ES2283791T3 - Epitopos t del antigeno epha2. - Google Patents
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Abstract
Péptido inmunogénico que constituye un epítopo T presentado por el CMH I, caracterizado porque está constituido por un fragmento de 8 a 11 aminoácidos consecutivos del antígeno EphA2.
Description
Epítopos T del antígeno EphA2.
La presente invención se refiere a péptidos
derivados de la proteína EphA2 y a su utilización en inmunoterapia
antitumoral.
La vacunación o inmunoterapia peptídica es un
enfoque terapéutico que actualmente es objeto de gran interés en el
marco de la prevención o del tratamiento de cánceres. Su principio
se basa en la inmunización mediante péptidos que reproducen
epítopos T de antígenos tumorales reconocidos por los linfocitos T
citotóxicos (CTL), que juegan un papel principal en la eliminación
de las células cancerosas que expresan estos antígenos en su
superficie.
Se recordará que los CTL no reconocen los
antígenos proteicos completos, sino fragmentos peptídicos de estos,
presentados por las moléculas del complejo principal de
histocompatibilidad (CMH) expresadas en la superficie de diferentes
células. Son estos fragmentos peptídicos los que constituyen los
epítopos T.
La presentación de estos péptidos resulta de un
proceso complejo, denominado "preparación del antígeno", que
implica 3 etapas principales:
- -
- la degradación citosólica de los antígenos por un complejo multienzimático denominado proteosoma;
- -
- la translocación de los péptidos resultantes de esta degradación al retículo endoplasmático (RE) por los transportadores TAP;
- -
- la asociación de estos péptidos con el CMH para formar complejos estables péptido/CMH, que se exportarán a la superficie celular.
La presentación de los epítopos T en la
superficie celular depende particularmente de la estabilidad de la
proteína antigénica en el citosol, de los sitios y de la frecuencia
de los cortes realizados por el proteosoma, de la eficacia de la
translocación al RE por los transportadores TAP, y de la capacidad
de los péptidos para fijarse a las moléculas del CMH y para formar
complejos péptido/CMH estables.
Los epítopos presentados por el complejo
principal de histocompatibilidad de clase I (CMH I) tienen
generalmente de 8 a 11 aminoácidos, y son reconocidos por las
células T CD8+, que representan el componente principal de la
respuesta citotóxica. Los epítopos presentados por el complejo
principal de histocompatibilidad de clase II (CMH II) tienen
generalmente de 13 a 18 aminoácidos y son reconocidos por las
células T CD4+.
La identificación de estos epítopos, y
particularmente (teniendo en cuenta el papel esencial de la
respuesta CD8+ en la citotoxicidad) de los presentados por el CMH
I, constituye por tanto una etapa esencial para el desarrollo de
composiciones de inmunoterapia anti-tumoral.
Actualmente se conocen numerosos antígenos
tumorales capaces de inducir una respuesta CTL. Se han identificado
algunos de los epítopos T de estos antígenos, y se ha demostrado en
muchos casos la eficacia de vacunas a base de péptidos que
reproducen estos epítopos T. Sin embargo, la expresión de la mayoría
de estos antígenos está restringida a ciertos tipos histológicos de
tumores, lo que limita su utilización clínica. Es deseable por
tanto identificar otros antígenos tumorales expresados por un gran
número de tumores de diversos orígenes, y que además sean capaces
de inducir una respuesta inmune citotóxica antitumoral.
El receptor EphA2, denominado anteriormente ECK
(LINDBERG y HUNTER, Molec. Cell. Biol. 10,
6316-6324, 1990), es un receptor de membrana, que
posee una actividad tirosina quinasa. La secuencia del receptor
EphA2 humano se representa en la figura 1 (SEC ID Nº 1). Este
receptor comprende un dominio extracelular de 534 aminoácidos, un
dominio transmembrana de 24 aminoácidos, y un dominio citoplásmico
de 418 aminoácidos que contiene el dominio tirosina quinasa. Este
receptor se sobreexpresa en varios tipos de cáncer tales como el
cáncer de colon, de mama, de próstata, de pulmón, de estómago, de
esófago así como el melanoma metastásico, pero no se sobreexpresa
en lesiones no cancerosas de estos mismos tejidos (ROSENBERG et
al. Am. J. Physiol. 273, 824, 1997; ZELINSKI et al.
Cancer Res. 61, 2301, 2001; NEMOTO et al. Pathobiology 65,
195, 1997, EASTY et al. Int. J. Cancer 60, 129, 1995; WALKER
DANIEL et al. Prostate 41, 275, 1999). Se ha observado que la
sobreexpresión de EphA2 está asociada a la transformación maligna y
facilita la progresión metastásica de los tumores. Además, EphA2
juega un papel importante en la neovascularización tumoral (OGAWA
et al. Oncogene 19, 6043, 2000).
Debido a su sobreexpresión en numerosos tipos de
tumores, y a su implicación en la transformación maligna y en la
angiogénesis tumoral, se ha propuesto utilizar EphA2 como diana de
tratamientos antitumorales. De este modo, la Solicitud PCT WO
01/12172 propone la utilización de anticuerpos dirigidos contra
epítopos B transportados por el dominio extracelular del receptor
EphA2 para la inmunoterapia antitumoral pasiva.
Sin embargo, actualmente se desconoce si podría
prepararse EphA2 eficazmente para generar epítopos T capaces de
inducir una respuesta citotóxica antitumoral. A fortiori, no
se había identificado ningún epítopo T de este antígeno.
Los inventores han identificado ahora en EphA2
péptidos inmunogénicos presentados por el CMH I, y que inducen
linfocitos T citotóxicos capaces de lisar células tumorales que
expresan EphA2.
La presente invención, en consecuencia, tiene
por objeto un péptido inmunogénico que constituye un epítopo T
presentado por el CMH I, caracterizado porque está constituido por
un fragmento de 8 a 11 aminoácidos consecutivos del antígeno
EphA2.
En el marco de la exposición de la presente
invención, se entiende por "péptido inmunogénico" un péptido
capaz de inducir una respuesta CTL específica contra el antígeno
EphA2.
Pueden obtenerse péptidos de acuerdo con la
invención de diversas maneras a partir del antígeno EphA2. Por
ejemplo, se sabe que los péptidos susceptibles de formar un complejo
con una molécula dada del CMH I, tienen en común la presencia, en
ciertas posiciones, de restos aminoacídicos particulares,
denominados "restos de anclaje". También se han definido para
las diferentes moléculas del CMH I, motivos de anclaje específicos,
que implican aminoácidos denominados "restos de anclaje
primarios". También se ha demostrado que los restos situados
fuera de los motivos de anclaje primarios (restos de anclaje
secundarios) podían ejercer un efecto favorable o desfavorable
sobre la afinidad del péptido por el CMH.
La elección de las secuencias peptídicas
susceptibles de constituir epítopos presentados por una molécula
dada del CMH I puede realizarse, de manera clásica, mediante el
análisis de la secuencia peptídica del antígeno EphA2, para
seleccionar los péptidos que poseen todo o parte del motivo de
anclaje primario correspondiente a esta molécula. Están disponibles
diferentes bases de datos que catalogan los motivos de anclaje
conocidos: a modo de ejemplos, se citará la base SYFPEITHI
(http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/;
RAMMENSEE et al., Immunogenetics, 50,
213-219, 1999), o la base BIMAS
(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind; PARKER et
al., J. Immunol. 152, 163, 1994).
Generalmente, a continuación se determinará la
afinidad de unión de los péptidos identificados de este modo por la
molécula del CMH correspondiente, así como la estabilidad del
complejo péptido/molécula del CMH I. En efecto, los péptidos
no-inmunogénicos presentan generalmente una afinidad
débil por las moléculas del CMH I, y/o forman con estas un complejo
poco estable. Se conocen en si mismos métodos para determinar la
afinidad del péptido por la molécula del CMH I, y la estabilidad
del complejo formado. Se citará por ejemplo el descrito por FIRAT
et al.(Eur. J. Immunol., 29, 3112, 1999).
La afinidad de un péptido por una molécula del
CMH I generalmente se define con respecto a la de un péptido de
referencia (por ejemplo IVGAETFYV (SEC ID Nº 2) por
HLA-A*0201 o RPHERNGFTV (SEC ID Nº 3) por
HLA-B*0702), en forma de afinidad relativa. La
afinidad relativa se define como la relación entre la concentración
del péptido ensayado y la concentración del péptido de referencia
que permite la formación en las mismas condiciones, de la misma
cantidad de complejo péptido/molécula del CMH I. Cuanto más
importante sea la afinidad relativa, más débil será la afinidad de
unión del péptido por la molécula del CMH I.
La estabilidad del complejo péptido/molécula del
CMH I se define a menudo mediante la CD_{50}, que representa el
tiempo necesario para la disociación del 50% de los complejos
formados.
Por ejemplo, en el caso de los péptidos
potencialmente inmunogénicos y presentados por
HLA-A*0201, la afinidad relativa es generalmente
inferior a 5 y la CD_{50} superior a 2 horas.
La inmunogenicidad de los péptidos
potencialmente inmunogénicos detectados de este modo puede
verificarse, por ejemplo, mediante métodos clásicos de
determinación de la capacidad de este péptido para generar, in
vivo, ex vivo, o in vitro una respuesta CTL específica
para las células-diana cargadas con este péptido, o
que expresan el antígeno EphA2 del que procede.
Los péptidos que poseen una afinidad débil por
la molécula del CMH I correspondiente, y/o que forman con esta
última un complejo poco estable, tienen generalmente una
inmunogenicidad débil. Sin embargo, estos péptidos pueden presentar
un interés terapéutico, en la medida en que parece que los epítopos
de afinidad débil participan sólo un poco o nada en el
establecimiento de fenómenos de tolerancia, que constituyen uno de
los principales obstáculos de la vacunación antitumoral.
En este caso, es posible preparar péptidos
variantes cuya inmunogenicidad sea más importante, mediante
sustitución de uno o varios de los aminoácidos del péptido nativo
por uno o varios aminoácidos favorables a la afinidad por la
molécula del CMH I correspondiente y/o a la estabilidad del complejo
péptido/molécula del CMH I.
Estos péptidos variantes también forman parte
del objeto de la presente invención.
Los aminoácidos favorables a la afinidad por una
molécula dada del CMH I y/o a la estabilidad del complejo
péptido/molécula del CMH I, pueden estar constituidos por ejemplo
por restos de anclaje, y particularmente los restos de anclaje
secundarios, conocidos para la molécula del CMH I correspondiente.
Estos restos de anclaje pueden identificarse fácilmente consultando
las bases de datos disponibles, como las mencionadas anteriormente
en este documento.
\newpage
A modo de ejemplo de sustitución que permite
aumentar la inmunogenicidad de un péptido presentado por una
molécula del CMH I, y particularmente por
HLA-A*0201, se citará la sustitución del aminoácido
N-terminal de dicho péptido por una tirosina, como
se describe en la Solicitud PCT WO 02/08716.
La afinidad de un péptido variante por la
molécula del CMH I correspondiente, así como su inmunogenicidad,
pueden verificarse a continuación como se ha indicado anteriormente
en este documento para los péptidos nativos.
A modo de ejemplo no limitante de realización de
la presente invención, los Inventores han identificado cinco
péptidos, denominados en lo sucesivo en este documento p58, p61,
p546, p550 y p883, presentados por HLA-A*0201.
Las secuencias (código de 1 letra) de estos
péptidos son las siguientes:
| p58: | IMNDMPIYM | (SEC ID Nº 4); | |
| p61: | DMPIYMYSV | (SEC ID Nº 5); | |
| p546: | VLLLVLAGV | (SEC ID Nº 6); | |
| p550: | VLAGVGFFI | (SEC ID Nº 7); | |
| p883: | TLADFDPRV | (SEC ID Nº 8). |
Se ha obtenido también, a partir del péptido
p61, que solamente presenta una afinidad débil por
HLA-A*0201, y una inmunogenicidad débil, un péptido
inmunogénico, denominado en lo sucesivo en este documento p61Y de
secuencia YMPIYMYSV (SEC ID Nº 9), que resulta de la sustitución del
resto N-terminal de p61 por un resto tirosina.
Estos péptidos son capaces de inducir una
respuesta CTL específica para las células HLA-A*0201
que expresan EphA2. Inducen particularmente una respuesta
citotóxica con respecto a células tumorales
HLA-A*0201 resultantes de tumores de tipos
variados.
La presente invención tiene también por objeto
composiciones que comprenden al menos un péptido inmunogénico de
acuerdo con la invención, o una molécula de ácido nucleico que
codifica dicho péptido.
Puede tratarse de composiciones multiepitópicas,
capaces de generar una respuesta CTL poliespecífica, y que con este
fin comprenden también uno o varios epítopo(s)
inmunogénico(s) diferente(s). Estos epítopos
diferentes pueden proceder de EphA2, o de uno o varios antígenos
diferentes.
Estas composiciones multiepitópicas de acuerdo
con la invención pueden comprender, para ser ampliamente utilizables
en una población cuyos individuos llevan alelos HLA diferentes,
epítopos presentados por diferentes moléculas del CMH I. También
pueden comprender además al menos un epítopo presentado por una
molécula del CMH II, y capaz de inducir una respuesta T
auxiliar.
De acuerdo con una realización preferida de una
composición de acuerdo con la invención, ésta comprende al menos un
polipéptido quimérico que comprende una o varias copias de un
péptido inmunogénico de acuerdo con la invención. En el caso de una
composición multiepitópica, dicho polipéptido quimérico comprende
además una o varias copias de al menos otro epítopo
inmunogénico.
Un polipéptido quimérico semejante puede
obtenerse fácilmente mediante métodos conocidos en sí mismos, y
particularmente mediante las técnicas clásicas de ADN
recombinante.
La presente invención tiene también por objeto
las moléculas de ácido nucleico que codifican un péptido
inmunogénico o un polipéptido quimérico de acuerdo con la
invención.
La presente invención tiene también por objeto
la utilización de un epítopo peptídico inmunogénico, de una
composición, o de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
invención para la obtención de un medicamento, y particularmente de
un medicamento destinado a la inmunoterapia antitumoral, y en
particular al tratamiento de tumores que expresan EphA2.
Esto abarca una gran variedad de tumores, entre
los cuales se citarán particularmente los tumores de colon, de
mama, de próstata, de pulmón, de estómago, de riñón, y de
esófago.
Los péptidos p58, p61, p546, p550, p883 y p61Y
se pueden utilizar particularmente para la obtención de medicamentos
destinados al tratamiento de pacientes
HLA-A*0201.
La presente invención también abarca los
medicamentos que comprenden, en calidad de principio activo, al
menos un péptido inmunogénico, una composición, o una molécula de
ácido nucleico de acuerdo con la invención.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, dichos medicamentos son vacunas.
\newpage
Los medicamentos de acuerdo con la invención
pueden comprender además los excipientes habituales, así como
adyuvantes utilizados habitualmente en inmunoterapia, y que permiten
por ejemplo favorecer la administración del principio activo,
estabilizarlo, aumentar su inmunogenicidad, etc.
La presente invención se comprenderá mejor con
ayuda del complemento de descripción proporcionado a continuación,
que se refiere a ejemplos no limitantes que ilustran la inducción de
una respuesta citotóxica antitumoral por péptidos de acuerdo con la
invención, procedentes del antígeno EphA2.
Ejemplo
1
La secuencia de aminoácidos de la proteína EphA2
se ha analizado con ayuda del programa BIMAS (PARKER et
al., J. Immunol. 152, 163, 1994), para identificar
péptidos potencialmente capaces de unirse a
HLA-A*0201. Entre los epítopos potenciales
identificados, se han seleccionado los cinco péptidos
siguientes:
| p58: | IMNDMPIYM | (SEC ID Nº 4); | |
| p61: | DMPIYMYSV | (SEC ID Nº 5); | |
| p546: | VLLLVLAGV | (SEC ID Nº 6); | |
| p550: | VLAGVGFFI | (SEC ID Nº 7); | |
| p883: | TLADFDPRV | (SEC ID Nº 8); |
Los péptidos correspondientes a estas secuencias
se han sintetizado mediante SYNT:EM (Nîmes, Francia). La pureza
(> 85%) se controla por cromatografía líquida de alta resolución
de fase inversa. Los péptidos se liofilizan, después se disuelven
en DMSO a 10 mg/ml y se almacenan a -80ºC.
La inmunogenicidad de estos péptidos se ha
evaluado mediante la medición de su afinidad por
HLA-A*0201. Ésta se define mediante dos parámetros:
la afinidad relativa (AR) que refleja la capacidad de los péptidos
para fijarse a HLA-A*0201, y la velocidad de
disociación de los complejos HLA-A*0201/péptido
(CD_{50}) que muestra su estabilidad. Los péptidos de afinidad
elevada (AR < 5 y CD_{50} > 2 h.), son potencialmente
inmunogénicos, al contrario que los péptidos de afinidad débil (AR
> 5 y CD_{50} < 2 h.).
Se incuban células T2 (FIRAT et al., Eur.
J. Immunol., 29, 3112, 1999) (3 x 10^{5} células/ml) humanas, que
son deficientes en transportadores TAP, a 37ºC durante 16 horas con
diversas concentraciones (100 \muM, 10 \muM, 1 \muM,
0,1 \muM) de cada péptido a ensayar en medio RPMI 1640 sin suero, suplementado con 100 ng/ml de \beta2-microglobulina humana. A continuación, se lavan dos veces, y se marcan con el anticuerpo monoclonal BB7.2 (PARHAM et al, Hum. Immunol., 3, 4, 277-299, 1981) que es específico de la molécula HLA-A*0201, y después con un anticuerpo de cabra anti-Ig de ratón, acoplado al isotiocianato de fluoresceína (FITC).
0,1 \muM) de cada péptido a ensayar en medio RPMI 1640 sin suero, suplementado con 100 ng/ml de \beta2-microglobulina humana. A continuación, se lavan dos veces, y se marcan con el anticuerpo monoclonal BB7.2 (PARHAM et al, Hum. Immunol., 3, 4, 277-299, 1981) que es específico de la molécula HLA-A*0201, y después con un anticuerpo de cabra anti-Ig de ratón, acoplado al isotiocianato de fluoresceína (FITC).
Las células se analizan a continuación por
citometría de flujo. Para cada concentración de péptido, se calcula
la fluorescencia específica de HLA-A*0201 en calidad
de porcentaje de la fluorescencia obtenida con 100 \muM de un
péptido de referencia (HIVpol 589; IVGAETEYV, SEC ID Nº 2). La
afinidad relativa (AR) se define como la relación de la
concentración de cada péptido que induce el 20% de la fluorescencia
obtenida con 100 \muM del péptido de referencia, con la
concentración del péptido de referencia que induce el 20% de la
fluorescencia obtenida con 100 \muM de dicho péptido de
referencia. Cuanto más débil es la afinidad relativa, más
fuertemente se une el péptido a HLA-A*0201. La AR
media para cada péptido se determina a partir de al menos tres
experimentos independientes. En todos los experimentos, se ha
obtenido el 20% de la fluorescencia máxima para de 1 a 3 \muM del
péptido de referencia.
Se incuban células T2 (10^{6}/ml) durante una
noche a 37ºC con 100 \muM de cada péptido a ensayar en medio RPMI
1640 sin suero, suplementado con 100 ng/ml de
\beta2-microglobulina humana. A continuación, se
lavan cuatro veces para eliminar los péptidos libres, se incuban
con BREFELDIN A (SIGMA; 10 \mug/ml) durante una hora para
prevenir la expresión en su superficie de las moléculas
HLA-A*0201 sintetizadas recientemente, se lavan y
se incuban a 37ºC durante 0, 2, 4, 6 u 8 horas en presencia de
BREFELDIN A (0,5 \mug/ml). Para cada periodo de incubación, las
células se marcan a continuación, como se ha indicado anteriormente
en este documento, con el anticuerpo BB7.2, y se analizan por
citometría de flujo para evaluar la cantidad de complejo
péptido/HLA-A*0201 presente en su superficie. Esta
cantidad se evalúa mediante la fórmula: (fluorescencia media de las
células T2 preincubadas con el péptido - fluorescencia media de las
células T2 tratadas en condiciones similares en ausencia de
péptido). El CD_{50} (complejo de disociación: CD) se define como
el tiempo (en horas) requerido para la pérdida del 50% de los
complejos HLA-A*0201/péptido estabilizados a t =
0.
\newpage
Los resultados de estos experimentos se
presentan en la Tabla I a continuación en este documento.
Estos resultados muestran que los péptidos p58,
p546, p550 y p883 poseen una afinidad de unión importante (AR de 1
a 2,2). En cambio, el péptido p61 presenta una afinidad débil por
HLA-A*0201 (AR > 10) y por tanto no debería ser
inmunogénico. Para mejorar la afinidad de este péptido por
HLA-A*0201, los inventores han sustituido el ácido
aspártico en posición 1 por una resto tirosina. El péptido variante
p61Y obtenido presenta una afinidad de unión importante (AR = 1,5),
muy superior a la del péptido del que procede.
Los resultados muestran también que los péptidos
p58, p546, p550 y p883 forman complejos estables con las moléculas
HLA-A*0201 (CD_{50} > 2 h para cada uno de
ellos).
Ejemplo
2
La inmunogenicidad de los péptidos p58, p61Y,
p546, p550 y p883 se ha evaluado mediante generación de CTL en
ratones transgénicos HHD (PASCOLO et al., J. Exp. Med., 185,
2043, 1997). Estos ratones son \beta2m-/-, D^{b}-/- y expresan
una monocadena HLA-A*0201 compuesta por los dominios
\alpha1 y \alpha2 de HLA-A*0201 y los dominios
\alpha3 e intracelular de D^{b}, unida por su extremo
N-terminal al extremo C-terminal
de la \beta2-microglobulina humana mediante un
péptido de 15 aminoácidos.
Los ratones HHD reciben una inyección subcutánea
en la base de la cola con 100 \mug de cada péptido a ensayar
emulsionado en adyuvante incompleto de Freund, en presencia de 140
\mug de un epítopo auxiliar T derivado del antígeno "core"
de HBV (128-140, secuencia TPPAYRPPNAPIL, SEC ID Nº
10).
Después de 11 días, se estimulan in vitro
células esplénicas prelavadas en los ratones (5 x 10^{7} células
en 10 ml), conel péptido a ensayar (10 \muM). El 6º día de
cultivo, se ensayan las poblaciones que responden para determinar
una citotoxicidad específica. Las células que responden se estimulan
de nuevo in vitro a intervalos de una semana con 2 x
10^{7} células esplénicas HHD irradiadas (3000 rad) y una
concentración de 1 a 0,1 \muM de péptido en presencia de 50 UI/ml
de IL2 recombinante (PROLEUKIN, CHIRON CORP).
Los ensayos de citotoxicidad se realizan 6 días
después de la última estimulación.
Se utilizan células RMAS-HHD
como diana para estudiar la citotoxicidad. Estas células se obtienen
mediante transfección de células RMAS de ratón con la construcción
HHD como se describe por PASCOLO et al.(J. Exp. Med., 185,
2043, 1997).
Estas células-diana se marcan
con 100 \muCi de ^{51}Cr durante 90 minutos, después se lavan
tres veces y se extienden en placas de 96 pocillos de fondo redondo
(3 x 10^{3} células/pocillo en 100 \mul de RPMI 1640 + 3% de
suero bovino fetal). Se cargan con una concentración de 1 \muM del
péptido a ensayar, o de un péptido de control no pertinente, a 37ºC
durante 90 minutos.
A continuación, se añaden 100 \mul de células
efectoras (relación de células efectoras/células diana = 40/1) a
los pocillos, y las placas se incuban a 37ºC durante 4 horas.
Después de la incubación, se recogen 100 \mul de sobrenadante y
la radiactividad se mide en un contador \gamma.
El porcentaje de lisis específica se calcula
mediante la fórmula: [(liberación de ^{51}Cr experimental -
liberación de ^{51}Cr espontánea)/(liberación de ^{51}Cr máxima
- liberación de ^{51}Cr espontánea)] x 100. En todos los
experimentos, la liberación espontánea es inferior al 20% de la
liberación máxima inducida por HCl 3 N.
Los resultados de estos experimentos para los
péptidos p58 y p550 se ilustran mediante la Figura 2.
\Box : péptido no pertinente;
\blacksquare : péptido EphA2.
Estos resultados demuestran que la inmunización
mediante el péptido p58 o p550 genera CTL que destruyen las dianas
RMAS-HHD cargadas con este mismo péptido, pero no
las células cargadas con el péptido no pertinente. Se han obtenido
resultados equivalentes con los péptidos p61Y, p546 y p883.
Se han establecido líneas de CTL, denominadas
respectivamente mCTL58, mCTL61Y, mCTL546, mCTL550 y mCTL883, a
partir de las células esplénicas de ratón HDD inmunizadas con el
péptido p58, p61Y, p546, p550 o p883, mediante estimulaciones
repetidas in vitro con concentraciones decrecientes (10
\muM-1 \muM) del mismo péptido.
La avidez de estas líneas por su péptido
inductor se ha determinado midiendo, como se ha descrito
anteriormente en este documento, su citotoxicidad con respecto a
células dianas RMAS-HHD cargadas con concentraciones
crecientes (1 pM a 10 \muM) del péptido correspondiente.
Los resultados se ilustran mediante la Figura
3.
Estos resultados demuestran que las líneas
mCTL58, mCTL61 Y, mCTL546, mCTL550 y mCTL883 poseen una avidez
relativamente elevada. Se obtiene el 50% de la lisis máxima para
concentraciones de péptido que van de 3 nM en el caso de mCTL546 a
40 nM en el caso de mCTL61Y.
Ejemplo
3
Para ensayar si los péptidos p58 y p550
constituyen epítopos preparados de forma natural del antígeno EphA2,
se ha evaluado de dos maneras diferentes la respuesta de las
células de las líneas mCTL58 y mCTL550 a las células que expresan
este antígeno.
Las células de las líneas mCTL58 y mCTL550, se
estimulan con células COS-7 de mono
co-transfectadas con la construcción HHD (PASCOLO
et al. citado anteriormente) y un plásmido que contiene el
ADNc de EphA2. A modo de controles negativos se utilizan células
COS-7 transfectadas con la construcción HHD en
solitario, o con el plásmido que contiene el ADNc de EphA2 en
solitario.
La estimulación de los CTL se evalúa por
medición de su secreción de TNF-\alpha. A modo de
control positivo, se utilizan células COS-7
transfectadas con la construcción HHD y cargadas con el péptido p58
o p550.
4 días después de la transfección, las células
COS-7 se ponen en contacto con las células mCTL58 y
mCTL550 a razón de 5 x 10^{4} CTL por 3 x 10^{4} células
COS-7 en RPMI 1640 en presencia de SVF al 10%.
Después de 6 horas de incubación, se prelava el
sobrenadante (50 \mul), y se pone en contacto con células de
fibrosarcoma de ratón WEHI164 clon 13 (3 x 10^{4} por pocillo) que
se caracterizan por una fuerte sensibilidad a la apoptosis inducida
por el TNF-\alpha. Para cuantificar el contenido
de TNF de los sobrenadantes del cultivo, se utiliza en paralelo una
gama patrón de TNF-\alpha (concentraciones de 0 a
10^{4} pg/ml). Después de 16 horas de incubación a 37ºC, se
determina la viabilidad de las células WEHI-164 clon
13 mediante un ensayo colorimétrico con MTT (SIGMA) (ESPEVIK y
NISSEN MEYER, J. Immunol. Methods., 95, 99, 1986).
Los resultados se ilustran mediante la Figura
4.
- : células COS-7 non
transfectadas;
EphA2: células COS-7
transfectadas con el ADNc de EphA2 en solitario;
HHD: células COS-7 transfectadas
con la construcción HHD en solitario;
HHD + péptido: células COS-7
transfectadas con la construcción HHD y cargadas con el péptido p58
o p550;
HHD + EphA2: células COS-7
transfectadas con la construcción HHD y el ADNc de EphA2.
Estos resultados muestran que las líneas mCTL58
y mCTL550 responden a la estimulación por las células COS que
co-expresan HHD y EphA2.
En cambio, no se observa ninguna respuesta a las
células COS transfectadas por separado con la construcción HHD o
con el ADNc de EphA2.
Se han utilizado las siguientes líneas tumorales
HLA-A*0201: SAOS (sarcoma), 1355 (cáncer de pulmón),
Caco-2 (cáncer de colon), HIEG (carcinoma renal),
LNCaP (cáncer de próstata). También se ha utilizado la línea DU145
(cáncer de próstata) que no expresa HLA-A*0201 a
modo de control negativo.
Entre estas líneas, se sabe que DU145 y
Caco-2 expresan EphA2, y que LNCaP no expresa
EphA2.
La expresión de EphA2 en las otras líneas
tumorales se ha evaluado mediante transferencia de Western. El nivel
de expresión de EphA2 en el conjunto de las líneas utilizadas se
resume en la Tabla II a continuación en este documento.
Las líneas mCTL58 y mCTL550 se han estimulado
con las líneas tumorales SAOS, 1355, Caco-2,
HIEG,
LNCaP, y DU145 mencionadas anteriormente en este documento. Las líneas mCTL61Y, mCTL546 y mCTL 883 se han estimulado con las líneas tumorales LNCaP, DU145 y Caco-2 mencionadas anteriormente en este documento. La estimulación se evalúa mediante detección de la secreción de TNF-\alpha, como se ha descrito anteriormente en este documento.
LNCaP, y DU145 mencionadas anteriormente en este documento. Las líneas mCTL61Y, mCTL546 y mCTL 883 se han estimulado con las líneas tumorales LNCaP, DU145 y Caco-2 mencionadas anteriormente en este documento. La estimulación se evalúa mediante detección de la secreción de TNF-\alpha, como se ha descrito anteriormente en este documento.
Los resultados se ilustran mediante las Figuras
5A, 5B y 5C.
La figura 5A muestra que las células mCTL58 y
mCTL550 responden a la estimulación con las células
Caco-2, que expresan HLA-A*0201 y
EphA2, pero no responden ni a las células DU145 que no expresan
HLA-A*0201 ni a las células LNCaP que no expresan
EphA2.
La figura 5B muestra que las células mCTL58 y
mCTL550 responden a la estimulación con las células HIEG,
Caco-2, 1355 y SAOS que expresan cantidades
importantes de EphA2, pero no responden a las células LNCaP que no
expresan EphA2.
La figura 5C muestra que las células mCTL61Y,
mCTL546 y mCTL883 responden a la estimulación con las células
Caco-2 que expresan cantidades importantes de EphA2,
pero no responden a las células LNCaP y DU145 que no expresan EphA2
y HLA-A*0201 respectivamente.
Los resultados de los experimentos anteriores en
este documento demuestran que los CTL inducidos por p58, p61Y,
p546, p550 o p883 reconocen epítopos preparados de forma natural del
antígeno EphA2.
Ejemplo
4
La capacidad de p58 y p550 para inducir CTL
in vitro a partir de células mononucleadas de sangre
periférica (PMBC) de donantes sanos, se ha ensayado de la siguiente
manera.
Las PBMC se obtienen, a partir de extracciones
sanguíneas por leucoféresis en donantes sanos, después del
centrifugado a 2000 rpm durante 20 min. en gradiente de
Ficoll/Hypaque (AMERSHAM). Después de 3 lavados en NaCl al 0,9%, se
resuspenden 10^{7} PBMC en cada uno de los pocillos de una placa
de cultivo de 6 pocillos, en 3 ml de medio completo (RPMI 1640
suplementado con suero humano AB inactivado por calor al 10%), y se
incuban a 37ºC durante 2 horas. Después de la incubación, las
células no adherentes se prelavan y las células adherentes se
diferencian en células dendríticas añadiendo a cada uno de los
pocillos 3 ml de medio completo que contiene 50 ng/ml de
GM-CSF (R & D SYSTEMS) y 1000 UI/ml de
IL-4 (R & D SYSTEMS). Después de 7 días de
cultivo, las células dendríticas se recogen y se cargan con el
péptido p58 o p550 por incubación durante 4 horas a 20ºC con 40
\mug/ml de péptido en presencia de 3 \mug/ml de
\beta2-microglobulina, después se irradian a 4200
rad y a continuación se lavan para eliminar el péptido libre. Las
células CD8+ se aíslan a partir de células no adherentes con ayuda
de microesferas acopladas a un anticuerpo anti-CD8
(MILTENYI BIOTEC).
Se estimulan 0,5 x 10^{6} células CD8+
mediante co-cultivo en una placa de 48 pocillos con
2,5 x 10^{4} células dendríticas cargadas con el péptido p58 o
p550, en medio completo suplementado con 10 ng/ml de
IL-7 en un volumen final de 500 \mul/pocillo. Al
día siguiente de la puesta en cultivo, se le añaden a cada uno de
los pocillos 10 ng/ml de IL-10 humana (R & D
SYSTEMS); al segundo día, se le añaden a cada uno de los pocillos
30 UI/ml de IL-2 humana. El séptimo y el
decimocuarto día después de la primera estimulación, las células
CD8+ se estimulan de nuevo con las células adherentes cargadas con
10 \mug/ml de péptido en presencia de 3 \mug/ml de
\beta2-microglobulina y se irradian. Se añaden
IL-10 (10 ng/ml) e IL-2 (30 UI/ml)
respectivamente 24 horas y 48 horas después de la
re-estimulación. Siete días después de la segunda
re-estimulación, se evalúa la respuesta de estas
células a células T2 cargadas con p58 o p550 o con un péptido no
pertinente, o a células tumorales HLA-A*0201
Caco-2 (que expresan EphA2 y
HLA-A*0201), LNCaP (que expresan
HLA-A*0201 y que no expresan EphA2), y DU145 (que
expresan EphA2 y que no expresan HLA-A*0201)
mediante dosificación de la producción de IFN\gamma
intra-celular.
Las células hCTL58 o hCTL550 se incuban con las
células T2 cargadas, o con las células de la línea tumoral
ensayada, en presencia de 20 \mug/ml de
BREFELDINE-A (SIGMA). Después de 6 horas, éstas se
lavan, se marcan con un anticuerpo anti-CD8
conjugado con r-ficoeritrina (CALTAG LABORATORIES)
en PBS durante 25 min. a 4ºC, se lavan y se fijan con
paraformaldehído al 4%. A continuación se permeabilizan con saponina
(SIGMA) al 0,2% en PBS, y se marcan con un anticuerpo monoclonal
anti-IFN\gamma conjugado con aloficocianina
(PHARMIN-GEN).
Las células se analizan a continuación por
citometría de flujo (FACSCalibur™ (BECTON DICKINSON) y el programa
CellQuest™).
Los resultados (expresados en número de células
CD8 + productoras de IFN\gamma por 10^{5} células CD8+) se
ilustran mediante las Figuras 6A y 6B.
La Figura 6A muestra que los CTL humanos
obtenidos a partir de células CD8+ estimuladas respectivamente con
el péptido p58 (hCTL58) o el péptido p550 (hCTL550) se activan con
las células T2 cargadas con el péptido correspondiente, y que no se
observa ninguna activación con las células T2 cargadas con el
péptido no pertinente.
La Figura 6B muestra una respuesta de los CTL
hCTL58 y hCTL550 con respecto a la línea tumoral
Caco-2 (EphA2^{+},
HLA-A*0201^{+}), pero no con respecto a las líneas
LNCaP (EphA2^{-}, HLA-A*0201^{+}) y DU145
(EphA2^{+}, HLA-A*0201^{-}).
Estos resultados demuestran que los péptidos p58
o p550 inducen CTL humanos capaces de reconocer células tumorales
HLA-A*0201+ que expresan EphA2.
<110> INSERM
\hskip1cm IGR
\hskip1cm KOSMATOPOULOS, Kostas
\hskip1cm ALVES, Pédro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> EPÍTOPOS T DEL ANTÍGENO EPHA2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJPah598/69EX
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 976
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Val Gly Ala Glu Thr Phe Tyr Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Herpesvirus humano 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr
Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Met Asn Asp Met Pro Ile Tyr Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Met Pro Ile Tyr Met Tyr Ser Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Leu Leu Leu Val Leu Ala Gly Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Leu Ala Gly Val Gly Phe Phe Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Ala Asp Phe Asp Pro Arg Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido inmunogénico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Met Pro Ile Tyr Met Tyr Ser Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro
Ile Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Péptido inmunogénico que constituye un
epítopo T presentado por el CMH I, caracterizado porque está
constituido por un fragmento de 8 a 11 aminoácidos consecutivos del
antígeno EphA2.
2. Péptido inmunogénico de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona
entre:
- - el péptido de secuencia IMNDMPIYM
- (SEC ID Nº 4);
- - el péptido de secuencia VLLLVLAGV
- (SEC ID Nº 6);
- - el péptido de secuencia VLAGVGFFI
- (SEC ID Nº 7);
- - el péptido de secuencia TLADFDPRV
- (SEC ID Nº 8).
3. Péptido inmunogénico caracterizado
porque es capaz de inducir una respuesta CTL específica contra el
antígeno EphA2, y porque procede de un péptido constituido por un
fragmento de 8 a 11 aminoácidos consecutivos del antígeno EphA2,
por sustitución de al menos un aminoácido de dicho péptido por un
aminoácido que aumenta la afinidad de dicho péptido por una
molécula del CMH I.
4. Péptido inmunogénico de acuerdo con la
reivindicación 3, caracterizado porque procede de un péptido
constituido por un fragmento de 8 a 11 aminoácidos consecutivos del
antígeno EphA2, por sustitución del aminoácido
N-terminal de dicho péptido por un resto de
tirosina.
5. Péptido inmunogénico de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizado porque se define por la
secuencia YMPIYMYSV (SEC ID Nº: 9).
6. Polinucleótido que codifica un péptido de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Composición que comprende al menos un péptido
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un
polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Composición de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizada porque se trata de una composición
multiepitópica que comprende además uno o varios péptido(s)
inmunogénico(s) diferente(s) o uno o varios
polinucleótido(s) que codifica(n) dicho(s)
péptido(s).
9. Composición de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizada porque se trata de un polipéptido quimérico
que comprende al menos una copia de un péptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y al menos una copia de un
péptido inmunogénico diferente, o de un polinucleótido que codifica
dicho polipéptido quimérico.
10. Utilización de un péptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, de un polinucleótido de
acuerdo con la reivindicación 6, o de una composición de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, para la obtención de
un medicamento.
11. Utilización de acuerdo con la reivindicación
10, caracterizada porque dicho medicamento se destina a la
inmunoterapia antitumoral.
12. Utilización de acuerdo con la reivindicación
11, caracterizada porque dicho medicamento se destina a la
inmunoterapia de tumores que expresan el antígeno EphA2.
13. Utilización de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 10 a 12, caracterizada porque dicho
medicamento se destina al tratamiento de pacientes
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