parvenues à
augmenter l'immunogénicité de peptides identifiés comme immunogènes viraux ou tumoraux potentiels, en augmentant leur affinité pour le CMH I. Par exemple, chez la souris, LIPFORD
et al. [Vaccine, 13, 313, (1995)] ont montré que la substitution de D par I en position 2 du peptide sur l'épitope 50-57 de l'Ag E6.1 du papillomavirus présenté par la molécule Kb augmentait la stabilité des complexes formés avec la molécule Kb, et rendait l'épitope immunogène in vivo, les CTL induits reconnaissant les cellules transformées par le papillomavirus. BRISTOL et al. [J. Immunol., 160, 2433, (1998)] ont également montré que le remplacement du résidu V
en position C-terminale de l'épitope 4-12 de l'oncogène Ras p21 muté, par I ou L, qui sont les acides aminés d'ancrage en position 9 spécifiques de la molécule Kd, permettait l'induction d'une réponse CTL spécifique chez la souris BALB/c. HUDRISIER et al. [Mol. Immunol., 32, 895, (1995)] ont identifié les résidus du peptide SMIENLEYM (SEQ ID NO: 1) qui intervenaient dans la liaison à la molécule Db, et ont produit une série de peptides à forte affinité, dérivés de la séquence X'AIX4NAEAL (SEQ ID NO: 2) où X1=Y ou K et X4 =E ou K.
Chez l'homme, POGUE et al. [Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 92, 8166, (1995)] ont substitué des acides aminés

5 aux différentes positions de l'épitope 767-484 de la transcriptase inverse du virus HIV-1, présenté par la molécule HLA A2.1, et ont montré que la substitution par Y ou F du résidu en position 1 augmentait l'affinité du peptide et sa capacité à induire des CTL à partir de PBL de donneurs séropositifs possédant l'allèle HLA A2.1. PARKHURST et al.
[J. Immunol., 157, 2539, (1996)] ont réalisé des substitutions uniques aux positions 1, 2, 3, ou doubles aux positions 1 et 2, ou 2 et 3, dans les épitopes gplOO 209, J 280 et gplOO 154 de l'Ag gplOO associé au mélanome, et ont montré que les épitopes modifiés gplOO 209 2M, et gplOO
280 9V avaient une affinité plus forte que l'épitope non-modifié. BAKKER et al. [Int. J. Cancer, 70, 302, (1997)], ont obtenu par substitution à une des positions d'ancrage (position 2) ou en dehors des positions d'ancrage (position 8), des variants de l'épitope gplOO 154, possédant une plus forte affinité que l'épitope natif. SAROBE et al. [J. Clin.
Invest., 102, 1239, (1998)] ont obtenu un variant immunogène de l'épitope C7A de la protéine core du virus HCV présenté
par HLA A2.1. VALMORI et al. [J. Immunol., 160, 1750, (1998)]
ont obtenu un dérivé à forte affinité de l'épitope 26-35 de l'antigène de mélanome MART-1 présenté par HLA A2.1.
Il apparaît donc possible d'augmenter 1'immunogénicité d'épitopes sous-dominants/cryptiques, afin de les utiliser en immunothérapie. Cependant, ceci nécessite l'identification préalable de ces épitopes. Or, celle-ci demeure problématique, du fait précisément de leur faible immunogénicité.
Dans le but de remédier à ce problème, les Inventeurs ont recherché s'il était possible de définir des règles générales de substitution des acides aminés qui permettrait d'augmenter l'affinité et donc l'immunogénicité
de la majorité des épitopes tumoraux présentés par le CMH
(par les molécules HLA de classe I et notamment la molécule

6 PCT/FR01/02387 HLA A2 . 1) , et ce, qu'ils possèdent ou non les acides aminés d'ancrage spécifiques de cette molécule, et de façon générale, indépendamment de leur séquence d'origine.
Les Inventeurs ont ainsi constaté que la seule substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine augmentait, quelle que soit la séquence du peptide natif, l'affinité de ce peptide pour les molécules HLA de classe I et notamment la molécule HLA A2.1, et la stabilité
du complexe peptide/CMH I formé, et ce dans une proportion d'autant plus importante que l'affinité du peptide natif était plus faible. Ils ont en outre observé que les peptides modifiés de la sorte conservaient la spécificité antigénique des peptides naturels, et devenaient immunogènes, et capables .e recruter in vivo un répertoire CTL spécifique du peptide natif correspondant.
La présente invention a pour objet un procédé
d'identification d'épitopes sous-dominants/cryptiques présentés par une molécule HLA de classe I, par exemple HLA
A2.1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
a) le choix, à partir de la séquence d'une protéine vis-à-vis de laquelle on souhaite induire une réponse cytotoxique T, d'au moins une séquence peptidique de 8 à 11 acides aminés susceptible de constituer un épitope de ladite protéine présenté par une molécule HLA de classe I, par exemple HLA A2.1, et correspondant à un peptide à faible affinité pour ladite molécule HLA de classe I et non-immunogène ;
b) la préparation, pour chaque séquence sélectionnée, d'un peptide variant dérivé de ladite séquence par substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine ;
c) la détermination de l'immunogénicité de chaque peptide variant obtenu à l'étape b) par la sélection, parmi ceux-ci, de chaque peptide immunogène, générant une réponse CTL spécifique vis-à-vis de cellules cibles exprimant la protéine dont il est issu et l'identification de la séquence peptidique dont dérive ledit peptide immunogène.

7 Alternativement, la présente invention a pour objet un procédé
d'identification d'épitopes sous-dominants/cryptiques présentés par la molécule HLA
A2.1 de classe I, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes:
a) le choix, à partir de la séquence d'une protéine vis-à-vis de laquelle on souhaite induire une réponse cytotoxique T, d'au moins une séquence peptidique de

8 à 11 acides aminés qui possède tout ou partie du motif d'ancrage primaire de la molécule HLA A2.1, et telle que le complexe de ce peptide avec la molécule HLA
A2.1 possède une DC50 inférieure à 2 heures; et b) la préparation, pour chaque séquence sélectionnée, d'un peptide variant dérivé de ladite séquence par substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine;
c) la détermination de l'immunogénicité de chaque peptide variant obtenu à l'étape b) par la sélection, parmi ceux-ci, de chaque peptide immunogène, générant une réponse CTL spécifique vis-à-vis de cellules cibles exprimant la protéine dont est issue la séquence peptidique choisie à l'étape a), et l'identification de la séquence peptidique dont dérive ledit peptide immunogène.
La présente invention a également pour objet un procédé de détermination d'une séquence d'un peptide immunogène présenté par la molécule HLA A2.1 de classe I, capable d'induire une réponse cytotoxique T dirigée contre un épitope non immunogène d'une protéine cible, ledit procédé étant caractérisé
en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes:
a) l'identification, par un procédé selon l'invention, d'un épitope sous-dominant/cryptique de la protéine vis-à-vis de laquelle on souhaite induire une réponse cytotoxique T, et b) la modification de la séquence dudit épitope sous-dominant/cryptique, par substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine.

7a Également, la présente invention a pour objet un peptide immunogène dérivé, par substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine, d'un épitope sous-dominant/cryptique présenté par HLA A2.1 choisi parmi:
le peptide HER-2/neu 650: PLTSIISAV (SEQ ID NO: 4) le peptide HER-2/neu 466: ALIHHNTHL (SEQ ID NO: 5) le peptide HER-2/neu 402: TLEEITGYL (SEQ ID NO: 6) le peptide HER-2/neu 391: PLQPEQLQV (SEQ ID NO: 7) le peptide gagp24-212: EMMTACQGV (SEQ ID NO: 8) le peptide po179 : LLDTGADDTV (SEQ ID NO: 9) le peptide mhp 572: RLFFYRKSV (SEQ ID NO: 10) et le peptide mhp 988: DLQVNSLQTV (SEQ ID NO: 11).
Également, la présente invention a pour objet un épitope sous-dominant/cryptique présenté par HLA A2.1, caractérisé en ce qu'il s'agit du peptide mhp 988: DLQVNSLQTV (SEQ ID NO: 11).
Également, la présente invention a pour objet une composition comprenant au moins un peptide immunogène telle que décrit dans l'invention et un excipient.
Également, la présente invention a pour objet une molécule d'acide nucléique codant un polypeptide chimérique telle que décrite dans l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence codant pour un épitope choisi parmi:
l'épitope HER-2/neu 650Y1 : YLTSIISAV (SEQ ID NO: 69) l'épitope HER-2/neu 466Y: YLIHHNTHL (SEQ ID NO: 66) l'épitope HER-2/neu 402Y1 : YLEEITGYL (SEQ ID NO: 67) et l'épitope HER-2/neu 391Y: YLQPEQLQV (SEQ ID NO: 68).
Également, la présente invention a pour objet un médicament destiné à
l'immunothérapie antivirale ou antitumorale, préventive ou curative comprenant, en tant que principe actif, au moins un peptide immunogène, un épitope sous-7b dominant/cryptique, au moins une composition, ou au moins une molécule d'acide nucléique, tels que décrits dans l'invention.
Également, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un peptide immunogène, d'un épitope sous-dominat/cryptique, d'une composition, ou d'une molécule d'acide nucléique tels que décrits dans l'invention, pour l'obtention d'un médicament destiné à l'immunothérapie antivirale ou antitumorale.

Dans le cadre de l'exposé de la présente invention, on entend par peptide immunogène un peptide capable d'induire une réponse CTL spécifique et par peptide non-immunogène un peptide incapable d'induire une réponse CTL spécifique.
Le choix des séquences peptidiques susceptibles de constituer des épitopes présentés par une molécule HLA de classe I, notamment HLA A2.1 peut s'effectuer, de manière classique, par l'analyse de la séquence peptidique de la protéine choisie, afin de sélectionner les peptides possédant tout partie du motif d'ancrage primaire d'une molécule HLA
cce classe I, notamment d'HLA A2.1 (L en position 2 et/ou V/L
en position C-terminale). On éliminera, bien entendu, les peptides connus comme étant immunogènes. Eventuellement, on pourra effectuer une sélection complémentaire des peptides dont la capacité de liaison potentielle à HLA de classe I, notamment HLA A2.1, prédite par analyse informatique, apparaît la plus faible. Des algorithmes utilisables dans ce but sont connus en eux-mêmes ; à titre d'exemple, on citera ceux décrits par PARKER et al. [J. Immunol., 152, 163, (1994)].
Cette analyse pourra avantageusement être complétée par la détermination expérimentale de l'affinité de liaison du peptide pour HLA de classe I, notamment HLA A2.1, et de la stabilité du complexe peptide/HLA de classe I. Des peptides non-immunogènes présentent le plus souvent une 7c faible affinité pour HLA de classe I, et/ou forment avec celui-ci un complexe peu stable. Des méthodes pour déterminer l'affinité du peptide pour HLA A2.1, et la stabilité du complexe formé sont connues en elles-mêmes. On citera par exemple celle décrite par FIRAT et al. [Eur. J. Immunol., 29, 3112, (1999)].
L'affinité d'un peptide pour HLA de classe I, notamment HLA A2.1 est le plus souvent définie par rapport à
celle d'un peptide de référence, sous forme d'affinité
relative. L'affinité relative est définie comme le rapport de la concentration dudit peptide permettant la formation d'une certaine quantité de complexe peptide/HLA de classe I, à la concentration du peptide de référence permettant la formation, dans les mêmes conditions, de la même quantité de complexe peptide/HLA de classe I. Dans ce cas, plus l'affinité relative est importante, plus l'affinité de liaison du peptide pour HLA de classe I sera faible.
A titre d'exemple, pour un complexe peptide/HLA
A2.1, en prenant comme peptide de référence, le peptide de séquence IVGAETFYV (SEQ ID NO: 3), plus de 84 % des peptides non-immunogènes auront fréquemment une affinité relative supérieure à 10.
La stabilité du complexe peptide/HLA A2.1 est souvent définie par la DC50, qui représente le temps nécessaire à la dissociation de 50% de complexes formés.
Généralement, ce temps est inférieur à 2 heures pour les peptides non-immunogènes.
Ainsi, si un peptide présenté par HLA A2.1, possède une affinité relative (par rapport à HIVpol 589) supérieure à 10, et une DC50 inférieure à 2 heures, il sera très probablement non-immunogène.
L'immunogénicité des peptides retenus à l'étape c) pourra être facilement vérifiée, par exemple par des méthodes classiques de détermination de la capacité de ce peptide à générer, in vivo, ex vivo, ou in vitro une réponse CTL spécifique vis-à-vis de cellules cibles exprimant la protéine dont il est issu.
Une fois ce choix effectué, les peptides variants, dérivés des séquences retenues par substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine, peuvent être très facilement préparés, notamment par synthèse peptidique, selon des techniques classiques bien connues en elles-même de l'homme du métier.
Avantageusement, avant la détection de l'immunogénicité de ces peptides variants, effectuée à
l'étape c) du procédé conforme à l'invention, ledit procédé
comprend une présélection desdits peptides variants par la détermination de l'affinité relative du peptide pour une molécule HLA de classe I, notamment HLA A2.1, et/ou de la stabilité du complexe peptide/HLA de classe I formé, et la

9 sélection des peptides variants présentant une affinité
relative pour HLA A2.1 inférieure à celle des peptides natifs dont ils sont dérivés, et/ou une DC50 supérieure à 2 heures.
Chaque peptide répondant à ces critères peut ensuite être testé, pour rechercher s'il peut induire un répertoire CTL spécifique du peptide natif non-immunogène dont il dérive, et capable notamment d'entraîner la lyse de cellules-cibles exprimant la protéine native dont ce peptide non-immunogène est issu.
Si-ce test est positif, on peut considérer que ce peptide natif non-immunogène représente un épitope sous-dominant/cryptique, présenté par HLA A2.1, dudit antigène.
La mise en oeuvre du procédé ci-dessus a par exemple permis aux Inventeurs d'identifier de nouveaux épitopes sous dominants/cryptiques présentés par HLA A2.1 de l'antigène tumoral HER-2/neu, de la sous-unité catalytique de la télomérase (TERT) et du virus HIV-1.
Ces épitopes sous-dominants/cryptiques sont les suivants :
Pour HER-2/neu le peptide HER-2/neu 650 : PLTSIISAV (SEQ ID NO: 4) le peptide HER-2/neu 466 : ALIHHNTHL (SEQ ID NO: 5) le peptide HER-2/neu 402 : TLEEITGYL (SEQ ID NO: 6) le peptide HER-2/neu 391 : PLQPEQLQV (SEQ ID NO: 7) Pour HIV-1 :
le peptide gagp24-212 : EMMTACQGV (SEQ ID NO: 8) le peptide pol79 : LLDTGADDTV (SEQ ID NO: 9) Pour la sous-unité catalytique de la télomérase (TERT) :
le peptide mhp 572 : RLFFYRKSV (SEQ ID NO: 10) le peptide mhp 988 : DLQVNSLQTV (SEQ ID NO: 11) 9a La présente invention a également pour objet des épitopes peptidiques immunogènes dérivés d'épitopes.sous-dominants/cryptiques pouvant être identifiés par la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, et notamment des épitopes sous-dominants/cryptiques de HER/neu, du virus HIV-1, et de la sous-unité catalytique de la télomérase (TERT) mentionnés ci-dessus.

De plus, la présente invention a pour objet un épitope sous-dominant/cryptique présenté par HLA A2.1, caractérisé en ce qu'il s'agit du peptide mhp 988: DLQVNSLQTV (SEQ ID NO: 11).
Également, la présente invention a pour objet une molécule d'acide nucléique codant un polypeptide chimérique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence codant:
l'épitope HER-2/neu 650Y1 : YLTSIISAV (SEQ ID NO: 69) l'épitope HER-2/neu 466Y : YLIHHNTHL (SEQ ID NO: 66) l'épitope HER-2/neu 402Y1 : YLEEITGYL (SEQ ID NO: 67) et l'épitope HER-2/neu 391Y: YLQPEQLQV (SEQ ID NO: 68).

Un épitope peptidique immunogène conforme à
l'invention peut être obtenu par différentes modifications de la séquence peptidique de l'épitope sous-dominant/cryptique dont il dérive. Très avantageusement, ces modifications 5 comprennent au moins la substitution de l'acide aminé *N-terminal par un résidu tyrosine. Il peut s'agir notamment d'un peptide variant sélectionné à l'issue de l'étape c) du procédé conforme à l'invention, ou éventuellement de tout dérivé de celui-ci comprenant d'autres modifications de

10 séquence permettant d'accroître son immunogénicité.
La présente invention a également pour objet des compositions comprenant au moins un épitope peptidique immunogène conforme à l'invention.
Les épitopes peptidiques immunogènes conformes à
l'invention sont utilisables dans tous les traitements d'immunothérapie pour lesquels il est souhaitable d'induire une réponse CTL dirigée contre des épitopes sous-dominants/cryptiques, et notamment dans le cadre de la thérapie antivirale ou anti-tumorale.
Avantageusement, il s'agit de compositions multiépitopiques, capables de générer une réponse CTL
polyspécifique, et qui dans ce but comprennent également un ou plusieurs autre(s) épitope(s) immunogène(s). Il peut s'agir d'un ou plusieurs autre(s) épitope(s) sous-dominant(s)/cryptique(s) et/ou d'un ou plusieurs épitope(s) immunodominant(s). Ces épitopes peuvent être issus du même antigène, ou de deux ou plusieurs antigènes différents.
Avantageusement, des compositions multiépitopiques conformes à l'invention peuvent également comprendre au moins un épitope présenté par une molécule du CMH II, et capable d'induire une réponse T auxiliaire. Elles peuvent comprendre en outre, pour être plus largement utilisables sur une population dont les individus portent des allèles HLA différents, un ou plusieurs épitopes présentés par des molécules du CMH I autres que HLA A2.
Selon un mode de réalisation préféré d'une composition conforme à l'invention, elle comprend au moins un polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copies

11 d'un épitope peptidique immunogène conforme à l'invention.
Dans le cas d'une composition multiépitopique, ledit polypeptide chimérique comprend en outre une ou plusieurs copies d'au moins un autre épitope immunogène.
Un tel polypeptide chimérique peut être facilement obtenu par des méthodes connues en elles-mêmes, et notamment par les techniques classiques de l'ADN recombinant.
La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique codant un polypeptide chimérique conforme à l'invention.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un épitope peptidique immunogène, d'une composition, ou d'une molécule d'acide nucléique conforme à
l'invention pour l'obtention d'un médicament, et notamment d'un médicament destiné à l'immunothérapie antivirale ou antitumorale.
La présente invention englobe également les médicaments comprenant, en tant que principe actif, au moins un épitope peptidique immunogène, une composition, ou une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, lesdits médicaments sont des vaccins.
Des médicaments conformes à l'invention peuvent comprendre en outre les excipients usuels, ainsi que des adjuvants habituellement utilisés en immunothérapie, et permettant par exemple de favoriser l'administration du principe actif, de le stabiliser, d'augmenter son immunogénicité, etc.
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs d'identification de nouveaux peptides et de nouveaux antigènes potentiellement utilisables en immunothérapie, par la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention.

12 EXEMPLE 1 : RELATION ENTRE L'AFFINITE, LA STABILITE DES
COMPLEXES HLA A2.1/PEPTIDE ET L'IMMUNOGENICITE DES PEPTIDES
VIRAUX ET TUMORAUX.

Trente-cinq peptides provenant d'antigènes viraux (HBV, HIV, Flu) et de tumeurs (HER-2/neu, mélanome gplOO, Tyrosinase, Mart-1) ont été testés pour leur capacité à fixer et à stabiliser la molécule HLA A2.1 : ces peptides sont représentés dans le Tableau I ci-après.
Tableau I
Peptides Séquences Tyrosinase 224 KLTGDENFTI (SEQ ID NO: 12) Tyrosinase 207 FLPWHRLFLL (SEQ ID NO: 13) Tyrosinase 1* MLLAVLYCL (SEQ ID NO: 14) gplOO 154* KTWGQYWQV (SEQ ID NO: 15) gpl00 476* VLYRYGSFSV (SEQ ID NO: 16) gplOO 209* TDQVPFSV (SEQ ID NO: 17) gplOO 570* SLADTNSLAV (SEQ ID NO: 18) gplOO 177* AMLGTHTMEV (SEQ ID NO: 19) gplOO 178 MLGTHTMEV (SEQ ID NO: 20) gpl00 457* LLDGTATLRL (SEQ ID NO: 21) mart-1 27* AAGIGILTV (SEQ ID NO: 22) mart-1 32* ILTVILGVL (SEQ ID NO: 23) HER-2/neu 789* CLTSTVQLV (SEQ ID NO: 24) HER-2/neu 48 HLYQGCQW (SEQ ID NO: 25) HER-2/neu 650 PLTSIISAV (SEQ ID NO: 4) HER-2/neu 466 ALIHHNTHL (SEQ ID NO: 5) HER-2/neu 402 TLEEITGYL (SEQ ID NO: 6) HER-2/neu 661 ILLVVVLGV (SEQ ID NO: 26) HER-2/neu 799* QLMPYGCLL (SEQ ID NO: 27) HER-2/neu 369* KIFGSLAFL (SEQ ID NO: 28) HER-2/neu 851* VLVKSPNHV (SEQ ID NO: 29) HER-2/neu 5* ALCRWGLLL (SEQ ID NO: 30) HER-2/neu 391 PLQPEQLQV (SEQ ID NO: 7) HER-2/neu 773* VMAGVGSPYV (SEQ ID NO: 31) HER-2/neu 971* ELVSEFSRM (SEQ ID NO: 32) HER-2/neu 1023* YLVPQQGFFC (SEQ ID NO: 64) HER-2/neu 689* RLLQETELV (SEQ ID NO: 65) HBVpoI 985 NLQSLTNLL (SEQ ID NO: 33) HBVpoI 765 LLGCAANWIL (SEQ ID NO: 34) HBVpoI 28 LLDDEAGPL (SEQ ID NO: 35) HBV pol 575* FLLSLGIHL (SEQ ID NO: 36) H BVpol 594 PLEEELPRL (SEQ ID NO: 37) FIuM 58* GILGFVFTL (SEQ ID NO: 38) HlVgag 76* SLYNTVATL (SEQ ID NO: 39) HIVrt 309* ILKEPVHGV (SEQ ID NO: 40) Vingt-deux de ces peptides (signalés par un astérisque dans le Tableau I) sont déjà connus en tant qu'épitopes, présentés par HLA A2.1 et générant une réponse cytotoxique CTL chez l'homme ; les 13 autres peptides qui n'ont pas encore été décrits en tant qu'épitopes, ont été
choisis en fonction de deux critères : la présence de motifs

13 d'ancrage primaires de HLA A2.1 (L en position 2 et V/L en position C-terminale) et un score de liaison faible, selon une évaluation effectuée par le programme BIMAS [PARKER'et al., J. Immunol. , 152, 163, (1994)].
L'affinité pour HLA A2.1 et la stabilité du complexe peptide/HLA A2.1 ont été évaluées par cytométrie de flux et l'immunogénicité a été évaluée par génération de CTL
sur des souris transgéniques HHD [PASCOLO et al., J. Exp.
Med., 185, 2043, (1997)].
Les protocoles utilisés sont les suivants [FIRAT
et al., Eur. J. Immunol., 29, 3112, (1999)]

Affinité

Des cellules T2 [FIRAT et al., Eur. J. Immunol., 29, 3112, (1999)] (3x105 cellules/ml) humaines, qui sont déficientes en transporteurs TAP, sont incubées à 37 C
pendant 16 heures avec diverses concentrations de chaque peptide à tester dans du milieu RPMI 1640 sans sérum, supplémenté avec 100 ng/ml de 32-microglobuline humaine.
Ensuite, elles sont lavées deux fois, et marquées avec l'anticorps monoclonal BB7.2 [PARHAM et al., Hum. Immunol., 3, 4, 277-299, (1981)] qui est spécifique de la molécule HLA
A2.1, puis avec un anticorps de chèvre anti-Ig de souris, couplé à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC).
Les cellules sont ensuite analysées en cytométrie de flux. Pour chaque concentration de peptide, la fluorescence spécifique de HLA A2.1 est calculée en tant que de la fluorescence obtenue avec 100 pM d'un peptide de référence (HIVpol 589 ; IVGAETFYV (SEQ ID NO: 3)). L'affinité
relative (RA) est définie comme le rapport de la concentration de chaque peptide induisant 20% de la fluorescence obtenue avec 100 pM du peptide de référence, à
la concentration du peptide de référence induisant 20% de la fluorescence obtenue avec 100 pM dudit peptide de référence.
Plus l'affinité relative est faible, et plus fortement le peptide se lie à HLA A2.1. La RA moyenne pour chaque peptide est déterminée à partir d'au moins trois expériences indépendantes. Dans toutes les expériences, 20% de la

14 fluorescence maximale ont été obtenus pour 1 à 3 p.M du peptide de référence.
Stabilité :

Des cellules T2 (106/ml) sont incubées pendant une nuit à 37 C avec 100 pM de chaque peptide à tester dans du milieu RPMI 1640 sans sérum, supplémenté avec 100 ng/ml de (32-microglobuline humaine. Ensuite, elles sont lavées- à
quatre reprises pour éliminer les peptides libres, incubées avec du Brefeldin A (SIGMA ; 10 pg/ml) pendant une heure pour prévenir l'expression à leur surface des molécules HLA A2.1 nouvellement synthétisées, lavées et incubées à 37 C pendant 0, 2, 4, 6 ou 8 heures. Pour chaque temps d'incubation, les cellules sont ensuite marquées, comme indiqué ci-dessus, avec l'anticorps BB7.2, et analysées en cytométrie de flux pour évaluer la quantité de complexe peptide/HLA A2.1 présent à
leur surface. Cette quantité est évaluée par la formule :
(fluorescence moyenne des cellules T2 préincubées avec le jieptide - fluorescence moyenne des cellules T2 traitées dans des conditions similaires en l'absence de peptide) . Le DC50 (complexe de dissociation : DC) est défini comme étant le temps requis pour la perte de 50% des complexes HLA A2.1/peptide stabilisés à t=0.

Immunogénicité :

Les souris HHD utilisées sont (32m-/-,Db-/- et expriment une monochaîne HLA A2.1 composée des domaines al et a2 de HLA A2.1 et des domaines a3 et intracellulaire de Db reliée par son N-terminal au C-terminal de (32-m humain par un peptide de 15 acides aminés.
Les souris reçoivent une injection sous-cutanée à
la base de la queue avec 100 pg de chaque peptide à tester émulsifié dans de l'adjuvant incomplet de Freund, en présence de 140 pg d'un épitope auxiliaire T dérivé de l'antigène core de HBV (128-140, séquence TPPAYRPPNAPIL (SEQ ID
NO: 63)).
Après 11 jours, des cellules spléniques prélevées sur les souris (5x107 cellules dans 10 ml) sont stimulées in vitro avec le peptide à tester (10 }iM). Le hème jour de culture, les populations qui répondent sont testées pour déterminer une cytotoxicité spécifique. Dans certains cas, les cellules qui répondent sont restimulées in vitro à des intervalles d'une semaine avec 2x106 cellules spléniques HHD
5 irradiées (3000 rads) et 10 pM de peptide en présence de UI/ml d'IL2 recombinante.
Des cellules RMA-HHD et RMAS-HHD, sont utilisées comme cibles pour étudier la cytotoxicité. Ces cellules sont respectivement obtenues par transfection de cellules RMA
10 murines et de leurs cellules RMAS variantes déficientes en TAP avec la construction HHD comme décrit par PASCOLO et al.
[J. Exp. Med., 185, 2043, (1997)]. Elles sont infectées par des virus exprimant les différents antigènes dont sont issus les peptides à tester.

15 Les virus utilisés sont les suivants : le virus recombinant de la vaccine exprimant VIHgag VVTG1144 (vac-VIHgag) décrit par JOHNSON [J. Immunol., 147, 1512, (1991)] ;
virus recombinant de la vaccine exprimant HER-2/neu VT39 (vac-neu) (Therion Biologics) ; le virus de la vaccine vac-20 gplOO, décrit par YANG [J. Immunol., 164, 4204, (2000)] ; un virus de la vaccine de type sauvage (vac-WT) ; et le virus flu PR8 de l'influenza décrit par VIRELIZIER [J. Immunol., 115, 2, 434-439, (1975)]. Pour les infections virales, les cellules RMA-HHD sont incubées pendant 16 heures avec les virus de la vaccine (10 PFU/cellule), recombinants ou sauvage, ou avec le virus flu PR8 (50 HAU) pendant 2 heures.
Les cellules-cibles sont marquées avec 150 pCi de 51Cr pendant 90 minutes, puis lavées trois fois et étalées dans des plaques de 96 puits à fond rond (104 cellules/puits dans 100 pl de RPMI 1640 + 3% de sérum de veau foetal).
Des cellules RMA-HHD ou RMAS-HHD non infectées sont chargées avec 1 pM de peptide à tester, à 37 C pendant 90 minutes.
Ensuite, 100 pl des cellules effectrices à
différentes concentrations, sont ajoutés dans les puits et les plaques sont incubées à 37 C pendant 4 heures. Après incubation, 100 pl de surnageant sont collectés et la radioactivité est mesurée dans un compteur y.

16 PCT/FR01/02387 Le pourcentage de lyse spécifique est calculé par la formule : [(libération de 51Cr expérimentale-libération de 51Cr spontanée) / (libération de 51Cr maximale-libération de 51Cr spontanée)] x 100. Dans toutes les expériences, la libération spontanée est inférieure à 20% de la libération maximale induite par HCl 3N.
En fonction de leur capacité à fixer et à
stabiliser la molécule HLA A2.1, et de leur immunogénicité, les 34 peptides ont été classés en trois groupes différents ;
les résultats de ce classement sont représentés dans le Tableau II.

17 Tableau II
Peptides RA DC50 (heures) Répondeurs*/Souris totales Groupe I
HIV gag 76 1,0 >8 7/10 Flu M58 0,2 >8 4/6 HBV pol 575 2,5 >8 6/8 HBV pol 765 2,0 4 ND
M a rt-1 27 2, 2 2-4 4/5 gp100177 0,5 >6 3/5 gp 100 178 0,3 6-8 4/6 g p 100 154 2,3 6-8 7/9 gp 100 570 1,0 4-6 6/9 gplOO 209 1,3 4 4/6 gpl00 476 10,0 6 8/10 gp 100457 1,6 2-4 4/6 HER-2/neu 799 1,0 6-8 3/4 HER-2/neu 369 2,3 4 12/13 HER-2/neu 789 1,6 6-8 4/6 HER-2/neu 48 1,7 >8 5/6 HER-2/neu 773 1,7 6 2/3 HER-2/neu 5 2,3 >8 5/6 HER-2/neu 689 2 4 5/6 Groupe Il Tyrosinase 1 >60,0 2-4 4/23 Mart-1 32 21,1 4 0/10 HER-2/neu 851 24,0 4 1/12 HER-2/neu 661 >60,0 2-4 0/6 HER-2/neu 1023 19,6 4 5/10 Groupe III
HBV pol 28 5,3 <2 0/6 HBV pol 594 4,2 <2 0/6 HBV pol 985 43,3 <2 0/6 Tyrosinase 224 >50,0 <2 0/6 Tyrosinase 207 >50,0 2 0/6 HER-2/neu 650 1,4 <2 0/6 HER-2/neu 466 4,8 2 0/6 HER-2/neu 402 19,0 <2 0/6 HER-2/neu 391 >70,0 2 0/6 HER-2/neu 971 >70,0 2 0/6 * On considère que les souris répondent lorsqu'une cytotoxicité spécifique contre des cribles pulsés par un peptide est supérieure à 15% de la toxicité vis-à-vis des cibles non-chargées.
Le premier groupe est constitué de 19 peptides ayant une RA <_ 10 et un DC50 > 2 heures. Ils correspondent à
des épitopes d'antigènes de virus ou de tumeurs (à
l'exception de HBVpol 765 et HER-2/neu 48) et déclenchent une réponse CTL chez un pourcentage élevé (60 à 92%) des souris HHD.
Le deuxième groupe de cinq peptides avec une RA >
et un DC50 > 2 heures comprend trois épitopes connus, et 10 un épitope potentiel (HER-2/neu 661) . Deux d'entre eux sont non-immunogènes (Mart-1 32, HER-2/neu 661), tandis que HER-

18 2/neu 851 et tyrosinase 1 induisent une réponse chez un faible pourcentage de souris HHD (8% et 17%, respectivement).
Dix peptides avec un DC50 < 2 heures et une RA
variable appartiennent au troisième groupe. Ils ne correspondent pas à des épitopes connus (à l'exception de HER-2/neu 971) et ils sont non-immunogènes chez des souris HHD, même s'ils ont une RA élevée, comme HBVpol 28, HBVpol 594, HER-2/neu 650 et HER-2/neu 466.
Les conclusions suivantes peuvent être tirées de ces résultats (i) des motifs d'ancrage secondaires influencent fortement la liaison HLA A2.1 puisque des peptides ayant les résidus d'ancrage primaires FILA A2.1 optima présentent un très large spectre d'affinités, (ii) l'affinité de liaison n'est pas toujours en corrélation avec l'aptitude à stabiliser la molécule HLA A2.1. Les peptides Mart-1 32 et HER-2/neu 851 sont de faibles liants mais ils forment des complexes peptide/HLA A2.1 stables. Au contraire, les peptides HBVpol 28, HBVpol 594, HER-2/neu 650 et HER-2/neu 466 sont des liants puissants mais ils forment des complexes instables avec la molécule FILA A2.1, (iii) l'immunogénicité des peptides dépend principalement de leur capacité à stabiliser la molécule HLA A2.1. Des peptides ayant un DC50 < 2 heures ne sont jamais immunogènes même s'ils ont une forte affinité de liaison. Cependant, une stabilité de HLA A2.1 induite par un peptide n'est pas suffisante pour assurer une immunogénicité. En fait, des peptides ayant un DC50 > 2 heures peuvent être non immunogènes (Mart-1 32 et HER-2/neu 661) ou très faiblement immunogènes (Tyrosinase 1 et HER-2/neu 851) s'ils présentent une faible affinité de liaison.
Il apparaît donc qu'il est nécessaire d'améliorer à la fois l'affinité de liaison et l'aptitude à stabiliser la molécule HLA A2.1 pour que des peptides génèrent une forte réponse CTL.

19 EXEMPLE 2 : EFFET DU REMPLACEMENT DU RESIDU EN POSITION PI
PAR UNE TYROSINE SUR L'AFFINITE ET LA STABILITE DU COMPLEXE
HLA A2.1/PEPTIDE.

Des variants de 33 peptides décrits dans l'exemple 1, résultant de la substitution du 1eY acide aminé
N-terminal par une tyrosine (substitution P1Y), ont été
synthétisés. Ces variants ont été testés pour leur affinité
pour la molécule HLA A2.1 et leur capacité à stabiliser le complexe formé.
Les résultats sont illustrés par le Tableau III.
Tableau III
Peptide RA WT/RA Y1 DC50 Y1-DC50 WT
HIV gag 76 T 3,0 =0 Flu M58 T 2,4 =0 H BV pal 575 T 2,6 =0 HBV pal 765 T 40,4 t4 Mart-127 T 2 =0 gp100177 = 0,6 t2 gp100178 = 0,8 t2 gp100 154 = 0,8 L 2 gplOO 570 't 3,4 T >2 gp100209 =1,7 t2 gp100476 T4,2 t2 gp 100 457 T 2,3 T >2 HER-2/neu 369 T 3,9 T >2 HER-2/neu 799 T 3,9 T >2 HER-2/neu 789 T 2,1 =0 HER-2/neu 48 t 3,0 =0 HER-2/neu 773 1' 2,0 t2 HER-2/neu 5 = 1,1 =0 HER-2/neu 689 T 3,1 t>2 Tyrosinase 1 T >3,7 t >2 Mart-1 32 T 16,2 T 2 HER-2/neu 851 T 3,0 t2 HER-2/neu 661 T >1,5 t2 HBV poI 28 T 2,3 t>2 HBV pol 594 T 14,8 T >6 HBV pol 985 T 13,7 t>6 Tyrosinase 224 T >5,1 T >2 Tyrosinase 207 T >6,4 t>4 HER-2/neu 650 1' 6,0 t >4 HER-2/neu 466 t 3,3 T >4 HER-2/neu 402 T' 5,2 t >2 HER-2/neu 391 T 55,5 t >6 HER-2/neu 971 T 11,6 T 2 Ces résultats montrent que la substitution P1Y
augmente la liaison de tous les peptides de faible affinité, et favorise la stabilisation de HLA A2.1 pour tous les peptides stabilisants faibles (groupes II et III dans le Tableau II). L'augmentation d'affinité, mesurée par le rapport entre les RA du peptide modifié et du peptide naturel, est au minimum de 1,5 et va jusqu'à 55,5, tandis que 5 l'augmentation de la stabilisation de HLA A2.1, mesurée par la différence entre les DC50 du peptide modifié et du peptide naturel est au minimum de 2 heures et va jusqu'à 6 heures. Le RA de tous les peptides modifiés, à l'exception d'un d'entre eux (HER-2/neu 661Y1) est inférieur à 10, et leur DC50 est >
10 4 heures. Pour les peptides Tyrosinase 1 et HER-2/neu 661, la modification P1Y ne génère pas de peptides ayant une très forte affinité. Ceci est dû à la présence dans ces peptides de résidus d'ancrage secondaires P3-P8/9 défavorables pour la l .aison de HLA A2.1.
L'effet de la substitution P1Y n'est pas limité
aux peptides de faible affinité mais est aussi observé avec la majorité des peptides de forte affinité (groupe I du le Tableau II). Deux seulement des dix-neuf peptides de forte affinité n'ont amélioré ni leur affinité de liaison, ni leur

20 capacité de stabilisation (gplOO 154 et HER-2/neu 5). Il faut noter qu'une augmentation d'affinité est indépendante de la nature du résidu en position 1 du peptide natif et qu'elle est observée même si le résidu substitué n'est pas un résidu défavorable à la liaison avec HLA A2.1. Quatre seulement des 19 peptides ayant un rapport RA du peptide naturel/RA de peptide modifié supérieur à 3 ont un résidu défavorable en Pl (P pour HER-2/neu 391, HER-2/neu 650 et HBVpol 594, E pour HER-2/neu 971). L'augmentation d'affinité de ces quatre peptides est toutefois très importante : elle est comprise entre 6 et 55,5.
Cependant, l'affinité est augmentée même lorsque Y substitue un autre résidu favorable comme F (HBVpol 575 et Tyrosinase 207).
Ces résultats démontrent qu'une substitution P1Y
augmente la liaison à HLA A2.1 et la capacité de stabilisation du complexe formé pour presque tous les peptides liés à HLA A2.1. Cet effet est bien plus prononcé

21 pour les peptides non-immunogènes de faible affinité pour HLA
A2.1.

EXEMPLE 3 : RECONNAISSANCE CROISEE DES PEPTIDES NATURELS ET
DE LEURS VARIANTS PIY PAR DES CTL SPECIFIQUES.

L'augmentation de l'affinité pour HLA A2.1 est la première condition pour rendre immunogènes des peptides de faible affinité. Il est cependant également nécessaire que leur conformation dans le complexe avec HLA A2.1 ne soit pas modifiée, et que leur spécificité antigénique soit conservée.
Si tel est le cas, des CTL générés chez des souris HHD
vaccinées par le peptide natif doivent reconnaître celui-ci et son variant P1Y avec la même efficacité. De plus, les variants P1Y doivent être capables de recruter in vivo le répertoire des CTL spécifiques du peptide naturel.
La reconnaissance des variants P1Y par des CTL
spécifiques de peptide naturel a d'abord été étudiée. Des CTL
induits chez des souris HHD sensibilisées avec les peptides HIVgag 76, HBVpol 575, gpl00 154, gplOO 457, gpl00 476, gp100 570, gplOO 177 ou HER-2/neu 369 ont été testés pour leur capacité à tuer des cibles RMAS-HHD chargées avec soit les peptides naturels (WT), soit les variants P1Y correspondants (PlY).
La Figure 1 illustre les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) obtenus avec huit peptides différents.
Cellules RMAS-HHD chargées avec le peptide naturel : ^
Cellules RMAS-HHD chargées avec le peptide P1Y : A
Cellules RMAS-HHD non-chargées : =.
Ces résultats montrent que des CTL induits chez des souris HHD sensibilisées avec les peptides HIVgag 76, HBVpol 575, gpl00 154, gplOO 457, gplOO 476, gplOO 570, gplOO
177 et HER-2/neu 369 tuent avec la même efficacité les cellules RMAS-HHD chargées avec le peptide naturel ou avec son variant PlY.
Les variants P1Y sont aussi capables de recruter les CTL spécifiques du peptide naturel in vivo. Des cellules spléniques de souris HHD sensibilisées avec les variants P1Y

22 HIVgag 76Y1, HBVpol 575Y1, gplOO 154Y1, gp100 457Y1; gplOO
476Y1, gplOO 570Y1, gplOO 177Y1 et HER-2/neu 369Y1, sont testées pour leur capacité à tuer des cibles RMAS-HHD
chargées avec soit les variants P1Y (P1Y), soit avec les peptides de type sauvage (WT).
Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) sont illustrés par la Figure 2.
Cellules RMAS-HHD chargées avec le peptide naturel : ^
Cellules RMAS-HHD chargées avec le peptide P1Y : A
Cellules RMAS-HHD non-chargées : S.
Ces résultats montrent que les variants P1Y
génèrent des CTL qui tuent les cibles RMAS-HHD chargées avec le peptide variant, ou avec le peptide naturel correspondant.
En outre, tous ces peptides variants à
l'exception de gplOO 154Y1, induisent des CTL chez un pourcentage plus élevé de souris HHD que ne font les peptides naturels correspondants. Trois à huit souris HHD ont été
testées pour chaque peptide et une réponse CTL a été induite chez 100% des souris sensibilisées par HIVgag 76Y1, HBVpol 575Y1, gplOO 476Y1, gplOO 570Y1 et HER-2/neu 369Y1 et chez 75% des souris sensibilisées par gplOO 457Y1, gplOO 177Y1 et gplOO 154Y1.
De plus, les CTL induits par les variants P1Y
reconnaissent ces variants et les peptides naturels correspondants avec des avidités comparables.
Les CTL générés chez des souris sensibilisées avec les variants P1Y HER-2/neu 369Y1, HIVgag 76Y1 et gplOO
154Y1 ont été testés pour leur aptitude à tuer des cibles RMAS-HHD chargées avec différentes concentrations du peptide variant P1Y, ou du peptide sauvage correspondant.
Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) sont illustrés par la Figure 3.
Cellules RMAS-HHD chargées avec le peptide naturel : =
Cellules RMAS-HHD chargées avec le peptide P1Y : ^.
Ces résultats montrent que les CTL induits par les variants P1Y donnent une cytolyse égale à la moitié de la

23 cytolyse maximale pour des quantités similaires de variant P1Y et de peptide naturel.
Pour envisager une utilisation des variants P1Y
en immunothérapie, il est en outre nécessaire que les CTL
induits par ces variants reconnaissent des épitopes apprêtés naturellement de l'antigène dont ils sont dérivés.
Des CTL générés chez des souris sensibilisées par HIVgag 76Y1, HER-2/neu 369Y1, HER-2/neu 5Y1, gplOO 476Y1 et fluM 58Y1 sont testés pour déterminer leur aptitude à tuer des cellules RMA-HHD infectées par les virus recombinants vac-HIVgag, vac-neu, vac-gplOO ou flu PR8 et exprimant de façon endogène les antigènes viraux correspondants, ou infectées avec le virus sauvage vac-WT.
Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) sont illustrés par la Figure 4 .
Cellules RMA-HH,D infectées avec vac-WT (I) ;
Cellules RMA-HHD infectées avec vac-HIVgag (U) ;
Cellules RMA-HHD infectées avec vac-neu (A) Cellules RMA-HHD infectées avec vac-gp100 (Y) ;
Cellules RMA-HHD infectées avec flu PR8 (+).
Ces résultats montrent que des CTL spécifiques des variants P1Y reconnaissent l'épitope maturé naturellement puisqu'ils tuent des cibles infectées avec le virus correspondant mais non les cibles infectées par vac-wt.
Il apparaît donc que la substitution P1Y
satisfait aux deux critères qui sont nécessaires à
l'induction d'une réponse CTL contre un quelconque peptide de faible affinité pour HLA A2.1, quelle que soit sa séquence.
D'abord, elle augmente l'affinité de liaison et la capacité
de stabilisation des peptides liés à HLA A2.1 et en second lieu, elle n'interfère pas avec l'interaction peptide/TCR et ne modifie donc pas leur spécificité antigénique.

24 EXEMPLE 4 : RESTAURATION DE L'IMMUNOGENICITE DE PEPTIDES NON
IMMUNOGENES DE FAIBLE AFFINITE POUR HLA A2.1 PAR UNE
SUBSTITUTION P1Y.

Des souris ont été vaccinées avec les variants P1Y des peptides HER-2/neu 402, HER-2/neu 466, HER-2/neu 650, HER-2/neu 391, Tyrosinase 207, HBVpol 594, HBVpol 28 et HBVpol 985. Onze jours plus tard, leurs cellules spléniques sont restimulées in vitro avec le peptide naturel correspondant, et les CTL générés sont testés contre des cellules-cibles RMAS-HHD non-chargées ou chargées avec le peptide naturel.
Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) sont illustrés par la Figure 5 Cellules RMAS-HHD chargées avec le peptide naturel .~
Cellules RMAS-HHD non-chargées : =.
Pour chaque peptide, le nombre de souris qui -épondent est indiqué.
Ces résultats montrent que les souris HHD
sensibilisées avec des variants P1Y génèrent des CTL
spécifiques du peptide naturel. En outre, le pourcentage des souris qui fournissent une réponse est relativement élevé
il est compris entre 33 et 77%.
Ces données démontrent qu'une substitution P1Y
constitue une stratégie générale pour augmenter l'immunogénicité de peptides non-immunogènes de faible affinité pour HLA A2.1.

EXEMPLE 5 : IDENTIFICATION D'EPITOPES SOUS-DOMINANTS/
CRYPTIQUES A L'AIDE DE VARIANTS P1Y.

La possibilité d'induire une réponse CTL contre des peptides de faible affinité pour HLA A2.1 permet d'identifier des épitopes sous-dominants/cryptiques viraux ou tumoraux, utiles pour une immunothérapie spécifique.
Cette possibilité est illustrée ci-après par l'exemple de 3 antigènes différents : l'antigène tumoral HER-2/neu, le virus HIV-1 et la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT).

Epitopes HER-2/neu Le peptide HER-2/neu 650 ne participe pas à la réponse CTL spécifique de HER-2/neu développée chez des patients portant une tumeur HER-2/neu+. 2 hypothèses sont 5 possibles : ou bien il s'agit d'un épitope qui n'est pas naturellement maturé par des cellules tumorales exprimant HER-2/neu, ou bien il s'agit d'un épitope sous-dominant/cryptique.
Comme décrit à l'Exemple 1 ci-dessus, le peptide 10 HER-2/neu 650 forme des complexes HLA A2.1/peptide instables et n'est donc pas immunogène.
1) Pour étudier si le peptide HER-2/neu 650 correspond à un épitope sous-dominant/cryptique, les CTL
nérés chez des souris sensibilisées par le variant HER-i5 2/neu 650Y1 sont testés pour leur capacité à tuer des cellules RMA-HHD infectées par vac-neu.
Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) sont illustrés par la Figure 6 :
20 Cellules RMA-HHD infectées avec vac-WT (=) ;
Cellules RMA-HHD infectées avec vac-neu (A) Ces résultats montrent que des CTL spécifiques de HER-2/neu 650 tuent des cellules cibles infectées par vac-neu, mais non des cibles infectées par vac-WT, ce qui

25 démontre que le peptide HER-2/neu 650 est un épitope sous-dominant/cryptique de HER-2/neu.
Les variants P1Y des peptides HER-2/neu 466, HER-2/neu 402, HER-2/neu 661 et HER-2/neu 391 ont été testés de la même manière ; à l'exception du variant P1Y de HER-2/neu 661, les résultats sont similaires à ceux observés pour HER-2/neu 650.
Les peptides HER-2/neu 466, HER-2/neu 402 et HER-2/neu 391 constituent donc également des épitopes sous-dominant/cryptiques de HER-2/neu.
En ce qui concerne HER-2/neu 661, les résultats obtenus confirment ceux relatifs à la faible augmentation de l'affinité décrits à l'exemple 2 ci-dessus. Des modifications

26 supplémentaires devront être effectuées pour envisager l'utilisation de ce peptide en immunothérapie.
2) L'immunogénicité des variants HER-2/neu 466Y1, HER-2/neu 402Y1, HER-2/neu 650Y1, et HER-2/neu 391Y1 conformes à l'invention, par rapport à un peptide immunodominant a également été évaluée sur des cellules humaines, et comparée à celle du peptide immunodominant HER-2/neu 369.
Des cellules mononucléées du sang périphérique (PMBC) ont été obtenues à partir de donneurs sains HLA A2.1, et resuspendues dans 2 ml de milieu de culture RPMI 1640 supplémenté avec 10 nM de glutamine, 250 unités/ml de pénicilline-streptomycine, et, 10% de sérum humain AB
inactivé par la chaleur, et incubés à 37 C pendant 2 heures.
Les cellules non-adhérentes sont collectées, et les cellules adhérentes restantes sont chargées avec le peptide à tester (5 M) à 37 C pendant 90 minutes, et irradiées à 3000 rads ;
elles sont ensuite lavées pour éliminer le peptide libre.
3x106 cellules non-adhérentes sont ajoutées à un volume final de 2 ml de milieu de culture supplémenté avec 50 UI/ml d'IL-2 recombinante. Au septième jour, elles sont récoltées, lavées, et suspendues dans du milieu de culture, et restimulées avec 5x106 cellules autologues adhérentes préalablement chargées avec le peptide à tester comme décrit ci-dessus. Le lendemain, 150 UI/ml d'IL-2 recombinante sont ajoutées. Le neuvième ou le dixième jour, les cultures sont complémentées avec 300 UI/ml d'IL-2 recombinante. Lorsque nécessaire, le milieu est changé en prélevant 1 ml de surnageant de culture et en le remplaçant par 1 ml de milieu de culture contenant 300 UI/ml d'IL-2 recombinante. Cette procédure est répétée au moins 3 fois à intervalles d'une semaine.
Des cellules T2 chargées avec le peptide natif (1 ELM de peptide, 37 C , 90 minutes) correspondant au peptide P1Y à tester sont utilisées comme cibles pour étudier la cytotoxicité.

27 Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles) pour chacun des peptides testés sont illustrés par la Figure 7 :
Cellules T2 chargées avec le peptide naturel : ^
Cellules T2 non-chargées : =.
Ces résultats montrent que la substitution P1Y
augmente également l'immunogénicité vis-à-vis de cellules humaines.
3) Pour vérifier si les peptides P1Y induisaient des CTL humains spécifiques d'épitopes tumoraux naturellement ~ ?prêtés, des CTL générés, comme décrit ci-dessus, à partir PBMC humains, provenant de 3 donneurs différents, stimulés par HER-2/neu 369, ou par les peptides HER-2/neu 466 Yl, HER-2/neu 402, HER-2/neu 650 Y1,et HER-2/neu 391 Y1 ont également été testés pour leur capacité à tuer des cellules de tumeurs humaines HLA A2.1+, exprimant en quantité plus ou moins importante l'épitope HER-2/neu.
Les cellules tumorales utilisées comme cellules-cibles sont les suivantes - 4 lignées cellulaires HLA A2.1+/ HER-2/neu+
MC F-7 [ZAKS, Cancer Res., 58, 4902, (1998)] ; PUB/N (lignée tumorale humaine de cancer du poumon pas à petites cellules ) ; HCT-116 [BROSSART, Cancer Res., 58, 732, (1998)] ; LAW (lignée tumorale humaine de cancer rénal) ;
- 2 lignées cellulaires HLA A2.1+/ HER-2/neu-ZR75.1 [OSBORNE et al., Cancer Res., 39, 2422-2428, (1979)] ;
SUP/M2 [MORGAN et al., Blood, 73, 8, 2155-2164, (1989)] ;
- à titre de témoin, la lignée K562, sensible à
la lyse par les cellules NK.
L'expression de l'antigène tumoral HER-2/neu par ces cellules, évaluée par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-HER-2/neu, est illustrée par le Tableau IV ci-après.

28 Tableau IV
Lignée cellulaire HER-2/neu (FI) ZR75.1 0,12 SUP/M2 0,11 MCF-7 1,94 HCT-116 1,23 PUB/N 1,33 LAW 0,35 Les résultats de ces essais de cytotoxicité (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles ; rapports E/T : 40/1 ; 20/1) pour chacun des peptides testés sont illustrés par la Figure 8 Cellules ZR75.1 : =
Cellules SUP/M2 : =
Cellules MCF-7 : ^
Cellules HCT-116 : Y
Cellules PUB/N A
Cellules LAW : =.
Aucune cytotoxicité vis-à-vis des cellules K562 n'est observée.
Ces résultats montrent que les CTL obtenus à
~,artir des PMBC de 3 donneurs différents, stimulés par les peptides variants P1Y, lysent les cellules HER-2/neu+ MCF-7, PUB/N, HCT-116, et LAW, mais pas les cellules HER-2/neu-ZR75.1 et SUP/M2.
Il est à noter que la lyse est aussi efficace dans le cas des cellules LAW, qui n'expriment que faiblement l'antigène HER-2/neu que dans celui des cellules MCF-7, PUB/N, et HCT-116, qui l'expriment à un niveau élevé. Ceci montre que la présentation des épitopes de faible affinité ne nécessite pas l'expression de l'antigène à un niveau élevé.
Epitopes de HIV 1 :

La substitution P1Y a été utilisée pour identifier de nouveaux épitopes sous-dominants/cryptiques de HIV 1.
17 peptides de Gag, Pol, Env et Nef de HIV, ont été choisis à partir de la séquence polypeptidique complète de HIV 1. La liste de ces peptides est représentée dans le Tableau V ci-après.

29 Tableau V
Protéine d'origine* Peptides Fréquence parmi les isolats de HIV 1 /o GAG p17 (77-85) SLYNTVATL (SEQ ID NO: 39) (S9L) 39.6 p24 (19-27) TLNAWVKVV (SEQ ID NO: 41) (T9V) 62.5 p24 212-221 EMMTACQGV (SEQ ID NO: 8) (E9V) 95.8 POL (79-88) LLDTGADDTV (SEQ ID NO: 9) (L10V) 96.8 (188-196) ALVEICTEM (SEQ ID NO: 42) (A9M) 46.2 (263-273) VLDVGDAYFSV (SEQ ID NO: 43) (VI 1V) 84.9 (334-342) VIYQYMDDL (SEQ ID NO: 44) (V9L) 84.9 (464-472) ILKEPVHGV (SEQ ID NO: 45) (19V) 68.8 (576-584) PLVKLWYQL (SEQ ID NO: 46) (P9L) 87.1 (669-679 ESELVNQIIEQ (SEQ ID NO: 47) (E11Q) 33.3 (671-680) ELVNQIIEQL (SEQ ID NO: 48) (E10L) 33.3 956-964 LLWKGEGAV (SEQ ID NO: 49) (L9V) 98.9 ENV gp120 (120-128) KLTPLCVSL (SEQ ID NO: 50) (K9L) 8.9 gp120 (120-128) KLTPLCVTL (SEQ ID NO: 51) (K9L/T) 79.4 41 (260-268) RLRDLLLIV (SEQ ID NO: 52) (R9V) 0.3 NEF (134-143) PLTFGWCFKL (SEQ ID NO: 53) (P1 0L) 0.1 188-196 AFHHVAREL (SEQ ID NO: 54) (A9L) * La numérotation des acides aminés est basée sur la séquence du clone HIV 1 WEAU 1.60 uméro d'accès Genbank U21135). Cette référence est simplement donnée pour indiquer la calisation des peptides de ce tableau par rapport aux protéines virales ; la séquence de ces peptides n'est pas toujours totalement identique à celle des peptides correspondants du clone WEAU.
*'*La fréquence a été calculée à partir des isolats disponibles sur la base de données HIV
Molecular Immunology Database .
L'affinité relative de ces peptides pour HLA A2.1 (peptide de référence 19V), et la stabilité du complexe peptide/ HLA A2.1 ont été déterminées comme décrit dans l'exemple 1 ci-dessus, pour le peptide natif, et pour son variant résultant de la substitution de l'acide aminé N-terminal par une tyrosine.
Les résultats sont illustrés dans le Tableau VI
ci-dessous Tableau VI
Peptides natifs Peptides P1Y
Peptides épitopiques CD8 RA DC RA DC
GAG S9L 2,2 >6h 5 >6h T9V 5,5 3,5h 5,5 >6h E9V 21 <2h 1,7 >6h POL L10V 10 <2h 1,5 4h A9M 5 2h 1,75 >6h V11V 4,5 2h 2,5 3,5h V9L >100 ND 8,6 <2h 19V 1 5h ND ND
P9L >100 ND 4,6 <2h E11 Q >100 ND >100 ND
E10L >100 ND 10 <2h L9V 3,1 >6h 1,3 >6h ENV K9L 1,35 >6h 0,7 >6h K9L/T 0,65 >6h 0,4 >6h R9V >100 ND 5 ND
NEF P10L >100 ND 5 ND
A9L >100 ND 7 >6h Les deux peptides gagp24-212 (E9V) et po179 (LlOV) ont une affinité et une capacité de stabilisation faibles (RA > 5 et DC50 < 2 heures) ; en revanche leur 5 variants P1Y ont une affinité et une capacité de stabilisation fortes (RA < 5 et DC50 > 2 heures).
L'immunogénicité des peptides E9V et L10V et de leurs variants P1Y a également été testée. Les peptides natifs ne sont pas immunogènes ; en revanche leurs variants sont 10 immunogènes aussi bien chez les souris HHD que chez l'homme.
En outre, des CTL générés, à partir de PBMC
humains, provenant de 6 donneurs différents, stimulés in vitro par des cellules autologues chargées avec le peptide variant E9VY, ou le peptide variant L10VY, ou par le peptide 15 natif immunodominant S9L ont également été testés pour leur capacité à tuer des cellules RMA-HHH (cellules RMA exprimant la molécule HLA A2.1 native) infectées par un virus de la vaccine recombinant exprimant soit la protéine gag, soit la protéine pol de HIV1 (isolat LAI), ou par un virus de la 20 vaccine contrôle, de type sauvage.
Les résultats sont illustrés par la Figure 9 (en abscisse le % de lyse spécifique ; en ordonnée le rapport cellules effectrices/cellules cibles). Ces résultats montrent que les peptides E9V et L 10V sont naturellement présentés par des cellules qui expriment HLA-A2.1 et la protéine virale dont ils sont issus (gag pour E9V et pol pour L10V).

Epitopes de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT) :

La substitution P1Y a été utilisée pour déterminer si la sous-unité catalytique de la télomérâse (hTERT) possédait des épitopes capable d'induire une réponse T cytotoxique.
8 peptides ont été choisis à partir de la séquence polypeptidique de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT).
L'affinité relative de ces peptides pour HLA
A2.1, et la stabilité du complexe peptide/HLA A2.1.ont été
déterminées comme décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus (peptide de référence : HIVpol 589).
Les résultats sont illustrés dans le Tableau VII
ci-dessous Tableau VII
peptides natifs Séquences RA DC50 mp 530 ILATFLAWL (SEQ ID NO: 55) 0,8 >6 mp 534 FLFWLMDTYV (SEQ ID NO: 56) 0,2 >6 mp 545 QLLRSFFHFL (SEQ ID NO: 57) 1,8 >6 mp 797 SLFDFFHFL (SEQ ID NO: 58) 1,5 >6 m p876 FLSTLVHGV (SEQ ID NO: 59) 1,2 >6 mh 540 ILAKFLHWL (SEQ ID NO: 60) 0,3 >6 mh 572 RLFFYRKSV (SEQ ID NO: 10) 25,3 <2 mhp 988 DLQVNSLQTV SEQ ID NO: 11) 28,6 <2 Les deux peptides mhp 572 et mhp 988 ont une affinité-et une capacité de stabilisation faibles (RA > 5 et DC50 < 2heures) . Ces 2 peptides sont en outre communs à la sous-unité catalytique de la télomérase humaine (hTERT) et à
la sous-unité catalytique de la télomérase murine (mTERT).
Les variants P1Y de ces 2 peptides, résultant de la substitution de l'acide aminé N-terminal par une tyrosine, ont été préparés, et leur affinité relative pour HLA A2.1, et la stabilité du complexe peptide/HLA A2.1 ont été
déterminées.
Les résultats, illustrés dans le Tableau VIII ci-dessous, montrent que ces variants mhp 572Y1 et mhp 988Y1 ont une affinité et une capacité de stabilisation fortes (RA < 5 et DC50 > 2 heures).

Tableau VIII
peptides modifiés Séquences RA DC50 mhp 572Y1 YLFFYRKSV (SEQ ID NO: 61) 2,2 5 m ph 988Y1 YLQVNSLQTV SEQ ID NO: 62) 2,1 >6 Des CTL générés à partir de PBMC humains, provenant de donneurs sains, stimulés in vitro par des cellules dendritiques autologues chargées avec le peptide variant mhp 572Y1, ou le peptide variant mhp 988Y1 ont été
testés pour leur capacité à tuer des cellules tumorales humaines HLA A2.1+/hTERT+ U266 [VONDERHEIDE, Immunity, 10, 11, (1999)], ou HSS HLA A2.1-/hTERT+ : [VONDERHEIDE, Immunity, 10, 11, (1999) ] .
Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices/cellules cibles ; rapports E/T : 40/1 ;
20/1 ;' 10/1) sont illustrés par la Figure 10 : on n'observe aucune lyse pour les cellules tumorales HSS qui n'expriment pas HLA A2.1 ; en revanche, on observe une lyse importante dans le cas des cellules tumorales U266 qui expriment à la fois la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT) et HLA A2.1.
Ces résultats montrent que les peptides mhp 572 et mhp 988 sont naturellement présentés par les cellules tumorales humaines, et que des dérivés immunogènes de ces peptides sont potentiellement utilisables en immunothérapie anti-tumorale.
EXEMPLE 6 : ACTIVITE ANTI-TUMORALE DES VARIANTS P1Y
I. dérivés de l'épitope de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT).
Des variants P1Y (mhp 572Y1 et mhp 988Yl), obtenus tel que décrit à l'exemple 2, sont testés pour leur capacité à induire in vivo une réponse anti-tumorale protectrice avec des peptides immunodominants (mp 797 et mp 545).
Dix souris HHD générées tel que décrit à
l'exemple 1 sont vaccinées, à raison de deux injections à
deux semaines d'intervalle, avec ces différents peptides synthétisés par Synt:em (Nîmes, France).
Sept jours après la dernière injection, les souris vaccinées avec les peptides mhp 572Y1, mhp 988Y1, mp 797 et mp 545 sont greffées avec des cellules tumorales EL-4/HHD [PASCOLO et al., J. Exp. Med., 185, 2043-2051 (1997)].
L'efficacité de la protection anti-tumorale est évaluée en mesurant la taille des tumeurs 28 jours après leur implantation (Figures 11A1 et 11A2 : taille des tumeurs en fonction des peptides utilisés pour la vaccination) et par la survie des souris greffées (Figure 11B : % de survie en fonction du nombre de jours après l'implantation des cellules tumorales).
Les résultats sont illustrés aux Figures 11A1, 11A2 et 11B : on observe qu'à J28, les tumeurs mesurent 490 144 mm2 et 653 148 mm2 respectivement chez les souris non traitées (contrôle) et traitées avec le peptide mp 797, 421 170 mm2 et 489 209 mm2 respectivement chez les souris non traitées (contrôle) et traitées avec le peptide mp 545, mais que dans le lot de souris vaccinées avec les peptides mhp 572Y1 et mhp 988Y1, les tumeurs mesurent respectivement 232 244 mm2 et 190 207 mm2 (Figure 11A1) ou 213 160 mm2 (Figure 11A2), et que 4 souris vaccinées avec mhp 572Y1 et mhp 988Y1 respectivement ne présentent pas de tumeurs à J28.
Toutes les souris non vaccinées meurent à J50 (Figure 11B : 0) .
Pour les souris vaccinées avec les peptides mp 797 et mp 545 (Figure 11B : Y et =), on observe une mortalité à partir de J40 et la dernière souris meurt à J50.
La mortalité est significativement réduite dans le lot de souris vaccinées avec mhp 572Y1 et mhp 988Y1 (Figure 11B : à et ^). Elle apparaît à J40 et 4 souris (40%) sont encore en vie à J80 (Figure 11B : A, ^).
II. dérivés de l'épitope HER-2/neu.
Des variants P1Y (HER-2/neu 650Y1, HER-2/neu 402Y1), obtenus tel que décrit à l'exemple 2, sont testés pour leur capacité à induire in vivo une réponse anti-tumorale protectrice avec des peptides immunodominants (HER-2/neu 369, HER-2/neu 48).
Dix souris HHD générées tel que décrit à
l'exemple 1 sont vaccinées, à raison de deux injections à

deux semaines d'intervalle, avec ces différents peptides synthétisés par Synt:em (Nîmes, France).
Des cellules HER-2/HHD/neu sont obtenues en transfectant les cellules tumorales EL-4/HHD avec l'ADNc codant pour la molécule HER-2/neu Sept jours après la dernière injection, les souris vaccinées avec les peptides HER-2/neu 650Y1, HER-2/neu 402Y1, HER-2/neu 369 et HER-2/neu 48 sont greffées avec des cellules tumorales EL-4/HHD/neu.
L'efficacité de la protection anti-tumorale est évaluée en mesurant la taille des tumeurs 28 jours après leur implantation (Figure 12A : taille des tumeurs en fonction des peptides utilisés pour la vaccination) et par la survie des :ris greffées (Figure 12B : pourcentage de survie en fonction du nombre de jours après implantation des cellules tumorales).
Les résultats montrent qu'à J28 les tumeurs mesurent 560 93 mm2, 474 234 mm 2 et 564 174 mm 2 respectivement chez les souris non traitées (contrôle) -et traitées avec les peptides HER-2/neu 369 et HER-2/neu 48, mais que dans le lot de souris vaccinées avec les peptides HER-2/neu 402Y1 et HER-2/neu 650Y1, les tumeurs mesurent 323 116 mm2 et. 100 99 mm2, respectivement, et que 4 souris vaccinées avec HER-2/neu 650Y1 ne présentent pas de tumeurs à
J28.
Toutes les souris non vaccinées meurent à J40 (Figure 12B : 0) .
Pour les souris vaccinées avec les peptides HER-2/neu 369 et HER-2/neu 48 (Figure 12B : Y et =), la mortalité n'apparaît qu'à J32 et la dernière souris meurt à
J52.
La mortalité est significativement réduite dans le lot de souris vaccinées avec HER-2/neu 402Y1 et HER-2/neu 650Y1 (Figure 12B : ^ et A). Elle n'est observée qu'à
partir de J46 et 3 souris (30%) sont encore en vie à J70 (Figure 12B : A).
L'ensemble de ces résultats démontre que seules les formes substituées en Pl avec une tyrosine de peptides sous-dominants/cryptiques (HER-2/neu 650Y1, HER-2/neu 402Y1, mhp 572Y1 et mhp 988Y1) sont capables de générer in vivo une réponse anti-tumorale efficace. Il semble donc intéressant d'utiliser en immunothérapie anti-tumorale des peptides sous-5 dominants/cryptiques sous leur forme substituée en P1 avec une tyrosine.
EXEMPLE. 7 : ACTIVITE ANTI-TUMORALE INDUITE PAR DES VACCINS
ADN CODANT POUR DE MULTIPLES EPITOPES DOMINANTS ET SOUS-DOMINANTS/CRYPTIQUES DERIVES DE HER-2/neu.
10 Afin de palier les échecs relatifs des essais .:;ues menés à ce jour exclusivement au moyen de peptides tumoraux, une nouvelle approche en immunothérapie antitumorale consiste à induire des réponses multispécifiques par une immunisation génétique avec une construction 15 polyépitopique composée de huit épitopes dominants et quatre sous-dominants/cryptiques dérivés de HER-2/neu et restreints au HLA A2.1.
Sélection des épitopes.
Les huit épitopes dominants (HER-2/neu 799, HER-20 2/neu 369, HER-2/neu 789, HER-2/neu 689, HER-2/neu 773, HER-2/neu 5, HER-2/neu 48 et HER-2/neu 1023) présentent une grande affinité pour HLA A2.1 (RA < 5 et DC50 > 4 heures), sauf HER-2/neu 1023 qui est considéré comme ayant une affinité de liaison intermédiaire (RA > 5, DC50 > 4 heures) 25 (cf. tableau II, Exemple 1).
Les quatre épitopes sous-dominants/cryptiques (HER-2/neu 466, HER-2/neu 402, HER-2/neu 391 et HER-2/neu 650) (cf. tableau II, Exemple 1) présentent une très faible affinité de liaison et sont non-immunogènes chez les souris

30 HHD ou chez l'homme, alors que les variants P1Y (HER-2/neu 466Y, HER-2/neu 402Y1, HER-2/neu 391Y et HER-2/neu 650Y1), obtenus tel que décrit à l'exemple 2, présentent une grande affinité pour HLA A2.1 (RA < 4 et DC50 > 4 heures) . Ces variants P1Y sont représentés dans le tableau IX ci-après :

Tableau IX
variants P1Y séquence RA DC50 (heures) HER-2/neu 466Y1 YLIHHNTHL (SEQ ID NO: 66) 1,4 6 HER-2/neu 402Y1 YLEEITGYL (SEQ ID NO: 67) 3,7 4 HER-2/neu 391Y1 YLQPEQLQV (SEQ ID NO: 68) 1,3 8 HER-2/neu 650Y1 YLTSIISAV (SEQ ID NO: 69) 0,2 6 L'immunogénicité des variants P1Y et des épitopes immunodominants est testée selon le protocole décrit à
l'exemple 1 :
Des souris sont vaccinées en sous-cutané avec chacun des douze peptides mentionnés ci-dessus en présence de l'épitope Th Iab dérivé de l'antigène core de HBV. Onze jours plus tard, leurs cellules spléniques sont restimulées in vitro avec le peptide à tester (1 g) pendant six jours, et les CTL générés sont testés contre des cellules cibles 'S-HHD chargées avec les peptides d'immunisation ou un peptide contrôle.
Les résultats (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices / cellules cibles) sont illustrés à la Figure 13 :
Cellules RMAS-HHD chargées avec le peptide d'immunisation : ^
Cellules RMAS-HHD chargées avec un peptide contrôle : =.
Comme attendu tous ces épitopes provoquent une réponse CTL, et celles provoquées par les variants P1Y sont spécifiques pour les peptides naturels correspondants.
Sélection d'une construction polyépitopique.
La construction polyépitopique (pet-neu) comprend une suite continue des 12 épitopes précités, à savoir :
- les huit épitopes dominants (HER-2/neu 799, HER-2/neu 369, HER-2/neu 789, HER-2/neu 689, HER-2/neu 773 HER-2/neu 5, HER-2/neu 48 et HER-2/neu 1023) décrits comme étant des cibles des lymphocytes infiltrant les tumeurs (LIT) dans les cancers du poumon, de l'ovaire, de l'estomac et du RCC, et - les quatre variants P1Y sous-dominants/cryptiques (HER-2/neu 466Y, HER-2/neu 402Y1, HER-2/neu 391Y et HER-2/neu 650Y1) obtenus tel que décrit, à
l'exemple 2.

L'utilisation de la construction polyépitopique ci-dessus a été optimisée pour l'expression chez l'homme et tout codon d'initiation potentiel a été conservé aussi près que possible du site d'initiation, en particulier si des séquences Kosack sont incorporées. Une étiquette SV5-pk est ajoutée à l'extrémité 3' de la construction afin de permettre la vérification de l'expression de pet-neu dans les cellules COS transfectées (expression de l'anticorps anti-PK de 14 acides aminés).
Un plasmide de 3,0 kb, Vaxl (Invitrogen) est sélectionné, dans lequel les séquences non nécessaires à la réplication dans E. coli ou pour l'expression de la protéine recombinante dans les cellules de mammifère ont été retirées r~,our limiter les séquences d'ADN homologues au génome humain, et ce afin de minimiser la possibilité d'intégration chromosomique. Ce plasmide comporte le gène de résistance à
la kanamycine, plutôt qu'à l'ampicilline, dans la mesure où
les aminoglycosides sont moins susceptibles de provoquer une réponse allergique chez l'homme. L'expression est dirigée par les séquences promoteurs-activatrices du cytomégalovirus humain (CMV). Une terminaison de la transcription et une polyadénylation de l'ARNm efficaces sont obtenues en utilisant le signal de polyadénylation de l'hormone de croissance bovine.
L'ADN de pet-neu est synthétisé et cloné dans le vecteur pVaxl (Vaxl/pet-neu).
La construction polyépitopique telle que décrite ci-dessus présente les propriétés suivantes :
a) elle permet l'apprêtage de chaque épitope à son extrémité
C-terminale,.et b) elle ne crée pas de nouveaux peptides de jonction avec une affinité élevée pour la molécule HLA A2.1.
L'apprêtage à l'extrémité C-terminale est évaluée par deux modèles de prédiction de clivage du protéasome ( netChopl.0, www.cbs.dtu.dk/services/NetChopPAPROC, www.uni-tuebingen.de/
uni: bcm/kuttler/links /html). Une prédiction de clivage par deux modèles est nécessaire pour considérer qu'un épitope est apprêté. L'affinité des nouveaux peptides de jonction est évaluée comme précisé à l'exemple 1 par le modèle de prédiction BIMAS [PARKER et al., J. Immunol., 152, 163, (1994)]. Parmi les différents arrangements évalués, l'arrangement de la Figure 14, correspondant à SEQ ID NO: 70, a été choisi car il répond mieux aux deux propriétés précisées ci-dessus. Les épitopes HER-2/neu 773, HER-2/neu 1023, HER-2/neu 5, HER-2/neu 466Y, HER-2/neu 391Y, HER-2/neu 650Y1 sont prédits comme étant apprêtés et seulement cinq nouveaux peptides de jonction avec une affinité élevée pour la molécule HLA A2.1 pourraient être générés (p679, p949, p179r p9110, p6310) ; ces peptides sont définis par leur position dans la séquence pet-neu (positions : 67, 94, 17, 91 et 63) et leur longueur (9 ou 10 acides aminés).
I. Immunogénicité de Vaxl/pet-neu chez des souris transgéniques HHD.
A. Capacité de Vaxl/pet-neu d'induire in vivo des CTL spécifiques.
L'immunogénicité de Vaxl/pet-neu est testée tel que décrit à l'exemple 1 :
Des souris HHD, générées tel que décrit à
l'exemple 1, sont immunisées en intramusculaire à raison de deux injections à 15 jours d'intervalle avec Vaxl/pet-neu (150 g). Une semaine après la dernière immunisation, leurs cellules spléniques sont restimulées in vitro avec des cellules B activées par le LPS et chargées avec chacun des douze peptides.
La cytotoxicité est évaluée à l'aide de cellules RMAS-HHD (cellules cibles) chargées avec le peptide correspondant à celui avec lequel les cellules B ont été
chargées ou avec un peptide contrôle.
Les résultats provenant d'une souris HHD
immunisée prise au hasard sont présentés à la Figure 14 (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices / cellules cibles).
Cellules RMAS-HHD chargées avec le peptide utilisé pour les cellules B : ^
Cellules RMAS-HHD chargées avec un peptide contrôle : =.

Les CTL tuent les cellules RMAS-HHD chargées avec chacun des douze peptides, bien que pour des CTL spécifiques de certains peptides, une lyse des cellules cibles RMAS-HHD
chargées avec un peptide contrôle est observée (lyse non spécifique).
Les lyses spécifiques les plus importantes (30%
au-dessus du bruit de fond) sont obtenues avec HER-2/neu 773, HER-2/neu 799, HER-2/neu 369, HER-2/neu 689, HER-2/neu 402Y1 et HER-2/neu 391Y.
B. Capacité des CTL à reconnaître HER-2/neu endogène.
Les CTL induits chez des souris HHD vaccinées avec Vaxl/pet-neu, sont testés pour leur capacité à
reconnaître spécifiquement HER-2/neu endogène.
Les résultats sont présentés à la Figure 15 (% de lyse en fonction du rapport cellules effectrices (E) /
cellules cibles (T)).
Les CTL sont induits comme décrit en A ci-dessus et sont testés contre les cellules cibles EL-4/HHD (=) référencées à l'exemple 6 et les cellules cibles EL-4/HHD/neu (B) obtenues en transfectant les cellules EL-4/HHD avec l'ADNc codant pour HER-2/neu.
Les CTL spécifiques des douze peptides de pet-neu reconnaissent et tuent les cibles EL-4/HHD/neu exprimant HER-2/neu mais pas les cibles EL-4/HHD utilisées comme contrôle négatif.
Pour les trois souris testées, une lyse spécifique plus importante (> 20% au-dessus du bruit de fond) est obtenue pour HER-2/neu 1023, HER-2/neu 789, HER-2/neu 48, HER-2/neu 689, HER-2/neu 466Y, HER-2/neu 402Y1 et HER-2/neu 391Y.
C. Facteur en cause dans l'induction des CTL.
L'induction des CTL nécessite soit la sensibilisation avec Vaxl/pet-neu ou bien résulte de la répétition des stimulations in vitro des cellules spléniques naïves.
L'immunogénicité de Vaxl/pet-neu est testée tel que décrit à l'exemple 1 Six souris sont immunisées avec soit la construction Vaxl/pet-neu soit le vecteur Vaxl. Leurs cellules spléniques sont stimulées in vitro de façon répétitive avec les cellules B activées par le LPS et 5 chargées avec chaque peptide à tester (cellules effectrices).
Les cellules cibles utilisées pour étudier la spécificité des CTL vis-à-vis de HER-2/neu sont des cellules RMAS-HHD et les cellules EL-4/HHD/neu obtenues tel que décrit à l'exemple 6.
10 La cytotoxicité est testée après la troisième stimulation in vitro. Les cellules RMAS-HHD, chargées avec le peptide correspondant à celui avec lequel les cellules B ont été chargées ou avec un peptide contrôle, et les cellules EL-4/HHD/neu sont utilisées comme cellules cibles.
Les résultats sont présentés à la Figure 16 [% de lyse spécifique (la lyse des cellules cibles chargées avec un peptide contrôle est déduite) après une immunisation avec Vax1 (D) ou Vaxl/pet-neu (3) ].
Les cellules spléniques sensibilisées avec 20 Vaxl/pet-neu conduisent à des CTL spécifiques pour les douze peptides. De façon surprenante, les CTL contre la majorité
des peptides, sauf HER-2/neu 369 et HER-2/neu 789, sont générés à partir des cellules spléniques sensibilisées avec le vecteur Vaxl. Pour quelques peptides (HER-2/neu 1023, HER-25 2/neu 48, HER-2/neu 799, HER-2/neu 773, HER-2/neu 391Y), la cytotoxicité des CTL induits à partir des cellules spléniques sensibilisées avec Vax1 est presque aussi élevée que la cytotoxicité des CTL induits à partir des cellules spléniques sensibilisées avec Vaxl/pet-neu (Figure 16A) . Cela démontre 30 que les stimulations in vitro répétitives sont suffisantes pour déclencher l'induction de' CTL.
Cependant, ces CTL bien qu'ils éliminent des cibles chargées avec les peptides sont incapables de reconnaître et d'éliminer des cellules cibles exprimant HER-35 2/neu endogène (EL-4/HHD/neu) contrairement aux CTL induits à
partir des cellules spléniques sensibilisées avec Vaxl/pet-neu (Figure 16B).

L'ensemble de ces résultats démontre que les CTL
spécifiques de HER-2/neu capables d'éliminer efficacement les cellules tumorales exprimant l'antigène sont générés par une vaccination Vaxl/pet-neu.
II. La vaccination Vaxl/pet-neu induit in vivo une immunité
anti-tumorale.
Les résultats obtenus in vitro ont conduit à
rechercher si la vaccination Vaxl/pet-neu induit in vivo une immunité anti-tumorale protectrice.
A. Effet sur la croissance des tumeurs et spécificité de la protection anti-tumorale.
Un sous-clone des cellules EL-4/HHD/neu, générées tel que décrit à l'exemple 6, extrêmement tumorigénique est obtenu après trois sélections in vivo dans les souris HHD. Il exprime HHD et HER-2/neu au même niveau que les cellules parentales.
Des souris HHD, générées tel que décrit à
l'exemple 1, sont immunisées à raison de 2 injections à deux semaines d'intervalle avec la construction Vaxl/pet-neu (Figures 17A et 17C) ou avec le vecteur Vaxl vide (Figure 17B) ou ne sont pas immunisées (Figure 17D).
Une semaine après la dernière immunisation, les souris ci-dessus sont greffées avec 2x104 cellules EL-4/HHD/neu (Figures 17A, 17B et 17D) ou avec des cellules EL-4/HHD/Tel-Aml, obtenues en transfectant les cellules EL-4/HHD
avec l'ADNc codant pour la protéine recombinante Tel-Aml, pour tester in vivo la spécificité de l'immunité protectrice anti-tumorale.
La croissance des tumeurs est évaluée tous les 5 à 7 jours jusqu'à J28 lorsque toutes les souris non vaccinées sont mortes et que les souris des groupes restants sont suivies pour leur mortalité.
Les résultats sont présentés dans la Figure 17 (taille des tumeurs en fonction du nombre de jours après l'implantation des cellules tumorales).
Toutes les souris contrôle non vaccinées (Figure 17D) ou vaccinées avec Vax1 (Figure 17B) développent des tumeurs qui apparaissent à J17 et grossissent très rapidement. A J28 les tumeurs mesurent 772 268 mm2 et 404 121 mm2 chez les souris contrôle et traitées avec Vax1 respectivement (p=0,04).
Au contraire, dans le lot de souris vaccinées avec Vaxl/pet-neu (Figure 17A), 2 souris sur 9 ne présentent pas de tumeurs à J28, sinon les tumeurs apparaissent à J23 et grossissent lentement. La taille des tumeurs est 116 66 mm2 (p=0,0001 par comparaison avec soit les souris non traitées ou les souris traitées avec Vaxl).
Cette immunité protectrice anti-tumorale in vivo est spécifique de HER-2/neu du fait que les souris vaccinées avec Vaxl/pet-neu ne sont pas protégées contre la tumeur EL-44/HHD/Tel-Aml (Figure 17C). En effet, toutes les souris développent des tumeurs et leur taille à J28 est 578 231 mm2.
B. Effet sur la survie des souris et spécificité
de la protection anti-tumorale.
L'effet de la protection anti-tumorale induite par la vaccination Vaxl/pet-neu est confirmé en examinant la survie de souris portant des tumeurs.
Des souris HHD sont vaccinées et greffées tel que décrit en A. Leur mortalité est suivie jusqu'à J55.
Les résultats sont présentés dans la Figure 18 (%
de survie en fonction du nombre de jours après l'implantation des cellules tumorales) Toutes les souris non vaccinées meurent à J32 (Y).
Pour les souris vaccinées avec Vaxl (e), la mortalité commence à J32 et la dernière souris meurt à J42 (p=0,04 par comparaison avec les souris non vaccinées).
La mortalité est significativement réduite dans le lot de souris vaccinées avec Vaxl/pet-neu (=). Elle commence à J39 et 5 souris (56%) sont encore en vie à J55 (p=0,0008 par comparaison aux souris non traitées et traitées avec Vax1).
Cette immunité protectrice est spécifique pour HER-2/neu du fait que la mortalité des souris traitées avec Vaxl/pet-neu et greffées avec la tumeur EL4/HHD/Tel-Aml (A) est similaire à la mortalité des souris traitées avec Vaxl et greffées avec les cellules tumorales EL-4/HHD/neu (U).

Claims (15)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'identification d'épitopes sous-dominants/cryptiques présentés par une molécule HLA A2.1 de classe I, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes:
a) le choix, à partir de la séquence d'une protéine vis-à-vis de laquelle on souhaite induire une réponse cytotoxique T, d'au moins une séquence peptidique de 8 à 11 acides aminés qui possède tout ou partie du motif d'ancrage primaire de la molécule HLA A2.1, et telle que le complexe de ce peptide avec la molécule HLA

A2.1 possède une DC50 inférieure à 2 heures;
b) la préparation, pour chaque séquence sélectionnée, d'un peptide variant dérivé de ladite séquence par substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine; et c) la détermination de l'immunogénicité de chaque peptide variant obtenu à l'étape b) par la sélection, parmi ceux-ci, de chaque peptide immunogène, générant une réponse CTL spécifique vis-à-vis de cellules cibles exprimant la protéine dont est issue la séquence peptidique choisie à l'étape a), et l'identification de la séquence peptidique dont dérive ledit peptide immunogène.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence peptidique choisie à l'étape a) correspond à un peptide qui possède une affinité
relative pour la molécule HLA A2.1 supérieure à 5 par rapport à HlVpol 589 (SEQ ID
NO : 3).

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence peptidique choisie à l'étape a) correspond à un peptide qui possède une affinité
relative pour la molécule HLA A2.1 supérieure à 10 par rapport à HlVpol 589 (SEQ
ID NO : 3).

4. Procédé de détermination d'une séquence d'un peptide immunogène présenté
par la molécule HLA A2.1 de classe I, capable d'induire une réponse cytotoxique T
dirigée contre un épitope non immunogène d'une protéine cible, ledit procédé
étant caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes:
a) l'identification, par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, d'un épitope sous-dominant/cryptique de la protéine vis-à-vis de laquelle on souhaite induire une réponse cytotoxique T, et b) la modification de la séquence dudit épitope sous-dominant/cryptique, par substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine.

5. Peptide immunogène dérivé, par substitution de l'acide aminé N-terminal par un résidu tyrosine, d'un épitope sous-dominant/cryptique présenté par HLA A2.1 choisi parmi:
le peptide HER-2/neu 650 : PLTSIISAV (SEQ ID NO: 4) le peptide HER-2/neu 466 : ALIHHNTHL (SEQ ID NO: 5) le peptide HER-2/neu 402 : TLEEITGYL (SEQ ID NO: 6) le peptide HER-2/neu 391: PLQPEQLQV (SEQ ID NO: 7) le peptide gagp24-212 : EMMTACQGV (SEQ ID NO: 8) le peptide pol79 : LLDTGADDTV (SEQ ID NO: 9) le peptide mhp 572: RLFFYRKSV (SEQ ID NO: 10) et le peptide mhp 988 : DLQVNSLQTV (SEQ ID NO: 11)

6. Épitope sous-dominant/cryptique présenté par HLA A2.1, caractérisé en ce qu'il s'agit du peptide mhp 988 : DLQVNSLQTV (SEQ ID NO: 11).

7. Composition comprenant au moins un peptide immunogène selon la revendication 5 et un excipient.

8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ou plusieurs autre(s) peptide(s) immunogène(s).

9. Composition selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copies d'un peptide immunogène selon la revendication 5.

10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit polypeptide chimérique comprend en outre une ou plusieurs copies d'un ou plusieurs autre(s) peptide(s) immunogène(s).

11. Molécule d'acide nucléique codant un polypeptide chimérique selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence codant pour un épitope choisi parmi:
l'épitope HER-2/neu 650Y1 : YLTSIISAV (SEQ ID NO: 69) l'épitope HER-2/neu 466Y : YLIHHNTHL (SEQ ID NO: 66) l'épitope HER-2/neu 402Y1 : YLEEITGYL (SEQ ID NO: 67) et l'épitope HER-2/neu 391Y : YLQPEQLQV (SEQ ID NO: 68).

12. Molécule d'acide nucléique selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une séquence codant pour un épitope choisi parmi:
l'épitope HER-2/neu 799 : QLMPYGCLL (SEQ ID NO: 27) l'épitope HER-2/neu 369 : KIFGSLAFL (SEQ ID NO: 28) l'épitope HER-2/neu 789 : CLTSTVQLV (SEQ ID NO: 24) l'épitope HER-2/neu 689 : RLLQETELV (SEQ ID NO: 65) l'épitope HER-2/neu 773 : VMAGVGSPYV (SEQ ID NO: 31) l'épitope HER-2/neu 5 : ALCRWGLLL (SEQ ID NO: 30) l'épitope HER-2/neu 48 : HLYQGCQVV (SEQ ID NO: 25) et l'épitope HER-2/neu 1023 : YLVPQQGFFC (SEQ ID NO: 64).

13. Médicament destiné à l'immunothérapie antivirale ou antitumorale, préventive ou curative comprenant, en tant que principe actif, au moins un peptide immunogène selon la revendication 5, un épitope sous-dominant/cryptique selon la revendication 6, au moins une composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, ou au moins une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 11 et 12.

14. Médicament selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vaccin.

15. Utilisation d'un peptide immunogène selon la revendication 5, d'un épitope sous-dominat/cryptique selon la revendication 6, d'une composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, ou d'une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 11 et 12, pour l'obtention d'un médicament destiné à l'immunothérapie antivirale ou antitumorale.