ES2347762T3

ES2347762T3 - Sincronizacion de epitopos en celulas que presentan antigenos.

Info

Publication number: ES2347762T3
Application number: ES01930922T
Authority: ES
Inventors: John J. L. Simard; David C. Diamond; Xiang-Dong Lei
Original assignee: Mannkind Corp
Current assignee: Mannkind Corp
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2010-11-04
Anticipated expiration: 2021-04-27
Also published as: ATE474931T1; AU2010251790A1; EP1276896A2; JP2003535824A; AU2001257410B2; AU2001257410B8; WO2001082963A3; CN1440462A; EP2278024A1; DE60142615D1; WO2001082963A2; EP2278023A1; AU2001257410B9; DK1276896T3; EP1276896B1; AU2010251790B2; AU5741001A; EP2248910A1; US20070269464A1; CA2405363A1

Abstract

Un método de obtención de una composición inmunógena, que comprende: identificar un epítopo a partir de un primer antígeno asociado a una célula diana, en el que la identificación comprende la confirmación de que el epítopo es un epítopo constitutivo producido en una célula en la que el proteosoma constitutivo es predominantemente activo; en el que el primer antígeno se selecciona del grupo que consiste en MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, RAGE, NY-ESO, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR- ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein-Barr, EBNA, los antígenos E6 y E7 de virus de papiloma humano (HPV), TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, ß-Catenina, CDK4, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, telomerasa, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, ß-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, y GA733-2\KSA, y en el que el epítopo constitutivo tiene una longitud de 9 o 10 aminoácidos identificar un grupo de epítopos a partir de un segundo antígeno asociado a la célula diana, en el que el grupo de epítopos comprende un epítopo inmunitario; en el que el segundo antígeno se selecciona del grupo que consiste en MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, RAGE, NY-ESO, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A- PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein-Barr, EBNA, los antígenos E6 y E7 de virus de papiloma humano (HPV), TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, cmet, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, ß-Catenina, CDK4, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, telomerasa, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, ß-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, y GA733-2\KSA, en el que la longitud del grupo de epítopos es de al menos 10 aminoácidos y menor de 75 aminoácidos combinar el epítopo constitutivo en forma de un péptido, polipéptido o ácido nucleico que codifica dicho péptido o polipéptido, y el grupo de epítopos en forma de un polipéptido que contiene un grupo de epítopos o un ácido nucleico que codifica un grupo para obtener una composición inmunógena adecuada para provocar que una población de células profesionales presentadoras de antígenos presente el epítopo constitutivo, en el que la célula diana es una célula neoplásica o una célula infectada por un virus.

Description

Sincronización de epítopos en células que presentan antígenos.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención descrita en la presente memoria se refiere a métodos y composiciones para inducir a una célula presentadora de antígenos a presentar un epítopo específico de una célula diana particular, por lo que se estimula una respuesta eficaz de células T citotóxicas hacia la célula diana.

La invención se refiere además a la identificación de epítopos y grupos de epítopos de las células diana, y también a los vectores que codifican epítopos que se pueden usar para generar composiciones farmacéuticas inmunológicamente activas. Estas composiciones, cuando se administran, pueden estimular el sistema inmunitario de un sujeto para generar una respuesta inmunitaria contra una célula diana que expone el antígeno diana. La invención es, por lo tanto, útil en el tratamiento y la prevención de enfermedades neoplásicas y virales.

Descripción de la técnica relacionada Neoplasia y el Sistema Inmunitario

Se cree que la enfermedad neoplásica conocida comúnmente como cáncer es generalmente el resultado de una única célula que crece fuera de control. El estado de crecimiento descontrolado generalmente es el resultado de un proceso de múltiples etapas en el que fallan varios sistemas celulares, lo que da como resultado la génesis de una célula neoplásica. La célula neoplásica resultante se reproduce rápidamente, forma uno o más tumores, y finalmente puede provocar la muerte del hospedador.

Debido a que el progenitor de la célula neoplásica comparte el material genético del hospedador, las células neoplásicas están exentas en gran medida del sistema inmunitario del hospedador. Durante la vigilancia inmunitaria, el proceso en el que el sistema inmunitario del hospedador vigila y localiza materiales exógenos, una célula neoplásica parecerá una célula "propia" a la maquinaria de vigilancia inmunitaria del hospedador.

Virus y el Sistema Inmunitario

En contraste con las células cancerosas, la infección viral implica la expresión de antígenos que claramente no son propios. Como resultado, muchas infecciones virales son resueltas eficazmente por el sistema inmunitario con secuelas clínicas mínimas. Además, ha sido posible desarrollar vacunas eficaces para muchas de las infecciones que provocan enfermedades graves. Se ha usado eficazmente una diversidad de aproximaciones con vacunas para combatir diversas enfermedades. Estas aproximaciones incluyen las vacunas de subunidades, que consisten en proteínas individuales producidas por medio de la tecnología del ADN recombinante. A pesar de estos avances, la selección y la administración eficaces de los epítopos mínimos para el uso como vacunas virales han seguido siendo problemáticas.

Además de las dificultades implicadas en la selección de los epítopos, sigue existiendo el problema de los virus que han desarrollado la capacidad de eludir el sistema inmunitario del hospedador. Muchos virus, en especial los virus que establecen infecciones persistentes, tales como los miembros de las familias de herpesvirus y poxvirus, producen moléculas inmunomoduladoras que permiten que el virus eluda el sistema inmunitario del hospedador. Los efectos de estas moléculas inmunomoduladoras sobre la presentación de antígenos se pueden superar eligiendo como diana epítopos seleccionados para la administración en forma de composiciones inmunógenas. Para entender mejor la interacción de las células neoplásicas y las células infectadas por virus con el sistema inmunitario del hospedador, a continuación se expone una discusión sobre los componentes del sistema.

El sistema inmunitario funciona para distinguir las moléculas endógenas de un organismo (moléculas "propias") del material exógeno o ajeno al organismo (moléculas "ajenas"). El sistema inmunitario tiene dos tipos de respuestas adaptativas a los cuerpos exógenos basadas en los componentes que actúan como mediadores en la respuesta: una respuesta humoral y una respuesta mediada por células. La respuesta humoral está mediada por anticuerpos, mientras la respuesta mediada por células implica a las células clasificadas como linfocitos. Las estrategias antineoplásicas y antivirales recientes se han centrado en la movilización del sistema inmunitario del hospedador como medio del tratamiento o la terapia antineoplásica o antiviral.

El sistema inmunitario funciona en tres fases para proteger al hospedador de los cuerpos exógenos: la fase cognitiva, la fase de activación, y la fase efectora. En la fase cognitiva, el sistema inmunitario reconoce y señaliza la presencia de un antígeno exógeno o invasor en el cuerpo. El antígeno exógeno puede ser, por ejemplo, un marcador de la superficie celular de una célula neoplásica o de una proteína viral. Una vez que el sistema detecta un cuerpo invasor, las células específicas del antígeno del sistema inmunitario proliferan y se diferencian en respuesta a las señales desencadenadas por el invasor. La última etapa es la etapa efectora, en la que las células efectoras del sistema inmunitario responden y neutralizan el invasor detectado.

Una serie de células efectoras llevan a cabo una respuesta inmunitaria hacia un invasor. Un tipo de célula efectora, la célula B, genera anticuerpos dirigidos contra los antígenos exógenos a los que se enfrenta el hospedador. En combinación con el sistema del complemento, los anticuerpos dirigen la destrucción de las células o de los organismos que albergan el antígeno seleccionado como diana. Otro tipo de célula efectora es la célula citolítica natural (célula NK), un tipo de linfocito que tiene la capacidad de reconocer espontáneamente y destruir una diversidad de células infectadas por virus, así como tipos de células malignas. No se conoce bien el método usado por las células NK para reconocer las células diana.

Otro tipo de célula efectora, la célula T, tiene miembros clasificados en tres subcategorías, y cada uno desempeña un papel diferente en la respuesta inmunitaria. Las células T colaboradoras secretan citocinas que estimulan la proliferación de otras células necesarias para generar una respuesta inmunitaria eficaz, mientras las células T supresoras inhiben la respuesta inmunitaria. Una tercera categoría de célula T, la célula T citotóxica (CTL), es capaz lisar directamente una célula seleccionada como diana que presenta un antígeno exógeno en su superficie.

El Complejo Principal de Histocompatibilidad y el Reconocimiento de las Dianas de las Células T

Las células T son células inmunitarias específicas de antígenos que funcionan en respuesta a señales de antígenos específicos. Los linfocitos B y los anticuerpos que producen también son entidades específicas de antígenos. Sin embargo, a diferencia de los linfocitos B, las células T no responden a antígenos en forma libre o soluble. Para que una célula T responda a un antígeno, es necesario que el antígeno esté unido a un complejo presentador conocido como el complejo principal de histocompatibilidad (MHC).

Las proteínas del complejo MHC proporcionan el medio mediante el cual las células T diferencian las células nativas o "propias" de las células exógenas. Existen dos tipos de MHC, el MHC de clase I y el MHC de clase II. Las células T colaboradoras (CD4+) interaccionan de forma predominante con las proteínas del MHC de clase II, mientras las células T citolíticas (CD8+) interaccionan de forma predominante con las proteínas del MHC de clase I. Ambos complejos del MHC son proteínas transmembrana con la mayoría de su estructura en la superficie externa de la célula. Además, ambas clases de MHC tienen una hendidura de unión de péptidos en sus porciones externas. Es en esta hendidura en donde se unen fragmentos pequeños de proteínas, nativas o exógenas, y se presentan al medio extracelular.

Las células denominadas células presentadoras de antígenos (APCs) exhiben los antígenos a las células T mediante el uso de los complejos MHC. Para que las células T reconozcan un antígeno, se debe presentar en el complejo MHC para su reconocimiento. Este requisito se denomina restricción MHC, y es el mecanismo mediante el cual las células T diferencian las células "propias" de las "ajenas". Si un antígeno no es expuesto por un complejo MHC reconocible, la célula T no reconocerá y no actuará sobre la señal antigénica. Las células T específicas del péptido unido a un complejo MHC reconocible se unen a estos complejos MHC-péptido y pasan a las siguientes etapas de la respuesta inmunitaria.

Tal como se discutió anteriormente, las células neoplásicas son ignoradas en gran medida por el sistema inmunitario. Se está realizando un gran esfuerzo actualmente en un intento de aprovechar el sistema inmunitario de un hospedador para ayudar a combatir la presencia de células neoplásicas en un hospedador. Un área de tal investigación implica la formulación de vacunas anticancerosas.

Vacunas Anticancerosas

Entre las diversas armas disponibles para un oncólogo en la batalla contra el cáncer está el sistema inmunitario del paciente. Se ha trabajado en diversos intentos para hacer que el sistema inmunitario combata las enfermedades cancerosas o neoplásicas. Desafortunadamente, los resultados hasta la fecha han sido en gran medida decepcionantes. Un área de interés particular implica la generación y el uso de vacunas anticancerosas.

Para generar una vacuna u otra composición inmunógena, es necesario introducir en un sujeto un antígeno o epítopo contra el que se pueda generar una respuesta inmunitaria. Aunque las células neoplásicas proceden de, y por lo tanto son sustancialmente idénticas a, las células normales a nivel genético, se sabe que muchas células neoplásicas presentan antígenos asociados a tumores (TuAAs). En teoría, estos antígenos podrían ser usados por el sistema inmunitario de un sujeto para reconocer estos antígenos y atacar a las células neoplásicas. Desafortunadamente, las células neoplásicas parecen ser ignoradas por el sistema inmunitario del hospedador.

Se han desarrollado varias estrategias diferentes en un intento de generar vacunas con actividad contra las células neoplásicas. Estas estrategias incluyen el uso de antígenos asociados a tumores como inmunógenos. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.993.828 describe un método para producir una respuesta inmunitaria contra una subunidad particular del antígeno asociado a tumores urinarios administrando a un sujeto una dosis eficaz de una composición que comprende células tumorales inactivadas que tienen el antígeno asociado a tumores urinarios en la superficie de la célula, y al menos un antígeno asociado a tumor seleccionado del grupo que consiste en GM-2, GD-2, Antígeno Fetal y Antígeno Asociado a Melanoma. Por lo tanto, esta patente describe el uso de células tumorales completas inactivadas como inmunógeno en una vacuna anticancerosa.

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Otra estrategia usada con las vacunas anticancerosas implica la administración de una composición que contiene antígenos tumorales aislados. En una aproximación, se usaron péptidos antigénicos MAGE-A1 como inmunógeno (véase Chaux, P., et al., "Identification of Five MAGE-A1 Epitopes Recognized by Cytolytic T Lymphocytes Obtained by III Vitro Stimulation with Dendritic Cells Transduced with MAGE-A1", J. Immunol., 163(5):2928-2936 (1999)). Ha habido varios ensayos terapéuticos que usaban péptidos MAGE-A1 para la vacunación, aunque la eficacia de los regímenes de vacunación fue limitada. Los resultados de algunos de estos ensayos se discuten en Vose, J.M., "Tumor Antigens Recognized by T Lymphocytes", 10^{th} European Cancer Conference, día 2, 14 de sept., 1999.

En otro ejemplo de antígenos asociados a tumores usados como vacunas, Scheinberg, et al. trataron a 12 pacientes de leucemia mielógena crónica (LMC) que ya estaban recibiendo interferón (IFN) o hidroxiurea con 5 inyecciones de péptidos bcr-abl asociados a la clase I con un péptido auxiliar más el adyuvante QS-21. Scheinberg, D.A., et al., "BCR-ABL Breakpoint Derived Oncogene Fusion Peptide Vaccines Generate Specific Immune Responses in Patients with Chronic Myelogenous Leukemia (CML)" [Resumen 1665], American Society of Clinical Oncology, 35^{th} Annual Meeting, Atlanta (1999). Se provocaron respuestas de células T proliferativas y de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) indicativas de actividad T colaboradora, pero no se observó una actividad de células T citolíticas en las muestras de sangre reciente.

Se observan ejemplos adicionales de intentos de identificar TAAs para el uso como vacunas en el trabajo reciente de Cebon, et al., y Scheibenbogen, et al. Cebon et al. inmunizaron pacientes con melanoma metastásico mediante el uso de péptido MART-1_{26-35} administrado de forma intradérmica con IL-12 en dosis crecientes administradas de forma subcutánea o intravenosa. De los primeros 15 pacientes, se observó 1 remisión completa, 1 remisión parcial, y 1 respuesta mixta. Los ensayos inmunitarios para la generación de células T incluyeron DTH, que se observó en los pacientes con o sin IL-12. Los ensayos de CTL positivos se observaron en pacientes con indicios de beneficios clínicos, pero no en los pacientes sin regresión tumoral. Cebon, et al., "Phase I Studies of Immunization with Melan-A and IL-12 in HLA A2+ Positive Patients with Stage III and IV Malignant Melanoma", [Resumen 1671], American Society of Clinical Oncology, 35^{th} Annual Meeting, Atlanta (1999).

Scheibenbogen, et al. inmunizaron a 18 pacientes con 4 péptidos de tirosinasa restringidos de HLA de clase I, 16 con melanoma metastásico y 2 pacientes auxiliares. Scheibenbogen, et al., "Vaccination with Tyrosinase peptides and GM-CSF in Metastatic Melanoma: a Phase II Trial", [Resumen 1680], American Society of Clinical Oncology, 35^{th} Annual Meeting, Atlanta (1999). Se observó una actividad de CTLs incrementada en 4/15 pacientes, 2 pacientes auxiliares, y 2 pacientes con indicios de regresión tumoral. Como en el ensayo de Cebon et al., los pacientes con enfermedad progresiva no mostraron una inmunidad reforzada. A pesar de los diversos esfuerzos realizados hasta la fecha para generar vacunas anticancerosas eficaces, todavía no se ha desarrollado tal composición.

Los procedimientos para seleccionar un epítopo de interés a partir de una población de fragmentos peptídicos que tienen una afinidad conocida o predicha hacia una hendidura de unión de un péptido receptor de la clase I del complejo principal de histocompatibilidad, o para ensayar/confirmar que un epítopo seleccionado representa el producto de una reacción de escisión por proteosomas, se describen en los documentos WO 97/41440, DE-A-4423392 y en Melief, C.J. (1996), Ann. Oncol. 7 (supl. 1) pág 18.

El documento WO 97/41440 describe una vacuna para melanomas que se prepara mediante el empleo de la secuencia de epítopo representada por SEQ ID No:78 de la presente solicitud, y Thomson, S.A. et al., Proc. Natl. Acad. USA 92:5845-5849 (1995) ilustra la posibilidad de unir un gran número de epítopos de CTLs CD8 en vacunas de CTLs de poliepítopos artificiales.

Las estrategias con vacunas para proteger contra enfermedades virales han tenido muchos éxitos. Quizás el más notable de estos es el progreso que se ha realizado contra la enfermedad de la viruela, que se ha llevado hasta la extinción. El éxito de la vacuna de la poliomielitis es de una magnitud similar.

Las vacunas virales se pueden agrupar en tres clasificaciones: vacunas con virus vivos atenuados, tales como vaccinia para viruela, la vacuna de Sabin para poliovirus, y sarampión, paperas y rubeola; vacunas con virus completamente muertos o inactivados, tales como la vacuna de Salk para poliovirus, vacuna para el virus de la hepatitis A y las vacunas para los virus de la gripe en general; y vacunas de subunidades, tales como hepatitis B. Debido a la carencia de un genoma viral completo, las vacunas de subunidades ofrecen un mayor grado de seguridad que las basadas en virus completos.

El paradigma de una vacuna de subunidades eficaz es la vacuna contra la hepatitis B recombinante basada en la proteína de la cubierta viral. A pesar del gran interés académico en llevar el concepto de subunidad más allá de las proteínas simples hasta los epítopos individuales, los esfuerzos todavía tienen que dar frutos. La investigación de vacunas virales se ha concentrado además en la inducción de una respuesta de anticuerpos, aunque también se pueden dar respuestas celulares. Sin embargo, muchas de las formulaciones de subunidades son especialmente ineficaces en la generación de una respuesta de CTLs.

Sumario de la invención

La presente invención se dirige a métodos para obtener una composición inmunógena tal como se define en las reivindicaciones 1-11.

Vacunas que Comprenden Epítopos Constitutivos

En la presente memoria se describe una vacuna que incluye un epítopo constitutivo derivado de un antígeno asociado a una célula diana. De forma ventajosa, la célula diana puede ser una célula neoplásica. La célula neoplásica puede ser cualquier célula transformada asociada a tumores sólidos o linfomas tales como leucemia, carcinoma, linfoma, astrocitoma, sarcoma, glioma, retinoblastoma, melanoma, tumor de Wilm, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer hepatocelular, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de cuello de útero, cáncer testicular, cáncer de células renales, y cáncer cerebral. De forma alternativa, la célula diana puede estar infectada por un parásito intracelular. Por ejemplo, el parásito intracelular puede ser un virus tal como un adenovirus, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus herpes simple, herpesvirus 6 humano, virus varicela-zóster, virus de hepatitis virus de papiloma, parvovirus, poliomavirus, virus de sarampión, virus de rubeola, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), o virus de leucemia de células T humanas. El parásito intracelular puede ser una bacteria, protozoo, hongo, o un prión. Más en particular, el parásito intracelular puede ser Chlamydia, Listeria, Salmonella, Legionella, Brucella, Coxiella, Rickettsia, Mycobacterium, Leishmania, Trypanasoma, Toxoplasma, y Plasmodium.

El epítopo constitutivo puede proceder de un antígeno asociado a la célula diana. El antígeno puede ser MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-I, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, RAGE, NY-ESO, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein-Barr, EBNA, los antígenos E6 y E7 de virus de papiloma humano (HPV), TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, \beta-Catenina, CDK4, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, telomerasa, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, \alpha-fetoproteína, \beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, GA733-2\KSA y similares. Opcionalmente, el antígeno puede ser un antígeno asociado a un virus. En otro aspecto de la invención, el antígeno puede ser un antígeno asociado a un parásito.

El epítopo constitutivo puede incluir o codificar un polipéptido de una longitud de alrededor de 6 a alrededor de 23 aminoácidos. Preferiblemente, el polipéptido tiene una longitud de 9 ó 10 aminoácidos. El polipéptido puede ser un polipéptido sintético. De forma ventajosa, la vacuna incluye adicionalmente tampones, detergentes, tensoactivos, antioxidantes o agentes reductores. Aún en otro aspecto de la vacuna, el epítopo constitutivo incluye de forma ventajosa un ácido nucleico. En una realización preferida, el epítopo constitutivo es específico para al menos un alelo del MHC. El alelo puede codificar los tipos A1, A2, A3, A11, A24, A26, A29, B7, B8, B14, B18, B27, B35, B44, B62, B60, o B51.

La vacuna puede incluir un epítopo inmunitario. Opcionalmente, el epítopo inmunitario procede de un segundo antígeno asociado a la célula diana. El primer antígeno y el segundo antígeno pueden ser iguales o diferentes. De forma ventajosa, el epítopo constitutivo es específico de un primer alelo del MHC, y el epítopo inmunitario es específico de un segundo alelo del MHC. El primer alelo y el segundo alelo pueden ser iguales o diferentes.

La vacuna puede incluir un grupo de epítopos (véase más adelante) que incluye el epítopo inmunitario. El grupo de epítopos puede proceder de un segundo antígeno asociado a la célula diana. El primer antígeno y el segundo antígeno pueden ser iguales o diferentes. De forma ventajosa, el grupo de epítopos incluye o codifica un polipéptido que tiene una longitud de al menos 10 aminoácidos, pero menos de alrededor de 60 aminoácidos. Preferiblemente, la longitud del polipéptido del grupo de epítopos es menor de alrededor del 80%, 50%, o 20% de la longitud del segundo antígeno.

La vacuna puede incluir además un segundo epítopo constitutivo derivado de un segundo antígeno asociado a una segunda célula diana. Opcionalmente, el primer antígeno y el segundo antígeno pueden ser iguales. De forma alternativa, el primer y el segundo antígenos son diferentes. De forma similar, la primera y la segunda células diana pueden ser iguales o diferentes.

La vacuna puede incluir de forma ventajosa una construcción de ácido nucleico que codifica un epítopo constitutivo derivado de un antígeno asociado a una célula diana. Preferiblemente, la célula diana es una célula neoplásica. La célula neoplásica puede ser cualquier célula transformada asociada a tumores sólidos o linfomas tales como leucemia, carcinoma, linfoma, astrocitoma, sarcoma, glioma, retinoblastoma, melanoma, tumor de Wilm, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer hepatocelular, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de cuello de útero, cáncer testicular, cáncer de células renales, y cáncer cerebral. En contraste, la célula diana puede ser una célula infectada por un parásito intracelular. El parásito intracelular puede ser un virus. En particular, el virus puede ser un adenovirus, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus herpes simple 1, virus herpes simple 2, herpesvirus 6 humano, virus varicela-zóster, virus de hepatitis B, virus de hepatitis D, virus de papiloma, parvovirus B19, poliomavirus BK, poliomavirus JC, virus de hepatitis C, virus de sarampión, virus de rubeola, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de leucemia de células T humanas de tipo I, o virus de leucemia de células T humanas de tipo II. Opcionalmente, el parásito intracelular es una bacteria, protozoo, hongo, o prión. Más en particular, el parásito intracelular puede ser Chlamydia, Listeria, Salmonella, Legionella, Brucella, Coxiella, Rickettsia, Mycobacterium, Leishmania, Trypanasoma, Toxoplasma, y Plasmodium.

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El antígeno de la vacuna que incluye una construcción de ácido nucleico puede ser MelanA (MART-1), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, RAGE, NY-ESO, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein-Barr, EBNA, los antígenos E6 y E7 de virus de papiloma humano (HPV), TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, \beta-Catenina, CDK4, Mum-1 y p16. De forma alternativa, el antígeno puede ser un antígeno asociado a un virus o infección viral. En aún otra realización, el antígeno es un antígeno asociado a parásitos intracelulares que no son virales.

El epítopo constitutivo codifica preferiblemente un polipéptido que tiene una longitud de alrededor de 6 a alrededor de 23 aminoácidos. Más preferiblemente, el epítopo constitutivo codifica un polipéptido que tiene una longitud de 9 a 10 aminoácidos. De forma ventajosa, el epítopo constitutivo es específico para al menos un alelo del MHC. El alelo puede codificar el tipo A1, A2, A3, A11, A24, A26, A29, B7, B8, B14, B18, B27, B35, B44, B62, B60, o B51.

En otro aspecto de la invención, la vacuna incluye un epítopo inmunitario. El epítopo inmunitario puede proceder de un segundo antígeno asociado a la célula diana. El primer antígeno y el segundo antígeno pueden ser iguales o diferentes. Preferiblemente, el epítopo constitutivo es específico para un primer alelo del MHC y el epítopo inmunitario es específico para un segundo alelo del MHC. El primer alelo y el segundo alelo pueden ser iguales o diferentes.

La vacuna con una construcción de ácido nucleico incluye adicionalmente un grupo de epítopos. El grupo de epítopos incluye un epítopo inmunitario. Preferiblemente, el grupo de epítopos procede de un segundo antígeno asociado a la célula diana. El primer antígeno y el segundo antígeno pueden ser iguales o diferentes.

De forma ventajosa, el grupo de epítopos incluye o codifica un polipéptido que tiene una longitud de al menos 10 aminoácidos y menos de alrededor de 60 aminoácidos. En una realización preferida, el grupo de epítopos incluye o codifica un polipéptido con una longitud menor de alrededor del 80% de la longitud del segundo antígeno. En otra realización preferida, la longitud del polipéptido es menor de alrededor del 50% de la longitud del segundo antígeno. En una realización particularmente preferida, la longitud del polipéptido es menor de alrededor del 20% de la longitud del segundo antígeno.

La vacuna que incluye una construcción de ácido nucleico puede incluir además un segundo epítopo constitutivo, en el que el segundo epítopo constitutivo procede de un segundo antígeno asociado a una segunda célula diana. El primer antígeno y el segundo antígeno pueden ser iguales o diferentes. Preferiblemente, la primera célula diana y la segunda célula diana son diferentes.

Construcciones de Ácidos Nucleicos

En la presente memoria se describe una construcción de ácido nucleico que incluye una primera región codificante, en la que la primera región codificante incluye una primera secuencia que codifica al menos un primer polipéptido, en el que el primer polipéptido incluye un primer epítopo constitutivo derivado de un primer antígeno asociado a una primera célula diana. La primera región codificante puede incluir además una segunda secuencia que codifica al menos un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido incluye un segundo epítopo derivado de un segundo antígeno asociado a una segunda célula diana. El primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden estar contiguos o no estar contiguos. El segundo epítopo puede ser un epítopo constitutivo o un epítopo inmunitario. El primer antígeno y el segundo antígeno pueden ser iguales o diferentes; de forma similar, la primera y la segunda células diana pueden ser iguales o diferentes.

La célula diana puede ser una célula neoplásica, tal como, por ejemplo, leucemia, carcinoma, linfoma, astrocitoma, sarcoma, glioma, retinoblastoma, melanoma, tumor de Wilm, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer hepatocelular, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de cuello de útero, cáncer testicular, cáncer de células renales, y cáncer cerebral. El primer antígeno puede ser, por ejemplo, MART-1/MelanA, gap100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15, NY-ESO, los productos de un miembro de la familia de genes SSX, CT-7, y los productos de un miembro de la familia de genes SCP. La célula diana puede estar infectada por un virus tal como, por ejemplo, adenovirus, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus herpes simple 1 y 2, herpesvirus 6 humano, virus varicela-zóster, virus de hepatitis B, virus de hepatitis D, virus de papiloma, parvovirus B19, poliomavirus BK, poliomavirus JC, virus de hepatitis C, virus de sarampión, virus de rubeola, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de leucemia de células T humanas de tipo I, y virus de leucemia de células T humanas de tipo II. La célula diana puede estar infectada de forma similar por una bacteria, un protozoo, un hongo, un prión o cualquier otro parásito intracelular, ejemplos de los cuales son Chlamydia, Listeria, Salmonella, Legionella, Brucella, Coxiella, Rickettsia, Mycobacterium, Leishmania, Trypanasoma, Toxoplasma, y Plasmodium.

La construcción incluye generalmente una primera secuencia promotora unida de forma operable a la primera región codificante. El promotor puede ser, por ejemplo, de citomegalovirus (CMV), de SV40, y de la repetición terminal larga (LTR) retroviral. El promotor puede ser un promotor bidireccional, y/o se puede unir de forma operable una segunda secuencia promotora a una segunda región codificante. La construcción de ácido nucleico puede incluir además una secuencia de poli A unida de forma operable a la primera región codificante, a la segunda región codificante, o a ambas. La construcción de ácido nucleico puede incluir además una secuencia de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), una secuencia de ubiquitina, una secuencia de péptido autocatalítico, potenciadores, secuencias de importación nuclear, secuencias inmunoestimuladoras, casetes de expresión para citocinas, marcadores de selección, moléculas indicadoras, y similares. El primer polipéptido puede tener una longitud de alrededor de 7 a 15 aminoácidos, y tiene preferiblemente una longitud de 9 o 10 aminoácidos. El segundo polipéptido puede tener una longitud de 9 o 10 aminoácidos, o puede ser un grupo de epítopos con una longitud de entre alrededor de 10 y alrededor de 75 aminoácidos. El primer epítopo y el segundo epítopo se pueden unir al mismo alelo o a alelos diferentes del MHC.

También se describe en la presente memoria una vacuna que incluye cualquiera de las realizaciones de construcciones de ácidos nucleicos anteriores; un método de tratamiento de un animal mediante la administración de tal vacuna; y un método de fabricación de la vacuna.

Identificación de Grupos de Epítopos

Otras realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a la identificación de regiones de grupos de epítopos que se usan para generar composiciones farmacéuticas capaces de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto al que se han administrado las composiciones. Una realización se refiere a un grupo de epítopos, y el grupo procede de un antígeno asociado a una diana, y el grupo incluye o codifica al menos dos secuencias que tienen una afinidad conocida o predicha hacia una hendidura de unión de un péptido receptor MHC, en el que el grupo es un fragmento del antígeno.

En un aspecto, la diana es una célula neoplásica. De forma alternativa, la diana puede ser una célula infectada por un parásito intracelular. El parásito intracelular puede ser un virus, una bacteria o un protozoo. Opcionalmente, la diana es un agente patógeno. El agente patógeno puede incluir un virus, una bacteria, un hongo, un protozoo, un prión, una toxina, o un veneno.

En otro aspecto, el receptor MHC puede ser un receptor HLA de clase I. De forma similar, el receptor MHC puede ser un receptor HLA de clase II.

Aún en otro aspecto, el grupo incluye o codifica un polipéptido que tiene una longitud, en el que la longitud es al menos de 10 aminoácidos. De forma ventajosa, la longitud del polipéptido puede ser menor de alrededor de 75 aminoácidos.

En aún otro aspecto, se proporciona un antígeno que tiene una longitud, en el que el grupo consiste en o codifica un polipéptido que tiene una longitud, en el que la longitud del polipéptido es menor de alrededor del 80% de la longitud del antígeno. Preferiblemente, la longitud del polipéptido es menor de alrededor del 50% de la longitud del antígeno. Lo más preferiblemente, la longitud del polipéptido es menor de alrededor del 20% de la longitud del antígeno.

Otra realización se refiere a un método de identificación de un grupo de epítopos que incluye las etapas de: proporcionar una secuencia de un antígeno asociado a una célula diana; puntuar los péptidos candidatos dentro de la secuencia, basándose en la afinidad conocida o predicha hacia una hendidura de unión de un péptido receptor MHC para identificar supuestos epítopos del MHC; e identificar una región dentro del antígeno, en la que la región incluye al menos dos de los supuestos epítopos del MHC, y en la que la región comprende una densidad superior de supuestos epítopos del MHC que la densidad de los supuestos epítopos del MHC en el antígeno completo.

Métodos de Tratamiento

Se describe de forma similar en la presente memoria un método de tratamiento de un animal mediante la administración al animal de una vacuna que incluye un primer epítopo constitutivo, en el que el epítopo constitutivo procede de un primer antígeno asociado a una primera célula diana. Preferiblemente, la etapa de administración incluye un modo de administración que es transdérmico, intranodular, perinodular, oral, intravenoso, intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, o mucoso.

El método de tratamiento de un animal puede incluir además una etapa de ensayo para determinar una característica indicativa del estado de las células diana. De forma ventajosa, la etapa de ensayo puede incluir además una primera etapa de ensayo y una segunda etapa de ensayo, en la que la primera etapa de ensayo precede a la etapa de administración, y la segunda etapa de ensayo sigue a la etapa de administración. Preferiblemente, la característica determinada en la primera etapa de ensayo se compara con la característica determinada en la segunda etapa de ensayo para obtener un resultado. El resultado puede ser una disminución en el número de células diana, una pérdida de masa o de tamaño de un tumor que comprende las células diana, o una disminución del número o concentración de un parásito intracelular que infecta a las células diana.

Preferiblemente, la célula diana es una célula neoplásica. La célula neoplásica puede ser cualquier célula transformada asociada a tumores sólidos o linfomas tales como leucemia, carcinoma, linfoma, astrocitoma, sarcoma, glioma, retinoblastoma, melanoma, tumor de Wilm, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer hepatocelular, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de cuello de útero, cáncer testicular, cáncer de células renales, y cáncer cerebral. De forma alternativa, la célula diana está infectada por un parásito intracelular. El parásito intracelular puede ser un virus. El virus puede ser un adenovirus, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus herpes simple 1, virus herpes simple 2, herpesvirus 6 humano, virus varicela-zóster, virus de hepatitis B, virus de hepatitis D, virus de papiloma, parvovirus B19, poliomavirus BK, poliomavirus JC, virus de hepatitis C, virus de sarampión, virus de rubeola, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de leucemia de células T humanas de tipo I, o virus de leucemia de células T humanas de tipo II. El parásito intracelular puede ser una bacteria, protozoo, hongo, o un prión. De forma ventajosa, el parásito intracelular es Chlamydia, Listeria, Salmonella, Legionella, Brucella, Coxiella, Rickettsia, Mycobacterium, Leishmania, Trypanasoma, Toxoplasma, y Plasmodium.

En otro aspecto, el antígeno es MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, RAGE, NY-ESO, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein-Barr, EBNA, los antígenos E6 y E7 de virus de papiloma humano (HPV), TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, \beta-Catenina, CDK4, Mum-1 y p16. De forma alternativa, el antígeno está asociado a un virus o infección viral. Aún en otro aspecto, el antígeno es un antígeno asociado a parásitos intracelulares que no son virales.

El epítopo constitutivo puede incluir o codificar un polipéptido de una longitud de alrededor de 6 a alrededor de 23 aminoácidos. Preferiblemente, el polipéptido tiene una longitud de 9 o 10 aminoácidos. El polipéptido puede ser sintético. La vacuna puede incluir adicionalmente tampones, detergentes, tensoactivos, antioxidantes, o agentes reductores. El epítopo constitutivo puede incluir de forma ventajosa un ácido nucleico. Preferiblemente, el epítopo constitutivo es específico para al menos un alelo del MHC. El alelo puede codificar los tipos A1, A2, A3, A11, A24, A26, A29, B7, B8, B14, B18, B27, B35, B44, B62, B60, o B51.

El método de tratamiento de un animal puede incluir además un epítopo inmunitario. El epítopo inmunitario puede proceder de un segundo antígeno asociado a la célula diana. Opcionalmente, el primer antígeno y el segundo antígeno son iguales. El epítopo constitutivo puede ser específico de un primer alelo del MHC, y el epítopo inmunitario puede ser específico de un segundo alelo del MHC. El primer alelo y el segundo alelo pueden ser iguales o diferentes.

De forma ventajosa, la vacuna incluye un grupo de epítopos que incluye el epítopo inmunitario. El grupo de epítopos puede proceder de un segundo antígeno asociado a la célula diana. Opcionalmente, el primer antígeno y el segundo antígeno son iguales. El grupo de epítopos puede incluir o codificar un polipéptido que tiene una longitud de al menos 10 aminoácidos y menos de alrededor de 60 aminoácidos.

Preferiblemente, el grupo de epítopos incluye o codifica un polipéptido que tiene una longitud menor de alrededor del 80% de la longitud del segundo antígeno. La longitud del polipéptido puede ser menor de alrededor del 50% de la longitud del segundo antígeno. Aún en otro aspecto, la longitud del polipéptido puede ser menor de alrededor del 20% de la longitud del segundo antígeno.

El método de tratamiento de un animal puede incluir además un segundo epítopo constitutivo, en el que el segundo epítopo constitutivo procede de un segundo antígeno asociado a una segunda célula diana. El primer antígeno y el segundo antígeno pueden ser iguales o diferentes. De forma similar, la primera célula diana y la segunda célula diana pueden ser iguales o diferentes.

También se contempla en la presente descripción un método de tratamiento de un animal que incluye administrar a un animal una vacuna que comprende una construcción de ácido nucleico. La construcción de ácido nucleico codifica de forma ventajosa un epítopo constitutivo. El epítopo constitutivo puede proceder de un primer antígeno asociado a una primera célula diana.

En otro aspecto de la descripción, se proporciona un método para producir una vacuna. El método incluye las etapas de seleccionar un epítopo constitutivo identificando epítopos que se producen o se podrían producir a partir de una fuente de antígenos particular mediante proteosomas constitutivos, en el que el epítopo constitutivo procede de un primer antígeno asociado a una primera célula diana, producir una vacuna que incluye el epítopo constitutivo, y preparar una composición de vacuna que incluye o codifica el epítopo constitutivo seleccionado.

La vacuna producida de acuerdo con el método anteriormente mencionado se puede administrar para tratar a un animal.

Descubrimiento de Epítopos Constitutivos y Otros Epítopos

Otras realizaciones descritas en la presente memoria se dirigen a la identificación de epítopos que son útiles para generar vacunas capaces de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto al cual se le han administrado las composiciones, en particular los epítopos más útiles en las realizaciones de vacunas de la invención. Una realización se refiere a un método de descubrimiento de epítopos que comprende la etapa de seleccionar un epítopo de una población de fragmentos peptídicos de un antígeno asociado a una célula diana, en la que los fragmentos tienen una afinidad conocida o predicha hacia una hendidura de unión de un péptido receptor de la clase I del complejo principal de histocompatibilidad, en el que el epítopo seleccionado corresponde a un producto de escisión por proteosomas de la célula diana.

Otra realización se refiere a un método de descubrimiento de un epítopo que comprende las etapas de: proporcionar una secuencia de una célula diana, en la que la secuencia codifica o comprende una proteína expresada en la célula diana; identificar una población de fragmentos peptídicos de la proteína, en la que los miembros de la población de fragmentos peptídicos tienen una afinidad conocida o predicha hacia una hendidura de unión de un péptido receptor de la clase I del complejo principal de histocompatibilidad; seleccionar el epítopo de la población de fragmentos peptídicos, en el que el epítopo corresponde a un producto de un proteosoma activo en la célula diana.

Un aspecto de esta realización se refiere a un epítopo descubierto mediante el método anteriormente mencionado. Otro aspecto de esta realización se refiere a una vacuna que comprende el epítopo descubierto. Aún otro aspecto se refiere a un método de tratamiento de un animal, que comprende administrar al animal la vacuna anteriormente mencionada.

Otra realización se refiere a un método de descubrimiento de epítopos que comprende las etapas de: proporcionar una célula neoplásica y una secuencia, en la que la secuencia comprende o codifica un antígeno asociado a la célula neoplásica; identificar una población de fragmentos peptídicos del antígeno, en el que se predice que la población de fragmentos peptídicos tiene afinidad hacia una hendidura de unión de un péptido receptor de la clase I del complejo principal de histocompatibilidad; seleccionar un epítopo de la población de fragmentos peptídicos, en la que se determina mediante análisis in vitro que el epítopo es un producto de una reacción de escisión por un proteosoma activo en la célula neoplásica.

Otra realización se refiere a un método de descubrimiento de epítopos que comprende la etapa de seleccionar un epítopo de una población de fragmentos peptídicos de un antígeno asociado a una diana en un hospedador, en el que los fragmentos tienen una afinidad conocida o predicha hacia una hendidura de unión de un péptido receptor de la clase I o II del complejo principal de histocompatibilidad del hospedador, en el que el epítopo seleccionado corresponde a un producto de la escisión proteolítica del antígeno en una célula del hospedador.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa de forma esquemática las partes de una célula implicadas en el procesamiento de proteínas mediante el proteosoma y la presentación de epítopos.

La Figura 2 es una comparación del proteosoma constitutivo y del proteosoma inmunitario.

La Figura 3 representa de forma esquemática la sincronización de epítopos entre células infectadas y pAPCs.

La Figura 4 muestra la presentación de diferentes epítopos por pAPCs y células tumorales.

La Figura 5 muestra la presentación de diferentes epítopos por pAPCs y células infectadas.

La Figura 6 representa la presentación por células tumorales de epítopos tanto constitutivos como inmunitarios debida a la inducción mediante IFN-\gamma.

La Figura 7 muestra un ataque a células infectadas por virus por parte de células T inducidas para reconocer un epítopo constitutivo.

La Figura 8 muestra un ataque doble contra epítopos tanto constitutivos como inmunitarios.

La Figura 9 es una representación de los componentes del plásmido pVAX-EP1-IRES-EP2-ISS-NIS.

La Figura 10 es una representación de los componentes del plásmido pVAX-EP2-UB-EP1.

La Figura 11 es una representación de los componentes del plásmido pVAX-EP2-2A-EP1.

La Figura 12 es una representación de los componentes del plásmido pVAX-EP1-IRES-EP2.

La Figura 13 representa los resultados de un ensayo de citometría de flujo que verifica la unión al HLA de epítopos de Melan-A.

La Figura 14 representa los resultados de un ensayo de citometría de flujo que verifica la unión al HLA del péptido de Tirosinasa 207-216.

La Figura 15 representa la secuencia de Melan-A (SEQ ID NO: 1), que muestra la agrupación de epítopos de HLA de clase I.

La Figura 16 representa la secuencia de SSX-2 (SEQ ID NO: 2), que muestra la agrupación de epítopos de HLA de clase I.

La Figura 17 representa la secuencia de NY-ESO (SEQ ID NO: 3), que muestra la agrupación de epítopos de HLA de clase I.

La Figura 18 representa la secuencia de Tirosinasa (SEQ ID NO: 4), que muestra la agrupación de epítopos de HLA de clase I predicha mediante el algoritmo BIMAS-NIH/Parker por encima de la línea de la secuencia y mediante el algoritmo SYFPEITHI/Rammensee por debajo.

Descripción detallada de la realización preferida

Las realizaciones de la presente descripción proporcionan epítopos, vacunas y métodos terapéuticos para dirigir una respuesta inmunitaria eficaz contra una célula diana. La base principal de la invención es el descubrimiento nuevo e inesperado de que muchas células diana exponen epítopos que son diferentes de los epítopos expuestos por las células profesionales presentadoras de antígenos (pAPCs). Debido a esta diferencia, las pAPCs dirigen a las células T contra epítopos que no están presentes en las células diana, y las células T no reconocen por tanto a las células diana. Los métodos de la presente invención pueden provocar que las pAPCs expongan los mismos epítopos que están presentes en las células diana, lo que da como resultado que las células T sean capaces de reconocer correctamente y destruir las células diana.

Las realizaciones descritas en la presente memoria proporcionan además métodos para identificar epítopos de antígenos diana que se pueden usar para generar vacunas inmunológicamente eficaces. Tales vacunas pueden estimular al sistema inmunitario para que reconozca y destruya células diana que exponen los epítopos seleccionados, lo que es especialmente útil en el tratamiento y la prevención de cánceres y de infecciones de células por parásitos intracelulares, así como en el tratamiento o la prevención de enfermedades asociadas a otros patógenos, toxinas y alergenos.

Ciertos tipos de dianas son especialmente difíciles de detectar para el sistema inmunitario. Entre estos hay muchos tipos de cáncer, así como células infectadas por parásitos intracelulares, tales como, por ejemplo, virus, bacterias, y protozoos. Se ha realizado un gran esfuerzo de investigación para identificar antígenos y epítopos útiles para generar una respuesta inmunitaria eficaz contra tales dianas, con poco éxito. Esta descripción proporciona una base para el descubrimiento eficaz de una nueva generación de epítopos eficaces contra tales dianas difíciles de detectar.

Tal como se describe en la presente memoria, es posible seleccionar secuencias de epítopos con auténtica relevancia biológica. Para que un epítopo tenga importancia biológica, p.ej., para que funcione en la estimulación de una respuesta inmunitaria, debe tener afinidad hacia la hendidura de unión de un péptido receptor del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Existen varios medios conocidos en la técnica para predecir si una secuencia oligopeptídica tendrá afinidad de unión al MHC. No obstante, la mayoría de las secuencias que se predice que tienen afinidad de unión al MHC no son biológicamente relevantes, debido a que no se presentan realmente en la superficie de una célula diana o de una pAPC.

Los métodos de la invención descrita permiten al diseñador de vacunas ignorar los péptidos que, a pesar de una afinidad de unión elevada predicha hacia el MHC, nunca serán útiles porque no pueden ser presentados por las células diana. Por lo tanto, los métodos y las enseñanzas descritas en la presente memoria proporcionan un avance importante en el diseño de vacunas, que combina la potencia del análisis de secuencias de antígenos con la realidad fundamental de la inmunología. Los métodos enseñados en la presente memoria posibilitan la selección simple y eficaz de epítopos significativos para la creación de vacunas de la clase I o de la clase II del MHC mediante el uso de cualquier secuencia polipeptídica que corresponda a una diana deseado.

Las realizaciones adicionales descritas en la presente memoria proporcionan regiones de grupos de epítopos (ECRs) para el uso en vacunas y en el diseño de vacunas y el descubrimiento de epítopos. De forma específica, ciertas realizaciones se refieren a la identificación de grupos de epítopos para el uso en la generación de composiciones inmunológicamente activas dirigidas contra poblaciones de células diana, y para el uso en el descubrimiento de epítopos constitutivos y epítopos inmunitarios distintos. En muchos casos, pueden existir numerosos epítopos supuestos del MHC de clase I en un único antígeno asociado a diana (TAA). Tales epítopos supuestos se hallan a menudo en grupos (ECRs), epítopos del MHC distribuidos a una densidad relativamente elevada dentro de ciertas regiones de la secuencia de aminoácidos del TAA original. Debido a que estos ECRs incluyen múltiples epítopos supuestos con actividad biológica potencialmente útil en la inducción de una respuesta inmunitaria, representan un material excelente en el análisis in vitro o in vivo para identificar epítopos especialmente útiles para el diseño de vacunas. Y, debido a que los grupos de epítopos pueden ser procesados ellos mismos dentro de una célula para producir epítopos del MHC activos, los grupos se pueden usar directamente en vacunas, con uno o más epítopos supuestos en el grupo que se va a procesar realmente hasta dar un epítopo del MHC activo.

El uso de ECRs en vacunas ofrece avances tecnológicos importantes en la fabricación de vacunas recombinantes, y además ofrece ventajas cruciales de seguridad sobre las vacunas de ácidos nucleicos existentes que codifican secuencias proteicas completas. Las vacunas recombinantes dependen en general de una producción cara y técnicamente exigente de proteínas completas en fermentadores microbianos. Las ECRs ofrecen la opción de usar polipéptidos sintetizados químicamente, lo que simplifica en gran medida el desarrollo y la fabricación, y se evita una diversidad de problemas de seguridad. De forma similar, la capacidad de usar secuencias de ácidos nucleicos que codifican ECRs, que generalmente son regiones relativamente cortas de una secuencia completa, permite el uso de procesos de química de oligonucleótidos sintéticos en el desarrollo y la manipulación de vacunas basadas en ácidos nucleicos, en vez de los procedimientos de biología molecular más caros, que consumen más tiempo, y que son potencialmente más difíciles, implicados en el uso de secuencias génicas completas.

Debido a que una ECR está codificada por una secuencia de ácido nucleico que es relativamente corta en comparación con la que codifica la proteína completa a partir de la cual se ha descubierto la ECR, esto puede mejorar en gran medida la seguridad de las vacunas de ácidos nucleicos. Un problema importante en el campo de las vacunas de ácidos nucleicos es el hecho de que el grado de homología de secuencias de la vacuna con las secuencias del animal al que se administra determina la probabilidad de integración de la secuencia de la vacuna en el genoma del animal. Un problema de seguridad fundamental de las vacunas de ácidos nucleicos es su capacidad de integrarse en las secuencias genómicas, lo que puede provocar la desregulación de la expresión génica y la transformación tumoral. La Food and Drug Administration ha recomendado que las vacunas recombinantes y de ácidos nucleicos deberían contener tan poca homología de secuencias con las secuencias humanas como sea posible. En el caso de las vacunas que administran antígenos asociados a tumores, es inevitable que las vacunas contengan secuencias de ácidos nucleicos que sean homólogas a las que codifican las proteínas que se expresan en las células tumorales de los pacientes. Es muy deseable, no obstante, limitar el grado de esas secuencias hasta el que sea mínimamente esencial para facilitar la expresión de los epítopos para inducir respuestas inmunológicas terapéuticas. El uso de las ECRs ofrece así el doble beneficio de proporcionar una región mínima de homología, a la vez que se incorporan múltiples epítopos que tienen un valor terapéutico potencial.

Los aspectos de la presente descripción proporcionan construcciones de ácidos nucleicos que codifican un epítopo constitutivo. Un epítopo constitutivo, como se describirá con más detalle más adelante, incluye fragmentos peptídicos producidos por el proteosoma activo de una célula periférica. Una base para la presente invención es el descubrimiento de que cualquier antígeno asociado a una célula diana se puede procesar de forma diferencial en dos grupos distinguibles de epítopos para la presentación por las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I del cuerpo. Los "epítopos inmunitarios" son presentados por las pAPCs y, también en general, en las células periféricas que están infectadas de forma aguda o bajo ataque inmunológico activo por células que secretan interferón (IFN). En contraste, los "epítopos constitutivos" son presentados por cualquier otra célula periférica que incluye, en general, las células neoplásicas (cancerosas) y las células infectadas de forma crónica. Esta coordinación incorrecta, o asincronía, en los epítopos presentados subyace en la persistencia y el avance de los cánceres y de las infecciones crónicas, a pesar de la presencia de un sistema inmunitario en funcionamiento en el hospedador. Así, es esencial provocar la sincronización de la presentación de epítopos entre la pAPC y la célula diana para provocar una respuesta inmunitaria eficaz mediada por linfocitos T citolíticos (CTL).

La sincronización se puede llevar a cabo de forma fiable proporcionando a la pAPC un epítopo constitutivo. A menudo se puede conseguir una respuesta más sólida proporcionando más de un único epítopo. Además, una vez que se ha establecido una respuesta inmunitaria eficaz contra las células diana, la secreción de IFN puede conducir a la expresión del proteosoma inmunitario, por lo que se cambia la presentación de epítopos a epítopos inmunitarios. Por esta razón, entre otras, puede ser ventajoso también incluir epítopos inmunitarios, además de los epítopos constitutivos, en las vacunas desarrolladas según la descripción a la que se hace referencia anteriormente. Puede ser de utilidad adicional proporcionar epítopos inmunitarios en forma de una ECR. Las realizaciones de la descripción proporcionan vectores de expresión que codifican epítopos constitutivos y/o epítopos inmunitarios en una diversidad de combinaciones. Las construcciones de expresión preferidas codifican al menos un epítopo capaz de estimular una respuesta inmunitaria celular dirigida contra una célula diana. En una realización de la invención, las células diana son células neoplásicas. En otra realización, las células diana son cualquier célula hospedadora infectada de forma intracelular. Los agentes infecciosos intracelulares incluyen los virus persistentes y cualquier otro organismo infeccioso que tenga una etapa intracelular de infección.

Las construcciones de ácidos nucleicos de ciertas realizaciones se dirigen a potenciar el sistema inmunitario de un sujeto y a sensibilizarlo hacia la presencia de células neoplásicas dentro del hospedador. En otras realizaciones, las construcciones de ácidos nucleicos facilitan la erradicación de infecciones virales persistentes así como de células infectadas con parásitos intracelulares.

Definiciones

A menos que esté claro de otra manera a partir del contexto del uso de una expresión en la presente memoria, las siguientes expresiones enumeradas tendrán en general los significados indicados para los fines de esta descripción.

Célula profesional presentadora de antígenos (pAPC) - una célula que posee moléculas coestimuladoras de las células T y que es capaz de inducir una respuesta de células T. Las pAPCs bien caracterizadas son las células dendríticas, células B, y macrófagos.

Célula periférica - una célula que no es una pAPC.

Proteosoma constitutivo - un proteosoma normalmente activo en las células periféricas, y que en general no está presente o no es intensamente activo en las pAPCs.

Proteosoma inmunitario - un proteosoma normalmente activo en las pAPCs; el proteosoma inmunitario es activo también en ciertas células periféricas en los tejidos infectados.

Epítopo - una molécula o sustancia capaz de estimular una respuesta inmunitaria. En las realizaciones preferidas, los epítopos según esta definición incluyen, pero sin limitación, un polipéptido y un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el polipéptido es capaz de estimular una respuesta inmunitaria. En otras realizaciones preferidas, los epítopos según esta definición incluyen, pero sin limitación, los péptidos presentados en la superficie de células unidos de forma no covalente al bolsillo del MHC de la clase I, de forma que pueden interaccionar con los receptores de las células T.

Epítopo del MHC - un polipéptido que tiene una afinidad conocida o predicha por una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I de mamífero.

Epítopo del HLA - un polipéptido que tiene una afinidad conocida o predicha por una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I humano.

Epítopo constitutivo - en una realización preferida, un epítopo constitutivo se define como un fragmento polipeptídico que es un epítopo del MHC, y que se expone en una célula en la que los proteosomas constitutivos son predominantemente activos. En otra realización preferida, un epítopo constitutivo se define como un polipéptido que contiene un epítopo constitutivo según la definición anterior, que está flanqueado por uno a varios aminoácidos adicionales. En otra realización preferida, un epítopo constitutivo se define como un ácido nucleico que codifica un epítopo constitutivo según cualquiera de las definiciones anteriores.

Epítopo inmunitario - en una realización preferida, un epítopo inmunitario se define como un fragmento polipeptídico que es un epítopo del MHC, y que se expone en una célula en la que los proteosomas inmunitarios son predominantemente activos. En otra realización preferida, un epítopo inmunitario se define como un polipéptido que contiene un epítopo inmunitario según la definición anterior, que está flanqueado por uno a varios aminoácidos adicionales. En otra realización preferida, un epítopo inmunitario se define como un polipéptido que incluye una secuencia de grupos de epítopos, que tiene al menos dos secuencias polipeptídicas que tienen una afinidad conocida o predicha por un MHC de clase I. Aún en otra realización preferida, un epítopo inmunitario se define como un ácido nucleico que codifica un epítopo inmunitario según cualquiera de las definiciones anteriores.

Célula diana - una célula a seleccionar como diana por las vacunas y los métodos de la invención. Los ejemplos de células diana según esta definición incluyen, pero no se limitan necesariamente a: una célula neoplásica y una célula que alberga un parásito intracelular, tal como, por ejemplo, un virus, una bacteria, o un protozoo.

Antígeno asociado a diana (TAA) - una proteína o polipéptido presente en una célula diana.

Antígeno asociado a tumor (TuAA) - un TAA, en el que la célula diana es una célula neoplásica.

Obsérvese que la siguiente discusión expone la comprensión de los inventores de la operación de la invención. Sin embargo, no se pretende que esta discusión limite la patente a ninguna teoría particular de operación no expuesta en las reivindicaciones.

Diferentes Proteosomas Producen Diferentes Epítopos

Los epítopos presentados por el MHC de clase I en la superficie de las pAPCs o de las células periféricas se producen mediante la digestión de las proteínas dentro de esas células por los proteosomas. Aunque se ha informado que los proteosomas de las pAPCs no son idénticos a los proteosomas de las células periféricas, la importancia de esta diferencia ha sido inapreciable hasta ahora. Esta invención se basa en el hecho de que cuando las pAPCs y las células periféricas procesan un TAA dado, los proteosomas activos en las pAPCs generan fragmentos de epítopos que son diferentes de los fragmentos de epítopos generados por los proteosomas que son activos en las células periféricas. Por comodidad en la referencia, y como se definió anteriormente, los proteosomas que son predominantemente activos en las pAPCs se denominan en la presente memoria "proteosomas inmunitarios", mientras los proteosomas que son normalmente activos en las células periféricas se denominan en la presente memoria "proteosomas constitutivos".

No se puede exagerar la importancia del procesamiento diferencial de los TAAs por las pAPCs y las células periféricas. El procesamiento diferencial proporciona una explicación unificada de por qué ciertas células diana son resistentes al reconocimiento y al ataque por el sistema inmunitario. Aunque las pAPCs puedan captar TAAs recortados de las células diana y presentarlos en su superficie, las pAPCs estimularán la producción de CTLs para reconocer un "epítopo inmunitario" (el epítopo que resulta del procesamiento del TAA por el proteosoma inmunitario), mientras las células diana exponen "epítopos constitutivos" (fragmentos distintos del TAA generados por el proteosoma constitutivo). Como consecuencia, la respuesta de CTLs en condiciones fisiológicas se dirige erróneamente a dianas distintas de los epítopos de las células diana.

Debido a que las respuestas de CTLs se inducen por las pAPCs, por definición seleccionan como diana los epítopos inmunitarios en vez de los epítopos constitutivos, y así no consiguen reconocer las células diana, que por lo tanto son capaces de persistir en el cuerpo. Esta "compartimentación de epítopos" fundamental de la respuesta inmunitaria celular es la razón por la que ciertas células neoplásicas pueden persistir para formar tumores; también es la razón de que ciertos virus y parásitos intracelulares puedan infectar las células de forma crónica sin ser erradicados por el sistema inmunitario. Con respecto a los agentes infecciosos, normalmente provocan la expresión de proteosomas inmunitarios en las células que infectan. Esto da como resultado la producción de epítopos en la superficie celular que son idénticos a los que son presentados por las pAPCs al sistema inmunitario. La infección da como resultado así una "sincronización de epítopos" entre el sistema inmunitario y la célula infectada, la posterior destrucción de las células infectadas, y la eliminación del agente infeccioso del cuerpo. En el caso de ciertos agentes infecciosos, especialmente aquellos que son capaces de establecer infecciones crónicas, estos han desarrollado un medio para evitar la expresión de proteosomas inmunitarios en las células que infectan. El proteosoma de estas células se mantiene en un modo constitutivo, por lo que impide la sincronización de epítopos y el ataque por los CTLs. Existen pruebas sustanciales de que este es un mecanismo habitual usado por prácticamente todos los agentes infecciosos
crónicos.

Una manera de superar este fallo por parte de los CTLs para reconocer y erradicar ciertas células diana es proporcionar vacunas y métodos de tratamiento que sean capaces de "sincronizar" la presentación de epítopos. La sincronización de epítopos en este contexto significa que se hace que las pAPCs presenten epítopos constitutivos, lo que da como resultado CTLs que pueden reconocer los epítopos constitutivos expuestos en las células diana, y por lo tanto pueden atacar y eliminar las células diana.

Por lo tanto, las realizaciones de la descripción son útiles para el tratamiento de enfermedades neoplásicas que incluyen tumores sólidos y linfomas. Las realizaciones adicionales tienen aplicación en el tratamiento de infecciones virales persistentes así como de infecciones parasitarias en las que el agente infeccioso tiene una etapa de infección intracelular. La administración apropiada de epítopos constitutivos que corresponden a tales células diana puede activar una respuesta de células T citotóxicas específicas contra las células diana.

El Papel de las Diferencias de Epítopos en el Cáncer

En ciertas realizaciones, la presente descripción se dirige al tratamiento de las enfermedades neoplásicas. Los cánceres están provocados por el crecimiento desregulado y progresivo de la progenie de una única célula anormal. El término "cáncer", tal como se usa en la presente memoria, incluye las enfermedades neoplásicas, células neoplásicas, tumores, células tumorales, tumores malignos y cualquier célula transformada, que incluye tanto los tumores sólidos como la enfermedad neoplásica difusa. Históricamente, se ha creído en general que las células cancerosas escapan a la detección y destrucción por el sistema inmunitario porque las células cancerosas contienen el mismo material genético que las células no cancerosas del cuerpo. La identidad o similitud genética de las células cancerosas y las células sanas del cuerpo provoca supuestamente la dificultad de distinguir las células cancerosas de las células normales, y el sistema inmunitario es incapaz por tanto de generar una respuesta inmunitaria eficaz, como se demuestra por la persistencia de las células cancerosas en el cuerpo.

Al contrario, se ha descrito una diversidad de antígenos asociados a tumores (TuAAs) que podrían, y de hecho pueden, provocar respuestas inmunitarias. Numerosos estudios han descrito los linfocitos infiltrantes de tumor (TILs), que pueden destruir células diana que presentan péptidos derivados de diversos TuAAs in vitro. Tal como se describe con más detalle más adelante, sin embargo, el fracaso de los TILs para controlar el cáncer resulta de una diferencia en los epítopos producidos y presentados por las células que inducen la actividad de los CTLs, las pAPCs, y las células diana deseadas, es decir, las del tumor. Para entender la diferencia, es necesario entender las funciones y la dinámica de los proteosomas.

Todas las células contienen proteosomas para degradar proteínas. Estos proteosomas, que comprenden alrededor del 1% del contenido total de proteína de la célula, sirven para regular la semivida de las proteínas en la célula. En el curso de la degradación de proteínas, los proteosomas generan la gran mayoría de los fragmentos peptídicos implicados en la presentación de antígenos de clase I, y los patrones de escisión de los proteosomas afectan a la disponibilidad de los epítopos antigénicos para la presentación de las moléculas de la clase I (Figura 1). Así, los epítopos del MHC son producidos por la actividad proteosómica de las células. No obstante, la actividad proteolítica en las pAPCs, en comparación con las células periféricas, es notablemente diferente. Las pAPCs contienen un proteosoma que incorpora de forma constitutiva subunidades que en general se expresan solamente en las células periféricas durante la infección o tras la exposición a diversas citocinas, en particular interferón (IFN), como parte de una respuesta inmunitaria celular. Tal como se expuso anteriormente, las diferentes actividades proteosómicas de las pAPCs y de las células periféricas se denomina en la presente memoria proteosomas inmunitarios y constitutivos, respectivamente.

Los proteosomas inmunitarios y constitutivos tienen la capacidad de escindir proteínas en localizaciones similares pero diferentes. El proteosoma inmunitario incorpora varias subunidades que lo distinguen de su homólogo constitutivo. Estas subunidades inmunitarias incluyen LMP2, LMP7, y MECL1, que sustituyen las subunidades catalíticas del proteosoma constitutivo, PA28\alpha y PA281\beta, que cumplen una función reguladora (Figura 2). Colectivamente, la incorporación de estas subunidades da como resultado la actividad del proteosoma inmunitario, que es cualitativamente y cuantitativamente diferente de la actividad del proteosoma constitutivo. Aunque han existido pruebas de que hay diferencias entre los proteosomas constitutivos e inmunitarios con respecto a los epítopos del MHC que producen, hasta ahora estas diferencias se han racionalizado en términos cuantitativos. Otros autores han propuesto que el efecto fundamental mediado por el proteosoma inmunitario es facilitar la producción de más péptidos, en vez de péptidos diferentes.

Las diferencias cualitativas en el procesamiento de antígenos entre los proteosomas inmunitarios y constitutivos tienen implicaciones importantes para el diseño de vacunas. El IFN-\gamma se produce en los linfocitos T, en los que está implicado en la estimulación de la inducción de las respuestas inmunitarias celulares y, tal como se indicó anteriormente, induce la expresión del proteosoma inmunitario. De forma notable, el IFN se produce también en prácticamente cualquier otra célula en una circunstancia: en el caso de que la célula resulte infectada por un patógeno. En la naturaleza, la infección viral provoca generalmente la producción de IFN por la célula infectada, lo que a su vez induce a que la célula cambie de una configuración de proteosoma constitutivo a una configuración de proteosoma inmunitario. Una explicación para este fenómeno es que la infección y la estimulación posterior del IFN sirve para alinear a la célula infectada, en cuanto al repertorio de antígenos expuestos, con las pAPCs implicadas en la estimulación de la respuesta inmunitaria contra el virus. Esto da como resultado el procesamiento tanto de sus proteínas "propias" endógenas, expresadas normalmente por la célula, como de las proteínas relacionadas con el agente infeccioso ("ajenas") de una manera idéntica al procesamiento de antígenos que ocurre en las pAPCs. La conversión del proteosoma de la célula infectada desde una configuración constitutiva hasta una configuración inmunitaria da como resultado una "sincronización de epítopos" entre las células infectadas y las pAPCs (Figura 3).

Los CTLs restringidos a la clase I del MHC específicos de los TuAAs son un componente importante de la respuesta inmunitaria contra el cáncer. Los TuAAs son dianas útiles de una respuesta de células T específicas de tumores en la medida en que no se exponen en la superficie de las células normales, o se sobreexpresan en las células tumorales, o de otra forma son intensamente característicos de las células tumorales. Se conocen numerosos TuAAs, y están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica en la bibliografía o comercialmente.

De hecho, se ha descubierto de ciertos tumores son deficientes en la inducción por IFN-\gamma de los proteosomas inmunitarios. En estas situaciones, es probable que los CTLs estén seleccionando como diana epítopos inmunitarios de TuAAs que han sido procesados por las pAPCs. A pesar del número elevado de CTLs en estos pacientes activados específicamente contra estos epítopos inmunitarios, los CTLs no consiguen hallar el epítopo en las células cancerosas. La enfermedad progresa y finalmente los CTLs acumulados, incapaces de localizar la diana, se hacen disfuncionales (Lee, et al. Nature Medicine (1999) 5[6]:677-685). Al proporcionar a las pAPCs epítopos constitutivos, se puede sincronizar la presentación de epítopos por las pAPCs con la presentación de epítopos por el tumor, y activar una población de CTLs que reconoce los epítopos constitutivos presentes en el tumor.

Así, el descubrimiento de que los proteosomas inmunitarios en las pAPCs producen epítopos cualitativamente diferentes de los de los proteosomas constitutivos en las células periféricas, proporciona una explicación de por qué los TILs no erradican las células tumorales. El mecanismo de procesamiento descrito anteriormente explica cómo los linfocitos T consiguen llegar a las masas tumorales, y sin embargo son relativamente ineficaces contra las propias células tumorales. El procesamiento diferencial de antígenos entre el proteosoma inmunitario de las pAPCs y el proteosoma constitutivo de las células tumorales puede explicar la observación de las frecuencias elevadas de linfocitos T específicos contra los TuAAs en pacientes con cáncer progresivo. Lee, et al. Nature Medicine (1999) 5[6]:677-685. (Figura 4).

Debido a las diferencias en la actividad de los proteosomas, las células diana periféricas, que incluyen las células tumorales, y ciertas células infectadas por un virus u otro parásito intracelular (todas las cuales expresan el proteosoma constitutivo), exponen necesariamente señales de epítopos diferentes que las señales de epítopos hacia las que las células T han sido condicionadas para reconocer por las pAPCs. En vista de este descubrimiento, se presenta un papel inmunorregulador fascinante para el proteosoma. Este descubrimiento proporciona una clave para manipular el sistema inmunitario, en particular las pAPCs, para inducir un ataque mediado por células eficaz y letal hacia las células
diana.

El procesamiento diferencial de antígenos explica por qué los CTLs específicos para los TuAAs se hallan a menudo entre los TILs sin la erradicación de la enfermedad. Las respuestas de los linfocitos T se sensibilizan contra los TuAAs que han sido procesados por las pAPCs. Los CTLs hallados entre los TILs están seleccionando en vano como diana TuAAs que estaban presentes en las pAPCs, pero que no están en las células tumorales (Figura 4).

El comportamiento de las células tumorales en el cuerpo, concretamente la migración, el recorte de antígenos, la inducción de respuestas inflamatorias, etc., da como resultado respuestas inmunitarias intensas. Desafortunadamente, el mecanismo natural del procesamiento diferencial de antígenos entre las células tumorales y las pAPCs da como resultado el aislamiento de epítopos del tumor - es decir, el tumor tiene una firma de epítopos diferente de la de las pAPCs que procesan el TuAA, y así los epítopos del tumor están "aislados" de los epítopos hacia los que las células T han sido condicionadas para reconocer por las pAPCs. La capacidad de predecir y hacer frente a este efecto de aislamiento de los epítopos es crucial para el desarrollo de una nueva generación de vacunas terapéuticas contra el cáncer. La superación del aislamiento de los epítopos da como resultado la sincronización de los epítopos.

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El Papel de las Diferencias de los Epítopos en las Infecciones por Virus y Otros Parásitos Intracelulares

Los patógenos persistentes emplean una amplia diversidad de mecanismos para establecer infecciones crónicas en el organismo hospedador. Un sello característico habitual es la expresión reducida o alterada de antígenos. En ciertas realizaciones, la presente invención se dirige al tratamiento y la prevención de la infección intracelular por diversos patógenos. Los ejemplos de tales patógenos incluyen, pero sin limitación: cualquier virus, bacteria, protozoo, prión u otros organismos que tengan una etapa de infección intracelular en el hospedador.

La presentación de los antígenos virales por las pAPCs comienza con la digestión de los antígenos virales hasta péptidos por el proteosoma. Después de que el proteosoma digiera la proteína hasta péptidos, algunos de los péptidos se cargan en el complejo de clase I en el retículo endoplásmico y se transportan a la superficie de la célula. En la superficie de la célula, el complejo clase I-péptido es reconocido por los receptores de las células T en la superficie de los CTLs, y las células infectadas son destruidas.

Los herpesvirus y los retrovirus escapan a la detección y a la erradicación posterior por el sistema inmunitario del hospedador por medio de la expresión génica viral restringida. También se han propuesto otros mecanismos mediante los cuales ciertos virus pueden eludir el sistema inmunitario, que incluyen los sitios "inmunológicamente privilegiados" de infección viral y la variación antigénica en los péptidos virales clave. Aunque estos modelos pueden explicar la persistencia de ciertos virus, el concepto de sincronización de epítopos, o a la inversa, la compartimentación de epítopos, proporciona una solución. Concretamente, este concepto proporciona una base para vacunas para dirigir una respuesta inmunitaria celular eficaz contra cualquier virus u otro parásito intracelular que eluda el sistema inmunitario bloqueando la expresión de proteosomas inmunitarios en las células del hospedador, o por otra parte evitando la sincronización de epítopos eficaz entre las células infectadas y las pAPCs (Figura 5).

Debido a que la infección de cualquier célula por un patógeno provoca normalmente que la célula infectada produzca IFN, el proteosoma del tejido infectado cambia generalmente de la configuración constitutiva a una configuración inmunitaria. La infección tiene así el efecto de alinear la célula infectada, en cuanto al repertorio de antígenos que expone en su superficie, con el de las pAPCs implicadas en la estimulación de la respuesta inmunitaria contra el virus u otro patógeno intracelular. Cuando se induce a las células infectadas por virus o a las células infectadas por parásitos a que expresen un proteosoma inmunitario, en vez del proteosoma constitutivo, el resultado es la "sincronización de epítopos" entre las células infectadas y las pAPCs, y la erradicación posterior de las células infectadas por los
CTLs.

Sin embargo, ciertos virus y otros parásitos intracelulares pueden escapar al reconocimiento de las células T inhibiendo la expresión de moléculas del hospedador necesarias para el reconocimiento eficaz de las células infectadas por parte de las células T. Existen pruebas que indican que muchas infecciones virales crónicas interfieren con la cascada del IFN (véase la Tabla 1). Por lo tanto, debido al papel de los proteosomas constitutivos, los proteosomas inmunitarios, y la compartimentación de epítopos, en muchas infecciones crónicas, algunas realizaciones de la invención son aplicables también al diseño de vacunas para cualquier parásito intracelular relevante, lo que incluye, pero sin limitación, virus, bacterias, y protozoos. Todos los parásitos intracelulares son dianas para tal diseño de vacunas. Estos incluyen, pero sin limitación: virus tales como adenovirus, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus herpes simple 1, virus herpes simple 2, herpesvirus 6 humano, virus varicela-zóster, virus de hepatitis B, virus de hepatitis D, virus de papiloma, parvovirus B19, poliomavirus BK, poliomavirus JC, virus de hepatitis C, virus de sarampión, virus de rubeola, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de leucemia de células T humanas de tipo I, y virus de leucemia de células T humanas de tipo II; bacterias tales como Chlamydia, Listeria, Salmonella, Legionella, Brucella, Coxiella, Rickettsia, Mycobacterium; y protozoos tales como Leishmania, Trypanasoma, Toxoplasma, y Plasmodium.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Vacunas y Métodos para Conseguir la Sincronización de Epítopos

Tal como se ha discutido en la presente memoria, la inmunidad celular eficaz se basa en la presentación sincronizada de epítopos entre las pAPCs y las células periféricas infectadas. En ausencia de sincronización de epítopos, las células diana no son reconocidas por las células T, incluso si esas células T están dirigidas contra TAAs. Las células cancerosas y las células que albergan parásitos intracelulares persistentes eluden la respuesta inmunitaria celular porque evitan la sincronización de epítopos. La sincronización de epítopos "natural" implica la activación de los proteosomas inmunitarios en las células infectadas, de forma que las células infectadas exponen los epítopos inmunitarios y así son reconocidas por las células T inducidas por las pAPCs. Sin embargo, los cánceres y las células infectadas por parásitos intracelulares persistentes no tienen proteosomas inmunitarios activos, y así permanecen sin ser reconocidas por el grupo normal de células T inducidas.

Las vacunas y los métodos de las realizaciones preferidas de la presente descripción representan así, esencialmente, una sincronización de epítopos "inversa", que provoca que las pAPCs expongan epítopos constitutivos para enfrentarse a situaciones en las que las células diana no exponen epítopos inmunitarios (Figuras 6 y 7). Ciertas realizaciones proporcionan también una segunda oleada de sincronización de epítopos induciendo a las pAPCs a que expongan tanto epítopos constitutivos como epítopos inmunitarios que corresponden a una célula diana seleccionada. Así, en estas realizaciones con epítopos dobles, una vez que las células diana son atacadas de forma eficaz por las células T que reconocen los epítopos constitutivos, un cambio de las células diana hacia el procesamiento con proteosomas inmunitarios no da como resultado una pérdida de reconocimiento inmunitario. Esto se debe a la presencia de epítopos inmunitarios en la vacuna, que actúa para inducir una población de células T que reconocen los epítopos inmunitarios.

Las realizaciones preferidas de la presente descripción se dirigen a vacunas y métodos para provocar que una pAPC o una población de pAPCs presenten epítopos constitutivos que corresponden a los epítopos expuestos en una célula diana particular. En una realización, el epítopo constitutivo es un epítopo de TuAA procesado por el proteosoma constitutivo de un tipo de tumor particular. En otra realización, el epítopo constitutivo es un epítopo asociado a virus procesado por el proteosoma constitutivo de una célula infectada con un virus. Esto facilita una respuesta de células T específicas hacia las células diana. La expresión concurrente por las pAPCs de múltiples epítopos, que corresponden a diferentes estados de inducción (pre- y post-ataque), puede controlar una respuesta de CTLs eficaz contra las células diana, ya que exponen epítopos constitutivos o epítopos inmunitarios (Figura 8).

Al tener epítopos constitutivos e inmunitarios presentes en las pAPCs, esta realización puede optimizar la respuesta de células T citotóxicas hacia una célula diana. Con la expresión doble de epítopos, las pAPCs pueden seguir manteniendo una respuesta de CTLs hacia el epítopo de tipo inmunitario cuando la célula tumoral cambia desde el proteosoma constitutivo al proteosoma inmunitario con la inducción mediante IFN, que puede ser producido, por ejemplo, por los CTLs infiltrantes de tumor.

En una realización preferida, la inmunización de un paciente es con una vacuna que incluye un epítopo constitutivo. Muchos TAAs preferidos están asociados exclusivamente a una célula diana, en particular en el caso de las células infectadas. En otra realización, muchos TAAs preferidos son el resultado de la expresión génica desregulada en las células transformadas, pero también se hallan en tejidos del testículo, ovarios y feto. En otra realización, los TAAs útiles se expresan a niveles superiores en la célula diana que en otras células. Aún en otras realizaciones, los TAAs no se expresan de forma diferencial en la célula diana en comparación con otras células, pero todavía son útiles debido a que están implicados en una función particular de la célula, y diferencian cada célula diana de la mayoría de las otras células periféricas; en tales realizaciones, las células sanas que también expresan el TAA pueden ser atacadas de forma colateral por la respuesta inducida de células T, pero se considera que tal daño colateral es más preferible que la enfermedad provocada por la célula diana.

Cuando las células neoplásicas son la diana, los antígenos preferidos incluyen TuAAs. Los ejemplos de antígenos proteicos adecuados para el uso incluyen los antígenos de diferenciación tales como MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, y antígenos multilinaje específicos de tumores tales como MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, RAGE, NY-ESO, SCP-1, Hom/Mel-40 y PRAME. De forma similar, los TuAAs incluyen oncogenes sobreexpresados, y genes supresores de tumores mutados tales como p53, H-Ras y HER-2/neu. Además, se incluyen los TuAAs únicos que resultan de translocaciones cromosómicas tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR y antígenos virales tales como los antígenos del virus de Epstein-Barr EBNA, y los antígenos E6 y E7 de virus de papiloma humano (HPV). Otros antígenos proteicos útiles incluyen, pero sin limitación, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, \beta-Catenina, CDK4, Mum-1, y p16. Se sabe que estos y otros TuAAs y antígenos relacionados con patógenos están disponibles para los expertos en la técnica en la bibliografía o comercialmente.

En una realización adicional, el TAA es un antígeno específico para un virus. Véase la Tabla 2. Aún en otra realización de la presente invención, el TAA es un antígeno específico para un parásito intracelular que no es viral. Los ejemplos de antígenos específicos de parásitos incluyen los nucleótidos, las proteínas, u otros productos génicos asociados al parásito intracelular. Los nucleótidos o las proteínas adecuadas se pueden hallar en la base de datos taxonómica del NCBI en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html/. Se proporcionan descripciones más detalladas de productos génicos para parásitos y otros patógenos en esta página de Internet.

TABLA 2

2

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Los compuestos y métodos descritos en la presente memoria son eficaces en cualquier contexto en el que una célula diana exponga epítopos constitutivos. Los métodos para descubrir epítopos eficaces para el uso en relación a las realizaciones de vacunas y tratamientos de esta invención se describen en la presente memoria.

Procesamiento Proteolítico de Antígenos

Los epítopos que son expuestos por el MHC en las células diana o en las pAPCs son productos de escisión de precursores antigénicos proteicos mayores. Para los epítopos del MHC I, los antígenos proteicos son digeridos por proteosomas residentes en la célula. Véase la Figura 1. La digestión proteosómica intracelular produce generalmente fragmentos peptídicos de una longitud de alrededor de 3 a 23 aminoácidos. Las actividades proteolíticas adicionales dentro de la célula, o en el medio extracelular, pueden recortar y procesar adicionalmente estos fragmentos. El procesamiento de los epítopos del MHC II ocurre por medio de proteasas intracelulares del compartimento lisosómico/endosómico.

Supuestamente, la mayoría de los productos del procesamiento proteico por los proteosomas o por otras actividades proteasas tienen poca o ninguna afinidad por la hendidura de unión de un péptido receptor MHC particular. Sin embargo, es probable que los productos del procesamiento que sí tienen tal afinidad sean presentados, a cierto nivel de abundancia, por el MHC en la superficie celular. A la inversa, si una secuencia oligopeptídica dada no sale intacta de las actividades de procesamiento de antígenos de la célula, no se puede presentar en la superficie celular, independientemente de la afinidad predicha de la secuencia por el MHC.

El diseño de vacunas que se centra completamente en la afinidad del MHC es fundamentalmente erróneo. El simple hecho de que un péptido tenga afinidad de unión al MHC no asegura que tal péptido conduzca a un inmunógeno funcional. Para proporcionar un epítopo capaz de provocar una respuesta inmunitaria eficaz contra un TAA, el péptido debe tener afinidad de unión al MHC y debe ser el producto de sistemas de generación de péptidos celulares. Los métodos de la invención descrita utilizan protocolos tanto del análisis de afinidad de unión al MHC como del análisis del procesamiento de antígenos para identificar nuevos epítopos de interés.

Correlación de la Unión al MHC predicha o Conocida con el Procesamiento Proteolítico de Antígenos

Para identificar los epítopos potencialmente eficaces como compuestos inmunógenos, las predicciones o la unión al MHC por sí solas generalmente son desventajosas, porque muchos fragmentos con unión predicha nunca se forman realmente en la célula. Las realizaciones de la invención combinan un análisis de la unión al MHC con un análisis del procesamiento proteolítico para identificar los epítopos que tiene las dos propiedades esenciales de un epítopo útil: afinidad por el MHC y procesamiento proteolítico correcto. Los péptidos que tienen estas dos propiedades son buenos candidatos para vacunas e inmunoterapia. Los péptidos que carecen de cualquiera de estas propiedades tienen pocas posibilidades de tener una oportunidad significativa de actuar como epítopos eficaces.

Las realizaciones de la descripción son capaces de identificar epítopos derivados de TAAs para el uso en vacunas. Los antígenos diana pueden proceder de células neoplásicas, células infectadas con un virus u otro parásito intracelular, o células infectadas con otros agentes patógenos tales como bacterias, hongos, protozoos, virus, priones, toxinas, venenos, alergenos, y similares. Brevemente, las realizaciones del método se pueden aplicar a prácticamente cualquier secuencia proteica para identificar en ella los epítopos capaces de generarse mediante proteolisis y capaces de unirse al MHC. Por lo tanto, la invención no se limita a ninguna diana particular o enfermedad médica, sino que en su lugar abarca el descubrimiento de epítopos del MHC biológicamente relevantes a partir de cualquier fuente útil.

En una realización preferida, el TAA es característico de una célula neoplásica, y así se define como un antígeno asociado a tumor (TuAA). Los TuAAs preferidos incluyen: antígenos de diferenciación tales como MelanA (MART-1), gap100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; antígenos embrionarios sobreexpresados en general; oncogenes sobreexpresados y genes supresores de tumores mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos tumorales únicos que resultan de translocaciones cromosómicas tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR1 y antígenos virales, tales como antígenos del virus de Epstein-Barr (EBVA) y los antígenos E6 y E7 de papiloma virus humano (HPV). Otros antígenos de interés incluyen el antígeno específico prostático (PSA), antígeno de células pluripotenciales de próstata (PSCA), MAAT-1, GP-100, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, p185erbB-2, p185erbB-3, c-met, nm-23H1, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, -Catenina, CDK4, Mum-1, p15, y p16. También se contemplan otros antígenos
diana.

Están disponibles y se conocen bien en la técnica una diversidad de métodos para identificar TuAAs. Los ejemplos de estas técnicas incluyen la hibridación diferencial, que incluye el uso de micromatrices; cloración mediante hibridación sustractiva; expresión diferencial, a nivel de la expresión del mARN o de proteínas; secuenciación de EST; y SAGE (análisis secuencial de la expresión génica). Estas técnicas de ácidos nucleicos han sido resumidas por Carulli, JP. et al J. Cellular Biochem Supl. 30/31:286-296, 1998. La expresión diferencial de proteínas implica, por ejemplo, la comparación de la electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional de lisados celulares de tejido tumoral y normal, la localización de puntos de proteínas únicas o sobreexpresadas en el tumor, la recuperación de la proteína del gel, y la identificación de la proteína mediante el uso de técnicas de secuenciación bioquímica tradicional o de técnicas de secuenciación mediante espectrometría de masas. Una técnica adicional para la identificación de TuAAs es la técnica SEREX, discutida en Türeci, Ö., Sahin, U., y Pfreundschuh, M., "Serological analysis of human tumor antigens: molecular definition and implications", Molecular Medicine Today, 3: 342,1997. El uso de estos y otros métodos proporciona a un experto en la técnica los métodos necesarios para identificar antígenos útiles para generar epítopos constitutivos e inmunitarios de clase I, así como epítopos de clase II para vacunas. Sin embargo, no es necesario, al poner en práctica la invención, identificar un TuAA o TAA nuevo. En su lugar, las realizaciones de la invención hacen posible identificar epítopos útiles a partir de cualquier secuencia proteica relevante, tanto si ya se conoce la secuencia como si es nueva.

Análisis de Fragmentos de TAAs para la Unión al MHC

Para identificar epítopos biológicamente relevantes, se identifican fragmentos dentro del TAA con una afinidad conocida o predicha por el MHC. La secuencia de aminoácidos de un TAA se puede realizar mediante varias técnicas diferentes con las que identificar los fragmentos peptídicos que tienen una afinidad conocida o predicha por la hendidura de unión de un péptido MHC. En una realización, se analiza la capacidad predicha de los fragmentos del TAA de unirse a la hendidura de unión de un péptido MHC mediante el uso de un algoritmo informático. Cada alelo del MHC especifica un dominio de unión a un epítopo particular. Así, para cualquier alelo del MHC dado, los péptidos candidatos se pueden cribar en función de la afinidad predicha hacia él. Los ejemplos de algoritmos informáticos adecuados para este propósito incluyen los que se hallan en la página de Internet de Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Emmerich, Stefan Stevanovic: SYFPEITHI: An Internet Database for MHC Ligands and Peptide Motifs (acceso vía http://: syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/honle.htm). Los resultados obtenidos a partir de este método se discuten en Rammensee, et al., "MHC Ligands and Peptide Motifs", Landes Bioscience Austin, TX, 224-227, 1997. Otro sitio http:// de interés es "bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind", que también contiene un algoritmo adecuado. Los métodos de este sitio de Internet se discuten en Parker, et al., "Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains", J. Immunol. 152:163-175.

Mediante el uso del algoritmo NIH (Parker) con los métodos de la invención, se seleccionarían los péptidos mediante el uso de varios tiempos de retención posibles para indicar una secuencia de unión. En una realización, se seleccionarían los péptidos con un tiempo de retención infinito. En otra realización, se seleccionarían los péptidos con un tiempo de retención de 25 minutos o más para indicar una secuencia de unión. Aún en otra realización, se seleccionaría un tipo de retención de 15 minutos o más para indicar una secuencia de unión. Aún en otra realización, se seleccionaría un tiempo de retención de 10 minutos para indicar una secuencia de unión. También se contemplan los tiempos de retención de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, y 1 minuto.

Como alternativa a los algoritmos predictivos, hay disponibles varios ensayos de afinidad de unión a receptores in vitro estándar para identificar péptidos que tienen una afinidad por un alelo particular del MHC. Por lo tanto, mediante el método de este aspecto de la invención, la población inicial de fragmentos peptídicos se puede estrechar para que incluyan solamente los péptidos que tienen una afinidad real o predicha por el alelo seleccionado del MHC.

Inicialmente, los candidatos peptídicos para este análisis pueden incluir cualquier secuencia posible de alrededor de 6 a 24 aminoácidos contiguos de la secuencia proteica completa del TAA. En una realización preferida, las secuencias pueden tener una longitud de alrededor de 7 a 20 aminoácidos. En una realización más preferida, las secuencias pueden tener una longitud de alrededor de 8 a 15 aminoácidos. Para el análisis de secuencias para identificar fragmentos con una afinidad predicha por el MHC I, una realización muy preferida analiza todas las secuencias posibles de fragmentos de 9 ó 10 aminoácidos contiguos del TAA. El análisis de la afinidad por el MHC de los fragmentos se puede llevar a cabo in vitro o por medio del análisis informático de los fragmentos.

Los alelos comunes seleccionados del MHC I, y sus frecuencias aproximadas, se informan en las Tablas 3-5 a continuación.

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Las Tablas 3, 4 y 5 proceden de HLA Gene and Haplotype Frecuencies in the North American Population: The National Marrow Donor Program Donor Registry, Mori, M. et al.

Determinación de si un Fragmento con Afinidad por el MHC es un Epítopo Útil

Tal como se discutió anteriormente, una etapa preliminar del método descrito es seleccionar de entre la población original de fragmentos peptídicos una subpoblación de péptidos con una afinidad real o predicha por el MHC. Los fragmentos seleccionados se analizan adicionalmente para determinar cuáles pueden ser producidos por una célula en condiciones in vivo que podrían dar como resultado la unión del péptido al alelo del MHC seleccionado. Todos los péptidos que cumplen ambos criterios de afinidad por el MHC y de procesamiento proteolítico correcto se denominan "epítopos descubiertos". Hay disponible una diversidad de métodos para determinar qué fragmentos peptídicos se pueden producir mediante el procesamiento proteolítico in vivo. Estos métodos incluyen la elución de péptidos a partir del MHC solubilizado y células intactas, análisis de secuencias por ordenador de los motivos de escisión proteolítica, y análisis in vitro de los fragmentos peptídicos reales producidos por la maquinaria proteolítica celular.

En una realización preferida, se puede generar una serie de péptidos sintéticos que contienen en posición central secuencias peptídicas candidatas individuales o agrupadas. Tales péptidos oscilan en general en una longitud de alrededor de 10 a alrededor de 75 aminoácidos. En una realización preferida, el péptido sintético tiene una longitud de entre alrededor de 20 y 60 aminoácidos. En una realización más preferida, el grupo tiene una longitud de entre alrededor de 30 y 40 aminoácidos. Mediante el uso de métodos de química sintética de péptidos estándar, lo que incluye la química de protección con t-Boc, la química de protección con Fmoc, y similares, un experto en la técnica puede producir una población de péptidos candidatos para el cribado posterior.

De forma alternativa, se pueden generar fragmentos peptídicos que contienen péptidos candidatos in vitro por medio de la digestión con proteasas o la escisión química del TAA o de los fragmentos del mismo. La digestión con proteasas para preparar tales fragmentos de TAAs puede emplear una amplia diversidad de proteasas conocidas, que incluyen, pero sin limitación, proteasas de proteosomas, tripsina, quimotripsina, bromelaína, clostripaína, elastasa, endoproteinasas, exoproteinasas, proteinasa K, ficina, papaína, pepsina, plasmina, termolisina, trombina, tripsina, catepsinas, y otras. También se pueden usar métodos químicos para generar péptidos candidatos. Los productos químicos o las reacciones químicas adecuadas para escindir enlaces peptídicos incluyen la escisión con ácidos suaves, bromuro de cianógeno, hidroxilamina, ácido yodosobenzoico, 2-nitro-5-tiocianobenzoato, y similares. En una realización, se puede usar el TAA sin fragmentar, aunque el uso de una secuencia inicial especialmente larga puede complicar el análisis.

Independientemente de cómo se creen los fragmentos que contienen los péptidos candidatos, es importante determinar qué epítopos son producidos por la maquinaria celular. En una realización de la invención, se usa la digestión con proteosomas para estimar la generación celular de epítopos. En esta realización, se purifican proteosomas inmunitarios y constitutivos para el uso in vitro para estudiar el repertorio antigénico generado de forma natural a partir de los dos tipos de proteosomas.

En general, se preparan los proteosomas mediante purificación por afinidad a partir de extractos celulares. En una realización preferida, se prepara un lisado celular mediante el uso de técnicas habituales. El lisado se purifica mediante ultracentrifugación si los eritrocitos no son el material original. El lisado celular preparado se purifica después a partir de otros componentes celulares mediante el uso de cualquiera de varias técnicas de purificación, que incluyen diversas formas de cromatografía.

En una realización, se usa la cromatografía de afinidad para purificar los proteosomas. El lisado celular se aplica en una columna de afinidad que contiene un anticuerpo monoclonal (mAb) contra una de las subunidades proteosómicas. La columna se lava después para purificar los proteosomas unidos del resto del material celular. Tras el lavado, los proteosomas unidos se eluyen de la columna. El eluato se caracteriza en cuanto al contenido proteico y a la actividad proteolítica con un sustrato estándar.

El análisis de escisión mediante el uso de proteosomas tanto constitutivos como inmunitarios produce epítopos de clase I a partir de diversos TAAs. Los epítopos que son presentados por las pAPCs corresponden a los productos de escisión del proteosoma inmunitario, mientras los epítopos presentados por tumores y por muchas células infectadas de forma crónica con parásitos intracelulares corresponden a los productos de escisión del proteosoma constitutivo. Una vez que se lleva a cabo la digestión, se identifican las especies moleculares particulares producidas. En una realización preferida, esto se consigue mediante espectrometría de masas. Esto permite la identificación rápida de los fragmentos peptídicos naturales que son producidos por cualquiera de los dos tipos de proteosomas. En otra realización, la escisión del antígeno diana o de los fragmentos del mismo por los proteosomas inmunitarios y constitutivos, o por las proteasas endosómicas/lisosómicas (véase más adelante), se predice mediante la modelización informática basada en los motivos de escisión de las actividades proteolíticas relevantes.

Mientras el MHC de clase I se carga principalmente con péptidos derivados de proteosomas a medida que se pliega inicialmente en el retículo endoplásmico, la hendidura de unión del MHC de clase II está bloqueada por la denominada cadena invariable (II) en este compartimento. La carga del péptido para el MHC de clase II tiene lugar principalmente en el compartimento endosómico, mediante la utilización de los péptidos generados por las proteasas endosómicas y lisosómicas. Así, si se desea la identificación in vitro de los epítopos de clase II del MHC, las preparaciones de proteasas de las fracciones endosómicas y/o lisosómicas se pueden sustituir por los proteosomas. Se describe una diversidad de métodos para llevar a cabo esta sustitución en la bibliografía. Por ejemplo, Kido y Ohshita, Anal. Biochem., 230:41-7 (1995); Yamada, et al., J. Biochem. (Tokio), 95:1155-60 (1984); Kawashima, et al., Kidney Int., 54:275-8 (1998); Nakabayshi e Ikezawa, Biochem. Int. 16:1119-25 (1988); Kanaseki y Ohkuma, J. Biochem. (Tokio), 110:541-7 (1991); Wattiaux, et al., J. Cell Biol., 78:349-68 (1978); Lisman, et al., Biochem. J. 178:79-87 (1979); Dean, B., Arch. Biochem. Biophys., 227:154-63 (1983); Overdijk, et al., Adv. Exp. Med. Biol., 101:601-10 (1978); Stromhaug, et al., Biochem. J., 335:217-24 (1998); Escola, et al., J. Biol. Chem. 271:27360-5 (1996); Hammond, et al., Am. J. Physiol., 267:F516-27 (1994); Williams y Smith, Arch. Biochem. Biophys. 305:298-306 (1993); Marsh, M., Methods Cell Biol., 31:319-34 (1989); y Schmid y Mellman, Prog. Clin. Biol. Res., 270:35-49 (1988), describen todos ellos métodos para preparar preparaciones proteolíticas adecuadas.

En otra realización, la digestión para determinar qué epítopos produce la maquinaria celular tiene lugar dentro de una célula que expresa el TAA o un fragmento del mismo. Para los epítopos de clase I se prefiere que el tipo de proteosoma expresado por la célula se determine, por ejemplo, mediante transferencia de Western. Los epítopos del MHC producidos se pueden eluir después del MHC solubilizado y purificado tal como se describe en Falk, K. et al. Nature 351:290, 1991, o directamente de las células intactas tal como se describe en la patente de EE.UU. 5.989.565. Los fragmentos eluidos se identifican después mediante espectrometría de masas.

Análisis de los Fragmentos de las Proteínas Diana

Las especies moleculares detectadas mediante espectrometría de masas se comparan con los péptidos candidatos predichos anteriormente. En el caso de los epítopos de clase I, se desean las especies que son tan largas como, o más largas que, un péptido candidato y que comparten su extremo C-terminal; el recorte N-terminal de al menos hasta 25 aminoácidos se puede dar independientemente del proteosoma (Craiu, A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10850-55, 1997). El MHC de clase II es muy tolerante en cuanto a la longitud de los péptidos a los que se unirá, de forma que la ausencia de escisión en mitad del epítopo se convierte en el criterio principal, en vez de la generación de un extremo correcto.

Después se sintetiza un producto de digestión seleccionado y se usa como patrón en un método analítico tal como HPLC frente a una alícuota de la digestión. Esto proporciona una comprobación adicional de la identidad del producto de la digestión y permite determinar su rendimiento. En casos poco frecuentes, más de un producto potencial pueden tener masas y características químicas lo suficientemente similares para que no se diferencien con precisión mediante estos métodos. En tales casos, se puede recoger el pico de HPLC y someterlo a secuenciación directa para confirmar la identidad.

Análisis de Péptidos para la Unión al MHC

El epítopo se sintetiza, y se ensaya su capacidad de unirse a un receptor MHC. Por ejemplo, en un ensayo preferido, se pueden usar células que exponen el receptor MHC I para medir la afinidad de unión de los péptidos candidatos marcados con un radionúclido. Otra aproximación preferida mide la capacidad de un péptido de unirse a un receptor MHC I mediante el uso de un ensayo basado en cultivos celulares. En este ensayo, se usan células que carecen de transportadores asociados al procesamiento de antígenos (TAP) para determinar si un péptido candidato tiene o no la capacidad de unirse al receptor MHC I. Las células TAP^{-} tienen un fenotipo en el que las proteínas del MHC de clase I no siempre se pliegan de forma correcta, y así se reduce o se suprime la expresión superficial del MHC I. Cuando la célula está saturada de péptido exógeno que se puede unir a la hendidura del MHC I, se restaura la expresión del receptor. Esto se puede monitorizar por varios medios tales como RIA, FACS y similares. Mediante el uso de células TAP^{-}, un experto en la técnica puede cribar un gran número de péptidos candidatos potenciales para la unión al receptor sin tener que llevar a cabo un análisis de afinidad de unión detallado.

Los métodos de análisis de las diversas realizaciones de la descripción son útiles para examinar péptidos candidatos generados de una diversidad de formas. Por ejemplo, el análisis descrito se puede usar para estudiar múltiples péptidos candidatos generados por medio de métodos in vitro o mediante análisis informático, para identificar las secuencias candidatas que tienen características de unión a receptores MHC. Los péptidos candidatos preferidos en esta realización de la invención son aquellos que ya se sabe que son productos de la producción proteolítica mediante proteosomas constitutivos y/o inmunitarios. Tanto los productos de escisión in vivo como los productos de escisión in vitro que se demuestra o que se predice que se unen al MHC se denominan de forma apropiada "epítopos descubiertos". Los grupos de epítopos para el uso en relación a esta invención se describen en la presente memoria.

Los ECRs Se Procesan hasta Epítopos de Unión al MHC en las pAPCs

El sistema inmunitario vigila constantemente la presencia de antígenos exógenos en el cuerpo, en parte a través de la actividad de las pAPCs. Las pAPCs endocitan la materia hallada en el medio extracelular, procesan esa materia desde una forma polipeptídica hasta oligopéptidos más cortos de una longitud de alrededor de 3 a 23 aminoácidos, y exponen algunos de los péptidos resultantes a las células T por medio del complejo MHC de las pAPCs. Por ejemplo, una célula tumoral tras la lisis libera su contenido celular, que incluye diversas proteínas, en el medio extracelular. Esas proteínas liberadas pueden ser endocitadas por las pAPCs y procesadas hasta péptidos distintos que después se exponen en la superficie de las pAPCs por medio del MHC. Mediante este mecanismo, no es la proteína diana completa la que se presenta en la superficie de las pAPCs, sino que se presentan uno o más fragmentos distintos de esa proteína en forma de epítopos de unión al MHC. Si un epítopo presentado es reconocido por una célula T, esa célula T se activa y se da como resultado una respuesta inmunitaria.

De forma similar, los receptores depuradores de la pAPC pueden captar secuencias desnudas de ácidos nucleicos u organismos recombinantes que contienen secuencias de ácidos nucleicos diana. La absorción de las secuencias de ácidos nucleicos en la pAPC da como resultado posteriormente la expresión de los productos codificados. Como anteriormente, cuando un ECR se puede procesar hasta uno o más epítopos útiles, estos productos se pueden presentar en forma de epítopos del MHC para el reconocimiento por las células T.

Los epítopos de unión al MHC a menudo están distribuidos de forma irregular en grupos a lo largo de la secuencia de una proteína. Las realizaciones de la invención se dirigen a la identificación de las regiones de grupos de epítopos (ECRs) en una región particular de una proteína diana. Es probable que los ECRs candidatos sean sustratos naturales para diversas enzimas proteolíticas, y es probable que se procesen hasta uno o más epítopos para la exposición con el MHC en la superficie de una pAPC. En contraste con las vacunas más tradicionales que administran proteínas completas o agentes biológicos, los ECRs se pueden administrar en forma de vacunas, lo que da como resultado una probabilidad elevada de que al menos un epítopo sea presentado con el MHC sin la necesidad del uso de una secuencia de longitud completa.

El Uso de ECRs en la Identificación de Epítopos Distintos de Unión al MHC

La identificación de supuestos epítopos del MHC para el uso en vacunas incluye a menudo el uso de algoritmos predictivos disponibles que analizan las secuencias de proteínas o genes para predecir la afinidad de unión de los fragmentos peptídicos al MHC. Estos algoritmos clasifican los supuestos epítopos según la afinidad predicha u otras características asociadas a la unión al MHC. Los algoritmos ejemplares para este tipo de análisis incluyen los algoritmos de Rammensee y NIH (Parker). Sin embargo, la identificación de los epítopos que están presentes de forma natural en la superficie de las células de entre los supuestos epítopos predichos mediante el uso de estos algoritmos ha demostrado ser un procedimiento difícil y laborioso. El uso de los ECRs en un procedimiento de identificación de epítopos puede simplificar enormemente la tarea de identificar epítopos distintos de unión al MHC.

En una realización preferida, los polipéptidos de ECRs se sintetizan en un sintetizador automatizado de péptidos, y estos ECRs se someten después a digestiones in vitro mediante el uso de enzimas proteolíticas implicadas en el procesamiento de proteínas para la presentación de los epítopos. Después se usa la espectrometría de masas y/o la HPLC analítica para identificar los productos de la digestión, y se usan los estudios de unión al MHC in vitro para estudiar la capacidad de estos productos para unirse realmente al MHC. Una vez que se ha demostrado que los epítopos contenidos en los ECRs se unen al MHC, se pueden incorporar en vacunas o usarlos como productos de diagnóstico, en forma de epítopos distintos o en el contexto de los ECRs.

El uso de un ECR (que debido a su secuencia relativamente corta se puede producir por medio de la síntesis química) en esta realización preferida es una mejora significativa sobre lo que de otra manera requeriría el uso de la proteína completa. Esto se debe a que las proteínas completas se tienen que producir mediante el uso de sistemas de vectores de expresión recombinantes y/o procedimientos complejos de purificación. La simplicidad de usar los ECRs sintetizados químicamente permite el análisis y la identificación de un gran número de epítopos, a la vez que se reduce en gran medida el tiempo y el coste del procedimiento en comparación con otros métodos usados actualmente. El uso de un ECR definido también simplifica enormemente el análisis mediante espectrometría de masas de la digestión, debido a que los productos de la digestión de ECRs son una pequeña fracción de los productos de digestión de una proteína completa.

En otra realización, se usan secuencias de ácidos nucleicos que codifican ECRs para expresar los polipéptidos en células o líneas celulares para estudiar qué epítopos se presentan en la superficie. Se puede usar una diversidad de medios para detectar el epítopo en la superficie. Las realizaciones preferidas implican la lisis de las células y la purificación mediante afinidad del MHC, y la elución posterior y el análisis de los péptidos del MHC; o la elución de los epítopos a partir de células intactas (Falk, K. et al. Nature 351:290, 1991, y la patente de EE.UU. 5.989.565, respectivamente). Un método sensible para el análisis de los péptidos eluidos de esta manera del MHC emplea HPLC capilar o nanocapilar-espectrometría de masas ESI y secuenciación en tiempo real.

Antígenos Asociados a Diana que Contienen ECRs

Los TAAs a partir de los cuales se pueden definir ECRs incluyen los de TuAAs, que incluyen genes oncofetales, de cáncer de testículo, desregulados, genes de fusión de translocaciones anormales, antígenos de diferenciación, antígenos embrionarios, proteínas del ciclo celular, genes supresores de tumores mutados, y productos génicos sobreexpresados, que incluyen los oncogenes. Además, los ECRs pueden proceder de productos génicos virales, en particular aquellos asociados a virus que provocan enfermedades crónicas o que son oncógenos, tales como los herpesvirus, virus de papiloma humano, virus de inmunodeficiencia humana, y virus de leucemia de células T humanas. Además, los ECRs pueden proceder de productos génicos de organismos parasitarios, tales como Trypanosoma, Leishmania, y otros organismos intracelulares o parasitarios.

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Algunos de estos TuAAs incluyen \alpha-fetoproteína, antígeno carcinoembrionario (CEA), NY-ESO-1 derivado de cáncer esofágico, y genes SSX, SCP-1, PRAME, MART-1/MelanA (MART-1), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; oncogenes sobreexpresados y genes supresores de tumores mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos tumorales únicos que resultan de translocaciones cromosómicas tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RARI y antígenos virales, EBNA1, EBNA2, HPV-E6, -E7; antígeno prostático específico (PSA), antígeno de células pluripotenciales prostáticas (PSCA), MAAT-1, GP-100, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, p185erbB-2, p185erbB-3, c-met, nm-23H1, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, -Catenina, CDK4, Mum-1, p15, y p16.

Otros numerosos TAAs también se contemplan tanto para patógenos como para tumores. En cuanto a los TuAAs, hay disponible una diversidad de métodos bien conocidos en la técnica para identificar genes y productos génicos que se expresan de forma diferencial en las células neoplásicas en comparación con las células normales. Los ejemplos de estas técnicas incluyen la hibridación diferencial, que incluye el uso de micromatrices; la clonación mediante hibridación sustractiva; la expresión diferencial, a nivel del mARN o de la expresión de proteínas; la secuenciación de EST; y SAGE (análisis secuencial de la expresión génica). Estas técnicas con ácidos nucleicos han sido resumidas por Carulli, J.P. et al., J. Cellular Biochem, Supl. 30/31:286-296, 1998. La expresión diferencial de proteínas implica, por ejemplo, la comparación de la electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional de lisados celulares de tejido tumoral y normal, la localización de los puntos de las proteínas únicas o sobreexpresadas en el tumor, la recuperación de la proteína del gel, la identificación de la proteína mediante el uso de la secuenciación basada en procedimientos bioquímicos tradicionales o en espectrometría de masas. Una técnica adicional para la identificación de TAAs es la técnica Serex, discutida en Türeci, Ö, Sahin, U., y Pfreundschuh, M., "Serological analysis of human tumor antigens: molecular definition and implications", Molecular Medicine Today, 3:342, 1997.

El uso de estos y otros métodos proporciona a un experto en la técnica los métodos necesarios para identificar los genes y productos génicos contenidos dentro de una célula diana que se pueden usar como proteínas candidatas potenciales para la generación de los epítopos de la invención descrita. Sin embargo, no es necesario, en la práctica de la invención, identificar un TuAA o TAA nuevo. En su lugar, las realizaciones de la invención hacen posible identificar ECRs a partir de cualquier secuencia proteica relevante, tanto si ya se conoce la secuencia como si es nueva.

Análisis de Secuencias Proteicas para Identificar Grupos de Epítopos

En las realizaciones preferidas, la identificación de los ECRs implica dos etapas principales: (1) identificar supuestos epítopos adecuados; y (2) definir los límites de cualquier grupo en el que estén localizados estos supuestos epítopos. Hay diversas realizaciones preferidas de cada una de estas dos etapas, y una realización seleccionada para la primera etapa se puede combinar libremente con una realización seleccionada para la segunda etapa. Los métodos y realizaciones que se describen en la presente memoria para cada una de estas etapas son meramente ejemplares, y no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna manera. Los expertos en la técnica apreciarán las herramientas específicas que se pueden aplicar al análisis de un TAA específico, y tales análisis se pueden llevar a cabo de varias maneras de acuerdo con la invención.

Las realizaciones preferidas para la identificación de supuestos epítopos adecuados incluyen el uso de cualquier algoritmo predictivo disponible que analice las secuencias de proteínas o genes para predecir la afinidad de unión de los fragmentos peptídicos por el MHC, o para clasificar los supuestos epítopos según la afinidad predicha u otras características asociadas a la unión al MHC. Tal como se describió anteriormente, los algoritmos ejemplares disponibles para este tipo de análisis incluyen los algoritmos de Rammensee y NIH (Parker). De forma similar, se pueden identificar supuestos epítopos adecuados mediante ensayos directos o indirectos de unión al MHC. Para elegir supuestos epítopos "adecuados" es necesario fijar un punto de corte en cuanto a la puntuación informada por el programa informático de predicción, o en cuanto a la afinidad de unión ensayada. En ciertas realizaciones, tal punto de corte es absoluto. Por ejemplo, el punto de corte se puede basar en la semivida de disociación medida o predicha entre un epítopo y un alelo del MHC seleccionado. En tales casos, las realizaciones del punto de corte pueden ser cualquier semivida de disociación mayor de, por ejemplo, 0,5 minutos; en una realización preferida mayor de 2,5 minutos; en una realización más preferida, mayor de 5 minutos; y en una realización muy rigurosa puede ser mayor de 10, o 20, o 25 minutos. En estas realizaciones, los supuestos epítopos adecuados son aquellos en los que se predice o se identifica que tienen buenas características de unión al MHC, que se definen por estar en el lado deseable del punto de corte designado. De forma similar, el punto de corte se puede basar en la afinidad de unión medida o predicha entre un epítopo y un alelo del MHC seleccionado. Además, el punto de corte absoluto puede ser simplemente un número seleccionado de supuestos epítopos.

En otras realizaciones, el punto de corte es relativo. Por ejemplo, se puede usar un porcentaje seleccionado del número total de supuestos epítopos para establecer el punto de corte para definir una secuencia candidata como un buen supuesto epítopo adecuado. De nuevo, las propiedades para clasificar los epítopos proceden de la unión al MHC medida o predicha; la propiedad usada para tal determinación puede ser cualquiera que sea relevante o indicativa de la unión. En las realizaciones preferidas, la identificación de supuestos epítopos adecuados puede combinar múltiples métodos para clasificar las secuencias candidatas. En tales realizaciones, los epítopos adecuados son en general aquellos que representan un consenso de los epítopos adecuados basados en métodos y parámetros diferentes, o aquellos que son clasificados especialmente bien mediante al menos uno de los métodos.

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Cuando se han identificado varios supuestos epítopos adecuados, se pueden analizar sus posiciones relativas entre sí para determinar los grupos óptimos para el uso en vacunas o en el diseño de vacunas. Este análisis se basa en la densidad de una característica del epítopo seleccionado en la secuencia del TAA. Las regiones con la densidad más elevada de la característica, o con una densidad por encima de cierto punto de corte seleccionado, se denominan ECRs. Diversas realizaciones de la invención emplean diferentes características para el análisis de la densidad. Por ejemplo, una característica preferida es simplemente la presencia de cualquier supuesto epítopo adecuado (tal como se define mediante cualquier método apropiado). En esta realización, todos los supuestos epítopos por encima del punto de corte se tratan igualmente en el análisis de la densidad, y los mejores grupos son aquellos con la densidad más elevada de supuestos epítopos adecuados por residuo de aminoácido. En otra realización, la característica preferida se basa en el/los parámetro(s) previamente usado(s) para puntuar o clasificar los supuestos epítopos. En esta realización, un supuesto epítopo con una puntuación que sea el doble que la de otro supuesto epítopo se pondera doblemente en el análisis de la densidad, respecto del otro supuesto epítopo. Aún otras realizaciones tienen en cuenta la puntuación o la clasificación, pero a una escala disminuida, tal como, por ejemplo, mediante el uso del logaritmo o de la raíz cuadrada de la puntuación para proporcionar más ponderación a ciertos supuestos epítopos que a otros en el análisis de la densidad.

Dependiendo de la longitud del TAA a analizar, el número de posibles epítopos candidatos, el número de supuestos epítopos adecuados, la variabilidad de la puntuación de los supuestos epítopos adecuados, y otros factores que se hacen evidentes en cualquier análisis dado, se pueden usar las diversas realizaciones de la invención solas o en combinación para identificar los ECRs que son los más útiles para una aplicación dada. Los análisis iterativos o paralelos que emplean múltiples aproximaciones pueden ser beneficiosos en muchos casos. Los ECRs son herramientas para una eficacia incrementada en la identificación de auténticos epítopos del MHC, y para un "empaquetamiento" eficaz de los epítopos del MHC en vacunas. Por lo tanto, cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, u otras realizaciones que son evidentes para los expertos en la técnica basándose en esta descripción, son útiles para incrementar la eficacia de estos esfuerzos mediante el uso de los ECRs en vez del uso de TAAs completos en vacunas y en el diseño de vacunas.

Debido a que muchos o la mayoría de TAAs tienen regiones con una baja densidad de epítopos del MHC predichos, el uso de los ECRs proporciona una metodología valiosa que evita las ineficacias de incluir regiones de baja densidad de epítopos en vacunas y en protocolos de identificación de epítopos. Así, los ECRs útiles se pueden definir también como cualquier porción de un TAA que no es el TAA completo, en el que la porción tiene una densidad superior de supuestos epítopos que el TAA completo, o que cualquier región del TAA que tiene una densidad especialmente baja de supuestos epítopos. En este aspecto de la invención, por lo tanto, un ECR puede ser cualquier fragmento de un TAA con una densidad elevada de epítopos. En ciertas realizaciones, un ECR puede incluir una región de hasta alrededor de un 80% de la longitud del TAA. En una realización preferida, un ECR puede incluir una región de hasta alrededor del 50% de la longitud del TAA. En una realización más preferida, un ECR puede incluir una región de hasta alrededor del 30% de la longitud del TAA. Y en una realización muy preferida, un ECR puede incluir una región de entre un 5 y un 15% de la longitud del TAA.

En otro aspecto de la invención, el ECR se puede definir en términos de longitud absoluta. Por lo tanto, mediante esta definición, el grupo mínimo para los epítopos 9-méricos incluye 10 residuos de aminoácidos y tiene dos 9-meros solapantes con 8 aminoácidos en común. En una realización preferida, el grupo tiene una longitud de entre alrededor de 15 y 75 aminoácidos. En una realización más preferida, el grupo tiene una longitud de entre alrededor de 20 y 60 aminoácidos. En una realización muy preferida, el grupo tiene una longitud de entre alrededor de 30 y 40 aminoácidos.

En la práctica, tal como se describió anteriormente, la identificación de ECRs puede emplear una función de densidad simple, tal como el número de epítopos dividido por el número de aminoácidos abarcados por esos epítopos. No es necesario que los epítopos se solapen, pero el valor para un único epítopo no es significativo. Si se usa solamente un único valor para un punto de corte en porcentaje y no se usa un punto de corte absoluto en la predicción de epítopos, es posible fijar un único umbral en esta etapa para definir un grupo. Sin embargo, mediante el uso de un punto de corte absoluto y llevando a cabo la primera etapa mediante el uso de puntos de corte en porcentaje diferentes, se pueden producir variaciones en la densidad global de los epítopos candidatos. Tales variaciones pueden requerir cálculos o manipulaciones adicionales. Por ejemplo, un solapamiento de 2 epítopos es más significativo si se consideraban solamente 3 epítopos candidatos que si se consideraban 30 candidatos para cualquier longitud de proteína particular. Para tener en cuenta esta característica, la ponderación proporcionada a un grupo particular se puede dividir además por la fracción de péptidos posibles que se están realmente considerando, para incrementar la significación del cálculo. Esto ajusta el resultado a la densidad media de los epítopos predichos en la proteína original.

De forma similar, ciertas realizaciones basan la puntuación de los supuestos epítopos adecuados sobre el número medio de péptidos considerados por aminoácido en la proteína. La proporción resultante representa el factor por el cual la densidad de los epítopos predichos en el supuesto grupo difiere de la densidad media en la proteína. Por lo tanto, un ECR se define en una realización como cualquier región que contiene dos o más epítopos predichos para la cual esta proporción supera 2, es decir, cualquier región con dos veces la densidad media de epítopos. En otras realizaciones, la región se define como un ECR si la proporción supera 1,5, 3, 4, o 5, o más.

El considerar el número medio de péptidos por aminoácido en una proteína diana para calcular la presencia de un ECR pone de relieve ECRs densamente poblados independientemente de la puntuación/afinidad de los constituyentes individuales. Esto es muy apropiado para el uso de puntos de corte basados en puntuaciones. Sin embargo, un ECR con solamente un pequeño número de candidatos clasificados de forma elevada puede ser de más significación biológica que un grupo con varios candidatos densamente empaquetados pero con clasificaciones menores, en particular si solamente un pequeño porcentaje del número total de péptidos candidatos se designaron como supuestos epítopos adecuados. Así, en ciertas realizaciones, es apropiado tomar en consideración las puntuaciones de los péptidos individuales. Esto se lleva a cabo muy fácilmente sustituyendo la suma de las puntuaciones de los péptidos en el supuesto grupo por el número de péptidos en el supuesto grupo en el cálculo descrito anteriormente.

Este método de suma de puntuaciones es más sensible para grupos poblados de forma difusa que contienen epítopos de puntuación elevada. Debido a que el amplio intervalo de puntuaciones (es decir, semividas de disociación) producido por el algoritmo BIMAS-NIH/Parker puede conducir a un único péptido de puntuación elevada que empequeñece la contribución de otros epítopos potenciales, se usa preferiblemente el logaritmo de la puntuación en vez de la propia puntuación en este procedimiento.

Se pueden idear otros diversos cálculos en una u otra circunstancia. En general, la función de densidad de epítopos se construye de forma que es proporcional al número de epítopos predichos, sus puntuaciones, sus clasificaciones, y similares, dentro del supuesto grupo, y de forma inversamente proporcional al número de aminoácidos o fracción de proteína contenida dentro de ese supuesto grupo. De forma alternativa, la función se puede determinar para un intervalo de un número seleccionado de aminoácidos contiguos. En cualquier caso, la función se determina también para todos los epítopos predichos en la proteína completa. Si la proporción de valores para el supuesto grupo (o intervalo) y la proteína completa es mayor de, por ejemplo, 1,5, 2, 3, 4, 5, o más, se define un ECR.

Análisis de Productos Génicos Diana para la Unión al MHC

Una vez que se ha identificado un TAA, se puede usar la secuencia proteica para identificar supuestos epítopos con afinidad conocida o predicha hacia la hendidura de unión de un péptido MHC. Se pueden llevar a cabo ensayos de los fragmentos peptídicos in vitro, o la secuencia se puede analizar informáticamente para determinar la unión a receptores MHC de los fragmentos peptídicos. En una realización de la invención, los fragmentos peptídicos basados en la secuencia de aminoácidos de la proteína diana se analizan en cuanto a su capacidad predicha de unirse a la hendidura de unión de un péptido MHC. Los ejemplos de algoritmos informáticos adecuados para este propósito incluyen el Rammensee/SYFPETTHI y los sitios del NIH (Parker) a los que se hace referencia en la discusión del descubrimiento de epítopos anterior.

Como alternativa a los algoritmos predictivos, hay disponibles varios ensayos de afinidad de unión a receptores in vitro estándar para identificar péptidos que tienen afinidad por un alelo particular del MHC. Por lo tanto, mediante el método de este aspecto de la invención, la población inicial de fragmentos peptídicos se puede estrechar para incluir solamente supuestos epítopos que tienen una afinidad real o predicha por el alelo seleccionado del MHC. Los alelos comunes seleccionados del MHC, y sus frecuencias aproximadas, se informan en las Tablas 3-5 anteriores.

Se ha observado que los epítopos predichos se agrupan a menudo en una o más regiones particulares dentro de la secuencia de aminoácidos de un TAA. La identificación de tales ECRs ofrece una solución simple y factible para el problema del diseño de vacunas eficaces para estimular la inmunidad celular. Para las vacunas en las que se desean epítopos inmunitarios, un ECR es directamente útil como vacuna. Esto se debe a que los proteosomas inmunitarios de las pAPCs pueden procesar correctamente el grupo, liberando uno o más de los péptidos de unión al MHC contenidos en él, de la misma forma que una célula que tiene proteosomas inmunitarios procesa y presenta los péptidos derivados del TAA completo. El grupo es también un material de partida útil para la identificación de epítopos constitutivos producidos por los proteosomas constitutivos activos en las células periféricas.

Consideraciones Adicionales para el Diseño de Vacunas

Existen numerosos alelos del MHC I en la población humana. Así, en una realización preferida, el diseño de vacunas puede tener en cuenta el genotipo del MHC I del paciente, para administrar epítopos que tengan afinidades de unión adecuadas para el/los alelo(s) del MHC particular(es) del paciente. Debido a que un paciente puede ser homocigoto o heterocigoto para el locus relevante, en ciertas realizaciones de la descripción se prefieren los epítopos óptimos para un único alelo del MHC I, mientras en otras realizaciones se pueden preferir los epítopos que corresponden a los diferentes alelos del MHC. En la Tabla 6 se proporciona una lista parcial de los tipos del MHC de clase I principales, cada uno codificado en general por múltiples alelos, y sus frecuencias aproximadas.

TABLA 6

8

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Aún en otra realización de la presente invención, se proporciona a las pAPCs un epítopo constitutivo y un grupo de epítopos. El grupo de epítopos es una secuencia peptídica o de ácido nucleico que contiene o que codifica al menos dos secuencias que tienen una afinidad conocida o predicha por el MHC I. Aunque es preferible que el epítopo constitutivo se proporcione a las pAPCs en un estado que esté completamente procesado o en forma de un precursor que está modificado de forma tal que se puede procesar en las pAPCs para ser un epítopo constitutivo eficaz, el epítopo inmunitario puede ser procesado a partir de un precursor más grande por las pAPCs. Esto se debe a que el proteosoma inmunitario es constitutivamente activo en las pAPCs, y es completamente competente para procesar un precursor apropiado presumiblemente de cualquier longitud hasta un epítopo inmunitario "correcto".

Los epítopos potenciales se hallan habitualmente, pero no siempre, en grupos en segmentos distintos de un TAA que contiene múltiples epítopos para proporcionar un epítopo inmunitario. Simplemente proporcionando a la pAPC un polipéptido que contiene un grupo de epítopos potenciales, o un ácido nucleico que codifica un grupo, o un organismo recombinante que expresa el grupo, se posibilita que la pAPC produzca al menos un epítopo inmunitario apropiado. Debido a que los grupos de epítopos contienen en general epítopos potenciales para más de un alelo del MHC de clase I, en muchas realizaciones se puede usar un único grupo para producir epítopos inmunitarios útiles con más de un alelo del MHC de clase I.

En una realización preferida, se inocula a un paciente una vacuna que incluye epítopos constitutivos derivados de un TAA seleccionado. El epítopo constitutivo puede ser un polipéptido o un ácido nucleico que codifica un polipéptido, o un organismo recombinante modificado para expresar el epítopo específico. Aparte de esta vacuna "mínima" que contiene un epítopo constitutivo (ya sea un polipéptido, un ácido nucleico, o un organismo recombinante), las realizaciones incluyen vacunas que tienen además uno o más epítopos constitutivos, o uno o más epítopos inmunitarios, o cualquier combinación de los mismos. Tales epítopos pueden proceder del mismo TAA, o pueden proceder de TAAs diferentes.

Una realización preferida de la presente invención incluye un método de administración de una vacuna que incluye un epítopo constitutivo para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica. La vacuna se administra a un paciente de una manera coherente con los protocolos de administración de vacunas habituales que se conocen bien en la técnica. Los métodos de administración de epítopos de TAAs incluyen, sin limitación, la administración transdérmica, intranodular, perinodular, oral, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal y mucosa. Un método especialmente útil para la administración de vacunas para provocar una respuesta de CTLs se describe en la publicación PCT nº WO 99/02183 titulada "A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE", presentada el 10 de julio de 1998.

Debido a que el sistema de sincronización de epítopos tiene utilidad en la inducción de una respuesta inmunitaria mediada por células, se incluye de forma similar una vacuna para inducir una respuesta de células T específicas hacia una célula diana en una realización preferida de la presente invención. La vacuna contiene un epítopo constitutivo en una concentración eficaz para provocar que una pAPC o que poblaciones de pAPCs expongan epítopos constitutivos. De forma ventajosa, la vacuna puede incluir una diversidad de epítopos constitutivos o uno o más epítopos constitutivos opcionalmente en combinación con uno o más epítopos inmunitarios. Las formulaciones de las vacunas contienen péptidos y/o ácidos nucleicos en una concentración suficiente para provocar que las pAPCs presenten los epítopos. Las formulaciones contienen preferiblemente epítopos en una concentración total de alrededor de 1 \mug-1 mg/100 \mul de preparación de vacuna. Se pueden usar dosis y dosificaciones convencionales para las vacunas peptídicas y/o las vacunas de ácidos nucleicos en la presente invención, y tales regímenes de dosificación se entienden bien en la técnica. En una realización, una única dosis para un humano adulto puede ser de forma ventajosa de alrededor de 1 a alrededor de 5000 \mul de tal composición, administrados una vez o varias veces, p.ej., en 2, 3, 4 o más dosis separadas por 1 semana, 2 semanas, 1 mes, o más. En una realización especialmente preferida, tal composición se administra de forma continua, directamente a un nódulo linfático, por medio del uso de una bomba de insulina, a una velocidad de al menos 1 \mul por hora a lo largo de varios días. Tal administración se puede repetir de forma periódica para mantener la respuesta de CTL tal como se describe de forma más completa en la publicación PCT nº WO 99/02183.

Las composiciones y los métodos de la invención descritos en la presente memoria contemplan además la incorporación de adyuvantes en las formulaciones para mejorar la eficacia de las vacunas. De forma específica, la adición de adyuvantes a las formulaciones se diseña para mejorar el transporte o la absorción de los epítopos por las pAPCs. Los expertos en la técnica conocen los adyuvantes contemplados por la presente invención e incluyen, por ejemplo, GMCSF, GCSF, IL-2, IL-12, BCG, toxoide tetánico y osteopontina/ETA-1.

En una realización adicional, se pueden administrar células T reactivas hacia los epítopos constitutivos a un paciente como una inmunoterapia adoptiva. Tales células T se pueden obtener muy fácilmente mediante inmunización in vitro, mediante el uso de células de un donante sin exposición previa, aunque también puede ser factible usar al paciente como donante. Las técnicas para la inmunización in vitro se conocen en este campo, por ejemplo, Stauss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7871-7875, 1992; Salgaller et al. Cancer Res. 55:4972-4979, 1995; Tsai et al., J. Immunol. 158:1796-1802, 1997; y Chung et al., J. Immunother. 22:279-287, 1999. También se contempla el uso de donantes inmunizados, o de los propios pacientes, como fuentes iniciales de células T (véase, por ejemplo Oelke, M. et al. Clin Cancer Res. 6:1997-2005, 2000; Gervois, N. et al. Clin Cancer Res. 6:1459-1467, 2000; Valmori, D. et al. Cancer Res. 59:2167-3173, 1999; Tsai, V. et al. Crit. Rev. Immunol. 18:65-75, 1998; Matsunaga, K. et al. Jpn. J. Cancer Res. 90:1007-1015, 1999; van Elsas, A. et al. Eur J. Immunol. 26:1683-1689, 1996; y Alters, S.E. et al. Adv. Exp. Med. Biol. 417:519-524, 1997). Una vez generadas, se puede obtener un número suficiente de tales células T mediante expansión in vitro por medio de la estimulación con las vacunas de esta invención y/o citocinas (véase, por ejemplo, Kurokawa, T. et al., Int. J. Cancer 91:749-746, 2001). Estas células T pueden constituir un clon o una población policlonal que reconoce uno o más epítopos. En general, se transfieren del orden de 10^{5} a 10^{8} células a ratones y 10^{8} a 10^{11} a humanos (véase, por ejemplo, Drobyski, W.R. et al. Blood 97:2506-2513, 2001; Seeley B.M. et al. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124:436-441, 2001; Kanwar, J.R. et al. Cancer Res. 61:1948-1956, 2001; Plautz, G.E. et al. Clin. Cancer Res. 6:2209-2218, 2000; Plautz, G.E. et al., J. Neurosurg. 89:42-51, 1998; y Plautz, G.E. et al., Urology 54:617-623, 1999). Los clones y poblaciones más enriquecidas de otra forma requieren en general la transferencia de menos células. Los epítopos reconocidos pueden ser epítopos constitutivos o una combinación de epítopos constitutivos e inmunitarios. También se prevé que se pueda usar la ingeniería genética para expresar TCRs clonados en una línea celular adecuada para el uso en la inmunoterapia adoptiva. Los ejemplos de fuentes a partir de las cuales se pueden clonar TCRs útiles incluyen las células T descritas anteriormente, y los ratones transgénicos para HLA inmunizados con las vacunas de esta invención. Las variaciones adicionales serán evidentes para un experto en la técnica.

En ciertas realizaciones, las vacunas pueden incluir un organismo recombinante, tal como un virus, bacteria o parásito, modificado mediante ingeniería genética para que exprese un epítopo en un hospedador. Por ejemplo, Listeria monocytogenes, una bacteria intracelular facultativa grampositiva, es un excelente vector para seleccionar como diana TuAAs para el sistema inmunitario. En una realización preferida, este vector se puede modificar para que exprese un epítopo constitutivo para inducir respuestas terapéuticas. La vía normal de infección de este organismo es a través del intestino, y se puede administrar de forma oral. En otra realización, se puede usar un vector de adenovirus (Ad) que codifica un epítopo constitutivo para un TuAA para inducir respuestas antivirales o antitumorales. Se pueden transducir células dendríticas derivadas de médula ósea con la construcción del virus y después inyectarlas, o el virus se puede administrar directamente por medio de inyección subcutánea a un animal para inducir respuestas de células T potentes. Otra realización emplea un virus vaccinia recombinante modificado para codificar las secuencias de aminoácidos que corresponden a un epítopo constitutivo para un TAA. Los virus vaccinia que portan construcciones con las sustituciones de nucleótidos apropiadas en forma de una construcción de minigen pueden dirigir la expresión de un epítopo constitutivo, lo que conduce a una respuesta terapéutica de células T contra el epítopo.

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En la presente memoria se describen construcciones de ácidos nucleicos especialmente útiles como vacunas de acuerdo con la presente invención.

Construcciones de Vectores que Codifican Epítopos

La presente descripción proporciona construcciones de ácidos nucleicos para el uso como vacunas terapéuticas. Las construcciones incluyen una región codificante que tiene una secuencia que codifica un polipéptido. El polipéptido es un epítopo de un TAA. En una realización, la célula diana es una célula neoplásica y el polipéptido es un epítopo o precursor de un epítopo de un TuAA. En otra realización, la célula diana es cualquier célula infectada con un parásito intracelular. El término "parásito", tal como se usa en la presente memoria, incluye cualquier organismo o agente infeccioso, tal como un virus, que tiene una etapa de infección intracelular dentro del hospedador. Estos incluyen, pero sin limitación: virus tales como adenovirus, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus herpes simple 1, virus herpes simple 2, herpesvirus 6 humano, virus varicela-zóster, virus de hepatitis B, virus de hepatitis D, virus de papiloma, parvovirus B19, poliomavirus BK, poliomavirus JC, virus de hepatitis C, virus de sarampión, virus de rubeola, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de leucemia de células T humanas de tipo I, y virus de leucemia de células T humanas de tipo II; bacterias tales como Chlamydia, Listeria, Salmonella, Legionella, Brucella, Coxiella, Rickettsia, Mycobacterium; y protozoos tales como Leishmania, Trypanasoma, Toxoplasma, y Plasmodium.

El/los polipéptido(s) codificado(s) por la construcción de ácido nucleico puede incluir un epítopo constitutivo de un TAA. En las realizaciones preferidas, la construcción de ácido nucleico codifica una diversidad de epítopos constitutivos. Cuando la construcción codifica tal diversidad, los múltiples epítopos pueden corresponder todos a segmentos diferentes de un único TAA, o pueden corresponder a diferentes TAAs. En una realización preferida, la construcción de ácido nucleico contiene un epítopo constitutivo y un epítopo inmunitario. En otra realización preferida, la construcción de ácido nucleico contiene un epítopo constitutivo y una región de grupos de epítopos.

En las realizaciones preferidas, en las que la construcción de la vacuna codifica tanto un epítopo constitutivo como un epítopo inmunitario, la vacuna puede estimular una respuesta inmunitaria celular contra las células diana que presentan cualquier epítopo, es decir, la respuesta inmunitaria puede reconocer los epítopos constitutivos expuestos inicialmente por las células diana, y después puede reconocer también los epítopos inmunitarios presentados por las células diana tras la inducción mediante IFN.

De forma ventajosa, la construcción de ácido nucleico puede incluir además una tercera o cuarta secuencia, o más, y tales secuencias codifican un tercer o cuarto epítopo, o epítopos adicionales, respectivamente. Tales epítopos pueden proceder de un único TAA o de dos o más TAAs diferentes, y pueden ser epítopos constitutivos o inmunitarios en cualquier combinación. Las construcciones se pueden diseñar para que codifiquen epítopos que correspondan a cualquier otra actividad proteosómica que pueda desempeñar un papel en el procesamiento de antígenos en cualquier célula diana o pAPC.

Los epítopos del MHC codificados tienen preferiblemente una longitud de alrededor de 7-15 aminoácidos, y más preferiblemente una longitud de 9 ó 10 aminoácidos. Aunque el tamaño peptídico preferido generalmente para la unión al MHC I es de 9 aminoácidos, los péptidos más cortos o más largos se pueden unir también en algunos casos al MHC I. De forma similar, muchos péptidos mucho más largos de 9 aminoácidos se pueden recortar mediante exopeptidasas u otras proteasas que residen en la célula para producir fragmentos que se unen al MHC I de forma muy eficaz. El tamaño del péptido que contiene una secuencia de epítopo inmunitario no es crítico, con tal de que la secuencia incluya el epítopo. Esto se debe a que el proteosoma inmunitario, residente en la pAPC, en combinación con exopeptidasas de recorte y otras proteasas, en su función normal procesa correctamente TAAs de tamaño completo para producir epítopos inmunitarios. Así, la secuencia de ácido nucleico que codifica el epítopo inmunitario puede codificar realmente un precursor mucho más largo, que incluye el TAA completo. Tal construcción preferiblemente codifica además un epítopo constitutivo.

Los ejemplos de TuAAs y de otros TAAs adecuados para el uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación: antígenos de diferenciación tales como MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, y antígenos multilinaje específicos de tumores tales como MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, RAGE, NY-ESO, SCP-1, Hom/Mel-40 y PRAME. De forma similar, los TuAAs incluyen oncogenes sobreexpresados, y genes supresores de tumores mutados tales como p53, H-Ras y HER-2/neu. Además, se incluyen los TuAAs únicos que resultan de translocaciones cromosómicas tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR y antígenos virales tales como los antígenos del virus de Epstein-Barr EBNA, y los antígenos E6 y E7 de virus de papiloma humano (HPV). Otros antígenos proteicos útiles incluyen, pero sin limitación, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, \beta-Catenina, CDK4, Mum-1, y p16. Estos y otros TuAAs y antígenos relacionados con patógenos son conocidos y están disponibles para los expertos en la técnica en la bibliografía o comercialmente.

En una realización adicional, el TAA es un antígeno específico para un virus. Véase la Tabla 2 anterior. Aún en otra realización, el TAA es un antígeno específico para un parásito intracelular que no es viral. Los ejemplos de antígenos específicos de parásitos incluyen los nucleótidos, las proteínas, u otros productos génicos asociados al parásito intracelular. Los nucleótidos o las proteínas adecuadas se pueden hallar en la base de datos taxonómica del NCBI en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html/. Se proporcionan descripciones más detalladas de productos génicos para parásitos y otros patógenos en esta página de Internet.

Los péptidos especialmente preferidos tienen una longitud de alrededor de 7-15 aminoácidos. Se proporciona un listado exhaustivo de péptidos que tienen motivos de unión al MHC en Han-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, y Stefan Stevanovic, "MHC Ligands and Peptide Motifs", Springer-Verlag, Alemania, (1997) Landes Bioscience, Austin, Texas.

Los epítopos codificados por las construcciones tienen afinidad hacia uno o más alelos del MHC I. En ciertas realizaciones, en las que un paciente es heterocigoto para el MHC I, la construcción puede codificar epítopos que corresponden a los diferentes alelos del MHC I.

Las construcciones de ácidos nucleicos preferidas incluyen al menos una secuencia promotora que está unida de forma operable al extremo 5' de la región codificante de la construcción. Los expertos en la técnica apreciarán que se puede emplear cualquier promotor activo en las células mamíferas. Las secuencias promotoras preferidas incluyen, pero sin limitación, el promotor de CMV, el promotor de SV40, y las secuencias promotoras de LTR retrovirales, y también pueden incluir los promotores de EF-1A, UbC, \beta-actina. En ciertas realizaciones, las construcciones pueden incluir dos o más promotores que están unidos de forma operable al extremo 5' de diferentes secuencias que codifican polipéptidos. De forma similar, las construcciones pueden emplear potenciadores, secuencias de importación nuclear, secuencias inmunoestimuladoras, y casetes de expresión para citocinas, marcadores de selección, moléculas indicadoras, y similares. Además, se pueden unir secuencias inmunoestimuladoras u otras secuencias moduladoras al vector por medio de un ácido peptidonucleico PNA hibridado de forma estable. En las realizaciones preferidas, las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen también una secuencia de poli A que está unida de forma operable a un extremo 3' de la región codificante. Se representa una construcción de ácido nucleico que incluye una secuencia de importación nuclear y una secuencia inmunoestimuladora en la Figura 9.

En ciertas realizaciones, las construcciones de ácidos nucleicos codifican un mARN que se traduce en forma de un único polipéptido y después se escinde. En una realización, el polipéptido consiste en una serie lineal de epítopos, en la que la primera secuencia (N-terminal) es uno o más epítopos inmunitarios o grupos de epítopos, y la segunda secuencia (C-terminal) es un epítopo constitutivo, de forma que el extremo C-terminal correcto del epítopo constitutivo está especificado por el codón de terminación, y todos los demás extremos de los epítopos del HLA están determinados por el procesamiento proteosómico y el recorte por exopeptidasas.

En otra realización preferida, la construcción de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos en la que un epítopo inmunitario o un grupo de epítopos están unidos a una secuencia de ubiquitina. La secuencia de ubiquitina está unida de forma similar a un epítopo constitutivo. La presencia de ubiquitina entre los epítopos facilita el transporte eficaz del epítopo inmunitario al proteosoma para el procesamiento del epítopo. La secuencia de ubiquitina (con o sin un espaciador N-terminal para asegurar la integridad del péptido precedente) está localizada en el marco de lectura entre la primera y la segunda secuencia, o entre cualquier otra secuencia que codifique epítopos. El polipéptido Secuencia1-Ubiquitina-Secuencia2 así producido es escindido rápidamente (de forma co-traduccional) en la unión Ubiquitina-Secuencia2 por proteasas de procesamiento específicas de ubiquitina, que producen Secuencia1-Ubiquitina y Secuencia2 (véase la Figura 10).

Fisiológicamente, la ubiquitina sirve principalmente como una señal que marca como diana a la proteína para la degradación por el proteosoma. Está entre las proteínas más conservadas en los eucariotas, con solamente tres sustituciones conservativas de aminoácidos entre las levaduras y el ser humano. Aunque la secuencia exacta de la ubiquitina puede variar algo, la secuencia de la realización preferida está representada por ID SEQ NO: 5. La ubiquitina es un polipéptido con una longitud de 76 aminoácidos que tiene dos características cruciales: 1) un residuo de Gly C-terminal, implicado en la conjugación de la ubiquitina a la cadena lateral de Lys de los sustratos proteicos, y 2) un residuo de Lys, en la posición 48, para la formación de cadenas de multi-ubiquitina.

Los genes de ubiquitina son únicos, en el sentido de que todos ellos se sintetizan como fusiones a otros polipéptidos, lo que incluye otras ubiquitinas. En la levadura S. cerevisiae, se han identificado cuatro genes de ubiquitina: mientras las tres primeras (UBI1-3) se fusionan a proteínas ribosómicas, el cuarto gen (UBI4) se sintetiza en forma de una fusión de cinco repeticiones idénticas de la secuencia de ubiquitina. Así, la ubiquitina libre funcional se produce de forma natural tras el procesamiento proteolítico co-traduccional mediante hidrolasas específicas de ubiquitina expresadas de forma ubicua. Tal organización natural se ha aprovechado generando fusiones C-terminales entre un único resto de ubiquitina y cualquier polipéptido deseado.

La ubiquitina puede existir en dos conformaciones: la primera se ha descrito anteriormente y consiste en una fusión lineal de una única ubiquitina a cualquier polipéptido deseado, en la que la Gly C-terminal de la ubiquitina está unida, por medio de un enlace peptídico, al aminoácido N-terminal del polipéptido de elección. La segunda implica la conjugación de un resto de ubiquitina a un sustrato proteico, por medio de la formación de un enlace Gly-Lys. En este caso, el grupo COOH de la Gly de la ubiquitina está unido a la cadena lateral \varepsilon (épsilon) de una Lys del sustrato expuesta al disolvente (u otro resto de ubiquitina). La señal de ubiquitina para la degradación del sustrato está asociada a la segunda conformación. Así, en la construcción Secuencia1-Ubiquitina-Secuencia2 descrita anteriormente, la Secuencia2 en general no se dirige al proteosoma. Por lo tanto, la posición de la Secuencia2 se usa preferiblemente para un epítopo completamente procesado, o uno que necesita solamente un recorte N-terminal, en general un epítopo constitutivo. El resto de ubiquitina que permanece unido a la Secuencia1 en la construcción descrita anteriormente se puede poliubiquitinar en la Lys48, por lo que se dirige ese fragmento al proteosoma para el procesamiento, y se da como resultado la liberación del epítopo contenido en la Secuencia1. Se debería indicar que si más de dos secuencias están unidas entre sí en una serie lineal por restos de ubiquitina, en general solamente la última secuencia se comporta como la secuencia 2; el procesamiento de todas las secuencias en dirección N-terminal se parece al de la secuencia 1. En la medida en que las construcciones descritas en la presente memoria se expresan en las pAPCs, en las que el proteosoma inmunitario es predominantemente activo, la expresión correcta de los epítopos constitutivos mediante estas construcciones se beneficia de que los epítopos constitutivos estén en la posición de la secuencia 2, o en una posición correspondiente en la que el epítopo no necesita el procesamiento proteosómico en la pAPC.

Aún en otra realización, las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención pueden incluir secuencias que codifican péptidos autoproteolíticos. Tales secuencias están localizadas entre la primera y la segunda secuencia, o entre cualquier otra secuencia que codifique epítopos. Los ejemplos de tales secuencias autoproteolíticas incluyen las inteinas; también están incluidas las proteasas 3C^{pro} y 2A^{pro} de los picornavirus, que incluyen los poliovirus y otros enterovirus, rinovirus, cardiovirus, y apthovirus, y las proteasas equivalentes de cornoviridae. Estas proteasas catalizan la escisión postraduccional de la poliproteína precursora grande producida por esta familia de
virus.

En una realización, la secuencia de la proteína autocatalítica se inserta entre dos o más epítopos. En una realización adicional, la secuencia se inserta tras dos o más epítopos, pero la señal de escisión se halla entre los epítopos, de forma que se escinden en dos o más epítopos completamente funcionales. El tipo de proteasa no es importante, solamente es importante que la señal de escisión apropiada esté disponible para el procesamiento correcto de los
epítopos.

Debido a que se conocen los sitios de escisión y las secuencias de las proteínas autocatalíticas (recientemente resumidas por Seipelt, J. et al., Virus Research 62:159-168, 1999), se pueden usar fácilmente para la construcción de un vector que produce una poliproteína o biproteína. Brevemente, 3C^{pro} reconoce de forma predominante un sitio Q-G como señal de escisión, aunque pueden ser importantes otras posiciones muy adyacentes. Además, la 3C^{pro} de algunos de estos virus se adhiere menos estrechamente a este patrón general, lo que proporciona un grado mayor de flexibilidad en el diseño. La limitación impuesta por estos requerimientos es más formal que real, en particular si la proteasa se coloca entre los epítopos a expresar. En esta disposición, se puede liberar un epítopo inmunitario en posición N-terminal mediante el procesamiento proteosómico incluso si la proteasa viral no consigue escindir su extremo N-terminal. Los residuos clave para la escisión en el extremo C-terminal son internos para el propio 3C^{pro}, lo que en general deja solamente 1-4 residuos, si los hay, para que sean eliminados por el recorte mediante exopeptidasas del extremo N-terminal de un epítopo constitutivo en posición C-terminal. Se puede usar 2A^{pro} prácticamente la misma manera, con la comprensión de que el sitio de escisión, aunque favorece G-P, es algo más variable entre estos virus. También se debe considerar que su expresión puede conducir a una suspensión de la síntesis de proteínas en la célula hospedadora con una rapidez y extensión que depende de la cepa viral de la que
procede.

En sentido estricto, las proteínas 2A de los cardiovirus y apthovirus (es decir, virus de la glosopeda (FMDV)) no son proteasas, sino que en su lugar previenen la formación de enlaces peptídicos en sus extremos C-terminales sin provocar una terminación de la traducción (Ryan, M.D., et al., Bioorganic Chemistry 27:55-79, 1999). Así, mediante la colocación de estas proteínas 2A entre los epítopos, se puede provocar la escisión dentro de un único marco de lectura. La proteína 2A de FMDV es muy pequeña, solamente 18 aminoácidos, lo que la hace particularmente adecuada para la expresión de múltiples epítopos. Se representa un plásmido que emplea la proteína 2A en la Figura
12.

En otras realizaciones, las construcciones de ácidos nucleicos codifican un mARN que se traduce como dos o más polipéptidos. En una realización, el transcrito puede contener una o más secuencias de sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) que están localizadas entre la primera y la segunda secuencia o entre cualquier otra secuencia que codifique epítopos. Las secuencias IRES son usadas de forma natural por los picornavirus para dirigir la traducción interna independiente de caperuza del mARN. Tales secuencias IRES pueden permitir también la traducción independiente de dos o más marcos de lectura abiertos consecutivos a partir del mismo ARN mensajero. Aunque las secuencias IRES de las diversas construcciones pueden variar, la secuencia IRES de una realización preferida se proporciona en SEQ ID NO: 6. El extremo C-terminal de cada epítopo expresado se determina mediante los codones de terminación. Así, no importa el orden de las secuencias que codifican el epítopo constitutivo y las secuencias que codifican el epítopo inmunitario, lo que proporciona flexibilidad en la construcción del plásmido. Opcionalmente, la secuencia que codifica el epítopo constitutivo puede preceder a la secuencia IRES, y la secuencia que codifica el epítopo inmunitario puede estar unida al otro extremo de la secuencia IRES. Tales vectores pueden codificar también de forma útil dos o más epítopos constitutivos. Además, pueden permitir la combinación de las diversas construcciones de polipéptidos simples descritas anteriormente, para expresar de forma productiva múltiples epítopos. Véase la Figura
12.

En otras realizaciones, las construcciones de ácidos nucleicos codifican dos o más transcritos de mARN. Cada uno de estos transcritos puede codificar epítopos únicos o cualquiera de los transcritos de epítopos dobles o múltiples descritos en las realizaciones anteriores. Dos o más transcritos pueden ser el resultado del uso de múltiples promotores. Los expertos en la técnica reconocerán que el uso de más de una copia de un único promotor puede conducir a la inestabilidad del plásmido durante la propagación. Así, será preferible en general el uso de dos (o más) promotores diferentes.

Dos o más transcritos pueden ser también el resultado del uso de promotores bidireccionales. Los promotores bidireccionales se pueden hallar en una amplia diversidad de organismos. Los ejemplos de tales promotores incluyen PDGF-A de ser humano, pcbAB y pcbC de Penicillium chrysogenum, virus JC neurotrópico, y BRCA1 de ratón, perro y ser humano. Aunque la investigación intensiva sobre los promotores bidireccionales comparativamente comenzó recientemente, existe un conjunto de información creciente sobre la secuencia, la regulación, y otros entresijos de cómo funcionan. Por ejemplo, el promotor de la transcobalamina II humana requiere un fragmento de 69 pares de bases (pb) que contiene una caja GC y una caja E para la actividad transcripcional completa. Se demostró que el promotor de la dipeptidilpeptidasa IV estimula la transcripción desde ambos lados con una eficacia similar. Las chaperoninas 60 y 10 mitocondriales de rata están unidas cabeza a cabeza y comparten un promotor bidireccional. Por lo tanto, se han identificado, secuenciado y clonado varios promotores bidireccionales que funcionan, de tal forma que se pueden usar en una construcción de ácido nucleico para expresar dos genes.

Así, en una realización preferida, las construcciones de ácidos nucleicos contienen promotores bidireccionales tales como, por ejemplo, los enumerados anteriormente, unidos a una secuencia de ácido nucleico que codifica un epítopo constitutivo o un precursor del mismo. En una realización especialmente preferida, la construcción de ácido nucleico contiene promotores bidireccionales unidos a secuencias de ácido nucleico que codifican una diversidad de epítopos constitutivos. En otra realización, las construcciones de ácidos nucleicos comprenden promotores bidireccionales unidos a secuencias de ácidos nucleicos que codifican un epítopo constitutivo y un epítopo inmunitario, o a una región de grupos de epítopos. Además, el promotor bidireccional se puede regular de forma positiva o
negativa.

Cuando la construcción de ácido nucleico contiene más de un epítopo, el promotor bidireccional puede expresar la diversidad de epítopos en cantidades comparables, o algunos se pueden expresar a niveles más elevados que los otros. De forma alternativa, un epítopo puede ser inducible y el otro constitutivo. De esta manera, se puede conseguir una regulación temporal de la expresión de epítopos, en la que un epítopo se expresa de forma temprana en el tratamiento y el otro se expresa más tarde.

Análisis de la Expresión de Epítopos

Se pueden usar varios métodos descritos en la bibliografía para determinar si los epítopos se han presentado en las pAPCs. Un método indirecto pero potente es el uso del análisis de tetrámeros de clase I para determinar la frecuencia de las células T en un animal antes y después de la administración de un epítopo constitutivo. La expansión clonal de las células T en respuesta a un epítopo se da de forma preferente solamente cuando el epítopo es presentado a las células T por las pAPCs. Por lo tanto, la medida de la frecuencia de células T específicas contra el epítopo constitutivo antes y después de la administración del epítopo a un animal es un medio para determinar si el epítopo está presente en las pAPCs. Un incremento en la frecuencia de las células T específicas para el epítopo tras la administración indica que el epítopo se presentó en las pAPCs. Se pueden usar otros métodos para determinar la frecuencia de las células T tales como el análisis de la dilución limitante o ELISPOT principalmente de la misma forma para determinar la presentación de los epítopos constitutivos por las pAPCs. De forma similar, se puede usar cualquier método para determinar la frecuencia de las células T en un animal.

Un método directo para la determinación de la presentación de epítopos constitutivos en las pAPCs implica la purificación de las pAPCs a partir de un animal tras la administración de un epítopo. Tras la vacunación de un animal con un epítopo constitutivo, se pueden recoger las pAPCs de PBMC, esplenocitos o células de nódulos linfáticos, mediante el uso de anticuerpos monoclonales contra marcadores específicos presentes en las pAPCs, y purificación por afinidad, tal como con el uso de anticuerpos monoclonales fijados a microesferas magnéticas. El tiempo óptimo para tal recogida es variable, y puede depender del animal vacunado, la naturaleza de la vacuna, y otros factores que incluyen la dosificación, el sitio de administración, la farmacocinética, y similares. La preparación de sangre en bruto o esplenocitos se puede enriquecer en pAPCs mediante el uso de esta técnica. Las pAPCs enriquecidas se pueden usar después en un ensayo de proliferación contra un clon de células T que se ha generado y que es específico del epítopo constitutivo de interés. Las pAPCs se co-incuban con el clon de células T, y las células T se monitorizan en función de la actividad proliferativa, tal como midiendo la incorporación de timidina radiomarcada por parte de las células T. La proliferación indica que las células T específicas del epítopo constitutivo están siendo estimuladas por ese epítopo en las pAPCs.

Los siguientes ejemplos pretenden tener fines ilustrativos solamente, y no se deberían considerar limitantes del alcance de la invención de ninguna manera.

Ejemplos Ejemplo 1 Caracterización proteolítica de un epítopo del HLA como un epítopo constitutivo o un epítopo inmunitario

Mediante el uso de los procedimientos descritos más adelante, se prepara un péptido sintético de 13 aminoácidos o más, que contiene el epítopo del HLA candidato en posición central. Se preparan proteosomas a partir de células que expresan cada tipo de proteosoma, por ejemplo eritrocitos y células Raji para los proteosomas constitutivos e inmunitarios, respectivamente. El péptido se digiere con las preparaciones de proteosomas y los fragmentos resultantes se identifican mediante espectrometría de masas. Si uno de esos fragmentos es co-C-terminal con el epítopo del HLA, y se produce con un rendimiento significativo en la preparación que contiene un proteosoma constitutivo, entonces el epítopo del HLA es un epítopo constitutivo. De forma similar, si uno de esos fragmentos es co-C-terminal con el epítopo del HLA y es producido con un rendimiento significativo por el proteosoma inmunitario, y no es producido con un rendimiento significativo por el proteosoma constitutivo, entonces el epítopo del HLA es un epítopo
inmunitario.

A. Síntesis Peptídica

Se construyen polipéptidos sintéticos o recombinantes que abarcan el epítopo del HLA y al menos dos residuos proximales a sus extremos. Estos residuos añadidos a los extremos de un epítopo del HLA particular son para asegurar que el complejo del proteosoma encuentre un medio de procesamiento similar al hallado dentro de la célula, por lo que se incrementa la probabilidad de que lleve a cabo su función proteolítica normalmente. Se pueden añadir residuos adicionales que se hallan normalmente en posiciones proximales a los extremos del epítopo del HLA si es necesario para ayudar a incrementar la solubilidad de los péptidos.

Algunos epítopos del HLA presentan dificultades en cuanto a la solubilidad debidas a su elevada hidrofobicidad. Ciertos péptidos pueden ser extremadamente difíciles de purificar debido a que no se disuelven en eluyentes cromatográficos normales, o pueden ser muy difíciles de usar una vez que se han purificado debido a que no se disolverán en los tampones de digestión. Este problema se puede evitar eligiendo cuidadosamente qué parte de la secuencia que rodea al epítopo del HLA incluir en una construcción peptídica particular, o extendiendo la secuencia tal como se mencionó en el párrafo precedente. Si no hay residuos próximos a los extremos del epítopo del HLA que puedan ayudar a incrementar la solubilidad, se puede añadir una secuencia hidrófila corta en su lugar (p.ej., -EAEAE). Esto se añade al menos tres a cinco residuos más allá del extremo del epítopo del HLA para mantener un sitio de escisión terminal natural para el proteosoma.

En una realización preferida, los péptidos se sintetizan en un sintetizador de péptidos 433A de Applied Biosystems mediante el uso de metodologías de síntesis en fase sólida Fmoc estándar. El sintetizador está equipado con un sistema de monitorización por retroalimentación de conductividad que permite tiempos de reacción incrementados para secuencias que contienen tramos de residuos que son difíciles de desproteger y/o difíciles de acoplar. Tras la síntesis, los péptidos se escinden de su soporte con ácido trifluoroacético en presencia de agentes protectores apropiados, se precipitan con éter, y después se liofilizan.

Los péptidos en bruto se purifican después en una columna de HPLC de difenilo preparativa después de desarrollar primero un gradiente mediante el uso de un sistema de HPLC de difenilo analítico similar. Las fracciones principales de HPLC de la primera inyección preparativa del péptido se analizan mediante espectrometría de masas con electropulverización para identificar el compuesto diana. Los picos correspondientes de las inyecciones posteriores se recogen, se mezclan y se liofilizan, y se toma una muestra para verificar el tiempo de retención y la pureza cromatográfica mediante HPLC analítica. Estos péptidos purificados están listos entonces para la digestión mediante la preparación de proteosomas.

B. Ensayo de Proteosomas

Se aíslan complejos de proteosomas inmunitarios o constitutivos tal como se describe con detalle en el Ejemplo 2 más adelante.

Los péptidos purificados se disuelven después en un tampón apropiado hasta una concentración de alrededor de 1 mM y se añaden a aproximadamente 2 volúmenes de las preparaciones de proteosomas. Se preparan digestiones replicadas: una para el análisis mediante espectrometría de masas y una para el análisis mediante HPLC, y se prepara una digestión adicional mediante el uso de un péptido de control positivo para verificar el funcionamiento apropiado de la preparación de proteosomas utilizada. Los siguientes péptidos son adecuados para el uso como péptidos de control para los ensayos de proteosomas inmunitarios: MLLAVLYCLLWSFQTS (SEQ ID NO: 7); HSYTTAEEAAGITILT
VILGVL (SEQ ID NO: 8); EAASSSSTLVEVTLGEVAAESPD (SEQ ID NO: 9); EFLWGPRALVETSYVKVLHHM
VI (SEQ ID NO: 10); APEEKIWEELSVLEVFEGR (SEQ ID NO: 11); y ELMEVDPIGHLYIFAT (SEQ ID NO: 12). Los residuos subrayados indican los sitios de escisión proteolítica. El péptido FLWGPRALVETSYVK (SEQ ID NO: 13) es adecuado como péptido de control para los ensayos de proteosomas constitutivos. Estos se dejan incubar en paralelo a 37ºC durante un período de tiempo, y después se detiene la digestión mediante la adición de ácido trifluoroacético diluido, y las muestras se congelan en hielo seco. Se analiza un replicado y un control positivo mediante el uso de espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo en un Lasermat 2000 (Finnigan Mat, LTD, R.U.), y los otros se reservan para la HPLC.

C. Análisis Mediante Espectrometría de Masas MALDI-TOF de la Digestión

El análisis de las digestiones se lleva a cabo empleando el paquete informático "Peptide" (Lighthouse Data), o el paquete informático disponible de ThermoBioanaIysis Ltd., R.U. Este paquete informático puede generar la secuencia y el peso molecular de todos los fragmentos posibles que satisfacen los requerimientos de tener el extremo C-terminal correcto de cualquier epítopo predicho, y contener la longitud completa de ese epítopo, o más.

Por ejemplo, si el epítopo del HLA que abarca el péptido tiene la secuencia:

: AAMLLAVLYCLLSEIAAAEEE,

en la que la secuencia subrayada es el epítopo del HLA, entonces el programa identificaría que todas las secuencias siguientes son potencialmente útiles, y asignaría a cada una un peso molecular.

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 AAMLL AVLYCLLSEI \cr \cr  AMLL AVLYCLLSEI \cr \cr 
MLL AVLYCLLSEI \cr \cr  LL AVLYCLLSEI \cr \cr 
L AVLYCLLSEI \cr \cr 
 AVLYCLLSEI \cr}

Si los resultados de MALDI-TOF demuestran que uno o más de esos pesos moleculares está representado en una mezcla de digestión, entonces el péptido correspondiente se sintetiza, se purifica, se identifica mediante espectrometría de masas y después se somete a HPLC analítica para establecer tanto el tiempo de retención estándar como la proporción de masa aproximada respecto del área del pico. La digestión de reserva se diluye después en un disolvente apropiado y se inyecta mediante el uso del mismo método de HPLC analítica. Si la digestión proporciona un pico con buen rendimiento que tiene el mismo tiempo de retención que el del patrón, es casi seguro que se deba a la presencia de esa secuencia en la digestión. Si existe ambigüedad debida a la posible generación de otros fragmentos que proporcionarían los mismos o similares resultados en la espectrometría de masas, el componente sospechoso se puede recoger y reservar para una secuenciación C-terminal para confirmar la identidad.

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Ejemplo 2 Purificación de complejos de proteosomas A. Complejos de proteosomas de células sanguíneas

Se obtuvieron bolsas de eritrocitos concentrados de un banco de sangre local (HemaCare, Van Nuys, CA). El contenido de cada bolsa se vertió en tubos de centrífuga de 200 ml y se lavó 3 veces con PBS mediante centrifugación a 2000 RPM durante 10 minutos a temperatura ambiente en un rotor basculante en una Megafuge 2.0 (Heraeus, Southplainfield, NJ). Después del último lavado, las muestras se mezclaron en un recipiente para minimizar la variabilidad entre los tubos, y después se volvieron a dividir en varios tubos de centrífuga. Las células se centrifugaron de nuevo a 2000 RPM durante 10 min. Se aspiró el PBS residual. El sedimento se almacenó a -70ºC hasta su uso.

B. Complejos de proteosomas de células tumorales

Se obtuvieron células Raji, una línea celular de linfoma de Burkitt, de la ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA). Las células se cultivaron mediante el uso de métodos de cultivos celulares estándar y se estimularon con IFN-\gamma (100-500 U/ml) (Pharmingen, San Diego, CA). La expresión de subunidades de proteosomas inmunitarios se confirmó por separado mediante inmunohistoquímica en el cultivo, y SDS-PAGE con una muestra del lisado celular. Las células se recogieron mediante centrifugación, se lavaron con PBS y se almacenaron a -70ºC hasta su uso.

C. Procesamiento adicional de los complejos de proteosomas

Se descongelaron sedimentos de células sanguíneas o tumorales de linfoma (congeladas) en un baño a 37ºC y se añadió ddH_{2}O a cada tubo. La suspensión celular se homogeneizó en un homogeneizador Dounce de 40 ml. Además, para las células tumorales, el homogeneizado celular se centrifugó a 2000 rpm para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante se centrifugó a 10.000 rpm a 4ºC durante 10 minutos y después se centrifugó a 50.000 rpm a 4ºC durante 30 minutos en un rotor T-1270 (Sorval, Newtown, CT).

Los homogeneizados se pasaron a través de papel de filtro para eliminar los residuos, y después se mezclaron. Se añadió una disolución de sacarosa del 68% a la muestra de homogeneizados mezclados. Se incubó una preparación de anticuerpo-Sepharose con el homogeneizado durante tres horas a temperatura ambiente en un agitador rotatorio. La suspensión se centrifugó y se lavó 3X con TBS y después se lavó a fondo en un embudo de vacío 6-8 X. Los proteosomas se eluyeron en TBS (pH 7,6) y se midió la densidad óptica del eluato. La preparación de proteosomas se dializó durante la noche a 4ºC con Tris 20 mM (pH 7,6) mediante el uso de una membrana de celulosa MWCO 1000. Al siguiente día, la preparación de proteosomas se concentró mediante ultrafiltración en un dispositivo de centrifugación ULTRAFREE-15 de Millipore (Millipore, Danbury, CT). Los proteosomas, a una concentración de 4 mg/ml, se alicuotaron y se almacenaron a -20ºC hasta su uso. Se analizó la actividad y la especificidad de los proteosomas mediante la digestión de un sustrato fluorogénico o de un péptido de control que proporcionaba fragmentos conocidos. Los siguientes péptidos son adecuados para el uso como péptidos de control para los ensayos de proteosomas inmunitarios: MLLAVLYCLLWSFQTS (SEQ ID NO: 14); HSYTTAEEAAGITILTVILGVL (SEQ ID NO: 15); EAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPD (SEQ ID NO: 16); EFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKI (SEQ ID NO: 17); APEEKIWEELSVLEVFEGR (SEQ ID NO: 18); y ELMEVDPIGHLYIFAT (SEQ ID NO: 19). Los residuos subrayados indican los sitios de escisión proteolítica. El péptido FLWGPRALVETSYVK (SEQ ID NO: 20) es adecuado como péptido de control para los ensayos de proteosomas constitutivos.

D. Análisis de cuantificación y de actividad de las preparaciones de proteosomas

Se usó un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para cuantificar las preparaciones de proteosomas descritas anteriormente. Los métodos de ELISA se conocen bien en la técnica, y se discuten en general en Ausubel, et al., "Short Protocols in Molecular Biology", 3ª Ed., Unidad 11.2 (1997). Se obtuvieron células de hibridoma (MCP-21) que producían un anticuerpo monoclonal anti-proteosoma humano de la European Collection of Cell Culture ((ECACC), RU), y se mantuvieron mediante el uso de técnicas e instrumental de cultivos celulares estándar. Se añadió suplemento de hibridomas (Gibco BRL, Rockville, MD) a las células productoras de anticuerpos. Tras alcanzar una densidad celular de 500.000 células/ml en un volumen aproximado de 2-3 litros, las células se extrajeron mediante centrifugación y se recogió el sobrenadante. Se monitorizó la secreción de mAb en el medio periódicamente mediante densidad óptica (D.O.) mediante el uso de un espectrofotómetro Lambda 20 (Perkin Elmer, Norwalk, CT).

El sobrenadante se hizo pasar a través de una columna de Sepharose-proteína G (Amersham/Pharmacia Biotech Piscataway, NJ). La columna se lavó con PBS y el anticuerpo se eluyó en un tampón de glicocola 0,1 M, pH 2,2. Se midió la densidad óptica de las fracciones de eluato a 280 nm, y se recogieron las fracciones positivas. El anticuerpo se dializó con 2 L de PBS durante 2 días a 4ºC y se almacenó hasta su uso.

El anticuerpo se unió a Sepharose 4B activada con CNBr (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NY). El complejo anticuerpo-Sepharose se lavó alternativamente 5-7 veces con acetato sódico 0,1 M en solución salina, pH 4, y borato sódico 0,1 M en solución salina, pH 8, y finalmente se suspendió en solución salina tamponada con Tris (TBS), pH 8. La preparación se almacenó a 4ºC hasta su uso.

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Ejemplo 3 Generación de péptidos con Unión a la hendidura de péptidos MHC I predichos mediante el uso de modelización con algoritmos

Se produjo una población de péptidos candidatos con unión al MHC I, generados a partir de la secuencia de aminoácidos del precursor del antígeno carcinoembrionario humano (CEA) (número de acceso de GENBANK P06731) mediante el uso de un algoritmo. El algoritmo particular está disponible en <<http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.clll/
EpPredict.htm>>, tal como se discutió anteriormente. Una vez que se accedió al algoritmo, se proporcionó la secuencia de aminoácidos de CEA. A continuación, se seleccionaron los parámetros para la longitud del epítopo (decámeros) y se seleccionó el alelo del MHC particular (H2-Db) de interés. Tras esto, los datos se sometieron a análisis mediante el algoritmo. Los datos resultantes se muestran en la Tabla 7.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 7 Fragmentos de CEA que tienen una afinidad predicha por H2-Db

9

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La Tabla anterior elimina los valores por debajo de un punto de corte arbitrario de 15. El algoritmo puede producir puntuaciones menores de 15.

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Ejemplo 4 Digestión de precursores peptídicos mediante el uso de proteosomas inmunitarios y constitutivos para determinar los fragmentos producidos por la digestión proteolítica

Los péptidos se sintetizaron mediante un sintetizador 433A ABI. Los péptidos se produjeron en cantidades de 0,25 mmoles mediante el uso de la química Fastmoc. Se analizó la solubilidad de los péptidos, y una vez solubilizados se preparó una disolución 2 mM y se dividió en alícuotas de 25-30 \muL que se almacenaron a -20ºC para su uso futuro. Se llevaron a cabo reacciones de digestión cronometradas, que consistían en general en 2 \mul de péptido y 4 \mul de proteosoma, con t=0 como control y una incubación del péptido con agua en lugar del proteosoma como control adicional. La reacción se llevó a cabo a 37ºC y se finalizó mediante la adición de TFA al 10% (ácido trifluoroacético) sobre hielo seco. Las muestras congeladas se analizaron después mediante espectrometría de masas (MS) MALDI-TOF tal como se describe en el Ejemplo 5, más adelante.

Se puede llevar a cabo una etapa de desalación opcional en las digestiones antes del análisis de MS mediante el uso del método ZIP-TIP (Millipore, Boston, MA). El método ZIP-TIP es una punta de pipeta especialmente diseñada que contiene un lecho de resina de sílice esférica. La muestra se une a la punta, que está preequilibrada con TFA al 0,1%, y después se eluye con un tampón de acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1%.

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Ejemplo 5 Identificación y cuantificación de fragmentos proteolíticos relevantes mediante HPLC y espectrometría de masas A. Identificación de secuencias de interés terapéutico

La secuencia de aminoácidos de una proteína de interés se introduce en un ordenador, y se usa el algoritmo de Rammensee, et al., para generar secuencias con una longitud de 9 ó 10 aminoácidos que se predice que se unen a un receptor de HLA particular. El algoritmo también clasifica estos epítopos predichos según cómo coincidan con el motivo de unión.

Después se construyen péptidos sintéticos que contienen la secuencia de los epítopos potenciales identificados, para abarcar la secuencia del epítopo candidato y al menos 3-5 residuos proximales a sus extremos. Estos residuos añadidos en los extremos de un epítopo candidato particular son para asegurar que el complejo del proteosoma encuentra un medio de procesamiento similar al hallado dentro de la célula, por lo que se incrementa la probabilidad de que lleve a cabo normalmente su función proteolítica. Se pueden añadir residuos adicionales hallados normalmente en posiciones proximales en los extremos del epítopo candidato si es necesario para incrementar la solubilidad de los péptidos.

Los péptidos se sintetizan en un sintetizador de péptidos 433A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Norwalk, CT) mediante el uso de metodologías de síntesis en fase sólida Fmoc estándar. El sintetizador está equipado con un sistema de monitorización por retroalimentación de conductividad que permite tiempos de reacción incrementados para secuencias que contienen tramos de residuos que son difíciles de desproteger y difíciles de acoplar. Tras la síntesis, los péptidos se escinden de su soporte con ácido trifluoroacético en presencia de agentes protectores apropiados, se precipitan con éter, y después se liofilizan.

Los péptidos en bruto se disuelven después en un disolvente adecuado a 0,5 mg/ml. Después se analizan cinco microlitros (\mul) de esta disolución en un sistema de HPLC en fase inversa analítica de Shimadzu (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD) mediante el uso de un gradiente TFA al 0,1% en agua - acetonitrilo. En general, se usa una columna de sílice C-18 (Machery-Nagel nº 720051.40, (Machery-Nagel GmbH, Alemania)) para los péptidos hidrófilos, y una columna de sílice de fenilo (Vydac nº 219TP5415 (The Separations Group, Inc., Hesperia, CA)) para los péptidos hidrófobos. Los gradientes usados varían de un 0-40% de acetonitrilo para los péptidos hidrófilos a un 30-70% de acetonitrilo para los péptidos hidrófobos. Los péptidos se purifican posteriormente en un sistema de HPLC de Varian Prostar (Varian, Inc., Palo Alto, CA) mediante el uso de gradientes similares y versiones semi-preparativas de las columnas anteriormente mencionadas (Machery Nagel nº 715802, y Vydac 219TP510). Las fracciones de HPLC principales de la primera inyección preparativa del péptido se analizan mediante el uso de un espectrómetro de masas MALDI-TOF para identificar el componente deseado. Los picos correspondientes de las inyecciones subsiguientes se recogen, se mezclan y se liofilizan, y se toma una muestra para verificar el tiempo de retención y la pureza cromatográfica mediante HPLC analítica con el uso del sistema descrito anteriormente. Estos péptidos purificados están preparados entonces para la digestión mediante la preparación de proteosomas.

B. Ensayo de proteosomas

Se aíslan complejos de proteosomas inmunitarios o constitutivos mediante el método de Levy (Morel, S., et al., Immunity 12:107-117 (2000), y las referencias citadas en el mismo) descrito anteriormente. El péptido purificado se disuelve en un tampón apropiado hasta una concentración de alrededor de 1 a 2 mM y se añade a aproximadamente 2 volúmenes de la preparación de proteosomas. El tampón elegido debe solvatar el péptido sin interferir con el proceso de digestión. Se prepara una digestión adicional mediante el uso del péptido de control positivo descrito anteriormente para verificar el funcionamiento correcto de la preparación de proteosomas utilizada. Estas se incuban a 37ºC durante periodos de hasta 120 minutos, y después la digestión se detiene mediante la adición de ácido trifluoroacético diluido; las muestras se analizan inmediatamente mediante espectrometría de masas, o se congelan en hielo seco hasta el análisis. La reacción de digestión se puede detener también poniendo las muestras en hielo para el análisis inmediato mediante espectrometría de masas.

C. Análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF de la digestión

Se mezclaron aproximadamente 0,5 \mul de cada digestión con un volumen igual de la disolución de matriz (10 mg/ml de ácido dihidroxibenzoico en EtOH al 70%, pH 2-3) directamente sobre la placa de muestra y se dejó secar al aire a alrededor de 40ºC. Las muestras se analizaron después en un espectrómetro de masas MALDI-TOF Lasermat^{TM} (Thermo Bioanalysis, Santa Fe, NM) que se calibró con patrones de pesos moleculares adecuados.

Los programas informáticos (el paquete informático "Peptide", (Lighthouse Data), o "Dynamo" (ThermoBioanalysis Ltd., R.U.)) desarrollados para el ensayo de proteosomas generan la secuencia y el peso molecular de todos los fragmentos posibles que satisfacen los requerimientos de tener el extremo C-terminal correcto de cualquier epítopo predicho, y de contener la longitud completa de ese epítopo o más.

Cuando los resultados de MALDI-TOF demostraron que un peso molecular particular estaba representado en una mezcla de digestión, se sintetizó el péptido correspondiente, se purificó, se identificó mediante MALDI-TOF y después se sometió a HPLC analítica en fase inversa para establecer un tiempo de retención estándar y una proporción aproximada de masa respecto del área del pico. Estos procedimientos son directamente análogos a los descritos anteriormente. Después se diluyó una digestión de proteosomas replicada en un disolvente apropiado y se analizó mediante el uso del mismo método de HPLC analítica. Cuando la digestión proporciona un pico con buen rendimiento que tiene el mismo tiempo de retención que el del patrón, es casi seguro que se deba a la presencia de esa secuencia en la digestión. Cuando existe cualquier ambigüedad debida a la generación posible de otros fragmentos que darían lugar a los mismos resultados de espectrometría de masas o a resultados similares, se puede recoger el componente sospechoso y reservarlo para una secuenciación para confirmar la identidad. La HPLC analítica también proporciona de manera importante una cuantificación relativamente precisa del producto peptídico en la digestión, lo que permite la determinación de si un péptido dado es un producto con poca o mucha importancia en la digestión, lo que indica si el epítopo es producido de manera eficaz por el proteosoma. Mediante el uso del método anterior, se identificaron epítopos constitutivos. La Figura 13 muestra los resultados de un ensayo de citometría de flujo para verificar la unión al HLA de estos epítopos. Este ensayo se discute en el Ejemplo 6.

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Ejemplo 6 Determinación de la capacidad de unión al MHC de los péptidos seleccionados

La unión de un epítopo candidato a HLA-A2.1 se ensayó según el método de Stauss et al., (Proc Natl Acad Sci USA 89(17):7871-5 (1992)). Las células T2, que expresan moléculas del MHC vacías o inestables en su superficie, se lavaron dos veces y se suspendieron a 5 x 10^{6} células/ml en medio de Dulbecco modificado por Iscove completo exento de suero (IMDM). Se añadió \beta_{2}-microglobulina (Sigma, St. Louis, MO) a 5 \mug/ml y las células se distribuyeron en una placa de 96 pocillos de fondo en forma de U a 5x10^{5} células/pocillo. Los péptidos se añadieron a 100, 10, 1 y 0,1, \mug/ml. La placa se agitó suavemente durante 2 minutos y después se incubó durante 4 horas en un incubador con un 5% de CO_{2} a 37ºC. Después de eliminar el péptido sin unir lavando dos veces con IMDM, se añadió una cantidad de saturación de anticuerpo monoclonal W6/32 (Sigma). Tras la incubación durante 30 minutos a 4ºC, las células se lavaron con PBS complementado con un 1% de FCS inactivado térmicamente, 0,1% (p:v) de azida sódica, pH 7,4-7,6 (tampón de tinción), y se incubó con F(ab') de cabra anti-IgG de ratón conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma) durante 30 min a 4ºC, y se lavó cuatro veces como anteriormente. Las células se resuspendieron en tampón de tinción y se fijaron mediante la adición de un cuarto del volumen de paraformaldehído al 2%. El análisis de las moléculas HLA-A2.1 superficiales estabilizadas mediante la unión del péptido se llevó a cabo mediante citometría de flujo en un FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Los resultados del experimento se muestran en la Figura 14. Mediante el uso del método discutido anteriormente, se descubrió que un epítopo constitutivo de tirosinasa candidato identificado mediante la digestión proteosómica, (tirosinasa 207-216, FLPWHRLFLL, SEQ ID NO: 78) se unía a HLA-A2.1 en un grado similar al péptido de unión a A2.1 conocido FLPSDYFPSV (SEQ ID NO: 79) (control positivo). El péptido de unión a HLA-B44 AEMGKYSFY (SEQ ID NO: 80) se usó como control negativo. La fluorescencia obtenida a partir del control negativo fue similar a la señal obtenida cuando no se usó ningún péptido en el ensayo. Los péptidos de control positivos y negativos se eligieron de la Tabla 18.3.1 de Current Protocols in Immunology, pág. 18.3.2, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998.

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Ejemplo 7 Elución de epítopos del HLA a partir de tumores, muestras de tejido, líneas celulares inmortalizadas, o líneas celulares tumorales

En lugar de generar epítopos del HLA con proteolisis in vitro, se pueden identificar tras la elución de los HLA de tumores, muestras de tejido, líneas celulares tumorales u otras líneas celulares inmortalizadas mediante el uso de métodos de espectrometría de masas. Aunque se puede usar una amplia diversidad de tales métodos, uno de los métodos más potentes para identificar epítopos de la superficie de las células implica la HPLC capilar o nanocapilar-espectrometría de masas ESI y la secuenciación en tiempo real, tal como se describe en la bibliografía publicada. Los procedimientos de elución para el HLA solubilizado y las células intactas se describen también en Falk, K. et al. Nature 351:290, 1991 y en la patente de EE.UU. 5.989.565, respectivamente. No se describe en la bibliografía, sin embargo, la necesidad de identificar el tipo de proteosoma expresado en las células sometidas a la elución y el análisis de péptidos para determinar si los epítopos identificados son epítopos constitutivos, que son necesarios para hacer vacunas eficaces. Para identificar definitivamente el epítopo del HLA como un epítopo constitutivo o inmunitario, se debe saber en general qué proteosoma expresan las células de las que proceden. La expresión de los proteosomas se puede determinar preferiblemente mediante transferencia de Western, que se describe con detalle más adelante, y se puede determinar también mediante RT-PCR, inmunohistoquímica, o hibridación in situ.

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Ejemplo 8 Ensayo de inducción con IFN

Otro ensayo para distinguir entre los epítopos constitutivos y los epítopos inmunitarios es ensayar la capacidad de CTLs anti-péptidos de destruir las células que expresan el TAA en cuestión. Se puede usar el IFN para inducir la expresión del proteosoma inmunitario (suponiendo que no se exprese todavía de forma constitutiva) y se puede comparar el reconocimiento por CTLs de las células inducidas y sin inducir. Como anteriormente, se debería confirmar el tipo de proteosoma, p.ej., mediante transferencia de Western. Si las células inducidas con IFN se destruyen de forma preferente, el péptido constituye un epítopo inmunitario. Si las células no inducidas se destruyen de forma preferente, el péptido constituye un epítopo constitutivo. Ciertos epítopos se pueden producir mediante ambos proteosomas con eficacias diferentes, y en tales casos se observa actividad citolítica contra ambas poblaciones. Tales epítopos se clasifican como epítopos constitutivos debido a que están presentes en las células diana periféricas.

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Ejemplo 9 Uso de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) o de linfocitos infiltrantes de tumor (TILs) para identificar epítopos constitutivos

Se pueden usar TILs aislados a partir de biopsias de pacientes, o PBMCs de sangre de donantes o de pacientes para identificar epítopos constitutivos mediante el uso de los métodos que se describen habitualmente en la bibliografía publicada. Para identificar epítopos constitutivos, se confirma que las células diana, usadas para ensayar la destrucción activa por parte de los PBMCs o TILs, expresan solamente los proteosomas constitutivos, y no expresan niveles significativos de proteosoma inmunitario. Los PBMCs de sangre de donante se estimulan in vitro mediante el uso de un panel de antígenos peptídicos con una afinidad predicha por el alelo del HLA de clase I expresado en las células sanguíneas a utilizar. Cada muestra de PBMC se estimula con un antígeno peptídico de la clase I específico durante una semana, preferiblemente con la combinación de citocinas tales como IL-2 o IL-12 para mejorar la actividad de las células T. Esta estimulación se repite al menos tres veces para inducir la expansión clonal de las células T específicas contra el péptido. Se lleva a cabo un ensayo de liberación de cromo estándar mediante el uso de células diana que se sabe que expresan la proteína que contiene el epítopo y exclusivamente el proteosoma constitutivo. Los indicios de la destrucción de las células diana medido mediante la liberación de cromo indican que el péptido usado para estimular los PBMCs está presente en forma de un epítopo constitutivo en la superficie de la célula diana. Los tumores que expresan esta proteína son así dianas candidatas para una vacuna que contiene el epítopo.

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Ejemplo 10 Identificación de proteosomas constitutivos y/o inmunitarios mediante transferencia de Western

Los dos siguientes protocolos comienzan con una membrana sobre la cual se han transferido las proteínas extraídas de las células de interés tras una separación electroforética.

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A. Protocolo cromogénico

1. Lavar la membrana durante 5 min en 20 ml de PBS-T (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 + 0,1% de Tween-20) a temperatura ambiente en un agitador orbital (TA/agitador).

PBS (Sigma, nº de cat. P-3813)

(los volúmenes pueden variar con el tipo de recipiente en cualquier caso).

2. Incubar la membrana durante 5 min en 20 ml de PBS-T, 3% de H_{2}O_{2} a TA/agitador:

: 2 ml de H_{2}O_{2} al 30% + 18 ml de PBS-T

3. Lavar la membrana 3x5 min con PBS-T a TA/agitador.

4. Bloquear durante la noche en 20 ml de PBS-T/5% de leche descremada en polvo a 4ºC/agitador:

: 20 ml de PBS-T + 1 g de leche

5. Lavar la membrana en PBS-T.

6. Incubar la membrana en 5 ml de anticuerpo primario (Affinity Research Products Ltd, Reino Unido) en tampón de bloqueo durante 2 hrs a TA/agitador:

: 11

Estas condiciones son para los anticuerpos precedentes solamente. Las condiciones para cada anticuerpo se deben determinar de forma empírica.

7. Lavar la membrana como en la etapa 3.

8. Incubar la membrana en 5 ml de anticuerpo secundario (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) en tampón de bloqueo durante 30 min a TA/agitador:

: 12

9. Lavar la membrana como en la etapa 3.

10. Incubar la membrana en 5 ml de ABC (Vector Laboratories, nº de cat. PK-6100) en PBS-T durante 30 min:

: Hacer ABC al menos 30 min antes del uso como sigue:

: A=5 \mul/1 ml=25 \mul/5 ml

: B=5 \mul/1 ml=25 \mul/5 ml

: 5 \mul A+5 \mul B > mezclar > dejar reposar a 4ºC > añadir 990 \mul de PBS-T

: Diluir ABC en PBS-T justo antes del uso

11. Lavar la membrana como en la etapa 3.

12. Detección:

1): transferir 5 ml de PB 0,2 M a un 1^{er} tubo de 15 ml

: Tampón de fosfato 0,4 M:

: 90,4 ml de fosfato sódico monobásico (1 M)

: 619,2 ml de fosfato sódico dibásico (0,5 M)

: pH a 7,4

: C.s. hasta 1 L

2): transferir 2,8 ml de PB 0,2 M a un 2º tubo de 15 ml

3): transferir 2 ml de Glucosa al 1% a un 3^{er} tubo de 15 ml

4): pesar 6 mg de ANS (sulfato de níquel y amonio) y transferirlo al 1^{er} tubo de 15 ml; agitar en agitador vorticial

5): añadir 1101 de Glucosa Oxidasa (Sigma, nº de cat. G-6891) a un tubo eppendorf

6): añadir 1101 de sustrato DAB (Diaminobencidina HCl, KPL, Maryland nº de cat. 71-00-46) en otro tubo eppendorf

7): Mezclar en la campana: 5 ml de PB + 2 ml de Glucosa

: +1101 GO

: +1101 DAB

: + 2,8 ml de PB 0,2 M

13. Aplicar la mezcla de detección sobre la membrana y ajustar el cronómetro. Registrar la duración de la incubación en el cromógeno.

14. Después de que las bandas se hagan lo suficientemente visibles, lavar la membrana 3 veces con PB 0,2 M.

15. Agitar en PBS durante la noche a TA.

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B. Protocolo de quimioluminiscencia

1. Lavar la membrana dos veces en TBS-T (solución salina tamponada con Tris de pH 7,6 + 0,1% de Tween-20). Solución salina tamponada con Tris: 2,42 g de base Tris (20 mM)

8 g de cloruro sódico (137 mM)

3,8 ml de ácido clorhídrico 1 M

2. Bloquear durante la noche en 20 ml de tampón de bloqueo (TBS-T/5% de leche descremada en polvo)

4ºC/agitador:

: 20 ml de TBS-T + 1 g de leche

: Los volúmenes dependen del tipo de recipiente

3. Lavar la membrana dos veces con TBS-T.

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4. Incubar la membrana en 5 ml de anticuerpo primario (Affinity Research Products Ltd, Reino Unido) en tampón de bloqueo durante 2 hrs a TA/agitador:

16

5. Lavar la membrana en 20 ml de TBS-T a TA/agitador:

: Lavar brevemente la membrana mediante el uso de dos cambios de TBS-T y después lavar una vez durante 15 minutos y dos veces durante 5 minutos con cambios nuevos del tampón de lavado a temperatura ambiente.

6. Incubar la membrana en 5 ml de anticuerpo secundario marcado con HRP (marcado con peroxidasa de rábano) (Amersham; nº de cat. NIF 824 o NIF 825), dilución 1:1000 en tampón de bloqueo durante 1 h a TA/agitador

7. Lavar la membrana como en la etapa 5.

8. Mezclar un volumen igual de disolución de detección 1 (Amersham, nº de cat. RPN2109) y disolución de detección 2 (Amersham, nº de cat. RPN2109) (1 ml+1 ml). 9. Drenar el exceso de tampón de la membrana lavada y colocarla sobre un trozo de Saran Wrap, con el lado de la proteína hacia arriba. Añadir el reactivo de detección hasta cubrir la membrana.

10. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente sin agitación.

11. Drenar el exceso del reactivo de detección y transferir la membrana a un Kodak Digital Science Image Station 440CF con el lado de la proteína hacia abajo. Revelar y cuantificar la señal según las instrucciones del fabricante.

La presencia de las subunidades específicas constitutivas (en cualquier protocolo) se determina directamente mediante el uso de:

17

(Affinity Research Products Ltd, Reino Unido).

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Ejemplo 11 Preparación de una vacuna peptídica de epítopos constitutivos

Se sintetiza una secuencia que se ha identificado que es un epítopo constitutivo mediante el uso de un sintetizador de péptidos comercial. Los péptidos de interés se formulan de diferentes maneras y se administran solos o en combinación con adyuvantes, tales como CFA, IFA, o melacina, o con citocinas, tales como IL-2, IL-12, o GM-CSF para conseguir el efecto de estimular las células T contra el epítopo en animales. Los péptidos se formulan también con sustancias de liberación controlada, tales como microesferas de PLGA u otras sustancias biodegradables, que alteran la farmacocinética del péptido y también pueden mejorar la inmunogenicidad. Los péptidos se formulan también para administración oral mediante el uso de tales sustancias para facilitar la sensibilización de la respuesta inmunitaria por medio de la absorción en GALT (tejidos linfoides asociados al intestino). Los péptidos también se adhieren a partículas de oro diminutas de forma que se pueden administrar mediante el uso de una "pistola de genes".

A. Síntesis de péptidos de grado GRMP

Se sintetizaron péptidos mediante el uso de las metodologías de síntesis en fase sólida FMOC o tBOC. Tras la síntesis, los péptidos se escindieron de sus soportes con ácido trifluoroacético o fluoruro de hidrógeno, respectivamente, en presencia de agentes protectores apropiados. Después de eliminar el ácido mediante evaporación, los péptidos se extraen con éter para eliminar los agentes protectores, y el péptido precipitado en bruto se liofiliza después. La pureza de los péptidos en bruto se determina mediante HPLC, análisis de la secuencia, análisis de aminoácidos, análisis del contenido de contraiones y otros medios adecuados. Si los péptidos en bruto son lo suficientemente puros (una pureza mayor o igual a alrededor del 90%), se pueden usar tal como están. Si es necesaria una purificación para cumplir las especificaciones de las sustancias farmacológicas, los péptidos se purifican mediante el uso de uno o una combinación de lo siguiente: re-precipitación; cromatografía en fase inversa, de intercambio de iones, de exclusión por tamaño o de interacción hidrófoba; o distribución contracorriente.

B. Formulación de productos farmacológicos

Se formulan péptidos de grado GMP en un sistema tampón o disolvente acuoso, orgánico o acuoso-orgánico parenteralmente aceptable en el que permanecen físicamente y químicamente estables y biológicamente potentes. En general, son apropiados los tampones o las combinaciones de tampones o las combinaciones de tampones y disolventes orgánicos. El intervalo de pH es generalmente entre 6 y 9. Se pueden añadir modificadores orgánicos u otros excipientes para ayudar a solubilizar y estabilizar los péptidos. Estos incluyen detergentes, lípidos, co-disolventes, antioxidantes, quelantes y agentes reductores. En el caso de un producto liofilizado, se puede añadir sacarosa o manitol u otros adyuvantes para la liofilización. Las disoluciones de péptidos se esterilizan mediante filtración con membranas hasta su sistema de recipiente-cierre final, y se liofilizan para su disolución en la clínica, o se almacenan hasta su uso.

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Ejemplo 12 Administración de una vacuna peptídica de epítopos constitutivos A. Administración intranodular

Se inyectó una formulación que contenía un péptido en un tampón acuoso con un agente antimicrobiano, un antioxidante, y una citocina inmunomoduladora, de forma continua a lo largo de varios días en el nódulo linfático inguinal mediante el uso de un sistema de bombeo en miniatura desarrollado para la administración de insulina (MiniMed; Northridge, CA). Este ciclo de infusión se seleccionó para imitar la cinética de la presentación de antígenos durante una infección natural.

B. Liberación controlada

Se administra una formulación de péptido mediante el uso de microesferas de PLGA controladas, que alteran la farmacocinética del péptido y mejoran la inmunogenicidad. Esta formulación se inyecta o se toma de forma oral.

C. Administración mediante pistola de genes

Se prepara una formulación de péptido en la que el péptido se adhiere a micropartículas de oro. Las partículas se administran en una pistola de genes, y se aceleran a una velocidad elevada para penetrar en la piel, llevando las partículas a los tejidos dérmicos que contienen pAPCs.

D. Administración mediante aerosol

Se inhala una formulación de péptido en forma de un aerosol, para la absorción en el tejido vascular o linfático apropiado en los pulmones.

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Ejemplo 13 Preparación de una vacuna de ácido nucleico

Se modificó un vector plasmídico portador, pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contenía un gen de resistencia a kanamicina y un promotor de CMV, para que incluyera dos secuencias que contenían los epítopos deseados. Además, contenía una secuencia IRES situada entre los dos epítopos para permitir su expresión simultánea mediante el uso de un promotor. Después se transfectó una cepa de E. coli adecuada con el plásmido y se colocó en placas en medios selectivos. Varias colonias crecieron en el cultivo en suspensión, y los clones positivos se identificaron mediante cartografía de restricción. El clon positivo se cultivó después y se alicuotó en viales de almacenamiento y se almacenó a -70ºC.

Después se produjo una mini-prep (QIAprep Spin Mini-prep: Qiagen, Valencia, CA) del plásmido a partir de una muestra de estas células y se usó un análisis de secuenciación didesoxi fluorescente automatizado para confirmar que la construcción tenía la secuencia deseada. Los vectores de vacunas de ácidos nucleicos adecuados y las formulaciones se describen en las secciones anteriores de esta memoria descriptiva, y en los Ejemplos 18-20 más adelante.

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Ejemplo 14 Administración de una vacuna de ácido nucleico

Se inyecta una vacuna de ácido nucleico en un nódulo linfático mediante el uso de un sistema de bombeo en miniatura, tal como la bomba de insulina MiniMed. Se administra una construcción de ácido nucleico formulada en una disolución acuosa tamponada que contiene un agente antimicrobiano, un antioxidante, y una citocina inmunomoduladora, a lo largo de un ciclo de infusión de varios días para imitar la cinética de la presentación de antígenos durante una infección natural.

Opcionalmente, la construcción de ácido nucleico se administra mediante el uso de sustancias de liberación controlada, tales como microesferas de PLGA u otras sustancias biodegradables. Estas sustancias se inyectan o se toman de forma oral. La vacuna de ácido nucleico se da mediante el uso de administración oral, sensibilizando la respuesta inmunitaria por medio de la absorción en los tejidos GALT. De forma alternativa, la vacuna de ácido nucleico se administra mediante el uso de una pistola de genes, en la que la vacuna de ácido nucleico se adhiere a partículas de oro diminutas. Las construcciones de ácidos nucleicos se pueden inhalar también en forma de un aerosol, para la absorción en el tejido vascular o linfático apropiado en los pulmones.

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Ejemplo 15 Ensayo para la presentación de un epítopo constitutivo en las pAPCs A. Análisis de tetrámeros

Se usa el análisis de tetrámeros de clase I para determinar la frecuencia de células T en un animal antes y después de la administración de un epítopo constitutivo. La expansión clonal de las células T en respuesta a un epítopo indica que el epítopo es presentado a las células T por las pAPCs. La frecuencia de células T específicas se mide hacia el epítopo constitutivo antes y después de la administración del epítopo a un animal, para determinar si el epítopo está presente en las pAPCs. Un incremento en la frecuencia de las células T específicas hacia el epítopo tras la administración indica que el epítopo se presentó en las pAPCs.

B. Ensayo de proliferación

Aproximadamente 24 horas tras la vacunación de un animal con un epítopo constitutivo, se recogen las pAPCs de PBMCs, esplenocitos o células de nódulos linfáticos, mediante el uso de anticuerpos monoclonales hacia marcadores específicos presentes en las pAPCs, fijados en esferas magnéticas para la purificación por afinidad. La preparación de esplenocitos o sangre en bruto se enriquece en pAPCs mediante el uso de esta técnica. Las pAPCs enriquecidas se usan después en un ensayo de proliferación con un clon de células T que se ha generado y que es específico para el epítopo constitutivo de interés. Las pAPCs se co-incuban con el clon de células T, y se monitoriza la actividad de proliferación de las células T midiendo la incorporación de timidina radiomarcada en las células T. La proliferación indica que las células T específicas para el epítopo constitutivo están siendo estimuladas por ese epítopo en las pAPCs.

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Ejemplo 16 Ensayo de la eficacia de los epítopos constitutivos como tratamiento anticanceroso

Se usan criterios de valoración sustitutos o la supervivencia para determinar la eficacia de las vacunas de sincronización de epítopos en el tratamiento del cáncer.

A. Análisis de la frecuencia de células T

Un criterio de valoración sustituto útil es la determinación de la frecuencia de células T contra el epítopo constitutivo usado en la inmunización. Los pacientes que desarrollan frecuencias de células T elevadas contra epítopos de TuAAs específicos usados en la inmunoterapia tumoral tienen una supervivencia significativamente mejor en comparación con los pacientes inmunizados mediante el mismo epítopo, pero que no desarrollan una frecuencia de células T incrementada hacia el epítopo. Se usa el análisis de tetrámeros, el análisis ELISPOT, o el análisis mediante dilución limitante para determinar la frecuencia de las células T hacia un epítopo constitutivo antes y después de la inmunización con el epítopo, lo que indica la eficacia anticancerosa de un epítopo constitutivo en una vacuna.

B. Análisis de la masa tumoral/supervivencia

Se estudia la masa tumoral en un animal con un tumor existente antes y después de la inmunización con un epítopo constitutivo. La regresión tumoral parcial o completa indica una intervención terapéutica eficaz, y se correlaciona con una supervivencia mejorada. En un laboratorio, se inocula un tumor a varios animales en paralelo. Algunos de los animales se inmunizan después con una vacuna de epítopos constitutivos. La supervivencia de los animales inmunizados con el epítopo constitutivo se compara con la de aquellos que recibieron un epítopo de control o placebo, para determinar la eficacia de la vacuna.

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C. Ensayo de liberación de cromo

Se inmuniza a un animal modificado genéticamente para que exprese el MHC de clase I humano mediante el uso de un epítopo constitutivo. Las células T de estos animales se usan en un ensayo de liberación de cromo estándar mediante el uso de dianas tumorales humanas u dianas modificadas para que expresen el mismo MHC de clase I. La destrucción de las dianas por parte de las células T indica que la estimulación de las células T en un paciente sería eficaz para destruir un tumor que expresa un TuAA similar.

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Ejemplo 17 Identificación de epítopos constitutivos únicos

Los epítopos útiles en las vacunas y métodos de la presente invención se pueden identificar fácilmente tal como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, se han identificado tres epítopos constitutivos únicos que no son producidos por las pAPCs como sigue:

A. Aislamiento y Purificación

Se aíslan complejos de proteosomas inmunitarios o constitutivos. El péptido purificado se disuelve en un tampón apropiado a una concentración de alrededor de 1 a 2 mM y se añade a aproximadamente 2 volúmenes de la preparación de proteosomas. El tampón elegido debe solvatar al péptido sin interferir en el proceso de digestión. Se prepara una digestión adicional mediante el uso del péptido de control positivo descrito anteriormente para verificar el funcionamiento correcto de la preparación de proteosomas utilizada. Estos se incuban a 37ºC durante periodos de hasta 120 minutos y después se detiene la digestión mediante la adición de ácido trifluoroacético diluido; las muestras se analizan inmediatamente mediante espectrometría de masas, o se congelan en hielo seco hasta su análisis. La reacción de digestión se puede detener también colocando las muestras en hielo para el análisis inmediato mediante espectrometría de masas.

B. Análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF de la digestión

Se mezclaron aproximadamente 0,5 \mul de cada digestión con un volumen igual de la disolución de matriz (10 mg/ml de ácido dihidroxibenzoico en EtOH al 70%, pH 2-3) directamente sobre la placa de muestra y se dejó secar al aire a alrededor de 40ºC. Las muestras se analizaron después en un espectrómetro de masas MALDI-TOF Lasermat^{TM} que se calibró con patrones de pesos moleculares adecuados.

El programa informático desarrollado para el ensayo de proteosomas genera la secuencia y el peso molecular de todos los fragmentos posibles que satisfacen los dos requerimientos de tener el extremo C-terminal correcto de cualquier epítopo predicho, y de contener la longitud completa de ese epítopo o más.

Cuando los resultados de MALDI-TOF demostraron que un peso molecular particular estaba representado en una mezcla de digestión, el péptido correspondiente se sintetizó, se purificó, se identificó mediante MALDI-TOF y después se sometió a HPLC analítica en fase inversa para establecer un tiempo de retención estándar y una proporción aproximada de masa respecto del área del pico. Estos procedimientos son directamente análogos a los descritos anteriormente. Después se diluyó una digestión de proteosomas replicada en un disolvente apropiado y se analizó mediante el uso del mismo método de HPLC analítica. Cuando la digestión proporciona un pico con buen rendimiento que tiene el mismo tiempo de retención que el del patrón, es casi seguro que se deba a la presencia de esa secuencia en la digestión. Cuando existe ambigüedad debida a la posible generación de otros fragmentos que proporcionarían los mismos o similares resultados en la espectrometría de masas, el componente sospechoso se puede recoger y reservar para una secuenciación para confirmar la identidad. Mediante el uso del método anterior, se identificaron epítopos constitutivos.

C. Epítopo constitutivo único adicional

La unión de un epítopo candidato a HLA-A2.1 se ensayó según el método de Stauss et al., (Proc Natl Acad Sci USA 89(17):7871-5 (1992)). Se lavaron dos veces células T2, que expresan moléculas del MHC vacías o inestables en su superficie, y se suspendieron a 5x10^{6} células/ml en medio de Dulbecco modificado por Iscove completo exento de suero (IMDM). Se añadió \beta_{2}-microglobulina (Sigma, St. Louis, MO) a 5 \mug/ml y las células se distribuyeron en una placa de 96 pocillos de fondo en forma de U a 5x10^{5} células/pocillo. Los péptidos se añadieron a 100, 10, 1 y 0,1 \mug/ml. La placa se agitó suavemente durante 2 minutos y después se incubó durante 4 horas en un incubador con un 5% de CO_{2} a 37ºC. Después de eliminar el péptido sin unir lavando dos veces con IMDM, se añadió una cantidad de saturación de anticuerpo monoclonal W6/32 (Sigma). Tras la incubación durante 30 minutos a 4ºC, las células se lavaron con PBS complementado con un 1% de FCS inactivado térmicamente, 0,1% (p:v) de azida sódica, pH 7,4-7,6 (tampón de tinción), y se incubó con F(ab') de cabra anti-IgG de ratón conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma) durante 30 min a 4ºC, y se lavó cuatro veces como anteriormente. Las células se resuspendieron en tampón de tinción y se fijaron mediante la adición de un cuarto del volumen de paraformaldehído al 2%. El análisis de las moléculas HLA-A2.1 superficiales estabilizadas mediante la unión del péptido se llevó a cabo mediante citometría de flujo en un FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Mediante el uso del método discutido anteriormente, se descubrió que un epítopo constitutivo de tirosinasa candidato identificado mediante la digestión proteosómica (tirosinasa 207-216, FLPWHRLFLL, SEQ ID NO: 78) se unía a HLA-A2.1 en un grado similar al péptido de unión a A2.1 conocido FLPSDYFPSV (SEQ ID NO: 79) (control positivo). El péptido de unión a HLA-B44 AEMGKYSFY (SEQ ID NO: 80) se usó como control negativo. La fluorescencia obtenida a partir del control negativo fue similar a la señal obtenida cuando no se usó ningún péptido en el ensayo. Los péptidos de control positivos y negativos se eligieron de la Tabla 18.3.1 de Current Protocols in Immunology, pág. 18.3.2, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998.

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Ejemplo 18 Construcción de pVAX-EP1-IRES-EP2 Resumen

El plásmido de partida para esta construcción es pVAX1 adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). Se sintetizaron los epítopos EP1 y EP2 mediante GIBCO BRL (Rockville, MD). IRES se cortó de pIRES adquirido de Clontech (Palo Alto, CA). Véase la Figura 12.

Procedimiento

1: Digerir pIRES con EcoRI y NotI. Separar los fragmentos digeridos con un gel de agarosa, y purificar el fragmento IRES mediante purificación en gel;

2: Digerir pVAX1 con EcoRI y NotI. Purificar en gel el fragmento pVAX1;

3: Establecer una ligadura que contiene los fragmentos purificados pVAX1 e IRES;

4: Transformar DH5\alpha competentes con la mezcla de ligadura;

5: Escoger 4 colonias y hacer una Miniprep.

6: Llevar a cabo un análisis mediante digestión con enzimas de restricción del ADN Miniprep. Se usó una colonia recombinante que tenía el inserto IRES para la inserción adicional de EP1 y EP2. Esta construcción intermedia se denominó VAX-IRES.

7: Sintetizar EP1 y EP2;

8: Subclonar EP1 en pVAX-IRES entre los sitios AflII y EcoRI, para producir pVAX-EP1-IRES;

9: Subclonar EP2 en pVAX-EP1-IRES entre SalI y NotI, para producir la construcción final pVAX-EP1-IRES-EP2;

10: Secuenciar el inserto EP1-IRES-EP2 para confirmar la secuencia.

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Ejemplo 19 Construcción de pVAX-EP1-IRES-EP2-ISS-NIS Resumen

El plásmido de partida para esta construcción fue pVAX-EP1-IRES-EP2 (Ejemplo 18). La ISS (secuencia inmunoestimuladora) (SEQ ID NO: 82) introducida en esta construcción es AACGTT, y la NIS (que significa secuencia de importación nuclear) (SEQ ID NO: 81) utilizada es la secuencia de repeticiones de 72 pb de SV40. ISS-NIS fue sintetizada por GIBCO BRL. Véase la Figura 9.

Procedimiento

1: Digerir pVAX-EP1-IRES-EP2 con NruI. Purificar en gel el plásmido linealizado;

2: Sintetizar ISS-NIS;

3: Establecer una reacción de ligadura que contiene el pVAX-EP1-IRES-EP2 linealizado purificado y el ISS-NIS sintetizado;

4: Transformar DH5\alpha competentes con el producto de ligadura;

5: Recoger colonias y hacer una Miniprep;

6: Llevar a cabo una digestión con enzimas de restricción de la Miniprep;

7: Secuenciar el plásmido con el inserto.

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Ejemplo 20 Construcción de pVAX-EP2-UB-EP1 Resumen

El plásmido de partida para esta construcción es pVAX1 (Invitrogen). EP2 y EP1 fueron sintetizados por GIBCO BRL. El cADN de ubiquitina de tipo natural que codifica los 76 aminoácidos en la construcción se clonó a partir de levadura. Véase la Figura 10.

Procedimiento

1: Llevar a cabo una RT-PCR mediante el uso de mARN de levadura. Los cebadores se diseñaron para amplificar la secuencia codificante completa de la ubiquitina de levadura;

2: Analizar los productos de RT-PCR mediante el uso de un gel de agarosa. Purificar en gel la banda con el tamaño predicho;

3: Subclonar la banda de ADN purificada en pZERO1 en el sitio EcoRV. El clon resultante se denominó pZERO-UB;

4: Secuenciar varios clones de pZERO-UB. Confirmar la secuencia de la ubiquitina antes de manipulaciones adicionales;

5: Sintetizar EP1 y EP2;

6: Ligar EP2, ubiquitina y EP1 y clonar el inserto en pVAX1 entre BamHI y EcoRI, colocándolo bajo el control del promotor de CMV;

7: Confirmar la secuencia del inserto EP2-UB-EP1 mediante secuenciación.

IRES (SEQ ID NO: 6)

18

: Referencia: Clontech PT3266-5

\newpage

UBIQUITINA (SEQ ID NO: 5)

19

: Referencia: Ozkaynak, E., Finley, D., Solomon, M.J. y Varshavsky, A., The yeast ubiquitin genes: a family of natural gene fusions. EMBO J. 6 (5), 1429-1439 (1987).

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NIS (SEQ ID NO: 81)

20

: Referencia: Dean DA, Dean BS, Muller S, Smith LC, Sequence requirements for plasmid nuclear import. Exp. Cell Res. 253 (2): 713-22 (1999).

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ISS (SEQ ID NO: 82)

: AACGTT

: Referencia: Sato Y, Roman M, Tighe H, Lee D, Corr M, Nguyen M, Silverman GJ, Lotz M, Carson DA y Raz E, Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization. Science, 273: 352-354 (1996).

Los Ejemplos 21-24 están relacionados con la predicción de epítopos 9-méricos presentados por HLA-A2.1, aunque el procedimiento es igualmente aplicable a cualquier tipo de HLA, o longitud de epítopo, para el cual haya disponible un algoritmo predictivo o un ensayo de unión al MHC.

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Ejemplo 21 Melan-A/MART-1 (SEQ ID NO: 1)

Este antígeno asociado a tumor (TuAA) de melanoma tiene una longitud de 118 aminoácidos. De los 110 9-meros posibles, a 16 de ellos se les da una puntuación de 16 mediante el algoritmo SYFPEITHI/Rammensee (véase la Tabla 8). Estos representan un 14,5% de los péptidos posibles y una densidad media de epítopos en la proteína de 0,136 por aminoácido. Doce de estos solapan, cubriendo los aminoácidos 22-49 de SEQ ID NO: 1, lo que da como resultado una densidad de epítopos para el grupo de 0,428, lo que da una proporción, como se describió anteriormente, de 3,15. Otros dos epítopos predichos solapan los aminoácidos 56-69 de SEQ ID NO: 1, lo que da una densidad de epítopos para el grupo de 0,143, que no es diferente de forma apreciable de la media, con una proporción de solamente 1,05. Véase la Figura 15.

TABLA 8

21

La restricción del análisis a los 9-meros que se predice que tienen una semivida de disociación de 5 minutos mediante el algoritmo BIMAS-NIH/Parker deja solamente 5 (véase la Tabla 9). La densidad media de epítopos en la proteína es ahora solamente 0,042 por aminoácido. Tres péptidos solapantes cubren los aminoácidos 31-48 de SEQ ID NO: 1, y los otros dos cubren 56-69 de SEQ ID NO: 1, como anteriormente, lo que da unas proporciones de 3,93 y 3,40, respectivamente (véase la Tabla 10).

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TABLA 9

22

TABLA 10

23

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Ejemplo 22 SSX-2/HOM-MEL-40 (SEQ ID NO: 2)

Este antígeno asociado a tumor (TuAA) de melanoma tiene una longitud de 118 aminoácidos. De los 180 9-meros posibles, a 11 de ellos se les da una puntuación de 16 mediante el algoritmo SYFPEITHI/Rammensee (véase la Tabla 11). Estos representan un 6,1% de los péptidos posibles y una densidad media de epítopos en la proteína de 0,059 por aminoácido. Tres de estos solapan, cubriendo los aminoácidos 99-114 de SEQ ID NO: 2, lo que da como resultado una densidad de epítopos para el grupo de 0,188, lo que da una proporción, tal como se describió anteriormente, de 3,18. También hay pares solapantes de epítopos predichos en los aminoácidos 16-28, 57-67, y 167-183 de SEQ ID NO: 2, lo que da unas proporciones de 2,63, 3,11, y 2,01, respectivamente. Hay un grupo de epítopos predicho adicional que cubre los aminoácidos 5-28 de SEQ ID NO: 2. El estudio de la región 5-28 de SEQ ID NO: 2 que contiene tres epítopos da una densidad de epítopos de 0,125 y una proporción de 2,14 (véase la Tabla 12).

La restricción del análisis a los 9-meros que se predice que tienen una semivida de disociación de 5 minutos mediante el algoritmo BIMAS-NIH/Parker deja solamente 6 (véase la Tabla 13). La densidad media de epítopos en la proteína es ahora solamente 0,032 por aminoácido. Solamente solapa un único par, en 167-180 de SEQ ID NO: 2, con una proporción de 4,48. Sin embargo, el péptido con mayor clasificación está cerca de otro epítopo predicho simple si esa región, los aminoácidos 42-65 de SEQ ID NO: 2, se estudia la proporción es 2,51, lo que representa una diferencia sustancial de la media (véase la Figura 16 y la Tabla 14).

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TABLA 11

24

TABLA 12

25

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TABLA 13

26

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TABLA 14

27

Ejemplo 23 NY-ESO (SEQ ID NO: 3)

Este antígeno asociado a tumor (TuAA) tiene una longitud de 180 aminoácidos. De los 172 9-meros posibles, a 25 de ellos se les da una puntuación de 16 mediante el algoritmo SYFPEITHI/Rammensee (véase la Tabla 15). Como anteriormente Melan-A, estos representan un 14,5% de los péptidos posibles y una densidad media de epítopos en la proteína de 0,136 por aminoácido. Sin embargo, la distribución es bastante diferente. Prácticamente la mitad de la proteína está vacía, con sólo un epítopo predicho en los primeros 78 aminoácidos. A diferencia de Melan-A, en la que había un grupo muy apretado de péptidos muy solapantes, en NY-ESO los solapamientos son más pequeños y se extienden por la mayoría del resto de la proteína. Una serie de 19 péptidos solapantes cubre los aminoácidos 108-174 de SEQ ID NO: 3, lo que da una proporción de 2,04. Otros 5 epítopos predichos cubren 79-104 de SEQ ID NO: 3, para una proporción de solamente 1,38 (véase la Tabla 16).

Si en su lugar se toma la aproximación de considerar solamente el 5% superior de los epítopos predichos, en este caso 9 péptidos, se puede examinar si los grupos adecuados están siendo ocultados por péptidos que se predice que tienen menos probabilidad de unirse al MHC. Cuando se consideran solamente estos epítopos predichos, se observa que la región 108-140 de SEQ ID NO: 3 contiene 6 péptidos solapantes con una proporción de 3,64. También hay 2 péptidos próximos en la región 148-167 de SEQ ID NO: 3 con una proporción de 2,00. Así, el grupo grande 108-174 de SEQ ID NO: 3 se puede romper en dos grupos más pequeños que cubren gran parte de la misma secuencia (véase la Tabla 16).

La restricción del análisis a los 9-meros que se predice que tienen una semivida de disociación de 5 minutos mediante el algoritmo BIMAS-NIH/Parker proporciona 14 péptidos a considerar (véase la Tabla 17). La densidad media de epítopos en la proteína es ahora 0,078 por aminoácido. Se observa una única serie de 10 péptidos solapantes, que cubren los aminoácidos 144-171 de SEQ ID NO: 3, con una proporción de 4,59. Los 14 péptidos se hallan en la región 86-171 de SEQ ID NO: 3, lo que todavía es 2,09 veces la densidad media de epítopos en la proteína. Aunque tal grupo grande es mayor de lo que se considera ideal, todavía ofrece una ventaja significativa con respecto a trabajar con la proteína completa (véase la Figura 17 y la Tabla 18).

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TABLA 15

28

TABLA 16

29

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TABLA 17

30

TABLA 18

31

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Ejemplo 24 Tirosinasa (SEQ ID NO: 4)

Este antígeno asociado a tumor (TuAA) de melanoma tiene una longitud de 529 aminoácidos. De los 521 9-meros posibles, a 52 de ellos se les da una puntuación de 16 mediante el algoritmo SYFPEITHI/Rammensee (véase la Tabla 19). Estos representan un 10% de los péptidos posibles y una densidad media de epítopos en la proteína de 0,098 por aminoácido. Hay 5 grupos de péptidos solapantes que contienen 2 a 13 epítopos predichos cada uno, con proporciones que oscilan de 2,03 a 4,41, respectivamente. Hay 7 grupos adicionales de péptidos solapantes, que contienen 2 a 4 de epítopos predichos cada uno, con proporciones que oscilan de 1,20 a 1,85, respectivamente. Los 17 péptidos en la región 444-506 de SEQ ID NO: 4, que incluyen los 13 péptidos solapantes anteriores, constituyen un grupo con una proporción de 2,20 (véase la Tabla 20).

La restricción del análisis a los 9-meros que se predice que tienen una semivida de disociación de 5 minutos mediante el algoritmo BIMAS-NIH/Parker proporciona 28 péptidos a considerar (véase la Tabla 21). La densidad media de epítopos en la proteína en estas condiciones es 0,053 por aminoácido. A esta densidad, cualquier solapamiento representa más de dos veces la densidad media de epítopos. Hay 5 grupos de péptidos solapantes que contienen 2 a 7 epítopos predichos cada uno, con proporciones que oscilan de 2,22 a 4,9, respectivamente (véase la Tabla 22). Solamente tres de estos grupos son comunes a los dos algoritmos. Varios, si no todos, de estos grupos se podrían agrandar estudiando la región que los contiene y los epítopos predichos cercanos. Véase la Figura 18.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 19

32

TABLA 20

33

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TABLA 21

34

35

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TABLA 22

36

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<110> CTL IMMUNOTHERAPIES CORP.

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SIMARD, John, J., L.

\hskip1cm

DIAMOND, David, C.

\hskip1cm

LEI, Xiang-Dong

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<120> SINCRONIZACIÓN DE EPÍTOPOS DE CÉLULAS QUE PRESENTAN ANTÍGENOS

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<130> CTLIMM.004VPC

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<150> US 09/561.572

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<151> 2000-04-28

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<150> US 09/561.571

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<151> 2000-04-28

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<150> US 09/561.074

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<151> 2000-04-28

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<150> US 09/560.465

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<151> 2000-04-28

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<160> 82

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 118

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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37

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<210> 2

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<211> 188

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

38

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<210> 3

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<211> 180

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

39

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<210> 4

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<211> 529

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 4

40

41

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<210> 5

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<211> 228

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<212> ADN

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<213> Saccharomyces Cerevisiae

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<400> 5

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42

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<210> 6

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<211> 581

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<212> ADN

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<213> Encephalomyocarditis Virus

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<400> 6

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43

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<210> 7

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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44

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<210> 8

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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45

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<210> 9

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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46

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<210> 10

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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47

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<210> 11

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

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48

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<210> 12

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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49

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<210> 13

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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50

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<210> 14

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

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51

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<210> 15

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

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52

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<210> 16

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

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53

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<210> 17

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

58

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

59

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

61

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

62

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

63

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

64

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

65

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

66

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

67

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<210> 31

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

68

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

69

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

70

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

71

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

72

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

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\hskip1cm

73

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

74

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

75

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

76

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

77

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

79

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

80

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

81

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

82

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

83

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

84

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

87

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<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

93

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

94

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

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<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

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<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

96

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

99

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> SV40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de Nucleótidos Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de Nucleótidos Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacgtt

\hfill

6

Claims

1. Un método de obtención de una composición inmunógena, que comprende:

: identificar un epítopo a partir de un primer antígeno asociado a una célula diana, en el que la identificación comprende la confirmación de que el epítopo es un epítopo constitutivo producido en una célula en la que el proteosoma constitutivo es predominantemente activo; en el que el primer antígeno se selecciona del grupo que consiste en MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, RAGE, NY-ESO, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein-Barr, EBNA, los antígenos E6 y E7 de virus de papiloma humano (HPV), TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, \beta-Catenina, CDK4, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, telomerasa, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, \alpha-fetoproteína, \beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, y GA733-2\KSA, y en el que el epítopo constitutivo tiene una longitud de 9 o 10 aminoácidos

: identificar un grupo de epítopos a partir de un segundo antígeno asociado a la célula diana, en el que el grupo de epítopos comprende un epítopo inmunitario; en el que el segundo antígeno se selecciona del grupo que consiste en MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, RAGE, NY-ESO, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein-Barr, EBNA, los antígenos E6 y E7 de virus de papiloma humano (HPV), TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, \beta-Catenina, CDK4, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, telomerasa, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, \alpha-fetoproteína, \beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, y GA733-2\KSA, en el que la longitud del grupo de epítopos es de al menos 10 aminoácidos y menor de 75 aminoácidos

: combinar el epítopo constitutivo en forma de un péptido, polipéptido o ácido nucleico que codifica dicho péptido o polipéptido, y el grupo de epítopos en forma de un polipéptido que contiene un grupo de epítopos o un ácido nucleico que codifica un grupo para obtener una composición inmunógena adecuada para provocar que una población de células profesionales presentadoras de antígenos presente el epítopo constitutivo, en el que la célula diana es una célula neoplásica o una célula infectada por un virus.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además incorporar adyuvantes en la composición inmunógena para mejorar la administración o la absorción de los epítopos por las células profesionales presentadoras de antígenos.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la célula neoplásica se selecciona del grupo que consiste en leucemia, carcinoma, linfoma, astrocitoma, sarcoma, glioma, retinoblastoma, melanoma, tumor de Wilm, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer hepatocelular, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de cuello de útero, cáncer testicular, cáncer de células renales, y cáncer cerebral.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el virus se selecciona del grupo que consiste en:

: Virus de Epstein-Barr y virus de papiloma humano.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el primer y segundo antígeno es un antígeno asociado a virus.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el grupo de epítopos consiste en o codifica un polipéptido que tiene una longitud que es menor de alrededor del 50% de la longitud del segundo antígeno.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la longitud del polipéptido es menor de alrededor del 20% de la longitud del segundo antígeno.

8. El método de la reivindicación 1, en el que el primer antígeno y el segundo antígeno son iguales.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el epítopo constitutivo es específico de un primer alelo del MHC, y en el que el epítopo inmunitario es específico de un segundo alelo del MHC.

10. El método de la reivindicación 9, en el que el primer alelo y el segundo alelo son iguales.

11. El método de la reivindicación 9, en el que el primer alelo y el segundo alelo no son iguales.