CN104933277A - 基于代谢组学数据建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于代谢组学数据建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法，是采用高效液相色谱-质谱联用技术分离并鉴定健康人、糖尿病患者但未患认知功能障碍及糖尿病患者但患有认知功能障碍三组血浆，利用软件对所分离得到的物质分别进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析，确定差异性代谢产物并对其结构进行鉴定，选择显著的差异性代谢产物构成分析预测糖尿病认知功能障碍平台。可以及时根据糖尿病患者的血浆分析预测糖尿病认知功能障碍，及早发现及早治疗，可降低糖尿病认知功能障碍的发病率，避免由糖尿病认知功能障碍引起的一系列家庭与社会问题。

Description

基于代谢组学数据建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法

技术领域

本发明涉及一种分析预测平台的建立方法，尤其是一种基于代谢组学数据建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法。

背景技术

糖尿病认知功能障碍作为糖尿病的常见并发症，主要症状以学习能力下降、记忆损害为主，严重可发展为痴呆。虽然并不是糖尿病中最严重的并发症，但由此病引起的后果是非常严重的，譬如糖尿病患者忘记吃药，将会加重病情等。糖尿病患者患上认知功能障碍的几率比正常人高50%，Ⅱ型糖尿病中年患者患痴呆的长期风险显著提高；65岁以上的老年人12~25%都患有糖尿病，世界范围内10到15个痴呆患者就有1个是由Ⅱ型糖尿病引起，如果把糖尿病前期也纳入考虑，大约可达到7~10个患者中就有1个。目前，临床上采用MoCA和MMSE方法来评价糖尿病认知功能障碍，缺乏血液学证据。

高效液相色谱作为一种分离设备的联用技术被广泛的使用，其中以高效液相色谱质谱联用最为常见。高效液相色谱-质谱联用技术始于20 世纪70 年代，其分析的物质多数直接进样在HPLC 上得到分离，然后在MS 上获得准确的定性和定量，从而大大地缩短了分析时间，提高了分析的灵敏度和准确性。

但是，迄今为止还没有关于以高效液相色谱-质谱联用技术分析血浆内源性成分并获得代谢组学数据，从而建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术存在的上述技术问题，提供一种基于代谢组学数据建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法。

本发明的技术解决方案是：一种基于代谢组学数据建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a.  取冷冻储存的三组血浆样本，分别为A组健康人；B组糖尿病患者但未

患认知功能障碍；C组糖尿病患者但患有认知功能障碍；将三组血浆样本均置于室温下解冻15min，涡漩震荡5s；分别取每个样本100μl加入300μl HPLC级甲醇，涡漩震荡30s，4°C静置20min；对所有样本进行冷冻离心，12000rpm, 4°C，15min，取每个样本的上清液；

b．将每个样本的上清液分别进入LC/MS进行分离；

色谱条件：分离色谱柱为C18色谱柱，分离条件为：柱温为40℃；流速0.4 ml/min；流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脱程序见表1；进样量为5μl，自动进样器温度4℃；

                                               表1

Time (min)	Flow rate (ml/min)	A (%)	B (%)
				0	0.4	98	2
2	0.4	98	2
				17	0.4	5	95
19	0.4	5	95

质谱条件：采用ESI正离子模式进行检测，以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型；

正离子模式条件：毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4 V；离子扫描时间0.03 s、扫描时间间隔0.02 s、数据采集范围：50~1000 m/z；应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子模式下产生[M+H]+离子556.2771 Da；

c. 数据处理：

对所有原始质谱数据进行预处理并导出mz格式数据；具体步骤是在R软件平台下采用xcms程序代码进行数据预处理，包括基线过滤、峰识别，进行保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属分析，最后在EXCEL2007软件中进行后期编辑，包括来自于柱流失和样本制备造成的杂质峰剔除和定量离子选择，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量、观察量和峰强度；

d. 数据分析：

将所有数据归一化到总信号积分，将编辑后的数据矩阵导入版本11.0的Simca-P软件，分别进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析；

e. 差异性代谢产物确定及其结构鉴定：

采用 PLS-DA模型第一主成分的VIP值，并结合学生氏t检验的p值确定差异性代谢产物并对其结构进行鉴定；

f. 分析预测平台的建立：

选择显著的差异性代谢产物构成预测平台，具体步骤：

f.1分别按照差异性代谢产物的VIP值、ROC曲线下的面积和倍数变化的绝对值降序排列，P值升序排列，形成四个列表；

f.2挑选所有列表中的前20%的变量为分析预测糖尿病认知功能障碍的标准值，构成预测平台。

本发明是采用高效液相色谱-质谱联用技术分离并鉴定健康人、糖尿病患者但未患认知功能障碍及糖尿病患者但患有认知功能障碍三组血浆，利用软件对所分离得到的物质分别进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析，确定差异性代谢产物并对其结构进行鉴定，选择显著的差异性代谢产物构成分析预测糖尿病认知功能障碍平台。可以及时根据糖尿病患者的血浆分析预测糖尿病认知功能障碍，及早发现及早治疗，可降低糖尿病认知功能障碍的发病率，避免糖尿病认知功能障碍进一步恶化及带来的严重后果。

附图说明

图1是本发明实施例1 主成分分析PCA得分图。

图2是本发明实施例1采用PLS-DA对AB两组样本分析得分图。

图3是本发明实施例1采用PLS-DA对AC两组样本分析得分图。

图4是本发明实施例1采用PLS-DA对BC两组样本分析得分图。

具体实施方式

按照如下步骤进行：

a.取冷冻储存的三组血浆样本，分别为A组健康人；B组糖尿病患者但未

患认知功能障碍；C组糖尿病患者但患有认知功能障碍；每组取24个样本，将三组血浆样本均置于室温下解冻15min，涡漩震荡5s；分别取每个样本100μl加入300μl HPLC级甲醇，涡漩震荡30s，4°C静置20min；对所有样本进行冷冻离心，12000rpm, 4°C，15min，取每个样本的上清液；

b．将每个样本的上清液分别进入LC/MS进行分离；

LC/MS仪器分析平台为Agilent,1290 Infinity LC, 6530 UHD and Accurate-Mass Q-TOF /MS。

色谱条件：分离色谱柱为C18色谱柱（Agilent, 100 mm×2.1 mm，1.8μm），分离条件为：柱温为40℃；流速0.4 ml/min；流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脱程序见表1；进样量为5μl，自动进样器温度4℃； 

表1

Time (min)	Flow rate (ml/min)	A (%)	B (%)
				0	0.4	98	2
2	0.4	98	2
				17	0.4	5	95
19	0.4	5	95

质谱条件：采用ESI正离子模式进行检测，以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型；

正离子模式条件：毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4 V；离子扫描时间0.03 s、扫描时间间隔0.02 s、数据采集范围：50~1000 m/z；应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子模式下产生[M+H]+离子556.2771 Da；

c. 数据处理：

通过安捷伦工作站MassHunter (Version B 03.01)对所有原始质谱数据进行预处理并导出mz格式数据；具体步骤是在R软件平台下采用xcms程序代码进行数据预处理，包括基线过滤、峰识别，进行保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属分析，最后在EXCEL2007软件中进行后期编辑，包括来自于柱流失和样本制备造成的杂质峰剔除和定量离子选择，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量（rt_mz，即保留时间_质荷比）、观察量（样本）和峰强度，本发明实施例所得血清经分离分析共得到1639个物质（每组至少80%以上样本中存在）；提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据；

d. 数据分析：

将所有数据归一化到总信号积分，将编辑后的数据矩阵导入版本11.0的Simca-P软件，分别进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析；

Simca-P软件中，数据均采用默认的UV格式化（Unit Variance Scaling）和平均中心化（Mean-Centered）处理，以获得更加可靠且更加直观的结果。主成分分析作为一种非监督式的方法，能够真实反应样本的情况，所以首先采用PCA的方法对整体样本进行评估。软件对整体数据进行模型拟合分析，共获得5个主成分，R2X=0.203（横坐标为第1主成分得分，用t[1]表示；纵坐标为第2主成分得分，用t[2]表示）。PCA得分图（Scores plot）如图1所示；样本大部分处于95%置信区间（Hotelling T2 ellipse）内。一般来说临床样本PCA分析中的参数R2X值大于0.1就表示该模型可靠，因此当前PCA模型能可靠地用于解释样本之间的代谢差异。从图1中可以直观地观察出三组之间的大体分布趋势，为了保证数据的原始性，在不影响后续分析的前提下，不剔除三个在置信区间外的样本。之后采用PLS-DA对AB两组及AC两组样本进行模型分析；AB两组间共获得3个主成分，R2X=0.139，R2Y=0.996，Q2=0.818，得分图如图2所示；AC两组间共获得3个主成分，R2X=0.16，R2Y=0.998，Q2=0.905，得分图如图3所示；AC两组间共获得3个主成分，R2X=0.133，R2Y=0.995，Q2=0.785，得分图如图4所示；大部分样本均处于95%置信区间内。一般来说R2Y及Q2值大于0.4就表示该模型可靠，因此当前PLS-DA模型能可靠地用于解释两组样本之间的代谢差异；

e. 差异性代谢产物确定及其结构鉴定：

采用 PLS-DA模型第一主成分的VIP值（阈值>1），并结合学生氏t检验的p值（阈值0.05）确定差异性代谢产物并对其结构进行鉴定；

f. 分析预测平台的建立：

选择显著的差异性代谢产物构成预测平台，具体步骤：

f.1分别按照差异性代谢产物的VIP值、ROC曲线下的面积和倍数变化的绝对值降序排列，P值升序排列，形成四个列表；

f.2挑选所有列表中的前20%的变量为分析预测糖尿病认知功能障碍的标准值，构成预测平台。

定性方法为：搜索自建的标准物质数据库和公共网络数据库（Metlin以及HMDB）。

可根据所选择的差异性代谢产物建立代谢网络，具体步骤为：

下载KEGG数据库中pathway数据，通过R（http://www.r-project.org/）下载（http://www.bioconductor.org/packages/2.4/bioc/html/KEGGSOAP.html）软件包，分析基因组范围内的代谢物之间的相互作用，参数设定5步反应之内为相关的代谢物，建立网络，网络构建软件使用cytoscape(http://www.cytoscape.org)。

Claims (1)

1.一种基于代谢组学数据建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法，

其特征在于按照如下步骤进行：

a. 取冷冻储存的三组血浆样本，分别为A组健康人；B组糖尿病患者但未

患认知功能障碍；C组糖尿病患者但患有认知功能障碍；将三组血浆样本均置于室温下解冻15min，涡漩震荡5s；分别取每个样本100μl加入300μl HPLC级甲醇，涡漩震荡30s，4°C静置20min；对所有样本进行冷冻离心，12000rpm, 4°C，15min，取每个样本的上清液；

b．将每个样本的上清液分别进入LC/MS进行分离；

色谱条件：分离色谱柱为C18色谱柱，分离条件为：柱温为40℃；流速0.4 ml/min；流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脱程序见表1；进样量为5μl，自动进样器温度4℃；

表1

Time (min) Flow rate (ml/min) A (%) B (%) 0 0.4 98 2 2 0.4 98 2 17 0.4 5 95 19 0.4 5 95

质谱条件：采用ESI正离子模式进行检测，以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型；

正离子模式条件：毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4 V；离子扫描时间0.03 s、扫描时间间隔0.02 s、数据采集范围：50~1000 m/z；应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子模式下产生[M+H]+离子556.2771 Da；

c.数据处理：

对所有原始质谱数据进行预处理并导出mz格式数据；具体步骤是在R软件平台下采用xcms程序代码进行数据预处理，包括基线过滤、峰识别，进行保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属分析，最后在EXCEL2007软件中进行后期编辑，包括来自于柱流失和样本制备造成的杂质峰剔除和定量离子选择，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量、观察量和峰强度

d. 数据分析：

将所有数据归一化到总信号积分，将编辑后的数据矩阵导入版本11.0的Simca-P软件，分别进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析；

e. 差异性代谢产物确定及其结构鉴定：

采用 PLS-DA模型第一主成分的VIP值，并结合学生氏t检验的p值确定差异性代谢产物并对其结构进行鉴定；

f. 分析预测平台的建立：

选择显著的差异性代谢产物构成预测平台，具体步骤：

f.1分别按照差异性代谢产物的VIP值、ROC曲线下的面积和倍数变化的绝对值降序排列，P值升序排列，形成四个列表；

f.2挑选所有列表中的前20%的变量为分析预测糖尿病认知功能障碍的标准值，构成预测平台。