WO2023140724A1 - Composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, su proceso de obtención y su uso como agente antitumoral - Google Patents

Composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, su proceso de obtención y su uso como agente antitumoral Download PDF

Info

Publication number
WO2023140724A1
WO2023140724A1 PCT/MX2023/050005 MX2023050005W WO2023140724A1 WO 2023140724 A1 WO2023140724 A1 WO 2023140724A1 MX 2023050005 W MX2023050005 W MX 2023050005W WO 2023140724 A1 WO2023140724 A1 WO 2023140724A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
breast cancer
icrp
cancer cells
lct
Prior art date
Application number
PCT/MX2023/050005
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
María Cristina RODRÍGUEZ PADILLA
Ana Carolina Martínez Torres
Kenny Misael CALVILLO RODRÍGUEZ
Alejandra REYES RUIZ
Original Assignee
Universidad Autónoma De Nuevo León
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad Autónoma De Nuevo León filed Critical Universidad Autónoma De Nuevo León
Publication of WO2023140724A1 publication Critical patent/WO2023140724A1/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the object of the present invention is to provide a composition based on a tumor lysate of breast cancer cells treated with a dialyzable extract of bovine spleen leukocytes (ICRP), its production process and the use of said composition as an antitumor agent, for the treatment and prevention of cancer, especially breast cancer, this formulation is used as a vaccine for the treatment and prevention of breast cancer, without the need for adjuvants to exert its effect.
  • ICRP bovine spleen leukocytes
  • the present invention belongs to the field of preparation or medicinal compositions especially of antineoplastic or antitumor agents.
  • TCL tumor cell lysates
  • DAMPs damage-associated molecular patterns present in the lysates interact with dendritic cell (DC) receptors (CD91, Toll-like receptor 4, punnergic receptors, among others), promoting their maturation and antitumor activity (Chiang, Cheryl, Coukos, G., & Kandalaft, L. (2015). “Whole Tumor Antigen Vaccines: Where Are We?” Vaccines 3 (2): 344-72).
  • DC dendritic cell
  • LCTs can be used to induce an immunogenic response of DCs against multiple tumor antigens, triggering a polyclonal tumor-specific T cell response (Chiang., Lai-Lai, C., Kandalaft, L., Tanyi, J., Hagemann, A., Motz, G., Svoronos, N., & Montone, K. (2013). “A Dendritic Cell Vaccine Pulsed with Autologous Hypochlo rous Acid- Oxidized Ovarian Cancer Lysate Primes Effective Broad Antitumor Immunity: From Bench to Bedside.” Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research 19 (17): 4801-15).
  • TAA tumor-associated
  • IMMUNEPOTENT CRP is a dialyzable extract of bovine leukocytes (DLE) obtained from ruptured spleen ((Available in and https://biomedres.us/pdfs/BJSTR.MS.ID.002509.pdf).
  • DLE bovine leukocytes
  • ICRP is a mixture of substances with biological activity, with multiple applications for human health. Today, ICRP has been shown to exert immunomodulatory and anticancer functions.
  • ICRP improved survival (90%) in BALB/c mice with endotoxic shock induced by lipopolysacchards (LPS), decreasing the levels of IL-10, IL-6, and TNF-a in serum (Franco, M. (2004). “Bovine Dialyzable Leukocyte Extract Protects against LPS-Induced, Mur ine Endotoxic Shock.” International Immunopharmacology 4(13): 1577-86).
  • ICRP decreased NO, TNF- ⁇ and IL-6 levels, but increased IL-10 production in LPS-stimulated muhnian peritoneal macrophages.
  • Bovine Dialyzable Leukocyte Extract Modulates the Nitric Oxide and Proinflammatory Cytokine Production in Lipopolysacchahde-Stimulated Murine Peritoneal Macrophages in Vitro.” Journal of Medicinal Food 8(1): 20-26.).
  • ICRP increased the activity of endogenous antioxidants (catalase, glutathione peroxidase, and superoxide dismutase), and decreased cyclooxygenase-2 activity, PGD2, NO, and TNF-a production (Franco, M. (2011). “Anti-Inflammatory and Antioxidant Effects of IMM UNEPOTENT CRP in Lipopolysaccharide (LPS)-Stimulated Human Macrophages.” African Journal of Microbiology Research 5(22): 3726-36).
  • CTLs tumor cell lysates
  • Figure 1 Shows representative dot plots (A) and quantifications (B) of cell death assessed by flow cytometry using Annexin-V and Pl staining in MCF-7, MDA-MB-231 and 4T1 cells treated with different concentrations of ICRP for 24 hours.
  • Figure 2 Shows graphs of cell death by staining with Annexin-V and Pl in MCF-7, MDA-MB-231 and 4T1 cells in the absence (control, white bar) or presence (black bar) of ICRP CC50 for 24 h without co-treatment (-) or co-treated with N- acetylcysteine (NAC), QVD-OPH (QVD), Necrostatin-1 (NEC-1) or Spautin-1 (SP-1).
  • Graphs represent means ( ⁇ SD) of triplicates from at least three independent experiments.
  • Figure 3 Shows graphs where ICRP induces A) loss of mitochondrial membrane potential evaluated by TMRE staining in the MCF-7, MDA-MB-231 and 4T1 lines. B) ROS levels evaluated by staining with DCFDA in the MCF-7, MDA-MB-231 and 4T1 lines. C) Formation of autophagosomes in the lines MCF-7, MDA-MB-231 and 4T1. For all items, absence (control, white bar) or presence (black bar) of ICRP CCso.
  • FIG. 4 Representative immunofluorescence images of Cyto-ID staining in MCF-7, MDA-MB-231 and 4T1 cells untreated (control) or treated with ICRP CCso for 24 h. Nuclei were stained blue with Hoechst 33342 stain.
  • Figure 5 Representative histograms of staining for P-elF2a (grey) and isotype IgG antibodies (dotted) in cancer cells untreated (negative control) or treated with ICRP CC50 for 18 h or 1 pM Thaps for 2 h (positive control). Plots are quantification of P-elF2a staining in controls and cancer cells treated with ICRP or Thaps.
  • FIG. 6 Shows graphs of CRT exposure in cancer cells untreated (CTR, negative control, in gray) or treated with ICRP CC50 (in black), or EPI CC50 (positive control, in red) for 24 hours.
  • FIG. 7 Shows graphs of HSP70 exposure in cancer cells untreated (CTR, negative control, in gray) or treated with ICRP CC50 (in black), or EPI CC50 (positive control, in red) for 24 hours.
  • FIG. 8 Shows graphs of HSP90 exposure in cancer cells untreated (CTR, negative control, in gray) or treated with ICRP CC50 (in black), or EPI CC50 (positive control, in red) for 24 hours.
  • Figure 9 shows graphics of a) Quantification of the release of ATP by detection of bioluminescence in the supernatant of cancer cells in absence (negative control) or presence of ICRP CC50 or EPI CC50 for 24 Hy b) Quantification of the release of HMGB1 evaluated by ELISA in the supernatants of cancer cells in absence (negative control) or presence of ICRP cc. C50 for 24 Hy 48 h.
  • Graphs represent the means ( ⁇ SD) of triplicates from at least three independent experiments.
  • Figure 10 Shows graphs of prophylactic vaccination with ICRP-LCT preventing tumor establishment in BALB/c mice.
  • mice were inoculated on the left flank sc with PBS, 1.5x10 6 4T1 cells killed by ICRP treatment (ICRP-LCT), 1.5x10 6 4T1 cells killed by EPI treatment (EPI-LCT) or 1.5x10 6 4T1 cells killed by CPA treatment (CPA-LCT).
  • ICRP-LCT ICRP treatment
  • EPI-LCT EPI treatment
  • CPA-LCT CPA treatment
  • Figure 11 shows graphs in which ICRP-LCT therapeutic treatment induces tumor regression in tumor-bearing BALB/c mice.
  • FIG. 12 Shows graphs in which prophylactic treatment with ICRP-LCT induces long-term antitumor memory in BALB/c mice.
  • FIG. 13 Shows graphs in which ICRP-LCT treatment induces long-term antitumor memory in BALB/c mice.
  • Prophylactic vaccination with ICRP-LCT induces long-term antitumor memory, modulates tumor establishment, DC maturation, distribution T-cell and splenocyte-mediated tumor cell-directed cytotoxicity.
  • C Kaplan-Meier graph with the percentage of survival of the treated mice.
  • D Histology of lymph nodes from naive mice and ICRP-LCT stained with H&E.
  • E Percentage of CD11 c and CD86 positive cells in TDLN from na ⁇ ve mice and ICRP-LCT.
  • F Proportion of CD3, CD4 and CD8 positive cells in TDLN (F) and peripheral blood (G) from naive and ICRP-LCT mice.
  • H Histology of the tumor inoculation site in na ⁇ ve mice and ICRP-LCT stained with H&E. Normal tissue (white arrows), tumor cells (red arrows), mitotic cells (black arrows), lymphocytes (blue arrows), and polymorphonuclear cells (green arrows).
  • I Proportion of CD3, CD4 and CD8 positive cells at the tumor inoculation site of naive or ICRP-LCT mice.
  • J Percentage of calcein-negative 4T1 cells in samples without co-culture (Control) or co-cultured with splenocytes from na ⁇ ve mice or ICRP-LCT for 24 h (1:40 co-culture).
  • the present invention describes a composition based on a tumor lysate of breast cancer cells treated with a dialyzable extract of bovine spleen leukocytes (ICRP), its process for obtaining it and the use of said composition as an antitumor agent, without adjuvants, for the treatment and prevention of cancer, especially breast cancer.
  • ICRP bovine spleen leukocytes
  • Human mammary adenocarcinoma cell lines MCF-7 (ATCC® HTB-22TM), triple negative human breast adenocarcinoma MDAMB-231 (ATCC® HTB-26TM) and murine mammary adenocarcinoma 4T1 (ATCC® CRL2539TM) were obtained from the American Type Culture Collection.
  • MCF-7 and MDA-MB-231 cells were cultured in DMEM-F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin (DMEM complete medium), and 4T1 cells were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin (RPMI complete medium) (Life Technolo gies, Grand Island, NY) and cultured as usual in plastic tissue culture dishes (Life Sciences, Corning, NY). All cell cultures were maintained in a humidified incubator in a 5% CO2 atmosphere at 37 °C. Cell counting was performed in a Neubauer chamber, using 0.4% thpane blue (MERCK, Darmstadt, Germany). Throughout the writing, cancer cells are mentioned as the group formed by the cancer cells used in the present invention MCF-7, MDAMB-231 and 4T1, used for the purpose of illustrating, without limiting the invention.
  • FBS fetal bovine serum
  • RPMI complete medium penicillin-strepto
  • mice Female BALB/c mice (6 to 8 weeks of age; weighing 20 ⁇ 2 g) provided by the animal husbandry of the Autonomous University of Nuevo León, Mexico, were used. The animals were housed in plastic cages and given seven days to acclimate to the housing. The conditions environmental conditions were: temperature 21 °C ⁇ 3 °C, humidity 55% ⁇ 10%, and light/dark cycles of 12 h. Animals received rodent maintenance chow (LabDiet, St. Louis, MO) and water ad libitum, and their health conditions were monitored twice daily, with no adverse events observed. Mice were randomly assigned to different groups for all studies.
  • Cell death was induced to the cancer cells used in the present invention (MCF-7, MDAMB-231 and 4T1) with the ImmunePotent CRP (ICRP), 5 x 10 4 cell/well in plates of 24 wells (Life Sciences) were incubated in the presence or absence of different concentrations of immunepotent CRP (ICRP) ML for MCF-7 and MDAMB-231, and 0.1, 0.15. 0.2 and 0.5 U/mL for 4T1), Epirubicin (EPI, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) or cyclophosphamide (CPA, Sigma-Aldrich) for 24 h in complete DMEM or RPMI up to a final volume of 400 pls to obtain the CCSO.
  • ICRP ImmunePotent CRP
  • cells were pre-treated for 30 min with or without 5 mM N-acetyl-L-cysteine (antioxidant NAC), 10 pM QVD.OPh, 30 pM necrostatin-1 (NEC-1) or 15 pM Spautin-1 (Sp-1), subsequently co-treated with or without ICRP CCso for 24 h, as
  • NAC N-acetyl-L-cysteine
  • NEC-1 necrostatin-1
  • Sp-1 Spautin-1
  • ICRP induced treatment concentration-dependent regulated cell death in all cell lines 30% of the cells died (cytotoxic concentration - CC30) after being incubated with 1 U/mL of ICRP in MCF-7 and MDA-MB-231, and 0.1 U/mL in 4T1 cells.
  • the ICRP CCso was 1 .25 U/mL in MCF-7 and MDA-MB-231 cells, and 0.15 U/mL in 4T 1 cells, while the CCso was 1 .5 U/mL in human breast cancer cells and 0.2 U/mL in 4T1 cells, the CC100 was reached at 2 U/mL in MCF-7 and MDA-MB-231, and 0.5 U/mL in 4T1 cells, where we observed more than 90% cell death as shown in Figure 1, A and B. 4T1 cells killed by ICRP ( ICRP-KCC, described below) were generated with this CC100.
  • the antioxidant NAC significantly inhibited ICRP-induced cell death, while the autophagy inhibitor Sp-1 significantly potentiated ICRP-mediated cell death, as shown in Figure 2.
  • the caspase inhibitor QVD significantly enhanced ICRP-mediated cell death in MDA-MB-231 and 4T1 cells, while no significant changes were observed in MCF 7 cells ( Figure 2).
  • Mitochondrial membrane potential was determined using 500 nM TMRE (MERCK). 5 x 10 4 cells in 24-well plates were incubated with the ICRP CCso obtained for the various cancer cells in the cell death assay for 24 h. Cells were then harvested, washed with PBS, stained, incubated at 37 S C for 30 min, and measured by flow cytometry.
  • ROS generation assay reactive oxygen species
  • ROS levels were determined by staining cells with 2.5 pM 2',7'-Dichlorofluorescine diacetate (DCFDA) (MERCK). 5 x 10 4 cells/well of the cancer cells were incubated with their respective ICRP CC50 for 24 h. Then, the cells were separated, washed with PBS, stained, incubated at 37 °C for 30 min and measured using flow cytometry. This treatment generated an increase in ROS levels in 45-55% of MCF-7, MDA-MB-231 and 4T1 cells, as observed in Figure 3, letter B. Autophagosome formation assay.
  • DCFDA 2',7'-Dichlorofluorescine diacetate
  • CTCF integrated density - (selected cell area * mean fluorescence of background readings), results are shown in Figure 4.
  • the cells were resuspended in 100 ⁇ l of 1x PBS / 10% FBS / 0.3 M glycine, and incubated for 15 min under shaking (400 rpm) at 25°C. Finally, 0.2 pL of H&L goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor® 488) (ab150077, Abeam) (1:500) or 0.2 pL of goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor® 488) (H+L, Life Technologies) (1:500) was added for P-elF2a or T-elF2 analysis. a respectively, and incubated for 1 h in the dark. Cells were washed with 2% FACS buffer and fluorescence assessed by flow cytometry, as mentioned above.
  • the dialyzable extract of bovine spleen leukocytes induces elF2a phosphorylation and DAMPs emission in MCF-7, MDA-MB-231 and 4T1 cells.
  • Results indicate induction of P-elF2a in 40-60% of cells in all cell lines treated with ICRP CCso for 18 h; these results are similar to those observed with the 1 pM Thaps treatment for 2 h ( Figure 5).
  • CTR calreticulin exposure
  • HMGB1 BioAssay ELISA Kit Human
  • HMGB1 BioAssay ELISA Kit Mae
  • 4T1 cells US Biological Life Science
  • 1.5 x 10 6 4T1 cells are plated in a 75cm 2 culture dish with 10 mL of RPMI medium supplemented with 10% FBS, however, any of the cancer cells described in the present invention can be used to obtain the ICRP-LCT, depending on the target to be treated (for example, mice or humans).
  • the cells are incubated for 12 to 24 hours (37 S C and 5% CO2) in order for them to adhere to the culture dish.
  • the cytotoxic concentration 100 (CC100) obtained in the previous cell death assays (which varies depending on the type of cell line to be treated) is used, using a 5-Unit (U) bottle of Immunepotent-CRP, which is dissolved with 1250pL of RPMI, for a final concentration of 0.4 U/mL.
  • U 5-Unit
  • the RPMI is removed from the culture dish and new RPMI medium (8.75mL, for this test) is added, in addition to previously dissolved Immunepotent-CRP (1.25 mL for this test) maintaining a ratio of 8.75:1.25 RPMI medium: Immunepotent-CRP.
  • Cells are incubated for 24 hours (37 S C and 5% CO2). Subsequently, the cells are recovered, washed with PBS and centrifuged at 1600 rpm for 10 minutes.
  • the cell pellet is resuspended in 100 pL of PBS.
  • Equation 1 The volume of the tumors of the following tests was measured three times in a week, using a vernier (Digimatic Caliper Mitutoyo Corporation, Japan), this was determined by means of Equation 1. Equation 1...
  • Tumor volume (mm ) — - — - ; — — - — -
  • mice When the tumors exceeded 1000 mm 3 the mice were anesthetized with an intraperitoneal injection of ketamine (80 mg/kg body weight) and xylazine (10 mg/kg body weight) and were sacrificed by cervical dislocation.
  • ketamine 80 mg/kg body weight
  • xylazine 10 mg/kg body weight
  • mice All naive (PBS) mice achieved correct tumor establishment at the inoculation site ( Figure 10, A), while immunization with ICRP-LCT prevented tumor growth at the inoculation site in nine out of ten mice ( Figure 10, B). Furthermore, vaccination with EPI-LCT prevented tumor establishment in seven out of ten mice ( Figure 10, C), while vaccination with CPA-LCT prevented tumor establishment in only two out of ten mice ( Figure 10, D).
  • mice with ICRP-LCT prevented tumor growth at the challenge site in nine out of ten mice; furthermore, tumors growing at the challenge site of the non-vaccinated mice (PBS) reached up to 1200 mm 3 in all six mice ( Figure 10, letter B), confirming that ICRP-LCT induces a potent immune response in vivo, reflected in 90% (9/10) of the 60-day survival rates of the ICRP-LCT group mice, while 70% was observed in the EPI-LCT group of mice ( 7/10) of survival for 60 days, the CPA-LCT group presented a survival of 20% (2/10) and all the mice inoculated with PBS were sacrificed on day 20 (10/10) (letter E of Figure 10). Therapeutic Vaccination with ICRP-LCT.
  • mice After evaluation of the immunogenicity of ICRP-induced cell death, the therapeutic potential of ICRP-LCT per se was tested in tumor-bearing mice. For this, BALB/c mice were inoculated with 5x10 5 live 4T1 cells, and when the tumors reached 100 mm 3 , therapeutic vaccinations were performed every three days for two weeks with sc inoculations of 1.5 x 10 6 4T1 cells by treatment with ICRP-LCT or PBS (control) on the opposite flank (letter A of Figure 11 ).
  • mice that survived 150 days of a prior prophylactic vaccination with ICRP-LCT were challenged again with live 4T1 cancer cells, na ⁇ ve mice challenged with live 4T1 cancer cells were used as controls. Mice in remission after prophylactic vaccination with ICRP-LCT were challenged again sc with 5 x 10 5 live 4T1 cells after 150 days of prophylactic vaccination. Tumor growth at the challenge site was evaluated after 60 days post-reimmunization (letter A of Figure 12).
  • mice After 150 days of reaching remission after ICRP-LCT treatment these mice were challenged again with viable 4T1 cancer cells. Naive mice were used as control, which were also challenged with live 4T1 cancer cells (Figure 13, letter A). The results demonstrated that ICRP-LCT-pretreated mice were prevented from tumor growth after re-exposure, whereas continued tumor growth was observed in na ⁇ ve mice ( Figure 13, letter B). This was reflected in 100% (8/8) survival in ICRP-LCT challenged mice, while na ⁇ ve mice were sacrificed on day 15 (5/5) ( Figure 13 letter C). These results strongly suggest stimulation of long-term antitumor immune memory by ICRP-LCT treatment.
  • 3 days after re-exposure to the tumor tumor draining lymph node tissues (TDLN) and tumor re-challenge sites were obtained from naive (naive) mice and ICRP-KCC vaccinated mice, and were fixed in 3.7% neutral formalin, embedded in paraffin, sectioned (5 ⁇ m thick) and stained with H&E (MERCK).
  • TDLN tumor draining lymph node tissues
  • re-challenge sites were obtained from naive (naive) mice and ICRP-KCC vaccinated mice, and were fixed in 3.7% neutral formalin, embedded in paraffin, sectioned (5 ⁇ m thick) and stained with H&E (
  • Histopathological analyzes were performed by an external veterinary pathologist (national professional certificate 2593012). Blood was obtained by cardiac puncture from anesthetized mice as described above, and isolation of PBMCs was performed by density gradient centrifugation, using Ficoll-Hypaque-1119 (MERCK). Cells from the tumor re-challenge site, TDLN and spleen were obtained using 70 pm cell filters (MERCK) and suspended in 2% FACS buffer. PBMCs, TDLN cells, and cells from the tumor re-challenge site were stained with a cocktail of mouse T-lymphocyte antibodies: PE-Cy7 CD3e, PE CD4 and FITC CD8 (BD Pharmingen) following the manufacturer's instructions.
  • DC maturation was analyzed by immunostaining of lymph node cells using anti-CD1 1 c-Alexafluor 488 (R&D Systems) and anti-CD86-APC (BD Biosciences) at 25°C for 30 min. Cell surface markers were assessed by flow cytometry, as mentioned above. Finally, viable 4T1 cells were seeded at a concentration of 1 x 10 5 cells/mL, stained with 0.1 pL/mL calcein-AM (BD Biosciences) for 30 min and washed twice with PBS, then splenocytes from naive mice or mice previously vaccinated with ICRP-KCC were added to each well at a concentration of 40 x 10 5 cells/mL.
  • tumor establishment a group of na ⁇ ve mice as negative control.
  • Histopathologic analyzes of tumor-draining lymph nodes showed diffuse lymphoid hyperplasia in na ⁇ ve mice, while nodes from ICRP-LCT mice exhibit follicular lymphoid hyperplasia, indicating a modulated response, associated with immunological memory ( Figure 14, D). Because of these differences, the proportion of mature dendritic cells in the tumor-draining lymph nodes was then assessed.
  • mice showed a slight infiltration of neoplastic cells in the striated muscle tissue, observing a strong infiltration of lymphocytes and polymorphonuclear cells (figure 14, H right).
  • an increase in total CD3+ cells, a significant decrease in CD4+ T cells, and a significant increase in CD8+ T cells were observed at the tumor re-challenge site in ICRP-LCT mice, compared to na ⁇ ve mice ( Figure 14, I).
  • Splenocytes from ICRP-LCT mice mediated a cytotoxic effect against 4T1 cells, inducing loss of cell viability in up to 50% of cancer cells, while no significant cytotoxic effect was detected in 4T1 cells co-cultured with splenocytes from na ⁇ ve mice ( Figure 14, J), indicating cytotoxicity directed toward tumor cells.
  • Tumor cell lysates obtained by treatment with inducers of immunogenic cell death mediate optimal therapeutic effects in immunocompetent mice.
  • the results presented in the present invention demonstrate that ICRP-LCT induced tumor regression and increased survival in mice bearing 4T1 tumors, confirming the immune response elicited by ICRP-LCT against 4T1 cells, leading to tumor eradication.
  • tumor cell lysates have been proposed as a therapeutic approach in cancer therapy.
  • There are several clinical trials using tumor cell lysates as immunogenic sources for cancer vaccine design for example, there is a phase I/II study for subjects with recurrent ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal cancer to determine the immunogenicity of an oxidized autologous cell lysate (OC-L) administered in combination with a Toll-like receptor 3 agonist (NCT01312389), a phase II trial studying the effectiveness of vaccination with autologous tumor cells plus immune adjuvant (GM-CSF) in the treatment of patients with metastatic cancer (NCT00002505), and another study uses irradiated resected tumor cells mixed with CpG to create a vaccine (NCT00780988).
  • O-L oxidized autologous cell lysate
  • GM-CSF immune adjuvant
  • NCT00780988 another study uses irradiated resected tumor cells mixed with CpG to create
  • tumor cell lysates are used to pulse Dendritic Cells, for example, an early Phase I study investigates the safety and efficacy of cell vaccines.
  • Pulsed dendritic cells with autologous whole tumor cells Used for the treatment of patients with advanced solid tumors with a high burden of tumor mutations (NCT03671720).
  • NCT03671720 Used for the treatment of patients with advanced solid tumors with a high burden of tumor mutations (NCT03671720).
  • Most of these studies are based on mouse models, where most of them use tumor cell lysates in combination with adjuvants to achieve therapeutic success (Kawahara, M., & Hiroshi, T. (2015).
  • ICRP-LCT Prophylactic vaccination with ICRP-LCT prevents tumor establishment in BALB/c mice, leading to long-term antitumor memory.
  • ICRP-LCT treatment causes tumor regression in mice bearing breast cancer tumors, 4T1, triggering long-term antitumor memory in the treated mice.
  • ICRP-LCT may have the ability to convert breast cancer cells into potential vaccines in vivo.
  • the process for obtaining the tumor lysate of this invention begins by plating 1.5 x 10 6 4T1 cells in a 75cm 2 culture dish with 10mL of RPMI medium supplemented with 10% SFB. The cells are incubated for 12 to 24 hours (37 S C and 5% CO2) in order for them to adhere to the culture dish.
  • ICRP cytotoxic concentration 100 (CC100) is used for treatment of cells and is performed as follows:
  • a vial of 5 Units (U) of Immunepotent-CRP is used, which is dissolved with 1250 mL of RPMI medium, for a final concentration of 0.4U/mL.
  • the final concentration of the treatment is 0.5U/mL (CC100).
  • the RPMI is removed from the culture box and 8.75mL of new RPMI medium are added, in addition to 1.25mL of previously dissolved Immunepotent-CRP. Cells are incubated for 24 hours (37 S C and 5% CO2).
  • the cells are recovered, washed with phosphate buffered saline (PBS), and centrifuged at 1600 rpm for 10 minutes. Finally, the cell pellet is resuspended in 10OpiL of PBS which is taken with a 1 mL syringe and inoculated subcutaneously in the opposite site to where the tumor is located.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the treatment scheme in the form of a vaccine is administered in a therapeutically effective amount of the composition based on a tumor lysate of breast cancer cells as described above, generating an immune response in the host against the vaccine, and immunizing against breast cancer.
  • the optimal treatment scheme for the treatment of breast cancer using the tumor lysate obtained by this invention is as follows: Two weekly inoculations with 1.5 x 10 6 4T1 cells treated with 0.5 U/mL of ICRP for 24 hours.
  • the dialyzable extract of bovine spleen leukocytes under trademark registration as Immunepotent CRP (ICRP) is used as an inducer of immunogenic cell death, which is cytotoxic in breast cancer cells and promotes the release of molecular patterns associated with damage, capable of being recognized by the immune system and activating the antitumor immune response.
  • ICRP Immunepotent CRP
  • Phosphate buffered saline is used as a vehicle for the tumor lysate.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La presente invención describe una composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama tratadas con un extracto dializable de leucocitos de bazo de bovino (ICRP-LCT), su proceso de obtención y el uso de dicha composición como agente antitumoral, para el tratamiento y prevención de cáncer especialmente de cáncer de mama, esta formulación es utilizada en forma de vacuna para el tratamiento y prevención de cáncer de mama, sin necesidad de adyuvantes para ejercer su efecto. La acción del ICRP-LCT induce una potente respuesta inmune in vivo, reflejado una tasas de supervivencia a 60 días en el 90% (9/10) de los sujetos de estudio, así mismo el ICRP-LCT indujo la regresión tumoral en ocho de nueve sujetos de estudio y un 100% de sobrevivencia (9/9) de sujetos re-desafiados con células cancerosas tratados posteriormente con el ICRP-LCT, lo que demuestra el uso del ICRP-LCT para el tratamiento y prevención del cáncer de mama, así como fuertemente estimulación de la memoria inmune antitumoral a largo plazo por la vacunación profiláctica ICRP-LCT.

Description

COMPOSICIÓN A BASE DE UN LISADO TUMORAL DE CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA, SU PROCESO DE OBTENCIÓN Y SU USO COMO AGENTE ANTITUMORAL
DESCRIPCIÓN
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de la presente invención es proveer una composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama tratadas con un extracto dializable de leucocitos de bazo de bovino (ICRP), su proceso de obtención y el uso de dicha composición como agente antitumoral, para el tratamiento y prevención de cáncer especialmente de cáncer de mama, esta formulación es utilizada en forma de vacuna para el tratamiento y prevención de cáncer de mama, sin necesidad de adyuvantes para ejercer su efecto. La presente invención pertenece al campo de preparación o composiciones medicinales especialmente de agente antineoplásicos o antitumorales.
ANTECEDENTES
El cáncer de mama es el tipo de cáncer con mayor incidencia y la principal causa de muerte en mujeres (Siegel, R. L., Miller, K. D., & Jemal, A. (2019). Cáncer statistics. CA Cancer J. Clin. 69, 7-34.1 ). Las muertes derivadas de esta patología se asocian mayormente con los procesos de metástasis y su capacidad para reaparecer hasta 20 años después de su diagnóstico (Richman, J., & Dowsett, M. (2019). Beyond 5 years: enduring risk of recurrence in oestrogen receptor-positive breast cancer. Nat. Rev. Clin. Oncol. 16, 296-311 ). Estos fenómenos se relacionan con la pérdida de la inmunogenicidad de las células tumorales, como resultado de la liberación de factores inmunosupresores por dichas células, los cuales bloquean el ciclo de inmunidad del cáncer. Sin embargo, actualmente se ha propuesto que, con la apropiada estimulación del sistema inmune, las células cancerosas podrían volverse inmunogénicas. Diversos estudios indican que la muerte celular inmunogénica (MCI) es una estrategia prometedora para convertir las células cancerosas en su propia vacuna, conduciendo a un éxito terapéutico a largo plazo debido a la inducción de la respuesta inmune de memoria (Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., & Zitvogel, L. (2013). Immunogenic cell death in cancer therapy. Annu Rev. Immunol. 31 , 51-72; Garg, A. D., More, S., Rufo, N., Mece, O., Sassano, M., L., & Agostinis, P. (2017). Trial watch: immunogenic cell death induction by anticancer chemotherapeutics. Oncolmmunology), lo cual podría hacer frente a la alta tasa de recurrencia en pacientes con cáncer de mama.
Además, se ha demostrado que los lisados de células tumorales (LCT, por sus siglas en español y TCL por sus siglas en inglés) obtenidos por el tratamiento con inductores de MCI pueden provocar respuestas inmunitañas antitumorales en modelos muñnos preclínicos para glioblastoma, cáncer de mama y de ovario y en ensayos clínicos para cáncer de melanoma, próstata y ovario (Chang, Wei-Ting, Hui- Ming Chen, Shu-Yi Yin, Yung-Hsiang Chen, Chih-Chun Wen, Wen-Chi Wei, Phoency Lai, Cheng-Hsin Wang, & Ning-Sun Yang. (2013). “Specific Dioscorea Phytoextracts Enhance Potency of TCL-Loaded DC-Based Cancer Vaccines.” Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: ECAM: 932040). Los patrones moleculares asociados a daño (DAMPs, por sus siglas en inglés) presentes en los lisados interactúan con receptores de células dendríticas (DCs, por sus siglas en inglés) (CD91 , receptor tipo Toll 4, receptores puñnérgicos, entre otros), promoviendo su maduración y actividad antitumoral (Chiang, Cheryl, Coukos, G., & Kandalaft, L. (2015). “Whole Tumor Antigen Vaccines: Where Are We?” Vaccines 3 (2): 344-72). Por lo tanto, los LCT pueden usarse para inducir una respuesta inmunogénica de DCs contra múltiples antígenos tumorales, desencadenando una respuesta policlonal de células T específicas de tumor (Chiang., Lai-Lai, C., Kandalaft, L., Tanyi, J., Hagemann, A., Motz, G., Svoronos, N., & Montone, K. (2013). “A Dendritic Cell Vaccine Pulsed with Autologous Hypochlorous Acid- Oxidized Ovarian Cancer Lysate Primes Effective Broad Antitumor Immunity: From Bench to Bedside.” Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research 19 (17): 4801-15). Tratamientos contra el cáncer con DCs pulsadas con antígenos tumorales han demostrado respuestas antitumorales eficaces en modelos de mesotelioma, glioma y cáncer de mama (Chiarella, P., Reffo, V., Bruzzo, J., Bustuoabad, O., & Ruggiero, R. (2008). “Therapeutic Anti-Tumor Vaccines: From Tumor Inhibition to Enhancement.” Clinical Medicine. Oncology 2 (January): CMO.S538; Cho., Sik, Y., McQuade, T., Zhang, H., Zhang, J., & Ming Chan, F. (2011 ). “RIP1 -Dependent and Independent Effects of Necrostatin-1 in Necrosis and T Cell Activation.” PLoS ONE; Denéfle, T., Boullet, H., Herbi, L., Newton, C., Martinez-Torres, A., Guez, A., Pramil, E. (2016). “Thrombospondin-1 Mimetic Agonist Peptides Induce Selective Death in Tumor Cells: Design, Synthesis, and Structure-Activity Relationship Studies.” Journal of Medicinal Chemistry 59 (18): 8412-21 ). Además, el uso de LCT como vacunas terapéuticas también han demostrado ser una estrategia útil para provocar respuestas inmunitarias antitumorales, superando los mecanismos inmunosupresores del microambiente tumoral (Chang, Wei-Ting, Hui-Ming Chen, Shu-Yi Yin, Yung-Hsiang Chen, Chih-Chun Wen, Wen-Chi Wei, Phoency Lai, Cheng- Hsin Wang, & Ning-Sun Yang. (2013). “Specific Dioscorea Phytoextracts Enhance Potency of TCL-Loaded DC-Based Cancer Vaccines.” Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: ECAM: 932040). La mayoría de estos estudios se basan en modelos realizados en ratones, donde el tratamiento con lisados de células tumorales se aplica en combinación con adyuvantes o mediante estrategias que implican la maduración de células dendríticas con el fin de alcanzar el éxito terapéutico (Mamoru, K., & Takaku, H. (2015). “A Tumor Lysate Is an Effective Vaccine Antigen for the Stimulation of CD4 + T-Cell Function and Subsequent Induction of Antitumor Immunity Mediated by CD8 + T Cells.” Cancer Biology & Therapy 16(11 ): 1616-25; Pyo, Ho, K„ Lee, Y„ Lim, S„ & Shin, E. (2016). “Immune Adjuvant Effect of a Toxoplasma Gondii Profilin-like Protein in Autologous Whole-Tumor-Cell Vaccination in Mice.” Oncotarget 7(45): 74107-19; Chunfeng, S. (2017). “In Vivo Antitumor Activity Evaluation of Cancer Vaccines Prepared by Various Antigen Forms in a Murine Hepatocellular Carcinoma Model.” Oncology Letters 14(6): 7391-97).
Actualmente existen patentes que protegen el uso de bacterias como adyuvantes de lisados tumorales (US10772944B2), así como el uso de un lisado de células tumorales tratadas con alta presión hidrostática para estimular células dendríticas (US10918704B2).
Por otra parte, se ha propuesto que los LCTs son más prometedores como vacunas contra el cáncer en comparación a vacunas con antígenos individuales asociados a tumores (TAA) porque pueden provocar respuestas inmunes a múltiples TAA (Dobrovolskiené, N., Pasukoniené, V., Darinskas, A., Krasko, J., Zilionyté, K., Mlynska, A., Gudleviciené, Z. (2018). “Tumor Lysate-Loaded Bacterial Ghosts as a Tool for Optimized Production of Therapeutic Dendritic Cell-Based Cancer Vaccines.” Vaccine 36 (29): 4171-80). Sin embargo, la disponibilidad y los tipos de neoantígenos, la cantidad de DAMPs liberados y la inmunogenicidad general del LCT dependen en gran medida del inductor de muerte celular (Chen., Hui-Ming., Wang, P., Chen, S., Wen, C., Chen, Y., Yang, W., & Yang, N. (2012). “Shikonin Induces Immunogenic Cell Death in Tumor Cells and Enhances Dendritic Cell-Based Cancer Vaccine.” Cancer Immunology, Immunotherapy 61 (11 ): 1989-2002). Por Io tanto, es importante encontrar inductores de muerte celular efectivos que puedan proporcionar un LCT inmunogénico capaz de inducir respuestas inmunitarias antitumorales.
IMMUNEPOTENT CRP (ICRP) es un extracto dializable de leucocitos bovino (DLE) obtenido de bazo roto ((Disponible en
Figure imgf000006_0001
y https://biomedres.us/pdfs/BJSTR.MS.ID.002509.pdf). El ICRP es una mezcla de sustancias con actividad biológica, con múltiples aplicaciones para la salud humana. Hoy en día, ICRP ha demostrado ejercer funciones inmunomoduladoras y anticancerígenas.
En cuanto a las actividades inmunomoduladoras, el ICRP mejoró la sobrevivencia (90%) en ratones BALB/c con shock endotóxico inducido por lipopolisacáhdos (LPS), decreciendo los niveles de IL-10, IL-6, y TNF-a en suero (Franco, M. (2004). “Bovine Dialyzable Leukocyte Extract Protects against LPS- Induced, Murine Endotoxic Shock.” International Immunopharmacology 4(13): 1577- 86).
Además, el ICRP disminuyó los niveles de NO, TNF-a e IL-6, pero incrementó la producción de IL-10 en macrófagos perifonéales muhnos estimulados por LPS. (Franco, M. (2005). “Bovine Dialyzable Leukocyte Extract Modulates the Nitric Oxide and Proinflammatory Cytokine Production in Lipopolysacchahde-Stimulated Murine Peritoneal Macrophages in Vitro.” Journal of Medicinal Food 8(1 ): 20-26.). Por otra parte, en macrófagos humanos estimulados por LPS, el ICRP incrementó la actividad de antioxidantes endógenos (catalasa, glutatión peroxidasa y superóxido dismutasa), y disminuyó la actividad de la ciclooxigenasa-2, PGD2, NO, y la producción de TNF-a (Franco, M. (2011 ). “Anti-Inflammatory and Antioxidant Effects of IMMUNEPOTENT CRP in Lipopolysaccharide (LPS)-Stimulated Human Macrophages.” African Journal of Microbiology Research 5(22): 3726-36). Además, en pacientes con cáncer de pulmón y mama sometidos a quimioterapia y / o radioterapia, la administración de ICRP resultó en una mejor calidad de vida y actividad inmunomoduladora (aumentando las subpoblaciones totales de leucocitos y linfocitos T) (Franco, M. (2008). “IMMUNEPOTENT CRP (Bovine Dialyzable Leukocyte Extract) Adjuvant Immunotherapy: A Phase I Study in Non-Small Cell Lung Cancer Patients.” Cytotherapy 10(5): 490-96; Lara, H. (2010). “Clinical and Immunological Assessment in Breast Cancer Patients Receiving Anticancer Therapy and Bovine Dialyzable Leukocyte Extract as an Adjuvant.” Experimental and Therapeutic Medicine 1 (3): 425-31 ).
Sin duda se han empleado diversas estrategias para generar respuestas inmunitarias antitumorales a través del uso de lisados de células tumorales (LTC), sin embargo, resulta importante encontrar inductores de muerte celular efectivos que puedan proporcionar un LTC inmunogénico capaz de inducir respuestas inmunitarias antitumorales, en donde su vía de administración sea lo más sencilla posible, evitando el uso de adyuvantes y que muestre resultados respecto a la recurrencia de la aparición de nuevas células tumorales.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra gráficos de puntos representativos (A) y cuantificaciones (B) de la muerte celular evaluada por citometría de flujo mediante tinción con Anexina-V y Pl en células MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1 tratadas con diferentes concentraciones de ICRP durante 24 horas.
Figura 2. Muestra gráficas de muerte celular mediante tinción con Anexina-V y Pl en células MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1 en ausencia (control, barra blanca) o presencia (barra negra) de ICRP CC50 durante 24 h sin co-tratamiento (-) o co-tratado con N- acetilcisteína (NAC), QVD-OPH (QVD), Necrostatina- 1 (NEC-1 ) o Spautin-1 (SP-1 ). Las gráficas representan los promedios (± DE) de los triplicados de al menos tres experimentos independientes.
Figura 3. Muestra gráficos en donde el ICRP induce A) pérdida del potencial de membrana mitocondhal evaluadas mediante tinción con TMRE en las líneas MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1. B) Niveles de ROS evaluados mediante tinción con DCFDA en las líneas MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1. C) Formación de autofagosomas en las líneas MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1. Para todos los incisos ausencia (control, barra blanca) o presencia (barra negra) de ICRP CCso.
Figura 4. Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la tinción con Cyto- ID en células MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1 sin tratar (control) o tratadas con ICRP CCso durante 24 h. Los núcleos se tiñeron en azul con el colorante Hoechst 33342.
Figura 5. Histogramas representativos de la tinción de P-elF2a (en gris) y anticuerpos ¡sotipo IgG (punteados) en células cancerosas sin tratamiento (control negativo) o tratadas con ICRP CC50 durante 18 h o Thaps 1 pM durante 2 h (control positivo). Los gráficos son la cuantificación de la tinción de P-elF2a en controles y células cancerosas tratadas con ICRP o Thaps.
Figura 6. Muestra gráficos de la exposición de CRT en células cancerosas sin tratar (CTR, control negativo, en gris) o tratadas con ICRP CC50 (en negro), o EPI CC50 (control positivo, en rojo) durante 24 horas.
Figura 7. Muestra gráficos de la exposición de HSP70 en células cancerosas sin tratar (CTR, control negativo, en gris) o tratadas con ICRP CC50 (en negro), o EPI CC50 (control positivo, en rojo) durante 24 horas.
Figura 8. Muestra gráficos de la exposición de HSP90 en células cancerosas sin tratar (CTR, control negativo, en gris) o tratadas con ICRP CC50 (en negro), o EPI CC50 (control positivo, en rojo) durante 24 horas.
Figura 9. Muestra gráficos de A) Cuantificación de la liberación de ATP mediante detección de bioluminiscencia en los sobrenadantes de células cancerosas en ausencia (control negativo) o presencia de ICRP CC50 o EPI CC50 durante 24 h y B) Cuantificación de la liberación de HMGB1 evaluada por ELISA en los sobrenadantes de células cancerosas en ausencia (control negativo) o presencia de ICRP CC50 o EPI CC50 durante 24 h y 48 h. Los gráficos representan las medias (± DE) de triplicados de al menos tres experimentos independientes. Figura 10. Muestra gráficos de la vacunación profiláctica con ICRP-LCT que previene el establecimiento tumoral en ratones BALB/c. A - D Los ratones fueron inoculados en el flanco izquierdo por vía s.c. con PBS, 1.5x106 células 4T1 muertas por el tratamiento con ICRP (ICRP-LCT), 1.5x106 células 4T1 muertas por el tratamiento con EPI (EPI-LCT) o 1.5x106 células 4T1 muertas por el tratamiento con CPA (CPA-LCT). En el día 7 después de la vacunación, los ratones fueron retados por vía s.c. en el flanco opuesto con 5x105 células 4T1 viables. Se evaluó el crecimiento tumoral en el sitio de inoculación con células 4T1 viables durante 60 días después de la inoculación. Gráficas de volumen tumoral en el sitio de exposición de ratones no vacunados (PBS) (A) o vacunados con ICRP-LCT (B), EPI- LCT (C) o CPA- LCT (D). Cada línea representa un ratón. C Gráfica de Kaplan-Meier representando el porcentaje de sobrevida en ratones tratados como en (A-D) (n=10 ratones por grupo).
Figura 11. Muestra gráficos en los que el tratamiento terapéutico con ICRP-LCT induce la regresión tumoral en ratones BALB/c portadores de tumores. A) Se evaluó el crecimiento tumoral en el sitio de exposición durante 60 días después de la exposición. B) Volumen del tumor en el sitio de exposición de ratones de control o ratones tratados con células 4T1 tratadas con ICRP. C) Gráfico de Kaplan Meier con el porcentaje de supervivencia en ratones tratados como en B.
Figura 12. Muestra gráficos en los que el tratamiento profiláctico con ICRP-LCT induce memoria antitumoral a largo plazo en ratones BALB/c. A) Se evaluó el crecimiento tumoral en el sitio de exposición durante 60 días después de la exposición. B) Volumen del tumor en el sitio de exposición de ratones de control o ratones tratados con ICRP-LCT. C) Gráfico de Kaplan Meier con el porcentaje de supervivencia en ratones tratados como en B. Naive-ratones sin tratamiento previo.
Figura 13. Muestra gráficos en los que el tratamiento con ICRP-LCT induce memoria antitumoral a largo plazo en ratones BALB/c. A) Se evaluó el crecimiento tumoral en el sitio de exposición durante 60 días después de la exposición. B) Volumen del tumor en el sitio de exposición de ratones de control o ratones tratados con ICRP-LCT. C) Gráfico de Kaplan Meier con el porcentaje de supervivencia en ratones tratados como en B. Naive-ratones sin tratamiento previo.
Figura 14. La vacunación profiláctica con ICRP-LCT induce memoria antitumoral a largo plazo, modula el establecimiento tumoral, la maduración de DCs, distribución de células T y la citotoxicidad dirigida hacia células tumorales mediada por los esplenocitos. A) Después de 150 días de la vacunación profiláctica con ICRP-LCT los ratones en remisión fueron re-retados por vía s.c. con 5x105 células 4T1 viables. Se evaluó el crecimiento del tumor en el sitio de re-reto durante 60 días después la inoculación con las células tumorales. B) Volumen tumoral en el sitio de inoculación de las células cancerosas en ratones sin tratamiento previo (cuadrado negro, n=9 ratones) o ratones en remisión después de una vacunación previa con 1.5x106 ICRP-LCT (círculo blanco, n = 9 ratones). C) Gráfica de Kaplan-Meier con el porcentaje de sobrevida de los ratones tratados. D), K) Los ratones sin tratamiento previo (n = 6) y los ratones en remisión después de la vacunación profiláctica ICRP- LCT (n = 6) fueron retados/re-retados por vía s.c. con 5x105 células 4T1 viables. Tres días después, se obtuvieron los ganglios linfáticos que drenaban el tumor, sangre periférica, el tejido del sitio de inoculación del tumor y el bazo. D) Histología de los ganglios linfáticos de ratones sin tratamiento previo e ICRP-LCT teñidos con H&E. E) Porcentaje de células positivas para CD11 c y CD86 en TDLN de ratones sin tratamiento previo e ICRP-LCT. F), G) Proporción de células positivas para CD3, CD4 y CD8 en TDLN (F) y sangre periférica (G) de ratones sin tratamiento previo e ICRP-LCT. H) Histología del sitio de inoculación tumoral en ratones sin tratamiento previo e ICRP-LCT teñidos con H&E. Tejido normal (flechas blancas), células tumorales (flechas rojas), células mitóticas (flechas negras), linfocitos (flechas azules) y células polimorfonucleares (flechas verdes). I) Proporción de células positivas para CD3, CD4 y CD8 en el sitio de inoculación tumoral de ratones sin tratamiento previo o ICRP-LCT. J) Porcentaje de células 4T1 negativas para calceína en muestras sin co-cultivo (Control) o cocultivadas con esplenocitos de ratones sin tratamiento previo o ICRP-LCT durante 24 h (co-cultivo 1 :40). K) Cuantificación de la concentración de IFN-y, TNF-a e IL-2 en sobrenadantes de co-cultivos obtenidos como en (J), expresada como la media (± DE) de tres experimentos independientes (n = 6 ratones por grupo). *En las gráficas/f ¡guras D-K se menciona la abreviación KCC como equivalente a la abreviación LCT. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se describe una composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama tratadas con un extracto dializable de leucocitos de bazo de bovino (ICRP), su proceso de obtención y el uso de dicha composición como agente antitumoral, sin adyuvantes, para el tratamiento y prevención de cáncer especialmente de cáncer de mama.
Cultivo Celular.
Se obtuvieron líneas celulares de adenocarcinoma mamario humano MCF-7 (ATCC® HTB-22TM), adenocarcinoma de mama humano triple negativo MDAMB- 231 (ATCC® HTB-26TM) y adenocarcinoma mamario murino 4T1 (ATCC® CRL2539TM) de la American Type Culture Collection. Las células MCF-7 y MDA- MB-231 fueron cultivadas en medio DMEM-F12 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y penicilina-estreptomicina al 1% (medio completo DMEM), y las células 4T1 fueron cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con FBS 10 % y penicilina-estreptomicina al 1% (medio completo RPMI) (Life Technologies, Grand Island, NY) y cultivadas de forma habitual en placas de cultivo de plástico para tejidos (Life Sciences, Corning, NY). Todos los cultivos celulares se mantuvieron en una incubadora humidificada en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 °C. El conteo celular fue realizado en una cámara Neubauer, usando azul de thpano al 0.4% (MERCK, Darmstadt, Germany). A lo largo de la redacción se menciona como las células cancerígenas al grupo formado por las células cancerígenas empleadas en la presente invención MCF-7, MDAMB-231 y 4T1 , empleadas con el fin de ¡lustrar, sin limitar la invención.
Animales.
El Comité de Ética en Investigación y Bienestar Animal (CEIBA), de la Facultad de Ciencias Biológicas aprobó este estudio con el folio: CEIBA-2019-006. Todos los experimentos fueron efectuados de acuerdo con la norma mexicana NOM- 062-ZOO-1999. Se usaron ratones hembra BALB/c (de seis a ocho semanas de edad; de un peso de 20 ± 2 g) proporcionados por el bioterio de la Universidad Autónoma de Nuevo León, México. Los animales fueron alojados en jaulas de plástico y se les dio siete días para aclimatarse al alojamiento. Las condiciones ambientales fueron: temperatura 21 °C ± 3 °C, humedad 55% ± 10% y ciclos de luz / oscuridad de 12 h. Los animales recibieron alimento de mantenimiento para roedores (LabDiet, St. Louis, MO) y agua ad libitum, y sus condiciones de salud fueron monitoreadas dos veces al día, sin observarse eventos adversos. Las ratonas se asignaron al azar a diferentes grupos para todos los estudios.
PRUEBAS IN VITRO DE INMUNOGENICIDAD DE LA MUERTE CELULAR INDUCIDA POR EL ICRP EN CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA:
Ensayo de Muerte Celular.
Se indujo muerte celular a las células cancerígenas empleadas en la presente invención (MCF-7, MDAMB-231 y 4T1 ) con el IMMUNEPOTENT CRP (ICRP), se incubaron 5 x 104 células/pozo en placas de 24 pozos (Life Sciences) en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de IMMUNEPOTENT CRP (ICRP) (1 , 1.25, 1.5 y 2 U/mL para MCF-7 y MDAMB-231 , y 0.1 , 0.15. 0.2 y 0.5 U/mL para 4T1 ), epirrubicina (EPI, Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO) o ciclofosfamida (CPA, Sigma- Aldrich) durante 24 h en DMEM completo o RPMI hasta un volumen final de 400 pL para obtener la CCso. Para los ensayos de inhibición de la muerte celular, las células se pre-trataron durante 30 minutos con o sin N-acetil-L-cisteína (antioxidante NAC) 5 mM, QVD.OPh 10 pM, necrostatina-1 (NEC-1 ) 30 pM o Spautin-1 (Sp-1 ) 15 pM, posteriormente se co-trataron con o sin ICRP CCso durante 24 h, como se mencionó anteriormente, se obtuvo una suspensión celular y después de dos lavados con PBS, las células se suspendieron en 100 pL de buffer de unión o binding buffer (HEPES / NaOH 10 mM, pH 7.4, NaCI 140 mM y CaCI2 2.5 mM), se tiñeron y evaluaron en un citómetro de flujo BD Accury C6 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NUEVA JERSEY). La muerte celular se midió utilizando 1 pg/mL de APC Annexin V (BD Pharmingen, San Jose, CA) y 0.5 pg/mL de yoduro de propidio (Pl) (MERCK). Los resultados se analizaron utilizando el software FlowJo (LLC, Ashland, OR).
El ICRP indujo la muerte celular regulada dependiente de la concentración de tratamiento en todas las líneas celulares. El 30% de las células muñeron (concentración citotóxica - CC30) después de ser incubadas con 1 U/mL de ICRP en MCF-7 y MDA-MB-231 , y 0.1 U/mL en células 4T1 . La CCso de ICRP fue 1 .25 U/mL en células MCF-7 y MDA-MB-231 , y 0.15 U/mL en células 4T 1 , mientras que la CCso fue 1 .5 U/mL en células de cáncer de mama de humano y 0.2 U/mL en células 4T1 , la CC100 se alcanzó a 2 U/mL en MCF-7 y MDA-MB-231 , y 0.5 U/mL en células 4T1 , donde observamos más del 90% de muerte celular como se muestra en la Figura 1 , A y B. Las células 4T1 muertas por ICRP (ICRP-KCC, descrito delante) se generaron con esta CC100.
El antioxidante NAC inhibió significativamente la muerte celular inducida por el ICRP, mientras que el inhibidor de autofagia Sp-1 potenció significativamente la muerte celular mediada por el ICRP, como se muestra en la Figura 2. No se observaron cambios significativos con el inhibidor de necroptosis NEC-1 en células MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1. Además, el inhibidor de caspasas QVD potenció significativamente la muerte celular mediada por el ICRP en células MDA-MB-231 y 4T1 , mientras que no se observaron cambios significativos en las células MCF 7 (Figura 2).
Análisis del potencial de membrana mitocondrial.
El potencial de membrana mitocondrial fue determinado usando TMRE 500 nM (MERCK). Se incubaron 5 x 104 células en placas de 24 pocilios con el ICRP CCso obtenido para las diversas células cancerígenas en el ensayo de muerte celular por 24 h. A continuación, se recogieron las células, se lavaron con PBS, se tiñeron, se incubaron a 37SC durante 30 min y se midieron mediante citometría de flujo.
La pérdida del potencial de la membrana mitocondrial se indujo en el 55-65% de las células MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1 tratadas con su respectivo ICRP CC50 durante 24 h, como se puede observar en la Figura 3, letra A.
Ensayo de generación de ROS (especies reactivas de oxígeno).
Los niveles de ROS fueron determinados por la tinción de células con diacetato de 2',7'-Diclorofluorescina 2.5 pM (DCFDA) (MERCK). Se incubaron 5 x 104 células/pocillo de las células cancerígenas con su respectivo ICRP CC50 por 24 h. Luego, las células se separaron, se lavaron con PBS, se tiñeron, se incubaron a 37 °C durante 30 min y se midieron usando una citometría de flujo, este tratamiento generó un aumento de los niveles de ROS en el 45-55% de las células MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1 , según se observa en la Figura 3, letra B. Ensayo de formación de autofagosomas.
Para esta evaluación, se cultivaron 5 x 104 células en placas de 24 pocilios (Life Sciences) de las células cancerígenas con su respectivo ICRP CC50 por 24 h. Luego, las células se separaron, se lavaron con PBS y se tiñeron con el kit de detección de autofagia (Abeam, Cambridge, UK), y fueron medidas por medio de citometría de flujo, en donde se observa que este tratamiento provocó la formación de autofagosomas en el 40-55% de las células MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1 (Figura 3 letra C). La formación de autofagosomas se confirmó por microscopía de fluorescencia, se cultivaron 5x104 células en placas de 24 pozos (Life Sciences), de las células cancerígenas pre-tratadas durante 30 min con o sin 15 pM de Sp-1 y después se co-trataron con o sin el ICRP CC50 determinado durante 24 h, como se mencionó anteriormente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS y se tiñeron con el kit de detección de autofagia Cyto-ID (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los núcleos se contratiñeron en azul con Hoechst 33342 (Enzo Life Science). Las imágenes se adquirieron con el generador de imágenes InCellis (BERTIN Instruments, Montigny- le-Bretonneux, Francia), la fluorescencia se midió utilizando el programa Image J (NIH Image, Bethesda, MD) para obtener la fluorescencia celular total corregida (CTCF) usando la siguiente fórmula: CTCF = densidad integrada - (área de la célula seleccionada * fluorescencia media de las lecturas de fondo), los resultados se muestran en la Figura 4.
Análisis de fosforilación EIF2a.
Para este ensayo, se sembraron 5 x 105 de las células cancerígenas en placas de 6 pocilios (Life Sciences) en medio completo DMEM o RPMI a un volumen final de 2 mL, e incubadas en presencia o ausencia de la ICRP CCso por 18 h o 1 pM de tapsigargina (Thaps) durante 2 h. A continuación, se recuperaron las células y se fijaron con metanol al 80% durante 5 min a -20°C, se lavaron con PBS y se permeabilizaron con PBS-Tween al 0.1 % durante 20 min a 25°C. Después, las células se lavaron con PBS, se suspendieron en 50 pL de PBS 1x/ SFB al 10% / glicina 0.3 M, se incubaron durante 30 min y en agitación a 400 rpm, 25°C, seguido de la adición de 0.2 pL de anticuerpo anti-elF2S1 (phospho S51 ) [E90] (ab32157, Abeam) (1 :250) para el análisis de fosforilación de elF2a (P-elF2a) o 0.5 pL de anticuerpo anti-elF2A (3A7A8, Santa Cruz Biotechnology) (1 :100) para elF2a total (T -elF2a), las células se incubaron durante 2 h y se lavaron con buffer FACS al 2% (PBS 1x y SFB al 2%). Posteriormente, las células se resuspendieron en 100 pl de PBS 1x / SFB al 10% / glicina 0.3 M, y se incubaron durante 15 min en agitación (400 rpm) a 25°C. Por último, se agregaron 0.2 pL de IgG de cabra anti-conejo H&L (Alexa Fluor® 488) (ab150077, Abeam) (1 : 500) o 0.2 pL de IgG de cabra anti-ratón (Alexa Fluor® 488) (H + L, Life Technologies) (1 :500) para el análisis de P-elF2a o T- elF2a respectivamente, y se incubaron durante 1 h en oscuridad. Las células se lavaron con buffer FACS al 2% y se evaluó la fluorescencia mediante citometría de flujo, como se mencionó anteriormente.
El extracto dializable de leucocitos de bazo de bovino (ICRP) induce la fosforilación del elF2a y la emisión de DAMPs en células MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1. Los resultados indican la inducción de P-elF2a en un 40-60% de las células en todas las líneas celulares tratadas con ICRP CCso durante 18 h; estos resultados son similares a lo observado con el tratamiento de Thaps 1 pM durante 2 h (Figura 5).
Análisis de la exposición de calreticulina (CRT), HSP70, y HSP90.
Para este análisis, se sembraron 5 x 104 de las células cancerígenas en placas de 24 pozos y se trataron con el ICRP CCso o EPI CCso durante 24 h. Las células se separaron, lavaron e incubaron durante 1 h a 25°C con 2 pg/mL de anti- calreticulina (FMC-75, Enzo Life Science), 0.8 pg/mL de anti-HSP70 (F-3, Santa Cruz Biotechnology), o 0.8 pg/mL de anti-HSP90 (F-8, Santa Cruz Biotechnology), en FACS buffer al 2%. Las células se lavaron e incubaron durante 30 min en oscuridad a 25°C con IgG anti-ratón (Alexa Fluor 488) (H + L, Life Technologies) (1 :1500) o IgG anti-rata (Alexa Fluor 488) (H + L, Life Technologies) (1 :1500) en buffer FACS al 2%, después, las células se lavaron, se suspendieron en buffer FACS al 2% con 7-AAD (Life Technologies) (1 :1000) o Fixable viability stain 780 (BD Biosciences) (1 :1000) y se incubó en oscuridad durante 10 min a 25°C. La exposición de CRT, HSP70, y HSP90 se determinó mediante citometría de flujo en células viables (negativas para el mareaje 7-AAD o Fixable viability stain).
Además, se usaron sobrenadantes de células tratadas con ICRP CCso o EPI CCso (2x105) para evaluar el ATP extracelular mediante un ensayo de luciferasa (ENLITEN kit, Promega, Madison, Wl), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La bioluminiscencia fue determinada en un lector de microplacas Synergy HT, usando el software Gen5 (BioTek, Winooski, VT) a 560 nm.
Los resultados muestran que el tratamiento con ICRP CC50 durante 24 h indujo 3.73 ± 0.83, 3.07 ± 0.97 y 3.20 ± 0.59 veces más la exposición de CRT (Figura 6), 2.61 ± 0.82, 1 .63 ± 0.24 y 6.51 ± 1 .74 veces más la exposición de HSP70 (Figura 7), 2.55 ± 0.26, 1 .93 ± 0.31 y 6.23 ± 1 .35 veces más la exposición de HSP90 (Figura 8) y 135 ± 31.38, 140.99 ± 50.38 y 7.30 ± 3.92 veces más la liberación de ATP (Figura 9, letra A) en células MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1 , respectivamente, en comparación con células no tratadas. Además, el tratamiento con EPI CC50 durante 24 h indujo 6.61 ± 1.61 , 2.69 ± 0.33 y 1.46 ± 0.20 veces más la exposición de CRT (Figura 6), 3.41 ± 0.64, 2.56 ± 0.45 y 1 .66 ± 0.19 veces más la exposición de HSP70 (Figura 7), 6.24 ± 0.28, 2.98 ± 0.69 y 2.29 ± 0.95 veces más la exposición de HSP90 (Figura 8), y 2.02 ± 0.92, 12.61 ± 1.47 y 3.07 ± 0.66 veces más la liberación de ATP (Figura 9, letra A) en células MCF-7, MDA-MB 231 y 4T1 , respectivamente, en comparación con células no tratadas.
Ensayo de liberación de la proteína de alta movilidad del grupo 1.
Para este ensayo, 2 x 105 de las células cancerígenas se trataron con ICRP CCso o EPI CC50 por 24 h. Los sobrenadantes se utilizaron para evaluar la proteína de alta movilidad del grupo 1 (HMGB1 ) extracelular usando el kit HMGB1 BioAssay ELISA (Humano) para células MCF-7 y el kit HMGB1 BioAssay ELISA (Ratón) para células 4T1 (US Biological Life Science), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 450 nm. Los resultados revelaron que el tratamiento con ICRP CC50 durante 24 h indujo 1.58 ± 0.07, 1.65 ± 0.25 y 1.34 ± 0.28 veces más la liberación de HMGB1 y que el mismo tratamiento durante 48 h provocó 5.32 ± 0.83, 4.94 ± 1 .14 y 1 .49 ± 0.04 veces más la liberación de HMGB1 en células MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1 , respectivamente, en comparación con células no tratadas. Finalmente, el tratamiento con EPI CC50 durante 24 h provocó 7.51 ± 1.12, 2.66 ± 0.61 y 1.13 ± 0.11 veces la liberación de HMGB1 y este tratamiento durante 48 h provocó 7.55 ± 0.89, 2.87 ± 0.61 y 1.29 ± 0.08 veces más la liberación de HMGB1 en células MCF-7, MDA-MB-231 y 4T1 , respectivamente, en comparación con células no tratadas (Figura 9, letra B). OBTENCIÓN DEL LA COMPOSICIÓN DE USADO TUMORAL DE CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA (ICRP-LCT)
A fin de ¡lustrar la invención, sin limitarla, se plaquean 1 .5 x 106 células 4T1 en una caja de cultivo de 75cm2 con 10 mL de medio RPMI suplementado con 10% de SFB, sin embargo, se puede usar cualquiera de las células cancerígenas descritas en la presente invención, para obtener el ICRP-LCT, dependiendo del blanco a tratar (por ejemplo, a ratones o humanos). Las células se incuban durante 12 a 24 horas (37SC y 5% de CO2) con el fin de que se adhieran a la caja de cultivo. Para el tratamiento de las células se utiliza la concentración citotóxica 100 (CC100) obtenida en los ensayos previos de muerte celular (la cual varía dependiendo del tipo de línea celular a tratar), utilizando un frasco de Immunepotent-CRP de 5 Unidades (U), el cual se disuelve con 1250pL de RPMI, para una concentración final de 0.4 U/mL. Con el fin de que la concentración final del tratamiento sea 0.5 U/mL o el CC100 calculado, se retira el RPMI de la caja de cultivo y se agrega medio RPMI nuevo (8.75mL, para esta prueba), además del Immunepotent-CRP previamente disuelto (1.25 mL para esta prueba) manteniendo una relación 8.75:1.25 medio RPMI: Immunepotent-CRP. Se incuban las células durante 24 horas (37SC y 5% de CO2). Posteriormente, las células son recuperadas, lavadas con PBS y centrifugadas a 1600 rpm durante 10 minutos.
Finalmente, el pellet celular se resuspende en 100 pL de PBS.
USO DE LA COMPOSICIÓN DE USADO TUMORAL DE CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA (ICRP-LCT) COMO AGENTE PARA LA PREVENCIÓN O EL TRATAMIENTO DE CÁNCER.
Mediciones del volumen del tumor.
El volumen de los tumores de las siguientes pruebas fue medido tres veces en una semana, usando un vernier (Digimatic Caliper Mitutoyo Corporation, Japan), esto fue determinado por medio de la Ecuación 1. Ecuación 1...
4TT
Volumen del tumor (mm ) = — - — - ; — — - — -
(largo) (ancho) (alto
(1)
Cuando los tumores excedieron los 1000 mm3 los ratones fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg/kg de peso corporal) y xilazina (10 mg/kg de peso corporal) y fueron sacrificados mediante dislocación cervical.
Vacunación profiláctica con ICRP-LCT
Se inocularon ratones BALB/c de siete a ocho semanas de edad vía subcutánea (s.c.) con 1.5 x 106 células 4T1 moribundas o muertas (n=10 ratones) (tratamientos con ICRP-LCT, EPI-LCT y CPA-LCT) o con PBS (n=6 ratones) en el sitio del flanco izquierdo. En el día 7 después de la vacunación, los ratones fueron desafiados s.c. en el flanco opuesto con 5 x 105 células 4T1 vivas.
Todos los ratones no vacunados (PBS) alcanzaron un correcto establecimiento tumoral en el sitio de inoculación (Figura 10, A), mientras que la inmunización con ICRP-LCT previno el crecimiento tumoral en el sitio de inoculación en nueve de diez ratones (Figura 10, B). Además, la vacunación con EPI-LCT previno el establecimiento tumoral en siete de diez ratones (figura 10, C), mientras que la vacunación con CPA-LCT previno el establecimiento tumoral en sólo dos de diez ratones (figura 10, D). La inmunización de los ratones con ICRP-LCT impidió el crecimiento tumoral en el sitio de desafío en nueve de cada diez ratones; además, los tumores que crecían en el sitio de desafío de los ratones no vacunados (PBS) alcanzaron hasta 1200 mm3 en los seis ratones (letra B de la Figura 10), confirmando que ICRP-LCT induce una potente respuesta inmune in vivo, reflejado en el 90% (9/10) de las tasas de supervivencia a 60 días de los ratones del grupo ICRP-LCT, mientras que en el grupo de ratones EPI-LCT se observó el 70% (7/10) de sobrevida durante 60 días, el grupo CPA-LCT presentó una sobrevida del 20% (2/10) y todos los ratones inoculados con PBS fueron sacrificados el día 20 (10/10) (letra E de la Figura 10). Vacunación Terapéutica con ICRP-LCT.
Después de la evaluación de la inmunogenicidad de la muerte celular inducida por ICRP, se probó el potencial terapéutico de ICRP-LCT per se en ratones portadores de tumores. Para ello, se inocularon ratones BALB/c con 5x105 células 4T1 vivas, y cuando los tumores alcanzaron los 100 mm3, se realizaron vacunaciones terapéuticas cada tres días durante dos semanas con inoculaciones s.c. de 1.5 x 106 células 4T1 por tratamiento con ICRP-LCT o PBS (control) en el flanco opuesto (letra A de la Figura 11 ).
Los tratamientos con ICRP-LCT indujeron la regresión tumoral en ocho de nueve ratones, mientras que los tumores que crecieron en el grupo de control alcanzaron hasta 600 mm3 en los cinco ratones (letra B de la Figura 11 ), reflejado en 88.88% (8/9) de supervivencia después de 60 días en el grupo ICRP-LCT, mientras que todos los ratones de control fueron sacrificados el día 19 (5/5) debido al importante crecimiento tumoral y siguiendo las recomendaciones del comité de ética y cuidado animal (letra C de la Figura 11 ).
Análisis de la memoria a largo término.
Los ratones libres de tumores que sobrevivieron 150 días de una vacunación profiláctica previa con ICRP-LCT fueron desafiados otra vez con células cancerosas 4T1 vivas, los ratones sin tratamiento previo desafiados con células cancerosas 4T1 vivas se usaron como control. Los ratones en remisión después de la vacunación profiláctica con ICRP-LCT fueron desafiados otra vez vía s.c. con 5 x 105 células vivas 4T1 después de 150 días de la vacunación profiláctica. El crecimiento del tumor en el sitio de desafío fue evaluado después de 60 días posteriores a la reinmunización (letra A de la Figura 12).
Los resultados mostraron que el crecimiento del tumor fue prevenido en los ratones re-desafiados, mientras que un crecimiento continuo del tumor se observó en los ratones sin tratamiento previo, desafiados por primera vez (letra B de la Figura 12). Esto se refleja en un 100% de sobrevivencia (9/9) de los ratones redesafiados con ICRP-LCT, mientras que los ratones sin tratamiento previo perecieron el día 15 (5/5) (letra C de la Figura 12). Estos resultados sugieren fuertemente la estimulación de la memoria inmune antitumoral a largo plazo por la vacunación profiláctica ICRP-LCT.
Después de 150 días de haber llegado a remisión después del tratamiento con ICRP-LCT se volvieron a desafiar estos ratones con células cancerosas 4T1 viables. Se usaron como control ratones sin previo tratamiento, los cuales también fueron desafiados con células cancerosas 4T1 vivas (letra A de la Figura 13). Los resultados demostraron que en los ratones previamente tratados con ICRP-LCT se previno el crecimiento tumoral después de su re-exposición, mientras que se observó un crecimiento tumoral continuo en ratones sin tratamiento previo (letra B de la Figura 13). Esto se reflejó en el 100% (8/8) de supervivencia en los ratones reexpuestos a ICRP-LCT, mientras que los ratones sin tratamiento previo se sacrificaron el día 15 (5/5) (letra C de la Figura 13). Estos resultados sugieren fuertemente la estimulación de la memoria inmune antitumoral a largo plazo por el tratamiento con el ICRP-LCT.
Los ratones en remisión completa después de la vacunación profiláctica con ICRP-LCT se retaron nuevamente con 5x105 células 4T1 viables en 100 pL de PBS en el flanco opuesto (n= 9 ratones), utilizando ratones sin tratamiento previo (na’íve) como control (n = 9 ratones) (figura 14, A). Se evaluó el volumen tumoral y la sobrevida de los ratones, como se describió anteriormente. Además, 3 días después de la re-exposición al tumor se obtuvieron los tejidos de ganglios linfáticos que drenan el tumor (TDLN) y los sitios de re-reto tumoral de ratones sin tratamiento previo (naive) y ratones vacunados con ICRP-KCC, y se fijaron en formalina neutra al 3.7%, embebidos en parafina, seccionados (5 pm de espesor) y teñidos con H&E (MERCK). Los análisis histopatológicos fueron realizados por un patólogo veterinario externo (certificado profesional nacional 2593012). La sangre se obtuvo mediante punción cardíaca de ratones anestesiados como se describió anteriormente, y el aislamiento de PBMCs se realizó mediante centrifugación en gradiente de densidad, usando Ficoll-Hypaque-1119 (MERCK). Se obtuvieron células del sitio de re-reto tumoral, TDLN y bazo usando filtros de células de 70 pm (MERCK) y se suspendieron en FACS buffer al 2%. Las PBMCs, células de TDLN y células del sitio de re-reto tumoral se tiñeron con un cóctel de anticuerpos de linfocitos T de ratón: PE-Cy7 CD3e, PE CD4 y FITC CD8 (BD Pharmingen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La maduración de las DCs se analizó mediante inmunotinción de células de los ganglios linfáticos utilizando anti-CD1 1 c-Alexafluor 488 (R&D Systems) y anti-CD86-APC (BD Biosciences) a 25°C durante 30 min. Los marcadores de la superficie celular se evaluaron mediante citometría de flujo, como se mencionó anteriormente. Por último, se sembraron células 4T1 viables a una concentración de 1 x105 células/mL, se tiñeron con 0.1 pL/mL de calceína-AM (BD Biosciences) durante 30 min y se lavaron dos veces con PBS, posteriormente, se añadió a cada pozo esplenocitos de ratones na’íve o ratones previemnte vacundados con ICRP-KCC a una concentración de 40x105 células/ml (en una proporción de 1 :40, células cancerosas:esplenocitos); El co-cultivo de 4T1 +esplenocitos se incubó a 37°C y CO2 al 5% durante 24 h. Los sobrenadantes se obtuvieron y almacenaron a -80°C para analizar los niveles de IFN-y, TNF-a, IL-2, IL-4 e IL-5, como se mencionó anteriormente. Después, las células cancerosas se lavaron y se despegaron para analizar el porcentaje de células 4T1 negativas para calceína mediante citometría de flujo, como se describió anteriormente (n = 6 ratones por grupo).
Los resultados muestran que se logró prevenir el crecimiento tumoral en el grupo de ratones re-expuestos (ICRP-LCT), mientras que se observó un crecimiento tumoral continuo en ratones sin tratamiento previo, y expuestos por primera vez a las células 4T1 (figura 14, B). Esto se reflejó en el 100% (9/9) de sobrevida en el grupo de los ratones ICRP-LCT retados nuevamente, mientras que los ratones sin tratamiento previo perecieron el día 15 (9/9) (figura 14, C). Estos resultados sugieren fuertemente la estimulación de la memoria inmune antitumoral a largo plazo generada por la vacunación profiláctica con ICRP-LCT.
Para caracterizar mejor esta respuesta inmune se evaluó: el establecimiento tumoral, la maduración de DCs, la distribución de las células T y la citotoxicidad dirigida hacia células tumorales mediada por los esplenocitos después de tres días de re-reto tumoral (grupo ICRP-LCT), utilizando un grupo de ratones sin tratamiento previo como control negativo. Los análisis histopatológicos de los ganglios linfáticos que drenan el tumor mostraron una hiperplasia linfoide difusa en ratones sin previo tratamiento, mientras que los ganglios de ratones ICRP-LCT presentan una hiperplasia linfoide folicular, lo que indica una respuesta modulada, asociada con la memoria inmunológica (Figura 14, D). Debido a estas diferencias, a continuación, se evaluó la proporción de células dendríticas maduras en los ganglios linfáticos que drenan el tumor. Los resultados indicaron que el grupo ICRP-LCT re-retado no mostró una diferencia significativa en el porcentaje de DCs, pero si se observó un aumento en la proporción de DCs maduras (CD11 c+ CD86+) en comparación con los ratones no tratados previamente (Figura 14, 5). Por otro lado, los estudios de la proporción de células T en TDLN mostraron que no existía diferencia en el total de células CD3+, además, se observó una disminución significativa de células T CD4+ y un aumento de células T CD8+ en ratones ICRP-LCT, en comparación con ratones sin tratamiento previo (Figura 14, F).
Posteriormente, se evaluó la proporción de células T en sangre periférica y no se detectaron diferencias en el total de células CD3+, mientras que se observó una disminución significativa de células T CD4+ y un aumento de células T CD8+ en ratones ICRP-LCT en contraste con ratones no tratados previamente (figura 14, G). Los análisis histopatológicos del sitio de re-reto tumoral revelaron que los ratones sin tratamiento previo presentaron establecimiento tumoral con una infiltración extensa de células neoplásicas en el tejido muscular estriado y estas células presentaban una intensa actividad mitótica (figura 14, H izquierda). Por otro lado, los ratones ICRP-LCT mostraron una infiltración discreta de células neoplásicas en el tejido muscular estriado, observándose una fuerte infiltración de linfocitos y células polimorfonucleares (figura 14, H derecha). Además, se observó un aumento en las células CD3+ totales, una disminución significativa en las células T CD4+ y un aumento significativo en las células T CD8+ en el sitio de re-reto tumoral en los ratones ICRP-LCT, en comparación con los ratones sin tratamiento previo (figura 14, I). Los esplenocitos de los ratones ICRP-LCT mediaron un efecto citotóxico contra células 4T1 , induciendo la pérdida de viabilidad celular en hasta el 50% de las células cancerosas, mientras que no se detectó ningún efecto citotóxico significativo en las células 4T1 co-cultivadas con esplenocitos de ratones sin tratamiento previo (figura 14, J), lo que indica la citotoxicidad dirigida hacia las células tumorales. Finalmente, se observó un aumento significativo en la liberación de IFN-y (95.05 ± 40.01 pg/mL), TNF-a (4239.85 ± 784.34 pg/mL) e IL-2 (20.97 ± 0.68 pg/mL) en el cocultivo de células 4T1 con esplenocitos de ratones ICRP-LCT, en comparación con el co-cultivo de células 4T1 con esplenocitos de ratones sin tratamiento previo (IFN-y: 27,66 ± 15,12 pg/mL, TNF-a: 3310,46 ± 422,46 pg/mL e IL-2: 10.69 ± 2.94 pg/mL) (Fig. 5K).
Análisis Estadístico.
Los datos se analizaron usando el Software Graph Pad Prism (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA) y se mostró como media ± SD de triplicados de tres experimentos independientes. Para los estudios in vitro, el análisis estadístico se realizó usando la prueba t de Student pareada, y para los estudios in vivo y ex vivo se realizaron las pruebas de Mann-Whitney y la t de Student no pareada de dos colas.
Los lisados de células tumorales obtenidos mediante el tratamiento con inductores de muerte celular inmunogénica median los efectos terapéuticos óptimos en ratones inmunocompetentes. Los resultados presentados en la presente invención demuestran que el ICRP-LCT indujo la regresión tumoral y aumentó la supervivencia en ratones portadores de tumores 4T1 , lo que confirma la respuesta inmune desencadenada por ICRP-LCT contra las células 4T1 , conduciendo a la erradicación del tumor.
Además, es importante mencionar que se han propuesto lisados de células tumorales completas como un enfoque terapéutico en la terapia del cáncer. Existen vahos ensayos clínicos que utilizan lisados de células tumorales como fuentes inmunogénicas para el diseño de vacunas contra el cáncer, por ejemplo, hay un estudio en fase I / II para sujetos con cáncer de ovario, de trompas de Falopio o primario peritoneal recurrente para determinar la inmunogenicidad de un lisado celular autólogo oxidado (OC-L) administrado en combinación con un agonista del receptor 3 tipo Toll (NCT01312389), un ensayo de fase II que estudia la efectividad de la vacunación con células tumorales autólogas más adyuvante inmunológico (GM-CSF) en el tratamiento de pacientes con cáncer metástatico (NCT00002505), y otro estudio utiliza células tumorales resecadas irradiadas y mezcladas con CpG para crear una vacuna (NCT00780988). En otros ensayos clínicos, los lisados de células tumorales se utilizan para pulsar Células Dendríticas, por ejemplo, un estudio en la fase I temprana investiga la seguridad y eficacia de las vacunas de células dendríticas pulsadas con Usado de células tumorales enteras autólogas para el tratamiento de pacientes con tumores sólidos avanzados con una alta carga de mutaciones tumorales (NCT03671720). La mayoría de estos estudios se basan en modelos realizados en ratones, donde la mayoría de ellos utilizan lisados de células tumorales en combinación con adyuvantes para alcanzar un éxito terapéutico (Kawahara, M., & Hiroshi, T. (2015). “A Tumor Lysate Is an Effective Vaccine Antigen for the Stimulation of CD4 + T-Cell Function and Subsequent Induction of Antitumor Immunity Mediated by CD8 + T Cells.” Cancer Biology & Therapy 16(11 ): 1616-25; Pyo., Kyoung, Ho., Lee, Y., Lim, S., & Shin, E. (2016). “Immune Adjuvant Effect of a Toxoplasma Gondii Profilin-like Protein in Autologous Whole-Tumor-Cell Vaccination in Mice.” Oncotarget 7(45): 74107-19; Chunfeng, S. (2017). “In Vivo Antitumor Activity Evaluation of Cancer Vaccines Prepared by Various Antigen Forms in a Murine Hepatocellular Carcinoma Model.” Oncology Letters 14(6): 7391-97). Los resultados de la presente invención muestran una regresión tumoral en el 88% de los ratones tratados con ICRP-LCT, obteniendo dicho porcentaje sin ningún tipo de adyuvantes.
La vacunación profiláctica con ICRP-LCT previene el establecimiento de tumores en ratones BALB/c, lo que conduce a una memoria antitumoral a largo plazo. El tratamiento con ICRP-LCT generan regresión tumoral en ratones portadores de tumores de cáncer de mama, 4T1 , lo que desencadena una memoria antitumoral a largo plazo en los ratones tratados. Por tanto, la ICRP-LCT puede tener la capacidad de convertir las células de cáncer de mama en vacunas potenciales in vivo.
MODALIDAD PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
Para obtener el lisado tumoral de la presente invención se contemplan las siguientes etapas:
El proceso de obtención del lisado tumoral de esta invención se inicia a partir del plaqueo de 1.5 x 106 células 4T1 en una caja de cultivo de 75cm2 con 10mL de medio RPMI suplementado con 10% de SFB. Las células se incuban durante 12 a 24 horas (37SC y 5% de CO2) con el fin de que se adhieran a la caja de cultivo. Para el tratamiento de las células se utiliza la concentración citotóxica 100 (CC100) del ICRP y se realiza de la siguiente manera:
Se utiliza un frasco de Immunepotent-CRP de 5 Unidades (U), el cual se disuelve con 1250 mL de medio RPMI, para una concentración final de 0.4U/mL.
Con el fin de que la concentración final del tratamiento sea 0.5U/mL (CC100). Se retira el RPMI de la caja de cultivo y se agregan 8.75mL de medio RPMI nuevo, además se agregan 1.25 mL del Immunepotent-CRP previamente disuelto. Se incuban las células durante 24 horas (37SC y 5% de CO2).
Posteriormente, las células son recuperadas, lavadas con un buffer salino de fosfatos (PBS), y centrifugadas a 1600 rpm durante 10 minutos. Finalmente, el pellet celular se resuspende en 10OpiL de PBS el cual se toma con una jeringa de 1 mL y se inocula de forma subcutánea en el sitio opuesto a donde se encuentra el tumor.
El esquema de tratamiento en forma de vacuna se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama como se describe anteriormente, generando una respuesta inmune en el huésped contra la vacuna, e inmunizando contra cáncer de mama.
El esquema de tratamiento óptimo para el tratamiento de cáncer de mama utilizando el lisado tumoral obtenido por esta invención, es el siguiente: Dos inoculaciones semanales con 1.5 x 106 de células 4T1 tratadas con 0.5 U/mL de ICRP durante 24 horas.
El extracto dializable de leucocitos de bazo de bovino, bajo registro de marca como Immunepotent CRP (ICRP) se utiliza como inductor de muerte celular inmunogénica, el cual es citotóxico en células de cáncer de mama y promueve la liberación de patrones moleculares asociados a daño, capaces de ser reconocidos por el sistema inmune y activar la respuesta inmune antitumoral. El buffer salino de fosfatos se utiliza como vehículo del lisado tumoral.

Claims

24 REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficientemente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:
1. Una composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama caracterizada porque comprende un lisado tumoral de células de cáncer de mama tratadas con una CC100 de un extracto dializable de leucocitos de bazo de bovino.
2. La composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la CC100 del extracto dializable de leucocitos de bazo de bovino es de 0.5 U/mL a 2 U/mL.
3. Un proceso de obtención de una composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, caracterizado porque comprende las etapas de a) Incubar células de cáncer de mama; b) Tratar durante 24 horas a las células incubadas en la etapa a) con un extracto dializable de leucocitos de bazo de bovino (Immunepotent CRP) a una concentración citotóxica 100 (CC100); c) Recuperar las células tratadas en la etapa b) y lavar dichas células con un buffer; d) Centrifugar las células recuperadas en la etapa c) para obtener un pellet celular, y e) Resuspender el pellet celular en un buffer para obtener una composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama.
4. El proceso de obtención de una composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque en la etapa a) se incuban 1 .5 x 106 de células por 12 a 24 horas a 37°C y 5% de CO2.
5. El proceso de obtención de una composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque en la etapa b) la CC100 es de 0.5 U/mL a 2 U/mL.
6. El proceso de obtención de una composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque en la etapa b) las células se tratan a 37SC y con 5% de CO2. El proceso de obtención de una composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque en la etapa c) el buffer es un buffer salino de fosfatos (PBS). El proceso de obtención de una composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque en la etapa d) las células son centrifugadas a 1600 rpm durante 10 minutos. El proceso de obtención de una composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque en la etapa e) el pellet celular se resuspende en un buffer salino de fosfatos (PBS). La composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama descrita en las reivindicaciones 1 a 2 para usarse como agente antitumoral para el tratamiento y prevención de cáncer de mama. Una vacuna para el tratamiento y prevención de cáncer de mama caracterizada porque comprende a. una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama descrita en las reivindicaciones 1 a 2. La vacuna para el tratamiento y prevención de cáncer de mama, de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada porque permite la estimulación de la memoria inmune antitumoral a largo plazo. Un proceso para el tratamiento o prevención de cáncer de mama que se comprende de: a. Administrar en una vacuna descrita en las reivindicaciones 11 a 12 en una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama como se describe en las reivindicaciones 1 a 2, generando una respuesta inmune en el huésped contra la vacuna, e inmunizando contra cáncer de mama.
PCT/MX2023/050005 2022-01-24 2023-01-23 Composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, su proceso de obtención y su uso como agente antitumoral WO2023140724A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MXMX/A/2022/000975 2022-01-24
MX2022000975A MX2022000975A (es) 2022-01-24 2022-01-24 Composicion a base de un lisado tumoral de celulas de cancer de mama, su proceso de obtencion y su uso como agente antitumoral.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023140724A1 true WO2023140724A1 (es) 2023-07-27

Family

ID=87348594

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/MX2023/050005 WO2023140724A1 (es) 2022-01-24 2023-01-23 Composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, su proceso de obtención y su uso como agente antitumoral

Country Status (2)

Country Link
MX (1) MX2022000975A (es)
WO (1) WO2023140724A1 (es)

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CALLMANN CASSANDRA E ET AL.: "Tumor cell lysate-loaded immunostimulatory spherical nucleic acids as therapeutics for triple-negative breast cancer", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 117, no. 30, 28 July 2020 (2020-07-28), pages 17543 - 17550, XP055866180, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.2005794117 *
DOMBROSKI JENNA A., JYOTSANA NIDHI, CREWS DAVIS W., ZHANG ZHENJIANG, KING MICHAEL R.: "Fabrication and Characterization of Tumor Nano-Lysate as a Preventative Vaccine for Breast Cancer", LANGMUIR, vol. 36, no. 23, 16 June 2020 (2020-06-16), US , pages 6531 - 6539, XP093081268, ISSN: 0743-7463, DOI: 10.1021/acs.langmuir.0c00947 *
LARA HUMBERTO H., TURRENT LILIANA IXTEPAN, GARZA-TREVIÑO ELSA N., TAMEZ-GUERRA REYES, RODRIGUEZ-PADILLA CRISTINA: "Clinical and immunological assessment in breast cancer patients receiving anticancer therapy and bovine dialyzable leukocyte extract as an adjuvant", EXPERIMENTAL AND THERAPEUTIC MEDICINE, vol. 1, no. 3, 1 January 2010 (2010-01-01), GR , pages 425 - 431, XP093081277, ISSN: 1792-0981, DOI: 10.3892/etm_00000066 *
MARTÍNEZ-TORRES ANA CAROLINA, REYES-RUIZ ALEJANDRA, CALVILLO-RODRIGUEZ KENNY MISAEL, ALVAREZ-VALADEZ KARLA MARIA, USCANGA-PALOMEQU: "IMMUNEPOTENT CRP induces DAMPS release and ROS-dependent autophagosome formation in HeLa and MCF-7 cells", BMC CANCER, vol. 20, no. 1, 1 December 2020 (2020-12-01), XP093081273, DOI: 10.1186/s12885-020-07124-5 *
REYES-RUIZ ALEJANDRA ET AL.: "The bovine dialysable leukocyte extract IMMUNEPOTENT CRP induces immunogenic cell death in breast cancer cells leading to long-term antitumour memory", BRITISH JOURNAL OF CANCER, vol. 124, no. 8, 2 March 2021 (2021-03-02), London, pages 1398 - 1410, XP037682349, ISSN: 0007-0920, DOI: 10.1038/s41416-020-01256-and *
RUIZ ALEJANDRA REYES: "Study of Ca2+ -implication and immunogenicity of the regulated cell death induced by immunepotent CRP on breast cancer", TESIS, UNIVERSIDAD AUTONOMA OF NUEVO LEON, SCHOOL OF BIOLOGICAL SCIENCES, 1 July 2020 (2020-07-01), pages 1 - 134, XP093081265 *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022000975A (es) 2023-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2451599T3 (es) Uso de liposomas en un vehículo que comprende una fase hidrofóbica continua como un vehículo para el tratamiento del cáncer
ES2965009T3 (es) Terapia combinada contra el cancer
ES2323895T3 (es) Uso de peptidos nativos y sus derivados optimizados para vacunacion.
RU2473560C2 (ru) Совместная химиотерапия и иммунотерапия
ES2702622T3 (es) Método para mejorar la eficacia de una vacuna de survivina en el tratamiento de cáncer
Baghban Rahimi et al. Enhancement of therapeutic DNA vaccine potency by melatonin through inhibiting VEGF expression and induction of antitumor immunity mediated by CD8+ T cells
CN103800896A (zh) 一种自体肿瘤疫苗的制备方法及其应用
EP3265120B1 (en) Method
Tian et al. Luteolin as an adjuvant effectively enhances CTL anti-tumor response in B16F10 mouse model
RU2759728C2 (ru) Лекарственное средство
RU2709015C2 (ru) Лекарственное средство
Shi et al. Development of novel self‐assembled vaccines based on tumour‐specific antigenic peptide and TLR2 agonist for effective breast cancer immunotherapy via activating CD8+ T cells and enhancing their function
CA2945220C (en) Method of treating melanoma
CN113244273A (zh) 疟原虫在制备联合放射疗法用于抗肿瘤的制剂中的应用
CN105816863A (zh) 免疫原性抗炎组合物
WO2023140724A1 (es) Composición a base de un lisado tumoral de células de cáncer de mama, su proceso de obtención y su uso como agente antitumoral
ES2335490T3 (es) Vacunacion con celulas inmunoaisladas y productoras de un inmunomodulador.
Yamazaki et al. Boosting CAR T cell expansion and therapeutic activity with low-dose radiation therapy
Gabri et al. Complete antitumor protection by perioperative immunization with GM3/VSSP vaccine in a preclinical mouse melanoma model
US20060062766A1 (en) Remedy for cancer
Safahi et al. Exploring the Potential of Echinococcus granulosus Antigens in Immunotherapy for Cancer
Caproni et al. Anti-Tumor Efficacy of In Situ Vaccination Using Bacterial Outer Membrane Vesicles. Cancers 2023, 15, 3328
WO2018119535A1 (es) Composición tópica natural de extracto de lithraea caustica y su uso en tumores
Wan et al. Phase I/II trail of autologous dendritic cell vaccine in patients with colorectal carcinoma
Kosmatopoulos et al. Safety and immunogenicity of the optimized cryptic peptideTERT572Y in patients with advanced malignancies: a Phase I clinical study.

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23743567

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE