ES2323895T3 - Uso de peptidos nativos y sus derivados optimizados para vacunacion. - Google Patents
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Abstract
Uso de un péptido nativo, para producir una composición medicinal para mantener la respuesta inmune de LTC iniciada por su péptido optimizado afín, en el que dicho péptido nativo es un péptido críptico y dicho péptido optimizado afín es un péptido obtenido por una o varias sustituciones de aminoácidos en dicho péptido nativo, dando como resultado dichas modificaciones una mayor afinidad por la molécula de MHC y/o una mayor estabilidad del complejo de MHC/péptido.
Description
Uso de péptidos nativos y sus derivados
optimizados para vacunación.
La presente invención se refiere al campo de la
vacunación y, más particularmente, a los campos de vacunación
antitumoral y antiviral. La invención se refiere al uso de de un
péptido nativo en una composición medicinal, para seleccionar y/o
reforzar parte de una respuesta inmune de LTC que se ha iniciado por
un péptido inmunógeno optimizado obtenido de dicho péptido
nativo.
La inmunoterapia de cáncer tiene por objeto
estimular linfocitos T citotóxicos (LTC) que reconocen péptidos
obtenidos de antígenos tumorales y presentados en la superficie de
la célula tumoral por moléculas de HLA de clase 1. Los péptidos
dirigidos a LTC pueden ser dominantes o crípticos (Moudgil y Sercarz
1994). Los péptidos dominantes tienen una alta afinidad por HLA y
se presentan frecuentemente por células tumorales. Por el contrario,
los péptidos crípticos tienen una baja afinidad por HLA y casi
nunca se presentan por células tumorales. Todas las vacunas de
cáncer ensayadas hasta ahora se han dirigido a péptidos dominantes,
con relativamente poco éxito (Slingluff, Yamshchikov et al.
2001; Knutson, Schiffman et al. 2002; Schaed, Klimek et
al. 2002; Parkhurst, Riley et al. 2004; Vonderheide,
Domchek et al. 2004). Los estudios que usan modelos de ratón
demostraron que esta ausencia de eficacia se debe a la tolerancia a
antígenos tumorales y, especialmente, a sus péptidos dominantes
(Cibotti, Kanellopoulos et al. 1992; Theobald, Biggs et
al. 1997; Colella, Bullock et al. 2000; Hernandez, Lee
et al. 2000; Grossmann, Davila et al. 2001; Gross,
Graff-Dubois et al. 2004).
Para evitar esta tolerancia se ha propuesto
recientemente la vacunación con péptidos crípticos. Se observó que
en ratones humanizados, la tolerancia de péptidos crípticos era
débil o estaba ausente y que los péptidos crípticos inducían de
forma eficaz inmunidad antitumoral in vivo, suponiendo que se
hubiera optimizado su inmunogenicidad (Tourdot, Scardino et
al. 2000; Scardino, Gross et al. 2002; Gross,
Graff-Dubois et al. 2004). Previamente se ha
descrito una modificación de secuencia peptídica que optimiza la
inmunogenicidad de prácticamente todos los péptidos restringidos
por HLA-A*0201 de baja afinidad ensayados (Tourdot,
Scardino et al, 2000).
TERT_{572Y} es un péptido críptico optimizado
asociado con HLA-A*0201 obtenido de TERT, un
antígeno sobreexpresado por el 85% de los tumores humanos (Kim,
Piatyszek et al. 1994). TERT_{572} está presente en TERT
tanto humano como murino y TERT_{572Y} fue capaz de inducir
inmunidad antitumoral en ratones transgénicos
HLA-A*0201; sin embargo, no se observó
autoinmunidad frente a tejidos normales que expresan TERT (Gross,
Graff-Dubois et al. 2004). In vitro,
TERT_{572Y} estimuló LTC antitumorales tanto de donantes sanos
como de pacientes con cáncer de próstata. Los LTC inactivaron las
células tumorales que expresan TERT pero no células normales que
expresan TERT (Hernandez, Garcia-Pons et al.
2002; Scardino, Gross et al. 2002).
Sin embargo, en una estrategia de vacunación
similar, se ha descrito que la vacunación de pacientes con melanoma
con gp100_{209M} optimizado condujo a la amplificación de células
T que ya no eran capaces de reconocer el péptido gp100_{209}
nativo o células de melanoma que expresan gp100 (Clay, Custer et
al. 1999).
Por tanto, actualmente existe una necesidad de
un protocolo de vacunación que permita el inicio y mantenimiento de
una respuesta de células T dirigida a epítopos
sub-dominantes o crípticos, especialmente cuando
esta respuesta se inicia por péptidos optimizados.
El estudio descrito en el siguiente Ejemplo 1 se
diseñó para evaluar: i) la capacidad de TERT_{572Y} de estimular
una respuesta inmune antitumoral in vivo en pacientes con
cáncer avanzado; y ii) el riesgo de inducir autoinmunidad frente a
células y tejidos normales que expresan TERT tales como precursores
hematopoyéticos, intestino, timo e hígado. La vacunación de
pacientes con cáncer avanzado con TERT_{572Y} estimuló LTC
específicos que eran completamente funcionales y capaces de
inactivar in vitro células tumorales que
sobre-expresan TERT. Además, la vacunación fue
segura y no indujo ninguna autoinmunidad frente a tejidos normales
positivos a TERT. Ésta es la primera demostración in vivo en
seres humanos de que se pueden considerar péptidos crípticos
optimizados para inmunoterapia tumoral.
Además, estos resultados, así como los
presentados en los Ejemplos 2, 3 y 4, muestran que la inyección de
un péptido nativo, después de la vacunación con su péptido
optimizado afín, puede mantener la respuesta inmune iniciada por
dicho péptido optimizado. Sin quedar ligado a ninguna teoría, se
puede plantear la hipótesis de que el uso del péptido nativo
permite seleccionar y/o reforzar, entre las células T reclutadas por
el péptido optimizado, las que tengan la mayor especificidad por el
péptido nativo presentado por células tumorales.
Estos hallazgos permiten proponer el uso de un
péptido críptico o no optimizado nativo para mejorar la respuesta
inmune de LTC generada por un péptido optimizado afín.
Un "péptido críptico" para una molécula de
MHC dada es un péptido que es capaz de unirse a dicha molécula de
MHC, pero solamente con una afinidad débil por la molécula de MHC
y/o una estabilidad débil del complejo de MHC/péptido. Como
resultado, este péptido solamente se presenta ligeramente por dicha
molécula de MHC en la superficie de una célula presentadora de
antígenos y, por tanto, solamente participa de forma ligera, o de
ningún modo, en la respuesta de LTC al antígeno del que se obtiene
dicho péptido. Por ejemplo, en el caso de HLA A2, los péptidos
crípticos se pueden definir como péptidos que tienen una baja
afinidad y una débil capacidad de estabilización (RA>5 y
CD_{50}<2 horas), como se describe en el documento WO
0208716.
Un "péptido nativo" (críptico o no) es un
péptido que se corresponde a un fragmento de un antígeno, sin
ninguna modificación de secuencia.
Un "péptido optimizado" para un péptido
nativo dado es un péptido obtenido por una o varias sustituciones
de aminoácidos en dicho péptido nativo, dando como resultado dichas
modificaciones una mayor afinidad por la molécula de MHC y/o una
mayor estabilidad del complejo de MHC/péptido. Por ejemplo, los
péptidos asociados con HLA-A2.1 se pueden optimizar
modificando su secuencia introduciendo una tirosina en la primera
posición (sustitución P1Y) (Tourdot, Scardino et al, 2000).
En el documento PCT WO 02/08716 se describe, por ejemplo, un método
para identificar péptidos crípticos y generar péptidos optimizados
afines. También se han descrito otras modificaciones para optimizar
péptidos HLA A2, tal como por sustitución del aminoácido en la
posición 2 por una metionina o una leucina (Parkhurst, Salgaller
et al. 1996; Bakker, van der Burg et al. 1997;
Valmori, Fonteneau et al. 1998) o por sustitución del
aminoácido C-terminal por una valina o una leucina
(Parkhurst, Salgaller et al. 1996). Estas modificaciones
peptídicas se pueden realizar para obtener péptidos optimizados
para realizar la presente descripción.
Un péptido críptico no es capaz de generar in
vitro una respuesta de LTC específica frente a células diana
que expresan la proteína de la que se obtiene. Por el contrario, el
péptido optimizado afín es capaz de generar una respuesta de LTC
específica frente a las mismas células diana, donde al menos parte
de los LTC tienen una alta avidez por dicho péptido críptico.
Un objeto de la presente descripción es el uso
de un péptido sub-dominante o críptico nativo, para
producir una composición medicinal para mantener la respuesta
inmune de LTC iniciada por su péptido optimizado afín.
La presente descripción es particularmente útil
en el dominio de inmunoterapia antitumoral o antiviral. En
consecuencia, el péptido nativo es ventajosamente de un antígeno
tumoral o de un antígeno viral, especialmente de un antígeno de un
virus que produce infecciones duraderas, tales como VIH, HCV y
HBV.
De acuerdo con la invención, un péptido nativo
se puede usar para vacunación de pacientes que han recibido
previamente un péptido optimizado afín.
Se incluye un método para vacunar un paciente
frente a un antígeno tumoral o viral, donde dicho método comprende
una primera etapa de vacunación con un péptido optimizado afín a un
péptido críptico nativo de dicho antígeno, seguido de una segunda
etapa de vacunación con dicho péptido nativo.
Un ejemplo de vacunación antitumoral que usa el
péptido críptico nativo TERT_{572} (RLFFYRKSV) y su péptido
optimizado afín TERT_{572Y} (YLFFYRKSV), se proporciona más
adelante en este documento en el Ejemplo 1.
De acuerdo con una realización preferida, el
péptido críptico se presenta por HLA A2 y el péptido optimizado se
produce por la sustitución del aminoácido N-terminal
de dicho péptido críptico con un resto de tirosina. Se describen
ejemplos no limitantes de pares de péptidos crípticos y péptidos
optimizados, presentados por HLA A2, y que se pueden usar en la
presente invención, en el documento PCT WO 02/08716 y en la
siguiente Tabla 1. En la Tabla 1 se presentan otros pares de
péptidos nativos y optimizados afines. Entre estos, se pueden usar
los siguientes pares de péptidos crípticos nativos y péptidos
optimizados afines de acuerdo con la presente invención:
[TERT_{572} (SEC ID Nº: 1), TERT_{572Y1} (SEC ID Nº: 2)];
[TERT_{988} (SEC ID Nº: 3), TERT_{988Y1} (SEC ID Nº: 4)];
[MAGE-A_{248D9} (SEC ID Nº: 5),
MAGE-A_{248V9} (SEC ID Nº: 6)];
[MAGE-A_{248G9} (SEC ID Nº: 7),
MAGE-A_{248V9} (SEC ID Nº: 6)]; [HBVpol_{575}
(SEC ID Nº: 15), HBVpol_{575Y1} (SEC ID Nº: 16)]; [HBVpol_{765}
(SEC ID Nº: 17), HBVpol_{765Y1} (SEC ID Nº: 18)]; [Gp100_{177}
(SEC ID Nº: 23), [Gp100_{177Y1} (SEC ID Nº: 24)]; [Gp100_{178}
(SEC ID Nº: 25), Gp100_{178Y1} (SEC ID Nº: 26)]; [Gp_{570} (SEC
ID Nº: 27), Gp100_{570Y1} (SEC ID Nº: 28)];
[HER-2/neu_{799} (SEC ID Nº: 36),
HER-2/neu_{799Y1} (SEC ID Nº: 37)];
[HER-2/neu_{48} (SEC ID Nº: 42),
HER-2/neu_{48Y1} (SEC ID Nº: 43)];
[HER-2/neu_{773} (SEC ID Nº: 44),
HER-2/neu_{773Y1} (SEC ID Nº: 45)];
[HER-2/neu_{851} SEC ID Nº: 48),
HER-2/neu_{851Y1} (SEC ID Nº: 49)];
[HER-2/neu_{661} (SEC ID Nº: 50),
HER-2/neu_{661Y1} (SEC ID Nº: 51)];
[HER-2/neu_{650} (SEC ID Nº: 52),
HER-2/neu_{650Y1} (SEC ID Nº: 53)];
[HER-2/neu_{466} (SEC ID Nº: 54),
HER-2/neu_{466Y1} (SEC ID Nº: 55)];
[HER-2/neu_{402} (SEC ID Nº: 56),
HER-2/neu_{402Y1} (SEC ID Nº: 57)];
[HER-2/neu_{391} (SEC ID Nº: 58),
HER-2/neu_{39Y1} (SEC ID Nº: 59)];
[HER-2/neu_{971} (SEC ID Nº: 60),
HER-2/neu_{971Y1} (SEC ID Nº: 61)];
[HBVpol_{28} (SEC ID Nº: 62), HBVpol_{28Y1} (SEC ID Nº: 63)];
[HBVpol_{594} (SEC ID Nº: 64), HBVpol_{594Y1} (SEC ID Nº: 65)];
[HBVpol_{985} (SEC ID Nº: 66), HBVpol_{985Y1} (SEC ID Nº: 67)];
[EphA2_{61} (SEC ID Nº: 68), EphA2_{61Y1} (SEC ID Nº: 69)];
[HER2_{911} (SEC ID Nº: 70), HER_{911Y1V10} (SEC ID Nº: 71)];
[HER4_{911} (SEC ID Nº: 72), HER_{911Y1V10} (SEC ID Nº: 71)];
[HER1_{911} (SEC ID Nº: 73), HER_{911Y1V10} (SEC ID Nº: 71)];
[HER2_{722} (SEC ID Nº: 74), HER_{722Y1V9} (SEC ID Nº: 75)];
[HER3_{722} (SEC ID Nº: 76), HER_{722Y1V9} (SEC ID Nº: 75)];
[HER4_{722} (SEC ID Nº: 77), HER_{722Y1V9} (SEC ID Nº: 75)];
[HER1_{722} (SEC ID Nº: 78), HER_{722Y1V9} (SEC ID Nº: 75)];
[HER2_{845} (SEC ID Nº: 79), HER_{845Y1} (SEC ID Nº: 80)];
[HER3_{845} (SEC ID Nº: 81), HER_{845Y1} (SEC ID Nº: 80)];
[HER2_{904} (SEC ID Nº: 82), HER_{904Y1} (SEC ID Nº: 83)];
[HER4_{904} (SEC ID Nº: 84), HER_{904Y1} (SEC ID Nº: 83)];
[HER2_{933} (SEC ID Nº: 85), HER_{933Y1} (SEC ID Nº: 86)];
[HER1_{933} (SEC ID Nº: 87), HER_{933Y1} (SEC ID Nº: 86)];
[HER2_{945} (SEC ID Nº: 88), HER_{945Y1} (SEC ID Nº: 90)];
[HER3_{945} (SEC ID Nº: 89), HER_{945Y1} (SEC ID Nº: 90)];
[HER4_{945} (SEC ID Nº: 91), HER_{945Y1} (SEC ID Nº: 90)]; y
[HER1_{945} (SEC ID Nº: 92), HER_{945Y1} (SEC ID Nº: 90)].
\newpage
Otro aspecto de la presente descripción es un
proceso para obtener in vitro LTC que tengan alta avidez por
un péptido nativo, especialmente un péptido críptico nativo,
estimulando, con dicho péptido nativo, los LTC que están presentes
en una muestra biológica de un paciente que se ha inmunizado con un
péptido optimizado afín. En este proceso, los péptidos nativo y
optimizado son ventajosamente como se ha descrito anteriormente.
La presente descripción también se refiere a un
kit de partes para la vacunación, que comprende al menos una dosis
de un péptido nativo y al menos una dosis de su péptido optimizado
afín. En una realización preferida, el kit de vacunación comprende
2 ó 3 dosis de péptido optimizado y 3, 4, 5 ó 6 dosis de péptido
nativo. Un kit de vacunación particular de acuerdo con la
descripción está adaptado para la primera secuencia de vacunación
de 6 de inyecciones y comprende 2 ó 3 dosis de péptido optimizado y
4 ó 3 dosis de péptido nativo. En el caso de enfermedades
duraderas, es preferible mantener el nivel de inmunidad obtenido
después de esta primo-vacunación mediante recuerdos
regulares. Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante inyecciones
practicadas cada 3 a 6 meses. Por lo tanto, también son parte de la
presente descripción kits complementarios, que comprenden al menos
2 dosis y hasta 40 ó 50 dosis de péptido nativo. Alternativamente,
el kit de vacunación puede comprender de 2 a 3 dosis de péptido
optimizado y de 3 a 40 o hasta 50 dosis de péptido nativo. Por
supuesto, dichos péptidos nativo y optimizado presentes en el kit
son como se ha descrito anteriormente.
Cada dosis comprende entre 0,5 y 10 mg de
péptido, preferiblemente de 1 a 5 mg. En una realización preferida,
cada dosis se formula para inyección subcutánea. Por ejemplo, cada
dosis se puede formular en 0,3 a 1,5 ml de una emulsión de solución
acuosa emulsionada con Montanide, usado como un adyuvante. El
especialista puede seleccionar cualquier otro adyuvante o
adyuvantes en lugar de (o además de) Montanide. En una realización
particular, las dosis están en forma de una solución acuosa.
Alternativamente, las dosis pueden estar en forma de un péptido
liofilizado, para preparación improvisada de la solución líquida a
inyectar.
La invención se ilustra adicionalmente mediante
las siguientes figuras y ejemplos.
Figura 1: Células CD8 específicas de
TERT_{572Y} detectadas ex vivo en pacientes #1, #3, #8, #1
y #13. PBMC descongeladas recogidas de los pacientes #1, #8, #1 y
#13 antes de la vacunación y después de la segunda (#1, #8, #11) y
sexta (#13) inyección de vacuna se tiñeron con tetrámero
TERT_{572Y} marcado con PE, anti-CD8 marcado con
APC y anti-CD3 marcado con FITC. Se analizaron
células reguladas por CD3+.
Figura 2: Células CD8 específicas de
TERT_{572Y} detectadas después de estimulación in vitro de
PBMC de pacientes #6 y #18. Se cultivaron PBMC descongeladas de los
pacientes #6 y #18 en ausencia (no estimulado) o presencia
(estimulado) de TERT_{572Y} 10 \muM durante nueve días. Después,
las células se tiñeron y analizaron como se ha descrito en la
leyenda de la figura 1.
Figura 3: Desarrollo en el tiempo de respuestas
inmunes.
Figura 4: Análisis funcional de células CD8
específicas de TERT_{572Y} inducidas por vacunación
- A)
- PBMC del paciente #4, recogidas tres semanas después de la segunda inyección de vacuna, se estimularon in vitro con péptido TERT_{572Y} durante nueve días. Las células específicas de TERT_{572Y} se purificaron y amplificaron con PHA. Las células amplificadas se tiñeron con tetrámero TERT_{572Y} y mAb CD8.
- B)
- Células positivas a tetrámero TERT_{572Y} se estimularon con los péptidos TERT_{572Y} y FluM58 no pertinente durante 6 horas, después se tiñeron con anti-CD107a marcado con PE, se permeabilizaron con Saponina y se tiñeron con anti-IFN\gamma marcado con FITC para evaluar el lFN\gamma intracelular.
- C)
- Células positivas a tetrámero TERT_{572Y} se incubaron con N418 marcado con ^{51}Cr y células N418 transfectadas con TERT durante cuatro horas en un ensayo clásico de liberación de ^{51}Cr. Se indican las proporciones E/T.
- D)
- Células positivas a tetrámero TERT_{572Y} se incubaron con NA8 marcado con ^{51}Cr y células tumorales ME290 durante cuatro horas en un ensayo clásico de liberación de ^{51}Cr. Se indican las proporciones E/T.
\newpage
Ejemplo
1
Los pacientes con tumores malignos resistentes a
quimioterapia eran idóneos para el estudio. Otros criterios de
idoneidad fueron: enfermedad progresiva para la que no existía
ninguna otra opción terapéutica de beneficio probado; una
supervivencia esperada de al menos 6 meses; los pacientes tenían que
ser positivos para HLA-A*0201; de
18-75 años de edad, estado general (OMS) <2,
médula ósea adecuada (recuento absoluto de neutrófilos
\geq1500/mm^{3}; recuento absoluto de linfocitos
\geq1300/mm^{3}; plaquetas >100000/mm^{3}; Hgb >10
g/dl), función renal (creatinina <1,5 mg/dl) y hepática
(bilirrubina <1,5 veces el valor normal superior). Los pacientes
se excluyeron si habían recibido quimioterapia, radioterapia,
hormonoterapia, inmunoterapia o corticosteroides en el intervalo de
un mes antes de la participación en el estudio o si tenían una
inmunodeficiencia o enfermedad autoinmune conocida. El protocolo se
ha aprobado por el Comité Ético y Científico del Hospital
Universitario de Heraklion y la Administración Nacional de Fármacos
de Grecia. Todos los pacientes dieron un consentimiento informado
por escrito para participar en el estudio.
La vacuna consistía en los péptidos
TERT_{572Y} optimizado (YLFFYRKSV) y TERT_{572} nativo
(RLFFYRKSV) emulsionados en Montanide ISA51 (Seppic Inc, Francia).
Los péptidos vacunales se sintetizaron en la Facultad de Farmacia,
Universidad de Patras (Grecia) mediante química de Fmoc/Bu en fase
sólida. Los estudios de garantía de calidad incluyeron confirmación
de identidad, esterilidad y pureza (>95% para ambos péptidos). No
se observó disminución en pureza o concentración después de más de
dos años de almacenamiento a -80ºC. Cada péptido se preparó como un
polvo liofilizado para reconstitución y dilución en agua
estéril.
Los pacientes recibieron un total de seis
vacunaciones subcutáneas administradas cada 3 semanas. Los péptidos
en 0,5 ml de solución acuosa se emulsionaron con 0,5 ml de Montanide
ISA51 inmediatamente antes de ser inyectados. El péptido
TERT_{572Y} optimizado se usó para las primeras 2 vacunaciones y
el péptido TERT_{572} nativo, para las 4 vacunaciones restantes.
Se estudiaron cinco niveles de dosis de los péptidos; los niveles de
dosis incluyeron 2, 3, 4, 5 y 6 mg de ambos péptidos. Se
incorporaron tres pacientes en cada nivel de dosis. Se planeó que 3
pacientes adicionales participaran en el nivel de dosis en el que se
observara un acontecimiento de limitación de dosis. Cada paciente
recibió la misma dosis de péptido en las seis vacunaciones. No se
permitió otro tratamiento con posible actividad antitumoral, es
decir, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal o
administración de corticosteroides, durante el ciclo de
vacunación.
Antes de incorporarse en el estudio, todos los
pacientes se evaluaron por historial médico completo, examen físico
y hemograma completo con análisis bioquímico sérico diferencial y
mediciones basales de marcadores tumorales pertinentes. Además, la
enfermedad medible se determinó mediante procedimientos de formación
de imágenes convencionales (radiografía de tórax, ultrasonidos,
exploraciones por tomografía computarizada de tórax y abdomen,
formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) si está
indicado y gammagrafías óseas de cuerpo completo). La toxicidad
durante el protocolo de vacunación se evaluó repitiendo el hemograma
completo semanalmente y realizando el historial medico, examen
físico y análisis bioquímico sérico cada tres semanas antes de cada
inyección posterior durante el periodo de vacunación y cada mes
después de esto durante el seguimiento. Se evaluó y puntuó la
toxicidad usando los Criterios de Toxicidad Común del Instituto
Nacional del Cáncer (NCI) (Ajani, Welch et al 1990). La
toxicidad de limitación de dosis (DLT) se evaluó durante todo el
protocolo de vacunación y se definió como la aparición de
cualquiera de lo siguiente: toxicidad hematológica de grado 4;
neutropenia de grado 3-4 con fiebre > 38,2ºC;
toxicidad no hematológica de grado 3-4; y cualquier
retraso de tratamiento debido a toxicidad. El aumento de dosis se
interrumpió y se alcanzó el nivel de dosis de DLT si al menos el
50% de los pacientes tratados a ese nivel desarrollaron una DLT. El
nivel de dosis MTD se definió como el primer nivel por debajo del
nivel de dosis de DLT.
La respuesta al tratamiento se evaluó repitiendo
los estudios de formación de imágenes basales y mediciones de
marcador tumoral pertinente después de cada 2 vacunaciones o antes
si estaba indicado clínicamente. La respuesta al tratamiento se
puntuó como respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR),
enfermedad estable (SD) y enfermedad progresiva (PD) usando los
criterios convencionales de la OMS (Miller, Hoogstraten et
al. 1981). Las respuestas radiológicas se confirmaron mediante
un grupo independiente de radiólogos. Las CR y PR se tenían que
mantener durante un mínimo de 4 semanas. La duración de la respuesta
se midió desde la primera verificación de respuesta hasta la
progresión de la enfermedad. El tiempo hasta la progresión (TTP) se
determinó mediante el intervalo entre el inicio de la terapia hasta
la primera fecha en la que se verificó objetivamente la progresión
de enfermedad. La supervivencia global (OS) se midió desde la fecha
de incorporación en el estudio hasta la fecha de la muerte. El
tiempo de seguimiento se midió desde el día de la primera
administración de tratamiento hasta el último contacto o la muerte.
Las respuestas inmunes se examinaron antes de la primera inyección
y después de la segunda, cuarta y sexta inyección. Se recogieron
células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en cada punto de
tiempo y se congelaron.
T2 es un híbrido T/B humano mutante que carece
de moléculas TAP pero que expresa HLA-A*0201. Se
proporcionaron fibroblastos N418 positivos a
HLA-A*0201, células N418 transfectadas con TERT y
las líneas celulares de melanoma Na8 y Me290 por P. Romero (Ludwig
Institute for Cancer Research, Lausanne, Suiza).
Los péptidos restringidos por clase I usados
para estudios de laboratorio incluyeron TERT_{572} (RLFFYRKSV,
SEC ID Nº: 1), TERT_{572Y} (YLFFYRKSV, SEC ID Nº: 2) y FIuM_{58}
(GILGFVFTL, SEC ID Nº: 11), todos producidos por Epytop (Nimes,
Francia).
Se incubaron PBMC (3x10^{5} células/pocillo en
200 \mul) descongeladas en presencia de péptido TERT_{572Y} 10
\muM en medio completo (RPMI 1640 suplementado con suero AB humano
al 8%) en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadió IL2 a
una concentración final de 10 U/ml después de 48 h y 96 h. Se
incubaron las células a 37ºC en aire con CO_{2} al 5%. El día 9
de cultivo se combinaron las células de seis pocillos y se
analizaron para determinar la presencia de células CD8 específicas
de TERT_{572Y} por tinción de tetrámero TERT_{572Y}.
Las células se incubaron con tetrámero
TERT_{572Y} conjugado con PE (Proimmune Ltd, Oxford, RU) durante
30 min a temperatura ambiente y después con mAb
anti-CD8 conjugado con APC (BD Pharmingen.
Mississauga, Canadá) y anti-CD3 conjugado con FlTC
(BD Pharmingen, Mississauga, Canadá) durante 30 min a 4ºC. Las
células teñidas se analizaron por citometría de flujo (FACSCalibur,
BD Biosciences, Mountain View, CA).
Las PBMC se estimularon con TERT_{572Y} 10
\muM en presencia de 10 U/ml de IL2 durante 9 días. Las células
se marcaron con mAb anti-CD8 y tetrámero
TERT_{572Y} antes del aislamiento con un clasificador de células.
Las células clasificadas se estimularon con PHA (Difco) durante 14
días.
Se estimularon células T con células T2 cargadas
con péptido (10 \muM) en presencia de 20 \mug/ml de Brefeldina
A (Sigma, Oakville, Canadá). Seis horas después, se lavaron, se
tiñeron con mAb anti-CD107 conjugado con PE (BD
Pharmingen, Mississauga, Canadá) en PBS durante 25 minutos a 4ºC, se
volvieron a lavar y se fijaron con paraformaldehído al 4%. Las
células se permeabilizaron con PBS/Saponina al 0,2%/BSA al 0,5%
(Sigma) y se tiñeron con mAb anti-IFN\gamma
conjugado con APC (BD Pharmingen, Mississauga, Canadá) antes del
análisis por citometría de flujo (FACSCalibur, BD Biosciences,
Mountain View, CA).
Las células diana se marcaron con 100 \muCi de
^{51}Cr durante 90 min, se lavaron dos veces y se sembraron en
placas de fondo redondo de 96 pocillos (3x10^{3} células/pocillo
en 100 \mul de RPMl 1640 más suero fetal de ternero al 5%).
Después se añadieron células efectoras (100 \mul) a cada pocillo.
Después de 4 h se recogieron 100 \mul de sobrenadante y se midió
la radiactividad con un contador gamma. Se determinó el porcentaje
de lisis específica del siguiente modo: lisis = (liberación
experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima -
liberación espontánea) x 100.
Las características de los 19 pacientes
incluidos en el experimento se muestran en la Tabla 2. Todos excepto
un paciente (paciente #11) tenían cáncer de estadio IV con
múltiples metástasis, principalmente en los huesos, el hígado y el
pulmón. Todos tenían enfermedad activa y progresiva y habían
recibido varios tratamientos, principalmente quimioterapia, antes
de incorporarse al protocolo de vacunación. Tres pacientes se
incluyeron en los niveles de dosis de 2, 3, 4 y 5 mg de los
péptidos, mientras que siete pacientes recibieron la dosis de 6 mg.
Cinco pacientes se retiraron del protocolo después de la cuarta (#1,
#5, #14 y #19) o quinta (#18) inyección de vacuna debido a rápida
progresión de enfermedad. Los cinco pacientes murieron
posteriormente en el intervalo de seis meses desde la progresión de
la enfermedad. Los 14 pacientes restantes completaron el protocolo
de vacunación. La enfermedad se estabilizó en cuatro (29%) pacientes
(# 9, #11, #12 y #13) y continuaron progresando en 10 pacientes.
Los últimos 10 pacientes recibieron posteriormente quimioterapia y
seis de ellos todavía viven. Uno (paciente #11) de los 4 pacientes
cuya enfermedad se estabilizó durante 9 meses progresó
posteriormente, mientras que los demás tres pacientes todavía tienen
enfermedad estable (después de 12 meses para los pacientes #9 y #12
y 9 meses para el paciente #13) sin terapia adicional después del
final de la vacunación.
En total, después de un seguimiento medio de
10,7 meses (intervalo 4,4-27,6), nueve pacientes
murieron, todos debido a progresión de enfermedad. El tiempo medio
hasta la progresión del tumor fue 4,2 meses (intervalo
2,3-11,2) y la supervivencia global media, 15,2
meses (intervalo 4,4-27,6).
No se observó DLT a lo largo de todo el estudio
y, por lo tanto, no se ha alcanzado el nivel de dosis MTD (Tabla
3). Trece pacientes desarrollaron toxicidad de grado 1. Consistía en
reacción cutánea local (11 pacientes), anemia (6 pacientes),
trombocitopenia (2 pacientes), fatiga (1 paciente) y anorexia (1
paciente). Excepto por la reacción cutánea local, las demás
toxicidades estaban muy probablemente relacionadas con la enfermedad
en vez de con la vacunación. Las toxicidades de grado 1 aparecieron
de forma temprana en el ciclo de vacunación. Tres pacientes
desarrollaron toxicidad de grado Il que consistía en fatiga (3
pacientes), náuseas (2 pacientes) y anorexia (2 pacientes). En el
paciente #5 (NSCLC) aparecieron fatiga y náuseas después de la
tercera vacunación y desaparecieron dos semanas después sin ningún
tratamiento específico. En el paciente #10 (cáncer colorrectal) se
pensaba que la fatiga, las náuseas y la anorexia observadas después
de la tercera vacunación se debían a la enfermedad más que a la
vacunación. Este paciente desarrolló una obstrucción intestinal
mortal. El paciente #18 experimentó una progresión extremadamente
rápida de su enfermedad y, como consecuencia, se retiró del
protocolo después de la cuarta vacunación. Murió dos meses después.
Específicamente, no se observó ninguna toxicidad hematológica,
renal, gastrointestinal o hepática significativa aunque TERT se
expresa en estas células y tejidos normales. Los pacientes se
controlaron para toxicidad durante un promedio de 10,7 meses
(intervalo 4,4-27,6). Incluso después de finalizar
o interrumpir el programa de vacunación, se realizó un seguimiento
a los los pacientes mensualmente para determinar la aparición de
cualquier toxicidad retrasada. Sin embargo, no se observaron signos
u observaciones de toxicidad retardada.
Se detectaron células CD8^{+} específicas de
péptido en sangre periférica por triple tinción de PBMC con
tetrámero TERT_{572Y}, mAb anti-CD8 y
anti-CD3, tanto ex vivo como después de 9
días de estimulación in vitro con péptido TERT_{572Y}. En
un estudio preliminar, el tetrámero TERT_{572Y} marcó menos del
0,11% de células CD8 en siete donantes sanos
HLA-A*0201 (media 0,035 \pm 0,035, intervalo
0,0-0,11%) (datos no mostrados). El límite de
positividad para inmunidad específica, por lo tanto, se ajustó en el
0,14% (media + 3 DT). Se estudiaron respuestas inmunes en 14
pacientes vacunados (Tabla 4). Solamente un paciente (#2) no
consiguió responder a la vacuna. Se detectaron células específicas
de TERT_{572Y} ex vivo en cuatro (29%) pacientes (Figura
1). La inmunidad específica apareció después de la segunda inyección
en los pacientes #1, #8 y #11 y después de la sexta vacunación en
el paciente #13. Se debe señalar que, antes de la vacunación, el
tetrámero TERT_{572Y} marcó el 0,29%, 0,33% y 1,00% de células
CD8^{+} en los pacientes #1, #8 y #11 después de estimulación de
PBMC in vitro (Tabla 4). También se detectaron células
específicas de TERT_{572Y} en 9 pacientes (64%) después de
estimulación in vitro, 3 semanas después de la 2ª (#3, #4,
#5, #6, #12, #15 y #19) o la 4ª (#7 y #18) inyección. Los
resultados representativos (pacientes #6 y #18) se muestran en la
Figura 2. La respuesta inmune también se midió 3 y 14 meses después
del final del protocolo de vacunación en los pacientes #13 y #11,
respectivamente. En los dos pacientes se detectó más del 1,5% de
células CD8 positivas a tetrámero después de estimulación in
vitro de sus PBMC (Figura 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la funcionalidad de células
CD8^{+} específicas de TERT_{572Y},_{ }se clasificaron las
células positivas a tetrámero TERT_{572Y} de PBMC estimuladas
in vitro del paciente #4 (Figura 4A); se amplificaron con
PHA y se ensayaron para determinar su capacidad de responder
específicamente a péptido TERT_{572Y} y de inactivar células
tumorales que sobre-expresan TERT. Más del 90% de
las células amplificadas se marcaron con tetrámero TERT_{572Y}
(Figura 4A). Las células específicas de TERT_{572Y} purificadas
eran completamente funcionales, ya que producían IFN\gamma y
mostraron regulación positiva de CD107a después de activación con
péptido TERT_{572Y} (Figura 4B). Los LTC reconocieron TERT
endógeno e inactivaron específicamente fibroblastos N418
transfectados con TERT pero no los no transfectados (Figura 4C). Lo
que es aún más importante, los LTC inactivaron células tumorales
que sobre-expresan TERT (células Na8) pero no
células tumorales que expresan TERT a un nivel bajo (células ME290)
(Figura 4D).
Los objetivos del presente experimento clínico
fueron evaluar el perfil de toxicidad y probar el concepto de que
péptidos crípticos obtenidos de antígenos tumorales universales
pueden inducir inmunidad en pacientes con cáncer y, por lo tanto,
se pueden considerar para inmunoterapia de tumor. Los inventores
usaron el péptido críptico TERT_{572}, que se presenta por
HLA-A*0201 y se obtiene de TERT, un antígeno tumoral
universal sobre-expresado por el 85% de los
tumores. La inmunogenicidad se ha mejorado sustituyendo el primer
aminoácido por una tirosina (Tourdot, Scardino et al. 2000).
Los resultados mostraron que la vacunación con TERT_{572Y} de
pacientes con cáncer avanzado estimula LTC específicos que son
completamente funcionales y son capaces de inactivar células
tumorales que sobre-expresan TERT in vitro.
La vacunación se toleró bien y no parecía inducir autoinmunidad
frente a tejidos normales que expresan TERT. Estos resultados
ofrecen la primera confirmación in vivo humana de que
péptidos crípticos optimizados son buenos candidatos para
inmunoterapia de tumor.
Los antígenos tumorales son proteínas propias no
mutadas también expresadas por tejidos normales, que incluyen el
timo, y que están implicadas en la inducción de tolerancia. La
tolerancia, el proceso por el que LTC, principalmente los de alta
avidez, se purgan del repertorio de células T, es una barrera
principal que obstaculiza el desarrollo de respuestas de células T
antitumorales eficaces. Sin embargo, la tolerancia principalmente
conforma el repertorio de células T específico para péptidos
dominantes en vez de para crípticos (Cibotti, Kanellopoulos et
al. 1992; Moudgil y Sercarz 1994). Recientemente, usando un
modelo de ratón humanizado, se mostró que la vacunación con dos
péptidos crípticos obtenidos de TERT murino (TERT_{572Y} y
TERT_{988Y}) reclutó LTC de alta avidez capaces de suscitar
inmunidad antitumoral potente (Gross, Graff-Dubois
et al. 2004). En el presente estudio clínico, más del 90% de
los pacientes vacunados desarrollaron células T específicas capaces
de inactivar células tumorales que sobre-expresan
TERT. Por el contrario, solamente el 50% de los pacientes tratados
con el péptido dominante TERT_{540} emulsionado en Montanide
respondieron a la vacuna (Parkhurst, Riley et al. 2004). Sin
embargo, el procesamiento natural del TERT_{540} dominante
descrito inicialmente (Vonderheide, Hahn et al. 1999; Minev,
Hipp et al. 2000; Vonderheide, Domchek et al. 2004) no
se confirmó en estudios más recientes (Ayyoub, Migliaccio et
al. 2001; Parkhurst, Riley et al. 2004), lo que sugiere
que posiblemente TERT_{540} no pertenece al panel inmunológico.
Dada esta ambigüedad con respecto a la presentación del péptido
TERT_{540} dominante, una comparación aleatorizada directa con el
péptido críptico podría producir resultados que serían muy
difíciles de interpretar.
La tasa de respuesta a vacuna en los pacientes
en el presente estudio es mayor que la obtenida en los
aproximadamente cincuenta estudios clínicos de vacunación de tumor
publicados hasta la fecha (Pullarkat, Lee et al. 2003;
Slingluff, Petroni et al. 2003). También se debe señalar que
prácticamente todos los estudios clínicos previos que muestran
altas tasas de respuesta inmune implicaron a pacientes con
enfermedad mínima y estado general excelente (Disis, Gooley et
al. 2002; Pullarkat, Lee et al. 2003; Disis, Schiffman
et al. 2004; Vonderheide, Domchek et al. 2004).
Scheibenbogen et al (Scheibenbogen, Lee et al. 1997)
demostraron que la inmunorreactividad en pacientes con melanoma
estaba correlacionada con la remisión de enfermedad. Por el
contrario, en el presente estudio, todos los pacientes tenían
enfermedad de estadio terminal.
No se observó ninguna correlación entre la
magnitud de la respuesta inmune y la dosis de péptido administrado.
Esto concuerda con datos recientes que indican que respuestas
inmunes a vacunas Her2/neu no dependían de la dosis de vacuna
(Disis, Schiffman et al. 2004). No se observó correlación
entre la dosis de vacuna y el intervalo de tiempo requerido para
que surgiera una respuesta detectable. Los 13 pacientes que
respondieron tenían LTC específicos detectables entre la 2ª y la 4ª
inyección de vacuna. La inducción rápida de inmunidad puede ser
importante en este entorno, especialmente para pacientes con
neoplasias que progresan rápidamente.
El fundamento para el uso de péptido
TERT_{572} nativo para la 3ª a 6ª inyección de vacuna fue
seleccionar, entre las células T reclutadas por el TERT_{572Y}
optimizado, aquellas con la mayor especificidad por TERT_{572}
presentados por células tumorales. De hecho, Clay et al
(Clay, Custer et al. 1999) han demostrado que la vacunación
de pacientes con melanoma con gp100_{209M} optimizado amplificó
células T que ya no eran capaces de reconocer el péptido
gp100_{209} nativo o células de melanoma que expresan gp100. Los
anteriores resultados muestran que la inyección del péptido nativo
puede mantener la respuesta inmune iniciada por el péptido
optimizado. Además, la persistencia de la respuesta inmune más de un
año después del final de la vacunación sugiere que el péptido
nativo presentado sobre la superficie de células tumorales puede
mantener la respuesta inmune específica por sí mismo. El hito de la
inmunidad antitumoral in vivo es la autoinmunidad. La
autoinmunidad es aceptable cuando se dirige a células y tejidos
normales no esenciales tales como melanocitos, pero puede impedir
el desarrollo de vacunas cuando se dirige a células esenciales tales
como precursores hematopoyéticos. Aunque TERT se expresa por
células madre hematopoyéticas, intestino, timo y células B y T
activadas (Ramakrishnan, Eppenberger et al. 1998; Liu,
Schoonmaker et al. 1999), ninguno de los pacientes mostró
signos de autoinmunidad incluso 24 meses después del final de la
vacunación. Esto confirma los resultados previos obtenidos en
ratones HHD transgénicos HLA-A*0201 vacunados con
péptido TERT_{572Y}, que también es parte de TERT murino (Gross,
Graff-Dubois et al. 2004). Los ratones HHD
vacunados desarrollaron inmunidad antitumoral sin signos de
autoinmunidad. Además, los LTC específicos de TERT_{572Y}
inactivaron células tumorales pero no células B activadas. Una
posible explicación es que la expresión de TERT es insuficiente en
células normales (al contrario que en células tumorales) para
permitir la presentación de péptidos de baja afinidad como
TERT_{572}.
TERT_{572}.
La toxicidad observada en el presente estudio
fue esencialmente mínima y, con la excepción de reacciones cutáneas
transitorias provocadas por el adyuvante Montanide, todas las demás
toxicidades leves también se podrían atribuir a la enfermedad
subyacente. Dadas las limitaciones del pequeño número de pacientes
incluidos en este experimento y el seguimiento relativamente corto
debido a la enfermedad avanzada, se puede concluir que este programa
de vacunación carece de cualquier toxicidad aguda principal y a
corto plazo. Sin embargo, las toxicidades a largo plazo se tendrán
que evaluar en pacientes con mejor pronóstico que más probablemente
se curarán de su enfermedad
neoplásica.
neoplásica.
Por motivos éticos, este estudio implicó
pacientes con cáncer de estadio terminal, que no son los mejores
candidatos para inmunoterapia tumoral. Ahora generalmente se está de
acuerdo en que es mejor que la inmunoterapia se administre a
pacientes con enfermedad residual mínima y el objetivo debe ser
prevenir recidivas en vez de curar cáncer avanzado. La incapacidad
de las vacunas de erradicar tumores crecientes de forma activa se
ha demostrado claramente en modelos animales (Cheever y Chen 1997).
Aunque no se observó actividad antitumoral clínica mediante
reducción de tumor en este grupo muy pretratado de pacientes, cuatro
pacientes mostraron estabilización de enfermedad duradera en este
experimento de fase 1. Estos pacientes tenían previamente enfermedad
progresiva y desarrollaron LTC específicos de TERT que se podrían
detectar en su sangre incluso meses después de finalizar el
programa de vacunación. Es interesante que dos de estos pacientes
(#9 y #13), ambos con carcinoma de células renales, en el pasado se
hubieran tratado exitosamente con IL2 o IFN\alpha, confirmando la
sensibilidad de este cáncer a inmunoterapia. Por el contrario,
ninguno de los 11 pacientes con cáncer renal que se vacunaron con
el péptido TERT_{540} dominante tuvo ninguna respuesta clínica
objetiva, incluso cuando desarrollaron una respuesta inmune
específica de péptido (Parkhurst, Riley et al. 2004).
En conclusión, este estudio demuestra que la
vacunación de pacientes con cáncer avanzado con el péptido
TERT_{572Y} críptico optimizado es segura e induce una inmunidad
antitumoral en más del 90% de los pacientes. Ésta es la primera
confirmación clínica de que los péptidos crípticos son candidatos
prometedores para inmunoterapia de cáncer.
\newpage
Ejemplo
2
Los péptidos TERT_{988Y} (YLQVNSLQTV, SEC ID
Nº: 4), TERT_{988} (DLQVNSLQTV, SEC ID Nº: 3),
MAGE-A_{248V9} (YLEYRQVPV, SEC ID Nº: 6) y
MAGE-A_{248D9} (YLEYRQVPD, SEC ID Nº: 5) se han
producido por Epytop (Nîmes, Francia).
Los ratones HHD transgénicos
HLA-A*0201 y las células tumorales RMAS/HHD murinas
se han descrito previamente (Pascolo, Bervas et al.
1997).
A ratones HHD se inyectaron por vía subcutánea
100 \mug de péptidos nonaméricos emulsionados en adyuvante
incompleto de Freund (IFA) en presencia de 150 \mug del epítopo de
T auxiliar HBVcore128 restringido por I-Ab. Se
estimularon in vitro células esplénicas (5x10^{7} células
en 10 ml) de ratones HHD inmunizados con péptido (10 \muM) en
RPMI1640+FCS al 10% durante cinco días. Las líneas de LTC se
establecieron por re-estimulación semanal in
vitro con
células esplénicas irradiadas en presencia de péptido y 50 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, CA).
células esplénicas irradiadas en presencia de péptido y 50 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, CA).
Se usaron células RMAS/HHD murinas como dianas
para citotoxicidad como se ha descrito (Tourdot, Scardino et
al. 2000). En resumen, 2,5x10^{3} dianas marcadas con
^{51}Cr se pulsaron con dosis crecientes
(0,00001-10 \muM) de péptidos a 37ºC durante 60
min. Después se añadieron células efectoras en 100 \mul y se
incubaron a 37ºC durante 4 horas. Después de la incubación se
recogieron 100 \mul de sobrenadante y se midió la radiactividad
en un contador gamma. La lisis específica se determinó como:
Lisis = (Liberación Experimental - Liberación
Espontánea)/(Liberación Máxima - Liberación espontánea). La avidez
de LTC se define como la concentración de péptido que proporciona la
mitad de la lisis máxima. Por tanto, cuanto menor es la avidez
medida (en nM), mayor es la avidez de los LTC.
Se vacunaron ratones HHD con 100 \mug de
péptido emulsionado en IFA en presencia de 150 \mug del epítopo
HBVcore128 restringido por 1Ab una vez y después de nuevo dos
semanas después. Una semana después de la segunda vacunación se
expusieron por vía subcutánea a 2x10^{4} células EL4/HHD. La
supervivencia se registró cada dos días.
Se inmunizaron ratones HHD con el péptido
TERT_{988Y} críptico optimizado. Once días después, las células
esplénicas de ratones vacunados se combinaron y se estimularon in
vitro de forma seriada con 10 \muM de TERT_{988Y} o los
péptidos TERT_{988} crípticos nativos en presencia de 50 UI/ml de
IL2. Las estimulaciones se repitieron cada semana. Después de la
primera, tercera y sexta estimulación in vitro, las líneas de
LTC se ensayaron para determinar su avidez por el péptido
TERT_{988} nativo en un ensayo clásico de citotoxicidad de
liberación de ^{51}Cr (Tabla 5).
Se inmunizaron ratones HHD con el péptido
MAGE-A_{248V9} optimizado, correspondiente al
MAGE-A_{248D9} críptico (ambos descritos en el
documento WO03083124). Once días después, las células esplénicas de
ratones vacunados se combinaron y se estimularon in vitro de
forma seriada con 10 \muM con MAGE-A_{248V9} o
los péptidos MAGE-A_{248D9} crípticos nativos en
presencia de 50 UI/ml de IL2. Las estimulaciones se repitieron cada
semana. Después de la primera, tercera y sexta estimulación in
vitro, las líneas de LTC se ensayaron para determinar su avidez
por el péptido MAGE-A_{248D9} nativo en un ensayo
clásico de citotoxicidad de liberación de ^{51}Cr (Tabla 6).
La vacunación con péptidos crípticos optimizados
recluta un repertorio de LTC que contiene células con alta avidez
por el péptido críptico nativo. Estos LTC de alta avidez se pueden
seleccionar in vitro y amplificar por estimulación con el
péptido nativo en vez de con el críptico optimizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se usaron los mismos materiales y métodos que en
el Ejemplo 2.
Se vacunaron ratones HHD con el péptido
TERT_{572Y} críptico optimizado como se ha descrito anteriormente.
Quince días más tarde, se reforzaron con el mismo péptido
optimizado o con el TERT_{572} críptico nativo. Siete días
después del refuerzo, sus células esplénicas se estimularon in
vitro con 10 \muM del TERT_{572}. Los LTC generados después
de un ciclo de estimulación in vitro se ensayaron para
determinar su avidez por TERT_{572}. La Tabla 7 presenta
resultados de seis ratones individuales.
La sensibilización in vivo con los
péptidos crípticos optimizados recluta un repertorio que contiene
LTC con alta avidez por el péptido nativo. Estos LTC de alta avidez
se pueden seleccionar in vivo y amplificar por refuerzo con
el péptido nativo en vez de con el optimizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se usaron los mismos materiales y métodos que en
el Ejemplo 2.
También se usó un péptido adicional, denominado
gp100_{154}: KTWGQYWQV (SEC ID Nº: 8).
Se vacunaron ratones HHD con los péptidos
TERT_{572Y} y TERT_{988Y} crípticos optimizados y quince días
después se reforzaron con el mismo péptido optimizado o con el
correspondiente péptido críptico nativo. Diez días después del
refuerzo, los ratones se expusieron a células tumorales EL4/HHD y se
controlaron para crecimiento de tumor y supervivencia. Los ratones
sensibilizados y reforzados con el péptido gp100_{154} se usaron
como controles negativos (Tabla 8). El 100% de los ratones de
control murieron el día 43 post-exposición. El 17%
de los ratones sensibilizados y reforzados con los péptidos
optimizados y el 50% de los ratones sensibilizados con el péptido
optimizado y reforzados con el nativo estaban definitivamente
protegidos contra tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
La inmunidad contra tumor es mucho más eficaz en
ratones sensibilizados con el péptido optimizado y reforzados con
el nativo que en ratones sensibilizados y reforzados con el mismo
péptido optimizado.
\vskip1.000000\baselineskip
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<110> VAXON BIOTECH
\hskip1cmKOSMATOPOULUS, Kostantinos (Kostas)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE PÉPTIDOS NATIVOS Y SUS
DERIVADOS OPTIMIZADOS PARA VACUNACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> VMA/bv1788/1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 05290984.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
09-05-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> TERT-572
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
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<210> 2
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> TERT-572Y1
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<400> 2
\hskip1cm
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<210> 3
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> TERT-988
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
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<210> 4
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> TERT-988Y1
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<400> 4
\hskip1cm
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<210> 5
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223>
MAGE-A-248D9
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<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223>
MAGE-A-248V9
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<400> 6
\hskip1cm
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<210> 7
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223>
MAGE-A-248G9
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<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Gp100-154
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Gp100-154Y1
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Gp100-159M155
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<400> 10
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<210> 11
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<213> Artificial
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<220>
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<223> FluM-58
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<400> 11
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> FluM-58Y1
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<210> 13
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<213> Artificial
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<220>
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<223> HIVgag-76
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<210> 14
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> HIVgag-76Y1
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<210> 15
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> HBVpol-575
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<400> 15
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> HBVpol575Y1
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<210> 17
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> HBVpol-765
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<210> 18
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<223> HBVpol-765Y1
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223>
Mart-1-27
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<400> 19
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<210> 20
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223>
Mart-1-27Y1
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<400> 20
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<220>
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<223>
Mart-1-26
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Mart-1-26L27
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<212> PRT
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<223>
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<223>
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<223>
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<220>
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<223>
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<223>
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<220>
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<212> PRT
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<223>
HER-2/neu-48
\newpage
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<212> PRT
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<223>
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<223>
HER-2/neu-773
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<223>
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<223>
HER-2/neu-5
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<212> PRT
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<223>
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<220>
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<223>
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<223>
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<223>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
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<220>
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<223>
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\hskip1cm
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HER-2/neu-402
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<223>
HER-2/neu-902Y1
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\hskip1cm
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<223>
HER-2/neu-391
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<213> Artificial
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<223>
HER-2/neu-391Y1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
HER-2/neu-971
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
HER-2/neu-971Y1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HBvpo1-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HBVpol-28Y1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HBVpol-594
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HBVpol-599Y1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HBVpol-985
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HBVpol-985Y1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> EphA2-61
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> EphA2-61Y1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER2-911
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>70
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER2-911Y1V10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER4-911
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER1-911
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER2-722
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER2-722Y1V9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER3-722
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER4-722
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER1-722
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER2-845
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER-845Y1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER3-845
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER2-904
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER-904Y1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER4-904
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER2-933
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER-933Y1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER1-933
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER2-945
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER3-945
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER-995Y1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER4-945
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER1-945
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\hskip1cm
Claims (14)
1. Uso de un péptido nativo, para producir una
composición medicinal para mantener la respuesta inmune de LTC
iniciada por su péptido optimizado afín, en el que dicho péptido
nativo es un péptido críptico y dicho péptido optimizado afín es un
péptido obtenido por una o varias sustituciones de aminoácidos en
dicho péptido nativo, dando como resultado dichas modificaciones
una mayor afinidad por la molécula de MHC y/o una mayor estabilidad
del complejo de MHC/péptido.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que
dicho péptido nativo es de un antígeno tumoral o de un antígeno
viral.
3. El uso de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el péptido nativo y el péptido
optimizado se presentan por HLA A2 y el péptido optimizado se
produce por la sustitución del aminoácido N-terminal
de dicho péptido nativo con un resto de tirosina.
4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3, en el que los péptidos nativo y su optimizado afín se
seleccionan entre los siguientes pares de peptidos: [TERT_{572}
(SEC ID Nº: 1), TERT_{572Y1} (SEC ID Nº: 2)]; [TERT_{988} (SEC
ID Nº: 3), TERT_{988Y1} (SEC ID Nº: 4)];
[MAGE-A_{248D9} (SEC ID Nº: 5),
MAGE-A_{248V9} (SEC ID Nº: 6)];
[MAGE-A_{248G9} (SEC ID Nº: 7),
MAGE-A_{248V9} (SEC ID Nº: 6)]; [HBVpol_{575}
(SEC ID Nº: 15), HBVpol_{575Y1} (SEC ID Nº: 16)]; [HBVpol_{765}
(SEC ID Nº: 17), HBVpo_{765Y1} (SEC ID Nº: 18)]; [Gp100_{177}
(SEC ID Nº: 23), Gp100_{177Y}, (SEC ID Nº: 24)]; [Gp100_{178}
(SEC ID Nº: 25), Gp100_{178Y1} (SEC ID Nº: 26)]; [Gp100_{570}
(SEC ID Nº: 27), Gp100_{570Y1} (SEC ID Nº: 28)];
[HER-2/neu_{799} (SEC ID Nº: 36),
HER-2/neu_{799Y1} (SEC ID Nº: 37)];
[HER-2/neu_{48} (SEC ID Nº: 42),
HER-2/neu_{48Y1} (SEC ID Nº: 43)];
[HER-2/neu_{773} (SEC ID Nº: 44),
HER-2/neu_{773Y1} (SEC ID Nº: 45)];
[HER-2/neu_{851} (SEC ID Nº: 48),
HER-2/neu_{851Y} (SEC ID Nº: 49)];
[HER-2/neu_{661} (SEC ID Nº: 50),
HER-2/neu_{66Y1} (SEC ID Nº: 51)];
[HER-2/neu_{650} (SEC ID Nº: 52),
HER-2/neu_{650Y1} (SEC ID Nº: 53)];
[HER-2/neu_{466} (SEC ID Nº: 54),
HER-2/neu_{466Y1} (SEC ID Nº: 55)];
[HER-2/neu_{402} (SEC ID Nº: 56),
HER-2/neu_{402Y1} (SEC ID Nº: 57)];
[HER-2/neu_{391} (SEC ID Nº: 58),
HER-2/neu_{391Y1}) (SEC ID Nº: 59)];
[HER-2/neu_{971} (SEC ID Nº: 60),
HER-2/neu_{971Y1} (SEC ID Nº: 61)]; [HBVpol_{28}
(SEC ID Nº: 62), HBVpol_{28Y1} (SEC ID Nº: 63)]; [HBVpol_{594}
(SEC ID Nº: 64), HBVpol_{594Y1} (SEC ID Nº: 65)]; [HBVpol_{985}
(SEC ID Nº: 66), HBVpol_{985Y1} (SEC ID Nº: 67)]; [EphA2_{61}
(SEC ID Nº: 68), EphA2_{61Y1} (SEC ID Nº: 69)]; [HER2_{911}
(SEC ID Nº: 70), HER_{911Y1V10} (SEC ID Nº: 71)]; [HER4_{911}
(SEC ID Nº: 72), HER_{911Y1V10} (SEC ID Nº: 71)]; [HER1_{911}
(SEC ID Nº: 73), HER_{911Y1V10} (SEC ID Nº: 71)]; [HER2_{722}
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(SEC ID Nº: 76), HER_{722Y1V9} (SEC ID Nº: 75)]; [HER4_{722}
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(SEC ID Nº: 79), HER_{845Y1} (SEC ID Nº: 80)]; [HER3_{845} (SEC
ID Nº: 81), HER_{845Y1} (SEC ID Nº: 80)]; [HER2_{904} (SEC ID
Nº: 82), HER_{904Y1} (SEC ID Nº: 83)]; [HER4_{904} (SEC ID Nº:
84), HER_{904Y1} (SEC ID Nº: 83)]; [HER2_{933} (SEC ID Nº: 85),
HER_{933Y1} (SEC ID Nº: 86)]; [HER1_{933} (SEC ID Nº: 87),
HER_{933Y1}, (SEC ID Nº: 86)]; [HER2_{945} (SEC ID Nº: 88),
HER_{945Y1} (SEC ID Nº: 90)]; [HER3_{945} (SEC ID Nº: 89),
HER_{945Y1} (SEC ID Nº: 90)]; [HER4_{945} (SEC ID Nº: 91),
HER_{945Y1}, (SEC ID Nº: 90)]; y [HER1_{945} (SEC ID Nº: 92),
HER_{945Y1} (SEC ID Nº: 90)].
5. El uso de las reivindicaciones 1 a 4, en el
que el péptido críptico nativo es TERT_{572} (RLFFYRKSV, SEC ID
Nº: 1) y su péptido optimizado afín es TERT_{572Y} (YLFFYRKSV, SEC
ID Nº: 2).
6. El uso de las reivindicaciones 1 a 4, en el
que el péptido críptico nativo es TERT_{988} (DLQVNSLQTV, SEC ID
Nº: 3) y su péptido optimizado afín es TERT_{988Y} (YLQVNSLQTV,
SEC ID Nº: 4).
7. El uso de las reivindicaciones 1, 2, y 4, en
el que el péptido críptico nativo es
MAGE-A_{248D9} (YLEYRQVPD, SEC ID Nº: 5) o
MAGE-A_{248G9} (YLEYRQVPG, SEC ID Nº: 7) y su
péptido optimizado afín es MAGE-A_{248V9}
(YLEYRQVPV, SEC ID Nº: 6).
8. Un proceso para obtener in vitro LTC
que tienen alta avidez por un péptido nativo, que comprende una
etapa de estimular LTC presentes en una muestra biológica de un
paciente que se ha inmunizado con un péptido inmunógeno optimizado
obtenido de dicho péptido nativo, en el que dicha estimulación se
realiza con el péptido nativo.
9. El proceso de la reivindicación 8, en el que
dichos péptidos nativo y optimizado son como se describe en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Un kit de vacunación, que comprende al menos
una dosis de un péptido nativo y al menos una dosis de un péptido
inmunógeno optimizado obtenido de dicho péptido nativo.
11. El kit de vacunación de la reivindicación
10, que comprende 2 ó 3 dosis de péptido optimizado y 3, 4, 5, 6 o
hasta 50 dosis de péptido nativo.
12. El kit de vacunación de la reclamación 10 o
la reivindicación 11, en el que cada dosis comprende de 1 a 5 mg de
péptido.
13. El kit de vacunación de cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en el que dichas dosis de vacunación se
formulan para inyección subcutánea.
14. El kit de vacunación de cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en el que dichos péptidos nativo y
optimizado son como se describe en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
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