CN103592389A - 一种基于妊娠糖尿病人血清lc/ms代谢组学分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于妊娠糖尿病人血清LC/MS代谢组学分析方法，包括：收集正常孕妇及妊娠糖尿病孕妇的血清样本，经处理后经色谱柱分离，并采用质谱检测分析，在进行LC/MS检测分析后提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据，通过建立多维统计模型可视化地显示两组之间的代谢谱差异，获得两组之间的差异性代谢物，并对这些物质进行初步鉴定。本发明方法可以全面、综合地体现妊娠糖尿病患者的代谢产物的变异状况，可用于妊娠糖尿病的早期诊断和预后提供有利的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于妊娠糖尿病人血清LC/MS代谢组学分析方法，具体涉及一种采用LC/MS正离子模式分析法分析正常孕妇和妊娠糖尿病孕妇血清中代谢物的方法。
背景技术
糖尿病是一种严重危害人类生命和健康的疾病。随着人类生活水平的不断提高，生活节奏的加快和饮食的不科学，妊娠糖尿病的发病率逐年增加。妊娠糖尿病（GDM）是糖尿病的一种特殊类型，指妊娠前无糖尿病和糖耐量异常，在妊娠期发生或首次发现的糖尿病或糖耐量异常，不包括妊娠前已知的糖尿病患者。患病率从1%-14%不等，取决于研究的人群和使用的诊断性试验标准。土著居民GDM的患病率是非土著居民的2.5倍；土耳其GDM的患病率为1.23%；俄罗斯GDM的患病率为4.03%，糖耐量异常(IGT)为2.3%；墨西哥的一项流行病学研究表明，GDM为2.12%，IGT的患病率为13.2%；地中海地区GDM的患病率为9%，糖耐量受损是33%；我国天津的GDM患病率为2.31%。妊娠糖尿病系高危妊娠，它严重危害母儿的健康，具有餐后高血糖明显、空腹血糖偏低、易出现肾性糖尿等特点，此病一般发生于妊娠的中期或后期，并可能同时合并其他类型的糖尿病。
目前国际GDM的筛查诊断方法包括空腹血糖，随即血糖、临床高危因素和50g GCT，GCT是目前应用最广泛、最有效的方法。由于GDM的诊断存在地域和种族的差异，目前国内尚无统一的标准，因此，在国内找出一个妊娠糖尿病的早期诊断的方法显得尤为重要。
代谢组学 (metabonomics)是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后兴起的一个新的组学研究热点，是系统生物学的组成部分。代谢组学的主要研究对象是相对分子质量1000以下的内源性小分子，与转录组学和蛋白组学等其他组学相比，具有以下优点：基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物水平得到放大；代谢组学的研究不需要进行全基因组测序或建立大量表达序列标签的数据库；代谢物的种类远少于基因和蛋白的数目；生物体液的代谢物分析可反映机体系统的生理和病理状态。通过代谢组学研究既可以发现生物体在受到各种内外环境扰动后的应答情况，也可以区分同种不同个体之间的差异。
代谢组学主要使用的分析方法有核磁共振波谱（NMR）、质谱（MS）、色谱（GC或HPLC）、红外光谱、毛细管电泳、紫外吸收、电化学检测等，其中色谱以其高分离度、高通量，质谱以其普适性、高灵敏度和特异性而成为最主要的分析工具，液相色谱或气相色谱与质谱联用分析范围更广，己成为代谢组学研究中最重要的研究工具，液相色谱一质谱联用系统(Liquid chromatography—massspectrometer，LC-MS)相比NMR具有更高灵敏度和分辨率的优势，在代谢组学领域得到了越来越广泛的应用。代谢组学现已广泛应用与临床诊断，主要是发现与疾病诊断、治疗相关的代谢标记物，通过代谢物谱分析得到的相关标志物是疾病的分型、诊断、治疗的基础。糖尿病是一种以糖代谢失常为主的内分泌代谢性疾病通常表现为整体的代谢紊乱，因此代谢组学的方法非常适合于糖尿病的研究。
本发明拟以妊娠糖尿病患者和妊娠正常对照人群的血清为研究对象，采用超高效液相色谱飞行时间质谱建立其代谢指纹图谱，并结合主成分分析进行模式识别，通过对比妊娠糖尿病患者和妊娠正常对照人群的代谢谱图，将妊娠糖尿病患者和妊娠正常对照人群很好的区分开，并试图从中发现一些潜在的特征代谢标志物,以期在国内建立一个统一标准的诊断方法。同时检测妊娠糖尿病患者不同治疗期的代谢谱图变化，以期通过患者血清中代谢物的变化，找出与妊娠糖尿病治疗相关代谢标志，为妊娠糖尿病的临床治疗提供理论依据。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中上述缺陷，提供一种基于妊娠糖尿病人血清LC/MS代谢组学分析方法，包括：收集正常孕妇及妊娠糖尿病孕妇的血清样本，经处理后经色谱柱分离，并采用质谱检测分析，在进行LC/MS检测分析后提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据，通过建立多维统计模型可视化地显示两组之间的代谢谱差异，获得两组之间的差异性代谢物，并对这些物质进行初步鉴定。本发明方法可以全面、综合地体现妊娠糖尿病患者的代谢产物的变异状况，可用于妊娠糖尿病的早期诊断和预后提供有利的技术支持。
本发明的解决上述技术问题的方案是：一种基于妊娠糖尿病人血清LC/MS代谢组学分析方法，包括：
（1）样品制备：收集正常孕妇及妊娠糖尿病孕妇的血清样本，经处理后准备进行LC/MS检测分析；
（2）LC/MS检测分析：将血清样本经色谱柱分离，并采用质谱检测分析；
（3）数据分析：提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据，通过建立多维统计模型可视化地显示两组之间的代谢谱差异，获得两组之间的差异性代谢物，并对这些物质进行初步鉴定。
优选的，所述步骤（1）中处理方法为：取冷冻储存的样本，置室温下解冻15min，涡漩震荡5s。分别取100μL的样本加入300 μL HPLC级甲醇，涡漩震荡30s，4°C静置20min；所有样本进行冷冻离心，取200 μL上清液，转入进样小瓶。
优选的，所述步骤（1）中冷冻离心条件为12000rpm、 4°C、15min。
优选的，步骤（2）中LC/MS检测分析的仪器分析平台为LC-Q/TOF-MS，分离色谱柱为C18色谱柱（Agilent, 100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）。色谱分离条件为：柱温为40℃；流速0.4 mL/min；流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脱。进样量为4 μL，自动进样器温度4℃。
优选的，步骤（2）质谱条件：正离子模式条件：以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型。正离子模式条件为：毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度100 ℃；脱溶剂气温度350 ℃、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600 L/h、萃取锥孔4 V。离子扫描时间0.03 s、扫描时间间隔0.02 s、数据采集范围：50-1000 m/z。应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子模式下产生[M+H]+离子556.2771 Da。
优选的，所述步骤（3）中提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据为：采用Agilent MassHunter 工作站采集总离子流图(TIC)进行可视化检查，通过多个样本图谱的重叠，判断仪器在分析样本时是否符合代谢组学分析要求，进行稳定性和重复性的考察。
优选的，步骤（3）中在建立多维统计模型具体为：在R软件平台下采用自写的程序代码提取原始数据信号（峰识别和积分），然后进行保留时间校正、峰对齐和反卷积分析（质谱碎片归属），最后在EXCEL软件中进行后期编辑，将结果组织为二维数据矩阵，包括变量保留时间Rt，质荷比m/z、观察量（样本）和积分面积。将编辑后的数据矩阵导入Simca-P软件（版本11.0）分别进行主成分分析（PCA），偏最小二乘方判别分析（PLS-DA），正交偏最小二乘方分析（OPLS）并且按照OPLS的VIP值挖掘差异代谢物质。
附图说明
图1为正模式下样本的总离子流图（横坐标-保留时间，纵坐标-峰强）；
图2为样本A4的TIC；
图3为样本B33的TIC；
图4为两组样本的PCA得分图（ESI+）；
图5为两组样本PLS-DA得分图(ESI+)；
图6为两组样本OPLS得分图(ESI+)。
具体实施方式
下面结合实施例进一步描述本发明。
一、数据信息及分析内容
1.1 样本基本信息
共收到客户提供的人血清样本60个样本，2组：分别为组A（正常孕妇），组B（妊娠糖尿病孕妇，样本编号如下表1。按照合同规定，对每组样本进行LC-MS正离子模式分析及代谢组学分析。
表1：人血清样品
| Time (min) | Flow rate (mL/min) | A (%) | B (%) |
| 0 | 0.4 | 95 | 5 |
| 2 | 0.4 | 95 | 5 |
| 17 | 0.4 | 5 | 95 |
| 19 | 0.4 | 5 | 95 |
1.2 样本制备
取冷冻储存的样本，置室温下解冻15min，涡漩震荡5s。分别取100μL的样本加入300 μL HPLC级甲醇，涡漩震荡30s，4°C静置20min；所有样本进行冷冻离心（12000rpm, 4°C, 15min），取200 μL上清液，转入进样小瓶，进行LC/MS检测分析。实验用到的试剂为：甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵为美国默克公司色谱级试剂，实验用水为屈臣氏蒸馏水。
1.3 LC/MS分析
本实验的仪器分析平台为LC-Q/TOF-MS (Agilent,1290 Infinity LC, 6530 UHD and Accurate-Mass Q-TOF /MS)，分离色谱柱为C18色谱柱（Agilent, 100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）。色谱分离条件为：柱温为40℃；流速0.4 mL/min；流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脱程序见表2。进样量为4 μL，自动进样器温度4℃。
表2：梯度洗脱程序
| Time (min) | Flow rate (mL/min) | A (%) | B (%) |
| 0 | 0.4 | 95 | 5 |
| 2 | 0.4 | 95 | 5 |
| 17 | 0.4 | 5 | 95 |
| 19 | 0.4 | 5 | 95 |
质谱条件
正离子模式条件：以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型。正离子模式条件为：毛细管电压（capillary voltage）4 kV、锥孔电压（Sampling cone）35 kV、离子源温度（Source temperature）100 ℃；脱溶剂气温度（Desolvation temperature）350 ℃、反向锥Lock mass qtof孔气流（Cone gas flow）50 L/h、脱溶剂气（Desolvation gas flow）600 L/h、萃取锥孔（Extraction cone）4 V。
离子扫描时间（Scan time）0.03 s、扫描时间间隔（Inter scan time）0.02 s、数据采集范围：50-1000 m/z。为确保质量的准确性和重复性，应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量（Lock mass），正离子模式下产生[M+H]+离子556.2771 Da。
1.4 数据分析内容
（1）提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据；
（2）通过建立多维统计模型可视化地显示两组之间的代谢谱差异；
（3）获得两组之间的差异性代谢物，并对这些物质进行初步鉴定。
二、数据分析结果
2.1 原始色谱图检查
首先采用Agilent MassHunter 工作站(Qualitative Analysis VB 03.01, Agilent, USA)采集总离子流图(TIC)进行可视化检查，通过多个样本图谱的重叠，直观地判断仪器在分析样本时是否符合代谢组学分析要求，即稳定性和重复性的考察，如图1所示。
从图1中多样本重叠的谱图效果看，仪器的状态良好，并且得到的谱峰数据比较可靠，可以进一步多元统计分析。在此我们也从各组样本中随即抽取一个样本的TIC图罗列，TIC在ESI+模式下的响应较好，大部分代谢物质能够在此模式出峰，所以正模式下的峰更多，如图2、图3。
2.2 数据处理
在R软件平台下采用自写的程序代码提取原始数据信号（峰识别和积分），然后进行保留时间校正、峰对齐和反卷积分析（质谱碎片归属），最后在EXCEL软件中进行后期编辑，将结果组织为二维数据矩阵，包括变量（保留时间Rt，质荷比m/z）、观察量（样本）和积分面积。其中两组样本的谱图整合后正模式（ESI+）下获得975个变量或物质（至少一组的80%以上样本中存在）。将编辑后的数据矩阵导入Simca-P软件（版本11.0）分别进行主成分分析（PCA），偏最小二乘方判别分析（PLS-DA），正交偏最小二乘方分析（OPLS）并且按照OPLS的VIP值挖掘差异代谢物质。
2.3 两组样本整体分析
对样本进行主成分分析能从总体上反应各组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小。在Simca-P软件中，数据均采用默认的UV格式化（Unit Variance Scaling）和平均中心化（Mean-Centered）处理，以获得更加可靠且更加直观的结果。软件进行自动化模型拟合分析，获得能得到最可靠数学模型的主成分数目。
2.3.1 主成分分析(PCA)
主成分分析作为无监督式学习方法，可以真实反映样本的聚类情况。对2组样本正模式下得到的数据进行PCA分析，共获得2个主成分(PC)，R2X=0.146，一般来说R2X值大于0.4就表示该模型可靠，由于临床样本的复杂性，一般大于0.1即可，因此本项目建立的模型可以应用于可视化观察2组之间的代谢谱差异。PCA得分图(Scores plot)如图4，模式下PCA得分图均可以看出大部分样本都在95%的置信区间，并且大部分A组样本处于右上方，B组样本处于左下方。
2.3.2 最小二乘判别分析(PLS-DA)
通过主成分分析后，经过评估，同时为了确保数据的原始性，本模型不需要剔除任何样本，所以进一步采用有监督式方法PLS-DA进行建模分析，模型的参数R2Y表示模型的解释率，Q2表示模型的预测率，一般来说此参数大于0.4即表明此模型可靠。结果正模式下得到4个主成分，R2Y=0.993，Q2=0.785，PLS-DA得分图如图5所示。
2.3.3 正交最小二乘分析(OPLS)
进一步采用有监督式方法OPLS进行建模分析，模型的参数R2Y表示模型的解释率，Q2表示模型的预测率，一般来说此参数大于0.4即表明此模型可靠。结果正模式下得到1个主成分和1个正交成分，R2Y=0.897，Q2=0.551，其得分图如图6所示。
通过OPLS分析，得分图的效果上看，两组样本在正离子模式下能够很好的分离，并且大部分A组的样本处在主成分1（PC1）的左侧，而组B样本处在主成分1（PC1）的右侧，下一节我们将根据此OPLS模型的Variable Importance list 所给出的值，结合t-test,寻找对两组之间的显著差异具有重要贡献的变量（代谢物），并对这些变量进行定性。
2.3.4 两组之间差异性代谢产物的挖掘及鉴定
本项目采用 PLS-DA模型的VIP（Variable Importance in the Projection）值（阈值>1），并结合学生氏t检验(t-test)的p值（阈值0.05）来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库（http://metlin.scripps.edu/）（比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass）。差异性代谢物数据如表3所示：
表 3. 组B与组A正模式下的差异性代谢物
| RT | mass | name | VIP | ttest | fold(B/A)* |
| 0.687017 | 190.0333 | 4-Nitroquinoline-1-oxide | 1.52511 | 0.0246386 | -0.76998 |
| 0.730733 | 226.0958 | Porphobilinogen | 1.736 | 0.010021 | -0.79006 |
| 0.823933 | 181.0741 | L-Tyrosine | 1.86314 | 0.005496 | -0.36036 |
| 1.137967 | 117.0793 | Betaine | 1.69489 | 0.0120524 | -0.15163 |
| 1.1389 | 204.022 | Oxaloglutarate | 1.77264 | 0.0084677 | -0.8499 |
| 1.141117 | 203.1163 | Acetylcarnitine | 1.4964 | 0.0276052 | -0.23603 |
| 1.155867 | 149.0512 | L-Methionine | 2.31483 | 0.0004344 | -0.25018 |
| 4.709083 | 145.0528 | Isoquinoline N-oxide | 2.13359 | 0.0013042 | -0.22197 |
| 4.709083 | 204.0915 | L-Tryptophan | 2.11144 | 0.0014801 | -0.22976 |
| 4.7092 | 158.0845 | Nicotyrine | 2.16672 | 0.0010759 | -0.22852 |
| 4.70925 | 187.064 | Indoleacrylic acid | 2.03866 | 0.0022182 | -0.20692 |
| 6.661167 | 254.0798 | L-Arginine phosphate | 1.18673 | 0.0830698 | -0.2065 |
| 7.566867 | 175.0636 | 3-Indoleacetic Acid | 1.4204 | 0.0369336 | -0.87178 |
| 8.488867 | 362.2103 | Cortisol | 2.13027 | 0.0013293 | -0.29961 |
| 8.5553 | 360.1946 | Cortisone | 2.21625 | 0.0008013 | -0.43446 |
| 9.519533 | 315.2421 | Decanoyl-L-carnitine | 1.34181 | 0.049189 | -0.47413 |
| 10.6753 | 343.2734 | Lauroylcarnitine | 1.44647 | 0.0334755 | -0.46371 |
| 11.22675 | 449.3152 | glycodeoxycholic acid | 1.47688 | 0.0297881 | -0.92308 |
| 11.52273 | 666.9481 | adenosine 5'-pentaphosphate | 1.76055 | 0.0089553 | -1.29054 |
| 12.7442 | 501.2872 | Glycerophospho-N-Arachidonoyl Ethanolamine | 1.67144 | 0.0133637 | -0.4395 |
| 13.0424 | 314.2254 | progesterone | 1.72043 | 0.0107523 | -0.41721 |
| 13.14028 | 517.316 | PC(18:3) | 1.3434 | 0.0489118 | -0.17328 |
| 13.51793 | 479.3024 | Glycerophospho-N-Oleoyl Ethanolamine | 1.74091 | 0.0097995 | -0.2152 |
| 13.97665 | 521.3494 | PC(18:1) | 1.48515 | 0.0288459 | -0.75581 |
| 14.89313 | 523.3678 | PC(18:0) | 1.48318 | 0.0290681 | -0.09748 |
| 16.03007 | 278.2254 | γ-Linolenic Acid | 1.49843 | 0.0273854 | 0.349926 |
| 16.31102 | 148.0377 | 2-Hydroxyglutarate | 1.36447 | 0.0453549 | -0.53356 |
| 16.68292 | 304.2409 | Arachidonic Acid (peroxide free) | 1.51205 | 0.025953 | 0.609636 |
*组B与组A均值之比的对数值（以2为底），正号表示组B相对于组A上升，负号表示下降。
三、分析结果讨论
本发明采用UPLC-Q/TOF-MS仪器对人血清样本进行代谢组学全谱分析。采用所有样本中这些物质的峰的响应强度数据进行PCA分析。PCA成功地对所有组样本进行建模，AB两组存在差异。
在此基础上，我们对各组样本进行有监督式统计分析，包括PLS-DA及OPLS，采用OPLS的VIP值并结合学生氏t检验，获得差异性表达代谢物。差异性代谢物及其变化关系初步显示，其差异代谢产物主要归属于小分子有机酸、氨基酸类、短链脂肪酸类以及醇类等物质。实际应用中可以根据这些代谢物的生化途径归属并结合已有的基因和蛋白质知识构建代谢网络。也可以根据附件提供的原始数据绘图，附件也提供了分析报告中的所有图片的原始文件。实际应用中可以根据需要进行后期总结、加工。总之，基于LC/MS的样本的代谢组学的PCA和差异性代谢物及其相对定量（变化）信息将为从代谢通路及其变化关系的角度阐明生物学变化提供强有力的数据支撑。
本发明说明书书未详细阐述部分属于本领域公知技术。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种基于妊娠糖尿病人血清LC/MS代谢组学分析方法，包括：
（1）样品制备：收集正常孕妇及妊娠糖尿病孕妇的血清样本，经处理后准备进行LC/MS检测分析；
（2）LC/MS检测分析：将血清样本经色谱柱分离，并采用质谱检测分析；
（3）数据分析：提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据，通过建立多维统计模型可视化地显示两组之间的代谢谱差异，获得两组之间的差异性代谢物，并对这些物质进行初步鉴定。
2.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤（1）中处理方法为：取冷冻储存的样本，置室温下解冻15min，涡漩震荡5s；分别取100μL的样本加入300 μL HPLC级甲醇，涡漩震荡30s，4°C静置20min；所有样本进行冷冻离心，取200 μL上清液，转入进样小瓶。
3.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤（1）中冷冻离心条件为12000rpm、 4°C、15min。
4.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，步骤（2）中LC/MS检测分析的仪器分析平台为LC-Q/TOF-MS，分离色谱柱为C18色谱柱（Agilent, 100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；色谱分离条件为：柱温为40℃；流速0.4 mL/min；流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脱；进样量为4 μL，自动进样器温度4℃。
5.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，步骤（2）质谱条件：正离子模式条件：以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型；正离子模式条件为：毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度100 ℃；脱溶剂气温度350 ℃、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600 L/h、萃取锥孔4 V；离子扫描时间0.03 s、扫描时间间隔0.02 s、数据采集范围：50-1000 m/z；应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子模式下产生[M+H]+离子556.2771 Da。
6.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤（3）中提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据为：采用Agilent MassHunter 工作站采集总离子流图(TIC)进行可视化检查，通过多个样本图谱的重叠，判断仪器在分析样本时是否符合代谢组学分析要求，进行稳定性和重复性的考察。
7.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，步骤（3）中在建立多维统计模型具体为：在R软件平台下采用自写的程序代码提取原始数据信号（峰识别和积分），然后进行保留时间校正、峰对齐和反卷积分析（质谱碎片归属），最后在EXCEL软件中进行后期编辑，将结果组织为二维数据矩阵，包括变量保留时间Rt，质荷比m/z、观察量（样本）和积分面积；将编辑后的数据矩阵导入Simca-P软件（版本11.0）分别进行主成分分析（PCA），偏最小二乘方判别分析（PLS-DA），正交偏最小二乘方分析（OPLS）并且按照OPLS的VIP值挖掘差异代谢物质。
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