CN105067731B - 一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法及筛选出的生物标记物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法，是采用液相色谱‑四极杆质谱连用的方法，再通过多变量分析和热图聚类分析，筛选出弓形虫感染后血清中生物标记物，并提供了筛选得到的生物标记物在制备弓形虫病靶向药物中的应用。本发明的有益效果为：本发明提供的一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法及筛选出的生物标记物的应用，能够大规模、显著的区分感染状态和未感染状态，可作为一种准确可靠的方法应用于弓形虫感染鉴别诊断，为弓形虫病的诊断及预防起到了做出了贡献。

Description

一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法及筛选出的 生物标记物的应用

技术领域

本发明涉及生物标记物的筛选领域，具体涉及一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法及筛选出的生物标记物的应用。

背景技术

弓形虫(Toxoplasma.gondii)是一种顶复门原虫，广泛寄生于哺乳动物的有核细胞内，包括人类。它是一种重要的人兽共患性寄生虫病病原，具有发病率高、危害严重的流行病学特点。人类或动物因食入被包囊污染的肉制品或饮用被卵囊污染的水而发生感染。不同人群在感染弓形虫后可能会出现不同的临床症状，并且弓形虫的种型也会对临床症状的表现产生影响。

迅速增殖的弓形虫速殖子会引起急性感染，但是很快会被宿主的免疫系统控制。然后速殖子会转变成缓殖子，被包囊包裹，进入一种缓慢的增殖状态，持续存在于宿主的肌肉和脑组织中。当宿主的免疫系统受到抑制，这种潜在的感染又会被重新激发，出现急性感染症状。比如艾滋病人产生的弓形虫性脑炎就是一个典型的例子。以前的研究表明，二型虫株感染小鼠3天后就可以在肺组织中检测出来；当到达10天的时候弓形虫含量发展为最多，而此时也被认为是二型虫株引起的急性感染阶段；位于脑组织中的弓形虫会继续增加，直到感染后21天，此时被认为是慢性感染的开始。此时其他器官的弓形虫已经开始减少，甚至已经消失。同时有研究证明弓形虫进入宿主的中枢神经系统后可以对宿主的行为产生影响，比如损害宿主的学习能力和记忆能力。尽管慢性弓形虫感染在免疫力强健的宿主中不表现冥想的临床症状，但是有研究发现一些精神疾病依然与弓形虫的感染直接相关，比如精神分裂症，情绪紊乱和自杀。目前人们还不清楚弓形虫引起的精神疾病的病理基础是什么。

代谢组学，作为一种系统生物学的研究方法，已经广泛应用于各种模式生物的研究。另外，代谢组学在原虫研究中也取得了长足发展，并成为研究宿主与寄生虫互作的强大工具。目前在代谢组学的研究中，核磁共振技术和色谱-质谱连用技术是应用最为广泛的两种技术。核磁共振技术的主要优点包括：核磁共振没有偏向性，对所有化合物的灵敏度一样；无损伤性，可以在接近生理条件下进行试验，所以其可以直接处理生物流体而不需额外的样品准备；另外它产生的信号与化合物的丰度直接线性相关。但是核磁共振也具有一些局限性，比如灵敏度低，易形成信号重叠；测量范围有限。

代谢组学分析得到的数据十分丰富，并呈多维形式存在。为使数据易于可视化分析，应用模式识别和多维统计分析挖掘其中存在的信息。目前，用于分析代谢组数据的算法分为两类，分别是非监督方法和有监督方法。监督方法是用来探索完全未知的数据特征的方法，对原始数据信息依据样本特征进行分类，把具有相似特征的目标数据进行同源性归类，并以可视的形式展现出来。目前常用的非监督方法包括聚类分析和主成分分析(principal component analysis，PCA)等。有监督方法是在已有的知识基础上建立的信息组，并利用已经建立的信息组对未知数据进行辨识、归类和预测。常用的有监督方法包括线性判别分析、偏最小二乘法-显著性分析(PLS-DA)和人工神经元网络(ANN)。

代谢组学的分析离不开各种现存的数据库。与转录组和蛋白质组相比，代谢组数据库还不完善，还处在不断健全的阶段。目前应用比较广泛的代谢组数据库包括：DOME，MetaCyc,MMP，ArMet和KEGG。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种大规模筛选弓形虫感染后血清中生物标记物的方法及筛选出的生物标记物的应用。

色谱-质谱连用技术因为其具有较高的灵敏性和特异性而被广泛应用于代谢组学的研究中。目前气相色谱-质谱连用和液相色谱-质谱连用是最常用的两种技术手段。气质连用具有很好的分离效率和廉价的成本。但是该技术对样本的要求比较高，需要进行衍生化处理。液质连用技术则不需要对样品进行衍生化处理，再加上该技术的选择性及灵敏度都比较令人满意，所以其的应用在目前更为主流。

液质连用技术的离子化方式有大气压电离(API)包括大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI)与基质辅助激光解吸电离。前者采用四级杆或离子陷阱质量分析器，统称API-MS。后者常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器成为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)。API-MS可以和液相色谱等分离手段连用，扩展了应用范围。而MSALDI-TOF-MS又以测样速度快，操作简单著名。另外质谱仪也可以串联的形式连用，比如三重四极杆质谱仪。另外根据实验人员个性化的需求，也可以将不同类型的质谱分析器连用，比如四级杆飞行时间分析器与电场轨道阱分析器连用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法，是采用液相色谱-四极杆质谱连用的方法，再通过多变量分析和热图聚类分析，筛选出弓形虫感染后血清中生物标记物。

进一步的，上述的一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法，所述生物标记物为犬尿氨酸、甘油磷酸胆碱、五羟色胺、胆碱、N-乙酰-DL–色氨酸、延胡索酸、L-苯丙氨酸、苹果酸、12S-羟基-9E-十八烯酸和胞苷。

进一步的，上述的一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法，包括以下步骤：

1)建立小鼠感染模型；

2)液相色谱-四极杆质谱连用上机处理；

3)数据处理和分析；

4)差异性代谢物及其结构鉴定；

5)聚类分析和生物标记物的筛选。

本发明的第二个目的是提供了上述的一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法筛选得到的生物标记物在制备弓形虫病靶向药物中的应用。

本发明的有益效果为：本发明提供的一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法及筛选出的生物标记物的应用，能够大规模、显著的区分感染状态和未感染状态，可作为一种准确可靠的方法应用于弓形虫感染鉴别诊断，为弓形虫病的诊断及预防起到了做出了贡献。

附图说明

图1为小鼠感染模型病理切片图。

其中，A为小鼠感染14天后出现的典型症状：a，血管套；b，胶质细胞结节。B为小鼠感染21天出现的典型症状：a，包囊；b，五角星代表胶质细胞结节，两侧剪头为包囊。

图2为总体分析(PCA)结果图。

其中，A为ESI+模式下，B为ESI-模式下。

图3为感染组与对照组组间分析(OPLS-DA)结果图。

其中，A为7天感染组与7天对照组OPLS-DA分析结果，B为14天感染组与14天对照组OPLS-DA分析结果,C为21天感染组与21天对照组OPLS-DA分析结果。a为ESI+模式，b为ESI-模式。

图4为感染组组间分析(OPLS-DA)结果图。

其中，A为14天感染组与7天感染组OPLS-DA分析结果，B为7天感染组与21天感染组OPLS-DA分析结果,C为21天感染组与14天感染组OPLS-DA分析结果。a为ESI+模式，b为ESI-模式。

图5为感染组与对照组间、感染组间的热图分析图。

其中，A为根据7天感染组与7天对照组的差异代谢物所做热图，B为根据14天感染组与7天感染组的差异代谢物所做热图,C为根据21天感染与7天感染的差异代谢物所做热图。上述三图的差异代谢物均是在正离子模式下找出的。

图6是信息分析流程图。

图7是不同时期差异代谢物维恩图。

其中，A为正离子模式下；B为负离子模式下。

图8生物标记物ROC曲线图。

其中，生物标记物依次分别为犬尿氨酸(Kynurenine)、甘油磷酸胆碱(Glycerophosphocholine)、五羟色胺(Serotonin)、胆碱(Choline)、N-乙酰-DL-色氨酸(N-Acetyl-DL-tryptophan)、延胡索酸(Fumaric acid)、L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine)、苹果酸(Malic acid)、胞苷(Cytidine)、12S-羟基-9E-十八烯酸HOME(12S-hydroxy-9E-octadecenoic acid)。

具体实施方式

实施例1：

本发明物料来源：

雌性Balb/c鼠：8周龄左右，体重22±2g，购自兰州大学医学实验中心。

弓形虫PRU株：中国农业科学院兰州兽医研究所寄生虫功能基因组学研究室保存。

10×PCR Buffer(Mg²⁺free)、MgCl₂(25mM)、dNTP Mixture(2.5mM each)、Ex-Taq(5U/μL)、10×和6×Loading Buffer：购自TaKaRa公司；

甲酸购自CNW公司；乙腈、甲醇购自Merk公司；亮氨酸-脑啡肤购自Sigma。

质谱仪购自Agilent，型号为Accurate-Mass Q-TOF/MS。

液相购自Agilent，型号为1290Infinity LC,6530UHD。

一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法，包括以下步骤：

一、动物感染模型的构建：

1、建立小鼠感染模型：选取两月龄大的balb/c小鼠,分为两组，一组为感染组，另一组为空白对照组，每组18只。感染组小鼠每只灌胃10个PRU包囊(100μL)，空白对照灌胃相应体积的PBS。

2、PCR鉴定：于7天，14天，21天各处死6只感染小鼠和对照小鼠，取脑，心，肝，脾，肺等组织器官，提取DNA,进行弓形虫B1基因扩增。引物分为两轮。第一轮：F

5’-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3’,R 5’-TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC-3’。第二轮：F

5’-TGCATAGGTTGCAGTCACTG-3’,R 5’-TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC-3’。PCR反应条件为：93℃预变性5min；93℃变性10s，57℃复性10s；72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

3、病理切片检测：将脑组织切成5mm的小块，放置于10％的福尔马林溶液中，2周。在一系列不同浓度酒精溶液中脱水后，包埋进固体石蜡，然后用显微切片机将脑组织蜡块切成5μm厚的薄片。最后进行苏木精和伊红染色(HE)。将制备好的切片放到光学显微镜下，在20倍的物镜条件下进行观察。小鼠感染模型构建成功：以病理切片为例，出现感染症状的小鼠，脑组织具有典型的病理特征，结果如图1所示。

二、LC-MS上机：

1、血清样品制备：小鼠在麻醉后，眼球静脉采血。在室温放置5-8小时，让血清自然析出。4℃3000g离心10min。吸取上清，迅速置于-80℃保存。血清在4℃条件下融解。取100μL血清与300μL甲醇混合，涡旋30s，然后在4℃条件下12000转离心10min，最后转移至1.5mL离心管中。

2、上机：该项目使用的是液相色谱与质谱连用的技术(LC-Q/TOF-MS)，机器的型号为：质谱仪为Accurate-MassQ-T OF/MS；液相色谱仪为Agilent,1290Infinity LC,6530UHD。该系统使用的是C18柱子，具体的规格为1.8μm,100×2.1mm，温度为40℃。该系统是在二元梯度溶剂模式条件下运行的，包括(v/v)0.1％甲酸+水(溶剂A)and(v/v)乙腈+0.1％甲酸(溶剂B)，流速为0.4mL/min。液相洗脱梯度如表1所示。

表1

时间(min)	流速(mL/min)	A(％)	B(％)
				0	0.4	95	5
2	0.4	95	5
				17	0.4	5	95
19	0.4	5	95

质谱参数：采用正离子模式进行检测条件：以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型。离子扫描时间(Scan time)0.03s、扫描时间间隔(Inter scan time)0.02s、数据采集范围：50-1000m/z。为确保质量的准确性和重复性，应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量(Lock mass)，正离子模式下产生[M+H]+离子556.2771Da。负离子模式下产生[M-H]-离子554.2615Da。正负模式下其它质谱参数如表2所示。

表2

	正离子模式	负离子模式
			毛细管电压(Capillary voltage)	4kV	3.4kV
锥孔电压(Sampling cone)	35kV	50kV
			离子源温度(Source temperature)	100	100
脱溶剂气温度(Desolvation temprature)	350	300
			反向锥孔气流(Cone gas flow)	50L/h	50L/h
脱溶剂气(Desolvation gas flow)	600L/h	700L/h
			萃取锥孔(Extraction cone)	4V	4V

3、色谱检查：首先对整体样本的总离子流色谱图(TIC)色谱图进行可视化检查，本检测样本所得的TIC图重叠；目测发现所有样本仪器分析信号强、峰容量大且保留时间重现性好。

三、数据处理和分析

1、总体分析：

首先对整体数据进行评价，检查是否达到代谢组学分析的标准。Simca-P软件中，数据均采用默认的UV格式化(Unit Variance Scaling)和平均中心化(Mean-Centered)处理，以获得更加可靠且更加直观的结果。主成分分析作为一种非监督式的方法，能够真实反应样本的情况，所以首先采用PCA的方法对整体样本进行评估。当各组之间区分并不十分明显时，需要进一步分析。总体分析(PCA)。从图2中可以看出各组区分明显，说明总体样本PCA模型构建成功。

2、组间分析：

2.1 PCA分析：

主成分分析作为无监督式学习方法，可以真实反映样本的聚类情况。一般来说参数R2X值大于0.4就表示该模型可靠。此时项目建立的模型可以应用于可视化观察2组之间的代谢谱差异。

2.2最小二乘判别分析(PLS-DA)：

通过主成分分析后，我们未发现异常需要剔除的样本(所有样本均在置信区间内)，所以进一步采用有监督式方法PLS-DA进行建模分析，模型的参数R2Y表示模型的解释率，Q2表示模型的预测率，一般来说此参数大于0.4即表明此模型可靠。

2.3正交最小二乘判别分析(OPLS-DA)：

为消除系统误差及杂质峰干扰以进一步采用OPLS-DA进行建模分析，模型的参数R2Y表示模型的解释率，Q2表示模型的预测率，一般来说此参数大于0.4即表明此模型可靠。感染组与对照组组间分析(OPLS-DA)。从图3、4中可以看出各组区分明显，说明OPLS-DA模型构建成功。

四、差异性代谢物质及其结构鉴定：

本发明采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP(Variable Importance in theProjection)值(阈值>1)，并结合学生氏t检验(t-test)的p值(阈值0.05)来寻找差异性表达代谢物。定性方法为：搜索公共网络数据库(Metlin以及HMDB)。为了尽量避免峰图中污染物质对差异物的影响，定性过程中排出所有非内源性物质和一些罕见内源性物质。

五、聚类分析和生物标记物的筛选：

ROC筛选生物标记物(biomarker)如表3所示。

表3

从表3中可以看出选出来的代谢物(生物标记物)，经过t检验P值<0.05。AUC值较高，都在0.85以上。说明上述生物标记物具有较高的可信性。

综上所述，本发明中涉及到的液质连用技术可以很好的用来开发区分弓形虫感染状态的生物标记物，并且通过该方法确定的生物标记物具有很高的可信性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种弓形虫感染后血清中生物标记物的筛选方法筛选得到的生物标记物在制备弓形虫病靶向药物中的应用，其特征在于，所述筛选方法是采用液相色谱-四极杆质谱连用的方法，再通过多变量分析和热图聚类分析，筛选出弓形虫感染后血清中生物标记物，具体步骤包括：

1）建立小鼠感染模型；

2）液相色谱-四极杆质谱连用上机处理；

3）数据处理和分析；

4）差异性代谢物及其结构鉴定；

5）聚类分析和生物标记物的筛选，所述生物标记物为犬尿氨酸、甘油磷酸胆碱、五羟色胺、胆碱、N-乙酰-DL –色氨酸、延胡索酸、L-苯丙氨酸、苹果酸、12S-羟基-9E-十八烯酸和胞苷。